FI105104B - Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö - Google Patents

Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI105104B
FI105104B FI915279A FI915279A FI105104B FI 105104 B FI105104 B FI 105104B FI 915279 A FI915279 A FI 915279A FI 915279 A FI915279 A FI 915279A FI 105104 B FI105104 B FI 105104B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
globin
alpha
beta
hemoglobin
polypeptide
Prior art date
Application number
FI915279A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI915279A0 (fi
Inventor
Gary L Stetler
Steven J Hoffman
Douglas L Looker
Mary S Rosendal
Michael Wagenback
Original Assignee
Baxter Biotech Tech Sarl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Biotech Tech Sarl filed Critical Baxter Biotech Tech Sarl
Publication of FI915279A0 publication Critical patent/FI915279A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI105104B publication Critical patent/FI105104B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6445—Haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Description

, 105104
Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen poly-peptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö
Viitteet liittyvistä patenttihakemuksista 5 Hoffman ja Nagai, US-patentti 5 028 588 koskee matalan happiaffiniteetin omaavien mutanttihemoglobiinien käyttöä veren substituentteina ja alfa- ja beeta-globiinin ekspressiota muissa kuin punaisissa verisoluissa.
Keksinnön ala 10 Tämä keksintö liittyy di-alfa- ja di-beeta- globiinin kaltaisiin polypeptideihin ja niitä koodaaviin yhdistelmä-DNA-molekyyleihin. Keksintö kohdistuu edelleen menetelmään reversiibelin hapensitomisaktiivisuuden omaavan ihmisen hemoglobiinin kaltaisen proteiinin tuot-15 tamiseksi, jossa luonnollisen hemoglobiinin kaksi alfa-tai kaksi beeta-alayksikköä on korvattu yhdellä di-alfa-globiinin tai vastaavasti di-beeta-globiinin kaltaisella polypeptidillä.
Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä toimivan 20 linkkerin määrittämiseksi di-alfa-globiinin kaltaiselle tai di-beeta-globiinin kaltaiselle polypeptidille, joka linkkeri on sopiva käytettäväksi hemoglobiinin kaltaisen « · '·' proteiinin tuotossa.
: " Tässä esitetään hemoglobiinin kahden alfa-alayk- • · ·.*·: 25 sikön geneettistä yhteenliittämistä niin, että muodoste- • · l \ · taan uusi polypeptidi di-alfa-globiini, jota voidaan pitää ·;··· osittain koottuna välimuotona, joka johtaa hemoglobiinin .‘J*. kaltaiseen proteiiniin, ja tämän yhdisteen käyttämistä • sellaisten synteettisten hemoglobiinien tuottamisessa, #···. 30 joilla on kohonnut suonen sisäinen puoliintumisaika ver- • · III rattuna peruskudoksesta vapaisiin hemoglobiineihin. Se • · ·** koskee myös analogista polypeptidiä di-beeta-globiinia.
• « « M « < • · · ‘ · · » % 4 « « « · 4 · 4 4 « 4 2 105104
Selvitys esityksen taustatiedoista
Aina ei ole käytännöllistä transfusoida potilasta luovutetulla verellä. Näissä tapauksissa on punasolusubs-tituutin käyttö toivottavaa. Tuotteen täytyy kuljettaa 02:a 5 tehokkaasti aivan kuten punasolut tekevät. ("Plasman laajentajat", kuten dekstraani ja albumiini, eivät kuljeta happea.) Kaksi substituenttityyppiä, joita on tutkittu eniten, ovat hemoglobiiniliuokset ja fluorihiiliemulsiot.
A. Hemoglobiinin rakenne ja toiminta 10 Hemoglobiini (Hgb) on veren happea kuljettava osa.
Hemoglobiini kiertää verenkierrossa pienten tumattomien solujen, joita kutsutaan erytrosyyteiksi (punaiset verisolut) , sisällä. Hemoglobiini on proteiini, joka rakentuu neljästä yhteenliittyneestä polypeptidiketjusta ja sisäl-15 tää prosteettisia ryhmiä, joita kutsutaan hemiryhmiksi. Erytrosyytti auttaa pitämään hemoglobiinin sen pelkistyneessä toimivassa muodossa. Hemiryhmän rauta-atomi on altis hapettumiselle, mutta voi jälleen pelkistyä erytro-syytin jommankumman kahden entsyymisysteemin, sytokromi b5-20 ja glutationipelkistyssysteemin, vaikutuksesta.
Noin 92 % normaalin aikuisen ihmisen hemolysaatista on Hgb A:ta (jota merkitään nimellä alfa2-beeta2, koska se
I I
' sisältää kaksi alfa- ja kaksi beetaketjua) . Alfaketju si- ; '·· sältää 141 aminohappoa. Hemiryhmän (ferroprotoporfyriini 25 IX) rauta-atomi on sitoutunut His 87 aminohapon ("proksi- : maalinen histidiini") imidatsoliryhmään kovalenttisesti.
·;··· Beetaketju on 146 jäännöksen pituinen ja hemiryhmä on si- toutunut siihen His 92 aminohapon kohtaan. Apohemoglobiini on hemiryhmästä vapaa hemoglobiinianalogi; se on olemassa '···' 30 pääasiallisesti alfa-beeta-globiinidimeerinä.
• ·
Erotetut hemistä vapaat alfa- ja beeta-globiinit on • · ·;* valmistettu hemoglobiinin hemiryhmän sisältävistä alfa- ja beeta-alayksiköistä. Erotetut hemistä vapaat globiiniket-jut laskostuvat hyvin erilaisesti, vaikka hemiä sisältävät i I « i «
« « I
I «
« · I
3 105104 alayksiköt ovat erittäin samanlaisia sekundaarirakenteel-taan ja laskostumisen perusominaisuuksiltaan. Tämä osoittaa, että prosteettisen hemiryhmän sitoutumisella globii-nialayksikköön on hyvin erilaiset vaikutukset alfa- ja 5 beeta-globiinissa. Yip et ai., J. Biol. Chem., 247: 7237 -44 (1972) .
Ihmisen luonnollinen hemoglobiini on rakennettu kokonaisuudessaan erotetuista hemivapaista alfa- ja beeta-globiineista ja hemiryhmästä. Hemiryhmä lisätään suositelit) tavasti ensin alfa-globiinialayksikköön. Sitten hemiryhmän sitonut alfa-globiini liitetään yhteen hemivapaan beeta-globiinialayksikön kanssa. Lopuksi hemiryhmä lisätään puoliksi täytettyyn globiinidimeeriin ja saadaan tetrameeri-nen hemoglobiini. Yip et ai., PNAS (USA), 74: 64 - 68 15 (1977).
Fraktioimattomista kanin retikulosyyttihemolysaa-teista valmistetuissa soluvapaissa systeemeissä globiinia syntetisoidaan aktiivisesti noin viiden minuutin ajan ja sitten proteiinisynteesi äkillisesti loppuu. Hemiryhmän 20 lisäys ennen tätä estää tai viivyttää synteesiaktiivisuu- den loppumista johtuen hemiryhmän vaikutuksesta inhibito-riseen proteiiniin, joka tunnetaan nimellä "hemisäädelty • · *·' ' inhibiittori" (HRI) . Hemiryhmän puutoksella on vakavampia i '*· vaikutuksia alfaketjun synteesiin kuin beetaketjun syntee- 4 4 25 siin, koska alfa-globiinin mRNA on tehottomampi kuin bee- • · : ta-globiinin mRNA polypeptidiketjun synteesin aloitukses- ·;··· sa. On arveltu, että alfaketjut irrotetaan niiden syntee- sikohdalta ainoastaan vapaiden beetaketjujen läsnä ollessa, jotka välittömästi liittyvät yhteen vapautettujen al- #···, 30 faketjujen kanssa muodostaen alfa-beeta-globiinidimeerit.
• · IY. Nämä yhdistyvät sitten hemiryhmän kanssa muodostaen tetra- • · ·” meerisen hemoglobiinin. Winterhalter ja Huehns, J. Biol.
et]·* Chem., 239: 3699 (1964). Tiedetään varmasti, että hemiryh- 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 » 4 4 4 105104 män lisäys alfa-beeta-globiinidimeereihin (apohemoglobii-ni) johtaa nopeaan hemoglobiinin muodostumiseen.
Ihmisen alfa- ja beeta-globiinigeenit ovat kromosomeissa 16 ja 11, vastaavassa järjestyksessä. Bunn ja 5 Forget, supra, sivulla 172. Molemmat geenit on kloonattu ja sekvenssoitu, Liebhaber et ai., PNAS 77: 7054 - 58 (1980) (alfa-globiinin genominen DNA); Marotta et ai., J. Biol. Chem., 252: 5040 - 53 (1977) (beeta-globiinin cDNA); Lawn et ai., Cell 21: 647 (1980) (beeta-globiinin genomi-10 nen DNA).
Hemoglobiinimolekyylin neljällä alayksiköllä (kaksi alfa-globiinia ja kaksi beeta-globiinia Hgb A:n tapauksessa) on yhteisvaikutteinen hapensitomisominaisuus ja tämä yhteisvaikutteisuus edesauttaa suuresti tehokasta hapen-15 kuljetusta. Yhteisvaikutteisuus, joka saavutetaan niin sa notulla hemi-hemi-interaktiolla, sallii hemoglobiinin muutella sen affiniteettia hapelle. Hemoglobiini sitoo rever-siibelisti jopa neljä moolia happea per mooli Hgb:ia.
Happea kuljettavia yhdisteitä verrataan tavallises-20 ti sellaisella keinolla, joka tunnetaan nimellä hapen dis-sosiaatiokäyrä. Tämä käyrä saadaan, kun tietyn hapenkanta-jan happikyllästys tai happimäärä esitetään graafisesti 4 « « .1 hapen osapaineen funktiona. Hgb:lie kyllästysprosentti . kohoaa osapaineen mukaan sigmoidisen suhteen mukaisesti.
25 PS0-arvo on se osapaine, jossa happea kuljettava liuos on » * « ··· · puoliksi kyllästynyt hapella. Se on näin ollen hapen si- * * toutumisaffiniteetin mittari; mitä korkeampi P50-arvo, sitä «44 ·.· · heikommin happi on kiinni.
Kun hapen dissosiaatiokäyrä happea kuljettavalle ;***: 30 liuokselle on sellainen, että P50-arvo on pienempi kuin • · · ;***. kokoverelle, sen sanotaan olevan "vasemmalle siirtynyt".
• · · ·, Hemoglobiinin affiniteettia hapelle alentaa 2,3- • « « difosfoglyseraatin (2,3-DPG), kloori-ionien ja vetyionien
« I
läsnäolo. Hengittävä kudos vapauttaa hiilidioksidia vereen 35 ja alentaa sen pH:ta (se on, se kohottaa vetyionikonsen- « « « t 4 4 105104 traatlota) aiheuttaen näin hapen irtoamisen hemoglobiinista ja sallien sen diffundoitumisen yksittäisiin soluihin.
Hemoglobiinin kyky muuttaa happiaffiniteettiaan, joka kohottaa hapen kuljetustehokkuutta ympäri kehoa, 5 riippuu metaboliitin 2,3-DPG:n, läsnäolosta. Erytrosyytin sisällä 2,3-DPG on läsnä konsentraationa, joka on lähes yhtä suuri kuin hemoglobiinin konsentraatio. 2,3-DPG:n poissa ollessa "tavanomainen" hemoglobiini sitoo hapen hyvin tiukasti ja vapauttaa ainoastaan vähän happea hen-10 gittävälle kudokselle.
Ikääntyneet erytrosyytit vapauttavat pieniä määriä vapaata hemoglobiinia veriplasmaan, jossa sen nopeasti sitoo poistoproteiini-haptoglobiini. Hemoglobiini-hapto-globiinikompleksi poistetaan verestä ja hajotetaan pernan 15 ja maksan toimesta.
B. Veren substituutit, yleistä
Yllä olevien ajatusten perusteella on selvää, että vapaa luonnollinen hemoglobiini A injektoituna suoraan verenkiertoon ei pidä yllä tehokasta hapenkuljetusta kehos-20 sa. Elintärkeä allosteerinen säätelijä 2,3-DPG ei ole läsnä riittävissä konsentraatioissa plasmassa, jotta hemoglobiini vapauttaisi paljon happea laskimon happipaineessa.
« · « .! Siitä huolimatta tavanomaisen hemoglobiinin liuok- • « , siä on käytetty punaisten verisolujen substituentteina.
t « « '· “· 25 Klassinen menetelmä hemoglobiiniliuoksien valmistamiseksi • · · ' käyttää hyväkseen vanhentunutta verta. Punasolut hajote- taan ja soluroskat poistetaan jättäen jäljelle sen, joka • · · v · toivottavasti on "peruskudosvapaata hemoglobiinia" (SFH).
Tässä lähestymistavassa on havaittu useita peruson-30 gelmia. Liuos täytyy vapauttaa kaikista punasolumembraanin • · · .***. myrkyllisistä komponenteista, ilman että täytyy turvautua ··· \ vaivalloisiin ja aikaa vieviin menetelmiin, jotka tekevät • t · ••j suurimittakaavaisen tuotannon huonoksi. DeVenuto, "Ap praisal of Hemoglobin Solution as a Blood Substitute", 35 Surgery, Gynecology and Obstetrics, 149: 417 - 436 (1979).
« « « t « « 6 105104
Toiseksi, kuten odotetaankin, sellaiset liuokset ovat "vasemmalle siirtyneitä" (matalampi P50-arvo) verrattuna kokovereen. Gould et ai., "The Development of Polymerized Pyridoxylated Hemoglobin Solution as a Red Cell 5 Substitute", Ann. Emerg. Med. 15: 1416 - 1419 (3.12.1986).
Kolmanneksi, SFH:n puoliintumisaika verenkierrossa on ainoastaan noin 2-4 tuntia. Tämä johtuu siitä, että happea sisältävä Hgb osittain eroaa dimeeriksi (alfa-beeta), joka on riittävän pieni suodattuakseen munuaisten 10 välityksellä.
Lopuksi, SFH:11a on korkea kolloidinen osmoottinen paine (COD). Näin ollen SFH:n anto annoksena, jolla olisi sama happea kuljettava kapasiteetti kuin yksiköllä pakattuja punasoluja, ei ole viisasta, koska korkea osmoottinen 15 paine (60 mmHg) voisi aiheuttaa massiivisen veden kulkeu tumisen soluista verenkiertoon näin kuivattaen potilaan kudokset. Tämä syy rajoittaa SFH:n annoksen sellaiseen, joka antaa lopullisen konsentraation, joka on noin 6 - 8 g Hgb:ia/dl.
20 Yrityksessä säilyttää haluttu P50-arvo, tutkijat lisäsivät 2,3-DPG:tä hemoglobiiniliuokseen. Valitettavasti 2,3-DPG poistettiin nopeasti verenkierrosta. Sitten tiedemiehet käyttivät muita orgaanisia fosfaatteja, erikoisesti , pyridoksaalifosfaattia. Kuten 2,3-DPG, nämäkin yhdisteet 25 stabiloivat Hgb:n "T-tilaa" muodostaen suolasillan kahden • · · ϊ beetaketjun N-päiden välille. Pyridoksyloidun hemoglobii- *·*’· nin P50-arvo oli 20 - 22 torria verrattuna SFH:n 10 torriin • · · ί.ί · ja kokoveren 28 torriin. Samalla, kun tämä oli parannus SFH:hon verrattuna, pyridoksyloitu Hgb on "korkea-affini-30 teettinen" verrattuna kokovereen.
• · · .*··. C. Hemoglobiinialayksiköitten kemiallinen yhteen liittäminen • m t ···> Hemoglobiinin ominaisuuksia on muutettu yhteenliit- tämällä spesifisesti kemiallisesti alfaketjut alfal-ketjun 35 Lys99:n ja alfa2-ketjun Lys99:n väliltä. Walder, US-pa- • · · « · < · « · « 7 105104 tentti 4 600 531; Snyder et ai., PNAS (USA) 84: 7280 - 84 (1987); Chaterjee et ai., J. Biol. Chen»., 261: 9927 - 37 (1986). P50-arvo oli 29 mmHg:aa ja yhteenliittäminen ehkäisi munuaiserityksen, mutta puoliintumisaika plasmassa 5 kohosi ainoastaan 2 - 3-kertaisesti.
Tämä kemiallinen yhteenliittäminen suoritettiin antamalla bis(3,5-dibromisalisyyli)fumaraatin reagoida deok-sihemoglobiini A:n kanssa inositoliheksafosfaatin läsnä ollessa. Tällä reaktiolla on matala saanto (10 - 20 %). 10 Lisäksi tarvitaan puhdistus muista kohdista modifioitunei-den johdannaisten poistamiseksi (neljässä ketjussa on 42 muuta lysiinijäännöstä ja aminopään aminoryhmää, joissa kilpaileva reaktio voi tapahtua).
Lisäongelma "diaspiriini" yhteenliitosaineen käy-15 tössä on se, että se voi osallistua sivureaktioon, joka tuottaa karsinogeenista halo£enolia.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa hemoglobiiniana-logissa alfa-globiinien N-pään väliini ja C-pään arginiini on yhdistetty aminohappo- tai peptidilinkkerin avulla, il-20 man että täytyy turvautua erikoisiin kiinnitysaineisiin.
Beetaketjut on myös liitetty yhteen kemiallisesti.
Kavanaugh et ai., Biochemistry, 27: 1804 - 8 (1988). Kava-
.! naugh panee merkille, että beetaketjujen N-päät ovat 16 A
päässä toisistaan T-tilassa ja 20 A päässä toisistaan ‘ 25 R-tilassa. DIDS-sillan muodostaminen T-tilassa olevan he- • · · ··*· · moglobiinin N-päiden välille esti siirtymisen R-tilaan näin alentaen molekyylin 02-affiniteettia, mikä ei ole yl- • · · V* · lättävää. Samalla, kun Kavanaugh-analogilla on toivotut hapensitomis- ja munuaisten kautta poistumisominaisuudet, :***; 30 se saadaan myös matalalla saannolla.
.·**. D. Geeniekspressio, yleistä ♦ · · ' ·. Geeniekspressio pitää sisällään DNA:n transkription « · · ··* lähetti-RNA:ksi ja lähetti-RNA:n trans loimi sen proteiinik- *...* si. Transkriptioprosessi alkaa, kun entsyymi, DNA: s ta ·*.. 35 riippuvainen RNA polymer aasi, kiinnittyy DNA:han. Tämän • · · • · • · • * · e 105104 entsyymin sitoutumiskohtaa kutsutaan usein "promoottoriksi" ja entsyymin sitoutumista promoottoriin voi säädellä useat eri transkription repressorit tai indusoijät. RNA polymeraasi liukuu pitkin DNA molekyyliä muodostaen lähet-5 ti-RNA-transkriptin. Kun se kohtaa toisen säätelyelemen-tin, "terminaattorin", entsyymi putoaa pois ja mRNA-trans-kripti on muodostunut.
Ribosomit, solun proteiinitehtaat, käyttävät lä-hetti-RNA:ta templaattina vastaavan proteiinin rakentami-10 seksi. Ribosomin sitoutumiskohta sisältää niin kutsutun Shine-Dalgarno-sekvenssin (SD) ja sopivasti sijoittuneen aloituskodonin (starttikodonin). Aloittaen spesifisestä RNA-tripletistä, joka tunnetaan aloituskodonina, siirtäjä-RNA:t sitoutuvat vastaaviin lähetti-RNA:n kodoneihin. Ku-15 kin siirtäjä-RNA on kaksitoiminen; se sitoutuu lähetti-RNArn kodoniin komplementaarisen antikodonin välityksellä samalla pitäen vastaavaa aminohappoa paikallaan niin, että se liitetään kasvavaan polypeptidiketjuun. Ketju putoaa pois, kun ribosomi kohtaa yhden kolmesta spesifisestä 20 tripletistä, jotka tunnetaan "lopetus"-kodoneina. Se osa alkuperäistä geeniä, joka vastaa lähetti-RNA:n sekvenssiä /'; aloituskodonista viimeiseen kodoniin ennen lopetuskodonia, on koodittava sekvenssi. On olemassa myös 5' -pään sekvens- • 4 1 ; si, joka alkaa promoottorista ja 3'-pään sekvenssi, joka 25 loppuu terminaattoriin.
• « · • · · *“1 E. Polykistroninen ekspressio
On mahdollista, että yksittäisellä lähetti-RNA- • · · ’·1 1 transkriptillä on yksi promoottori, mutta kaksi tai useam pia pareja aloitus- ja lopetuskodoneita, jotka määrittävät · · *...· 30 erillään transloitavia sekvenssejä. Kukin sellainen sek- • · · venssi on "kistroni" ja kistroneita vastaavat polypeptidit ]·. yhteisekspressoidaan näin ollen yhden promoottorin sääte- lyn alaisuudessa.
# « • ·
Suurin osa bakteerioperoneista on polykistronisia, ’·· 35 se tarkoittaa, että useat eri geenit transkriptoidaan yh- * # · • · 9 105104 tenä lähetti-RNA:na niiden operoneista. Esimerkit sisältävät laktoosioperonin, jossa on kolme yhteenliitettyä geeniä (IacZ, IacY ja IacA) ja tryptofaanioperonin, jossa on viisi liittynyttä geeniä (trpE, trpD, trpC, trpB ja 5 trpA). Näissä operoneissa lähetti-RNA:n synteesi alkaa promoottorista ja transkriptissa koodittavat alueet on erotettu vaihtelevan pituisilla kistronien välisillä alueilla. (Operoni on ryhmä geenejä, joita säädellään yhtenä transkriptionasiisena geneettisenä yksikkönä). 10 Translaatiotehokkuus vaihtelee kistronista kistroniin. Kastelein et ai., Gene, 23: 245 - 54 (1983).
Kun kistronien väliset alueet ovat pidempiä kuin ribosomin ulottuvuus (noin 35 emästä), yhden kistronin lopetuskodonissa tapahtuvaa eroamista seuraa siitä riip-15 pumaton aloitus seuraavassa kistronissa. Kun kistronien väliset alueet ovat lyhyempiä tai jos kistronit ovat päällekkäin meneviä, terminoituvan ribosomin 30S alayksikkö voi epäonnistua eroamaan polykistronisesta mRNA:sta sen sitoutuessa välittömästi seuraavaan translaation aloitus-20 kohtaan. Lewin, Gene Expression. 143 - 148.
Toisin kuin bakteerien mRNA:t, eukaryoottien mRNA:t ovat yleensä luonteeltaan monokistronisia. Lewin, Gene :·. Expression, 157.
• * I
’•t ; Synteettisiä polykistronisia operoneja on rakennet- 25 tu ja ekspressoitu sekä prokaryooteissa että eukaryooteis- • · · ··· · sa.
Lee et ai., Nucleic Acids Res., 12: 6797 (1984) • · · *.* * kuvaavat spesifisen synteettisen polykistronisen operonin tapauksen, jossa kaikki kistronit ekspressoivat samaa po- • · · 30 lypeptidiä. Tämä homopolykistroninen rakenne muodostet- tiin geeniannosvaikutuksen maksimoimiseksi.
‘ Schoner et ai., PNAS, 83: 8506 - 10 (1986) trans- loivat synteettistä kaksikistronista mRNA:ta E. coli -bak-·'···* teerissä. Ensimmäinen kistroni oli lyhyt keinotekoinen AU- : *.. 35 rikas sekvenssi, kun taas toinen kistroni oli nisäkkään • · · • · • · • · · 10 105104 geeni (bGH). Havaittiin, että translaation "läpilukua" tapahtui, jos ensimmäisen kistronin lopetuskodonia seurasi toisen kistronin SD-sekvenssi ja jos se sijaitsi lähellä toisen kistronin aloituskodonia. Schoner'in tarkoitus oli 5 ratkaista hänen epäonninen Met-bGH:n korkean tason eks- pressio, jossa käytettiin geenin luonnollisia kodoneja, joka johtui luultavasti paikallisten sekundaarirakenteiden aiheuttamasta translaation inhibitiosta. Ensimmäinen kis-troni rakennettiin niin, että se suosi ribosomin sitoutu-10 mistä (sijoittamalla SD-sekvenssi ja AUG-aloituskodoni sellaiselle AU-rikkaalle alueelle, joka oli vapaa paikallisesta sekundaarirakenteesta). Katso myös Schoner et ai., Meth. Enzymol., 153: 401 - 416 (1987), joka paljastaa, että bGH:n ylituotto tällä menetelmällä liittyi proteiini-15 granuloiden muodostumiseen.
Saito et ai., J. Biochem. , 101: 1281 - 88 (1987) ekspressoivat synteettistä somatomediini C geeniä E. co-li -bakteerissa käyttäen kahden kistronin systeemiä. He muodostivat teorian, että somatomediini C:n, joka on emäk-20 sinen polypeptidi, epästabiilisuus voitaisiin ratkaista kompleksoimalla se happaman polypeptidin kanssa. Näin ollen he rakensivat kaksikistronisysteemin, joka pystyi eks-pressoimaan molempia polypeptidejä. Ensimmäisen kistronin lopetuskodoni meni päällekkäin toisen kistronin aloitusko-25 donin kanssa. Transformantit akkumuloivat somatomediini ·* \ C:tä korkeina tasoina. Somatomediini C saatiin kuitenkin talteen liukenemattomien pellettien muodossa (katso sivu : 1282).
Nisäkässolujen ribosomit kykenevät samalla tavalla • · · • 30 aloittamaan translaation uudelleen lopetuskodonin alavir- : rassa olevasta aloituskodonista. Näin ollen, Boel et ai., • · · FEBS Lett., 219: 181 (1987) ekspressoivat kaksikistronista *.“ transkriptioyksikköä nisäkässoluissa (CHO). Tämä yksikkö ohjasi sekä ihmisen haiman polypeptidin esiasteen että \ *.· 35 selektoitavan merkkigeenin (hiiren DHFR) synteesiä.
• « I
• · 11 105104 CODON, W088/05486, kuvaa kaksikistronisen mRNA:n tuoton, joka koodittaa sekä haluttua proteiinia (esim. kudoksen plasminogeeniaktivaattoria) että selektoitavaa fenotyyppiä (esim. neomysiiniresistenssiä). Yhteinen pro-5 moottori oli kummassakin esimerkissä Harvey'n jyrsijän sarkoomaviruksen johdannainen ja kaksikistroninen mRNA transloitiin sopivissa eukaryoottisissa soluissa.
GENENTECH, EP-patenttihakemus 117 058, esittää kaksikistronisen ekspressiovektorin ekspression selkärankais-10 isäntäsoluissa, jossa vektorissa yksi kistroni koodittaa haluttua proteiinia (esim. HbsAg) ja toinen koodittaa toista proteiinia (esim. DHFR), jonka synteesi on ympäris-tön säätelyn alainen (esim. metotreksaatilla).
F. Fuusiogeenit ja -proteiinit, yleistä 15 Geenit voidaan fuusioida yhteen poistamalla ensim mäisen geenin lopetuskodoni ja liittämällä se lukuraamiin toisen geenin kanssa. Geenien osia voidaan myös fuusioida ja täyte-DNA-sekvenssejä, jotka pitävät lukuraamin yllä, voidaan lisätä fuusioitujen sekvenssien väliin. Fuusiogee-20 nin tuote on yksi polypeptidi eikä useita polypeptidejä, kuten polykistronisen operonin ekspressiossa. Erilaisia geenejä on fuusioitu yhteen eri tarkoituksia varten. Näin ollen, Gilbert, US-patentti 4 338 397, insertoi rotan pre-proinsuliinigeenin E. coli -bakteerin penis!llinaasigee-25 nin fragmentin taakse. Hänen tarkoituksensa oli ohjata E.
*** · coli -transformantteja erittämään fuusiogeenin ekspressio- tuote. Fuusiogeenejä on muodostettu myös niin, että ei- » · · *♦* * antigeenistä polypeptidiä voidaan ekspressoida valmiiksi konjugoituna immunogeeniseen kantajaproteiiniin. Esillä • · · •"S 30 oleva keksintö kuitenkin pitää sisällään kahden saman gee- nin kopion yhteen liittämisen.
·· · \.t Linkkeri-DNA-sekvenssien käyttö kahden eri DNA- *".! sekvenssin yhteen liittämiseksi on tunnettu. Näitä link- *·;·* kerisekvenssejä käytetään muodostettaessa restriktiokohtia : *.. 35 DNA:n katkaisua varten tai koodittamaan peptidejä, joilla • · 105104 12 on sellainen ainutlaatuinen ominaisuus, joka tehostaa koo-ditetun fuusioproteiinin tai sen fragmentin puhdistusta. Katso esim. Rutter, US-patentti 4 769 326.
Plsum sativum -siementen lektiini syntetisoidaan 5 yksittäisenä 275 aminohapon pituisena preproproteiinina, joka sisältää signaalisekvenssin, jota seuraa ensin beeta-ketju ja sitten alfaketju. Signaalisekvenssi poistetaan endoplasmisessa retikkelissä ja proteiinikappaleissa tuloksena syntynyt "prolektiini" katkaistaan 187 aminohapon 10 pituiseksi beetaketjuksi ja 58 aminohapon pituiseksi alfa-ketjuksi. (Lisäprosessointi johtaa lyhentymiseen karboksi-päistä.) Samalla kun herneen siemenisolaatti on näin ollen heterodimeeri havaittiin, että katkaisematon luonnollisesti esiintyvä "prolektiini" myöskin sitoo hiilihyd-15 raatteja ja että tätä "prolektiiniä” voidaan ekspressoida E. coli -bakteerissa ja saada talteen toimivassa muodossa. Stubbs et ai., J. Biol. Chem., 26: 6141 - 44 (1986).
Toth, US-patentti 4 774 180, esittää polyproteiinin ekspressoimisen. Tämä polyproteiini tehtiin fuusioidusta 20 DNA-sekvenssistä, joka koodittaa sekä ensimmäistä polypep-tidiä, joka katalysoi glysiinin reaktiota ATP:n kanssa, jossa muodostuu glysyyli-adenylaattia ja toista polypepti-diä, joka saa glysyyli-adenylaatin reagoimaan tRNAcly:n kanssa niin, että saadaan glysiinillä varattu tRNA. Nämä 25 kaksi polypeptidiä ovat glysiini-tRNA-syntetaasin alfa- ja ·** i beeta-alayksiköt, jolla syntetaasilla on kvaternaarinen alfa2beeta2-rakenne. Kahta alayksikköä koodittaa E. coli -’·1 * bakteerin genomissa yksi kaksikistroninen geeni. Toth liitti alfaketjua koodittavan alueen beetaketjua kooditta-30 van alueen kanssa yhteen linkkerin avulla, joka linkkeri :***: kooditti kuutta aminohappoa. Katso myös Toth ja Schimmel, J. Biol. Chem., 261: 6643 - 46 (toukokuu 1986).
• · · '
Ladner, US-patentti 4 704 692, kuvaa eksperttisys- • · teemin sellaisten linkkerisekvenssien löytämiseksi, joita '· 35 voidaan käyttää kahden luonnollisesti aggregoituvan, mutta • · · • · • · 13 105104 kemiallisesti erotettavan polypeptidiketjun muuttamiseksi yhdeksi polypeptidiketjuksi, jolla on samanlainen konfor-maatio laskostumisen jälkeen. Tämä systeemi perustuu tietokantaan, joka sisältää aminohapposekvenssit, joiden kol-5 miulotteiset rakenteet tunnetaan. Tietokannasta etsitään aminohapposekvenssiehdokkaita, jotka ovat ulottuvuudeltaan samanpituisia kuin ketjujen välinen sidottava alue. Sitten peptidiehdokkaiden suunta ja orientaatio tarkistetaan. Algoritmi olettaa, että nämä peptidit säilyttävät saman pi-10 tuuden ja orientaation riippumatta niiden viereisistä alueista.
Ladner, W088/06601, esittää hypoteettisen lähestymistavan dimeeristen repressoriproteiinien "pseudodimee-risten" analogien valmistamiseksi. Olennaisesti, aminohap-15 polinkkerisekvenssiä käytetään muuttamaan dimeerinen molekyyli yhdeksi ketjuksi. Ladner*in mukaan tämä linkkerisek-venssi voidaan suunnitella suoraan US-patentin 4 704 692 menetelmän mukaisesti; vaihtoehtoisesti linkkerisekvenssiä koodittava DNA on sattumanvaraisen emäsjärjestyksen sisäl-20 tävä oligonukleotidi ja in vivo -selektiota käytetään löytämään sellainen pseudodimeeri, jonka linkkerisekvenssi sallii molekyylin laskostumisen oikein ja sitoutumisen sekvenssispesifisesti DNA:hän.
Hallewell et ai., J. Biol. Chem., 264: 5260 - 68 25 (1989) valmistivat CuZn-superoksididismutaasin analogin.
• · · * Kukin dismutaasimolekyyli on kahden samanlaisen alayksikön • · ... dimeeri; kupari-ioni ja sinkki-ioni ligandoidaan alayksik- • · · *·* ’ köön. Dimeeri-interaktio CuZn-superoksididismutaasissa on niin vahva, että alayksiköitä ei ole saatu erotettua inak- • · · ·...· 30 tivoimatta entsyymiä. Entsyymi on konformaatioltaan mer- • · · :...ί kittävän samanlainen immunoglobuliinien kanssa; Hallewell .:. et ai. liittivät kaksi ihmisen superoksididismutaasigeeniä joko suoraan tai sellaisen DNA:n välityksellä, joka koo- « · dittaa ihmisen immunoglobuliini IgAl:n 19-jäännöksen pi- 1 *·· 35 tuista sarana-aluetta ja ekspressoivat fuusioituja geenejä « « · • ♦ • « ««« 14 105104 transformoidussa isännässä. Kun yritettiin ekspressoida suoraan liitettyjä geenejä, tapahtui rekombinaatiota, joka poisti yhden peräkkäin olevista geeneistä joistain plasmi-dimolekyyleistä. Hallewell et ai. olettivat, että suora 5 liitos väänsi dimeeriä niin, että se aiheutti hydrofobisten alueiden esiintuloon, jolla sitten oli myrkyllinen vaikutus. Tämä olisi muodostanut selektiopaineen, joka suosi geenideleetiota. Mitään rekombinaatiota ei havaittu IgAl-linkkerirakenteen suhteen.
10 Valitettavasti ei voida olettaa, että peptidilink- kerisekvenssin sisältävä pseudodimeerinen fuusioproteiini laskostuu sopivasti niin, että se olisi toiminnallisesti samanlainen kuin sen emoheterodimeeri.
G. Liukoisten proteiinien ekspressio 15 Yritykset tuottaa heterologisia proteiineja trans formoiduissa soluissa johtaa joskus osan tai koko proteiinin saostumiseen liukenemattomina inkluusiokappaleina, jotka tunnetaan myös valoa taittavina kappaleina. Katso esim. Paul et ai., Eur. J. Cell Biol., 31: 171 - 174 20 (1983) (ihmisen proinsuliini/E. coli -bakteerin trpE-fuu- sioproteiini); Denefle et ai., Gene, 56: 61 - 70 (1987) (angogeniini); Langley et ai., Eur. J. Biochem., 163: 313 - 321 (1987) (naudan kasvuhormoni); Petrov et ai.,
Biology of the Cell, 61: 1-4 (1987) (kalsitoniini); 25 Richardson et ai., Biochim. Biophys. Acta, 950: 385 - 94 *** · (1988) (risiinin B-ketju); Davis et ai., Biochemistry, 26: 1322 - 26 (1987) (kasvaimen nekroositekijä); Lee et ai., ··· *.* * Biochim. Biophys. Res. Commun., 151: 598 - 607 (1988) (gamma-interferoni); Meng et ai., J. Chromatogr., 443: 30 183 - 92 (1988) (somatomediini C); Tsuji et ai., Biochem- :***; istry, 26: 3129 - 34 (1987) (interleukiini-2). Termi "va- • · · *:> loa taittava" viittaa kykyyn havaita nämä kappaleet faasi- kontrastimikroskoopilla. Tavallisesti tällä liukenematto-’··/' maila proteiinilla on ainoastaan pieni osa odotetusta bio- : *.. 35 logisesta aktiivisuudesta jäljellä johtuen ehkä väärästä « · · 4 · • · « » · is 105104 laskostumisesta. On ehdotettu, että inkluusiokappaleet muodostuvat, kun osittain laskostuneet proteiinimolekyylit reagoivat toistensa kanssa nopeammin kuin ne voivat las-kostua niiden luonnolliseen aktiiviseen konformaatioon.
5 Kruger et ai., Biopharm, 40 (maaliskuu 1989); Haase-Pet-tingell ja King, J. Biol. Chem., 263; 4977 - 83 (1988). "Tekijät, jotka ottavat osaa inkluusiokappaleiden muodostumiseen rekombinanttibakteereissa, jäävät epäselviksi eikä ole helppoa ennustaa uuden E. coli-bakteerissa ekspres-10 soidun eukaryoottisen geenin tuotteen fysikaalista tilaa". Petrov, supra.
Samalla, kun näiden inkluusiokappaleiden muodostus johtaa rekombinanttiproteiinin rikastumiseen ja on näin ollen joskus toivottavaa, se myöskin tekee tarpeelliseksi 15 aggregaattien liuottamisen ja proteiinin biologisen aktiivisuuden uudelleen muodostuksen. Petrov, supra sivulla 4 oleva selittävä huomautus, "joskus nämä esteet tuntuvat olevan kriittisimpiä kohtia yhdistelmä-DNA-teknologiassa" .
On tehty yrityksiä liuottaa ja renaturoida näitä 20 proteiineja. Wetzel, US-patentti 4 599 197; Builder, US-patentti 4 620 948; Olson, US-patentti 4 511 503; Jones, US-patentti 4 512 922. Sellaiset yritykset voivat kuitenkin olla työläitä ja onnistumisensa suhteen epävarmoja. Katso Giantini ja Shatkin, Gene, 56; 153 - 160 (1987).
25 Kuten Weir ja Sparks, Biochem. J., 245: 85 - 91 (1987) • · · **' l ovat maininneet, "proteiinit vaihtelevat merkittävästi renaturaation optimiolosuhteiden suhteen; erilaiset teki- • · · *·* * jät, kuten pH, suolakonsentraatio ja -tyyppi, denaturoivan aineen poistonopeus, kohdeproteiinin ja kontaminanttien • · · 30 konsentraatiot voivat vaikuttaa suuresti autenttisen pro- ··· teiinin saamiseen". Nämä ongelmat vältetään, jos haluttu proteiini ekspressoidaan liukoisessa muodossa.
Gatenby et ai., Eur. J. Biochem., 168: 227 - 31 • · *" (1987) ovat keskustelleet vaikeuksista, joitä kohdataan • · • ’·· 35 valmistettaessa korkeamman kasvin ribuloosi-bisfosfaatti- « · « ·
I · I
105104 16 karboksylaasientsyymiä. Tämän entsyymin alayksikkörakenne on L8S8, jossa L on suuri alayksikkö ja S on pieni alayksikkö. Luonnossa sitova proteiini ilmeisesti pitää L-ala-yksikön liukoisessa muodossa ennen sen kokoamista S-alayk-5 sikön kanssa. Yrityksiä koota aktiivinen korkeamman kasvin RuBPCaasi-entsyymi E. coli -bakteerissa on estänyt liukenemattoman inaktiivisen L-alayksikköaggregaatin muodostuminen.
H. Ihmisen alfa- ja beeta-globiinien bakteerieks- 10 pressio
Nagai ja Thorgerson (Nature, 309: 810 - 812, 1984) ekspressoivat E. coli -bakteerissa hybridiproteiinia, joka sisälsi lambda cll-proteiinin 31 aminopään jäännöstä, Ile-Glu-Gly-Arg-linkkerisekvenssin ja ihmisen täydellisen bee-15 ta-globiiniketjun. He katkaisivat hybridin juuri linkkeri-sekvenssin jälkeen veren hyytymistekijällä Xa näin vapauttaen beeta-globiiniketjun. Myöhemmin Nagai et ai., PNAS (USA), 82: 7252 - 55 (1985) ottivat yhdistelmä-DNA-mene-telmällä saadun ihmisen beeta-globiinin, luonnollisesta 20 lähteestä peräisin olevan alfa-globiinin ja hemiryhmän lähteen ja onnistuivat tuottamaan ihmisen aktiivisen hemoglobiinin. Koska alfa-globiini oli peräisin erytrosyyteistä, lopullinen tuote voi sisältää ei-toivottavia erytro-syyttimebraanin osia.
; 25 Sen jälkeen julkaistiin tehokas bakteeriekspressio- • · · systeemi ihmisen alfa-globiinille. Julkaisu GB 8711614, • · ... joka on rekisteröity 16.5.1987; katso haettavana oleva • · · *·* * sarjanumero 07/194 338 ja W088/09179. Tämä johti ihmisen kokonaan synteettisen hemoglobiinin tuottoon niin, että *...* 30 liukenemattomat globiinialayksiköt ekspressoitiin erillään :...: erillisissä bakteerisolulinjoissa ja ketjut laskostettiin .:. uudelleen in situ hemiryhmän hapettuneen kofaktorin kanssa * ' ’1 .·>·, saaden tetrameerinen hemoglobiini. Tämä menetelmä on työ- läs ja saannoltaan matala. Se vaatii denaturoivien liuot-' '·· 35 timien (urean ja guanidiinin) käyttöä ja ferri-ionin ke- 17 105104 mlallisen pelkistyksen ferroionitilaan (katso esimerkki). Yksi esillä olevan keksinnön aihe on päästä eroon näistä haitoista.
Samalla, kun ihmisen alfa- Ja beeta-globiinine-5 Ja voidaan ekspressoida erillään E. coli -bakteerissa, Walder, Proceedings, Biotech USA 1988 (San Francisco, 14. - 16.11.1988) varoittaa sivulla 360, "eristetyt alfa-Ja beeta(globiini)ketjut ovat epästabiileja Ja pyrkivät saostumaan". Jos ihmisen alfa- Ja beeta-globiinineja ei 10 tuoteta liukoisessa muodossa, ne täytyy liuottaa denaturoivilla aineilla Ja sitten laskostaa uudelleen aktiivisuuden takaisin saamiseksi. Lisäksi, kun villityypin alfa-globiinigeeniä ekspressoidaan E. coli -bakteerissa, alfa-globiini akkumuloituu ainoastaan hitaasti. Ei ole varmaa, 15 johtuuko tämä epätehokkaasta translaatiosta vai isännän proteaasien toiminnasta, mutta WO 88/09179 esittää, että tämä ongelma voidaan ratkaista fuusioimalla lyhyt alue beeta-globiinigeenistä alfa-globiinigeeniin niin, että tuotetaan hybridiproteiini. Tämä hybridiproteiini täytyy 20 sitten katkaista esim. proteaasilla globiinin vapauttamiseksi. Jos proteaasi ei ole täysin selektiivinen (johtuen ehkä muiden proteaasien kontaminaatiosta), haluttu katka!-sutuote ei ehkä ole ainoa saatu. Joka tapauksessa se tuote pitää erottaa muista E. coli -bakteerin polypeptideistä ja 25 kaikista proteaasiin liittyvistä kontaroinanteista.
• « · *'* I Kaskelotin myoglobiinia on ekspressoitu E. coli -bakteerissa, joka osoittaa, että bakteerit voivat sisäl- « · « *·* ‘ lyttää prosteettisia hemiryhmiä sellaiseen proteiiniin, joka ekspressoidaan kloonatusta eukaryoottisesta geenis- • · · 30 tä. Springer ja Sligar, PNAS (USA) 84: 8961 - 65 (1987).
• · ·
Walder sanoo, "jää nähtäväksi, voidaanko hemoglobiinia valmistaa samalla tavalla, jos sekä alfa- että beetaketjut "··. ekspressoidaan samassa solussa". Samalla, kun myoglobiinin • · (yksiketjuinen proteiini) ja erillisten alfa- ja beeta- • · 1 ’·· 35 globiinialayksikköjen välillä on korkea tertiaarirakenteen • · · • · • · • · · 18 105104 samankaltaisuustaso, hemoglobiini on heterotetrameerinen proteiini, primaarisilla globiinisekvensseillä ei ole kuin 27 % homologia ja myoglobiinilla tiedetään nyt olevan merkittävästi suurempi stabiilisuus kuin sekä alfa- että bee-5 ta-globiinilla. Näin ollen ei voida ennustaa, että alfa-ja beeta-globiinin yhteisekspressio samassa solussa johtaisi toimivan hemoglobiinin kokoamiseen solun sisässä, joka toimiva hemoglobiini vaatii sopivan alfa- ja beeta-ketjujen laskostumisen ja hemiryhmän sisällyttämisen.
10 1. Ihmisen geenin ekspressio hiivassa, yleistä
Useita ihmisen proteiineja on ekspressoitu transformoiduissa hiivasoluissa, erikoisesti Saccharomyces ce-revisiae -kannassa, joko sytoplasmisesti tai erittämällä viljelyalustaan. King et ai., Biochem. Soc. Transac., 16: 15 1083 - 1086 (1988). Mutta onnistuminen ei ole taattu. Thim et ai., FEBS Lett., 212: 307 - 312 (1987) kokivat vaikeuksia oikein yhteenliittyneen insuliinin saamisessa hiivasoluista, joihin oli insertoitu koskematon proinsuliinia koodittava geeni. He ratkaisivat tämän ongelman rakenta-20 maila modifioidun proinsuliinigeenin, joka kooditti B- ja A-ketjuja, jotka oli liitetty yhteen heksapeptidikäsivar-rella. Tämän geenin tuote katkaistiin ja kaksi ketjua las-kostuivat ja liittyivät yhteen oikealla tavalla solujen toimesta.
. 25 Richardson et ai., Biochim. Biophys. Acta, 950: k m m *** 1 385 - 94 (1988) ekspressoivat heterodimeerisen risiinipro- I./ teiinin B-ketjua E. coli -bakteerissa. He julkaisivat, et- • t · *1 1 tä oli vaikeaa saada aikaan hiivan alfa-tekijän "leader"- sekvenssi/risiini B-ketju -fuusioproteiinin korkean tason M» 30 eritys. Mitään yrityksiä ei tehty risiinin A- ja B-ketju- ·· · jen yhteisekspressoimiseksi ja kokoamiseksi.
]·. Murakami et ai., DNA, 6: 189 - 97 (1987) julkaisi- * vat hemiä sisältävän fuusioentsyymin tuoton transformoi- a a '1' duissa hiivasoluissa.
« < • « • «« aa • · • · « · · 19 105104
Horwitz et ai., PNAS (USA), 85: 8678 - 82 (marraskuu 1982) kuvasivat sellaisten hiivakantojen valmistuksen, jotka erittävät toimivia kimeerisiä hiiren variaabelialue/ ihmisen IgGl vakioalue -vasta-aineita viljelyalustaan. He 5 kuvaavat julkaisuaan ensimmäiseksi julkaisuksi, jossa eritetään vierasta multimeeristä tai heterodimeeristä proteiinia hiivassa. Mutta katso myös Carlson, Mol. Cell. Biol., 8: 2638 - 46 (kesäkuu 1988), joka esittää raskas-ja kevytketjujen cDNArden transkription ja translaation 10 polypeptideiksi, jotka yhtyvät ja sitoutuvat antigeeniin.
Beggs et ai., Nature, 283: 835 (1980) yrittivät ekspressoida kanin kromosomaalista beeta-globiinigeeniä S. cerevisiae -kannassa. Nämä hiivasolut eivät kuitenkaan kyenneet silmukoimaan oikein intronin sisältävää globiinin 15 mRNA-transkriptia.
Mitään myönnytyksiä ei ole tehty, että mitkään tässä lainatut viitteet olisivat alan prioriteetteja. Työn kuvaus ja julkaisupäivämäärän lainaus perustuvat ainoastaan julkaistuihin tietoihin ja patentinhakijat varaavat 20 oikeuden kysyä näiden tietojen tarkkuutta.
Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön aiheena on ratkaista edellä maini-... tut alan aiempien menetelmien puutokset.
t · *·* ’ Tarkemmin ilmaistun tämän keksinnön tarkoituksena • * • « *· ” 25 on uusien välimuotojen, di-alfa-globiinin ja di-beeta- • · globiinin (ja niiden mutanttien) tuotto, joita välimuotoja • · ·.· ; voidaan ekspressoida solussa ja koota yhteen toistensa *:**: kanssa tai beeta- tai alfa-globiinin kaltaisten :*·*: polypeptidien kanssa, vastaavassa järjestyksessä, 30 hemoglobiinin kaltaiseksi proteiiniksi. Samalla, kun solun .···. sisällä tapahtuvaa kokoamista ei välttämättä vaadita, di- ♦ · alfa- ja di-beeta-globiineja voidaan pitää erikoisen • · soveltuvina toimivan hemoglobiinin solun sisällä tapah-tuvaa kokoamista varten, ko&ka esim. · di-alfa-globiinin :iti· 35 ekspressio on analoginen joissakin suhteissa kahden alfa-« · • «· • · · • · • · • · · 20 105104 globiinialayksikön solun sisällä tapahtuvalle kokoamiselle niin, että se eroaa aiemmin keskustellusta kokoamisesta siten, että yhteen liittyminen saadaan aikaan ekspressoimalla kovalenttista peptidilinkkeriä mieluummin 5 kuin alayksiköiden ei-kovalenttisella reaktiolla keskenään. Di-alfa- ja di-beeta-globiinin kaltaisia polypeptide jä voidaan ekspressoida suositeltavasti bakteerisoluissa tai hiivasoluissa.
Keksinnön mukaiselle di-alfa-globiinin ja di-beeta-10 globiinin kaltaiselle proteiinille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 ja vastaavasti 2 esitetään. Keksinnön mukaiselle yhdistelmä-DNA-molekyylille, joka koodaa alfa-globiinin kaltaista tai beeta-globiinin kaltaista polypeptidiä on tunnusomaista se, mitä 15 patenttivaatimuksessa 9 ja vastaavasti 10 esitetään.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen hemoglobiinin kaltaisen proteiinin tuottamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 14 ja vastaavasti 18 esitetään. Keksinnön mukaiselle menetelmälle toimivan linkkerin 20 määrittämiseksi on tunnusomaista se, mitä patentti vaatimuksessa 19 esitetään.
Tässä esitetään myöskin patentinhakijat ovat ... esimerkiksi saaneet aikaan tetrameerisen hemoglobiinin * ensimmäisen täydellisen ekspression ja kokoamisen soluis- " 25 sa, jotka eivät tuota hemoglobiinia luonnossa. Alan • · aiemmat työt ovat liittyneet alfa- ja beeta-globiinin • · ·.· · erilliseen ekspressioon ja niiden solun ulkopuolella ta- *:·1: pahtuvaan yhdistämiseen hemiryhmän kanssa hemoglobiinin muodostamiseksi.
