JP2502508B2 - 調節領域ｄｎａ断片及びアルコ―ルオキシダ―ゼ指定遺伝子、それらを含有するプラスミド及びその形質転換酵母又は純粋培養物並びに同酵母によるポリペプチドの製造方法 - Google Patents

調節領域ｄｎａ断片及びアルコ―ルオキシダ―ゼ指定遺伝子、それらを含有するプラスミド及びその形質転換酵母又は純粋培養物並びに同酵母によるポリペプチドの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、組換DNAについての技術分野に関する。
この発明の側面の１つは、メセンジヤーRNAへのDNAの転
写並びにメセンジヤーRNAの蛋白への翻訳の開始及び終
了を調節するDNA断片に関する。他のもう一つの側面
は、上述のDNA断片を統合するベクターの発現に関する
ものである。更に他のもう一つの側面は、上述の発現ベ
クターで形質転換した新規な微生物に関するものであ
る。更にもう一つの側面は、ポリペプチドに関するもの
である。
最近組換DNA技術が開発されに従い、種々の有用なポ
リペプチドの微生物による制御下での生産が可能となつ
た。多くの真核生物由来のポリペプチド、例えば、ヒト
成長ホルモン、白血球インターフエロン、ヒトインシユ
リン及びヒトプロインシユリンが既に種々な微生物によ
り生産されている。既に獲得した技術の継続的応用が将
来他の種種な有用なポリペプチド製品の微生物による産
出を可能とするものと期待されている。
組換DNA技術において使用される基本的な技術は、当
業者には既知のことである。組換DNA技術の実施に必要
な宿主微生物に望まれる要素としては、次のものがある
が、これのみに限定されるわけではない。
（１）ひとつ以上の所望のポリペプチドの遺伝情報を有
して居り、かつ宿主微生物中で発現するのに必要とされ
る適切な制御配列を有していている遺伝子。
（２）ベクター、通常は、プラスミドであるが、その中
に当該遺伝子を挿入可能なこと。当該ベクターは、細胞
中への遺伝子の挿入と、当該遺伝子の高水準の発現に加
え、細胞中での当該DNA配列の保持を可能とするのに役
立つ。
（３）適切な宿主微生物で、かつ、この宿主は所望の遺
伝子を有するベクターで形質転換することができ、ま
た、その宿主微微生物は、挿入された遺伝子により暗号
化されている情報の発現を許す細胞質の容器を有してい
ること。
組換DNA技術に使用される基本的要素は、プラスミドで
あり、染色体外の、二重鎖のDNAで、ある種の微生物内
で見出されたものである。自然界において、微生物中に
存在するとして見出されたプラスミドの場合、細胞１個
あたり多数のコピーがしばしば存在することが見出され
ている。自然界に存在するプラスミドに加えて、種々の
人工プラスミドやハイブリツドベクターも作出されてい
る。プラスミドDNA中に暗号化された情報中に含まれる
もので、娘細胞中でプラスミドを再生するときに必要と
されるものは、自律複製配列である。一つ又はそれ以上
の遺伝子表現型の淘汰特性が、プラスミドDNA中に暗号
化されている情報に含まれていなければならない。この
遺伝子表現型の淘汰特性が、淘汰（選抜）培地中で細胞
の優先的生育により区別され、選抜されうる特性を有す
るプラスミドを含有する宿主細胞のクローン化を可能と
する。
プラスミドの利用性は、一種又は他の種類制限エンド
ヌクレアーゼ又は制限酵素−いずれも当該プラスミド上
に定まつた特異的切断部位を認識しているのであるが−
その酵素により特定の個所で切断されるという事実に存
する。切断した後、同質又は宿主以外の微生物由来の外
来遺伝子、あるいは、遺伝子断片を、切断部位、又は該
部位に隣接し再構築された部位で、切断されたプラスミ
ドと所望の遺伝子材料との末端を結合させることにより
挿入する。生成した組換DNA材料をハイブリツドベクタ
ーと称することも可能である。
DNA組換は、宿主微生物の菌外体で行なわれる。生成
したハイブリツドベクターは、形質転換として知られて
いる過程により宿主微生物に導入される。形質転換され
た微生物を生育させることにより、大量のハイブリツド
ベクターを得ることができる。遺伝子がそのDNA中に暗
号化されている情報の転写及び翻訳をつかさどるプラス
ミド内の場所に正しく挿入された場合は、生成したハイ
ブリツドベクターは、挿入遺伝子を暗号化したポリペプ
チド配列の生産を指示するために使用することができ
る。ポリペプチドのこの方法による生産を遺伝子発現と
いう。
遺伝子発現は、DNA内のプロモータ領域として知られ
ている領域内で開始する。発現の転写段階ではメツセン
ジヤーRNAの合成のための鋳型としてむき出しになりな
がら当該DNAは解き広がる。RNAポリメラーゼは、プロモ
ータ領域に結合し、遺伝情報を暗号化（又は指定）して
いる鎖に含まれる当該情報を転写しながら、解き広がつ
たDNAに沿つて５′末端から３′末端へと移動する。該
メツセンジヤーRNA（mRNA）は、次々に、当該mRNAが、
ポリペプチドへと翻訳される場所であるリボゾームに結
合する。各アミノ酸は、構造遺伝子と称される部分内の
核酸トリプレツト又はコドン、すなわち、発現された産
物のアミノ酸配列をコード化している遺伝子の部分によ
つて、遺伝情報として暗号化（コード化）されている。
３個の核酸は、各アミノ酸の産出についての情報をコー
ド化しているので、一つの核酸配列を３通りの異なつた
型で読むことは可能である。所望のポリペプチド産物を
コード化している特定の読み取り枠は適切な解読枠と称
されている。
プロモータに結合した後、RNAポリメラーゼは、最初
にmRNAの５′のリーダー（leader）領域をまず転写し、
次いで翻訳開始又は開始コドンを、次いで構造遺伝子そ
れ自体の内部の核酸コドンを転写する。所望の遺伝子産
物を得るために、適切な解読枠中でリボゾームによるメ
ツセンジヤーRNAの翻訳を正しく開始する事が、開始す
なわち開始コドンにとつて必要なことである。最後に、
終止コドンが、構造遺伝子の終点で転写され；たとえ、
DNA鋳型とmRNAポリメラーゼとの間の相互作用により追
加のmRNA配列が形成されたとしても、当該リボゾームに
よつては、ペプチドへとは翻訳されずに残つている追加
のmRNA配列が生ずる。このようにして、終止コドンが翻
訳の終了を決定し、それ故に、更にポリペプチド産品へ
のアミノ酸組込の終了を決定する。当該ポリペプチド産
品は、細胞を溶解し、当該産品を他の微生物蛋白より適
当な精製法により回収するか、又は、特定の条件下で
は、当該宿主細胞が成長し、当該ポリペプチドが分泌さ
れている醗酵培地から精製し、得ることができる。
実際には、組換DNA技術の利用は完全に外来のポリペ
プチド、すなわちある微生物内で本来は見出されない、
換言すれば、生産できないペプチドを発現する−−いわ
ゆる直接発現できる微生物を作出可能である。逆に、融
合蛋白、すなわち、同種のポリペプチド、つまり、野生
型（形質転換されていない）宿主微生物内で見出され
る、換言すれば生産されるもののアミノ酸配列の一部分
に融合した外来ポリペプチドの発現−−すなわち間接発
現も可能である。間接発現については、当該当初に得ら
れた融合蛋白産品は、時として、その目的とする使用に
関して、当該同質性／外来ポリペプチドが細胞外の環境
で開裂するまでは、不活性である。それ故、例えば、メ
チオニン残基の臭化シアン開裂が融合同質／外来ポリペ
プチドからソマトスタチン、チモシンアルフア１並びに
ヒトインシユリンの成分Ａ鎖及びＢ鎖を生成するのに対
し、一方特定化された残基の酵素による開裂がベーター
エンドルフインを生成する。
現在まで、種々のポリペプチドを産生するために組換
DNA技術を商業的に利用しようとする試みは、宿主生物
として大腸菌を用いるものに集中している。しかし、あ
る場合には、大腸菌は宿主としては適切でないというこ
とが判明している。例えば、大腸菌は、医薬品として有
用なポリペプチドから除外しなければならない有害な発
熱因子を多数含有している。この精製が良好に実施され
るための効率は、いうまでもなく、特定のポリペプチド
により異なる。更に、大腸菌の蛋白分解能がある種の有
用な製品の収率を著るしく制限する。これら及びその他
の点を配慮し、代替宿主、特にポリペプチドの生産のた
めに真核生物を使用することに興味の対象が移りつつあ
る。
真核系、すなわち酵母におけるポリペプチド産品の産
出手段が存在することは、組換DNAにより遺伝情報が暗
号化されたポリペプチドの産品に大腸菌などの原核系を
使用することと比較して、顕著な利点を提供できること
となつた。酵母は、大腸菌の大規模醗酵が比較的最近に
なり到来したのに比べて、数世紀にもわたつて大規模醗
酵に使用されてきている。酵母は、細菌に比較して一般
により高い菌体濃度でも生育でき、連続醗酵工程にも応
用されている。事実、ピキア パストリス（Pichia pa
storis）などの酵母は、極めて高い細胞濃度、すなわ
ち、100g/lを越える細胞濃度でも生育できることを米国
特許第41414329号［フイリツプス石油（株）所有］でウ
エグナーが開示している。酵母宿主の別の利点には、生
物の多くの臨界的機能、例えば、酸化的リン酸化反応が
細胞機関の中に存在するので、そのため野生型の宿主細
胞にとつては異物であるポリペプチドの当該生物による
生産により、場合によつては、起りうる恐ろしい影響に
曝されることがないという事実も含んでいる。真核生物
として、酵母は発現されたポリペプチド産品の生物活性
にとつては重要である。真核生物として酵母は高等生物
と同様のコドン優位性を示し、哺乳動物の遺伝子や、例
えば哺乳動物のmRNAから逆転写により得られた相補的DN
A（cDNA）由来の発現産品の効率的産出へ向うことも可
能である。
充分に特性が明らかにはされていない酵母類の宿主／
ベクター系としての開発は、形質転換条件についての知
識の欠如と適切なベクターが存在しないことにより随分
と妨げられた。更に、栄養要求性の変更株がしばしば入
手出来ず、そのため、栄養要求的補体による形質転換体
を直接選抜することを不可能としている。もしも、組換
DNA技術が充分にその約束を果せたら、DNAの操作を可能
とし挿入したDNAの配列の発現を適正化し、その結果、
所望のポリペプチド産品が制御された条件下で、かつ、
高収率で産出できることとなる新しい宿主／ベクター系
が発明されるにちがいない。
この発明により、本発明者等は、DNAのmRNAへの転写
とポリペプチド産品を得るための該メツセンジヤーRNA
の翻訳を調節するDNA配列を見出し、単離し、特性を明
らかとした。この発明の新規なDNA配列は、 （ａ）メタールを炭素及びエネルギー源として成育する
ことのできる酵母菌株、 （ｂ）グルコース、エタノール、果糖等上で成育するこ
とのできる酵母菌株、及び （ｃ）グリセロール、ガラクトーズ、酢酸塩又はエステ
ルなどで成育できる酵母菌株 を用いたポリペプチド産品の産出に有用である。
次の略号を、使用した制限酵素を表示するために本明
細書を通して使用した。
A ＝AsuII B ＝BamHI B2 ＝BglII BC ＝BclI C ＝ClaI H2 ＝HincII H3 ＝HindIII K ＝KpnI Nd1 ＝NdeI Nr ＝NruI Ps ＝PatI Pv1 ＝PvuI Pv2 ＝PvuII R1 ＝EcoRI R5 ＝EcoRV Rs ＝RsaI Ｓ ＝SalI S3 ＝Sau3AI SC ＝SacI Sm ＝SmaI Sp ＝SphI Ss ＝SstI St ＝StuI Ｔ ＝TaqI Th ＝ThaI Xb ＝XbaI Xh ＝XhoI Xm ＝XmaI この発明により、少くとも次の一つの条件に応答性の
調節領域を含有する新規のDNA断片を提供する； メタノールの存在、メタノール以外のある種の基質で
細胞を生育さたときの炭素源飢餓、及びメタノール以外
の非異化代謝産物制限炭素源の存在。
本発明のDNA断片の調節領域が、メツセンジヤーRNA産出
の情報をコード化しているDNAの５′末端の位置につい
ている場合、メツセンジヤーRNAの転写を制御できる。
本発明者らによるこの発明の技術的範囲には当然に上述
のDNA断片の変異株をも含むものである。
更に、この発明によれば、調節領域がメツセンジヤー
RNA産出に関する情報をコード化している当該ポリペプ
チドコード化領域の３′末端の位置についているとき、
メツセンジヤーRNA転写の終了及び翻訳の終了を制御で
きる調節領域を含むDNA断片を提供する。なお当該メツ
センジヤーRNAの転写及び翻訳は、次の条件の少くなく
とも１つに応答性の調節領域により制御されている： メタノールの存在、メタノール以外のある種の基質で
細胞を生育させたときの炭素飢餓、及びメタノール以外
の非異化代謝産物制限炭素源の存在。
本発明者らの発明の技術的範囲には、当然に上述DNA断
片の変異体も含むものである。
更に、この発明の１つの特異的な実施態様によれば、
ペロオキソームの中へ情報をコード化されたポリペプチ
ドの組込みを指導するDNA断片を提供する。ペロオキソ
ームは、メタノールで生育させた酵母細胞中に大量に存
在する細胞内体である。これらの細胞内体は、細胞液と
プロテアーゼなどの酵素から、組込まれたポリペプチド
を単離するのに役立つ。
この発明のもう１つの実施態様によれば、アルコール
オキシダーゼ産出の情報をコード化している遺伝子、約
40キロダルトンの蛋白及び76キロダルトンの蛋白を提供
する。
更に、もう１つの実施態様によれば、上述のDNA断片
を含有するプラスミド及び形質転換された生物を提供す
る。
更にもう１つのこの発明の実施態様によれば、この発
明のプラスミド及びDNA断片、並びに外来ポリペプチ
ド、すなわち宿主生物由来でないポリペプチドの産出方
法を提供する。ピキア パストリスからの調節遺伝子の単離 単一の炭素源としてのメタノールで生育させたピキア
パストリスから分離されたポリA+RNAを用いて、約200
00よりなるcDNAライブラリーを大腸菌内で調製した。ラ
イブラリーは、メタノール又はエタノールの存在下で生
育させたピキア パストリスから単離したキナーゼ化し
たポリA+RNAを用いたハイブリダイゼーシヨンによりス
クリーニングした。このプラス−マイナス スクリーニ
ングを数回繰り返した後、メタノール特異性メツセンジ
ヤーRNAのコピーであると、３種の顕著な、非同質性のc
DNAクローンを同定した。このクローンは、pPC6.4、pPC
8.0及びpPC15.0と命名され、そして、それぞれ長さにお
いて470、750及び1100の核酸よりなる挿入を含有するこ
とが判明した。
より長いcDNAクローンを得るための企てとして、最初
のcDNAライブラリーの調製に使用したものよりも、より
穏やかなS1ヌクレアーゼ消化条件を用いて、第２のcDNA
ライブラリーを調製した。そしてこの新しいライブラリ
ーはそれぞれ32P−標識のcDNAクローンpPC6.4、pPC8.0
及びpPC15.0でスクリーニングした。その結果、cDNAク
ローンpPC6.4及びpPC8.0に対応するより大きなcDNAを単
離した。このより大きなクローン、pPC6.7及びpPC8.3
は、1200と2100の核酸の長さの挿入をそれぞれ含有して
いることが判明した（第２図及び第３図参照）。pPC15.
0に対応する1100を越える核酸よりなる挿入を持つcDNA
クローンは、40000を越えるcDNAクローンをスクリーニ
ングしたが見出されなかつた。
これらのcDNAクローンの各々に対応するゲノムDNA断
片の単離は、32P標識のpPC15.0、pPC8.0又はpPC6.4でハ
イブリダイゼーシヨンした染色体DNAを制限エンドヌク
レアーゼ処理のピキア パストリスDNA断片の切断及び
アガロースゲルからの電気溶出により達成された。次い
で、溶出したゲノムDNA断片を大腸菌へとクローン化
し、上述の各々のcDNAプローブで数回スクリーニングす
ることにより適当なゲノムクローニンを同定した。
各cDNAクローンとその対応するゲノムクローンの関係
は、第１図、第２図及び第３図に示した。pPC15.0は、
クローンpPG6.0に存在する6000の核酸よりなるHindIII
のゲノム断片内に情報がコード化されている（第１図参
照）。pPC15.0でコード化されている遺伝子の５′末端
は1300bpのpPG6.0中に含まれるHindIIIへ向いている
が、一方、この遺伝子の３′末端は、pPG6.0内のPstＩ
部位の近くに位置している。 当該cDNAクローンpPC8.3
は、ゲノムクローンpPG4.0の内部に含まれている（第２
図参照）。pPG4.0は、隣接するゲノムDNAの4000核酸よ
りなるEcoRI-PvuIIを含有する。pPG4.0内でのpPC8.3の
オリエンテーシヨンは、BamHI部位近くのこのcDNAの遺
伝子の５′末端に位置しているが、この遺伝子の３′末
端は、当該PvuII部位の近くに位置している。pPG4.0内
でのpPC8.0（関連したcDNAクローン）のオリエンテーシ
ヨンは、pPG4.0の３′末端のKpnＩ部位に近いこのクロ
ーンの５′末端に位置しており、このcDNAのクローンの
３′末端は、PvuII部位近くに位置している。
このcDNAクローンpPC6.7は、4800の核酸のBamHI-EcoR
Iゲノム断片内に全部が位置している（第３図参照）。
クローンpPC6.4は、順繰りに、cDNAクローンpPC6.7の内
部に完全に位置している。pPC6.7は、pPC6.4よりもより
完全なコピーであつたので、後者は、更に研究はしなか
つた。当該遺伝子の５′末端は、ゲノムクローンpPG4.8
のEcoRI末端よりもBamHI末端のより近い位置に位置して
いる（第３図参照）。
上述のすべてのゲノムクローンの場合、当該cDNAクロ
ーンの各々中でコピーされた構造遺伝子に対して５′で
ある、少くなくとも1.2キロ塩基対よりなるフランキン
グ（flanking）ゲノムDNA配列が存在している。
上述のゲノム及びcDNAクローンの各々は、この出願が
特許となつたとき、公衆が入手可能にするために、イリ
ノイ州ピオリア市の米国合衆国北方地区研究センター
（Northern Regional Research Center）に寄託してあ
る。すべてのクローンは、大腸菌宿主内に入れて、寄託
している。
上記の生物はすべて取り消ししないとの条件で寄託し
てあり、1984年８月31日より公衆は入手できるようにし
てある。
メタノール同化酵母に対するpPG6.0、pPG4.0及びpPG4.8
の特異性 上述のcDNAクローンの各々は、標識し一連のメタノー
ル同化酵母と１つの非メタノール非同化酵母からの染色
体DNA配列のプローブとして用いた。３個の総てのcDNA
の同質性遺伝子は、すべてのメタノール同化酵母中に実
質的に存在することが見出されたが、メタノール非同化
酵母（エス・セレビシエ）中には、明らかに存在しなか
つた。かくして、これらの遺伝子は、メタノール同化酵
母に対して特異的であるというることが信じられるに致
つた。加えて、実施例XVIIで詳述したサザン ハイブリ
ダイゼーシヨンは、これらの、種々のメタノール同化酵
母由来の特異的メタノール応答性遺伝子の間には、高い
同質性が存在することを実証している。
pPG6.0、pPG4.0及びpPG4.8遺伝子のRNA転写に関する特
性 メタノールの、これらのクローン化された遺伝子の各
々の発現についての影響は、これらの遺伝子の転写につ
いての影響を研究することにより観察しうる。エタノー
ル又はメタノールを唯一の炭素源として成育させたピキ
ア パストリス細胞からの単離ポリA+RNAをノーザン
ハイブリダイゼーシヨンフイルターを用意するのに使用
した（実施例IV参照）。３個のメタノール及びエタノー
ルで生育させた細胞からのフイルターの同一の対（実施
例Ｉ参照）は、標識したpPC15.0、pPC8.0及びpPC6.4で
別々にプローブした。当該クローンpPC15.0、pPC8.0及
びpPC6.4を、メタノールで生育させた細胞からのRNA分
子（それぞれ約2400、2300、及び1300のヌクレオチド）
にハイブリツド化した。エタノールの存在下で生育させ
た細胞から得たRNAを用いてのクローンpPC15.0及びpPC
8.0のハイブリダイゼーシヨン プローブとのバイブリ
ダイゼーシヨンは、観察されなかつた。しかし、エタノ
ールで生成させた細胞から単離したRNAをpPC6.4でプロ
ーブしたところ、当該クローンは、メタノールで生育し
た細胞で見られたのと同一の1300個のヌクレオチドのRN
A分子とハイブリツド化したが、推定で（量的に）５倍
低い水準であつた。
pPG6.0、pPG4.0及びpPG4.8により情報がコード化されて
いる蛋白産品のサイズの測定 いかなる蛋白産品が、上記のcDNAクローンの各々によ
りコード化されているかを決定するために、ピキア パ
ストリスのメタノールで生育させた細胞からのポリA+RN
Aを、選択的に、当該cDNAのそれぞれにハイブリダイゼ
ーシヨンした。当該ハイブリツド−選択mRNA、すなわ
ち、当該cDNAクローンの各々とハイブリダイゼーシヨン
したmRNAを、次いで、試験管内で翻訳し、蛋白産品の各
々を、SDS変性条件を使用した電気泳動により溶解した
（実施例Ｖ参照）。この試験管内での陽性のハイブリダ
イゼーシヨン−翻訳実験結果は、76000ダルトンのポリ
ペプチド（p76）、72000ダルトンのポリペプチド（p7
2）及び40000ダルトンのポリペプチド（p40）について
の遺伝情報コード化しているmRNAをクローンpPC15.0、p
PC8.3及びpPC6.7がそれぞれ選択することを示した。こ
れらと同一の蛋白が、メタノールで生育したピキア パ
ストリスの細胞からの前ポリA+RNA（つまり、ハイブリ
ッド−選択ではない）が、同一の試験管内系で翻訳した
場合に観察されている。
p72のアルコール オキシダーゼとしての同定 A.分子量比較 アルコールオキシダーゼ蛋白を高度に富化したサンプル
を、澄明細胞分解物をH2Oに対して透析することにより
調製した（実施例VII参照）。この透析により得られた
結晶性沈澱物は、それぞれ76000及び72000ダルトンの二
つのポリペプチドを主として含有していることがSDS電
気泳動により明らかとされた。この沈澱物は、セフアア
クリル200を通したクロマトグラフイーで更に精製し
（実施例VII参照）、その結果、アルコール オキシダ
ーゼ活性は、精製した72000ダルトンのポリペプチドの
活性に対応していることが実証された。このポリペプチ
ドのサイズは、cDNApPC8.3で選択された蛋白産品のそれ
と同一であつた（実施例Ｘ参照）。
B.免疫沈澱 クローンpPC8.3とpPG4.0がアルコールオキシダーゼ構
造遺伝子をコード化していることの追加の照明は、免疫
的手法により得られた（実施例XI参照）。７万６千と７
万２千ダルトンのポリペプチドの両方を含むピキア パ
ストリスから単離された蛋白調製品は、これらのポリペ
