JPS62236485A - キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 - Google Patents
キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子Info
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- JPS62236485A JPS62236485A JP7663386A JP7663386A JPS62236485A JP S62236485 A JPS62236485 A JP S62236485A JP 7663386 A JP7663386 A JP 7663386A JP 7663386 A JP7663386 A JP 7663386A JP S62236485 A JPS62236485 A JP S62236485A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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- C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子、それを
含む酵母発現プラスミド及びそれらのプラスミドを菌体
内に保持する酵母菌株並びにこれらの製造方法に関する
。
含む酵母発現プラスミド及びそれらのプラスミドを菌体
内に保持する酵母菌株並びにこれらの製造方法に関する
。
従来技術および問題点
チトクロムＰ−４５０（以下Ｐ−４５０と略称する）は
、微生物から咄乳動物にいたるまで広く生物界に存在す
るヘムタンパク質であり、多くの分子種が存在する。
各々のＰ−４５０分子種は基質特異性を異にしているが
、共通して脂溶性基質に対して一原子酸素添加反応を触
媒する。
、微生物から咄乳動物にいたるまで広く生物界に存在す
るヘムタンパク質であり、多くの分子種が存在する。
各々のＰ−４５０分子種は基質特異性を異にしているが
、共通して脂溶性基質に対して一原子酸素添加反応を触
媒する。
近年、本発明者らは、酵母を宿主としてラット肝チトク
ロムＰ−４５０ＭＣ（Ｐ−４５０ＭＣ）を発：・ τ現
させる酵母発現ベクターｐＡＭＣ１を構築し酵二
・）ｉ ”＋ ：ｉ ｌ Ｈ’、母でＰ ＩＦＩＯＭＣを大量に
生産させることに成功し、酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロム
Ｐ−４５０還元酵素と連携して電子伝達系を形成し、一
原子酸素添加反応（＃比活性）を示す。
ロムＰ−４５０ＭＣ（Ｐ−４５０ＭＣ）を発：・ τ現
させる酵母発現ベクターｐＡＭＣ１を構築し酵二
・）ｉ ”＋ ：ｉ ｌ Ｈ’、母でＰ ＩＦＩＯＭＣを大量に
生産させることに成功し、酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロム
Ｐ−４５０還元酵素と連携して電子伝達系を形成し、一
原子酸素添加反応（＃比活性）を示す。
本発明者らの特許用１＊ＪＩ （特願昭６Ｏ−１３９１
２８）に記載したように、Ｐ−４５０ＭＣ発現酵母菌株
を用いて、アセトアニリドをパラ位水酸化し、アセトア
ミノフェンを製造することが可能である（特願昭６Ｏ−
１３９１２８）。
２８）に記載したように、Ｐ−４５０ＭＣ発現酵母菌株
を用いて、アセトアニリドをパラ位水酸化し、アセトア
ミノフェンを製造することが可能である（特願昭６Ｏ−
１３９１２８）。
さらに、本発明者らは、キメラＰ−４５０遺伝子を２種
以上のＰ−４５０遺伝子から構築し、酵母菌体内で発現
させることにに成功した（特願昭６Ｏ−２４２７７３）
、 この特許出願に記載のキメラＰ ４５０ｃｃｄ
の基質特異性は、Ｐ−４５０ＭＣから由来するものであ
り、本キメラＰ−４５０は、高い酸化活性とＰ−４５０
ＭＣの基質特異性を有するものである。
以上のＰ−４５０遺伝子から構築し、酵母菌体内で発現
させることにに成功した（特願昭６Ｏ−２４２７７３）
、 この特許出願に記載のキメラＰ ４５０ｃｃｄ
の基質特異性は、Ｐ−４５０ＭＣから由来するものであ
り、本キメラＰ−４５０は、高い酸化活性とＰ−４５０
ＭＣの基質特異性を有するものである。
発明の背景
本発明者らは、種々研究の結果、Ｐ−４５０のロソーム
に局在化し、安定に保たれ、酸化活性を示すことを明ら
かにした。
に局在化し、安定に保たれ、酸化活性を示すことを明ら
かにした。
発明の構成
本発明は、Ｐ−４５０ＭＣのアミノ酸末端領域部分をコ
ードする遺伝子領域の後に他の分子種のＰ−４５０をコ
ードする遺伝子の対応するＣ末端側部分を結合すること
により構築したキメラムＰ−４５０遺伝子、該遺伝子を
含みこれを酵母菌体内で発現させる酵母発現プラスミド
、該発現プラスミドで形質転ｔｉすることにより創製し
た形質転換体酵母、および発現産物のキメラＰ−４５０
を提供する。
ードする遺伝子領域の後に他の分子種のＰ−４５０をコ
ードする遺伝子の対応するＣ末端側部分を結合すること
により構築したキメラムＰ−４５０遺伝子、該遺伝子を
含みこれを酵母菌体内で発現させる酵母発現プラスミド
、該発現プラスミドで形質転ｔｉすることにより創製し
た形質転換体酵母、および発現産物のキメラＰ−４５０
を提供する。
問題解決の手段
発明のキメラＰ−４５０遺伝子は、Ｐｉ５０肛の酵母ミ
クロソームへの局在化に関与する領域即ち、Ｎ末端から
約数十程度のアミノ酸残恭を含む領域をコードするＰ−
４５０ＭＣ遺伝子の断片を、例えば、Ｐ−４５０ＭＣ遺
伝子を含むプラスミドｐより具体的に説明すれば、例え
ば、Ｐ−４５０肛遺伝子のＮ末端の１８６のアミノ酸残
基をコードする領域の後に、他の分子種のＰ−４５０遺
伝子の対応するＣ末端部分、例えばＰ−４５０ｄ（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、 ９６．７９３−８０４．
（１９８４））の１８４番目から５１３番目のアミノ酸
をコードする領域を接続することにより得ることができ
る（この様にして構築したキメラＰ−４５０をキメラＰ
−４５０’ｃ ｄ ｄ ’ｌと称する）。
クロソームへの局在化に関与する領域即ち、Ｎ末端から