30 Keskeinen ominaisuus on alfa- ja beeta-globiinin .···. kaltaisten polypept idien solun sisällä tapahtuva • · kokoaminen ja solun sisällä tapahtuva hemiryhmän sisällyt- • · täminen niin, että muodostetaan biologisesti toimiva < hemoglobiinin kaltainen proteiini. Tämä solun sisällä • · < :<t<! 35 tapahtuva kokoaminen saadaan aikaan ekspressoimalla alfa- • · • ·« · · • · • « • · 1 2i 105104 ja beeta-globiinin kaltaisia polypeptide ja samassa solussa niin, että ne laskostuvat yhteen ja sisällyttävät itseensä hemiryhmän. Tärkeä ominaisuus on liukenemattomien glo-biiniaggregaattien, erikoisesti beeta-globiinin, muodos-5 tumisen oleellinen aleneminen verrattuna siihen, joka havaitaan, kun globiineja ekspressoidaan erillään E. coli -bakteerissa tai S. cerevisiae -hiivassa. Yhteisekspressio voidaan saada aikaan geeneistä, jotka ovat kahdessa erillisessä, mutta yhteensopivassa plasmidissa samassa solus-10 sa, tai samassa plasmidissa olevasta kahdesta erilaisesta operonista tai yhdestä polykistronisesta operonista.
Yhdessä suoritustavassa alfa- ja beeta-globiinin kaltaisia polypeptidejä yhteisekspressoidaan bakteerisoluissa. Vastaavat geenit voidaan sisällyttää samaan syn-15 teettiseen operoniin (se on, niitä ohjaa yksi promoottori) tai sijoittaa erillisiin operoneihin, joissa on erilliset promoottorit (jotka voivat olla samoja tai erilaisia). Suositeltavasti alfa- ja beeta-globiinin ekspressiota tehostetaan sijoittamalla "ribosomin syöttö" -sekvenssi, 20 joka kuvataan tässä tämän jälkeen, kunkin globiinigeenin eteen. Tämä on erikoisen edullista alfa-globiinin tapauksessa, jota on vaikeampi tuottaa suurina määrinä.
... Toisessa suoritustavassa alfa- ja beeta-globiinin • · ’·1 kaltaisia polypeptidejä yhteisekspressoidaan hiivasoluis- • · • 2 25 sa. On saatu aikaan parannuksia sekä alfa-globiinin saan- • · nossa että beeta-globiinin liukoisuudessa.
• · · Näistä keksinnön näkökohdista sekä niihin liit- ·:2: tyvistä näkökohdista keskustellaan nyt yksityiskoh- taisemmin.
30 Hemoglobiinin kaltaisten proteiinien ekspressio .···. hiivassa • · m Patentinhakijat ovat havainneet, että on mahdollis- • 1 ta tuottaa ihmisen hemoglobiinia (tai sen mutantteja) hii-vassa, erikoisesti Saccharomvces cerevisiae -kannassa.
• « « : 35 Hiivan ekspressiosysteemin käyttö poistaa tarpeen erottaa · 2 • «· • · · • · • · • · · 105104 22 hemoglobiini bakteerin endotoksiineista. Olemme myös havainneet, että alfa- ja beeta-globiineja, joissa on oikea N-pään aminohappo, voidaan saada aikaan, ilman että ensin ekspressoidaan globiinia selektiivisesti katkaistavan fuu-5 sioproteiinin osana. Uskomme, että tämä johtuu siitä, että hiivan metionyyliaminopeptidaasientsyyrni kykenee poistamaan N-pään metioniinin Met-alfa-globiinista ja Met-beeta-globiinista niin, että toivottu N-pään aminohappo tulee esiin (väliini). Muutetun happiaffiniteetin sisältävien 10 mutanttien, joista on keskusteltu patentissa WO88/09179, tuotto on erikoisen mielenkiinnon kohteena. Sellaisia mu-tantteja voidaan tuottaa globiinigeenien kohdennetulla mutageneesillä, jonka jälkeen kloonataan ja ekspressoidaan hiivassa.
15 Suositeltavassa suoritustavassa ekspressiota sää dellään Mgal-gap49"-hybridipromoottorilla, joka määritellään tässä myöhemmin.
Alfa- ja beeta-globiinxgeenxen yhteisekspressxo hiivasoluissa 20 Suositeltavassa suoritustavassa alfa- ja beeta- globiinigeenit ekspressoidaan molemmat samassa hiivasolussa. Beeta-globiinigeenin ekspressio yksinään johtaa beeta- ... globiinin tuottoon suurimmaksi osaksi liukenemattomana « · * vaikeasti uutettavana proteiinina, joka muodostaa vähemmän : ** 25 kuin 2 % solun kokonaisproteiinista. Alfa-globiinigeenin • « *. 1: ekspressio yksinään johtaa alfa-globiinin tuottoon hyvin • · :.· · alhaisina tasoina (alle 0,5 % solun kokonaisproteiinista) .
*:**: Kummassakaan tapauksessa hemiryhmä ei mene proteiiniin :1·1: sisälle. Kuitenkin, kun alfa- ja beeta-globiinigeenejä 30 yhteisekspressoidaan, transformoidut hiivasolut laskosta- .···. vat alfa- ja beeta-globiiniketjut yhteen ja ottavat sisään • · .···. hemiryhmät niin, että saadaan toimiva ihmisen rekombinant- tihemoglobiini liukoisessa muodossa, joka akkumuloituu niin, että sitä on noin 10 % solun kokonaisproteiinista, • « · · t 4 · • · 23 1 05 1 04 ilman että geeneihin toimivasti liitetyissä promottoreissa tehdään mitään muutoksia.
Alfa- ja beeta-globiinigeenit voivat puolestaan olla eri plasmideissa tai samassa plasmidissa isäntäso-5 lussa.
Alfa- ja beeta-globiinigeenien polykistroninen yh- teisekspressio bakteerisoluissa
Patentinhakijat ovat translatorisesti liittäneet alfa- ja beeta-globiinigeenit pieneen "ribosomin syöttö" 10 -geeniin, joka koodittaa pientä käyttöpeptidiä, joka johtaa ribosomin suoraan halutun alfa- ja beeta-globiinin lähetin ATG-kodoniin ja näin tehostaa translaatiotehok-kuutta. He ovat myös sijoittaneet alfa- ja beeta-globiinigeenit samaan operoniin niin, että ne transkriptoidaan 15 yhdeksi polykistroniseksi mRNA-transkriptiksi. Sitten glo- biinit transloidaan erillisinä polypeptidiketjuina, jotka transformoidut solut sen jälkeen laskostavat yhteen ja lisäävät solunsisäisesti hemiryhmän muodostaen hemoglobii-nitetrameerin. Patentinhakijoiden menetelmä ratkaisee on-20 gelman, joka liittyy saostettujen alfa- ja beeta-globii-nien erilliseen puhdistukseen.
Ihmisen hetero-oligomeerisen proteiinin polykistro- ... nista ekspressiota liukoisessa aktiivisessa muodossa hete- • · ’ rologisessa isännässä ei ole aiemmin julkaistu. On erikoi- • « : ** 25 sen huomattavaa, että tämä oli nisäkkään proteiini, jota • · • · · *. ekspressoitiin prokaryoottisessa isännässä (bakteeri) . On • · ·.· · huomattava vielä lisäksi, että tämä proteiini sisältää *:**; prosteettisia ryhmiä, joka lisää edelleen vaikeuksia oi- kean translaation jälkeisen prosessoinnin saavuttamiseksi.
30 Yhdessä suoritustavassa yhteisekspressoidaan Met-
.···. FX-alfa-globiinia ja Met-FX-beeta-globiinia, joissa FX
• · .···. osoittaa "leader"-peptidiä, jossa on tunnistuskohta fakto- • · ri Xa:n katkaisuaktiivisuudelle. FX-alfa-globiini ja FX- i ..li' beeta-globiini yhtyvät muodostaen mutanttihemoglobiinin, * · · 35 jolla on reversiibeli hapen sitomisaktiivisuus vaikka sil- • · « · I M « « « « • · • · • · t 24 105104 lä on korkeampi affiniteetti hapelle kuin luonnollisella hemoglobiinilla. Vaihtoehtoisesti FX-"leader"-sekvenssi tai muu fuusioitu "leader"-sekvenssi voidaan katkaista niin, että saadaan luonnollisen Hgb:n kopio.
5 Toisessa suoritustavassa yhteisekspressoidaan Met- alfa-globiinia ja Met-beeta-globiinia. Tämä poistaa kat-kaisuvaiheen käyttötarpeen.
Kolmannessa suoritustavassa yhteisekspressoidaan des-val-alfa-globiinia ja des-val-beeta-globiinia. Luon-10 nolliset alfa- ja beeta-globiinit molemmat alkavat valii-nilla. Väliini voidaan kuitenkin korvata metioniinilla, jolla on samanlainen hydrofobisuus.
Lisäsuoritustavoissa on muutettu yksi tai useampi luonnollisten geenien kodoneista niin, että tuotetaan sel-15 lainen alfa- ja/tai beeta-globiinin kaltainen proteiini, joka eroaa ominaisuuksiltaan luonnollisista proteiineista yhden tai useamman aminohapon suhteen (insertiot, delee-tiot tai substituutiot).
Di-alfa- ja di-beeta-globiinit 20 On valmistettu uusi proteiini, di-alfa-globiini, joka sisältää kaksi alfa-globiinin aminohapposekvenssiä, jotka on kovalenttisesti liitetty yhteen peptidisidoksin ... suositeltavasti yhden tai useamman aminohapon pituisen ’·1 1 välittävän linkkerin välityksellä. Yllättävästi, nämä "ge- *' 25 neettisesti yhteenliitetyt" alfa-globiiniketjut kykenivät « « ·.1·; laskostumaan oikein ja yhdistymään beeta-globiinin ja he- • 1 ·.· · miryhmän kanssa muodostamaan toimivan hemoglobiinianalo- *:·1: gin. Termi "geneettisesti yhteenliitetty" viittaa tuotto- :1·1: menetelmään. Kaksi globiinigeenikopiota fuusioidaan yhteen 30 suositeltavasti DNA-välisekvenssin avulla, joka sekvenssi .···. koodittaa aminohappolinkkeriä niin, että rakenne suoraan • · ·'·' koodittaa haluttua di-alfa-globiinia. Termiä "analogi" • · käytetään sen vuoksi, että luonnollisessa hemoglobiinissa alfal- ja alfa2-alayksiköt ovat ei-kovalenttisesti sitou-
« I
« · • · • · · « · » · • · · 105104 25 tuneet yhteen. Di-beeta-globiinin samanlainen valmistus on myös kuviteltu.
"Geneettisesti yhteenliitettyjen" hemoglobiinien valmistus välttää ne huonot puolet, joita on kemiallisessa 5 yhteenliittämisessä. Jälkimmäinen on epätehokas ja vaatii usein hemoglobiiniliuoksen deoksigenaation ja toisen molekyylin (esim. inositoliheksafosfaatin tai 2,3-DPG:n) läsnäolon kilpailevien reaktioiden estämiseksi.
Suositeltavassa suoritustavassa di-alfa-globiini 10 ja/tai beeta-globiini sisältävät mutaatioita, jotka alentavat hemoglobiinianalogin hapen sitomisaffiniteettia liuoksessa niin, että saavutetaan kokoveren hapensitomis-ominaisuudet.
Di-alfa-hemoglobiini omaa edullisesti oleellisesti 15 pidemmän puoliintumisajan verenkierrossa kuin tavanomainen (des-val) rekombinanttihemoglobiini. Ihmisillä puoliintumisaika ylittää suositeltavasti 9 tuntia annoksella, joka on ainakin 1 mg/kg kehon painoa. Tämän voidaan odottaa vastaavan noin 3 tunnin puoliintumisaikaa rotilla, joille 20 on annettu verrattavissa oleva annos.
Di-alfa- ja di-beeta-globiineja voidaan ekspressoi-da sekä bakteereissa että hiivassa.
... Kuvioiden lyhyt kuvaus *·’ ’ Kuvio 1: Kaaviokuva sellaisten plasmidien, jotka • · • ” 25 ekspressoivat FX-alfa-globiinia (pDL II-62m), FX-beeta- • · globiinia (pDL II-10a) ja FX-hemoglobiini a (pDL II-66a) , • · ·.· · rakentamisesta.
·:**: Kuvio 2: Kaaviokuva plasmidin pDL III-la (2a), joka sisältää kaksikistronisen Des-Val-alfa-globiinigeenin Tae-30 promoottorin säätelyn alaisuudessa ja polykistronisen di- .···. alfa/beeta yhteisekspressioplasmidin pDL III-47a (2b) , • 9 X! rakentamisesta.
• · • ·
Kuvio 3: Kaaviokuva Met-alfa- ja Met-beeta-globii-nien yhteisekspressioplasmidin pDL III-13e rakentamisesta.
• · ·
I I
• « • « « 1 · « Il • · · « · • · « · « 105104 26
Kuvio 4: Oligonukleotidit synteettisten FX-alfa- ja FX-beeta-globiinigeenien rakentamiseksi. Yläjuoste kuvataan 5' - 3' suuntaan ja alajuoste 3' - 5' suuntaan.
Alueet, joilla komplementaariset synteettiset oligonukleo-5 tidit menevät päällekkäin on esitetty alueina, joilla molemmat juosteet kuvataan samankokoisilla kirjaimilla. Pstl-kohta, joka yhdistää FX-alfan ja FX-beetan, on päällekkäin menevillä alueilla oligonukleotideissa SJH I-35a ja SJH I-36b.
10 Kuvio 5: Synteettinen geeni Met-FX-alfa- ja Met-FX- beeta-globiinin ekspressoimiseksi. Alue A sisältää alfa-globiinigeenin ja alue B sisältää beeta-globiinigeenin. Faktori X:n sekvenssin ja kahden Shine-Dalgarno-sekvenssin (SD 1 ja SD 2) sijainnit molemmilla alueilla on osoitettu.
15 Valitut restriktioentsyymien tunnistuskohdat löytyvät myös. Transloitavat aminohapposekvenssit ribosomin "syöttö" -alueella ja Met-FX-alfa- ja beeta-globiinille on annettu .
Kuvio 6: FX-hemoglobiinin eluutioprofiili ja absor- 20 banssispektri.
Kuvio 7: Oligonukleotidit mutanttihemoglobiinien (eroavat aminohapposekvenssiltään tavanomaisesta hemoglo- ... biinista) rakentamiseksi.
« «
Kuvio 8: Oligonukleotidit sellaisten plasmidien, : 25 jotka eivät koodita faktori Xa:n substraatin tunnistuskoh- • · · *. 1! taa, rakentamiseksi.
• · ; Kuvio 10: Des-FX-Hgb:n hapen sitominen.
*:1·: Kuvio 11: Plasmidit pDL III-14c ja pDL III-38b.
Kuvio 12: Kuvaa sellaisen suositeltavan synteetti- 30 sen geenin sekvenssin, joka ekspressoi (des-Val)-alfa- .···. (GlyGly)-alfa-ja des-Val-beeta-globiinia. A kuvaa alueen • · .···, (EcoRI - PstI) , joka sisältää ribosomin Shine-Dalgarno- • · '11 sitoutumissekvenssit (SD 1 ja SD 2) , sekvenssin, joka eks- pressoi oktapeptidiä (Met...Glu), joka toimii kotranslato- « · · 35 risena liitossekvenssinä ja sekvenssin, joka koodittaa • · • · ·
• · I
« ·
I I
105104 27 kahta lähes identtistä alfa-globiinin kaltaista polypepti-diä ja välissä olevaa Gly-Gly-linkkeriä. Ensimmäinen alfa-globiinisekvenssi alkaa "Met-Leu"-ryhmällä, se tarkoittaa, että se sisältää keinotekoisen metioniinin eikä sisällä 5 valiinia, joka on normaalisti ensimmäinen kypsän alfa-globiinin jäännös ja jatkuu toisella jäännöksellä, joka on leusiini. Toinen alfa-globiinisekvenssi alkaa "Val-Leu"-ryhmällä juuri alleviivatun "Gly-Gly"-linkkerin jälkeen. Aloitus- ja lopetuskodonit on alleviivattu. B kuvaa analo-10 gista aluetta (PstI - Hindlll), joka sisältää koodittavan alueen des-Val-beeta-globiinille. A ja B on liitetty yhteen PstI-kohdasta niin, että ne muodostavat yhden poly-kistronisen operonin.
Kuvio 13: Kuvaa lopullisen ekspressiovektorin pDL 15 III-47a rakenteen. "PTac" on Tae-promoottori ja "ampisil-liini" on ampisilliiniresistenssigeeni. Kuvio 13a esittää plasmidin pDL III-47a Xbal-BamHI-fragmentin.
Kuvio 14: Plasmidi pSGEO.0E4.
Kuvio 15: Plasmidi pSGEl.lE4.
20 Kuvio 16: Plasmidi pDL IV-67a.
Kuvio 17: Plasmidi pJR VI-54a.
Kuvio 18: Plasmidi pDL di-alfa/beeta/beeta.
... Kuvio 19: Kaaviokuva, joka esittää eri ekspressio- « · ' vektorien rakentamisen, jotka käyttävät lambda PL-promoot- • a • “ 25 torin säätelyä eri polykistronisille globiinioperoneille.
• · *. *5 Kuvio 20: GAL-GAP-promoottorin nukleotidisekvenssi, • · ·.· · jossa on kuvattu restriktioentsyymien tunnistuskohdat.
*:*" Alue Sphl - EcoRV sisältää synteettisen GALj . 10 -sääte- lyalueen (M. Johnston ja R. Davis, 1984. Molecular and 30 Cellular Biology, 4.: 1440 - 1448) . UAS on alueella, joka .···. on numeroitu 29 - 63 tässä kuviossa. Alue EcoRV - Xbal • · .···. sisältää GAP491-geenin transkription konsensusaloitus- • · alueen, jossa transkription aloitus tapahtuu noin kohdalta i ..! 395. (L. McAlister ja M.J. Holland. 1983. J. Biol. Chem., « « a < a · « i « a • · « · « · · a • « < • · • * a · t 28 1 05 1 04 260: 15019-15027; J. Holland et al. 1983. J. Biol. Chetn. , 258: 5291-5299.)
Kuvio 21: Kaaviokuvat, jotka esittävät beeta-glo-biiniekspressiokasetin (21a ja 21b) rakentamisen.
5 Kuvio 22: Kaaviokuvat, jotka esittävät beeta-glo- biiniekspressiovektorin pGS4988 (22a) ja alfa-globiinieks-pressiovektorin pGS4688 (22b) rakentamisen.
Kuvio 23: Kaaviokuvat (23a ja 23b), jotka esittävät alfa-globiiniekspressiokasetin ja vektorien pGS289 ja 10 pGS389 rakentamisen alfa- ja beeta-globiinien yhteiseks- pressiota varten samasta plasmidista. Huomaa, että alfa-ja beeta-globiinit ekspressoidaan eri promoottoreista.
Kuvio 24: Hiivassa tuotetun rekombinanttihemoglo-biinin ja ihmisen luonnollisen hemoglobiinin absorptio-15 spektrit.
Kuvio 25: Kaaviokuva (25a), joka esittää di-alfa/ beeta-hemoglobiinin hiivaekspressiovektorin rakentamisen ja plasmidin pGS3089 kartan (25b).
Kuvio 26: Plasmidin pGS3089RGV des-beeta kartta.
20 Suositeltavien suoritustapojen yksityiskohtainen kuvaus
Tavanomaisen hemoglobiinin rakenne on hyvin tunnet-tu. Liitämme tässä viitteeksi koko tekstin julkaisuista • · ·;1 ' Bunn ja Forget, toim. , Hemoglobin: Molecular, Genetic and 25 Clinical Aspects (W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA: • · ·,’·1 1986) ja Fermi ja Perutz, "Hemoglobin and Myoglobin", * · ·,· · teoksessa Phillips ja Richards, Atlas of Molecular Struc- ·;·1: tures in Biology (Clarendon Press: 1981).
Polypeptidin primaarirakenne määritetään sen amino- 30 happosekvenssistä ja tunnistamalla kaikki yksittäisten ,···. aminohappojen sivuketjujen modifikaatiot.
• · V.\ Noin 92 % normaalin aikuisen hemolysaatista on Hgb • · • · Ί' A:ta (merkitään alfa2 beeta2, koska se sisältää kaksi ai- « fa- ja kaksi beetaketjua) . Alfaketju sisältää 141 amino-ί1^: 35 happoa (katso kuvio li). Hemiryhmän (ferroprotoporfyriini • · • · · 1 • · » · • « · 29 105104 IX) rauta-atomi on sitoutunut kovalenttisesti his 87 jäännöksen ("proksimaalinen histidiini") imidatsoliryhmään. Beetaketju on 146 jäännöksen pituinen (katso kuvio 12) ja hemiryhmä on sitoutunut siihen kohtaan his 92.
5 Muut tunnistetut hemoglobiinilajit ovat Hgb A2 (o2 «2 δ2) , Hgb Ala, Hgb Alb ja Hgb Alc kuin myös harvinaiset lajit Hgb F (a2 gamma2) , Hgb Gower-l (zeeta2 epsilon2) , Hgb Gower-2 (o2 epsilon2), Hgb Portland (zeeta2 gamma2) ja Hgb H (beeta4) ja Hgb Bart (gamma1) . Ne eroavat Hgb A:sta eri-10 laisella polypeptidiketjujen valikoimalla.
Polypeptidiketjujen alueet voidaan stabiloida laskostamalla ne toiseen kahdesta yleisestä konformaatiosta, alfa-heliksiksi ja beeta-levyksi. Luonnollisessa tilassaan noin 75 % henoglobiinimolekyylistä on alfa-helik- 15 simuodossa. Alfa-heliksialueet on erotettu toisistaan alueilla, joissa ketju on vähemmän laskostettu. On tavallista tunnistaa kunkin ketjun alfa-helikaaliset alueet kirjaimilla, esim. alfaketjun proksimaalinen histidiini on F8 (heliksin F jäännös 8). Ei-helikaaliset alueet tunnis-20 tetaan kirjainpareilla, jotka osoittavat, mihin helikaali-siin alueisiin ne liittyvät. Näin ollen, ei-helikaalinen alue BC sijaitsee heliksin B ja heliksin C välissä. Kun • · · verrataan tietyn hemoglobiiniketjun kahta muunnosta, voi • « : “ olla valaisevaa yrittää asettaa helikaaliset alueet alek- • · Ί 25 käin yritettäessä löytää rakennehomologioita. Ihmisen ta-:.· : vanomaisen hemoglobiini A^n alfa- ja beetaketjujen amino- *52ί happosekvenssin ja helikaalijäännösten merkintätapaa var- ten katso julkaisua Bunn ja Forget, supra. ja tässä olevaa taulukkoa 1.
.···. 3 0 Hemoglobiinimolekyylin tertiaarirakenne viittaa .···. niiden aminohappojäännösten eteerisiin suhteisiin, jotka • · Ί1 jäännökset sijaitsevat kaukana toisistaan lineaarisessa sekvenssissä, kun taas kvaternaarinen rakenne viittaa ta- • I « paan, jolla alayksiköt (ketjut) ovat pakkautuneet yhteen.
:·. 35 Hemoglobiinimolekyylin tertiääri- ja kvaternaarirakenne on • · · · · • · • · 2
«M
30 1 05 1 04 erotettu hemoglobiinikiteiden röntgendiffraktioanalyysil-lä, joka sallii molekyylin kaikkien atomien kolmiulotteisen kohdan laskemisen.
Oksigenoimattomassa ("deoksi"- tai "T"-, joka tar-5 koittaa "jäykkää"-muotoa) muodossaan hemoglobiinin alayksiköt (alfal, alfa2, beetal ja beeta2) muodostavat tetra-hedronin, jolla on kaksinkertainen symmetria-akseli. Akseli kulkee veden täyttämässä "keskusonkalossa". Alayksiköt reagoivat toistensa kanssa Van Der Vaals'in voimien, 10 vetysidosten ja ioni-interaktioiden {tai "suolasiltojen") välityksellä. Alfalbeetal- ja alfa2beeta2-pinnat pysyvät suhteellisen liikkumattomina oksigenaation aikana. Päin-vastaisesti alfalbeeta2-pinnalla (ja alfa2beetal) on huomattavaa liikkumista. Oksigenoidussa ("oksi"- tai "R", 15 joka tarkoittaa "vapautunutta" muotoa) muodossa alayksikköjen väliset etäisyydet suurenevat.
Luonnollisen oksihemoglobiinin ja deoksihemoglobii-nin tertiääri- ja kvaternaarirakenteet on riittävän hyvin tunnettuja niin, että lähes kaikki atomit vetyatomeita 20 lukuunottamatta voidaan sijoittaa 0,5 Ä tarkkuudella tai tarkemmin. Ihmisen deoksihemoglobiinia varten katso Fermi ... et ai., J. Mol. Biol., 175: 159 (1984) ja ihmisen oksihe- ];1 moglobiinia varten katso Shaanan, J. Mol. Biol., 171: 31 : " (1983), jotka molemmat on lisätty tähän viitteiksi.
t · 25 Samalla, kun hemoglobiinirakenteen analyyseillä on • · ·.· · taipumus keskittyä alfa-beeta pinnoille, tiedetään, että ·:2: yhden alfa-alayksikön aminopään ja toisen alayksikön kar- :1·1: boksipään välimatka on noin 5,6 Ä deoksimuodossa ja 3,3 Ä • oksimuodossa.
.···. 30 Tässä yhteydessä hemoglobiinin kaltainen proteiini • · on happea sitova proteiini, jossa on useita prosteettisia • · "1 hemiryhmiä ja jonka PS0-arvo on ainakin noin 0,8 kPa (eli 6 torria, kun mitataan, kuten US-patentin 5 028 588 I I · :<ι§: taulukkoa 1 varten) ja joka koostuu useista polypeptideis- 35 tä, joista kukin on ihmisen alfa- (tai di-alfa) globiinin • 1 · · · • t • · 2 • · · 31 105104 kaltainen tai ihmisen beeta- (tai di-beeta) globiinin kaltainen polypeptidi. Ihmisen alfa-globiinin kaltainen polypeptidi on luonnollinen ihmisen alfa-globiini tai sen mutantti, joka eroaa luonnollisesta sekvenssistä yhden tai 5 useamman susbtituution, deleetion tai insertion suhteen samalla, kun siinä on jäljellä ainakin 75 % homologiaa ihmisen alfa-globiinin kanssa ja joka edelleen kykenee ottamaan sisäänsä hemiryhmän ja liittymään yhteen beeta-globiinin kanssa. Beeta-globiinin kaltainen alayksikkö 10 määritellään samoin. Eläinten hemoglobiinien tai niiden mutanttien alayksiköt, jotka ovat riittävän homologisia ihmisen alfa- tai beeta-globiinille, sisällytetään termiin "ihmisen alfa- tai beeta-globiinin kaltainen polypeptidi". Esimerkiksi naudan hemoglobiinin alayksiköt kuuluvat 15 näiden termien piiriin. Alfa- ja beeta-globiinin kal taisiin polypeptideihin voidaan viitata yhteisesti nimellä "globiinit".
Tässä yhteydessä di-alfa-globiinin kaltainen polypeptidi on sellainen, joka sisältää oleellisesti kaksi 20 alfa-globiinin kaltaista polypeptidisekvenssiä peptidisi-doksilla yhteen liitettynä ensimmäisen alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin normaalin C-pään ja toisen alfa- ♦ ♦ *·* * globiinin kaltaisen polypeptidin normaalin N-pään väliltä.
i *·· Nämä kaksi sekvenssiä voivat olla suoraan yhteen • · *·/·· 25 liitettyjä tai liitettyjä yhden tai useamman aminohapon : pituisen peptidilinkkerin välityksellä. Tähän ei sisäl- ·;··· lytetä sellaisia alfa-globiiniketjuja, jotka on liitetty yhteen N- ja C-päistä muilla keinoin kuin peptidisidoksil-la (esim. DIDS:llä). Di-alfa-globiinin kaltaisen poly-3 0 peptidin täytyy kyetä laskostumaan yhteen beeta-globiinin • ♦ IV. kanssa ja ottamaan sisäänsä hemiryhmä muodostaakseen toi- • · *···* mi van hemoglobiinin kaltaisen proteiinin. Di-beeta-globii- nin kaltainen polypeptidi määritellään samoin. Di-alfa- ja di-beeta-globiinin kaltaisiin polypeptideihin voidaan vii- « · • * • · • · · 32 1 05 1 04 tata yhteisesti nimellä "pseudodimeeriset globiinin kaltaiset polypeptidit".
"Met-FX-alfa-globiini" on alfa-globiinin kaltainen polypeptidi, joka sisältää N-pään metioniinin, olidopep-5 tidin, joka toimii faktori Xa:n tunnistuskohtana (esim. Ile-Glu-Gly-Arg) ja alfa-globiinin kaltaisen sekvenssin (esim. Val-His-Leu-Thr-Pro...), joka voi vastata villityy-pin alfa-globiinin tai sen tässä kuvatun mutantin sekvenssiä. Termi "Met-FX-alfa-globiini" lyhennetään joskus ni-10 meksi "FX-alfa-globiini". "FX-beeta-globiini" on vastaavalla tavalla määritelty beeta-globiinin kaltainen polypeptidi .
"Met-alfa-globiini" on alfa-globiinin kaltainen polypeptidi, jolla on ylimääräinen N-pään metioniini. Toi-15 nen aminohappo on väliini, joka on ensimmäinen aminohappo kypsässä villityypin alfa-globiinissa. Met-beeta-globiini on määritelty samoin. "Des-FX-alfa-globiini"-geeni (tai "des-FX-beeta-globiini") on Met-alfa-globiinigeeni, joka saadaan katkaisemalla FX-kodonit pois Met-FX-alfa-globii-20 nigeenistä. Huomaa, että termiä "Met-Hgb" käytetään viittaamaan metionyyli-Hgb:hen, joka muodostuu metionyyli-al- ... fa-globiinista ja metionyyli-beeta-globiinista.
• » "Des-Val-alfa-globiini" (tai "dVal-alfa-globiini") • ” on alfa-globiinin kaltainen polypeptidi, jossa metioniini .**: 25 on korvattu valiinilla, joka aloittaa kypsän villityypin • m :.·· alfa-globiinin sekvenssin. Des-Val-beeta-globiini on mää- *:**: ritelty samoin. Des-Val-alfa/alfa-globiini (di-des-Val- :*·*: alfa-globiini) on "di-alfa-globiini", jossa "Des-Val-al- fa"-sekvenssi on liitetty sopivan peptidilinkkerin väli- .··. 30 tyksellä alfa-globiinin kaltaiseen sekvenssiin, joka alkaa • · ··· valiinilla.
• · • · '!* Alfa- ja beeta-globiinin kaltaisten ketjujen ei .,// tarvitse vastata täsmällisesti "tavanomaisen" hemoglobii- nin alfa- ja beeta-globiinien sekvenssejä. Mieluummin voi-:·, 35 daan sisällyttää mutaatioita, jotka muuttavat hemoglobii- 33 1 05 1 04 nin happiaffiniteettia tai stabiilisuutta tai jotka helpottavat yksittäisten ketjujen ekspressiota ja kokoamista. Esimerkin valossa, ei rajoittavassa mielessä, on valmistettu useita mutanttihemoglobiineja tämän keksinnön mukai-5 sella menetelmällä. Oppaana lisämutaatioiden tekemiselle toimii US-patentti 5 028 588, joka on liitetty tähän viitteeksi .
DNA-sekvenssit, jotka koodattavat yksittäisiä alfa-(tai di-alfa) ja beeta- (tai di-beeta) globiiniketjuja, 10 voivat olla alkuperältään genomisia, cDNA:ta tai synteettisiä tai niiden yhdistelmiä. Koska genomiset globiinigee-nit sisältävät introneita, genomista DNA:ta täytyy joko ekspressoida isännässä, joka kykenee silmukoimaan oikein esilähetti-RNA:n, tai se täytyy modifioida poistamalla 15 intronit. Ainakin osittain synteettisen geenin käyttö on suositeltavaa monista syistä. Ensiksi, kodonit, jotka koodattavat haluttuja aminohappoja, voidaan valita siten, että saadaan sekvenssiin sopiviin kohtiin yksittäisiä tai lähes yksittäisiä restriktioentsyymien tunnistuskohtia 20 näin tehostaen sekvenssin nopeaa muuttamista kasettimuta-geneesillä. Toiseksi, kodonien valinta voidaan tehdä niin, ... että optimoidaan ekspressio valitussa isännässä. E. coli • · * -bakteerin kodonien käyttöä varten katso Königsberg et • ai., PNAS, 80: 687 - 91 (1983). Hiivan kodonien käyttöä • · ·.*·: 25 varten katso seuraava osa. Lopuksi, lähetti-RNA-transkrip- • · ·.· · tin muodostamat sekundaarirakenteet voivat häiritä trans- • _ *:**! kriptiota tai translaatiota. Jos näin on, nämä sekundaari- rakenteet voidaan poistaa muuttamalla kodonivalintoja.
Tietysti, jos käytetään linkkeriä alayksikköjen ge- .···. 30 neettiseksi yhteenliittämiseksi, linkkeriä koodittaa nor- • · .···. maalisti synteettinen DNA. Samalla, kun di-alfa-globiinia • · *** ja beeta-globiinia voidaan ekspressoida erikseen ja sitten yhdistää toisiinsa ja hemiryhmään in vitro, ne sijoitetaan suositeltavasti yhteen plasmidiin.
• « • t « « · · • · • · · 34 105104
Esillä oleva keksintö ei ole rajoittunut minkään tietyn isäntäsolun, vektorin tai promoottorin käyttöön. Suositeltavat isäntäsolut ovat kuitenkin bakteeri- (erikoisesti E. coli) ja hiivasoluja (erikoisesti S. cerevi-5 siae). Valitun promoottorin täytyy olla toimiva halutussa isäntäsolussa. Se on suositeltavasti indusoitava promoottori, joka induktion aikana saa aikaan korkean transkrip-tionopeuden. Suositeltava bakteeripromoottori on Tac-pro-moottori, tm/lac-hybridi. jonka on täysin kuvannut 10 DeBoer, US-patentti 4 551 433, ja joka on kaupallisesti saatavissa Pharmacia-LKB'Itä. Muut promoottorit, joita voidaan käyttää, sisältävät lämpöherkät lambda PL- ja PR-promoottorit kuin myös lac-, trp-, trc-, pIN- (lipopro-teiinipromoottorin ja lac-operaattorin hybridi), gal- ja 15 lämpöshokkipromoottorit. Käytetyn promoottorin ei tarvitse olla identtinen minkään luonnollisesti esiintyvän promoottorin kanssa. Neuvoja promoottorien suunnittelemiseksi on annettu sellaisissa promoottoritutkimuksissa, kuten Harley ja Reynolds, Nucleic Acids Res., 15: 2343 - 61 (1987) ja 20 siinä lainatuissa papereissa. Promoottorin sijainti suhteessa ensimmäiseen rakennegeeniin voidaan optimoida. Katso Roberts et ai., PNAS (USA), 76: 760 - 4 (1979). Yhden • · ’·* ' promoottorin käyttö on suositeltavaa. Sopivat hiivaeks- • · 1 '·* pressiosysteemit on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla • · :.*·· 25 tässä patenttihakemuksessa.
• · : Käytetyn vektorin täytyy olla sellainen, jossa on ·;·*: replikaation aloituskohta, joka toimii isäntäsolussa. Sii- nä on suositeltavasti myös yksittäisiä restriktioentsyy- mien tunnistuskohtia globiinigeenien ja haluttujen sääte- e···. 30 lyalueiden insertiota varten ja tavanomainen selektiomerk- • · kigeeni. Vektoria voidaan modifioida niin, että siihen li- • · *** sätään tai siitä poistetaan restriktioentsyymien tunnis- ^‘5’ tuskohtia sen tekemiseksi sopivammaksi lisämanipulaatioil- : : le.
35 105104
Alfa- ja beeta-globiiniketjuja voidaan ekspressoida joko suoraan tai osana fuusioproteiineja. Kun ekspressoi-daan fuusioproteiineina, jälkimmäinen voi sisältää kohdan, josta ne voidaan katkaista vapauttaen alfa- ja beeta-glo-5 biinit ylimääräisestä polypeptidistä. Jos näin, voidaan lisätä faktori Xa entsyymille herkkä kohta, kuten ovat esittäneet Nagai ja Thorgenson, EP-patenttihakemus 161 937, joka on liitetty tähän viitteeksi. Vaihtoehtoisesti alfa- ja beeta-fuusioproteiinit voidaan syntetisoi-10 da, laskostaa ja liittää hemiryhmä saaden hemoglobiiniana-logi.
Alfa- ja beeta-globiinialayksikköjen suora ekspres-sio on suositeltavaa. Faktori Xa on verijohdannainen. Sen vuoksi faktori Xa:n valmisteet voivat sisältää ei-toivot-15 tavia vereen liittyviä aineita tai etiologisia aineita. Joka tapauksessa hemoglobiini täytyy erottaa faktori Xa:sta.
Nagai ja Thorgerson, EP-patenttihakemus 161 937, joka on liitetty tähän viitteeksi, esittävät fuusiogeenien 20 rakentamisen, jossa juuri ennen haluttua polypeptidiä koodi ttavaa DNA:ta sijaitsee DNA, joka koodittaa faktori Xa:n, joka on seriiniproteaasi, katkaisukohtaa. Jotkin ·.·1 · tietyt peptidisekvenssit, jotka faktori Xa katkaisee, on • 1·· esitetty alla (joissa katkaisukohtaa merkitään merkillä 25 " = ") : • Ile-Glu-Gly-Arg=Val-His-Leu-Thr CII FxB-globiini • · · ·
Ile-Glu-Gly-Arg=Thr-Ala-Thr-Ser ihmisen protrombiini
Ile-Glu-Gly-Arg=Thr-Ser-Glu-Asp naudan protrombiini • · ·
Ile-Asp-Gly-Arg=Ile-Val-Glu-Gly ihmisen protrombiini ... 30 Ile-Glu-Gly-Arg=Ile-Val-Glu-Gly naudan protrombiini • ·
Ala-Glu-Gly-Arg=Asp-Asp-Leu-Tyr ihmisen antitrombiini
:···! III
Yllä olevassa listassa "CIIFXbeeta-globiini" viit- taa hybridifuusioproteiiniin, joka sisältää lambdaCII- ..· 35 proteiinin 31 aminopään jäännöstä, faktori Xa:n tunnistus- • · « · · • · · · 36 1 05 1 04 sekvenssin "Ile-Glu-Gly-Arg" ja ihmisen beeta-globiinin täydellisen aminohapposekvenssin (joka alkaa "Val-His-Leu-Thr-..."). Tutkittaessa kuviota 4 on ilmeistä, että esimerkin 1 FX-alfa- ja FX-beeta-globiinit vastaavat luonnol-5 lista globiinia, jonka edessä on ryhmä "Met-Ile-Glu-Gly-Arg" .
Bakteerin mRNA:ssa kohta, josta ribosomi sitoutuu lähettiin, on polypuriinijakso, joka sijaitsee 4-7 emästä ylävirtaan aloituskodonista (AUG). Tämän jakson konsen-10 sussekvenssi on 5'...AGGAGG...3' ja sitä nimitetään tavallisesti Shine-Dalgarno-sekvenssiksi. Shine ja Dalgarno, Nature, 254: 34 (1975). SD-sekvenssin ja translaation aloituskodonin tarkka välimatka ja tämän välillä olevan alueen emässekvenssi vaikuttavat translaation tehokkuuteen 15 ja ne voidaan optimoida empiirisesti. Shepard et ai., DNA 1: 125 (1985); DeBoer et ai., DNA 2: 231 (1983); Hui et ai., EMBO J., 3: 623 (1984).
Lisäksi SD-sekvenssiä itseään voidaan modifioida ekspression muuttamiseksi. Hui ja DeBoer, PNAS (USA), 84: 20 4762 - 66 (1987). Sellaiset vertailevat tutkimukset ribo- somin sitoutumiskohdista, kuten Scherer et ai., Nucleic ... Acids Res., 8: 3895 - 3907 (1987), voivat antaa neuvoja • < sopivista emäsmuutoksista. Jos hemoglobiinia aiotaan eks- • · : ” pressoida muussa isännässä kuin E. coli -bakteerissa, pi- • « 25 tää muodostaa sellainen ribosomin sitoutumiskohta, jota se • « ·.· | isäntä suosii. Zaghbil ja Doi, J. Bacteriol. , 168: 1033 - •f: 35 (1986).
Voidaan käyttää mitä tahansa isäntää, joka tunnis- taa valitun promoottorin ja ribosomin sitoutumiskohdan ja .*··. 30 jolla on kyky syntetisoida ja sisällyttää hemiryhmä. Bak- • · teeri- ja hiivaisäntiä suositellaan.
% · *;* Solun sisällä koottu hemoglobiini voidaan ottaa talteen tuottavista soluista ja puhdistaa millä tahansa • · · : : alalla tunnetulla menetelmällä.
4 I t *
• I
• · • Il •
IM I
« I
«M
37 1 05 1 04
Alfa- ja beeta-globiinien polykistroninen yhteis- ekspressio ja niiden kokoaminen hemoglobiiniksi
Eräässä suoritustavassa alfa- ja beeta-globiinigee-nien ekspressiota ohjaa yksi ainoa promoottori ja geenit 5 on sijoitettu niin, että transkriptoituu polykistroninen lähetti-RNA-transkripti, josta erilliset alfa- ja beeta-globiinipolypeptidit sen jälkeen transloidaan. Tässä esitetään kuitenkin alfa- ja beeta-globiinigeenien yhteisekspressio eri promoottoreista, se tarkoittaa, että 10 isäntä transkriptoi erilliset alfa- ja beeta-globiinien lähetti-RNA:t.
Yhden promoottorin käyttöä suositaan teoreettisilla perusteilla. Ideaalisesti alfa- ja beeta-globiinia eks-pressoidaan stoikiometrisesti samat määrät. Samalla, kun 15 yhden promoottorin käyttö ei varmista saman määrän tuottoa, se poistaa yhden epätasapainottavan vaikutuksen -erot transkriptiossa, jotka johtuvat eroista promoottorien vahvuuksissa ja luoksepäästävyydessä. Jos erot promoottorien vahvuuksissa minimoitaisiin käyttämällä kahta identtistä 20 promoottoria samassa plasmidissa, plasmidin stabiilisuus alenisi, koska olisi olemassa alttius homologisten aluei-... den rekombinaatiolle. Huomautamme kuitenkin, että prelimi- '·* ' naarisissa kokeissa olemme yhteisekspressoineet alfa- ja • · • " beeta-globiineja eri promoottoreista.
• 4 25 Toinen oikeutus yhden promoottorin käytölle on rep- • 4 ·.· j ressorin sitoutumiskohtien määrän minimoiminen.
·:**: Alfa- ja beeta-globiinigeenit sijoitetaan suositel- tavasti niin, että ribosomi transloi alfa-globiinikistro- nin ensin. Perussyy on se, että on olemassa joitain perus- ,···. 30 teitä uskoa, että alfa-globiini vaikuttaa beeta-globiinin • · II! laskostumiseen. Silti geenien sijainnit voidaan muuttaa • · *1* niin, että beeta-globiini syntetisoidaan ensin, kuten on ..‘.j* esitetty esimerkissä 6.
: : Polykistronisen mRNA-transkriptin stabiilisuutta, y[ 35 sen translaatiotehokkuutta alfa- ja beeta-globiiniksi ja • 4 4 4 4 4 4 « · 4 4 4 3β 105104 globiiniketjujen laskostumista tetrameeriseksi hemoglobiiniksi voidaan modifioida vaihtelemalla kistronien välisten alueiden (alue, joka sijaitsee yhden kistronin lopetusko-donin ja seuraavan kistronin aloituskodonin välissä) pi-5 tuutta ja emässekvenssiä, vaihtelemalla toisen kistronin tahdistusta ensimmäisen kistronin suhteen ja vaihtelemalla yhden kistronin ribosomin sitoutumiskohtaa ja sekvenssiä suhteessa edeltävään kistroniin.
Suositeltavassa suoritustavassa alfa- ja beeta-10 globiinigeeniä kumpaakin edeltää lyhyt "syöttö"-kistroni tai "ribosomin syöttökistroni", joka tehostaa seuraavan globiinikistronin translaatiota. Kuviossa 4 alue A sisältää kaksi kistronia ja Shine-Dalgarno-sekvenssin ennen kumpaakin kistronia. Ensimmäinen Shine-Dalgarno-sekvenssi 15 (SD 1) sitoo ribosomin, joka sitten transloi ensimmäisen kistronin, joka on lyhyt oktapeptidiä koodittava kistroni. (Tämä kistroni on nimeltään "syöttökistroni" tai "ribosomin syöttökistroni".) Toinen kistroni on globiinigeeni, tässä tapauksessa FX-alfa-globiinigeeni. Toisen kistronin 20 tehostamiseksi tarkoitettu Shine-Dalgarno-sekvenssi (SD 2) sijaitsee todellisuudessa ensimmäisessä kistronissa. Tästä johtuen näiden kahden sanotaan olevan "translatorisesti • % '·' yhteenliitettyjä". Alue B on rakenteeltaan samanlainen, ! ’1· paitsi että toinen kistroni koodittaa FX-beeta-globiinia.
« · ·.1·· 25 A- ja B-alueiden välillä on 43 emäksen pituinen kistronien il i välinen alue. Alueiden A ja B syöttökistronit vastaavat ·;··· sen kaksikistronisen ekspressiosysteemin ensimmäistä kis- tronia, joka on nimeltään pCZ144 julkaisussa Schoner et ai., Meth. Enzymol. , 153: 401 - 16 (1987). Esillä oleva 30 menettely ei kuitenkaan ole rajoitettu erityiseen "aloitu- « · I" skistroniin", jonka Schoner et ai. ovat kuvanneet; mui- • · ’"2 takin syöttökistroneita, jotka sallivat seuraavan kistro- ‘ϊ’ nin korkean tason translaation uudelleen aloituksen, voi- • · · · ' daan käyttää.
• · · • · • · « « · · · # · • « 2 « · · 39 105104
Neuvoja kistronien välisten sekvenssien ja SD-sekvenssien sijainnin suunnittelemiseksi voidaan saada vertaamalla saman polykistronisen operonin spontaanien tai säädeltyjen mutanttien translaatiotehokkuutta, kuten ovat 5 esimerkiksi tehneet Schoner et ai., PNAS, 83: 8506 - 10 (1980). On myös mahdollista katsoa eri operoneiden kistronien välisten alueiden konsensusominaisuuksia. McCarthy et ai., EMBO J., 4: 519 - 26 (1985) ovat tunnistaneet E. coli -bakteerin atp-operonissa translaatiota tehostavan kistro-10 nien välisen sekvenssin.
Esillä olevan menettelyn on tarkoitettu alentavan tai poistavan hemoglobiinin tai sen osapolypeptidien sijoittumista inkluusiokappaleisiin. Sen mukaisesti keksinnön lisäominaisuus on se, että toimiva hemoglobiini löyde-15 tään oleellisesti (suositeltavasti yli 80 %) solun liukoisesta fraktiosta. On ilmeistä, että tämän keksinnön avulla yli 90 % toimivasta hemoglobiinista voidaan ohjata tällä tavoin, kun alfa2 beeta2 -hemoglobiini kootaan alfa- ja beeta-globiiniketjuista, jotka yhteisekspressoidaan tetra-20 kistronisesta operonista, kuten tässä on kuvattu. Di-alfa, beeta2-hemoglobiinin suhteen lähes 100 % on liukoista, kun ekspressio indusoidaan 25 °C:ssa ja vähemmän liukoinen, • · ’·1 1 kun induktio tehdään korkeammissa lämpötiloissa. Nämä pro- • · : '1 sentit heijastavat prosentteja kaikista niistä di-alfa- ja • · :.1·· 25 beetaketjuista, jotka löydetään solun liukoisesta frak- • · ϊϊί tiosta eikä todellista solusta saatua proteiinisaantoa.
• ·· · 1 *:2· Ekspressio hiivassa
Esitetyn menetelmän toinen suoritustapa koskee hemoglobiinin kaltaisten molekyylien tuottoa hiivassa.
..... 30 Suositeltava isäntämme ihmisen rekombinanttihemoglobiinin • · III ekspressiota varten hiivassa on Saccharomvces cerevisiae.
• 3 Muita home- tai hiivakantoja voidaan kuitenkin käyttää ..1·1 tähän tarkoitukseen, kuten Aspergillus- tai Pichia-kanto- ja. Jotta hiiva olisi sopiva isäntä, sen täytyy kyetä ole- .·1 35 maan transformoitavissa rekombinanttivektoreilla, joko • ·« • I · I · 2 I · 3
III
40 105104 replikoituvilla tai integroituvilla tyypeillä. Tämä sallii tutkittavan geenin halutun DNA-sekvenssin insertion. Sen täytyy myös kyetä korkeaan solutiheyteen viljeltäessä sopivassa tilavuudessa niin, että se tuottaa riittävästi so-5 lumassaa halutun geenituotteen eristämiseksi halutuista raektioastioista, joissa kasvua voidaan ideaalisesti helposti säädellä useiden parametrien avulla, jotka sisältävät ravinteen formulaation, sekoituksen ja hapen siirron ja lämpötilan. On myös toivottavaa kyetä indusoimaan pro-10 teiinisynteesin ekspressio käsittelemällä alustaa, lämpötilaa tai lisäämällä tai kuluttamalla pois tiettyjä kemikaaleja. Lopuksi, ollakseen sopiva isäntä, hiivan täytyy kyetä tuottamaan rekombinanttiproteiineja suositeltavasti niin, että niitä on yli 1 % solun kokonaisproteiinista.