プチドに対しての特異的抗血精をウサギの内で高めるの
に使用した。クローンpPC8.3由来のハイブリツド−選択
ポリA+RNAを試験管内で翻訳させたところ、72000ダルト
ンの翻訳産品のみが、ピキア パストリス細胞よりの蛋
白調製品に対して作つた抗血精により沈澱した。
C.予測された／実際のアミノ酸配列比較 クローンpPC8.3が、ピキア パストリス−アルコール
オキシダーゼをコード化したcDNAクローンであることを
更に実証するために、蛋白のアミノ酸末端についてのア
ミノ酸配列を、pPC8.3によりコード化された予測アミノ
酸配列と比較した。かくして、当該単離72000ダルトン
蛋白のNH2末端アミノ酸配列（配列Ａ）は次の通りであ
ると決定された（実施例VIII参照）： Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gl
y-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser. 配列Ａ 平行して、pPC8.3及びpPG4.0内のコード化された遺伝
子の５′末端のヌクレオチド配列を決定した。ゲノム及
びcDNAクローンの両方のDNA配列から誘導されたアミノ
酸2-19についての予測アミノ酸配列は、上で決定した単
離ピキア パストリスアルコールオキシダーゼについて
の予測アミノ酸配列（配列Ａ）の最初の18個のアミノ酸
と完全に一致した。
加えて、当該アルコールオキシダーゼ遺伝子のコード
化領域に関する全ヌクレオチド配列を決定した。決定し
たヌクレオチドと予測アミノ酸配列は、配列Ｂ′として
示し、それらは次の通であると信じられている： 配列Ｂ′ 上記のヌクレオチド配列とレデボエル等により公表さ
れているハンセンヌラ ポリモルフア由来の、既に記載
されているアルコールオキシダーゼに関するヌクレオチ
ド配列との比較により、予測アミノ酸配列、実際の遺伝
子（及び生成蛋白）の大きさ、コドンの利用バイアス等
を含む沢山の顕著な差異があることが明らかにされてい
る。
p76のジヒドロオキシアセトンの合成酵素としての同定 p76の遺伝子の最初の51個についてのヌクレオチドの
配列を標準方法により決定した。この配列から、当該p7
6蛋白のアミノ末端についてのアミノ酸配列が予測でき
る： このp76に関する予測アミノ酸配列は、ハセンヌラ
ポリモルフアから得たジヒドロオキシアセトン合成酵素
（DHAS）の公表されたアミノ酸配列（ジヤノビツツ等）
に比敵しうるものである。配列での数種類の差異は明ら
かではあるが、識別できる類似性がこの２つの蛋白には
存在する；すなわち、ピキア DHAS:met-ala- arg-ile-pro-lys-pro- ピキアp76とハンセンヌラDHASとの有意な程度の同質
性と同程の蛋白サイズ（約76000ダルトン）にもとづ
き、p76を仮にピキア由来DHASと同定した。
アルコールオキシダーゼの場合と同様に、ピキアDHAS
の最初の51個のヌクレオチドについてのヌクレオチド配
列と、先きに公表されているハンセンヌラDHASのヌクレ
オチド配列（ジヤノビツツ等参照）との比較により、コ
ドン利用バイアス、予測アミノ酸配列、当該遺伝子の全
体の大きさなどにおいて多くの差異があることが示唆さ
れている。ピキア パストリスからの調節領域を含むDNA断片 この発明の５′調節領域は、制限酵素地図（以下単に
制限地図と称す。）で詳細に第４、５及び６図に示す。
ポリペプチドp76の発現を制御する当該５′領域は、第
４図ａに記述したDNA断片の内に位置する。当該約2.9キ
ロ塩基対のHindIII-XhoＩ断片は、明白に、以下に詳述
するように、当該調節領域を含有することを実証してい
る。cDNAクローンpPC15.0は、完全なコピーのcDNAでは
ないので、ポリペプチドp76をコード化している構造遺
伝子を、第４図ａに記述した当該DNA断片の少くなくと
も一部分を含有しているようである。調節領域は第４図
ｂに示した約1300塩基対のHindIII-EcoRI断片中に残留
していると信じられている。新規のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を含む構造については以下に詳述するが、この
示唆を支持する。
ポリペプチドp72（アルコールオキシダーゼ）の発現
を制御する５′領域は、第５図に示した約2000塩基対の
EcoRI-BamHIDNA断片内に位置している。新規のβ−グリ
コシダーゼ遺伝子含有構造については以下に記述する
が、この構造が該DNA断片の調節性質を実証している。
第６図は、ポリペプチドp40の産出を制御する当該
５′調節領域を含む約３キロ塩基対BamHI-SalIDNA断片
に関する制限地図を示す。
第10図、第２図ａ及び第11図は、ポリペプチドp76、p
72（アルコールオキシダーゼ）及びp40に関する調節領
域と構造遺伝子の制限酵素のデータをそれぞれ示す。そ
れ故、第10図は、ポリペプチド72（アルコールオキシダ
ーゼ）の産出を制御し、コード化しているピキア パス
トリスのゲノムDNAの3.8キロ塩基対のHindIII−PstＩ断
片の詳細について示す。第２図ａは、ポリペプチドp72
（アルコールオキシダーゼ）の産出を制御し、コード化
しているピキア パストリスゲノムDNAの4.0キロ塩基対
EcoRI-PvuII断片を取扱つている。第11図は、ポリペプ
チドp40の産出を制御し、コード化しているパキア パ
ストリスゲノムDNAの3.7キロ塩基対BamHI-EcoRI断片を
表わす。
ゲノムクローンpPG6.0、pPG4.0及びpPG4.8もまた制限
酵素の地図化により特性を明らかとしている。かくし
て、クローンpPG6.0は第１図ａに詳述している。参照点
として、当該DNA断片の５′末端をオリジンと看做して
いる。クローンpPG6.0は、ピキア パストリス染色体DN
AのHindIII断片で、約6.0キロの塩基対の長さで、種々
の制限酵素により以下の如く開環する。
クローンpPG4.0は、第２図ａに詳細に示している。こ
のクローンは、約４キロ塩基対の長さの染色体のEcoRI-
PvuII断片である。クローンの５′末端をオリジンとし
て、pPG4.0については次の制限データが得られた。
クローンpPG4.8は、第３図ａに詳細に示している。こ
のクローンは、約4.8キロ塩基対を有する、次の追加の
制限酵母切断部位を持つピキア パストリス染色体DNA
のBamHI-EcoRI断片である。
ゲノムクローンpPG6.0、pPG4.0及びpPG4.8を、大腸菌
プラスミドpBR322の特異的制限酵素切断部位（以下制限
部位と称す。）へと挿入することにより操作した。クロ
ーンpPG6.0は、HindIII断片の一つであり、これは、pPB
R322のEcoRI-PvuII部位へと、クローンpPG4.8は、pBR32
2のEcoRI-BamHI部位へとクローン化した（実施例VI参
照）。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌菌株
は、この出願が特許されたとき、公衆が入手できるよう
にするため、イリノイ州ペオリア市の北方地区研究セン
ターに寄託してある。寄託した菌株には次の寄託番号が
付与されている。
プラスミド 実験室内名称 寄託番号 pPG 6.0 LE392-pPG 6.0 NRRL B-15867 pPG 4.0 LE392-pPG 4.0 NRRL B-15868 pPG 4.8 LE392-pPG 4.8 NRRL B-15869 第７、８及び９図は、それぞれ、ポリペプチドp76、p
72（アルコールオキシダーゼ）及びp40の３′調節領域
についての制限地図データを提示する。当該３′調節領
域は、先行するヌクレオチド配列により情報がコード化
されているメツセンジヤーRNAのポリアデニル化、転写
終了及び翻訳終了を制御するのに有用である。かくし
て、このポリペプチドp76遺伝子からの３′調節領域
は、第７図に示した如く2.7キロの塩基対のEcoRI-HindI
II断片であるが、これは、ポリペプチドp76の遺伝情報
をコード化しているmRNA、又は当該３′調節領域の上流
に挿入された遺伝子由来の他のいずれのmRNAのポリアデ
ニル化、転写終了及び翻訳終了制御に有用である。p72
遺伝子からの0.2キロ塩基対のStuI-PvuII断片は第８図
ａに詳述し、p72遺伝子からの0.3キロ塩基対のStuI-Hin
dIII断片は第８図ｂに詳述し、p72遺伝子からの3.2塩基
対のSalI-EcoRI断片は第８図Ｃに、p40遺伝子からの1.9
塩基対のSalI-EcoRI断は第９図に詳述しているが、これ
らは、野生型ピキア パストリスと会合している構造遺
伝子及びこれらの３′調節領域の上流に挿入可能などん
な異質の（すなわち、外来の）遺伝子に関して、同様な
有用性を有している。
pPG4.0内の当該アルコールオキダーゼ遺伝子（AO）
は、当該AO遺伝子の転写終了部位の数百の塩基対の範囲
内で終結しているので、第８図ｃに詳記した当該追加の
３′配列は次のようにして得た。まず最初、ピキア染色
体DNAをEcoRIとSalＩで消化し、サザンブロツト法でAO
遺伝子からの2.0Kpb（キロ塩基対と同義）の32p標識Bam
HI-HindIII断片と当該消化断片とをハイブリダイゼーシ
ヨンした。当該AO（アルコールオキダーゼと同義）遺伝
子プローブとハイブリダイゼーシヨンをしたピキア EcoR
I-SalＩ消化断片の中で、AO遺伝子の３′部分と当該遺
伝子の３′末端の側面に付いている配列をコード化して
いる3.2Kbp断片があつた。
当該３′AO遺伝子断片は、次いで、約3.2KbpのEcoRI-
SalＩ切断ピキアDNA断片を回収し、当該断片をEcoRI及
びSalＩ消化pBR322へと挿入することによりクローン化
した。最後に、組換プラスミド−３′AO遺伝子断片を含
むpPG3.2を、標識したAO遺伝子断片をプローブとして用
いるクローンハイブリダイゼーシヨンにより確認した。
この出願が特許されたとき、公衆が自由に入手できるよ
うにするため、プラスミドpPG3.2で形質転換した大腸菌
をイリノイ州ペオリア市北方地区研究センターに寄託し
ている。寄託菌の寄託番号は、NRRLB-15999である。第
８図ｃは、pPG3.2からのピキアDNAの制限エンドヌクレ
アーゼ開環部位の地図を示す。この断片は、AOの３′部
分（SalIからHindIIIまで）をコード化している約1.5Kb
pとAOの配列３′の約1.7Kbpを含有する。
cDNAクローンの特性化 ピキア パストリスからの調節遺伝子に関するcDNAク
ローンについても、制限酵素の地図化により特性を明ら
かとした。第12図において、当該p76cDNA、1.1キロ塩基
対断片について詳記している。当該DNA配列の５′末端
をオリジンとし説明すると、制限酵素XhoＩはp76のcDNA
をオリジンから約500の塩基対で、HincIIはオリジンか
ら約950塩基対で、そしてEcoRIはオリジンから約1050-1
000塩基対でp76のcDNAを開環する。第12図に示したcDNA
クローン、第13図及び第14図に示したcDNAはPstＩ末端
と共にすべて示してある。これらは、当初に得られた相
補DNAを、pBR322へと当該DNA断片のクローン化を実施す
るためにＣ−Ｇテーリング（tailing）に人工的に創り
出された制限酵素による切断部位である。ノーザンハイ
ブリダイゼーシヨン研究と当該ポリペプチド産品の大き
さにもとづいて、cDNAクローンpPC15.0が、当該メツセ
ンジヤーRNA配列の約半分だけを代表する、p76mRNAの不
完全コピーと推定されている。
第13図では、p72（アルコールオキシダーゼ）cDNA−
これは、pPC8.3とpPC8.0のオーバラツプにより構築され
たものであるが−に関する複合制限地図を示してある。
上記の如く、このDNA配列の５′末端をオリジンとして
説明している。それ故、種々の制限酵素でアルコールオ
キシダーゼcDNAを処理することにより、次の大きさの断
片が得られる。
クローンpPC8.0とpPC8.3におけるアルコールオキシダ
ーゼ遺伝子の３′末端の制限酵素の地図化により、cDNA
クローンpPC8.3は、約250のヌクレオチドが当該アルコ
ールオキシダーゼ配列からなくなつていることが明らか
となつた（第２図参照）。
第14図は、1.2キロ塩基対のポリペプチドp40のcDNAの
制限地図を表わす。このcDNAクローンの５′末端をオリ
ジンとして説明すると、クローンpPC6.7はオリジンから
約1000塩基対でSalI（及びHincII）により開環する。
このcDNA断片のそれぞれは、pBR322へとクローン化し
て居り、大腸菌をこれで形質転換している。この出願が
特許されたとき、公衆が自由に入手できるようにするた
めにイリノイ州ペオリア市の北方地区研究センターに、
これらの形質転換菌株は寄託してある。寄託菌株は次の
寄託番号を有する。
cDNA クローン 実験室内名称 寄託番号 pPC 15.0 LE392-pPC 15.0 NRRL B-15870 pPC 8.3 LE392-pPC 8.3 NRRL B-15871 pPC 8.0 MM294-pPC 8.0 NRRL B-15873 pPC 6.7 LE392-pPC 6.7 NRRL B-15872 上記の各cDNAクローンは、メタノールを炭素及びエネ
ルギーとする酵母の生育に、特異的であるポリペプチド
の遺伝情報をコード化している染色体DNAの同定及び単
離の際のプローブとして有用である。それ故、すでに記
述した如く、ピキア パストリスをメタノールで生育さ
せたときに認められる特異的ポリペプチドに関する調節
領域及び構造的にコード化している情報を含むピース・
パストリスの染色体DNA断定の同定に使用した。同様の
方法で、他のメタノール同化酵母、例えば、トルロプシ
ス モリシアナ（Torulopsis molischiana）、ハンセン
ヌラ カプスラタム（Hansenula capsulatum）、エイチ
・ノンフアメンタンス（H. nonfermentas）などからの
類似の遺伝子の同定及び単離の際のプローブしての有用
性を有している（実施例XVII参照）。
アルコールオキシダーゼの詳細な解析 クローンpPG4.0の５′調節領域は、p72（アルコール
オキシダーゼ）に関する構造的情報がコード化されてい
る点のクローンの上流の（５′）のヌクレオチド配列を
決定することにより更に特性化を行なつた。当該mRNA翻
訳開始部位（ATGコドン）の前の最初の250個のヌクレオ
チドは次の通りであると信じられている。
クローンpPG4.0のプロモータ機能は、この配列ヌクレ
オチド塩基内に含まれていると信じられている。
この新規のDNA断片を更に充分に記述するために、上
で詳記した配列Ｃの配列の上流の更に301個のヌクレオ
チドを決定した。かくして、当該mRNA翻訳開始部位の前
の最初の553個のヌクレオチドは次の通りであると信じ
られている。
配列Ｄに含まれている追加のヌクレオチド（配列Ｃと比
較して）は、その操作は不明であるが、配列Ｃの内に含
まれているプロモータ領域に追加の調節機能を付与する
ものと信じられている。配列Ｄは、酵母中で遺伝子発現
を調節できる、実施例XIV及びXVで示した1.1KbpのDNA断
片に関してほんの一部のDNAの配列化を表示すると認識
すべきである。配列Ｄでは詳記されていない1.1KbpDNA
他断片の１部分に、恐らく追加の制御機能がコード化さ
れているのであろう。
この新規1.1KbpDNA断片を更に記述するために、酵母
内での遺伝子発現を制御することのできる、実施例XIV
及びXVで示した全1.1KbpのDNA断片のヌクレオチド配列
を充分に記述するべく、追加のヌクレオチド配列化を実
施した。このヌクレオチド配列は配列Ｄ′として記述し
てある。
当業者であれば、配列Ｃ及びＤで詳記したヌクレオチ
ド配の更に上流（すなわち、５′指向における）にある
配列Ｄ′のその部分に、配列Ｃ及びＤに関連した、追加
の制御機能をコード化できうることを認識している。
どこで当該アルコールオキシダーゼ遺伝子のRNA転写
が始じまるのか決定するために、当該ゲノムクローンpP
G4.0及び当該cDNAクローンpPC8.3からのこの遺伝子の
５′末端の付近のDNA配列を比較した。当該アルコール
オキシダーゼ遺伝子に、翻訳されない領域５′の約100
個のヌクレオチドを、cDNAクローンpPC8.3は含有してい
る。この配列にもとづいて、翻訳開始部位（ATGコド
ン）のＡを＋１とし、５′方向のＧを−１として表わし
たとき、−29から−43のヌクレオチドに関して相補的で
ある15塩基（５′‐CTTCTCAAGTTGTCG−３′）のオリゴ
ヌクレオチドを合成して（実施例IX参照）、アルコール
オキシダーゼmRNAに沿つて当該５′末端まで拡大するた
めのプライマーとして用いた。このプライマー−伸長実
験から得たcDNAの配列は、ピキア パストリス アルコ
ールオキシダーゼに関し三つの異なつた転写開始点を明
らかにした。主要な転写は、翻訳開始コドンから114の
ヌクレオチドから開始する。二つの副次的どちらか一方
が選ばれる転写は、当該アルコールオキシダーゼAUGコ
ドンの上流（５′）の117及び111のヌクレオチドで開始
する。
アルコールオキシダーゼmRNAの開始点に先行する55の
ヌクレオチドは、うわさのゴルドベルグ−ホツグネスボ
ツクス（TATAAbox）を含む。当該TATAAA配列は、アルコ
ールオキシダーゼmRNAのための主要な転写の５′末端か
ら−40の位置、すなわち、この蛋白の翻訳コドンから15
4のヌクレオチド上流で発生する。
アルコールオキシダーゼの３′調節領域は、p72（ア
ルコールオキシダーゼ）の構造的情報がコード化されて
いる点の約120ヌクレオチド下流に関するヌクレオチド
を決定することで更に特性化を行なつた。この配列は、
配列Ｄ″として以下に示してある。
p76遺伝子の詳細な解析 当該クローンpPG6.0の５′調節領域は、更にp76の構
造的遺伝子がコード化されている場所の当該クローンの
上流（５′）のヌクレオチド配列を決定することにより
特性化された。当該mRNA翻訳開始部位（ATGコドン）に
先行した最初の622のヌクレオチドは次の通りであると
考えられる。
クローンpPG6.0のプロモータ機能は、このヌクレオチド
塩基の配列の内に含まれていると考えられるが、当業者
は、配列Ｄとして表わされる配列よりも更に上流の配
列により追加の調節性質を与えうることを認識してい
る。クローンpPG6.0の当該３′調節領域を、当該p76構
造的情報がコード化されている場所の約180ヌクレオチ
ド上流の（３′）のヌクレオチド配列を決定することに
より特性化した。当該配列は、配列Ｄ′として以下に
示す。
形質転換酵母の発現 本発明の上記プラスミドは、形質転換することのでき
る酵母菌株で有用性を有している。酵母中での遺伝子発
現の、本発明による新規DNA断片による調節は、当該形
質転換した生物を炭素源飢餓にさらすことにより達成さ
れる。種々の異化代謝産物制限及び非異化代謝産物制限
炭素源で生育させた後での炭素源飢餓は、この発明の調
節領域の制御下で保持されていた遺伝子産品の発現を誘
発する。当該所望の遺伝子産品の形質転換酵母の適切な
種での発現を達成するための他の手段は、形質転換酵母
をメタノールで生育させることである。当該所望の遺伝
子産品の発現を誘発するもう一つの手段は、非異化代謝
産物制限炭素源を含む培地上で形質転換酵母を生育させ
ることである。この発明の調節領域は、すべての酵母菌
株での発現に有用である。何故ならば、種々な条件下で
当該調節領域は誘導されることが示されているからであ
る。かくして、メタノール又は非異化代謝産物制限炭素
源で生育できる酵母で異質の、つまり、外来性のポリペ
プチドを直接生産することができる；一方、異化代謝産
物制限炭素源で生育できる酵母では、当該酵母細胞を炭
素飢餓条件下で生育させることにより異質のポリペプチ
ドを生産することができる。
この発明の工程で好ましい形質転換酵母菌株は、カン
ジダ、クロエケラ（Kloekera）、サツカロミセス、ロド
トルラ、ハンセンヌラ、トルロプシス、ピキア及びクル
イベロマイセス（Kluyveromyces）属に属するものを含
む。これらの属の酵母は、取扱い上の安全性、生育条件
などについて既に確立して居り、当業者によく知られて
いる故に、好ましい。
本発明の工程の一つ態様に使用する菌株として特に好
ましいものは、メタノールを炭素及びエネルギー源とし
て生育できる酵母菌株である。メタノールで生育できる
酵母として知られている酵母には、カンジダ、クロエケ
ラ、サツカロミセス、ロドトルラ、ハンセンヌラ、トル
ロプシス、及びピキア属に属するものが含まれる。
本発明の調節領域は、非異化代謝産物制限炭素源、及
び炭素飢餓条件下での生育によりまた誘導されるので、
グルコース、アセテート（塩又はエステル）、グリセロ
ール、エタノール、ラクトーズ、ガラクトーズ、果糖及
び庶糖等又はこれらの２つ又はそれ以上のいずれの組合
せ混合物を基質として生育することができる酵母は、ま
た本発明の実施に有用である。当該宿主生物を適当な非
異化代謝産物制限性の非メタノール炭素源、例えば、グ
リセロール及びガラクトーズで生育させるか、又は、当
該宿主生物を適当な異化代謝産物制限性炭素源、例え
ば、エタノール、グルコース及び果糖で生育させ、次い
で当該宿主生物を炭素飢餓条件下にさらすことにより、
本発明の調節領域の制限下で遺伝子産品の発現が達成で
きる。
更に、この発明の調節領域は、発現の誘発及び発現の
抑制の両方において、種々な条件に対して応答性である
ので、この発明の調節領域の制限下で遺伝子産品の調節
された発現が達成される。それ故に、例えば、たんに低
い水準の異質の遺伝子の発現を誘発する炭素源で生成さ
せ、次いで遺伝子発現を強く誘発するメタノールにきり
かえることができる。また、調節された遺伝子の発現
は、誘発／抑制基質の混合物、例えば、メタノール／グ
ルコース混合物を用いることにより達成できる。更にも
う一つの方法としては、メタノールで生育させて誘導し
た高水準の発現を、グルコース又はエタノールなどの抑
制炭素源の生育用培地に加えることにより所望の如く低
下させることができる。勿論、当業者ならば、基質混合
物の種々のバリエーシヨン及び基質導入の順序の種々の
バリエーシヨンが可能でであり、この発明の調節領域か
ら得られた遺伝子発現の水準を随分制御できるというこ
とを承知している。
特別に好ましい宿主酵母菌株の一つは、変異株ピキア
パストリスGS115であり、これは、ヒスチジン生産能
欠損変異株の一つで、それ故に、変異遺伝子型his４を
持つものとして命名されている。GS115は、ピキア パ
ストリスNRRLY-11430から誘導させたもので、イリノイ