約数十程度のアミノ酸残恭を含む領域をコードするＰ−
４５０ＭＣ遺伝子の断片を、例えば、Ｐ−４５０ＭＣ遺
伝子を含むプラスミドｐより具体的に説明すれば、例え
ば、Ｐ−４５０肛遺伝子のＮ末端の１８６のアミノ酸残
基をコードする領域の後に、他の分子種のＰ−４５０遺
伝子の対応するＣ末端部分、例えばＰ−４５０ｄ（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、 ９６．７９３−８０４．
（１９８４））の１８４番目から５１３番目のアミノ酸
をコードする領域を接続することにより得ることができ
る（この様にして構築したキメラＰ−４５０をキメラＰ
−４５０’ｃ ｄ ｄ ’ｌと称する）。
Ｐ−４５０ｄのＣ末端部分は、Ｐ−４５０ｄをコードす
る領域を含むプラスミドｐＴＺ３３０（Ｊ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、９６．７９３−８０４．（１９８４）に記載
の方法で製造することができる〕から分離することがで
きる。 キメラプラスミドｐＡＣＤＤ２構築の概略を第
２図に示す。
る領域を含むプラスミドｐＴＺ３３０（Ｊ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、９６．７９３−８０４．（１９８４）に記載
の方法で製造することができる〕から分離することがで
きる。 キメラプラスミドｐＡＣＤＤ２構築の概略を第
２図に示す。
この様にして得られた本発明のキメラＰ−４５０は、そ
のＣ末端側に用いた各種のＰ−４５０分子種の基質特異
性を有し、本発明によれば、種〜の基質特異性を有する
キメラＰ−４５０を製造することが可能である。
のＣ末端側に用いた各種のＰ−４５０分子種の基質特異
性を有し、本発明によれば、種〜の基質特異性を有する
キメラＰ−４５０を製造することが可能である。
本発明のキメラＰ−４５０遺伝子を保持する酵母発現用
プラスミドは、例えば、 酵母アルコ−４２方法により
製造できる）や酵母発現ベクターｐＪ’Ｄ Ｂ ２１９
（Ｎａｔｕｒｅ、 ２７５．１０４（１９７９））等
の酵母、 ｌ □ 発現ベクターに上述のように製造したキメラＰ−、
、、，７４５０遺伝子を組み込むことにより製造するこ
とができる。 この場合において、酵母発現ベクターは
、特に限定されるものではなく、また、使用するプロモ
ーターやターミネータ−についても、酵母内で効率良く
機能するプロモーター、ターミネータ−であればよく、
こらに限定されずものではない。 また、プラスミド上
のプロモーター１、キメラＰ−４５０遺伝子、ターミネ
ータ−以外の構造も限定されるものでなく、酵母内で安
定に保持されるものであればよい。
プラスミドは、例えば、 酵母アルコ−４２方法により
製造できる）や酵母発現ベクターｐＪ’Ｄ Ｂ ２１９
（Ｎａｔｕｒｅ、 ２７５．１０４（１９７９））等
の酵母、 ｌ □ 発現ベクターに上述のように製造したキメラＰ−、
、、，７４５０遺伝子を組み込むことにより製造するこ
とができる。 この場合において、酵母発現ベクターは
、特に限定されるものではなく、また、使用するプロモ
ーターやターミネータ−についても、酵母内で効率良く
機能するプロモーター、ターミネータ−であればよく、
こらに限定されずものではない。 また、プラスミド上
のプロモーター１、キメラＰ−４５０遺伝子、ターミネ
ータ−以外の構造も限定されるものでなく、酵母内で安
定に保持されるものであればよい。
キメラＰ−４５０遺伝子Ｐ−４５０ｃｄｄ２を保持する
酵母発現用プラスミドｐＡＣＤＤ２により形質転換され
た酵母菌株における菌体当たり、あるいはＰ−４５０１
分子当たりのアセトアニリド２位水酸化活性は、従来の
プラスミドｐΔＭＣＩによって形質転（負された酵母菌
株の約５〜６倍であり、バイオリアクターとして有用性
が高いことがわかる。 また、本発明の酵母菌体は、キ
メラＰ−４５０ｉＩｔ伝子を含むプラスミドにより、ア
ルカリ金属法、あるいはプロトプラスト法などでサツカ
ロミセス属に属する酵母を形質転換することによって得
られる。 サッカロミセス・セレビシェーＡ Ｉ（２２
株を用いることができるが、この株に限定されるもので
はない。
酵母発現用プラスミドｐＡＣＤＤ２により形質転換され
た酵母菌株における菌体当たり、あるいはＰ−４５０１
分子当たりのアセトアニリド２位水酸化活性は、従来の
プラスミドｐΔＭＣＩによって形質転（負された酵母菌
株の約５〜６倍であり、バイオリアクターとして有用性
が高いことがわかる。 また、本発明の酵母菌体は、キ
メラＰ−４５０ｉＩｔ伝子を含むプラスミドにより、ア
ルカリ金属法、あるいはプロトプラスト法などでサツカ
ロミセス属に属する酵母を形質転換することによって得
られる。 サッカロミセス・セレビシェーＡ Ｉ（２２
株を用いることができるが、この株に限定されるもので
はない。
以下に実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する。 本
発明は、以下の実施例のみに限定されるのもではなく、
本発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。
発明は、以下の実施例のみに限定されるのもではなく、
本発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。
実施例１ プラスミドｐＡＣＤＤ２の構築第２図にプラ
スミドｐＡＣＤＤ２の構築の概略を示す。
スミドｐＡＣＤＤ２の構築の概略を示す。
本発明・Ｈらの発明に係る特許出願（特願昭５９−１２
２５９３）に記載したプラスミドｐＴＦ１を制限酵素Ｂ
ａ１ｌで部分切断し、さらに５ｔｕｉで切断した後、低
融点アガロースゲル電気泳動を行い、約４．２ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むゲルを切り出して、これを６５℃で５分
間加熱した。融解したゲルに２倍容のＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス−塩酸０．５ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐ
ｔｌ ８．０） ）を加え、次にＴＥＩＩ衝液で飽和し
