DK175036B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved dyrkning af en transformeret mikroorganisme, en transformeret mikroorganisme egnet dertil og DNA-sekvenser, som er egnede til fremstilling af en sådan mikroorganisme - Google Patents

Description

DK 175036 B1 o

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til mikrobiologisk at fremstille oxidoreduktaser, disse enzymers anvendelse i blege- og/eller rengøringsmidler, især vaskemidler, samt mikroorganismer transformeret ved hjælp af 5 DNA-sekvenser, som koder for en oxidoreduktase og eventuelt for et dihydroxyacetonesyntaseenzym, og H. Polymor-pha alkoholoxidase- og/eller -dihydroxyacetonesyntasere-gulerende sekvenser, hvilke mikroorganismer er velegnede til brug ved fremgangsmåden.

10 Oxidoreduktaser, navnlig dem, der udnytter oxygen som elektronacceptor, er enzymer, der er velegnede til brug i blege- og/eller rengøringsmidler, hvori de kan anvendes til in situ dannelsen af blegestoffer, f.eks. h2°2' under vaske- eller blegeprocessen. Se f.eks. beskri-15 sen til britisk patent nr. 1.225.713, Colgate-Palmolive

Company), hvori brugen af en blanding af glucose og glu-coseoxidase og andre bestanddele i et tørt pulverformigt rengøringsmiddel er beskrevet, tysk fremlagt ansøgning 2.557.623 {Henkel & Co.

20 GmbH), hvori brugen af en C^-C^-alkanol og alkoholoxidase eller galactose og galactose-oxidase eller urinsyre og uratoxidase og andre bestanddele i et tørt rengøringsmiddel med blegende egenskaber er beskrevet, samt. britisk patentansøgning nr. 2.101.167 {Unilever 25 PLC) , hvori brugen af en C^-^-alkanol og en c^-^-alka-noloxidase i et flydende blege- og/eller rengøringsmiddel er beskrevet, hvor alkanolen og enzymet er ude af stand til væsentlig indbyrdes bivirkning, før midlet fortyndes med vand og/-30 eller er kommet i kontakt med tilstrækkelig oxygen.

Indtil nu har naturlige oxidaseenzymer ikke kunnet fremstilles til en kostpris, som tillader industriel anvendelse i stor skala, dvs. i form af rengøringsprodukter. I øvrigt skal oxidaseenzymerne virke, under 35 ikke-fysiologiske betingelser, når de bruges i rengørings-

O

2 DK 175036 B1 og blegeprodukter. Endvidere er de naturlige oxidaser, som er blevet undersøgt til brug i rengøringsmidler, ledsaget af det naturlige catalase-enzym, som dekomponerer næsten umiddelbart, når peroxidet eller peroxiderne dan-5 nes, således at der ikke opnås nogen effektiv blegning.

Der består således et behov for oxidaseenzymer, som er mere velegnet til anvendelse under de fremstillingsbetingelser og brugsbetingelser, som gælder for rengørings- og blegeprodukter.

10 For at opnå en økonomisk gennemførlig produktion af disse oxidaser kræves det endvidere at nå op på et udbytte af disse enzymer ved forgæringsfremgangsmåder af en størrelsesorden som for alkoholoxidase fra H. polymor-pha.udgør op til 20% af det cellulære protein (jfr. Van 15 Dijken m.fl., 1976).

En måde til at finde frem til nye mikroorganismer, der frembringer enzymer i højere mængder, eller til at finde frem til nye oxidaseenzymer med forbedrede egenskaber går ud på at efterprøve alle slags mikroorganismer 20 og forsøge at isolere de relevante oxidaser, som derefter kontrolleres for deres evene til at frembringe peroxider og deres stabilitet under de betingelser, som gælder for fremstilling og brug af rengøringsmidler og blegeprodukter. Man kan håbe på, at der så en dag vil bli-25 ve fundet et velegnet emzym; men chancen for at få held hermed er uforudsigelig og sandsynligvis meget lav.

En anden metode går ud på at anvise en anden prøve-fej lemetode, nemlig ved at krydse naturlige mikroorganismer, som frembringer disse oxidaser, ved klassisk ge-30 netisk teknik, nemlig i det håb, at man en dag vil finde en mere produktiv mikroorganisme eller et mere hensigtsmæssigt enzym; men at der her er chancen for succes forholdsvis lav.

Der består derfor tydeligvis et behov for en frem-35 gangsmåde til at. fremstille oxidaseenzymer i højere udbyt-

O

3 DK 175036 B1 te og/eller uden samtidig dannelse af catalase og/eller med forbedrede egenskaber under opbevaring og/eller brug i bl.a. blege- og/eller rengøringsmidler. Problemet med prøve-fejlemetoden kan overvindes ved en fremgangsmåde 5 til fremstilling af et oxidaseenzym ved at dyrke en mikroorganisme under hensigtsmæssige betingelser og fortrinsvis koncentrere enzymet og indsamle det koncentrerede enzym på i og for sig kendt måde, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes en mikroorganis-10 me, som er frembragt ved rekombinant DNA-teknologi, og som er i stand til at producere det omhandlede oxidaseenzym.

Mikroorganismerne, som er velegnede til brug ved en fremgangsmåde til fremstilling af et oxidaseenzym, 15 kan fås ved rekombinant DNA-teknologi, hvorved en mikroorganisme transformeres ved hjælp af en DNA-sekvens, som koder for et oxidaseenzym (et såkaldt strukturgen), sammen med en eller flere andre DNA-sekvenser, der regulerer strukturgenets ekspression i en særlig mikroorganis-20 me eller gruppe af organismer, enten via indførelse af en episomal vektor indeholdende disse sekvenser eller via en vektor indeholdende de omhandlede sekvenser, som også er udstyret med DNA-sekvenser, der er i stand til at integreres i mikroorganismens kromosom.

25 Bestemmelsen af et strukturgen, som koder for en zymet alkoholoxidase (EC 1.1.3.13), som stammer fra H. po-lymorpha, sammen med dets regulerende 51- og 3'-flankerende regioner skal beskrives som eksempel på den foreliggende opfindelse, idet det dog vil forstås, at opfindelsen 30 ikke herved skal begrænses til udelukkende at angå dette eksempel. Opfindelsens ånd og ramme kan også anvendes på isolationen af DNA-sekvenser fra andre oxidaseenzymer såsom glyceroloxidase, glucoseoxidase, D-aminosyreoxidase osv., ligesom opfindelsen kan anvendes på inkorporeringen 35 af DNA-sekvenserne eller modifikationer deraf i mikroorga-

I DK 175036 B1 I

I 4 I

I ° I

I nismers genom eller i episomale vektoerer, som anvendes I

I til at transformere mikroorganismer, samt på dyrkningen I

I af de således opnåede transformerede mikroorganismer som I

I sådanne, eller- opfindelsen kan udnyttes på frembringel- I

I 5 sen af de ønskede oxidaseenzymer samt på anvendelsen af I

I disse enzymer i blegemidler med indhold heraf. I

I Selv om de mikroorganismer, der skal anvendes, kan I

I være bakterier, f.eks. af slægten Bacillus, såvel som for- I

I skellige mugarter, foretrækkes dog brugen af gærarter, I

I io nemlig af såvel teknologiske som økonomiske grunde. I sær- I

I deleshed kan en mug eller gær udvælges blandt slægterne I

I Aspergillus, Candida, Geotrichum, Hansenula, Lenzi.tes, I

I Nadsonia, Pichia, Poria, Polyporus, Saccharomyces, Sproro- I

I bolomyces, Torulopsis, Trichosporon og Zendara, men især I

I 15 blandt arterne A. japonicus, A. niger, A. oryzae, C. boi- I

I dinii, H. polymorpha, Pichia pastoris og Kloeckera sp. I

I 2201. Sidstnævnte navn anvendes i stedet for betegnelsen I

I C. boidinii. I

I Mange gærarter, der udnytter C^, er blevet isole- I

I 20 ret inden for det sidste tiår, og for Hansenula polymorpha I

I og Candida boidinii er deres methanolstofskifte blevet un- I

dersøgt extensivt (vedrørende en oversigt henvises til I

Venhuis m.fl., 1983). I

Det første trin ved denne metabolisme (stofskifte) I

25 er oxidationen af methanol til formaldehyd og H2O2 kata- I

lyseret ved hjælp af MOX. Formaldehyd oxideres endvidere I

ved indvirkning af formaldehyddehydrogenase og formiatde- I

I hydrogenase. H2O2 spaltes til vand og oxygen ved hjælp af I

catalase. I

30 Alternativt assimileres methanol i cellulær mate- I

riale. Efter dens omdannelse til formaldehyd fikseres I

dette produkt ad xylulosemonophosphatvejen i carbonhydra- I

ter. Dihydroacetonesynthase (DHAS) spiller en afgørende I

rolle ved denne assimileringsproces. I

35 Forekomsten af MOX, formiatdehydrogenase, formal- I

O

5 DK 175036 B1 dehyddehydrogenase, DHAS og catalase er udsat for gluco-serepression (undertrykkelse), f.eks. på O,5%'s glucose* Imidlertid bliver syntesen af MOX fortrængt den anden vej ved glucoses vækst i lave koncentrationer (0,1%), 5 hvilket er i modsætning til syntesen af DHAS, der stadig undertrykkes fuldstændigt under disse betingelser (Rog-genkampm.fi. 1984).

Styring eller regulering, dvs. muligheden for at tilslutte eller afbryde genet for det pågældende poly-10 peptid, er ønskelig, fordi dette tillader biomasseproduktion, når en sådan ønskes, ved at udvælge et hensigtsmæssigt substrat som f.eks. melasse, og produktion af det pågældende polypeptid, når dette ønskes, ved at anvende methanol eller blandinger af methanol og andre carbon-15 kilder. Methanol er et forholdsvis billigt substrat, og derfor kan polypéptidfremstillingen gennemføres på meget økonomisk måde.

Efter derepression (ophævelse af undertrykkelse) af det gen, som koder for alkoholoxidase (MOX), ved hjælp 20 af vækst på methanol dannes der store mikrolegemer, per-oxisomer. Medens celler dyrket på glucose kun indeholder et lille peroxisom, er op til 80% af cellens indre rumfang erstattet med peroxisomer i den derepresserede tilstand. Methanols omdannelse til formaldehyd og H2O såvel 25 som nedbrydningen af H202er påvist at forekomme i disse peroxisomer, medens yderligere oxidation eller assimilation af formaldehyd mest sandsynligt foregår i cytoplas-maen. Denne proces er et fuldendt eksempel på opdelingen af giftige produkter, på en stærk koordineret dere-30 pression af flere forskellige cellulære processer og af den selektive translokation af mindst to af de enzymer, der indgår i denne proces.

De fleste af de enzymer, som indgår i methanol-stofskiftet, er blevet renset og karakteriseret (Sahm,

35 1977 og Bystrykh m.fl. 1981). Især methanoloxidase (EC

6

O

DK 175036 B1 1.1.3.13) er blevet detaljeret undersøgt. Det er en oc-tamer bestående af identiske monomere med en M^-værdi på ca. 74 kd, og den indeholder FAD som prosthetisk gruppe.

Indtil nu har ingen fraspaltelig signalsekvens for trans-5 lokation kunnet påvises således som konkluderet på grundlag af elektroforeseundersøgelser gennemført ved· produkter syntetiseret in vivo og in vitro (Roa og Biobel, 1983) eller ud fra in vitro syntese i nærværelse af mikrosomale membraner (Roggenkamp m.fl., 1984).

10 Under derepressionsbetingelser, dvs. hvor under trykkelsen er mere eller mindre ophævet igen, består op til 20% af det cellulære protein af MOX.

Materialer og metoder 15 a) Mikroorganismer og dyrkningsbetingelser

Hansenula polymorpha CBS 4732 fås fra dr. J.P. van Dijken (University of Technology, Delft, Holland). Celler dyrkes ved 37°C i 1 liters Erlenmeyer-kolber indeholdende 300 ml minimalt medium (Vennhuis m.fl. 1978) suppleret 20 med 0,5% (efter rumfang/rumfang (methanol) eller 0,5% (efter rumfang/rumfang (ethanol) således som indiceret. Phag lambda L47.1 og den P2-lysogene E. coli K12-stamme Q 364 fås fra dr. P. van der Elsen (Free University of Amsterdam, Holland) og propageres som beskrevet (Loenen og 25 Brammar, 1980).

E. coli Kl2-stammerne BHB 2600, BHB 2688 og BHB 2690 (Hohn, 1979) fås fra dr. M. van Montagu (Gent universitet, Belgien), medens E. coli K12 stamme JM 101.7118 og M13 derivaterne M13 mp 8, 9, 18 og 19 fås fra Bethesda - 30 Research Laboratories Inc. (Gaithersburg, MD, USA), b) Enzymer

Alle anvendte enzymer fås fra Amersham International PLC, Amersham, England, med undtagelse af a-heli-case, der fås fra Pharm Industri, Clichy, Frankrig. Der 35 gennemføres enzyminkubationer ifølge fabrikanternes in- 7 DK 175036 B1 o struktioner. ATP:RNA adenyltransferase renses således som beskrevet af Edens m.fl. (1982). c) Andre materialer [35S) methionin, [a-35S] dATP, [a-32P] dNTP’er, 32 32 5 [α- P] ATP og [γ- 0] ATP fås fra Amersham Internatio nal PLC, Amersham, England.

Nitrobenzyloxy-methylpapir (NBM) fås fra Schleicher og Schuell og omdannes til diazoformen (DBM) i henhold til fabrikantes instruktioner.

10 Nitrocellulosefiltere (type HATF) fås fra Milli- pore.

RNA-isolation, fraktionering og analyse

Hansenula polymorpha-celler dyrkes til den mid-15 exponentielle fase, enten i nærværelse af methanol eller ethanol. Celler opbrydes ved at tvinges gentagne 2 gange gennem en French-presse ved et tryk på 1125 g/cm i en puffer indeholdende 10 mM tris-HCl med pH 8, 5 mM MgC^/ 1% NaCl, 6% para-aminosalicylsyre, 1% natriumdo-20 decylsulfat (SDS) og 5% phenol. Rensningen af polyadeny-leret RNS gennemføres derefter således som tidligere beskrevet (jfr. Edens m.fl., 1982). 1 g celler giver i 4 mg totalt RNA og 0,1 mg polyadenyleret RNA. Prøver på 5 mg total RNA eller polyadenyleret RNA mærkes radioak- 25 tivt ved deres 3'-ender med ATP:RNA adenyltransferase og 32 [a-. P] ATP og adskilles derefter på en 2,5%'s polyacryl-amidgel indeholdende 7 M urinstof (jfr. Edens m.fl., 1982).

Til præparativ isolation af en specifik mRNA-fraktion blandes 40 jig polyadenyleret RNA med 4 pg mærket polyadenyle-30 ret RNA og fraskilles på den denaturerende polyacrylamid-gel. Den radioaktive 2,4 kilobase RNA-klasse elueres fra skiver af gelen og befries for urenheder ved centrifugering gennem en 5-30%’s glycerolgradient i 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCL, pH 7,5, 1 mM EDTA og 0,1% SDS i 15 timer 35 ved 24.000 omdr./minut i en Beckman-centrifuge under an- 8 0 DK 175036 B1 vendelse af en SW 60-rotor og ved en temperatir på 20°C.

De radioaktive fraktioner hældes sammen og fældes med ethanol. Polyadenyleret RNA translateres in vitro i et kaninreticulocytlysat ifølge den af Pelham og Jackson 5 (1976) anviste teknik under anvendelse af [^S] methio- nin som precursor (forstadie). Translationsprodukterne immunfældes med MOX-antiserum således således som beskrevet af Velerio m.fl. (1983).

10 cDNA-syntese

En trediedel af RNA-fraktionen isoleret fra po-lyacrylamidgelen anvendes til at fremstille et radioaktivt cDNA med omvendt transcriptase (Edens m.fl., 1982).

32 32

Under anvendelse af [α- P] dATP og ta- P] dCTP med 15 højspecifik aktivitet (mere end 3.000 Co/mM) dannes 20.000 cpm cDNA med høj molekylvægt i løbet af 1 time ved 42°C i nærværelse af human placenta-nucleaseinhibi-tor.

2° DNA-isolation 10 g Hansenula polymorpha celler vaskes med 1 M sorbitol og suspenderet påny i 100 ml 1,2 M sorbitol, 10 mM EDTA og 100 mM citronsyre, pH 5,8, hvortil er sat 100 jil (3-mercaptoethanol. Cellerne spheroplasteres ved 25 inkubation med 500 mg α-helicase i 1 time ved 30°C. Der indsamles spheroplaster ved centrifugering med 4000 omdr./-minut i en Sorvall GSA-rotor, og de suspenderes påny i 40 ml 20 mM tris-HCl pH 8, 50 mM EDTA og lyseres ved tilsætning af 2,5% SDS. Ufuldstændigt lyserede celler pelle-30 tiseres i 30 minutter ved 20.000 omdr./min. i en Sorvall SS34-rotor, og DNA isoleres fra den viskose væskeoverfa-se ved centrifugering under anvendelse af en CsCl-ethi-diumbromiddensitetsgradient ved 35.000 omdr./min. i 48 timer i en Beckman centrifuge under anvendelse af en 35 60 Ti-rotor. Der isoleres 2 mg DNA med en middellængde 30 kb.

i 0 9 DK 175036 B1

Fremstilling af en klonbank i phag lambda L47.1 150 pg Hansenula polymorpha DNA fordøjes delvis med Sau3AI og sedimenteres gennem en 10-40%'s saccharo-segradient i l'M NaCl, 20 mM tris-HCl, pH 8, og 5 niM 5 EDTA i 22 timer ved 23.000 omdr./min. i en SW 25-rotor. Gradienten fraktioneres, og prøver af fraktionerne adskilles på en 0,6%'s agarosegel i TBE puffer (89 mM tris, 89 mM borsyre og 2,5 mM EDTA).

Fraktioner, som indeholder DNA på 5-20 kb, hæl-10 des sammen, og DNA'et fældes med ethanol. Phag lambda L47.3 dyrkes, og dets DNA isoleres således som beskrevet af Ledeboer m.fl. (1984). DNA'et fordøjes med BamHI, og der isoleres arme ved centrifugering gennem en kali-umacetatgradient således som beskrevet af Maniatis m.fl; 15 (1982).

2 pg phag lambda DNA-arme og 0,5 pg med Sau3AI fordøjet Hansenula polymorpha DBA opnået på denne måde ligateres og pakkes in vitro under anvendelse af fremgangsmåden som beskrevet af Hohn (1979) . Phager udpla-20 des på E. coli stamme Q 364 til en pladedensitet på 20.000 pfu pr. 14 cm petriskål. Der foretages pladeaftryk (ved blotting-teknik) på et nitrocellulosefilter (Benton og Davis, 1977), og aftrykket hybridiseres med den således som ovenfor beskrevet isolerede cDNA-sonde.

25 Hybridiseringsbetingelserne er de samme som beskrevet af Ledeboer m.fl. (1984), og hybridiserende plader påvises ved hjælp af autoradiografi.