州ペオリア市にある合衆国農務省の北方地区研究センタ
ーに、この発明が特許されたとき公衆が自由に入手可能
となるように、寄託してある。ピキア パストリスGS11
5は、寄託番号NRRLY-15851が1984年８月31日現在で割り
当られている。この特別の宿主は、ヒスチジン（代謝）
経路に欠 のある栄養要求性変異株であるので有用である。この宿
主の、種々の他のDNA配列中、HIS4遺伝子機能を含有す
るベクターでの形質転換は、形質転換宿主の容易な選抜
を可能とする。
本発明の調節領域は、沢山の栄養要求性の変異株が知
られている、サツカロミセス属に属する酵母菌株内で外
来遺伝子産品の調節された発現に有用であることもまた
実証されている。追加の好ましい宿主酵母菌株には、AT
CC26423（trp1、ade1、his2、leu1、gal1、nra1変異
株）、ATCC24684（trp1、ade1、his7、gal1、ura1変異
株）、ATCC32810（trp5、arg4、his5、lys5、ade5、gal
2変異株）、ATCC34182（ade3、his、lys、ura変異株）A
TCC34352（ura2変異株）、ATCC34353（ura2変異株）、A
TCC38523（arg1、thr1変異株）、ATCC38626（leu2、his
4変異株）、ATCC38660（his4、leu2、thr4変異株）、AT
CC42243（ura変異株）、ATCC42336（ade1、his4、thr4
変異株）、ATCC42403（arg4、lys7変異株）、ATCC42404
（ade1、his4、leu2変異株）、ATCC42564（ura1、his6
変異株）、ATCC42596（his4、leu2、lys変異株）、ATCC
42957（his4、leu2、thr4、trp変異株）、ATCC42950（a
de変異株）、ATCC42951（ade、leu変異株）、ATCC44069
（ura1変異株）、ATCC44070（leu2、his4変異株）、ATC
C44222（his変異株）、ATCC44376（his4、ade2変異
株）、ATCC44377（his4、leu1変異株）などが、当業者
にとつては、容易に入手可能である。
当業者にとつて、有用な宿主菌株は、栄養要求性の変
異株のみに限定されないことは明らかなことである。そ
れ故、陽性淘汰マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝
子をもつ原栄養要求性の菌株の形質転換は、また、形質
転換菌株の検出及び分離の有用な手段を提供する。
大腸菌はまたこの発明のプラスミドの宿主として適当
である。当業者は、大腸菌の多くの菌株が適当な宿主で
あると認めている。この発明で使用した数種の菌株は以
下にまとめて示す。菌株名称 寄託番号 MC1061 不明 LE392 ATCC♯33572 MM294 ATCC♯33625 ピキア パストリスの形質転換手順 ピキア パストリスの形質転換についてはいままでに
記載されていない。ピキア パストリスの形質転換に関
する実験手順については、より詳しく以下に記載する
（実施例XII参照）。ピー・パストリスの形質転換系の
開発のため、栄養要求性の変異株GS115（NRRLY-15851）
を分離し、当該菌株が検出しうるヒスチジノール脱水素
酵素活性を有しないので、ヒスチジン経路において欠 していると決定した。
GS115（NRRLY-15851）は、細胞株の酵素消化によりス
フエロプラストを得、更に次の工程を行なうことにより
形質転換される。すなわち、当該スフエロプラストを形
質転換用DNAと混合し、カルシユウム イオンとポリエ
チレン グリコールの存在下でインキユベートし、次い
でヒスチジンを欠く淘汰用生育培地で再生する。当該形
質転換用DNAは、当該宿主菌株の欠缺しているHIS4遺伝
を含み、それ故に、形質転換された細胞のみが採用され
た淘汰用生育培地で生存できる。ピキア パストリスHIS4遺伝子の単離 HIS4遺伝子は、ピー パストリスNRRLY-11430から、
全染色体のSau3Aを用いた部分消化及びそれに続いての
庶糖濃度勾配遠心法により単離した（実施例XIII参
照）。エス・セレビシエ−大腸菌シヤトルベクターYEp1
3（ATCC37115;第33図参照）のBamHI切断部位に、５〜20
Kbpの断片をクローン化し、大腸菌を形質転換した。エ
ス・セレビシエ5799−4D株（NRRLY-15859）、his4ABC変
異株のスフエロプラストを約１μｇのヒンネン等の方法
によりYEp13ピキアDNAライブラリーと混合し、ヒスチジ
ン欠損培地で再生させた。全再生スフエロプラスト５×
107個から、形質転換体としては、約１×103コロニーの
原栄養性酵母が得られた。DNAなしで培養した対照サン
プルでは、コロニーの発生はなかつた。20個のHis+コロ
ニーから、全酵母DNAを抽出し、大腸菌を逆形質転換さ
せた。17の酵母DNA調製物がアンピシリン抵抗性コロニ
ーを形成した。これらのクローン化された断片は、制限
酵素切断物の大きの測定及び同地図化並びに実施例XIII
G項記載の方法で低厳密度下での標識されたエス・セレ
ビシエHIS4断片とのクロスハイブリダイゼーシヨン（ポ
ストハイプリツド化洗浄については、55℃、２×SSC実
施）に対する能力により更に特性を明らかとした。この
HIS4含有断片は、それぞれがエス・セレビシエHIS4遺伝
子とハイブリツド化した断片を含有していた。そのうち
の１つのHIS4含有プラスミドを再クローン化して、pYJ8
と命名したHIS4含有プラスミドを得、第25図に示してい
る。プラスミドpYJ8は、クロラムフエニコール及びアン
ピシリン抵抗性遺伝子とピキアHIS4遺伝子を含むpBR325
配列を含有している。
当該ARG4は、ピー・パストリスNRRLY-11430から、同
様のプロトコールと、Arg−エス・セレビシエ菌株S2072
A［arg4、leu2、trp1、gal2；カナダ国バークレー市酵
母遺伝子貯蔵センター（Yeast Genetic stock Center）
より入手した］を用いて、分離したものである。
当業者ならば、ピキアからの他のマーカー遺伝子を、
エス・セレビシエ菌株の適当な欠損株を用いて同様に分
離できることは明らかである。ピキア パストリス自律複製配列の分離 他のもう一つの、本発明のベクターとしての有用な成
分は、ピキア由来の自律複製配列配列（PARS）であり、
これは、GS115の形質転換頻度も、安定な染色体外要素
として当該プラスミドを保持することも増強する。
ピキアARSを探索するために、ピキア パストリスGS1
15（NRRLY-15851）からのDNAをTagIで一部消化し、５〜
10Kbpの断片を単離し、pYJ8ΔClaの特異的ClaI部位へと
クローン化した（第26図参照）。プラスミドDNAを約100
00個のHis+ピキアコロニーから回収し、大腸菌の形質転
換に用いた。約10000のアンピシリン抵抗性コロニーか
らプラスミドを単離し、次いでGS115へと逆形質転換し
た。このサブライブラリーの形質転換から40個のHis+酵
母コロニーを別々に淘汰培地に線条接種し、淘汰培地中
で別のカルチヤー（culture）で生育させた。全酵母DNA
をこれら40個の培養菌から抽出し、大腸菌を形質転換し
た。二つのプラスミド、pYA63（PARS1）及びpYA90（PAR
S2）−この両者の酵母DNA調製物は、もつともアンピシ
リン抵抗性の大腸菌を産出した−、は更に解析するため
に選抜された。これらのプラスミドの両者とも、ピキア
パストリスGS 115（NRRLY-15851）を非常に高頻度で
形質転換し、各々とも外来性DNAの挿入１つを含有して
いた。
ピキア内でプラスミドを自律性要素として保持するた
めの当該ARSの能力を測定するために、各プラスミドで
形質転換された酵母細胞を淘汰培地中で培養し、定期的
にサンプルを採取した。細胞中のプラスミド配列の状態
は、制限酵素で処理してない酵母DNRを放射能で標識し
たpBR325へとサザンハイブリダイゼーシヨンすることに
より決定した。プラスミドpYA63及びpYA90は少くなくと
も10世代の間淘汰用培地で、ピキア内に保持されていた
（50世代までには統合されてしまつた。）。
ピキア自律複製配列（PARS1）と予想されるものの１
つを、自律要素として形質転換DNAを保持する能力をた
しかめるために他の類種類のピキアベクター中にクロー
ン化した。プラスミドpYJ30（第27図参照）及びpBPf1
（第34図参照）は、淘汰培地（His-）中で20世代も生育
させた後でも、依然として自律要素として存在して居
り、細胞あたり多数のコピーが存在していた。pYJ30で
形質転換した細胞のサザンブロツト解析は、細胞当り約
10個のコピーの存在を示している。
pYJ30及びpBPf1により与えられたPARS1を夫々含有す
るプラスミド、pSAOH5（第18図参照）及びpT76H4（第22
図ｂ参照）が、誘導源のプラスミドと同様の安定性を示
すか否かを確かめるために、これらのベクターを含有す
る細胞を、グルコースの存在下、淘汰条件（His-）下で
50世代にわたり生育させた。これらのプラスミドの安定
性は、pYJ30の安定性、これは、非淘汰培地に移し替え
ると迅速にHis原栄養性を損失するが、そのことを含め
て、に相当するものであつた。それ故、自律複製配列、
PARS1を含有するプラスミドを用い実験は、自律プラス
ミドからの遺伝子表現の結果を提示するものと考えられ
る。
新規のβ−グラクトシダーゼ遺伝子含有構造 この発明による調節領域が、蛋白産品のに産出を制御
する能力を実証するべく、新規のDNA構造を調製した。
つまり、大腸菌lacZ遺伝子を、ポリペプチドp72（アル
コールオキシダーゼ）又はp76の遺伝情報をコード化し
ている遺伝子の調節領域の制御下で数種類のプラスミド
にうえつけた。プラスミドpSAOH1、pSAOH5、pSAOH10、p
TAFH.85、pT76HI、pT76H3及びpT76H4の調製について
は、実施例XIVに記載している。
この発明の調節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝子融
合体の、プラスミドを伝播体として、宿主酵母細胞への
導入についてはここで記述するが、当業者であれば、調
節領域−構造遺伝子構築をプラスミドを経由して細胞へ
と導入する必要のないことは明らかなことである。それ
故、酵母中で保持できるものであれば、どんな分子を用
いることができる。当該調節領域−構造遺伝子構築を、
かわりに、当該宿主酵母細胞の染色体へ統合できる。
当業者であれば、また、ここで記述した調節領域の規
制下でβ−ガラクトシダーゼを産出することに、この発
明の技術的範囲は限らないことは明らかなことである。
この発明の調節領域の規制下での産品できるポリペプチ
ドの種類は、この明細書をどう読解するかによつてのみ
限定されるのである。多くの方法が、所望のポリペプチ
ドの情報をコード化しているDNA配列の調製には存在し
ている。例えば、公知の方法により、種々の長さのオリ
ゴヌクレオチドが合成出来る。いくつかのこのようなオ
リゴヌクレオチドが、それ自身の特異的塩基対合性質の
結果集合し、長い二重鎖分子となる。この二重鎖の分子
の成分オリゴペプチドは、酵素DNAリガーゼに結合（リ
ゲート）することができる。所望の遺伝情報をコード化
している配列を含有するDNA分子は、かわりに、逆転写
酵素の作用に対して鋳型として、所望のポリペプチドに
関連したメツセンジヤーRNAを使用し、酵素、逆転写酵
素の利用により合成することができる。更にもう一つの
可能性は、ゲノムDNA断片のクローン化及び所望の産品
の直接発現が起るか否かの観察である。
所望のポリペプチドの遺伝情報をコード化しているDN
A配列は、種々の方法により、調節領域−構造遺伝子構
築の調製のために修飾することが可能である。例えば、
上記の如く調製されたDNAの末端を、特定の制限エンド
ヌクレアーゼにより認識されたヌクレオチド配列を含有
する短かい二重鎖DNA、いわゆるリンカー分子に、酵
素、DNAリガーゼを用いてリゲートすることができる。
これらの分子の特定制限エンドヌクレアーゼを用いて、
リゲーシヨンに次いで、消化することにより、調製され
たDNA配列の末端で、特定の制限エンドヌクレアーゼ認
識部位に対応する末端（termini）を生成する。
この発明により調製された、３個の特定調節領域−β
−ガラクトシダーゼ遺伝子構築は、第15図及び第16図に
提示した制限地図化データを用いて記述している。第15
図ａに提示した制限地図は、pPG6.0の５′調節領域から
誘導した0.85キロ塩基対のHindIII-BamHI部分と大腸菌
からのlacＺ遺伝子よりなる構築（3.6キロ塩基対のBamH
I-NruＩ断片として示した）を記述する。これと同じ構
築がプラスミドpTAFH.85、pT76H1及びpT76H2のそれぞれ
に存在するが、それについては、以下（実施例XIV）で
より詳しく記述する。第15図ｂに提示した制限地図は、
pPG6.0の５′調節領域から誘導された1.3キロ塩基対のH
indIII-EcoRI部分と大腸菌からのlacＺよりなる構築を
記述する。これと同じ構築は、プラスミドpT76U1、pT76
H3及びpT76H4のそれぞれに存在して居り、詳細について
は以下（実施例XIV参照）に述べる。
第16図は、pPG4.0の５′調節領域の一部から誘導した
1.1キロ塩基対のEcoRI-BamHI断片と大腸菌のlac遺伝子
よりなる構築について記述している。これの構築は、プ
ラスミドpSAOH1、pSAOH5及びpSAOH10のそれぞれに存在
し、以下（実施例XIV）で詳述する。
プラスミドpSAOH1は、第17図に図式的に表示してあ
る。第16図に詳記した調節領域−β−ガラクトシダーゼ
遺伝子融合を含有することに加えて、当該プラスミドは
次のものを含有することが明らかにされている： （ａ）pBR322配列、AmpR遺伝子も含む、 （２）ピキア パストリスHIS4遺伝子、 （ｃ）エス・セレビシエ２μの環状（circle）DNA、及
び （ｄ）エス・セレビシエ由来の断続（interrupted）URA
3遺伝子。
それ故、当該プラスミドは、大腸菌宿主及び酵母宿主に
おいて形質転換又は複製する能力を有する。淘汰可能な
マーカーは、大腸菌又は酵母宿主内でDNAの操作のため
に存在している。
プラスミドpSAOH5は第18図に図式的に表示してある。
当該プラスミドは、上記のpSAOH1に類似しているが、次
の点、即ち、エス・セレビシエ２μ環状DNAとピキア
パストリスHIS4遺伝子フランキングDNAのいくつかが除
去され、一方、ピキア パストリス自律複製配列（pYA6
3からのPARS1）が加えられた点でことなる。
プラスミドpSAOH10は、第19図に図式的に示す。当該
プラスミドは、 （ａ）調節領域−β−グラクトシダーゼ遺伝子融合、 （ｂ）テトラサイクリン抵抗性、クロラムフエニコール
抵抗性及びアンピシリン抵抗性（それぞれtetR、camR及
びampR）を与える遺伝子を含むpBR325配列、と （ｃ）エス・セレビシエHIS4遺伝子（以下に記述する通
りプラスミドpYA2より得たもの） を含有する。
プラスミドpTAFH.85、pT76H1及びpT76H2は、用いた調
節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合が第15図ａに
記載したもの（第16図に記載した融合の代わりに）であ
ることを除き、上記の３種のプラスミドに類似してい
る。
プラスミドpT76H3及びpT76H4は、使用した調節領域−
β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合が（第16図に記載した
融合に替え）第15図ｂに記載したものであることをのぞ
き、pSAOH1とpSAOH5と類似している。
プラスミドpTAFH.85は、第20図に図式的に表示してあ
り、それは、 （ａ）第15図ａに示した調節領域−β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子融合、 （ｂ）ampR遺伝子を含むpBR322配列、 （ｃ）ピキア パストリスHIS4遺伝子、 （ｄ）エス・セレビシエ２μ環状DNAと、 （ｅ）エス・セレビシエ由来の断続URA3遺伝子 を含有する。
プラスミドpT76H1は、第21図に図式的に表示している
が、それは、 （ａ）第15図ａに示した調節領域−β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子融合、 （ｂ）ampR遺伝子を含むpBR322配列、と （ｃ）ピキア パストリスHIS4遺伝子と自律複製配列
（PARS1） を含有する。
プラスミドpT76H2は、第22図に図式的に表示してある
が、それは、 （ａ）第15図ａに示した調節領域−β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子融合、 （ｂ）テトラサイクリン抵抗性、クロラムフエニコール
抵抗性及びアンピシリン抵抗子付与遺伝子を含有するpB
R325配列、と （ｃ）エス・セレビシエHIS4遺伝子 を含有する。
プラスミドpT76H3は、第22図ａに図式的に表示してい
るが、それは、 （ａ）第15図ｂに示した調節領域−β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子融合、 （ｂ）amp R遺伝子を含むpBR322配列、 （ｃ）ピ− パストリスHIS4遺伝子、 （ｄ）エス・セレビシエ２μ環状DNAと、 （ｅ）エス・セレビシエ由来の断続URA3遺伝子 を含有する。
プラスミドpT76H4は、第22図ｂに図式的に示してある
が、それは、 （ａ）第15図ｂに示した調節領域−β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子融合、 （ｂ）amp R遺伝子を含有するpBR322配列、 （ｃ）ピキア パストリスHIS4遺伝子と、 （ｄ）ピキア パストリス自律複製配列（PAS1） を含有する。
酵母におけるβ−ガラクトシダーゼの発現 ピキア パストリスGS115（NRRLY-15851）を上記の新
規β−ガラクトシダーゼ遺伝子含有構築で形質転換し
た。得られた形質転換酵母菌株のうちの数種類のもの
は、合衆国農務省北方地区研究センターに寄託してあ
り、次の如き寄託番号が付与されている。
この新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子含有構築を大腸
菌の形質転換にも使用した。形質転換細菌の菌株を、こ
の出願が特許されたとき公衆が自由に入手可能にするた
めイリノイ州ピオリア市の北方地区研究所に寄託した。
この形質転換菌株は次の寄託番号が付与されている。
ピキア パストリスGS115（NRRLY-15851）を本発明の
アルコールオキシダーゼ及びp76調節領域−lacＺ遺伝子
融合を含有する上記８種のプラスミドで形質転換し、ビ
チオンと炭素源としてグルコースを補充した最少培地で
定常期まで生育させた。定常期に達すると、ビチオンと
炭素源としてメタノールを補充した最少培地に移し替え
た。特定時点で、培養菌のサンプルを採取し、実施例VI
I及びXVに記載した方法で、β−ガラクトクシダーゼ及
びアルコールオキシダーゼの存在について分析した。
グルコースを炭素源として生育させた細胞は、検出で
きる水準のβ−ガラクトシダーゼもアルコールオキシダ
ーゼも産出しなかつたが、一方、メタノールを唯一の炭
素源として生育させた細胞は、顕著な水準のアルコール
オキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを発現している
ことが判明した。グルコースで生育させた細胞を、炭素
源飢餓条件にさらすと測定しうる量のアルコールオキシ
ダーゼばかりでなくβ−ガラクトシダーゼを同様に発現
することが判明した。それ故、本発明の調節領域が、炭
素飢餓条件にも、メタノールの存在にも応答性であるこ
とは明らかである。
本発明の調節領域が非異化代謝産物制限炭素源同様炭
素飢餓条件での生育に応答性であることの実証のため、
アルコールオキシダーゼ調節領域含有のブラスミド、pT
AO13、p76調節領域含有のプラスミド、pT76U1を用いて
非メタノール利用酵母菌株、サツカロミセス セレビシ
エの形質転換に使用した。使用した形質転換菌株の一つ
で、当実験室内名称SEY2102-pTAO13を有する菌株を、こ
の出願が特許されたとき公衆が入手可能とするためイリ
ノイ州ピオリア市北方地区研究センターに寄託してあ
る。この形質転換菌株には寄託番号NRRL Y-15858が付与
されている。サツカロミセス セレビシエNRRL Y-15858
及びSEY2102-pT76U1をグルコース、果糖、エタノール、
グリセロール及びガラクトースで約５世代の間生育さ
せ、次いで炭素源飢餓条件にさらした。５世代間の生育
後β−ガラクトシダーゼの通常分析（実施例XV参照）に
より、グリセロール及びガラクトースで生育させた細胞
は、大量のβ−ガラクトシダーゼを産出したが、一方グ
ルコース及び果糖で生育させた細胞は、実質的には、β
−ガラクトシダーゼを産出しなかつた。炭素源飢餓条件
下で６時間生育させたのち、β−ガラクトシダーゼを測
定したところ、グルコース及び果糖で生育させた異質転
換菌株でも、中程度の、またグリセロール及びカラクト
ースで生育させたものでは、相当な量のβ−ガラクトシ
ダーゼの産出が認められた。それ故、この発明の調節領
域は、遺伝的に非常に異なつた酵母宿主での蛋白質産品
の産出を制御でき、メタノール利用酵母での利用に限定
されるものではない。
実施例 以下の実施例で使用した緩衝液及び溶液は次の示した
ような組成を有する。
１モルトリス緩衝液:800mlの水にトリス塩基121.1g、pH
を所望の値に濃塩酸（35％）を加えて調整。最終pH調節
前に溶液を室温まで冷却し、最終液量を１とする。
Ｓ−緩衝液:1.5モルのソルビトールを0.04M燐酸緩衝液
中に含む。pH＝6.6 pK緩衝液:0.14モルのNaCl、１％ドデシル硫酸ソーダ（S
DS）、0.01モルEDTAを0.01M（pH7.4）のトリス緩衝液中
に含む。
EST緩衝液:10ミリモルのEDTA、0.2％SDSを、0.01M（pH
7.4）トリス緩衝液中に含む。
TE緩衝液:1.0ミリモルのEDTAを0.01M（pH7.4）のトリス
緩衝液中に含む。
SSC:0.15モルのNaClと、15ミリモルのクエン酸ソーダを
含み、pHを7.0に調節。
TAE:40ミリモルの酢酸、５ミリモルのEDTAを0.02モル
（pH8.3）トリス緩衝液に含む。
PBS（燐酸緩衝食塩水）:10ミリモルの燐酸ソーダ（pH7.