たフェノールを等量刑えて撹拌した。遠心分離後、上層
を分取し、２倍容の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱
させ、回収した。
２５９３）に記載したプラスミドｐＴＦ１を制限酵素Ｂ
ａ１ｌで部分切断し、さらに５ｔｕｉで切断した後、低
融点アガロースゲル電気泳動を行い、約４．２ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むゲルを切り出して、これを６５℃で５分
間加熱した。融解したゲルに２倍容のＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス−塩酸０．５ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐ
ｔｌ ８．０） ）を加え、次にＴＥＩＩ衝液で飽和し
たフェノールを等量刑えて撹拌した。遠心分離後、上層
を分取し、２倍容の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱
させ、回収した。
以後のＤＮＡ断片の回収はすべてこの方法で行った。約
４．２ｋｂのＤＮＡ断片約１００ ｎｇをアルカリホス
ファターゼ処理した後、公知のプラスミドｐＴＯｎｇと
混合し、リガーゼ反応を行った。反応後のンｎ’ｌ（ｌ
により大腸菌Ｄ Ｈ１（Ｆ −ｒｅｃ八１へ、 ｅｎｄ
ＡＩ 。
４．２ｋｂのＤＮＡ断片約１００ ｎｇをアルカリホス
ファターゼ処理した後、公知のプラスミドｐＴＯｎｇと
混合し、リガーゼ反応を行った。反応後のンｎ’ｌ（ｌ
により大腸菌Ｄ Ｈ１（Ｆ −ｒｅｃ八１へ、 ｅｎｄ
ＡＩ 。
ｇｙｒ９６Ａ、 ｔｈｉ−１、ｈｓｄ Ｒ１７，５ｕｐ
Ｅ４４．λ−）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むプレートに広げ出現するコロニーからプ
ラスミドＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡ約１１００
ｎを’、５．’、ａ ｌ １−Ｂａ Ｉ Ｉ ＤＮＡ断
片約５０ｎｇと混合し、二−二′リガーゼ反応を行った
。反応混液にて形質転換した大腸菌ＤＨＩのコロニーか
らプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦ ｃ ｄ ｃと名
付けた（第２図）。
Ｅ４４．λ−）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むプレートに広げ出現するコロニーからプ
ラスミドＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡ約１１００
ｎを’、５．’、ａ ｌ １−Ｂａ Ｉ Ｉ ＤＮＡ断
片約５０ｎｇと混合し、二−二′リガーゼ反応を行った
。反応混液にて形質転換した大腸菌ＤＨＩのコロニーか
らプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦ ｃ ｄ ｃと名
付けた（第２図）。
ｐ Ｔ Ｆ ｃ ｄ ｃを５ｔｕ１．Ｈｉｎｄｎｌで切
断して得られた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片約１１００ｎ
をアルカリホスファターゼ処理した後、下記に示した配
列を有する合成リンカ−ＤＮＡ約１１００ｎと混合し、
リガーゼ反応を行った０合成リンカーの塩基配列： ＣＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＧＡＣ
ＣＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＣＧ反応混
液によって形質転換した大腸菌ＤＨＩのコロニーからプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡ約１
１００ｎを３Ｌｕｌで切断してアルカリホスファーゼ処
理し、ｐＴＺ３３０を３ｔｕｔで切断して得た約４２０
ｂｐのＤＮＡ約ＬＯＯｎｇと混合し、リガーゼを行った
。 反応混液によって形質転換した大腸菌ＤＨＩのコロ
ニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦ ｃ ｄゼ
処理を施した。これに約５００ｎｇのＨｉｎｄ′ｍリン
カ−を加えてリガーゼ反応を行った０反応混液により大
腸菌ＤＨＩを形質転換し得られたコ、Ｉ；に一からプラ
スミドＤＮＡを調製し、Ｈｉ ｎ ｄ■で切断してＤＮ
Ａ構造を確認し、得られたプラスミドをｐＴＦｃｄｄ
（Ｈ）と名付けた。ｐＴＦｃｄｄ（Ｈ）をＨｉｎｄｌｌ
ｒで切断し、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
断して得られた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片約１１００ｎ
をアルカリホスファターゼ処理した後、下記に示した配
列を有する合成リンカ−ＤＮＡ約１１００ｎと混合し、
リガーゼ反応を行った０合成リンカーの塩基配列： ＣＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＧＡＣ
ＣＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＣＧ反応混
液によって形質転換した大腸菌ＤＨＩのコロニーからプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡ約１
１００ｎを３Ｌｕｌで切断してアルカリホスファーゼ処
理し、ｐＴＺ３３０を３ｔｕｔで切断して得た約４２０
ｂｐのＤＮＡ約ＬＯＯｎｇと混合し、リガーゼを行った
。 反応混液によって形質転換した大腸菌ＤＨＩのコロ
ニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦ ｃ ｄゼ
処理を施した。これに約５００ｎｇのＨｉｎｄ′ｍリン
カ−を加えてリガーゼ反応を行った０反応混液により大
腸菌ＤＨＩを形質転換し得られたコ、Ｉ；に一からプラ
スミドＤＮＡを調製し、Ｈｉ ｎ ｄ■で切断してＤＮ
Ａ構造を確認し、得られたプラスミドをｐＴＦｃｄｄ