15 Tämä sallii halutun rekombinanttiproteiinin helpomman eristyksen.
S. cerevisiae -kantaan viitaten mahdollisesti käytettävät haploidit kannat sisältävät seuraavat: BJY3501 Matalta pep4::HIS3 prbl-delta 1.6R his3
20 200 ura3-52 canl GAL
GSY112 Kuten yllä, mutta Leu2::HISG
GSY112 cir° Kuten yllä, mutta parannettu 2 μ plas-
• I I
·.* * midista • ’·· BJY3505 Mata pep4::HIS3 prbl-delta 1.6R HIS3 lys2- 25 208 trpl-101 ura3-52 gal2 canl
• :*: GSY113 Kuten yllä, mutta leu2::HISG
• ·· · ....: RSY330 Matalta pep4-3 prbl-1122 hist7 ura3-52 ,·;·. trpl-289 canl gall • · · BJY2168 Mata prcl-407 prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ... 30 ura3-52 • · *”·/ BJY1991 Matalta prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3-52 • · *···* RSY334 Matalta regl-501 pep4-3 prbl-1122 ura3-52 ·;· leu2-3, 112 gall RSY214 Matalta pep4-3 prbl ura3-52 « 4 « « • 4 « * * 4 « « 4 «41 41 105104 Tähän mennessä sellaiset kannat, kuten GSY112, GSY113 ja RSY334, ovat olleet parhaita hemoglobiinin tuottajia. Sellaiset kannat, kuten RSY334, joka sisältää regl-501-mutaation, voivat olla erikoisen tärkeitä, koska niis-5 sä glukoosin aiheuttama repressio ei liity galaktoosilla tapahtuvaan induktioon, joka sallii indusoimisen matalammilla galaktoositasoilla glukoosin läsnä ollessa. Koska tällä kannalla on gall-mutaatio, se ei voi metaboloida galaktoosia, joten galaktoosikonsentraatio säilyy vakiona 10 ja jatkaa toimintaansa indusoijana.
Diploidit kannat, jotka muodostetaan risteyttämällä mitkä tahansa yllä olevat yhteensopivat kannat tai samanlaiset yhteensopivat kannat, voivat myös olla käyttökelpoisia, koska niillä tuntuu olevan nopeammat kasvunopeudet 15 kuin haploideilla kannoilla.
Esimerkiksi seuraavat diploidit kannat, jotka yh-teisekspressoivat alfa (tai di-alfa) ja beeta-globiineja, on kuvattu esimerkeissä: BJY350 (pGS4988) x RSY330 (pGS4688) 20 BJY3505 (pGS4988) x BJY1991 (pGS4688) ·:·, Muita risteytyksiä voidaan samalla tavalla käyttää • · · .! esillä olevan keksinnön suorituksessa.
« · « · · *. . Kantojen, joilta puuttuvat proteaasit, käyttö voi • « « ’· / 25 myös olla edullista.
*·* · Hiivan ekspressiosysteemit voidaan jakaa kahteen * * pääluokkaan: (1) systeemit, jotka on suunniteltu proteii- ·»· : nin erittämiseksi ja (2) systeemit, jotka on suunniteltu proteiinien sytoplasmista ekspressiota varten. Erityssys- :***: 30 teemien edut ovat: • · · ;***; (1) Proteiini on usein helpompi puhdistaa viljely- ·· · alustasta kuin kokosolu-uutoksista.
• · · ·;;; (2) Jos proteiinilla on elintärkeitä disulfidisi- « < doksia, ne muodostuvat todennäköisemmin, jos proteiini 35 kulkee eritysreitin läpi. Tämän ajatellaan johtuvan osaksi «« « 42 1 05 1 04 proteiinidisulf idi-isomeraasin läsnäolosta endoplasmisessa retikkelissä ja vähemmän pelkistävästä ympäristöstä kuin sytoplasmassa.
(3) Eritys voi myös olla edullista, jos ensimmäinen 5 aminohappo (aloittavan metioniinin jälkeen) muodostaa sellaisen dipeptidisekvenssin, jota metionyyliaminopeptidaasi prosessoi huonosti. Erityssignaalisekvenssin lisäys voi sallia signaalipeptidaasin aiheuttaman prosessoinnin erityksen aikana, joka johtaa proteiiniin, jolla on proteii-10 nin aminopäässä autenttinen aminohappo.
Erityssysteemin huonot puolet ovat: (1) Ekspressiotaso on yleisesti paljon alempi kuin se, joka voidaan saada sytoplasmisella ekspressiolla. Tämä tuntuu osaksi johtuvan rajoittavasta eritysnopeusvaihees- 15 ta.
(2) Kaikki proteiinit eivät ole erittyviä.
(3) Usein, erikoisesti S. cerevisiae -kannalla, väärin prosessoidut proteiinin muodot akkumuloituvat ja nämä voivat olla vaikeita puhdistaa pois oikein prosessoi- 20 duista muodoista.
Yleisimmin hiivalla käytetty eritysekspressiosys- •j*. teemi on hiivan alfa-faktorin erityssignaalisekvenssit ja « ;·. alfa-faktoripromoottori. Yleiskatsausta varten katso A.J.
• · · . Brake. Yeast Genetic Engineering, toim. P. Barr, A. Brake • I « 25 ja P. Valenzuela. Butterworth Publishing, Boston 1989.
• · · ··· I Useisiin eri promoottoreihin liitettyä invertaasisignaali- sekvenssiä on myös käytetty heterologisten proteiinien ··· *.* · ekspressoimiseksi hiivassa. Katso G. Stetler et ai., Bio technology, 7: 55 - 60 (1989), R. Smith et ai., Science, 30 229 : 1219 - 1229 (1985) .
Sytoplasmisen ekspression edut ovat: • · · *. (1) Ekspressiotasot voivat olla melko korkeita ·«· ·;;; niin, että on julkaistu proteiinien ekspressioita, jotka ';-' ovat > 20 % solun kokonaisproteiinista, tavallisesti liu- 35 koisena proteiinina.
< « « < i · 43 105104 (2) Joitain proteiineja ei voida tehokkaasti erittää.
(3) Proteiinit, jotka sisältävät glykosylaatiokoh-tia, glykosyloidaan hiivasta eritettyinä hiivalle ominai- 5 sella sokerirakenteella. Koska nämä erittäin hydrofiiliset translaation jälkeiset modifikaatiot sijaitsevat proteiinien pinnalla, ne muodostavat proteiinille antigeenisuutta. Jos proteiini toimii ilman hiilihydraattisivuketjuja, voi olla edullista tuottaa proteiini ilman niitä mieluum-10 min kuin hiivaspesifisen modifikaation kanssa (katso esim. Travis et ai. 1985. J. Biol. Chem., 260: 4384 - 4389).
(4) Joillain proteiineilla on muita spesifisiä modifikaatioita, jotka esiintyvät ehkä ainoastaan sytoplasmassa, esimerkiksi aminopään asetylaatio, modifikaatiot 15 lipideillä, ehkä hemiryhmän sisällyttäminen ja niin edelleen .
Tällä hetkellä suositellaan sytoplasmista ekspressiota, koska hiivasolu laskostaa globiiniketjut yhteen ja sisällyttää hemiryhmän tuottaen hemoglobiinin in vivo. On 20 kuitenkin mahdollista ekspressoida erikseen ja erittää alfa- ja beeta-globiiniketjut ja koota hemoglobiini in vitro.
Globiinigeenit täytyy sijoittaa sopivan promootto- • · . rin säätelyn alaisuuteen. Yleisesti käytetyt hiivapromoot- • « · / / 25 torit sijoittuvat yleensä kahteen laajaan ryhmään: säädel- • · « ··· · lyt ja konstitutiiviset. Laajasti käytetyt konstitutiivi- 44 1 05 1 04 Säädeltyjen promoottoreiden käyttö voi olla tärkeää plasmidin stabiilisuuden kannalta. Usein rekombinanttipro-teiinien ekspressio korkeina tasoina inhiboi isäntäorga-nismin kasvua. Tämä huono puoli voi johtaa sellaisen solu-5 populaation akkumuloitumiseen, jossa on ainoastaan muutama kopio plasmidia läsnä, alenemiseen kasvunopeudessa ja ko-konaisekspressiotasojen putoamiseen. Pitämällä geeni re-pressoidussa tilassa ja indusoimalla myöhään fermentaa-tiossa voidaan pitää yllä korkeat kasvunopeudet ja selek-10 tio korkeaa plasmidin kopiolukua vastaan voidaan välttää.
On jonkin verran vaikeaa saada tarkkaa tietoa hii-vapromoottorien suhteellisista vahvuuksista, koska tämän asian ainoa todellinen mitta perustuisi mRNA:n synteesin kinetiikkaan. Suurin osa olemassa olevista tiedoista mit-15 taa ainoastaan lopullista proteiinikonsentraatiota, joka on saatu. Koska proteiinin stabiilisuudessa voi olla suuria eroja, on tarpeellista verrata samaa proteiinia ja mRNA:ta useilla promoottoreilla samanlaisissa vektoreissa. Tällaisen tutkimuksen suorittivat Verbakel et ai., Gene, 20 61: 207 - 215 (1987). He vertasivat GAPDH-, CYC1-, GAL7-, PH05- ja PGK-promoottoreita ja mittasivat beeta-galakto-·;·. sidaasi/polioviruksen VP2-proteiinin fuusion ekspressiota.
;·, CYC1 johti ekspressiotasoon, joka oli 0,14 % solun koko- • · \ . naisproteiinista (TCP); GADPH, 0,22 % TCP; PH05, 0,26 % // 25 TCP; PGK, 0,9 % TCP ja GAL7, 0,96 % TCP.
··· | Käyttäen GAL-GAP-hybridipromoottoriamme olemme saa- ’ ’ neet sellaiset hemoglobiinin ekspressiotasot, jotka edus- • · · *.* · tavat - 15 % solun kokonaisproteiinista. Tämä mitä toden näköisemmin johtuu kohonneesta promoottorin vahvuudesta : **: 30 yhdessä erittäin stabiilin proteiinituotteen ja ehkä pi- dentyneen puoliintumisajan sisältävän mRNA:n kanssa.
• · · *. GAL-GAP-hybridipromoottorin käyttö on suositelta- • · · ·; vaa. Molemmat elementit (GAL^ ja GAP:n transkription aloi tuskohta) ovat hyvin ymmärrettyjä. GAL:n säätelyalueen 35 transkriptiosäätelymekanismien tutkimukset ovat olleet 45 1 05 1 04 melko laajoja. Galaktoosisäätelyalue sisältää viisi geeniä, jotka koodittavat entsyymeitä, joita tarvitaan galak-toosin käyttämiseksi. Neljää näistä geeneistä (GAL1, GAL7, GAL10 ja GAL2) ekspressoidaan ainoastaan galaktoosin läsnä 5 ollessa. Galaktoosi-induktio ei tapahdu glukoosin läsnä ollessa ellei hiivakannassa ole REGl-geenin mutaatiota. GAL1-, GAL7-, GAL10- ja GAL2-geenejä säädellään ainakin kahdella muulla geenillä, GAL80:lla ja GAL4:llä. GAL4 on transkription aktivaattoriproteiini, joka aktivoi rnRNAm 10 synteesin GAL1-, GAL7-, GAL10- ja GAL2-geenien ylävirran aktivaattorisekvensseistä (IJAS^) . Vaikka GAL4-geeniä ekspressoidaan konstitutiivisesti, se on toiminnallisesti hiljainen galaktoosin poissa ollessa. GAL4:n aktiivisuuden repressiota galaktoosin poissa ollessa pidetään yllä 15 GAL80-geenituotteen avulla. GAL80-proteiini ilmeisesti reagoi fyysisesti GAL4:n kanssa niin, että se estää transkription aktivaation. Galaktoosi tai galaktoosijohdannainen luultavasti estää tämän interaktion sallien GAL4-välitteisen induktion.
20 £. cerevisiae -kannan haploideilla kannoilla on kolme erilaista geeniä, jotka koodittavat glyseraldehydi-*:·. 3-fosfaattidehydrogenaasientsyymiä {GAP) . Nämä geenit ovat nimeltään TDH1, TDH2 ja TDH3 ja kukin on läsnä yhtenä ko- • · · . piona per haploidi genomi. TDH3-geeni tuottaa noin 60 % .* 25 solun GAP-entsyymistä ja TDH1 ja TDH2 tuottavat noin 12 % • ♦ # ··· | ja 28 %, vastaavassa järjestyksessä (McAllister, L. ja *:**: M.J. Holland, 1985. J. Biol. Chem., 2£0: 15019 - 16027).
• · · * Holland'in ryhmä (Holland et ai. 1981. J. Biol. Chem., 256: 1385 - 1395 ja Holland et ai. 1983. J. Biol. Chem., :***: 30 258: 5291 - 5299) on kloonannut ja karakterisoinut S. ce- :***: revisiae -kannan kolme GAP-geeniä. Kloonit ovat nimeltään • ·φ pGAPll, pGAP63 ja pGAP491. pGAP491 vastaa TDH3-geeniä ja • · « on sen vuoksi korkeimmin ekspressoituva. Tätä promoottoria - on käytetty ekspressoitaessa useita erilaisia proteiineja 35 hiivassa, jotka proteiinit sisältävät seuraavat: • < « 46 1 05 1 04
Proteiini Viite
Alfa-interferoni (1)
Hepatiitti-B-antigeeni (1)
Taumatiini (2) 5 Hepatiitti-B-antigeeni (3) HIVIII-käänteiskopioijaentsyymi (4)
Ihmisen SOC (5)
Alfal-antiproteaasi (6) (1) Bitter, G. ja K.M. Eagan. 1984. Gene, 32: 263 - 274. 10 (2) Edens, L et ai. 1984. Cell, 37: 629 - 633.
(3) Kitano, K. et ai. 1987. Biotechnology, 5.: 281 - 283.
(4) Hallewell, R.A. et ai. 1987. Biotechnology, 5: 363 -366 .
(5) Barr, P.J. et ai. 1987. Biotechnology, 5.: 486 - 489.
15 (6) Travis, J. et ai. 1985. J. Biol. Chem. , 260: 4384 - 4389 .
Tätä promoottoria käytetään tavallisesti 600 - 850 emäsparin pituisena fragmenttina ja se on oleellisesti säätelemätön. Pidemmässä muodossaan tämä on erittäin vahva 20 promoottori. Meidän käyttämämme muoto sisältää ainoastaan noin 200 emäsparia translaation aloituskohdan 5'-puolelta.
·;·, Tämä muoto ilman mitään lisättyjä tehostajasekvenssejä on • · · .! oleellisesti vähemmän aktiivinen kuin promoottorin pidempi , muoto [Edens, L. et ai., Cell, .37: 629 (1984)] . GAL-tehos- • « · / *t: 25 taja-alueen lisäyksemme tuo mukanaan sekä säätelyn että • · M *· korkeat ekspressiotasot. Ainoastaan GAP491 -promoottorilla alfa- ja beeta-globiineja tuotettiin tasoilla, jotka oli- • · · : vat vähemmän kuin 0,2 % solun kokonaisproteiinista; GAL- GAP491-hybridipromoottorilla ekspressio nousi 7-10 %:iin 30 solun kokonaisproteiinista.
··· .*·*. Monet muutkin hybridipromoottorit ovat erikoisen • · · •# mielenkiintoisia:
·; GAL-SIGMA
Vahva galaktoosilla säädeltävä promoottori, jossa ' 35 on sigman transkription aloituskohta.
47 105104
SIGMA-GAP
Vahva peptidihormonilla säädeltävä promoottori, jossa on GAP491-geenin transkription aloituskohta.
GAL-EF III
5 Vahva galaktoosilla säädeltävä promoottori, jossa
on pidennysfaktori III-geenin transkription aloituskohta. SIGMA-EF III
Vahva peptidihormonilla säädeltävä promoottori, jossa on pidennysfaktori III-geenin transkription aloitus-10 kohta.
Voidaan helposti suunnitella muita promoottorisys-teemejä, jotka myös toimivat. Nämä sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, useat konstitutiiviset promoottorit. Esimerkiksi hiivan pariutumisfaktori alfan (MFalfa) pro-15 moottori tai pariutumisfaktori a:n (MF a) promoottori, fosfoglyseraattikinaasin (PGK) promoottori, heksokinaasi l:n, heksokinaasi 2:n, pyruvaattikinaasin, trioosifosfaat-ti-isomeraasin, fosfoglyseraatti-isomeraasin, fosfoglyse-raattimutaasin, fosfofruktoosikinaasin tai aldolaasin pro-20 moottoreita voidaan kaikkia käyttää. Lyhyesti, kaikki hy vin ekspressoivat hiivan promoottorit voivat toimia eks-·;·. pressoitaessa hemoglobiinia hiivassa. Laajaa joukkoa eri- laisia luonnollisesti esiintyviä säädeltyjä promoottoreita • ·» *. , voidaan myös käyttää, esimerkiksi: GAL1-10, GAL7, PH05, • · · / / 25 ADHII on kaikkia käytetty tuotettaessa heterologisia pro- « · « ··· | teiineja hiivassa. Joukkoa erilaisia synteettisiä tai puo- ‘ * lisynteettisiä hiivan promoottoreita, kuten GAL-PGK, GAL- • ·· · MFalfa-1, GAL-MFal, GAL-SIGMA, voidaan myös käyttää.
ADHII:n säätelysekvenssit voidaan myös liittää vahvoihin 30 transkription aloituskohtiin, jotka ovat peräisin erilai- • · · sista promoottoreista. PH05:n säätelysekvenssiä tai sigma- • m · *. elementin säätelysekvenssejä voidaan myös käyttää raken- • · φ net taessa vahvoja hybridipromoottoreita. Hiivan promoot-toreiden lisäksi on ajateltavissa, että voidaan käyttää 35 vahvaa prokaryoottista promoottoria, kuten T7-promootto- < 48 105104 ria. Tässä tapauksessa T7-polymeraasi voidaan sijoittaa tiukasti säädellyn hiivapromoottorin säätelyn alaisuuteen. Faagin polymeraasin induktio sellaisissa hiivasoluissa, joissa on hemoglobiinigeenit T7-promoottorin säätelyn 5 alaisuudessa, sallii geenien transkription tällä erittäin tehokkaalla faagin polymeraasilla.
Koska useimmat yllä kuvatuista hiivan säätelysek-vensseistä toimivat kohteina proteiineille, jotka ovat transkription positiivisia säätelijöitä on ajateltavissa, 10 että nämä proteiinit voivat rajoittaa transkriptiota sellaisissa tapauksissa, joissa kohdesekvenssi on läsnä monena kopiona. Sellainen tapaus voi sattua sellaisten vektoreiden, kuten pCIB, pCIT, pCIU tai pCln kohdalla, joita voi olla yli 200 kopiota per solu. Positiivisen säätelijän 15 (esim. GAL4) yliekspressio voi johtaa tehostuneeseen eks-pressioon. On mahdollista rakentaa kanta, jossa GAL4-geeni on muutettu niin, että siitä on poistettu sen promoottori ja promoottori on korvattu GAL7- tai GALlO-promoottorilla, jotka molemmat transkriptoidaan tehokkaammin kuin GAL4-20 promoottori. Tässä tapauksessa positiivinen transkription aktivaattoriproteiini GAL4 voi ekspressoitua kohonneina ·:·. tasoina sinä aikana, kun hemoglobiinin ekspressio indusoi- • · · daan.
• « • «« *, , Korkeampien eukaryoottien ribosomin sitoutumiskoh- « · < ' / 25 tien konsensussekvenssin on määritellyt Kozack (Cell, 44.: ··· · 283 - 292 (1986)) olevan G^CCAUGG. Poikkeamilla tästä sek- *·**· venssistä, erikoisesti -3 kohdassa (A tai G) , on suuri • · · V · vaikutus tietyn mRNA:n translaatioon. Käytännössä kaikki korkeasti ekspressoidut nisäkäsgeenit käyttävät tätä sek- ;***: 30 venssiä. Korkeasti ekspressoidut hiivan mRNA:t toisaalta • · · eroavat tästä sekvenssistä ja käyttävät sen sijaan sek- ♦# venssiä AAAAAUGU [Cigan ja Donahue, Gene, 5ji: 1 - 18 • · · ·"' (1987)] . Ribosomin sitoutumiskohta, jota me käytämme alfa- ja beeta-globiinien ekspressoimiseksi, vastaa korkeampien « 35 eukaryoottien ribosomin sitoutumiskohtaa. Tämän keksinnön 49 105104 aiheena on systemaattisesti muuttaa tätä RBS:ää niiden muutosten vaikutusten testaamiseksi, jotka muutokset tekevät siitä enemmän hiivan RBSsää muistuttavan. On kuitenkin korostettava, että muutosten kohdilla -2, -1 ja +3 yleensä 5 on havaittu vaikuttavan ainoastaan vähän translaatiotehok-kuuteen hiivassa ja nisäkkäissä.
Geenien solunsisäiseen ekspressioon S. cerevisiae -kannassa vaikuttaa pääasiassa geeniin liittyneen promoottorin vahvuus, plasmidin kopioluku (plasmidissa oleville 10 geeneille), transkription terminaattori, isäntäkanta ja geenin kodonikäyttö. Kun halutaan geenituotteen erittyvän, erityssignaalisekvenssit tulevat merkittäviksi. On huomautettava, että monikopioisilla plasmideilla eritystehokkuus voi alentua vahvoilla promoottorirakenteilla. Ernst, DNA, 15 5: 483 - 491 (1986) .
Useita erilaisia kromosomin ulkopuolisia replikoi-tuvia vektoreita (plasmideja) on saatavissa hiivasolujen transformoimiseksi. Käyttökelpoisimmat monikopioiset kromosomin ulkopuoliset hiivavektorit ovat sukkulavektoreita, 20 jotka käyttävät täyspitkää 2 μ plasmidia, joka on yhdistetty E. coli -bakteerin plasmidiin. Näissä vektoreissa on ·;·# geenit, jotka sallivat plasmidin ylläpidon sopivissa hii- vamutanteissa ja antibioottiresistenssimerkkigeenit, jotka • « « , sallivat selektion E. coli -bakteerissa. Täyspitkän 2 μ • · « ’· '·' 25 plasmidin käyttö, verrattuna vektoreihin, jotka sisältävät • · « ϊ·ί l ainoastaan osan 2 μ plasmidin sekvenssistä, johtaa yleensä * *:**· paljon korkeampaan plasmidin stabiilisuuteen erikoisesti ««» · sellaisissa hiivakannoissa, jotka on parannettu endogeeni- sestä 2 μ plasmidista. Tässä kuvattu pC-vektorien ryhmä on ;***; 30 tämän tyyppisiä vektoreita.
··· .·**. Kannat voidaan rakentaa myös sillä tavalla, että • · · GAL-GAP-hemoglobiiniekspressiokasetit integroidaan kromo- • · ♦ ·· someihin käyttäen hiivan integroituvia vektoreita. Vaikka hemoglobiinigeenien kopioluku onkin matalampi kuin plas- I 35 midivektorien tapauksessa, ne ovat melko stabiileja eivät- • « (41 50 1 05 1 04 kä ehkä tarvitse ollenkaan selektiota pysyäkseen isäntä-solussa. Hiivan integroituvat vektorit sisältävät vektorin Yip5 (Struhl et ai., PNAS, 76: 1035 - 39, 1989), Yipl (Id.) ja pGT6 (Tchumper ja Carbon, Gene, 10: 157 - 166, 5 1980) . Tietoja varten näistä ja muista hiivavektoreista katso Pouwels et ai., Cloning Vector. I - VI, et seq. (Elsevier, 1985).
Alfa- ja beeta-globiinigeenit voidaan viedä sisään erillisissä plasmideissa tai molemmat samassa plasmidissa.
10 Yhden plasmidin systeemin etu kahden plasmidin systeemiin verrattuna on teoreettinen. Ajatellaan yleisesti, että on olemassa yläraja plasmidien kokonaiskopiolukumäärälle per solu. Jos se on esimerkiksi 1 000, kahden plasmidin systeemissä voisi olla ainoastaan 500 kopiota alfaketjun 15 plasmidia ja 500 kopiota beetaketjun plasmidia. Yhdessä plasmidissa, jota on 1 000 kopiota per solu, on 1 000 kopiota sekä alfa- että beetaketjun geeniä. Kopioiden lukumäärä voi olla kuitenkin vailla merkitystä, jos muut tekijät ovat rajoittavia. Tosiasiassa monet ryhmät pitävät pa-20 rempana käyttää kantoja, jotka sisältävät geenit integroituina kromosomin eri lokuksiin. Sellaiset kannat ylläpitä-vät erittäin stabiilisti vieraan geenin eivätkä tarvitse • · « erikoisalustaa plasmidiselektion ylläpitämiseksi.
• * ” Korkeasti ekspressoiduilla hiivageeneillä on hyvin S1 105104 donien laskettu arvo on 0,23. Samanlainen arvo voidaan laskea beeta-globiinin cDNA:lle. Koska on olemassa erittäin korkea korrelaatio tavallisimmin käytettyjen kodonien välillä, on mahdollista, että hemoglobiinin ekspressiota 5 ihmisen cDNAtsta hiivassa voi rajoittaa sopivien tRNA-molekyylien saatavuus. Jos näin on, geenin täydellinen synteesi käyttäen kaikista suosituimpia hiivan kodoneita voi parantaa ekspressiotasoja. On melko mahdollista, että suurin negatiivinen vaikutus epäsuotuisan kodonin käytöstä 10 tapahtuu silloin, kun jos käytetyssä cDNArssa on paljon sellaisia kodoneita, joille on ainoastaan vähän vastaavia tRNA-molekyylejä. Sellaisessa tapauksessa hemoglobiinin korkean tason ekspressio voi kuluttaa täysin loppuun sellaisten tRNA-molekyylien varaston alentaen ei ainoastaan 15 hemoglobiinin translaatiota vaan myös hiivaproteiinien, jotka sattuvat käyttämään sitä kodonia, translaatiota. Alfa-globiinin ihmisen cDNA:n tapauksessa tavallisimmin käytetty leusiinikodoni on CTG (14 kappaletta 21 kappaleesta) , tätä kodonia ei koskaan käytetä korkeasti eks-20 pressoiduissa hiivageeneissä (Guthrie ja Abelson, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces. toim. Stratern, Jones ja Broach, 1982, Cold Spring Harbor, NY).
• « « ·.· * Matala kodonikäyttöindeksi ja harvinaisten hiivakodonien : läsnäolo globiinin cDNA:ssa on ollut meille riittävä kan- 25 nustin niin, että syntetisoimme modifioidun muodon alfa- : ja beeta-globiinigeeneistä käyttäen hiivan suosimia kodo- • · · · neita.
• · "Di-alfa"- ja "di-beeta"-hemoglobiinit • » ·
Esillä oleva keksintö pitää sisällään joissain 30 suoritustavoissa yhdistelmät, joissa (a) yksi molekyyli • · *···’ di-alfa-globiinin kaltaista polypeptidiä muodostaa kahden • · · - · · molekyylin kanssa beeta-globiinin kaltaista polypeptidiä ··· "di-alfa"-hemoglobiinin kaltaisen proteiinin; (b) kaksi molekyyliä alfa-globiinin kaltaista polypeptidiä 35 muodostaa yhden molekyylin kanssa di-beeta-globiinin kai- 52 1 05 1 04 täistä polypeptidiä "di-beeta"-hemoglobiinin kaltaisen proteiinin.
On lisäksi huomattava, että delta-, gamma- ja epsi-lonketjuilla on huomattavaa homologiaa beetaketjun kanssa 5 ja että zeetaketjulla on huomattavaa homologiaa alfaketjun kanssa. Sen vuoksi di-delta-, di-gamma-, di-epsilon- ja di-zeetapolypeptidit kuuluvat keksinnön piiriin ja niitä voidaan käyttää muiden kuin Hgb AI:n tyyppisten uusien hemoglobiinien valmistukseen.
10 Di-alfa-linkkeri (jos sellaista käytetään) sisältää suositeltavasti 1-3 aminohappoa, jotka voivat olla samoja tai erilaisia. Mono-Gly-linkkeri on erikoisen suositeltava. Sellaisen linkkerin suunnittelussa on tärkeää tietää se, että on toivottavaa käyttää yhtä tai useampaa sellais-15 ta aminohappoa, joka joustavasti liittää yhteen kaksi alayksikköä muuttaen ne yhden di-alfa-globiinipolypeptidin domeeneiksi.
"Di-beeta" -mutanttien valmistus kuuluu myös keksinnön piiriin. Yhden beeta-alayksikön N-pään ja toisen bee-20 ta-alayksikön C-pään välimatka on 18,4 Ä deoksimuodossa ja 5,2 Ä oksimuodossa. Di-beeta-linkkeri sisältää suositeltavasti 4-9 aminohappoa, jotka voivat olla samoja tai eri-: laisia.
: ·.. Linkkerin pitäisi olla sellainen, joka epätodennä- :*·.· 25 köisesti muodostaa sekundaarirakenteen, kuten alfa-helik- : .·. sin tai beetalevyn. Tietyillä aminohapoilla on suurempi • · · · taipumus osallistua sellaisiin rakenteisiin. Katso Chou ja • ·
Fasman, Biochemistry, 13: 222 - 245 (1974), joka on lii- • · i tetty tähän viitteeksi. Aminohapot on alla asetettu alene-30 van osallistumisen mukaiseen järjestykseen. Suositeltavat # · '···* linkkerin aminohapot on lihavoitu. Glysiini on sopivin • * φ aminohappo tähän tarkoitukseen. Suositeltavimmat di-alfa-·♦· linkkerit ovat Gly tai Gly-Gly.
4 · ( 53 105104
Alfa-heliksin Beeta-lewn muodostajat muodostan at
Glu (1,53) Met (1,67)
Ala (1,45) Val (1,65) 5 Leu (1.341 Ha He (1.601 Hfl
His (1,24) Cys (1,30)
Met (1,20) Tyr (1,29)
Gin (1,17) Phe (1,28)
Val (1,14) Gin (1,23)
Trp (1,14) Leu (1,22)
Phe (1,121 ha Thr (1,20) 10 £ys (1,07) ΤΓΡ H, 19) hfl
He (1,00) Ala (0,971 1/3
Asp (0,98) Aro (0,90)
Thr (0,82) Gly (0,81)
Arq (0,79) Asp (0,80) ifl
Ser (0,79) Lys (0,74)
Cvs (0,77) ior Se^ (0,72) ς &sn (0,73) His (0,71)
Tvr (0.61) ba Asn (0,65)
Pro (0,59) Pro (0,621 bβ
Glv (0.53) Ba Glu (0,26) B/3 (Kirjainsymbolit ovat Haifa, vahva alfa-heliksin 20 muodostaja; halfa, alfa-heliksin muodostaja; Ialfa, heikko alfa-heliksin muodostaja; ialfa, yhdentekevä alfa-heliksin muodostuksessa; balfa, alfa-heliksin murtaja ja Balfa, .: : vahva alfa-heliksin murtaja. Beeta-symbolit ovat samanlai- siä. Trp on bbeeta, jos se sijaitsee lähellä beetalevy- : 25 alueen C-päätä) .
• · : .·. Polypeptidiketjun alfa-heliksi sisältää keskimäärin • · · \ 3,6 jäännöstä per kierre. Pallomaisissa proteiineissa kes- ... kimääräinen pituus on noin 17 Ä vastaten 11 jäännöstä tai • · · ’·’ ’ 3 heliksin kierrettä. Alfa- ja beeta-globiineissa heliksit 30 vaihtelevat pituudeltaan 7 aminohaposta 21 aminohappoon ··· ·...* (A.A.). Beetalevy sisältää 2,3 jäännöstä per kierre; kes- kimääräinen pituus on noin 20 Ä tai 6 jäännöstä.
Chou ja Fasman määrittävät alfa-heliksin ytimen heksapeptidiksi, joka sisältää neljä heliksiä muodostavaa « < ‘I’ 3 5 jäännöstä eikä enempää kuin yhden heliksin murtajan ja « < I ( <
I I I
54 105104 beetalevyn ytimen pentapeptidiksi, joka sisältää kolme beetalevyn muodostavaa jäännöstä eikä enempää kuin yhden levynmurtaj an.
Aminohapposekvenssi di-alfa-linkkerin läheisyydessä 5 on seuraava: Jäännös numero 138 139 140 141 1234 AA Ser Lys Tyr Arg-(XXX)n Vai Leu Ser Pro
Heliksin Not H21 HC1 HC2 HC3 NAI NA2 AI A2
Heliksin pot. 079 107 061 079 114 134 079 059 10 Levyn pot. 072 074 129 090 165 122 072 062 (Huomaa: heliksin- ja levynmuodostuspotentiaalit on kerrottu sadalla typografisista syistä).
Di-alfa-linkkeri on suositeltavasti ainoastaan 1 -3 aminohapon pituinen. Näin ollen se voi muodostaa alfa-15 heliksin ainoastaan yhdessä linkkerin "päiden" kanssa.
Yhden tai kahden jäännöksen pituinen linkkeri, vaikka koostuisi vahvat sekundaarirakennetaipumukset sisältävistä aminohapoista, ottaa epätodennäköisestä alfa-heliksi- tai beetalevyrakenteen ottaen huomioon esimerkiksi Arg 141: n 20 ja Ser 3:n hajottavan vaikutuksen. Jos linkkeri on kolmen jäännöksen pituinen, on suositeltavaa, ettei useampi kuin yksi jäännös ole vahva alfa-heliksin muodostaja ellei linkkeri sisällä myös vahvaa alf a-heliksin murtajaa.
Aminohapposekvenssi di-beeta-linkkerin läheisyy-.·. : 25 dessä voi muodostaa ankarampia rajoituksia.
143 144 145 146 1 2 3 4 • · ·
His Lys Tyr His-(XXX) Vai His Leu Thr
H21 HC1 HC2 HC3 NAI NA2 NA3 AI
• · « *·’ * 124 107 061 124 114 124 134 082 30 071 074 129 071 165 071 122 120 • · · ·...· Di-beeta-linkkeri on pitempi (suositeltavasti 4 -9 • « · aminohappoa) ja siksi herkempi sekundaarirakenteen muodos-tumiselle. On suositeltavaa, että Vall:n vieressä oleva aminohappo on alf a-heliksin murtaja ottaen huomioon ryhmän *; 35 Val-His-Leu taipumuksen alf a-heliksiin. Yleisemmin, on 1 < t « « 55 105104 toivottavaa, että linkkeri ei sisällä (tai ei yhteistyössä proksimaalisesti liitettyjen aminohappojen kanssa muodosta) alfa-heliksin tai beetalevyn ydintä.
Aminohappoja, joilla on suuri taipumus alfa-helik-5 sin muodostukseen, voidaan käyttää linkkerissä, jos niiden yhteydessä on "heliksin murtaja" aminohappoja. Samalla tavalla beetalevyn muodostus voidaan estää "levyä hajottavilla" aminohapoilla.
Sekundaarirakenteen ennustuksella käyttäen Chou'n 10 ja Fasman'in lähestymistapaa on tietysti rajoituksensa ja lopullinen testi linkkerin hyväksyttävyydestä on se, onko di-alfa- tai di-beeta-hemoglobiinilla haluttu affiniteetti hapelle vai ei. Erikoisesti polyalaniinilinkkeri, huolimatta sen oletetusta taipumuksesta alfa-heliksin muodos-15 tukseen, voi hyvinkin olla arvokas, koska alaniiniryhmä on tiivis ja sen vuoksi linkkeri olisi melko joustava ellei sekundaarirakennetta muodostu.
Erikoisen suositeltavassa suoritustavassa di-alfa-ja di-beeta-globiinigeenit yhdistetään yhdeksi polykis-20 troniseksi operoniksi. Polykistronisen operonin käyttö ei kuitenkaan ole tarpeellista esillä olevan keksinnön suorittamiseksi ja alfa- (tai di-alfa) tai beeta- (tai di-beeta) globiinigeenit voidaan ekspressoida eri promootto-reistä, jotka voivat olla samoja tai erilaisia.
.·. : 25 Samalla, kun esillä oleva suositeltava "geneet- ·*,·. tisesti yhteenliitetty hemoglobiini" on sellainen, joka • ♦ · I sisältää di-alfa- ja/tai di-beeta-globiinin, muutkin glo- biiniketjut voidaan liittää geneettisesti yhteen ja käyt- • · · '·* * tää niitä muiden hemoglobiinilajien kuin Hgb Al:n (al- 30 fa2beeta2) tuotossa.
• · · Tässä esitetyt patenttivaatimukset lisätään tähän • · · viitteenä suositeltavien suoritustapojen luettelosta. Kaikki lainatut viitteet sisällytetään viitteinä siinä määrin, joka on tarpeellista tässä tämän jälkeen vaaditun *; 35 keksinnön suorittamiseksi.
56 105104 Tässä patenttihakemuksessa kuvatuilla tavoilla olemme tehneet seuraavat saavutukset, jotka ovat: (1) Met-FX-alfa-globiinin ekspressio E. coli -bakteerissa kaksikistronisesta operonista, joka sisältää 5 syöttökistronin ja Met-FX-alfa-globiinigeenin, jotka mo lemmat transkriptoidaan Tae-promoottorista. (Esimerkki 2) (2) Met-FX-beeta-globiinigeenin ekspressio E. coli -bakteerissa samoilla tavoilla. (Esimerkki 2) (3) Met-FX-alfa-globiinin ja Met-FX-beeta-globiinin 10 yhteisekspressio E. coli -bakteerissa tetrakistronisesta operonista, joka sisältää syöttökistronin, FX-alfa-globii-nigeenin, kistronien välisen sekvenssin, toisen syöttökistronin ja FX-beeta-globiinigeenin, joita kaikkia säädellään yhdestä Tac-promoottorista. Alfa- ja beeta-globiinit 15 koottiin solun sisällä toimivaksi FX-hemoglobiiniksi. FX- hemoglobiini muutettiin entsymaattisesti Hgb:ksi. (Esimerkki 3) (4) FX-hemoglobiinimutanttien yhteisekspressio kuten yllä olevassa osassa (3) , joissa mutanteissa beeta- 20 globiinialayksiköissä oli Beth Israel-, Cheverly-, Provi- dence/MSR-, Kansas- tai beeta67 Vai - Ile -mutaatiot. (Esimerkki 4) (5) Met-alfa-globiinin ja Met-beeta-globiinin yh- « teisekspressio kuten yllä olevassa osassa (3) ja solun .·. : 25 sisällä tapahtuva kokoaminen Met-Hgb:ksi (a.k.a. Des-FX- ; .·. Hgb) . (Esimerkki 5) • · · (6) Des-Val-alfa-globiinin ja Des-Val-beeta-globii- • · ... nin yhteisekspressio, kuten yllä olevassa osassa (3).
• · · *·* * (Esimerkki 6) 30 (7) Yhteisekspressio, kuten yllä olevassa osassa • · · ·...' (6) , mutta käyttäen Des-Val-beeta-globiinigeeniä, joka • · · edeltää Des-Val-alfa-globiinigeeniä operonissa. (Esimerkki 6) "'·'· (8) (Des-Val) -alfa- (Gly-Gly)-alfa-globiinin ja bee- 35 ta-globiinin yhteisekspressio, kuten yllä olevassa osassa 105104 57 (3), ja kokoaminen solun sisässä di-alfa-hemoglobiiniksi. (Esimerkki 8) (9) (Des-Val-alfa-(Gly-Gly)-alfa-globiinin ja bee-ta-globiinimutantin (Nagai, Arg-Nagai tai Kansas) yhteis- 5 ekspressio, kuten yllä olevassa osassa (8), ja kokoaminen solun sisässä di-alfa-mutanttihemoglobiiniksi. (Esimerkki 9) (10) Des-Val-alfa-globiinin ja Presbyterian-mutaa-tion sisältävän Des-Val-beeta-globiinin yhteisekspressio, 10 kuten yllä olevassa osassa (3) , ja kokoaminen solun sisässä Des-Val-mutanttihemoglobiiniksi. (Esimerkki 11) (11) (Des-Val)-alfa-(Gly-Gly)-alfa-globiinin ja Presbyterian-mutaation sisältävän beeta-globiinin yhteisekspressio, kuten yllä olevassa osassa (8). (Esimerkki 11) 15 (12) Di-alfa-globiinin ja di-beeta-globiinin eks pressio eri promoottoreista samasta plasmidista. (Esimerkki 12) (13) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä di-alfa-globiinin ja kahden beeta-globiinikopion yhteisekspressoi- 20 miseksi samasta operonista. (Esimerkki 13) (14) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä di-beeta-hemoglobiinin yhteisekspressoimiseksi. (Esimerkki 14) ·,·* · (15) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä eri pro- : moottorien säätelyn alaisena samassa plasmidissa olevien :*♦.· 25 alfa-globiinin ja beeta-globiinin yhteisekspressoimiseksi .
• ♦ : (Esimerkki 16) » · · ♦ · * · (16) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä eri pro- • · m·..' moottorien säätelyn alaisena eri plasmideissa olevien ai- • ♦ · fa-globiinin ja beeta-globiinin yhteisekspressoimiseksi. 30 (Esimerkki 17) • · *···* (17) Alfa- ja beeta-globiinin yhteisekspressio S.
cerevisiae -kannassa. (Esimerkki 19) · (18) Di-alfa- ja beeta-globiinin yhteisekspressio • · « « .· S. cerevisiae -kannassa. (Esimerkki 23)· • « « 58 105104 (19) Lambda PL -promoottorin säätelyn alaisena olevien Des-Val-alfa-globiinin ja Des-Val-beeta-globiinin rakentaminen E. coli -bakteerissa.
(20) Lambda PL -promoottorin säätelyn alaisena ole-5 vien di-alfa-globiinin ja Des-Val-beeta-globiinin yhteis- ekspressio E. coli -bakteerissa.
(21) Alfa- ja beeta-globiinin yhteisekspressio eri plasmideista diploideissa S. cerevisiae -kannoissa.
(22) Di-alfa-globiinin ja Presbyterian-mutaation 10 sisältävän beeta-globiinin yhteisekspressio S. cerevisiae -kannassa.
(23) Vektorien valmistus -Gly- tai -Pro-linkkerit sisältävien di-alfa-globiinien ekspressoimiseksi.
(24) Eri kantojen ja induktiolämpötilojen arviointi 15 di-alfa-hemoglobiinien ekspressoimiseksi E. coli -baktee rissa .
(25) Alfa- ja beeta-mutanttiglobiinin yhteisekspressio S. cerevisiae -kannassa ja kokoaminen muodostamaan matalan affiniteetin sisältävät hemoglobiinimutantit.
20 Odottamaton ja yllättävä muutos hemoglobiinin ha- pensitomisominaisuuksissa havaittiin korvattaessa N-pään väliini metioniinilla. Kuten esimerkissä 11 on kuvattu, • · · ·/· · verestä puhdistetun hemoglobiini A^n P50-arvo on 4,03 ja N = 2,7. E. coli -bakteerissa tuotetun Des-FX-hemoglobii- :\j 25 nin, joka on samanlainen hemoglobiini kuin Aq, paitsi että • · : .·. siinä on alfa- ja beetaketjujen N-päissä lisättynä metio- niini, P50- ja N-arvot ovat oleellisesti samat. (Esimerkki • · ... 7.) Näin ollen metioniinin lisäyksellä ilman viereisen va- • · · • « · * liinijäännöksen muutosta on vähän tai ei mitään vaikutusta 30 hapensitomiseen. Toisaalta, E. coli -bakteerissa tuotetul- • · *...* le des-Val-hemoglobiinille, joka on hemoglobiini, jossa on • · · normaali N-pään väliini kussakin ketjussa korvattu metio-niinillä, havaittiin kaksi kertaa korkeampi P50-arvo 7,04. Yhteisvaikutus, mitattuna N:llä, oli kuitenkin tälle mole-'·' 35 kyylille sama kuin muille. Samanlainen vertailu tehtiin 59 1 05 1 04 kahdelle hemoglobiinille, jotka sisälsivät kumpikin yh-teenliitetyn alfaketjun ja kummankin sisältäessä Pres-byterian-mutaation, joista toinen tuotettiin E. coli -bakteerissa (esimerkki 11) ja toinen hiivassa. E. coli -bak-5 teerissä tuotettu hemoglobiini rakennettiin Des-Val-alfa-ketjulla, se tarkoittaa, että N-päässä oli normaali väliini korvattu metioniinilla. Hapensitoutuminen karakterisoitiin arvoilla P50 = 33 ja N = 2,4. (Esimerkki 11.) Vastaava hiivan koodittava alue alkaa normaalin valiinikodonin 10 edessä olevasta lisämetioniinikodonista. Koska tämä aloi-tusmetioniini poistetaan translaation jälkeen in vivo, puhdistetulla hemoglobiinilla on normaali N-pään väliini. Tälle molekyylille P50 = 23 - 25 ja N = 2,5. Näin ollen kahdessa melko erilaisessa tapauksessa N-pään valiinin 15 korvaaminen N-pään metioniinilla kohotti P50-arvoa. Fysiologisissa olosuhteissa odotetaan, että E. coli -bakteerissa tuotettu yhteenliitetty Presbyterian-hemoglobiini kuljettaa 20 - 30 % enemmän happea kuin hiivassa tuotettu samanlainen hemoglobiini, jolla on muutettu N-pää.
20 Seuraavissa esimerkeissä on viitattu hyvin suureen määrään erilaisia plasmideja. Näiden plasmidien keskeisten suhteiden esille tuomiseksi on laadittu taulukko vekto- • · · : reistä (katso taulukko 100).
:*·.. Esimerkki 1 25 FX-alfa-globiinin (pDLII-62m) ja beeta-globiinin • · : .·. (pDLII-10a) ekspr es s io vektoreiden rakentaminen • · · ""· Materiaalit ja menetelmät • · ... Jollei muuta ole ilmoitettu, kaikki elektroeluu- • · · *’* tiot, fenolikloroformiuutot, etanolisaostukset (EtOH), 30 alkali-SDS-plasmidipuhdistukset, agaroosielektroforeesit • · · *...* ja DNArden käsittelyt suoritettiin oleellisesti, kuten on ··« ·...· kuvattu teoksessa Maniatis et ai. ("Molecular Cloning", .:. Cold Spring Harbor, New York, 1982) .
• · « « ,···, Seuraavia lyhenteitä ja määritelmiä käytetään:, ety- « « 35 leenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA); natriumdodekyylisul- < * 1
« « I
1 I
6„ 105104
faatti (SDS); polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE); dimetyylisulfoksidi (DMSO); ditiotreitoli (DTT); isopro-pyyli-beeta-D-tiogalaktopyranosidi (IPTG); 2 x YT-alusta (16 g Bactotryptonia, 10 g Bacto-hiivauutetta, 5 g NaCl.-ia 5 per litra vettä); SDS-PAGE-latauspuskuri (0,125 M Tris-HC1, pH 6,8, 20 % v/v glyseroli, 2 % SDS, 2 % 2-merkapto-etanoli, 0,01 % bromifenolisini); fosfaatilla puskuroitu TB-alusta (24 g hiivauutetta, 12 g tryptonia, 4 ml glyserolia, 17 ml 1 M KH2P04:ää, 72 ml 1 M K2HP04:aa per litra 10 vettä); Tris-EDTA-puskuri (TE: 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM
EDTA); Tris-boraatti-EDTA-puskuri (TBE: 0,089 M Tris,
0,089 M boorihappo, 0,002 M EDTA); Tris-asetaatti-EDTA-puskuri (TAE: 0,04 M Tris, 0,04 M etikkahappo, 0,001 M
EDTA).
15 Proteiinielektroforeesi suoritettiin menetelmällä, jonka on kuvannut Laemmli, UK (Nature, 1970, 227. 680 - 685) , 15 % SDS-polyakryyliamidigeeleissä.
E. coli JM109 -kannan solut tehtiin kompetenteiksi seuraavasti: 200 ml 2 x YT-alustaa ympättiin 2 ml :11a yli 20 yön kasvanutta E. coli JM109 -kantaa. Sitten 200 ml viljelmää inkuboitiin ravistellen 37 °C:ssa yksi tunti. Solut kerättiin sentrifugoimalla 6 000 kierrosta minuutissa 4 . : : minuutin ajan kääntyväputkisessa Beckman JS13.1 -rootto- rissa (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) . Solut .·. j 25 suspendoitiin uudelleen yhteensä 50 ml:aan puskuria, joka : .·. oli 45 mM MnCl2, 60 mM CaCl2, 40 mM KOAc, pH 6,2, 15 % sak- • · · karoosi (w/v), 1,3 % RbCl (w/v) ja 7,5 % (v/v) glyseroli.
• · ... Kun oli sentrifugoitu, kuten yllä, solut suspendoitiin uu- • · · **’ delleen 20 ml:aan samaa puskuria ja inkuboitiin 0 °C:ssa 30 30 minuuttia. Solut jaettiin yhden millilitran eriin ja • · · '...· säilytettiin -80 °C:ssa, kunnes käytettiin.
• · ·
Jollei muuta ole ilmoitettu, kaikki restriktioent-syymidigestiot suoritettiin valmistajan ehdottamissa olo-.···, suhteissa. DNA konsentraatiot määritettiin Beers1 in lain 35 mukaan käyttäen 260 nm mittausabsorbanssia (A260) käyttäen
• I I
« « 4 ( 4 I 4 «1 105104 vettä viitestandardina. Synteettisille oligonukleotideille käytettiin seuraavia ekstinktioarvoja: E260 = 0,05 ml^g/cm ja kaksijuosteiselle DNA:lie E260 = 0,02 ml/^g/cm.
Globiinigeenin synteesi 5 Kukin globiinigeeni rakennettiin 14 erillisestä oligonukleotidista, jotka vaihtelivat pituudeltaan 50 - 85 emäspariin. FX-alfa-globiinigeeni syntetisoitiin oligonuk-leotideista SJH I-33a-f, SJH I-34a-f ja SJH 35a,b; FX-bee-ta-globiinigeeni syntetisoitiin oligonukleotideista SJH 10 I-36a-f, SJH Ia-f ja SJH I-38a,b. Kunkin globiinigeenin edessä on lyhyt syöttögeeni, kuten aiemmin on kuvattu. Oligonukleotidit syntetisoitiin Biosearch 8600 -laitteella käyttäen beeta-syaanietyylifosforiamidiittikemiaa 1 000 A CPG-pylväissä (0,2 mmoolia) (Beaucage, S.L. ja Caruthers, 15 M.H., Tet. Lett.. 1981, 22, 1859 - 1862). Näiden oligonuk-leotidien sekvenssit on annettu kuviossa 4.
Jollei muuta ole ilmoitettu, oligonukleotidit katkaistiin pylväistä irti käyttäen seuraavaa menetelmää: noin 0,5 ml tuoretta, konsentroitua NH4OH:ta vedettiin pyl-20 vääseen 1 ml ruiskulla. NH4OH:n annettiin reagoida 20 minuuttia, sitten puserrettiin ulos lasipulloon (tilavuudeltaan noin 4 ml). Tämä menetelmä toistettiin 2 kertaa, pul-: lo täytettiin yli 75 % tilavuudesta NH4OH:lla ja kuumennet- ·'*·., tiin 55 °C:ssa yli yön. Näytteet lyofilisoitiin, suspen- 25 doitiin uudelleen 0,1 ml:aan H20:ta ja konsentraatio ar- • · : .·. vioitiin mittaamalla A260 .