0）と0.15モルのNaCl ラムンリー（Lammli）負荷緩衝液： 62.5ミリモルのト
リス−塩酸（pH6.8）、２％SDS、10％グリセロール、５
％ ２−メルカプトエタノール、0.01％ブモムフエノー
ルブルー RIPA緩衝液:1％NP40（シグマ製）１％デオキシコール酸
0.1％SDSをPBS中に含む。
20倍SSC:20モルモルのEDTA、0.16モルのNaOH、0.2モル
のNaH2PO4・H2O、3.6モルのNaCl、pHをNaOHで7.0に調整 デンハルト（Denhardt）氏溶液（X50）:5gのフアイコー
ル（Ficoll）、5gのポリビニールピロリドン、5gの牛血
清アルブミン（BSA;ペンタツクスフラクシヨンＶ）、全
容を水で500mlとする。
プレハイブリダイゼーシヨン緩衝液:5倍のSSPE、５倍の
デンハルト氏溶液、50％の脱イオン化ホルムアミド、0.
2％SDS、200μg/mlの切断し変性したニシンの精子DNA、 LB（ルリアーベールタニ）培地:5gのバクト−トリプト
ン、5gのバクト−酵母エキス、2.5gNaCl、を水１中に
含み、pHはNaOHで7.5に調整。
YPD培地:1％のバクト−酵母エキス、２％のバクト−ペ
クトン、２％のデキストローズを水１中に含む。
SD培地:6.75gの酵母窒素基剤でアミノ酸を含有しないも
の（DIFCO）、２％デキストローズを水１中に含む。
SED:1Mのソルビトール、25ミリモルのEDTA、50ミリモル
のDTT SCE緩衝液:9.1％のソルビトール、1.47gのクエン酸ソー
ダ、0.168gEDTA、50mlの水、pHを塩酸で5.8に調整。
CaS:1モルのソルビトール、10mMのCaCl2、濾過、滅菌す
る。
PEG溶液:20％ポリエチレングリコール−3350、10ミルモ
ルのCaCl2、10ミリモルのトリス−塩酸（pH7.4）、濾
過、滅菌する、 SOS:1モルのソルビトール、0.3倍のYPD培地10ミリモル
のCaCl2 ホルムアミド染料ミツクス:0.1％キシレン シクレノー
ル（cylenol）FF、0.2％プロモフエノールブルー、10ミ
ルモルのEDTA、95％の脱イオンホルムアミド。
トツプゲル:76.8gの尿素、24mlのアクリルアミドストツ
ク、8mlの10倍TBE最終容量を160mlとする。
アクリルアミドストツク:38gのアクリルアミド、2gのビ
ス（N,N−メチレンビスアクリルアミド）、に水を加え
て全容を100mlとする。
ボトムゲル:14.4gの尿素、3.0gの庶糖、7.5mlの10倍TB
E、4.5mlのアクリルアミドストツク、0.3mlブロムフエ
ノールブルー溶液（0.01g/ml）に水を加えて全容を30ml
とする。
ハイブリダイゼーシヨン選抜用プレハイブリダイゼーシ
ヨン緩衝液:50％ホルムアミド、0.75％モルNaCl、0.1モ
ルのトリス、pH7.4、0.008モルのEDTA、0.5％SDS、200
μg/mlのウサギ肺臓tRNA（シグマ製） 0.5モルのNETS緩衝液:0.5MNaCl、10ミリモルのEDTA、10
ミリモルのトリス、pH7.4、0.2％SDS 10倍RT緩衝液:500ミリモルのNaCl、340ミリモルのトリ
ス、pH8.3 60ミリモルのMgCl2、50ミリモルのDTT（ジチ
オスライトール） 希釈RT:4μｌのH2O、１μｌの10倍RT緩衝液、５μｌの
逆転写酵素、15単位／μｌ（ライフサイエンセズ社製） ジデオキシ： ddATP 0.49ミリモル ddCTP 0.1165ミリモル ddGTP 0.369ミリモル ddTTP 0.82ミリモル dNTPミツクス:0.625ミリモルのdGTP、0.625ミリモルのd
ATP、0.625ミリモルのTTP チエイス（chase）:1.125ミリモルのdATP、1.125ミリモ
ルのdCTP、1.125ミリモルのdGTP、1.125ミリモルのTTP
を１倍RT緩衝液中に含む。
特に特定しないかぎり、上記の溶液は、使用時基本（１
倍の）濃度を示す。実施例を通して、異なつた濃度水準
を採用したところでは、その事実を、基本（１倍の）濃
度の倍数として、当該溶液を言及することにより示して
いる。
次の略号を実施例を通して使用しているが、次の意味
を有する。
EDTA エチレンジアミン テトラ酢酸 TEMED N,N,N′,N′−テトラメチレンジアミン DTT ジチオスライトール BSA 牛血精アルブミン EtBr 臭化エチジウム Ci キユーリー dATP デオキシアデノシン トリホスヘート dGTP デオキシグアノシン トリホスヘート TTP チミジン トリホスヘート dCTP デオキシシチジン トリホスヘート dXTP “一般的”デオキシ トリホスヘートヌクレオチ
ド オリゴ(dT)12-18供給先：コラボレーテブ リサーチ
（株）（Collabrative Research Inc.） チモリラーゼ60000供給先：マイルス ラボラトリーズ
社 常套手段として用いた数種類の手順は、ここで以下に
詳記する標準プロトコールに従つている。
遠心分離は、澄明上澄液が得られるのに充分な回転速
度で、かつ充分な時間実施する。一般に、酵母細胞の遠
心分離は、少くなくとも1500Gで、少くなくとも５分間
実施する。
フエノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで
の核酸抽出は、50:48:2容のフエノール、クロロホルム
及びイソアミルアルコール混合物を、核酸を含む溶液と
等量用い、当該核酸含有溶液と接触させることを含む。
クロロホルム／イソアミルアルコールでの核酸抽出は、
48:2容のクロロホルムとイソアミルアルコール混合液を
当該溶液と等量を用いて接触させることを含む。
ゲル、フイルター、等をある特定の溶液中で洗つた又
は同溶液に浸漬したと記載している場合は、全ゲル、フ
イルター等を適当な容器、例えば、パン、皿、バイアル
等内で、当該ゲル、フイルターなどを対象溶液と完全に
接触させるために浸たした。
実施例１ 酵母細胞の生育及び調製 ピキア パストリスNRRL Y-11430を、ウエグナーによ
り米国特許第4414329号中で記載したIM1塩最少培地中で
メタノール又はエタノールを唯一の炭素源を用いて30℃
で継続培養により、炭素限定下で培養した。IM1最少培
地は、培地１当り、36mM（ミリモルと同義）KH2PO4、
23mM(NH4)2SO4、2mMMgSO4、6.7mMKCl、0.7mMCaCl2、0.2
μＭCuSO4・5H2O、1.25μMKI、4.5μＭMnSO4、２μＭNa
2MoO4、0.75μMH3BO3、17.5μＭZnSO4、44.5μＭFeCl2
及び1.6μＭビオチンを含む。メタノールで生育させた
細胞は、約12時間の保持時間で、140g/l（乾重）の細胞
濃度まで生育させた。エタノールで生育させた細胞は、
約11.5時間の保持時間で、90g/lの細胞濃度まで生育さ
せた。酵母槽へメタノール又はエタノールを仕込む際に
は、それぞれ20％及び40％の濃度を含む貯蔵仕込液を使
用した。
10gの醗酵槽で生育させたピキア パストリス細胞を
遠心分離により収集し、１％の２−メルカプトエタノー
ルを含む0.1Mトリン（pH8.0）に、約108細胞/mlの割合
で再懸濁させた。これらの細胞は、５〜10分37℃でイン
キユベートし、遠心分離により回収した。ペレツトを１
度30mlのＳ−緩衝液で洗浄し、細胞ｇ当り5mlのＳ−緩
衝液に再懸濁させた。チモリラーゼ（マイルス バイオ
ケミカルズ製）を細胞懸濁液に加えて、最終濃度で500
μg/mlとした。当該細胞を37℃で20分間インキユベート
し、次いで遠心分離した。上澄を捨て、細胞ペレツトを
回収した。このペレツトを、液体窒素中で凍結し、後の
使用のために−70℃で保存した。
実施例II 酵母RNAの単離 全細胞RNAは、実施例Ｉで記載した如く調製した凍結
ペレツトを乳鉢と乳棒で粉砕し、更に液体窒素の存在下
でワリングブレンダーで約２〜５分当該ペレツトを破砕
することにより調製した。この粉砕したペレツトをPK緩
衝液に、細胞ｇ当り7.5mlの濃度で加えた。プロテナー
ゼＫ（ベーリンガーマンハイム製）を再懸濁させた細胞
に最終濃度で400μg/mlとなるまで加え、当該懸濁液を
室温で10分インキユベートした。この混合液をフエノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次
いでクロロホルム／イソアミルアルコール抽出を行なつ
た。核酸を、当該溶液を0.25MNaClの濃度となるように
調整し、エタノールを加えて沈澱させた。当該ペレツト
をETS緩衝液の最少量、つまり、核酸を溶解させるに充
分な量の緩衝液量；一般には、溶液ml当りDNAを約100μ
ｇから最高約1mg程度に再懸濁させた。この溶液をフエ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用い
て、次いで、クロロホルム／イソアミルアルコールを用
いて再抽出し、最後にエタノールで沈澱させた。
この核酸をTE緩衝液の最少量中に再溶解させた。この
溶液中に存在するRNAは、4mlCsC1クシヨン［1gCsCl/m
l、1mMEDTAを10mMのトリス緩衝液（pH7.4）］を通した
遠心分離で富化するか、又は該溶液を2MLiClとし、４〜
８℃で一晩保持し、沈澱させ、遠心分離により回収し
た。当該ポリA+RNAを、オリゴ（dT）セルロースカラム
上で親和カクロマトグラフイーにより溶液より選抜し
た。一般に、0.25gのオリゴ（dT）セルローズ、型式３
（コラボレイテブ リサーチ製）を、全RNA5〜10mg当り
クロマトグラフイーのために用意した。0.25gのオリゴ
（dT）セルローズを2mlのETS緩衝液でスラリー化して、
少さな、シリコンを充填したガラスカラム中に注ぎ込ん
だ。このオリゴ（dT）セルローズカラムを、当該オリゴ
（dT）セルローズの上に0.1MのNaOHを置き、洗浄液をオ
リゴ（dT）セルローズマトリツクスを通過させることに
より、洗浄した。このオリゴ（dT）セルローズを次いで
10mlのETS緩衝液を用いて同一の方法で洗浄し、最後に
は、10mlのNETS緩衝液で洗浄した。
全RNA（５〜10mg）を、約10mg/mlを越えない濃度でET
S緩衝液に再懸濁させ、65℃のウオターバス上に２分置
いたのち、直ちに氷上に置いた。次いで、当該RNA溶液
を室温にまで加温し、5MのNaClの貯蔵液を、当該RNA溶
液中での最終塩類濃度が0.5MNaClとなるように加えた。
得られたRNA溶液を、既に調製したオリゴ（dT）セルロ
ーズカラム上におき約５秒間に１滴の割合でゆつくりと
通過させた。カラムの底から流れ出る材料を試験管中に
とり、再びカラムの上端に加えた。カラムの底から流れ
出る材料を二度カラム上端に加えたときに、当該RNA溶
液は当該オリゴ（dT）セルローズカラムを合計３回通過
したこととなる。カラムを最後に通過させたのち、当該
材料を回収し、ポリＡ−、すなわち、非ポリARNAと標識
した。当該カラムを30mlの0.5M NETSで洗浄し、最後
に、ポリA+RNAをカラム上に5mlのETS緩衝液を負荷し、
この緩衝液をゆつくりと通過させ、当該ポリA+RNAフラ
クシヨンを、カラムの底から流出す各5mlのフラクシヨ
ンにして回収する事で、溶出させた。当該ポリA+RNAフ
ラクシヨンには、NaClが全くない仮定して、このフラク
シヨンのNaCl濃度が0.25MNaClとなるように調整し、エ
タノールでRNAを沈澱させた。
実施例III cDNAライブラリーの構築 相補DNA（cDNA）クローンを次のようにして合成し
た。実施例IIで記載した如く調製したポリA+RNAを10μ
ｇ、７μｌのH2Oに再懸濁させ、最終濃度を2.7mMCH3HgO
Hにし、次いで室温で５分間インキユベートした。cDNの
最初の鎖を、42℃で15分間、50mMトリス（pH8.3;42
℃）、10mMMgCl2、30mM2−メルカプトエタノール、70mM
KCl、各500μＭのdATP、dGTP、TTP、200μＭのdCTP、25
μg/mlのオリゴ（dT）、60μg/mlのアクチノマイシン
Ｄ、25単位のアールナシン（RN asin:バイオテツク社
製）、25μCiα‐32PdCTP（32.5pモル）及び120単位の
逆転写酵素（ライフ サイエンセイズ社製）を含む溶液
50μｌ中で合成させた。この反応混液を37℃で更に15分
間インキユベートした。0.5MEDTA2μｌと20％SDS0.5μ
ｌを加えて反応を終了させた。反応混液をフエノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いで
クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出、最後にセ
フアデツクスG50カラムを用いTE緩衝液中でクロマトグ
ラフにかけた。この放射能を有する一本鎖のcDNAを、１
つのフラクシヨンにプールし、ブタノール抽出か、真空
下での遠心分離による留去により100μｌまで濃縮し
た。この単鎖cDNAを当該濃縮溶液よりエタノール沈澱さ
せ、cDNAを遠心分離により回収し、100μｌの水に再懸
濁させた。
この単鎖のcDNA水溶液を2.5mM酢酸アンモニアに調整
し、エタノールで沈澱させ、遠心分離により回収し、20
μｌの水に再懸濁させた。この単鎖DNA溶液を、5mMのMg
Cl2、1mMの２−メルカプトエタノール、各250μＭのdAT
P、dGTP及びTTP、125μＭのdCTP、25μCiのα‐32P-dCT
P（32.5pモル）及び８単位のレナウ（klenow）断片DNAP
olＩ（ニユーイングランド バイオラボ製）を含有する
50mM燐酸カリ緩衝液で最終容量を50μｌとした。得られ
た反応混液を、当該単鎖DNAに相補的な第二のDNA鎖を合
成するため、１時間、37℃でインキユベートした。反応
は、２μｌの0.5MのEDTAの添加により終結させた。当該
二重鎖cDNAフラクシヨンをプールし、プールしたものを
単鎖cDNAについて記載したと同じ方法で濃縮し、沈澱さ
せた。
最終のエタノール沈澱及び遠心分離による二重鎖の回
収後、当該ペレツトは、水20.25μｌに再懸濁させ、次
いで、10mMのMgCl2、30mMの２−メルカプトエタノー
ル、70mMのKCl、500μＭのdXTP及び150単位の逆転写酵
素を含む50mMトリス緩衝液（42℃でpH8.3）を用いて最
終液量を50μｌとした。得られた溶液を420℃で15分間
インキユベートし、第２のcDNAの合成を確実とした。反
応を２μｌの0.5MEDTAの添加により終了させ、単鎖cDNA
について記載したと同じ方法により濃縮し、沈澱させ
た。
この二重鎖cDNAペレツトを42μｌの水に再懸濁させ、
次いで、2.8MNaCl、200mNaOAc及び45mMのZnSO4を含む貯
蔵溶液を５μｌ加えて最終容量を47μｌとした。ヘアピ
ンループを消化させるために、三種類の濃度のS1ヌクレ
アーゼ（シグマ製）を用い３つの反応を別々に行なつ
た。１単位、10単位、100単位のS1ヌクレアーゼを加
え、液量を50μｌとし、次いで、22℃で30分インキユベ
ートした。反応を２μｌの0.5MEDTA及び2.67μｌの2Mト
リス塩基を加えて終結させた。６μｇのウサギの肝臓tR
NAをキヤリヤーとして加えて、反応混液を、DNAペレツ
トを水の代りにTE緩衝液に再懸濁させたことを除き上記
の如く、濃縮、沈澱させた。最後の沈澱後、当該ペレツ
トを20μｌのTE緩衝液に再懸濁させ、10pモルのα‐32P
-dCTP、２μｌのdCTP及び21単位のターミナル トラン
スフエラーゼ［ラツトリツフ バイオケム（Ratliff Bi
ochem）製］を含むターミナル トランスフエラーゼ緩
衝液（BRL）中で、最終容量を50μｌとした。得られた
溶液を、ポリｄ（ｃ）テールを当該二重鎖cDNAに加える
ために37℃で30分間インキユベートした。反応を、５μ
ｌの0.5MのEDTAを加え終了させ、抽出しクロマトグラフ
にかけ、エタノール沈澱物として貯蔵した。
当該二重鎖、ｄ（ｃ）末端と結合した（tailed）cDNA
を、直接ポリｄ（Ｇ）末端と結合したpBR322で、PstＩ
部位の開いているものと再アニール化するか又はセフア
ローズCL4B-200カラム（25μmlフラクシヨン）でまずサ
イズフラクシヨンを行なつた。
末フラクシヨン化ライブラリーについては、150ngの
二重鎖のポリｄ（ｃ）末端結合cDNAを、NaClでは0.1M、
EDTAでは1mMである、10mMトリス（pH7.4）180μｌ中で9
00ngのｄ（Ｇ）末端結合pBR322でPstＩ部位の開いてい
るものとアニール化した。各25μｌのフラクシヨン化し
たライブラリーのフラクシヨンを上記と同一のアニール
化混合液中で最終液量50μｌとして、125ngのポリｄ
（Ｇ）末端結合pBR322にアニール化した。当該アニール
反応は65℃で３分間イキユベートし、次いで42℃で２時
間、そしてゆつくりと室温にまで冷却して行なつた。
当該アニール化cDNAライブラリーで、調製したコンピ
テント大腸菌LE392（ATCC33572）を次に述べた如く形質
転換した。LE392を２×LB培地に接種し、37℃で一晩生
育させた。この一晩培養物5mlを200mlの新しい２×LB培
地に接種し、37℃でOD600で0.2〜0.3となるまで生育さ
せた。この培養物を氷の上に10分間置いて、次いで細胞
を４℃で遠心分離により回収した。当該細胞ペレツト
は、80mlの氷で冷やした。0.1MのCaCl2に再懸濁させ、2
5分間４℃でインキユベートした。細胞を４℃で遠心分
離により収集し、細胞ペレツトを2mlの氷で冷やした0.1
CaCl2に再懸濁させ使用前に４℃で少くなくとも２時間
インキユベートした。次いで、200μｌのコンピテント
細胞をアニーリングミツクス50μｌ当り、形質転換用と
して用いた。コンピテント細胞とDNAをあわせ、約４℃
で10分間インキユベートし、次いで、37℃で５分間イン
キユベートし、最後に10分間氷の上に放置した。当量の