（Ｈ）と名付けた。ｐＴＦｃｄｄ（Ｈ）をＨｉｎｄｌｌ
ｒで切断し、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
次に酵母発現ベクターｐ Ａ Ａ Ｈ５（Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎＡ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄａｔｉｏｎか
ら入手可能、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、 １０１ ｐａｒｔ Ｃｐ１９２−２０１の方法によ
り製造できる）、約１ ｏｏｎｇを）Ｉｉｎｄｕｌで切
断し、アルカリホスファーゼ処理を行った後、１．６ｋ
ｂのＤＮＡ断片約２００ｎｇと混合し、リガーゼ反応を
行った後、反応混液により大腸菌Ｄ）［１を形質転換し
、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、Ｂ
ａｍＨＩ、５Ｌｕｌで切断してＤＮへの構造を確認し、
得られたプラスミドをｐＡＣＤＤ２と名付けた。
ｇｔｏｎＡ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄａｔｉｏｎか
ら入手可能、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、 １０１ ｐａｒｔ Ｃｐ１９２−２０１の方法によ
り製造できる）、約１ ｏｏｎｇを）Ｉｉｎｄｕｌで切
断し、アルカリホスファーゼ処理を行った後、１．６ｋ
ｂのＤＮＡ断片約２００ｎｇと混合し、リガーゼ反応を
行った後、反応混液により大腸菌Ｄ）［１を形質転換し
、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、Ｂ
ａｍＨＩ、５Ｌｕｌで切断してＤＮへの構造を確認し、
得られたプラスミドをｐＡＣＤＤ２と名付けた。
実施例２ プラスミドｐＡＣＤＤ２による酵母の形質転
換 ＹＰＤ培地（１％Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、 ２％
ポリペ懸濁した後、再び遠心分離し、得られたベレット
に２０μｌの１ＭＬｉｃ１：ｆ４液３ Ｑ ）ｔ ｌの
７０％ポリエチレングリコール４０００溶液、約１μｇ
のｐＡＣＤＤ２を含む１０μｌの溶液を添加した。十分
に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さら
に１４０μｌの滅菌水を加えて撹拌した。この溶液をＳ
Ｄ合成培地プレート（２％グルコース。
換 ＹＰＤ培地（１％Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、 ２％
ポリペ懸濁した後、再び遠心分離し、得られたベレット
に２０μｌの１ＭＬｉｃ１：ｆ４液３ Ｑ ）ｔ ｌの
７０％ポリエチレングリコール４０００溶液、約１μｇ
のｐＡＣＤＤ２を含む１０μｌの溶液を添加した。十分
に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さら
に１４０μｌの滅菌水を加えて撹拌した。この溶液をＳ
Ｄ合成培地プレート（２％グルコース。
０．６７％窒素源アミノ酸不含、２０μｍ ／ ｍ １
ヒスチジン、２％寒天）の上にまき、３０℃で３日間実
施例２で得たＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株をＳＤ合成培
地（２％グルコース、 ０．６７％窒素源アミノ酸不含
、２０μｍ／ｍｌヒスチジン）で各々１．５ ＸＩＯ’
ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌまで培養した後、集菌し、ザイモ
リエース溶液（１，２Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ７，２） 、 １４ ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、０．４ ｍＨ／ ｍ１ザイモリエー
ス６０，０００）に９．濁し、３０℃で３０分インキュ
ベートした。遠心分離により集めたスフェロプラストに
１００℃に熱した緩衝液（１％ＳＤＳ。
ヒスチジン、２％寒天）の上にまき、３０℃で３日間実
施例２で得たＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株をＳＤ合成培
地（２％グルコース、 ０．６７％窒素源アミノ酸不含
、２０μｍ／ｍｌヒスチジン）で各々１．５ ＸＩＯ’
ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌまで培養した後、集菌し、ザイモ
リエース溶液（１，２Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ７，２） 、 １４ ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、０．４ ｍＨ／ ｍ１ザイモリエー
ス６０，０００）に９．濁し、３０℃で３０分インキュ
ベートした。遠心分離により集めたスフェロプラストに
１００℃に熱した緩衝液（１％ＳＤＳ。
られた上清く約３Ｘ１０’菌体分）を１０％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いて電気泳動した。さらに、ゲル中の
タンパク質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣＩＣｐＨ８゜３
）、 １９２ ｍＭグリシン−２０％メタノール中で電
気３％ゼラチン０，０５％ＴｌＡＩｅｅｎ ２０を含む
ＴＢＳｉｌ衝液中、３７℃で４０分インキュベートし、
さらに、３０μｇの精製抗−Ｐ−４５０ＭＣＩｇＧ、
１％ゼラチ′ン、 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０をふ
くむＴＢＳ中３７℃で２時間インキュベートした。その
後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む緩衝液中、３７