• · · 200 μg kutakin oligonukleotidia puhdistettiin urea- • · ... polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Tämän suorittami- • ti *·’ * seksi oligonukleotidiin lisättiin sama tilavuus 2 x la- 30 tauspuskuria (90 % formamidi (v/v) , 0,5 x TBE, 0,05 % • · · ·...· (w/v) bromifenolisini, 0,05 % (w/v) ksyleenisyanoli) . Näy- ··· tettä kuumennettiin 95 °C:ssa 10 minuuttia ja ladattiin 10-%:iseen akryyliamidigeeliin, joka sisälsi 7 M ureaa ja 1 x TBE-puskuria. Elektroforeesia ajettiin 800 voltilla 35 noin 2 tuntia. Täyspitkää oligonukleotidia tarkasteltiin • 4 « « « · « « • · • · · 62 105104 silmin ultraviolettivalossa. Se alue geelistä leikattiin sitten irti ja inkuboitiin 3 ml puskuria, joka oli 100 mM Tris, pH 7,8, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 60 °C:ssa yli yön.
Oligonukleotidiliuos lisäpuhdistettiin käänteisfaa-5 sikromatografiällä seuraavasti: C18 Sep-Pak -patruuna (Waters Associates) pestiin 10 ml :11a 100-%:ista metano-lia, jonka jälkeen se pestiin 10 ml:lla H20:ta. Oligonukleotidiliuos laitettiin pylvääseen, pestiin 20 ml H20:ta ja eluoitiin 3 x 1 ml määrillä liuosta, joka oli 50 mM tri-10 etyyliammoniumasetaatti, pH 7,3/metanoli (1:1). Puhdistettu oligonukleotidi lyofilisoitiin, pestiin 100-%:isella etanolilla, kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 0,1 ml:aan H20:ta. Konsentraatio määritettiin mittaamalla A260 .
Synteettinen FX-beetageenin sekvenssi (sisällytetty 15 kuvioon 5) rakennettiin seuraavasti: 100 pmoolia seuraavia oligonukleotideja kinasoitiin 3 erillisessä reaktiossa. Reaktio 1 sisälsi oligonukleotidit SJH I-36b, c, d, e ja f. Reaktio 2 sisälsi oligonukleotidit SJH I-37a, b, c ja e. Reaktio 3 sisälsi oligonukleotidit SJH I-37d, f ja SJH 20 I-38a. Kun sopivat oligonukleotidit oli yhdistetty, liuok set lyofilisoitiin kuiviksi ja suspendoitiin uudelleen 16 μl:aan H20:ta. Sitten lisättiin 2 (il 10 x kinaasipuskuria Λ": (0,5 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M MgCl2) , 0,5 μΐ 100 mM DTT: ia ja 1 μΐ 1,0 mM ATP:tä. Reaktio aloitettiin lisäämällä 1 μΐ « 25 (2 yksikköä) T4 polynukleotidikinaasia (IBI, Inc., New • « : .·. Haven, CT) . Kun oli inkuboitu 37 °C:ssa yksi tunti, reak- • · · tioita kuumennettiin 95 °C:ssa 10 minuutin ajan kinaasin • · ... inaktivoimiseksi. Kolme reaktiota yhdistettiin ja lisät- • · ·
* tiin 100 pmoolia oligonukleotideja SJH I-36a ja SJH I-38b. 30 Kun oli lisätty 10 μΐ liuosta, joka oli 100 mM Tris, pH
7,8, 100 mM MgCl2, oligonukleotidien sallittiin hybridisoi- * · · tua inkuboimalla 65 °C:ssa 30 minuutin ajan, 37 °C:ssa 30 minuutin ajan ja 15 °C:ssa yksi tunti. Hybridisoituneet ,···. oligonukleotidit ligoitiin lisäämällä ATP:tä (lopullinen ’·’ 35 konsentraatio 1 mM) ja DTT:tä (lopullinen konsentraatio • * • « • «4 105104 6 3 10 mM) ja 4 μΐ (20 yksikköä) Τ4 DNA ligaasia (IBI; Inc., New Haven, CT) ja inkuboimalla 15 °C:ssa yksi tunti. Pienet määrät tästä ligaationseoksesta kloonattiin sitten suoraan vektoriin M13mpl9 (katso alla).
5 FX-alfa-globiinin rakentamista varten oligonukleo- tidit puhdistettiin, kinasoitiin, hybridisoitiin ja ligoi-tiin samalla tavalla. Ennen ligaatiota vektoriin M13mpl9, täysipitkä FX-alfa-globiinigeeni puhdistettiin elektroforeesilla 0,8 % agaroosissa 1 x TAE-puskurissa ja elektro-10 eluoitiin dialyysiletkuun käyttäen 0,5 x TBE-puskuria elektroeluutiopuskurina ja menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Maniatis et ai. Eluoitu DNA uutettiin fenolilla, saostettiin EtOH:lla ja suspendoitiin uudelleen 20 μΐ-.aan TE-puskuria. Pieniä määriä käytettiin vektoriin M13mpl9 15 kloonausta varten.
Faagivektorit
Kloonausta varten 2-, 5- tai 10-kertainen mooliyli- määrä kutakin FX-alfa- ja FX-beeta-globiinigeenisekvenssiä yhdistettiin 200 ng:n kanssa kahdella restriktioentsyymil- 20 lä katkaistua geelipuhdistettua vektoria Ml3mpl9-RF (New
England Biolabs, Inc., Beverly, MD) ja ligoitiin yli yön 15 °C:ssa 50 μl:ssa ligaatiopuskuria (IBI, Inc., New . : : Haven, CT) , joka sisälsi 2 yksikköä T4 ligaasia. FX-alfa- ·’·.. globiini kloonattiin vektorin M13mpl9 Xmal/Pstl-kohtiin.
;\j 25 FX-beeta-globiini kloonattiin vektorin M13mpl9 Pstl/Hind- • « : .·. III-kohtiin.
• · · t]*.j E. coli JM109 -kanta transformoitiin M13mpl9 ligaa- • · ... tioseoksella, joka sisälsi FX-alfa- tai FX-beeta-globiini-
I I I
• geenisekvenssit, käyttäen seuraavaa transformaatiomenetel- 30 mää: 9 μΐ DMSO:ta lisättiin 0,25 ml:aan kompetentteja E.
• 9 coli JM109 -soluja ja soluja inkuboitiin jäissä 10 minuut- • · · tia. Lisättiin pienet määrät FX-alfa- tai FX-beeta-globii- .:. nin ligaatioreaktioita ja inkuboitiin jäissä 40 minuuttia « · « « ,···, ja 42 °C:ssa 3 minuuttia. Kuhunkin transformaatioseokseen 35 lisättiin 100 μΐ yli yön kasvanutta JM109-viljelmää, jonka
< I
• « < «
( I I I I
« I
«Il 64 105104 jälkeen lisättiin 60 μΐ liuosta, jossa oli 50 μΐ 2 % (w/v) 5-bromi-4-kloori-3 -indolyyligalaktopyranosidia dimetyyli-formamidissa ja 10 μΐ 100 mM isopropyylitiogalaktosidia. Lisättiin 2,5 ml sulatettua B-yläagaria (10 g Bacto-tryp-5 töniä, 8 g NaCl:ia, 6 g agaria per litra vettä) ja seos kaadettiin B-ala-agaria (10 g Bacto-tryptonia, 8 g NaCl:ia, 12 g agaria per litra vettä) sisältävälle maljalle. Kun oli inkuboitu yli yön 37 °C:ssa, värittömät plakit (se tarkoittaa kloonit, jotka sisälsivät insertoidun 10 DNA:n) poistettiin maljoilta käyttäen steriilejä siirto-pipettejä ja ympättiin 1 ml:aan yli yön kasvanutta JM109-viljelmää, joka oli laimennettu 1:100 2 x YT-alustaan.
Bakteriofagiklooneja kasvatettiin 37 °C:ssa 6-8 tuntia ja sentrifugoitiin mikrosentrifugissa 5 minuuttia. 15 Solupelleteistä puhdistettiin plasmidin M13mpl9 RF-muoto käyttäen alkali-SDS-menetelmää ja suspendoitiin uudelleen 20 μΐ-.aan TE-puskuria, joka sisälsi 20 μg/ml DNaasi-ent-syymistä vapaata RNaasi-entsyymiä (Sigma, St. Louis, MO). Pienet määrät (1-3 μΐ) RF-valmisteista digestoitiin 10 -20 20 yksiköllä kutakin sopivaa restriktioentsyymiä (katso yllä) ja analysoitiin 0,8 % agaroosielektroforeesigeeleis-sä (katso yllä).
•J': M13mpl9-klooneja, jotka sisälsivät oikean kokoiset insertit, kasvatettiin suuremmissa määrissä yksijuosteisen 25 faagi-DNA:n saamiseksi sekvenssointia varten. 35 ml 2 x • · : YT-alustaa ympättiin 0,3 ml :11a yli yön kasvanutta JM109- • · · viljelmää. Kun oli kasvatettu 1 tunti 37 °C:ssa, 35 ml • · ... viljelmä ympättiin 200 μΐ-.lla sopivaa faagia sisältävää • · t * supernatanttia. Viljelmää inkuboitiin 6 tuntia 37 °C:ssa 30 ja viljelmän supernatantti kerättiin sentrifugoimalla *...* 9 000 kierrosta minuutissa 10 minuutin ajan JS13.1-root- • · · ·...· torissa. Faagi saostettiin 31 ml:sta supernatanttia lisää- ♦ , mällä 5 ml 4 M NaCl: ia ja 40 % (w/w) polyetyleeniglykoli 6000:tta ja sentrifugoimalla uudelleen, kuten yllä. Faagi-35 pelletti suspendoitiin uudelleen 0,4 ml:aan TE-puskuria, < 65 1 05 1 04 uutettiin fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholilla [50:49:1 (v/v)] kolme kertaa, kloroformi/isoamyylialkoholilla [49:1 (v/v)] kerran ja saostettiin etanolilla. DNA pelletti sus-pendoitiin uudelleen 20 /xl:aan TE-puskuria ja määritettiin 5 spektrofotometrisesti mittaamalla A260. Yhdessä sekvenssoin-tisarjassa käytettiin 1 μg faagi-DNA:ta.
Sekvenssointi suoritettiin Sanger'in dideoksimene-telmällä (Sanger, F.S. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei, USA. 1977, 74, 5463 - 5467) käyttäen M13 -20 ja M13 -40 univer-10 saalialukkeita (New England Biolabs, Beverly, MA) ja gee-nispesifisiä alukkeita (FX-alfa-globiinille käytettiin seuraavia alukkeita: alfa-1 5'-CGTATGTTCCTGTCTTT-3'; alfa-2 5'-ACAAACTGCGTGTTGAT-3'; FX-beeta-globiinille käytettiin seuraavia alukkeita: beeta-l 5'-GCTGGTTGTTTACCCGT-3'; bee-15 ta-2 5'-ACCCGGAAAACTTCCGTC-3').
Ekspressiovektorit pDLII-62m ja pDLII-10a M13mpl9-vektorista katkaistiin sopivat sekvenssit ja kloonattiin ekspressiovektoriin pKK-223-3 (Pharmacia/ LKB, Piscataway, NJ) Tae-promoottorin (Brosius, J. ja 20 Holy, A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984, 81, 6929-6933) säätelyn alaisuuteen. Alfa-globiinia koodittava DNA-sekvenssi poistettiin katkaisemalla EcoRI- ja Pstl-entsyy- • · · y : meillä. Globiinin sisältävä fragmentti puhdistettiin gee-
Iissä ja ligoitiin EcoRI- ja PstI-entsyymeillä katkaistuun ;\· 25 geelipuhdistettuun vektoriin pKK-223-3 käyttäen mene- • · : .·. telmiä, jotka on kuvattu yllä. £. coli JM109 -solut trans- • · · formoitiin ligaatioreaktiolla, joka sisälsi halutun FX- ... alfa-globiinisekvenssin (pDL II-62m) (kuvio 1) ja selek- • · · toitiin kasvattamalla 2 x YT-alustalla, joka sisälsi ampi-30 silliinia (100 μg/ml). Yksittäiset kloonit seulottiin ha- • · · *...* lutun insertin läsnäolon suhteen (antoi plasmidin pDL II- • * · 62m) puhdistamalla plasmidit alkali-SDS-puhdistuksella ja suorittamalla restriktioanalyysi EcoRI- ja Pstl-entsyym-,···, eillä käyttäen yllä kuvattuja menetelmiä. FX-beeta-glo- *!' 35 biinisekvenssin kloonaus ekspressiovektoriin pKK-223-3, joka antoi plasmidin pDL II-10a (kuvio 1) , suoritettiin 66 1 05 1 04 samoin, paitsi että restriktioanalyysi ja kloonaus suoritettiin PstI- ja HindiII-entsyymeillä.
Esimerkki 2
Synteettisten FX-alfa- ja FX-beeta-globiinien eril-5 linen ekspressio
Yksittäisten FX-globiinigeenituotteiden ekspression vahvistamiseksi E. coli JM109 -kloonit, jotka oli transformoitu joko plasmidilla pDL II-62m tai pDL II-10a, ympättiin 2 mlraan TB-alustaa, joka sisälsi ampisilliinia 10 (100 μg/ml). Ymppiä kasvatettiin 37 °C:ssa 3-4 tuntia, sitten jaettiin kahteen 1 ml osaan. Toinen osista indusoitiin lisäämällä IPTGitä (lopullinen konsentraatio 1 mM) ja kasvatettiin lisää 3-4 tuntia. Solut kerättiin sentri-fugoimalla, suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan SDS-PAGE-15 latauspuskuria ja kuumennettiin 85 °C:ssa 10 minuuttia. Solun kokonaisproteiiniseos ajettiin elektroforeesissa 15-%:isissä SDS-polyakryyliamidigeeleissä käyttäen autenttista hemoglobiinia molekyylipainostandardina.
Esimerkki 3 20 FX-alfa- ja FX-beeta-globiinigeenituotteiden poly- kistroninen yhteisekspressio samasta operonista (PDLII-66a) ja FX-hemoglobiinin muuttaminen hemo- • · · ·.· : globiiniksi • · : FX-alfa- ja FX-beeta-globiinien yhteisekspression 25 aikaansaamiseksi yhdestä polykistronisesta operonista FX- • · \ beeta-globiinisekvenssi plasmidista pDL II-10a katkaistiin • »· · irti Hindlll- ja Pstl-entsyymeillä, geelipuhdistettiin ja ligoitiin Pstl/Hindlll-entsyymeillä katkaistuun ja geeli-puhdistettuun pDL II-62m plasmidiin. Ligaatio- ja trans-30 formaatio-olosuhteet olivat samanlaiset kuin yllä kuvatut.
'···* Huomaa, että kutakin globiinikistronia edeltää "syöttökis- '...· troni", kuten aiemmin kuvattiin, niin että Tac-promootto- ··. rilla ohjatussa koko operonissa oli neljä kistronia. Kloo nit tarkastettiin yksittäin sekä FX-alfa- että FX-beeta-• 35 globiinigeenien läsnäolon suhteen digestoimalla plasmidit
EcoRI-entsyymillä ja erottamalla fragmentit 0,8 % agaroo-sissa tehdyllä elektroforeesilla. Plasmidit, jotka sisäl- « 105104 sivät molemmat geenit (pDL II-66a, kuvio 1) tuottivat noin 1,0 kiloemäksen pituisen fragmentin EcoRI-digestion jälkeen.
Klooneja, jotka sisälsivät plasmidin pDL II-66a, 5 kasvatettiin 2 mlrssa TB-alustaa, joka sisälsi ampisil-liinia (100 μg/ml), 4 tuntia 37 °C:ssa. Viljelmä jaettiin kahteen 1 ml osaan, joista toinen indusoitiin 1 mM IPTG:llä. Inkubointia jatkettiin 4 tuntia. Solun kokonais-proteiiniuutokset sekä indusoimattomista että indusoiduis-10 ta klooneista tarkasteltiin SDS-PAGE-elektroforeesilla FX- alfa- ja FX-beeta-globiinin yhteisekspression varmistamiseksi .
Sen määrittämiseksi, johtiko molempien geenituot-teiden yhteisekspressio tetrameerisen FX-alfa-globiini2 FX-15 beeta-globiini2 -proteiinin muodostumiseen, suoritettiin seuraavat kokeet. Kaksi litraa TB-alustaa, joka sisälsi ampisilliinia (100 μg/ml), ympättiin 20 ml:lla yli yön kasvanutta E. coli -kloonia, joka ekspressoi FX-alfa/FX-beeta-globiinia, ja kasvatettiin 37 °C:ssa niin, että sen 20 optinen tiheys 600 nm:ssa (OD600) oli 2,1. Viljelmä indusoitiin IPTG:llä (lopullinen konsentraatio 2,5 mM) ja kasvatettiin OD600-arvoon 3,5.
.* * Solut (40 g) kerättiin sentrifugoimalla 10 000 x g ja suspendoitiin 80 ml lyysispuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 25 8,0, 25 % sakkaroosi, 1 mM EDTA) . Lisättiin kymmenen mil- lilitraa lysotsyymiliuosta (18 mg/ml lyysispuskurissa) ja seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia. MgCl2:ia, MnCl2: ia ·;·. ja DNaasi I -entsyymiä (Sigma, St. Louis, MO) lisättiin niin, että lopulliset konsentraatiot olivat 10 mM, l mM ja 30 10 μg/ml, vastaavassa järjestyksessä. Soluja inkuboitiin ;;;* huoneenlämpötilassa 1 tunti ja lysaattiin lisättiin sama ;·* tilavuus liuosta, joka oli 1 % deoksikoolihappo, 1 % ·;· Nonidet P40, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA.
Partikkelimainen materiaali poistettiin sentrifu-35 goimalla 10 000 x g 10 minuuttia. Supernatanttia (noin 200 ml) kuplitettiin hiilimonoksidilla 5 minuuttia ja dia-lysoitiin yli yön 4 litraa vastaan 10 mM NaP04-puskuria, 68 105104
pH 6,0. Soluvapaa uutos kirkastettiin sentrifugoimalla 10 000 x g 10 minuuttia. Supernatanttiin lisättiin 20 g DE-52-resiiniä (Whatman, UK) . Suspension pH säädettiin 7,0:aan ja ioninvaihtoresiini poistettiin sentrifugoi-5 maila. Supernatantin pH säädettiin uudestaan 6,0 .-aan ja supernatantti ladattiin CM-selluloosapylvääseen (2,5 x 15 cm) , joka oli tasapainotettu 10 mM NaP04-puskurissa, pH
6,0, 4 °C:ssa. Pylväs pestiin kahdella patsastilavuudella 10 mM NaP04-puskuria, pH 6,0, jonka jälkeen suoritettiin 10 lineaarinen gradientti 10 mM NaP04-puskurista, pH 6,9 20 mM NaP04-puskuriin, pH 9,0 (400 ml kokonaistilavuus) . Fraktiot 36 - 42 sisälsivät punaisen liuoksen ja ne yhdistettiin; pieni määrä tästä liuoksesta tutkittiin 650 nm:sta 400 nm:iin, joka paljasti samanlaisen spektrin, joka on kar-15 boksihemoglobiinilla (kuvio 6). Pieni määrä samasta huipusta analysoitiin SDS-PAGE-elektroforeesilla käyttäen hemoglobiinia molekyylipainostandardina ja sen havaittiin sisältävän kaksi proteiinirintamaa, joiden molekyylipainot olivat noin 15 500 ja 16 200. Kuten odotettua, nämä rin-20 tamat kulkivat hiukan hitaammin kuin autenttinen hemoglobiini (alfan molekyylipaino = 15 100; beetan molekyylipai-no = 15 850) johtuen ehkä faktori Xa:n tunnistussekvenssin • · aiheuttamasta viiden aminohapon pidennyksestä. Tällä perusteella materiaali nimettiin FX-hemoglobiiniksi.
'·· 25 FX-hemoglobiinia (2,0 mg) digestoitiin huoneenläm- : : pötilassa 2 tuntia 3 ml-.ssa liuosta, joka oli 20 mM HEPES, ··; pH 7,4, 0,1 M NaCl, 10 mM CaCl2, joka sisälsi 2 mg tryp- !'; siiniä (Sigma, St. Louis, MO, 10 000 yksikköä/mg) . SDS- PAGE-elektroforeesi varmisti FX-hemoglobiinin muutoksen 30 materiaaliksi, joka kulki samalla nopeudella luonnollisen !! hemoglobiinin kanssa.
♦
Esimerkki 3A
FX-globiinituotteiden jakaantuminen E. coli -eks-pressiossa 35 100 ml viljelmät E. coli -klooneja, jotka ekspres- soivat FX-alfa-globiinia (plasmidi pDL II-62m), FX-beeta-globiinia (plasmidi pDL II-10a) ja FX-hemoglobiinia (plas- 69 105104 midi pDL II-66a), aloitettiin yli yön kasvaneiden viljelmien 1 ml:n ympillä. Kun oli kasvatettu 4 tuntia, proteii-niekspressio indusoitiin lisäämällä IPTG:tä niin, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 1 mM. Inkubointia jat-5 kettiin 3 tuntia lisää. Solut kerättiin sentrifugoimalla, punnittiin ja lyysattiin, kuten yllä on kuvattu, paitsi että DNaasi-käsittely tehtiin 30 minuuttia jäissä. Näytteet sentrifugoitiin 5 000 x g 10 minuuttia ja superna-tanttien (jotka edustivat liukoisten proteiinien fraktio-10 ta) lopullinen tilavuus tehtiin 2 ml:ksi H20:lla ja jäädytettiin -80 °C:ssa. Pelletit (jotka edustavat liukenemattomien proteiinien tai inkluusiokappaleiden fraktiota) pestiin kahdesti 5 ml:11a liuosta, joka oli 0,5 % Triton X-100, 1 mM EDTA, suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan H20:ta 15 ja jäädytettiin -80 °C:ssa.
Proteiinien jakaantumisen analyysi suoritettiin SDS-PAGE:11a ja Western-blottauksella. Primaarinen vasta-aine oli kanin anti-ihmis-hemoglobiini IgG. Western-blot-tausmenetelmä suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti 20 (Proto Blot Western Blot AP System, Promega Corp., Madison, WI) . Liukoisten ja liukenemattomien proteiinien näytteet, joiden määrät olivat 60 μg solun märkäpainoa, .* * analysoitiin FX-alfa- ja FX-beeta-globiinia ekspressoivis- ta klooneista. Koska FX-hemoglobiinikloonissa oli suurempi • · ‘.j 25 ekspressiotaso, analysoitiin materiaalia määrä, joka oli ainoastaan 15 μg solun märkäpainoa.
.··· Kuten taulukosta 11 nähdään, proteiinien jakaantu- minen vaihteli. FX-alfa-globiini oli havaittavissa ainoastaan liukoisessa fraktiossa, kun taas FX-beeta-globiini 30 jakaantui solun liukenemattoman ja liukoisen fraktion kes-" ken. FX-hemoglobiini, joka stabiloi kunkin erillisen ala- yksikön, löydettiin ainoastaan liukoisesta fraktiosta ja *i* konsentraationa, joka oli ainakin 2,6 kertainen verrattuna yksittäin ekspressoituihin alayksiköihin. Nämä tulokset 35 osoittavat, että FX-beeta-globiini on täysin liukoinen, kun sen sallitaan yhdistyä FX-alfa-globiinin kanssa.
70 105104
Esimerkki 4
Tetrameerisen FX-alfa/FX-beeta-mutanttihemoglobii-nin ekspressiovektorin rakentaminen ja ekspressio Hemoglobiini Beth Israel: Plasmidi pDL II-10a di-5 gestoitiin Sacl- ja Spel-restriktioentsyymeillä, puhdis tettiin geelissä ja eristettiin elektroeluutiolla. Sellaiset oligonukleotidit, joissa oli Beth Israel -hemoglobiinille sopiva kodonin muutos (beeta102 asn - ser) (kuvio 7) syntetisoitiin, kuten yllä on aiemmin kuvattu, niin että 10 ne ylsivät Sacl-restriktiokohdasta Spel-restriktiokohtaan.
Yksittäisten oligonukleotidien puhdistus ja määrän määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. Komplementaariset oligonukleotidit hybridisoitiin kuumentamalla 95 °C:ssa 10 minuuttia, jonka jälkeen annettiin hitaasti 15 jäähtyä huoneenlämpötilaan 2 tunnin aikana. Sitten pieni määrä hybridisoitua seosta yhdistettiin Sacl/Spel-entsyymeillä digestoidun geelissä puhdistetun plasmidin pDL II-10a kanssa niin, että moolisuhteet olivat samat kuin mitä käytettiin alkuperäisessä FX-alfa- ja FX-beeta-kloonauk-20 sessa. Lisättiin T4 DNA -ligaasia (2 yksikköä) ja seosta inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa. E. coli JM109 -kanta transformoitiin tällä ligaatioseoksella, kuten
( I
·' ‘ aiemmin on kuvattu. Yksittäiset kloonit eristettiin ja " plasmidit puhdistettiin ja sekvenssoitiin käyttäen aluket- .’·· 25 ta beeta-1 (yida supra) . Plasmidisekvenssointi suoritet- | : tiin Sequenase-käyttöpakkauksella (United States Biochemi- · cal Corp., Cleveland, OH) seuraten valmistajan ohjetta.
Sitten sopivasti mutatoitunut beeta-globiinisekvenssi katkaistiin Hindlll- ja Pstl-entsyymeillä, puhdistettiin gee- 30 Iissä ja kloonattiin plasmidiin pDL II-62m, kuten yllä on !! kuvattu.
;· Muut hemoglobiinimutantit: Synteettiset geenit,
jotka koodittivat hemoglobiini Cheverly- (beeta45 phe -ser) , hemoglobiini Providence/MSR- (beeta82 lys - asp) ja 35 hemoglobiini beeta67 vai - ile- ja hemoglobiini Kansas-pro-teiinia (beeta102 asn - thr) , valmistettiin samalla tavalla, paitsi että synteettiset oligonukleotidit ulottuivat SacII
71 105104 - Bglll-, Sali - Spel-, Ncol - Kpnl- ja Sacl - Spel -res-triktiokohtien yli, vastaavassa järjestyksessä (kuvio 7). Mutanttioligonukleotidien synteesi-, restriktioentsyymidi-gestio-, geelipuhdistus- ja ligaatio-olosuhteet olivat 5 samanlaisia kuin hemoglobiini Beth Israel -proteiinin tapauksessa käytetyt. Kaikki mutaatiot kloonattiin ensin plasmidiin pDL II-10a, sopivat kloonit sekvenssoitiin ja mutatoitu beeta-globiinigeeni jatkokloonattiin PstI- ja HindiII-entsyymeillä digestoituun plasmidiin pDL II-66a.
10 Plasmidin sekvenssointi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. E. coli -solut transformoitiin, viljeltiin ja indusoitiin, kuten aiemmin on kuvattu. FX-hemoglobiinimutantit puhdistettiin esimerkin 3 menetelmällä. Puhdistettujen hemoglobiinien hapensitominen on esitetty taulukossa 9.
15 Esimerkki 5
Synteettisen Met-alf a/Met-beeta-hemoglobiinin tuotto
Des-FX-alfa- ja Des-FX-beeta-globiinigeenien rakentaminen 20 Vahvistimme, että E. coli -bakteeri voi tuottaa tetrameerista fuusiohemoglobiinia. Faktori Xa:n substraa- .. tin tunnistuskohtaa koodattavien DNA-sekvenssien poistami- • · sen kunkin peptidin N-päästä pitäisi johtaa synteettisen hemoglobiinin (FX-vapaa; "des-FX") tuottoon, joka sisältää *: 25 N-pään metioniinin ainoana ylimääräisenä jäännöksenä.
: · Plasmidi pDL II-62m digestoitiin EcoRI-ja Pstl-entsyymeil- lä FX-alfa-globiinigeeniä sisältävän sekvenssin irrottami-:*; seksi. Sitten FX-alfa-globiinigeeni puhdistettiin geelis sä. Plasmidi pGEM-1 (Promega Corp.) linearisoitiin EcoRI-·. 30 ja PstI-entsyymeillä, puhdistettiin geelissä ja FX-alfa- *. globiinigeeni ligoitiin plasmidiin, kuten on aiemmin ku vattu. Kloonit (FX-alfa-pGEM) , jotka sisälsivät FX-alfa-globiinigeenin palsmidissa pGEM-1, tunnistettiin digestoi-/- maila puhdistetut plasmidit EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä, 35 jonka jälkeen suoritettiin agaroosigeelielektroforeesiana- 72 105104 lyysi. FX-alfa-pGEM digestoitiin Ndel- ja EagI-entsyymeillä faktori Xa:ta koodittavan sekvenssin poistamiseksi (kuvio 5) . Oligonukleotidit, jotka sisälsivät luonnollista alfa-globiinia koodittavan sekvenssin, syntetisoitiin sel-5 laisilla päillä, jotka olivat yhteensopivia Ndel- ja Eagl-restriktiokohtien kanssa (kuvio 8) . Synteesin jälkeen oligonukleotidit puhdistettiin, hybridisoitiin ja ligoitiin, kuten yllä on kuvattu. pGEM-des-FX-alfa-sekvenssi (pDL II-83a) varmistettiin dideoksisekvenssoimalla plasmidi käyt-10 täen T7-promoottorialuketta (Promega Corp., Madison, WI). Sitten klooni, joka sisälsi oikean sekvenssin, digestoitiin EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä. Des-FX-alfa-globiinigee-ni puhdistettiin geelissä, kloonattiin EcoRI/Pstl-diges-toituun geelissä puhdistettuun plasmidiin pKK-233-3 plas-15 midin pDL II-86c muodostamiseksi. E. coli JM109 -kanta transformoitiin ligaatioseoksilla ja yksittäisten kloonien des-FX-alfa-globiinin ekspressio määritettiin analysoimalla indusoitujen viljelmien ymppien solujen kokonaispro-teiiniuutokset (katso yllä). Des-FX-alfa-globiini, päin-20 vastoin kuin FX-alfa-globiini, kulkee autenttisen alfa-globiinin kanssa yhtä suurella nopeudella SDS-PAGE:ssa.
Des-FX-beeta-globiinisekvenssi valmistettiin samalla tavalla käyttäen FX-beeta-globiinigeeniä, joka oli irrotettu plasmidista pDL II-10a PstI- ja Hindlll-entsyy-25 meillä. Sitten tämä geelissä puhdistettu beeta-globiini-; sekvenssi ligoitiin plasmidiin pGEM-1, joka oli digestoitu samoilla kahdella entsyymillä. Sellainen pGEM-1-plasmidi, joka sisälsi FX-beeta-globiinigeenin, digestoitiin Ndel-ja SacII-entsyymeillä, puhdistettiin geelissä ja sitä käy-30 tettiin rakennettaessa des-FX-beeta-globiinigeeni. Halutun sekvenssin sisältävät oligonukleotidit (kuvio 20) syntetisoitiin, puhdistettiin, hybridisoitiin ja ligoitiin Ndel-’ ja SacII-entsyymeillä katkaistuun plasmidiin pGEM-FX-beeta ϊ plasmidin pGEM-des-FX-beeta (pDL III-6f)· muodostamiseksi, 35 kuten yllä on kuvattu. Kun oli varmistettu, että sekvenssi 73 105104
oli oikea, des-FX-beetageeni poistettiin PstI- ja Hindlll-entsyymeillä ja puhdistettiin geelissä. Sitten des-FX-beeta ligoitiin des-FX-alfaa sisältävään plasmidiin pDL
II- 86c käyttäen Pstl/Hindlll-kohtia. Kloonit, jotka sisäl-5 sivät sekä des-FX-alfa- että beeta-globiinigeenit (pDL
III- 13e) (kuvio 9), varmistettiin puhdistettujen plasmi-dien EcoRI-digestiolla (katso yllä) ja seulottiin ekspression suhteen vertaamalla IPTGrllä indusoituja ja indusoi-mattomia viljelmiä. Des-FX-hemoglobiini kulkee samalla 10 nopeudella luonnollisen hemoglobiinin kanssa SDS-PAGE: ssa.
Met-hemoglobiinin (Des-FX-Hgb) karakterisointi Rekombinanttimetionyyli-hemoglobiinilla on erilaiset reaktio-ominaisuudet kuin hemoglobiini A^lla kloori-ja fosfaatti-ionien läsnä ollessa (taulukko 10) ja vetyio-15 nikonsentraation muutoksissa (kuvio 10) . Syyn tähän ajatellaan johtuvan molempien globiinien N-päässä olevasta lisäaminohaposta, metioniinista. Alfa-ketjun N-pään amino-ryhmä on tärkeä fosfaatti-ionin aiheuttamalle Ps0-arvon muutokselle. N-pään aminoryhmän syrjäyttäminen paikaltaan 20 tai sen elektronisen tilan muuttaminen metioniinin lisäyksellä voi muuttaa näitä vaikutuksia.
Inositoliheksafosfaatti-ionin läsnä ollessa havait-tu P50-arvon kohoaminen on vailla merkitystä mille tahansa liuoksessa olevalle hemoglobiinille, koska plasmasta löy-25 detty monofosfaatti-ionikonsentraatio ei ole tarpeeksi korkea, jotta se kohottaisi P50-arvoa merkittävästi. Plasmasta ei löydy yhtään inositoliheksafosfaatti-ionia. Se PS0-arvon kohoaminen, joka tarvitaan, jotta liuoksessa oleva hemoglobiini luovuttaa tehokkaasti hapen, saadaan ai-. 30 kaan parhaiten sisällyttämällä mutaatioita, jotka muodos- , tavat hapelle alemman affiniteetin sisältävän hemoglobii- « nin.
Mitä tulee kloori-ionin aiheuttamaan PS0-arvon muu-’ toksen suuruuteen, se ei ole fysiologisesti tärkeää. Vai- 35 kutus, joka on mielenkiintoinen sen biokemiallisten meka- 74 105104 nismien suhteen, ei lisää merkittävästi liuoksessa olevan hemoglobiinin hapenluovutuskapasiteetin määrää. Joillain eläinten hemoglobiineilla on erittäin pienet kloorivaiku-tukset. Jälleen, kloorin vaikutuksen on ajateltu välitty-5 vän alfa-globiinin N-pään aminoryhmän välityksellä; metio-nyyli-hemoglobiinilla tämä vaikutus voi olla muuttunut johtuen eteerisestä muutoksesta tai siitä, että metionii-nin aminoryhmän pKa on erilainen kuin valiinin vastaava.
Hemoglobiinin P50-arvo muuttuu normaalisti dramaat-10 tisimmin vetyionikonsentraation mukaan. Niin sanottuun "Bohrin vaikutukseen" on ajateltu osaksi ottavan osaa alfa-globiinin N-pään aminoryhmä. Useilla ihmisen mutantti-hemoglobiinimolekyyleillä on osoitettu olevan muuttuneet Bohrin vaikutusmuutokset ilman mitään fysiologisia puutok-15 siä. On edullista, että liuoksessa useisiin erilaisiin lääketieteellisiin ja biokemiallisiin sovellutuksiin käytettävällä hemoglobiinimolekyylillä on rajoitettu Bohrin vaikutus kuin myös fosfaatti- ja kloorivaikutukset. Bohrin vaikutusta ajatellen on metionyyli-hemoglobiinille olemas-20 sa useita sovellutuksia, joissa sitä voidaan käyttää emäk-sisemmillä pH-alueilla, esim. kudosviljelyssä, elimen per-fuusiossa. Kuvio 10 esittää alustavan kokeen, joka osoitti, että P50-arvo on todellisuudessa suurempi metionyyli-hemoglobiinille kuin hemoglobiini A^lle korkeammissa ‘; 25 pH:ssa kuin 7,8. Kuviosta 10 voidaan havaita, että esitet täessä P50-arvo graafisesti pH:n funktiona, kulmakerroin Met-Hgb:lle on matalampi kuin Hgb A^lie, se tarkoittaa, että Bohrin vaikutus on pienempi. Myöhemmät kokeet antavat olettaa, että ero Bohrin vaikutuksessa Met-Hgb:n ja Hgb 30 A^n välillä on pienempi kuin kuviossa 10 esitetty.
Pääasiallisin etu käytettäessä sellaista hemoglobiinimolekyyliä, jolla on vakiintuneet P50-arvon muutokset :* suhteessa pH:hon, klooriin ja fosfaattiin on se, että ' käyttäjä tietää formulaation hapenluovutuskapasiteetin 75 105104 tarvitsematta välittää sen spesifisistä käyttöolosuhteista .
Esimerkki 6
Luonnollisen kokoisen synteettisen hemoglobiinin 5 (Des-Val-Hgb) syntetisoiminen
Des-Val-alfa- (pDL II-91f) ja Des-Val-beeta- (pDL
III-la) globiinigeenien rakentaminen DNA-sekvenssit, jotka koodittavat globiinigeenejä, joissa N-pään valiinikodoni kussakin geenissä on korvattu 10 ATG-kodonilla (metioniini), rakennettiin samalla tavalla kuin des-FX-kloonit, paitsi että sisällytetyt oligonukleo-tidit (kuvio 8) olivat sellaisia, jotka koodittivat aminohapposekvenssejä "met-leu..." ja "met-his..." alfa- ja beeta-globiinigeeneille, vastaavassa järjestyksessä. Kun 15 oli varmistettu oikea sekvenssi vektorissa pGEM-1 oleville sekä des-val-alfa (pDL II-91f) että des-val-beeta (pDL II-95a) -geeneille, des-val-alfa-globiinigeeni kloonattiin EcoRI/Pstl-entsyymeillä katkaistuun vektoriin pKK-223-3 (katso yllä) niin, että muodostettiin plasmidi pDL III-la. 20 Des-val-beeta-globiinigeeni plasmidista pDL II-95a kloonattiin sitten plasmidiin pDL III-la käyttäen PstI/ Hindlll-restriktiokohtia.
Erikoisemmin, des-val-alfa-siirtovektori valmistettiin plasmidista pDL II-62m seuraavasti. Plasmidi pDL II- « i 25 62m digestoitiin EcoRI- ja PstI-entsyymeillä FX-alfa-glo- * biinigeenin sisältävän fragmentin irrottamiseksi. Sitten ': FX-alfa-globiinigeeni puhdistettiin geelissä. Plasmidi pGEM-1 (Promega Corp.) linearisoitiin EcoRI- ja Pstl-ent- syymeillä, puhdistettiin geelissä ja FX-alfa-globiinigeeni , 30 ligoitiin plasmidiin, kuten aiemmin on kuvattu. Oli tar- , peellista jatkokloonata plasmidiin pGEM-1, koska plasmi- < dissa pKK-223-3 olevat ylimääräiset restriktiokohdat estivät FX:ää koodattavan sekvenssin poistamisen suoraan yksittäisistä FX-alfa- ja FX-beeta-globiinigeeneistä. Kloo-35 nit, jotka sisälsivät FX-alfa-globiinigeenin plasmidissa 76 105104 pGEM-1, tunnistettiin digestoimalla puhdistetut plasmidit EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä, jonka jälkeen suoritettiin agaroosigeelielektroforeesianalyysi. Plasraidi FX-alfa-pGEM-1 digestoitiin Ndel- ja EagI-entsyymeillä FX-alfaa 5 koodittavan sekvenssin poistamiseksi ja sellaiset oligonukleotidit, jotka sisälsivät luonnollista alfa-globiinia koodittavat DNA-sekvenssit, joissa N-pään väliini oli korvattu metioniinilla, syntetisoitiin niin, että niiden päät olivat yhteensopivia Ndel- ja Eagl-restriktiokohtien kansio sa. Syntetisoinnin jälkeen oligonukleotidit puhdistettiin, hybridisoitiin ja ligoitiin, kuten on kuvattu yllä. Plas-midin pGEM-des-val-alfa (plasmidi pDL II-91f) sekvenssi varmistettiin plasmidin dideoksisekvenssoinnilla käyttäen T7-aluketta (Promega Corp., Madison, Wisconsin). Klooni, 15 joka sisälsi oikean des-val-alfa (pDL II-91f) -sekvenssin, digestoitiin sitten EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä. Des-val-alfa-globiinigeeni puhdistettiin geelissä ja ligoitiin EcoRI/Pstl-entsyymeillä digestoituun geelissä puhdistettuun vektoriin pKK-223-3 niin, että muodostettiin plasmidi 20 pDL III-la.
Des-val-beeta-globiinisiirtovektori valmistettiin ... samalla tavalla käyttäen FX-beeta-globiinigeeniä plasmi- • Il dista pDL II-10a. FX-beeta irrotettiin plasmidista pDL II- « · : " 10a PstI- ja Hindi-entsyymeillä. Tämä geelissä puhdistettu
« I
*: 25 beeta-globiinisekvenssi ligoitiin sitten plasmidiin pGEM- : 1, joka oli katkaistu samoilla kahdella entsyymillä. Sei- ”*’· lainen pGEM-klooni, joka sisälsi FX-beeta-globiinigeenin, digestoitiin Ndel- ja SacII-entsyymeillä, puhdistettiin geelissä ja käytettiin rakennettaessa des-val-beeta-glo- .···. 30 biinigeeni. Oligonukleotidit, jotka koodittivat des-val- • · .···. beetan koko haluttua sekvenssiä syntetisoitiin, puhdistet- • · *" tiin, hybridisoitiin ja ligoitiin Ndel- ja SacII-entsyy- meillä katkaistuun plasmidiin pGEM-FX-beeta niin, että muodostettiin plasmidi pGEM-des-val-beeta (plasmidi · pDL ;·. 35 II-95a) . Kun oli varmistettu, että sekvenssi oli oikea
I I I
III
77 105104 des-val-beeta-globiinille, geeni poistettiin PstI- ja Hindlll-entsyymeillä ja puhdistettiin geelissä.
Plasmidien pDL III-14c ja III-38b (polykistroniset des-val-alfa/des-val-beeta-geenikloonit) valmistus 5 Plasmidi pDL III-laf joka sisälsi Des-Val-alfa- globiinigeenin, digestoitiin PstI- ja Hindlll-entsyymeillä ja puhdistettiin geelissä. Des-Val-beeta-globiinigeeni poistettiin plasmidista pDL II-95a käyttäen samaa menetelmää. Ligaation ja transformaation jälkeen yksittäiset 10 kloonit, jotka sisälsivät Des-Val-alfa/des-val-beeta-glo- biinia yhteisekspressoivan plasmidin pDL III-14c, analysoitiin Des-Vai-hemoglobiinin tuoton suhteen IPTG-induk-tiolla ja SDS-PAGE:11a.
Sitten rakennettiin ja analysoitiin plasmidi pDL 15 III-38b, joka sisälsi Des-Val-beeta-globiinigeenin Des-
Val-alfa-globiinigeenin 5'-puolella.
Plasmidi pDL III-la, joka sisältää des-val-alfa-globiinigeenin, linearisoitiin Smal-restriktioentsyymillä. Sitten plasmidia käsiteltiin bakteerin alkalisella fosfa-20 taasilla 5'-päiden fosfaattiryhmien poistamiseksi, uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudelleen TE-puskuriin, kuten yllä. Des-val-beetageenin * · · sisältävä klooni pGEM-1 digestoitiin Hindlll-entsyymillä, ·' ” uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja suspendoi- *· “· 25 tiin uudelleen ligaatioseokseen, joka sisälsi 50:1 molaa- • · :.: : risen suhteen Hindlll-Smal-linkkeriä verrattuna plasmi- diin. Sitten tämä ligaatioseos digestoitiin Smal-entsyymi*: millä ja beeta-globiinifragmentti, jossa nyt oli Smal-res- triktiokohdat sekä 5'- että 3'-päissä, puhdistettiin gee-.***. 30 Iissä ja lisättiin ligaatioreaktioon, joka sisälsi yllä .···. olevan plasmidin pDL III-la linearisoidun muodon saaden • · **j näin plasmidi pDL III-38b. Alfa- ja beeta-globiinigeenien orientaatiot plasmideissa pDL III-14C ja pDL III-38b var- • · · mistettiin restriktioanalyysillä.
35 E. coli JM109 -kannan solut transformoitiin plasmi- '···. deilla pDL III-14C ja pDL III-38b ja kasvatettiin 2 x YT- « · alustassa, joka sisälsi ampisilliinia. Pesäkkeet indusoi- 78 105104 tiin IPTG:llä, kuten yllä. Yksittäiset kloonit analysoitiin niiden kyvyn suhteen tuottaa des-val-alfa- ja des-val-beeta-globiinipolypeptidejä SDS-PAGE:lla ja Western-blottauksella. Ei ollut mitään olennaista eroa immunoreak-5 tiivisen des-val-alfa- tai des-val-beeta-globiinin eks-pressiossa orientaatiosta alfa -* beeta (pDL lll-14c) tai orientaatiosta beeta -♦ alfa (pDL III-38b).
Esimerkki 7
Des-FX- ja Des-Val-rekombinanttihemoglobiinien ana- 10 lyysit ja toimintaominaisuuksien vertailu JM109-soluja, jotka ekspressoivat joko des-FX-hemo- globiinia (dFX-hgb) tai des-Vai-hemoglobiinia (dV-hgb), kasvatettiin 10 litran fermentorissa OD600-arvoon 15 ja sitten indusoitiin lisäämällä IPTGrtä 300 pMrksi. Indu- 15 sointiaika oli 6 tuntia. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja jäädytettiin -80 eC:ssa, kunnes käytettiin.
Hemoglobiinin puhdistamiseksi noin 200 g soluja suspendoitiin uudelleen 350 ml:aan 50 mM natriumfosfaat- tipuskuria (NaPi), pH 7,0, joka sisälsi 200 yksikköä apro- 20 tiniinia/ml ja 20 yg DNaasi I-entsyymiä/ml. Sitten solut lyysattiin lisäämällä 1 mg lysotsyymiä/ml ja vietiin neljä ·;·. kertaa Dynomill-laitteen läpi. Soluroskat poistettiin • · « sentrifugoimalla 10 000 kierrosta minuutissa Beckman JA14 • · « . -roottorissa 4 °C:ssa 40 minuuttia. Supernatantti lisät- / / 25 tiin 200 ml:aan hemoglobiinia sitovaa resiiniä, joka oli ··· · tasapainotettu 10 mM NaPi-puskurilla, pH 7,0. pH säädet- ' ’ tiin 7,0:aan 10 M NaOH-liuoksella tai konsentroidulla fos- ·.· * forihapolla. Sitten resiini laitettiin 5 x 30 cm kokoi seen kromatografiapylvääseen ja annettiin asettua. Sitten 30 pylväs pestiin 2,5 pylvään tilavuudella 10 mM NaPi-pusku- • · · ria, pH 7,0, joka sisälsi 100 yksikköä aprotiniinia/ml.
• · · *. Hemoglobiini eluoitiin pylväästä 20 mM Tris-HCl-puskuril- • · · ·;;; la, pH 7,5, joka sisälsi 100 yksikköä aprotiniinia/ml.
« · ’··' Tämä osittain puhdistettu hemoglobiini suodatettiin sitten 35 0,2 mikronin suodattimen läpi ja ladattiin 1,6 x 10 cm • · · • · • « • · · 79 105104
Mono-Q anioninvaihtopylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCl-puskurilla, pH 8,0. Hemoglobiini eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia, joka oli 0 - 0,4 M NaCl 20 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0. Sitten materiaali la-5 dattiin 1,6 x 10 cm Mono-S kationinvaihtopylvääseen. Hemoglobiini eluoitiin lineaarisella gradientilla, joka oli 10 mM NaPi-puskuri, pH 7,0 - 10 mM NaPi-puskuri, pH 8,5, 160 mM NaCl. Hemoglobiinin pääasiallinen huippu kerättiin, konsentroitiin konsentraatioon noin 100 mg/ml ja käytet-10 tiin analyysiin.
Rekombinanttihemoglobiinin toiminta arvioitiin käyttäen Hemox-analysaattoria 25 °C:ssa 50 mM HEPES-pus-kurissa, pH 7,4, joka oli 0,1 M Cl‘-ionien suhteen. Saatiin seuraavat hapensitomistulokset: 15
NÄYTE P50 N
A0 4,03 2,7 dFX-hgb 3,43 2,6 dV-hgb 7,04 2,8 20
Merkittävää näissä tuloksissa ovat seuraavat asiat: ·;·. 1) Ylimääräisen aminohapon metioniinin lisäys alfa- .! ja beeta-globiinien N-päihin (dFX-hgb) tuntuu alentavan • «· . hiukan molekyylin P50-arvoa, mutta sillä on ainoastaan vä- • · « *· 25 hän vaikutusta yhteisvaikutukseen (N).
··’· *· 2) Alfa- ja beeta-globiinien N-päiden valiinien korvaaminen metioniinilla (dV-hgb) kohottaa molekyylin • · · : P50-arvoa, mutta sillä ainoastaan vähän vaikutusta yhteis vaikutukseen (N).
:***; 30 Esimerkki 8 • · · .***. Des-Val-alfa/alfa- (di-alfa) ja Des-Val-beeta-glo- • · · biinin polykistroninen yhteisekspressio
Ψ f P
Kokonaissynteesisuunnitelma plasmidin (pDL III-47a), joka yhteisekspressoi di-alfa-globiinia ja beeta- : 35 globiinia, valmistamiseksi on annettu alla. Lähtömateriaa- • · · • · « · • · · 80 1 05 1 04 lit ovat kaupallisesti saatavat siirtovektorit M13mpl9-RF, pKK-223-3 ja pGEM-1 ja synteettiset oligonukleotidit, jotka on kuvattu esimerkeissä.
Mukavuuden vuoksi käsittelymme alkoivat plasmideil-5 la pDL II-62m ja pDL II-10a. Plasmidi pDL II-62m saatiin kloonaamalla "FX-alfa-globiini"-geeni plasmidiin pKK-223-3 alavirtaan Tac-promoottorista. Plasmidi pDL ll-10a valmistettiin insertoimalla "FX-beeta-globiini"-geeni samalla tavalla.
10 Kuten kuviossa 14 on kuvattu yksityiskohtaisemmin, "FX-alfa-globiini"-operoni koodittaa kahta kistronia, joista ensimmäinen ekspressoi "syöttö"-oktapeptidiä ja toinen alfa-globiinia, jota edeltää ryhmä Met-Ile-Glu-Gly-Arg. Jälkimmäiset neljä aminohappoa muodostavat faktori 15 X:n katkaisuaktiivisuuden tunnistuskohdan. "FX-beeta-globiini "-operoni rakennettiin samalla tavalla.