２×LB培地を形質転換ミツクスに加え、37℃で45分間イ
ンキユベートした。この形質転換した細胞は、15μg/ml
のテトラサイクリンを含有する２×LB平板培地（150m
m）上250μl/プレートで平板培養した。平板培地を37℃
で24時間インキユベートし、４℃に貯えた。
レプリカ フイルターを平板上のコロニーを切り取る
のに使用した原フイルターの上にニトロセルローズのフ
イルターを押しつけることにより調製した。これらのレ
プリカフイルターは２×LB-Tet（15μg/mlのテトラサイ
クリン）平板培地上でインキユベートした。フイルター
上のコロニーを、フイルターをクロラムフエニコール20
0μg/ml含有する２×LB-Tet平板培地に移し替え、フイ
ルターを37℃で少くなくとも12時間インキユベートし、
次いでコロニーを、フイルターを1.5MNaCl及び0.5MNaOH
よりなる水溶液プールに10分間浮遊させることによつて
溶解させることにより、プローブの用意をした。フイル
ターは次いで1.5MNaClと0.5Mトリス（pH7.4）よりなる
水溶液プールに15分間浮遊させて中和し、この中和をも
う一度くりかえした。フイルターを次いで風乾し、最後
に70℃で２時間真空乾燥した。
実施例IV コロニー ハイブリダイゼーシヨン 当該cDNAライブラリーを含有する真空乾燥したニトロ
セルローズフイルター（先の実施例において記載の如く
調製）をプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液中で42℃、
５時間プレハイブリツド化した。フイルターを当該ハイ
ブリダイゼーシヨン緩衝液から除き、細胞渣をのぞくた
め５×SSPE中で手袋をはめた手で軽くこすつた。フイル
ターをハイブリダイゼーシヨン緩衝液（１×のデンハル
ト氏液をのぞきプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液と同
一）に放置した。32Ｐ−標識単鎖cDNA（106cpm/ml）又
は末端標識ポリA+RNAでのフイルターのハイブリダイゼ
ーシヨンを、42℃、17時間行なつた。ハイブリダイゼー
シヨン後、フイルターを２×SSPE中で22℃で簡単に洗
い、次いで二度65℃で0.1×SSPEで各10分間洗つた。
ポリA+mRNAの末端標識化は、２μｇのポリA+mRNAを50
μｌの50Mトリス（pH9.5）含有液に加え、100℃に３分
間加熱し、迅速に氷上で冷却することにより行なつた。
このRNA溶液を、最終容量200μｌまでに希釈し、50mMト
リス（pH9.5）、10mMMgCl2、5mMDDT及び5pモルの32P-AT
Pに調整した。10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ
（ベリンガーマンハイム製）を加え、混合液を37℃で１
時間インキユベートした。キナーゼ化反応は、10μｌの
0.5MEDTAを添加して終了させ、フエノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコールで抽出し、セフアデツクスG5
0を通じクロマトグラフを行ない、未挿入放射能標識を
除去した。
実施例Ｖ ノーザンハイブリダイゼーシヨン ２ないし５μｇのポリA+mRNAを、50％ホルムアミド、
2.2Mホルムアルデヒド及び0.5mMEDTAを含有する10mM燐
酸ソーダ緩衝液（pH7.4）中で５分間65℃に加熱した。
得られた溶液を室温まで冷却し、適当量（一般的には、
処理したサンプルの量の約0.2容）の５×サンプル緩衝
液（0.5％SDS、0.025％ブロモフエノール ブルー、25
％グリセロール、25mMEDTA）を加えた。このサンプル
を、1.1Mホルムアルデヒドを含む10mM燐酸ソーダ緩衝液
（pH7.4）中で調製した1.5％アガロースゲルに添加し同
一の緩衝液中で電気泳動した。ゲルを10mMの燐酸ソーダ
緩衝液（pH7.4）を入れたアクリジンオレンジ（33μg/m
l）で染色し、当該ゲルを同一の緩衝液に10分間浸漬す
ることにより脱色し、10×SSPE中ですくなくとも10分間
浸漬し、RNAを実施例VIで記述するようにニトロセルロ
ーズへと移し替えた。
実施例VI ゲノムDNAとクローンの単離 ピキアゲノムDNAをピキアRNA単離の為実施例IIで記載
した方法を用いて単離した。核酸ペレツトを最少容のTE
緩衝液に再懸濁させて、20μg/mlRNアーゼＡを用いて30
分間37℃でインキユベートした。溶液を0.14MNaClまで
にし、15分間22℃で200μg/mlのプロテナーゼＫで処理
した。得られた溶液を最初フエノール／クロロホルム／
イソアミルアルコールで、次いでクロロホルム／イソア
ミルアルコールで抽出、最後にエタノールで沈澱させ
た。沈澱したDNAは、最少容のTE緩衝液に再懸濁させ、D
NA溶液を澄明にするため遠心分離した。
先きの文節に記載したように調製したピキアゲノムDN
Aを10μｇ、種々の制限酵素（BRL）で消化し、TAE含有
の１％アガローズゲル上で電気泳動した。ゲル中のDNA
断片を、1.5MNaCl、0.5MNaOHに20分浸漬し、変性した。
当該ゲルを1.5MNaCl、0.5Mトリス（pH7.4）中に20分間
浸漬させ中和した。移し替に先き立ち、当該ゲルを10×
SSPE中にすくなくとも５分間漬けた。ニトロセローズ紙
をゲルの大きさに切り、水で湿らし、簡単に10×SSPEに
浸漬した。このフイルターをパラフイルム片の上に順に
おいてあるゲルの上にのせた。ワツトマン濾紙１枚と紙
タオル一かさねを、DNAをゲルから引き出し、ニトロセ
ルロースに移しかえるためにニトロセルロースの上にお
いた。移動をおこすため、当該紙タオルの上に重しをの
せた。３時間、このようにして、DNAを移しかえさせ
た。この移し替えののち、フイルターを５×SSPEに簡単
につけ、風乾し、２時間70℃で真空乾燥した。相補的ゲ
ノム断片を、実施例IV記載と同じプレハイブリダイゼー
シヨン、ハイブリダイゼーシヨン及び洗浄緩衝液を用い
て、ニツク−トランスレーシヨンされたcDNAクローンpP
C8.0、pPC6.4及び1pPC15.0へのハイブリダイゼーシヨン
により同定した。
200ngの当該cDNAを、50mMトリス−塩酸（pH7.4）、10
mM MgSO4、100μＭ（マイクロモル）、50μg/mlBSA、各
20μＭのdGTP、TTP及びdATP、31.25pモル（ピコモル）
32P-α−dCTP（3200Ci/mM、MEN）、２単位の大腸菌DNAP
olＩ（BRL）、及び0.02ng（ナノグラム）のDNアーゼＩ
（DNaseI）を含む溶液30μｌ中で、14℃、90分間、ニツ
クトランスレーシヨンを行なつた。反応は、0.5MEDTA/
μｌ、及び20％SDS/μｌの添加により終了させた。この
標識化された溶液を、最終濃度で0.3NaOHとし、３分間
沸騰水中に置いた。この混合液を、セフアデツクスG50
カラムでクロマトグラムにかけた。標識されたDNA断片
をプール化し、比活性を測定し、ハイブリダイゼーシヨ
ン実験でプローブとして使用した。
当該cDNAプローブにハイブリダイゼーシヨンされたゲ
ノム断片を、200μｇのピキアゲノムDNAを種々の制限酵
素（BRL）で消化し、消化物をTAE緩衝液中の１％アガロ
ースゲルで電気泳動することにより単離した。適当な大
きさのバンドを、当該アガロースゲルより切り取り、DN
Aを電気溶出し、エルチツプ（Elutip）カラム（シユラ
イヒヤー及びシユエル製）を通し、エタノールで沈澱さ
せた。
電気泳動断片を水に再懸濁させ、200ng（ナノグラ
ム）断片を、適当な制限酵素切断部位を開環してあり、
必要に応じ、脱燐酸してあるpBR322,500ngにリゲートし
た。このリゲーシヨン反応は、6.6mMMgCl2、10mMDTT、
0.4mMATP、25μg/mlBSA、及び40-80単位のT4DNAリガー
ゼを含有する66mMのトリス（pH7.4）300μｌ中で実施し
た。このリゲーシヨン混液を直接コンピテント大腸菌細
胞へと形質転換した。細胞のコンピテント化及び形質転
換については、実施例III記載の如く実施した。10,40,
および100ngのpBR322（＋挿入）を用い、各100μｌのコ
ンピテント細胞含有液中で、３個の形質転換をシリーズ
で行なつた。抗生物質淘汰を、アンピシリン50μg/mlを
用いたのをのぞき実施例IIIと同様に、当該細胞を平板
培養により行なつた。当該クローンを実施例III記載の
通り、ニトロセルロースに移し替え、複製させ、ハイブ
リダイゼーシヨンの用意をした。当該フイルターは、適
切なニツクトランスレーシヨンされたcDNA断片でプロー
ブした。ハイブリダイゼーシヨンで陽性であつた、線条
接種により純化したクローンを、以下に記載の如く、追
加プラスミドを調製するのに用いた。
プラスミドを有するLE392大腸菌株をアンピシリン50
μg/ml含有の１×LB培地中で、OD600が1.0となるまで生
育させ、クロラムフエニコール200μg/mlを最終的に含
むまで添加して、一晩増幅させた。細胞を、0.8％NaC
l、20mMトリス（pH8.0）、20mMEDTA中で洗浄し、次い
で、25％蔗糖、50mMトリス（pH7.4）及び20mMEDTA中
で、450μg/mlのリゾゾーム（lysozome）で処理した。
溶菌は、5MのNaClを加えて最終濃度が2.0Mとなる様加
え、次いで、同量の0.2％トリトンX-100と40mMEDTAを加
えた。当該調製液を20000RPMで、45分間遠心分離して澄
明とした。上澄液をフエノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコールで、次いでクロロホルム／イソアミルア
ルコールで抽出し、エタノールで沈澱させた。ペレツト
を、TE緩衝液中に再分散させ、RNアーゼ（RNase）Ａで
処理、再びフエノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール、次いで、クロロホルム／イソアミルアルコール
で抽出した。固体CsClを加えて最終濃度800μg/mlと
し、またEtBrは、最終濃度1mg/mlとなるように加えた。
得られた溶液を、ヴチ（Vti）50ローター中で18-20時
間、20℃で、45000RPMで遠心分離した。
当該プラスミドをUV蛍光により可視化し、針と注射器
を用いて遠心管より抜き取つた。当該プラスミドを、４
回ブタノールで抽出し、−20℃でエタノールで沈澱させ
た。エタノール沈澱を２回繰り返し、すべてのCsClをの
ぞいた。当該プラスミドは、エタノール沈澱物のまゝ−
20℃で貯蔵した。
実施例VII アルコールオキシダーゼの精製 実施例Ｉ記載の如くメタノールで生育させたピキア
パストリス細胞からの蛋白を、以下の通り、酵母細胞で
溶解させ、次いで、細胞砕渣をのぞくため遠心分離によ
り澄明化することにより調製した。すなわち、醗酵廃液
の一部を取り去り、pH7.5に水酸化アンモニアで調整
し、0.6lの容器を用い、ダイノ−ミル（Dyno-Mill）型
式KDLで、30℃で、ベルト組合せNo3を用い、20-30ml/時
間の流速で連続運転して、ホモジネート化した。ミル中
のビーズは、無鉛ガラスビーズで、直径0.3-0.5mmのも
のであつた。得られたホモジネートを５℃、20000Gで30
分間遠心分離し、無細胞上澄液を得た。
６個の130ml無細胞上澄液を、酢酸セルロース透析袋
に入れ、約8lの蒸留水に対して、５℃で透析した。４日
後、各袋の水溶液の部分のデカンテーシヨンにより除い
た。袋に残つている固体は、二つの型の固体より構成さ
れていた。白色の上部の薄い層を注意深くとりのぞき、
捨てた。底部の固体は、ブラウンないし黄色で、結晶性
のアルコールオキシダーゼであつた。このアルコールオ
キシダーゼの一部を、蒸留水（約固体の10倍容）に溶解
させ、染料−パーオキシダーゼ方法による測定により、
活性は94EU/mlであることを示した。当該アルコールオ
キシダーゼの比活性は、蛋白で10.4EU/mgであつた。
上記の透析からの結晶性沈澱物を、0.05Mの燐酸緩衝
液（pH7.5）に対して透析し、上記緩衝液で平衡したス
パクリル200（フアルマシア製）カラム、２×200cmに適
用した。3.5mlづつの各フラクシヨンを、流速10ml/時間
で収集し、アルコールオキシダーゼ活性について測定し
た。
メタノールを用いた反応に対する当該アルコールオキ
シダーゼは、次の測定方法（染料−パーオキシダーゼ
法）により測定した。染料−緩衝液混合物を、0.1mlの
ｏ−ジアニシジン溶液（１重量％ｏ−ジアニシジン水溶
液）に、12mlの通気した0.1Mの燐酸緩衝液（pH7.5）で
混合することにより調製した。測定用混液は、2.5mlの
染料−緩衝液混合物、50μｌのメタノール、10μｌのパ
ーオキシダーゼ溶液（1mgのわさびパーオキシダーゼ−
シグマ製、タイプII）、及び25μｌのアルコールオキシ
ダーゼ溶液で調製した。当該測定用混液を、４×１×1c
mのキユベツト中で25℃に保持し、染料による吸光度の4
50nmにおける増加を２ないし４分間測定した。酵素活性
は、次式により算出した。
ここで、11.5は、既知量のH2O2を用いて作成した標準曲
線にもとづく係数で、ΔＡは、実験期間内における吸光
度の変化である。
全量で0.1μｇの各フラクシヨンからの全蛋白を、SDS
−ポリアクリルアミド（12％）を用いたゲル電気泳動に
よりアルコールオキシダーゼ活性について同様に測定し
た。
実施例VIII DNA及び蛋白の配列 DNA配列の決定は、バクテリオフアージM13を用いたジ
オキシ鎖の延長方法（シンガー等、1980年）又は化学的
修飾法（マキサム及びギルバート、1980年）により実施
した。当該アルコールオキシダーゼ遺伝子の５′末端に
対応するDNA断片を、M13mp8及びM13mp9ベクターへと挿
入するか、この領域内にある制限酵素切断部位を使用す
る化学的修飾法による末端標識を行なつた。
710bpのHindIII/SalＩのpPG4.0からの断片を、まず33
μｇの当該プラスミドをHindIIIで消化することによ
り、マキサム−ギルバート法による配列決定のための末
端標識を行なつた。反応混合液を、フエノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコールで、次いでクロロホルム
／イソアミルアルコールで抽出し、エタノールで沈澱さ
せた。当該DNAを遠心分離により収集し、31μｌの水に
再懸濁させた。100μCiの32p-α‐dCTP（3200Ci/mM）及
び２単位のレナウ断片DNApolＩを反応容器に加えて、40
0μＭのdATP、400μＭのdGTP、50mMのトリス（pH7.
4）、10mMMgSO4、及び1mMのDTTを含有する、最終容量50
μｌの溶液を得た。この反応溶液を、37℃で１時間イン
キユベートし、２μｌの0.5MEDTAを加えて反応を停止さ
せた。次いで、混液を、フエノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコールで抽出し、更にクロロホルム／イソ
アミルアルコールで抽出し、セフアデツクスG-50カラム
上でクロマトグラムにかけ、標識された核酸断片をプー
ルし、エタノールで沈澱させた。遠心分離後、DNAペレ
ツトを水で再懸濁させ、SalＩで消化した。この消化物
をTAE緩衝液中の１％アガロースケルで電気泳動させ
て、ゲルから710bpのバンドを切り取つて、DNAを電気溶
出させ、ブタノールで抽出し、エタノールで沈澱させ
た。当該断片を100μｌのTE緩衝液に再懸濁させて、2.5
Mの酢酸アンモニアに調整し、次いでエタノールで沈澱
させた。得られたDNA断片を50000cpm/μｌの濃度でTE緩
衝液に再懸濁させた。
４種の塩基修飾反応は次のように行なつた。すなわ
ち、（ａ）Ｇ（グアニン）反応は、22℃で８分間インキ
ユベートして行なつたが、反応溶液は、１μｌ（50000C
PM）の当該標識DNA断片、４μｌの水、200μｌの50mMの
カコジル酸ソーダ、pH8.0の、1mMETDA（DMS緩衝液）及
び１μｌのジメチル硫酸を含有していた。反応は、1.5M
の酢酸ソーダ（pH7.0）を含有したDMS停止緩衝液で、か
つ1Mの２メルカプトエタノール及び100μg/mlのtRNAを
含むものを添加して終了させ、次いでエタノール（750
μｌ）を加え、反応混液を少くなくとも15分間−70℃に
保つた。（ｂ）G/A（グアニン／アデニン）反応は、イ
ンキユベーシヨン10分間で、溶液は、２μｌ（100000cp
m）の標識DNA断片、８μｌの水及び30μｌのギ酸を含有
していた。反応は、200μｌのHz停止緩衝液（0.3Mの酢
酸ソーダ、pH5.5,0.1METDA、及び25μg/mlのtRNAを含
有）の添加により終了させ、次いでエタノール（750μ
ｌ）を加えて、反応混液を少くなくとも15分間−70℃に
保つた。（ｃ）T/C（チミン／シトシン）反応は、22℃
で、10分間インキユベートしたが、反応液には２μｌ
（100000cpm）の標識DNA断片、18μｌのヒドラジンを含
有していた。反応は、上記（ｂ）で記載した如く終結さ
せた。（ｄ）Ｃ（シトシン）反応は、22℃で10分間イン
キユベートし、反応液には１μｌ（50000cpm）の標識DN
A断片、４μｌの水、15μｌの5MNaCl、及び２μｌのヒ
ドラジンを含有していた。反応は、上記（ｂ）記載の如
く終了させた。
当該DNAペレツトを遠心分離により収集し、250μｌの
0.3Mの酢酸ソーダ（pH5.5）、750μｌの95％エタノール
を加え沈澱させた。ペレツトを遠心分離により回収し、
５分間真空下で乾燥させ、ペレツトを100μｌの１対10
希釈ピペリジン溶液に再懸濁させて、当該DNAを開環し
た。開環反応は、90℃で30分間インキユベートすること
により行ない、反応を500μｌの98％エタノール、60mM
の酢酸ソーダ（pH5.5）と10μg/mlのtRNAを添加して終
了させた。当該断片は、50μｌの0.3M酢酸ソーダ（pH5.