℃で３０分インキュベートする操作を４回繰り返した後
、３％ゼラチン、 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
ＴＢＳｔｌ衝液中に３７℃で２０分インキュベートした
。次に、２μＣｉの（１１５１）−プロティンＡ、１％
ゼラチン０゜０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ緩
衝液中、３７℃で７０分インキュベートした後、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ中３７℃で３０分イ
ンキュベートする操作を４回繰り返した。フィルターを
風乾した後、オートラジオグラフィーを行ったところ、
ラットＰ ４５０ＭＣとほぼ同じ泳動位置にＰ−４５
０ｃｄｄ ２のバンドが認められた。バンドの濃さから
、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株は菌体あたり少なくとも
２×１０’分子のＰ−４５０ｃｄｄ ２を産生している
ことが推定された。
ルアミドゲルを用いて電気泳動した。さらに、ゲル中の
タンパク質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＩＣＩＣｐＨ８゜３
）、 １９２ ｍＭグリシン−２０％メタノール中で電
気３％ゼラチン０，０５％ＴｌＡＩｅｅｎ ２０を含む
ＴＢＳｉｌ衝液中、３７℃で４０分インキュベートし、
さらに、３０μｇの精製抗−Ｐ−４５０ＭＣＩｇＧ、
１％ゼラチ′ン、 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０をふ
くむＴＢＳ中３７℃で２時間インキュベートした。その
後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む緩衝液中、３７
℃で３０分インキュベートする操作を４回繰り返した後
、３％ゼラチン、 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
ＴＢＳｔｌ衝液中に３７℃で２０分インキュベートした
。次に、２μＣｉの（１１５１）−プロティンＡ、１％
ゼラチン０゜０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ緩
衝液中、３７℃で７０分インキュベートした後、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ中３７℃で３０分イ
ンキュベートする操作を４回繰り返した。フィルターを
風乾した後、オートラジオグラフィーを行ったところ、
ラットＰ ４５０ＭＣとほぼ同じ泳動位置にＰ−４５
０ｃｄｄ ２のバンドが認められた。バンドの濃さから
、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株は菌体あたり少なくとも
２×１０’分子のＰ−４５０ｃｄｄ ２を産生している
ことが推定された。
実施例４ ヘムを含有するＰ−４５０ｃｄｄ ２の定量
サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙ
ｃｃｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ
２）株の培養００＋＋Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）に懸濁し、°２本のキュベツトに１ｍｌずつ分注
した。サンプル側のキュヘットに一酸化炭素を吹きこん
だ後、ｊ 、両キュベフト内にジチオナイト５〜１０ｍｇを添ｆ −加し、撹拌した後、２０分間放置した。その後、キュ
ベツト中の液を攪拌して４００〜５００ ｎｍＯ差スペ
クトルを測定し、Δε４４７〜４９０ ＝９１ｉ＋Ｍ−
’ｃｍ−’という大村、佐藤らの値を元にしてＰ−４５
０？！度を産出した。その結果、サツカロミセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） Ａ ＩＩ ２２ （ｐ ＡＣＤＤ２）株は菌
体あたり約１．５ ＸＩＯ’分子のヘムタンパク質を産
生じていることがわかった。
サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙ
ｃｃｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ
２）株の培養００＋＋Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）に懸濁し、°２本のキュベツトに１ｍｌずつ分注
した。サンプル側のキュヘットに一酸化炭素を吹きこん
だ後、ｊ 、両キュベフト内にジチオナイト５〜１０ｍｇを添ｆ −加し、撹拌した後、２０分間放置した。その後、キュ
ベツト中の液を攪拌して４００〜５００ ｎｍＯ差スペ
クトルを測定し、Δε４４７〜４９０ ＝９１ｉ＋Ｍ−
’ｃｍ−’という大村、佐藤らの値を元にしてＰ−４５
０？！度を産出した。その結果、サツカロミセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ） Ａ ＩＩ ２２ （ｐ ＡＣＤＤ２）株は菌
体あたり約１．５ ＸＩＯ’分子のヘムタンパク質を産
生じていることがわかった。
実施例５ 酵母菌体のアセトアニリド２位水酸化活性の
測定 ＳＤ合成培地中で約１．４Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／ ｍ
Ｉまで培養したサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ
２２（ｐ Ａ Ａ Ｈ５） 、ＡＨ２２（ｐＡＭｃｌ）
株および １．２×１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍ ＋まで培
養したＡＨ２２（ｐへ〇ＤＤ２）株の培養液中に１．５
Ｍアセトアニリド（メタノール溶液）を添加し、終濃度
２５ｍＭとした。
測定 ＳＤ合成培地中で約１．４Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／ ｍ