Isolation og delvis analyse af aminosyresekvens hos al-30 koholoxidase (MOX)

Hansenula polymorpha celler dyrket på methanol sønderbrydes ved ultralydbehandling (ultrasonisk), og cellebrokkerne fjernes ved centrifugering. Den MOX-hol-dige proteinfraktion isoleres ved fældning med (NH^jSO^ 35 (40-60%'s mætning). Efter dialyse af bundfaldet skilles

DK 175036 B1 I

MOX fra catalase og andre proteiner ved ionbytningschro- I

matografi (DEAE-sepharose) og gelfiltrering (Sephacryl I

S-400). Antistoffer over for Mox opdrættes i kaniner ved I

konventionelle' metoder under anvendelse af fuldstændigt I

5 og ufuldstændigt Freund's adjuvans {fra Difco Lab., De- I

troit, USA). Sekvensanalyse af alkoholoxidase behandlet I

med permyresyre gennemføres på en Beckman-sekvenator. I

Identifikation af resterne foretages med højtydende væ- I

skechromatografi (HPLC). Aminosyresammensætningen bestem- I

10 mes på en Chroraaspek analysator (fra Rank Hilger, England) I

under anvendelse af standardmetoder og ved farvning med I

ninhydrin. Den carboxyterminale aminosyre bestemmes sale- I

des som beskrevet af Ambier (1972) . I

15 Kemisk syntese af deoxyoligonucleotider I

Deoxyoligonucleotider syntetiseres på en Biosearch I

SAM I genmaskine under anvendelse af phosphit-teknik (iføl- I

ge Matteucci og Caruthers, 1981). De renses på 16-20%'s I

polyacrylamidgeler i TBE. I

Hybridisering med deoxyoligonucleotid-sonder I

Deoxyoligonucleotiderne mærkes radioaktivt med T4~ I

-polynucleotidkinase og [γ-^Ρ] ATP. De opnåede MOX-klo- I

ners DNA nedbrydes delvis (digereres) ved fordøjning med I

25 forskellige restriktionsenzymer, adskilles på 1%'s agaro- I

segel, og der foretages aftryk på DBM-papir (blotting). I

Der gennemføres hybridiseringer således som beskrevet af I

Wallace m.fl. (1981) . I

30 DNA sekvensanalyse I

Fra klon nr. 4 (se nedenstående eksempel 1), der I

indeholder det fuldstændige MOX-gen laves flere forskel- I

lige underkloner i phag Ml3mp-8, -9 eller Ml3mp-18, -19 I

-derivater ved standardteknik. Små underkloner (på mindre I

35 end 0,5 kb) klonet i to orienteringer udtages i sekvens- I

11 DK 175036 B1 o ser direkte fra begge sider. Fra de større underkloner, der også klones i to orienteringer, fås sekvensdata ved hjælp af en exonuclease Bal31-fordøjelsesstrategi (jfr. tegningens fig\ 1). For hver af de to klonede oriente-5 ringer fordøjes RF M13 DNA med et restriktionsenzym, som fortrinsvis kun spalter i midten af indsatsen. Derefter afskæres begge klonernes orienteringer på dette særegne sted og fordøjes med exonuclease Bal31 med forskellige tidsintervaller. Inkubationstider og betingelser vælges 10 således, at der elimineres ca. 100 til 150 nucleotider i løbet af hvert af disse tidsintervaller. Hver fraktion fordøjes derefter med restriktionsenzymet, som genkender restriktionsstedet, der befinder sig nær ved den stilling eller position, i hvilken sekvensreaktionen påbegyndes 15 hos Ml3-derivaterne. Ender afskæres stumpt ved inkubation med -polymerase, og alle dNTP'er og hele blandingen li ga teres under fortyndede betingelser, hvorved dannelsen af interne RF-molekyler begunstiges. Hele ligationsblandingen anvendes til at transformere E. coli stamme JM 20 101-7118. Fra hvert enkelt tidsinterval opsamles flere forskellige plader og sekvensbestemmes under anvendelse af de for nylig beskrene modifikationer ifølge Sanger's sekvensbestemmelsesprotokol (Biggin m.fl., 1983).

25 Isolationen af auxotrope mutanter LEU-1 (CBS nr. 7171) er et auxotropt derivat af H. polymorpha stamme NCYC 495, der mangler β-isopropyl-malat-dehydrogenaseaktivitet. Denne mutants isolation er allerede beskrevet af Gleeson m.fl. (1984).

30 LR9 (CBS nr. 7172) er et auxotropt derivat af H. polymorpha ATCC 34438, der mangler orotidin-5'-decarb-oxylaseaktivitet.

Til isolationen gennemføres alle procedurer ved 30°C i stedet for ved 37°C, der er den optimale tempera-35 tur for denne gærarts vækst. Gærceller mutageniseres med 0 12 DK 175036 B1 3%'s ethylmethansulfonat i 2 timer (Fink 1970). Reaktionen standses med 6%'s natriumthiosulfat (slutkoncen-tration), og opløsningen inkuberes i endnu 10 minutter.

Muta geni serede' celler vaskes derpå én gang med H20 og 5 inkuberes i 2 dage på YEPD eller YNB suppleret med uracil til opnåelse af segregering og berigelse af uracil--auxotrofer efterfulgt af 15 timers dyrkning på MM uden nitrogenkilde. Til slut anvendes en nystatinberigelse i 12 timer på MM med en koncentration på 10 pg antibio-10 tikum pr. ml. De behandlede celler udplades på UNB-pla-der indeholdende 200 pg uracil pr. ml og 0,8 mg 5-fluor-orotinsyre (Boeke m.fl., 1984). Sædvanligvis udplades 10 6 celler på én enkelt plade. Resistente kolonier opsamles efter 3 dage til inkubation, replikater udplades 15 to gange på YNB-plader for at etablere auxotrofien. Fra de auxotrofe mutanter isoleres ura -celler. Alternativt inkuberes 1,5 x 10^ gærceller i 1 ml YNB-væskemedium suppleret med 200 pg uracil og 0,8 mg fluoroorotinsyre.

Efter inkubation i 2 dage udplades de behandlede celler 20 på YNB indeholdende uracil, replika-plades to gange på YNB og analyseres som beskrevet ovenfor.

Sådanne resistente mutanter er vist at være ura-cil-auxotrofer, som påvirkes ved URA3- eller URA5-stedet i S. Cerevisiae (jfr. F. Lacroute, personal communication).

25 Af ca. 600 afprøvede resistente kolonier af H. polymorpha udviser 52 en uracil phenotype. Da URA3- og URA5-mutatio-ner i S. cerevisiae mangler henholdsvis orotin-51-decarboxylase og orotin-51-phosphatpyrophosphorylase (Jones og Fink, 1982), afprøves de opnåede uracil auxotrofer af H.

30 polymorpha for begge enzymatiske aktiviteter (Lieberman m.fl., 1955). Mutanter, som påvirkes i nogen af de to enzymer, er fundet (jfr. tabel I nedenfor). De er blevet betegnet henholdsvis odel- og oppl-mutanter. odel-mutanterne udviser passende lave reversionsfrekvenser (jfr. tabel II 35 nedenfor) og er således velegnede til transformationsfor-

O

13 DK 175036 B1 mål ved komplementdannelse.

Isolation af autonome replikationssekvenser (HÅRS) fra H. polymorpha ' 5 Kromosomal DNA fra H. polymorpha fordøjes delvis med enten Sall og BamHI og ligateres ind i det enkelte respektive Sall- og BamHl-sted hos det integrative plasmid YIp5. Ligationsblandingen anvendes til at transformere E. coli 490 til ampicillinresistens. YIp5 er et in-10 tegrativt plasmid indeholdende URA3-genet som selektiv markør (Stinchcomb m.fl., 1980).

Plasmidpuljen af H. polymorpha Sall-kloner anvendes til at transformere H. polymorpha mutant LR9. Der fås i alt 27 transformanter, som også er positive ved 15 den biologiske 3-lactamaseprøve. Fra alle disse kan plas-mider udvindes efter transformation af E. coli 490 med gærminilysater. Restriktionsanalyse af plasmiderne afslører, at de fleste af indsætningerne viser samme mønster.

De to forskellige plasmider pHARSl og pHARS2, som inde-20 holder indsatser på henholdsvis 0,4 og 1,6 kb, anvendes til yderligere undersøgelser (jfr. fig. 2) . Begge plasmider transformerer H. polymorpha mutant LR9 med en frekvens på ca. 500 til 1500 transformanter pr. jig DNA under anvendelse af transformationsproceduren for intakte 25 celler behandlet med polyethylenglycol. Southern analyse af H. polymorpha transformanter efter fornyet transformation med pHARSl og pHARS2 udvundet fra E. coli plas-midpræparater viser de forventede plasmidbånd og udelukker således integration af URA3-genet som grund til ura-30 cil-protofien. Det må derfor konkluderes, at HARS-sekven-ser ligesom ARSI (Stinchcomb m.fl., 1982) tillader autonom replikation i H. polymorpha. Hverken HARS1 eller HARS2 muliggør autonom replikation i S. cerevisiae. HARS1 er fuldstændig sekvensbestemt således som vist i tegnin-35 gens fig. 3.

O

14 DK 175036 B1

Bedømmelse af plasmid kopital i H. polymorpha transformant er

Kopi tallet hos plasmider, der meddeler autonom replikat ion i H. polymorpha enten ved hjælp af ARS-sekven-5 ser eller ved hjælp af HÅRS sekvenser, bedømmes ved hjælp af Southern blot-analyse (aftryksteknik eller overføringsteknik således som vist i fig. 4). Til sammenligning anvendes plasmid YRP17 i S. cerevisiae (fig. 4, bane 6 og 7), der har et kopital fra 5 til 10 pr.' celle (Struhl 10 m.fl., 1979) og plasmid pRB58 med højt kopital i S.

cervisiae (fig. 4, bane 4 og 5) med ca. 30 til 50 kopier pr: celle. YRP17 er et URA3-holdigt gærplasmid, der bærer en ARS-sekvens (Stinchcomb m.fl., 1982), medens pRB58 er et 2 pm derivat indeholdende URA3-genet (Carlson og 15 Botstein, 1982). En Kluyveromyces lactis-transformant, som bærer to integrerede kopier af pBR pBR322, anvendes som kontrol (fig. 4, bane 2 og 3). Intensiteten ved farvning i autoradiodiagrammet afslører, at plasmidet YRP17 i H. polymorpha har praktisk talt det samme kopital som 20 i S. cerevisiae, hvorimod plasmider pHARS-1 og pHARS-2 viser et kopital, som ligger i området fra ca. 30 til ca.

40 kopier pr. celle ligesom pBR58 i S. cerevisiae. Dette beviser endnu en gang HARS-sekvensens autonomreplikeren-de karakter.

25

Transformationsprocedurer

Der anvendes flere forskellige protokoller eller forskrifter.

a) H. polymorpha stamme LEU-1 transformeres under 30 anvendelse af en procedure tillempet ifølge Beggs (1978) .

Stammen dyrkes ved 37°C med kraftig luftning i 500 ml YEPD flydende medium op til en OD600 (optisk tæthed ved 600 niti) på 0,5. Cellerne indhøstes, vaskes med 20 ml destilleret vand og suspenderes påny i 20 ml 1,2 M sorbi-35 tol, 25 mM EDTA pH 8,0, 150 mM DTT og inkuberes ved stue-

O

15 DK 175036 B1 temperatur i 15 minutter. Celler indsamles ved centrifugering og optages i 20 ml 1,2 N sorbitol, 0,01 M EDTA, 0,1 M natriumcitrat, pH 5,8, og 2% efter (rumfang/rumfang) β-glucuronidase-opløsning (sigma 1.500.000 enheder/ml) og 5 inkuberes ved 37°C i 105 minutter. Efter 1 time bringes slutkoncentrationen af β -g lueuronidase til 4% (efter rumfang/rumfang) . Til transformation tilsættes 3 ml af ali-quotdele af protoplasterne til 7 ml iskold 1,2 M sorbitol, 10 mM tris-HCl, pH 7. Protoplaster indhøstes ved centrifu-10 gering ved 2000 omdr./min. i 5 minutter og vaskes tre gange i iskold sorbito-lpuffer. Vaskede celler suspenderes på-ny i 0,2 ml 1,2 M sorbitol, 10 mM CaC^r 10 mM tris-HCl, pH 7, på is. 2 jag YEP13 DNA — et autonomt replikerende S. cerevisiae plasmid bestående af LEU2 genet fra S. ce-15 revisiae og det 2 mikron-ori (Broach m.fl., 1979) c sættes til 100 ml celler og inkuberes ved stuetemperatur. 0,5 ml af en opløsning af 20% PEG 4000 10 mM CaCl2» 10 mM tris--HC1, pH 7,5, tilsættes, og hele blandingen inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur. Der indsamles celler ved 20 kort (5 sekunders) centrifugering i en MSG-mikrocentrifu-ge indstillet på høj hastighed, og de suspenderes påny i 0,1 ml YEPD 1,2 M sorbitol', pH 7,0, og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Cellerne udplades direkte ved spredning på overfladen af plader indeholdende 2%'S Difco 25 agar, 2% glucose, 0,67% Difco gærnitrogenbase, og 20 mg/-liter af henholdsvis L-adenin-semisulfat, mithionin, uracil, histidin, tryptophan, lysin og 1,2 M sorbitol. Leu+--transformanter kommer til syne efter 5 dages inkubation ved 37°C med en frekvens på 50 kolonier/pg DNA, medens der 30 ikke viser sig nogen transformanter, hvis ikke DNA tilsættes .

b) Alternativt transformeres H. polymorpha LEU-1 med YE013 under anvendelse af en procedure tillempet ifølge Das m.fl. (1984). Exponentielt voksende celler dyrkes 35 op til et 0Fg0Q på 0,4, vaskes i TE-puffer (50 mM tris- 16 DK 175036 B1 o -HC1, pH 8,0, 1 mM EDTA) og suspenderes påny i 20 ml TE--puffer. 0,5 ml celler inkuberes ved 0,5 ml 0,2 M LiCl i 1 time ved 30°C. Til 100 ml af disse celler sættes 4 pg YEP13 i 20 ml TE-puffer, og prøven inkuberes i yder-5 ligere 30 minutter ved 30°C. Et lige så stort rumfang 70% (efter rumfang/rumfang) PEG 4000 tilsættes, og blandingen inkuberes i 1 time ved 30 minutter og derefter ved 42°C i 5 minutter. Efter tilsætning af 1 ml vand, indsamles celler ved kort centrifugering som beskrevet 10 under afsnit a), vaskes to gange med vand og suspenderes påny i 0,1 ml YEPD 1,2 M sorbitol og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Cellerne udplades som be-skrevet. Der viser sig Leu transformanter med en frekvens på 30/jig DNA.

15 c) H. polymorpha URA mutant LR9 transformeres med YRP17, et plasmid indeholdende URA3-genet fra S.

Cerevisiae som selektiv markør og en autonomt replicerende sekvens (ARS) for S. cerevisiae (Stinchomb m.fl., 20 1982). Under anvendelse af protoplastmetoden som beskre vet af Beggs (1978) fås 2-5 transformanter/jig DNA. Dette antal forstørres under anvendelse af LiSO^-metoden ifølge I to m.fl. (1983) op til 15-20 transformanter pr. jig DNA.

Dog er den bedste procedure stadig den af Klebe m.fl 25 (1983) beskrevne under anvendelse af intakte celler be handlet med PEG 4000. Der fås op til 300 transformanter pr. jag DNA. LiSO^-proceduren såvel som Klebe-proceduren gennemføres ved 37°C.

Transformation af H. polymorpha baseret på auto-30 nom replikation af vektoren indiceres ved hjælp af to egenskaber: 1) uracil+ phenotypens ustabilitet. Efter transformanter vækst på YEPD i ti generationer har over 99% tabt evnen til at gro på selektivt medium (tabel II).

2) Autonom replikation sikres yderligere ved at transfor-35 mere E. coli celler med gærminylisater og påny transfor-

O

17 DK 175036 B1 mere H. polymorpha. Efterfølgende Southern-analyse viser tilstedeværelsen af det forventede plasmid.

H. polymorpha LR9 kan ikke transformeres med pRB58 eller med pHH85 konstrueret ved indsætning af det 5 hele 2 micron cirkelformede DNA (Hollenberg m.fl., 1982) i Pstl-stedet for ampicillingenet hos plasmid YIP5. YIP5 indeholdende DNA-sekvensen af HARS1 eller HÅRS2 transformeres til H. polymorpha LR9 under anvendelse af Klebes protokol med en frekvens på 500 til 1500 transformanter 10 pr. ug DNA. Transformationsfrekvensen er således 2-5 gange højere end ovenfor beskrevet under anvendelse af det heterogene ARS 1 i YRP17 fra S. cerevisiae. Ligeledes er HARS-plasmidets stabilitet i transformanter en lille smule højere end ARS 1 plasmidets (tabel II).

15

Transformation af H. polymorpha ved integration af URA3--genet fra S.cerevisiae URA3-genet fra S. cerevisiae viser ingen homologi med ODC-genet i H. polymorpha således som afsløret ved 20 Southern hybridisering af nick-translateret Ylp5 plasmid DNA til kromosomal DNA fra H. polymorpha. Derfor måtte man forudse lavfrekvensintegration af URA3-genet på tilfældige steder hos H. polymorpha-genomet. Transformation af mutant LR9 med den integrative vektor YIp5 resulterer 25 i 30-40 kolonier pr. pg DNA på YNB-plader under anvendelse af polyethylenglycolmetoden, hvorimod der ingen trans-formanter fås ved kontrolforsøget under anvendelse af YIp5 til transformation af S. Cerevisiae-mutant YNN27.

Analyse af 38 transformanter afslører fire stabile inte-30 granter efter vækst på ikke-selektivt medium. Ingrations- begivenheden demonstreres yderligere ved hjælp af Southern--analyse (fig. 5).

En anden procedure til at frembringe eller skabe integration af URA3-genet i chromosomalt DNA fra H. poly-35 morpha gennemføres ved berigelse af stabile URA -trans- 0 18 DK 175036 B1 formanter fra transformanter, som bærer plasmid pHARSl. Transformanter dyrkes i flydende YEPD op til en celle- 9 tæthed på 10 celler pr. ml. En aliquot del indeholdende 5 x 10^ celler· anvendes til at inokulere eller pode 100 9 5 ml frisk medium og dyrkes op til en celletæthed på 10 pr. ml. Proceduren gentages, indtil man er nået op på ca. 100 generationer. Eftersom reversionsgraden for mu- -9 tant LR9 er 2 x 10 og frekvensen for plasmidtab pr. ti generationer er 97% i pHARSl transformanter, bør den 10 overvejende del af URA+-cellerne efter 100 generationer være integranter. De afprøvede URA -kolonier viser sig alle at bevare en stabil URA+-phenotype, hvilket indicerer integration af URA3-genet. Dette verificeres yderligere ved Southern blotanalyse eller aftryksanalyse. Her- 15 til kommer, at disse data indicerer, at integrationsfre- _6 kvensen er 5 x 10

De følgende eksempler tjener til yderligere belysning af den foreliggende opfindelse.

20 Eksempel 1

Kloning af genet for alkoholoxidase (MOX) fra Hansenula » polymorpha

Katakterisering af polyadenyleret RNA

Totalt RNA og polyadenyleret RNA isoleret fra cel-25 ler dyrket på methanol mærkes ved deres 3'-ender med ATP:-RNA-radenyltransferase og adskilles på en denaturererende polyacrylamidgel (fig. 6). Bortset fra rRNA-båndene kommer to klasser af RNA til syne i den polyadenylerede RNA bane med en længde på henholdsvis 1 kb og 2,3 kb’er. Da disse 30 RNA-klasser ikke findes i polyadenyleret RNA fra ethanol-dyrkede celler (resultatet er ikke vist), er de åbenbart transskripter af gener, som er derepresserede ved dyrkning på methanol. 2,3 kg-klassen kan kode for et protein på 700-800 aminosyrer, hvilket afhænger af de ikke-transla-35 terede sekvensers længde. På lignende måde koder 1 kb-klas- 0 19 DK 175036 B1 sen for et protein på 250 til 300 aminosyrer. Enzymer, som derepresserer (dvs. hvis undertrykkelse er ophævet påny) ved dyrkning på methanol, og som er 700 til 800 aminosyrer lange, er mest sandsynligt MOX (jfr. Kato 5 m.fl., 1976 og Roa og Biobel, 1983) og DHAS (jfr. By-strykh m.fl., 1981). Derepresserede enzymer i 250 til 300 aminosyresområdet er sandsynligvis formaldehyd-og formiatdehydrogenase (jfr. Schutte m.fl., 1976). Det polyadenylerede RNA karakteriseres yderligere ved in vi-10 tro translation i et reticulocytcelle translationssystem. 2 γΐ af den polyadenyleret RNA-styrede proteinblanding adskilles direkte på en 10%'s SDS polyacryl-amidgel, medens de resterende 18 pi underkastes immunfældning med antiserum over for MOX (fig. 7). Seks stær-15 ke bånd dominerer i totalproteinblandingen, og de har molekylvægte på henholdsvis 78kd,,74kd, 58kd, 42kd, 39kd og 36kd. I det væsentlige de samme molekylvægte er blevet fundet af Roa og Biobel (1983) i en totalcelleekstrakt fra methanoldyrkede H. polymorpha-celler.

20 74kd-proteinet kan med forbehold tilskrives mono meren fra MOX, 58kd-proteinet kan tilskrives monomeren fra katalase, og 39kd- og 36kd-proteinerne kan tilskrives monomerene fra henholdsvis formaldehyddehydrogenase og formiatdehydrogenase. 78kd-polypeptidet er muligvis DHAS, 25 medens 4 2kd-po ly pept idet stadig er uidentificeret. Efter immunfældning reagerer begge højmolekylære proteiner med MOX-antiserummet.

Kloning af genet for MOX

30 Selv om 2,3 kb mRNA-klassen induceret ved dyrkning på methanol åbenbart koder for mindst to polypeptider, synes den at være en god kandidat til screening af en Han-senula polymorpha-klonbank eller -samling ved hybridise-ring. 5-20 kb-fraktionen af delvis med Sau3AI fordøjet 35 h. polymorpha DNA klones i phag lambda L47.1.

I DK 175036 B1 I

I 20 I

I λ I

\j

I Pr. mg insat DNA fås der 300.000 plader, medens I

I baggrunden er mindre end 1:1000. To Benton Davis-aftryk I

I indeholdende ca. 20.000 plader hver hybridiseres med I

I 15.000 cpm af den med mRNA afledte cDNA-sonde. Efter I

I 53 ugers autoradiografi kan der påvises ca. 40-50 hy- I

I bridiserende plader. Alle plader opsamles, og fem ren- I

I ses yderligere ved udpladning med lavere tæthed og ved I

I en anden hybridisering med cDNA-sonden. Ud fra fire en- I

I kelthybridiserende plader (1, 3, 4, 5) isoleres DNA. Ind- I

I 10 satslængden varierer fra 8 til 13 kb. I

I Hybridiseringsudvælgelse under anvendelse af organiske I

I syntetiske DNA-sonder I

I Sekvensen på 30 aminosyrer ved aminoenden af ren- I

I 15 set MOX bestemmes (fig. 8). I

I Under anvendelse af den rigest ydende codonudnyt- I

I telse for gæren S. cerevisiae kan der afledes en sekvens I

I på 14 baser fra én del af denne proteinsekvens med kun I

I én dobbelttydighed. Begge sonder angivet i fig. 4 synte- I

I 20 tiseres. i begge sonder forekommer et EcoRI-sted. Der I

I laves DBM-aftryk på DNA'et fra MOX-klonerne fordøjet med I

restriktionsenzymerne BamHI, EcoRI/Hindlll, Hindlll/Sall I

og Pstl/Såll, og de adskilles på 1,5%'s agarosegeler. Ef- I

ter hybridisering af aftrykket med en blanding af begge I

25 radioaktivt mærkede sonder hybridiserer klonerne lf 4 og 5, I

medens klon 3 ikke gør, således som vist for HindIII/SalI“ I

aftrykket i fig. 9. Imidlertid hybridiserer sonderne ikke I

med disse kloners DNA fordøjet med EcoRI/Hindlll {resul- I

I taterne er ikke vist). Da der forekommer et EcoRI-sted I

30 i sonderne, afskæres det hybridiserende DNA i klonerne I

sandsynligvis også med dette enzym. Følgelig ses det, at I

hybridiseringsoverlapningen er blevet for lille til at I

tillade dannelsen af stabile hybrider. I

35 I

O

21 DK 175036 B1

Restriktionskort og sekvensanalyse

Ved at sammenligne nedbrydninger eller fordøjel-ser med restriktionsenzym og ved tværhybridiseringsfor-søg konkluderes det, at klonerne 1, 4 og 5 dækker iden-5 tiske strækninger af DNA.

Med det formål nøjagtigt at konstatere denne strækning af klonet DNA's natur eller art analyseres indsatsen af klon 4 helt detaljeret. Hybridisering med den amino-terminale sonde viser, at hele MOX-genet (ca. 2 kb'er) 10 er til stede inklusive 2 kb-sekvenser ovenfor og 3,5 kb--sekvenser nedenfor (fig. 10).

DNA-sekvensanalyse af det mindste EcoRI-fragment afslører nucleotidsekvensen svarende til aminoenden hos MOX således som bestemt ved aminosyresekvensanalyse.

15 Til sekvensanalyse subklones flere fragmenter i henholdsvis M13mp8/Ml3mp9 eller Ml3mpl8/ml3mpl9 i to orienteringer således som angivet i fig. 10. Kloner, der vejer mindre end 0,5 kb, sekvenseres direkte fra begge sider. De større kloner afskæres ved de særegne restrik-20 tionssteder, der befinder sig i midten af det klonede fragment, for at tillade dannelse af subkloner fordøjet med exonuclease Bal31 således som beskrevet i "Materials and methods". Under anvendelse af specifikke oligonucleo-tidigangsættere (primere) sekvenseres endnu en gang se-25 kvenser omkring restriktionsstederne, der anvendes til subkloning, og sekvenser, som ikke tillod en éntydig sekvensbestemmelse, under anvendelse af 5,5 kb BamHI/-Sacl-subklonen, som dækker hele sekvensen. Den komplette nucleotidsekvens er angivet i fig. 11A og 11B.

30 Sekvensen indeholder en åben aflæsningsramme på 2046 nucleotider, der kan kode for et protein på 664 aminosyrer. Det sidste codon i den åbne aflæsningsramme koder for Phe, hvilket er i overensstemmelse med carboxy-enden hos renset MOX. Aminosyresammensætningen afledt 35 fra DNA-sekvensen, som indkoder dette protein, og amino- 0 22 DK 175036 B1 syresammensætningen hos renset MOX, er praktisk talt identisk (tabel III) . De eneste vigtige forskelle vedrører serin- og threonin-resterne, der som bekendt er uhyre vanskelige at bestemme.

5 Den beregnede molekylvægt for proteinet er 74.050

Dalton, hvilket stemmer godt overens med molekylvægten på 74 kb for MOX således som bestemt på polyacrylamid/SDS-ge-ler.

10 Codon-udnyttelse I tabel IV er codon-udnyttelsen for MOX angivet.

En skævhed hen mod brugen af et selektivt antal codoner er tydelig.

15 Eksempel 2

Konstruktion af et pladmid pUR 3105, ved hjælp af hvilket genet, der koder for neomycinphosphotransferase, som meddeler modstandsdygtighed over for antibiotiket G 418, indbygges til en helhed i det kromosomale Mox-gen under 20 styring med MOX-regulonet H. polymorpha-celler transformeret med enten plas-miderne YEP 13, YRP 17, pHARS 1 eller pHARS 2, er ustabile, og taber deres leu+ eller ura+ phenotype allerede efter ti generationers dyrkning under ikke-selektive betin-25 gelser. For at opnå stabile transformanter og for at afprøve MOX-promotoren konstrueres et plasmid pUR 3105, i £ hvilket neumycinphosphotransferasegenet (ΝΕ0 ) bringes under MOX-regulonets direkte styring. Konstruktionen la-ves på en sådan måde, at NOR -genets første ATG kobles 30 til MOX-regulonets 1,5 kb. Kloningen af et sådant stort regulonfragment er nødvendigt, da kortere fragmenter, som ikke indeholder regulonets -1000-region, er mindre effektive .

NEO -genet isoleres som et 1,1 kb Xmalll-Sall frag-35 ment fra transposonet Tn5, som befinder sig 35 bp neden

O

23 DK 175036 B1 for det første ATG og op til 240 bp neden for TGA-trans-lationsstopcodonet. For at undgå en indviklet eller sammensat ligationsblanding konstrueres først pUR 3101 (fig. 12A), som er en fusion af det længst opstrømsbe-5 liggende Sall-Xmalll-fragment (nemlig fra stillingen -1510 til stillingen -1128) af MOX-regulonet, og NEO^--genet subklonet på M13mp9. Der konstrueres et andet plasmid pUR 3102, hvori MOX-genets 1,5 kb Sall-Hgil-fragment, som dækker næsten hele MOX-regulonet, ligateres £ 10 til en MOX-NOR -adaptersekvens, dvs. et tilpasningsstykke, (jfr. fig. 12B) og klones i Ml3-mp9. Dette plasmids

1,2 kb XmaIII-fragment klones til Xmalll-stedet hos pUR

3101, hvilket fører til frembringelsen af pUR 3103, som

R

er den nøjagtige fusion af MOX-regulonet og NEO -genet 15 (fig. 12C) . Orienteringen kontrolleres ved spaltning med HgiAI og Sall. Ud fra lambda-M0X-4-klonen subklones et Sall-SacI-fragment, som når fra Sall-snitstedet, der stadig befinder sig i det strukturelle MOX-gen (stilling 894), og op til Sacl-stedet, som ligger længere fremme 20 i det strukturelle MOX-gen (stilling 3259), jfr. fig. 10.

Denne M13mpl9-subklon kaldes pUR 3104. Plasmidet pUR 3105 fås ved direkte ligatering af 2,7 base Sall-fragmentet fra pUR 3103 til Sall-stedet hos pUR 3104. Orienteringen afprøves ved spaltning med Smal og Sacl.

25 Efter spaltning af dette plasmid med Hindlll og

Sacl og transformation af dette spaltede plasmid til H. polymorpha findes der G 418-resistente kolonier, som ikke taber deres resistens efter dyrkning under ikke selektive betingelser gennem et større antal generationer.

30 35 0 24 DK 175036 B1

Eksempel 3

Konstruktion af pUR 3004, hvorved genet, der koder for D-aminosyreoxidase, overføres til H. polymorpha's kromosom under· MOX-regulonets styring 5 D-aminosyreoxidase (AAO) er et eksempel på en oxi- doreduktase til fremstillingen af hvilken den methylotro-fe H. polymorpha er særdeles velegnet. Det kunne forventes, at enzymet, da det er en oxidase ligesom MOX, trans-lokeres til gærens peroxisomer, som induceres under vækst 10 på methanol eller en blanding af methanol og en forgæringsdygtig eller fermenterbar sukkerart som carbonkilde og D--aminosyrer som eneste nitrogenkilde. Under disse betingelser vil cellen være beskyttet mod det frembragte Alternativt kan AAO fremstilles uden frembringelse af 15 H2®2' n^r ^en sættes uncler styring af MOX- eller DAS-regu- lonet. Frembringelsen AAO vil induceres ved tilstedeværelsen af methanol i mediet.

AAO-enzymets aminosyresekvens er publiseret (Ron-chi m.fl., 1981), og det komplette gen er syntetiseret 20 under anvendelse af phosphitteknikken (Matteuci og Ca-ruthers, 1981). Genet er konstrueret på en sådan måde, at H. polymorpha's optimale codon-udnyttelse således som afledt fra MOX-genets sekvens anvendes. I øvrigt indføres flere særegne restriktionssteder uden at ændre aminosyre-25 sekvensen for derved at lette subkloningen under syntesen. DNA-sekvensen er vist i fig. 13. Genet syntetiseres i oli-gonucleotider på ca. 50 nucleotiders længde. Oligonucleo-tiderne renses på 16%'s polyacrylamidgeler. Oligonucleoti-derne, som danner en subklon, adderes i ligasepuffer 30 {Maniatis m.fl., 1982) og opvarmes til 70°C på vandbad.

Vandbadet afkøles langsomt til 16°C, og T^-ligase tilsæt tes. Efter 2 timers ligatering skilles DNA'et fra på en 1,5%'s agarosegel, og fragmentet, der har den forventede længde, isoleres fra gelen. Det subklones i en M13mpl8-35 -vektor spaltet ved de respektive restriktionssteder an- 0 25 DK 175036 B1 bragt ved fragmentets ender. Genet subklones på denne måde i fire subkloner, nemlig henholdsvis Sall-Hindlll (stilling 39-346), Hindlll-Xmal (stilling 346-589)

Xmal-Kpnl (stilling 589-721) o.g KpnI-Sall (stilling 5 721-1044). Sall-Hindlll- og Hindlll-Xmal-subklonerne og

Xmal-Kpnl- og KpnI-Sall-subklonerne ligateres sammen som to Sall-Xmal-subkloner i Sall-Xmal-spaltet M13mpl8. Disse to subkloner ligateres i en Sall-spaltet Ml3mp8f hvilket fører til pUR 3001 (fig. 13 og 14A). Hele sekvensen 10 bekræftes ved bestemmelse af nucleotidsekvensen under anvendelse af den modificeres Sanger dideoxysekvenserings-teknik (jfr. Biggin m.fl., 1983).

Konstruktionen af det integrative plasmid, som indeholder AAO-genet, er vist i fig. 14A og 14B. Det næsten 15 komplette AAO-gen er anbragt oven for MOX-terminerings- regionen ved indsættelse af det AAO-genholdige Sall-frag-ment fra pUR 3001 ved det særegne Sall-sted hos pUR 3104 (se også fig. 14A), hvilket fører til pUR 3002. Orienteringen kontrolleres ved spaltning med Hindlll. MOX-promo-20 torregionen isoleres som et 1,4 kb Sall-HgiAI-fragment fra pUR 3102 (fig. 14A). Dette fragment anbringes derpå opstrøms for AAO-genet i pUR 3002 ved ligatering til med Sall delvis fordøjet pUR 3002 i nærværelse af HgiAI--Sall MOX-AAO-adaptoren således som vist i fig. 14A. Ori-25 enteringen af det herved fremkomne plasmid pUR 3003 kontrolleres igen ved spaltning med Hindlll. Dette plasmid integreres i MOX-genet efter spaltning med SacI og transformation til H. polymorpha-celler. Der udvælges transfor-manter ved hjælp af disses evne til at vokse på D-amino-30 syrer som nitrogenkilden i nærværelse af methanol som inducer eller igangsætter.

Eftersom udvælgelsen af celler, der indeholder AAO--genet, ikke er ganske simpel, indføres der endnu en selektionsmarkør. Til dette formål integreres S. cerevisiae 35 LEU2-genet imellem det strukturelle AAO-gen og MOX-termi- 0 26 DK 175036 B1 natoren. Til denne konstruktion anvendes plasmidet pURS 528-03. Dette plasmid er afledt fra pURY 528-03 beskrevet i europæisk patentansøgning 0096910. Konstruktionen er vist i fig.*14C. Den udslettede eller sløjfede carb-5 oxyterminale LEU2-gensekvens i pURY 528-03 erstattes med den komplette carboxyterminale LEU2-gensekvens fra pYeleu 10 {jfr. Ratzkin og Carbon, 1977), og E. coli lac-lac-re-gulonet elimineres. Derefter indsættes Hpal-SalI-fragmentet i pURS 528-03 indeholdende LEU2-genet stumpendet i 10 Sall-stedet hos pUR 3003, der befinder sig mellem AAO- . -strukturgenet og MOX-terminatoren. Orienteringen af det herved fremkomne plasmid pUR 3004 kan efterprøves ved spaltning med Sall og Sacl. pUR 3004 integreres i H. po-lymorpha's kromosomale MOX-gen efter transformation af 15 det med Sacl spaltede plasmid til dannelse af en H. po-lymorpha leu”-mutant. Udvalgte leu -transformanter integreres i det kromosomale MOX-gen sammen med AAO-genet.

Eksempel 4

20 Konstruktionen af pUR 3204, pUR 3205, pUR 3210 og pUR

3211, ved hjælp af hvilken det lille peptidhormon, men-neskevækstfrigivende faktor udtrykkes (exprimeres) under MOX-regulonets styring, enten ved integration i det kromosomale MOX-gen (pUR 3203, pUR 3204) eller ved inteqra-25 tion i et HARSI-holdigt plasmid (pUR 3205) eller ved fusion til MOX-strukturgenet (pUR 3209, pUR 3210 og pUR 3211)

Menneskevæksthormonfrigivende faktor (HGRF) er et lille 44-aminosyrer langt peptid, som aktiverer sekrete-30 ringen af mennevæksthorrnon fra hypofysen. HGRF kan anvendes ved diagnosen og behandlingen af hypofysebestemt dværgvækst hos mennesker. Da det er vist, at HGRF inducerer væksthormonstimulering hos talrige arter, kan HGRF muligvis anvendes også inden for veterinærområdet ved at 35 stimulere dyrs vækst og forøge mælkeproduktion (jfr.

0 27 DK 175036 B1

Coude m.fl., 1984). Det er vanskeligt at opnå HGRF med mennesker som kilde; men det vil særdeles udmærket kunne frembringes ved hjælp af bioteknologiske fremgangsmåder , når først genet er klonet og overført til en pas-5 sende værtsorganisme. Som alment eksempel på frembringelsen af et peptidhormon ved hjælp af H. polymorpha syntetiseres også genet for HGRF ved H. polymorpha's optimale codonudnyttelse og bringes til expression på flere forskellige måder.

10 Til konstruktionen af pUR 3204 og pUR 3205 synte tiseres det genfragment, der koder for proteinets carb-oxyterminale del, i DNA-oligomere på ca. 50 nucleotiders længde og subklones som Hindlll-Sall-fragment i Ml3mpl8 spaltet med Hindlll-Sall, hvilket fører til pUR 3201 15 (fig. 15 og 16A) . Dette Hindlll-Sall-fragment indsættes derefter ovenfor MOX-terminatoren i pUR 3104 spaltet med Hindlll-Sall (fig. 16A), hvilket fører til pUR 3202. MOX-promotoren indsættes foran HGRF-genet ved indsættelse af Sall-HgiAI-MOX-promotor-fragmentet fra pUR 3102 (fig. 16A) 20 i pUR 3202 spaltet med Hindlll under anvendelse af en

HgiAI-Hindlll-adapter mellem mox-promoteren og HGRF-genet (fig. 15 og 16A). Orienteringen af det herved fremkomne plasmid pUR 3203 kontrolleres ved spaltning med Sall og HgiAI. pUR 3203 integreres i H. polymorpha’s 25 kromosomale MOX-gen efter transformation af det med Sacl--spaltede plasmid. Transformanter udvælges på grundlag af immonologaktivitet. pUR 3203 spaltes med Sall til indsættelse af Sall-Hpal fragmentet hos pURS 528-03 (fig. 16B), der indeholder LEU2-genet. Dette gens orientering i pUR 30 3204 kontrolleres ved spaltning med Hindlll og EcoRI.

pUR 3203 integreres i H. polymorpha's kromosomale MOX--gen efter transformation af det med SacI spaltede plasmid (fig. 16B) til dannelse af en leu H. polymorpha mutant. Der foretages udvælgelse på leu+-transfor-35 manter. Et plasmid kaldet pUR 3205, som autonomt repli- o 28 DK 175036 B1 ceres i H. polymorpha og indeholder HGRF-genet, fås ved indsætning af det med EcoRI og delvis Hindlll-spaltede 4 kb lange fragment af pUR 3203 indeholdende HGRG--genet indsat mellem MOX-promotoren og terminatoren, i 5 delvis med Hindlll-EcoRI-spaltet pHARSl (fig. 2 og 16C) . Konstruktionen af pUR 3205 efterprøves ved spaltning med Hindlll.

Fremstillingen af små peptider som HGRF ved hjælp af mikroorganismer er ofte ustabil som resultat af enzy-10 matisk nedbrydning (jfr. Itakura m.fl., 1977). Fusion til et protein såsom MOX og efterfølgende transport til peroxisomerende kunne måske hindre nedbrydning. Derfor blev det besluttet at indsætte HGRF-genet i det særegne KpnI-sted ved stilling 1775 (aminosyre nr. 591 i 15 fig. 10 og 11) hos Mox-strukgenet. HGRF-genet syntetiseres igen i DNA-oligomere på 50 nucleotiders længde, men nu som to KpnI-Hindlll-subkloner, der klones som komplet HGRF-strukturgen i Ml3mpl9, spaltet med Kpnl (plasmid pUT 3206 i fig. 17 og 16D). I øvrigt omdannes den ATG-20 -triplet, der koder for det interne methionin hos HGRF i stilling 27 (jfr. Coude m.fl., 1984) (stilling 82 i DNA-sekvensen), til en TGT-triplet, der koder for cystein.

Dette ændrer ikke HGRF-aktiviteten væsentligt, men letter spaltningen af HGRF fra fusionsproteinet ved hjælp af 25 CNBr-spaltning (jfr. Itakura m.fl., 1977). Fra phag lambda MOX-4 (fig. 10) isoleres Sphl (stilling -491)-KpnI--fragmentet og indsættes i Ml3mpl9 spaltet med SphI-Kpnl.

Dette fører til pUR 3207. pUR3206 spaltet med Kpnl og HGRF-genet indsættes i KpnI-stedet hos pUR 3207, hvilket 30 fører til pUR 3208. Orienteringen efterprøves ved direkte sekvensanalyse på den enkeltstrengede DNA hos pUR 3208. Derefter isoleres den lasngere fremad beliggende del af MOX-genet fra det særegne KpnI-sted og op til Sacl--stedet som et 1,5 kb fragment fra lambda MOX-4 og ind-35 sættes i pUR 3208 delvis spaltet med Kpnl. Orienteringen 29 DK 175036 B1

O

af det herved fremkomne plasmid pUR 3209 efterprøves ved fordøjelse med KpnI. pUR 3209 integreret i H. poly-morpha's kromosomale MOX-gen efter transformation af det med SacI og Sphl spaltede plasmid. Der foretages ud-5 vælgelse på grundlag af immunologaktivitet.

Dette MOX-HGRF-fusionsgen indsættes i pHARSl ved hjælp af isolation af hele fusionsgenet fra delvis med Hindlll og delvis med EcoRI spaltet pUR 3209 i med EcoRI og delvis Hindlll spaltet pHARSl. Dette fører til pUR 10 3210, der replicerer H. polymorpha efter transformation (fig. 16E). Alternativt indsættes det LEU2-holdige Sall--Hpal-fragment af pURS 528-03 i det stumpendede KpnI sted hos HGRF-genet, som er lokaliseret ved det indkodede proteins carboxyende, efter delvis KpnI-spaltning 15 af pUR 3209. Det herved fremkomne plasmid pUR 3211 integreres i H. polymorpha's kromosomale MOX-gen efter transformation af det med SacI og Sphl-spaltede plasmid (fig.

16F) .

20 Diskussion

Ud fra længden af den åbne aflæsningsramme, ud fra ligheden i aminosyresammensætning hos renset MOX og den DNA-afledte proteinsekvens og ud fra de identiske 30 N--terminale aminosyrer konkluderes det, at det komplette 25 gen for MOX fra gæren Hansenula polymorpha er blevet klonet. Dets beregnede molekylvægt stemmer godt overens med molekylvægten, der er blevet bestemt på SDS polyacrylamid-geler. Bortset fra kodningssekvensen er mere end 1200 basepar blevet sekvensbestemt ud fra både de 5'- og de 3'-ikke-30 -kodende regioner, der når fra Sall-stedet ovenfor for kodningssekvensen og op til Sacl-stedet nedenfor. Genet synes ikke at være afbrudt med intervenerende sekvenser.

Proteinet transskriberes ikke i form af en precursor. På grundlag af molekylvægtsbestemmelsen kan der hel-35 ler ikke påvises N-terminale sekvenser hos tidligere un- 30 DK 175036 B1 o dersøgelser af Roa og Biobel (1983) eller Roggenkamp m.fl.

(1984) . Ved lignende undersøgelser er det blevet foreslået, at heller ikke de peroxisomale enzymer fra rottelever, henholdsvis uricase (Goldman og Blobel, 1978) og catalase 5 (Goldman og Blobel, 1978 og -Robbi og Lazarow, 1978) indeholder et fraspaltelig N-terminalt signalpeptid. Imidlertid kunne proteolytisk nedbrydning, således som diskuteret af disse forfattere, muligvis forklare den manglende påvisning af en sådan signalsekvens. io De her anførte sekvensresultater beviser afgjort, at til translokation af dette protein til peroxisomet kræves der ikke en fraspaltelig N-terminal signalsekvens. Et sådant translokationssignal kan udmærket befinde sig i det modne proteins interne sekvens, således som det er 15 tilfældet for ovalbumin (jfr. Lingappa m.fl., 1979). Inspektion af proteinsekvensen afslører aminosyresekvensen Gly X Gly Y Z Gl^ (aminosyrerne 13-18), der er karakteristisk for FAD-holdige enzymer (hvor FAD står for flavin-adenindinucleotid, jfr. Ronchi m.fl., 1981).

20 Den ovenfor beskrevne isolation af MOX-genet angi ver en måde til at bestemme DNA-sekvensen, som koder for MOX, og MOX-enzymets aminosyresekvens.

Ligeledes kan DNA-sekvenserne og aminosyresekven-serne, som tilhører andre oxidaseenzymer, isoleres og 25 bestemmes. Kendskabet til MOX-sekvensen kan anvendes til at lette isolationen af gener, der koder for alkoholoxi-daser eller selv for andre oxidaser. Ved at sammenligne egenskaberne og strukturen hos enzymer kan man sandsynligvis etablere sammenhænge mellem strukturfunktion og aktivi-30 tet. Man kan også anvende metoder som stedstyret mutagenase eller afkortning eller forlængelse af de proteinko-dedende sekvenser, modificering af de tilsvarende poly-peptider til at udvælge oxidaseenzymer med forbedrede egenskaber, f.eks. med forbedret alkalistabilitet, for-35 bedret produktion eller oxidaseenzymer, der behøver et 0 31 DK 175036 B1 substrat, som er mere forenelig med rengøringsprodukter.

Endvidere er isolationen og karakteriseringen af strukturgenet for MOX fra gæren H. polymorpha og også isoleringen og karakteriseringen af strukturgenet for DHAS 5 fra gæren H. polymorpha blevet gennemført på lignende måde.

DNA-sekvensen hos DAS er angivet i fig. 18A-18C.

Et restriktionskort er angivet i fig. 19. Aminosyresam-mensætningen beregnet ud fra DNA-sekvensen hos DRA ser ud 10 til at være i overensstemmelse med aminosyresammensætningen bestemt efter hydrolyse af renset DHAS. DHAS-enzymet katalyserer syntesen af dihydroxyacetone ud fra formaldehyd og xylulosemonophosphat. Denne reaktion spiller en afgørende rolle ved methanolassimilationsprocessen (jfr.

15 Veenhuis m.fl., 1983).

Således som ovenfor beskrevet er syntesen af MOX og DHAS genstand for glucoserepression. Det har nu vist sig, at der nås højere niveauer af MOX, når man anvender glucose/methanoIblandinger som substrater i stedet for 20 0,5% (efter rumfang/rumfang) methanol. Under de tidlige re betingelser består op til 30% af det cellulære protein af MOX, hvilket skal sammenlignes med en mængde på op 20% under de sidstnævnte betingelser.

Man har regnet med, at i regulonerne hos MOX og 25 DAS må der eksistere sekvenser, som spiller en afgørende rolle ved reguleringen af repressions/derepression med glucose eller af induktionen med methanol. En vis homologi kunne derfor forventes.

Der er faktisk fundet en slående homologi hos 30 "TATA-kasserne", som begge har sekvensen CTATAAATA. Der er ingen andre homologier fundet i den nærmeste region oven for MOX- og DAS-regulonerne. Uventet har en detaljeret undersøgelse af begge reguloner vist en bemærkelsesværdig homologi mellem regulonerne for MOX og DAS i 35 regionen ca. 1000 basepar oven for translationsinitie-

O

32 DK 175036 B1 ringscodoner. En praktisk fuldstændigt sammenhængende region på 65 basepar i regulonet for MOX er homolog med en region på 139 basepar i DAX-regulonet afbrudt af flere ikke-homologe regioner (se fig. 20). En lignende homo-5 goli findes ikke hos nogen anden region i begge gener, som er over 4 kb baser lange inklusive deres oven for og neden for beliggende sekvenser. Det foreslås, at disse homologe sekvenser spiller en rolle ved begge geners regulering med glucose og methanol. Transformationsundersøgelser med vek-10 torer, der som regulon indeholder de første 500 basepar ovenfor MOX-strukturgenets ATG viser, at dette afkortede MOX-regulon giver anledning til en forholdsvis lav expression af indikatorgenet Ø-lactamase. Indikatorgener er gener, som meddeler gæren egenskaber, der let kan bedømmes, 15 idet f.eks. genet for neomycinphosphotransferase således giver modstandsdygtighed over for antibiotiket G 418 (jfr.

Watson m.fl., 1983), eller en auxotrop markør såsom leucin.

Den kendsgerning, at de længst oven for beliggende homologe regioner i MOX- og DAS-generne har forskellige 20 afbrydelser, og den kendsgerning, at DAS undertrykkes (represseres) ved tilstedeværelsen af 0,1% glucose, medens MOX ikke undertrykkes, antyder, at disse homologe regioner har betydning for repression/derepression med glucose og/eller expressionens induktion i nærværelse af 25 methanol. Denne antagelse har faktisk vist sig at være korrekt, og tilstedeværelsen eller fraværelsen af disse homologe regioner kan derfor være vigtig for specifikke anvendelser. Hvis f.eks. -1052 til -987 regionen hos MOX-genet eller -1076 til -937 regionen hos DAS-genet er vig-30 tige for induktionen af MOX eller DAS med methanol, da kræves disse regioners tilstedeværelse til expressionen af MOX eller DAS og/eller til induktionen af andre enzymer med methanol. Endnu et eksempel kunne være fjernelsen af regionerne for at undgå repression med glucose, hvil-35 ket er nødvendigt for expressionen af gener, der koder 0 33 DK 175036 B1 for andre proteiner end MOX og DHAS under indflydelse af de MOX- og/eller DAS-regulerende regioner, hvor glucose anvendes som carbonkilde.

Et aspekt af den foreliggende opfindelse angår 5 således isolationen og den fuldstændige karakterisering af de strukturgener, der koder for MOX og DHAS, fra gæren H. polymorpha. Endvidere angår opfindelsen isolationen og den fuldstændig karakterisering af DNA-sekvenser-ne, der regulerer biosyntesen af MOX og DHAS i H. poly-10 morpha, navnlig regulonerne og terminaterne.

Endvidere angår opfindelsen kombinationer af gener, der koder for alkoholoxidase eller andre oxidaser hidrørende fra andre H. polymorpha-stammer end H. poly-morpha-CBS 4732 eller andre Hansenula-arter end H. poly-15 morpha eller andre gærslægter end Hansenula eller mugarter eller højere eukaryoter med det kraftfulde regulon og terminatoren fra MOX-genet hos H. polymorpha's CBS 4732. Disse kombinationer kan lokaliseres på vektorer, som bl.a. bærer en autonomt replikerende sekvens hidrø-20 rende fra H. polymorpha eller dermed beslægtede arter eller mikrosomer indeholdende centromere og eventuelt selektionsmarkør(er) og telomere. Disse kombinationer kan også være integreret i H. polymorpha's kromosomale DNA.

25 Endvidere angår opfindelsen kombinationer af det kraftfulde regulon eller dele deraf eller terminater hos MOX og/eller DAS samt den stedstyrede mutagenese eller andre metoder til ændring af strukturgener, der koder for alkoholoxidase eller anden oxidase. Disse 30 ændrede strukturgener kan være lokaliseret på episomale vektorer, i minokromosomer eller integreret i kromosomerne hos H. polymorpha, H. vingeii, H. anomala og S. cerevisiae eller i andre gærarter.

Desuden angår den foreliggende opfindelse kombi-35 nationer af regulonet og terminatoren fra H. polymorpha's 0 34 DK 175036 B1 MOX- og DAS-gen med strukturgener, koder for andre proteiner end oxidaser.

En meget vigtig og foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse er en fremgangsmåde til frem-5 stilling af et polypeptid såsom et protein eller et enzym ved dyrkning af en mikroorganisme under hensigtsmæssige betingelser, idet polypeptidet eventuelt koncentreres og indsamles på i og for sig kendt måde, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes en mikro-10 organisme, som er opnået ved rekombinant DNA-teknologi, og som bærer et strukturgen, der koder for det pågældende polypeptid, hvis expression styres af et regulon omfattende en promotor og mindst enten -1052 til -987 regionen af MOX-genet i Hansenula polymorpha CBS 4732 eller 15 -1076 til -937 regionen af DAS-genet i Hansenula polymor pha CBS 4732 eller en tilsvarende region af andre methy-lotrofe mugarter eller gærarter eller en effektiv modifikation af en hvilken som helst af disse regioner.

Overraskende nok er det nu blevet konstateret iføl-20 ge den foreliggende opfindelse, at de pågældende regioner, som er vist i fig. 20, og som her er omtalt som -1000-regionerne hos MOX- og DAS-generne, har afgørende betydning for expressionen af det pågældende strukturgen. Gennemførte forsøg med rekombinanter indeholdende MOX-regulonet, 25 hvorfra denne region er elimineret, har vist et lavere expressionsniveau. Derfor gør anvendelsen af et regulon omfattende en sådan -1000-region eller en effektiv modifikation, deraf, dvs. en hvilken som helst modifikation, der ikke resulterer i nogen betydelig forvanskning af den- 30 ne regions funktion, det muligt at gennemføre produktion af en forholdsvis høj mængde af det ønskede polypeptid.

En foretrukken udførelsesform for denne fremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at det pågældende strukturgen er forsynet med en eller flere DNA-35 -sekvenser, der koder for aminosyresekvenser, som ind-

O

DK 175036 B1 35 går i translokationen af genproduktet til peroxisosomer-ne eller dermed ækvivalente mikrolegemer hos mikrobeværten. Translokation af det frembragte polypeptid til per-oxisomerne eller dermed ækvivalente mikrolegemer forbed-5 rer disses stabilitet, hvilket resulterer i højere udbytte. For visse arter af polypeptider, i særdeleshed oxidaser, er en sådan translokation imperativ for mikrobeværtens overlevelse, dvs. til at beskytte værten mod giftvirkninger fra det hydrogenperoxid, der frembringes, når 10 mikrobeværtens celler dyrkes på substratet for oxidase.

Hvis den pågældende oxidase ikke indeholder addresseringssignaler, som er funktionelle i den mikrobevært, der benyttes ved produktionsfremgangsmåden, bør man forsyne strukturgenet med sekvenser, der koder for værtsspecifik-15 ke addresseringssignaler, f.eks. ved at addere sådanne sekvenser eller ved at udskifte genets oprindelige addresser ingssekvenser med disse. Frembringelse af et fuseret polypeptid, hvori fusionspartneren bærer hensigtsmæssige addresseringssignaler er en anden mulighed. I tilfælde, 20 hvor methylotrofe gærarter anvendelse ved produktions-fremgangsmåden, foretrækkes det, at DNA-sekvenserne består af MOX-genet eller de dele deraf, som er ansvarlige for MOX-translokation til peroxisosomerne eller mikrole-gemerne.

25 Endelig angår dette aspekt af den foreliggende op findelse syntesen i andre gærarter af MOX, som stammer fra H. polymorpha.

Nogle mikroorganismer med evnen til at frembringe alkoholoxidaser er anført nedenfor.

30 Gærarter, der frembringer alkoholoxidaser (Taxo- nomiopdeling ifølge Lee og Komagata, 1980):

Gruppe 1 Candida boidinii Gruppe 2a Hansenula philodendra Pichia lindnerii 35 Torulopsis nemodendra

O

36 DK 175036 B1

Torulopsis pinus " sonorensis

Gruppe 2b Candida cariosilignicola 5 Hansenula glucozyma " henricii " minuta ” nonfermentans " polymorpha 10 ” viskerhamii

Pichia pinus " trahalophila Gruppe 2c Candida succiphila

Torulopsis nitratephila 15 Gruppe 3 Pichia cellobiosa

Gruppe 4 Hansenula capsulata

Pichia pastoris Torulopsis molischiana

Mugarter der frembringer alkoholoxidaser: 20 Lenzites trabea

Polyporus versicolor " obtusus

Poria contigua

Blandt andre oxidaser end alkoholoxidaser er de mest in-25 teressante: - glyceroloxidase, - aldehydoxidase, - aminoxidase, - aryl-alkoholoxidase, 30 - aminosyreoxidase, - glucoseoxidase, - galactoseoxidase, - sorboseoxidase, - urinsyreoxidase, 35 - chlorperoxidase og - xanthinoxidase.

DK 175036 B1 37

O

Kombinationer af de stærke reguloner og termina-torer hos MOX- og DAS-generne fra H. polymorpha og strukturgener for oxidaser kan kombineres med en eller flere DNA-sekvenser,* som muliggør strukturgenets replikation i 5 en særlig værtsorganisme eller gruppe af værtsorganismer, f.eks. autonomt replikerende sekvenser eller centromere (og telomere) som stammer fra H. polymorpha til hensigtsmæssige vektorer, der kan overføres i H. polymorpha og dermed beslægtede gærarter eller andre mikroorga-10 nismer.

H. polymorphamutanterne LEU-1 og LR9, som er nævnt ovenfor på side 12, er deponeret hos Centraalbureau voor Schimmelcultures i Delft den 15. juli 1985 under de respektive numre CBS 7171 og CBS 7172.

15 Til supplering og tydeliggørelse af den foregående beskrivelse tjener følgende litteraturliste, tabeller, figurforklaringer og tegningens figurer såvel som patentkravene .

20 Litteraturliste 1. GB-PS 1 225 713 (Colgate-Palmolive Company; publ.

24th March 1971; priority date 19th April 1968).

25 2. DE-PA 2 557 623 (Henkel & Cie GmbH; publ. 30th June 1977; priority date 20th December 1975).

3. GB-PA 2 101 167 (Unilever PLC; publ. 12th January 1983; priority date 7th July 1981).

30 4. van Dijken, J.P., Otto, R. and Harder, W. (1976),

Arch.Microb. Ill, 137-144.

35 o

Litteraturliste (fortsat) DK 175036 B1 38 5. Veenhuis, M., van Dijken, J.P. and Harder, W.

(1983) in Advances in Microbial Physiology, 5 Rose, A.H., Gareth Morris, J. and Tempest, D.W.,

Eds, Vol. 24, pp 1-82, Academic Press, New York, 6. Roggenkamp, R., Janowicz, Z., Stanikowski, B, and Hollenberg, C.P. (1984), Mol.Gen.Genet. 194, 489- 10 493.

7. Sahm, H. (1977) in Advances in Microbiol. Engineering, Ghose, T.K., Fiechter, A. and Blakebrough, N., Eds, Vol. 6, pp 77-103, Springer-Verlag, 15 Berlin.

8. Bystrykh, L.V., Sokolov, A.P. and Trotsenko, Y.A.

(1981), FEBS Letters 132, 324-328.

20 9. Roa, M. and Biobel, G. (1983), Proc.Natl.Acad.Sci.

USA, 80, 6872-6876.

10. Veenhuis, M., van Dijken, J.P., Pilon, S.A.F. and Harder, W. (1978), Arch.Microbiol. 117, 1953-163.

25 11. Loenen, W.A.M. and Branunar, W.J. (1980), Gene 20, 249-259.

12. Hohn, B. (1979) in Methods in Énzymology, Wu, R., 30 Ed., Vol. 68, pp 299-309, Academic Press, New

York.

13. Edens, L., Heslinga, L., Klok, R., Ledeboer, A.M.,

Maat, J., Toonen, M.Y., Visser, C. and Verrips, C.T.

35 (1982), Gene 18, 1-12.

O

DK 175036 B1 39

Litteraturliste (fortsat) 14. Pelham, H.R.B. and Jackson, R.J. (1976), Eur.J.

Biochem. 67, 247-257.

5 15. Valerio, D., Duyvensteijn, M.G.C., Meera Khan, P.,

Geurts van Kessel, A., de Waard, A. and van der Eb, A.J. (1983), Gene 25, 231-240.

16. Ledeboer, A.M., Verrips, C.T. and Dekker, B.M.M.

10 (1984), Gene 30, 23-32.

17. Maniatis, T., Pritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982), Molecular Cloning, p 278, Cold Spring Harbor Laboratory Publ., New York.

15 18. Benton, W.D. and Davis, R.W. (1977), Science 196, 180-182.

19. Ambler, R.P. (1972), Methods in Enzymology, Vol. 25, 20 pp 262-272, Academic Press, New York.

20. Matteucci, M.D. and Caruthers, M.H. (1981), J.Am.

Chem.Soc. 103, 3185-3191.

25 21. Wallace, R.B., Johnson, M.J., Hirose, T., Miyake, T., Kawashima, E.H. and Itakura, K. (1981), Nucl.

Acids Res. 9, 879-894.

22. Biggin, M.D., Gibson, T.J. and Hong, G.F. (1983), 30 Proc.Na11.Acad. Sci.USA 80, 3963-3965.

23. Gleeson, M.A., Waites, M.J. and Sudbery, P.E. (1984), ins Microbial growth on Cj compounds, Eds.

Crawford, R.L. and Hanson, R.S., Publ. A.S.M., 35 Washington, 228-235.

40 DK 175036 B1

C

Litteraturliste (fortsat) 24. Fink, G.D. (1970), Methods in Enzymology, Tabor, H. and Tabor, C.W., Eds., Vol. 17, pp 59-78, Academic Press, New York.

5 25. Boeke, J.D., LaCroute, F. and Fink, G.D. (1984), Mol.

Gen.Genet. 197, 345-346.

26. Jones, E.W. and Fink, G.D. (1982), Cold Spring 10 Harbour Monogr.Ser., 11B, 181-299.

27. Lieberman, I., Kornberg, A, and Sinuns, E.S. (1955), J.Biol.Chem. 215, 403-415.

15 28. Stinchcomb, D.T., Thomas, M., Kelly, J., Selker, E.

and Davis, R.W. (1980), Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77, 4559-4563.

29. Stinchcomb, D.T., Mann, C. and Davis, R.W. (1982), 20 J.Mol.Biol. 158. 157-179.

N__ 30. Struhl, K., Stinchcomb, D.T., Scherer, S. and Davis, R.W. (1979), Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76. 1035-1039.

25 31. Carlson, M. and Botstein, D. (1982), Cell 28, 145- 154.

32. Beggs, J.D. (1978), Nature 275, 104-109.

30 33. Broach, J.R., Strathern, J.N. and Hicks, J.B. (1979),

Gene 8, 121-133.

34. Das, S., Kellerman, E. and Hollenberg, C.P. (1984), 35 J.Bacteriol. 158, 1165-1167.

Litteraturliste (fortsat) 41

O

DK 175036 B1 35. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. and Kimura, A.

(1983), J.Bacteriol. 1^3, 163-168.

5 36. Klebe, R.J., Harriss, J.V., Sharp, Z.D. and Douglas, M.G. (1983), Gene 25, 333-341.

37. Hollenberg, C.P. (1982), Curr.Top.Microbiol.Immunol.

10 96, 119-144.

38. Kato, N., Omori, Y., Tani, Y. and Ogata, K. (1976),

Eur.J.Biochem. 64, 341-350.

15 39. Schiitte, H., Plossdorf, J. , Sahm, H. and Kula, M.R. , (1976), Eur.J.Biochem. 62, 151-160.

40. Ronchi, S., Minchiotti, L., Galliano, M., Curti, B.,

Swenson, R.P., Williams, C.H. and Massey, V. (1981), 20 J.Biol.Chem. 257, 8824-8830.

41. Ratzkin, B. and Carbon, J. (1977), Proc.Natl.Acad.

Sci.USA 74, 487-491.

25 42. Coudé, F.X., Diaz, J., Morre, M., Roskam, W. and

Roncucci, R. (1984), Trends in Biotechnology 2, 83- 88.

43. Itakura, K., Hirose, T., Crea, R., Riggs, A.D., 30 Heyneker, H.L., Bolivar, F. and Boyer, H.W. (1977),

Science 198. 1056-1063.

44. Goldman, B.M. and Blobel, G. (1978), Proc.Natl.

Acad.Sci.USA 75, 5066-5070.

35

O

42

Litteraturliste (fortsat) DK 175036 B1 45. Robbi, M. and Lazarow, P.B. (1978), Proc.Natl.Acad.

5 Sci.USA 75, 4344-4348.

46. Lingappa, V.R., Lingappa, J.R. and Blobel, G.

(1979), Nature 281, 117-121.

10 47. Watson, J.D., Tooze, J. and Kurtz, D.T. (1983),

Recombinant DNA, A Short Course, page 178, published by W.H. Freeman and Company, New York.

48. Lee, J.D. and Komagata, K. (1980), J.Gen.Appl.

15 Microbiol. 26^, 133-158.

Tabel I

20 Aktiviteter for orotidin-51-phosphatdecarboxylase og orotidin-5'-phosphatphosphorylase i H. polymor-_phamutanter, som kræver uracil til vakst_ _Aktivitet (%)a_

Stamme/- Reversionsgenotype grad Orotidin-5'- Orotidin-5- phosphatde- phosphat 25 _carboxylase_phosphorylase

Vildtype - 100 100 LR 9/odcl <2 x 109 <1 106 MR 7/odel 6 x 107 <1 71 NM 8/odcl 3 x 108 <1 105 30 CLK 55/oppl n.e.b 90 <1 CLK 68/oppl n.e. 82 ^1 YNN 27/ura3 n.e. 0 n.e.

Stammerne dyrkes i YEPD til den sene exponentialfase-Celleextraktion gennemføres med glasperler under anvendel-35 se af en Braun-homogenisator. Protein bedømmes ved optisk tæthed ved 280 nm.

DK 175036 B1 43

O

a) Udtrykt som procentdelen af vildtypens aktivitet.

b) Ej bedømt.

Tabel II

5 Transformation af uracilkrævende mutanter af H. poly- mutanter _ r J r

Stamme Plasmid Transformations- Stabilitet'· Status for frekvens3 (I) transformeret

__;_DNA

LR 9 YRP17 2,2 x 102 <1 autonom repli kat ion 10 3 LR 9 pHARSl 1,5 x ΚΓ 2 LR 9 pHARS 2 4,6 x 102 1,5 LR 9 YIP5 3 (38)C 105 integration LR 9 pBR58 0

LR 9 pHH85 O

15 YNN 27 YIP5 0 a) Udtrykt som total antal pr. pg DNA. Intakte celler behandlet med polyethylenglycol anvendes til transformation således som beskrevet i Materials and Methods.

b) Udtrykt som procentdelen af tilbageværende uracil pro- 20 totrofer efter dyrkning på YEPD i 10 generationer.

c) Antal i parentes angiver mængden af minikolonier indeholdende frit plasmid YIP5.

25 30 35 44 DK 175036 B1 Λ u

Tabel III

Aminosyresammensastning af MOX

3.)

Aminosyre_DNA-sekvens_Hydrolysat PHE 31 32 5 LEU 47 49 ILE 34 34 MET 12 11 VAL 42 43 SER 43 33 10 PRO 43 42 THR 44 38 ALA 47 50 TYR 27 27 HIS 19 21 15 GLN 13 GLU 36 3 51 ASN 32 ASP 50 3 84 LYS 35 38 20 CYS 13 12 TRP 10 - b) ARG 36 36 GLY 50 53 a) Hydrolyse gennemført i 24 timer 25 b) Ej bestemt 30 35 DK 175036 B1 45 0

Tabel IV

Sammenligning af foretrukken codon-udnyttelse i S.

_cerevisiae, H. polymorpha og E. coli_ 5 Saccharomyces Hansenula E. coli

MOX

ALA GCU, GCC GCC GCC udnyttes ikke ingen klar pref.

SER UCU, UCC UCC, UCG UCU, UCC

10 THR ACU, ACC ACC ACU, ACC

VAL GUU, GUC GUA udnyttes ikke GUU, GUA

ingen klar pref. .

ILE AUU, AUC AUC, AUU AUC

ASP GAC GAC GAC

15 PHE UUC UUC UUC

TYR UAC UAC UAC

CYS UGU ingen klar pref. ingen klar pref.

ASN AAC AAC AAC

HIS CAC CAC CAC

20 GLU GAA GAG G AA

GLY GGU GGC udnyttes GGU, GGC

praktisk taget ikke, ingen klar pref.

GLN C AA CAG CAG

LYS AAG AAG AAA

25 pro CCA CCU, CCA CCG

LEU UUG CUG, CUC CUG

ARG AGA AGA CGU

30 35 0 46 DK 175036 B1

Figurforklaring

Fig. 1 viser den exonuclease Bal31-fordøjelses-strategi, som anvendes ved sekvensbestemmelse af specifikke MOX-subkloner. Fragmentet X-Y subklonet i Ml3mp-8 5 eller -9, -18 eller -19 skæres ved det særegne restriktionssted Z. DNA-molekylet underkastes tidsafhængig fordøjelse med exonuclease Bal31. DNA-fragmentet, der befinder sig tæt ved M13-sekvenseringsprimeren, fjernes under anvendelse af restriktionsenzym Y. Enderne gøres 10 stumpe ved inkubation med T^-DNA-polymerase og ligateres derpå intramolekylært. Phag-plader opsamles efter transformation, og fragmentet sekvenseres fra stedet Z i retning af stedet X. Under anvendelse af Ml3-derivatet med et omvendt multipel kloningssted sekvenseres fragmentet 15 fra stedet Z i retning af stedet X.

Fig. 2 viser indretningen af pHARS-plasmider afledt ved indsætning af HARS-fragmenter i det enkelte Sall-sted hos YIp5.

Fig. 3 viser den komplette nucleotidsekvens hos 20 HARS-1-fragmentet.

Fig. 4 viser en vurdering af kopitallet ved Sou-thern-hybridisering af H. polymorpha-transformanter. En aliquot del på 8 og 16 pi af hver enkelt sonde underkastes elektroforese. Resultaterne heraf er som følger: 25 bane 1 viser phag lambda DNA fordøjet med Hindlll og EcoRI. Bane 2 og 3 viser transformanter af K. lactis indeholdende to kopier af integreret plasmid fordøjet med HindiII (jfr. M. Reynen, K. Breuning og C.P. Hollen-berg i utrykt litteratursted), bane 4 til 7 viser hen-30 holdsvis YNN 27 transformeret med pRB58 (bane 4 og 5) og YRP17 (bane 6 og 7) fordøjet med EcoRI, og bane 8 og 9 viser resultat for LR9 transformeret med YRP17 fordøjet med EciRI, medens bane 10 og 11 viser resultater for LR9 transformeret med pHARS2 fordøjet med 35 Hindlll, og bane 12 og 13 viser resultater for LR9 0 47 DK 175036 B1 transformeret med pHARSl fordøjet med EcoRI.

Fig. 5 viser et autoradiogram af Southern-af-tryk af DNA af H. polymorpha-mutant LR9 transformeret ved integration af plasmid YIp5. Bane 1 viser resulta-5 ter for phag lambda DNA fordøjet både med HindIXI og EcoRI, bane 2 viser resultat for pHARS-1 ufordøjet, og bane 3-5 og bane 6-7 viser DNA fra to forskellige trans-formanter. Bane 3 viser resultater fra ufordøjet prøve, bane 4 for prøve fordøjet med EcoRI, bane 5 for prøve io fordøjet med PvuII, bane 6 for prøve fordøjet med EcoRI, bane 7 for prøve fordøjet med PvuII, og bane 8 plasmid YIp5 fordøjet med EcoRI. Nicktranslateret YIp5 anvendes som hybridiseringssonde.

32

Fig. 6 viser resultater af elektroforese af p-15 -mærket RNA fra Hansenula polymorpha renset én gang (bane A) eller to gange (bane B) på oligo(dT)cellulose.

Der gennemføres elektroforese på en denaturerende 7 M urinstof, 2,5% polyacrylamidgel. Stillingen for gær--rRNA'erne og deres respektive molekylvægte er angivet 20 ved 18S og 25S. 2,3 kb båndet, der kan ses i bane B, omdannes til en cDNA-sonde, som derpå anvendes til at isolere MOX- og DHAS-kloner fra Hansenula polymorpha-klonbanken.

35

Fig. 7 viser resultater for med S-mærkede pro-25 teiner, der fås efter in vitro-translation af methanol-derepresseret Hansenula polymorpha mRNA med et kanin-reticulocytlysat. Enten 2 pi af det totale lysat (bane A) eller en immunfældning af de tilbageværende 18 γΐ under anvendelse af et MOX-specifikt antiserum (bane B) 30 adskilles på en 11,5%'s SDS-polyacrylamidgel. En blanding af proteiner med kendte molekylvægte anvendes som markører.

Fig. 8 viser den N-terminale sekvens af renset MOX således som bestemt på en Beckman-sequenator. De 35 to sonder, der kan udledes fra sekvensen Pro-Asp-Gln-

O

48 DK 175036 B1 -Phe-Asp under anvendelse af codoner foretrukket af Saccharomyces er angivet.

Fig. 9 viser hybridisering af et DBM-aftryk med Hindlll/Sall afskårne MOX-kloner. DNA’et adskilles på 5 en 1,5%'s agarosegel (fig. 9A), og aftrykket hybridise-res til en blanding af begge MOX-afledte syntetiske DNA--sonder (fig. 8). Kun ét bånd af klonerne 1, 4 og 5 hy-bridiserer (fig. 9B), hvilket er antydet ved en pil i fig. 9A. Bane M viser molekylvægtsmarkører således som 10 angivet. Bane A, B, C og D viser de respektive kloner 1, 3, 4 og 5, og bane E viser lambda L47.1.

Fig. lO viser et restriktionskort for MOX klon 4.

Kun relevante restriktionssteder er angivet, og som er anvendt til subkloning og sekvensering af MOX-genet. Den 15 åbne aflæsningsramme indeholdende struktur-MOX-sekvensen og de fremstillede M13 subkloner er afbildet. De anvendte restriktionssteder er: B- BamHI, Ej = EcoRX, Ev =

EcoRV, P = PstI, SI = Sall, Sc = Sad, St = Stul, H =

Hindlll, Sp = Sphl, K = Kpnl, Hg = HgiAI og X = Xmal.

20 Fig. 11A og B viser MOX-strukturgenets nucleotid- sekvens og dens 5'- og 3'-flankeringssekvens.

Fig. 12A og C viser konstruktionen af plasmid pUR 3105, ved hvilken neomycin phosphotransferasegenet integreres i H. polymorpha's kromosomale MOX-gen.

25 Fig. 12B viser promotor MOX-neomycinphosphotrans- feraseadapterfragmenter.

Fig. 13 viser AAO-genet's DNA sekvens udledt ud fra den offentliggjorte aminosyresekvens. Genet syntetiseres ved den optimale codonudnyttelse for H. polymorpha 30 i oligonucleotider på ca. 50 nucleotiders længde. De anvendte restriktionssteder til subkloning er angivet. HgiAI-Sall-fragmenterne danner adapteren mellem struktur AAO-genet og MOX-promotoren. Translationsstartcodo-net (met) og -stopcodonet ( ) er angivet, strukturse- 35 kvensen er nummereret fra 1 til 1044, medens MOX-promo- 0 49 DK 175036 B1 toren er nummereret fra -34 og -1.

Fig. 14A viser konstruktionen af pUR 3003, ved hjælp af hvilken AAO-genet integreres i H. polymorpha's kromosomale MOX-gen. Der foretages udvælgelse på grund-5 lag af AAO-genets aktivitet.

Fig. 14B viser konstruktionen af pUR 3004, ved hjælp af hvilken AAO-genet integreres i det kromosomale MOX-gen af et H. polymorpha leu~-derivat. Der foretages udvælgelse på grundlag af leu ’.

10 Fig. 14C viser konstruktionen af pURS 528-03. På grund af fjernelsen af pCRl-sekvensen og den dobbelte lac UV5-promotor er dette plasmid ca. 2,2 kb kortere end pURY 528-03.

Fig. 15 viser DNA-sekvensen af HGRF-genet udledt 15 ud fra den publiserede aminosyresekvens. Genet syntetiseres ved den optimale codonudnyttelse for H. polymorpha i oligonucleotider på ca. 50 nucleotiders længde.

HgiAI-, Hindlll- og Sall-steder anvendes til subkloning. HgIAI-HindIII-fragmentet danner adapteren mellem struk-20 tur HGRF-genet og MOX-promotoren. Translationsstartcodo- uuu net (met) og stopcodonet ( ) er angivet. Strukturse- kvensen er nummereret fra 1 til 140, medens MOX-promoto-ren er nummeret fra -34 til -1.

Fig. 16A viser konstruktionen af pUR 3203, ved 25 hjælp af hvilken genet, der koder for HGRF, integreres ind i H. polymorpha's kromosomale MOX-gen. Der foretages udvælgelse på grundlag af HGRF's immunologe aktivi tet.

Fig. 16B viser konstruktionen af pUR 3204, ved 30 hjælp af hvilken genet, der koder for HGRF, integreres ind i det kromosomale MOX-gen af et H. polymorpha leu~--derivat. Der foretages udvælgelse på grundlag af leu+.

Fig. 16C viser konstruktionen af pUR 3205, ved hjælp af hvilken genet, der koder for HGRF, indsættes 35 i et HARS-l-holdigt plasmid, der replikerer autonomt 50 DK 175036 B1 f\ i H. polymorpha. Der foretages udvælgelse ved hjælp af transformation af en ura -mutant.

Fig. 16D viser konstruktion af pUR 3209, ved hjælp af hvilken genet, der kodet for HGRF, integre-5 res ind i H. polymorpha's kromosomale MOX-gen fuseret til struktur-MOX-genet. HGRF spaltes fra fusionsproteinet ved CNBr-spaltning. Der foretages udvælgelse på grundlag af HGRF's immunologe aktivitet.

Fig. 16E viser konstruktionen af pUR 3210, ved 10 hjælp af hvilken genet, der koder for HGRF, indsættes i et HARS-l-holdigt plasmid fuseret til struktur-MOX-genet. Der foretages udvælgelse som anført under fig. 16C.

Fig. 16F viser konstruktionen af pUR 3211, ved hjælp af hvilken genet, der koder for HGRF, integreres 15 ind i det kromosomale MOX-gen af et H. polymorpha leu --derivat fuseret til struktur-MOX-genet. Der foretages udvælgelse på grundlag af leu+.

Fig. 17 viser HGRF-genets DNA-sekvens udledt ud fra den offentliggjorte aminosyresekvens. Genet synte-20 tiseres som nævnt under fig. 15, men konstrueres på en sådan måde, at det kan indsættes i det særegne KpnI-sted hos struktur-MOX-genet. Det er derfor udstyret med KpnI-steder på begge sider af genet, og KpnI-HindIII-fragmenter anvendes til subkloning. Syntesen vil være som 25 et fusionsprodukt til MOX-enzymet. Det interne met (ATG) ved stilling 82 omdannes til et cys (TGT). Translations-startcodonet (met) og -stopcodonet (xxx) er angivet.

Fig. 18A, B og C viser nucleotidsekvensen hos DAS-strukturgenet og dets 5' og 31-flankeringssekvens.

30 Fig. 19 viser et restriktionskort for DAS-lambda- klonen. Der er kun angivet relevante restruktionssteder, som er benyttet til subkloning og sekvensering af M0X-ge-net. Den åbne aflæsningsramme indeholdende struktur DAS--sekvensen og de fremstillede Ml3-subkloner er afbildet.

35 Fig. 20 viser identiske sekvenser i -1000-regionen af DAS- og MOX-gener.

Claims (2)

51 DK 175036 B1 1. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved dyrkning af en mikroorganisme under sådanne betingelser, at mikroorganismen producerer polypeptidet, eventuelt kon- 5 centrering af polypeptidet og fraskillelse af dette på i og for sig kendt måde, kendetegnet ved, der anvendes en transformeret mikroorganisme, som bærer et strukturelt gen, som koder for det pågældende polypeptid og er under kontrol af et regulon omfattende en promotor og i det mindste 10 enten -1052 til -987-regionen af MOX-genet af Hansenula polymorpha CBS 4732 anført i fig. 11A, eller -1076 til -937-regionen af DAS-genet af Hansenula polymorpha CBS 4732 anført i fig. 18A, eller en tilsvarende region af andre methylotrofe skimmelarter eller gærarter, eller en modikation af enhver 15 af disse regioner, som ikke forringer regulon-funktionen, hvorved det strukturelle gen, som koder for polypeptidet, og regulonet er indført i mikroorganismen ved hjælp af en vektor. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-20 net ved, at promotoren er afledt fra gærarten Hansenula polymorpha. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende -tegnet ved, at mikroorganismen er en skimmelart eller gærart. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at skimmelarten eller gærarten er valgt blandt slægterne Aspergillus, Candida, Geotrichum, Hansenula, Len-zites, Nadsonia, Pichia, Poria, Polyporus, Saccharomyces, Sporobolomyces, Torulopsis, Trichospora og Zendera. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg net ved, at skimmelarten eller gærarten er valgt blandt Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida boidinii, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Hansenula wingeii, Kloeckera sp. 2201 og Pichia pastoris. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg net ved, mikroorganismen er gærarten Hansenula polymorpha. 52 DK 175036 B1 7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det strukturelle gen er forsynet med en eller flere DNA-sekvenser, som translokerer genproduktet til peroxisomerne eller tilsvarende mikrolegemer 5. den mikrobielle værtsorganisme. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at DNA-sekvenserne består af MOX-genet eller de dele deraf, som er ansvarlige for MOX-translokering til peroxisomerne eller mikrolegemerne. 9. Transformeret mikroorganisme, egnet til anvendelse ved en fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-8, omfattende et strukturelt gen, som koder for polypeptidet, der skal fremstilles, idet ekspressionen af genet er under kontrol af et regulon omfattende en promotor og i det mindste enten 15 -1052 til -987-regionen af MOX-genet anført i fig. 11A eller -1076 til -937-regionen af DAS-genet anført i fig. 18A af Hansenula polymorpha CBS 4732, eller en tilsvarende region af andre methylotrofe skimmelarter eller gærarter, eller en effektiv modifikation af enhver af disse regioner. 10. Kombination af DNA-sekvenser, som er egnet til transformation af en mikrobiel værtsorganisme til produktion af et polypeptid og indeholdende et regulon, et strukturelt gen, som koder for polypeptidet, og eventuelt en terminator, kendetegnet ved, at der anvendes et regulon valgt 25 blandt i det mindste en del af regulonet -1 til ca. -1500 af MOX-genet anført i fig. 11A eller i det mindste en del af regulonet -1 til ca. -2125 af DAS-genet anført i fig. 18A, og modifikationer deraf, som ikke forringer regulon-funktionen, og eventuelt anvendes en terminator valgt blandt 30 i det mindste en del af terminatoren 1993 til ca. 3260 af MOX-genet anført i fig. 11B eller i det mindste en del af terminatoren 2110 til ca. 2350 af DAS-genet anført i fig. 18B, og modifikationer deraf, som ikke forringer terminator-funktionen. 11. Kombination af DNA-sekvenser ifølge krav 10, kendetegnet ved, at regulonet omfatter en promotor 53 DK 175036 B1 og i det mindste enten -1052 til -987-regionen af MOX-genet eller -1076 til -937-regionen af DAS-genet af Hansenula polymorpha CBS 4732 eller en tilsvarende region af andre methylotrofe skimmelarter eller gærarter, eller en effektiv 5 modifikation af enhver af disse regioner. 12. Kombination af DNA-sekvenser ifølge krav 10 eller 11, kendetegnet ved, at den er egnet til transformation af en Hansenula-gærart, især Hansenula polymorpha. 13. Kombination af DNA-sekvenser ifølge krav 10 eller 10 11, kendetegnet ved, at den er egnet til trans formation af en Saccharomyces-gærart, især Saccharomyces cerevisiae. 14. Kombination af DNA-sekvenser ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det strukturelle gen, som 15 koder for polypeptidet, indeholder DNA-sekvenser dannet ud fra det strukturelle gen, som koder for MOX (fig. 11A + 11B), som modificerer polypeptidet, uden at forringe dets funktioner, på en sådan måde, at polypeptidet translokeres til peroxisomerne eller ækvivalente mikrolegemer i den nævnte 20 mikrobielle værtsorganisme. z Fig. 7. z Xv' */ 7. primer / i MI3mp8,9 \ .... / i ig jg restnktions- 1 +InsatsX-Y enzym Z r l , jø Æ? Øø primer DK 175036 B1 Y ^primer restrik- / \ tions- | I j^enzym^J^^ \ J <?/ S' Æ? \*Xj? Y Fig.l (FORTSAT) DK 175036 B1 Fig. 2. PvuW / / pHARS \\ | 7,5 kb \ \ |URA3 6<0kb JJ \ s&EcoR\ \^_^r^W/ndlll ^ÆsSomHI HÅRS 2 ét-zra-^ l,9kb Sal I Pw/ll EcoRI So/1 HÅRS I as-a. Q4kb SalΪΛ So/1 W/ndlll DNS sekvens for den autonomt replikerende sekvens HARS1 fra den methylotrophe gær Hansenula polymorpha. HARS1 repræsenterer et Sall fragment omfattende 499 nucleotider. Dideoxy-sekvenserings-metoden er benyttet. 2 (GjTCGACTCCC GCGACTCGGC GTTCACTTTC GAGCTATTAT 40 CAACGCCGGA ATACGTCAGA AACAGCCGTG CCCCAGGGAC 80 CAGAAAGCCT ACTGGTGAGT ATGTTCTTTC GTGTGATTTT 120 TCCGAGGATG AGAACGACGA TAACGAGCAC AACTCGGAGT 160 CGGAGGACAC GCTTATTGCG TTGAACGCAG CCACATCAGC 200 AGGCTGTCAA GACTGAGTAT GGCCACAGAG CTGGATTCTC 240 GGCCTCATAC TCAAGACGTT AGTAAACTCC GTCTGCCAGA 280 AATTGCTGAC GAGGATGTAT AATAATAGAT GAATTACGAA 320 CAATTGTAGT TCAAAAAAAT TTAGTAACAA TATTGTCTAG 360 ATGACAGATG TGCTGAAACC AGTGAACTCC AATAAACCAC 400 TCACCGCTAC CCAAGAGAAA CAGATCAGAG TGCTAGGGCC 440 TTGTTTCAGA GTACTACAAC GTTTACCAGA AGCTTGAGCA 480 AGTTCTCAAA CGCGGGTTTG(TCGAC) 500 DK 175036 B1 Fig Λ. - I i *=* i i i i } i I 2 3 4 5 6 7 8 9 ΙΟ II 12 13 DK 175036 B1 Fig: 5. 9 'β - ^ 1 o" ^ kJ m w* μ A a , *1 4^ I ! ·* ! . * I i ! I__ I 12 3 4 5 6 7 8 DK 175036 B1 Fig·6· Fig. 7. længde/kb A B M AB „o (W) --- 3,2 ^ 25S rRNA I: 94—' 2,1 Ir ; fif® ]&» 66-ί kÆ 1,8 lp l8s rRNA Jff • 40- (K -v ·. 1 j * * *! ff -.?.· 4' j£ *,° ^ m - f 2S—— r i i___I I_I 20— Fig. 8. NH2”A1 a-Π e-Pro-Asp-G1 u-Phe-Asp-Il e-Π e-Val -Val - CCA GAC GAA TTC GA CCA GAT GAA TTC GA / -Gly-Gly- * -Thr-Gly-Cys-Cys-Ile-Ala-Gly- * -Leu -A1a-Asn-Leu-Asp-Asp-Gln-Asn-Leu Fig. 9. /1 B A B ^ C D E ^ M ^ A^ E Fig.10. Phag Λ 47,1 Hansenula DNA -\/- X Hg Ej Ei Η B SI IstSp^lEvEi SI Kp Ey Sc I i * —i_11 . „i i t« [ i i »i i *· i 1 _i--1-«- P P P 5I 3i åben aflæsningsramme 1-► i 1 I_I > —I L_J l_I M13 subcloner , , i L. I I-1 L. ....... ..... ... I kb * Fig.11A. GTCGACGCGG AGAACGATCT CCTCGAGCTG CTCGCGGATC AGCTTGTGGC CCGGT- -1501 AACCAGGCCG ACGCGACGCT CCTTGCGGAC CACGGTGGCT GGCGAGCCCA GTTTG' -1451 -1401 GAGGTCGTTT AGAACGTCCT GCGCAAAGTC CAGTGTCAGA TGAATGTCCT CCTCGl -1351 ATTCAGCATG TTCTCGAGCA GCCATCTGTC TTTGGAGTAG AAGCGTAATC TCTGC -1301 GTTACTGTAC CGGAAGAGGT AGTTTGCCTC GCCGCCCATA ATGAACAGGT TCTCT’ -1251 GTGGCCTGTG AGCAGCGGGG ACGTCTGGAC GGCGTCGATG AGGCCCTTGA GGCGC -1201 GTACTTGTTC CGTCGCTGTA GCCGGCCGCG GTGACGATAC CCACATAGAG GTCCT' -1151 -1101 ATTAGTTTGA TGAGGTGGGG CAGGATGGGC GACTCGGCAT CGAAATTTTT GCCGTi -1051 TACAGTGTGA TGTCACCATC GAATGTAATG AGCTGCAGCT TGCGATCTCG GATGG' -1001 GAATGGAAGA ACCGCGACAT CTCCAACAGC TGGGCCGTGT TGAGAATGAG CCGGA' -951 TTGAACGAGG GGGCCACAAG CCGGCGTTTG CTGATGGCGC GGCGCTCGTC CTCGA' -901 AAGGCCTTTT CCAGAGGCAG TCTCGTGAAG AAGCTGCCAA CGCTCGGAAC CAGCTi -851 -801 AGCCGAGACA ATTCGGGGGT GCCGGCTTTG GTCATTTCAA TGTTGTCGTC GATGAi -751 TCGAGGTCGT GGAAGATTTC CGCGTAGCGG CGTTTTGCCT CAGAGTTTAC CATGA* -701 Fig. 11B. TCCACTGCAG AGATGCCGTT GCTCTTCACC GCGTACAGGA CGAACGGCGT GC -651 CCCTTGATCC ATTCTATGAG GCCATCTCGA CGGTGTTCCT TGAGTGCGTA Cl - 601 TAGCGACTGG ACATCTCGAG ACTGGGCTTG CTGTGCTCGA TGCACCAATT A/ -551 -5 GCATGCATCC TTGCACCGCA AGTTTTTAAA ACCCACTCGC TTTAGCCGTC GC -451 TGTGAATCTG GCAACTGAGG GGGTTCTGCA GCCGCAACCG AACTTTTCGC ΤΊ -401 CAGCTGGATG GTGTCATGTG AGGCTCTGTT TGCTGGCGTA GCCTACAACG TC -351 TAACCGGACG GCGCTACCCA CTGCTGTCTG TGCCTGCTAC CAGAAAATCA CC -301 AGAGGGCCGA TGTGGCAACT GCTGGGGTGT CGGACAGGCT GTTTCTCCAC AG -251 -2 CGGGTGAACC GGCCAGAAAG TAAATTCTTA TGCTACCCTG CAGCGACTCC G/ -151 GTTTTTGCCC TACTTGATCA CAGATGGGGT CAGCGCTGCC GCTAAGTGTA C< -101 C CCACACGGT CCATCTATAA ATACTGCTGC CAGTGCACGG TGGTGACATC A/ -51 1 5 10 MET ALA ILE PRO ASP GLU PHE ASP ILE ILE VAL VAL GLY G1 ACAAAAACAAA ATG GCC ATT CCT GAC GAA TTC GAT ATC ATT GTT GTT GGT GC -11 20 25 30 GLY CYS CYS ILE ALA GLY ARG LEU ALA ASN LEU ASP ASP GLN ASN LEU ΊΙ GGC TGC TGC ATT GCG GGC AGA CTC GCA AAC CTC GAC GAC CAA AAC CTC A< 40 45 50 Fig. VC, ILE GLU GLY GLY GLU ASN ASN ILE ASN ASN PRO TRP VAL TYR LEU PRO GL ATC GAG GGT GGT GAG AAC AAC ATC AAC AAC CCT TGG GTC TAC CTT CCC GG 60 65 70 ARG ASN MET ARG LEU ASP SER LYS THR ALA THR PHE TYR SER SER ARG PR AGA AAC ATG AGA CTC GAC TCC AAG ACG GCC ACC TTC TAC TCG TCC AGA CC 80 85 90 LEU ASN GLY ARG ARG ALA ILE VAL PRO CYS ALA ASN ILE LEU GLY GLY GL CTG AAC GGC AGA AGA GCG ATC GTT CCT TGC GCC AAC ATC CTT GGA GGC GG 100 105 110 ASN PHE LEU MET TYR THR ARG ALA SER ALA SER ASP TYR ASP ASP TRP GL AAC TTT CTG ATG TAC ACC AGA GCC TCT GCT TCC GAC TAC GAC GAC TGG GA 120 125 130 TRP SER THR ASP GLU LEU LEU PRO LEU ILE LYS LYS ILE GLU THR TYR GL TGG AGC ACC GAC GAG TTG CTA CCT CTG ATC AAA AAA ATC GAA ACT TAC CA 140 145 150 ASN ASN ARG ASP LEU HIS GLY PHE ASP GLY PRO ILE LYS VAL SER PHE GL AAC AAC AGA GAT CTG CAC GGC TTT GAC GGC CCA ATC AAG GTT TCC TTT GG 160 165 170 TYR PRO THR CYS GLN ASP PHE LEU ARG ALA ALA GLU SER GLN GLY ILE PR TAT CCT ACG TGC CAG GAC TTC CTG AGA GCA GCA GAG TCG CAG GGA ATT CC 180 185 190 ASP LEU GLU ASP PHE LYS THR SER HIS GLY ALA GLU HIS TRP LEU LYS TR GAC CTG GAG GAC TTC AAG ACA TCG CAT GGT GCA GAG CAC TGG CTG AAG TG 200 205 210 ASP LEU GLY ARG ARG SER ASP SER ALA HIS ALA TYR VAL HIS PRO THR ME GAC CTG GGC AGA AGA TCG GAT TCT GCG CAC GCC TAC GTC CAC CCA ACT AT 220 225 230 GLN SER LEU PHE LEU ILE THR SER THR LYS CYS ASP LYS VAL ILE ILE GL CAG AGC CTG TTC CTC ATC ACC TCC ACC AAG TGT GAC AAG GTG ATC ATC GA 240 245 250 ALA VAL ALA VAL ARG THR VAL PRO MET LYS PRO LEU ASN PRO LYS LYS PR Fig. W. GOT GTG GCC GTG AGA ACA GTG CCA ATG AAG CCT CTG AAC CCT AAG AAG C 260 265 270 THR PHE ARG ALA ARG LYS GLN ILE VAL ILE SER CYS GLY THR ILE SER S ACC TTC AGA GCC AGA AAG CAG ATT GTG ATC TCC TGC GGA ACC ATC TCG T 280 285 290 LEU GLN ARG SER GLY ILE GLY ALA ALA HIS HIS LEU ARG SER VAL GLY V CTC CAG AGA TCT GGT ATT GGT GCA GCT CAC CAC TTG AGA TCC GTG GGG G 300 305 310 VAL ASP LEU PRO GLY VAL GLY GLU ASN PHE GLN ASP HIS TYR CYS PHE P GTC GAC CTG CCA GGT GTG GGT GAG AAT TTC CAG GAC CAC TAC TGT TTC T 320 325 330 TYR VAL LYS PRO ASP VAL PRO THR PHE ASP ASP PHE VAL ARG GLY ASP P TAC GTC AAG CCT GAC GTT CCT ACG TTC GAC GAC TTT GTC AGG GGC GAC C 340 345 350 LYS ALA ALA PHE ASP GLN TRP TYR SER ASN LYS ASP GLY PRO LEU THR T AAG GCC GCT TTC GAC CAG TGG TAC TCC AAC AAG GAC GGT CCA TTG ACC A 360 365 370 GLU ALA GLY VAL LYS ILE ARG PRO THR GLU GLU GLU LEU ALA THR ALA A GAA GCC GGA GTC AAG ATC AGA CCT ACC GAA GAG GAG CTG GCT ACC GCG G 380 385 390 ARG ARG GLY TYR ALA GLU TYR PHE GLU ASN LYS PRO ASP LYS PRO LEU M AGA CGC GGC TAC GCA GAG TAC TTC GAG AAC AAG CCA GAC AAG CCT CTG A 400 405 410 VAL ILE SER GLY PHE PHE GLY ASP HIS THR LYS ILE PRO ASN GLY LYS P GTC ATC TCC GGC TTC TTT GGA GAC CAC ACC AAG ATT CCT AAC GGC AAG T 420 425 430 PHE HIS PHE LEU GLU TYR PRO PHE SER ARG GLY PHE VAL ARG ILE THR S TTC CAC TTC CTG GAG TAT CCA TTC TCC AGA GGA TTT GTT AGA ATC ACC T 440 445 450 Fig. 11E. 440 445 450 TYR ASP ALA PRO ASP PHE ASP PRO GLY PHE LEU ASN ASP GLU ARG ASP LEU TAC GAC GCT CCT GAG TTC GAT CCC GGC TTC CTC AAT GAC GAA AGA GAC CTG 460 465 470 VAL TRP ALA TYR LYS LYS SER ARG GLU THR ALA ARG ARG MET GLU SER PHE GTC TGG GCA TAC AAG AAG TCC AGA GAG ACG GCC AGA AGA ATG GAG AGC TTT 480 485 490 VAL THR SER HIS HIS PRO LEU PHE LYS VAL ASP SER PRO ALA ARG ALA ARG GTC ACC TCG CAC CAC CCA TTG TTC AAG GTT GAC TCG CCA GCC AGA GCC AGA 500 505 510 LEU GLU THR CYS SER ALA TYR ALA GLY PRO LYS HIS LEU THR ALA ASN LEU CTC GAG ACA TGC AGT GCA TAT GCC GGT CCT AAG CAC CTC ACT GCC AAC CTG 520 525 530 SER TRP THR VAL PRO ILE ASP LYS PRO THR PRO LYS ASN ASP PHE HIS VAL TCG TGG ACC GTT CCT ATC GAC AAG CCA ACG CCT AAG AAC GAT TTC CAC GTG 540 545 550 GLN VAL GLN LEU HIS SER ASP ILE GLU TYR THR GLU GLU ASP ASP GLU ALA CAA GTC CAA CTG CAC TCC GAC ATC GAG TAC ACC GAG GAG GAC GAC GAG GCC 560 565 570 TYR ILE LYS GLU HIS THR GLU THR THR TRP HIS CYS LEU GLY THR CYS SER TAC ATT AAG GAA CAC ACC GAG ACC ACT TGG CAC TGT CTG GCT ACC TGC TCG 580 585 590 ARG GLU GLY SER LYS ILE ALA PRO LYS GLY GLY VAL LEU ASP ALA ARG LEU AGA GAG GGT AGT AAG ATT GCT CCT AAG GGA GGT GTC TTG GAC GCC AGA CTG 600 605 610 GLY VAL GLN ASN LEU LYS VAL ALA ASP LEU SER VAL CYS PRO ASP ASN VAL Fig. 11F GGA GTC CAG AAC CTC AAG GTT GCG GAC CTT TCT GTT TGT CCC GAC AAC GTT 620 625 630 THR TYR SER THR ALA LEU THR ILE GLY GLU LYS ALA ALA THR LEU VAL ALA ACC TAC TCT ACT GCA TTG ACC ATC GGT GAG AAG GCT GCC ACT CTT GTT GCT 640 645 650 GLY TYR SER GLY SER ASP LEU ASP MET THR ILE PRO ASN PHE ARG LEU GLY GGC TAC TCA GGC TCC GAC CTG GAC ATG ACG ATT CCA AAC TTC AGA CTC GGA 660 GLU THR GLY LEU ALA ARG PHE *** GAG ACC GGA CTT GCC AGA TTC TAA GGAG ACGTGGAAGG ACATACCGCT TTTGAGAA 2000 GTGTTTGAAA ATAGTTCTTT TTCTGGTTTA TATCGTTTAT GAAGTGATGA GAT 2050 TGAAATAGCG AGTATAGGAA AATTTAATGA AAATTAAATT AAATATTTTC TTA 2 100 AGTCACCTTC AAAATGCCGG CCGCTTCTAA GAACGTTGTC ATGATCGACA ACT 2150 220 GTTTACCTGG AACCTGTACG AGTACCTGTG TCAGGAGGGA GCCAATGTCG AGG 2250 GAACGATCAG ATCACCATTC CGGAGATTGA GCAGCTCAAG CCGGACGTTG TGG 2300 CCCTGGTCCT GGCCATCCAA GAACAGACTC GGGAATATCT CGCGACGTGA TCA 2350 TAAAGGCAAG ATTCCTGTCT TTGGTGTCTG TATGGCCCAG CAGTGTATCT TCG 2400 TGGCGGAGAC GTCGAGTATG CGGGCGAGAT TGTCCATGGA AAAACGTCCA CTG 2450 250 Fig. 77G. CGACAACAAG GGAATGTTCA AAAACGTTCC GCAAGATGTT GCTGTCACCA GATACCA' 2550 GCTGGCCGGA ACGCTCAAGT CGCTTCCGGA CTGTCTAGAG ATCACTGCTC GCACAGA 2600 CGGGATCATT ATGGGTGTGA GACACAAGAA GTACACCATC GAGGGCGTCC AGTTTCA' 2650 AGAGAGCATT CTGACCGAGG AGGGCCATCT GATGATCCAG AATATCCTCA ACGTTTC 2700 TGGTTACTGG GAGGAAAATG CCAACGGCGC GGCTCAGAGA AAGGAAAGCA TATTGGA 2750 2800 AATATACGCG CAGAGACGAA AAGACTACGA GTTTGAGATG AACAGACCGG GGCGCAG 2850 TGCTGATCTA GAACTGTACT TGTCCATGGG ACTGCACCGC CGCTAATCAA TTTTTAC 2900 AGATTGGAGC AGAACATCAG CGCCGGCAAG GTTGCAATTC TCAGCGAAAT CAAGAGA 2950 TCGCCTTCTA AAGGCGTCAT CGACGGAGAC GCTAACGCTG CCAAACAGGC CCTCAAC 3000 GCCAAGGCTG GAGTTGCCAC AATTTCTGTT TTGACCGAGC CAACCTGGTT TAAAGGA 3050 3100 ATCCAGGACC TGGAGGTGGC CAGAAAAGCC ATTGACTCTG TGGCCAATAG ACCGTGT 3150 TTGCGGAAGC AGTTTATCTT CAACAAGTAC CAAATTCTAG AGGCCCGACT GGCGGGA 3200 GACACGGTTC TGCTGATTGT CAAGATGCTG AGCTC 3250 Fig. 12A. λ M0X4(fig.6) Transposon Tn 5 MI3mp9 I Sal I Sal I Sal f alk 2,4 kb fragment isoleres pho j Xma\\\ Xmolll 380 bp fragment isoleres 1,1 kb fragment isoleres alkoholfældn i-_T_-1 IT4 ligase Xm2[llL „Sma\ Sal I So/1 Hin dll 1NEO^\ / pr.MOX \ I pUR 3101 ) λ ΜΟΧ 4 (fig.6) s’tGGC Ν^- 3·« Ν ——CTCCGGCCGCTTG3^ J 3ACGTGCCA---G AG GCCGGC G AACTTA/£. Sal I ’—' NE0 6 NEO 8 ' ' ' ,, HgiM Xma Ilt EcoRI NEO 6 og 7 phosphoryleres 2.4 kb fragment isoleres med T4 polynucleotid kinase og rATP HgiM I NE0 3·6·7 og 8

1 T4 ligase 11 86 bp fragment isoleres 1.5 kb fragment isoleres I L_!__ T4 ligose Xm°"' HgiM Sal I Hin d 111R1 / NE<J \ I pUR 3102 I Fig. 12A Fig. 12B. Promoter MOX-Neomycinphosphotransferase adaptor fragmenter ΝΕΟ3 5’CGGTGGTGACATCAATCTAAAGTACAAA 3' NE06 5'TCATTTTGTTTTTGTACTTTAGATTGATGTCACCACCGTGCA 3' NE07 5’AACAAAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCC NE08 5'AATTCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAA 3 pUR 3101 pU Fin 17Γ xma\\\ ’ *3/· · ^ · alkalisk phosphatase 1,2 kb fr< λΜΟΧ-4 (fig.6) MI3mpl9 __ Sal I Sal\ T4 ligase Soel Soel w v η » 1-\ΎΛ -.-1 Xmolll JT4 ligase ( Sal L ^ u;n <^ίοο°οξ^ A//n dlIIK røn d 111.Soc I / m / / νεοΥλ / \ pUR 3103 / pUR 3104 I \ 1 __I__ ____ DK 175036 B1 | So/I 2,7 kb fragment isoleres ---1 T4 ligase f Hgi AI ttn MOX i pUR 3I05 jo°| W/ndlll Sac I <' transformation Fig. 12C (FORTSAT) I Fig. 13A. <---------------- ----------------- -34 1 CGGTGG TGACATCAAT CTAAAGTACA AAAACAAAAT GAGAGTTGTC GTT ACGTGCCACC ACTGTAGTTA GATTTCATGT TTTTGTTTTA CTCTCAACAG CAA Hgial Met <<---------------> 62 CCGGTGTCAT CGGTCTGTCG ACCGCCCTGT GTATCCACGA GAGATACCAC TCC GGCCACAGTA GCCAGACAGC TGGCGGGACA CATAGGTGCT CTCTATGGTG AGG Sail 122 AGCCTCTGGA CGTTAAGGTC TACGCCGACA GATTCACCCC TTTCACCACC ACC TCGGAGACCT GCAATTCCAG ATGCGGCTGT CTAAGTGGGG AAAGTGGTGG TGG 182 CCGCCGGTCT GTGGCAGCCT TACACCTCCG AGCCTTCCAA CCCTCAGGAG GCC GGCGGCCAGA CACCGTCGGA ATGTGGAGGC TCGGAAGGTT GGGAGTCCTC CGG 242 ACCAGCAGAC CTTCAACTAC CTCCTCTCCC ACATCGGTTC GCCTAACGCC GCC TGGTCGTCTG GAAGTTGATG GAGGAGAGGG TGTAGCCAAG CGGATTGCGG CGC 302 GTCTGACCCC TGTCTCGGGT TACAACCTGT TCAGAGAGGC CGTTCCTGAC CCl CAGACTGGGG ACAGAGCCCA ATGTTGGACA AGTCTCTCCG GCAAGGACTG GGA Fig. 13B. 362 AGGACATGGT CCTCGGTTTC AGAAAGCTTA CCCCTAGAGA GCTGGACATG TT TCCTGTACCA GGAGCCAAAG TCTTTCGAAT GGGGATCTCT CGACCTGTAC AA Hindlll 422 ACAGATACGG TTGGTTCAAC ACCTCCCTGA TCCTGGAGGG TAGAAAGTAC Ct TGTCTATGCC AACCAAGTTG TGGAGGGACT AGGACCTCCC ATCTTTCATG GA 482 TGACCGAGAG ACTGACCGAG AGAGGTGTTA AGTTCTTCCT GAGAAAGGTC GA ACTGGCTCTC TGACTGGCTC TCTCCACAAT TCAAGAAGGA CTCTTTCCAG Cl 542 AGGAGGTTGC CAGAGGTGGT GCCGACGTCA TCATCATGTG TACCGGTGTC TC TCCTCCAACG GTCTCCACCA CGGCTGCAGT AGTAGTACAC ATGGCCACAG AC 602 TCCTGCAGCC TGACCCTCTG CTGCAGCCCG GGAGAGGTCA GATCATTAAG G1 AGGACGTCGG ACTGGGAGAC GACGTCGGGC CCTCTCCAGT CTAGTAATTC CA Xrnal 662 CATGGCTGAA GAACTTCATC ATTACCCACG ACCTGGAGAG AGGTATCTAC AA GTACCGACTT CTTGAAGTAG TAATGGGTGC TGGACCTCTC TCCATAGATG T1 722 ACATTATCCC TGGTCTGCAG GCCGTCACCC TGGGTGGTAC CTTCCAGGTC GC TGTAATAGGG ACCAGACGTC CGGCAGTGGG ACCCACCATG GAAGGTCCAG CC Kpnl Fig. 13C. 782 ACGAGATCAA CAACATCCAG GACCACAACA CCATCTGGGA GGGTTGTTGT AGA TGCTCTAGTT GTTGTAGGTC CTGGTGTTGT GGTAGACCCT CCCAACAACA TCT< 842 CTACCCTGAA GGACGCCAAG ATCGTTGGTG AGTACACCGG TTTCAGACCT GTT GATGGGACTT CCTGCGGTTC TAGCAACCAC TCATGTGGCC AAAGTCTGGA CAA 902 AGGTCAGACT GGAGAGAGAG CAGCTGAGAT TCGGTTCCTC CAACACCGAG GTC TCCAGTCTGA CCTCTCTCTC GTCGACTCTA AGCCAAGGAG GTTGTGGCTC CAG 962 ACTACGGTCA CGGTGGTTAC GGTCTGACCA TCCACTTGGG TTGTGCCCTG GAG TGATGCCAGT GCCACCAATG CCAGACTGGT AGGTGAACCC AACACGGGAC CTC 1022 AGCTGTTCGG TAAGGTCCTG GAGGAGAGAA ACCTGCTGAC CATGCCTCCA TCC TCGACAAGCC ATTCCAGGAC CTCCTCTCTT TGGACGACTG GTACGGAGGT AGG GAG CTCAGCT **SalI DK 175036 B1 Fig.%A. Ό Xma\ Kpn\ 7C| Sal aao^X j pUR 300I j Sal I jso/l 1 kb fragment isoleres __I H/ndlll lT4lig0Se Hind\\\<W8føtoSr /S AAO^n^v pUR 3002 ^-rWcl 1 partiel Sall DK 175036 B1 adaptor 5I pr MOX-AAO C— -"-G 3'aCGTG-1'-CAGCfS1 HgiM IT4ligose ' So/l 73 bp fragment isoleres pUR 3102 Sal I "f" Wg/AI lineariseret plasmid 1,4 kb fragment isoleres indeholdende promo- 11 ter 1 isoleres_ T4 ligase Wg/AI Sal 1 Hin dlliy^pr MOX \ / AAO yA i pUR 3003 fe \iEoe. Fig. %A (FORTSAT) I Tsocl ^oc> Fig. 1UB. Bgi /1 THAU^^H/ndlll / pr. GAPDH ^ / pURS 528-03 pUR 3003 l 2^0r,J part: Bal\\ , β>Ηρα\ klen< N. LeuZ/Ύ f --^plasmid lin« Λ-~&c di seret på et 50/ 1 ECO RI the Sall st< Hpa I Sal I ir klenow polymerase Leu 2 holdigt fragmentj isoleres DK 175036 B1 74 ligose f HgiA\ Sal I 1 Hin dll$^fpM0X^N^ / AACr^ek / Leu2 pUR 3004 \ / hEco RI Soc I Soel transformation f/g. 1UB (FORTSAT) I Fig. %C. Pvull epYeleu 10 — EcoRI ind 111 Sail RcL I fragment som indeho terminal del af leu isoleres \ EcoRI \Sal I phosX stort fragment — isoleres EcoRI T4DNA liq τ - Pvull pBR 322 indeholdende _ . .. _Dde I Bgl 11 i stedet for I c i EcoRi sted Dde IL**8® | alk.phos. Bgl II Sal I X · <\ / \\ fragment indeholdende / \ replikationsoprindelse isoleres / \ fragment Bgl II indeholdende Sal I | | gær DNA m \ I T4 DNA ligase isoleres \ J " \ 2 pm ori / > Pvull \ // leu

2 Sal I — id III EcoRI id I Fiq. %C (FORTSAT) ECORI FlQ. 15, (------Promotor MOX-HGRF adaptor -34 CGGTG GTGACATCAA TCTAAAGTA Cl ACGTGCCAC CACTGTAGTT AGATTTCAT GI HgTOT «------------------------------------------------------- ATGTACGCCG ACGCCATCTT CACCAACTCC TACAGAAAGG TTCTGGGTCA G< TACATGCGGC TGCGGTAGAA GTGGTTGAGG ATGTCTTTCC AAGACCCAGT C< Met —> 61 AGAAAGCTTC TGCAGGACAT CATGTCGAGA CAGCAGGGTG AGTCCAACCA G( TCTTTCGAAG ACGTCCTGTA GTACAGCTCT GTCGTCCCAC TCAGGTTGGT Cl HindflT ΡΤΓΊΓ 121 GCCAGAGCCA GACTGTGAG CGGTCTCGGT CTGACACTCA GCT ♦»♦Tall- DK 175036 B1 Fig. 16A. Hin dl il «*· dlly^^lVs0C I /HGRF*«\ / ''vafcoRI / \ I pUR 3104 I PUR 3201 I So/1 I So/1 f H/ndlll_\ H/ndl II |ϊ4 ligase Hinm<h /hgrf ^v\ pUR 3202 lQ^SgcI V A’EcoRI I HindHl DK 175036 B1 5^ pr MOX-HGRF adaptor_^3! ^ACGTG,-»«-JTCGA?1 1-r—* IT4 ligase '-r—1 HgiAl I Hin dlll 110 bp fragment isoleres pUR 3102 Τ' Sal I * , 1 Hgi AI 1,4 kb fragment indeholdende promoter isoleres |ϊ4 ligase jKlenow polymerase |T4 ligase Hinm Fig. 16 A (FORTSAT) I 7pr. MOX \o\ \ %hSac I \ MOX TERM /*EcoR\ DK 175036 B1 pURS 528-03 pUR 3203 Ηρα I Sal I , Sat I Leu 2 holdigt fragment isoleres '-Ί-' |T4 ligase Fig. 16B. J Klenow polymerase I |Τ4 ligase Hg/Al * Hind III Mp r.MOX Hin mjm Leu2 \ \ T PUR3204 I jo&oRI \ MOX TERM JqoJ I Soel :r ans formation DK 175036 B1 Fig. 16C. pHARS I pUR 3203 ECO RI ECO RI partiel Hindlll partiel Hind III 4 kb fragment inde- if holdende " containing pr. lineariseret plas- MOX, HGRF og mid indeholdende MOX TERM isoleres HÅRS 1 isoleres i-,-1 T4 ligase Pvu\V f nJRAZ AmpR\\ PUR3205 ' MOX LEGO \ HÅRS TERw /oyjSac\ Sal\\i pr HG\R^7 Hind 1 Sat I f £=Ξ0ξΗ>Ηιηά\\\ Som HI Hind III HgiM DK 175036 B1 Fig. 16D. , Hin d III λ MOX 4 MI3 mp 19 SphI SphI / \ Xpnl Kpnl pUR 3206 2,3 kb fragment \ J isoleres \ / ' |T4 ligase ------^ sph M'ndlll^^ M0X^\V\ Kp/71 i pr. MOX '^jA^jX'pn I pUR 3207 β|σ£:' \ rEcoR\ j føn * |T4ligose DK 175036 B1 Τ' sph Hin dΙΙΙ^^Π MOX\n\ /nr MOV \\V XM0X4 /pr.MOX \^Kpn\ κρη| pUR 3208 JfEpHindIII Soc| \ uråc Kpn 1 * \ HGRF /\*$qc\ lf5 kb frag- \ i ment isoleres N. C CO Kl lineariseret fragment indeholdende pr. ΜΟΧ,ΜΟΧ og HGRF isoleres |Τ4 ligase Eco RI Hin / I M0X\\\ / pr.MOX \\\ / uAa Kpn I pUR 3209 ΚΓ l HGRF'#,H/ndl" \ *Pn^ Fig. 160 (FORTSAT) I DK 175036 B1 Fig. 16 E. pHARSI pUR 3209 partiel Hin dlll partiel Hin dlll EcoRl . partiel EcoRl ? lineariseret plasmid 4 kb fragment indeholdende indeholdende HARS1 iso- pr. MOX,MOX,HGRF og MOX TERM leres isoleres I___!_I T4 ligase PvuW T //^43 I pUR 3210 ' | > HÅRS LecoRI Sal\-j^/ nr v y°7?Sacl W/ndlll SphT^t~^^Hinm “-EcoRl KPn] DK 175036 B1 Fig. 16F. pURS 528-03 pUR 3209 Ηρα I I partiel Kpn 1 I Sal I klenow polymerase klenow polymerase ,, ' r Leu 2 holdigt fragment isoleres i I T4 ligase Eco RI „ , \, ^---^ J<pn I dlll Sph Mn diller \\ Leu Z\ pUR 3211 «EcoRI VMOX JqoJ TERM /J A o/ Jo o/ ~~fco RI Socl Søcl ,, SphI transformation Fig. 17 CATGTACGCCG ACGCCATCTT CACCAACTCC TACAGAAAGG TTCTGGGTCA GC CATGGTACATGCGGC TGCGGTAGAA GTGGTTGAGG ATGTCTTTCC AAGACCCAGT CG, Kpnl Met 61 AGAAAGCTTC TGCAGGACAT CTGTTCGAGA CAGCAGGGTG AGTCCAACCA GG, TCTTTCGAAG ACGTCCTGTA GACAAGCTCT GTCGTCCCAC TCAGGTTGGT CC Hindlll PstI cys 121 GCCAGAGCCA GACTGTGAGGTAC CGGTCTCGGT CTGACACTC *** Kpnl Fig. 18A. G GAT -2125 CTTGGCCAAT GATTCAGCTG CTGGACCGAA AACGCCTCTT TTGGCCAAAA AAA -2104 GTTGATAACT GCGGAGGCCA TATTTCAAAG AACAGCGAAT AAGAAAAAAA GGT -2054 -20 ATGCGCGAAA CGATACCACT TATTAGCATA AACAAAAAAA AAAAAAATCT ATT -1954 ΑΤΤΑΤΛΑΤΤΑ GTTCAATAAT TTCATAAGCA TCATGGTTGG GCGGCCTATT GTC -1904 GTCCCTCTGG AACAGGTAAA TCCACTTTGC TGAAGAAGCT GTTTGCTGAG TTC -1854 AGTTTGGATT TTCCGTGTCC AACACCACGA GAAAACCTAG ACCTGGTGAA AAA -1804 TCGATTACCA CTTCACCACG GTAGAGGACT TCAAGAAGAT GATTGAAGAA AAC -1754 -17 TTGAATGGGC CCAGTTCTCC GGCAACTACT ACGGCACCTC TGTGAAAGCT GTG -1654 TGGCCGAAGT GATGAAGAGA ACGTGTATTT TGGACATTGA TATGCAGGGT GTC -1604 TCAAGAAGAC CAACCTGGGA GCCCGATTCC TCTTTATTTC TCCTCCGTCC ATC -1554 TCAAGAAGAG GCTCGAGAGC CGTGGAACAG AGACCCCTGA ATCTCTTGCC AAG -1504 CTGCTGCATC TGCGGAGATG CAGTACGCCA GGGCAGTGGA CACGACAAGG TCA -1454 -14 CGATGACCTT GAGAAGGCGT ACTCTGAGCT GAAGGAGTTC ATTTTCGCCG AGC -1354 AGCATTCATA AATTTTTAAT ATCTAGAGCT CTCATACGGG ACAGTATCTC CTC -1304 t Fig. 188. GCGTCAAGCT TGTCCTCTTC ATGCTCCTCA ACAGTCATGG CATCCAGCTG CTG -1254 TGCTCCAGCC TGGCATATAT GTCGCCATAC AGCTTGAGTT GGATTTTGAT GAA -1204 AAGGTAGGGT CCACCAGTGA CAGTCGCAGC GCAATGAACT GCTCGATTTC GTT -1154 -11 CGTGTGTTGA TGTCCGTGTA GATATTTTCT GCCTCGTCGT ACTCAACTTT GAA -1054 AGCTTGTCCA GGCTCTTCTG TAACTGGTCT GTTTTCTCGG TGTGATGCTG CTC -1004 TGTCGCTCAA TCGCTTCGTA CTCGCTCTGC AGCTTCGAAA GCTTGAATCG TGA -954 TAATCCACCT TTTTGCGTGC GCGCTTCTTG ATCAGCTTGT TGATCTCGTC GTT -904 TTCAGCTCGT TAATCGGCTC CACGACCGTG ATGCTCATTG GCTCCAGAAT TTC -854 -80 ATATTGTCTT TGATGTCTTC CACCATCTGC AGATAATTCA CAGAAATACC ATC -754 TTCACCTTGT GCTCTTCTGG CCGTTCCGCA GCTTCCGACC GCTTATCAGC CTT - 7 04 AAGCTATAGT CTCCGTAAAA CGAGTCCAGT GTTCTAGCCA TATTTATCTG AGT - 6 5 4 AGATTCTCCG AAATTGCCCA CAAAACGGCC TAGTTCCTGG TCCAGCTCGT TGG -604 CTCGAGTTTG CGGAAATTGG CCTCCTGGAC GTCAAACTCA GGATCAACAG AGG -554 "50 TTTGTTTGTG CGTAGTATCA CATGTGCTCC GGCACGATTG ACAGCTTTTT TAA -454 Fig. 18C. CCATGACATG TCGAGGAAAG GGTCGTTTCG GGGAGTTAAA TATTTTTGGC T/ ACATGTTTCG ACGCTGGCGT CGCGTCGATC GGAAAATATT ACCCCAGCAA CA -354 CTTGGGTTAG CCACCACCCT GCGCAAGCCT TTTTGCCGGC TCTACACAGG GC -304 TCTGGGCGGA ATCTGAAACC GATGAAACGG ACGACACTGG CAACAAGCTC AC -254 -2 TTTTTTTTTC TAGTGAAATA GCCTATCCTC GTCTCGCTCC CCTCATACCT G1 -154 GCAATTTAGC CTCGTTCCAG CCATTCACGG GCCACTCAAC AACACGTCGG Cl -104 GTGCTTGGGC ACCAAAAGGC CTATAAATAG GCCCCCATCC GTCTGCTACA C/ - 54 1 5 10 MET SER MET ARG ILE PRO LYS ALA ALA SER VAL ASN A£ TGTCTTTTCTTCCC ATG AGT ATG AGA ATC CCT AAA GCA GCG TCG GTC AAC Gå -14 20 25 30 GLN ARG ILE ILE LYS TYR GLY ARC ALA LEU VAL LEU ASP ILE VAL GLU G1 CAG AGA ATC ATC AAG TAC GGT CGT GCT CTT GTC CTG GAC ATT GTC GAG C/ 40 45 50 GLY HIS PRO GLY SER ALA MET GLY ALA MET ALA ILE GLY ILE ALA LEU ΤΪ GGC CAC CCG GGC TCG GCC ATG GGC GCC ATG GCT ATC GGA ATT GCT CTG TC 60 65 70 LEU LYS TYR ALA PRO ASN ASP PRO ASN TYR PHE ASN ARG ASP ARG PHE V/ CTG AAA TAT GCT CCC AAC GAC CCT AAC TAC TTC AAC AGA GAC AGG TTT G1 80 85 90 GLY HIS VAL CYS LEU PHE GLN TYR ILE PHE GLN HIS LEU TYR GLY LEU LI Fig. 18D. GGT CAC GTG TGT CTG TTC CAG TAT ATC TTC CAG CAC CTG TAC GGT CTC AA 100 105 110 MET ALA GLN LEU LYS SER TYR HIS SER ASN ASP PHE HIS SER LEU CYS PR ATG GCG CAG CTG AAG TCC TAC CAC TCG AAT GAC TTC CAC TCG CTG TGT CC 120 125 130 GLU ILE GLU HIS ASP ALA VAL GLU VAL THR THR GLY PRO LEU GLY GLN GL GAA ATC GAG CAC GAC GCC GTC GAG GTC ACA ACG CGC CCG CTC GGC CAG GG lAO 145 150 SER VAL GLY LEU ALA ILE ALA THR LYS ASN LEU ALA ALA THR TYR ASN LY TCT GTT GGT CTG GCC ATA GCC ACC AAA AAC CTG GCT GCC ACG TAC AAC AA 160 165 170 ASP ILE ILE THR ASN LYS VAL TYR CYS MET VAL GLY ASP ALA CYS LEU GL GAT ATC ATC ACC AAC AAG GTG TAC TGC ATG GTT GGC GAT GCG TGC TTG CA 180 185 190 ALA LEU GLU SER ILE SER LEU ALA GLY HIS MET GLY LEU ASP ASN LEU IL GCT CTC GAG TCG ATC TCG CTG GCC GGC CAC ATG GGG CTG GAC AAT CTG AT 200 205 210 ASP ASN ASN GLN VAL CYS CYS ASP GLY SER VAL ASP ILE ALA ASN THR GL GAC AAC AAC CAG GTC TGC TGT GAC GGC AGT GTT GAC ATT GCC AAC ACG GA 220 225 230 ALA LYS PHE LYS ALA CYS ASN TRP ASN VAL ILE GLU VAL GLU ASN ALA SE GCC AAG TTC AAG GCC TGC AAC TGG AAC GTG ATC GAG GTC GAG AAC GCT TC 2AO 2A 5 250 ALA THR ILE VAL LYS ALA LEU GLU TYR ALA GLN ALA GLU LYS HIS ARG PR GCT ACC ATT GTC AAG GCC TTG GAG TAC GCG CAG GCC GAG AAG CAC AGA CC 260 265 270 ASN CYS ARG THR VAL ILE GLY SER GLY ALA ALA PHE GLU ASN HIS CYS AL AAC TGC AGA ACT GTG ATT GGA TCG GGT GCT GCG TTC GAG AAC CAC TGT GC Fig. 18E. 280 285 290 ASN ALA LEU GLY GLU ASP GLY VAL ARG GLU LEU LYS ILE LYS TYR GLY M AAC GCT CTG GGC GAG GAC GGT GTG CGC GAG CTC AAA ATC AAG TAG GGC A 300 305 310 GLN LYS PHE TYR ILE PRO GLN ASP VAL TYR ASP PHE PHE LYS GLU LYS P CAG AAG TTC TAC ATT CCG CAG GAC GTG TAC GAC TTC TTC AAG GAG AAG C 320 325 330 ASP LYS LEU VAL ALA GLU TRP LYS SER LEU VAL ALA LYS TYR VAL LYS A GAC AAG CTG GTG GCC GAA TGG AAG AGT CTC GTG GCC AAG TAC GTC AAG G 340 345 350 GLU GLY GLN GLU PHE LEU ALA ARG MET ARG GLY GLU LEU PRO LYS ASN T GAG GGC CAG GAG TTT TTG GCG CGG ATG AGA GGC GAG CTG CCA AAG AAC T 360 365 370 LEU PRO GLN GLN GLU PHE THR GLY ASP ALA PRO THR ARG ALA ALA ALA A CTG CCG CAG CAG GAA TTC ACC GGC GAC GCT CCT ACA AGG GCC GCT GCC A 380 385 390 ARG ALA LEU GLY GLN ASN CYS LYS SER VAL ILE ALA GLY CYS ALA ASP L AGA GCC CTG GGG CAG AAC TGC AAG TCG GTG ATT GCC GGT TGC GCA GAC C 400 405 410 VAL ASN LEU GLN TRP PRO GLY VAL LYS TYR PHE MET ASP PRO SER LEU S GTC AAT TTG CAG TGG CCA GGG GTG AAA TAT TTC ATG GAC CCC TCG CTG T 420 425 430 GLY LEU SER GLY ASP TYR SER GLY ARG TYR ILE GLU TYR GLY ILE ARG G GGC CTG AGC GGC GAC TAC TCC GGC AGA TAC ATT GAG TAC GGA ATC AGA G 440 445 450 CYS ALA ILE ALA ASN GLY LEU ALA ALA TYR ASN LYS GLY THR PHE LEU P TGT GCT ATC GCC AAT GGC CTT GCC GCC TAC AAC AAG GGC ACG TTC CTG C 460 465 470 THR PHE PHE MET PHE TYR LEU TYR ALA ALA PRO ALA ILE ARG MET ALA G Fig. 18F. ACT TTC TTC ATG TTC TAC CTG TAC GCT GCC CCA GCC ATC AGA ATG GCC GGC A 80 485 490 LEU LYS ALA ILE HIS ILE GLY THR HIS ASP SER ILE ASN GLU GLY GLU ASN CTC AAG GCG ATC CAC ATC GGC ACC CAC GAC TCG ATC AAT GAG GGT GAG AAC 500 505 510 HIS GLN PRO VAL GLU SER PRO ALA LEU PHE ARG ALA TYR ALA ASN ILE TYR CAC CAG CCG GTC GAG TCG CCA GCA TTG TTC CGG GCC TAT GCA AAC ATT TAC 520 525 530 PRO VAL ASP SER ALA GLU VAL PHE GLY LEU PHE GLN LYS ALA VAL GLU LEU CCG GTC GAC TCT GCA GAA GTG TTT GGC CTG TTC CAA AAA GCC GTC GAG CTG 540 545 550 SER ILE LEU SER LEU SER ARG ASN GLU VAL LEU GLN TYR LEU ALA SER ARG TCG ATT CTG TCG CTC TCG AGA AAC GAG GTG CTG CAA TAC CTG GCA AGT CGA 560 565 570 ARG ARG ASN ALA ALA GLY TYR ILE LEU GLU ASP ALA GLU ASN ALA GLU VAL AGG CGC AAC GCG GCC GGC TAT ATT CTG GAG GAT GCG GAG AAC GCC GAG GTG 580 585 590 GLY VAL GLY ALA GLU MET GLU PHE ALA ASP LYS ALA ALA LYS ILE LEU GLY GGA GTT GGT GCA GAG ATG GAG TTT GCA GAC AAG GCC GCC AAG ATC TTG GGC 600 605 610 ARG THR ARG VAL LEU SER ILE PRO CYS THR ARG LEU PHE ASP GLU GLN SER AGG ACC AGA GTT CTC TCC ATC CCA TGC ACG CGG CTG TTT GAC GAG CAG TCG 620 625 630 ARG ARG SER VAL LEU ARG LYS ASP GLY ARG GLN VAL PRO THR VAL VAL VAL AGA CGC TCG GTT TTG AGA AAG GAC GGC AGA CAG GTG CCA ACG GTG GTG GTG 640 645 650 VAL ALA PHE GLY TRP GLU ARG TYR ALA THR ALA SER TYR CYS MET ASN THR GTT GCG TTC GGC TGG GAG AGA TAC GCT ACG GCG TCC TAC TGT ATG AAC ACG Fig. 18G. 660 665 670 SER LEU PRO PRO GLU VAL ILE TYR GLU TYR PHE GLY TYR ASN PRO ALA TH TCT CTG CCT CCA GAA GTG ATC TAC GAG TAC TTT GGA TAC AAC CCG GCA AC 680 685 690 LYS VAL GLU ALA TYR VAL ARG ALA CYS GLN ARG ASP PRO LEU LEU LEU HI AAG GTC GAA GCG TAC GTC CGG GCG TGC CAA AGA GAC CCT TTG CTG CTC CA 700 GLY PRO GLU GLY LYS ALA *** GGA CCT GAA GGA AAA GCC TAA CCACGAT AAAGTAAATA AGCTCTGATT AAGTAAGA 2 110 AATAAGTTCT TTGTCTGTGA ATGCCACCCC ACAATAACCC CACAAATAAA AC 2160 22 TTGCGTCAGA AACTGTCGAG CCGCACGGGA CTGACTGTTT GGCGGCGTGC Cl 2260 ACACGGATAT TTCGCACGGA ACAGAAACCA TTGGACAAGG GGTTGCTGCC GA 2310 AGAATGCATC GGATCC 2 3 50 Fig. 19. (A) _ ξΞ -bbs _ - Ξ_ 8. ii 8 i III 8 I Is _UJ XX LU CD XXX UJ op XLU Højre | I-1—.-1—-Λ— i I*·-1-L-11.....— E ·δ Ό — Ό— O ~ 'o ~~ZZZ (S x x(£$cl co S. uj </mSl</5o _I Mr I_I_I-J-LI—L·! (B) 5 i_;-— i-1 M13 Subkloner ^ I_I I- I- Fig. 20. Identiske sekvenser i -1000 regionen af DAS og MOX generne DAS -1076 TAGATATTTTCTGCCTCGTCGTACTCA—54N-GTGTGATG-8N-TC * ** ***** ************* * ******** ** * ** ********* *********************** TCGAAATTTTTGCCGTCGTCGTACAGTGTGATGTCACC MOX -1052 DAS -937 ATCGCTTCGTACTCGCTCTGCAGCTTCGA **** * *** * * ************ **** **** ** ********* *** ATCGAATGTAATGAGCTGCAGCTTGCGA MOX -987