Koska faktori X:n tunnistuskohtaa ei tarvittu tässä, geneettistä materiaalia käsiteltiin niin, että "FX"-kodonit poistettiin. (Tämä olisi voitu välttää syntetisoi-20 maila halutut di-alfa-globiini- ja des-val-beeta-globiini-geenit suoraan mieluummin kuin käyttäen FX-alfa- ja FX-;·, beetageenejä plasmideista pDL II-62m ja pDL II-10a. ) FX- ;·, alfa-globiinigeenikasetti irrotettiin ja kloonattiin plas- . midiin pGEM-1 saaden plasmidi pGEM-FX-alfa. Samalla taval- 25 la FX-beetageeni plasmidista pDL II-10a siirrettiin plas- « 4 » ··* \ midiin pGEM-1 saaden plasmidi pGEM-FX-beeta.
Tunnistuskohtaa (FX) koodittava sekvenssi voitiin • · · * nyt poistaa plasmideista pGEM-FX-alfa ja pGEM-FX-beeta saaden plasmidit pDL II-91f ja pDL II-95a, vastaavassa 30 järjestyksessä. Plasmidin pDL ll-91f des-val-alfa-globii- :***: nigeeni kloonattiin uudestaan plasmidiin pKK-223-3 muodos- • · · taen plasmidi pDL Ill-la, jossa geeni oli toiminnallisesti liitetty plasmidin pKK-223-3 Tac-promoottoriin. Plasmidin '·;·* pDL II-95a des-val-beeta-globiinigeeni puhdistettiin ja 35 insertoitiin plasmidin pDL III-la des-val-alfa-globiini- • · · • · 4 · • « · 81 105104 geenin alavirtaan niin, että muodostettiin yksi transkrip-tioyksikkö, joka pystyi koodittamaan polykistronista alfa-globiini/beeta-globiini mRNA:ta, katso plasmidi pDL III-14c. Lopuksi synteettiset oligonukleotidit, jotka sisälsi-5 vät haluttua di-alfa-linkkeriä koodittavan sekvenssin ja toisen kopion alfa-globiinigeenistä, insertoitiin plasmi-diin pDL III-14c niin, että muodostettiin plasmidi pDL III-47a, jossa Tac-promoottori säätelee di-alfa-globiini-geenin ja des-val-beeta-globiinigeenin transkriptiota.
10 Plasmidin pDL III-47a (di-alfa/beeta-globiinikloo- ni) valmistus
EagI- ja Pstl-restriktiofragmentti, joka sisälsi suurimman osan plasmidin pDL II-91f alfa-globiinigeenistä, puhdistettiin geelissä ja ligoitiin synteettiseen link-15 keri-DNA:han, joka sisälsi alfa-globiinigeenisekvenssin BstBI-kohdasta sen karboksipäähän, glysiinilinkkerin ja alfa-globiinin aminopään Eagl-kohtaan asti (kuvio 12). Kun tämä ligaatioseos oli digestoitu PstI-entsyymillä, tuloksena syntynyt fragmentti kloonattiin BstBI/Pstl-katkais-20 tuun plasmidiin pDL III-14c niin, että muodostettiin plasmidi pDL III-47a (kuvio 13).
Di-alfa/beeta-hemoglobiinin ekspressio Yksittäiset E. coli -kloonit analysoitiin Western- • · , blottauksella yhdessä monomeerisen beeta-globiinin kanssa
I I
/ / 25 olevan dimeerisen alfa-globiiniproteiinin tuoton suhteen.
Iti ί·: ; Sopivan plasmidirakenteen olemassaolo varmistettiin diges- toimalla EcoRI-entsyymillä ja ajamalla 0,8 % agaroosigee- • ·· V · lielektroforeesi. Di-alfa-rakenteissa läsnä oleva EcoRI- fragmentti on pituudeltaan noin 1 450 emäsparia.
:***: 30 Geneettisesti yhteenliitetyn hemoglobiinin ekspres- »·· ;***: sio saatiin aikaan käyttäen IPTG-indusointimenetelmää ja • · · rekombinanttihemoglobiinin S-Sepharose -puhdistusta. E.
• 9 · ··;; coli -solut (400 ml) kasvatettiin OD600-arvoon 3,0 ja indu- « * ‘···* soitiin 1 mM IPTG:llä. Solujen annettiin jatkaa kasvuaan 35 toiset 4 tuntia ja sitten kerättiin sentrifugoimalla. So- • • I <
I
4 I
« I I
82 105104
lupelletti suspendoitiin uudelleen 10 mM natriumfosfaat-tipuskuriln, pH 6,0, joka oli 1 mM bentsamidiinin, 1 mM EDTA:n ja 0,1 % Triton X-100:n suhteen. Sitten solususpen-sio sonikoitiin, sentrifugoitiin 15 000 x g 15 minuuttia 5 ja supernatantti ladattiin S-Sepharose-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 10 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH
6,0. Kun näyte oli ladattu pylvääseen, pylväs pestiin 10 patsaan tilavuudella 10 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 6,8. Di-alfa-hemoglobiini eluoitiin pylväästä 10 mM nat-10 riumfosfaattipuskurilla, pH 7,4, joka oli 30 mM NaCl:n suhteen. Hemoglobiinin tuoton varmistus suoritettiin puhdistetun materiaalin näkyvän valon spektroskopialla, SDS-PAGE:lla ja Western-blottauksella.
Esimerkki 9 15 Matalan affiniteetin sisältävien di-alfa-mutantti- hemoglobiinien valmistus
Di-alfa-rekombinanttihemoglobiinin happiaffinitee-tin alentamiseksi beeta-globiinipolypeptideihin sisällytettiin useita mutaatioita käyttäen synteettisiä oligonuk-20 leotideja. Näiden mutanttien insertoimiseksi käytetyt res-triktiokohdat esitetään taulukossa 3. Nagai- (beeta Vai 67 -1 Ile) ja Arg-Nagai- (myös beeta Lys 82 -» Arg) mutaa- • i t .! tioiden insertoimiseksi des-Val-beeta-plasmidi pDL II-95a digestoitiin Ncol- ja Kpnl-restriktioentsyymeillä ja puh- 25 distettiin geelissä. Oligonukleotidit, jotka ulottuivat ϊ.ί ϊ näiden kahden restriktiokohdan yli ja sisälsivät sopivat *·1’1 kodonimuutokset, syntetisoitiin, puhdistettiin, hybridi- ··· ί.ί · soitiin ja ligoitiin geelissä puhdistettuun plasmidiin.
Kun oli varmistettu oikean sekvenssin läsnäolo, des-Val- ;'”j 30 beeta-mutanttihemoglobiinigeeni irrotettiin PstI- ja • · · .·2. HindiII-entsyymeillä, puhdistettiin geelissä ja kloonat- ·· · \ tiin plasmidiin pDL IIl-47a. Beeta-globiinigeeni, joka • · · ··1· sisälsi Kansas-mutaation (beeta Asn 102 -» Thr), rakennet- • · « • · tiin samalla tavalla käyttäen Sacl- ja Spel-restriktiokoh- • · « · • «· · · • · • · 2 • · · 83 105104 tia. Mutatoidut kodonit kaikille näille beeta-globiinimu-taatioille esitetään taulukossa 3 pienillä kirjaimilla.
Esimerkki 10
Di-alfa-hemoglobiinien karakterisointi 5 Hapensitominen
Hapensitomismittaukset suoritettiin 37 °C:ssa He-mox-analysaattorissa (Southampton, PA). Liuokset olivat 50 mM bis-Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCl ja 60 μΜ di-alfa-hemo-globiinin hemiekvivalenttia. Liuokset mitattiin 120 ja 1,5 10 torrin happipaineiden välillä • P5o -arvot on annettu taulukossa 4.
Puoliintumisaika in vivo
Valmistettiin di-alfa-hemoglobiini (villityyppi), joka sisälsi gly-gly-linkkerin alfaan ja alfa2:n välissä, 15 kuten on aiemmin kuvattu. Proteiini formuloitiin 20 mM NaP04-puskuriin, pH 7,4 konsentraatioksi 95 mg/ml. Di-alfa-hemoglobiini infusoitiin koiraspuolisiin Sprague-Dawley-rottiin (388 - 426 g) annoksena, joka oli 875 mg/kg, kes-kuslaskimokatetrin välityksellä 20 - 30 sekunnissa. Veri-20 näytteet otettiin aikapisteinä 2, 30, 80, 90, 120, 150, 180, 210 ja 240 minuuttia heparinoituihin pulloihin. Veri sentrifugoitiin punaisten verisolujen poistamiseksi ja plasman hemoglobiini määritettiin mittaamalla absorbanssi \ : 540 nm:ssä. Jäljelle jääneen hemoglobiinin prosenttiosuus • 1 ( 25 ajan funktiona määritettiin vertaamalla 2 minuutin aika- • « · *** ’ pisteeseen, jonka oletettiin olevan homogeenisesti sekoit tunut näyte. Sama koe toistettiin ei-yhteenliitetyllä des-*.* * val-hemoglobiinilla konsentraationa 100 mg/ml. Tuloksista otettiin keskiarvot kullekin näytteelle ja esitettiin : : 30 graafisesti jäljelle jääneen hemoglobiinin prosenttiosuu- tena infuusion jälkeisen ajan funktiona. Mitatut puoliin- ··· tumisajat olivat 205 minuuttia ja 104 minuuttia di-alfa- • · » ’\\\ hemoglobiinille ja des-val-hemoglobiinille, vastaavassa '···' järjestyksessä.
« · * · « «« « « « t < • · M* 84 105104
Esimerkki 11
Villityypin Des-Val-alfa-globiinin ja di-alfa-glo-biinin yhteisekspressio Presbyterian-mutaation sisältävän Des-Val-beeta-globiinin kanssa 5 Plasmidi pSGE0.0-E4 on esitetty kuviossa 14 ja se sisältää seuraavat modifikaatiot verrattuna muihin plas-midista pKK-223-3 peräisin oleviin ekspressiovektoreihin.
1) Plasmidi sisältää nyt toimivan tetrasykliinire-sistenssigeenin.
10 2) Plasmidiin on sisällytetty lacl-geeni, joka koodittaa lac-repressoriproteiinia. Lac-repressoripro-teiini repressoi Tac-promoottoria, kunnes se indusoidaan IPTG:llä. Repressorigeeni insertoitiin plasmidiin sellaisten E. coli -solulinjojen transformaation sallimiseksi, 15 joilla ei ole sisäisiä lac-repressorigeenejä.
Des-Val-beeta-globiinigeeni, joka sisältää Presbyterian-mutaation, rakennettiin insertoimalla komplementaarinen synteettisten oligonukleotidien pari plasmidin pSGEO.0-E4 SacI-Spel-restriktiokohtiin.
20 Seuraavia oligonukleotideja (Pres-A ja Pres-B) käy tettiin rakennettaessa Presbyterian-mutaatio dVal-beeta-globiiniin.
Pres-A 5’ CCACTGCGACAAACTGCACGTTGACCCGG (jatkuu alla) 25 Pres-B 3' TCGAGGTGACGCTGTTTGACGTGCAACTGGGCC (jatkuu alla) ··· · Sacl • ———
Pres-A AAAACTTCCGTCTGCTGGGTaaaGTA 3’ • · · V : Pres-B T T T TGAAGGCAGACGACCCA111 CAT GATC 5'
Spel
M MM
: : 30 • ·· ·’*· Kun oli digestoitu kahdella restriktioentsyymillä, ·« « *. plasmidi puhdistettiin geelissä villityyppiä koodittavan • · · ·;;; DNA-fragmentin poistamiseksi. Sitten hybridisoidut oligo- • · '·· * nukleotidit ligoitiin plasmidiin. Kun oli transformoitu 35 JM109-solut, valittiin yksittäiset pesäkkeet ja analysoi- • · · • » * « • · · 85 1 05 1 04 tiin alfa- ja beeta-globiinien tuoton suhteen IPTG-indu-soinnilla ja SDS-PAGE:lla. Dideoksisenvenssointia käytettiin varmistettaessa Presbyterian-mutaation läsnäolo.
Mutanttihemoglobiini tuotettiin, puhdistettiin ja 5 analysoitiin, kuten on kuvattu esimerkissä 7 yllä. Saatiin seuraavat tulokset:
NÄYTE P50 N
A0 4,03 2,7 10 dV-hgb 7,04 2,8 dV-hgbPres 33,0 2,5
On huomattava, että Presbyterian-mutaatio, joka johtaa beetan asparagiinin 108 muuttumiseksi lysiiniksi, 15 alentaa molekyylin affiniteettia hapelle 10-kertaisesti, mutta ei vaikuta molekyylin yhteisvaikutukseen.
Presbyterian-mutaatiota on yhteisekspressoitu myös yhden glysiinilinkkerin sisältävän di-alfa-globiinin kanssa käyttäen plasmidia pSGEl.l-E4 (kuvio 15). Alla esitetyt 20 tulokset osoittavat, että alfalrn karboksipään liittämisellä alfa2:n aminopäähän ei ole mitään vaikutusta hapen-•:\ sitomiseen ja yhteisvaikutukseen.
a t > i
NÄYTE P50 N
25 dV-hgbPres 33,0 2,5 ··· | di-alfa/Pres 33,0 2,4 • · M« V *’ Esimerkki 12
Kaksipromoottorisysteemin rakentaminen di-alfa-glo- 30 biinin ja beeta-globiinin yhteisekspressoimiseksi :***· Tässä esimerkissä di-alfa-globiinigeeni on toimin- $·· *. nallisesti liitetty yhteen promoottoriin ja beeta-globii- a nigeeni toiseen promoottoriin, mutta molemmat geenit si- • · ' ’·· * jaitsevat samassa vektorissa.' Vertaa esimerkit 16 ja 17, 35 infra.
• r • · · • · • · • · · 86 105104
Oligonukleotidit (katso alla), jotka koodittavat Tac-promoottorin (syn pTAC) komplementaaristen juosteiden sekvenssiä ja sopivia restriktioentsyymikohtia, syntetisoitiin, puhdistettiin geelissä ja hybridisoitiin. Huomaa, 5 että sekvenssikomplementaarisuus Xbal-kohdassa suunniteltiin niin, että se poisti tämän restriktiokohdan, kun se ligoitiin autenttiseen Xbal-kohtaan. Tämä tehtiin syn pTAC -sekvenssin tulevien käsittelyjen helpottamiseksi.
Syn pTAC -sekvenssi 10 BamHI PstI
5' GATCCTGCAGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGG 3' GACGTCTCGACAACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACC
Xbal kömpi.
15 AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC 3’ TTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGGATC 5'
Plasmidi pDL III-47a (kuvio 13) digestoitiin BamHI-ja Xbal-restriktioentsyymeillä ja plasmidi, joka nyt si-20 sälsi inserttinä ainoastaan osan beeta-globiinigeenistä Xbal-kohdasta Hindlll-kohtaan (kuvio 13a), puhdistettiin geelissä.
Sitten syn pTAC-sekvenssi ligoitiin plasmidiin .'. j niin, että muodostettiin plasmidi pDL lV-64a ja transfor- : 25 moitiin JM109-solut. Yksittäiset transformantit eristet- ***,.· tiin ja analysoitiin IPTG-indusoinnilla ja SDS-PAGE:lla • · ... toimivan Tac-promoottorin läsnäolon varmistamiseksi.
* Plasmidi pDL III-47a digestoitiin PstI- ja Hindlll-restriktioentsyymeillä ja puhdistettiin geelissä beeta- • · 30 globiinia koodittavien sekvenssien poistamiseksi. Plasmidi ··· ·...* pDL IV-64a digestoitiin samoilla entsyymeillä ja syn pTAC/ .:. beeta-sekvenssiä koodittava fragmentti puhdistettiin gee- « » « t .··, Iissä. Syn pTAC/beeta-fragmentin ligointi Pstl/Hindlll- entsyymeillä katkaistuun plasmidiin pDL III-47a muodosti 4 » : " 35 plasmidin pDL IV-67a (kuvio 16). Yksittäiset transforman- I I I 1
I I
87 105104 tit seulottiin di-alfa- ja beeta-globiinin tuoton suhteen IPTG-indusoinnilla ja SDS-PAGE:lla.
Syn pTAC -sekvenssin säätelyn alaisena oleva dVal-beeta-globiinigeeni ligoitiin myös toiseen kohtaan plas-5 midissa pDL III-47a. Syn pTAC/beeta -sekvenssi poistettiin plasmidista pDL IV-62a digestoimalla Hindll- ja Pstl-ent-syymeillä. Restriktiokohtien epätasaiset päät täytettiin T4-polymeraasilla ja ligoitiin tasapäisinä plasmidin pDL III-47a PvuII-kohtaan niin, että muodostettiin plasmidi 10 pJR VI-54a (kuvio 17). IPTG-indusointi ja SDS-PAGE suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu.
Indusointikokeiden tulokset SDS-PAGE :11a arvioituina osoittivat, että di-alfa- ja beeta-globiinien ekspression säätely erillisillä promoottoreilla aiheutti pienen 15 kohoamisen kummankin proteiinin ekspressiossa. Samalla tavalla toisen beeta-globiinigeenin insertiolla erillisen promoottorin säätelyn alaisuuteen oli vähän vaikutusta proteiinien tuottoon.
Esimerkki 13 20 Hypoteettinen menetelmä toisen translationaalisesti liitetyn beeta-globiinigeenin insertoimiseksi di-alfa/beeta-ekspressioplasmidiin • *·· Plasmidi pDL III-47a (kuvio 13) digestoidaan : HindIII-ja PstI-entsyymeillä ja Hindlll/Pstl-fragmentti : 25 puhdistetaan geelissä. Sitten restriktiokohtien epätasai- • · i set päät täytetään T4-polymeraasilla. Sama plasmidi diges-toidaan HindiII-entsyymillä ja päät täytetään T4-polyme- • · · raasilla. Sitten beeta-globiinigeeni ligoidaan tasapäisenä ... plasmidiin (kuvio 18). Kun on transformoitu, yksittäiset • · 30 kloonit voidaan analysoida restriktioanalyysillä insertoi- • · *·;·* dun beeta-globiinigeenin läsnäolon ja orientaation varmisti* tamiseksi. IPTG-indusointia ja SDS-PAGE:a voidaan käyttää di-alfa- ja beetag-globiinien tuoton arvioimiseksi.
« · « « « · « « · 88 105104
Esimerkki 14
Hypoteettinen menetelmä di-beeta-globiinin ekspres- soimiseksi
Di-beeta-globiinigeeni, joka on samanlainen yllä 5 kuvatun di-alfa-globiinigeenin kanssa, voidaan rakentaa seuraavasti. Plasmidi pDL II-95a on plasmidi, joka sisältää des-val-beeta-globiinigeenin vektorissa pGEM-1 (Pro-mega Corp., Madison, WI). Plasmidi pDL ll-95a digestoidaan PstI- ja BspMII-restriktioentsyymeillä ja iso lineaarinen 10 DNA-sekvenssi eristetään puhdistamalla geelissä. Erillinen plasmidi pDL II-95a digestoidaan PstI- ja Nhel-restriktio-entsyymeillä ja puhdistetaan pieni Pstl-Nhel-fragmentti geelissä. Oligonukleotidit, jotka koodittavat di-beeta-linkkeriä, joka sisältää beeta!:n C-pään aminohapot ja bee-15 ta2:n N-pään aminohapot liitettynä yhteen vaihtelevan pituisella linkkeripeptidillä (katso esimerkki 15) syntetisoidaan, puhdistetaan geelissä ja hybridisoidaan, kuten on kuvattu aiemmin. Geneerinen sekvenssi sellaiselle oligo-nukleotidille, joka yhdistää beeta!:n C-pään histidiinin ja 20 beeta2:n N-pään valiinin, on seuraava: ' ·' ' Nhel
: BspMII
His Vai 25 5' CTAGCTCACAAATACCAC ( XXX ) nGTTCACCTGACT 3’ ·:··: 3’ GAGTGTTTATGGTG(XXX)nCAAGTGGACTGAGGCC 5' • · · • · · • · · jossa "XXX" osoittaa sen aminohapon (niiden aminohappojen) .···. kodonia (kodoneita), joka (jotka) liittää (liittävät) yh- 30 teen kaksi beeta-globiinipeptidiä. Koska beeta-globiinin *!* kaksi päätä ovat noin 18 A etäisyydellä toisistaan deoksi- tilassa, odotetaan että "n" voisi olla välillä 5-9. Yllä • « · ίι#>: olevassa esimerkissä oligonukleotidi ulottuu Nhel-restrik- :*. tiokohdan yli, beeta!:n karboksipään histidiinin yli, di- « · · 35 beetan luomiseen käytettävää aminohappolinkkeriä koodit- ♦ · · 105104 tavan vaihtelevan pituisen sekvenssin yli, beeta2:n amino-pään valiinin yli ja beeta2-geenissä olevan BspMII-restrik-tiokohdan yli.
Di-beeta-polypeptidiä koodittavan plasmidin raken-5 tamiseksi ligoidaan fosforyloimaton di-beeta-linkkeri-DNA, jossa on päissä Nhel- ja BspMII-restriktiokohdat, PstI/ Nhel-fragmenttiin. Pstl-kohtien ligoitumisen tuloksena syntyneet dimeeriset muodot digestoidaan ligaation jälkeen Pstl-entsyymillä sellaisten fragmenttien muodostamiseksi, 10 jotka sisältävät ainoastaan Pstl- ja BspMII-päät. Sitten nämä fragmentit jatkokloonataan Pstl/BspMII-katkaistuun plasmidiin. Transformaation jälkeen kloonit, jotka sisältävät di-beeta-rakenteen, varmistetaan Pstl- ja HindiII-restriktiofragmenttianalyysillä. Linkkerialue senvenssoi-15 daan ja sopivat rakenteet jatkokloonataan ekspressioplas-midiin, joka sisältää joko di-alfa-globiinigeenin tai yhden alfa-globiinigeenin. E. coli transformoidaan tavalla, joka on kuvattu aiemmin ja testataan hemoglobiinin tuoton suhteen, kuten on kuvattu aiemmin.
20 Esimerkki 15
Hypoteettinen menetelmä linkkerien muodostamiseksi mutatoimalla ja selektoimalla : *·· Tässä hypoteettisessa esimerkissä linkkeri saadaan linkkeriä koodittavan DNA-sekvenssin mutatoinnilla ja toi-: : : 25 mivien linkkerien selektoimisella. Oligonukleotidit, jotka ·:·*· ulottuvat alfax:n BstBI-kohdasta alfa2:n Eagl-kohtaan syn- ;*·*; tetisoidaan niin, että kuusi nukleotidia, jotka muodosta vat suositeltavan glysiini-glysiinilinkkerin, satunnais-.... tetaan. Satunnaistamalla nämä nukleotidit oligonukleotidi- 30 seoksessa on läsnä kaikkien aminohappoyhdistelmien kodo- *1* nit. Oligonukleotidien puhdistuksen ja hybridisaation jäi- » · .!·* keen niitä käytetään rakennettaessa di-alfa/beeta-yhdis- : : telmäekspressiogeenit, kuten yllä on kuvattu.
Eri di-alfa/beetaplasmidit sisältävät kloonit seu- « « · 35 lotaan sitten kohonneiden rekombinanttihemoglobiinituot- • · • · • · · 90 105104 totasojen suhteen käyttäen yhtiössä kehitettyä menetelmää. E. coll -kloonit järjestetään nitroselluloosasuodattimil-le, jotka on laitettu 2 x YT-ampisilliinimaljojen päälle, jotka maljat sisältävät 1 mM IPTG:tä. Kun on inkuboitu yli 5 yön 37 eC:ssa, maljat laitetaan muovipussiin, jossa ilma on korvattu hiilimonoksidilla (CO). CO:n sitoutuminen so-lunsisäiseen rekombinanttihemoglobiiniin tuottaa erotettavan punaisen värin E. coli -pesäkkeisiin. Pesäkkeet, jotka tuottavat vahvimman punaisen värin, analysoidaan 10 edelleen.
Tässä kokeessa tehdään se oletus, että tietyt ami-nohappoyhdistelmät di-alfa-linkkerissä sallivat yksittäisten liitettyjen alfa-globiiniketjujen stabiilimman laskostumisen ja siksi johtavat korkeampiin solun sisäisen re-15 kombinanttihemoglobiinin tuottotasoihin. Tämä kohonnut tuottotaso johtaa vahvempaan punaiseen väriin sopivissa E. coli -klooneissa.
Kun on selektoitu useita klooneja, jotka tuottavat korkeampia rekombinanttihemoglobiinin tasoja, yksityiskoh-20 taisempia analyysejä tehdään yksittäisillä klooneilla optimaalisen di-aminohappolinkkerin määrittämiseksi. Analyysi": sit sisältävät tuotetun rekombinanttihemoglobiinin mää- rien, happiaffiniteetin ja proteiinin stabiilisuuden mää-: rityksen. Lopuksi niiden kloonien, joiden havaitaan tuot- 25 tavan paraslaatuisen rekombinanttihemoglobiinin, DNA sen- • t t venssoidaan linkkerin muodostavien aminohappojen määrittä- • · miseksi.
"·* * Esimerkki 16
Hypoteettinen menetelmä sellaisten plasmidien syn- • · · 30 tetisoimiseksi, jotka plasmidit sisältävät alfa- ja beeta-globiinigeenit kahden erillisen promoottorin säätelyn alaisena samassa plasmidissa Ennakoidaan, että rekombinanttihemoglobiinia voi-daan ekspressoida rakenteista, joissa eri globiinigeenit • ’·· 35 ovat erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa. Tämä • t » 105104 91 tilanne muodostaa kaksi erillistä mRNA:ta; toisessa on kaksikistroninen sekvenssi, joka koodittaa alfa-globiini-geeniä ja toisessa kaksikistroninen sekvenssi, joka koodittaa beeta-globiinigeeniä. Sellaisen ekspressiosysteemin 5 rakentamiseksi, jossa sekä alfa- että beeta-globiinigeenit ovat erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa samassa plasmidissa, täytyy aluksi käyttää seuraavaa menetelmää. Plasmidi pDL III-la, joka sisältää des-val-alfa-glo-biinigeenin, digestoidaan BamHI-restriktioentsyymillä, an-10 netaan reagoida bakteerin alkalisen fosfataasin kanssa, uutetaan fenolilla, seostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan TE-puskuriin. Plasmidi pJR IIII 50-a, joka on ekspressioplasmidi pKK, joka sisältää des-val-beeta-raken-teen, digestoidaan sitten BamHI- ja Pvul-restriktioentsyy-15 meillä Ptac-promoottorin, des-val-beeta-sekvenssin, transkription terminaatiosekvenssin ja osan ampisilliiniresis-tenssigeenistä sisältävän fragmentin irrottamiseksi plas-midista. Kun tämä fragmentti on puhdistettu geelissä, PvuI-BamHI-linkkeri syntetisoidaan ja ligoidaan insert-20 tiin. Sitten insertti katkaistaan uudestaan BamHI-entsyymillä, jotta saadaan muodostettua insertin 5’- ja 3'-päi-*·* * hin yhteensopivat BamHI-kohdat. Sitten tämä insertti kloo-
"·· nataan BamHI-entsyymillä linearisoituun plasmidiin pDL
·',"· III-la, joka johtaa sellaisen plasmidin muodostumiseen, : : 25 jossa yhden Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa oleva ·:··· translationaalisesti liitetty des-val-beeta-globiinigeeni *:*. on sijoittunut erillisen Ptac-promoottorin säätelyn alaisuu dessa olevan translationaalisesti liitetyn des-alfa-glo-biinigeenin 3’-puolelle. Restriktioentsyymikartoitusta IV.' 30 käytetään beeta-globiinin sisältävän insertin orientaation *;* varmistamiseksi. E. coli JM109 -solut transformoidaan .*.*·* plasmidilla, joka sisältää erilliset Ptac-globiinirakenteet ja kasvatetaan alustassa, joka sisältää ampisilliinia plasmidin sisältävien kloonien eristämiseksi. Plasmidin • · · 35 sisältävät kloonit indusoidaan sitten IPTGillä ja des-val- • · • · t« · 105104 92 alfa-globiinin, des-val-beeta-globiinin ja des-val-he-moglobiinin ekspressio testataan SDS-PAGE-analyysillä, Western-blottauksella käyttäen anti-hemoglobiinivasta-ai-neita ja eristämällä des-val-hemoglobiini standardeilla 5 kromatografisilla menetelmillä.
Vaihtoehtoisesti molempien globiinigeenien yhteis-ekspressio saavutetaan erillisissä vektoreissa olevista DNA-sekvensseistä, jotka ovat erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa.
10 Esimerkki 17
Hypoteettinen menetelmä sellaisten vektorien rakentamiseksi, jotka sisältävät alfa- ja beeta-globii-nigeenit erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa ja eri vektoreissa
15 E. coli -kloonit, jotka sisältävät plasmidin pDL
III-la, joka on pKK-223-3 plasmidi, joka sisältää kaksi- kistronisen syöttögeeni/des-val-alfa-rakenteen Ptac-promoot- torin säätelyn alaisuudessa, transformoidaan plasmidilla, joka sisältää kaksikistronisen syöttögeeni/des-val-beeta- 20 rakenteen saman promoottorin säätelyn alaisuudessa, mutta ... sellaisen geenin kanssa, joka muodostaa lisäantibiootti- ‘ resistenssin tetrasykliinille. Tämä voidaan rakentaa seu- ; ** raavalla tavalla: Plasmidi pJR IV-50a sisältää des-val- * « beeta-globiinigeenin Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudes- · 25 sa. Tämä plasmidi katkaistaan PvuII-entsyymillä sellaisen *:♦·; lineaarisen plasmidin muodostamiseksi, jolla on tasaiset :*·*: päät. Tämä ligoidaan fosforyloidun NotI-käsivarren (New
England Biolabs) kanssa. Ligaatioseosta käytetään trans- .···. formoitaessa E. coli. Sitten valmistetaan plasmidi-DNA ja • · 1 30 plasmidit, jotka sisältävät Notl-kohdan, tunnistetaan di- • ♦ V gestoimalla NotI-entsyymillä ja ajamalla agaroosigeeli- elektroforeesi. Tämä plasmidi sisältää Ptec:des-val-beeta-: globiinisekvenssin. Resistenssigeeni kanamysiiniantibioo- :·. tille on kaupallisesti saatavissa (Pharmacia) ja se sisäl- ]...# 35 tää EcoRI-restriktiokohdat molemmissa päissään. Päät muu- 93 1 05 1 04 tetaan tasaisiksi käsittelemällä T4 DNA -polymeraasilla menetelmän mukaisesti, jonka ovat kuvanneet Maniatis et ai. Tuloksena syntynyt fragmentti ligoidaan 50-kertaisen ylimäärän kanssa fosforyloitua NotI-käsivartta (25 eC, 60 5 minuuttia). Ligaatioreaktio tehdään 0,01 M EDTA:n suhteen, kuumennetaan 70 °C:seen 20 minuutiksi ja saostetaan etanolilla. Saostunut DNA liuotetaan 100 pl:aan NotI-puskuria ja käsitellään 100 uksiköllä NotI-entsyymiä (37 eC) 2 tuntia. Fragmentti puhdistetaan agaroosigeelielektroforee-10 silla. Notl-kohdat saanut kanamysiiniresistenssigeeni ligoidaan sitten NotI-entsyymillä linearisoituun pJR IV-50a -plasmidiin, jotta saadaan plasmidi, jossa on des-val-beeta-globiinigeeni Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja kanamysiiniresistenssi. E. coli JM109 -kloonit, jotka 15 sisältävät plasmidin pDL III-la, joka sisältää des-val-alfa-globiinin Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja ampisilliinresistenssin, transformoidaan kanamysiiniresis-tentin plasmidin kanssa, joka sisältää des-val-beeta-glo-biinigeenin ja kloonit selektoidaan sekä ampisilliini-20 että kanamysiiniresistenssin suhteen. Muita antibiootti-resistenssigeenejä voidaan käyttää yhtä hyvin. Erillisten « « *·' * promoottorien säätelyn alaisuudessa olevien alfa- ja bee- .’ *·· ta-globiinipolypeptidien ekspressio analysoidaan sitten IPTG-indusoinnilla, SDS-PAGE:lla ja Western-blottauksella.
: 25 Jos kohtaamme ongelmia plasmidin pysyvyydessä so- *:··; lussa, voimme käyttää samaa strategiaa pIN-plasmidien ,*·*. kanssa, joita on käytetty ekspressoitaessa polypeptidejä erillisistä plasmideista E. coli -bakteerissa (McNally et ai., PNAS 85, 7270, 1988).
30 Yksi mahdollinen ongelma, jonka voimme kohdata sei- *Γ laisia plasmideja rakennettaessa, joissa alfa- ja beeta- *1:* globiinigeenit ovat erillisten, mutta samanlaisten pro moottorien säätelyn alaisuudessa, on homologisen rekombi-naation mahdollisuus plasmidien identtisten sekvenssien ... 35 välillä, esim. promoottorialueella. Tämä voi johtaa tär- • 4 94 105104 keän DNA-sekvenssin osan deleetioon. Sen vuoksi on suositeltavaa käyttää erilaisia ei-homologisia promoottoreita kullekin eri globiinigeenille, esim. Ptac- ja Ptrc- tai lambda PL -promoottoria sopivassa isännässä (joka sisältää 5 cl857-geenin).
Esimerkki 18
Di-alfa-beeta-globiinirakenteen synteesi ja kokoaminen PL-säädellyssä vektorisysteemissä Aiemmissa esimerkeissä globiinigeenit olivat Tac-10 promoottorin säätelyn alaisuudessa ja alfa- (tai di-alfa) ja beeta-globiinigeenit olivat kukin translationaalisesti liitetty ribosomin syöttökistroniin, kuten on esittänyt Schoner et ai. Tässä esimerkissä käytetään lambda PL -promoottoria ja erilaista translationaalista liitossekvenssiä 15 (katso alla).
Translationaalinen liitossekvenssi SD2 Met Sfi_ 5' AAT AAG GAG GAA TAA CAT ATG CTG TCT CCG GCC GAT (jatk.) 20 3' TTA TTC CTC CTT ATT GTA TAC GAC AGA GGC CGG CTA (jatk. )
EagI
I 4 I
V AAG GCC CCA AGC TTG GGG 3' : '< TTC CGG GGT TCG AAC CCC 5’ ; Hindin i 25 ·;··· pL-ekspressiosysteemillä on erilainen translatio- naalinen liitossekvenssi verrattuna pTac-systeemiin. Sek- • · · venssit, jotka koodittavat kahta SD-sekvenssiä ja trans- ... laation lopetuskodonia, lisättiin N-proteiinia kooditta- • · 30 vien sekvenssien 3’-päähän toimimaan translationaalisena • · *·;·* liitossekvenssinä. Sen jälkeen olevat globiinia kooditta- >t*{* vat sekvenssit ovat samanlaisia verrattuna pTac-systee- : * * *: missä käytettyihin.
• · « ./ Käyttäen pPL-lambdavektoria, joka on saatavissa
4 M
*... 35 Pharmacia'lta, koottiin plasmidirakenne, jota käytettiin « « « « • · · 105104 95 muodostettaessa geneettisesti yhteenliitetty tetrameerinen ihmisen hemoglobiini (villityyppi) E. coli -kannoissa N99Ci+ ja N4830-1 (cI857). Nämä bakteerikannat saatiin Pharmacia'lta ja ne voidaan indusoida lisäämällä naladik-5 siinihappoa (40 pg/ml) tai mitomysiini C:tä (10 pg/ml) silloin, kun läsnä on villityypin Ci+ repressoria, tai lämpökäsittelyllä sellaisella kannalla, joka sisältää cI857-repressorigeenin (Mott et ai., PNAS, 82, 88, 1985 ja Gottesmann, M.E. et ai., J. Mol. Biol., 140, 57, 1980). 10 Kaaviomainen esitys kloonausstrategiasta on esitetty kuviossa 19.
Eagl-kohdan poistaminen pPL-lambdavektorista
Eagl-kohdan poistaminen pPL-lambdavektorista oli tarpeellista, jotta kyettiin kloonaamaan di-alfa-geenin 15 sekvenssi, koska molemmat alfa-rakennegeenit sisältävät
Eagl-kohdan, joka sijoittuu 6 emäsparia koodittavan sekvenssin sisäpuolelle. pPL-lambdavektori digestoitiin Eagl-entsyymillä ja päät täytettiin käyttäen T4 DNA polymeraa-sia. BamHI-käsivarsi (5' CCCGGATCCGGG 3') (Pharmacia) li-20 goitiin tasapäisenä Eagl-entsyymillä digestoituun pPL-lambdaplasmidiin standardeilla menetelmillä. Tämä poisti Eagl-kohdan halutusta rakenteesta. Tuloksena syntynyt seos digestoitiin Eagl-entsyymillä sellaisten plasmidien poistamiseksi, jotka vielä sisälsivät Eagl-kohdan. E. coli ·, · 25 N99C1+ -solut transformoitiin tuloksena syntyneellä plas- ·"·: midilla pPL-lambda-E. Kloonit, jotka sisälsivät halutun plasmidin, tunnistettiin restriktiodigestioanalyysillä.
φ
Synteettisen kotranslationaalisen liitossekvenssin .···. sisällyttäminen plasmidiin pPL-lambda-E
30 Ennen globiinigeenien insertoimista vektoriin oli • · tarpeellista sisällyttää synteettinen translationaalinen liitossekvenssi plasmidin pPL-lambda-E Hpal-kohtaan. Tämä tehtiin digestoimalla plasmidi pPL-lambda-E Hpal-entsyymi millä, jonka jälkeen suoritettiin tasapäisen kotranslatio- 35 naalisen liitossekvenssin ligaatio vektorin Hpal-kohtaan.
97 1 05 1 04 3’), jolla varmistettiin des-val-beetan ja pPL-vektorin välissä oleva sekvenssi.
pPL-lambdan säätelyn alaisuudessa olevat di-alfa-ja beeta-globiinigeenit sisältävän ekspressioplas-5 midin rakentaminen RGV-ristilinkkeri, joka koodittaa alfa-globiinin karboksipään osaa liitettynä yhden glysiinijäännöksen välityksellä toisen alfa-globiiniketjun luonnolliseen amino-pään osaan, valmistettiin fosforyloimalla erikseen 5'-päät 10 oligonukleotideista 5' CGAAATAACGTGGTGTTCTGTCTGC 3' ja 3' TTTATGGCACCACAAGACAGACGCCGG 5' T4-kinaasilla, jonka jälkeen suoritettiin hybridisaatio. Tämä kaksijuosteinen oligonukleotidi kloonattiin puhdistetun des-val-alfa- ja beeta-globiinifragmentin Eagl-päähän, joka fragmentti oli 15 valmistettu plasmidista pDL III-14c digestoimalla se Eagl-ja HindiII-entsyymeillä, kuten yllä on kuvattu. Tästä li-gaatiosta muodostunut lineaarinen DNA-sekvenssi, joka nyt sisälsi epätasaiset päät, jotka koodittivat BstBl- ja Hindlll-restriktiokohtien sekvenssejä, puhdistettiin aga-20 roosigeelielektroforeesilla ja kloonattiin BstBl- ja tii Hindlll-entsyymeillä digestoituun plasmidiin pPL-alfa/bee- '·' ta. Uusi plasmidi, joka nimettiin plasmidiksi pPL-dialfa/ . " beeta, sisälsi kotranslationaalisen liitossekvenssin ylä- • « virtaan sekvenssistä, joka sisälsi di-alfa-globiinin lii-|(! : 25 tettynä glysiini jäännöksen välityksellä, jonka jälkeen seurasi kotranslationaalinen liitos sekvenssi beeta-globii-nigeenisekvenssin vieressä, kaikki yhden PL-promoottorin säätelyn alaisuudessa. Nämä kloonit tunnistettiin seulo-···, maila pienimittakaavaisia plasmidipuhdistuksia digestoi- 30 maila Eagl-restriktioentsyymillä. Kloonit, joissa ei ollut Ί* toista alfa-globiinigeeniä, ainoastaan linearisoituivat ,*·* digestiossa, kun taas kloonit, jotka sisälsivät toisen geenin, vapauttivat 431 emäsparin ja 6 222 emäsparin pi-tuiset DNA-fragmentit.
« » « « I « « · « « » 98 105104 ROP-replikaatio-origomutaation sisältävän ekspres-sioplasmidin pSGE0.1-L0 rakentaminen Plasmidi pPL-dialfa/beeta digestoitiin PvuII-ent-syymillä ja käsiteltiin sitten T4 DNA -polymeraasilla epä-5 tasaisten päiden täyttämiseksi. Sitten linearisoitu plasmidi ligoitiin tasapäisenä NotI-käsivarren (Promega Corp., Madison, WI) (5' TTGCGGCCGCAA 3') kanssa. Sitten ligaatio-seosta käsiteltiin PvuII-entsyymillä kaikkien jäljelle jääneiden PvuII-kohdan sisältävien plasmidien poistamisek-10 si. E. coli -solut transformoitiin plasmidilla pSGE0.1-L0 ja positiiviset kloonit tunnistettiin yhden ainoan Notl-restriktiokohdan läsnäolon avulla.
Lambda Pt -promoottorin säätelyn alaisuudessa olevan hemoglobiini SGE0.1:n ekspressio E. coli -baktee-15 rissa E. coli N99Ci+ ja E. coli N4830-1 transformoitiin plasmidilla pSGE0.1-L0 ja kasvatettiin agarmaljoilla, jotka sisälsivät ampisilliinia, kuten on kuvattu aiemmin. Nämä E. coli -kannat sisältävät cI+-repressorigeenin ja 20 lämpöherkän cI857-repressorigeenin, vastaavassa järjestyk sessä.
• · · • · ' Kannan N99Ci+ ymppi kasvatettiin 37 ®C:ssa TB-alus- t · : '·· tässä OD600-arvoon noin 1,0 ja indusoitiin naladiksiinih- a polla (40 pg/ml). Viljelmiä inkuboitiin 4-6 tuntia : : : 25 37 °C:ssa ennen kuin solut kerättiin. Hemoglobiinituotto •j··: arvioitiin kokosoluproteiinin SDS-PAGE-analyysillä ja •*j*. Western-blottausanalyysillä. Näillä menetelmillä SGEO.l:tä arvioitiin tuotettavan tasolla noin 0,02 % kokosolupro- '···. teiinista tässä solulinjassa. Hemoglobiini (57 pg) eris- • · VV. 30 tettiin Mono-Q-kromatografiällä ja sen osoitettiin sisäl-• · tävän normaalin hemoglobiinin kaltaisen optisen spektrin.
..*·* Kannan N4830-1 ymppiä inkuboitiin 30 °C:ssa TB- alustassa OD600-arvoon 1,0 ja indusoitiin lisäämällä riittä- ./ västi esilämmitettyä (65 eC) TB-alustaa niin, että ympin • · · 35 lämpötila nousi 42 °C:seen. Sitten viljelmää inkuboitiin • · • · • · · 99 1 05 1 04 42 eC:ssa 4-6 tuntia. Kokosoluproteiinin analyysi SDS-PAGE:lla paljasti, että SGE0.1:tä syntetisoitiin tasolla 0,4 % kokosoluproteiinista, joka vastasi 0,18 mg proteiinia per gramma märkäsolutahnaa. SGE0.1 puhdistettiin 2 5 litran valmisteesta, kuten on kuvattu muualla, ja se johti 7,6 mg määrän eristykseen puhdasta materiaalia. SGE0.1 (7,6 mg) eristettiin ja sen P50-arvo oli 7,08 (Hemox-analy-saattori, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 37 eC) ja sillä oli luonnollista hemoglobiinia vastaava optinen spektri.
10 Esimerkki 19
Hemoglobiinin tuotto hiivassa
Kaikki restriktioentsyymit ja DNA:ta modifioivat entsyymit hankittiin BRL'stä, New England Biolabs’sta, IBI’sta, Pharmacia'1ta tai Boehringer-Mannheim'lta. Käy-15 tetyt entsyymikonsentraatiot olivat valmistajan suosittelemia reaktiohin, joissa tapahtui täydellinen reaktio 30 minuutissa. Puskurit ja olosuhteet näiden entsyymien käyttämiseksi olivat entsyymien mukana tulleita ellei toisin ole mainittu. Plasmidi-DNA puhdistettiin E. coli-DH5alfa 20 -kannasta, kuten ovat kuvanneet Birnboim ja Doly (Nucleic ·'·' Acids Research 1979, 7: 1513 - 1520). DNA:n elektroforee- sianalyysit suoritettiin agaroosigeeleissä käyttäen Tris-•# , asetaatti-elektroforeesipuskuria (Maniatis et ai., Mole- '· cular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1982). DNA tehtiin : 25 silminnähtäväksi värjäämällä geelit etidiumbromidilla, ***** jonka konsentraatio oli 0,5 pg/ml, ja valottamalla geelejä ί.ϊ ί ultraviolettivalossa. DNA-fragmentit puhdistettiin agaroo- sigeeleistä käyttäen käyttöpakkausta, joka hankittiin BIO- :"*: 101'stä. DNA-fragmentit puhdistettiin akryyliamidigeeleis- • · · .***. 30 tä murskaamalla irrotettu haluttua DNA:ta sisältävä geeli- ·«» \ pala 3,25 M ammoniumasetaattiin ja inkuboimalla yli yön • · · •••j 37 eC:ssa. Geeli fragmentit poistettiin sentrifugoimalla (12 000 x g, 15 minuuttia) ja DNA saostettiin 2 tilavuu- della liuosta, jossa oli 95 % etanolia ja 5 % isopropano- .···. 35 lia. Saostuma kuivattiin tyhjiössä ja liuotettiin 0,1 x • · · loo 105104 TE-puskuriin (1 x TE on 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM Na3-EDTA). DNA:n akryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Maniatis et ai. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1982) Tris-asetaatti-elektroforee-5 sipuskurissa. Bakterilogiset kasvualustat ja DNA:n trans-formaatiomenetelmät ovat kuvanneet R.W. Davis et ai. (Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980, sivut 140 - 141). S. cerevisiae -hiivan transformaatio lineaarisella tai rengasmaisella 10 DNA:11a suoritettiin, kuten ovat kuvanneet H. Ito et ai. [J. Bacteriology 153: 163-168 (1983)]. Transformantit se-lektoitiin SD-alustassa, josta puuttui urasiili tai tryp-tofaani (SD-ura, SD-trp) riippuen plasmidissa olevasta selektiomerkkigeenistä (F. Sherman et ai., Methods in 15 Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1979). Kaikki muut käytetyt hiiva-alustat ovat, kuten ovat kuvanneet Sherman et ai. (ibid.).
Galaktoosilla säädellyn promoottorin synteesi ja kokoaminen 20 Tämä synteettinen promoottori sisältää kaksi toi- ... minnallista osaa, säätelevän sekvenssin ja sekvenssin, • · · joka sallii tehokkaan mRNA-synteesin aloituksen. Yksi va- ·_ " litsemistamme säätelyalueista sisältää nukleotidisekvens- '· ” sin, joka muodostaa positiivisen transkriptiosäätelyn ga- « « : 25 laktoosin läsnä ollessa (M. Johnston ja R. Davis, 1984.
Molecular and Cellular Biology 4: 1440 - 1448; L. Guarente :T: et ai., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79: 7410-7414).
Transkription aloituskohta on peräisin S. cerevisiae -hii-:**·. van glyserolialdehydi-3-f osf aattidehydrogenaasigeenin .·". 30 (GAP491) (L. McAlister ja M.J. Holland, J. Biol. Chem.
*·[ 260: 15019 - 15027, 1983; J.P. Holland et al.,J. Biol.
··· Chem., 258: 5291 - 5299, 1983) konsensussekvenssistä.
Kuviossa 1 esitetyt synteettiset oligonukleotidit I'. ^ syntetisoitiin Biosearch 8600 DNA -syntetisaattorilla.
.···. 35 Kukin oligonukleotidi katkaistiin kantajapylväästään 28 % 101 105104 NH4OH:lla. Suojausryhmät poistettiin inkuboimalla katkaistua oligonukleotidia 28 % NH4OH:ssa 65 °C:ssa -* 16 tuntia. Kaikki oligonukleotidit puhdistettiin preparatiivisella polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 10 % akryyliamidi-5 levygeeleissä (19:1 akryyliamidi:bis-akryyliamidi), jotka sisälsivät 7 M ureaa. Oligonukleotidit eluoitiin akryyli-amidipaloista inkuboimalla (16 tuntia) 37 °C:ssa liuoksessa, joka oli 50 mM ammoniumasetaatti (pH 7,4), 2,5 mM mag-nesiumasetaatti, 0,25 mM EDTA ja 0,25 % SDS. Akryyliamidi-10 fragmentit poistettiin sentrifugoimalla (14 000 x g, 10 minuuttia) ja oligonukleotidi saostettiin vesifaasista lisäämällä NaCltia loppukonsentraatioksi 0,25 M ja 3 tilavuutta 100-%lista etanolia. Saostetut oligonukleotidit kerättiin sentrifugoimalla (14 000 x g, 30 minuuttia), pes-15 tiin kahdesti 80-%:isella etanolilla, kerran 100-%:isella etanolilla ja pelletit kuivattiin. Pelletit liuotettiin 0,1 x TE-puskuriin. 2 x 10~10 moolia (kutakin) oligonuk-leotideja 1-5 (taulukko 5) fosforyloitiin 0,02 ml:ssa liuosta, joka oli 0,066 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,01 M MgCl2, 20 0,002 M ditiotreitoli (DTT), 0,001 M spermidiini ja jossa • ;*t oli 10 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia. Fosforylaatio- reaktiot suoritettiin 37 °C:ssa 30 minuuttia ja lopetet-' tiin kuumentamalla 96 °C:seen 5 minuutiksi. 2 x 10'10 moo-
I I
lia öligonukleotideja 1-6 (taulukko 5) lisättiin fosfo- • « 4 : 25 ryloituihin oligonukleotideihin lopullisessa tilavuudessa *·**· 0,04 ml liuoksessa, joka oli 0,07 M Tris-HCl (pH 7,6), • · · ·.· · 0,01 M MgCl2. Oligonukleotidien 1-6 (taulukko 5) seosta kuumennettiin 96 °C:ssa 5 minuuttia, 75 °C:ssa 20 minuut-tia, 55 eC:ssa 30 minuuttia, 37 °C:ssa 60 minuuttia ja • · · 30 25 eC:ssa 15 minuuttia. T4 DNA -ligaasia (10 yksikköä), ·. DTT:tä (lopullinen konsentraatio 0,002 M) ja ATP:tä • · · (0,001 M) lisättiin ja seosta inkuboitiin 4 eC:ssa 16 tun-*.·.* tia. Tuloksena syntyneet 210 emäsparin pituiset oligonuk- ·*·.. leotidit sisälsivät 5'-pään, joka oli yhteensopiva Sali- .***. 35 restriktioendonukleaasin kohdan kanssa ja 3'-pään, joka X02 105104 oli yhteensopiva Xbal-kohdan kanssa. Koska oligonukleoti-dit, jotka sisälsivät intaktin oligonukleotidin kaksi päätä, ei oltu fosforyloitu, ne eivät voineet ligoitua toisiinsa. Tämä oligonukleotidi kloonattiin vektoriin pSK+ 5 (Stratagene, Inc.) (kuvio 21a), joka oli digestoitu xbal-ja Sali-entsyymeillä. Ligaatioseos sisälsi 50 ng Xbal- ja Sali-entsyymeillä digestoitua vektoria pSK(+) ja 5 piko-moolia ligoitua oligonukleotidia 0,01 ml:n tilavuudessa. E. coli DH5alfa -solut transformoitiin osalla ligaatio-10 reaktiota ja kloonit, jotka sisälsivät insertit, tunnistettiin seulomalla valkoiset pesäkkeet LB-ampisilliini-agarmaljoilla (0,15 mg/ml), joihin oli lisätty X-gal:ia (4 pg/ml). Positiivinen tunnistus suoritettiin valmistamalla DNA näistä eritetyistä pesäkkeistä ja digestoimalla 15 Xbal- ja Sali-entsyymeillä. Restriktiodigestit analysoitiin ajamalla agaroosigeelielektroforeesi ja tunnistettiin kolme kloonia, jotka sisälsivät odotetun kokoisen (noin 250 emäsparia) fragmentin. Kaikkien kolmen kloonin DNA-sekvenssi määritettiin ja yksi valittiin käytettäväksi 20 edelleen ja sille annettiin nimi p6S2488 (kuvio 21a).
Synteettisen galaktoosin ylävirran aktivaattorisek- * « venssin (GAL„.) kokoaminen : " Taulukossa 6 esitetyt oligonukleotidit syntetisoi tiin ja puhdistettiin, kuten yllä on kuvattu. Oligonukleo- i.i 25 tidit 2-5 fosforyloitiin, hybridisoitiin oligonukleoti- ”*i dien 1-6 kanssa ja ligoitiin, kuten on kuvattu GAP:n :T: kokoamisen yhteydessä. Tällä menetelmällä muodostetulla täysipitkällä oligonukleotidilla on fosforyloimattomat .···. päät, jotka ovat yhteensopivia Sphl- ja Sall-restriktio- .···, 30 entsyymien muodostamien kohtien kanssa. Kun oligonukleoti- • · *·* di ligoidaan Sali-kohtaan, tuloksena syntynyt kahden frag- ...:* mentin yhtymiskohta ei kuitenkaan enää sisällä katkaista- 9 * t vissa olevaa Sali-kohtaa.
GAL^g'^ekvenssi sisältyy SphI-Sall-fragmenttiin. 35 Tämän fragmentin kloonaaminen plasmidiin pGS2488 vaati,
« I
* » « 103 105104
että muutimme tämän plasmidin Kpnl-kohdan Sphl-kohdaksi. Plasmidia p6S2488 modifioitiin katkaisemalla se Kpnl-ent-syymillä. Kpnl-entsyymillä digestoitua plasmidia inkuboi-tiin niin, että läsnä oli 2 yksikköä T4-polymeraasia 0,05 5 mlrssa puskuria, joka oli 50 μΜ kunkin deoksiribonukleoti-ditrifosfaatin (A, G, C, T), 0,033 M Tris-asetaatin (pH 7,9), 0,066 M kaliumasetaatin, 0,01 M magnesiumasetaatin, 0,5 mM DTT:n suhteen ja jossa oli 100 pg naudan seerumisi-bumiinia (BSA)/ml. Na3EDTA:ta lisättiin konsentraatioksi 10 0,015 M ja seos uutettiin kerran fenoli-kloroformilla. DNA
seostettiin etanolilla. Kuiva pelletti liuotettiin 0,008 ml:aan T4 DNA -ligaasipuskuria, jossa oli 50 ng fosfory-loituja Sphl-käsivarsia (New England Biolabs) ja 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Seosta inkuboitiin 1 tunti 25 °C:ssa 15 ja sitä käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Plasmidi-DNA valmistettiin 12 transformantista ja testattiin restriktioentsyymidigestiolla ja agaroosigeeli-elektroforeesilla Sphl-kohdan läsnäolon ja Kpnl-kohdan poissaolon suhteen. Sellainen klooni, jolla oli nämä omi-20 naisuudet sisältävä plasmidi, tunnistettiin ja plasmidi ·;·, nimettiin plasmidiksi pGS2888 (kuvio 21b).
,! Tämän hybridipromoottorin rakentamisen seuraava i t *, , vaihe oli GALuas-sekvenssin sisältävän Sphl-Sali-fragmentin « ( « kloonaaminen plasmidiin pGS2888. Plasmidi pGS2888 diges-25 toitiin Sphl- ja Sali-entsyymeillä, uutettiin fenoli-klo- c *·’*· roformilla ja seostettiin etanolilla. 50 ng Sphl- ja Sali- • · · ί.ί · entsyymeillä digestoitua plasmidia pGS2888 inkuboitiin niin, että läsnä oli 25 ng hybridisoitua, ligoitua GAL^- :***: seosta 0,005 mlrssa 1 x ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 • · · .·**. 30 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseosta inkuboitiin yli »«· ·. yön 4 °C:ssa ja osaa käytettiin transformoitaessa E. coli • · t ···· DH5alfa -solut. Ampisilliiniresistentit kloonit eristet- t t tiin ja valmistettiin plasmidi-DNA. Plasmidi-DNA (diges-toitiin Xbal- ja SpHi-entsyymeillä) analysoitiin agaroosi-35 geelielektroforeesilla. Plasmidi, joka sisälsi odotetun 104 105104 kokoisen fragmentin (noin 500 emäsparia), tunnistettiin. Tämän plasmidin mahdollisen GALuas-sekvenssin sisältävän osan sekvenssi määritettiin ja plasmidi nimettiin plasmi-diksi pGS4788 (kuvio 21b). Synteettisen GAL-GAP-promootto-5 rin (pGGAP) täydellinen sekvenssi on esitetty kuviossa 20.
pGGAP-beeta-globiinin ekspressiokasetin rakentaminen
Plasmidia pLCIIFX-beeta-globiini (K. Nagai, M. Perutz ja C. Payart, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82; 10 7252 - 7255) käytettiin ihmisen beeta-globiinin cDNA:n lähteenä. Beeta-globiinin cDNA:n koodittava alue voidaan irrottaa ApaLI-Hindlll-fragmenttina, josta puuttuu ainoastaan ensimmäiset neljä nukleotidia beeta-globiinin koodattavalta (transloitavalta) alueelta. Plasmidi pLCFX-beeta-15 globiini (5 pg) digestoitiin ApaLI- ja Hindlll-entsyymeil-lä ja 550 emäsparin pituinen fragmentti, joka sisälsi cDNA:n, puhdistettiin akryyliamidigeelielektroforeesilla. Beeta-globiinin cDNA:n sisältävä ApaLI-HindiII-fragmentti kloonattiin Xbal- ja HindiII-entsyymeillä digestoituun 20 pUC19-vektoriin käyttäen seuraavaa adaptorisekvenssiä ··_ (syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten yllä on kuvattu): • » « « · • ·
” Xbal Ncol ApaLI
YHla/b5'-CTAGAACCATGG
• · i 25 TTGGTACCACGT-5' • · ··· v* ·' Kaksi oligonukleotidia sekoitettiin (12,6 pg kum paakin), lisättiin NaCl:ia konsentraatioksi 0,25 M ja li-sättiin kolme tilavuutta etanolia (vedetöntä). Saostetut ··· .**·. 30 oligonukleotidit kerättiin sentrifugoimalla (14 000 x g, ··· ·. 15 minuuttia) ja pelletti pestiin kahdesti 80-%:isella • · · ···· etanolilla, kerran vedettömällä etanolilla ja kuivattiin
Mr w J
> c tyhjiössä. Adaptorisekvenssit liuotettiin 1 ml:aan 0,1 x TE-puskuria. 50 ng beeta-globiinin cDNA:ta sisältävää < .*··. 35 Xbal-Hindlll-fragmenttia ja 12,5 ng etanolisaostettua • · · 105 105104 (fosforyloimatonta) YHla,b-oligonukleotidia ligoitiin 0,010 ml:ssa T4 DNA ligaasi-puskuria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseosta inkuboitiin 4 °C:ssa 16 tuntia ja osaa käytettiin transformoitaessa E.
5 coli DH5alfa -solut. Transformantit selektoitiin LB-ampi-silliinimaljoilla, jotka sisälsivät 4 pg X-gal:ia/ml. Plasmidi-DNA valmistettiin 12 valkoisesta pesäkkeestä. DNA digestoitiin Ncol- tai ApaLI-entsyymeillä ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Neljä näistä pesäkkeistä 10 sisälsi plasmidit, joilla oli odotetut restriktiofragmen-tit ja yksi nimettiin plasmidiksi pUC19beeta-globiini (kuvio 21a). Plasmidi pSUC2-6sigma [G. Stetler et ai., Biotechnology 7: 55 - 60 (1989)] (kuvio 21a) digestoitiin
Hindlll- ja Xbal-entsyymeillä ja suuri fragmentti puhdis-15 tettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Beeta-globiinin cDNA:n sisältävä XbaI-HindIII-fragmentti puhdistettiin myös (agaroosigeelielektroforeesi ) plasmidista pUC19beeta-globiini. 10 ng geelissä puhdistettua Xbal- ja Hindlll-entsyymeillä digestoitua plasmidia pSUC2-6sigma sekoitet-20 tiin 16 ng kanssa plasmidista pUC19beeta-globiini peräisin ·;· olevaa Xbal-Hindlll-fragmenttia 0,01 ml:ssa ligaasipusku- .! ria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatio- , , seosta inkuboitiin 25 °C:ssa 1 tunti ja osaa käytettiin '· transformoitaessa E. coli DHSalfa -solut. Transformantit 25 selektoitiin LB-ampisilliinialustalla ja kolmea käytettiin plasmidi-DNA:n valmistuksessa. Nämä analysoitiin digestoi- ·«♦ · maila EcoRI-entsyymillä ja analysoitiin agaroosigeelielek troforeesilla. Kaksi näistä sisälsi plasmidit, joilla oli :***: odotetut restriktiofragmentit ja yksi nimettiin plasmidik- • · « .***. 30 si pGS1188 (kuvio 21b). Tämä plasmidi sisältää beeta-glo- • · · biinin sigma-promoottorin transkriptiosäätelyn alaisuudes- • « · ·♦♦♦ sa ja sisältää MFalfal-geenin 3’-puoleiset transkription terminaatiosignaalit ja polyadenylaatiosignaalit.
Sigma-promoottorin korvaaminen pGGAP-sekvenssillä .·". 35 Plasmidi pGS1188 digestoitiin Sphl- ja Ncol-entsyy- • · · meillä ja vektori ja beeta-globiinin cDNA erotettiin sig- 106 105104 ma-promoottorista agaroosigeelielektroforeesilla ja puhdistettiin, kuten on kuvattu aiemmin. Plasmidi pGS4788 (10 pg) digestoitiin myös SphI- ja Ncol-entsyymeillä ja tämän digestion tuottama noin 500 emäsparin fragmentti 5 (sisältää pGGAP-sekvenssin) puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. 50 ng geelissä puhdistettua beeta-glo-biinin sisältävää vektoria inkuboitiin 50 ng kanssa Ncol-Sphl-fragmenttia, joka sisälsi pGGAP-promoottorin, 0,01 ml:ssa 1 x ligaaslpuskuria, jossa oli 10 yksikköä T4 DNA 10 -ligaasia. Seosta inkuboitiin 1 tunti 25 °C:ssa ja osaa ligaatloseoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Selektoitiin ampisilliiniresistentit kloonit. 12 näistä klooneista eristetty plasmidi-DNA analysoitiin digestoimalla Sphl- ja Ncol-entsyymeillä sellaisten 15 plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisältävät noin 500 emäsparin GGAP-promoottorin. Beeta-globiinin cDNA:n läsnäolo varmistettiin digestoimalla Xbal- ja Sali-entsyymeillä, jonka jälkeen suoritettiin agaroosigeelielektroforee-sianalyysi. Plasmidi, joka sisälsi odotetut fragmentit, 20 tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pGS3588 (kuvio ... 21b). Tämän fragmentin jatkokloonauksen helpottamiseksi hiivavektoriin, plasmidin pGS3588 Smal-kohta muutettiin « « • " Xhol-kohdaksi seuraavasti: 1 pg plasmidia pGS3588 diges- ·. toitiin Smal-entsyymillä, digesti uutettiin kerran fenoli- • l
i.i 25 kloroformilla ja seostettiin etanolilla. Saostettu DNA
*ϊ**ϊ liuotettiin T4 DNA -ligaasipuskuriin yhdessä 100 ng kans- sa fosforyloitua Xhol-linkkeriä ja 10 yksikön kanssa T4 DNA -ligaasia (lopullinen tilavuus 0,01 ml). Ligaatiota .···. inkuboitiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia ja osaa ligaatio- .···. 30 seoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa • · -solut (ylimääräisiä linkkereitä ei poistettu ennen trans-formaatiota). Eristettiin ampisilliiniresistentit kloonit ttt •"S ja valmistettiin plasmidi-DNA. Plasmidit, jotka sisälsivät ·«, Xhol-lisäkohdan, tunnistettiin digestoimalla Xhol-entsyy- < «* 35 millä ja agaroosigeelielektroforeesianalyysillä. Plasmidi, 107 105104 joka sisälsi pGGAP-beeta-globiinin ekspressiokasetin, tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pGS3888 (kuvio 21b). Alfa-globiinin ekspressiokasetin rakentaminen Saimme ei-täyspitkän cDNA-kloonin (p-alfa-MRC) K. 5 Nagai'lta (MRC, Cambridge). Alfa-globiinia koodattavan cDNA:n muuttamiseksi niin, että se voitiin ekspressoida pGGAP-promoottorista, syntetisoitiin kaksi oligonukleoti-dialuketta (oligonukleotidien synteesi ja puhdistus suoritettiin, kuten yllä on kuvattu).
10 alfa-1: 5'-GAATTCCATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACC3'.
alfa-2: 5'-CTGCAGTCGACTTAACGGTATTTGGAGGTCAGCACGGTGCT-3*.
Näitä kahta oligonukleotidia käytettiin alukkeina 15 polymeraasiketjureaktiossa (PCR) (R.K. Sakai et ai., 1985,
Science 230: 1350 - 1354) käyttäen Perkin Elmer-Cetus PCR
-käyttöpakkausta ja plasmidia p-alfa-MRC templaattina.
Alfa-globiinin cDNA (8,3 pg/ml), joka oli 0,018 ml:ssa H20:ta, denaturoitiin lisäämällä 0,005 ml 10 M NaOH:ia.
20 Seosta inkuboitiin 25 ®C:ssa 5 minuuttia. Denaturoitu DNA
seostettiin lisäämällä 0,003 ml 3 M natriumasetaattia (pH
5,2) ja 0,075 ml vedetöntä etanolia. Seostettu DNA pestiin *, , kahdesti 80-%:isella etanolilla, kerran 100-%:isella eta- • < '· ’ nolilla ja kuivattiin. Kuivattu pelletti liuotettiin ·'·' ' 25 liuokseen, jossa oli 0,005 ml 20 μΜ oligonukloeotidia al- fa-1, 0,005 ml 20 μΜ oligonukleotidia alfa-2, 0,010 ml • · · V * 10 x Taq polymeraasipuskuria (Perkin Elmer-Cetus), 0,0005 ml TaqI polymeraasia (Perkin Elmer-Cetus), 0,663 ml H20:ta, 0,016 ml kaikkia neljää deoksiribonukleotiditrifosfaattia • · · »***· 30 (kukin 1,25 mM). Kun liuosta oli kuumennettu 94 °C:ssa 1 «·· *. minuutti, lisättiin Taql polymeraasia. Kun entsyymi oli ··· lisätty, vesipohjaisen liuoksen päälle lisättiin 0,100 ml « « paraffiiniöljyä. Reaktioseoksella tehtiin käsin 25 sykliä seuraavissa lämpötiloissa: 37 °C, 2 minuuttia/ 68,5 °C, 3 * 35 minuuttia ja 94 °C, 1 minuutti. 25:nnen syklin jälkeen « · « 105104 reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:ssa 2 minuuttia ja 68,5 °C:ssa 10 minuuttia. Osa (0,005 ml) reaktioseoksesta analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla ja se paljasti odotetun kokoisen (noin 430 emäsparia) rintaman. PCR:llä 5 amplifioidun DNA-fragmentin tulee sisältää 5'-puoleisen pidennyksen, joka sisältää ATG-kodonin translaation aloitukselle optimaalisen sekvenssirungon sisällä (M. Kozack, 1986, Cell, 44: 283 - 292). 3'-pään tulee sisältää pidennyksen, joka sisältää translaation lopetuskodonin ja Säiliö restriktioendonukleaasikohdan. PCR-amplifikaatioreaktio uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Kuiva pelletti liuotettiin 0,05 ml:aan 1 mM Tris-HCl-pus-kuria (pH 7,8). Osa tästä materiaalista (0,025 ml, 1,25 pg) digestoitiin Ncol- ja Sali-entsyymeillä ja puhdistet-15 tiin akryyliamidigeelielektroforeesilla (5 %). Geelipala, joka sisälsi fragmentin, eluoitiin murskaamalla geelipala 0,3 ml:aan 2,5 M ammoniumasetaattia (pH 7,4) ja inkuboi-malla sitä 37 eC:ssa 16 tuntia. Akryyliamidifragmentit poistettiin sentrifugoimalla ja DNA saostettiin lisäämällä 20 0,75 ml etanolia. Pelletti kerättiin ja liuotettiin 0,020 ml:aan 1 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,8), joka oli 0,1 mM EDTA:n suhteen. Tämä fragmentti kloonattiin Ncol- ja Sall- :·. entsyymeillä digestoituun ja agaroosigeelissä puhdistet- • « · ; tuun plasmidiin pGS3888. 50 ng Ncol- ja Sall-entsyymeil-
• 4 I
25 lä digestoitua plasmidia pGS3888 inkuboitiin (2 tuntia, ·** * 25 *C) 50 ng kanssa geelissä puhdistettua PCR: llä ampli- m * fioitua NcoI-Sall-fragmenttia, joka sisälsi alfa-globiinin • · · V * cDNA:n, 0,01 ml:ssa ligaasipuskuria, jossa oli 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Osaa tästä reaktioseoksesta käytettiin • · · 30 transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut ja ampisilliini-resistentit kloonit selektoitiin LB-ampisilliinialustalla.
·· ·
Plasmidi-DNA valmistettiin 12 yksittäisestä eristetystä pesäkkeestä ja digestoitiin Ncol- ja Sali-entsyymeillä.
« · '«;·* Restriktiodigestiot analysoitiin akryyliamidigeelielektro- 35 foreesissa (5 %), kaikki 12 sisälsivät odotetun kokoisen « • · « « · • · • · · 109 105104 fragmentin. Yksi näistä nimettiin plasmidiksi pGS4088 (kuvio 22). Plasmidin pGS4088 alfa-globiini-insertti sekvens-soitiin täydellisesti sen varmistamiseksi, ettei PCR-amp-lifikaatio ollut muodostanut yhtään mutaatioita.
5 Hiivan ekspressioplasmidin, joka yhteisekspressoi alfa- ja beeta-globiinigeenejä yhdestä plasmidista, rakentaminen
Plasmidien pGS3888 ja pGS4088 alfa-globiinin ja beeta-globiinin ekspressiokasetit kloonattiin yhteen plas-10 midiin sellaisella tavalla, joka sallii niiden irrottamisen yhtenä Notl-fragmenttina. Tämä NotI-fragmentti kloonattiin sitten korkean kopioluvun omaavaan hiivan plasmi-diin pCIN niin, että muodostettiin plasmidi, joka sisälsi ja ekspressoi sekä alfa- että beeta-globiiniketjuja, jotka 15 olivat erillisten (vaikkakin identtisten) promoottorien säätelyn alaisuudessa. Yksityiskohdat on esitetty alla. Notl-kohdan muodostaminen plasmidiin pSK(+) Plasmidia pSK(+) (Stratagene, Inc.) (kuvio 23a) modifioitiin digestoimalla 100 ng puhdistettua plasmidi-20 DNA:ta Kpnl-entsyymillä. Kun digestio oli täydellinen, DNA seostettiin etanolilla ja kuiva pelletti liuotettiin 0,05 ml:aan T4 DNA -polymeraasipuskuria, joka sisälsi 10 yk- • ;”.t< sikköä T4 DNA -polymeraasia. Reaktioseosta inkuboitiin .·. : 37 °C:ssa 20 minuuttia, lisättiin Na3EDTA:a (10 mM) ja näy-
: 25 tettä kuumennettiin 70 °C:ssa 10 minuuttia. Digestoitu DNA
* « I
\\\'\ seostettiin etanolilla ja kuiva pelletti liuotettiin 0,01
... ml:aan 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,8), joka oli 1 mM
• · · **’ EDTA:n suhteen. Osa tästä materiaalista (20 pg) liuotet tiin 0,005 ml:aan ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 yksik- • · * 30 köä T4 DNA -ligaasia ja 50 ng fosforyloituja Notl-linkke- • · · reitä. Ligaatioseosta inkuboitiin 25 °C:ssa 2 tuntia ja .:. osaa käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut.
Ampisilliiniresistentit pesäkkeet selektoitiin LB-ampisil-liinialustalla. Plasmidi-DNA eristettiin, digestoitiin i ” 35 Notl-entsyymillä ja analysoitiin akryyliamidigeelielektro- « « 110 105104 foreesilla (5 %). Plasmidin, joka sisälsi Notl-lisäkohdan, odotettiin muodostavan uuden noin 90 emäsparin pituisen fragmentin. Sellainen plasmidi tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pSN(+) (kuvio 23a).
5 pGGAP-alfa-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmidiin pSN(+)
Plasmidi pSN(+) digestoitiin Sali-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Seostettu DNA liuotettiin (50 pg/ml) 1 mM Tris-HCl-pusku-10 riin (pH 7,8), joka oli 0,1 mM EDTA:n suhteen. Plasmidi pGS4088 digestoitiin XhoI-entsyymillä ja noin 1 100 emäs-parin pituinen fragmentti, joka sisälsi alfa-globiinin ekspressiokasetin, eristettiin agaroosigeelistä. Puhdistettu fragmentti liuotettiin (20 pg/ml) 0,1 x TE-pusku-15 riin. 25 ng Sali-entsyymillä digestoitua plasmidia pSN(+) sekoitettiin 50 ng kanssa geelissä puhdistettua alfa-glo-biinifragmenttia 0,01 ml:ssa ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseosta inkuboitiin 1,5 tuntia 25 °C:ssa ja osaa käytettiin transformoitaessa 20 E. coli DH5alfa -solut. Eristettiin ampisilliiniresisten-tit kloonit. 100 transformanttia siirrettiin ruutumuotoon ·;·. tuoreille maljoille. Ruuduista tehtiin kopiot nitrosellu- .! loosasuodattimelle pesäkehybridisaatiota varten (R.W.
. Davis et ai., Adv. Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, I « < "" 25 NY, 1980). Hybridisaatiokoetin oli oligonukleotidi 4 (tau- ··· · lukko 6). Tämä oligonukleotidi (20 pM) leimattiin 32P- ATP:llä 0,02 ml:ssa reaktioseosta, joka oli 0,050 M Tris-·!·: : HC1 (pH 7,6), 0,01 M MgCl2, 0,005 M DTT, 0,0001 M spermi- diini, 0,0001 M EDTA, 50 pM 32P-ATP ja jossa oli 10 yksik-30 köä T4 -polynukleotidikinaasia. Reaktioseosta inkuboitiin • · · .*'*· 2 tuntia 37 eC:ssa, inkorporoitumaton ATP poistettiin • · · sentrifugipylväskromatografiällä (BIORAD) käyttäen vai- «·· mistäjän ohjeita. Suodattimia inkuboitiin (37 °C) hybri-'···* disaatioliuoksessa (6 c SSC, 50 % formamidi, 2 % SDS, 20 35 pmoolia 32P-leimattua koetinta) 16 tuntia. Suodattimet pes- • · · « · • · • · · 111 105104 tiin 4 kertaa (15 minuuttia kerta) liuoksella, joka oli 1 x SSC, 0,1 % SDS 55 ®C:ssa; kahdesti (5 minuuttia kerta) liuoksessa, joka oli 0,2 x SSC, 0,1 % SDS 50 °C:ssa ja kahdesti (5 minuuttia kerta) 0,2 x SSC:ssä. Suodattimista 5 valmistettiin autoradiografiat. Pesäkkeitä, jotka muodostivat hybridisaatiosignaalin, käytettiin plasmidi-DNA:n valmistukseen. Tämä DNA digestoitiin EcoRI-entsyymillä ja tämän digestion tuottamat fragmentit analysoitiin agaroo-sigeelielektroforeesilla. Plasmidi, joka sisälsi oikean 10 kokoisen fragmentin, tunnistettiin ja nimettiin plasmidik-si pGS4888 (kuvio 23a).
pGGAP-beeta-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmidiin pGS4888
Plasmidin pGS4888 rakentaminen vaati Xhol-fragmen-15 tin (pGGAP-alfa-globiini) kloonauksen Sali-kohtaan. Xhol-kohdan yhtyminen Sali-kohtaan tuhoaa sekä XhoI- että Sall-restriktioendonukleaasien tunnistuskohdat muodostaen sellaisen plasmidin pGS4888, jossa on ainoastaan yksi Xhol-kohta. Xhol-fragmentti plasmidista pGS3888 puhdistettiin 20 agaroosigeelielektroforeesilla ja kloonattiin XhoI-entsyymillä digestoituun plasmidiin pGS4888 oleellisesti, kuten on kuvattu plasmidin pGS4888 rakentamisessa. Pesäkehybri-j'·.. disaatiot suoritettiin käyttäen plasmidista pGS3888 peräi- .·. : sin olevaa NcoI-Sall-fragmenttia (joka sisältää beeta-glo- : 25 biinin cDNA:n) hybridisaatiokoettimena. Tämä fragmentti « · « puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja leimattiin ... radioaktiiviseksi alfa32P-dCTP: llä käyttäen Amersham'in • * t ’·* * Random Oligonucleotide Labelling -käyttöpakkausta. Suodat timet hybridisoitiin, pestiin ja autoradiografiat tehtiin, • · · 30 kuten on kuvattu plasmidin pGS4888 rakentamisessa. Plas- • · · midi-DNA valmistettiin pesäkkeistä, jotka muodostivat hyb-ridisaatiosignaalin ja digestoitiin joko Ncol- tai Ncol-ja Sphl-entsyymeillä. Nämä digestiot sallivat sellaisten V plasmidien tunnistamisen, jotka sisälsivät sekä alfa- että : ’·· 35 beeta-globiinin ekspressiokasetit ja paljasti alfa- ja • · · • · • · • · · 112 105104 beeta-globiinien transkriptioyksikköjen orientaation toisiinsa. Plasmidi, joka sisälsi molemmat transkriptyöyksiköt, tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pGS189 (kuvio 23b).
5 Plasmidin pCIN rakentaminen
Plasmidia pCIU modifioitiin niin, että siihen muodostettiin Notl-kohta. pClU-DNA:ta (100 pg) digestoitiin Sali-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja seostettiin etanolilla. Sall-päät modifioitiin T4 DNA polyme-10 raasilla muodostaen “tasaiset" päät ja lisättiin fosfory-loidut Notl-linkkerit. Menetelmät näiden modifikaatioiden suorittamiseksi olivat oleelliset samat kuin ne, joita käytettiin muodostettaessa plasmidi pSN(+) (kuvattu yllä). Näiden käsittelyjen tuloksena syntynyt plasmidi ni-15 mettiin plasmidiksi pCIN (kuvio 23b). Tämä plasmidi pCIN digestoitiin Notl-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja seostettiin etanolilla. Noin 2,4 kiloemäksen pituinen fragmentti (joka sisältää alfa- ja beeta-globiinin ekspressiokasetit) puhdistettiin Notl-entsyymillä diges-20 toidun plasmidin pGS189 DNA: s ta agaroosigeelielektroforee-silla. 50 ng Notl-entsyymillä digestoitua plasmidia pCIN sekoitettiin 50 ng kanssa geelissä puhdistettua plasmi-dista pGS189 peräisin olevaa 2,4 kiloemäksen pituista : fragmenttia 0,01 ml:ssa ligaasipuskuria, joka sisälsi ; .·, 25 10 yksikköä T4 DNA ligaasia. Reaktioseosta inkuboitiin • · · 25 °C:ssa 2 tuntia ja osaa käytettiin transformoitaessa E.
• · coli DH5alfa -solut. Ampisilliiniresistentit pesäkkeet • · · ’·* ’ selektoitiin LB-ampisilliinimaljoilla ja valmistettiin plasmidi-DNA. Puhdistettu DNA digestoitiin EcoRI-entsyy- • · · 30 millä ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla sei- • · · laisten plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät alfa-ja beeta-globiinigeenit ja insertin orientaation määrittämiseksi suhteessa vektoriin. Kaksi plasmidia tunnistettiin, jotka edustivat kahta mahdollista orientaatiota ja « · « · 113 105104 ne nimettiin plasmideiksi pGS289 (kuvio 23b) ja pGS389 (kuvio 23b).
Ihmisen rekombinanttihemoglobiinin ekspressio
Saccharomyces cerevisiae -hiivassa 5 S. cerevisiae -kannat GSY112 (MATalfapep4::HlS3prbl 1.6R his3 200 ura3-52 leu2::hisG canl cir°) ja RSY334 (MAT-alfa- regl-501 pep4-3 prbl-1122 ura 3-52 leu2-3, leu2-112) transformoitiin plasmideilla pGS289 tai pGS389 menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Ito et ai. [J. Bacterilogy 153: 10 163-168 (1983)]. Transformantit selektoitiin hiivan SD- ura-alustalla. Yksittäiset erillispesäkkeet poimittiin ja vedettiin viivoiksi SD-alustalle, josta puuttui ura-siili ja leusiini. Tästä selektiivisestä alustasta (SD-ura, -leu) peräisin olevia pesäkkeitä käytettiin ympät-15 täessä 2 ml SD-ura, -leu -alustaa, viljelmiä inkuboitiin 30 eC:ssa 24 tuntia ja niitä käytettiin ympättäessä 20 ml viljelmät alustalle, joka oli YP + 3 % etanoli, näitä inkuboitiin 24 tuntia lisää ja lisättiin galaktoosia konsen-traatioksi 2 %. Näytteet kerättiin 4, 8, 24, 28, 32 ja 48 20 tuntia induktion jälkeen. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin 1 ml :11a 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,8), joka ·;·, oli 1 mM EDTA:n suhteen, ja suspendoitiin uudelleen SDS- PAGE-näytepuskuriin (2 x 10® solua/ml). Näytteitä keitet-
I I
*. , tiin 10 minuuttia ja liukenematon materiaali poistettiin • < / / 25 sentrifugoimalla, 0,005 ml näytteet analysoitiin SDS- • · · :·: · PAGE:lla (12,5 %), jonka jälkeen siirrettiin nitrosellu- * * loosalle. Alfa- ja beeta-globiiniketjut värjättiin käyt- • ·· ·.· * täen kaupallisesti saatavaa kanin anti-ihmis hemoglobiini- vasta-ainetta ja immunoblottauskäyttöpakkausta, jotka han- :***: 30 kittiin Promega'lta. Käytetyt menetelmät olivat Promega'n • · · ·***: ohjeiden mukaiset. Immunoblottaus osoitti, että molempia ··· *. ketjuja syntetisoidaan ja että plasmidi pGS289 tuottaa • · · ·;;; hiukan vähemmän materiaalia kuin plasmidi pGS389. Ilmeinen I « '···' puutos alfaketjun (alempi rintama) ja beetaketjun väli- 35 sessä stoikiometriassa johtuu erosta vasta-aineen immuno- • « · • · • i M» 114 105104 reaktiivisuudessa kahdelle ketjulle. Tämä osoitettiin vertaamalla Coomassie brilliant blue -värillä värjättyjä ihmisen puhdistetun hemoglobiinin ja rekombinanttihemoglo-biinin geelejä immunoblotattuihin näytteisiin.
5 Esimerkki 20
Ihmisen hiivassa syntetisoidun rekombinanttihemo-globiinin karakterisointi
Kantaa RSY334 (pGS389) kasvatettiin 100 ml:ssa SD-leusiinialustaa OD600-arvoon 2,4. Tätä käytettiin ympättäes-10 sä 1 litra YPE-alustaa. Tätä viljelmää ravisteltiin 30 °C:ssa 24 tuntia, jona aikana lisättiin 50 ml 40 % ga-laktoosia. Inkubointia jatkettiin ja solut kerättiin 24 tuntia myöhemmin (OD600-arvossa 9). Solupelletti suspendoi-tiin uudelleen 100 ml:aan 0,01 M Tris-HCl-puskuria (pH 15 7,18), joka oli 0,001 M EDTA:n suhteen, ja solususpension
läpi kuplitettiin hiilimonoksidia 3 minuuttia. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja CO-käsittelyn jälkeen ne olivat selvästi punaisia. Solupelletti (19 g) suspendoitiin uudelleen 19 ml:aan lyysispuskuria (0,01 M NaP04, pH 6,0, 20 0,020 M DTT, 1 % Triton X-100, 0,001 M PMSF, 0,005 M
bentsamidiini ja 0,06 mM leupeptiini) ja kuplitettiin hii-limonoksidilla 2 minuuttia. Solususpensiota sonikoitiin _ Branson 250 -sonikaattorilla, joka oli varustettu 0,5 tuu- .·. man hajotuskärjellä. Sonikointiaika oli 2 minuuttia (0,5 a a < ·/,·. 25 sekunnin pulssit) täydellä teholla. Tämä toistettiin 4 • aa *** ! kertaa niin, että sonikointijaksojen välillä oli 2 minuu- • · ... tin jäähdytysajat. Soluroskat poistettiin sentrifugoimalla • · · (27 000 x g, 15 minuuttia) ja supernatantti säästettiin (0 ®C). Pelletti suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan lyysis- ♦ ♦♦ *...: 30 puskuria. Uudelleen suspendoitu pelletti sonikoitiin mik- ··· ·...· rokärjellä, kuten yllä (70 % maksimitehosta). Soluroskat .:. poistettiin sentrifugoimalla, kuten on kuvattu yllä ja supernatantti yhdistettiin ensimmäiseen. Yhdistetyt liuok- « a set kirkastettiin sentrifugoimalla (38 000 x g, 20 minuut- « « : *** 35 tia), joka tuotti kirkkaan punaisen liuoksen. Tämä ladat- « a · • · • « • · · 115 105104 tlin (kun pH oli säädetty 6,Oraan 10 mM fosforihapolla) 5 ml:n S-Sepharose-nopeavirtauspylvääseen, joka oli tasapainotettu 0,01 M natriumfosfaatilla (pH 6,0). Kaikki pylvääseen kiinnittynyt punainen materiaali ja pylväs pestiin 5 20 ml:11a 0,01 M natriumfosfaattia (pH 6,0). Pylväs eluoi- tiin 0,05 M natrimufosfaatilla (pH 7,5), joka oli 0,1 M NaClrn suhteen, ja kerättiin 1 ml:n fraktiot. Punainen väri eluoitui kahdessa fraktiossa. Tämän materiaalin puhtaus analysoitiin SDS-PAGE:lla ja se tuntui olevan -* 50 % 10 puhdasta ensimmäisen kromatografiavaiheen jälkeen. Tämä materiaali dialysoitiin 10 mM natriumfosfaattia (pH 6,0), joka oli 0,001 M EDTA:n suhteen, vastaan 16 tuntia 0 eC:ssa ja kromatografoitiin uudelleen Mono-S FPLC-pyl-väässä (pH 6,8 - 9,0, 0,02 M natriumfosfaattigradientti).
15 Tämän huippufraktio oli -* 85 % puhdasta. Absorptiospektri saatiin skannaamalla Mono-S-puhdistettua materiaalia 400 -650 nM Shimadzu-spektrofotometrillä (kuvio 24, yläosa). Saatu spektri oli identtinen ihmisen hemoglobiinin spektriin verrattuna (kuvio 24, alaosa), joka osoitti, että 20 proteiini oli laskostunut ja ottanut sisäänsä hemiryhmän. Kahdesta huippufraktiosta talteen saadun hemoglobiinin määrän määritettiin ekstinktiokoeffisientin (1,23 x 104 .! A450/M) perusteella olevan noin 20 mg.
Esimerkki 21 ' 25 Vektoreiden rakentaminen alfa- ja beeta-globiinien ·*· ' ekspressoimiseksi erillisistä hiivaplasmideista
Sen lisäksi, että kehitettiin yksi hiivavektori, • · · : joka sisälsi sekä alfa- että beeta-globiinien ekspressio- kasetit, kehitimme myös systeemin, joka käyttää erillisiä :***: 30 plasmideja molemmille kahdelle globiini-cDNA:lie. Kaksi • · · plasmidia sisältävät kumpikin kaksi hiivageeniä, joita • * · ·. käytetään säilyttämään plasmidi hiivassa. Molemmissa on # · · LEU2-geeni ja toisessa (pGS4688) on URA3-geeni ja toisessa .·* (pGS4988) on TRPl-geeni. Käyttämällä isäntää, joka sisäl- 35 tää mutaatiot URA3-, LEU2- ja TRPl-geeneissä, molemmat « · • · ««* 116 105104 plasmidit (toinen, jossa on alfa-globiinin ja toinen, jossa on beeta-globiinin ekspressiokasetti) voidaan ylläpitää. Näiden vektoreiden rakentaminen on kuvattu alla.
Plasmidin pClT rakentaminen 5 Plasmidi pClU (5 pg) digestoitiin BamHI- ja Sali- entsyymeillä ja suurin fragmentti puhdistettiin agaroosi-geelielektroforeesilla. Plasmidi YRp7 (10 pg) (J. Strat-hern, E. Jones ja J. Broach, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor, NY, 1981) diges-10 toitiin Bglll- ja Sali-entsyymeillä ja fragmentti, joka sisälsi TRPl-geenin, puhdistettiin agaroosigeelielektrofo-reesilla. 25 ng geelissä puhdistettua BamHI- ja Sali-entsyymeillä digestoitua plasmidia pCIU sekoitettiin 50 ng kanssa Bglll-Sall-fragmenttia ligaasipuskurissa, joka si-15 sälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Reaktioseosta inkuboi-tiin 25 °C:ssa 1,5 tuntia ja osaa ligaatioseoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Tetra-sykliiniresistentit pesäkkeet selektoitiin LB-tetrasyklii-nialustalla. Plasmidi-DNA valmistettiin 15 transformantis-20 ta, digestoitiin EcoRI-entsyymillä ja analysoitiin agaroo-sigeelielektroforeesilla. Yksi eristetty klooni, jolla oli odotetut EcoRI-restriktiofragmentit, valittiin ja nimettiin plasmidiksi pClT (kuvio 22a).
«
Beeta-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmi-25 diin pClT
*!*,· 100 ng plasmidia pClT digestoitiin Sall-entsyymil- • · ... lä, uutettiin fenoli-kloroformilla, seostettiin etanolilla • · ·
ja liuotettiin 0,01 ml:aan 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH
7,8), joka oli ImM EDTA:n suhteen. Plasmidi pGS3888 diges-30 toitiin XhoI-entsyymillä ja noin 1,2 kiloemäksen pituinen ··· :...* XhoI-fragmentti, joka sisälsi beeta-globiinin ekspressio- kasetin, puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. 10 ng Sali-entsyymillä digestoitua plasmidia pClT sekoi- 1 f tettiin 60 ng kanssa XhoI-fragmenttia, joka sisälsi beeta- I · : " 35 globiinin ekspressiokasetin, 0,01 ml:aan ligaasipuskuria, • · · « · • « • « · 117 105104 joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Reaktioseosta inkuboitiin 25 eC:ssa 30 minuuttia. Osaa tästä materiaalista käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. 100 ampisilliiniresistenttiä transformanttia poimittiin ja 5 täplitettiin LB-ampisilliiniagarille. Niitä inkuboitiin 5 tuntia 37 °C:ssa ja peitettiin nitroselluloosasuodattimel-la. Plasmidit, jotka sisälsivät XhoI-fragmentin, tunnistettiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen XhoI-fragmenttia hybridisaatiokoettimena, kuten yllä on kuvattu. Pesäkkei-10 tä, jotka muodostivat signaalin autoradiografiässä, käytettiin plasmidi-DNA:n valmistukseen. Puhdistettu DNA di-gestoitiin EcoRI-entsyymillä ja analysoitiin agaroosigee-lielektroforeesilla odotettujen restriktiofragmenttien läsnäolon suhteen. Kaksi kloonia, jotka sisälsivät halutun 15 Xhol-insertin, tunnistettiin ja insertin orientaatio määritettiin plasmidi-DNA:n EcoRI- tai SphI-digestien agaroo-sigeelianalyysillä. Molemmat eristetyt kloonit sisälsivät halutun insertin samassa orientaatiossa ja toinen nimettiin plasmidiksi pGS4988 (kuvio 22a).
20 Alfa-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmi-
diin pCIU
,'i ; XhoI-fragmentti plasmidista pGS4088, joka sisälsi alfa-globiinin ekspressiokasetin, puhdistettiin agaroosi-: geelielektroforeesilla ja talteen otettu fragmentti liuo- • t ; 25 tettiin (100 ng/0,01 ml) 1 mM Tris-HCl-puskuriin pH 7,8, « i i joka oli 0,1 mM EDTA:n suhteen. 25 ng geelissä puhdistet- • · ... tua fragmenttia sekoitettiin 10 ng kanssa Sali-entsyymi 1- » * · '·* lä digestoitua (fenoli-kloroformilla uutettu, etanolilla saostettu) plasmidia pCIU 0,01 ml:aan ligaasipuskuria,
• M
:...· 30 joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA ligaasia. Reaktioseosta ··· inkuboitiin 25 °C:ssa 1,5 tuntia ja osaa käytettiin trans-formoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Ampisilliiniresisten-tit pesäkkeet selektoitiin LB-ampisilliinimaljoilla. Plasmidi-DNA valmistettiin 12 transformantista, digestoitiin 35 Hindlll-entsyymillä ja analysoitiin agaroosigeelielektro- • I · < I · 105104 foreesilla. Kaksi mahdollista orientaatiota eristettiin ja nimettiin plasmideiksi pGS4488 (kuvio 22b) ja pGS4688 (kuvio 22b).
Alfa- ja beeta-globiiniketjuja erillisistä plasmi-5 deista ekspressoivien diploidien kantojen rakenta minen S. cerevisiae RSY330 (MAalfa pep4-3 prbl-112 hist7 ura3-52 trpl-289 canl gall) transformoitiin (Ito et ai.) plasmidilla pGS4488 tai pGS4688. Trp*-transformantit selek-10 toitiin SD-trp-alustalla ja vedettiin erillispesäkkeiksi.
S. cerevisiae BJY1991 (MATalfa prbl-112 pep4-3 leu2-3,112 trpl-101 ura3-52 gal2 canl) transformoitiin plasmidilla pGS4988. URA*-transformantit selektoitiin SD-ura-alustalla ja vedettiin erillispesäkkeiksi. Nämä kannat testattiin 15 kummatkin alfa- ja beeta-globiinin tuoton suhteen seuraavasti: (1) Yksittäiset pesäkkeet poimittiin selektiiviseltä SD-alustalta ja käytettiin ympättäessä 2 ml selektiivistä SDS-alustaa (liuosmainen). Viljelmiä inkuboitiin 24 tuntia 30 °C:ssa ja laimennettiin 25 ml:aan tuoretta se-20 lektiivistä SD-alustaa ja inkuboitiin lisää 24 tuntia. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 25 ml:aan YP-galaktoosia (2 %) ja inkubointia jatkettiin lisää 24 tuntia. Solut kerättiin (8 000 x g, 10 mi- • ' nuuttia) ja pelletti pestiin 50 ml:11a 0,010 M Tris-HCl- ' 25 puskuria (pH 7,8), joka oli 0,001 M EDTA:n suhteen. Pelle- « < : tit liuotettiin kuumentamalla 96 °C:ssa 10 minuuttia SDS- PAGE-näytepuskuriin ja roskat poistettiin sentrifugoimalla (15 000 x g, 10 minuuttia). Kirkastetut supernatantit 1 x 106 solusta analysoitiin kukin SDS-polyakryyliamidigeeli- .**·. 30 elektroforeesilla ja Western-immunoblottauksella, kuten • « · .···. yllä on kuvattu. Beeta-globiini oli helposti tunnistetta- • * • vissa kannan BJY3505 (pGS4988) uutoksista. Kykenimme myös • « · tunnistamaan alfa-globiinin kanssa ristireagoivaa mate- ·...· riaalia, vaikka signaalin vahvuus olikin huomattavasti 35 heikompi. Tetrameerisen hemoglobiinin tuotto vaatii sekä • · · 4 « 119 105104 alfa- että beeta-ketjujen läsnäolon, ideaalisesti näitä ekspressoitaisiin samassa solussa. Koska kannat BJY3505, BJY1991 ja RSY330 ovat haploideja, ne kukin voidaan pa-riuttaa vastakkaisen pariutumistyypin omaavan hiivakannan 5 kanssa. Kannat RSY330 ja BJY1991 ovat molemmat pariutumis-tyyppiä alfa, kun taas kanta BJY3505 on pariutumistyyppiä a. Kantojen BJY3505 (pGS4988), RSY330 (4688) tai BJY1991 (4688) tai RSY330 (pGS4688) pariutumiset tehtiin ja di-ploidit selektoitiin vetämällä SD-minimialustalle ilman 10 mitään lisäaminohappoja tai muita ravinteita. Kumpikaan plasmidia sisältävistä emokannoista ei kykene kasvamaan tällä alustalla, diploidit kuitenkin voivat kasvaa. Koska diploidit ovat homotsygoottisia TRP1- ja URA3-geenien mutaatioiden suhteen, molemmat plasmidit täytyy olla läsnä, 15 jotta solut voivat kasvaa näiden ravinteiden poissa ollessa. Nämä diploidit kannat analysoitiin alfa- ja beeta-glo-biinien synteesin suhteen, kuten on kuvattu yllä. Saatiin mitä yllättävin tulos. Vaikka alfa-globiinia ja beeta-glo-biinia syntetisoidaan matalilla tasoilla haploideissa kan-20 noissa, yhteisekspressio diploidissa kannassa johtaa oleelliseen kohoamiseen molempien ketjujen tasoissa. Li-säksi, kun oli indusoitu (24 tuntia) galaktoosilla, solu-:\it pelletit kehittivät selvän vaaleanpunaisen värin. Nämä : tulokset antavat olettaa, että: (a) alfa-ja beeta-globii- 25 nin yhteisekspressio stabiloi nämä kaksi proteiinia ehkä johtuen niiden interaktiosta keskenään ja (b) proteiini 4 · ilmeisesti laskostuu ja ottaa sisälleen hemiryhmän.
Esimerkki 22
Hiivasta peräisin olevan hemoglobiinin hapensito- • · ..· 30 misominaisuudet • · t..: Hiivasta peräisin olevan hemoglobiinin P50-arvo on lähes identtinen hemoglobiini A0:n vastaavaan. Riippuen ···_ siitä, miten mittaamme sen, P50-arvo vaihtelee noin 5-10 torriin fosfaattivapaassa liuoksessa. 25 °C:ssa se on noin • *·· 35 4 - 6 torria 50 mM BisTris-puskurissa, pH 7,4, joka on • · « 120 105104 0,1 M NaCltn suhteen. Samassa liuoksessa 37 °C:ssa P50-arvo on 8,5 - 11.
Esimerkki 23
Di-alfa-hemoglobiinin ekspressio S. cerevisiae 5 -hiivassa
Menetelmät
Jollei muuta ole ilmoitettu, kaikki entsyymit (res-triktioendonukleaasit, T4 DNA -ligaasi, T4 DNA -polyme-raasi, T4 -polynukleotidikinaasi) hankittiin New England 10 Biolabs'lta, Pharmacia'1ta, BRL'ltä, Stratagene'Itä tai Boehringer Mannheim'lta. Restriktioentsyymej ä j a T4 DNA -ligaasia käytettiin valmistajien mukaisissa puskureissa.
Nukleiinihappojen etanolisaostus suoritettiin lisäämällä 0,5 tilavuutta 7,5 M ammoniumasetaattia ja 2 ti-15 lavuutta etanoli-isopropanolia, jossa suhteet olivat 20:1. Pelletti kerättiin sentrifugoimalla 14 000 x g 15 minuutin ajan, pestiin kahdesti 80-%:isella etanolilla, kerran 95-%:isella etanolilla ja kuivattiin tyhjiössä. Fenoliuu-tot suoritettiin lisäämällä fenoli:kloroformi:isoamlyyli-20 alkoholiseosta, jossa suhteet olivat 50:49:1. Faasit erotettiin sentrifugoimalla 14 000 x g ja vesipohjainen faasi kerättiin. Plasmidi-DNA puhdistettiin E. coli DH5alfa -soluista, kuten ovat kuvanneet Birnboim ja Doly (Nucleic .·. Acids Research 1979, 7: 1513 - 1520). DNA:n elektroforeet- I · .·. 25 tinen analyysi suoritettiin agaroosigeeleissä käyttäen \[\m\ Tris-asetaattielektroforeesipuskuria (Maniatis et ai., ,.. Molecular Cloning, Cold Spring Harbot, NY, 1982). DNA teh- • · * tiin silmin näkyväksi värjäämällä geelit liuoksella, jossa oli etidiumbromidia 0,5 pg/ml ja valottamalla geelejä ult-30 raviolettivalossa. DNA-fragmentit puhdistettiin agaroosi- • · ,..· geeleistä käyttäen BlO-101'ltä hankittua käyttöpakkausta.
DNA-fragmentit puhdistettiin akryyliamidigeeleistä murskaamalla geelipala 3,25 M ammoniumasetaattiin ja inkuboi-maila yli yön 37 eC:ssa. Geelipalat poistettiin sentrifu-35 goimalla (14 000 x g, 15 minuuttia) ja DNA seostettiin • « · • · • · • · · 121 105104 etanolilla. Sakka liuotettiin TE-puskuriin (10 mM Tris-HC1, pH 7,8, 1 mM Na3EDTA). DNA:n akryyliamidigeelielektro-foreesi suoritettiin, kuten on kuvattu teoksessa Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 5 NY, 1982. Bakteriologiset kasvatusalustat ja DNA:n trans-formaatiomenetelmät olivat, kuten ovat kuvanneet R.W. Davis et ai., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1980. S. cerevisiae -hiivan kasvatusalustat ovat kuvanneet F. Sherman et ai., Methods in 10 Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1979. S. cerevisiae -hiivan transformaatio lineaarisella tai rengasmaisella DNA:11a suoritettiin, kuten ovat kuvanneet H. Ito et ai., J. Bacteriology, 153: 163 - 168, 1983.
15 PstI- ja Spel-kohtien poistaminen plasmidista PGS4888
Synteettisen linkkerin suunnitteleminen kahden al-fa-globiiniketjun liittämiseksi yhteen sallii 30 emäsparin pituisen sekvenssin, joka sisältää kahta alfa-globiinia 20 koodittavien sekvenssien liitoskohdan, viereisten PstI- ja Spel-kohtien mukaan ottamisen. Koska aikomuksenamme on testata useita erilaisia linkkerisekvenssejä, nämä kohdat « |’.fi sallivat suhteellisen lyhyiden synteettisten oligonukleo- : tidien, jotka koodittavat erilaisia linkkerisekvenssejä, : 25 suoran kloonauksen. PstI- ja Spel-kohtien poistaminen vek- i i * torisekvenssistä on sen vuoksi tarpeellista niin, että .. kohdat koodittavalla alueella ovat käytettävissä. Yksi pg • · plasmidia pGS4888 digestoitiin Pstl-entsyymillä ja seostettiin etanolilla. Kuiva pelletti suspendoitiin uudelleen 30 50 pl:aan liuosta, joka oli 33 mM Tris-asetaatin, pH 7,9, • · · 66 mM kaliumasetaatin, 10 mM magnesiumasetaatin, 0,5 mM DTT:n ja 50 μΜ kunkin dNTP:n suhteen (T4 polymeraasipus-kuri). Lisättiin kaksi yksikköä T4 DNA -polymeraasia ja reaktioseosta inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa. Lisät-; *· 35 tiin Na3EDTA:a niin, että loppukonsentraatio oli 12,5 mM ja « · · 122 105104 reaktioseosta kuumennettiin 65 °C:ssa 15 minuuttia, uutettiin fenolilla ja seostettiin etanolilla. Kuiva pelletti liuotettiin 14 pl:aan T4 DNA ligaasipuskuria (BRL) ja lisättiin 1 μΐ (10 yksikköä) T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseos-5 ta inkuboitiin 4 eC:ssa 16 tuntia. Osaa ligaatioreaktiosta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut ja transformantit selektoitiin LB-ampisilliinimaljoilla. Plasmidi-DNA valmistettiin 12 transformantista. DNA analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla PstI-entsyymillä 10 digestoiduista näytteistä. Viidestä transformantista oli hävinnyt Pstl-kohta ja yksi näistä nimettiin plasmidiksi pGS1889. Tämän plasmidin Spel-kohta poistettiin, kuten yllä on kuvattu sen jälkeen, kun plasmidi pGS1889 oli di-gestoitu Spel-entsyymillä. Tunnistettiin plasmidi, josta 15 oli hävinnyt sekä PstI- että Spel-kohta ja se nimettiin plasmidiksi pGS1989.
Strategia kahden alfa-globiinin cDNA-kopion yhteen-liittämiseksi
Fragmentti, joka sisältää alfa-globiinia kooditta-20 van alueen 5'-pään 363 emäsparin pituisen osan, voidaan irrottaa plasmidista pGS4888 NcoI-ApaLI-fragmenttina. Toinen fragmentti, joka sisältää nukleotidit 109 - 3'-pään « · '·1 1 puoleinen transloimaton alue, voidaan poistaa Fokl-Sall- i 1’ fragmenttina. Nämä kaksi fragmenttia voidaan sitten liit- « « ·.1·: 25 tää yhteen muodostamaan yhden translaatioyksikön, joka • · ♦ koodittaa kahta alfa-globiinin cDNArn peräkkäin olevaa *:1·: kopiota, käyttäen synteettistä oligonukleotidiadaptorisek- ;1·1: venssiä (taulukko 8). Näiden fragmenttien puhdistus ja kokoaminen on kuvattu alla.
.···. 30 Plasmidi pGS4888 digestoitiin peräkkäin ApaLI- ja • · 1··^ Ncol-entsyymeillä ja noin 365 emäsparin pituinen fragment- • · *Γ ti (alfaketju 1) puhdistettiin akryyliamidigeelielektro- foreesilla. Toinen noin 351 emäsparin pituinen fragmentti (alfaketju 2) valmistettiin digestoimalla peräkkäin Fokl-35 ja Sali-entsyymeillä, jonka jälkeen suoritettiin akryyli- • · · « · « • · ♦ · • « · 123 105104 amidigeelielektroforeesi. Syntetisoitiin neljä oligonuk-leotidia (taulukko 8) ja koottiin noin 173 emäsparin pituiseksi linkkeriksi (RGGV), joka sisälsi ApaLI- ja Fokl-päät. Oligonukleotidien synteesi, puhdistus ja kokoaminen 5 tapahtui, kuten on kuvattu aiemmin. Tämä adaptorisekvenssi koodittaa aminohapposiltaa, joka yhdistää alfaketju l:n karboksipään alfaketju 2:n aminopäähän kuin myös osia alfaketju l:n 3'-päästä ja alfaketju 2:n 5'-päästä. Alfa-ketju l:n karboksipään arginiinijäännös erotetaan tässä 10 rakenteessa alfaketju 2:n aminopään valiinista kahdella glysiinijäännöksellä. "Diglysiinisiltaosan" vieressä on Hpal-, Spel- ja Pstl-kohdat. Nämä kohdat sallivat substi-tuoimisen erilaisilla siltarakenteilla käyttämällä noin 30 emäsparin pituisia adaptorisekvenssejä liitettäessä kaksi 15 alfaketjua ekspressiokasettiin. Tämä suoritettiin neljä-vaiheisella ligaatiolla, kuten alla on kuvattu.
Plasmidi pGS1989 digestoitiin peräkkäin Ncol- ja Sali-entsyymeillä ja suuri fragmentti, joka sisälsi plas-midivektorin ja pGALGAP-sekvenssin, puhdistettiin agaroo-20 sigeelielektroforeesilla (gpl989). 50 ng fragmenttia gpl989 sekoitettiin 200 ng kanssa geelissä puhdistettua ApaLI-NcoI-fragmenttia, joka sisälsi alfaketju l:n, ja 200 ng kanssa geelissä puhdistettua Fokl-Sall-fragmenttia, .·. : joka sisälsi alfaketju 2:n. Lisättiin 20-kertainen mooli- « · t ;\·] 25 ylimäärä synteettistä ApaLI-Fokl-adaptorisekvenssiä (adap- • « « I torisekvenssin 5'-päät eivät olleet fosforyloituja). Li- gaatioreaktio suoritettiin 20 μΐ tilavuudessa 4 tunnin • · ·* ajan 23 °C:ssa. Osaa tästä reaktioseoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut ja selektoitiin >·· 30 ampisilliiniresistentit pesäkkeet. Transformantit täpli-tettiin nitroselluloosasuodattimille ja seulottiin hybri-disoimalla 32P-leimatun oligonukleotidin AL2as (taulukko ··', 8) kanssa. Viittä pikomoolia oligoa AL2-as inkuboitiin 20 pl:ssa liuosta, joka sisälsi 2 yksikköä T4-polynukleo-: *·· 35 tidikinaasia ja oli 50 mM Tris-HCl-puskurin (pH 7,6), • · · 124 105104 10 mM MgCl2:n, 6 mM DTT:n, 0,1 mM spermidiinin, 0,1 mM EDTA:n ja 10 pM gamma32P-ATP:n (7000 Ci/mM) suhteen, 2 tunnin ajan 37 eC:ssa. Suodattimia käsiteltiin, kuten ovat kuvanneet Maniatis et ai. ja hybridisaatio suoritettiin 5 37 °C:ssa liuoksessa, joka oli 5 x SSC, 50 % formamidi, 100 pg hiivan tRNA:ta/ml ja 2 % SDS, 16 tunnin ajan. Suodattimet pestiin peräkkäin 2 x SSC:llä ja 1 x SSCillä 55 °C:ssa 15 minuutin ajan (kaksi kertaa kummassakin, kaikki pesunesteet sisälsivät 1 % SDS:ää). Kuivatut suo-10 dattimet valotettiin röntgenfilmille ja pesäkkeitä, jotka antoivat hybridisaatiosignaalin, käytettiin plasmidi-DNA:n valmistukseen. Plasmidi-DNA analysoitiin restriktioentsyy-midigestiolla sellaisten plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät insertin, joka vastasi kooltaan kahta alfaket-15 jua (NcoI-Sall-digesti) ja jotka sisälsivät ainoastaan yhden PstI-, Spel- ja Hpal-kohdan. Tällä tavalla tunnistettu plasmidi nimettiin plasmidiksi pGS2189 (kuvio 25).
Xhol-fragmentti plasmidista pGS3888, joka fragmentti sisälsi beeta-globiinin ekspressiokasetin, puhdistet-20 tiin agaroosigeelielektroforeesilla. Xhol-entsyymillä di-gestoitu plasmidi pGS2189 (50 ng) yhdistettiin 150 ng
kanssa geelissä puhdistettua plasmidin pGS3888 inserttiä 1 pl:ssa ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA
.·. -ligaasia. Osaa tästä seoksesta käytettiin transformoi- < · · 25 taessa E. coli DH5alfa -solut ja selektoitiin ampisillii- • * * "* I niresistentit pesäkkeet. Plasmidi-DNA eristettiin ja ana- 4 · · · · · lysoitiin digestoimalla Xhol-, BamHI- tai Ncol-entsyymeil- • · ·’ lä. Useita sellaisia plasmideja tunnistettiin, jotka tuot tivat odotetun kokoiset restriktiofragmentit, jotka kaikki • · · ...· 30 sisälsivät insertin orientaatiossa, joka on esitetty ku- ί,,,ί viossa 25. Yksi näistä nimettiin plasmidiksi pGS2989.
Vaikka tämä plasmidi sisältää yhteen liitetyt alfa-globii-"·. nigeenit ja beeta-globiinigeenin erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa, se ei kykene replikoi tumaan S. ce- i '·· 35 revisiae -hiivassa. Koko ekspressiokasetti, joka sisältää « · « · 125 105104 kaksi geeniä (di-alfa- ja beeta-globiini), voidaan puhdistaa NotI-fragmenttina. 10 pg plasmidia pGS2989 digestoi-tiin PvuI- ja Notl-entsyymeillä ja Notl-fragmentti puhdistettiin geelissä. Digestio PvuI-entsyymillä suoritettiin, 5 jotta alennettiin niiden vektorisekvenssien kokoa, jotka muuten olisivat kulkeneet yhdessä halutun Notl-fragmen-tin kanssa. 200 ng geelissä puhdistettua Notl-fragmenttia yhdistettiin 50 ng kanssa NotI-entsyymillä digestoitua plasmidia pCIN 10 pl:ssa ligaatiopuskuria, joka sisälsi 10 10 yksikköä T4 DNA ligaasia. Reaktioseosta inkuboitiin 4 eC:ssa yli yön ja osaa käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Ampisilliiniresistentit transforman-tit selektoitiin ja valmistettiin plasmidi-DNA. DNA diges-toitiin Ncol-Sall-, PstI- tai Notl-entsyymeillä sellaisten 15 plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät di-alfa-, beeta-globiinin ekspressiokasetin ja insertoidun fragmentin orientaation määrittämiseksi. Useita sellaisia plas-mideja tunnistettiin, jotka sisälsivät oikean insertin, joista plasmideista kaikilla oli insertoitunut fragmentti 20 samassa orientaatiossa. Yksi näistä nimettiin plasmidiksi pGS3089 (kuvio 25). Tätä plasmidia käytettiin transformoi-; taessa kannat GSY112 ja RSY334.
Ekspressio ja puhdistus .·. : S. cerevisiae -kannat GSY112 (pGS3089) ja RSY334 ; 25 (pGS3089) kasvatettiin kyllästyspisteeseen SD-urasiili- alustassa ja laimennettiin 2 litraan YPD-alustaa (kaikkia * · · · · ^ • · ... viljelmiä inkuboitiin 30 °C:ssa). 24 tuntia ymppäyksen • · ·* ’ jälkeen (YPD-viljelmän) lisättiin galaktoosia 1 %:ksi ja viljelmiä inkuboitiin toiset 24 tuntia. Hiilimonoksidia *·· ·...· 30 kuplitettiin viljelmän läpi ja solut kerättiin sentrifu- • ♦ ♦
goimalla. Seos, jossa oli 1:1 (paino:tilavuus) soluja ja hajotuspuskuria (10 mM natriumfosfaatti (pH 7,2), 1 mM
• ••# EDTA, 1 mM EGTA ja 5 mM DTT), hajotettiin "Bead-Beater"- 4 · kojeessa (Biospec Products, Bartlesville, OK). Roskat ί '·· 35 poistettiin sentrifugoimalla (10 000 x g, 30 minuuttia).
I · 4 · « · • I · 126 105104
Liukoisen fraktion pH säädettiin 6,0:aan fosforihapolla ja kromatografoltiin S-Sepharose-pylvään (nopeavirtaus) läpi, joka pylväs oli tasapainotettu 10 mM natriumfosfaatissa, pH 6,0. Ladattu pylväs pestiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla, 5 pH 6,7 ja hemoglobiini eluoitiin pesemällä 20 mM Tris-HCl-puskurilla, pH 7,5. Kirkkaanpunainen rintama kerättiin ja pH säädettiin 8,0:aan lisäämällä NaOH:ia. Tämä materiaali kromatografoitiin sitten Q-Sepharose-pylväässä (nopea-virtaus), joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCl-puskuris-10 sa, pH 8,0. Hemoglobiini eluoitiin NaCl-gradientilla (0 -0,4 M). Lopullinen kromatograflavaihe suoritettiin Seph-acryl S-200-pylväässä, joka oli tasapainotettu 5 mM NaP04-puskurissa, pH 7,4, joka oli 0,1 M NaCl:n suhteen. Kukin puhdistussysteemin vaihe analysoitiin SDS-polyakryyliami-15 digeelielektroforeesilla (Laemmli, UK, 1970, Nature 227: 680 - 685) ja värjäämällä Coomassien brilliant blue-väril-lä. Puhdistettu proteiini sisältää rintaman, joka kulkee yhdessä monomeerisen beeta-globiinin kanssa ja rintaman, joka kulkee odotetussa alfa-globiinidimeerin kohdassa. 20 Tämä materiaali kulkee yhdessä ihmisen tetrameerisen hemoglobiinin kanssa, kun analysoidaan kokoerotukseen perustu-... valla kromarografiällä (Progel TSK G3000 SWXL HPLC-pyl-
• I
' väs). Tämä proteiini on väriltään punainen ja sitoo 02:a · • " niin, että 50 % sitoutumisaffiniteettiarvo (P50) on 8 - 10 25 torria, joka osoittaa, että se on ottanut sisäänsä hemi- « · ·.· 1 ryhmän ja kykenee reversiibeliin 02-sitomiseen.
*:··: Puhdistettu proteiini erotettiin alfa- ja beetaket- juihin käänteisfaasi-HPLC:llä ja kummankin ketjun 10 ami-nopään jäännöksen sekvenssi määritettiin. Sekvenssi sopi .···„ 30 yhteen ihmisen alkuperäisen hemoglobiinin vastaavan kanssa .···. osoittaen, että aloitusmetioniini oli tehokkaasti poistet- • · *!1 tu sekä alfa-globiinidimeeristä että beeta-globiinidimee- ristä.
« 4 4
• i I
• 4 4 • · « 4 4 · · • · • · • · · 127 105104
Esimerkki 24
Matalan affiniteetin sisältävien geneettisesti yh-teenliitettyjen hemoglobiinimutanttien rakentaminen ja ekspressio hiivassa 5 Vektorin rakentaminen kohdennettua mutageneesia varten
Beeta-globiinin ja sen GALGAP-promoottorin sisältävä XhoI-fragmentti eristettiin plasmidista pGS2989 prepa-ratiivisella agaroosigeelielektroforeesilla ja ligoitiin 10 Xhol-entsyymillä digestoidun Phagescript-vektorin (RF-muo-to, hankittiin Stratagene, Inc.'lta) kanssa. E. coli XL1-Blue -bakteerit transformoitiin DNA ligaatioseoksella ja faagia sisältävät insertit tunnistettiin (valkoiset plakit alustalla, joka sisälsi X-gal:ia). Yksittäiset plakit 15 eristettiin ja DNA valmistettiin ja analysoitiin digestoi-malla Xhol-entsyymillä ja ajamalla agaroosigeelielektro-foreesi. Tämä rakenne nimettiin plasmidiksi Mp-beeta-glo-biini.
Yksijuosteisen templaatin valmistus 20 Kyllästettyä E. coli XLl-Blue -bakteerin (kaupalli sesti saatavana Stratagene'lta, 11099 North Torrey Pines .*·; Road, La Jolla, CA 92037) viljelmää käytettiin ympättäessä 4 ml 2 x YT-lihalientä. Tätä viljelmää inkuboitiin 2 tun-.·. : tia 37 °C:ssa ja sitten infektoitiin yksittäisellä Mp-bee- 25 ta-globiini-faagiplakilla ja inkubointia jatkettiin 6-8 tuntia. Solut poistettiin sentrifugoimalla ja heitettiin pois. Faagi saostettiin 1,6 ml:sta kirkastettua alustaa • * · *·* lisäämällä 320 μΐ 3,5 M ammoniumasetaatissa olevaa kylmää 30-%:ista PEG 8000:aa, jonka jälkeen inkuboitiin jäissä 30 • * · 30 minuuttia. Faagi kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoi-tiin uudelleen 0,1 ml:aan 10 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, joka oli 1 mM EDTA:n suhteen (TE). DNA eristettiin uutta-maila kahdesti fenoli/kloroformilla. DNA (joka oli vesi-faasissa) saostettiin lisäämällä NaCl:ia konsentraatioksi « · · • · · « « i · 128 105104 0,5 M ja kaksi tilavuutta 95 % etanolia. DNA-pelletti liuotettiin 20 μΐ vettä.
In vitro mutageneesireaktiot 200 ng templaatti-DNA:ta sekoitetaan 20-kertai-5 sen mooliylimäärän kanssa sopivaa fosforyloitua oligonuk-leotidia 10 pl:ssa 20 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, joka on 2 mM MgCl2:n, 50 mM NaCl:n suhteen ja kuumennetaan 70 eC:seen 5 minuutiksi. Hybridisaatioreaktion annetaan jäähtyä hitaasti (40 minuuttia) 40 °C:seen ja sitten 10 30 4C:seen (15 minuuttia). Viimeisen hybridisaatiovaiheen
jälkeen seos siirretään jäihin 5 minuutiksi. Tähän seokseen lisätään 1 μΐ synteesipuskuria (4 mM kunkin dNTP:n suhteen, 7,5 mM ATP, 175 mM Tris-HCl, pH 7,4, 37,5 mM
MgCl2, 215 mM DTT), 0,5 μΐ T4 geeni 32:n proteiinia (2 pg/ 15 ui), 1 μΐ T4 DNA ligaasia (3 yksikköä) ja 1 μΐ T4 DNA po-lymeraasia (1 yksikkö). Seosta inkuboidaan 37 °C:ssa 90 minuuttia (jonka jälkeen 5 minuuttia huoneenlämpötilassa). Reaktio lopetetaan lisäämällä 90 μΐ liuosta, joka on 0,1 M Tris-HCl-puskurin (pH 8,0) ja 0,1 M EDTA:n suhteen. Noin 20 0,1 μΐ reaktioseoksesta käytettiin transfektoitaessa E.
coll XLl-Blue -solut (solut valmistettiin transformaatioon . ! : menetelmällä, jonka on kuvannut D. Hanahan, 1983, J. Mol.
Biol. 166: 557).
;*· ) Mutanttigeenin sisältävän faagin seulonta • · : 25 Noin 50 - 100 plakkia poimittiin tuoreille maljoil- « « · le, joille oli levitetty sopiva isäntäkanta (XLl-Blue) • · määrätyssä järjestyksessä. Kun oli inkuboitu 6-8 tuntia * 37 *C:ssa, maljojen päälle asetettiin nitroselluloosasuo- dattimet ja ne valmistettiin hybridisaatiota varten oleel- *...* 30 lisesti, kuten ovat kuvanneet Davis, R.W. et ai. (Advanced ··· ·...· Bacterial Genetics: A Manual of Genetic Engineering. Cold
Spring Harbor Laboratory, New York, 1980). Mutagenisoi- ,···, van oligonukleotidin kanssa käytettävä hybridisaatioläm- • · pötila määritettiin oligonukleotidin emäskoostumuksen pe- « · : ** 35 rusteella. Oligonukleotidi leimattiin gamma-32P-ATP:llä ja • · · • · • « • · · 129 105104 polynukleotidikinaasilla (T. Maniatis et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Hybridisaatiot suoritettiin > 6 tuntia 2 -5 eC täydellisesti yhteensopivan oligonukleotidin lasketun 5 Tm-lämpötilan alapuolella liuoksessa, joka oli 6 x SSC, 2 % SDS, 100 pg hiivan tRNA:ta/ml, käyttäen 105 cpm leimattua oligonukleotidia/ml. Tm-lämpötila laskettiin käyttäen kaavaa: 4 °C kutakin GC-paria kohti +2 °C kutakin AT-pa-ria kohti olettaen Na*-konsentraation olevan 1 M. Suodat-10 timet pestiin samassa lämpötilassa kuin hybridisoitiin liuoksessa, joka oli 5 x SSC, 2 % SDS ja valotettiin rönt-genfilmille. Plakkeja, jotka antoivat positiivisen hybri-disaatiosignaalin, käytettiin valmistettaessa yksijuostei-nen DNA, kuten on kuvattu yllä. Yksijuosteista DNA:ta käy-15 tettiin templaattina senvenssointireaktioissa (Sanger, F. ja Coulson, A.R. 1975, J. Mol. Biol., 94: 441) sen varmistamiseksi, että mutanttisekvenssi oli todella läsnä.
Mutageneesiin käytetyt oligonukleotidit 6N108K-"Presbyterian" 5'-AGGCTCCTGGGCAAGGTGCTGGTCTGT-3' 20 BE90K-"Agenogi" 5'-GCCACACTGAGTAAGCTGCACTGTGAC-3’ BV67I-(No Alias) 5'-CATGGCAAGAAAATCCTCGGTGCCTTT-3' BN102T-"Kansas" 5 '-GTGGATCCTGAGACTTTCAGGCTCCTG-3 '
Kloonaus hiivan ekspressiovektoreihin « « ; Faagin RF-DNA valmistettiin faagilla infektoiduista / 25 soluista, joiden oli varmistettu sisältävän mutanttisek- • « * ’** I venssin ja muutetun beeta-globiinigeenin sisältävä XhoI- I · · · · fragmentti puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla.
• · ·’ * Tämä fragmentti kloonattiin plasmidin pGS3089 johdannai seen, joka oli muutettu muuttamalla di-alfa-liitosryhmä • · · 30 diGly-muodosta yhden glysiinin sisältäväksi sillaksi ja • · · josta johdannaisesta beeta-globiinigeeni oli poistettu, ja joka oli nimetty plasmidiksi pGS3889desbeeta (kuvio 26).
'!!!t Tämä muodosti yhden ainoan XhoI-kohdan, johon muutettu < · beeta-globiinin ekspressiokasetti voitiin insertoida, joka • · • '·· 35 salli yhteisekspression alfa-globiinidimeerin kanssa. Täi- • · · • · « · • · · X30 105104 lä tavalla muodostettuja ekspressioplasmideja (pGS3889 "Presbyterian"-mutaatiolle, pGS5189 "Ahenogi"-mutaatiolle, pGS5689 "Kansas"-mutaatiolle ja pGS4989 "beetaV67I"-mutaatiolle, jotka kaikki ovat identtisiä plasmidille pGS3089 5 lukuun ottamatta mutaatiota spesifioidussa kodonissa) käytettiin transformoitaessa S. cerevisiae -kannat GSY112 ja RSY334.
Hiivassa ekspressoidun geneettisesti yhteenliitetyn matalan affiniteetin sisältävän mutanttiproteiinin 10 ominaisuudet
Soluja, jotka sisälsivät plasmidin pGS3889 (yksi gly-silta, beetaN108K eli "Presbyterian"-mutaatio) kasvatettiin ja hemoglobiini puhdistettiin, kuten aiemmin on kuvattu. Tämä materiaali, kun sitä analysoitiin toiminnan 15 suhteen, oli oleellisesti "oikealle siirtynyt" verrattuna villityypin beetaketjun kanssa yhteenliitettyyn proteiiniin (P50 « 23 - 25 mutantille, N - 2,5).
Esimerkki 25
Kannan valinnan ja induktiolämpötilan valinnan vai-20 kutus di-alfa-hemoglobiinin ekspressioon E. coli -bakteerissa
Taulukko 100 sisältää di-alfa/beeta-fermentaatioi- ’* ' den vertailut. Se esittää myös induktiolämpötilojen ver- : “ tailut. Sarake, jonka merkintä on "mg di-A+B" on kokonais- • · :.**i 25 milligrammamäärä di-alfa·^· ja beeta-polypeptidejä per fer- • · · mentaatio. Viereinen sarake, jonka merkintä on "mg/OD-L", *:·*: yksinkertaisesti esittää ensimmäisen sarakkeen luvun pe- ·’·*; rustuen solutiheyteen. Kaksi saraketta, jotka on merkitty RHGB:llä, esittävät läsnä olevan toimivan rekombinanttihe- .···. 30 moglobiinin kokonais- ja solutiheydellä korjatun saannon.
• *
Jill' Viimeinen sarake osoittaa, että lopullisen toimivan hemo- • ♦ *Γ* globiinin saannon suhteen kanta JM109 on suositeltava.
..*·* Ilman, että sitoutuisimme mihinkään teoriaan, uskomme että • · · : tällä erolla on tekemistä eri kannoissa ekspressoituvien ;·* 35 proteaasien kanssa. On kiintoisaa huomata, että kahdesta • · · « • · · • · • · • · · 131 105104 parhaasta JM109 kasvatuksesta yksi induktio tapahtui 30 eC:ssa ja yksi 37 °C:ssa niin, että molemmissa tuotettiin karkeasti samanlaiset määrät lopullista toimivaa hemoglobiinia.
5 Esimerkki 26
Yhdellä glysiini- tai proliinijäännöksellä yhdistettyjen geneettisesti yhteenliitettyjen alfa-glo-biinidimeerien rakentaminen
Syntetisoitiin seuraavat synteettiset adaptorisek-10 venssit di-alfa-globiinisillan muuttamiseksi ja ne puhdistettiin, kuten on kuvattu aiemmissa osissa.
TSKYRPVLSPA 5'-A ACT AGT AAG TAC AGA CCT GTT TTG TCT CCT GCA-3’ RPV 15 3’-T TGA TCA TTC ATG TCT GGA CAA AAC AGA GG-5’
Hpal PstI
TSKYRGVLSPA 5'-A ACT AGT AAG TAC AGA GGT GTT TTG TCT CCT GCA-3’ RGV 3’-T TGA TCA TTC ATG TCT CCA CAA AAC AGA GG-5’
20 Hpal PstI
... RPV- ja RGV-oligonukleotidien komplementaariset • I • · parit yhdistettiin (2,4 pg kutakin oligonukleotidia) : " 0,05 mlrssa vettä. Kaksi adaptorisekvenssiparia saostet- " 25 tiin (erikseen) lisäämällä 2 pl 4 M NaCl:ia ja 0,158 ml • · :.· : 100-%:ista etanolia, jonka jälkeen sentrifugoitiin. Pelle- ♦ *Σ**ϊ tit pestiin 80-%:isella ja 100-%:isella etanolilla ja kui- : vattiin. Adaptorisekvenssit liuotettiin 24 pl:aan TE-pus- kuria.
.···. 30 RBGV- ja RPV-adaptorisekvenssien kloonaus • · · .···. Plasmidi pGS2989 digestoitiin peräkkäin Hpal- ja • · *·* PstI-entsyymeillä ja vektori puhdistettiin agaroosigeeli- « i « elektroforeesin jälkeen. Sitten digestoitu plasmidi ligoi- • I 4 tiin 10-kertaisen mooliylimäärän kanssa joko RGV- tai RPV-:‘.<t 35 adaptorisekvenssiä (näitä adaptorisekvenssejä ei fosfory- 132 105104 loitu), kuten aiemmin on kuvattu. Osaa ligaatioseoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5 -solut. Transfor-mantit selektoitiin LB-maljoilla, jotka sisälsivät ampi-silliinia. Kloonit, jotka sisälsivät uuden adaptorisek-5 venssin, tunnistettiin pesäkehybridisaatiolla suodattimil-la. Hybridisaatiokoettimet olivat joko RPV- tai RGV-sek-venssien yläjuosteet (kuten kuvattu yllä). Nämä koettimet leimattiin gamma-32P-ATP:llä ja T4 polynukleotidikinaasil-la. Suodattimet hybridisoitiin sopivilla koettimilla (105 10 cpm/ml) 37 eC:ssa liuoksessa, joka oli 6 x SSC, 50 % form-amidi, 2 % SDS ja 150 pg hiivan tRNA:ta/ml. Suodattimia inkuboitiin > 12 tuntia ja pestiin 4 kertaa liuoksella, joka oli 2 x SSC, 2 % SDS (250 ml, 20 minuuttia kerta) ja valotettiin röntgenfilmille. Pesäkkeitä, jotka tuottivat 15 autoradiografiasignaalit, käytettiin valmistettaessa plas-midi-DNA, joka senvenssoitiin käyttäen seuraavaa aluketta: 5'-AAGCTTCAGCACCGTATTCA-3' (alfa2seql). Tämä aluke suunniteltiin spesifisesti niin, että se minimoi homologian vastaavaan sekvenssiin dimeerin alfal-alayksikössä ja niin, 20 että se maksimoi homologian niille sekvensseille, jotka sijaitsevat lähellä di-alfa-dimeerin alfa2-alayksikön 5'-päätä. Tämä sallii sekvenssin määrityksen niin, että sitä luetaan alfa-alueelta sen sekvenssin yli, joka yhdistää , kaksi alfa-domeenia, ilman ettei tule taustasekvenssiä,
I * I
’· ]· 25 joka luetaan läheltä alfal-domeenin 5'-päätä olevasta sa- • · · '··'· · manlaisesta sekvenssistä. Tällä tavoin rakennetut plasmi- dit nimettiin plasmideiksi pGS2989RPV (yksi proliinilii- V · tossekvenssi) tai pGS2989RGV (yksi glysiiniliitossekvens- si).
;***; 30 Kloonaus hiivan ekspressioplasmideihin • · · .**·. Not I-fragmentit joko plasmidista pGS2989RPV tai •e pGS2989RGV, joka fragmentti sisältää hemoglobiinin eks- II· ••j pressiokasetin, puhdistettiin agaroosigeelielektroforee- *...· silla ja jatkokloonattiin plasrhidiin pClN, joka oli diges- 35 toitu Notl-entsyymillä. Plasmidi-DNA eristettiin ampisil-
• M
« • · « « « 105104 133 liiniresistenteistä transformanteista ja analysoitiin di-gestoimalla Notl-entsyymillä ja ajamalla agaroosigeeli-elektroforeesi. Nämä plasmidit nimettiin plasmideiksi pGS3089RPV tai pGS3089RGV. Näistä muodostettiin toinen 5 sarja plasmideja niin, että helpotettiin eri beeta-ketju-mutanttien substituoimista. Nämä plasmidit muodostettiin digestoimalla XhoI-entsyymillä ja ligoimalla uudestaan itsensä kanssa kiinni laimeissa olosuhteissa (< 1 pg/ml). Tämä suosii beetaketjun ekspressiokasetin poistumista.
10 Ampisilliiniresistenteistä transformanteista eristettiin plasmidi-DNA ja rakenteet varmistettiin digestoimalla NotI- ja XhoI-entsyymeillä (nämä plasmidit nimettiin plasmideiksi pGS3089RGV-desbeeta, katso kuvio 26, ja pGS3089RPV-desbeeta).
15 Viite-esimerkki
Rekombinanttialfa-globiinin ja rekombinanttibeeta-globiinin rakentaminen hemiryhmän kanssa ja kemiallinen pelkistys keinotekoisen hemoglobiinin saamiseksi 20 Seuraava menetelmä antaa esimerkin tavanomaisista menetelmistä keinotekoisen hemoglobiinin valmistamiseksi. ... Lyofilisoidut rekombinanttialfa- ja beeta-globiinit (100 mg kumpaakin) liuotettiin erikseen liuokseen, joka • " oli 8 M urea/50 mM Tris-HCl, pH 8,01, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, ‘I 25 laimennettiin konsentraatioon ja inkuboitiin huoneenlämpö- ·.: : tilassa 3-4 tuntia. Sitten alfa-globiini laimennettiin '!“! konsentraatioon 0,3 mg/ml jäähdytetyllä liuoksella, joka :T: oli 20 mM K2HP04, pH 5,7, 1 mM EDTA, 1 mM DTT. Hemi (25 mg) liuotettiin konsentraatioksi 2,4 mg 0,1 M KOHilla, laimen- .·1·. 30 nettiin samalla tilavuudella 1 M KCNrää; tästä liuoksesta • · • · · .···. tehtiin sitten fosfaattipuskurin varastoliuoksella sellai- • · • · ·
• nen, että hemikonsentraatio oli 0,1 mg/ml ja se oli 20 mM
K2HP04:n, pH 6,7, suhteen. Tässä liuoksessa oleva hemi li-'...· sättiin 2,8-kertaisena mooliylimääränä jäähdytetyn alfa- 35 globiinin joukkoon ja lisättiin samanlainen moolimäärä « · 134 105104 beeta-globiinia ja liuos dialysoitiin 4 °C:ssa yli yön liuosta vastaan, joka liuos oli 0,1 M K2HP04, pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 mM KCN. Keinotekoisen hemoglobiinin liuos konsentroitiin ultrasuodatuksella käyttäen PM-10-membraania 5 (Amicon) ja siirrettiin 200 ml:n kierrekorkkiseen kumisen väliseinän sisältävään koeputkeen. Hemoglobiiniliuoksesta poistettiin happi tyhjiössä ja huuhdeltiin N2-kaasulla ja sitten liuos kyllästettiin CO:11a. 100 mM natriumditio- niittiliuos valmistettiin anaerobisesti 20 ml:n kierre-10 korkkisessa kumisen väliseinän sisältävässä koeputkessa. Hemoglobiiniliuokseen lisättiin 4,5 ekvivalenttia ditio-niittia ruiskulla ja seosta inkuboitiin jäissä 15 minuuttia. Hemoglobiiniliuos geelisuodatettiin 10 mM natriumfos-faattipuskuria, pH 6,0, vastaan 4 x 40 cm Sephadex G-25-15 pylväässä (hieno). Värillinen liuos ladattiin sitten 2 x 10 cm-52-pylvääseen (Whatman), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla ja kromatografia suoritettiin lineaarisella gradientilla, joka oli 500 ml 10 mM natriumfosfaat-. tipuskuria, pH 6,0 ja 500 ml 70 mM natriumfosfaattipusku-20 ria, pH 6,9. CO poistettiin hemoglobiinista fotolyysillä happivirtauksen alla. Tällä tavoin valmistettu keinotekoi-... nen hemoglobiini eristetään fuusiopeptideistä ainoastaan • Il noin 25 % saannolla, mutta se omaa luonnollisen hemoglo- • « • " biinin hapensitornisominaisuudet.
• · · • · · • · · · • · • · · • · · • · · ··· • · • · ··· • · · • · • · * ··· • · · • · · · • · · • · • · • · · • · • · • · · 1 · · • · • · • · · 135 1 05 1 04 (Ο Ή x; .c ί—( I—I .—I >1 I—I rH ID £ 0) Q) U φ >,<11 ω>Χ04Ε-<<ΟΟ·-3<<>Ε-<«>>-3Ε-ιΐ0»-32 μ α) 4) μ S ro M g
g E>iWa)>-i3PD<W(OUa)>-»Ml3Gi>iWrH
Π OUXD4E-tUO<^<BMHWJE-it3i-i> ro Λ e
•H
V4
Oh
G
r§ -HW=|Mp33«H<0^tCrö3a>tW^( .h ro -h φχ; u^ir-i >i x: r-t m ιλ,-ι oi >h γ-h >,ra •o to>XJH0iOOJE-«<><<iJE-'O^>
M
•W
tr
m ro^i^roDa>,w^H
rH i-(W3jH03dwkrHrox;rH<i)MfH>iro ro ω·Η0)χ:^ηΗΜ>Ί(ΐ)<>ΕΗΛ;^9Ηυ^> - >X»4E-tD4UOiJco .5 OHrsjrtTfinvDr^co
C <3a.>H<NrOTrinvor'00(nHrHHHrHrHHrHH
•H
•H
O
O
rH * tr· ·Η (n C .* (U-HrHcNr) o rH oj n rr in
“! 'T;rt:<t;<rHrs)m-^mU3l^(X)CrirHrHrHrHrHrH
| gzzz<<<<<<<<<<< < < < <
H
4·* · rH
• · · • o ·· Λί ‘ * ro
5 o)^ 3VHtnvH3CP^Q)a)rHjH4Jarow<i)5HJH
··· 3 0)0.' a)x:>-,x;r-Hklx:rHrH(0(U<l)>Hr-(>H>-H<Dx;
*. ·; ro MU) ^E-iiJtHO<EHHM>wsEH<>JMM EH
« ^ « · · ··· ί rHinroroa^WrH^ro
• Ή PVHOroOiWVHCro^rHrHVHrH^lCrHrH
:·*: ro ωα)>ΗΜνι>1χ;ιη>μα<<ΕΗθ^>ϋ< .·;·. orHfMo^inuJt^cooi
·· · ϋ rH CMO'TO'inVOn-COavi-IrHrHrHrHrHrHrHrHrH
• · · Ή : : 5
··· -rlrHfv) OrHCNn'TO'inVOrH
ti 'νΓ,'ΐ <HO)nTtmVOr^OOa\rHrHrHrHrHrHrHCa ·;· ¢2 Z<<<<<<<<<<<<<<<C< 1 · < 136 105104 a m e O'
(/) (0 H H H H f—i <—< H G) H 0) 0) (0 /0 V-J ^ >C »H U
C^H3aiO>i>i3^3>iO'33r-tr-tV40aMCO' U)(0r-4WrHr-(r-<^IJS(UlHV»Q)©rom>lV(M£rH^ <>ϋ<<ϋϋϋΗΗΐϋ<^^>>^βιΗΗϋ< C *H O, /0 .-I >-,>,3 (0 3 >, CT> 3 3 -H r-1 J-ι O DU M C O' U)((Jinr-l«JiH>H<--4rH©f-lt4©W<0(0>'^>-I.C·-)^ <><<>ΟϋΟ<Η4ϋ<·^^>>Ε-·θ4Ε-'Ε-'θΛ: c^a^-H^^srea^o'sa-iM^oauccn Μ(Οϋ)Η«ίΗ.-Ιι-ΙιΗ©ι-Ι^Ι©©(β«ί>·ιΜ*·)Λ<Η^ <><0>C500CJCI<:i-3iJ>>E-fO<E-'f-iC)< ovOi-irMnrrinvor-coo^OfHiNnTfinvDr^cooio
HtNfMrMOjrorvirjtNrorjnnnnnmnnnnTf
o r-( cm o tn \D
iHren'i'iDsor^eoo't-ipHrHrHHf-ifHtHr'jn^finvD
CQCQCQCQCQCQCQCQCQcacQCQCQCQCQCQOUUUUCJ
• · · • · • · « « *. . ctvauQjiHuauaa&zfozuv) o c u ui u : ·· <d ,h u © £ © ©-h i-i .h £ >, x: • · • · · ···· iflrc^DM^njranjzJzatri-uaJD^aiOk^u)^ ....: -H r-l M ^ Ξ>1 Ή Ή r—i rH O) «H J-l © £ © © xz u £. £. >, £
• · K<UOHU<e»<t-3O<SD*iJwti<04E-'HtJH
.·:·. θιΗΓΌπ·>3·ιηνθΓ^οοσιο·-(Γ»ητ}·ιηνθΓ'θοσιθ«-ι *.* * οΐΓ\)Γ\)(Ν)(Μ<ΝΓΜΓΜΓΝ)<ΝΠΓ3ηοηηηηηο·»τ·>5· • · · • · • · • · · .***, o H <N n fl· in vd
·..,· HtMri'tinvDI^COai'-IHf-lHHiHi-IHrjn'iinO
CQCQCQCQCQCOCQCQCQCOCOCDCQCQCQCQUUUUUU
• 0 0 0 0 0*99 * * * « «
«M
• · · · • · • · • · · 137 105104 0)a)D»^a)>iC3^>-iO>-itOa)3>iCOWrMWiOW>, a>a>&>-ia>>i£:;3wU(flM(aa)-P>*,cow,-iwiow>. £x; w m £ h tn ai o) a) .h q> r-ι .h <u r-t w ^ >,(0 >,ιη·η^η o*04<:waiO<iJww.<w<M£u<co<,_3>j<a:o <U<U3Ua»>i043»-iU(OD4rtir-(jJ>tCOW<-IWn3w>i XS^iHUJSrHUlVVIUi-llOfHRJVr-tUlkl^Rj^^-I.Hr-l CL<D<oco04U<i4wwa1<<>sci<a<j>j<Ku Q)(l>3}-lQ>>iO<3>-l>-tOa<<ei-<.p>>iCOW.-f(flff>V)>< j5x:.-Ha>jCi~iwQ)a).fiJ-iWr-i<o a> —i w >-i >, co >, .h -h .-e <-ιοαητί·ιη«)Γ^οοσΐθΓΗΓΜΓθττιηνοΓ~οοσιθ·ΗΓΜΓ-ιτί· 'i'frr<ff^<tTf<finioinininifiin(ninin(i)iDi£)\Da •-ΐΓΜηττιηνοΓ'ΟΟ t^QQQDQQQDi-trMnTrinvor^rHcsjoTtinvDi^co
UUUUOUCJOOQQQQQQQWWWWWUtiJIjJ
uoioino) OiDino rx.umcDO'coui:^ ' ^ ,r^ £ t/1 Q) *H M f—C Q) H r—C d) i-ί r—( «Γ-C *—i .·.: e-i λ a. x a. rtjtJxcu oco<o>J<<:nu : .*. u <u o w a> a. d ^ in >iU«jc<hw>.w>.
··! * «C )-i '*H «3 1/)0)0) erH f—t (1) rH »“C (0 f—( -H f—I
. ho<cus:cu <k3ujk uv)<u>iJe>ÄO
fSn^rinvD t-· oo σ\ o i-icMoxrinvDr^cocTv ;·_ 'Τ <3· *J· Tf *T rr \r> inininifiininininir) • « « • · · • · ·...· f-lc\)r-|«3· in ID CO σ\ ... r~ ω w ω ω ωωωω UHNn’itncohco :: υυυυυ u ο u u uwwwuuwww • · · • « · • « * · < · 138 105104 u)(flr-i:j^>-iQ>>iainjaJ</)G4->fxlC9 w o ro a) ro w >ι >ι 10 <UJ3 Q) · .C >-H Wr-((—I >iM <D W W 0) >, >-t r-l .C .-H >, a cu < cu < a u x:
EH
wwrH3Uik3>,alro<i)ww3D<a3 w>^>-(Q)roc
>1>lR5Q)JSa)a)r-inrHrH>t>HO>U)nO> >, .H J3 .C rH .H
^j>jEHwJu<<MiJa;J<<t-i JOEnOtCo wwrHD>iroo)»Ha>.3row3QiCD w >, m <u u c >i>iro<l>rHrH£<UWnH<UtH-HQ)WWa) >. .-H .C JC O) .-1 ^^>^ϋ<θιΐ/ι<ϋ^<χ^<<<^ joeho-wo >,«α)Μα>ι3π3Μ3αΕ3 it >, ^ ti a
WWr-(3rHrHi3<l)WrHa)rH-H<l)tnM<l) >ί i-H .C .C r—I .C
>i><(a mu<P<u<ui-)<xi4i4;i<^ .-} u h a. < eh
►H M > J
OVOHMOTflflVOt^COOVOrH fM CO rr lf> VO r~ invor^covor^r^r^r-r^r^r^r^r-r^coco oocooocococo vo vo vo vo OHrvjM'tmvot^coovOHc'in^m vor^oo OViHi-lrH<HrHrHrHrHHi-lfMtt|[i<fciCt<fti Uh Cij Cin r-H (Μ Π WWWWWWWWWWWWWWWWW W W W tn fc< • « · • · « :·. i-it/irHr-iroro^H^a.ro^HtnuQiCLCXo > >, ro a in .·· <i>>iroro>-i.-iro<Hi/)r-iro>,a),-iww.H .—i .—t .—< <u cu >, I I · • I * > . wtfl'-HroQiroDUcrorHrowrHttcx+j o c ro 3 v-i ro ::; >i>iro.-iinr-i<i>.cinr-iro.-i*Hrou)w<i) ^iw^hqjom ···· Q( < < μ] (I) <
·"! OHoooxa-invovoeoovOrHrjo^invo r'CoovOrHCM
>#> vovovovovovovovovovor^r^r^r^r^r^r^ h h h co co to • · · • · · • · ·
OiHrgo^invor^coovOi-ifNn^in vor-co *·· CJVrHHrHpHrHrHrHHi-li-IrMfciljLipLipL.U, II·, pL, U* i—I Cvl <-> ,···. wuwuuuwwwwwtLjwtJtijfjjw ω w u (j-, tn [j-c • φ • · · « · · till 4 ( « *1 «
II I I
• II
« « « · • I · 139 105104 3M33WWQ,W3WMaODCe)WD3>,C^4J^H i3cqU»JBCJ. <I-3MS><CUU<04^3|JMU<>£>
SJM3DO)tna«3in^ia03CQ)U133>iC^3rH
^»-tzJSujuiawawrHaoacQjcnss^cManH
(Udj^aj-H^iW^at-HmwM^iwjSMQjtUr-iMfoajm ^ωυ^χυ<ι-3μ33:><(χο<Λ<^Ηίυ<>^>
o^ssmwawswrHaodcajcnaa^Cr-id-H
<i)Q)^iQ)-H>,w>,a)-H(tJw>-irHWjc^(Qja)r-((/)ioa)/o ^ωο·4χυ<ι-31^χ><α4ο<Λ<^^υ<>^>
eoovOHrgn^s-mvor^coatOrHiMo^invot^eooOrH
οοα)σισ>σίσιαισισ>σισισιοοοοοοοοσθι-ΐΓ-ι γΗγΗτΗγΗ»—ifHrHfHf—ϊγΗγΗγΗ h m n in o «H m n
'S-invDr^cocnoouuUHronTrinvor-cocrii-iH^rH
ι^,ί^ι^ΐι,ι^ΐι,ΐΐιΐ^ΐι,ΐτ,ΐι-,υυυυοουυυουυυ .':*: 3>-i33Wn3>-<<l)DDi-HCi,o>-lC(UW33^V)in33 . (DOrHQj-Hr-t^^ituvjnJwvifotnxi^cucDQj.H^aja)
<JWUJX<HMJ<><D<><Q._3JJC0XUJJ
·” o i u \n \n o o
.·.: as-iaDiniowu)DDir-HaorHCQ)w<ua)<u-H>,aiG
• · O CU U) <D *H ·—I -H >i 0) l-ι (0 ΙΛ l-l <0 III £ >~i>-J»Jc/)XUi—1>-J
··· o rH cn n -^T m vd '. m-^mvor-coaiOi-iognTj-invDr^coaiooooooo
. oococooocococoa>cncTi<riaia>a>CTi(riaii-it-(^Hr-(rHiHrH
• · · · · • · • · · • · · • · « •Ηοοηττιη Or-ic\jn
... cfinvDr'roc^OOUUUf-irjn'^invor-coiTirHHHrH
; ; (^tttt-fett.tKfefctuttit^UOUOUOUUOUtJOO
• · · • · · • · • · • · · « · · · • · • « 140 105104
0)0»3ίβ^(Λ0>>ιΜ3« ^O3<HC(0(0D4CW3iH
Ή Η ¢1 Η β Ή £ H >i H £ HHJCHKQiUtJCSDi H04O>U<CE^U*-5Hi>
^^3rtJQ»W<l)>iW30» H03«HC(CUacW4J.H
SZ <D i-H rH -H .C .H >ιιΗ£ £Ur-«<OrSnHO)^irH>,Q)nJ
Hcuo>u<wE-<uJa>
WrHSrtD'CQJ^-.MiQ) ^OCJJCmnJ^iCWrH^i >inJQJr-JMWÄ^I^rHj2 (1) rH >—< r—l >, >,(0 Γ0 υ>ι4<<<α<ϋ·-3θ&ι EHiliUSt5<<HU»J>> tnrH3(eui«io>,w3«} MoOr-tcram>-iEU)r-(«-) 'I'j-'-il! 'ϊ’Ίΐί' fi^^flHHH>iH>iHIII| U>i-J<3:XO<Ov-3UO< E-t0«0<>O<<E-'U>-i>> fN>nTrir)vDt^eoo>o«-ifM nrrmvor^cocT^Oi-tfNn·^· r-Jr-JrHr-iH'HrH'-ICSMfN) (Ν<ΝΓΜ<ΝΓ\)ΓΊΓ\)ΜηΓ->θη l^^rHi—ti-H«—lr-ίι—li-HrH»—i f-|i-l<-<r-(r-(r-li-lr-lr-liHrHr-< 'Tinvot^cooNi-ttNn^in o o r-ι r\i
IlJrinJrJrinJS·?3"*1-® HfMnTrinvDi-.corHrH^irH
ouuouououuu ssääkkkkxksx • · • « «
.. Hk3®utJiii)oniftiii ^raSfljt/ifljajDuainajD
:·.. 5£<H'liiSb!,£'i4,Hin”c ri'-t'-tr-t—u v> >, .c <d
• *·· >-jVj3r0i0WDO(03a) tiOnjrHioro^iSCLMQJD
. . ä i-i —« «o -—I a> <u tn >t a> ’. ^^SRr1r1r>'ririvDr' oomOr-ifNjn«<rinvor^cocn • · · • · · « · · .·**. 'TinuDr^coaif-icMn'Tin .
X 5 3 3 5 3 3 5 5 5 § 15 5 ϊ ϊ ί ϊ ϊ Ϊ S Ϊ 2 5 3 • · • · · *
III I I I I III
' « I
I I I 1 *
« I
III
• · • · · 141 105104 un>iHidc>n>9iaiaui^(o ai h (OrHrHrH φ h ·η >, >, -h (Ο
»H
< i-t *—c ra v-ι rtj rs >-t ί-t tr> v-i to ÄHiaHaiHHiaiai^^ ή HO><W<JiOW<EhÄ m>ir-i<ac(a3iau)i/)Vi(n H j—1 iti H ΙΛ H 01 H ·Η >. >>. ·Η
<0><<<J<KJEhK
<0>ι«Η(0ΠΠ33ί0Ι/)ϋ3>-ιΙ/) H H (ti H l/l H φ H Ή >ί>ί·Η <0><<<^<Κι-3ΕηΚ invor'-eocnoHojn.rinvo nrofonroTj,^j,T?'T},ri,^rri‘
ΜγΗγΗιΗι—ItHrHrHrHr-liHrH
n^invor'COcriOHrHCNjm
*HHH«HrHr-4rHr\J<NUUU
» · ·’ ^rHrHk^HPV-lSWl-ltT' ·· αΐ(ΐΐιιια)α)«αΐ£Η>,>,^ w>>cow>h1e-iu»JE-i< • .·. : ιο^.η>^μη3^^ιι/)1-ιΟ' · ·; HO)iO<l).C<ti(D.C<l)>,>,^ • · ·
! .1 ! OHiMn-^s-invOHcoaiOH
• ηοΜηηηοηηητί·^·
*J**J Hr-I H r-i H H r-IfHrHrHrHrH
• · · • · · • · · ... πΜ'ΐηνοΓ'ωσιΟΗΓΗΜη
• * Hr-I H H i—(r-IHfMOlUOCJ
... EacKsscKKxsixa: • · · • · • · • · · 1 · ·
Mil 142 105104
Taulukko 2
Di-alfa-globiinigeenien muodostamiseen käytettyjen oiigonukleotIdien sekvenssit 5 a1 (Arg)-Gly-Met(Leu)a2-linkkeri
BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTATGCTGTCTCC TTTATGGCACCATACGACAGAGGCCGG
a1 (Arg)-Gly-Gly-(Val)o2 -linkkeri 10
BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTGGTGTTCTGTCTCC TTTATGGCACCACCACAAGACAGAGGCCGG
a1 (Arg)-Gly-(Vai)a2-linkkeri 15 BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTGTTCTGTCTCC
TTTATGGCACCACAAGACAGAGGCCGG
a1 (Arg)-Gly-Gly-(Leu)a2
BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTGGTCTGTCTCC
20 TTTATGGCACCACCAGACAGAGGCCGG
<11 (Arg)-(Vai)or2
BstBl Eagl
: CGAAATACCGTGTTCTGTCTCC
TTTATGGCACAAGACAGAGGCCGG
• · » · · • · · • · • · ♦ · · » « · ♦ ♦· ♦ ♦ ♦ ·♦ ♦ e ♦ • · · • · · ♦ ♦ · • · · • · • · • · · • · · • · • · ··· < · · « • > · · • · • · • · # «
• I
• · • · · · · • · • ♦ 1« 105104
•M
•H
(O
w c 0) & υ υ α> < <
w H M
- Ή o *H O tH
g G O υ G O υ 0) U
•h a < h a+Jio a eh •o «s eh :< tr o tn <
r| ' <! H U O' O
£ O υ O U rt! £h
S H < H < H C
3 o o υ o ου m υ o υ o υ o 2 <; eh *c eh c e-i g < H < E-I < Eh g, υ O u O H <
•h < H C E-I O O
i—i o u o O ου o ου o o ου £ o o υ o υ o
·" U O υ O O U
>1 < H C E-· EH rt!
-μ CJ O U O υ O
£ Eh rt! Eh < En rt!
5 U O O O O O
>, o υ ου u o «o ου o < u o ^ Eh rt! Eh O Eh < _ υ o υ < eh <
g Eh rt! H υ U CP
£ ου ου υ tr in ου o O (0 +j •h υ α υ eh << eh
s rt! EH CU 2 EH
2 υ υ o < ου to Eh rt! EH υ O υ o υ υ u c υ a ^ εη λ: εη υ υ ο ο υ ο υ c υ ο g Εη C Εη < < Εη Β Εη C Εη <<£ Ου c Η < Εη rt, Εη < φ υ Ο υ Ο ΕΗ < ο ου ου ου £ Εη rt! Εη < υ Ο η υ υ ου < εη +j ου ου υ ο ·;·. m ου tr ου ου ··· « Εη rt! Ei Εη rt! Εη< ΰ υϋ«υο υο g υ tr λ o tr <εη . ·· ·Η 4-> (0 I 4-> <0 c η . . C <Β 4-> I (0 4J < Εη ;·· <Εηιλλ;εη υο • · "ο < Εη >i«CEh <Εη
.. -g rt! Εη H 1¾ Eh OU
• · · iH C Eh C Eh OO
··'* tn rt!EHcjrt!EH Ου ' rt! Eh to Eh Ε<<
·· 2 Eh rt! «o. Eh rt! UO
... φ OU ·* Ου rt! EH
. i . Φ ΦΗΟ a)<HO Elr-ΐυθ
·.·· CQ iH O Eh f—I O Eh ÄUUO
•H U C -HUrt! JJfl< Λϊευ Λζυ a w o n I I I υ
... I I I tH
:: ο ή .π c ... X nj nj w
.···. a > > IB
·...· Ή f' Is" ~
. DO Ό O
. 2 ^ «*.
• · · H
144 105104
Taulukko 4
Hemoglobiinin kaltaisten proteiinien P^-arvot
Hemoglobiini Es-0- des-vai Hgb 10,2 5 di-alfa (arg-gly-met) Hgb 9,0 di-alfa beta67vai—>ile Hgb 16,0 di-alfa beta67 vai—>ile/ beta82lys—>arg Hgb 16,0 di-alfa (arg-gly-gly-val) Hgb 16 ?0 10
Taulukko 5 pGAP-sekvenssin syntetisoimiseen käytetyt synteettiset oligonukleotidit
15 1 TCGACTGAAA AAAAAGGTTT AAACCAGTTC CCTGAAATTA TTCCCCTACT
TGACTAATAA GTATATAAAG
2 CAATACCTAC CGTTTATATA CTTATTAGTC AAGTAGGGGA ATAATTTCAG GGAACTGGTT TAAACCTTTT TTTTCAG
3 ACGGTAGGTA TTGATTGTAA TTCTGTAAAT CTATTTCTTA AACTTCTTGA ATTCTACTTT TATAGTTAGT CTTTTTTTTA GTTTT
20
4 AAGTTCTTGG TGTTTTAAAA CTAAAAAAAA GACTAACTAT AAAAGTAGAA AGAAGTTTAA GAAATAGATT TACAGAATTA CAAT
/:1. 5 AAAACACCAA GAACTTAGTT TCGAATAAAC ACACATAAAT AAACCATGGT
’ TAACT
• · • · !·. : 25 • « · • t • · • · · • · m • · · · • · • · · • · · • · · ··· • · • · ··♦ ··· • ♦ • ♦ ··· • · · « • · · • · • · • · · • · • · · · · • · • · 145 105104
Taulukko 6
Galaktoosin ylävirran aktivaattorin syntetisoimi-seen käytetyt synteettiset oligonukleotidit
1 CGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTC
5 TCCTCCGTGCGTCCTCGTC TTCACCGGTCGC
2 AGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCTTCGGAGGGCTGTCACCCGCTCGGGG CTTCTAATCCGTACGCATG
3 GTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAAT AAAGATTCTACAATACTAGCTTTT ATGGTTATGAAGAGGAAAAT
10 4 ATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCG
GCGCGAGGCACATCTGCGTT TCAGGAACGCGACCGGTGAAGAC
5 TGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTCAAATGAACGAAATCAAATTA ACAACCAGATATC
6 TCGAGATATCTGGTTGTTAATTTGATTCGTTCATTTGAGGTTTGTGG
15 GGCCAGGTTACTGCCAATTTTCCTCTTC
Taulukko 7 Hiivan kodonikäyttö
Ala GCU, GCC
20 Ser ucu, ucc
Thr ACU, ACC
Vai GUU, GUC
Ile AUU, AUC
. : : Asp GAC
Ph e UUC
: '·· Tyr UAC
Cys UGU
[' Asn AAC
: His cac • · · «
Taulukko 8 146 105104
Kahta peräkkäistä alfa-globiinidimeeriä koodittavan geenin rakentamiseen käytetyt oligonukleotidit
AL-1SS
5 5'-tgcacgcttctttggacaagttcttggcttctgtttctactgtgttaactagtaagt acagaggtggtgttttgtctcctgcagacaagactaac-3'
AL-2SS
51-gttaaggctgcttggggtaaggttggtgctcacgctggtgaatacggtgctgaagcttt ^ ggaaaggatgttcttgtct-3'
AL-1AS
51-tgcaggagacaaaacaccacctctgtacttactagttaacacagtagaaacagaagcca agaacttgtccaaagaagcg-31
AL-2AS
15 51-ggaaagacaagaacatcctttccaaagcttcagcaccgtattcacccagcgtgagcacc aaccttaccccaagcagccttaacgttagtcttgtc-31
Huomaa: NcoI-ALPHA-l-ApaLl; FoKl-ALPHA-2-Sall; ApaLI-RGGV-Fokl
Taulukko 9 20 FX-hemoglobiinistä ja tryptisellä digestiolla muo dostetun rekombinanttimutanttihemoglobiinin happi-affiniteetti
Happiaf finiteetti mitattiin Hemox-Analyzer-lait-teessä 37 °C:ssa 50 mM Bis-Tris-liuoksessa, pH 7,4, joka .·. : 25 oli 0,1 M NaCl:n suhteen. Liuokset olivat 60 μΜ hemin suh- .1 / teen ja ne mitattiin 130 ja 1,2 torrin happipaineiden vä- ;;;; niia.
.111. —'50
Hgb A0 9,5 30 rHgb A0 9,2 • · · ·...· Hgb Providence 10,2 ί#>>ί Hgb Kansas 11,3 . Hgb (beeta67 valalle) 22,4 4 · » « · · • f 4 4 4 « · · · • · · • · 4 · 4 4 1 147 105104
Arvo Hgb Ac:lle on tietysti liuoksessa olevalle vapaalle hemoglobiinille. Kokoveren P50-arvo on paljon korkeampi .
Taulukko 10 5 NaCl:n ja inositolin vaikutukset hapen sitoutumi seen hemoglobiini A0:aan ja des-FX-rekombinanttihe-moglobiiniin P50 P50 0,1 M NaCl 0 M NaCl 2,2 mH IHP 0 M IHP 10 Hgb A0 6,6 2,8 51,1 6,6 des-FX-Hgb 4,9 3,9 5,5 4,9
Taulukko 11 FX-alfan, FX-beetan ja FX-hemoglobiinin jakautumi-15 nen E. coli -solussa milligrammaa proteiinia per OD-litra E. coli-bakteeria Liukoinen Liukenematon FX-alfa 36 0 20 FX-beeta 21 21 FX-hemoglobiini 188 0 • 1 · • · • · · 1 · • · % · « • · · • · • · · * # * • ·· · • · • ♦ · • · ♦ • · · « · · • · • · • · · »·« • ♦ • Φ ·♦· • · · • « « • · • 4 • 4 « · • · · ♦ · · » · * · • · · 148 105104 vy ΟθΦΗ^(ΝΗ^ιπ«^ΗΦηΝηΗσ\ονο 2 ·» «s. C» K K «S. K ►· *W ** ·* fc. ·* ·
OOOHrtHHHClHOOOOHONONO
Ö e ^ ooinoooooorMOHOOOOor-oo
ooininaicovOi-tTrrHinrrp'VOtTior^r^vooo g rjifnNnOinN ·»* «-i in <-i in in H
a » <h a, O in in in co ioni
O S O ID ID n <# N VO
g O » r-ι m n m m i—I rl 3 O +> m M -H Φ .* +J ±
3 :S I O O O O OO
jjj ° Q oT oT ^ cTxf' £ c n h ^ in Tf n ^ Jjj y m n t" o co g *
Oi U*
•H
H Q
rH O
2C ιοηΗηιυΝιηιηοοΊηοοιοΊΜΰοοοιη
j Ϊ iDOi['riiDinHO\Oi'<rOnhnina)nii^''ir M ^ Ή .-t rH rlNNNNNHH H H
• · · ♦
• · 4J
.Y · I
• · · «d . Q oooooooooooooooooooo *.*: Tj , ΟΓ'ΐ^Γ-Γ'Γ'ΐηιηοΓ'ΟΓ-ο'Γ-'οΤιζΓο'ιιΓο'Γ' , , nnor-inomcMnnonr-innnnnon
• · · H
·«· · Ό
....: S
• « • · · • · · • « · π) £o\ClO\ OIOIOIOIONOONO TT ^ ΓΗί-ΙθΟΟ»ΗΟΟΟΟΗ<ΛΓ-ΙΗΓΜΗΗ^ΐηΐη :···: i aaiiisiiilisiiss^ii • · · *** - - ·*· • · • · %· · • * · * • «M • · · « · u
E OHMnMn\OhOHWCD^OH
, Oi Ηΐη\ΟΓ^Ο)ΗΗΗΗΗΟ)ΝΛ}ΠΠΠΠ^ΐηΐη «* * • » • · ·
Ml * · • ♦ • · * 149 105104
Taulukko 200
Bakteeri- ja hiivavektorit Määritelmät: ROP, geeni, joka säätelee plasmidin kopiolukua 5 ROP+ = matala kopioluku ROP- = korkea kopioluku AR, plasmidien selektioon käytetty ampisilliiniresistenssi TR, plasmidien selektioon käytetty tetrasykliiniresistens-si 10 TS, tetrasykliinille herkkä, TR-geeni ei toimi FX-A, FX-alfa-geeni FX-B, FX-beeta-geeni DFX-A, des-FX-alfa-globiinigeeni DFX-B, des-FX-beeta-globiinigeeni 15 DV-A, des-Val-alfa-globiinigeeni DV-B, des-Val-beeta-globiinigeeni RV-di-alfa, di-alfa-geeni, joka ei sisällä aminohappolink-keriä (R = arginiini; V = väliini) RGV-di-alfa, di-alfa-geeni, joka sisältää yhden glysiinin 20 linkkerin (G), jota seuraa väliini RGM-di-alfa, di-alfa-geeni, joka sisältää yhden glysiinin linkkerin, jota seuraa metioniini (M) ·;·. RGGV-di-alfa, di-alfa-geeni, joka sisältää kahden glysii- • « i .'· nin linkkerin
« « I
. 25 RGGGV-di-alfa, di-alfa-geeni, joka sisältää kolmen glysii- / / nin linkkerin ··· | LACI, geeni, joka koodittaa repressoriproteiinia, joka * 1 säätelee TAC-promoottoria • · · *.· 1 LAC+ = plasmidissa repressorigeeni 30 LAC- 1 plasmidissa ei repressorigeeniä : J Kaikki alla luetellut bakteeriplasmidit, jotka si- sältävät alfa-, di-alfa- ja/tai beetageenit, sisältävät • « · myös translationaaliset liitossekvenssit. pPL-ekspressio- • · « "\\\ systeemi liittää translationaalisesti lambda N -proteiini- *·”1 35 geenin globiinigeeniin.
150 105104 PKK223-3
Emoplasmidi, jota on kaupallisesti saatavissa Pharmacia LKBTtä, 800 Centennial Ave., P.O. Box 1327 Piscata-way, N.J. 08855-1327; kaikki muut luetellut plasmidit ovat 5 peräisin tästä emoplasmidista. Siinä on TAC-promoottori, jonka jälkeen seuraa useita restriktiokohtia sisältävä alue geenin insertion helpottamiseksi.
AR, TS, R0P+, LAC- 1. pDL II-62m
10 Plasmidi pKK223-3, jossa on FX-A
AR, TS, R0P+, LAC- 2. pDL Il-I0a
Plasmidi pKK223-3, jossa on FX-B AR, TS, ROP+, LAC-15 3. pDL II-66A
Emoplasmidit ovat numerot 1 ja 2, sisältää sekä FX-A:n että FX-B:n yhdessä operonissa AR, TS, R0P+, LAC-
4. pGEM FX-A
20 Emoplasmidit ovat numero 1 ja pGEMl, joka on kau
pallisesti saatavissa Promega Corporation'1 ta, 2800 Woods Hollow Rd., Madison, WI 53711. pGEMl, jossa on FX-A AR
• «i
.·. : 25 5. pGEM FX-B
Emoplasmidit ovat numero 2 ja pGEMl : pGEMl, jossa on FX-B
AR
• · · :·: : 6. pDL II-83a 30 Emoplasmidi on numero 4, sisältää DFX-A:n 7. pDL III-6f ···
Emoplasmidi on numero 5, sisältää DFX-B:n ar • · · • · • · • · • · • · · 1 « · • m • · • · · 151 105104
8. pDL II-86C
Emoplasmidit ovat pKK223-3 ja numero 6, sisältää DFX-A:n AR, TS, ROP+, LAC-5 9. pDL III-13e
Emoplasmidit ovat numerot 7 ja 8
Plasmidi pKK223-3, jossa on sekä DFX-A että DFX-B AR, TS, ROP+, LAC- 10. pDL II-91f 10 Emoplasmidi on numero 4, sisältää DV-A:n
AR
11. pDL II-95a
Emoplasmidi on numero 7, sisältää DV-B:n AR
15 12. pDL III-la
Emoplasmidit ovat pKK223-3 ja numero 10, sisältää DV-A:n AR, TS, ROP+, LAC-
13. pDL III-14C
20 Emoplasmidit ovat numerot 11 ja 12, sisältää DV- A:n ja DV-B:n AR, TS, ROP+, LAC- 14. pDL III-47a
Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGM-di-alfan ja 25 DV-B:n t t « .1 ·1 AR, TS, ROP+, LAC-
I 15. pDL III-82A
« · · · · ... Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGGV-di-alfan ja DV-B:n 30 AR, TS, ROP+, LAC- • · · ’...· 16. pDL IV-8a • · t ·,..! Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGV-di-alfan ja DV-B: n AR, TS, ROP+, LAC- • · t t i · • · · • » · • » • 1 • · · 152 105104 17. pDL IV-47b
Emoplasmidi on numero 13, sisältää RV-di-alfan ja DV-B:n AR, TS, ROP+, LAC- 18. pDL IV-66a 5 Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGGGV-di-alfan ja DV-B:n AR, TS, ROP+, LAC- 19. pDL IV-3a
Emoplasmidi on numero 15 10 ROP-geeni on inaktivoitu insertoimalla Notl-linkke- ri ROP-geenin sisällä olevaan PvuII-kohtaan AR, TS, ROP-, LAC- 20. pDL IV-38a
Emoplasmidi on numero 15, sisältää Nagai-mutaation 15 DV-B:ssä AR, TS, ROP+, LAC- 21. pDL IV-58f
Emoplasmidi on numero 20 ROP-geeni on inaktivoitu, kuten numerossa 19 20 AR, TS, R0P-, LAC- 22. pDL IV-59a
Emoplasmidit ovat numero 21 ja pBR322, joka on kau-v pallisesti saatavissa useilta eri valmistajilta.
Sisältää toimivan TR-geenin, joka rakennettiin seu-25 raavalla tavalla: : .1 2 3. Plasmidin pBR322 EcoRI-kohta muutettiin BamHI-koh- daksi insertoimalla BamHI-linkkeri. Tämä salli TR- • · geenin 5'-pään poistamisen plasmidista pBR322 • · ·
BamHI-fragmenttina. Sitten tämä fragmentti inser-30 toitiin BamHI-kohtaan, joka sijaitsee TAC-promoot- • · *···1 torin ja plasmidin pKK223-3 inaktiivisen TR-geenin * · *.·.1 liitoskohdassa. Tämän fragmentin insertoiminen ak- ··· tivoi uudelleen TR-geenin, jos fragmentti inser- .1··. toituu sopivaan orientaatioon. Pesäkkeiden selektio ·1· • · • · • «« « · « · 2 • · 3 153 105104 tetrasykliinimaljoilla varmistaa sopivassa orientaatiossa olevan fragmentin läsnäolon.
AR, TR, ROP-, LAC- 23. pJR V-83a 5 Emoplasmidi on numero 11, sisältää Presbyterian- mutaation (asnl08 - lys) sisältävän DV-B:n AR, TS, ROP+, LAC- 24. pJR VI-29a
Emoplasmidit ovat numerot 15 ja 23, sisältää RGGV-10 di-alfan ja Presbyterian-mutaation sisältävän DV- B:n AR, TS, ROP-, LAC- 25. pJR VI-53b
Emoplasmidi on numero 24 15 Tehty TR:ksi insertoimalla BamHI-fragmentti AR, TR, ROP+, LAC- 26. pJR VI-61a
Emoplasmidi on numero 25
Tehty ROP-:ksi insertoimalla Notl-linkkeri PvuII-20 kohtaan AR, TR, ROP-, LAC- 27. pDL V-4a
Emoplasmidit ovat numerot 16 ja 26, sisältää RGV-di-alfan ja Presbyterian-mutaation sisältävän DV-25 B: n AR, TS, ROP-, LAC-
• · · WWW
j”i 28. pDL V-lOa • ·
Emoplasmidi on numero 27 # · * ’·* ’ Insertoitiin BamHI-fragmentti plasmidin muuttami- 30 seksi TRrksi • · · AR, TR, ROP-, LAC- • 29. pDL V-16d
Emoplasmidi on numero 28, sisältää LACI-geenin in-sertoituna Notl-kohtaan. LACI-geeni saatiin käyt-35 täen seuraavaa menetelmää: « • · 105104 154
Polymeraasiketjureaktion (PCR) alukkeita, jotka sisälsivät Notl-kohdat 5'-päissään, käytettiin lacl-geenin amplifioimiseen. Kun oli puhdistettu geelistä, geeni insertoitiin plasmidin pDLV-la 5 NotI-kohtaan AR, TR, ROP-, LAC+
Useita muita plasmidirakenteita on suunniteltu, jotka helpottavat toisen, oman TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa olevan, beeta-globiinigeenin insertoimista.
10 30. pDL IV-64a
Emoplasmidi on numero 14, sisältää beeta-globiinin synteettisen TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa AR, TS, R0P+, LAC-31. pDL IV-67a 15 Emoplasmidit ovat numerot 14 ja 30, sisältää di- alfan yhden TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja DV-B:n toisen TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa. DV-B on di-alfan vieressä AR, TS, ROP-, LAC-20 32. pJR VI-54a
Emoplasmidit ovat numerot 14 ja 30, sisältää di-alfan ja DV-B:n yhden TAC-promoottorin säätelyn ;·. alaisuudessa ja toisen DV-B:n toisen TAC-promootto rin säätelyn alaisuudessa. Toinen DV-B on insertoi- I f « . 25 tu plasmidin PvuII-kohtaan.
/ / AR, TS, ROP-, LAC- • · · ··· · 33. pPL lambda * ’ Pharmacia LKB'ltä (katso yllä) kaupallisesti saata- ·.* · va plasmidi, joka sisältää lambdan pL-promoottorin 30 ja N-proteiinia koodittavan alueen, joita voidaan :* käyttää fuusiorekombinanttiproteiinien tai transla- tionaalisesti liitettyjen rekombinanttiproteiinien • « · *. ekspressoimiseksi.
« · · · • « • φ · « · • ·« « · · « · t · • · « X5, 105104 34. pPL-alfa/beeta
Emoplasmidit ovat numerot 13 ja 33, sisältää DV-A:n ja DV-B:n AR, ROP+ 5 35. pPL-di-alfa/beeta
Emoplasmidi on numero 34, sisältää RGV-di-alfan ja DV-B:n AR, ROP+
36. pSGEO,1-LO
10 Emoplasmidi on numero 35 ROP-geeni on inaktivoitu insertoimalla Notl-linkke-ri ROP-geenin PvuII-kohtaan.
AR, ROP- 37. pKS+ 15 Kaupallisesti saatavana Stratagene'Itä, La Jolla, CA.
38. pGS2488
Peräisin plasmidista numero 37, insertoitu GAP491-geenin synteettinen transkription aloituskohta.
20 39. pGS2888
Peräisin plasmidista numero 38, Kpnl-kohta on muutettu Sphl-kohdaksi.
40. pGS4788
Peräisin plasmidista numero 39, johon on insertoitu 25 synteettinen GAL0AS-sekvenssi GALGAP-hybridipromoot- .1 .1 torin muodostamiseksi.
• · · *** I 41. pLC IIFX-beeta-globiini
Plasmidi saatavana Kiyoshi Nagai'lta, Medical Re- i i « *1 1 search Council, Lontoo, Englanti; sisältää beeta- 30 globiinigeenin.
• · · 42. pUCl9 ··« ϊ#>>5 Plasmidi kaupallisesti saatavana Bethesda Research
Laboratories'1ta, Gaithersburg, Maryland.
• · · · • · • · ·
« I I
« · « • · • · 105104 156 43. pSUC2-6sigma
Plasmidin ovat kuvanneet Stetler et ai., Biotechnology, 7: 55 - 60 (1989).
44. pUC19-beeta-globiini 5 Peräisin plasmideista numerot 41 ja 42.
45. Plasmidi pGS1188
Beeta-globiinigeeni (plasmidista numero 44) on sigma-promoottorin ja MFX-terminaattorin säätelyn alaisuudessa (molemmat plasmidista numero 43).
10 46. Plasmidi pGS3588
Peräisin plasmideista numerot 45 ja 40; sigma-promoottori korvattu plasmidin numero 40 GALGAP-pro-moottorilla.
47. Plasmidi pGS3888 15 Peräisin plasmidista numero 46, Smal-kohta on muu tettu XhoI-kohdaksi.
47a. Plasmidi p-alfa-MRC
Plasmidi on saatavana K. Nagai'lta, MRC; sisältää alfa-globiinigeenin.
20 48. Plasmidi pGS4088
Peräisin plasmidista numero 47, insertoimalla alfa-globiinigeeni on korvattu beeta-globiinigeeni.
49. Plasmidi pSN(+)
Peräisin plasmidista numero 37, Kpnl-kohta muutettu 25 NotI-kohdaksi.
4 I
/ 50. Plasmidi pGS4888 ♦ · · ’·· | Peräisin plasmidista numero 49, insertoitu pGGAP- *" alfa-globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero • · ♦ 48.
30 51. Plasmidi pGS189 ···
Peräisin plasmidista numero 50, insertoitu pGGAP- *: : beeta-globiinin ekspressiokasetti plasmidista nume- ro 47. Näin ollen plasmidi sisältää sekä GALGAP- ’ alfa-globiini- että GALGAP-beeta-globiinioperonit.
« · • · • · · • ♦ • · • · · 1 · · • · • · • · · 157 105104
52. Plasmidi pCIU
Plasmidin ovat kuvanneet Stetler et ai., Biotechnology, 7: 55-60 (1989).
53. Plasmidi pCIN
5 Peräisin plasmidista numero 52, lisätty Notl-kohta.
54. Plasmidi pGS289
Peräisin plasmidista numero 53, insertoitu alfa-globiinin ja beeta-globiinin ekspressiokasetit.
55. Plasmidi pGS389 10 Kuten edellä mainittu, mutta insertin orientaatio päinvastainen.
56. Plasmidi pYRp7
Plasmidin ovat kuvanneet Strathern et ai., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, (Cold 15 Spring Harbor, 1981). TRPl-geenin lähde.
57. pCIT
Peräisin plasmideista numerot 52 ja 56. Plasmidin numero 52 Ura3-geeni korvattu plasmidin 56 Trpl-geenillä.
20 58. pGS4988
Peräisin plasmidista numero 57, insertoitu beeta-globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero 47. 59. Plasmidi pGS4488 : . Peräisin plasmidista numero 52, insertoitu alfa- : 25 globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero 48.
« «« ;*.·* 60. Plasmidi pGS4688 # · ♦ ' Kuten edellä mainittu, mutta insertin orientaatio • · ... päinvastainen.
• · · *·* * 61. Plasmidi pGS4888 30 Peräisin plasmidista numero 49, insertoitu GGAP- ♦ ·· *...: alfa-globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero ··· 48.
62. Plasmidi pGS1889 « ’·*. Peräisin plasmidista niimero 61, Pstl-kohta poistet- 35 tu.
• · • · • · · • 4« • « • · « 105104 158 63. Plasmid! pGS1989
Peräisin plasmidista numero 62, Spel-kohta poistettu.
64. Plasmidi pGS2189 5 Peräisin plasmideista numerot 61 ja 63. Koodittaa di-alfa-globiinia, jossa on RGGV-linkkeri.
65. Plasmidi pGS2989
Peräisin plasmideista numerot 64 ja 47, sisältää di-alfa-globiinigeenin ja beeta-globiinigeenin.
10 66. Plasmidi pGS3089
Peräisin plasmidista numero 53, insertoitu plasmi-din 65 ekspressiokasetti.
66a. Phagescript
Faagi on kaupallisesti saatavana Stratagene1Itä.
15 67. Faagi Mp-beeta-globiini
Peräisin plasmidista Phagescript, insertoitu plas-midin numero 65 GALGAP-promoottori ja beeta-globii-nigeeni.
67a. Plasmidi pGS3089 RGV des-beeta 20 Peräisin plasmidista numero 66, beeta-globiinin ekspressiokasetin sisältävä Xhol-fragmentti poistettu .
68. Plasmidi pGS3889 4 « 4
Plasmidi numero 66 yhdessä "Presbyterian"-mutaation . 25 (beetaNl08K) kanssa.
.* .* 69. Plasmidi pGS5189 • · · ··· I Plasmidi numero 66 yhdessä "Agenogi"-mutaation * * (beetaE90K) kanssa.
··· V' 70. Plasmidi pGS5689 30 Plasmidi numero 66 yhdessä "Kansas"-mutaation (bee- taN102T) kanssa.
• · · ;··*: 71. Plasmidi pGS4989 • · · *. Plasmidi numero 66 yhdessä "beetaV67I"-mutaation *·« ···· kanssa.
44« • 0 0 0 9 0 0 • • « • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 105104
72. Plasmid! pGS2989 RPV
Plasmid! numero 64 yhdessä RPV-di-alfa-linkkerin kanssa.
73. Plasmidi pGS2989 RGV
5 Plasmidi numero 64 yhdessä RGV-di-alfa-linkkerin kanssa.
74. Plasmidi pGS3089 RGV
Plasmidi numero 53 yhdessä plasmidin numero 73 hemoglobiinin ekspressiokasetin kanssa.
10 75. Plasmidi pGS3089 RPV
Plasmidi numero 53 yhdessä plasmidin numero 72 hemoglobiinin ekspressiokasetin kanssa.
Taulukko 300 15 Taulukko bakteerikannoista
Kanta Saatavuus Ekspressio
1 BL21 Brookhaven TAC
2 JM109 Kaupallinen TAC
3 SCSI Kaupallinen TAC
20 4 JM110 ATCC TAC
5 LE392 ATCC TAC
6 23722 ATCC TAC
7 W3110 ATCC TAC
8 AG-1 Kaupallinen TAC
25 9 DH1 ATCC TAC
.1 10 NM554 Kaupallinen TAC
• · ·
*·· l 11 N99cl+ Kaupallinen PL
12 N4830-1 Kaupallinen PL
• « · I I I • · · • · · • · « · ·1· • · · • · • « • · · • · · • · .· · « « • · · • · · • · • ·

Claims (19)

105104
1. Di-alfa-globiinin kaltainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää oleellisesti ensimmäi- 5 sen ja toisen alfa-globiinin kaltaisen polypeptidisekvens- sin, jotka on liitetty yhdeksi polypeptidiketjuksi yhden tai useamman peptidisidoksen välityksellä mainitun ketjun kyetessä liittymään yhteen beeta-globiinin ja hemin kanssa niin, että se muodostaa ihmisen hemoglobiinin kaltaisen 10 proteiinin, jolla on reversiibeli hapensitomisaktiivisuus.
2. Di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää oleellisesti ensimmäisen ja toisen beeta-globiinin kaltaisen polypeptidisekvenssin, jotka on liitetty yhdeksi polypeptidiketjuksi 15 yhden tai useamman peptidisidoksen välityksellä mainitun ketjun kyetessä liittymään yhteen alfa-globiinin ja hemin kanssa niin, että se muodostaa ihmisen hemoglobiinin kaltaisen proteiinin, jolla on reversiibeli hapensitomisaktiivisuus .
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen polypepti di, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen alfa- tai beeta-globiinin kaltainen polypeptidisekvenssi on liitetty yhteen suoraan yhdellä peptidisidoksella, joka ;·. on ensimmäisen polypeptidin normaalin C-pään ja toisen • · . 25 polypeptidin normaalin N-pään välissä. • · ·
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen polypepti- • · · ··· · di, t u n n e t t u siitä, että ensimmäinen ja toinen * * alfa- tai beeta-globiinin kaltainen polypeptidi on liitet- • ·· : ty yhteen yhden tai useamman aminohapon pituisella pepti- 30 dilinkkerillä.
:***: 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, • M • tunnettu siitä, että linkkeri sisältää 1-3 ami- ··· ·. nohappoa. « · · • «««« , • « · • · • · « « · • · • · • «· »«· « · • · »*· 105104
6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen polypepti-di, tunnettu siitä, että linkkerin aminohapot järjestyvät sattumanvaraiselle kierteelle.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 4-6 mukainen po- 5 lypeptidi, tunnettu siitä, että linkkerin aminoha pot valitaan ryhmästä, joka koostuu lysiinistä, aspara-giinihaposta, arginiinista, seriinistä, asparagiinistä, proliinistä ja glysiinistä.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 4-6 mukainen polo lypeptidi, tunnettu siitä, että linkkeri on -Gly- tai -Gly-Gly-.
9. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää ekspressoituvan ensimmäisen ja toisen DNA-sekvenssin, jotka koodattavat ensimmäistä ja toista 15 alfa-globiinin kaltaista polypeptidisekvenssiä, ja mah dollisesti linkkeri-DNA-sekvenssin, joka koodittaa linkkerin aminohapposekvenssiä, mainitun ensimmäisen ja toisen polypeptidisekvenssin, ja jos sisällytetty, mainitun linkkerin aminohapposekvenssin, ekspressoituessa yhtenä poly-20 peptidiketjuna mainitun ketjun kyetessä liittymään beeta- globiinin ja hemin kanssa yhteen niin, että muodostuu ihmisen hemoglobiinin kaltainen proteiini, jolla on rever-siibeli hapensitomisaktiivisuus.
;·. 10. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu . 25 siitä, että se sisältää ekspressoituvan ensimmäisen ja • · · .* toisen DNA-sekvenssin, jotka koodittavat ensimmäistä ja • · · *·· · toista beeta-globiinin kaltaista polypeptidisekvenssiä ja linkkeri-DNA-sekvenssin, joka koodittaa linkkerin amino- * · · • « · *.* ’ happosekvenssiä, mainitun ensimmäisen ja toisen polypep- 30 tidisekvenssin ja mainitun linkkerin aminohapposekvenssin • · · ! ί ekspressoituessa yhtenä polypeptidiketjuna mainitun ketjun kyetessä liittymään alfa-globiinin ja hemin kanssa yhteen ·· · niin, että muodostuu ihmisen hemoglobiinin kaltainen prot- • ♦ · eiini, jolla on reversiibeli hapensitomisaktiivisuus.’ • · • · ·«· • · • · · • * · * « » · • · · 162 105104
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi kolmanneen DNA-sekvenssin, joka koodittaa beeta-globii-nin kaltaista polypeptidiä.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen molekyyli, tunnettu siitä, että mainitut ensimmäinen DNA-sekvenssi, linkkeri-DNA-sekvenssi ja toinen DNA-sekvenssi määrittävät polykistronisen operonin yhden kistronin ja mainittu kolmas DNA-sekvenssi määrittää sen toisen kistro-10 nin mainittujen kistronien transkriptoituessa yhteisestä promoottorista.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen molekyyli, tunnettu siitä, että yhteinen promoottori on Tac-promoottori.
14. Menetelmä reversiibelin hapensitomisaktiivisuu- den omaavan ihmisen hemoglobiinin kaltaisen proteiinin, jossa luonnollisen hemoglobiinin kaksi alfa-alayksikköä on korvattu yhdellä di-alfa-globiinin kaltaisella polypepti-dillä, tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se si-20 sältää vaiheet, joissa muodostetaan patenttivaatimuksen 9 mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä transformoitu isäntä, viljellään mainittua isäntää olosuhteissa, joissa se ·;1. ekspressoi mainittua di-alfa-globiinin kaltaista polypep- • · · ··, tidiä ja yhdistetään mainittu polypeptidi beeta-globiinin • · . 25 ja hemin kanssa ihmisen hemoglobiinin kaltaisen proteiinin • · · / / muodostamiseksi. • t
· ··· | 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, ** tunnettu siitä, että di-alfa-globiinia ja beeta- ··« V * globiinia yhteisekspressoidaan mainitusta yhdistelmä-DNA- 30 molekyylistä ja hemin toimittaa ja sisällyttää mainittu :***: isäntä niin, että muodostuu mainittu hemoglobiinin kai- ··· ·***· täinen proteiini.
• · · *, 16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, IM ' ·;;; tunnettu siitä, että isäntä on hiivasolu. f « « « « 4 « « « < I < I « « « 4 « « · « I Ml 163 1 05 1 04
17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä on bakteerisolu.
18. Menetelmä reversiibelin hapensitomisaktiivisuu-den omaavan ihmisen hemoglobiinin kaltaisen proteiinin, 5 jossa luonnollisen hemoglobiinin kaksi beeta-alayksikköä on korvattu yhdellä di-beeta-globiinin kaltaisella poly-peptidillä, tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa muodostetaan patenttivaatimuksen 10 mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä transformoi-10 tu isäntä, viljellään mainittua isäntää olosuhteissa, joissa se ekspressoi mainittua di-beeta-globiinin kaltaista polypeptidiä ja yhdistetään mainittu polypeptidi alfa-globiinin ja hemin kanssa ihmisen hemoglobiinin kaltaisen proteiinin muodostamiseksi.
19. Menetelmä toimivan linkkerin määrittämiseksi di-alfa-globiinin kaltaiselle tai di-beeta-globiinin kaltaiselle polypeptidille, joka linkkeri on sopiva käytettäväksi hemoglobiinin kaltaisen proteiinin tuotossa, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa (a) 20 muodostetaan ryhmä yhdistelmä-DNA-vektoreita kunkin vek torin koodittaessa di-alfa-globiinin kaltaista polypeptidiä tai di-beeta-globiinin kaltaista polypeptidiä, jotka sisältävät yhden tai useamman aminohapon pituisen polypep-tidilinkkerin, mainitun ryhmän kollektiivisesti koodit- \ ” 25 taessa useita erilaisia polypeptidejä, jotka eroavat « · · '· toisistaan linkkerin aminohapposekvenssin perusteella, (b) • · • · · : transformoidaan solua mainitulla vektoriryhmällä, (c) tuo- tetaan di-alfa- tai di-beeta-hemoglobiinin kaltaista pro- • · · : teiinia mainituissa soluissa, (d) seulotaan mainitut solut 30 hemoglobiinin kaltaisen proteiinin tuoton suhteen määrit- ;***· tämällä, mitkä solut reagoivat hiilimonoksidin kanssa ta- .···. valla, joka osoittaa hemoglobiinin kaltaisen proteiinin • f I • läsnäolon ja (e) määritetään linkkerin aminohapposekvenssi « « « ··.· di-alfa-hemoglobiinista tai di-beeta-hemoglobiinista, jot- 35 ka yllä olevassa vaiheessa (d) positiivisiksi seulotut solut tuottavat. « · · 1 ♦ a a « 105104
FI915279A 1989-05-10 1991-11-08 Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö FI105104B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34962389A 1989-05-10 1989-05-10
US34962389 1989-05-10
US37416189A 1989-06-30 1989-06-30
US37416189 1989-06-30
US37911689A 1989-07-13 1989-07-13
US37911689 1989-07-13
US9002654 1990-05-10
PCT/US1990/002654 WO1990013645A1 (en) 1989-05-10 1990-05-10 Production in bacteria and yeast of hemoglobin and analogues thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI915279A0 FI915279A0 (fi) 1991-11-08
FI105104B true FI105104B (fi) 2000-06-15

Family

ID=27407902

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI915279A FI105104B (fi) 1989-05-10 1991-11-08 Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö
FI20000025A FI107938B (fi) 1989-05-10 2000-01-05 Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20000025A FI107938B (fi) 1989-05-10 2000-01-05 Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi

Country Status (18)

Country Link
EP (3) EP0700997B1 (fi)
JP (1) JP3013902B2 (fi)
KR (1) KR920701434A (fi)
AT (2) ATE246246T1 (fi)
AU (1) AU635744B2 (fi)
CA (1) CA2050601C (fi)
DE (2) DE69034091T2 (fi)
DK (1) DK0402300T3 (fi)
ES (2) ES2093640T3 (fi)
FI (2) FI105104B (fi)
GR (1) GR3021106T3 (fi)
HU (1) HUT61591A (fi)
IE (1) IE970086A1 (fi)
IL (1) IL94361A (fi)
NO (2) NO304027B1 (fi)
NZ (1) NZ233642A (fi)
SG (1) SG47987A1 (fi)
WO (1) WO1990013645A1 (fi)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022849A (en) * 1987-05-16 2000-02-08 Baxter Biotech Technology Saarl Mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US6204009B1 (en) 1988-05-16 2001-03-20 BAXTER BIOTECH TECHNOLOGY SàRL Nucleic acids encoding mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US5545727A (en) * 1989-05-10 1996-08-13 Somatogen, Inc. DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin
US6150506A (en) * 1989-05-10 2000-11-21 Baxter Biotech Technology Sarl Modified hemoglobin-like compounds and methods of purifying same
US5844090A (en) * 1994-05-09 1998-12-01 Somatogen, Inc. Modified hemoglobin-like compounds
US5599907A (en) 1989-05-10 1997-02-04 Somatogen, Inc. Production and use of multimeric hemoglobins
WO1991013158A1 (en) * 1990-02-28 1991-09-05 Delta Biotechnology Limited Protein production in yeast
US6172039B1 (en) 1990-04-16 2001-01-09 Apex Bioscience, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
JPH07504645A (ja) * 1990-04-16 1995-05-25 アペックス　バイオサイエンス　インコーポレーテッド 酵母での組換えヘモグロビンの発現
US5610137A (en) * 1990-12-20 1997-03-11 The Uab Research Foundation Transgenic, cross-linked hemoglobin
DE69132763D1 (de) * 1990-12-20 2001-11-15 Univ Alabama Res Foundation Bi Transgenes, vernetztes hämoglobin
US5714345A (en) * 1990-12-24 1998-02-03 Pharmaceutical Proteins Limited Increased expression of a gene by a second transferred mammary gland specific sequence transgenic
GB9028062D0 (en) * 1990-12-24 1991-02-13 Agricultural & Food Res Production of transgenic animals
WO1993008831A1 (en) * 1991-10-30 1993-05-13 Strohtech, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
US5679777A (en) * 1991-11-08 1997-10-21 Somatogen, Inc. Hemoglobins as drug delivery agents
FR2688784B1 (fr) * 1992-03-18 1995-06-30 Pasteur Merieux Serums Vacc Transporteur d'oxygene.
US5939391A (en) * 1993-03-31 1999-08-17 Pro-Neuron, Inc. Hemoglobin alpha chain peptide fragments useful for inhibiting stem cell proliferation
US6610654B2 (en) 1993-03-31 2003-08-26 Wellstat Therapeutics Corporation Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
WO1994022915A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
US5612310A (en) * 1993-05-24 1997-03-18 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5554638A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5840851A (en) * 1993-07-23 1998-11-24 Plomer; J. Jeffrey Purification of hemoglobin
US5665869A (en) * 1993-11-15 1997-09-09 Somatogen, Inc. Method for the rapid removal of protoporphyrin from protoporphyrin IX-containing solutions of hemoglobin
US6140071A (en) * 1994-01-27 2000-10-31 Somatogen, Inc. Proteins with mutations to decrease N-terminal methylation
US6242417B1 (en) 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
US5631219A (en) * 1994-03-08 1997-05-20 Somatogen, Inc. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin
AU6489996A (en) * 1995-07-14 1997-02-18 Somatogen, Inc. Methods for increasing protein expression
US5824511A (en) * 1995-08-01 1998-10-20 University Technology Corporation Method for enhancing the production of hemoproteins
US6812207B1 (en) 1995-10-23 2004-11-02 William Marsh Rice University Hemoglobin mutants that reduce heme loss
US6114505A (en) * 1995-10-23 2000-09-05 William Marsh Rice University Hemoglobin mutants that reduce heme loss
CA2236794A1 (en) * 1995-11-30 1997-06-05 Bruce A. Kerwin Method for control of functionality during cross-linking of hemoglobins
WO1997023631A2 (en) * 1995-12-22 1997-07-03 Somatogen, Inc. Globins containing binding domains
CA2239303A1 (en) 1995-12-22 1997-07-03 Somatogen, Inc. Globins containing binding domains
US5861483A (en) 1996-04-03 1999-01-19 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
CA2268278A1 (en) * 1996-10-18 1998-04-30 Somatogen, Inc. Methods of reducing the levels of protoporphyrin ix in recombinant hemoglobin preparations
EP1950298A3 (en) 1997-05-02 2008-12-24 Baxter Biotech Technology S.A.R.L. Hemoglobin mutants with increased soluble expression and/or reduced nitric oxide scavenging
DE10036491A1 (de) 2000-07-25 2002-02-07 Roche Diagnostics Gmbh Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe
HU230335B1 (hu) 2001-03-09 2016-02-29 Genentech, Inc Eljárás polipeptidek előállítására
US7504377B2 (en) 2006-10-23 2009-03-17 Ikor, Inc. Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin
US7494974B2 (en) 2006-10-24 2009-02-24 Ikor, Inc. Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin
EP2178551A4 (en) * 2007-07-24 2010-07-21 Sanare Invest As NEW PEPTIDES
EP2058398A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-13 Nipro Corporation Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast
KR101584540B1 (ko) * 2014-04-16 2016-01-14 박병용 대형 식품용기 자동 세척장치
US10752672B1 (en) * 2019-02-01 2020-08-25 Cheer Global Limited Recombinant hemoglobins and methods of preparation and use thereof
US20230073947A1 (en) * 2020-01-10 2023-03-09 Intron Biotechnology, Inc. A method for preparing bovine myoglobin using escherichia coli
CN114929736A (zh) * 2020-01-10 2022-08-19 尹特荣生物科技株式会社 一种利用大肠杆菌制备猪肌红蛋白的方法
CN116203144B (zh) * 2022-05-11 2023-10-27 重庆医科大学附属儿童医院 测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法及其应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3924943A (en) 1974-06-11 1975-12-09 Xerox Corp Segmented biased transfer member
US4769326A (en) 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4599197A (en) 1982-12-22 1986-07-08 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4620948A (en) 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8412517D0 (en) 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
US4598064A (en) 1984-06-27 1986-07-01 University Of Iowa Research Foundation Alpha-alpha cross-linked hemoglobins
US4600531A (en) 1984-06-27 1986-07-15 University Of Iowa Research Foundation Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield
US4774180A (en) 1986-02-26 1988-09-27 Massachusetts Institute Of Technology Construction and application of polyproteins
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
GB8701001D0 (en) 1987-01-19 1987-02-18 Gordon D G Ceiling tiles
WO1988006601A1 (en) 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Gene repressors
EP0561245A1 (en) * 1987-05-16 1993-09-22 Somatogenetics International, Inc. Blood substitutes comprising recombinant hemoglobin
GB8711614D0 (en) 1987-05-16 1987-06-24 Medical Res Council Proteins

Also Published As

Publication number Publication date
GR3021106T3 (en) 1996-12-31
KR920701434A (ko) 1992-08-11
NO914387D0 (no) 1991-11-08
CA2050601C (en) 2000-09-19
NO973848D0 (no) 1997-08-21
IL94361A0 (en) 1991-03-10
WO1990013645A1 (en) 1990-11-15
JP3013902B2 (ja) 2000-02-28
IE970086A1 (en) 2000-02-23
NO304027B1 (no) 1998-10-12
FI20000025A (fi) 2000-01-05
HUT61591A (en) 1993-01-28
NO914387L (no) 1991-11-08
DK0402300T3 (da) 1996-09-30
DE69028448D1 (de) 1996-10-17
EP0402300A3 (en) 1991-01-30
ES2093640T3 (es) 1997-01-01
EP0700997A1 (en) 1996-03-13
NO315568B1 (no) 2003-09-22
NO973848L (no) 1997-08-21
AU5675690A (en) 1990-11-29
FI915279A0 (fi) 1991-11-08
IL94361A (en) 1995-07-31
DE69028448T2 (de) 1997-02-06
FI107938B (fi) 2001-10-31
ES2204926T3 (es) 2004-05-01
CA2050601A1 (en) 1990-11-11
JPH05503627A (ja) 1993-06-17
ATE142692T1 (de) 1996-09-15
EP1380645A2 (en) 2004-01-14
SG47987A1 (en) 1998-04-17
EP0402300A2 (en) 1990-12-12
EP0402300B1 (en) 1996-09-11
ATE246246T1 (de) 2003-08-15
DE69034091T2 (de) 2004-04-22
EP0700997B1 (en) 2003-07-30
DE69034091D1 (de) 2003-09-04
AU635744B2 (en) 1993-04-01
HU905111D0 (en) 1992-02-28
NZ233642A (en) 1992-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI105104B (fi) Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö
US5844089A (en) Genetically fused globin-like polypeptides having hemoglobin-like activity
JP3390990B2 (ja) 血清ヒトアルブミン，製剤及び利用
US5602034A (en) Expression and secretion of heterologous proteins in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
JP3315689B2 (ja) 治療的機能を有するアルブミンの誘導体
DK173186B1 (da) Gærpromotor, vektor indeholdende en sådan promotor, gær transformeret med en sådan vektor og fremgangsmåde til fremstilling
JP3667339B2 (ja) 酵母菌株
US6828125B1 (en) DNA encoding fused di-alpha globins and use thereof
CZ284251B6 (cs) Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce
US6172039B1 (en) Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
JPH07504645A (ja) 酵母での組換えヘモグロビンの発現
ES2199217T3 (es) Promotor de levadura y su utilizacion.
WO1991013158A1 (en) Protein production in yeast

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: BAXTER BIOTECH TECHNOLOGY S.A.R.L.

MA Patent expired