Ｉまで培養したサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ａ Ｈ
２２（ｐ Ａ Ａ Ｈ５） 、ＡＨ２２（ｐＡＭｃｌ）
株および １．２×１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍ ＋まで培
養したＡＨ２２（ｐへ〇ＤＤ２）株の培養液中に１．５
Ｍアセトアニリド（メタノール溶液）を添加し、終濃度
２５ｍＭとした。
その後、３０℃で振盪培養（１２０ｃｙｃｌｅ／ｌ１ｉ
ｎ ） Ｌ、ヰ負 出 ：Ａ２４５０− 流速： ２．Ｏｍ ｌ ／ｌ１ｌｉｎ 温 度：室温（２０〜２５℃） 培養０，４．７時間における菌体あたりのＰ−４５０含
ｆ（ハＡ Ｈ２２Ｃｐ 八ＭＣＩ ） 株カ約５．５Ｘ
１０’ 分子／菌体、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株が約
１．５×１ＯＳ分子／菌体であったが、コントロールＡ
Ｈ２２（ｐＡＡＨ５）株ではＰ−４５０は検出できな
かった。各々の株の活性からＡＨ２２（ｐＡＡ分子あた
りの活性はＡＨ２２（ｐＡＭＣＩ）株におけるＰ−４５
０ＭＣ１分子あたりの活性の約５〜６倍であることがわ
かった。
ｎ ） Ｌ、ヰ負 出 ：Ａ２４５０− 流速： ２．Ｏｍ ｌ ／ｌ１ｌｉｎ 温 度：室温（２０〜２５℃） 培養０，４．７時間における菌体あたりのＰ−４５０含
ｆ（ハＡ Ｈ２２Ｃｐ 八ＭＣＩ ） 株カ約５．５Ｘ
１０’ 分子／菌体、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株が約
１．５×１ＯＳ分子／菌体であったが、コントロールＡ
Ｈ２２（ｐＡＡＨ５）株ではＰ−４５０は検出できな
かった。各々の株の活性からＡＨ２２（ｐＡＡ分子あた
りの活性はＡＨ２２（ｐＡＭＣＩ）株におけるＰ−４５
０ＭＣ１分子あたりの活性の約５〜６倍であることがわ
かった。
実施例６ 酵母菌体の７−ニトキシクマリン０−脱エチ
ル化活性の測定 ＳＤ合成培地中で約１．２Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／ｍ
１まで培養したＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）、ＡＨ２２
（ｐＡＭｃｌ）株の培養液中に２Ｏｎ＋Ｍ７−ニトキシ
クマリン（５０％メタノール水溶液）を添加し、終濃度
０．５ ｉ＋Ｍとした。その後、３０℃で振盪培養し、
１時間ごとに０．２５ｍ １２ずつ分取し、遠心分離で
得た上清０，２ ｍ ｌに２０％トリクロロ酢酸２３．
５μ２クロロホルム１．Ｏｒ＋ｌ！を添加し、激しく攪
拌した。遠心分離後、クロロホルム層０．５５ｍ ｌに
２゜０ｍｌ１の０．ＯＩＮ Ｎ ａ ＯＨ−０，ＩＭ
Ｎ ａ Ｃ１水溶液を加えた後、激しく攪拌し、遠心分
離後、水層を励起波長３６６ｒｖ＋ 、 螢光波長４
５２止で螢光測定し、生成物７−ヒドロキシクマリンを
定量した。
ル化活性の測定 ＳＤ合成培地中で約１．２Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／ｍ
１まで培養したＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）、ＡＨ２２
（ｐＡＭｃｌ）株の培養液中に２Ｏｎ＋Ｍ７−ニトキシ
クマリン（５０％メタノール水溶液）を添加し、終濃度
０．５ ｉ＋Ｍとした。その後、３０℃で振盪培養し、
１時間ごとに０．２５ｍ １２ずつ分取し、遠心分離で
得た上清０，２ ｍ ｌに２０％トリクロロ酢酸２３．
５μ２クロロホルム１．Ｏｒ＋ｌ！を添加し、激しく攪
拌した。遠心分離後、クロロホルム層０．５５ｍ ｌに
２゜０ｍｌ１の０．ＯＩＮ Ｎ ａ ＯＨ−０，ＩＭ
Ｎ ａ Ｃ１水溶液を加えた後、激しく攪拌し、遠心分
離後、水層を励起波長３６６ｒｖ＋ 、 螢光波長４
５２止で螢光測定し、生成物７−ヒドロキシクマリンを
定量した。
その結果、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株におけるＰ−４
５０ｃｄｄ ２の１分子あたりの活性はＡＨ２２（ｐＡ
Ｍｃｌ）株におけるＰ−４５０ＭＣ１分子あたりの活性
の約１５％であることがわかった。上述したアセトアニ
リド２位水酸化活性はＰ−４５０ｄの方がＰ−４５０Ｍ
Ｃよりも高いことが既知であるが、７−ニトキシクマリ
ン〇−説エチル化活性は逆にＰ−４５０ＭＣのほうが高
いことが既知である。ここで得られた結果から、Ｐ−４
５０ｃｄｄ ２は Ｐ−４５０ｄの基質特異性を有する
と推測できる。
５０ｃｄｄ ２の１分子あたりの活性はＡＨ２２（ｐＡ
Ｍｃｌ）株におけるＰ−４５０ＭＣ１分子あたりの活性
の約１５％であることがわかった。上述したアセトアニ
リド２位水酸化活性はＰ−４５０ｄの方がＰ−４５０Ｍ
Ｃよりも高いことが既知であるが、７−ニトキシクマリ
ン〇−説エチル化活性は逆にＰ−４５０ＭＣのほうが高
いことが既知である。ここで得られた結果から、Ｐ−４
５０ｃｄｄ ２は Ｐ−４５０ｄの基質特異性を有する
と推測できる。
第１図は、ｐＡＣＤＤ２の塩基配列およびアミノ酸配列
を示す図である。 第２図はプラスミドｐＡＣＤＤ２の構築の概略を示す。 Ｓａ、 Ｐ、 Ｂ、 ＳＬ、 Ｈはそれぞれ制限酵素５
ａｌｌ。 ＰｓＬＴ、 Ｂａｌ Ｔ、 ５ｔｕｌ、旧ｎｄｎｌの切
断部位を示す。 第３図はＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２） 、ΔＨ２２（ｐへ
ＭＣＩ）株の培養液中の生成アセトアミフェン濃度（ｎ
ｍｏｌ／ｎ＋１）及び菌体濃度（Ｘ １０’ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ）の経時変化を示したものである。 閣９口は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株のアセ
トアミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 ム、△は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＭｃｌ）のアセトア
ミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 第４図は、各菌株の培養液中の生成７−ヒドロキシクマ
リン濃度及び菌体濃度の経時変化を第３図と同様に示し
た図である。 完 門ｒｌ＋ 門「１１１＋ＩＭＩ＾ 門−ｈ 門【つ−
つ手続補正書（自発） 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年 特許側 第７６６３３号 ２、発明の名称 キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号１００ ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１） 明細書第８頁第１１行目に、 「デヒドロゲナーゼ■遺伝子」とあるを「デヒドロゲナ
ーゼｌ （以下Ａ Ｄ Ｈ１と略称する）遺伝子」と訂
正する。 （２） 明細書第８頁第１６行目に、 ［方法により製造できる）」とあるを 「方法により製造できる。 なお、酵母Ａ Ｄ Ｈ１遺
伝子プロモーターは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｒｅ５
ｅａｒｃｂＦｏｕｎｄａ Ｌ ｔｏｎの米国特許出願第
２９９．７３３に含まれており、米国において、工業的
、商業目的で使用する場合は、権利者からの権利許諾を
必要とする。）と」と訂正する。 （３） 同第５頁第５行目、同第１０頁第６行〜７行目
に［特願昭５９−１２２９５３Ｊとあるを「特開昭６ｌ
−８８１１７８Ｊと訂正する。 （４） 同第７頁第７行目〜８行目に［特願昭５９−１
６９４４７ｊとあるを［特開昭６１−５２２８４」と訂
正する。 （５） 同第１２頁第１８行目〜２１行に「酵母発現ベ
クターｐ Ａ Ａ Ｈ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ 、、
、。 ００９．製造できる）」とあるを 「酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｊと訂正する。 以上
を示す図である。 第２図はプラスミドｐＡＣＤＤ２の構築の概略を示す。 Ｓａ、 Ｐ、 Ｂ、 ＳＬ、 Ｈはそれぞれ制限酵素５
ａｌｌ。 ＰｓＬＴ、 Ｂａｌ Ｔ、 ５ｔｕｌ、旧ｎｄｎｌの切
断部位を示す。 第３図はＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２） 、ΔＨ２２（ｐへ
ＭＣＩ）株の培養液中の生成アセトアミフェン濃度（ｎ
ｍｏｌ／ｎ＋１）及び菌体濃度（Ｘ １０’ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ）の経時変化を示したものである。 閣９口は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株のアセ
トアミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 ム、△は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＭｃｌ）のアセトア
ミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 第４図は、各菌株の培養液中の生成７−ヒドロキシクマ
リン濃度及び菌体濃度の経時変化を第３図と同様に示し
た図である。 完 門ｒｌ＋ 門「１１１＋ＩＭＩ＾ 門−ｈ 門【つ−
つ手続補正書（自発） 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年 特許側 第７６６３３号 ２、発明の名称 キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号１００ ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１） 明細書第８頁第１１行目に、 「デヒドロゲナーゼ■遺伝子」とあるを「デヒドロゲナ
ーゼｌ （以下Ａ Ｄ Ｈ１と略称する）遺伝子」と訂
正する。 （２） 明細書第８頁第１６行目に、 ［方法により製造できる）」とあるを 「方法により製造できる。 なお、酵母Ａ Ｄ Ｈ１遺
伝子プロモーターは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｒｅ５
ｅａｒｃｂＦｏｕｎｄａ Ｌ ｔｏｎの米国特許出願第
２９９．７３３に含まれており、米国において、工業的
、商業目的で使用する場合は、権利者からの権利許諾を
必要とする。）と」と訂正する。 （３） 同第５頁第５行目、同第１０頁第６行〜７行目
に［特願昭５９−１２２９５３Ｊとあるを「特開昭６ｌ
−８８１１７８Ｊと訂正する。 （４） 同第７頁第７行目〜８行目に［特願昭５９−１
６９４４７ｊとあるを［特開昭６１−５２２８４」と訂
正する。 （５） 同第１２頁第１８行目〜２１行に「酵母発現ベ
クターｐ Ａ Ａ Ｈ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ 、、
、。 ００９．製造できる）」とあるを 「酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｊと訂正する。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣの酵母ミクロ
ソームへの局在化を司る領域を含むアミノ酸末端側領域
と、その後に結合された他の分子種のチトクロムＰ−４
５０の対応するＣ末端側領域とからなるキメラＰ−４５
０遺伝子 （２）ラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子とラッ
ト肝チトクロムＰ−４５０ｄ遺伝子から構築された特許
請求の範囲第１項記載のキメラチトクロムＰ−４５０遺
伝子 （３）第１図に記載のアミノ酸配列で特定される特許請
求の範囲第１項記載のキメラチトクロムＰ−４５０遺伝
子 （４）第１図に記載の塩基配列で特定される特許請求の
範囲第１項記載のキメラチトクロムＰ−４５０遺伝子 （５）ラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣの酵母ミクロ