5）に再懸濁させ、次いで95％のエタノールを100μｌ添
加し沈澱させた。このエタノール沈澱をくり返し、当該
ペレツトを95％エタノールで洗浄し、遠心分離をしなが
ら、真空中で乾燥した。当該ペレツトを、10μｌの80％
ホルムアミド、10mMNaOH、1mMEDTA、0.1％キシレン、シ
アノール、及び0.1％ブロモブルーよりなる溶液に再懸
濁させた。２ないし３μｌを10％の0.4mmの厚さの、TBE
緩衝液中のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ
た。
アルコールオキシダーゼのアミノ酸配列は、2mgの精
製ピキア パストリス由来のアルコールオキシダーゼを
使用し、スクエマツト（Sequmat）社（マサチユウセツ
ツ州ウオタータウン市）により決定された。この成熟蛋
白の最初の18のアミノ酸は次の通りであると決定され
た。
Ala-Ile-Pro-Gle-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gl
y-Gly-Ser-Gly-Ser 実施例IX アルコールオキシダーゼ転写開始部位の決定 アルコールオキシダーゼ用mRNAの開始点がどこに位置
しているかを決定するために、プライマー拡張実験を、
プライマーとしてアルコールオキシダーゼ遺伝子の５′
末端よりなるDNA配列からコピーした合成オリゴヌクレ
オチドと10μｇのポリA+ ピキア パストリアmRNAを鋳型
として使用して行なつた。10μｇピキア パストリスポ
リA+mRNAを、43mMNaCl、29.2mMトリス（pH8.3）、5.2mM
MgCl2及び4.3mMDTTよりなる溶液で最終液量9.3μｌとし
た溶液中で、3ngのプライマー（５′‐CTT CTC AAG TTG
TCG-3′）と結合させた。当該核酸を70℃で５分間変性
し、22℃にゆつくりと冷しながら再アニール化させた。
再アニール化混液を各１μｌのddNTPに加えた。最終３
μｌとした混液を１μｌの水に加えた。反応は１μｌの
希RTを添加することにより開始し、42℃で15分間インキ
ユベートした。３μｌのチエイスRTを用いて反応を42℃
で15分間追跡（chase）した。反応は、7.5μｌのホルム
アミド−染料ミツクスを添加し停止させ、1XTBE中の0.4
mmの厚さの勾配ゲル上で電気泳動させた。電気泳動後、
当該ゲルを10％の酢酸溶液中で10％メタールを用い20分
間かけ固定した。ゲルを真空下で乾燥させ、XARX-rayフ
イルムに曝露させるのに使用した。
勾配ゲルは次の如く調製した。すなわち、300μｌの1
0％ペルオクソ燐酸アンモニアと14μｌのTEMEDを30mlの
ゲル最上部に加え、75μｌの10％ペルオクソ燐酸アンモ
ニアと3.5μｌのTEMEDを7mlの底部ゲルに加え、6mlの頂
上ゲルをピペツトで取り、次いで6mlの底部ゲルを同一
のピペツトで取つた。当該ゲルをゲル板の間に注ぎ、次
いで頂上ゲル22mlを注いだ。
実施例Ｘ mRNAハイブリダイゼーシヨン−淘汰及び試験管内翻訳 陽性ハイブリダイゼーシヨン−翻訳実験を20μｇのク
ローン化したピキアゲノムDNA（実施例VIで記載の如く
調製した）を種々の制限エンドヌクレアーゼを用いての
消化により線形することにより実施した。このDNAを、
当該溶液を0.3MNaOHとし、そして、65℃で10分間インキ
ユベートすることにより、変性化した。変性したDNA−
含有溶液は急速に氷上で冷却し、0.5Mトリス−塩酸（pH
7.4）に調節することにより中和した。当量の20×SSPE
を、当該変性DNAをニトロセルローズフイルターに結合
させる直前に、加えた。当該DNAをニトロセルローズフ
イルター（シユライヒヤー及びシユエル製BA83、直径9m
m）に適用する前に、当該フイルターをH2Oで湿らし、10
分間煮沸し、３回10×SSPE中ですゝいだ。10μｇのDNA
を各フイルターに適用させ、当該フイルターに結合さ
せ、風乾し、最後にフイルターを70℃で２時間真空下で
乾燥した。
プレハイブリダイゼーシヨンの前に、結合しているDN
Aと共にフイルターを1mlの滅菌水中に入れ、１分間100
℃で加熱し、氷上で冷却し、1mlの滅菌水中でばけしく
かきまぜながらすゝぎ、更に1mlのプレハイブリダイゼ
ーシヨン緩衝液中ですゝいだ。当該フイルターを1ml中
のプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液中でプレハイブリ
ダイゼーシヨン化し、次いで40μｇ（２μg/mlETS）の
ポリA+mRNAを直接当該プレハイブリダイゼーシヨン緩衝
液に加えた。このハイブリダイゼーシヨン混合液を65℃
で10分間加熱し、次いで42℃で24時間インキユベートし
た。
ハイブリダイゼーシヨンに続いて、フイルターを２回
0.5％SPSを含む１×SSPE中で22℃で簡単に洗浄し、次い
で0.5％のSDSを含む１×SSPE中で各５分間、50℃で７回
洗浄し、３回、50℃で各５分間0.1×SSPE中で洗浄し、
次いで一度10分間65℃で0.1×SSPE中で洗浄した。当該R
NAを、１分間、300μｌの15μｇのウサギ肝臓tRNAを含
むH2O中で１分間煮沸して、フイルターから溶出させ
た。溶出したRNAを迅速にドライアイスエタノールバス
上で凍結した。当該RNA混合液を室温まで暖め、フイル
ターを除去した。当該RNA混合液を2.5Mの酢酸アンモニ
アに調整して、沈澱させ、メタノールから２回沈澱さ
せ、最後に凍結乾燥前に100μｌのH2O中に再懸濁させ
た。
翻訳は、その技術分野で通常の知識を有するもの、す
なわち当業者により知られた標準方法、例えば、ニユー
・イングランドヌクレア イン ビトロ ウサギ網状赤
血球溶解物転写装置により提供されている指示などにも
とづいて実施した。蛋白産物は、4.5％のスタツキング
ゲルを含有する８％のポリアクリルアミドで電気泳動
した。
実施例XI 抗血清調製物及び免疫沈澱 ウサギ内でp72（アルコールオキシダーゼ）及びp76ポ
リペプチドの両者を含むピキア パストリス細胞からの
抽出物に対して高められた抗血清は、標準プロトコール
を用いて調製した。抽出物を抽入前にPBSに対して透析
した。８週間をかけて、各ウサギに、0.2mlのフルンズ
（Freunds）完全補薬で0.1mlとし、全蛋白1mgを含む注
射液を３回注射した。注射は各ウサギの６〜10部位に経
皮的に行なつた。８週後に、ウサギより採血し、オウチ
ヤーロンリー（Ouchterlony）二重拡散方法により精製
したピキア パストリスアルコールオキシダーゼに対し
て、これらの血精を検査した。
精製したウサギの抗−p72（アルコールオキシダー
ゼ）及び抗−p76蛋白抗体は、全血清をCNBrでカツプリ
ングしたp72（アルコールオキシダーゼ）−p76セフアロ
ーズ4Bカラム（フアルマシア製）を通す親和性クロマト
グラムにより調製した。1gのCNBr活性化ゲルを、当該ゲ
ルを200lの1mMHCl中で15分間水和させ、次いで、カツプ
リング緩衝液［0.1M炭酸ソーダ（pH8）及び0.5MNaCl］5
0mlで３回洗浄することにより調製した。5mlの、6mg/ml
のp72-p76含有カツプリング緩衝液を当該ゲルに加え、
おだやかに４℃で一晩撹拌した。未結合の蛋白は、カツ
プリング緩衝液50mlを用い各３回洗浄し、除去した。残
存する活性グループは、1Mのエタノールアミン（pH8）
中で２時間インキユベートして取り除いた。非共有結合
材料は、pBS中の2Mチオシアン酸ソーダ、50mlでゲルか
ら除去した。当該抗血清のクロマトグラフイーに先立つ
て、当該ゲルを最終的にPBS50mlで３回洗浄した。5mlの
確認済抗p72-p76抗血清を当該ゲルと混合し、４℃で２
時間おだやかに撹拌しながらインキユベートした。当該
抗血清−ゲル混合物を１×8cmのカラム中へピペツトで
加え、150mlのPBSで洗浄した。精製した抗体は、PBS中
の2Mのチオシアン酸ソーダ6mlでカラムより溶出させ
た。ゲルからの溶出後、精製抗体を0.02％アジ化ソーダ
を含有するPBSに対して広範囲に透析した。
当該親和力による精製抗血清をPBS中、１％NP40中の
イン ビトロ翻訳ミツクスに加え、インキユベートを４
℃で一晩行なつた。抗体−抗原コンプレツクスを、氷上
で2.5時間、パンソルビン（カルバイオケミ製）を用い
て沈澱させた。パンソルビンは、RIPA緩衝液中で洗浄し
て調製した。パンソルビン沈澱物は、RIPA緩衝液中で４
回洗浄し、レムリー（Laemmli）添加緩衝液に電気泳動
前に溶解させた。
実施例XIIピキア パストリスの形質転換手順 Ａ 細胞の成育 1.YPD培地約10ml中へピキア パストリスGS115（NRRL Y
-15851）のコロニーを植えつけ、30℃で12-20時間振と
う培養する。
2.約12-20時間後、OD600で約0.01から0.1となるように
細胞を希釈し、YPD培地中で30℃で約６〜８時間細胞を
対数増殖期に保持する。
3.約６〜８時間後、OD600で約0.1（又はその相当量）の
種培養0.5mlを、YPD培地100mlに植付ける。30℃で約12-
20時間振とう培養する。
4.OD600が約0.2-0.3となつたとき（約16-20時間後）培
養物を1500Gで５分間遠心分離し、回収する。
Ｂ スフエロプラストの調製 1.細胞を１度10mlの滅菌水中で洗う。（ステツプ１ない
し５の遠心分離はすべて1500G、５分間である）。
2.新たに調製したSED10ml中で細胞を洗う。
3.滅菌１モルソルビトール溶液10ml中で細胞を２度洗
う。
4.10mlのSCE緩衝液に細胞を再分散する。
5.チモリアーゼ60,000（マイルズ ラボラトリーズ社
製）ml当り4mg含む溶液を5-10μｌ加える。約30-60分、
30℃で細胞をインキユベートする。
スフエロプラストの調製は形質転換手順においては、
危険をはらんだ工程であるため、スフエロプラストの形
成を次の如くモニターする必要がある。細胞（を含む
液）100μｌを900μｌの５％SDS及び900μｌの１モルの
ソルビトールに、チモリアーゼの添加前又は添加直後及
びインキユベート期間中種々な間隔で加える。SDS中で
は細胞が溶解するが、ソルビトール中では溶解しない点
（通常30から60分のインキユベーシヨン）でインキユベ
ーシヨンを停める。
6.スフエロプラストを滅菌した１モルのソルビトール10
ml中で、1,000Gで5-10分遠心分離しながら二度洗浄する
（遠心分離のための時間及び速度は変動する。スフエロ
プラストがペレツト化するに充分なだけ遠心分離する。
しかし、その力で破壊されるほどであつてはならな
い）。
7.滅菌したCaS10ml中で１度洗う。
8.全量で0.6mlのCaSに細胞を再分散させる。
Ｃ 形質転換 1.DNAのサンプル（20μｌの容量まで）を12×75mmの滅
菌したポリプロピレン管に加える（DNAは水又はTE緩衝
液中に分散されていること；少量のDNAで最大限の形質
転換頻度を上げるためには各サンプルに、超音波処理し
た大腸菌を5mg/ml含む溶液１μｌを加えるのが好まし
い）。
2.100μｌのスフエロプラストを各DNAサンプルに加え
て、室温で約20分間インキユベートする。
3.1mlのPEG溶液を各サンプルに1ml加え、室温で約20分
間インキユベートする。
4.サンプルを1500Gで５〜10分間遠心分離し、PEG溶液を
デカンテーシヨンにより除く。
5.サンプルを、SOS150μｌ中に再分散し、室温で30分間
インキユベートする。
6.滅菌した１モルのソルビトール溶液850μｌを加え、
以下に記載した様に少量のサンプルをとり平板培養す
る。
Ｄ スフエロプラストの再生 1.再生用寒天培地の組成 a.寒天−ソルビトール培地;9gのバクト寒天、54.6gのソ
ルビトール、240mlの水、高温滅菌する。
b.グルコース10倍培地;20gのデキストローズ、100mlの
水、高温滅菌する。
c.SC10倍培地;6.75gのアミノ酸を含まない酵母窒素基
材、100mlの水、高温滅菌する（所望のアミノ酸又は各
酸を200μg/mlの濃度まで高温滅菌前又はその後に加え
る） d.30mlのグルコース10倍培地及び30mlのSC10倍培地を30
0mlの溶解した寒天−ソルビトール溶液に加える。0.2mg
/mlのビオチン液0.6ml、及び所望のアミノ酸又は核酸を
20μg/mlの濃度まで加える。溶解した再生用寒天培地を
55-60℃に保つ。
2.形質転換したサンプルの平板培養 形質転換サンプルが用意できる少なくとも30分前に、
プレートあたり10mlの再生用寒天培地よりなる基底部寒
天層を注ぐ。試験管に再生用寒天培地10mlを、形質転換
サンプルがSOS中に入れてある間に、45-50℃のバス上
で、分散させる。再生用寒天培地の入つた試験管に適当
量の形質転換サンプルを加え、プレート内の基底部寒天
層上に注ぐ。45-50℃に保つた溶融状態の再生用寒天培
地10mlにそれぞれのサンプルを適当量加え、再生用寒天
培地よりなる固まつた10mlの基底部寒天層上にそれぞれ
を注ぐ。
3.スフエロプラスト調製品の品質の決定 １サンプル当り10μｌをとり、1Mのソルビトール990
μｌを加えて100倍に希釈する。100倍希釈液を10μｌと
り、990μｌ量の1Mのソルビトールを再び加えて更に100
倍希釈する。YPD培地上に上記二つの希釈液100μｌを、
調製品中にスフエロプラスト化されずに残存している完
全細胞の濃度を測定するため、YPD寒天培地上に塗布す
る。40μg/mlヒスチジンを加えた再生寒天10mlに、全再
生可能なスフエロプラストを測定するため各希釈液を10
0μｌ加える。形質転換実験のための良好な値として
は、ml当り１−３×107の全再生可能なスフエロプラス
トとml当り約１×103の完全細胞である。
4.平板培地を30℃で３−５日間培養する。
実施例XIIIピキア パストリスHIS4遺伝子の分離 A.菌株 使用した菌株は次の通りである。
（ａ）ピキア パストリス NRRL Y-11430株 （ｂ）ピキア パストリス NRRL Y-15851（GS115-his
4） （ｃ）エス・セレビシエ5799-4D株 （his4-260 his4-39;NRRLY-15859）、及び （ｄ）大腸菌848株（F- met thi gal T1 Rφ80S hsd R-
hsd M+） B.プラスミド pYA2は、pBR325のPstＩ部位に挿入された9.3Kb PstＩ
断片上にエス・セレビシエのHIS4遺伝子より構成されて
居り、それはエス・セレビシエHIS4遺伝子断片の給源で
あり、大腸菌宿主に移入してありNRRL B-15874として公
衆が入手可能である。
YEp13はアメリカンタイプカルチヤーコレクシヨンか
ら入手可能であり、寄託番号はATCC37115が割り当てら
れている。
C.培地 ピキア パストリスはYPD（富化）培地又はIMG（最
少）培地で成育させた。IMG、最少培地は、次のものよ
り構成されている。
1.IM1塩類、最終濃度で36.7ミリモルのKH2PO4、22.7ミ
リモルの(NH4)2SO4、2.0ミリモルのMgSO4・7H2O、6.7ミ
リモルのKCl、0.7ミリモルのCaCl2・2H2O;10倍の貯蔵液
として調製し、高温滅菌したもの。
2.微量塩類、最終濃度で0.2マイクロモルのCuSO4・5H
2O、1.25マイクロモルのKI、4.5マイクロモルのMnSO4・
H2O、2.0マイクロモルのNaMoO4・2H2O、0.75マイクロモ
ルのH3BO3、17.5マイクロモルのZnSO4・7H2O、44.5マイ
クロモルのFeCl3・6H2O400倍貯蔵液として調製し、濾液
を滅菌した。
3.0.4μg/mlのビオチン及び 4.2％デキストローズ 大腸菌はLB培地又は2B培地100μl/mlのトリプトフア
ン及び0.2％カザミノ酸を追加添加したもので培養し
た。
D.DNA分離 1.酵素DNAの大規模調製 ピキア パストリス及びエス・セレビシエのDNA調製
は、酵母細胞をA600が１−２となるまで最少培地100ml
を成育させ、次いで2,000Gで５分間遠心分離して細胞を
回収することにより行なつた。当該細胞を水、SED、１
モルのソルビトール中でそれぞれ１度洗浄し、次いで1M
のソルビトールに分散した細胞を5mlの0.1モルのトリス
−塩酸（pH＝7.0）に分散した。細胞をチモラーゼ60,00
0（マイルズ ラボラトリーズ社製）の4mg/ml溶液50-10
0μｌと混合して、細胞壁を消化するために１時間30℃
でインキユベートした。スフエロプラスト調製品を1,00
0Gで5-10分間遠心分離し、溶菌用緩衝液（0.1％SDS、10
ミリモルのトリス−塩酸（pH7.4）、５ミリモルのEDTA
及び50ミリモルのNaCl）に懸濁した。プロテナーゼＫ
（ベーリンガー マンハイム社製）及びRNナーゼＡ（シ
グマ社製）それぞれ100μl/mlの割合で加え、混合物を3
7℃30分間インキユベートした。DNAは、イソアミルアル
コールを含有するクロロホルム（24:1、v/v）を当該調
製物と等量しずかに混合し、蛋白を除き、各相を12,000
Gで20分間遠心分離することにより分離した。上の
（水）相を新しい試験管に移し、当量のフエノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（25:24:1、v/v/v）
混合液で抽出した。各相を前と同様分離し、最上相を２
−３倍量の冷100％エタノールを含む試験管に入れた。
サンプルをしずかに混合し、DNAをプラスチツク製棒の
上にまきつけて回収した。当該DNAをただちに1mlのTE緩
衝液に溶解し、100倍量のTE緩衝液で40℃で１晩透析し
た。
2.小規模酵母DNA調製 A600で１−５でなるまで5mlの酵母の培養物を最少培
地で成長させ、次いで2,000Gで５分間遠心分離し、収集
した。細胞を1mlのSEDに懸濁し、1.5mlの極小遠心管に
移し、１モルのソルビトール中で１度洗い、１モルのソ
ルビトールに分散させた細胞を0.1モルトリス塩酸（pH
7.4）0.5ml中に懸濁した。チモリアーゼ60,000（マイル
ラボラトリーズ社;4mg/mlの溶液を10μｌ）各サンプ
ルに加え、当該細胞を30℃で、30-60分間インキユベー
トした。細胞は次いで１分間遠心分離し、溶菌用緩衝液
中に懸濁し、65-70℃でインキユベートした。15分後に
サンプルを５モルの酢酸カリウム100μｌと混合し、氷
浴中に15分間保持し、５分間遠心分離した。上澄液を10
0％のエタノール1mlを含む新しい極小遠心管中へデカン
テーシヨンし、混合後ただちに10秒間遠心分離した。最
終的にペレツトを10-15分間風乾し、５μｌのTE緩衝液
に溶かした。
3.大規模大腸菌DNAの分離 大規模（0.5-1）のプラスミド調製用の大腸菌の培
養物は、上述の如く補足され、かつ適当な抗生物質を含
む2B培地中で37℃で振とう培養により成育させた。pBR3
22由来のプラスミドを含む細胞の場合には、A550で約0.
7まで培養し、その時点で100μg/mlとなるように充分量
のクロラムフエニコールを加え、細胞をおゝよそ15時間
後に収集した。pBR325由来のプラスミドを含む菌株は、
補足された2Bの培地中に、当初のA550が約0.01-0.05と
なるよう移植し、収集前20-24時間37℃で振とうインキ
ユベートした。プラスミドをビルンボイム（Birnboim）
及びドーリー（Doly）のアルカリ溶菌法（1979年）によ
り分離した。
4.小規模大腸菌DNA調製 少量の迅速プラスミド分離のために、抗生物質を含
み、補充した2B培地中の2mlの培養物を37℃で振とう培
養し、1.5mlの極小遠心管中で遠心分離により収集し
た。プラスミドはビルンボイム及びドーリーのアルカリ
溶菌法（1979年）により分離した。
E.DNAの制限（酵素）及び断片の分離 制限酵素はニユー・イングランド バイオラボズ及び
ベセスダ（Bethesda）リサーチ ラボラトリーズから入
手し消化は常套手段により行なつた。制限（酵素）の地
図化は、挿入DNAを有するか又は有しないプラスミドの
並行消化物との比較により実施した。制限断片はアガロ
ーズゲルから透析管材料でバツクアツプされたワツトマ
ン3MM紙片への電気溶出により純化した。断片は、紙及
び管材料から0.1モルのNaCl、50ミリモルのトリス−塩
酸（pH8.0）と１ミリモルのEDTAを含む溶液0.1ないし0.
2mlを用い、３〜４回洗浄し、回収した。最後に、当該
断片をフエノール／ クロロホルム／イソアミルアルコ
ールで抽出し、エタノールで沈澱させ、少量のTE緩衝液
に再溶解した。
F.大腸菌内でのピー パストリスのライブラリー構築 ピキア パストリスDAN-YEp13ライブラリー構築のた
めに、50μｇのYEp13をBamHIで完全に消化し、仔牛の腸
アルカリンフオスフアターゼで処理し、DNAから末端の
５′ホスフエートを除去した。ピキア パストリスNRRL
Y-11430からのDNA100μｇを、全量で1mlとし、10単位
のSau3AIを用いて、37℃で５分間インキユベートするこ
とにより一部消化を行なつた。５ないし20kbpの断片を5
-20％の蔗糖濃度勾配遠心法を用いて大きさにより分離
した。当該ベクターの１μｇと２μｇのピキア Sau3AI
断片とを、総容量200μｌ中でT4DNAリガーゼ（ベセスダ
リサーチ ラボラトリーズ）の20単位と混合し、４℃
で１晩インキユベートした。当該リゲートしたDNAで大
腸菌を、同848菌細胞液2mlに全リゲーシヨン反応混液を
加え、０℃で15分間インキユベートすることにより形質
転換した。混合物を５分間で37℃までに加温し、その時
間経過後LB培地40mlを加え、37℃のインキユベーシヨン
を更に１時間つづけた。次いでアンピシリンを加え、全
濃度で100μg/mlとし、インキユベーシヨンを再び１時
間つづけた。最後に、細胞を3,000Gで10分間遠心分離
し、新しいLB培地1ml中に再び懸濁させ、100μg/mlのア
ンピシリンを含む10個のLB寒天平板培地上に等量づつ広
げた。結果として約50,000コロニーが発生したが、それ
が平板培地からかき取り、細胞の１部分を、当初のA550
が約0.1となるまで500mlの補充した2B培地に接種した。
培養物を成育させ、プラスミドを上述の方法により抽出
した。ライブラリー用としてプールしたコロニーの中
で、100試験したところ96がテトラサイクリン感受性
で、10試験したところ、７つが挿入DNAを有するプラス
ミドを含有していた。
ピキア パストリスDNA-pYJBΔClAライブラリー構築の
ために、50μｇのpYJBΔClaをClaＩで完全に消化し、仔
牛の腸アルカリンフオスフアターゼで処理し、DNAから
末端の５′ホスフエートを除去した。ピキア パストリス
NRRL Y-15851からのDNA100μｇを、全量で1mlとし、20
単位のTaqＩを用いて、65℃で５分間インキユベートす
ることにより一部消化を行なつた。５ないし10Kbpの断
片を0.5％アガロースゲルから電気溶出により（本実施
例、Ｅ項参照）大きさにより分離した。当該ベクターの
１μｇと２μｇのピキア TaqＩ断片とを、総容量200μ
ｌ中でT4DNAリガーゼ（ベセスダ リサーチ ラボラト
リーズ）の20単位と混合し、４℃で１晩インキユベート
した。当該リゲートしたDNAで大腸菌を、同848菌細胞液
2mlに完全リゲーシヨン反応混液を加え、０℃で15分間
インキユベートすることにより形質転換した。混合物を
５分間で37℃まで加温し、その時間経過後LB培地40mlを
加え、37℃のインキユベーシヨンを更に１時間つづけ
た。次いでアンピシリンを加え、全濃度で100μg/mlと
し、インキユベーシヨンを再び１時間つづけた。最後
に、細胞を3,000Gで10分間遠心分離し、新しいLB培地1m
l中に再び懸濁させ、100μg/mlのアンピシリンを含む10
個のLB寒天平板培地上に等量づつ広ろげた。結果として
約10,000コロニーが発生したが、それを平板培地からか
き取り、細胞の１部分を、当初のA550が約0.1となるま
で500mlの補充した2B培地に植えた。培養物を成育さ
せ、プラスミドを上述の方法により抽出した。
G.サザンハイブリダイゼーシヨン ハイブリダイゼーシヨンはサザンの方法（1975年）に
より実施した。大きい、又はスーパーコイル型DNA分子
のニトロセルローズへの移転には、アルカリ変性に先立
つて、アガロースゲルを10分間0.25モルのHCl中に浸漬
することによりDNAをまず一部加水分解した。エス・セ
レビシエのHIS4遺伝子由来の標識した断片の、ピキア
パストリスDNAへのハイブリダイゼーシヨンは50％のホ
ルムアミド、６倍量のSSC、５倍のデンハルト氏液、0.1
％SDS、１ミリモルのEDTA、100μg/mlの変性したニシン
の精子DNAの存在下で42℃で行なつた。エス・セレビシ
エHIS4遺伝子から標識された断片のピキア パストリス
DNAのハイブリダイゼーシヨンのためのハイブリダイゼ
ーシヨン後の洗浄は、２倍のSSC、１ミリモルのEDTA、
0.1％のSDS及び1.0％のビロリン酸ソーダ中で55℃で行
なつた。
H.32p−標識 ニツク翻訳はリグビイ（Rigby）らの方法（1977年）
で実施した。
I.酵母形質転換 エス・セレビシエの形質転換はヒンネン（Hinnen）ら
の方法（1978年）のスフエロプラスト世代法により実施
した。
ピキア パストリスの形質転換は上述した手順に順じ
実施した。
J.自律複製配列に関するピキア パストリス形質転換体
の解析 ピキア ARS含有プラスミドをピキア パストリス細
胞中での自律要素として保持されうる能力について次の
如き方法で決定した。形質転換体のコロニーを再生寒天
平板培地からとり、SD寒天培地上に塗布し、液体IMG培
地へと移植した。そのSD平板培地を30℃で３日間培養
し、その時点で一つのコロニーを平板培地からつまみと
り、再びSD平板培地上に塗布し、IMG培地を含むフラス
コへ再度植え継いだ。この過程を３回繰返した。この３
回のIMG培養物を30℃でA600で約１−２となるまで振と
うしながら成育させ、次いで遠心分離により収集した。
この酵母培養物からのDNAを上述の方法により抽出し、3
0ボルト、30ミリアンペアで10ないし15時間0.8％アガロ
ースゲルへと電気泳動し、次いでニトロセルロースへと
移転させ、上述の如く32P−標識のpBR322又はpBR325に
ハイブリダイゼーシヨンした。対照として大腸菌から分
離したプラスミド10ngを含むサンプルと形質転換してな
いピキア パストリスNRRL Y-15851（GS115）DNAを１−
２μｇ含むサンプルを実験サンプルと一緒に電気泳動さ
せた。
K.ピキア HIS4遺伝子の単離 ピキアHIS4遺伝子を含むDNA断片をエス・セレビシエh
is4株を相補する彼らの能力を用いピキアDNAライブラリ
ーから単離した。当該ライブラリーは、エス・セレビシ
エ−大腸菌シヤトルベクターYEp13のBamHI部位へと挿入
された野生型ピキアDNAの5-20KbpSau3AIの部分消化断片
より構成されていた。
エス・セレビシエNRRL Y-15859（5799-4D;his4ABC株
の一つ）のスフエロプラストをヒンネン等の方法（1978
年）により作り出し、当該ピキアDNAライブラリーと混
合し、ヒスチジン欠 培地中で再生させた。形質転換により５×107の全再生
可能なスフエロプラストから１×103の原栄養性の酵母
コロニーが得られた。全酵母DNAを20のHis+コロニーか
ら抽出し、大腸菌を形質転換した。17の酵母DNA調製物
がアンピシリン抵抗性コロニーを形成し、いずれのコロ
ニーもYEp13と挿入DNAよりなるプラスミドを含有してい
た。His+形質転換プラスミドがピキアHIS4遺伝子を含有
しているがサプレツサー活性をもつDNA遺伝子を含まな
いことを確認するために、当該プラスミドの制限（酵
素）消化物をエス・セレビシエHIS4遺伝子の大きな部分
を含む、標識されたDNA断片へとハイブリダイゼーシヨ
ンし、低い厳密度で洗浄した。当該his4エス・セレビシ
エ株を相補したプラスミドのいずれもが、当該エス・セ
レビシエHIS4遺伝子とハイブリダイゼーシヨンされた配
列を含有していた。
ピキアARS活性を有するDNA断片を探索するため、ピキ
ア パストリスGS115（NRRL Y-15851）からのDNAをTaq
Ｉで部分消化し、５から10kbp断片を分離しpYJ8ΔClaの
特異的なClaＩ部位にへとクローン化した（第26図参
照）。約10000アンピシリン抵抗性コロニーからプラス
ミドを分離し、GS115へと逆形質転換した。このサブラ
イブラリー形質転換体から40のHis+酵母コロニーを淘汰
用培地に別々に塗布し、独立に淘汰用培地中で生育させ
た。全酵母DNAをこの40の培養物の各々から抽出し、大
腸菌を形質転換した。２つのプラスミド、すなわち、PA
RS1を含むpYA63及びPARS1を含むpYA90とを更に解析する
ために選抜した。尚、この両者のDNA調製物は、アンピ
シリンに対して最も耐性のある大腸菌コロニーを形成さ
せた。また、このプラスミドは、両者とも、ピキア パ
ストリスNRRL Y-15851（GS115）を高頻度で形質転換で
き、自律要素として保持され、それぞれ一つの外来DNA
挿入を含有していた。
実施例XIV 調節領域−lac遺伝子融合体の構築 A.p72（アルコールオキシターゼ）の調節領域の構築 ４キロ塩基対を有するピキア パストリスからのEcoR
I-PvuゲノムDNA断片を含有するpBR322ベクターの一つ、
プラスミドpPG4.0をPstIで切断し、S1ヌクレアーゼで処
理して、開環を起させ、平滑末端を得、アルコールオキ
シダーゼ調節領域及びアルコールオキシダーゼの最初の
15個のアミノ酸に関する遺伝情報を含む1.12kbpのDNA断
片を得るためBamHIで切断した。この1.12kpbDNA断片は
次のヌクレオチド配列を有する。
この1.12kbpを大腸菌−エス・セレビシエシヤトルベ
クターpSEY101［ダグラス等（1984）参照］の（BamHIお
よびSmaＩで開環した）EcoRI/SmaＩBamHIリンカーへと
リゲートして、ハイブリツドプラスミドpTA011（第29図
参照）を得た。尚、ベクターpSEY101は、大腸菌のlaz遺
伝子及び次のヌクレオチド配列を含有している： pTA011の調節領域−lac遺伝子融合体は、配列Ｅに示
したようにβ−ガラクトシダーゼの生産に関しては、位
相を異にしているので、ベクターpTA011は、その特異的
なBamHI部位で開環し、次のSmaリンカー； の挿入により、ハイブリツドベクターpTA012を産出し、 又、当該ベクターは、当該調節領域−lacZ融合体に関し
ては、次のヌクレオチド配列を有し、 それ故に、当該lacZの転写解読枠に関しては、pTA012の
調節領域−lac融合体は、依然として位相を異にしてい
る。当該アルコールオキシダーゼの構造遺伝子に関する
遺伝情報をコード化しているＮ−末端をlacZ遺伝子と共
に、転写解読枠に導入するために、pTA012をEcoRI-Sma
Ｉで処理し、得られたDNA断片を、同様にEcoRI-SmaＩで
処理されたpSEY101へとリゲートして、ハイブリツドベ
クターpTA013を産出した（第30図及び次のヌクレオチド
配列参照）。
このベクターpTA013は、実施例XVで記載した次の研究の
ために、次いでエス・セレビシエの形質転換に使用し
た。
ベクターpTA013は、次いでPstＩ又はPstI-NruＩで開
環し、開環された断片中に含まれる調節領域−lacZ融合
体をシヤトルベクターpTAFH1のHIS遺伝子含有断片（第2
8図参照）、pYJ30（第27図参照）、又はpYA2（第23図参
照）とリゲートすると、それぞれ、プラスミドpSAOH1、
pSAOH5及びpSAOH10が得られた。
B.p76調節領域の構築 調節領域−lac遺伝子融合体は、p7676調節領域を用い
て次のようにして調製した。
1.pPG6.0の全５′部分を使用 1.35キロ塩基対のpPG6.0のEcoRIを、大腸菌−エス・
セレビシエのシヤトルベクターの１つpSEYの特異的なEc
oRI部位にクローン化し、プラスミドpT76U1（第30図ａ
参照）を得た。ベクターpT76U1を、次いでPstI-NruＩで
開環し、より大きなDNA断片をシヤトルベクターpTAFH1
のHIS4遺伝子含有断片（第28図参照）と上述のようにリ
ゲート（ligate）するか、又はシヤトルベクターpBPfI
（第34図参照）のPstI-EcoRI断片のEcoRI切断末端を満
したものでリゲートすることによりpT76H3又はpT76H4が
得られた。
2.5′−pPG6.0のBal31消化物を使用 pPG6.0の1.35キロ塩基対のEcoRI断片を、ピキアDNAの
挿入されたEcoRI部位に隣接した特異的SalＩ部位も有す
る大腸菌−エス・セレビシエのシヤトルベクターの一
つ、pSEY8の特異的EcoRI部位にクローン化して、プラス
ミドpTA01（第31図参照）を得た。このプラスミドpTA01
をSalＩで開環し、Bal31エンドヌクレアーゼで処理する
と種々な長さのポリペプチドp76調節領域の平滑末端を
有する断片を産出した。この平滑末端を有する断片は、
プラスミドpSEY8のEcoRIによる切断の結果生じた残存断
片を含んでいなかつた。得られたDNA断片をpSEY101のEc
oRI-SmaＩのリンカーへとクローン化して、プラスミドp
TAF.85（第32図参照）などを得た。プラスミドpTAF.85
は、第29図に示したpTA011の類似体であつて、p72（ア
ルコールオキシダーゼ）調節領域の代りに、p76調節領
域を有していた。 次いで、ベクターpTA013からプラス
ミドpTAFH.85を得たのと同様の方法で、ベクターpTAF.8
5を処理して、pT76H1及びpT76H2を得た。すなわち、次
のベクターを開環し、リゲートした。
実施例XVピキア ・パストリス内でのβ−ガラクトシダーゼ産出の
調節 数種類のピキア・パストリスGS115（NRRL Y-15851）
の形質転換体を、種々の条件下で種々な炭素源上で生育
させてβ−ガラクトシダーゼの産出について、研究し
た。形質転換した菌株を0.5μg/mlのビチオン、0.1％の
グルコースを含最少培地中で、定常期になるまで30℃で
生育させた。次いで、細胞を遠心分離により収集して、
ビチオン0.5μg/ml、メタノール0.5含有の最少培地に移
し替えて、30℃で約３〜５世代の間生育させた。メタノ
ール中での最初のこの生育後、ビチオン0.5μg/mlと炭
素源として0.1％グルコース又は0.3％メタノールを含む
新しい最少培地に移し替えた。細胞を、次いで、30℃で
約80時間インキユベートし、定期的にサンプルをとりア
ルコールオキシダーゼとβ−グルコシダーゼの水準を測
定した。約20ないし50時間後、炭素源を除去しその後
は、細胞を炭素源飢餓条件下に保持した。結果は、表−
１にまとめて示す。
アルコールオキシダーゼは上述の染料−パーオキシダ
ーゼ方法（実施例VII参照）で、β−ガラクトシダーゼ
は次の様にして測定した。
β−ガラクトシダーゼ測定 A.必要とした溶液 Ｚ−緩衝液 最終濃度 Na2HPO4・7H2O 16.1 g 0.06 Ｍ NaH2PO4 5.5 g 0.04 Ｍ KCl 0.75 g 0.01 Ｍ MgSO4・7H2O 0.246g 0.001Ｍ ２−メルカプトエタノール 2.7 mL 0.05 Ｍ 全量を11としpHを７とする Ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ONPG） 400mgのONPG（シグマ N-1127）を100mlの蒸留水にと
かし4mg/mlのONPG溶液をつくる。
B.分析手順 1.適当量（OD600で0.1〜0.5の酵母細胞）を培養培地か
らとり、遠心分離し、細胞ペレツトを水で洗う。2.1ml
のＺ緩衝液を細胞ペレツト、30μｌのCHCl3及び30μｌ
の0.1％SDSに加え、かきまぜ（vortex）、５分間インキ
ユベートする。
3.0.2mlのONPG（4mg/ml）を加え反応を開始し、かきま
ぜる。
4.適当な時点（A420＜１となつた時点）で１モルのNa2C
O3溶液0.5mlを加えて反応を停止させる。
5.420nmで上澄液の吸光度を読み取る。
C.β−ガラクトシダーゼ単位の計算： １単位＝30℃、pH7で１分間当り形成されたオルトニト
ロフエノール（ONP）の1nモル 1cmのパスレングス（pathlength）で、1nモルのONPは
420nm（A420）で0.0045の吸光度を持つ。従つて、420nm
での吸光度１で1ml当り222nモル、又は分析した上澄液
の全量が1.7mlであるので378nモル/1.7mlである。従つ
て、表中の単位を次の通り計算する。
表１に表わした結果は、酵母にとつて外来の蛋白、す
なわちβ−グラクトシダーゼがピキア パストリス内
に、培地中のメタノールの存在又は異化代謝制限炭素源
での生育させた後炭素源飢餓にすることにより産生でき
ることを示している。
実施例XVI ウラシル、ロイシン及びヒスチジンを生存のために要
求する菌株、サツカロミセス セレビシエSEY2102を、
プラスミドpTA013及びpT76U1で形質転換した。形質転換
した生物は、生育にウラシルの補充を必要としないコロ
ニーを選抜することにより容易に分離できた。分離した
形質転換体には、それぞれSEY2102-pTA013及びSEY2102-
pT76UIという実験室内の表示を割りあてた。SEY2102-pT
A013は、1984年８月31日付の寄託日で、公衆が入手可能
とするためにイリノイ州ペオリア（Peoria）市の北方地
区研究センター（Northern Regional Research Centr
e）に寄託してある。この菌株には寄託番号NRRLY-15858
が割りあてられている。
20μg/mlのヒスチジン及びロイシン並びに５％グルコ
ースを含む最少培地中で３〜５世代の間30℃で、NRRL Y
-15851及びSEY2102-pT76U1をインキユベートした。次い
で、細胞を移し替えた、つまり遠心分離により収集し、
表IIに示す炭素源３％を含むYP培地中へと移し替え、30
℃で５世代の間生育させた。次いで、細胞を更に50時間
炭素源飢餓条件下でインキユベートし、時々β−グラク
トシターゼ測定のためにサンプリングした。結果は表II
にまとめて示す。
これらの結果は、異化代謝産物制限炭素培地を生育に
用いた場合の炭素源飢餓条件下、又は、形質転換エス・
セレビシエ細胞を比較的非異化代謝産物制限的炭素源、
例えば、グリセロールやガラクトースなどを用いて生育
させることにより、酵母にとつては、外来の蛋白の一
つ、すなわち、β−ガラクシダーゼを、当該p72（アル
コールオキシダーゼ）及びp76調節領域により調節され
たサツカロミセス セレビシエにより産出されることを
示している。
エス・セレビシエ内での、この発明による調節領域の
制御下でのエス・セレビシエ内でのβ−ガラクシダーゼ
の発現水準は、他のエス・セレビシエ調節プロモターを
用いての可能な表現水準に比敵しうるものである。
驚くべきことに、この発明の調節領域は、エス・セレビ
シエ生来のプロモータに比較しエス・セレビシエのプロ
モータと少くなくとも同等に有効か、又はより有効であ
ることが明らかとなつた。
実施例XVII 酵母のゲノムDNAを用いたサザンハイブリダイゼーシヨ
ン ９種類の異なつたメタール同化酵母と１種類のメタノ
ール非同化酵母を最少培地（1M1、実施例Ｉ参照）に0.7
5％メタノール又は1.0％のグルコースをそれぞれ加えた
もので生育させた。全染色体DNAは、実施例VIに記載し
た方法、すなわち、全核酸を分離し、RNアーゼで処理
し、最初フエノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ールで抽出し、次いで、クロロホルム／イソアミルアル
コールで抽出し、最後にエタノールで沈澱をさせた。
沈澱させたDNAを最少量のTE緩衝液に再分散させ、遠
心分離により澄明なDNA溶液を得た。
サザン ハイブリダイゼーシヨンフイルターは実施例
VI、すなわち、様々な酵母種からの全DNAを過剰のHindI
IIで消化し、電気泳動させ、DNAを変性させ、ゲルを中
和し、DNAをニトロセルローズ フイルターへ移し替え
ることにより調整した。この濾過体（フイルター）のプ
レハイブリダイゼーシヨン条件は、42℃で一晩、50％の
脱イオン化したホルムアミド、６倍のSSC、５倍のデン
ハルト氏液、１ミリモルのEDTA、0.1％SDS及び100μg/m
lの変性サケ精子DNAを用い処理することを含んでいた。
同一条件を、最終濃度で106cpm/mlの32P−ニツク−トラ
ンスレーシヨン プローブに用い、ハイブリダイゼーシ
ヨン培地とし使用した。このプローブは、ピー・パスト
リスHIS4遺伝子の2.7kbpのBglIIDNAと同様、pPC8.3、pP
C15.0及びpPC6.7のクローン由来のcDNA挿入（Pst断片）
を含有していた。これらのプローブのいずれも42℃で24
時間続いたハイブリダイゼーシヨンに関しては、同一の
フイルターに別々に使用した。ハイブリダイゼーシヨン
後、フイルターを室温で15分間、65℃で15分間、２倍の
SSC、１ミリモルのEDTA、0.1％のSDS及び0.1％のピロリ
ン酸ソーダを含む溶液中で洗浄した。他の洗浄は低厳密
性下、すなわち、55℃及び42℃で、ハイブリダイゼーシ
ヨンを確認するために実施した。フイルターは72時間に
わたりオートラジオグラフイーにかけた。これらの結果
は、表IIIにまとめて示してある。
表IIIに示した結果は、p76、p72及びp40に類似したポ
リペプチドに関する遺伝子が実質的にすべてのメタノー
ル同化酵母中には存在することを示している。これらの
３種の遺伝子のいずれもが、メタノール非同化酵母、エ
ス・セレビシエからのDNAのハイブリダイゼーシヨン
は、観察されなかつた。このことは、ピー・パストリス
HIS4遺伝子とエス・セレビシエからのHIS4遺伝子との間
の同質性は既に観察されていることからみても、特記す
べきことである。
次に文献を本明細書中では引用した。
ビルボイム及びドーリー（1979年）核酸研究、７巻、15
13-1523頁［Birnboim and Doly（1979）Nucl.Acides Re
s.７、1513-1523］ エム・ジー・ダグラス等（1984年）米国国立教養学会大
会講演集、81巻、3983-3987［M.G.Douglas et al（1984
年）Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.81、3983-3987］ ヒンネン等（1987年）米国国立教養学会大会講演集、75
巻、1929-1933頁［Hinnen et al（1983）Proc.Nat.Aca
d.Sci.,USA 75、1929-1933］ ゼツト・エイ・ジヤノビツツ等（1985年）核酸研究、13
巻、3043-3062頁［Z.A.Janowicz et al（1985）Nucl.Ac
ids Res.13、3043-3062］ エイ・エム・レデボエール等（1985年）核酸研究、13
巻、3063-3082頁［A.M.Ledeboer et al（1985）Nucl.Ac
ides Res.13、3063-3082］ マツクサム及びギルバード（1980年）酵素方法 65巻、
499-560頁［Maxam and Gilbert（1980）in Methods in
Enzymology 65、499-560］ サザン（1975年）分子微生物学誌、98巻、503-517頁［S
outhern（1975）J.Mol.Biol.98、503-517］ サンガー等（1980年）分子微生物学誌、143巻、161-178
頁［Sanger et al（1980）J.Mol.Biol.143、161-178］
【図面の簡単な説明】
第１図は、蛋白p76のゲノムクローン（pPG6.0）とcDNA
クローン（pPC15.0）の間の相互関係を示す。 第２図は、蛋白p72（アルコールオキシダーゼ）のゲノ
ムクローン（pPG4.0）とcDNA（pPC8.3及びpPC8.0）の間
の相互関係を示す。 第３図は、蛋白p40のゲノムクローン（pPG4.8）とcDNA
（pPC6.7）の間の相互関係を示す。 第４図は、クローンpPG6.0由来のこの発明の調節領域の
制限地図を、第５図は、クローンpP4.0由来のこの発明
の調節領域の制限地図を、第６図は、クローンpPG4.8の
この発明の調節領域の制限地図を示す。 第７図は、p76構造遺伝子の３′末端から得られたDNA配
列の制限地図を、 第８図は、p72（アルコールオキシダーゼ）構造遺伝子
の３′末端から得たDNA配列の制限地図を、第９図は、p
40構造遺伝子の３′末端から得たDNA配列の制限地図を
示す。 第10図は、蛋白p76の構造遺伝子とその５′末端の調節
領域の制限地図を、第11図は、蛋白p40の構造遺伝子と
その５′末端の調節領域の制限地図を示す。 第12図は、蛋白p76cDNAの、第13図は、蛋白p40cDNAの、
第14図は、蛋白p40の制限地図をそれぞれ示す。 第15図は、この発明の２つの新規なp76の調節領域−lac
Z構造の制限地図を、第16図は、この発明の２つの新規
なp72（アルコールオキシダーゼ）調節領域−lacZ構造
の制限地図を示す。 第17図は、プラスミドpSAOH1の、第18図は、プラスミド
pSAOH5の、第19図は、プラスミドpSAOH10の、第20図
は、プラスミドpTAFH.85の、第21図は、プラスミドpT76
H1の、第22図は、プラスミドpT76H2の、第22a図は、プ
ラスミドpT76H3の、第22b図は、プラスミドpT76H4の、
第23図は、プラスミドpYA2の、第24図は、プラスミドpY
A4の、第25図は、プラスミドpYJ8の、第26図は、プラス
ミドpYJ8ΔClaの、第27図は、プラスミドpYJ30の、それ
ぞれ制限地図を示す。第28図はプラスミドpTAFH1の制限
地図を提供し、そして当該プラスミドがどのようにして
誘導されたかを示す。 第29図は、プラスミドpTA012の制限地図と、当該プラス
ミドがどのようにして誘導されたかを示す。 第30図は、プラスミドpTA013の、第30a図は、プラスミ
ドpT76U1の制限地図を示す。 第31図は、プラスミドpTA01及び当該プラスミドがどの
ようにして誘導されたかを、第32図はプラスミドpTAF.8
5の制限地図と、当該プラスミドがどのようにして誘導
されたかを、それぞれ示す。 第33図は、プラスミドYEp13の、第34図は、プラスミドp
BPf1の、それぞれ制限地図を示す。 尚、図中制限酵の略号をかつこで囲んで示している切断
個所は、DNA断片の操作に使用した切断部位ではある
が、リゲーシヨンにより当該切断部位を破壊したことを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:88） Ｃ１２Ｒ 1:88） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） 1:84） (72)発明者 スチーブン ブラツドリイ エリス アメリカ合衆国カリフオルニア州ラ ジ ヨラ，モーニング ウエイ 3122 (72)発明者 トーマス レイモンド ジンゲラス アメリカ合衆国カリフオルニア州エンシ ニタス，ジユニパー ヒル ドライブ 1528 (72)発明者 マイクル ミラー ハーポルド アメリカ合衆国カリフオルニア州サン ジエゴ，トウエンテイナインス ストリ ート 1341 (72)発明者 ジユアグ フリデリツク ツシヨツプ アメリカ合衆国カリフオルニア州サン ジエゴ，カーメル ケイプ 102458

Claims (60)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ピキア パストリスNRRL 11430菌株より誘
    導されうるDNA断片で、アルコールオキシダーゼ、ポリ
    ペプチドp76又はポリペプチドp40をコードする遺伝子よ
    り得られる調節領域よりなり、該DNA断片の宿主生物が
    接触している培地中のメタノールに応答性で、メッセン
    ジャーRNAの産生をコードするDNAの５′末端に位置する
    ときメッセンジャーRNAの転写を制御できるものである
    調節領域であり、下記の制限地図ａ〜ｄのいずれか一つ
    によって特徴づけられるDNA断片又は同DNA断片の一部分
    からなりかつ同DNA断片と同一の機能を有するDNA断片：
  2. 【請求項２】当該DNA断片が次のヌクレオチド配列 を有する特許請求の範囲第１項に記載のDNA断片
  3. 【請求項３】当該DNA断片が次のヌクレオチド配列、 を有する特許請求の範囲第１項記載のDNA断片
  4. 【請求項４】該断片が次のヌクレオチド配列、 を有する特許請求の範囲第１項記載のDNA断片
  5. 【請求項５】該調節領域が約72,000ダルトンのアルコー
    ルオキシダーゼの産生の遺伝情報をコードするメッセン
    ジャーRNAの転写を制御するものである特許請求の範囲
    第１項記載のDNA断片
  6. 【請求項６】該調節領域が約76000ダルトンのポリペプ
    チドp76の生産の遺伝情報をコードするメッセンジャーR
    NAの転写を制御するものである特許請求の範囲第１項記
    載のDNA断片
  7. 【請求項７】該断片が次のヌクレオチド配列、 を有する特許請求の範囲第６項記載のDNA断片
  8. 【請求項８】該調節領域が約40,000ダルトンポリペプチ
    ドp40の生産の遺伝情報をコードするメッセンジャーRNA
    の転写を制御するものである特許請求の範囲第１項記載
    のDNA断片
  9. 【請求項９】該アルコールオキシダーゼの産生の遺伝情
    報をコードするDNAの下流に更にDNAの３′配列を含有し
    ている特許請求の範囲第１項記載のDNA断片
  10. 【請求項１０】該ポリペプチドp76の生産の遺伝情報を
    コードするDNAの下流に更にDNAの３′配列を含有してい
    る特許請求の範囲第６項記載のDNA断片
  11. 【請求項１１】該ポリペプチドp40の生産の遺伝情報を
    コードするDNAの下流に更にDNAの３′配列を含有してい
    る特許請求の範囲第８項記載のDNA断片
  12. 【請求項１２】下記の制限地図により示される如く特徴
    づけられた追加の断片を含有する特許請求の範囲第５項
    記載のDNA断片：
  13. 【請求項１３】該断片が更に下記の制限地図により示さ
    れた如く特徴づけられた追加の断片をも含有する特許請
    求の範囲第６項記載のDNA断片：
  14. 【請求項１４】該断片が更に下記の制限地図により示さ
    れた如く特徴づけられた追加の断片をも含有する特許請
    求の範囲第８項記載のDNA断片：
  15. 【請求項１５】該メッセンジャーRNAの産生の遺伝子情
    報をコードするDNAの３′末端に、下記の制限地図によ
    って特徴づけられる群より選ばれた追加の断片を更に含
    有する特許請求の範囲第１項記載のDNA断片：
  16. 【請求項１６】更に外来性のポリペプチドをコードする
    領域を含有し、かつ該調節領域が該ポリペプチドをコー
    ドする領域の５′末端に位置している特許請求の範囲第
    １項記載のDNA断片
  17. 【請求項１７】該外来性ポリペプチドがβ−ガラクトシ
    ダーゼである特許請求の範囲第16項記載のDNA断片
  18. 【請求項１８】調節領域と更に外来性のポリペプチドを
    コードする領域とを含有し、かつ該調節領域が該ポリペ
    プチドをコードする領域の５′末端に位置しているDNA
    断片である該DNA断片が下記の制限地図により特徴づけ
    られた群より選ばれたである特許請求の範囲第17項記載
    のDNA断片：
  19. 【請求項１９】該DNA断片が下記の制限地図により特徴
    づけられた群より選ばれたものである特許請求の範囲第
    18項記載のDNA断片：
  20. 【請求項２０】該ポリペプチド遺伝情報をコードする領
    域により遺伝情報がコードされたメッセンジャーRNAの
    ポリアデニル化、転写及び翻訳の終了を制御することの
    できるDNAの３′配列を更に該ポリペプチド遺伝情報の
    コード領域のDNA下流に有する特許請求の範囲第19項記
    載のDNA断片
  21. 【請求項２１】該DNA断片が細菌性プラスミドDNA、バク
    テリアファージDNA、酵母DNA及び酵母染色体DNAよりな
    る群より誘導された追加DNA配列を更に一又はそれ以上
    含有する特許請求の範囲第16〜20項のいずれか１項に記
    載のDNA断片
  22. 【請求項２２】該染色体DNAが自律複製DNA配列及びマー
    カー遺伝子よりなる特許請求の範囲第21項記載のDNA断
    片
  23. 【請求項２３】第１の調節領域よりなるDNA断片であっ
    て、メッセンジャーRNAの産生についてコードしている
    ポリペプチドの遺伝情報をコードする領域の３′末端に
    位置しているとき、メッセンジャーRNAのポリアデニル
    化、転写及び翻訳の終了を制御でき、当該メッセンジャ
    ーRNAの転写、翻訳は第２の調節領域により制御されて
    居り、かつ該第２の調節領域は、ピキア パストリスNRRL
    11430菌株より誘導されうるDNA断片であって、 該DNA断片の宿主生物が接触している培養培地中のメタ
    ノールの存在に応答性で、該第２の調節領域が、代わり
    に外来性のポリペプチドをコードするメッセンジャーRN
    Aの産生の遺伝情報をコードするDNAの５′末端に位置し
    ているとき、該メッセンジャーRNAの転写及び翻訳を制
    御できるものであり、かつ該第２の調節領域が少なくと
    も下記制限地図のａ〜ｄのいずれか一つにより特徴づけ
    られるDNA断片、又は同DNA断片の一部分よりなり同DNA
    断片と同一の機能を有するDNA断片：
  24. 【請求項２４】該DNA断片が下記のヌクレオチド配列 よりなるものである特許請求の範囲第23項に記載の該DN
    A断片
  25. 【請求項２５】該第１の調節領域が下記の制限地図によ
    り特徴づけられた群より選ばれたものである特許請求の
    範囲第23項記載のDNA断片：
  26. 【請求項２６】該第１の調節領域が下記の制限地図によ
    り特徴づけられた群より選ばれたものである特許請求の
    範囲第23項記載のDNA断片：
  27. 【請求項２７】該第１の調節領域が下記の制限地図によ
    り特徴づけられた特許請求の範囲第23項記載のDNA断
    片：
  28. 【請求項２８】該DNA断片が環状ハイブリッドプラスミ
    ドの形である特許請求の範囲第23項又は第24項に記載の
    DNA断片
  29. 【請求項２９】該DNA断片が閉鎖された環状ハイブリッ
    ドプラスミドの形である特許請求の範囲第28項記載のDN
    A断片
  30. 【請求項３０】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有する非細菌性挿入を有するもの（pPG6.0）であ
    る特許請求の範囲第29項記載のDNA断片：
  31. 【請求項３１】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有する非細菌性挿入を有するもの（pPG4.0）であ
    る特許請求の範囲第29項記載のDNA断片：
  32. 【請求項３２】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有する非細菌性挿入を有するもの（pPG4.8）であ
    る特許請求の範囲第29項記載のDNA断片：
  33. 【請求項３３】該ハイブリッドプラスミドが下記の長さ
    で示される非細菌性挿入を有するもの（pPC15）である
    特許請求の範囲第29項記載のDNA断片：
  34. 【請求項３４】該ハイブリッドプラスミドが下記の長さ
    で示される非細菌性挿入を有するもの（pPC8.3）である
    特許請求の範囲第29項記載のDNA断片：
  35. 【請求項３５】該ハイブリッドプラスミドが下記の長さ
    で示される非細菌性挿入を有するもの（pPC8.0）である
    特許請求の範囲第29項記載のDNA断片：
  36. 【請求項３６】該ハイブリッドプラスミドが下記の長さ
    で示される非細菌性挿入を有するもの（pPC6.7）である
    特許請求の範囲第29項記載のDNA断片：
  37. 【請求項３７】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pSAOH1）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  38. 【請求項３８】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pSAOH5）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  39. 【請求項３９】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pSAOH10）である特許請求の範囲第2
    9項記載のDNA断片：
  40. 【請求項４０】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pTAFH.85）である特許請求の範囲第
    29項記載のDNA断片：
  41. 【請求項４１】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pT76H1）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  42. 【請求項４２】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pT76H2）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  43. 【請求項４３】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pT76H3）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  44. 【請求項４４】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pT76H4）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  45. 【請求項４５】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pTAO13）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  46. 【請求項４６】該ハイブリッドプラスミドが下記の制限
    地図を有するもの（pT76U1）である特許請求の範囲第29
    項記載のDNA断片：
  47. 【請求項４７】形質転換された酵母菌株であって、該形
    質転換された酵母菌株が組換DNA材料の宿主であり、該
    組換DNA材料が （イ）一つのDNA断片と、 （ロ）一つのポリペプチド遺伝情報をコードする領域、 よりなり、かつ該DNA断片はピキア パストリスNRRL 1143
    0菌株より誘導されうるものであって該DNA断片が該DNA
    断片の宿主生物が接触している培養培地中のメタノール
    の存在に応答性で、該調節領域が該ポリペプチドの遺伝
    情報をコードする領域の５′末端に位置しているもので
    あり、該組換DNA材料の宿主である形質転換された酵母
    菌株は当該ポリペプチド遺伝情報をコードする領域によ
    り遺伝情報がコードされたポリペプチドが発現できるも
    のであり、下記の制限地図のａ〜ｄのいづれか一つによ
    って特徴づけられる組換DNA材料又は同組換DNA材料の一
    部分よりなり同組換DNA材料と同一の機能を有する組換D
    NA材料である形質転換酵母菌株：
  48. 【請求項４８】該DNA断片が下記のヌクレオチド配列を を有するものである特許請求の範囲第47項に記載の該形
    質転換された酵母菌株
  49. 【請求項４９】メタノールを炭素及びエネルギー源とし
    て生育できる特許請求の範囲第47項記載の形質転換され
    た酵母菌株
  50. 【請求項５０】カンジダ、クロエケラ（Kloeckera）、
    サッカロミセス、ロドトルラ、ハンセンヌラ、トルロプ
    シス（Torulopsis）及びピキア属から選ばれた特許請求
    の範囲第47項記載の形質転換された酵母菌株
  51. 【請求項５１】該形質転換された酵母菌株がピキア属よ
    り選ばれた特許請求の範囲第50項記載の形質転換された
    酵母菌株
  52. 【請求項５２】該組換DNA材料は第２のDNA断片を更に含
    有して居り、メッセンジャーRNAの産生の遺伝情報をコ
    ードしているポリペプチド遺伝情報指定領域の３′末端
    に位置しているとき、その第２のDNA断片は該メッセン
    ジャーR52（GS115-pSAOH1）である特許請求の範囲第51
    項記載の形質転換された酵母菌株
  53. 【請求項５３】該形質転換された酵母菌株がサッカロミ
    セス属より選ばれた特許請求の範囲第51項記載の形質転
    換された酵母菌株
  54. 【請求項５４】該形質転換された酵母菌株がピキア パス
    トリスNRRL Y-15852（GS115-pSAOH1）である特許請求の
    範囲第51項記載の形質転換された酵母菌株
  55. 【請求項５５】該形質転換された酵母菌株がピキア パス
    トリスNRRL Y-15853（GS115-pSAOH5）である特許請求の
    範囲第51項記載の形質転換された酵母菌株
  56. 【請求項５６】該形質転換された酵母菌株がピキア パス
    トリスNRRL Y-15854（GS115-pSAOH10）である特許請求
    の範囲第51項記載の形質転換された酵母菌株
  57. 【請求項５７】該形質転換された酵母菌株がピキア パス
    トリスNRRL Y-15855（GS115-pTAFH.85）である特許請求
    の範囲第51項記載の形質転換された酵母菌株
  58. 【請求項５８】該形質転換された酵母菌株がピキア パス
    トリスNRRL Y-15856（GS115-pT76H1）である特許請求の
    範囲第51項記載の形質転換された酵母菌株
  59. 【請求項５９】該形質転換された酵母菌株がピキア パス
    トリスNRRL Y-15857（GS115-pT76H2）である特許請求の
    範囲第51項記載の形質転換された酵母菌株
  60. 【請求項６０】該形質転換された酵母菌株がサッカロミ
    セス セレビシエNRRL Y-15858（SEY 2102-pTAO13）であ
    る特許請求の範囲第53項記載の形質転換された酵母菌株
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YU (1) YU46695B (ja)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5741672A (en) * 1984-07-27 1998-04-21 Unilever Patent Holdings B.V. Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4882279A (en) * 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US5032516A (en) * 1985-10-25 1991-07-16 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
US4818700A (en) * 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
IL81817A0 (en) * 1986-03-14 1987-10-20 Phillips Petroleum Co Methanol and glucose responsive yeast regulatory regions
ZA872534B (en) * 1986-05-08 1987-11-25 Phillips Petroleum Co Yeast production of streptokinase
IL82935A0 (en) * 1986-08-12 1987-12-20 Phillips Petroleum Co Secretion of heterologous proteins from yeast
US5002876A (en) * 1986-09-22 1991-03-26 Phillips Petroleum Company Yeast production of human tumor necrosis factor
EP0299108B1 (en) * 1987-07-17 1994-05-18 Rhein Biotech Gesellschaft für biotechnologische Prozesse und Produkte mbH DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses
ATE248925T1 (de) * 1988-01-05 2003-09-15 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur herstellung von proteinen oder proteinhaltigen genprodukten
SE8901264L (sv) * 1988-04-11 1989-10-12 Phillips Petroleum Co Uttryck av laxtillvaexthormon i metylotropisk jaest av slaektet pichia
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
IL89992A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
IL89993A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts
IL89991A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts
IL89989A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts
EP0374282B1 (en) * 1988-12-20 1994-09-14 Rhein Biotech Gesellschaft für biotechnologische Prozesse und Produkte mbH A mutant strain of a methylotrophic organism and a process for the production of a protein in a methylotrophic organism
WO1990009434A1 (en) * 1989-02-13 1990-08-23 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells
GB8924883D0 (en) * 1989-11-03 1989-12-20 Shell Int Research Expression vector and polypeptide synthesis
US5264554A (en) * 1990-01-19 1993-11-23 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Platelet cell adhesion molecule and variants thereof
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
JPH06500470A (ja) * 1990-09-04 1994-01-20 メルク　エンド　カンパニー　インコーポレーテッド メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
ATE220105T1 (de) * 1991-04-01 2002-07-15 Merck & Co Inc Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung
CA2058820C (en) * 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) * 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
US5834262A (en) * 1992-01-06 1998-11-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Oxidation of glycolic acid to glyoxylic acid using a microbial cell transformant as catalyst
DE69303943T2 (de) * 1992-02-28 1997-01-30 Suntory Ltd Neuer Vektor, einen von Methanol und/oder Glyzerin induzierbaren Promotor enthaltend
US5708141A (en) * 1992-05-11 1998-01-13 Corvas International, Inc. Neutrophil inhibitors
KR100342948B1 (ko) * 1993-03-03 2002-11-29 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 메틸로트로픽효모에서글리콜레이트산화효소의제조방법
ES2229216T3 (es) * 1993-03-08 2005-04-16 MERCK & CO., INC. Composiciones de receptores nicotinicos neurales humanos de acetilcolina y procedimientos que emplean las mismas.
AU6415594A (en) * 1993-03-25 1994-10-11 Biosource Genetics Corporation (pichia pastoris) alcohol oxidase (zza1) and (zza2)
WO1994024284A1 (en) 1993-04-20 1994-10-27 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Human n-methyl-d-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor
US6001581A (en) 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US5912122A (en) * 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US6638905B2 (en) * 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
WO1995013299A1 (en) * 1993-11-08 1995-05-18 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US5453161A (en) * 1993-11-12 1995-09-26 Enichem S.P.A. Polyamic acid to polyimide conversion by microwave heating
CA2202351A1 (en) * 1994-10-18 1996-04-25 George Phillip Vlasuk Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
US5866543A (en) * 1995-06-05 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5945275A (en) * 1994-10-18 1999-08-31 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5872098A (en) * 1995-06-05 1999-02-16 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
ES2276396T3 (es) * 1994-10-18 2007-06-16 Dendreon Corporation Proteinas anticoagulantes e inhibidores de la serina proteasa extraidos de nematodos.
US5863894A (en) * 1995-06-05 1999-01-26 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5866542A (en) * 1994-10-18 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US6720140B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
US6143557A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Life Technologies, Inc. Recombination cloning using engineered recombination sites
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
CA2237120C (en) * 1995-11-09 2005-03-01 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
EP1659173A1 (en) 1997-10-01 2006-05-24 DSMIP Assets B.V. Protein production process
US7351578B2 (en) * 1999-12-10 2008-04-01 Invitrogen Corp. Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
CN101125873A (zh) * 1997-10-24 2008-02-20 茵维特罗根公司 利用具重组位点的核酸进行重组克隆
CA2307016A1 (en) * 1997-10-24 1999-05-06 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
EP1094081B1 (en) * 1998-07-06 2005-09-21 Tosoh Corporation Fused protein with direct bond of il-6-receptor to il-6
WO2000012687A1 (en) * 1998-08-28 2000-03-09 Invitrogen Corporation System for the rapid manipulation of nucleic acid sequences
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
US6720174B1 (en) 1999-01-28 2004-04-13 Novozymes A/S Phytases
NZ525134A (en) 1999-03-02 2004-09-24 Invitrogen Corp Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
US6440414B1 (en) * 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
US6261820B1 (en) * 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
EP2345721A1 (en) 1999-11-12 2011-07-20 Fibrogen, Inc. Recombinant gelatin in vaccines
EP2210948A3 (en) 1999-12-10 2010-10-06 Life Technologies Corporation Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
US7033776B2 (en) * 1999-12-17 2006-04-25 Amgen Inc. Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases
WO2001077351A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vectors and methods for dual protein expression in pichia pastoris and escherichia coli
US7244560B2 (en) * 2000-05-21 2007-07-17 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US7625756B2 (en) * 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7449308B2 (en) * 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
NZ523476A (en) 2000-06-28 2004-04-30 Glycofi Inc Methods for humanizing glycosylation of recombinant glycoproteins expressed in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
ATE414778T1 (de) 2000-06-30 2008-12-15 Vib Vzw Modifikation der proteinglycosylierung in pichia pastoris
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
JP2005514001A (ja) 2001-04-05 2005-05-19 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ネブラスカ 酵母中での異種遺伝子発現のためのアルコールオキシダーゼ１調節ヌクレオチド配列
CA2448505A1 (en) * 2001-05-21 2002-11-28 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in isolation of nucleic acid molecules
US6645739B2 (en) 2001-07-26 2003-11-11 Phoenix Pharmacologies, Inc. Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same
CA2482485A1 (en) * 2002-04-15 2003-10-30 Merck & Co., Inc. Matrix analysis of gene expression in cells (magec)
US7252933B2 (en) 2002-06-26 2007-08-07 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast
US20040204953A1 (en) * 2002-07-17 2004-10-14 Lincoln Muir Subscription based systems, methods and components for providing genomic and proteomic products and services
DE60335602D1 (de) * 2002-12-18 2011-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität
ATE387494T1 (de) * 2002-12-20 2008-03-15 Hoffmann La Roche Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
US7354734B2 (en) * 2003-08-25 2008-04-08 Funzyme Biotechnologies Sa Fungal proteins and nucleic acids encoding same
US8293503B2 (en) 2003-10-03 2012-10-23 Promega Corporation Vectors for directional cloning
ATE469984T1 (de) 2003-12-01 2010-06-15 Life Technologies Corp Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon
JP4411192B2 (ja) * 2003-12-05 2010-02-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 組換えで発現されるカルボキシペプチダーゼｂおよびその精製
BRPI0616054B8 (pt) * 2005-09-14 2021-05-25 Sanofi Aventis Deutschland processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor
AT504588B1 (de) * 2006-11-16 2008-08-15 Univ Graz Tech Nukleinsäure-promotor
BRPI0910286A2 (pt) 2008-03-03 2015-09-29 Abbott Lab métodos para transformação de levedura
US8753853B2 (en) 2008-12-12 2014-06-17 E I Du Pont De Nemours And Company Process for making linear dicarboxylic acids from renewable resources
EP2258855A1 (en) 2009-05-28 2010-12-08 Universität für Bodenkultur Wien Expression sequences
WO2011077359A2 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
BR112013029902A2 (pt) 2011-05-20 2016-12-20 Alderbio Holdings Llc produção de alta pureza de proteínas de múltiplas subunidades, tal como anticorpos, em micróbios transformados, tal como pichia pastoris
JP6138788B2 (ja) 2011-08-19 2017-05-31 アルダーバイオ・ホールディングズ・エルエルシー 形質転換した微生物、例えばピキア・パストリス中で抗体などのマルチサブユニットタンパク質を高濃度かつ高純度で生産するための多コピー法
EP3508494B1 (en) 2011-10-07 2022-02-23 Lonza Ltd Regulatable promoter
PL2970994T3 (pl) 2013-03-15 2020-03-31 Lonza Ltd Promotor konstytutywny
US9150870B2 (en) 2013-03-15 2015-10-06 Lonza Ltd. Constitutive promoter
US9518082B2 (en) 2013-03-15 2016-12-13 Alderbio Holdings Llc Antibody purification and purity monitoring
EP3597664A3 (en) 2013-03-15 2020-03-11 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells
ES2891752T3 (es) 2013-03-21 2022-01-31 Evonik Operations Gmbh Purificación de proteínas de triple hélice
AU2014260123B2 (en) 2013-04-30 2018-10-11 Donald Danforth Plant Science Center Antifungal plant proteins, peptides, and methods of use
AU2014317807B2 (en) 2013-09-09 2019-02-21 Evonik Operations Gmbh Modified bacterial collagen-like proteins
WO2016120764A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Aspergillus oryzae prolyl endopeptidases and use thereof in degradation of polypeptides

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5877896A (ja) * 1981-08-25 1983-05-11 ブリティッシュ　バイオテック　ファーマシューティカルス　リミテッド 酵母の発現ベクタ−及びそれを利用したポリペプチドの生産方法
JPS6192569A (ja) * 1984-07-27 1986-05-10 ユニリ−バ−　ナ−ムロ−ゼ　ベンノ−トシヤ−プ オキシドリダクタ−ゼの製造法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
ES522556A0 (es) * 1982-05-19 1984-03-01 Gist Brocades Nv Procedimiento de obtencion de nuevas cepas de la levadura kluyveromyces.
EP0118551A1 (en) * 1982-09-15 1984-09-19 Collaborative Research Inc. Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4885242A (en) * 1984-10-30 1989-12-05 Phillips Petroleum Company Genes from pichia histidine pathway and uses thereof
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5877896A (ja) * 1981-08-25 1983-05-11 ブリティッシュ　バイオテック　ファーマシューティカルス　リミテッド 酵母の発現ベクタ−及びそれを利用したポリペプチドの生産方法
JPS6192569A (ja) * 1984-07-27 1986-05-10 ユニリ−バ−　ナ−ムロ−ゼ　ベンノ−トシヤ−プ オキシドリダクタ−ゼの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0183071B1 (en) 1992-12-09
IE930804L (en) 1986-04-30
EP0183071A2 (en) 1986-06-04
DE3586889D1 (de) 1993-01-21
DK496385A (da) 1986-05-01
PT81399B (pt) 1987-11-11
GR852611B (ja) 1986-03-04
NO854312L (no) 1986-05-02
JP2552807B2 (ja) 1996-11-13
JP2552808B2 (ja) 1996-11-13
ES8609458A1 (es) 1986-09-01
AR242988A1 (es) 1993-06-30
FI94427B (fi) 1995-05-31
NO178076B (no) 1995-10-09
FI854142L (fi) 1986-05-01
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NO178076C (no) 1996-01-17
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YU46695B (sh) 1994-04-05
DE3586889T2 (de) 1993-04-15
US4855231A (en) 1989-08-08
AU4875285A (en) 1986-06-12
DD254211A5 (de) 1988-02-17
JPH06233686A (ja) 1994-08-23
EP0483115A2 (en) 1992-04-29
HUT38678A (en) 1986-06-30
DK496385D0 (da) 1985-10-29
EP0183071A3 (en) 1987-09-23
ES548307A0 (es) 1986-09-01
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YU169585A (en) 1991-04-30
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IL76765A (en) 1991-06-30
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PL256012A1 (en) 1986-09-23
NZ213842A (en) 1991-11-26
HU205627B (en) 1992-05-28
ATE83263T1 (de) 1992-12-15
JPS61173781A (ja) 1986-08-05
PT81399A (en) 1985-11-01
CA1340733C (en) 1999-09-14
KR930001117B1 (ko) 1993-02-18
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