ソームへの局在化を司る領域を含むアミノ酸末端側領域
と、その後に結合された他の分子種のチトクロムＰ−４
５０の対応するＣ末端側領域とからなるキメラチトクロ
ムＰ−４５０遺伝子を含み該遺伝子を酵母菌体内で発現
させる酵母発現プラスミド （６）キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子がラット肝チ
トクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子とラット肝チトクロムＰ
−４５０ｄ遺伝子から構築されたキメラチトクロムＰ−
４５０遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第
５項記載の酵母発現プラスミド （７）キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子が第１図に記
載のアミノ酸配列で特定されることを特徴とする特許請
求の範囲第５項記載の酵母発現プラスミド （８）キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子が第１図に記
載の塩基配列で特定されることを特徴とする特許請求の
範囲第５項記載の酵母発現プラスミド （９）ｐＡＣＤＤ２と名付けた特許請求の範囲第５項記
載の発現プラスミド （１０）ラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣの酵母ミク
ロソームへの局在化を司る領域を含むアミノ酸末端側領
域と、その後に結合された他の分子種のチトクロムＰ−
４５０の対応するＣ末端側領域とからなるキメラチトク
ロムＰ−４５０遺伝子を含む酵母発現プラスミドで形質
転換されキメラチトクロムＰ−４５０を菌体内で産生す
る酵母菌株（１１）キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子
がラット肝チトクロムＰ−４５０ＭＣ遺伝子とラット肝
チトクロムＰ−４５０ｄ遺伝子から構築されたキメラチ
トクロムＰ−４５０遺伝子であることを特徴とする特許
請求の範囲第１０項記載の酵母菌株 （１２）キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子が第１図に
記載のアミノ酸配列で特定されることを特徴とする特許
請求の範囲第１０項記載の酵母菌株 （１３）キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子が第１図に
記載の塩基配列で特定されることを特徴とする特許請求
の範囲第１０項記載の酵母菌株（１４）サッカロミセス
・セレビシェーＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）と名付けた特
許請求の範囲第１０項記載の酵母菌株 （１５）ラット肝チトクロムＰ−４５０ＨＣの酵母ミク
ロソームへの局在化を司るアミノ酸末端側領域とその後
に結合された他の分子種のチトクロムＰ−４５０の対応
するＣ末端側領域とからなるキメラチトクロムＰ−４５
０ （１６）第１図に記載のアミノ酸配列で特定される特許
請求の範囲第１５項記載のキメラチトクロＰ−４５０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61076633A JPH0636744B2 (ja) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61076633A JPH0636744B2 (ja) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62236485A true JPS62236485A (ja) | 1987-10-16 |
| JPH0636744B2 JPH0636744B2 (ja) | 1994-05-18 |
Family
ID=13610778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61076633A Expired - Lifetime JPH0636744B2 (ja) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0636744B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01261398A (ja) * | 1988-04-13 | 1989-10-18 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62104583A (ja) * | 1985-10-31 | 1987-05-15 | Agency Of Ind Science & Technol | 複数のチトクロムｐ−４５０遺伝子から構築したキメラチトクロムｐ−４５０遺伝子、およびそれを含む酵母内発現用プラスミドとその製造法、ならびに菌体内にそれらのプラスミドを保有する酵母菌株 |
-
1986
- 1986-04-04 JP JP61076633A patent/JPH0636744B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62104583A (ja) * | 1985-10-31 | 1987-05-15 | Agency Of Ind Science & Technol | 複数のチトクロムｐ−４５０遺伝子から構築したキメラチトクロムｐ−４５０遺伝子、およびそれを含む酵母内発現用プラスミドとその製造法、ならびに菌体内にそれらのプラスミドを保有する酵母菌株 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01261398A (ja) * | 1988-04-13 | 1989-10-18 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0636744B2 (ja) | 1994-05-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |