FI94427C - Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa - Google Patents

Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa Download PDF

Info

Publication number
FI94427C
FI94427C FI854142A FI854142A FI94427C FI 94427 C FI94427 C FI 94427C FI 854142 A FI854142 A FI 854142A FI 854142 A FI854142 A FI 854142A FI 94427 C FI94427 C FI 94427C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dna
yeast
plasmid
gene
cells
Prior art date
Application number
FI854142A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI854142L (fi
FI94427B (fi
FI854142A0 (fi
Inventor
Michael Miller Harpold
Steven Bradley Ellis
David Womack Stroman
Paul Frederic Brust
Thomas Raymond Gingeras
Juerg Friedrich Tschopp
Original Assignee
Res Corp Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/666,391 external-priority patent/US4808537A/en
Application filed by Res Corp Technologies Inc filed Critical Res Corp Technologies Inc
Publication of FI854142A0 publication Critical patent/FI854142A0/fi
Publication of FI854142L publication Critical patent/FI854142L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI94427B publication Critical patent/FI94427B/fi
Publication of FI94427C publication Critical patent/FI94427C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

1 , 5442? Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-tekniikan alaan. Eräässä piirteessään tämä keksintö kohdistuu DNA-kappaleisiin, jotka säätelevät DNA:n kopioitumista lähetti-RNA:ksi, sekä lähetti-RNA:n proteiiniksi luennan käynnistymistä sekä päättymistä.
Eräässä toisessa piirteessään tämä keksintö kohdistuu ilmentäviin vektoreihin, jotka käsittävät edellä kuvattuja DNA-kappa-leita. Edelleen, eräässä muussa piirteessään tämä keksintö kohdistuu uusiin mikro-organismeihin, jotka on muunnettu edellä kuvatuilla ilmentävillä vektoreilla. Edelleen, eräässä muussa piirteessään tämä keksintö kohdistuu polypeptidien tuottamiseen.
Viime vuosina tapahtuneen yhdistelmä-DNA-tekniikan kehittymisen myötä hyvin erilaisten, hyödyllisten polypeptidien hallittu tuottaminen mikro-organismien avulla on tullut mahdolliseksi.
Monia eukarioottisia polypeptidejä, kuten esimerkiksi ihmisen kasvuhormonia, leukosyytti-interferoneita, ihmisen insuliinia ja ihmisen proinsuliinia on jo tuotettu eri mikro-organismien avulla. Jo käytettävissä olevien tekniikoiden jatkuvan soveltamisen odotetaan tulevaisuudessa mahdollistavan lukuisten muiden hyödyllisten polypeptidituotteiden tuottamisen mikro-organismien avulla.
• • ·
Yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla käytetyt perustekniikat ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Jotta isäntäorganismi voisi olla käyttökelpoinen yhdistelmä-DNA-tekniikan käytännön sovellutuksissa, niin on toivottavaa, että käytettävissä ovat seuraavat elementit : • · • l * (1) geeni, joka koodaa yhtä tai useampaa toivottua polypeptidiä, ja jossa on isäntämikro-organismissa ilmentymisen edellyttämät, tarvittavat säätelyketjut, (2) vektori, tavallisesti plasmidi, johon tämä geeni voidaan istuttaa. Tämä vektori huolehtii geenin siirtymisestä solun 2 . 94427 sisään sekä DNA-ketjujen säilymisestä solussa ja edellä mainitun geenin hyvästä ilmentymisestä/ ja (3) sopiva isäntämikro-organismi, johon tätä toivottua geeniä kantava vektori voidaan siirtää, ja jossa isäntämikro-organismis-sa on samoin välttämättömät solutoiminnot tähän istutettuun geeniin koodatun informaation ilmentymisen mahdollistamiseksi, jotka elementit eivät kuitenkaan rajoitu edellä mainittuihin.
Yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytetty peruselementti on plasmidi, joka on kromosomien ulkopuolista, kaksoisjuosteista DNA:ta, jota esiintyy joissakin mikro-organismeissa. Mikäli plasmideja esiintyy luonnostaan mikro-organismissa, niin ne esiintyvät tavallisesti solussa useina kopioina. Luonnostaan esiintyvien plasmi-dien lisäksi lukuisia keinotekoisia plasmideja, eli hybridivekto-reita, on valmistettu. Plasmidi-DNAthan koodattu tieto sisältää informaatiota, joka on välttämätöntä plasmidin lisääntymiseen ty-tärsoluissa, eli autonomisen replikaatioketjun tai replikaation alkamiskohdan. Plasmidi-DNAihan koodattuun informaatioon täytyy myös sisältyä valikoinnin mahdollistava, yksi tai useampi feno-tyypin tunnusomainen piirre. Valikoinnin mahdollistavan, feno-tyypin tunnusomaisen piirteen avulla mielenkiinnon kohteena olevan plasmidin sisältävän isäntäsolun kloonit voidaan tunnistaa ja valikoida kasvattamalla soluja valikoivalla, tietynlaisten solujen kasvua edistävällä alustalla.
• · t
Plasmidien hyödyllisyys perustuu siihen tosiseikkaan, että niitä voidaan pilkkoa spesifisesti yhdellä tai useammalla restriktio-endonukleaasilla, eli restriktioentsyymillä, joista kukin tunnistaa yhden ainoan, tietyn kohdan plasmidi-DNA:ssa. Tämän jäl-keen tähän plasmidiin voidaan istuttaa homologisia geenejä, » · -* * heterologisia geenejä, eli geenejä, jotka on saatu isännästä poikkeavista organismeista, tai geenikappaleita liittämällä pilkottu plasmidi ja toivottu geneettinen materiaali päistään yhteen, joko pilkkomiskohdassa, tai pilkkomiskohdan viereen muodostetuista päistään. Tuloksena olevaa DNA-materiaalia voidaan nimittää hybridivektoriksi.
3 . 94427 DNA:n yhdistäminen toteutetaan isäntänä toimivan mikro-organismin ulkopuolella. Tuloksena oleva hybridivektori voidaan istuttaa isäntänä toimivaan mikro-organismiin menetelmällä, joka tunnetaan nimellä muuntaminen (transformaatio). Hybridi-vektoria voidaan saada suuria määriä kasvattamalla muunnettua mikro-organismia. Kun tämä geeni on istutettu asianmukaisesti plasmidin niiden osien suhteen, jotka osat hallitsevat koodaavan DNA-viestin kopioitumista ja luentaa (transkriptio ja translaatio), niin tuloksena olevaa hybridivektoria voidaan käyttää istutetun geenin koodaaman polypeptidiketjun tuotannon ohjaamiseen. Tällä tavalla tapahtuvaa polypeptidin tuotantoa kutsutaan geenin ilmentymiseksi (ekspressio).
Geenin ilmentyminen käynnistyy DNA-alueessa, joka tunnetaan promoottorialueena. Ilmentymisen kopiointivaiheessa DNA avautuu kierteisyydestään, paljastuu, ja toimii mallina lähetti-RNA:n synteesissä. RNA-polymeraasi sitoutuu tähän promoottorialueeseen ja liikkuu avautunutta DNA-ketjua pitkin ketjun 3'-päästä sen 5'-päätä kohden, jolloin koodaavan juosteen sisältämä informaatio kopioituu lähetti-RNA:ksi (m-RNA), m-RNA:n 5'-päästä sen 3'-päätä kohden. Tämä lähetti-RNA sitoutuu puolestaan riboso-meihin, joissa mRNA luetaan polypeptidiketjuksi. Kukin aminohappo on koodattu nukleotidien triplettiin eli kodoniin, jota voidaan kutsua rakenteelliseksi geeniksi, eli siksi osaksi geeniä, -j joka osa koodaa ilmentyvän tuotteen aminohappoketjua. Koska kunkin aminohapon tuotanto on kolmen nukleotidin koodaama, niin on mahdollista, että tämä nukleotidiketju "luetaan" kolmella eri tavalla. Toivotuksi polypeptidituotteeksi koodautuvaa spesifistä lukukehystä kutsutaan asianmukaiseksi lukukehykseksi.
„* Sen jälkeen, kun RNA-polymeraasi on sitoutunut promoottoriin, se kopioi ensin mRNA:n 5'-johtoalueen, sitten luennan käynnistävän kodonin eli aloituskodonin, ja tämän jälkeen itse rakenteellisen geenin nukleotidikodonit. Toivotun geenituotteen saamiseksi on välttämätöntä, että käynnistävä kodoni tai aloituskodoni käynnistää asianmukaisesti ribosomien avulla tapahtuvan lähetti- 4 . 94427 RNA:n luennan asianmukaisessa lukukehyksessä. Lopuksi, rakenteellisen geenin päässä kopioituvat pysäytyskodonit, jotka saavat aikaan sen, etteivät ribosomit lue muita mRNA-ketjuja peptidiksi, vaikka muita mRNA-ketjuja olisikin muodostunut RNA-polymeraasin ja DNA-mallin yhteisvaikutuksesta. Näin ollen pysäytyskodonit määrittävät luennan päättymisen, ja täten ne pysäyttävät muiden aminohappojen liittymisen polypeptidituotteeseen. Tämä polypeptidituote voidaan saada hajottamalla isäntäsolu, ja ottamalla tuote talteen puhdistamalla se sopivalla tavalla muista mik-robiperäisistä proteiineista, tai joissakin tapauksissa, puhdistamalla tämä tuote fermentointialustasta, jossa isäntäsoluja on kasvatettu ja johon tämä polypeptidituote on erittynyt.
Käytännössä yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla voidaan saada aikaan mikro-organismeja, jotka kykenevät ilmentämään täysin hete-rologisia polypeptidejä, eli polypeptidejä, joita ei tavallisesti esiinny eikä muodostu tässä tietyssä mikro-organismissa - niin kutsuttu suora ilmentyminen. Vaihtoehtoisesti mikro-organismissa voi ilmentyä fuusioproteiini, jossa tällöin heterologinen poly-peptidi on sulautunut yhteen homologisen polypeptidin amino-happoketjun osan kanssa, joka homologinen polypeptidi on poly-peptidi, jota esiintyy tai muodostuu isäntänä toimineessa villi-tyypin (muuntamattomassa) mikro-organismissa - niin kutsuttu epäsuora ilmentyminen. Epäsuoran ilmentymisen tapauksessa . alunperin saatu, yhteensulautumalla muodostunut proteiinituote • · · tehdään joskus epäaktiiviseksi sen aiottua käyttöä varten, kunnes yhteensulautunut, homologinen ja heterologinen polypeptidi on pilkottu erilleen solun ulkopuolisessa ympäristössä. Täten, esimerkiksi syanogeenibromidilla toteutettu metioniinijäännösten pilkkominen on tuottanut yhteensulautuneista homologisista ja ·’: heterologisista polypeptideistä somatostatiinia, tymosiini alfa-l:tä sekä ihmisen insuliinin A- ja B-komponenttien ketjuja, kun taas tiettyjen jäännösten entsymaattisella pilkkomisella on saatu beeta-endorfiiniä.
( IS l Silli l i I M i i 5 94427
Toistaiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikkaa soveltavassa kaupallisessa toiminnassa, joka on tähdännyt erilaisten polypeptidien tuottamiseen, ollaan keskitytty isäntäorganismin suhteen Escherichia coli-bakteeriin. Kuitenkin joissakin tilanteissa E. coli saattaa osoittautua sopimattomaksi isännäksi. E. coli-bakteeri sisältää esimerkiksi lukuisia pyrogeenisia tekijöitä, jotka on saatava poistetuiksi jokaisesta sellaisesta polypeptidistä, jota voidaan käyttää farmaseuttisena tuotteena. Se tehokkuus, jolla tämä puhdistaminen voidaan toteuttaa, riippuu luonnollisestikin kyseisestä proteiinista. Lisäksi E. coli-bakteerin proteolyyt-tinen aktiivisuus saattaa rajoittaa huomattavasti joidenkin hyödyllisten tuotteiden saantoa. Nämä ja myöskin muut havainnot ovat johtaneet vaihtoehtoisiin isäntiin kohdistuvan mielenkiinnon kasvamiseen, erityisesti tavoitellaan eukarioottisten organismien käyttöä polypeptidituotteiden tuotannossa.
Mikäli käytettävissä olisi keinoja polypeptidisten tuotteiden tuottamiseksi eukarioottisissa järjestelmissä, esimerkiksi hiivoissa, niin tällöin voitaisiin saavuttaa huomattavia etuja yh-distelmä-DNA:han koodattujen polypeptidien tuotannossa, proka-rioottisten järjestelmien, kuten E. coli-bakteerin, käyttöön verrattuna. Hiivoja on käytetty teollisissa käymisprosesseissa jo vuosisatojen ajan, kun taas E. coli-bakteerilla toteutetut, suuren mittakaavan käymisprosessit ovat suhteellisen nuoria.
. Hiivoja voidaan kasvattaa tavallisesti suurempiin solutiheyksiin • · « kuin bakteereita, ja ne saadaan helposti sopeutetuiksi jatkuviin käymisprosesseihin. Itse asiassa, hiivan, esimerkiksi Pichia pastoris-hiivan, kasvattaminen erittäin korkeiksi solutiheyksiksi, eli yli 100 g/1 oleviksi solutiheyksiksi, on esitetty US-patenttijulkaisussa 4 414 329. Isäntänä toimivan hiivan muuna etuna on se seikka, että organismin monet kriittiset toiminnot, esimerkiksi hapettava fosforylaatio, tapahtuvat solun organellien sisällä, joten ne eivät ole alttiina organismin tuottamien, isännän villityypin soluille vieraiden polypeptidien mahdollisille haitallisille vaikutuksille. Eukarioot-tisena organismina hiiva saattaa kyetä glykosyloimaan ilmentyneet 6 . 94427 polypeptidituotteet, mikäli tällainen glykosylointi on tärkeätä tämän polypeptidituotteen bioaktiivisuudelle. Samoin on mahdollista, että hiivassa, eukarioottisena organismina, esiintyy samanlaista kodonien suositummuisuusjärjestystä kuin korkeammissakin organismeissa, jolloin taipumuksena on nisäkkään geenistä peräisin olevien, tai esimerkiksi nisäkkään mRNAssta käänteis-kopioinnilla saadusta täydentävästä DNA:sta (c-DNA) peräisin olevien ilmentyvien tuotteiden tehokkaampi tuotanto.
Ominaisuuksiltaan huonosti tunnettujen hiivalajien kehittämistä isäntä/vektorijärjestelmiksi vaikeuttaa huomattavasti se, ettei tietoja transformaation olosuhteista tai sopivista vektoreista ole käytettävissä. Lisäksi usein käytettävissä ei ole auksotroo-fisia mutaatioita, jolloin transformanttien suora valikointi auksotroofisen täydentämisen avulla on mahdotonta. Jotta yhdis-telmä-DNA-tekniikkaa voitaisiin hyödyntää mahdollisimman täydellisesti, on kyettävä kehittämään uusia isäntä/vektorijärjestelmiä, joilla voidaan helpottaa DNA:n manipulointia, ja joilla voidaan optimoida istutettujen DNA-ketjujen ilmentymistä siten, että toivottuja polypeptidituotteitä voidaan valmistaa hallituissa olosuhteissa ja hyvillä saannoilla.
Näin ollen, tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusi säätelevä alue, joka reagoi metanolin läsnäoloon.
• ·
Edelleen, tämän keksinnön tavoitteena on uusi, kataboliiteille herkkä säätelevä alue, joka reagoi eräiden hiililähteiden läsnäoloon, mutta joka ei reagoi muiden hiililähteiden läsnäoloon.
Edelleen, tämä keksintö kohdistuu uuteen säätelevään alueeseen, ·*, joka reagoi hiililähteen ehtymiseen.
Edelleen, tämä keksintö kohdistuu uuteen vektoriin, joka kykenee ilmentämään istutettua, polypeptidin koodaavaa ketjua.
Lisäksi tämä keksintö kohdistuu uusiin, Pichia- ja Saccharomyces-sukuisiin hiivakantoihin.
Il : «11.1 Hill I I {.St : I
7 .. 94427
Lisäksi tämä keksintö kohdistuu menetelmään polypeptidien tuottamiseksi edellä kuvattuja uusia hiivakantoja käyttäen.
Nämä ja muut tämän keksinnön tavoitteet ovat ilmeisiä oheisen julkaisun sekä patenttivaatimusten perusteella.
Näiden tavoitteiden mukaisesti tässä keksinnössä ollaan todettu sellaisten DNA-ketjujen, jotka säätelevät DNA:n kopioitumista lähetti-RNA:ksi, sekä lähetti-RNA:n polypeptidituotteeseen johtavaa luentaa, olemassaolo, nämä ketjut on eristetty ja niiden tunnusomaiset piirteet on selvitetty. Tämän keksinnön mukaisia uusia DNA-ketjuja voidaan käyttää polypeptidituotteiden tuottamiseksi (a) sellaisten hiivakantojen avulla, jotka kannat kykenevät kasvamaan käyttäen metanolia hiilen ja energian lähteenään, (b) sellaisten hiivakantojen avulla, jotka kannat kykenevät kasvamaan glukoosia, etanolia, fruktoosia tai muita vastaavia käyttäen; sekä (c) sellaisten hiivakantojen avulla, jotka kannat kykenevät kasvamaan glyserolia, galaktoosia, asetaattia tai muita vastaavia käyttäen.
Piirustuksissa:
Kuva 1 esittää proteiinin p76 tapauksessa genomisen kloonin (pPG 6,0) ja cDNA-kloonin (pPC 15,0) välisen suhteen korrelaatiota.
··< Kuva 2 esittää proteiinin p72 (alkoholioksidaasi) tapauksessa genomisen kloonin (pPG 4,0) ja cDNA-kloonien (pPC 8,3) välisen suhteen korrelaatiota.
Kuva 3 esittää proteiinin p40 tapauksessa genomisen kloonin (pPG 4,8) ja cDNA-kloonin (pPC 6,7) välisen suhteen korrelaatiota.
:*: Kuva 4 esittää tämän keksinnön mukaisten säätelevien alueiden restriktiokarttoja kloonista pPG 6,0 lähtien.
Kuva 5 esittää tämän keksinnön mukaisen säätelevän alueen restriktiokarttaa kloonista pPG 4,0 lähtien.
Kuva 6 esittää tämän keksinnön mukaisen säätelevän alueen restrik tiokarttaa kloonista pPG 4,8 lähtien.
8 . 94427
Kuva 7 esittää proteiinin p7S rakenteellisen geenin 3' -päästä saadun DNA-ketjun restriktiokarttaa.
Kuva 8 esittää proteiinin p72 (alkoholioksidaasi) rakenteellisen geenin 3'-päästä saatujen DNA-ketjujen restriktiokarttoja.
Kuva 9 esittää proteiinin p40 rakenteellisen geenin 3'-päästä saadun DNA-ketjun restriktiokarttaa.
Kuva 10 esittää proteiinin p76 rakenteellisen geenin sekä sen 5'-säätelevän 5'-alueen restriktiokarttaa.
Kuva 11 esittää proteiinin p40 rakenteellisen geenin sekä sen säätelevän 5'-alueen restriktiokarttaa.
Kuva 12 esittää proteiinin p76 cDNAsn restriktiokarttaa.
Kuva 13 esittää proteiinin p72 (alkoholioksidaasi) cDNA:n restriktiokarttaa.
Kuva 14 esittää proteiinin p40 cDNA:n restriktiokarttaa.
Kuva 15 esittää tämän keksinnön mukaisen, kahden uuden DNA-rakenteen, jotka muodostuvat p76:n säätelevästä alueesta ja lacZ-osasta, restriktiokarttaa.
Kuva 16 esittää tämän keksinnön mukaisen, uuden DNA-rakenteen, joka muodostuu p72:n (alkoholioksidaasi) säätelevästä alueesta ja IacZ-osasta, restriktiokarttaa.
Kuva 17 esittää plasmidin pSAOH 1 restriktiokarttaa.
Kuva 18 esittää plasmidin pSAOH 5 restriktiokarttaa.
Kuva 19 esittää plasmidin pSAOH 10 restriktiokarttaa.
Kuva 20 esittää plasmidin pTAFH.85 restriktiokarttaa.
Kuva 21 esittää plasmidin pT76H 1 restriktiokarttaa.
: ; Kuva 22 esittää plasmidin pT76H 2 restriktiokarttaa.
Kuva 22a esittää plasmidin pT76H 3 restriktiokarttaa.
Kuva 22b esittää plasmidin pT76H 4 restriktiokarttaa.
Kuva 23 esittää plasmidin pYA2 restriktiokarttaa.
Kuva 24 esittää plasmidin pYA4 restriktiokarttaa.
< Klklt lilit t I ! -St : ' 1 > . 94427 9
Kuva 25 esittää plasmidin pYJ8 restriktiokarttaa.
Kuva 26 esittää plasmidin pYJ8ACla restriktiokarttaa.
Kuva 27 esittää plasmidin pYJ30 restriktiokarttaa.
Kuva 28 esittää plasmidin pTAFH 1 restriktiokarttaa, ja siitä nähdään myös se, miten tämä plasmidi saatiin.
Kuva 29 esittää plasmidin pTAO 12 restriktiokarttaa, ja siitä nähdään myös se, miten tämä plasmidi saatiin.
Kuva 30 esittää plasmidin pTA013 restriktiokarttaa.
Kuva 30a esittää plasmidin pT76Ul restriktiokarttaa.
Kuva 31 esittää plasmidin pTAOl restriktiokarttaa, ja siitä nähdään myös se, miten tämä plasmidi saatiin.
Kuva 32 esittää plasmidin pTAF.85 restriktiokarttaa, ja siitä nähdään myös se, miten tämä plasmidi saatiin.
Kuva 33 esittää plasmidin YEpl3 restriktiokarttaa.
Kuva 34 esittää plasmidin pBPfl restriktiokarttaa.
Käytetyistä restriktioentsyymeistä käytetään tässä hakemuksessa seuraavia lyhenteitä:
A = AsuII B = BamHI B2 = Bglll Bc = Bell C = Clal H2 = Hindi H3 = HindiII K = Kpnl Nd1 = Ndel Nr = NruI Ps = PstI Pv^ = PvuI Pv2 = PvuII R^ = EcoRI R5 = EcoRV
- 94427 10
Rs = Rsal S = Sali
S3 = Sau3AI
Se = Sael
Sm = Smal
Sp = Sphl
Ss = SstI
St = Stul T = Taql
Th = Thai
Xb = Xbal
Xh = XhoI
Xm = Xmal DNA-kappaleiden manipuloimiseen käytetyt restriktiokohdat, jotka tuhoutuvat ligatoinnissa, on merkitty liitteenä olevissa kuvissa siten, että tuhoutuneen kohdan lyhenne esitetään suluissa.
Tämän keksinnön tavoitteiden mukaisesti tässä keksinnössä saadaan aikaan uusi DNA-kappale, joka käsittää säätelevän alueen, joka säätelevä alue reagoi vähintään yhteen seuraavista ehdoista: metanolin läsnäoloon, hiililähteen ehtymiseen, kun soluja kasvatetaan jossakin muussa, metanolista poikkeavassa substraatissa, sekä metanolista poikkeavien, ei-kataboliittisten tukahdutta-vien hiililähteiden läsnäoloon. Tämän keksinnön mukainen säätelevä alue tässä DNA-käppaleessa kykenee säätämään lähetti-RNA:n kopioitumista, kun se sijaitsee lähetti-RNA:n tuotantoa koodaa-van DNA:n 5’-päässä. Tämän keksinnön piiriin kuuluvat samoin edellä kuvatun DNA-kappaleen mutantit.
-J : Edelleen, edellä esitettyjen tavoitteiden mukaisesti tässä keksinnössä saadaan aikaan sellainen DNA-kappale, joka käsittää säätelevän alueen, joka säätelevä alue kykenee säätämään poly-adenylaatiota, ja lähetti-ENA:n kopioitumisen päättymistä sekä luennan päättymistä, kun se sijaitsee lähetti-RNA:n tuotantoa koodaavan, polypeptidiä koodaavan alueen 3'-päässä, jolloin il *» } mu it am : . : u ->4427 lähetti-KNA:n kopioitumista ja luentaa säätelee sellainen säätelevä alue, joka reagoi vähintään yhteen seuraavista ehdoista: metanolin läsnäoloon, hiililähteen ehtymiseen, kun soluja kasvatetaan jossakin muussa, metanolista poikkeavassa substraatissa, sekä metanolista poikkeavien, ei-kataboliittisten tukahduttavien hiililähteiden läsnäoloon. Tämän keksinnön piiriin kuuluvat myös edellä kuvatun DNA-kappaleen mutantit.
Edelleen tämän keksinnön erityisen suoritusmuodon mukaisesti, keksinnössä saadaan aikaan sellaiset DNA-kappaleet, jotka ohjaavat koodautuneen polypeptidin liittymistä peroksisomeihin. Peroksisomit ovat solun sisäisiä muodostumia, joita on läsnä suurina määrinä metanolissa kasvatetuissa hiivasoluissa. Nämä solujen sisäiset muodostumat toimivat siten, että ne eristävät näihin muodostumiin liittyneen polypeptidituotteen solun sisäisistä väliaineista ja entsyymeistä, kuten proteaaseista.
Tämän keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti, tässä keksinnössä saadaan aikaan alkoholioksidaasin tuotantoa koodaa-vat geenit, noin 40 kilodaltonin suuruinen proteiini, sekä noin 76 kilodaltonin suuruinen proteiini.
Edelleen, tämän keksinnön erään muun suoritusmuodon mukaisesti tämä keksintö kohdistuu plasmideihin sekä muunnettuihin organis-. meihin, jotka sisältävät edellä kuvattuja DNA-kappaleita.
Edelleen, tämän keksinnön erään muun suoritusmuodon mukaisesti, tämä keksintö kohdistuu menetelmiin tämän keksinnön mukaisten plasmidien ja DNA-kappaleiden tuottamiseksi, sekä heterologisten polypeptidien, eli isäntäorganismissa luonnostaan esiintymättö-: : mien polypeptidien tuottamiseksi.
Säädeltävissä olevien geenien eristäminen Pichia pastoris-hiivasta
Suurin piirtein 20 000 jäsenen cDNA-kirjasto muodostettiin E. coli-bakteeriin käyttäen poly A+ RNA:ta, joka oli eristetty •-'94427 12 ainoana hiililähteenään metanolia sisältävällä alustalla kasvatetuista Pichia pastoris—hiivan soluista (katso esimerkki III).
Tämä kirjasto seulottiin hybridisoimalla, käyttäen kinasoitua poly A+ RNA:ta, joka oli eristetty joko metanolin tai etanolin läsnäollessa kasvatetusta Pichia pastoris-hiivasta. Kun tämä plus-miinus-seulonta oli suoritettu useaan kertaan, kolme selvää, ei-homologista cDNA-kloonia tunnistettiin metanolille spesifisten lähetti-RNA-molekyylien kopioiksi. Näille klooneille annettiin tunnuksiksi pPC 6,4, pPC 8,0 ja pPC 15,0, ja niiden todettiin sisältävän 470, 750 ja 1100 nukleotidin pituiset istutetut osat, vastaavasti.
Kun pyrittiin saamaan pituudeltaan suurempia cDNA-klooneja, niin toinen cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen Sl-nukleaasilla pilkkomisessa miedompia olosuhteita kuin mitä ensimmäisen cDNA-kirjas- ton valmistamisessa käytettiin, ja tämän uuden kirjaston jäse- 32
net seulottiin yksitellen P-merkityillä cDNA-klooneilla pPC
6,4, pPC 8,0 ja pPC 15,0. Tämän tuloksena suurempia cDNA-kloo-neja eristettiin, vastaten cDNA-klooneja pPC 6,4 ja pPC 8,0.
Näiden suurempien kloonien, pPC 6,7 ja pPC 8,3, todettiin sisältävän 1200 ja 2100 nukleotidin pituisia istutettuja osia, vastaavasti (katso kuvat 2 ja 3). Yli 1100 nukleotidin suuruisen istutetun osan käsittävää cDNA-kloonia ei ole havaittu pPC 15,O:n tapauksessa, kun yli 40 000 cDNA-kloonia oli seulottu.
• ·· ·
Kutakin näitä cDNA-klooneja vastaavien genomisten DNA-kappaleiden eristäminen toteutettiin siten, että ensin Pichia pastoris- hiivasta saadun, restriktioendonukleaasilla käsitellyn kromoso- 32 maalisen DNA:n kappaleet, jotka hybridisoituvat P-merkityn pPC 15,0:n, pPC 8,0:n tai pPC 6,4:n kanssa, pilkottiin ja eluoi-Γ: tiin sähköisesti agaroosigeeleiltä. Tämän jälkeen nämä eluoi- dut genomiset DNA-kappaleet kloonattiin E. coli-bakteeriin, ja asianmukaiset genomiset kloonit tunnistettiin usealla, kullakin edellä mainitulla cDNA-koettimella suoritetulla seulonnalla.
13 . 94427
Kunkin cDNA-kloonin ja vastaavan genomisen kloonin välistä suhdetta havainnollistetaan kuvissa 1, 2 ja 3. pPC 15,0 on koodautunut kloonissa pPG 6,0 läsnäolevaan 6000 nukleotidin genomiseen Hindlll-kappaleeseen (kuva 1). pPC 15,0:n koodaavan geenin 5'-pää on suuntautunut pPG 6,O:n sisältämää 1300 emäs-parin Hindlll-EcoRI-kappaletta kohden, kun taas tämän geenin 3'-pää sijaitsee pPG 6,0:ssa olevien Pstl-kohtien läheisyydessä.
cDNA-klooni pPC 8,3 on sisältyneenä genomiseen klooniin pPG 4,0 (kuva 2). pPG 4,0 sisältää viereisen genomisen DNA:n 4000 nukleotidin suuruisen EcoRI-PvuII-istutteen. pPC 8,3:n suuntautuminen pPG 4,0:ssa johtaa siihen, että tätä cDNA-kloonia varten olevan geenin 5'-pää joutuu BamHI-kohtien läheisyyteen, kun taas tämän geenin 3'-pää sijaitsee PvuII-kohdan lähellä. pPC 8,0:n (samankaltainen cDNA-klooni) suuntautuminen pPG 4,0:n sisällä johtaa siihen, että tämän cDNA-kloonin 5'-pää joutuu pPG 4,0:n 3'-päässä Kpnl-kohdan läheisyyteen, ja tämän cDNA-kloonin 3'-pää sijaitsee PvuII-kohdan lähellä.
cDNA-klooni pPC 6,7 sijaitsee täydellisesti 4800 nukleotidin suuruisen genomisen EcoRI-BamHI-kappaleen (kuva 3) sisällä.
Klooni pPC 6,4 sijaitsee puolestaan täydellisesti cDNA-kloonin pPC 6,7 sisällä. Koska pPC 6,7 on täydellisempi kopio kuin pPC
6,4, niin tätä jälkimmäistä ei tarkasteltu tämän enempää. Geenin '. 5*-pää sijaitsee lähempänä genomisen kloonin pPG 4,8 (kuva 3)
BamHI-päätä kuin EcoRI-päätä.
Kaikissa näissä edellä kuvatuissa genomisissa klooneissa on vähintään 1,2 kiloemäsparia reunan genomista DNA-ketjua, joilla on 5'-sijainti kuhunkin näistä cDNA-klooneista kopioituneiden : : rakenteellisten geenien suhteen.
Kaikki edellä kuvatuista genomisista ja cDNA-klooneista on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center of the United States of America, Peoria, Illinois, jotta ne olisivat yleisön saatavilla, kun tälle hakemukselle myönnetään k 14 - 94427 patenttioikeudet. Kaikki kloonit on tallennettu E. coli-isän-nissä:
Plasmidi Isäntä Tunnusnumero pPG 6,0 E. coli LE392-pPG 6,0 NRRL B-15867 pPG 4,0 E. coli LE392-pPG 4,0 NRRL B-15868 pPG 4,8 E. coli LE392-pPG 4,8 NRRL B-15869 pPC 15,0 E. coli LE392-pPC 15,0 NRRL B-15870 pPC 8,3 E. coli LE392-pPC 8,3 NRRL B-15871 pPC 6,7 E. coli LE392-pPC 6,7 NRRL B-15872 pPC 8,0 E. coli MM294-pPC 8,0 NRRL B-15873
Kaikki edellä mainitut organismit on tallennettu kiistatta, elokuun 31. päivänä 1984, ja ne ovat yleisön käytettävissä.
Kloonien pPG 6,0, pPG 4,0 ja pPG 4,8 ainutlaatuisuus metanolia assimiloivissa hiivoissa_
Kukin edellä kuvattu cDNA-klooni merkittiin ja niitä käytettiin lukuisista metanolia assimiloivista hiivoista ja metanolia assimiloimattomista hiivoista saatujen kromosomaalisten DNA-ketjujen koettimina. Kaikkia kolmea cDNA:ta vastaavien homologisten geenien todettiin esiintyvän jokseenkin kaikissa metanolia assimiloivissa hiivoissa, mutta ne puuttuivat selvästi metanolia assimiloimattomasta hiivasta (S. cerevisiae). Näin ollen »·· oletetaan, että nämä geenit ovat ainutlaatuisia metanolia assimiloivissa hiivoissa. Lisäksi esimerkissä XVII yksityiskohtaisesti kuvatuissa Southern*in hybridisaatiokokeissa todetaan, että erilaisista metanolia assimiloivista hiivoista saatujen, ainutlaatuisten, metanoliin reagoivien geenien välillä esiintyy huomattavaa homologisuutta.
•i ·
Geenien pPG 6,0, pPG 4,0 ja pPG 4,8 RNA-kopioiden tunnusomaiset piirteet_
Metanolin vaikutus kunkin näiden kloonatun geenin ilmentymiseen voidaan todeta tarkastelemalla metanolin vaikutusta näiden geenien kopioitumiseen. Northern'in hybridisaatiosuodattimien 15 . 94427 valmistamiseen käytettiin Pichia pastoris-soluista, joiden kasvatuksessa ainoana hiilen lähteenä oli ollut etanoli tai metanoli, eristetyn poly A+ RNA:ta. Kolme identtistä, metanolissa ja etanolissa kasvatetuista soluista (katso esimerkki I) saatujen suodattimien paria varustettiin toisistaan erillään koettimilla, 32 käyttäen P-merkittyä pPC 15,O:aa, pPC 8,0:aa ja pPC 6,4:ää.
Nämä kloonit pPC 15,0, pPC 8,0 ja pPC 6,4 hybridisoituivat metanolissa kasvatetuista soluista saatuihin RNA-molekyyleihin (suuruudeltaan noin 2400, 2300 ja 1300 nukleotidiä, vastaavasti). Kloonien pPC 15,0 ja pPC 8,0 ei todettu hybridisoituvan lainkaan hybridisaation koettimien kanssa etanolin läsnäollessa kasvatetuista soluista saadun RNA:n tapauksessa. Kuitenkin, kun etanolilla kasvatetuista soluista eristetty RNA varustettiin koetti-mella pPC 6,4, niin klooni hybridisoitui sellaiseen 1300 nukleotidin suuruiseen RNA-molekyyliin, joka oli identtinen metanolissa kasvatetuissa soluissa todetun RNA:n kanssa, mutta hybridisoi-tuminen tapahtui arviolta (kvalitatiivisesti) 5 kertaa heikommin.
Geenien pPG 6,0, pPG 4,0 ja pPG 4,8 koodaamien proteiinituottei-den koon määrittäminen
Jotta saataisiin selvitetyksi se, mitä proteiinituotteita kukin edellä tunnistettu cDNA-klooni koodaa, kuhunkin näistä cDNA-kloo-neista hybridisoitiin selektiivisesti poly A+ RNA:ta, jota oli saatu metanolilla kasvatetuista Pichia pastoris-soluista. Tämän jälkeen hybridin avulla valikoitu mRNA- eli se mRNA, joka hybridi-soitui kuhiinkin cDNA-klooniin, luettiin (translaatio) in vitro, ja proteiinituotteet erotettiin elektroforeettisesti käyttäen denaturoivia SDS-olosuhteita (katso esimerkki V). Näistä in vitro toteutetuista, positiivisen hybridisaation ja luennan kokeista saadut tulokset osoittavat, että kloonit pPC 15,0, pPC 8,3 ja ; pPC 6,7 valikoivat sellaisia mRNA-molekyylejä, jotka koodaavat 76 000 (p76), 72 000 (p72) ja 40 000 (p40) daltonin suuruisia polypeptidejä vastaavaa informaatiota, vastaavasti. Nämä samat proteiinit todetaan, kun metanolilla kasvatetuista Pichia pastoris-soluista saatu koko poly A+ RNA (eli jota ei ole valikoitu hybridin avulla) luetaan tässä samassa in vitro-järjestelmässä.
- 94427 16
Proteiinin p72 tunnistaminen ‘alkoholioksidaasiksi A. Molekyylipainojen vertaaminen
Alkoholioksidaasiproteiinia rikastettiin suuri määrä näytteeseen dialysoimalla kirkastettuja solulysaatteja vettä vastaan (katso esimerkki VII). SDS-elektroforeesin avulla todettiin, että tästä dialyysistä saatu kiteinen saostuma sisältää pääasiallisesti kahta, 76 000 ja 72 000 daltonin suuruista polypeptidiä, vastaavasti. Saostuma puhdistettiin edelleen kromatografisesti Sephacryl 200-geelin läpi (katso esimerkki VII), mikä osoitti, että alkoholioksidaasin aktiivisuus vastasi puhdistetun, 72 000 daltonin suuruisen polypeptidin aktiivisuutta. Tämän polypepti-din koko oli identtinen cDNA-kloonin pPC 8,3 avulla valikoidun proteiinituotteen koon kanssa (katso esimerkki X).
B. Immunosaostus
Lisätukea sille, että kloonit pPC 8,3 ja pPG 4,0 koodaavat alkoholioksidaasin rakenteellista geeniä, saatiin immunologisin menetelmin (esimerkki XI). Pichia pastoris-hiivasta eristettyä proteii-nipreparaattia, joka sisältää sekä 76 OOO että 72 000 daltonin polypeptidit, käytettiin näille polypeptideille spesifisten antiseerumeiden muodostamiseen kaniineissa. Kun hybridin avulla valikoitu poly A+ RNA kloonista pPC 8,3 luettiin in vitro, niin ainoastaan 72 000 daltonin suuruinen translaatiotuote saostui niillä antiseerumeilla, jotka olivat muodostuneet Pichia pastoris-soluista saatua proteiinipreparaattia vastaan.
C. Ennustetun ja todellisen aminohappoketjun vertaaminen Jotta edelleen saataisiin varmennetuksi se, että klooni pPC 8,3 on todellakin Pichia pastoris-hiivan alkoholioksidaasia koodaava cDNA-klooni, niin aminohappojen järjestystä tämän proteiinin ' : aminopäässä verrattiin pPC 8,3:n koodaaman ketjun ennustettuun aminohappojen järjestykseen. Täten, tämän eristetyn 72 000 daltonin suuruisen proteiinin NK^-päässä aminohappojäännösten järjestyksen (ketju A) todettiin olevan (esimerkki VIII):
Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser.
Ketju A
i7 . 54427
Samalla määritettiin nukleotidien järjestys pPC 8,3teen ja pPG 4fO:ään koodautuneen geenin 5'-päässä. Aminohappojen 2-19 tapauksessa (katso ketju B) sekä genomisen kloonin että cDNA-kloonin DNA-ketjujen perusteella ennustettu aminohappojen järjestys vastasi täydellisesti niitä ensimmäistä 18 aminohappoa, jotka edellä määritettiin Pichia pastoris-hiivasta eristetyn alkoholioksidaasin aminohappojen ketjussa (ketju A):
Ennustettu aminohappojen järjestys: Met ala ile pro glu glu phe
Nukleotidien järjestys 5'-ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT
(pPC 8,3 ja pPG 4,0): 3'-TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
asp ile leu vai leu gly gly gly ser ser gly ser GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TCC AGT GGA TCC-3' CTA TAG GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG-5'
Ketju B
Lisäksi määritettiin koko nukleotidiketju alkoholioksidaasin geenin koodaavassa alueessa. Määritetty nukleotidien järjestys ja ennustettu aminohappojen järjestys esitetään ketjuna B' ja niiden oletetaan olevan: ·{ Ennustettu aminohappojen järjestys: Met ala ile pro glu glu phe
Nukleotidien järjestys 5'-ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT
(pPC 8,3 ja pPG 4,0): 3'-TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
94427 18 asp ile leu vai leu gly gly gly ser ser gly ser
GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TTC AGT GGA TCC
CTA TAG GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG
cys ile ser gly arg leu ala asn leu asp his ser
TGT ATT TCC GGA AGA TTG GCA AAC TTG GAC CAC TCC
ACA TAA AGG CCT TCT AAC CGT TTG AAC CTG GTG AGG
leu lys va 1 gly leu ile glu ala gly glu -asn gin
TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAA GCA GGT GAG AAC CAA
AAC TTT CAA CCA GAA TAG CTT CGT CCA CTC TTG GTT
pro gin gin pro met gly leu pro ser arg tyr leu
CCT CAA CAA CCC ATG GGT CTA CCT TCC AGG TAT TTA
GGA GTT GTT GGG TAC CCA GAT GGA AGG TCC ΑΤΑ AAT
pro lys lys gin lys leu asp ser lys thr ala ser
CCC AAG AAA CAG AAG TTG GAC TCC AAG ACT GCT TCC
GGG TTC TTT GTC TTC AAC CTG AGG TTC TGA CGA AGG
phe tyr thr ser asn pro ser pro his leu asn gly
TTC TAC ACT TCT AAC CCA TCT CCT CAC TTG AAT GGT
AAG ATG TGA AGA TTG GGT AGA GGA GTG AAC TTA CCA
arg arg ala ile val pro cys ala asn val leu gly
AGA AGA GCC ATC GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG GGT
TCT TCT CGG TAG CAA GGT ACA CGA TTG CAG AAC CCA
gly gly ser ser ile asn phe met met tyr thr arg
GGT GGT TCT TCT ATC AAC TTC ATG ATG TAC ACC AGA
CCA CCA AGA AGA TAG TTG AAG TAC TAC ATG TGG TCT
gly ser ala ser asp ser asp asp ? gin ala glu
GGT TCT GCT TCT GAT TCT GAT GAC TTN CAA GCC GAG
CCA AGA CGA AGA CTA AGA CTA CTG AAN GTT CGG CTC
gly ser lys thr glu asp leu leu pro leu met lys
GGC TCG AAA ACA GAG GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAA
CCG AGC TTT TGT CTC CTG AAC GAA GGT AAC TAC TTT
• · “ • 1 • 1 · 19 . 94427 lys thr glu thr tyr gin arg ala ? gin ? tyr
AAG ACT GAG ACC TAC CAA AGA GCT TGN CAA CNA TAC
TTC TGA CTC TGG ATG GTT TCT CGA ACN GTT GNT ATG
pro asp ile his gly phe glu gly pro ile lys val
CCT GAC ATT CAC GGT TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTT
GGA CTG TAA GTG CCA AAG CTT CCA GGT TAG TTC CAA
ser phe gly asn tyr thr tyr pro val cys gin asp
TCT TTC GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT TGC CAG GAC
AGA AAG CCA TTG ATG TGG ATG GGT CAA ACG GTC CTG
phe leu arg ala ser glu ser gin gly ile pro tyr
TTC TTG AGG GCT TCT GAG TCC CAA GGT ATT CCA TAC
AAG AAC TCC CGA AGA CTC AGG GTT CCA TAA CGT ATG
val asp asp leu glu asp leu val leu thr his gly
GTT GAC GAT CTG GAA GAC TTG GTA CTG ACT CAC GGT
CAA CTG CTA GAC CTT CTG AAC CAT GAC TGA GTG CCA
ala glu his trp leu lys trp ile asn arg asp thr
GCT GAA CAC TGG TTG AAG TGG ATC AAC AGA GAC ACT
CGA CTT GTG ACC AAC TTC ACC TAG TTG TCT CTG TGA
gly arg arg ser asp ser ala his ala phe val his
CGT CGT TCC GAC TCT GCT CAT GCA TTT GTC CAC TCT
GCA GCA AGG CTG AGA CGA GTA CGT AAA CAG GTG AGA
ser thr met arg asn his asp asn leu tyr leu ile
TCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATC
AGA TGA TAC TCT TTG QTG CTG TTG AAC ATG AAC TAG
cys asn thr lys val asp lys ile ile val glu asp
TGT AAC ACG AAG GTC GAC AAA ATT ATT GTC GAA GAC
ACA TTG TGC TTC CAG CTG TTT TAA TAA CAG CTT CTG
gly arg ala ala ala val arg thr val pro ser lys
GGA AGA GCT GCT GCT GTT AGA ACC GTT CCA AGC AAG
CCT TCT CGA CGA CGA CAA TCT TGG CAA GGT TCG TTC
pro leu asn pro lys lys pro ser his lys ile tyr
CCT TTG AAC CCA AAG AAG CCA AGT CAC AAG ATC TAC
GCA AAC TTG GGT TTC TTC GGT TCA GTG TTC TAG ATG
: arg ala arg lys gin ile phe leu ser cys gly thr »·
CGT GCT AGA AAG CAA ATC TTT TTG TCT TGT GGT ACC
GCA CGA TCT TTC GTT TAG AAA AAC AGA ACA CCA TGG
ile ser ser pro leu val leu gin arg ser gly phe
ATC TCC TCT CCA TTG GTT TTG CAA AGA TCC GGT TTT
TAG AGG AGA GGT AAC CAA AAC GTT TCT AGG CCA AAA
l·· .· 94427 20 gly asp pro He lys leu arg ala ala gly val lys
GGT GAC CCA ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAG
CCA CTG GGT TAG TTC AAC TCT CGG CGA CCA CAA· TTC
pro leu val asn leu pro gly val gly arg asn phe
CCT TTG GTC AAC TTG CCA GGT GTC GGA AGA AAC TTC
GGA AAC CAG TTG AAC GGT CCA CAG CCT TCT TTG AAG
gin asp his tyr cys phe phe ser pro tyr arg ile
CAA GAC CAT TAT TGT TTC TTC AGT CCT TAC AGA ATC
GTT CTG GTA ATA ACA AAG AAG TCA GGA ATG TCT TAG
lys pro gin tyr glu ser phe asp asp phe val arg
AAG CCT CAG TAC GAG TCT TTC GAT GAC TTC GTC CGT
TTC GCA GTC ATG CTC AGA AAG CTA CTG AAG CAG GCA
gly asp ala glu ile gin lys arg val val asp gin
GGT GAT GCT GAG ATT CAA AAG AGA GTC GTT GAC CAA
CCA CTA CGA CTC TAA GTT TTC TCT CAG CAA CTG GTT
trp tyr ala asn gly thr gly pro leu ala thr asn
TGG TAC GCC AAT GGT ACT GGT CCT CTT GCC ACT AAC
ACC ATG CGG TTA CCA TGA CCA GGA GAA CGG TGA TTG
gly ile glu ala gly val lys ile arg pro thr pro
GGT ATC GAA GCT GGT GTC AAG ATC AGA CCA ACA CCA
CCA TAG CTT CGA CCA CAG TTC TAG TCT GGT TGT GGT
glu glu leu ser gin met asp glu ser phe gin glu
GAA GAA CTC TCT CAA ATG GAC GAA TCC TTC CAG GAG
CTT CTT GAG AGA GTT TAC CTG CTT AGG AAG GTC CTC
gly tyr arg glu tyr phe glu asp lys pro asp lys
GGT TAC AGA GAA TAC TTC GAA GAC AAG CCA GAC AAG
CCA ATG TCT CTT ATG AAG CTT CTG TTC GGT CTG TTC
·: pro val met his tyr ser ile ile ala gly phe phe
CCA GTT ATG CAC TAC TCC ATC ATT GCT GGT TTC TTC
GGT CAA TAC GTG ATG AGG TAG TAA CGA CCA AAG AAG
gly asp his thr lys ile pro pro gly lys tyr met
GGT GAC CAC ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATG
CCA CTG GTG TGG TTC TAA GGA GGA CCT TTC ATG TAC
• thr met phe his phe leu glu tyr pro phe ser arg
ACT ATG TTC CAC TTC TTG GAA TAC CCA TTC TCC AGA
TGA TAC AAG GTG AAG AAC CTT ATG GGT AAG AGG TCT
gly ser ile his ile thr ser pro asp pro tyr ala
GGT TCC ATT CAC ATT ACC TCC CCA GAC CCA TAC GCA
CCA AGG TAA GTG TAA TGG AGG GGT CTG GGT ATG CGT
« · » . 94427 21 ala pro asp phe asp arg gly phe met asn asp glu
GCT CCA GAC TTC GAC CG A GGT TTC P£G AAC GAT GAA
CGA GGT CTG AAG CTG GCT CCA AAG TAC TTG CTA CTT
arg asp met ala pro met vai trp ala tyr lys ser
AGA GAC ATG GCT CCT ATG GTT TGG GCT TAC AAG TCT
TCT CTG TAC CGA GGA TAC CAA ACC CGA ATG TTC TTC
ser arg glu thr ala arg arg ser asp his phe ala
TCT AGA GAA ACC GCT AGA AGA AGT GAC CAC TTT GCC
AGA TCT CTT TGG CGA TCT TCT TCA CTG GTG AAA CGG
gly glu vai thr ser his his pro leu phe pro tyr
GGT GAG GTC ACT TCT CAC CAC CCT CTG TTC CCA TAC
CCA CTC CAG TGA AGA GTG GTG GGA GAC AAG GGT ATG
ser ser glu ala arg ala leu glu met asp leu glu
TCA TCC GAG GCC AGA GCC TTG GAA ATG GAT TTG GAG
AGT AGG CTC CGG TCT CGG AAC CTT TAC CTA AAC CTC
thr ser asn ala tyr gly gly pro leu asn leu ser
ACC TCT AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCT
TGG AGA TTA CGG ATG CCA CCT GGA AAC TTG AAC AGA
ala gly leu ala his gly ser trp thr gin pro leu
GCT GGT CTT GCT CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTG
CGA CCA GAA CGA GTG CCA AGA ACC TGA GTT GGA AAC
lys lys pro thr ala lys asn glu gly his vai thr
AAG AAG CCA ACT GCA AAG AAC GAA GGC CAC GIT ACT
TTC TTC GGT TGA CGT TTC TTG CTT C CG GTG CAA TGA
. ser asn gin vai glu leu his pro asp ile glu tyr
TCG AAC CAG GTC GAG CTT CAT CCA GAC ATC GAG TAC
AGC TTG GTC CAG CTC GAA GTA GGT CTG TAG CTC ATG
·: asp glu glu asp asp lys ala ile glu asn tyr ile
GAT GAG GAG GAT GAC AAG GCC ATT GAG ACC TAC ATT
CTA CTC CTC CTA CTG TTC CGG TAA CTC TTG ATG TAA
arg glu his thr glu thr thr trp his cys leu gly
CGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGA
GCA CTC GTG TGA CTC TGG TGT ACC GTG ACA CCA GGT
tAr cys ser ile gly pro arg glu gly ser lys ile
ACC TGT TCC ATC GGT CCA AGA GAA GGT TCC AAG ATC
TGG ACA AGG TAG CCA GGT TCT CTT CCA AGG TTC TAG
vai lys trp gly gly vai leu asp his arg ser asn
GTC AAA TGG GGT GGT GTT TI G GAC CAC AGA TCC AAC
CAG TTT ACC CCA CCA CAA AAC CTG GTG TCT AGG TTG
• · · . 94427 22 vai tyr gly vai lys gly leu lys val gly asp leu
GTT TAC GGA GTC AAG GGC TIG AAG GTT GGT GAC TTG
CAA ATG CCT CAG TTC CCG AAC TTC CAA CCA CTG AAC
ser val cys pro asp asn val gly cys asn thr tyr
TCC GTG TGC CCA GAC AAT GTT GGT TGT AAC ACC TAC
AGG CAC ACG GGT CTG TTA CAA CCA ACA TTG TGG ATG
thr thr ala leu leu He gly glu lys thr ala thr
ACC ACC GCT CTT TTG ATC GGT GAA AAG ACT GCC ACT
TGG TGG CGA GAA AAC TAG CCA CTT TTC TGA CGG TGA
leu val gly glu asp leu gly tyr ser gly glu ala
TTG GTT GGA GAA CAT TTA GGA TAC TCT GGT GAG GCC
AAC CAA CCT CTT CTA AAT CCT ATG AGA CCA CTC CGG
leu asp met thr val pro gin phe lys leu gly thr
TTA GAC ATG ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT
AAT CTG TAC TGA CAA GGA GTC AAG TTC AAC CCG TGA
tyr glu lys thr gly leu ala arg phe stop TAC GAG AAG ACC GGT CTT GCT AGA TTC TAA-3' ATG CTC TTC TGG CCA GAA CGA TCT AAG ATT-5’
Ketju B1
Kun edellä esitettyä nukleotidiketjua verrataan Hansenula polymorpha-hiivan aikaisemmin kuvattua alkoholioksidaasia vastaavaan, julkaistuun (Ledeboer et ai.) nukleotidiketjuun, niin tällöin todetaan monia merkittäviä eroja, muun muassa ennustettu aminohappojen ketju, geenin (ja tuloksena olevan proteiinin) todellinen koko, kodonin käytön poikkeama, ja muita vastaavia.
Proteiinin p76 tunnistaminen dihydroksiasetonisyntaasiksi Proteiinin p76 geenin ensimmäisen 51 nukleotidin muodostaman ketjun järjestys määritettiin tavanomaisilla menetelmillä. Tämän ketjun perusteella voidaan ennustaa aminohappojen järjes-:: tys p76-proteiinin aminopäässä;
Aminohappojen järjestys: met ala arg ile pro lys
Nukleotidien järjestys: 5'-ATG GCT AGA ATT CCA AAA
3'-TAC CGA TCT TAA GGT TTT
pro vai ser thr gin asp asp ile his gly leu CCA GTA TCG ACA CAA GAT GAC ATT CAT GAA TTG-3' GGT CAT AGC TGT GTT CTA CTG TAA GTA CTT AAC-5 ' - 94427 23 Tätä ennustettua aminohappojen järjestystä proteiinissa p76 voidaan verrata Hansenula polymorpha-hiivasta saadun dihydrok-siasetonisyntaasiproteiinin (DHAS) julkaistuun aminohappo-ketjuun (Manowicz et ai.). Vaikkakin näissä ketjuissa todetaan lukuisia eroavaisuuksia, niin kuitenkin näiden kahden proteiinin välillä on myös samankaltaisuuksia, jotka on todettavissa seuraavasta:
Pichia DHAS : met-ala- arg-ile-pro-lys-pro-
Hansenula DHAS: met-ser-met-arg-ile-pro-lys-ala- val-ser-thr-gln-asp-asp-ile-his-glu- -leu-ala-ser-val-asn-asp-glu-gln-his-gln-arg-ile-
Proteiini p76 on toistaiseksi tunnistettu Pichia-hiivasta peräisin olevaksi DHAS-proteiiniksi Pichia-hiivan p76-proteiinin ja Hansenula-hiivan DHAS-proteiinin samankaltaisen koon (noin 76 000 daltonia) sekä merkittävän homologisuusasteen perusteella.
Kuten edellä alkoholioksidaasin geenin yhteydessä esitetään, verrattaessa Pichia-hiivan DHAS-proteiinin ensimmäisen 51 nukleotidin muodostamaa ketjua aikaisemmin julkaistuun (Janowicz et ai.), Hansenula-hiivan DHSA-proteiinin nukleotidi-ketjuun todetaan lukuisia eroavaisuuksia kodonin käytön poikkeamissa, ennustetussa aminohappoketjussa, geenin koko suuruudessa, jne.
DNA-kappaleet, jotka sisältävät Pichia pastoris-hiivasta pe- räisin olevia säädettäviä promoottoreita_ Tämän keksinnön mukaiset säätelevät 5'-alueet on esitetty yksityiskohtaisesti kuvien 4^ 5 ja 6 restriktiokartoissa. Poly-peptidin p76 ilmentymistä säätelevä 5'-alue sijaitsee kuvassa * 4a esitetyssä DNA-kappaleessa. Suurin piirtein 2,9 kiloemäs-parin suuruisen Hincttll-XhoI-kappaleen on selvästi osoitettu sisältävän tämän säätelevän toiminnon, kuten jäljempänä yksityiskohtaisemmin esitetään. Koska cDNA-klooni pPC 15,0 ei ole täydellinen kopio-cDNA, niin on erittäin todennäköistä, että . vähintään osa kuvassa 4a esitetystä DNA-kappaleesta sisältää 24 · 54427 rakenteellisia koodaavia ketjuja polypeptidia p76 varten.
Näin ollen, tämän säätelevän toiminnon oletetaan sijaitsevan kuvassa 4b esitetyssä, suurin piirtein 1300 emäsparin Hindlll-EcoRI-kappaleessa. Tätä olettamusta tukevat jäljempänä yksityiskohtaisemmin esitettävät uudet, $-galaktosidaasigeenin sisältävät muodosteet.
Polypeptidin p72 (alkoholioksidaasi) ilmentymistä säätelevä 5'-alue sijaitsee kuvassa 5 esitetyssä, suurin piirtein 2000 emäs-parin suuruisessa EcoRI-BamHI-DNA-kappaleessa. Jäljempänä tarkasteltavat uudet, β-galaktosidaasigeenin sisältävät muodosteet osoittavat tämän DNA-kappaleen säätelevän luonteen.
Kuva 6 esittää suurin piirtein 3 kiloemäsparin suuruisen BamHI-Sall-DNA-kappaleen restriktiokartan, joka DNA-kappale sisältää polypeptidin p40 tuotantoa säätelevän 5'-alueen. Tämä kappale on selvästi erotettavissa kuvissa 4 ja 5 esitetyistä säätelevistä 5'-alueista, mm. tässä DNA-kappaleessa olevien erilaisten restriktiokohtien perusteella.
Kuvissa 10, 2a ja 11 esitetään restriktioentsyymeihin liittyvää tietoa polypeptidien p76, p72 (alkoholioksidaasi) ja p40, vastaavasti, säätelevien alueiden sekä rakenteellisten geenien tapauksessa. Näin ollen, kuvassa 10 esitetään yksityiskohtaisesti 3,8 kiloemäsparin suuruinen, Pichia pastoris-hiivan geno-misen DNA:n HindiII-Pstl-kappale, joka säätää ja koodaa polypeptidin p76 tuotantoa. Kuva 2a käsittelee 4,0 kiloemäsparin suuruista, Pichia pastoris-hiivan genomisen DNA:n EcoRI-PvuII-kappaletta, joka säätää ja koodaa polypeptidin p72 (alkoholioksidaasi) tuotantoa. Kuvassa 11 esitetään 3,7 kiloemäsparin .* suuruinen, Pichia pastoris-hiivan genomisen DNA:n BamHI-EcoRI-kappale, joka säätää ja koodaa polypeptidin p40 tuotantoa.
Genomisten kloonien pPG 6,0, pPG 4,0 ja pPG 4,8 tunnusomaiset piirteet on myös selvitetty restriktioentsyymien avulla kartoittamalla. Klooni pPG 6,0 esitetään yksityiskohtaisesti • · · i ! ** l· tl li I | | at t k 94427 25 kuvassa la. Kiinnepisteenä’ toimiva DNA-kappaleen 5'-pää on lähtöpiste. Klooni pPG 6,0 on Pichia pastoris-hiivan kromoso-maalisen DNA:n Hindlll-kappale, jonka pituus on noin 6 kilo-emäsparia, ja joka pilkkoutuu seuraavasti eri restriktioentsyy-meillä:
Restriktioentsyymi Pilkkoutumiskohdat Etäisyys lähtöpistees-__ _ tä (emäsparia)_
Hindi 5 1070, 1740, 1890, 3320, 5520
EcoRI 2 1300, 3450
XhoI 1 2860,
PstI 2 3820, 4200
PvuII 1 4120
PvuI 1 4950
Klooni pPG 4,0 esitetään yksityiskohtaisesti kuvassa 2a. Tämä klooni on kromosomaalisen DNA:n EcoRI-HindiII-kappale, jonka pituus on noin 4 kiloemäsparia. Pidettäessä tämän kloonin 5'-päätä lähtöpisteenä tästä kloonista pPG 4,0 saatiin seuraavaa restriktioon liittyvää tietoa: » - 94427 26
Restriktioentsyymi Pilkkodtumiskohdat Etäisyys lähtöpis- _ _ teestä (emäsparia)
Hindlll 3 400, 600, 1840
PstI 1 850
BamHI 2 1960, 1970
Sali 1 2620
Bglll 2 1040, 2700
Kpnl 2 500, 2730
Xbal 1 3330
Stul 1 3880
Ndel 1 420
Hindi 2 870, 2430
SstI 1 1200
Bell 2 1710, 4080
AsuII 2 1900, 2300
EcoRV 1 1930
PvuII 1 4120
Klooni pPG 4,8 esitetään yksityiskohtaisesti kuvassa 3a.
Tämä klooni on 4,8 kiloemäsparin suuruinen, Pichia pastoris-hiivan kromosomaalisen DNA:n BamHI-EcoRI-kappale, jossa on myös seuraavat restriktiokohdat:
Restriktioentsyymi Pilkkoutumiskohdat Etäisyys lähtöpisteestä (emäsparia)
Clal 1 410
Kpnl 3 500, 3890, 4280
PvuI 1 1120
Sali 1 2900
PvuII 1 4135
EcoRV 2 3690, 3890
Bglll 1 4500
Xmal 1 4800
Genomisia klooneja pPG 6,0, pPG 4,0 ja pPG 4,8 manipuloitiin istuttamalla ne E. coli-plasmidin pBR322 ainutlaatuisiin restriktiokohtiin. Klooni pPG 6,0, joka on HindiII-kappale, • 94427 27 kloonattiin vaivattomasti plasmidin pBR322 Hindlll-kohtaan. Klooni pPG 4,0 kloonattiin plasmidin pBR322 EcoRI-PvII-kohtiin ja klooni pPG 4,8 kloonattiin plasmidin pBR322 EcoRI-BamHI-kohtiin (katso esimerkki VI). Näillä plasmideilla muunnetut E.coli-kannat on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois,jotta ne olisivat yleisön käytettävissä, kun tälle hakemukselle on myönnetty patenttioikeudet. Tallennetuille kannoille on annettu seuraa-vat tunnusnumerot:
Genomiluokka Laboratorionimitys Tunnusnumero pPG 6,0 LE392-pPG 6,0 NRRL B-15867 pPG 4,0 LE392-pPG 4,0 NRRL B-15868 pPG 4,8 LE392-pPG 4,8 NRRL B-15869
Kuvissa 7, 8 ja 9 esitetään polypeptidien p76, p72 (alkoholi-oksidaasi) ja p40 säätelevien 3'-alueiden restriktiokartat, vastaavasti. Säätelevät 3'-alueet ovat hyödyllisiä, koska ne säätelevät sen lähetti-RNA:n polyadenylaatiota, kopioitumisen päättymistä sekä luennan päättymistä, joka RNA on koodautuneena edellä esitettyihin nukleotidiketjuihin. Täten, polypeptidin p76 geenistä peräisin oleva säätelevä 3'-alue, joka esitetään kuvassa 7 ja joka on 2,7 kiloemäsparin suuruinen EcoRI-HindiII-kappale, on hyödyllinen siitä syystä, että se säätää sen mRNA-: molekyylin polyadenylaatiota sekä kopioitumisen päättymistä ja luennan päättymistä, joka mRNA koodaa polypeptidiä p76, mikä pätee myöskin kaikkiin muihin sellaisiin mRNA-molekyyleihin, jotka ovat peräisin säätelevän 3'-alueen suhteen ylävirran puolelle istutetusta geenistä. Kuvassa 8a esitetystä p72-geenistä saatu, 0,2 kiloemäsparin suuruinen StuI-PvuII-kappale, .* kuvassa 8b esitetystä p72-geenistä saatu, 0,3 kiloemäsparin suuruinen StuI-Hindlll-kappale, kuvassa 8c esitetystä p72-geenistä saatu, 3,2 kiloemäsparin suuruinen Sall-EcoRI-kappale, sekä kuvassa 9 esitetystä p40-geenistä saatu, 1,9 kiloemäsparin suuruinen PvuII-EcoRI-kappale ovat samalla tavalla hyödyllisiä, ajatellen sekä niitä rakenteellisia geenejä, joihin ne 28 - 94427 ovat liittyneet villityypin‘Pichia pastoris-hiivassa että kaikkia niitä vieraita (eli heterologisia) geenejä, jotka voidaan istuttaa näiden säätelevien 3'-alueiden suhteen ylävirran puolelle.
Koska alkoholioksidaasin geeni kloonissa pPG 4,0 päättyy parin sadan emäsparin etäisyydelle AO-geenin kopioitumisen päättymis- kohdasta, niin kuvassa 8c esitetty ylimääräinen 3'-ketju saatiin seuraavasti: Ensimmäisenä vaiheena oli pilkkoa Pichia-hiivan
kromosomaalinen DNA entsyymeillä ja hybridisoida pilkottu DNA
32 AO-geenistä saadun, 2,0 kiloemäsparin suuruisen, P-merkityn BamHI-Hindlll-kappaleen kanssa Southern'in täplitysmenetelmällä. Koettimena toimivan AO-geenin kanssa hybridisoituvien, Pichia-hiivasta EcoRI-Sall-pilkottujen kappaleiden joukossa oli sellainen 3,2 kiloemäsparin suuruinen kappale, joka koodaa AO-geenin 3'-osaa sekä tämän geenin 3'-pään vieressä olevia ketjuja.
Tämän jälkeen AO-geenin 3'-kappale kloonattiin siten, että Pichia-hiivasta EcoRI-Sali-pilkkomalla saadut, noin 3,2 kiloemäsparin suuruiset DNA-kappaleet otettiin talteen geelieluutiol-la ja nämä kappaleet istutettiin entsyymeillä EcoRI ja Sali pilkottuun plasmidiin pBR322. Lopuksi, yhdistelmäplasmidi pPG
3,2, joka sisältää AO-geenin 3'-kappaleen, tunnistettiin pesäkkeiden hybridisaatiolla käyttäen merkittyä AO-geenin kappaletta : koettimena. Plasmidilla pPG 3,2 muunnettu E. coli-kanta on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center Peoria, Illinois, jotta se olisi yleisön vapaasti käytettävissä, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. Tallennetulle lannalle on annettu tunnusnumeroksi NRRL B-15999. Kuvassa 8c esitetään yhdistelmäplasmidista pPG 3,2 peräisin olevassa, Pichia-hiivan DNA-kappaleessa sijaitsevat restriktioendonukleaa-sien pilkkomiskohdat. Tämä kappale sisältää noin 1,5 kilo-emäsparia, joihin on koodautunut AO:n 3'-osa (kohdasta Sali kohtaan Hindlll) sekä noin 1,7 kiloemäsparin pituisen AO-geenin 3'-ketjun.
Λ (ft.t MU I I I M 1 - 54427 29 cDNA-kloonien tunnusomaiset* piirteet
Pichia pastoris-hiivasta peräisin olevien säädeltävien geenien cDNA-kloonien tunnusomaiset piirteet on myös selvitetty restriktiokartoituksen avulla. Kuvassa 12 esitetään yksityiskohtaisesti p76 cDNA, joka on 1,1 kiloemäsparin suuruinen kappale. Pidettäessä tämän DNA-ketjun 5'-päätä lähtöpisteenä, restriktio-entsyymi XhoI pilkkoo p76-cDNA:n noin 500 emäsparin päässä lähtöpisteestä, Hindi pilkkoo sen noin 950 emäsparin päässä lähtöpisteestä ja EcoRI pilkkoo p76-cDNA:n noin 1050-1100 emäsparin päässä lähtöpisteestä. Kuvassa 12 esitetty cDNA-klooni, sekä kuvissa 13 ja 14 esitetyt cDNA-kloonit on esitetty Pstl-päisinä. Nämä ovat keinotekoisesti aikaansaatuja restriktiokohtia, jotka on muodostettu liittämällä alunperin saatuun täydentävään DNA-molekyyliin G-C, jolloin DNA-kappaleiden kloonaaminen plasmi-diin pBR322 helpottuu. Northern'in hybridisaatiotutkimuksiin sekä polypeptidituotteen kokoon perustuen on arvioitu, että cDNA-klooni pPC 15,0 on p76-mRNA:n epätäydellinen kopio, joka vastaa ainoastaan noin puolta lähetti-RNA:n koko ketjusta.
Kuvassa 13 esitetään p72:n (alkoholioksidaasi) cDNA:n kokonais-restriktiokartta, joka on muodostettu osittain päällekkäin menevistä klooneista pPC 8,3 ja pPC 8,0. Kuten edellä, DNA-ketjun 5'-päätä pidetään lähtöpisteenä. Täten, kun alkoholioksidaasin cDNA:ta käsitellään erilaisilla restriktioentsyymeillä, saa-: daan seuraavan kokoisia kappaleita:
Restriktioentsyymi Pilkkomiskohdat Etäisyys lähtöpisteestä _ _ (emäsparia)_
AsuII 2 20, 420
EcoRV 1 50
BamHI 2 80, 90 , «
Hindi 1 550
Sali 1 820
Bglll 1 820
Kpnl 1 850
Xbal 1 1450 ... RsaI 1 1760 »
Stul 1 2000 30 - 94427
Klooneissa pPC 8,0 ja pPC 8,3 olevan alkoholioksidaasigeenin 3'-pään restriktioentsyymeillä kartoittaminen paljasti, että cDNA-kloonista pPC 8,3 puuttuu suurin piirtein 250 alkoholi-oksidaasin mRNA-ketjun nukleotidiä (kuva 2). Alkoholioksidaa-sin mRNA:n 3'-päässä läsnäolevat ketjut ovat läsnä cDNA-kloonis-sa pPC 8,0, josta noin 500 nukleotidiä menee kloonin pPC 8,3 kanssa päällekkäin.
Kuva 14 esittää restriktiokarttaa polypeptidin p40 cDNA:n tapauksessa, joka cDNA on 1,2 kiloemäsparin suuruinen kappale.
Kun tämän cDNA-kloonin 5'-päätä pidetään lähtöpisteenä, niin entsyymi Sali (ja Hindi) pilkkoo kloonin pPC 6,7 noin 1000 emäksen päässä lähtöpisteestä.
Kukin näistä cDNA-kappaleista on kloonattu plasmidiin pBR322, jolla on tämän jälkeen muunnettu E. coli-bakteeri. Nämä muunnetut kannat on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, jotta ne olisivat yleisön käytettävissä, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. Tallennetuille kannoille on annettu seuraavat tunnusnumerot: cDNA-klooni Laboratoriotunnus Tunnusnumero pPC 15,0 LE392-pPC 15,0 NRRL B-15870 . pPC 8,3 LE392-pPC 8,3 NRRL B-15871
IM
• pPC 8,3 MM294-pPC 8,0 NRRL B-15873 pPC 6,7 LE392-pPC 6,7 NRRL B-15872
Kutakin edellä kuvattua cDNA-kloonia voidaan käyttää koettimena sellaisen kromosomaalisen DNA:n tunnistamiseen ja eristämiseen, joka DNA koodaa ainoastaan silloin hiivan kasvun aikana esiintyvien polypeptidien tuotantoa, kun hiilen ja energian lähteenä on metanoli. Kuten aikaisemmin jo esitettiin, näitä klooneja käytettiin Pichia pastoris-hiivan kromosomaalisten DNA-kappaleiden tunnistamiseen, jotka DNA-kappaleet sisältävät sääteleviä alueita sekä rakenteellista koodaavaa informaatiota 41 · t» 4 lii li t l i M : ! - 94427 31 sellaisille polypeptideille, joita esiintyy ainoastaan silloin, kun P. pastoris-hiivaa kasvatetaan metanolissa. Samalla tavalla näitä cDNA-klooneja voidaan käyttää koettimina muista metanolia assimiloivista hiivoista, kuten esimerkiksi Torulopsis molischiana, Hansenula capsulatum, H. nonfermantes, ja muista vastaavista peräisin olevien analogisten geenien tunnistamiseen ja eristämiseen.
Alkoholioksidaasigeenin yksityiskohtainen analyysi Kloonin pPG 4,0 säätelevän 5'-alueen muut tunnusomaiset piirteet selvitettiin määrittämällä tämän kloonin nukleotidien järjestys ylävirtaan (5') siitä pisteestä, missä proteiinin p72 (alkoholioksidaasi) rakenteellinen informaatio koodautuu. Ensimmäisten 250 nukleotidin, ennen mPNA:n luennan aloituskohtaa (ATG-kodoni), uskotaan olevan;
5'-ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA
ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG
GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA
AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAA
TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA
CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT
ATTCGAAACG-3’.
Ketju C
>· « »·
Kloonin pPG 4,0 promoottoritoiminnon uskotaan sisältyvän tähän nukleotidiemästen ketjuun.
Tämän uuden DNA-kappaleen täydellisemmäksi kuvaamiseksi siitä määritettiin edelleen 301 nukleotidiä, jotka ovat ketjuna C esitetystä ketjusta ylävirran puolella. Ensimmäisten 551 nukleotidin, ennen mRNA:n luennan aloituskohtaa, uskotaan olevan: 1 · 32 - 94427
5'-AATGGCCCAAA ACTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA
ATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTT
TGGTTCGTTG AAATCCTAAC GGCCAGTTGG TCAAAAAGAA
ACTTCCAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATT
GATTGACGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGC
GCAGTCTCTC TATCGCTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGC
CGAAACGCAA ATGGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATT
ATGCATTGTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTG
GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA
ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG
AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA
TTATTAGCTT ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA
CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA
AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3'-.
Ketju D
Ketjussa D olevien muiden nukleotidien (ketjuun C verrattuna) uskotaan saavan aikaan tuntemattomalla mekanismilla sääteleviä lisätoimintoja ketjun C sisältämään promoottorialueeseen. Huomattakoon, että ketju D on ainoastaan esimerkeissä XIV ja XV esitetyn, 1,1 kiloemäsparin suuruisen DNA-kappaleen osittainen DNA-ketju, joka mahdollistaa geenin ilmentymisen säätelyn hiivassa. Saattaa olla niin, että muita sääteleviä toimintoja on koodautuneena siihen 1,1 kiloemäsparin suuruisen DNA-kappaleen ;· osaan, joka on ketjun D ulkopuolella.
' · Tämän uuden, 1,1 kiloemäsparin DNA-kappaleen täydellisemmäksi kuvaamiseksi sen nukleotidiketjua selvitettiin edelleen, jotta esimerkeissä XIV ja XV esitetyn, 1,1 kiloemäsparin suuruisen DNA-kappaleen koko nukleotidiketju voitaisiin kuvata, hiivassa tapahtuvan geenin ilmentymisen säätämisen mahdollistamiseksi.
Tämä nukleotidiketju esitetään ketjuna D's *· 33 - 94427
5'-AGATCTAA CATCCAAAGA CGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCAC
AGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGG
GGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATC
CTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTTAT
GGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAG
GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGC
TTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG
GCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAAT
ATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG
GTTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC
TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA
TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC
AGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG
AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGÄTTAT
GCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGG
GAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA
CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA
AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCAT
TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC
AAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAA
GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG"31.
Ketju D' ··
Alan asiantuntija huomaa, että ketjuihin C ja D verrattuna muita sääteleviä toimintoja voi olla koodautuneena ketjun D' siihen osaan, joka on nukleotidiketjujen C ja D suhteen ylävirran puolella (eli 5'-suuntaan).
Jotta voitaisiin määrittää se, missä alkoholioksidaasigeenin RNA-kopioituminen käynnistyy, tämän genomisesta kloonista pPG 4,0 saadun geenin 5ipään ympärillä olevaa DNA-ketjua verrattiin cDNA-kloonin pPC 8,0 DNA-ketjuun. cDNA-klooni pPC 8,3 sisältää noin 100 nukleotidiä kopioitumattomasta alueesta, joka sijaitsee 5'-alkoholioksidaasigeenin suhteen. Tähän •i ketjuun perustuen syntetoitiin 15-emäksinen oligonukleotidi
N
34 - 94427 (5'-CTTCTCAAGTTGTCG-3'), joka on nukleotidejä -29 - -43 täydentävä, ja jossa luennan alkamiskohdan (ATG-kodoni) A:ta merkitään luvulla +1 ja 5'-suunnassa olevaa G:tä merkitään luvulla -1 (katso esimerkki IX), ja jota käytettiin primeerinä, joka etenee alkoholioksidaasin mRNA-molekyyliä pitkin 5'-pään saavuttaen. Tästä primeerin jatkamiskokeesta saatu cDNA-ketju paljasti Pichia pastoris-hiivan alkoholioksidaasi-mRNA:lle kolme erilaista kopioitumisen käynnistymispistettä. Pääasiallinen kopio alkaa 114 nukleotidin etäisyydeltä luennan käynnis-tyskodonista. Kaksi vähäisempää vaihtoehtoista kopiota alkavat alkoholioksidaasin AUG-kodonista 117 ja 111 nukleotidiä ylävirtaan (51-suuntaan).
Alkoholioksidaasin mRNA:n aloitusta edeltävät 55 nukleotidiä sisältävät oletettavasti Goldber-Hogness-kokonaisuuden (TATAA-kokonaisuus). Tämä ketju TATAAA esiintyy asemassa -40 alkoholioksidaasin mRNA:n pääasiallisen kopion 5'-päästä lukien, ja näin ollen 165 nukleotidiä ylävirtaan tämän proteiinin käynnisty skodon is ta.
Alkoholioksidaasigeenin säätelevän 3'-pään tunnusomaisia piirteitä selvitettiin edelleen määrittämällä 120 nukleotidin järjestys alavirtaan siitä pisteestä, mihin proteiinin p72 (alko-holioksidaasi) rakenteellinen informaatio on koodautunut. Tämä ** ketju esitetään alla ketjuna D'1:
5'-TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG
GCTTCATTTT TGATACTTTT TTATTTGTAA CCTATATAGT
ATAGGATTTT TTTTGTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA-3'
Ketju D'1 p76-geenin yksityiskohtainen analyysi
Kloonin pPG 6,0 säätelevän 5'-alueen tunnusomaisia piirteitä selvitettiin myöskin edelleen määrittämällä tämän kloonin nukleotidiketju ylävirtaan (5'-suuntaan) siitä pisteestä, mihin proteiinin p76 rakenteellinen informaatio on koodautunut. Ensim-mäisten 622 nukleotidin, ennen mRNA-molekyylin luennan alkamiskohtaa (ATG-kodoni), uskotaan olevan: < «H.l Ull I | J at : - l - 94427 35
5' -TT
CACCCATACA ACTATAAACC ‘ TTAGCAATTG AAATAACCCC
AATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA
AACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC
TTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAAC
AGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTT
CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTG
CCGTTCCATC CCTTTGTTGA GCAACACCAT CGTTAGCCAG
TACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA
AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT TAGTGAAGGG
TGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCT
TGTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGC
CAAATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGTTTTT
CTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAAT
ATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACA
ACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTAT
CAAACTATCA AACATCAAAA-3·
Ketju D' ' 1
Kloonin 6,0 promoottoritoiminnon uskotaan sisältyvän tähän nuk-leotidiemästen ketjuun, vaikka alan asiantuntijalle onkin selvää, että ketjut, jotka sijaitsevat ylävirran puolella ketjuna D*'' esitetyistä ketjuista, voivat saada aikaan muita säätäviä ominaisuuksia.
Kloonin pPG 6,0 säätelevän 3'-alueen tunnusomaisia piirteitä selvitettiin enemmän määrittämällä noin 180 nukleotidin järjestys alavirtaan (3'-suuntaan) siitä pisteestä, mihin proteiinin p76 rakenteellinen informaatio on koodautunut. Tämä ketju esitetään alla ketjuna D11''.
5' -GTCAGCAGTG TTTCCTGCCA ÄA.GCCATCAA GAGGACGTAC
ATGCTCTCAT TTTTTGGTTT TCTATGTCCG ACGGGGTTCG
TAAACTGGCT TCCTCCTTTT CCTTTCCTGT TGCATTTTAT
TTGGT.CAAAC AAAACTAGGG TCTTTTCCTA AAACCTTATG
TCAATGGACC TACCACATAG-3'
Ketju D 1 1 ' 1 i 36 - 94427
Ilmentyminen transformoidussa hiivassa
Edellä kuvattuja, tämän keksinnön mukaisia plasmideja voidaan käyttää hiivakannoissa, jotka voidaan transformoida (muuntaa). Hiivassa tapahtuvan geenin ilmentymisen säätäminen tämän keksinnön mukaisilla uusilla DNA-kappaleilla voidaan toteuttaa siten, että muunnetut organismit alistetaan hiililähteen ehtymiselle. Hiililähteen ehtyminen sen jälkeen, kun organismia on kasvatettu erilaisia, sekä kataboliitteja tukahduttavia että kataboliitteja tukahduttamattomia hiililähteitä käyttäen, indusoi tämän keksinnön mukaisten säätelevien alueiden hallitsemien geenituotteiden ilmentymistä. Toinen menetelmä toivotun geenituotteen ilmentymisen saavuttamiseksi sopivassa muunnetussa hiivalajissa on muunnettujen hiivojen kasvattaminen me-tanolissa. Edelleen, muu menetelmä toivotun geenituotteen ilmentymisen indusoimiseksi on kasvattaa muunnettua hiivaa alustalla, joka sisältää kataboliitteja tukahduttamattomia hiili-lähteitä.
. Tämän keksinnön mukaisia sääteleviä alueita voidaan käyttää kaikissa hiivakannoissa tapahtuvaan ilmentymiseen, koska näiden säätelevien alueiden on todettu indusoituvan lukuisissa erilaisissa olosuhteissa. Täten, hiivat, jotka kykenevät kasvamaan metanolissa tai kataboliitteja tukahduttamattomia hiililähteitä käyttäen, voidaan saada tuottamaan suoraan vieraita, ! eli heterologisia polypeptidejä; kun taas hiivat, jotka kykenevät kasvamaan kataboliitteja tukehduttavia hiililähteitä käyttäen, voidaan saada tuottamaan vieraita polypeptidejä alistamalla täten kasvatetut solut olosuhteisiin, joissa hiili-lähde ehtyy.
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä edullisiin, transformoituihin hiivakantoihin kuuluvat mm. seuraavien sukujen edustajat:
Candida,
Kloeckera, : Saccharomyces, 37 ' 94427
Schizosaccharomyces,
Rhodotorula,
Hansenula,
Torulopsis,
Pichia, ja Kluyveromyces.
Näiden sukujen hiivat ovat edullisia/ koska niiden käsitteleminen on turvallista, niiden kasvatusolosuhteet ja muut vastaavat ovat tunnettuja, ja koska ne ovat tuttuja alan asiantuntijoille.
Hiivakantoja, joiden käyttäminen on erityisen edullista tämän keksinnön mukaisen menetelmän eräässä suoritusmuodossa, ovat sellaiset hiivakannat, jotka kykenevät kasvamaan käyttäen meta-nolia hiilen ja energian lähteenään. Hiivat, joiden tiedetään kykenevän kasvamaan metanolia käyttäen, käsittävät mm. seuraa-vien sukujen edustajia:
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Rhodotorula,
Hansenula,
Torulopsis, ja :· Pichia.
t
Koska tämän keksinnön mukaisia sääteleviä alueita voidaan myös indusoida kasvattamalla organismia kataboliitteja tukah- duttamattomia hiililähteitä käyttäen, sekä olosuhteissa, joissa hiililähde ehtyy, niin myöskin sellaiset hiivakannat, jotka kykenevät kasvamaan tällaisissa metanolista poikkeavissa substraa- teissä, kuten: glukoosissa, asetaatissa, glyserolissa, etanolissa, ; laktoosissa, » 3β · 94427 galaktoosissa, fruktoosissa/ sakkaroosissa, sekä muissa vastaavissa, tai mistä tahansa kahdesta tai useammasta edellä mainitusta substraatista muodostuvassa seoksessa, ovat myös käyttökelpoisia tätä keksintöä käytäntöön sovellettaessa. Kun isäntänä toimivaa mikro-organismia kasvatetaan sopivaa, kataboliitteja tukahduttamatonta, metanolista poikkeavaa hiilen lähdettä, kuten esimerkiksi glyserolia ja galaktoosia käyttäen, tai kun tätä isäntäorganismia kasvatetaan sopivaa, kataboliitteja tukahduttavaa hiilen lähdettä, kuten esimerkiksi etanolia, glukoosia ja fruktoosia, käyttäen, jonka jälkeen isäntäorganismi alistetaan olosuhteille, joissa hiililähde ehtyy, niin tällöin voidaan saavuttaa geenituotteen ilmentyminen tämän keksinnön mukaisten säätelevien alueiden hallitsemana.
Lisäksi, koska tämän keksinnön mukaiset säätelevät alueet reagoivat monille kasvuolosuhteille, sekä ilmentymisen indusoin-nin että sen tukahduttamisen suhteen, niin geenituotteen hallittuun ilmentymiseen voidaan päästä tämän keksinnön mukaisten säätelevien alueiden huolehtiessa säätämisestä. Täten,esimerkiksi, soluja voidaan kasvattaa käyttäen sellaista hiilen lähdettä, joka indusoi vieraan geenin ilmentymistä ainoastaan vä-häisessä määrin, jonka jälkeen hiilen lähteeksi vaihdetaan meta-noli, joka indusoi geenin ilmentymistä voimakkaasti. Vaihtoehtoisesti geenin hallittuun ilmentymiseen voidaan myös päästä käyttäen indusoivista ja tukahduttavista hiililähteistä muodostuvia seoksia, kuten esimerkiksi metanoli-glukoosi-seoksia. Edelleen muuna vaihtoehtona on se, että korkeatasois-ta ilmentymistä, joka on saatu aikaan metanolissa kasvattamalla, voidaan pienentää toivotulla tavalla lisäämällä kasvatusalustaan tukahduttavaa hiilen lähdettä, esimerkiksi glukoosia tai etanolia. Alan asiantuntijoille on luonnollisestikin selvää, että myöskin muunlaiset syöttöseosten muunnelmat ja syötettävien substraattien järjestykset ovat mahdollisia.
- 54427 39 ja niillä on huomattavaa säätämisvaikutusta geenin ilmentymisen siihen tasoon, johon päästään tämän keksinnön mukaisilla säätelevillä alueilla.
Erityisen edullinen isäntänä toimiva hiivakanta on mutantti Pichia pastoris GS115, jolta puuttuu kyky tuottaa histidiiniä, joten tämän mutantin genotyyppiä merkitään lyhenteellä his4. GS115 on peräisin Pichia pastoris-kannasta NRRL Y-11430, ja se on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, jotta tämä isäntä olisi vapaasti yleisön käytettävissä, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. Pichia pastorisr-hiivalle GS115 on annettu tunnusnumeroksi NRRL Y-15851 elokuun 31. päivänä 1984. Tämä erityinen isäntä on käyttökelpoinen, koska se on auksotroofinen mutantti, jonka histidiini-reitti on puutteellinen. Tämän isännän muuntaminen sellaisella vektorilla, joka muiden DNA-ketjujen ohella sisältää HIS4-geenin toiminnot, mahdollistaa muunnetun isännän vaivattoman valikoinnin.
Tämän keksinnön mukaisia sääteleviä alueita on myös todettu voitavan käyttää heterologisten geenien tuotteiden hallittuun ilmentymiseen Saccharomyces-sukuisissa hiivakannoissa, joille tunnetaan suuri joukko auksotroofisiä mutantteja. Muita . edullisia isäntänä toimivia hiivakantoja ovat ATCC 24683 (trpl, adel, his2, leul, gall, urai-mutantti), ATCC 24684 (trpl, adel, his7, gall, ural-mutantti), ATCC 32810 (trp5, arg4, his5, lysl, ade2, gal2-mutantti), ATCC 34182 (ade3, his, lys, ura-mutantti), ATCC 34352 (ura2-mutantti), ATCC 34353 (ura 2-mutant-ti), ATCC 38523 (argl, thr1-mutantti), ATCC 38626 (leu2, his4-. mutantti), ATCC 38660 (his4, leu2, thr4-mutantti), ATCC 42243 (ura3-mutantti), ATCC 42336 (adel, his4, thr4-mutantti), ATCC 42403 (arg4, lys7-mutantti), ATCC 42404 (adel, his4, leu2-mu-tantti), ATCC 42564 (ural, his6-mutantti), ATCC 42596 (his4, leu2, lys1-mutantti), ATCC 42957 (his4, leu2, thr4, trp5-mutant-ti) ATCC 42950 (ade-mutantti), ATCC 42951 (ade, leu-mutantti), - 54427 ATCC 44069 (ural-mutantti), ATCC 44070 (leu2, his4-mutantti), ATCC 44222 (his4-mutantti), ATCC 44376 (his4, ade2-mutantti), ATCC 44377 (his4, leul-mutantti ) t sekä muut. vastaavat, ja ne ovat vaivatta alan asiantuntijan käytettävissä.
Alan asiantuntijalle on selvää, etteivät käyttökelpoiset isäntä-kannat rajoitu auksotroofisiin mutantteihin. Täten, käyttökelpoinen menetelmä muunnettujen kantojen havaitsemiseksi ja eristämiseksi saadaan myös aikaan transformoimalla proto-trooppisia kantoja valikoinnin mahdollistavilla positiivisilla merkitsimillä, kuten esimerkiksi antibiootin vastustuskyvyn aikaansaavalla geenillä.
Escherichia coli-bakteeri on myös sopiva isäntä tämän keksinnön mukaisille plasmideille. Alan asiantuntijalle on selvää, että monet E. coli-kannat ovat sopivia isäntiä. Alla esitetään useita tässä työssä käytettyjä kantoja:
Kannan nimitys Tunnusnumero MC1061 Tuntematon LE392 ATCC n:o 33572 MM294 ATCC n:o 33625
Toimenpiteet Pichia pastoris-hiivan muuntamiseksi Pichia pastoris-hiivan muuntamista (transformaatio) ei ole kuvattu aikaisemmin. Kokeelliset toimenpiteet Pichia pastoris-hiivan muuntamiseksi esitetään jäljempänä yksityiskohtaisemmin (esimerkki XII). P. pastoris-hiivalle soveltuvan transformaatio järjestelmän kehittämiseksi auksotroofinen mutantti GS115 (NRRL Y-15851) eristettiin, ja sen histidiinireitti • todettiin puutteelliseksi sen perusteella, että kannassa ei esiinny histidinoli-dehydrogenaasin ilmaistavaa aktiivisuutta.
Mutantti GS11 (NRRL Y-15851) voidaan muuntaa hajottamalla solujen seinämät entsymaattisesti, jolloin saadaan sferoplasteja;
Il S44 41« «i-i-Öl · ; I
- 54427 41 tämän jälkeen nämä sferoplästit sekoitetaan transformoivaan DNA:hän ja tätä seosta inkuboidaan kalsiumionien ja polyetylee-niglykolin läsnäollessa, jonka jälkeen regenerointi toteutetaan selektiivisellä kasvatusalustalla, josta puuttuu histi-diini. Muuntamiseen käytetty DNA käsittää HIS4-geenin, joka puuttuu isännästä, joten ainoastaan transformoidut solut säilyvät elossa käytetyllä selektiivisellä kasvatusalustalla.
Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin eristäminen Tämä HIS4-geeni eristettiin P. pastoris-kannasta NRRL Y-11430 siten, että koko kromosomaalinen DNA pilkottiin osittain entsyymillä Sau3A, mitä seurasi sakkaroosigradienttien läpi toteutettu sentrifugointi. (Katso esimerkki XIII). 5-20 kiloemäsparin suuruiset kappaleet kloonattiin S. cerevisiae- E.coli-sukkulavektorin YEpl3 (ATCC 37115; kuva 33) BamHI-pilkko-miskohtaan, ja sitten niillä transformoitiin E. coli-bakteeri. Arviolta noin 50 000 pesäkettä yhdistettiin, ja koko plasmidi-DNA uutettiin. S. cerevisiae-kannan 5799-4D (NRRL Y-15859), joka on his4ABC-mutantti, sferoplasteja sekoitettiin noin 1 mikrogrammaan Pichia-hiivan YEpl3-DNA-kirjastoon Hinnen et ai. esittämällä (1978) menetelmällä, ja annettiin regeneroitua alustassa, josta puuttui histidiini. Tämän transformaation 3 tuloksena saatiin noin 1 x 10 prototrooppista hiivapesäkettä, kun käytettiin yhteensä 5 x 10^ yksilön suuruista regeneroitu-vien sferoplastien populaatiota. Vertailuna toimivassa rinnak-kaisnäytteessä, jota inkuboitiin ilman DNA:ta, ei saatu pesäkkeitä. 20 His+-pesäkkeestä uutettiin hiivan koko DNA, ja se istutettiin takaisin E. coli-bakteeriin. 17 näistä hiivan DNA-preparaateista tuotti ampisilliinille vastustuskykyisiä pesäkkeitä. Näiden kloonattujen kappaleiden tunnusomaisia piirtei-.· · tä selvitettiin edelleen restriktioentsyyraeillä toteutetun koon määrityksen ja kartoittamisen avulla, sekä sen perusteella, miten ne kykenivät ristisitoutumaan S. cerevisiae-hiivan merkityn HIS-4-kappaleen kanssa, lujuuden pysyessä alhaisena (huuhtelut hybridisaation jälkeen 55°C:n lämpötilassa 2 x SSC-liuoksella), esimerkin XIII pykälässä G esitettyä menetelmää - ?4427 42 käyttäen. Kukin HIS4-kappaleen sisältävä plasmidi sisälsi yhden tai useamman sellaisen kappaleen, joka hybridisoitui S. cerevisiae-hiivan HIS4-geeniin. Eräs tällainen HIS4-kappa-leen sisältävä plasmidi kloonattiin uudestaan, jolloin saatiin HIS4-kappaleen sisältävä plasmidi pYJ8, joka on esitetty kuvassa 25. Plasmidi pYJ8 sisältää plasmidin pBR325 ketjuja, kloram-fenikolin ja ampisilliinin vastustuskyvyn geenit mukaan lukien, sekä Pichia-hiivan HIS4-geenin.
ARG4-geeni eristettiin Pichia pastoris-hiivan kannasta NRRL Y-11430 käyttäen samankaltaista eristysmenetelmää sekä S. cerevisiae-hiivan Arg -kantaa S2072A (arg 4 leu2 trpl gal2; joka oli saatu kantakokoelmasta Yeast Genetic Stock Center, Berkely, CA).
Alan asiantuntijalle on selvää, että myöskin muita Pichia-hii-vasta peräisin olevia merkitsingeenejä voidaan eristää samalla tavalla käyttäen asianmukaisesti puutteellisia S. cerevisiae-kantoja.
Pichia pastoris-hiivan autonomisten replikaatioketjujen eristäminen_ Tämän keksinnön mukaisen vektorin toisen käyttökelpoisen komponentin muodostavat Pichia-hiivasta saadut autonomiset repli-kaatioketjut (PARS), jotka parantavat sekä kannan GS115 (NRRL Y-15851) transformoituni.sen esiintymistiheyttä että plasmidin säilymistä stabiilina, kromosomien ulkopuolisena elementtinä.
Pichia-hiivan ARS-ketjujen löytämiseksi Pichia pastoris-kannasta GS115 (NRRL Y-15851) saatu DNA pilkottiin osittain : entsyymillä TagI, ja 5-10 kiloemäsparin suuruiset kappaleet eristettiin ja kloonattiin plasmidin pYJ8ACla ainoaan Clal-kohtaan (katso kuva 26). Plasmidi-DNA otettiin talteen noin 10 000 Pichia-hiivan His+-pesäkkeestä, ja sitä käytettiin E. coli-bakteerin transformoimiseen. Plasmidit noin 10 000 ampi-silliinille vastustuskykyisestä pesäkkeestä eristettiin, jonka 43 - 94427 jälkeen ne istutettiin takaisin kantaan GS115. 40 tästä ali kirjaston muodostavasta transformaatiosta peräisin olevaa hiivan His+-pesäkettä vedettiin toisistaan erillään selektiiviselle alustalle ja niitä kasvatettiin erillisinä viljelminä selektiivisellä alustalla. Kustakin näistä 40 viljelmästä eristettiin koko DNA-materiaali, ja sillä muunnettiin E. coli-bakteeri. Lisäanalysointia varten valittiin kaksi plasmidia pYA63 (PARSI) ja pYA90 (PARS2), joiden hiiva-DNA-preparaatit tuottivat ampisilliinille parhaiten vastustuskykyisiä E. coli-pesäkkeitä. Esiintymistiheys näillä molemmilla plasmideilla toteutetussa Pichia pastoris-hiivan GS115 (NRRL Y-15851) transformaatiossa oli erittäin korkea, ja kumpikin niistä sisälsi istutettua vierasta DNA:ta.
Jotta voitaisiin mitata ARS-ketjujen kyky säilyttää plasmidit autonomisina elementteinä Pichia-hiivassa, kummallakin plasmi-dilla muunnettujen hiivasolujen viljelmiä kasvatettiin selektiivisellä alustalla, ja niistä otettiin näytteitä tietyin väliajoin. Plasmidiketjujen tila soluissa määritettiin hybridi-soimalla pilkkomaton hiivan DNA radioaktiivisesti merkittyyn plasmidiin pBR325 Southern*in menetelmällä. Plasmidit pYA63 ja pYA90 säilyivät Pichia-hiivassa vähintään 10 sukupolven ajan selektiivisessä alustassa (mutta ne olivat integroituneet 50 sukupolven aikana).
• ' · ·
Yksi Pichia-hiivan oletetuista autonomisista replikaatioket-juista (PARSI) kloonattiin useisiin muihin Pichia-hiivan vek-toreihin, jotta voitaisiin tutkia sen kykyä säilyttää transformoiva DNA autonomisena elementtinä. Plasmidit pYJ30 (kuva 27) ja pBPfl (kuva 34) esiintyivät edelleen autonomisina : elementteinä 20 sukupolven jälkeen, kun soluja oli kasvatettu selektiivisellä alustalla (His"), ja ne esiintyivät lukuisina kopioina solua kohden. Plasmidilla pYJ30 transformoitujen solujen Southern'in täplitysanalyysi osoittaa noin 10 kopiota solua kohden.
44 - 54427
Sitten määritettiin se, saagatko plasmidit pSA0H5 (katso kuva 18) ja pT76H4 (katso kuva 22b), jotka sisältävät PARSl-ketjun plasmidien pYJ30 ja pBFfl, vastaavasti, avulla, aikaan samanlaista stabiilisuutta kuin ne plasmidit, joista ne ovat peräisin. Nämä vektorit sisältäviä soluja kasvatettiin valikoivissa olosuhteissa (His ) noin 50 sukupolven ajan glukoosin läsnäollessa. Tämän jälkeen solut siirrettiin epäselektiivisiin olosuhteisiin (His+), ja prototrofisuuden katoamista seurattiin. Näiden plasmidien stabiilisuus oli verrannollinen plasmidin pYJ30 stabiilisuuteen, ja His-prototrofisuus katosi samoin nopeasti, kun solut siirrettiin epäselektiiviselle alustalle. Näin ollen oletetaan, että autonomisen replikaatio-ketjun PARSI sisältävillä plasmideilla toteutetuissa kokeissa saadaan autonomisesta plasmidi-DNA:sta peräisin olevan geeni-ilmentymisen tuloksia.
Uudet, β-galaktosidaasigeenin sisältävät muodosteet Jotta voitaisiin osoittaa tämän keksinnön mukaisten säätelevien alueiden kyky säätää proteiinituotteiden tuotantoa, valmistettiin uudet DNA-muodosteet. Täten E. coli-bakteerin IacZ-geeni sijoitettiin useisiin plasmideihin, polypeptidiä p72 (alkoholioksidaasi) tai p76 koodaavien geenien säätelevien alueiden vaikutuksen alaisuuteen. Plasmidien pSAOHl, pSA0H5, pSAOHlO, pTAFH.85, pT76Hl, pT76H2, pT76H3 sekä pT76H4 valmis- • taminen kuvataan esimerkissä XIV.
• ·
Vaikka tämän keksinnön mukaisen, säätelevästä alueesta ja 8-galaktosidaasigeenistä muodostuvan yhteensulautuman istuttaminen isäntinä toimiviin hiivasoluihin kuvataankin oheisessa julkaisussa tapahtuvaksi siten, että plasmideja käytetään is- * · * · tuttamisen apuvälineinä, niin kuitenkin alan asiantuntijalle on selvää, ettei tämän säätelevästä alueesta ja rakenteellisesta geenistä muodostuvan yhteensulautuman istuttaminen soluun edellytä välttämättä plasmidin käyttöä. Mitä tahansa hiivassa säilyvää molekyyliä voidaan käyttää. Täten, tämän keksinnön mukaisia, säätelevästä alueesta ja rakenteellisesta
Λ iH* 41(1 ( I I HI I
• 94427 45 geenistä koostuvia muodoste'ita voidaan manipuloida muidenkin vektoreiden, kuin plasmidien, avulla. Vaihtoehtoisesti, tämä rakenteellisesta geenistä ja säätelevästä alueesta koostuva muodoste voidaan integroida isäntänä toimivan hiiva-solun kromosomiin.
Alan asiantuntijalle on myöskin selvää, etteivät tämän keksinnön tavoitteet rajoitu β-galaktosidaasin tuottamiseen ohessa julkaistujen säätelevien alueiden säätelyn alaisuudessa. Erilaisten, tämän keksinnön mukaisten säätelevien alueiden säätelyn alaisuudessa tuotettavien polypeptidien lukumäärää ja tyyppiä rajoittaa ainoastaan tämän julkaisun lukijan mielikuvitus. Olemassa on lukuisia menetelmiä sellaisten DNA-ketjujen valmistamiseksi, jotka DNA-ketjut koodaavat toivotunlaisia poly-peptidejä. Esimerkiksi eri pituisia oligonukleotidejä voidaan syntetoida tunnettuja menetelmiä käyttäen. Useita tällaisia oligonukleotidejä voidaan liittää yhteen, aina niissä esiintyvien emästen spesifisten parinmuodostusominaisuuksien mukaisesti, jolloin saadaan pitempiä, kaksoisjuosteisia molekyylejä. Tämän kaksoisjuosteisen molekyylin komponentteinä olevat oligonukleotidit voidaan liittää toisiinsa (ligatoida) entsyymillä DNA-ligaasi. Vaihtoehtoisesti DNA-molekyylejä, joilla on toivottu koodaava ketju, voidaan syntetoida käyttämällä entsyymiä käänteistranskriptaasi, jolloin toivottua polypeptidiä vastaavaa lähetti-RNA:ta käytetään käänteis-transkriptaasi-entsyymin toiminnan mallina. Edelleen muuna mahdollisuutena on genomisten DNA-kappaleiden kloonaaminen, jonka jälkeen seurataan sitä, esiintyykö toivotun tuotteen suoraa ilmentymistä.
:*: Toivottua polypeptidiä koodaava DNA-ketju voidaan muuntaa sää televästä alueesta ja rakenteellisesta geenistä koostuvan muodosteen valmistamiseksi useita eri menetelmiä käyttäen. Esimerkiksi, edellä kuvatusti valmistetun DNA-ketjun päät voidaan ligatoida entsyymillä DNA-ligaasi sellaisiin lyhyisiin, kaksoisjuosteisiin DNA-molekyyleihin, jotka sisältävät spesifisten restriktio-endonukleaasien tunnistaman nukleotidiketjun, •94427 46 ja jotka ovat niin kutsuttuja liittäjämolekyylejä. Tällaisten molekyylien hajottamisella spesifisiä restriktio-endonukleaa-seja käyttäen, ja tämän jälkeen toteutetulla ligaatiolla saadaan aikaan sellaisia päitä, jotka vastaavat valmistetun DNA-ketjun päissä sijaitsevaa, tietyn restriktio-endonukleaasin tunnistamiskohtaa.
Kolme erityistä, tässä julkaisussa valmistettua, säätelevästä alueesta ja β-galaktosidaasigeenistä koostuvaa muodostetta kuvataan kuvissa 15 ja 16 esitettyjen restriktiokarttojen, ja niistä saatavan tiedon avulla. Kuvassa 15a oleva restriktio-kartta esittää muodostetta, joka sisältää 0,85 kiloemäsparin suuruisen, kloonin pPG 6,0 säätelevästä 5'-alueesta saadun, Hindlll-BamHI-osan, sekä E. coli-bakteerista saadun lacZ-geenin (esitetty 3,6 kiloemäsparin suuruinen, BamHI-NruI-kappale). Tämä sama muodoste on läsnä kussakin plasmidissa pTAFH.85, pT76Hl ja pT76H2, jotka esitetään yksityiskohtaisemmin jäljempänä. (Katso esimerkki XIV). Kuvassa 15b oleva restriktiokartta esittää muodostetta, joka käsittää 1,3 kiloemäsparin suuruisen, kloonin pPG 6,0 säätelevästä 5'-alueesta saadun Hindlll-EcoRI-osan sekä E.coli-bakteerin IacZ-geenin.
Tämä sama muodoste on läsnä kaikissa plasmideissa pT76Ul, pT76H3 ja pT6H4, jotka kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä (katso esimerkki XIV).
• ·
Kuva 16 on restriktiokartta sellaisesta muodosteesta, joka käsittää 1,1 kiloemäsparin suuruisen, kloonin pPG 4,0 säätelevästä 5'-alueesta peräisin olevan EcoRI-BamHI-kappaleen sekä E. coli-bakteerista saadun IacZ-geenin. Tämä muodoste on läsnä kaikissa plasmideissa pSAOHl, pSA0H5 ja pSAOHlO, jotka kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä (katso esimerkki XIV).
Plasmidi pSAOHl on kuvattu kaavamaisesti kuvassa 17. Sen lisäksi, että tämä plasmidi sisältää kuvassa 16 esitetyn, säätelevästä alueesta ja B-galaktosidaasigeenistä koostuvan muodosteen, sen esitetään sisältävän myös: 47 - 54-427 £ (a) pBR322-ketjuja, muun imlassa Amp -geenin; (b) Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin; (c) S. cerevisiae-hiivan 2 mikronin rengasmaisen DNA:n; sekä (d) S. cerevisiae-hiivan epäjatkuvan URA3 geenin.
Näin ollen tällä plasmidilla voidaan muuntaa E. coli- ja hiiva-isäntiä, joissa se kykenee replikoituinaan. Valikoitavissa olevat merkitsimet ovat läsnä DNA:n manipuloimiseksi joko E. coli-tai hiivaisännissä.
Plasmidi pSA0H5 on kuvattu kaavamaisesti kuvassa 18. Tämä plasmidi on samanlainen kuin edellä kuvattu pSAOHl, paitsi että siitä puuttuu S. cerevisiae-hiivan 2 mikronin suuruinen DNA-rengas, sekä tietty osa Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin viereisestä DNA:sta, kun taas siihen on lisätty Pichia pastoris-hiivan autonomisesti replikoituva ketju (PARSI plasmidista pYA63).
Plasmidi pSAOHlO on kuvattu kaavamaisesti kuvassa 19. Tämä plasmidi sisältää: (a) säätelevästä alueesta ja β-galaktosidaasigeenistä muodostuvan yhteensulautuman; (b) plasmidin pBR325 ketjuj-a, mukaan lukien ne geenit, jotka saavat aikaan tetrasykliinin vastustuskyvyn, kloramfenikolin
R R
vastustuskyvyn sekä ampisilliinin vastustuskyvyn (tet , cam J) ja amp , vastaavasti); sekä (c) S. cerevisiae-hiivan geenin HIS4 (saatu plasmidista pYA2, kuten jäljempänä esitetään).
Plasmidit pTAFH.85, pt76Hl ja pT76H2 ovat analogisia edellä kuvatun kolmen plasmidin kanssa, paitsi että käytetty, säätele-• - vän alueen ja β-galaktosidaasigeenin muodostama yhteensulautuma on kuvassa 15a esitetyn mukainen (eikä kuvassa 16 esitetyn yhteensulautuman mukainen).
Plasmidit pT76H3 ja pT76H4 ovat analogisia plasmidien pSAOHl ja pSA0H5 kanssa, vastaavasti, paitsi, että käytetty, säätelevän 48 - 94427 alueen ja β-galaktosidaasigeenin muodostama yhteensulautuma oli kuvassa 15b esitetyn mukainen (eikä kuvassa 16 esitetyn mukainen yhteensulautuma).
Plasmidi pTAFH.85 esitetään kaavamaisesti kuvassa 20, ja se käsittää: (a) säätelevästä alueesta ja 8-galaktosidaasigeenistä muodostuvan yhteensulauman, joka esitetään kuvassa 15a; p (b) plasmidin pBR322-ketjuja, sisältäen amp -geenin; (c) Pichia pastoris HIS4-geenin (d) S. cerevisiae-hiivan 2 mikronin DNA-renkaan; sekä (e) S. cerevisiae-hiivasta peräisin olevan epäjatkuvan URA3-geenin.
Plasmidi pT76Hl esitetään kaavamaisesti kuvassa 21, ja se käsittää: (a) säätelevästä alueesta ja β-galaktosidaasigeenistä muodostuvan yhteensulauman, joka esitetään kuvassa 15a; p (b) plasmidin pBR322-ketjuja, sisältäen amp -geenin; ja (c) Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin, sekä autonomisesti replikoituvan ketjun (PARSI).
Plasmidi pT76H2 esitetään kaavamaisesti kuvassa 22 ja se käsittää:
·· I
(a) säätelevästä alueesta ja β-galaktosidaasigeenistä muodostuvan yhteensulautuman, joka esitetään kuvassa 15a; (b) plasmidin pBR325 ketjuja, sisältäen tetrasykliinin vastustuskyvyn, kloramfenikolin vastustuskyvyn ja ampisilliinin vastustuskyvyn aikaansaavat geenit; sekä ϊ (c) S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenin.
Plasmidi pT76H3 on esitetty kaavamaisesti kuvassa 22a ja se käsittää: (a) säätelevästä alueesta ja β-galaktosidaasigeenistä muodostuvan yhteensulautuman, joka on esitetty kuvassa 15b; 49 - 94427 « «
D
(b) plasmidin pBR322 ketjuja, sisältäen amp -geenin; (c) Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin; (d) S. cerevisiae-hiivan 2 mikronin suuruisen DNA-renkaan; sekä (e) S. cerevisiae-hiivasta saadun epäjatkuvan URA3-geenin.
Plasmidi pT76H4 esitetään kaavamaisesti kuvassa 22b, ja se käsittää: (2) säätelevästä alueesta ja 0-galaktosidaasigeenistä muodostuvan yhteensulauman, joka on esitetty kuvassa 15b; (b) plasmidin pBR322-ketjuja, sisältäen amp -geenin; (c) Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin; sekä (d) Pichia pastoris-hiivan autonomisen replikaatioketjun (PARSI).
β-galaktosidaasln ilmentyminen hiivassa
Pichia pastoris-hiivan kanta GS115 (NRRL Y-15851) muunnettiin edellä kuvatuilla uusilla, β-galaktosidaasigeenin sisältävillä muodosteilla. Moni näistä tuloksena olevista hiivakannoista on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, ja niille on annettu seuraavat tunnusnumerot:
Isäntä Plasmidi Muunnetun kannan tunnusnumero GS115 pSAOHl NRRL Y-15852 •l· GS115 pSA0H5 NRRL Y-15853 GS115 pSAOHIO NRRL Y-15854 GS115 pTAFH.85 NRRL Y-15855 GS115 pT76Hl NRRL Y-15856 GS115 pT76H2 NRRL Y-15857 Näitä uusia, β-galaktosidaasigeenin sisältämiä muodosteita käytettiin myöskin E. coli-bakteerin muuntamiseen. Nämä muunnetut bakteerikannat on myöskin tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois,jotta ne olisivat yleisön käytettävissä, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. Muunnetuille kannoille on annettu seuraavat tunnusnumerot: 50 -94427
Isäntä Plasmidi Muunnetun kannan tunnusnumero MC1061 pSAOHl NRRL B-15861 MC1061 pSA0H5 NRRL B-15862 MC1061 pSAOHIO NRRL B-15863 MC1061 pTAFH.85 NRRL B-15864 MC1061 pT76Hl NRRL B-15865 MC1061 pT76H2 NRRL B-15866 MC1061 pTA013 NRRL B-15875 MC1061 pT76H3 NRRL B-18000 MC1061 pT76H4 NRRL B-180C1 MC1G61 pT76Ul NRRL B-18002
Ensimmäisellä kahdeksalla edellä kuvatulla plasmidilla, jotka sisältävät alkoholioksidaasin ja polypeptidin p76 säätelevästä alueesta ja IacZ-geenistä muodostuvia, tämän keksinnön mukaisia yhteensulautumia, muunnettuja Pichia pastoris-hiivan GS115 (NRRL Y-15851) soluja kasvatettiin stationaarivaiheeseen saakka vähimmäisalustalla, johon oli lisätty biotiinia sekä glukoosia hiilen lähteeksi. Kun solut olivat saavuttaneet stationaari-vaiheen, ne siirrettiin vähimmäisalustalle, jota oli täydennetty biotiinilla ja metanolilla, jotka toimivat hiilen lähteenä. Sen jälkeen, kun solut olivat kasvaneet noin 3-5 sukupolvea 30°C:n lämpötilassa, ne siirrettiin uudelle vähimmäisalustalle, jota oli täydennetty biotiinilla, ja soluja kasvatet-tiin glukoosin tai metanolin toimiessa hiilen lähteenä. Näistä viljemistä otettiin tietyillä hetkillä näytteitä, ja niistä analysoitiin β-galaktosidaasin ja alkoholioksidaasin läsnäolo menetelmillä, jotka on esitetty esimerkeissä VII ja XV.
Todettiin, että ne solut, joiden kasvattamisessa oli käytetty glukoosia hiilen lähteenä, eivät tuottaneet ilmaistavia määriä β-galaktosidaasia tai alkoholioksidaasia, kun taas niissä soluissa, joiden kasvattamisessa ainoana hiilen lähteenä käytettiin metanolia, ilmentyi merkittäviä määriä sekä alkoholioksidaasia että β-galaktosidaasia. Samoin todettiin, että kun glukoosilla kasvatetut solut alistettiin olosuhteisiin, joissa hiililähde ehtyi, niin tällöin myöskin niissä ilmentyi mitattavia - 94427 51 määriä alkoholioksidaasia säkä β-galaktosidaasia. Näin ollen on selvää, että tämän keksinnön mukaiset säätelevät alueet reagoivat sekä metanolin läsnäoloon että niihin olosuhteisiin, joissa hiilen lähde ehtyy.
Jotta saataisiin varmennetuksi se, että tämän keksinnön mukaiset säätelevät alueet reagoivat kasvulle, jossa käytetty hiilen lähde on kataboliitteja tukahduttamatonta, sekä olosuhteille, joissa hiilen lähde ehtyy, alkoholioksidaasin säätelevän alueen sisältävää plasmidia pTA013, sekä polypeptidin p76 säätelevän alueen sisältävää plasmidia pT76Ul, käytettiin metanolia käyttämättömän hiivakannan, Saccharomyces cerevisiae, muuntamiseen.
Yksi käytetyistä transformoiduista kannoista, jonka laboratorio-tunnus on SEY2102-pTA0l3, on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, jotta se olisi yleisön käytettävissä, kun tälle hakemukselle myönnetään patenttioikeudet. Tälle muunnetulle kannalle on annettu tunnusnumeroksi NRRL Y-15858. Saccharomyces cerevisiae-hiivoja NRRL Y-15858 ja SEY2102-pT76Ul kasvatettiin glukoosilla, fruktoosilla, etanolilla, glyserolilla ja galaktoosilla noin viiden sukupolven ajan, jonka jälkeen ne alistettiin olosuhteisiin, joissa hiililähde ehtyy, β-galaktosidaasin tapauksessa tavallisesti viiden sukupolven jälkeen käytetty koe (katso esimerkki XV) osoitti, että glyserolilla ja galaktoosilla kasva-.. tetut solut tuottivat suuria määriä β-galaktosidaasia, kun taas glukoosilla ja fruktoosilla kasvatetut solut eivät tuottaneet juurikaan β-galaktosidaasia. Kun β-galaktosidaasia määritettiin sen jälkeen, kun solut olivat olleet 6 tuntia oloissa, joissa hiililähde oli ehtynyt, niin tällöin havaittiin, että glukoosilla ja fruktoosilla kasvatetut, transformoidut organismit tuotti-i vat kohtuullisia määriä β-galaktosidaasia, ja että glyserolilla ja galaktoosilla kasvatetut solut tuottivat olennaisia määriä β-galaktosidaasia. Näin ollen, tämän keksinnön mukaiset säätelevät alueet kykenevät säätämään proteiinituotteiden tuotantoa geneettisesti hyvin erilaisissa hiivaisännissä, ja niiden käyttö ei rajoitu metanolia hyödyntäviin kein töihin.
52 - 94427
Esimerkit
Seuraavissa esimerkeissä käytettiin puskureita ja liuoksia, joilla oli seuraava koostumus: 1 M Tris-puskuri 121,1 g Tris-emästä 800 millilitrassa vettä; pH asetetaan toivottuun arvoon lisäämällä HCl:n väkevää (35 %) vesiliuosta; liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan ennen kuin pH säädetään lopullisesti, liuos laimennetaan lopulliseen, 1 litran tilavuuteen.
S-puskuri 1,5 M sorbitolia 0,04 M natriumfosfaatti- puskurissa, pH 6,6.
PK-puskuri 0,14 M NaCl 1 % dodekyylisulfaatti (SDS)
0,01 M EDTA
0,05 M Tris-puskurissa (pH 8,4).
ETS-puskuri 10 mM EDTA
0,2 % SDS
0,01 M Tris-puskurissa (pH 7,4).
TE-puskuri 1,0 mM EDTA 0,01 M Tris-puskurissa (pH
7,4).
. . SSC 0,15 M NaCl • 15 mM natriumsitraatti, asetettu pH-arvoon 7,0 NaOH:11a.
TAE 40 mM etikkahappoa 5 mM EDTA, 0,02 M Tris-puskurissa (pH 8,3).
PBS (fosfaatilla 10 mM natriumfosfaattia (pH 7,0) s’i puskuroitu suolaliuos) 0,15 M NaCl
Laemmli-lataus- 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8)
puskuri 2 * SDS
10 % glyserolia 5 % 2-merkaptoetanolia 0,01 % bromifenolisinistä - 94427 53 RIPA-puskuri 1 % NP4o (Sigma) 1 % natriumdeoksikolaatti 0,1 % SDS PSB-liuoksessa.
20 x SSPE 20 mM EDTA
0,16 M NaOH
0,2 M NaH2P04 x H20 3,6 M NaCl pH asetettu arvoon 7,0 NaOH:11a Denhardt'in liuos 5 g Ficoll (50x) 5 g polyvinyylipyrrolidonia 5 g naudan seerumin albumiinia (BSA; Pentax-fraktio V) laimennettu 500 millilitran kokonaistilavuuteen vedellä
Ennen hybridisoi- 5x SSPE
mistä käytettävä 5x Denhardt*in liuos puskuri 50 % formamidi, josta ionit on poistettu
0,2 % SDS
200 yug/ml hajotettua ja denaturoitua sillin sperman DNA:ta LB (Luria-Bertani)- 5 g Bacto-tryptonia alusta 5 g Bacto-hiivauutetta *: 2,5 g NaCl 1 litrassa vettä, pH asetettu arvoon 7,5 NaOH:11a YPD-alusta 1 % Bacto-hiivauutetta 2 % Bacto-peptonia : 2 % dekstroosia I · SD-alusta 6,75 g hiivan typpipitoista perusravinnetta, joka ei sisällä aminohappoja (Yeast Nitrogen Base, DIFCO) 2 % dekstroosia 1 litrassa vettä »· « · 94427 54 SED 1 M sorbitolia
25 mM EDTA 50 mM DTT
SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia 0,168 g EDTA 50 ml H20 pH asetettu arvoon 5,8 HCl:llä
CaS 1 M sorbitolia 10 mM CaCl2 steriloidaan suodattamalla PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykolia 3350 10 mM CaCl2 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) steriloidaan suodattamalla SOS 1 M sorbitolia 0,3x YPD-alustaa 10 mM CaCl2
Formamidiväriseos 0,1 % ksyleenikylenolia FF
0,2 % bromifenolisinistä 10 mM EDTA
95 % formamidia, josta ionit on poistettu
Pintageeli 76,8 g ureaa
24 ml akryyliamidin varastoliuosta 8 ml ΙΟχ TBE
laimennetaan lopulliseen, 160 millilitran tilavuuteen
Akryyliamidin 38 g akryyliamidi varastoliuos 2 g bis(N,N*metyleenibisakryyliamidi) vettä lisätään, kunnes kokonaistilavuudeksi saadaan 100 ml
Pohjageeli 14,4 g ureaa 3,0 g sakkaroosia
.. 7,5 ml lOx TBE
4,5 ml akryyliamidin varastoliuosta -94427 55 0,3 ml 'bromifenolisinisen liuosta (0,01 g/ml) vettä lisätään, kunnes kokonaistilavuudeksi saadaan 30 ml
Ennen hybridisointia 50 % formamidi käytettävä puskuri 0,75 % M NaCl hybridien valikoin- 0,1 M Tris, pH 7,4
tia varten 0,008 M EDTA
0,5 * SDS
200 ^ug/ml kaniinin maksan tRNA:ta (Sigma) 0-5 M NETS-puskuri 0,5 M NaCl
10 mM EDTA
10 mM TRIS, pH 7,4
0,2 % SDS
10X RT-puskuri 500 mM NaCl 340 mM TRIS, pH 8,3 60 mM MgCl2 50 mM DTT (ditiotreitoli) laimea RT 4 ^ul H20 1 yul 10X RT-puskuria 5 ^ul käänteistranskriptaasia, 15 U/^ul (Life Sciences, Inc.) . dideoksi:
dd ATP 0,49 mM
dd CTP 0,1165 mM
dd GTP 0,369 mM
dd TTP 0,82 mM
dNTP-seos 0,625 mM dGTP
: 0,625 mM dATP
0,625 mM TTP
Chase 1,125 mM dATP
1.125 mM dCTP
1.125 mM dGTP
1.125 mM TTP
IX RT-puskurissa • 94427 56
Mikäli toisin ei mainita, edellä esitetyt liuokset ovat käytettyjä peruspitoisuuksia (lx). Mikäli esimerkeissä käytettiin tästä poikkeavia pitoisuuksia, niin tämä merkitään siten, että liuoksen yhteydessä on mainittu peruspitoisuuden (lx) monin-kerta.
Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä, jotka tarkoittavat: EDTA etyleenidiamiini-tetraetikkahappo TEMED N,N,N',N1-tetrametyleenidiamiini DTT ditiotreitoli BSA naudan seerumin albumiini
EtBr etidiumbromidi
Ci Curie dATP deoksiadenosiini-trifosfaatti dGTP deoksiguanosiini-trifosfaatti TTP tymidiini-trifosfaatti dCTP deoksisytidiini-trifosfaatti dXTP "yleinen" deoksitrifosfaattinukleotidi oligo(dT)]_2-l8 Lähde: Collaborative Research, Inc.
Zyraolyase- entsyymi 60 OOO Lähde: Miles Laboratories
Useissa rutiininomaisesti toteutetuissa toimenpiteissä käytettiin tavanomaisia menetelmiä, jotka kuvataan ohessa.
Sentrifugointien pituus ja niissä käytetty pyörimisnopeus ovat sellaiset, että tuloksena saadaan kirkas supernatantti. Yleisesti ottaen hiivasolujen sentrifugoiminen toteutetaan vähintään nopeudella 1500 g, ja sentrifugoinnin pituus on vähintään 5 minuuttia.
Fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoholin seoksilla toteutetuissa nukleiinihappojen uutoissa nukleiinihappoja sisältävä liuos saatetaan kosketuksiin yhtä suuren tilavuuden kanssa seosta, joka käsittää fenolia, kloroformia ja isoamyylialko- • holia suhteessa 50:48:2, vastaavasti. Kloroformin ja iso-• · - 94427 57 amyylialkoholin seoksilla tapahtuvissa uutoissa käsiteltävä liuos saatetaan kosketuksiin yhtä suuren tilavuuden kanssa seosta, joka käsittää kloroformia ja isoamyylialkoholia suhteessa 48:2.
Kun esimerkissä esitetään, että geeli, suodatin, jne. pestään tai upotetaan johonkin tiettyyn liuokseen, niin tämä tarkoittaa sitä, että koko geeli, suodatin, tai vastaava upotettiin sopivassa astiassa (kulho, malja, ampulli, jne.) tähän liuokseen, jotta geelin, suodattimen tai muun vastaavan koko pinta saataisiin kosketuksiin tämän tietyn liuoksen kanssa.
Nukleiinihappojen saostaminen etanolilla toteutetaan siten, että ensin nukleiinihappoja sisältävän liuoksen suolapitoisuus asetetaan sopivaksi, jonka jälkeen tämä liuos saatetaan kosketuksiin kylmän etanolin kaksi kertaa suuremman tilavuuden kanssa.
Esimerkki I
Hiivasolujen kasvattaminen ja preparointi
Pichia pastoris-hiivaa NRRL Y-11430 kasvatettiin olosuhteissa, joissa hiilen saantia oli rajoitettu, ja kasvattaminen toteutettiin jatkuvana viljelmänä 30°C:n lämpötilassa, metanolin tai etanolin toimiessa ainoana hiilen lähteenä, käyttäen vähimmäisvaatimukset täyttävää, IMl-suolojen alustaa, jonka Wegner kuvaa • US-patenttijulkaisussa 4 414 329. Tämä IMl-vähimmäisalusta sisältää alustan litraa kohden 36 mM K^PO^, 23 mM (NH^^SO^, 2 mM MgS04, 6,7 mM KC1, 0,7 mM CaCl2, 0,2 ^uM CUS04*5H20, 1,25 yUM KI, 4,5 ^um MnS04, 2 ^uM Na2Mo04, 0,75 ^uM H3B03, 17,5 yUM ZnS04, 44,5 ^uM FeCl2 sekä 1,6 ^uM biotiinia. Meta-nolilla kasvatetut solut kasvatettiin solutiheyteen 140 g/1 * (kuivapaino), viiveajan ollessa noin 12 tuntia. Etanolilla kasvatetut solut kasvatettiin solutiheyteen 90 g/1, viiveajan ollessa noin 11,5 tuntia. Kun metanolia tai etanolia syötettiin fermentoriin, niin tällöin käytettiin syöttöliuoksia, jotka sisälsivät 20 % ja 45 % alkoholia, vastaavasti.
·· < 58 - 94427
Kymmenen grammaa fermentorissa kasvatettuja Pichia pastoris-hiivan soluja otettiin talteen sentrifugoimalla, ja ne suspen-
O
doitiin uudestaan suurin piirtein pitoisuudeksi 10 solua/ml 0,1 M Tris-puskuriin (pH 8,0), joka sisälsi 1 % 2-merkaptoeta-nolia. Soluja inkuboitiin 5-10 minuuttia 37°C:n lämpötilassa, ja ne otettiin talteen sentrifugoimalla. Solukasauma pestiin kertaalleen 30 millilitralla S-puskuria, ja ne suspendoitiin uudestaan 5 millilitraan S-puskuria solugrammaa kohden. Tähän solususpensioon lisättiin Zymolyase-entsyymiä (Miles Biochemicals) siten, että lopullinen pitoisuus oli 500 ^ug/ml. Soluja inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 20 minuuttia, jonka jälkeen ne sentrifugoitiin; supernatantti kaadettiin pois, ja solukasauma otettiin talteen. Tämä solukasauma jäädytettiin nestemäisessä typessä, ja sitä säilytettiin -70°C:n lämpötilassa myöhempää käyttöä varten.
Esimerkki II
Hiivan RNA:n eristäminen
Solun koko RNA valmistettiin siten, että esimerkissä 1 kuvatulla tavalla saatu, pakastettu solukasauma jauhettiin huhmareessa, jonka jälkeen jäätynyttä solukasaumaa hajotettiin edelleen 2-5 minuutin ajan Waring-tehdsekoittajassa nestemäisen typen läsnäollessa. Näitä jauhettuja soluja lisättiin PK-puskuriin siten, että puskuria oli 7,5 ml solugrammaa kohden. Tähän : solususpensioon lisättiin entsyymiä Proteinase K (Boehringer
Mannheim) lopulliseksi pitoisuudeksi 400 ^ul/ml, ja tätä suspensiota inkuboitiin huoneenj lämpötilassa 10 minuutin ajan.
Sitten tätä seosta uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyyli-alkoholia sisältävällä seoksella, ja tämän jälkeen sitä uutettiin kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella. Nukleiinihapot saostettiin siten, että tämä liuos tehtiin NaCl:in suhteen 0,25-molaariseksi, ja siihen lisättiin etanolia.
Saatu kasauma suspendoitiin uudestaan mahdollisimman pieneen määrään ETS-puskuria, eli sellaiseen tilavuuteen puskuria, joka riitti nukleiinihappojen liuottamiseen; yleisesti ottaen noin 100 ^ug - 1 mg DNA:ta liuosmillilitraa kohden. Tätä liuosta . 94427 59 uutettiin uudestaan fenolia-, kloroformia ja isoamyylialkoho-lia sisältävällä seoksella, sitten kloroformia ja isoamyylial-koholia sisältävällä seoksella, jonka jälkeen saostaminen toteutettiin etanolilla.
Nukleiinihapot liuotettiin uudestaan mahdollisimman pieneen määrään TE-puskuria. Tässä liuoksessa läsnäolevaa RNA:ta rikastettiin joko siten, että liuos sentrifugoitiin tilavuudeltaan 4 millilitran CsCl-kerroksen läpi (1 g CsCl/ml, 1 mM EDTA 10 mM Tris-puskurissa (pH 7,4)),tai saostamalla siten, että liuos tehtiin 2-molaariseksi LiCl-suolan suhteen, pitäen tätä liuosta 4-8°C:n lämpötilassa yön yli, ja ottamalla saostuma talteen sentrifugoimalla. Poly A+ RNA valikoitiin tästä liuoksesta affiniteettikromatografisesti oligo(dT)selluloosapylväitä käyttäen. Yleisesti ottaen, kun RNA:n kokonaismäärä oli 5-10 mg, niin kromatografiässä käytettiin 0,25 g oligo(dT)selluloosaa, tYYPPi 3 (Collaborative Research). 0,25 g oligo(dT)selluloosaa lietettiin 2 millilitraan ETS-puskuria, ja kaadettiin pieneen, silikonilla pinnoitettuun lasikolonniin. Tämä oligo(dT)selluloosasta muodostuva kolonni pestiin siten, että kolonnin päälle laitettiin 10 ml 0,1 M NaOH:ta, ja tämän pesuliuoksen annettiin virrata oligo(dT)selluloosan muodostaman matriisin läpi. Sitten tämä oligo(dT)selluloosa pestiin samalla tavalla, käyttäen 10 ml ETS-puskuria, ja se pestiin lopuksi 10 millilitralla 0,5 M NETS-puskuria.
Koko RNA (5-10 mg) suspendoitiin uudestaan ETS-puskuriin pitoisuudeksi, joka on korkeintaan noin 10 mg/ml, se laitettiin 65°C:n vesihauteeseen 2 minuutiksi, ja sitten se laitettiin välittömästi jäihin. Tämän jälkeen tämän RNA-liuoksen annettiin i i lämmetä huoneen lämpötilaanpa siihen lisättiin 5 M NaCl- varastoliuosta, jolloin lopullinen suolapitoisuus tässä RNA-liuoksessa oli 0,5 M NaCl. Tuloksena oleva RNA-liuos kaadettiin käyttövalmiin, oligo(dT)selluloosasta muodostuvan kolonnin ' päälle, ja sen annettiin virrata hitaasti kolonnin läpi, virtausnopeuden ollessa noin 1 pisara viidessä sekunnissa. Ko-lonnin alaosasta virtaava materiaali kerättiin putkeen, ja se . 94427 60 kaadettiin uudestaan kolonnin yläosaan. Kolonnin pohjalta talteen saatu materiaali kaadettiin kolonnin huippuun toiseen kertaan, jolloin tämä RNA-liuos kulki oligo(dT)selluloosasta muodostuvan kolonnin läpi yhteensä kolme kertaa. Sen jälkeen, kun materiaali oli kulkenut kolonnin läpi viimeisen kerran, se otettiin talteen ja merkittiin poly A-RNA:ksi, eli ei-poly A RNAiksi. Tämän jälkeen kolonni huuhdottiin 30 millilitralla 0,5 M NETS-liuosta, ja lopuksi poly A+ RNA eluoitiin kolonnista siten, että kolonnin yläosaan kaadettiin 5 ml ETS-puskuria, ja tämän puskurin annettiin virrata kolonnin läpi hitaasti, ja poly A+ RNA-fraktio kerättiin kolonnin alaosasta virtaavana, 5 ml suuruisena fraktiona. Olettaen, että tämä poly A+ RNA-fraktio ei sisältänyt lainkaan NaCl:ia, tämän fraktion NaCl-pitoisuus asetettiin 0,25 molaariseksi, ja RNA saostettiin etanolilla.
Esimerkki III
cDNA-kirjaston muodostaminen Täydentävän DNA:n (komplementti-DNA:n) kloonit syntetoitiin seuraavasti: 10 yug esimerkissä II kuvatulla tavalla valmistettua poly A+ RNA:ta suspendoitiin uudestaan 7 mikrolitraan vettä, ja siihen lisättiin CH^HgOHrta siten, että lopullinen pitoisuus oli 2,7 mM, jonka jälkeen tätä seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia. cDNA:n ensimmäistä juostetta synte-toitiin 42°C:n lämpötilassa 15 minuuttia 50 mikrolitrassa liuosta, joka sisälsi 50 mM Tris (pH 8,3 42°C:n lämpötilassa), 10 mM MgCl2, 30 mM 2-merkaptoetanolia, 70 mM KC1, 500 ^uM kutakin dATP, dGTP ja TTP, 200 ^uM dCTP, 25 ^ug/ml oligo(dT), 60 ^ug/ml aktinomysiiniä D, 25 yksikköä RNAsiinia (Biotec, Inc.), 25 yuCi a*-"*2P dCTP (32,5 pikomoolia) ja 120 yksikköä käänteis-• transkriptaasia (Life Sciences Inc.). Tätä reaktioseosta inkuboitiin lisäksi 37°C:n lämpötilassa 15 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä tähän seokseen 2 ^ul 0,5 M EDTA-liuosta sekä 0,5 ^ul 20 % SDS-liuosta. Reaktioseos tehtiin 0,3-molaa-riseksi NaOH:n suhteen ja sitä inkuboitiin 65°C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen reaktioseos neutraloitiin
‘I SB i 3ilI: 1 I I St I
6i - 94427 lisäämällä siihen 10 ^ul 1 M Tris-puskuria (pH 7,4), ja tekemällä reaktioseos 0,21 molaariseksi HCl:n suhteen. Reaktioseos-ta uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, sitten sitä uutettiin kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä liuoksella, ja lopuksi se käsiteltiin kromatografisesti käyttäen Sephadex G50-kolonnia TE-puskurissa. Radioaktiivinen, yksijuosteinen cDNA yhdistettiin yhdeksi fraktioksi ja tiivistettiin 100 mikrolitraksi joko butanolilla uuttamalla tai haihduttamalla vakuumissa sentrifugoiden. Tämä yksijuosteinen cDNA saostettiin etanolilla tästä tiivistetystä liuoksesta, cDNA otettiin talteen sentrifugoimalla, ja se sus-pendoitiin uudestaan 100 mikrolitraan vettä.
Tämä yksijuosteisen cDNA:n vesiliuos tehtiin 2,5 molaariseksi ammoniumasetaatin suhteen, saostettiin etanolilla, otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudestaan 20 mikrolitraan vettä. Tämän yksijuosteisen DNA:n liuos laimennettiin lopulliseen 50 mikrolitran tilavuuteen 50 mM kaliumfosfaattipus-kurilla (pH 7,4), joka sisälsi 5 mM MgC^, 1 mM 2-merkaptoeta-
nolia, 250 ,uM kutakin seuraavista:. dATP, dGTP ja TTP, 125 ,uM
'32 dCTP, 25 yuCi a- P-dCTP (32,5 pikomoolia) ja 8 yksikköä
Klenow-fragmenttia DNA Poli (New England Biolabs). Tuloksena olevaa reaktioseosta inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa yhden tunnin ajan, jolloin yksijuosteisen cDNA:n täydentävä (komplement-•j ti) toinen DNA-juoste saatiin syntetoiduksi. Reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 2 ^ul 0,5 M EDTA-liuosta. Tämä kaksijuosteinen DNA uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, sitten kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, ja käsiteltiin kromatografisesta käyttäen Sephadex G50-kolonnia TE-puskurissa. Kaksi- * juosteisen cDNA:n sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja näin saatu fraktio tiivistettiin ja saostettiin yksijuosteisen cDNA:n tapauksessa esitetysti.
Etanolilla toteutetun lopullisen saostamisen, sekä sentrifugoin-nilla toteutetun, kaksijuosteisen cDNA:n talteenoton jälkeen * · « • 94427 62 saatu kasauma suspendoitiin uudestaan 20-25 mikrolitraan vettä, jonka jälkeen se laimennettiin lopulliseen 50 mikro-litran tilavuuteen 50 mM Tris-puskurilla (pH 8,3 42°C:ssa), joka sisälsi 10 mM MgCl2, 30 mM 2-merkaptoetanolia, 70 mM KC1, 500 ^uM dXTP sekä 150 yksikköä käänteistranskriptaasia.
Tuloksena olevaa liuosta inkuboitiin 42°C:n lämpötilassa 15 minuutin ajan, jotta cDNA:n toisen juosteen synteesin täydellisyys saataisiin taatuksi. Reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 2 ^ul 0,5 M EDTA-liuosta, ja seos haihdutettiin ja saostettiin yksijuosteisen cDNA:n yhteydessä esitetyllä tavalla.
Kaksijuosteisesta cDNA:sta muodostuva kasauma suspendoitiin uudestaan 42 mikrolitraan vettä ja liuos laimennettiin lopulliseen, 47 mikrolitran tilavuuteen lisäämällä siihen 5 ^ul varasto-liuosta, joka sisälsi 2,8 M NaCl, 200 mM NaOAc ja 45 mM ZnSO^, jonka jälkeen sen pH asetettiin arvoon 4,5 HCl:ia käyttäen (22°C:n lämpötilassa). "Hiusneulasilmukan" (hairpin loop) pilkkomiseksi kolme erillistä reaktiota toteutettiin käyttäen S^-nukleaa-sin (Sigma) kolmea eri pitoisuutta. Reaktioseokseen lisättiin S^-nukleaasia 1 yksikkö, 10 yksikköä tai 100 yksikköä siten, että reaktiotilavuudeksi saatiin 50 ^ul, ja reaktioseosta inkuboitiin 22°C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 2 ^ul 0,5 M EDTA-liuosta ja 2,67 ^ul 2 M Tris-emästä. Tämän jälkeen kantajaksi lisättiin 6 ^ug kaniinin maksan tRNA:ta, ja reaktioseos tiivistettiin ja saostettiin edellä esitetyllä tavalla, paitsi että DNA-kasaumat suspendoitiin uudestaan TE-puskuriin, eikä veteen. Lopullisen saostamisen jälkeen tämä kasauma suspendoitiin uudestaan 20 mikrolitraan TE-puskuria, ja se saatettiin lopulliseen 50 mikrolitran tilavuuteen terminaalitransferaasin puskurilla (BRL), joka sisälsi ί 10 pikomoolia a-32P-dCTP, 2 ^uM dCTP ja 21 yksikköä terminaali-transferaasia (Ratliff Biochem). Tuloksena olevaa liuosta inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 30 minuuttia, jotta kaksijuosteisen cDNA:n 3'-0H-päähän saataisiin liitetyksi poly d(C)-häntä.
Tämä reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 5 ^ul 0,5 M EDTA-liuosta, seos uutettiin, käsiteltiin kromatografisesti, ** ja sitä säilytettiin etanolilla saatuna saostumana.
63 9442 7 Tämä kaksoisjuosteinen, d(C)-rhännän käsittävä cDNA liitettiin joko uudestaan suoraan poly d(G)-hännän käsittävään, Pstl-kohdastaan avattuun plasmidiin pBR322, tai se fraktioitiin ensin eri kokoisiksi kappaleiksi Sepharose CL4B-200-kolonnilla (25 mikrolitran fraktioita). Fraktioihin jakamattoman kirjaston tapauksessa 150 ng kaksoisjuosteista, poly d(C)-hännän käsittävää cDNA:ta liitettiin 900 nanogrammaan d(G)-hännän käsittävää, Pstl-kohdastaan avattua plasmidia pBR322 180 mikrolitrassa 10 mM Tris-puskuria (pH 7,4), joka on 0,1 molaarista NaCl:n ja 1 millimolaarista EDTA-liuoksen suhteen. Fraktioihin jaetun kirjaston kukin 25 mikrolitran suuruinen fraktio liitettiin 125 nanogrammaan poly d(G)-hännän käsittävää plasmidia pBR322, 50 mikrolitran lopullisessa tilavuudessa samaa, edellä kuvattua liittävää seosta. Liittämisreaktioita inkuboitiin 65°C:n lämpötilassa 3 minuuttia, sitten 42°C:ssa 2 tuntia, jonka jälkeen reaktioseosten annettiin jäähtyä hitaasti huoneen lämpötilaan.
Tämä plasmidiin liitetty cDNA-kirjasto istutettiin sopivaan E. coli-bakteerikantaan LE392 (ATCC 33572) , joka oli käsitelty seuraavasti: Kannan LE392 siirrostetta kasvatettiin yön yli 37°C:n lämpötilassa 2x LB-alustalla. Viisi ml tätä yön yli kasvatettua viljelmää siirrostettiin 200 millilitraan tuoretta 2x LB-alustaa, ja sitä kasvatettiin niin kauan, että optinen tiheys .· 37°C:n lämpötilassa oli 0,2-0,3. Viljelmä laitettiin jäihin 10 minuutiksi ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla 4°C:n lämpötilassa. S.olukasauma suspendoitiin uudestaan 80 millilitraan jääkylmää 0,1 M CaClj-liuosta, ja niitä inkuboitiin 25 minuuttia 4°C:ssa. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla 4°C:n lämpötilassa, ja solukasauma suspendoitiin uudestaan 2 millilitraan jääkylmää 0,1 M CaC^-liuosta, ja niitä inkuboitiin vähintään kaksi tuntia 4°C:n lämpötilassa ennen käyttöä. Transformointiin käytettiin 200 ^ul täten käsiteltyjä soluja liittävän seoksen 50 mikrolitraa kohden. Täten käsitellyt solut ja DNA yhdistettiin, ja niitä inkuboitiin noin 4°C:n lämpötilassa 10 minuutin ajan, jonka jälkeen niitä inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 5 minuuttia, ja lopuksi ne laitettiin jäihin 64 . 94427 10 minuutiksi. Tähän transformaatioseokseen lisättiin yhtä suuri tilavuus 2x LB-alustaa, ja tätä seosta inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 45 minuuttia. Transformoidut solut mal-jattiin, 250 ^ul/malja, 150 millimetrin suuruisille, 2x LB-maljoille, jotka sisälsivät 15 ^ug/ml tetrasykliiniä. Maljoja inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 24 tuntia ja niitä säilytettiin 4°C:n lämpötilassa.
Suodatinkopiot valmistettiin painamalla nitroselluloosasuodat-timia sen alkuperäisen suodattimen päälle, jolla alkuperäisellä suodattimena pesäkkeet oli nostettu pois maljalta. Näitä suodatinkopioita inkuboitiin 2x LB-Tet-maljoilla (15 ^ug/ml tetrasykliiniä). Suodattamilla olevat pesäkkeet esikäsiteltiin koetintä varten siten, että suodattimet siirrettiin 2x LB-Tet-mal joille, jotka sisälsivät 200 ^ug/ml kloramfenikolia, suodattimia inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa vähintään 12 tuntia, jonka jälkeen pesäkkeet hajotettiin antamalla näiden suodattimien kellua 10 minuuttia sellaisessa vesiliuoksessa, joka on 1,5 M NaClsn ja 0,5 M Na0H:n suhteen. Sitten suodattimet neutraloitiin antamalla niiden uida 15 minuuttia sellaisessa vesiliuoksessa, joka on 1,5 M NaCl:n ja 0,5 M Tris-puskurin (pH 7,4) suhteen, jonka jälkeen tämä neutralointi toistettiin vielä kerran. Suodattimet kuivattiin ilmassa, ja lopuksi ne kuivattiin vakuumissa 2 tunnin ajan 70°C:n lämpötilassa.
Esimerkki IV
Pesäkkeiden hybridisointi
Vakuumissa kuivattuja nitroselluloosasuodattimia, jotka sisälsivät cDNA-kirjaston (valmistettu edellisessä esimerkissä kuvatusta) esihybridisoitiin 42°C:n lämpötilassa 5 tuntia esihybri-j·’ disaation puskurissa. Suodattimet poistettiin esihybridisaa- tion puskurista ja niitä hangattiin varovasti käsineellä suojatulla kädellä 5x SSPE-liuoksessa solujätteen poistamiseksi. Suodattimet laitettiin hybridisaatiopuskuriin (sama puskuri kuin esihybridisaatiopuskuri, paitsi että se oli lx Denhardt'in liuos). Suodattimia hybridisoitiin 17 tunnin ajan 42°C:n - 94427 65 32 6 lämpötilassa joko P-merkityn yksijuosteisen cDNA:n (10 tuikahdusta minuutissa/ml) kanssa tai päästään merkityn poly A+ RNA:n kanssa. Hybridisoinnin jälkeen suodattimet huuhdottiin nopeasti 2x SSPE-liuoksessa 22°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen ne huuhdottiin kahdesti 0,1 x SSPE-liuoksessa 65°C:n lämpötilassa, tämän huuhtelun kestäessä molemmilla kerroilla 10 minuuttia.
Poly A+ mRNA-molekyylin pään merkitseminen toteutettiin lisäämällä 2 ^ug poly A+ mRNA:ta 50 mikrolitraan liuosta, joka sisälsi 50 M Tris-puskuria (pH 9,5), jonka jälkeen tätä seosta kuu- , menuettiin 100°C:ssa kolme minuuttia, ja sitten se jäähdytettiin nopeasti jäissä. Tämä RNA-liuos laimennettiin lopulliseen tilavuuteensa, 200 yul, ja se tehtiin 50 miHimolaariseksi Tris- puskurin (pH 9,5), 10 millimolaariseksi MgCl0:n ja 5 mM DTTtn Δ 32 suhteen, ja lisäksi siihen lisättiin 50 pikomoolia P-a-ATP:ta. Seokseen lisättiin 10 yksikköä T^-polynukleotidikinaasia (Boehringer Mannheim), ja seosta inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa tunnin ajan. Kinasoiva reaktio pysäytettiin lisäämällä reaktio-seokseen 10 yul 0,5 M EDTA-liuosta, seos uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, ja se käsiteltiin kromatografisesti Sephadex G50-kolonnilla vapaaksi jääneen radioaktiivisen merkkiaineen poistamiseksi.
Esimerkki V
Hybridisoinnit Northern'in menetelmällä
Kahdesta viiteen ^,ug poly A+ mRNA:ta lämmitettiin 5 minuutin ajan 65°C:n lämpötilassa 10 mM natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,4), joka sisälsi 50 % formamidia, 2,2 M formaldehydiä sekä 0,5 mM EDTA-liuosta. Tuloksena oleva liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, ja siihen lisättiin asianmukainen määrä (yleensä noin 0,2-osa käsiteltävän näytteen tilavuudesta) 5x näytepusku-ria (0,5 % SDS, 0,025 % bromifenolisinistä, 25 % glyserolia, 25 mM EDTA-liuosta). Näytteet laitettiin 1,5-prosenttiselle agaroosigeelille, joka oli esikäsitelty 10 mM natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,4), joka puskuri sisälsi 1,1 M formaldehydiä, ja näytteet käsiteltiin elektroforeettisesti tässä samassa 66 . 94427 puskurissa. Geeli värjättiih akridiinioranssilla (33 ^ug/ml) 10 mM natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,4), väri poistettiin upottamalla geeli tähän samaan puskuriin 10 minuutiksi, jonka jälkeen geeli upotettiin lOx SSPE-liuokseen vähintään 10 minuutiksi, ja RNA siirrettiin nitroselluloosalle esimerkissä VI kuvatulla tavalla.
Esimerkki VI
Genomisen DNA:n ja kloonien eristäminen
Pichia-hiivan genominen DNA eristettiin käyttämällä esimerkissä 11 Pichia-hiivan SNA:n eristämiseksi kuvattua menetelmää. Nukleiinihapoista muodostuva kasauma suspendoitiin uudestaan mahdollisimman pieneen tilavuuteen TE-puskuria, ja sitä inku-boitiin RNaasin A, 20 ^ug/ml, kanssa 30 minuuttia 37°C:n lämpötilassa. Liuos tehtiin 0,14 molaariseksi NaClrn suhteen, ja sitä käsiteltiin proteinaasilla K, 200 yug/ml, 15 minuutin ajan 22°C:n lämpötilassa. Tuloksena olevaa liuosta uutettiin ensin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, ja sitten kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, ja lopuksi se saostettiin etanolilla. Saostunut DNA suspendoitiin uudestaan mahdollisimman pieneen määrään TE-puskuria, ja se sentrifugoitiin DNA-liuoksen kirkastamiseksi.
Kymmenen ^ug edellisessä kappaleessa kuvatulla tavalla valmistettua Pichia-hiivan genomista DNA;ta pilkottiin eri restriktio- . j · entsyymeillä (BRL) ja käsiteltiin elektroforeettisesti 1 % agaroosigeelillä, joka sisälsi TAE:tä. Geelissä olevat DNA-kappaleet denaturoitiin upottamalla geeli 20 minuutiksi 1,5 M NaCl-liuokseen, joka oli 0,5-molaarista Na0H:n suhteen. Geeli neutraloitiin upottamalla se 20 minuutiksi 1,5 M NaCl-liuokseen, *: joka oli 0,5 M Tris-puskurin (pH 7,4) suhteen. Ennen siirtä mistä geeli upotettiin vähintään 5 minuutiksi lOx SSPE-liuok-seen. Nitroselluloosaliuska leikattiin geelin kokoiseksi, kasteltiin vedellä, ja upotettiin lyhyesti lOx SSPE-liuokseen.
Tämä suodatin laitettiin geelin päälle, joka geeli oli puolestaan laitettu parafilmikappaleen päälle. Nitroselluloosan päälle laitettiin pala Whatman-suodatinpaperia sekä pino 67 p / /rs*7 - >^,z/ paperipyyhkeitä DNA:n vetämiseksi pois geelistä ja sen siirtämiseksi nitroselluloosalle. Paperipinon päälle laitettiin paino siirron helpottamiseksi. DNA:n annettiin siirtyä tällä tavalla vähintään 3 tuntia. Siirtämisen jälkeen suodatin upotettiin lyhyesti 5x SSPE-puskuriin, kuivattiin ilmassa, sekä.kuivattiin vakuumissa 70°C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan. Täydentävät genomiset kappaleet tunnistettiin hybridisoimalla ne avoimen fosfodiesterisillan kohdalta luettuihin ("nick-translaatio") cDNA-klooneihin pPC 8,0, pPC 6,4 ja pPC 15,0, käyttäen samaa, esimerkissä IV kuvattua esihybridisaatiota, hybridisaatiota sekä samoja huuhtelupuskureita.
200 ng näitä cDNA-klooneja alistettiin nick-translaatioreak-tioon 90 minuutin ajaksi 14°C:n lämpötilassa, 30 mikrolitras-sa liuosta, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), 10 mM MgSO^, 100 ^uM DTT, 50 ^ug/ml BSA, 20 ,uM kutakin seuraa-vista: dGTP, TTP ja dATP, 31,25 pikomoolia ^P-ot-dCTP (3200
Ci/mmol, NEN), 2 yksikköä E. coli-bakteerin DNA-PolI:tä (BRL), sekä 0,02 ng DNaasiI:tä. Reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 1 yUl 0,5 M EDTA-liuosta ja 1 ^ul 20 % SDS-liuosta. Merkitty DNA-liuos saatettiin NaOH:n suhteen lopulliseen pitoisuuteensa, 0,3 M, ja se laitettiin kiehuvaan vesihauteeseen 3 minuutiksi. Tämä seos käsiteltiin kromatografisesti Sephadex G50-kolonnilla. Merkityn DNA-:n sisältävät fraktiot yhdistettiin, ominaisaktiivisuus määritettiin, ja tätä koetinta käy-tettiin hybridisaatiokokeissa.
cDNA-koettimiin hybridisoituneet genomiset kappaleet eristettiin pilkkomalla 200 ^ug Pichia-hiivan genomista DNA:ta eri rest-riktioentsyymeillä (BRL), ja käsittelemällä täten pilkottu ;·. DNA elektroforeettisesti 1 % agaroosigeelillä TAE-puskurissa.
- « ·
Asianmukaisen kokoiset kappaleet sisältävä vyöhyke leikattiin irti agaroosigeelistä, DNA eluoitiin sähköisesti, sen annettiin kulkea Elutip-kolonnin (Schleicher ja Schuell) läpi, ja saostettiin etanolilla.
68 - 94427 Sähköisesti eluoidut kappaleet suspendoitiin uudestaan veteen ja 200 ng kappaleita ligatoitiin 500 ng plasmidia pBR322, joka oli katkaistu sopivasta restriktiokohdastaan, ja defosfory-loitiin, mikäli välttämätöntä. Tämä ligatointireaktio toteutettiin 300 mikrolitrassa 66 mM Tris-puskuria (pH 7,4), joka sisälsi 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,4 mM ATP, 25 ^ug/ml BSA ja 40-80 yksikköä T4-DNA-ligaasia, jonka jälkeen tätä seosta inku-boitiin 4°C:n lämpötilassa 24 tuntia. Tätä ligaatioseosta käytettiin suoraan asianmukaisesti käsiteltyjen E. coli-bakteerin LE392 solujen transformoimiseen. Solut käsiteltiin asianmukaisella tavalla ja transformointi suoritettiin esimerkissä III esitetysti. Kolmen transformaation sarja suoritettiin käyttämällä 10, 40 ja 100 ng plasmidia pBR322 (istute mukaanlukien), ja kussakin transformaatiossa käytettiin 100 ^ul asianmukaisesti esikäsiteltyjä soluja. Solut maljättiin esimerkissä III kuvatulla tavalla, paitsi että antibiootilla valikointi tapahtui 50 ^ug/ml ampisilliiniä käyttäen. Kloonit siirrettiin nitroselluloosalle, kopioitiin (replikoitiin), ja ne käsiteltiin hybridisointia varten esimerkissä III kuvatulla tavalla. Suodattimet varustettiin koettimilla käyttäen sopivalla tavalla avoimen fosfodiesterisillan kohdalta (nick-translaatio) luettua cDNA-kappaletta koettimena. Maljalle vetämällä puhdistettuja pesäkkeitä, jotka olivat positiivisia hybridisaation suhteen, käytettiin muiden plasmidien valmis-, tamiseen seuraavasti:
Plasmidin sisältäviä E. coli-bakteereita LE392 kasvatettiin 50 ^ul/ml ampisilliinia sisältävällä lx LB-alustalla optisen tiheyden arvoon 0°β0ο = ja laajentumisen annettiin edetä yön yli lisäämällä soluihin kloramfenikolia lopulliseen pitoi-suuteen 200 ^ug/ml. Solut huuhdottiin liuoksessa, joka sisälsi 0,8 % NaCl, 20 mM Tris-puskuria (pH 8,0), 20 mM EDTA, jonka jälkeen niitä käsiteltiin lysotsomilla 25-prosenttisessa sakkaroosissa, joka sisälsi 50 mM Tris-puskuria (pH 7,4), 20 mM EDTA-liuosta sekä 450 ^ug/ml lysotsomia. Hajoaminen saatiin aikaan lisäämällä soluihin 5 M NaCl:ia siten, että seos oli - 94427 69 lopulta 2,0 M NaCl:n suhteen, jonka jälkeen soluihin lisättiin yhtä suuri tilavuus 0,2 % Triton X-100- ja 40 mM EDTA-liuosta. Tämä preparaatti kirkastettiin sentrifugoimalla sitä nopeudella 20 000 rpm 45 minuutin ajan. Sitten supernatanttia uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, edelleen kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella ja se saostettiin etanolilla. Kasauma suspendoitiin uudestaan TE-puskuriin, käsiteltiin RNaasilla A, uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, ja sitten kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella. Kiinteätä CsCl:a lisättiin siten, että sen lopullinen pitoisuus oli 800 ^ug/rnl, ja EtBr:a lisättiin siten, että sen lopullinen pitoisuus oli 1 mg/ml. Tuloksena olevaa liuosta sentrifugoitiin Vti-roottorissa nopeudella 49 000 rpm 18-20 tunnin ajan 20°C:n lämpötilassa.
Plasmidivyöhyke tehtiin näkyväksi UV-fluoresenssin avulla, ja se otettiin ulos putkesta neulan ja männän avulla. Tämä plas-midiliuos uutettiin neljään kertaan n-butanolilla, ja se saostettiin etanolilla -20°C:n lämpötilassa. Etanolilla seostaminen toistettiin vähintään kahdesti kaiken CsClrn poistamiseksi. Plasmidia säilytettiin -20°C:n lämpötilassa etanolisaostumana.
Esimerkki VII
. Alkoholioksidaasin puhdistaminen
Esimerkissä I esitetyllä tavalla metanolilla kasvatetuista Pichia pastoris-hiivan soluista peräisin olevat proteiininäytteet valmistettiin hajottamalla hiivasolut, jonka jälkeen saatu materiaali kirkastettiin sentrifugoimalla solujätteen poistamiseksi, seuraavasti: Pieni määrä fermentorista ulosvirtaavasta materiaalista otettiin talteen ja sen pH asetettiin arvoon 7,5 ammoniumhydroksidilla, ja se homogenoitiin Dyno-Mill-homogeni-saattörilla, malli KDL, käyttäen 0,6 litran suuruista astiaa, ja homogenisaattorin toiminnan ollessa jatkuvaa, ja sen toimiessa 30°C:n lämpötilassa hihnayhdistelmällä n:o 3, ja virtauksen ollessa 20-30 ml/h. Homogenisaattorissa olevat ..94427 70 helmet olivat lyijyttömästä ‘lasista valmistettuja helmiä, joiden halkaisija oli 0,3-0,5 mm. Tuloksena olevaa homogenaattia sent-rifugoitiin 5°C:n lämpötilassa nopeudella 20 000 g 30 minuuttia, jolloin saatiin soluja sisältämätöntä supernatanttia.
Tästä soluja sisältämättömästä supernatantista otettiin kuusi 130 ml suuruista annosta, ja ne laitettiin selluloosa-asetaat-tia oleviin dialyysipusseihin, ja niitä dialysoitiin 5°C:n lämpötilassa tislatun veden noin 8 litraa vastaan. Kussakin pussissa oleva vesifaasi dekantoitiin 4 vuorokauden kuluttua.
Pusseihin jäävä kiintoaines muodostui kahdenlaisesta materiaalista. Ylempi, ohut, valkoinen kerros poistettiin varovaisesti ja heitettiin pois. Alla ollut kiintoaines oli ruskeankeltaista ja se oli kiteistä alkoholioksidaasia. Osa tästä kiteisestä alkoholioksidaasista liuotettiin tislattuun veteen (jonka tilavuus oli noin 10-kertainen kiintoaineeseen verrattuna) , ja väri-peroksidaasimenetelmällä toteutetussa kokeessa todettiin aktiivisuudeksi 94 EU/ml. Tämän alkoholioksidaasin ominaisaktiivisuus oli 10,4 EU/mg proteiinia.
Edellä kuvatusta dialyysistä saatu kiteinen saostuma dialysoitiin 0,05 M kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,5) vastaan, ja laitettiin tällä samalla puskurilla tasapainotettuun, 2 x 200 senttimetrin kokoiseen Sephacryl 200-kolonniin (Pharmacia). 3,5 mil- lilitran fraktioita kerättiin virtausnopeudella 10 ml/h, ja . * * niistä määritettiin alkoholioksidaasin aktiivisuus.
Alkoholioksidaasin aktiivisuus metanolin kanssa tapahtuvana reaktiona määritettiin seuraavaa koemenetelmää käyttäen (väri-peroksidaasimenetelmä). Värin ja puskurin seos valmistettiin sekoittamalla keskenään 0,1 ml o-dianisidiiniliuosta (1 paino-% o-dianisidiinia vedessä) ja 12 ml ilmastettua 0,1 M natrium-fosfaattipuskuria (pH 7,5). Kokeessa käytettävä seos valmistettiin sekoittamalla keskenään 2,5 ml värin ja puskurin seosta, 50 ^ul metanolia, 10 ^ul peroksidaasin liuosta (1 mg piparjuuresta saatua peroksidaasia. Sigma, tyyppi II) sekä 25 ^,ul ii ftii.i iti» l i i ai ' r - 94427 71 alkoholioksidaasiliuosta. ‘Tätä koeseosta pidettiin 25°C:n lämpötilassa 4 x 1 x 1 cm kokoisessa kyvetissä, ja värin aiheuttamaa absorbanssin suurentumista seurattiin aallonpituudella 460 nm 2-4 minuutin ajan. Entsyymin aktiivisuus laskettiin kaavalla
Aktiivisuus (mikromoolia/min/ml tai entsyymiyksikköä (EU)/ml) = ΔΑ/min x 11,5 missä 11,5 on tekijä, joka on saatu H202:n tunnetuilla määrillä valmistetulta standardikäyrältä, ja ΔΑ on absorbanssin muuttuminen kokeen kestäessä.
Kunkin fraktion kokonaisproteiinista otettiin yhteensä 0,1 ^ug, josta määritettiin alkoholioksidaasin pitoisuus geelielektrofo-reettisesti SDS-polyakryyliamidilla (12 %).
Esimerkki VIII
DNA:n ja proteiinin ketjujen selvittäminen toteutettiin di-deoksiketjun pidentämismenetelmällä käyttäen bakteriofaagia M13 (Sanger et ai., 1980) tai kemiallisen muuntamisen menetelmällä (Maxam ja Gilbert, 1980). Alkoholioksidaasigeenin 5'-päätä vastaavat DNA-kappaleet istutettiin M13mp8- ja Ml3mp9-vektoreihin, tai niiden päät merkittiin kemiallisen muuntamisen menetelmää varten käyttäen tässä alueessa saatavilla olevia ** restriktioentsyymien kohtia.
Kloonista pPG 4,0 saatu 710 emäsparin Hindlll/Sall-kappale merkittiin päästään Maxam-Gilbert-menetelmällä tapahtuvaa ketjun määritystä varten siten että 33 ^ug tätä plasmidia pilkottiin ensin entsyymillä Hindlll. Reaktioseosta uutettiin fenolia, ", kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, sitten * kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, ja se saostettiin etanolilla. DNA otettiin talteen sentrifugoimal-la ja se suspendoitiin uudestaan 31 mikrolitraan vettä. Reaktio-seokseen lisättiin 100 ^uCi ^Ρ-α-dCTP:tä (3200 Ci/mmol) ja 2 yksikköä Klenow-kappaletta DNA-PolI, jolloin sen lopullinen 72 · 94427 tilavuus oli 50 ^ul, ja se Sisälsi 400 ^uM dATP, 400 ^uM dGTP, 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM MgSO^ ja 1 mM DTT. Reaktio-seosta inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa tunnin ajan, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä siihen 2 ^,ul 0,5 M EDTA-liuosta. Tämän jälkeen seosta uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyylialko-holia sisältävällä seoksella, sitten se uutettiin kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, käsiteltiin kroma-tografisesti Sephadex G-50-kolonnilla, merkittyä nukleiinihappoa sisältävät fraktiot yhdistettiin ja saostettiin etanolilla. Sentrifugoinnin jälkeen DNA-kasauma suspendoitiin uudestaan veteen ja pilkottiin entsyymillä Sali. Pilkkomistuote käsiteltiin elektroforeettisesti 1 % agaroosigeelillä TAE-puskurissa, ja 710 emäsparin kokoiset kappaleet sisältävä vyöhyke leikattiin irti geelistä, DNA eluoitiin sähköisesti, uutettiin butanolilla, ja saostettiin etanolilla. Tämä kappale suspendoitiin uudestaan 100 ^ul TE-puskuria, sen ammoniumasetaattipitoisuudeksi asetettiin 2,5 M, jonka jälkeen se saostettiin etanolilla. Tuloksena oleva DNA-kappale suspendoitiin uudestaan TE-puskuriin pitoisuudeksi 50 000 tuikahdusta minuutissa/^ul.
Muuntamiseen käytetyt neljä perusreaktiota suoritettiin seuraavasti: (a) G-reaktion (guaniinireaktion) seosta inkuboitiin 8 minuuttia 22°C:n lämpötilassa, ja se sisälsi 1 ^ul (50 000 tuiketta minuutissa) merkittyä DNA-kappaletta, 4 ^,ul vettä, ·· 200 ^ul 50 mM natriumkakodylaattia, pH 8,0, 1 mM EDTA-liuosta (DMS-puskuri) ja 1 ^,ul dimetyylisulfaattia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 50 ^ul DMS-pysäytinpuskuria, joka sisälsi 1,5 M natriumasetaattia (pH 7,0), 1 M 2-merkaptoetanolia ja 100 ^ug/ml tRNA:ta, jonka jälkeen tähän seokseen lisättiin etanolia (750 ^ul) ja reaktioseosta pidettiin -70°C:n lämpötilas-sa vähintään 15 minuuttia. (b) G/A-reaktion (guaniini/adeniini) seosta inkuboitiin 10 minuuttia 22°C:n lämpötilassa ja se sisälsi 2 ^ul (100 000 tuiketta minuutissa) merkittyä DNA-kappaletta, 8 yul vettä ja 30 ^ul muurahaishappoa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä tähän seokseen 200 ^ul Hz-pysäytinpuskuria (0,3 M natriumasetaatti, pH 5,5, 0,1 M EDTA ja 25 ^ug/ml tRNA), sitten siihen lisättiin etanolia (750 ^ul), ja reaktioseosta - 94427 73 pidettiin -70°C:n lämpötilassa vähintään 15 minuuttia.
(c) T/C-reaktion (tymiini/sytosiini) seosta inkuboitiin 10 minuuttia 22°C:n lämpötilassa, ja se sisälsi 2 ^ul (100 000 tuiketta minuutissa) merkittyä DNA-kappaletta, 18 ^,ul vettä ja 30 ^ul hydratsiinia. Reaktio pysäytettiin edellä kohdassa (b) esitetysti.
(d) C-reaktion (sytosiini) seosta inkuboitiin 10 minuuttia 22°C:n lämpötilassa ja se sisälsi 1 ^ul (50 000 tuiketta minuutissa) merkittyä DNA-kappaletta, 4 ^ul vettä, 15 ^ul 5 M NaCl:a ja 30 ^ul hydratsiinia. Reaktio pysäytettiin edellä kohdassa (b) esitetyllä tavalla.
DNA-kasaumat otettiin talteen sentrifugoimalla, ne suspendoi-tiin uudestaan 250 mikrolitraan 0,3 M natriumasetaattia, pH 5,5 ja ne saostettiin etanolilla käyttäen 750 yul 95-prosenttista etanolia. Kasaumat otettiin talteen sentrifugoimalla, kuivattiin vakuumissa 5 minuuttia, ja DNA pilkottiin suspendoimalla nämä kasaumat uudestaan 100 mikrolitraan piperidiinin 1-10-kertaista (t/t) laimennosta. Tätä pilkkomisreaktion seosta inkuboitiin 90°C:n lämpötilassa 30 minuuttia, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä siihen 500 ^ul 98-prosenttista etanolia, 60 mM natriumasetaattia (pH 5,5) ja 10 yug/ml tRNA:ta. Reaktio-seos laitettiin hiilihappojäätä ja etanolia sisältävään hauteeseen (noin -70°C), ja pidettiin siinä noin 5 minuuttia, ja DNA-kappaleet otettiin talteen sentrifugoimalla. Nämä kappa-♦♦ leet suspendoitiin uudestaan 50 mikrolitraan 0,3 M natrium- asetaattia (pH 5,5), jonka jälkeen se saostettiin etanolilla, käyttäen 100 ^ul 95-prosenttista etanolia. Tämä etanolilla saostaminen toistettiin, kasaumat huuhdottiin 95-prosentti-sella etanolilla, ja haihdutettiin vakuumissa sentrifugoinnin aikana. Kasauma suspendoitiin uudestaan 10 mikrolitraan 80 % ' formamidia, joka oli 10 mM NaOH:n, 1 mM EDTA:n, 0,1 % ksyleeni-syanolin ja 0,1 % bromifenolisinisen suhteen. 2-3 mikrolitraa käsiteltiin elektroforeettisesti 10-prosenttisella, 0,4 mm paksulla polyakryyliamidigeelillä TBE-puskurissa.
74 - 94427
Aminohappojen järjestys alkoholioksidaasissa määritettiin yhtiön Sequemat, Inc. (Watertown, Mass.) laitteella käyttäen 2 mg Pichia pastoris-hiivasta saatua puhdistettua alkoholioksidaasia. Ensimmäisten 18 aminohapon täysin valmiissa proteiinissa todettiin olevan:
Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.
Esimerkki IX
Kopioinnin alkamiskohdan määrittäminen alkoholioksidaasin tapauksessa_
Jotta saataisiin määritetyksi se, missä alkoholioksidaasin tapauksessa mRNA-molekyylin alkamiskohta sijaitsee, primeerin jatkamis-koe toteutettiin käyttämällä primeerinä alkoholioksidaasigeenin 5 45ään DNA-ketjuista kopioitua synteettistä oligonukleotidiä, ja mallina 10 ^ug Pichia pastoris-hiivan poly A+ mRNA:ta. Kymmenen ^ug Pichia pastoris-hiivan poly A+ mRNA:ta ja 3 ng primee-riä (51-CTT CTC AAG TTG TCG-3') yhdistettiin lopulliseksi tilavuudeksi 9,3 ^ul, joka oli 43 mM NaCl:n, 29,2 mM Tris-puskurin (pH 8,3), 5,2 mM MgCljin ja 4,3 mM DTT:n suhteen. Nukleiinihappoja denaturoitiin 70°C:n lämpötilassa 5 minuuttia ja palautettiin antamalla seoksen jäähtyä hitaasti 22°C:n lämpötilaan.
Tämä käsittelyliuos lisättiin putkeen, joka sisälsi 4 ,ul dNTP- 32 . seosta, 0,8 ^ul RT-puskuria ja 1 ^ul merkitsintä P-a-dCTP ·· (800 Ci/mmol). Tästä seoksesta otettiin kolme ^ul, ja ne lisät tiin 1 mikrolitraan kutakin vastaavista ddNTP-molekyyleistä.
Viimeinen 3 ^ul tästä seoksesta lisättiin 1 mikrolitraan vettä. Reaktiot käynnistettiin lisäämällä 1 ^ul laimennettua RT-liuosta ja niitä inkuboitiin 45°C:n lämpötilassa 15 minuuttia. Reaktioi-. . ta nopeutettiin lisäämällä 3 yUl Chase-RT-liuosta, ja pitämällä seoksia 42°C:n lämpötilassa 15 minuuttia. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä reaktioseoksiin 7,5 ^ul formamidin ja värin seosta, ja 4-5 ^ul käsiteltiin elektroforeettisesti 0,4 mm paksulla gra-dienttigeelillä lx TBE-liuoksessa. Elektroforeesin jälkeen * tätä geeliä kiinnitettiin 10-prosenttisessa etikkahapossa 10- - 94427 75 prosenttisella metanolilla 20 minuuttia. Geeli kuivattiin vakuu-missa, ja sillä valotettiin röntgensädefilmi XAR.
Gradienttigeeli valmistettiin seuraavasti: 300 yul 10 % ammo- niumpersulfaattia ja 14 ^,ul TEMED-liuosta lisättiin 30 milli-litran suuruisen pintageelin päälle; 75 ^ul 10 % ammoniumper-sulfaattia ja 3,5 ^ul TEMED-liuosta lisättiin 7 ml suuruisen pohjageelin päälle# 6 ml pintageelistä vedettiin pipettiin, ja sitten 6 ml pohjageelistä vedettiin tähän samaan pipettiin. Tämä geeli kaadettiin geelimaljojen väliin, jonka jälkeen näiden mal-. jojen väliin kaadettiin 22 ml pintageeliä.
Esimerkki X
mRNA-hybridisaation valikointi ja in vitro-luenta Positiiviset hybridisaatio-luentakokeet suoritettiin siten, että 20 ^,ug Pichia-hiivan kloonattua genomista DNA:ta (valmistettu esimerkissä VI esitetyllä tavalla) tehtiin lineaariseksi pilkkomalla se erilaisilla restriktio-endonukleaaseilla. Tämä DNA denaturoitiin tekemällä liuos 0,3-molaariseksi NaOH:n suhteen, ja inkuboimalla tätä seosta 65°C:n lämpötilassa 10 minuuttia.
Tämä denaturoitua DNA:ta sisältävä liuos jäähdytettiin nopeasti jäissä ja se neutraloitiin tekemällä se 0,5-molaariseksi Tris-HCl-liuoksen (pH 7,4) suhteen. Tähän denaturoituun DNA:hän lisättiin yhtä suuri tilavuus 20x SSPE-liuosta välittömästi ennen DNA:n si- ·;· tornista nitroselluloosaa oleville suodattimille. Ennen DNA:n ·· laittamista nitroselluloosaa oleville suodattimille (Schleicher ja Schuell BA83, 9 mm halkaisija), suodattimet esikäsiteltiin kastelemalla ne vedellä, keittämällä niitä 10 minuuttia ja huuhtomalla ne kolmasti lOx SSPE-liuoksella. Tämän jälkeen kullekin suodattimelle kiinnitettiin 10 ^ug DNA:ta siten, että DNA * * laitettiin suodattimelle, suodatin kuivattiin ilmassa, ja lopuksi suodattimet kuivattiin vakuumissa 70°C:n lämpötilassa 2 tuntia.
Ennen esihybridisointia sidottua DNA:ta sisältävät suodattimet laitettiin 1 millilitraan steriiliä vettä, ja niitä kuumennettiin • 94427 76 yhden minuutin ajan lOO°C:n lämpötilassa, jäähdytettiin jäissä, huuhdottiin sekoittamalla niitä 1 millilitrassa steriiliä vettä, ja huuhdottiin 1 millilitralla esihybridisaation puskuria. Suodattimet esihybridisoitiin 1 millilitrassa esihybridisaation puskuria, ja tämän jälkeen esihybridisaation puskuriin lisättiin suoraan 40 ,ug (2 ,ug/ml ETS) poly A+ mRNA:ta.
O
Hybridisointiseosta lämmitettiin 65 C:ssa 10 minuuttia, jonka jälkeen sitä inkuboitiin 42°C:n lämpötilassa 24 tuntia.
Hybridisoinnin jälkeen suodattimet huuhdottiin lyhyesti 22°C:n lämpötilassa kahdesti lx SSPE-liuoksessa, joka sisälsi 0,5 % SDS, 7 kertaa 50°C:n lämpötilassa kulloinkin 5 minuutin ajan lx SSPE-liuoksessa, joka sisälsi 0,5 % SDS, 3 kertaa 50°C:n lämpötilassa kulloinkin 5 minuutin ajan 0,lx SSPE-liuoksessa, sekä kerran 10 minuutin ajan 65°C:n lämpötilassa 0,lx SSPE-liuoksessa.
RNA eluoitiin suodattamilta keittämällä niitä 1 minuutin ajan 300 mikrolitrassa vettä, joka sisälsi 15 ^ug kaniinin maksan tRNArta. Eluoitu RNA pakastettiin nopeasti hiilihappojäätä ja etanolia sisältävässä hauteessa. RNA-seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja suodattimet poistettiin. Tämän jälkeen RNA-seos saostettiin tekemällä liuoksesta 2,5-molaari-nen ammoniumasetaatin suhteen ja saostamalla etanolilla kahdesti, ja lopuksi RNA suspendoitiin uudestaan 100 mikrolitraan vettä ennen lyofilisoimista.
• ·» ·
Luennat (translaatiot) toteutettiin tavanomaisilla,alan asiantuntijalle tutuilla menetelmillä, esimerkiksi niiden ohjeiden mukaisesti, jotka ohjeet esitetään yhtiön New England Nuclear, kaniinin retikulosyyttilysaatin in vitro-luentaa varten tuottamien reagenssipakkausten yhteydessä. Proteiinituotteet käsiteltiin elektroforeettisesti 8 % polyakryyliamidigeeleillä, jotka sisälsivät 4,5 % tukigeeliä.
Esimerkki XI
Antiseerumipreparaatit ja immunosaostukset
Kaniineissa sekä polypeptidiä p72 (alkoholioksidaasi) että p76 sisältävistä Pichia pastoris-soluista saatua uutetta vastaan - 94427 77 muodostuneet antiseerumit tuotettiin tavanomaisia tekniikoita käyttäen. Nämä uutteet dialysoitiin PBS-liuosta vastaan ennen niiden injektointia. Kullekin kaniinille annettiin 8 viikon aikana 3 injektiota, joista kukin käsitti yhteensä 1 mg proteiinia 0,1 millilitran tilavuutena, sekä 0,2 ml Freund'in täydellistä apuainetta. Kaniinit saivat injektiot ihon alaisesti 6-10 eri kohtaan. Kahdeksan viikon kuluttua kaniineiden veri otettiin talteen, ja niiden seerumit testattiin Pichia pastoris-hiivan puhdistettua alkoholioksidaasia vastaan käyttäen Ouchterlony'n kaksinkertaisen diffuusion menetelmää.
Kaniinin puhdistettuja anti-p72- (alkoholioksidaasi) ja anti-p76-proteiinin vasta-aineita valmistettiin affiniteettikromatografi-sesti johtamalla koko antiseerumi CNBrsiin kytketyn p72 (alkoholioksidaasi) -p76-Sepharose 4B-kolonnin (Pharmacia) läpi. 1 gramma CNBr:11a aktivoitua geeliä valmistettiin hydraamalla geeliä 15 minuuttia 200 millilitrassa 1 mM HCl-liuosta, jonka jälkeen se huuhdottiin kolmasti 50 millilitralla kytkemispuskuria (0,1 M natriumkarbonaattia (pH 8) ja 0,5 M NaCl). Tähän geeliin lisättiin 5 ml kytkemispuskurissa olevaa p72-p76-liuosta, jonka pitoisuus oli 6 mg/ml, ja tätä seosta sekoitettiin varoen yön yli 4°C:n lämpötilassa. Sitoutumaton proteiini poistettiin pesemällä geeli 3 x 50 millilitralla kytkemispuskuria. Jäljelle jääneet aktiiviset ryhmät poistettiin inkuboimalla geeliä 2 tuntia ·· 1 H etanoliamiinissa (pH 8). Kovalenttisesti sitoutumaton • · materiaali poistettiin geelistä pesemällä se 50 millilitralla PBS-liuokseen valmistettua 2 M natriumtiosyanaattia. Ennen anti-seerumeiden kromatografointia geeli pestiin lopuksi 3 x 50 millilitralla PBS-liuosta. Viisi ml kirkastettua anti-p72-p76-antiseerumia sekoitettiin geeliin ja inkuboitiin varovaisesti [ sekoittaen 2 tunnin ajan 4°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen anti-seerumin ja geelin muodostama seos pipetoitiin 1 x 8 cm kolonniin, ja huuhdottiin 150 millilitralla PBS-liuosta. Puhdistettu vasta-aine eluoitiin kolonnista 6 millilitralla 2 M natriumtio-syanaattia, joka oli valmistettu PBS-liuokseen. Geelistä eluoimisen jälkeen puhdistettua vasta-ainetta dialysoitiin 78 - 94427 huolellisesti PBS-liuosta vastaan, joka PBS-liuos sisälsi 0,02 % natriumatsidia.
Affiniteetin perusteella puhdistettu antiseerumi lisättiin PBS-liuokseen valmistettuun in vitro-luennan seokseen, 1 % NP40, ja inkuboitiin yön yli 4°C:n lämpötilassa. Vasta-aineen ja antigeenin muodostama kompleksi saostettiin Pansorbin'11a (Calbiochem) pitäen seosta jäissä 2,5 tunnin ajan. Pansorbin'ia esikäsiteltiin RIPA-puskurissa pesemällä. Pansorbin - saostumat huuhdottiin neljästi RIPA-puskurissa, ja ne liuotettiin Laemmli'n· lataamispuskuriin ennen elektroforeesia.
Esimerkki XII
Pichia pastoris-hiivan transformointimenetelmä A. Solujen kasvattaminen 1. Pichia pastoris-hiivan GS115 (NRRL Y-15851) pesäke siirros-tetaan noin 10 millilitraan YPD-alustaa, ja tätä viljelmää ravistellaan 30°C:n lämpötilassa 12-20 tuntia.
2. Noin 12-20 tunnin kuluttua solut laimennetaan siten, että optinen tiheys OD^qq on noin 0,01-0,1, ja soluja pidetään logaritmisen kasvun vaiheessa YPD-alustalla 30°C:n lämpötilassa noin 6-8 tuntia.
3. Noin 6-8 tunnin kuluttua 100 millilitraan YPD-alustaa siir-rostetaan 0,5 ml siemenviljelmää suurin piirtein ODgoo-arvoon 0,1 (tai vastaava määrä). Viljelmää ravistellaan 30öC:n lämpötilassa noin 12-20 tuntia.
4. Solut otetaan talteen tästä viljelmästä, kun 0Dg0(j on noin 0. 2.0,3 (noin 12-20 tunnin kuluttua), sentrifugoimalla niitä nopeudella 1500 g 5 minuuttia.
B. Sferoplastien valmistaminen 1. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla steriiliä vettä.
(Kaikki vaiheiden 1-5 sentrifugoinnit toteutetaan nopeudella 1500 g, ja ne kestävät 5 minuuttia.) 2. Solut pestään kertaalleen 10 millilitralla juuri valmistettua SED-liuosta.
- 94427 79 3. Solut pestään kahdesti 10 millilitrassa steriiliä 1 M sorbitolia.
4. Solut suspendoidaan uudestaan 10 millilitraan SCE-puskuria.
5. Soluliuokseen lisätään 5-10 ^ul entsyymin Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories) liuosta, jonka pitoisuus on 4 mg/ml. Soluja inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa noin 30-60 minuuttia.
Koska sferoplastien valmistaminen on kriittinen vaihe transfor-mointimenetelmässä, niin sferoplastien muodostumista tulisi seurata seuraavasti: 100 mikrolitran suuruisia solunäytteitä lisätään 900 mikrolitraan 5 % SDS-liuosta ja 900 mikrolitraan sorbitolia ennen zymolyaasin lisäämistä tai välittömästi sen jälkeen, sekä eri hetkillä inkubointijakson aikana. Inkubointi pysäytetään sillä hetkellä, kun solut lysoituvat SDS-liuoksessa, mutta ne eivät lysoidu sorbitolissa (tavallisesti inkuboinnin kestettyä 30-60 minuuttia).
6. Sferoplastit pestään kahdesti 10 millilitrassa steriiliä 1 M sorbitolia, ja niitä sentrifugoidaan nopeudella 1000 g 5-10 minuuttia. Sentrifugoinnin kesto ja nopeus voivat vaihdella; sentrifugoinnin tulee olla riittävää sferoplastien kasauttami-seksi, mutta se ei saa olla niin voimakasta, että sferoplastit hajoavat voiman vaikutuksesta.
·ϊ· 7. Solut pestään kertaalleen 10 millilitrassa steriiliä CaS- liuosta.
8. Solut suspendoidaan uudestaan yhteensä 0,6 millilitraan CaS-liuosta.
. , C. Transformointi * 1. DNA-näytteet (tilavuudeltaan korkeintaan 20 ^ul) lisätään 12 x 75 millimetrin suuruisiin, steriileihin polypropyleeniput-kiin. (DNA:n tulisi olla vedessä tai TE-puskurissa; transformaatiossa mahdollisimman suurten esiintymistiheyksien saavuttamiseksi pieniä DNA-määriä käyttäen on suositeltavaa, että kuhunkin näytteeseen lisätään noin 1 ^ul E. coli-bakteerin sonikoitua 80 - 94427 DNA:ta, jonka pitoisuus on 5 mg/ml.) 2. Kuhunkin DNA-näytteeseen lisätään 100 ^ul sferoplasteja, ja näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa noin 20 minuuttia.
3. Kuhunkin näytteeseen lisätään 1 ml PEG-liuosta, ja näytteitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa noin 15 minuuttia.
4. Sentrifugoi näytteitä nopeudella 1000 g 5-10 minuuttia, ja dekantoi PEG-liuos.
5. Näytteet suspendoidaan uudestaan 150 mikrolitraan SOS-liuos-ta, ja niitä inkuboidaan huoneen lämpötilassa 30 minuuttia.
6. Näytteisiin lisätään 850 ^ul steriiliä 1 M sorbitolia, ja näytteistä maljataan pieniä määriä jäljempänä kuvatulla tavalla.
D. Sferoplastien regenerointi 1. Regeneroinnissa käytettävän agaralustan valmistusohje: a. Agar-sorbitoli - 9 g Bacto-agaria, 54,6 g sorbitolia, 240 ml vettä, autoklavointi.
b. lOx glukoosi - 20 g dekstroosia, 100 ml vettä, autoklavointi.
c. lOx SC - 6,75 g hiivan typpialustaa (Yeast Nittogen Base), joka ei sisällä aminohappoja, 100 ml vettä, autoklavointi.
(Tähän alustaan lisätään mitä tahansa toivottua aminohappoa tai nukleiinihappoa pitoisuudeksi 200 ^ug/ml ennen autoklavoin-tia tai sen jälkeen.) ...d. 240 millilitraan sulaa agar-sorbitoliliuosta lisätään 30 ml *· lOx glukoosia ja 30 ml lOx SC-liuosta. Siihen lisätään edelleen 0,6 ml biotiiniliuosta, jonka pitoisuus on 0,2 mg/ml, sekä mitä tahansa toivottua aminohappoa tai nukleiinihappoa pitoisuudeksi 20 ^ug/ml. Sulaa, regeneroinnissa käytettävää agaria pidetään 55-60°C;n lämpötilassa.
- 94427 81 sen ajanjakson aikana, kun transformoitavat näytteet ovat SOS-liuoksessa. Edellä kuvatuista transformoitavista näytteistä lisätään yhtä suuria määriä regenerointiagaria sisältäviin putkiin, ja ne kaadetaan maljoilla olevan pohja-agarkerroksen päälle. Kustakin näytteestä lisätään yhtä suuri määrä 10 ml sulaa regenerointiagaria sisältäviin putkiin, joita pidetään 45-50°C:n lämpötilassa, ja ne kaadetaan edelleen kullekin maljalle, jotka sisältävät 10 ml kiinteästä regenerointiagarista muodostuvan pohja-agarkerroksen.
3. Sferoplastipreparaatin laadun määrittäminen:
Yhdestä näytteestä otetaan 10 ^ul, ja se laimennetaan 100-kertai-sesti lisäämällä se 990 mikrolitraan 1 M sorbitolia. Tästä 100-kertaisesta laimennoksesta otetaan 10 ^ul, ja se laimennetaan edelleen 100-kertaisesti lisäämällä se toiseen 990 mikrolitran suuruiseen määrään 1 H sorbitolia. Näistä molemmista laimennoksista otetaan 100 ^ul, ja ne levitetään YPD-agaralustaa sisältäville maljoille preparaattiin jääneiden, kokonaisten, sferoplas-teja muodostamattomien solujen pitoisuuden määrittämiseksi. Kustakin laimennoksesta lisätään 100 ^ul 10 millilitraan regenerointiagaria, jota oli täydennetty 40 ^ul/ml histidiiniä, regeneroituvien sferoplastien kokonaismäärän määrittämiseksi. Hyvinä 7 arvoina transformointikokeissa pidetään yhteensä 1-3 x 10 3 regeneroituvaa sferoplastia/ml, ja noin 1 x 10 kokonaista *: solua/ml.
4. Maljoja inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa 3-5 vuorokautta. Esimerkki XIII
Pichia pastoris-hiivan HIS4-geenin ja autonomisten replikaatio- ketjujen eristäminen_ A. Kannat Käytettyjä kantoja ovat: (a) Pichia pastoris-hiivan kanta NRRL Y-11430; (b) Pichia pastoris-hiivan kanta GS115 (his4; NRRL Y-15851); (c) Saccharomyces cerevisiae-kanta 5799-4D (his4-260 his4-39? NRRL Y-15859); ja (d) E. coli-bakteerin kanta 848 (F met thi gal T^R Φ80^ hsdR-hsdM+).
82 - 94427 B. Plasmidit
Plasmidi pYA2 (katso kuva 23; pYA2 käsittää S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenin plasmidin pBR325 Pstl-kohtaan istutetussa, 9,3 kilo-emäsparin suuruisessa kappaleessa) toimi S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenikappaleen lähteenä, ja se on tallennettu E. coli-isäntään, ja se on yleisön käytettävissä tunnusnumeron NRRL B-15874 perusteella.
Plasmidi YEpl3 on saatavana kantakokoelmasta American Type Culture Collection, ja sille on annettu tunnusnumeroksi ATCC 37115.
C. Alustat
Pichia pastoris-hiivaa kasvatettiin joko YPD-alustalla (rikas alusta) tai IMG-alustalla (vähimmäisalusta). Vähimmäisalusta IMG muodostuu seuraavista: 1. IM^-suoloista, joiden lopullisena pitoisuutena on 36,7 mM KH2P04, 22,7 mM (NH4)2SC>4, 2,0 mM MgS04-7H20, 6,7 mM KC1, 0,7 mM CaCl2-2H20, ja joista valmistettiin lOx varastoliuos, joka auto-klavoitiin; 2. Hivensuoloista, joiden lopullisena pitoisuutena on 0,2 mM CuS04*5H20, 1,25 /UM KI, 4,5 ^uM MnS04.H20, 2,0 ^uM NaMo04.2H20 0. 75 ^um H3B03, 17,5 ^uM ZnS04*7H20, 44,5 ^uM FeCl3*6H20, joista valmistettiin 400x varastoliuos, joka steriloitiin suodattamalla; ’· 3. 0,4 ^,ug/ml biotiinia; ja 4. 2 % dekstroosia.
E.coli-bakteeria kasvatettiin joko LB-alustalla tai 2B-alustalla (0,2 % NH4P04, 1,2 % Na2HP04, 0,013 % MgS04*7H20, 0,074 % . CaCl2*2H20, 1 ^ug/ml tiamiinia ja 0,4 % dekstroosia), jota oli täydennetty tryptofäänillä, 100 ^ug/ml, sekä kasaminohapoilla, 0,2 %.
D. DNA:n eristäminen 1. Suuressa mitassa toteutettu hiivan DNA?n valmistaminen Sekä Pichia pastoris- että S. cerevisiae-hiivan DNA:n valmistaminen toteutettiin kasvattamalla hiivasoluja 100 millilitrassa - 94427 83 vähimmäisalustaa, kunnes AgQQ on 1-2, jonka jälkeen solut otetaan talteen sentrifugoimalla nopeudella 2000 g 5 minuuttia.
Solut pestiin kerran vedellä, kerran SED-liuoksella, kerran 1 M sorbitolissa, jonka jälkeen ne suspendoidaan 5 millilitraan 0,1 M Tris-HCl-liuosta (pH 7,0), joka on 1 M sorbitolin suhteen.
Solut sekoitettiin 50-100 mikrolitraan entsyymin Zymolyase 60 OOO (Miles Laboratories) liuosta, jonka pitoisuus on 4 mg/ml, ja niitä inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan solusei-nämien hajottamiseksi. Tämän jälkeen tätä sferoplastipreparaat-tia sentrifugoitiin 1000 g:n nopeudella 5-10 minuuttia, ja suspendoitiin lysointipuskuriin (0,1 % SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA ja 50 mM NaCl). Entsyymejä Proteinase K (Boehringer Mannheim) ja RNase A (Sigma) lisättiin pitoisuudeksi 100 yug/ml, ja seoksia inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 30 minuuttia. DNAista poistettiin proteiini sekoittamalla tähän preparaattiin varovaisesti yhtä suuri tilavuus kloroformia, joka sisälsi isoamyylialkoholia (24:1, t/t) ja faasit erotettiin sentrifugoimalla seosta nopeudella 12 000 g 20 minuutin ajan.
Ylempi faasi (vesifaasi) imettiin uuteen putkeen, ja se uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävää seosta. Faasit erotettiin edellä kuvatusti, ja ylempi faasi laitettiin putkeen, joka sisälsi 2-3-kertaisen tilavuuden kylmää 100 % etanolia. Näytettä sekoitettiin varovasti, ja DNA otettiin talteen kietomalla se muovisauvan päälle.
DNA liuotettiin välittömästi 1 millilitraan TE-puskuria, ja sitä dialysoitiin yön yli 4°C:n lämpötilassa TE-puskurin 100 tilavuutta vastaan.
2. Pienessä mitassa toteutettu hiivan DNA:n valmistaminen Viisi ml vähimmäisalustassa olevia hiivaviljelmiä kasvatettiin, • kunnes &qqq on 1-5, ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla niitä nopeudella 2000 g 5 minuutin ajan. Solut suspendoitiin 1 millilitraan SED-liuosta, ja ne siirrettiin 1,5 millilitran mikrofuugiputkiin, pestiin kertaalleen 1 M sorbitolilla, ja suspendoitiin uudestaan 0,5 millilitraan 0,1 M Tris-HCl-liuosta (pH 7,4), joka oli 1 M sorbitolin suhteen. Tähän lisättiin k - 94427 84 zymolyaasi 60 000-entsyymiä (10 ,ul liuosta, jonka pitoisuus
O
on 4 mg/ml), ja soluja inkuboitiin 30-60 minuuttia 30 C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen soluja sentrifugoitiin 1 minuutin ajan, suspendoitiin lysointipuskuriin ja inkuboitiin 65-70°C:n lämpötilassa. 15 minuutin kuluttua näytteisiin sekoitettiin 100 ^ul 5 M kaliumasetaattia, pidettiin jäähauteessa 15 minuuttia, ja sentrifugoitiin 5 minuuttia. Supernatantit dekantoi-tiin uuteen mikrofugiputkeen, joka sisälsi 1 millilitran 100 % etanolia, sekoitettiin, ja sentrifugoitiin 10 sekuntia. Lopuksi DNA-kasaumia kuivattiin ilmassa 10-15 minuuttia, ja ne liuotettiin 50 mikrolitraan TE-puskuria.
3. Suuressa mitassa toteutettu E.coli-DNA:n eristäminen E. coli-bakteerin viljelmiä suuren mittakaavan (0,5-1 1) plasmidi-preparaatteja varten kasvatettiin 37°C:n lämpötilassa ravistellen soluja 2B-alustalla, jota oli täydennetty edellä kuvatusti, ja joka sisälsi asianmukaista antibioottia. pBR322-peräisiä plasmideja sisältävien solujen tapauksessa näitä viljelmiä kasvatettiin suurin piirtein A60Q-arvoon 0,7, jonka jälkeen viljelmiin lisättiin niin paljon kloramfenikolia, että sen pitoisuudeksi saatiin 100 yug/ml, ja solut otettiin talteen arviolta 15 tuntia myöhemmin. pBR325-peräisiä plasmideja sisältävät kannat siirrostettiin täydennettyyn 2B-alustaan siten, että Agoo °li alussa noin 0,01-0,05, ja niitä inkuboitiin ravistel-Γ Ien 37°C:n lämpötilassa 20-24 tuntia ennen solujen ottamista talteen.
4. Pienessä mitassa toteutettu E. coll-DNAin valmistaminen Plasmidin eristämiseksi nopeasti ja pienessä mitassa 2 millilitran suuruisia viljelmiä täydennetyssä 2B-alustassa, joka sisälsi antibioottia, kasvatettiin yön yli 37°C:n lämpötilassa ravistellen, ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla niitä 1,5 milli-* litran mikrofugiputkissa. Kaikkien preparaattien plasmidit eristettiin alkalisella lysointimenetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Birnboim ja Doly (1979).
1· «Hl tilli I I M i - 94427 85 E. DNA:n restriktio ja kappaleiden eristäminen Restriktioentsyymit saatiin yhtiöistä New England Biolabs sekä Bethesda Research Laboratories, ja pilkkomiset toteutettiin tavanomaisilla menetelmillä. Restriktiokartoittaminen suoritettiin vertaamalla istutettua DNA:ta sisältävän ja sisältämättömän plasmidin rinnakkain suoritettuja pilkkomisia. Restriktiokappaleet puhdistettiin eluoimalla ne sähköisesti aga-roosigeeleiltä Whatman 3 MM-paperiliuskoille, joita tuettiin dialyysiputkilla. Nämä kappaleet otettiin talteen tästä paperista ja putkista pesemällä niitä 3-4 kertaa 0,1-0,2 millilitran suuruisilla tilavuuksilla liuosta, joka sisälsi 0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA. Lopuksi nämä kappaleet uutettiin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, saostettiin etanolilla, ja liuotettiin uudestaan pieneen määrään TE-puskuria.
F. Pichia pastoris-kirjaston muodostaminen E. coli-bakteeriin Pichia pastoris-DNA-YEpl3-kirjaston muodostamiseksi 100 ^ug plasmidia YEpl3 pilkottiin täydellisesti entsyymillä BamHI, ja sitä käsiteltiin vasikan suolistosta saadulla alkalisella fosfataasilla DNA-ketjun 5'-päässä olevan fosfaatin poistamiseksi. 100 yug suuruinen määrä Pichia pastoris-hiivasta NRRL Y-11430 saatua villityypin Pichia pastoris-DNA:ta pilkottiin osittain 10 yksiköllä entsyymiä Sau3A I inkuboimalla sitä ;* 5 minuuttia 37°C:n lämpötilassa 1 millilitran kokonaistilavuu dessa. 5-10 kiloemäsparin suuruiset kappaleet valikoitiin 5-20 prosenttisten sakkaroosigradienttien läpi tapahtuvilla sentrifugoinneilla. Yksi ^ug vektoria ja 2 ^ug Pichia-hiivan Sau3A I-kappaleita sekoitettiin 20 yksikköön T4 DNA-ligaasia (Bethesda Research Laboratories) 200 mikrolitran kokonaistilavuudessa, ja tätä seosta inkuboitiin yön yli 4°C:n lämpötilassa. Ligatoidut DNA:t transformoitiin E. coli-bakteeriin lisäämällä tämä koko ligaatioreaktion seos 2 millilitraan asianmukaisesti käsiteltyjä E. coli-bakteerin 848 soluja, ja inkuboimalla tätä seosta 15 minuuttia 0°C:n lämpötilassa. Tämä seos lämmitettiin 37°C:n lämpötilaan 5 minuutin aikana, minkä ajan 86 - s4427 kuluttua seokseen lisättiin ‘40 ml LB-alustaa, ja 37°C:ssa tapahtuvaa inkubointia jatkettiin edelleen tunnin ajan. Tämän jälkeen tähän seokseen lisättiin ampisilliinia siten,että sen kokonaispitoisuudeksi saatiin 100 ^ug/ml, ja inkubointia jatkettiin toisen tunnin ajan. Lopuksi soluja sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 3000 g, suspendoitiin uudestaan 1 milli-litraan juuri valmistettua LB-alustaa, ja ne levitettiin yhtä suurina määrinä 10 LB-agaria sisältävälle maljalle, jotka sisälsivät 100 ^ug/ml ampisilliinia. Tuloksena olevat noin 50 000 pesäkettä raaputettiin irti maljoilta, ja osa soluista siirros-tettiin 500 millilitraan täydennettyä 2B-alustaa siten, että alussa oli noin 0,1. Tätä viljelmää kasvatettiin ja plasmidi uutettiin edellä kuvatusti. Kirjastoa varten yhdistettyjen pesäkkeiden tapauksessa 96 pesäkettä sadasta oli herkkä tetrasykliinille ja 7 kymmenestä tutkitusta pesäkkeestä sisälsi istute-DNA:ta käsittäviä plasmideja.
Pichia pastoris DNA-pYJ8ACla-kirjaston muodostamiseksi 50 ^ug plasmidia pYJ8ACla pilkottiin täydellisesti entsyymillä Clal, ja käsiteltiin vasikan suolistosta saadulla alkalisella fosfa-taasilla DNA-ketjun 5'-päässä olevan fosfaatin poistamiseksi.
100 yug suuruinen määrä Pichia pastoris-hiivasta NRRL Y-15851 saatua DNArta pilkottiin osittain 20 yksiköllä entsyymiä Taql, inkuboimalla tätä seosta 5 minuuttia 65°C:n lämpötilassa : 1 millilitran kokonaistilavuudessa. 5-10 kiloemäsparin kappa- m leet valikoitiin eluoimalla ne sähköisesti 0,5 % agaroosigee-liltä (katso esimerkki II, osa E) . Yksi ^,ug vektoria ja 2 ^ug Pichia-hiivan Taql-kappaleitä sekoitettiin 20 yksikköön T4-DNA-ligaasia (Bethesda Research Laboratories) 200 mikrolitran kokonaistilavuutena, ja tätä seosta inkuboitiin yön yli 4°C:n lämpötilassa. Ligatoidut DNA:t transformoitiin E. coli-bak-teeriin lisäämällä koko ligaatioreaktion seos 2 millilitraan asianmukaisesti käsiteltyjä E. coli-bakteerin 848 soluja, ja tätä seosta inkuboitiin 15 minuuttia 0°C:n lämpötilassa. Tätä seosta lämmitettiin 37°C:n lämpötilassa 5 minuuttia, jonka ajan jälkeen siihen lisättiin 40 ml LB-alustaa ja inkubointia jatkettiin 37°C:n lämpötilassa toisen tunnin ajan. Sitten tähän 87 - 54427 seokseen lisättiin ampisilliinia siten, että sen kokonaispitoisuudeksi saatiin 100 ^ug/ml, ja inkubointia jatkettiin edelleen tunnin ajan. Lopuksi soluja sentrifugoitiin nopeudella 3000 g 10 minuuttia, suspendoitiin uudestaan 1 millilitraan juuri valmistettua LB-alustaa, ja levitettiin yhtä suurina määrinä 10 LB-agaria sisältävälle maljalle, jotka sisälsivät ampisilliinia pitoisuutena 100 ^ug/ml. Arviolta 10 000 tuloksena olevaa pesäkettä raaputettiin maljoilta, ja osa näistä soluista siirrostettiin 500 millilitraan täydennettyä 2B-alustaa siten, että A55Q oli aluksi noin 0,1. Tätä viljelmää kasvatettiin, ja plasmidi uutettiin edellä esitetysti.
G. Hybridisoiminen Southern'in menetelmällä
Suurten, erittäin kierteisten DNA-molekyylien siirtämiseksi nitroselluloosalle tämä DNA hydrolysoitiin ensin osittain upottamalla agaroosigeelit 0,25 M HCl-liuokseen 10 minuutiksi ennen alkalilla denaturoimista. S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenistä saatujen merkittyjen kappaleiden transformointi Pichia pastoris-hiivan DNA:hän toteutettiin siten, että läsnä oli 50 % form-amidia, 6x SSC, 5x Denhardt’in liuosta, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA ja 100 ^ug/ml denaturoitua sillin sperman DNA:ta, lämpötilan ollessa 42°C. Huuhtelu hybridisoinnin jälkeen tapahtui 65°C:n lämpötilassa siten, että läsnä oli lx SSC, 1 mM EDTA, 0,1 % 32 SDS ja 1,0 % natriumpyrofosfaattia. DNA merkittiin P:llä esimerkissä IV esitetysti.
H. DNA-ketjun selvittäminen DNA-ketjun selvittäminen suoritettiin dideoksinukleotidiketjun päättämismenetelmällä, joka kuvataan Sanger'in et ai. julkaisussa (1980).
I. Hiivan transformaatiot S. cerevisiae-hiivan transformaatiot toteutettiin sferoplastien generaatiomenetelmällä, joka kuvataan Hinnen et ai. julkaisussa (1978) .
88 • 94427
Pichia pastoris-hiivan transformoinnit suoritettiin edellä kuvattua menetelmää käyttäen.
J. Pichia pastoris-hiivan transformanttien analysointi Kunkin plasmidin kyky säilyä autonomisena elementtinä Pichia pastoris-soluissa määritettiin seuraavasti: transformanttipesä-ke otettiin regenerointiagaria sisältävältä maljalta, ja se vedettiin SD-agaralustaa sisältävälle maljalle, ja siirrostet-tiin nestemäiseen IMG-alustaan. SD-maljaa inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa, jonka ajan jälkeen tältä maljalta otettiin yksi pesäke, vedettiin toiselle SD-maljalle ja siirrostettiin toiseen, IMG-alustaa sisältävään pulloon. Tämä tapahtumasarja toistettiin kolmannen kerran. Näitä kolmea IMG-viljelmää kasvatettiin 30°C:n lämpötilassa ravistellen siten, että AgQQ oli noin 1-2, jonka jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla.
DNA eristettiin näistä hiivaviljelmistä edellä kuvatusti, siirrettiin elektroforeettisesti 30 volttia ja 30 milliampeeria käyttäen 10-15 tunnin aikana 0,8 % agaroosigeeleille, siirret- 32 tiin nitroselluloosalle, ja hybridisoitiin P-merkittyihin plasmideihin pBR322 tai pBR325 edellä esitetysti. Vertailuna käytettiin näytettä, joka sisälsi 10 ng E. coli-bakteerista eristettyä plasmidia, sekä näytettä, joka sisälsi 1-2 ^ug Pichia pastoris-hiivan GS115 transformoimatonta DNA:ta, ja nämä vertailunäytteet käsiteltiin elektroforeettisesti rinnan kokeellisten näytteiden kanssa.
K. Pichia-hiivan DNA-ketjujen eristäminen
Pichia-hiivan HIS4-geenin sisältävät DNA-kappaleet eristettiin Pichia-hiivan DNA-kirjastosta sen perusteella, että ne kykenivät täydentämään S. cerevisiae-hiivan his4-kantoja. Kirjasto • muodostettiin villityypin Pichia-DNA:sta entsyymillä Sau3AI
osittain pilkkomalla saaduilla, 5-20 kiloemäsparin kappaleilla, jotka istutettiin S. cerevisiae-E. coli-sukkulavektorin YEpl3 BamHI-kohtaan. S. cerevisiae-hiivan NRRL Y-15859 (5799-4D? his4ABC”-kanta) sferoplasteja tuotettiin Hinnen et ai. (1978) esittämällä tekniikalla, ne sekoitettiin Pichia-hiivan DNA- ia M i Jilt; i t t.sfc * - 94427 89 kirjastoon ja niiden annettiin regeneroitua alustalla, josta puuttui histidiini. Transformaation tuloksena saatiin noin 3 1 x 10 prototrofista hiivapesäkettä, kun lähdettiin populaa- 7 tiosta, joka käsitti yhteensä 5 x 10 regeneroituvaa sfero-plastia. Hiivan koko DNA uutettiin 20 tällaisesta His+-pesäk-keestä ja sillä transformoitiin E. coli. 17 näistä hiivan DNA-preparaateista saatiin aikaan ampisilliinille vastustuskykyisiä pesäkkeitä, joista kukin sisälsi vektorista YEpl3 ja istutetusta DNA:sta muodostuvan plasmidin. Jotta saataisiin vahvistetuksi se, että nämä His+-transformoivat plasmidit sisältävät Pichia-hiivan HIS4-geenin, eikä sellaista DNA-kappaletta, jolla on tukahduttavaa aktiivisuutta, näistä plasmideista restriktio-entsyymeillä saatuja pilkkomistuotteita hybridisoitiin sellaiseen merkittyyn DNA-kappaleeseen, joka sisälsi suuren osan S. cerevisiae-hiivan HIS4-geenistä, ja huuhdottiin alhaisella lujuudella. Kukin niistä plasmideista, jotka täydensivät S. cerevisiae-hiivan his4-kantoja, sisälsivät ketjuja, jotka hybridisoituivat S. cerevisiae-hiivan HIS4-geeniin.
Pichia-hiivan ARS-aktiivisuutta sisältävien DNA-kappaleiden löytämiseksi Pichia pastoris-hiivasta GS115 (NRRL Y-15851) saatu DNA pilkottiin osittain entsyymillä Taql, ja 5-10 kilo-emäsparin kappaleet eristettiin ja kloonattiin plasmidin pYJ8ACla ainoaan Clal-kohtaan (katso kuva 26). Plasmidi-DNA otettiin di talteen noin 10 000 Pichia-hiivan His+-pesäkkeestä, ja sitä käytettiin E. coli-bakteerin transformoimiseen. Plasmidit eristettiin noin 10 000 ampisilliinille vastustuskykyisestä pesäkkeestä ja ne transformoitiin takaisin hiivaan GS115. 40 tästä alikirjaston muodostavasta transformaatiosta saatua hiivan His+-pesäkettä vedettiin toisistaan erillään selektiivi-• selle alustalle, ja niitä kasvatettiin erillisinä viljelminä selektiivisellä alustalla. Hiivan koko DNA uutettiin kustakin näistä 40 viljelmästä ja transformoitiin E. coli-bakteeriin. Lisäanalysointia varten valikoitiin kaksi plasmidia pYA63 (PARSI) ja pYA90 (PARS2), joiden hiiva-DNA-preparaatit tuottivat ampisilliinille vastustuskykyisimmät E. coli-pesäkkeet. Nämä . 94427 90 molemmat plasmidit transformoivat Pichia pastoris-hiivaa GS115 (NRRL Y-15851) hyvin suurella esiintymistiheydellä, ja kumpikin niistä sisälsi vieraasta DNArsta muodostuvan istutteen.
Esimerkki XIV
Säätelevästä alueesta ja IacZ-geenistä muodostuvien yhteensulau- tumien muodostaminen_ A. p72-polypeptidin (alkoholioksidaasi) säätelevän alueen kä- sittävät muodosteet__
Plasmidi pPG 4,0, joka on Pichia pastoris-hiivasta saadun, 4 kiloemäsparin suuruisen genomisen, EcoRI-PvuII-DNA-kappaleen » sisältävä pBR322-vektori, pilkottiin entsyymillä PstI, käsiteltiin Sl-nukleaasilla epäaktiivisten (blunt) päiden muodostamiseksi kohdissa,joissa pilkkomista tapahtui, jonka jälkeen se pilkottiin entsyymillä BamHI, jolloin saatiin 1,12 kiloemäsparin suuruinen DNA-kappale, joka sisältää alkoholioksidaasin säätelevän alueen sekä alkoholioksidaasin ensimmäisten 15 aminohapon koodaavaa informaatiota. Tämän 1,12 kiloemäsparin suuruisen kappaleen nukleotidijärjestys on seuraava:
B
1,12 kep I
''Sl-nukleaasilla" CTA GGT GGT G* käsitelty pää GAT CCA CCA CCT AG^
B
... alkoholioksidaasi leull glyi2 g*y13 ·· Tämä 1,12 kiloemäsparin suuruinen kappale ligatoitiin E. coli- S. cerevisiae-sukkulavektorin EcoRI/Smal/BamHI-liittäjään (linker; pilkottu entsyymeillä BamHI ja Smal), Douglas et ai.
(1984). Vektori pSEYlOl sisältää E. coli-bakteerin IacZ-geenin ja polyliittäjän, jolla on seuraava nukleotidijärjestys:
R. Sm B
i i l _ GAATTCCCGGGGATCCC GTC GTT....
CTTAAGGGCCCCTAGGG CAG CAA....
t t t
Rj^ Sm B Valg Val1Q..8-galaktosidaasi 9i - 94427 jolloin saadaan hybridiplasmidi pTAOll (katso kuva 29).
Plasmidin pTAOll säätelevästä alueesta ja IacZ-geenistä muodostuva yhteensulautuma on eri vaiheessa β-galaktosidaasin tuottamisen suhteen, mikä nähdään ketjusta E: ·«.
« ·· 92 - 94427 • · • * • · • ’· eh <
Eh < tJi
U U P
U O <0
Eh rij tr
U U P
UO (fl in
rH
U O ffl ^ o o <— <u
Eh «< 01
TT
rH
C eh >1
O U rH
CQ-*C5U Cn w 3 m
•n rH
P Eh < >i
(U U U rH
* O U O'
IN I—I
Eh rtj >,
U U H
O U O' • * «·
rH
EH EH Ή •cfi 4 3 UU 0)
* · H
• · a. : : 1 : : .- <n ; ' . 1-1 . · * rH . # • · u a u a
ua<_ rH
ES “
Eh Η. Eh « ^ UU • · • · • · • 94427 93
Vektori pTAOll pilkotaan ainoasta BamHI-kohdasta, ja seuraa-va Smal-liittäjä istutetaan:
Sm
GATCACCCGGGT
TGGGCCCACTAG
t
Sm jolloin saadaan hybridivektori pTAU12, jolla on seuraava nukleotidiketju säätelevästä alueesta ja IacZ-geenistä muodostuvaan yhteensulautumaan verrattuna: «4 »· 4 t » 94 _ 94427 ; · 4 Επ’ <
CJ U U O
Eh tP
O U P
u o <0
U O tP
u u p eh < m
C eh P
u u a)
Eh < 01 o a ft u u o u u -p (0 e —^ *— e w w u a o
u e> P
u o ft in
rH
< Eh P
u a a)
Eh < (0
I—I
< Eh >1 O U Ή
ft O U tP
3 -n rn U Ή <ϋ Eh < >ι
« ϋ CJ rH
Ö O tP
CM
rH
EH C >1
O U rH
O U tP
.··! rH
rH
< En 3 eh < a)
a O rH
• · • · Q. · · d> · ·
Ai · · • · CM · · . rH · · • * ' · • - H · · • · • j ·
U O
u o
U U*_ rH
ES ^
rH_rtj EH
« O u • · • · • « 95 94427 ja näin ollen säätelevästä alueesta ja IacZ-geenistä muodostuva plasmidin pTA012 yhteensulauma on edelleen eri vaiheessa LacZ-lukukehyksen suhteen. Jotta N-pään koodaava informaatio alkoholioksidaasin rakenteellista geeniä varten saataisiin avoimeen lukukehykseen rakenteellisen IacZ-geenin kanssa, niin plasmidia pTA012 käsiteltiin entsyymeillä EcoRI-Smal, ja tuloksena oleva DNA-kappale ligatoitiin plasmidiin pSEYlOl, jota oli samoin käsitelty entsyymeillä EcoRI ja Smal, jolloin saatiin hybridivektori pTA013 (katso kuva 30 ja alla oleva nukleotidiketju:) ·» »«· 94427
r—I
s»
F
CQ
• · · . . · ‘
• * O
E-· < y
E· rt H
au s* en OOH H rt <3 au > u a o u o «_ m u u a a e» rt a.
C Eh m au m m —% au >1 au h au tn
£—> <— E
tn en u a o u a n u o a in
♦H
rt E-· P
u a φ E· rt to rr a < e· >1 au h 3 au tn
•n •P
0) n * H .
E-· U >i au h au tn
CM
i—) E U >1 ·: au h au tn
H
«H
rt! E· 3
E< rt 0J
u a h • · • · Q. · · ... JJ) · · : m · · * · · (N · · rH · · % · · «H · · • · • · • · • · u a u a u a ^— h es “
rt! EH
es ^ a u • · • · • ·
<1 «tl . J.li' M t Kl I
- 94427 97 Tätä vektoria pTA013 käytettiin sitten S. cerevisiae-hiivan SEY2102 transformoimiseen jäljempänä esimerkissä XV esitettyjä lisätutkimuksia varten.
Tämän jälkeen vektori pTA013 pilkottiin entsyymillä PstI tai Pstl-NruI, ja pilkotun kappaleen sisältämä, säätelevästä alueesta ja IacZ-geenistä muodostuva yhteensulautuma ligatoitiin sukkulavektoreiden pTAFHl (katso kuva 28), pYJ30 (katso kuva 27) tai pYA2 (katso kuva 23) HIS4-geenin sisältävään kappaleeseen, jolloin saatiin plasmidit pSAOH 1, pSAOH 5 ja pSAOH 10, vastaavasti.
pTA013 plus Tuloksena olevat plasmidit pTAFHl pSAOHl pYJ30 pSA0H5
pYA2 pSAOHlO
B. p76-polypeptidin säätelevän alueen käsittävät muodosteet Säätelevästä alueesta ja IacZ-geenistä muodostuvat yhteensulau-tumat valmistettiin seuraavasti p76-polypeptidin säätelevän alueen kanssa.
1. Kloonin pPG 6,0 koko 5'-osaa käyttäen
Kloonin pPG 6,0 1,35 kiloemäsparin suuruinen EcoRI-kappale *· kloonattiin plasmidin pSEYlOl ainoaan EcoRI-kohtaan, joka plas-midi on E. coli-S. cerevisiae-sukkulavektori, jolloin saatiin plasmidi pT76Ul (katso kuva 30a). Tämän jälkeen vektori pT76Ul pilkottiin entsyymeillä Pstl-NruI, ja suurempi DNA-kappale ligatoitiin sukkulavektorin pTAF-pTAFHl (kuva 28) HIS4-geenin sisältävään kappaleeseen edellä kuvatusti, jolloin * saatiin plasmidi pT76H3; tai sukkulavektorin pPBfl (katso kuva 34) Pstl-EcoRI-kappale sisältämään EcoRI-päähän, jolloin saatiin plasmidi pT76H4.
2. Kloonin pPG 6,0 5'-osan Bal31-kappaletta käyttäen Kloonin pPG 6,0 1,35 kiloemäsparin suuruinen EcoRI-kappale kloonattiin plasmidin pSEY8, E. coli-S. cerevisiae-sukkula- . 94427 98 vektori, ainoaan EcoRI-kohtaan, jossa plasmidissa on myös yksi Sali-kohta EcoRI-kohdan vieressä, johon Sali-kohtaan istutettiin Pichia-hiivan DNA, jolloin saatiin plasmidi pTAOl (katso kuva 31). Plasmidi pTAOl pilkottiin entsyymillä Sali, käsiteltiin Bal31-endonukleaasilla, jolloin saatiin polypepti-din p76 säätelevän alueen eripituisia, päistään epäaktiivisia (blunt) kappaleita. Nämä päistään epäaktiiviset kappaleet vapautettiin plasmidin pSEY8 jäännöksistä pilkkomalla entsyymillä EcoRI. Tuloksena olevat DNA-kappaleet kloonattiin plasmidin pSEYlOl EcoRI-Smal-liittäjään, jolloin saatiin mm. plasmidi pTAF.85 (katso kuva 32). Plasmidi pTAF.85 on analoginen kuvassa 29 esitetyn plasmidin pTAOll kanssa, paitsi että se sisältää polypeptidin p76 säätelevän alueen polypeptidin p72 (alkoholioksidaasi) säätelevän alueen sijaan.
Tämän jälkeen vektoria pTAF.85 käsiteltiin analogisesti vektorin pTA013 tavoin, jolloin saatiin plasmidit pTAFH.85, pT76Hl ja pT76H2. Näin ollen seuraavat vektorit pilkottiin ja ligatoitiin: pTAF.85 plus Tuloksena oleva plasmidi pTAFHl pTAFH.85 pYJ30 pT76Hl pYA2 pT76H2 ··
Esimerkki XV
β-galaktosidaasin tuotannon säätely Pichia pastoris-hiivassa Tämän jälkeen tarkasteltiin g-galaktosidaasin tuotantoa useissa Pichia pastoris-hiivan GS115 (NRRL Y-15851) transformanteissa, joita oli kasvatettu erilaisia hiilen lähteitä käyttäen, erilaisissa olosuhteissa. Transformoituja kantoja kasvatettiin vähimmäisalustalla, joka sisälsi 0,5 ^ug/ml biotiinia ja 0,1 % glukoosia, 30°C:n lämpötilassa, kunnes niiden kasvu saavutti stationäärivaiheen. Tämän jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja ne siirrettiin vähimmäisalustalle, joka sisälsi 0,5 ^ug/ml biotiinia ja 0,5 % metanolia ja niitä 99 94427
O
kasvatettiin noin 3-5 sukupblven ajan 30 C:n lämpötilassa.
Tämän metanolin avulla tapahtuneen ensimmäisen kasvatuksen jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla, ja ne siirrettiin uudelle vähimmäisalustalle, joka sisälsi 0,5 ^ug/ml biotiinia ja joko 0,1 % glukoosia tai 0,3 % metanolia hiilen lähteenä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa noin 80 tuntia, ja tästä viljelmästä otettiin näytteitä säännöllisin väliajoin alkoholioksidaasin ja β-galaktosidaasin pitoisuuksien määrittämiseksi. Noin 20-50 tunnin kuluttua hiilen lähde oli ehtynyt, jonka jälkeen soluja pidettiin näissä olosuhteissa, joissa hiilen lähdettä ei ollut käytettävissä. Tulokset on esitetty taulukossa I.
*·« ♦ ύ) 100 54427 >1 3 ±J 3 1 OJ “
10) -H
ω e m -p > Η -H' O O if) P Ή
Jh öPiHnmoj :tg z z z z -h 0 O in if) -*r -g -p -P oo 3 e χ in »· rt -H rt rt O -P a> a c
-H
rt rt ·>, in •Η Ή (0 x wcc -P rt ϋ « Ή® Pi Ό -h m » c S -h a Ό o -h Tl m •h o fi in O r* ^ss = s χ —. n ^ >t n ti φ μ 0
O X 3 -P rH S -H
O O H i-H
10 Ή O' 0) m O
or -h w λ 0^0 0 \ xi x :nj ‘ 0 I h «D JS A! o 10 XT] H 0 λ: £ < a; (0 •P g 3 -n m pj γη m λ; +* Cn-H ooo ooooo 3 >1 ^ in -h ^ m <** m 5 <0 P rH «0 ° m Ό in ™ -h « n in -P £ r? o
•h 3 -H -P
fi λ -¾ Λ hQ <L· — —— +5 <0 in -S fi «0 OOO Η h
Ji 3 Ή --- P as
Hio-3 <#> *h m :3 cp
fi .3 o H 00 <X\ - fS rH Q I
O 31. m 3 vo vo in O O oo O cn X C *3 m H in H Η Ή X Ή O +> H rH rH 0) C! rt +* 3 in 3 -n 10 I—I (0 in s, >i
3rttn r^ ry ad -P
i0 Ό iH 3 3—.-*—. OO+J rH d)
^ H 11 -H O) O O O OO 00 0) —. I-H +J
in -P in c IN IN IN -- "P o -h -h X 3 Ο -H — — — Tj oo x in O rt Ofi Γ~ O an — -PO) -H g rt X >Ί O r-* in H n M 0)
• rH p -H 3 -P m 10 CO - - E O O Λ -VO
*t OOinH^ioinoo O m m ^ in .3 >w 3 tr 0) oJ -h in O in « p -h
M S Ό 0) -P
H (0 iH tn rt p tn i c x +>oo α> a>
(0 -P o cn 0) -P
•n rH X M « VO -P
in (0 3 O - rH c
3 00 H H 11 I O m -H
nm n οιή oho ooooi -ph in h ö> tn - n χ
, (U I I dP O - 3 -P
i rt >· OQ o -rl 0) fö H -rl 4-> •H J -P 3 tn « -Po
O « <U -P
+> z h m -PO
M Ό O 00 O -P
rt 3 H H in H · rH oi m *j·
H rt E K K K S K !S S3 ffi rt -P
rt > tn OOO ft ίο ίο ίο ίο -n H) ö> -h rt C m; <C < n- r- r- r- 30) ι-h rH co co en Eh Eh eh fii eh hm cq ^ ft a a a a a a a a oo ίο λ; rt
Il s»-t i-lil f > > «I ί 101 94427
Alkoholioksidaasi määritettiin edellä kuvatulla väri-peroksidaasimenetelmällä (katso esimerkki VII), ja β-galaktosidaasi määritettiin seuraavasti: β-galaktosidaasikoe A. Tarvittavat liuokset: Z-puskuri Lopullinen pitoisuus
Na2HP04 · 7H20 16,1 g 0,06 M
NaH2P04 5,5 g 0,04 M
KC1 0,75 g 0,01 M
MgS04 · 7H20 0,246 g 0,001 M
2-merkaptoetanoli 2,7 ml 0,05 M
täytetään litraksi; pH:n tulisi olla 7.
O-nitrofenyyli-B-D-galaktosidi (ONPG): 400 mg ONPGitä (Sigma N-1127) liuotetaan 100 millilitraan tislattua vettä, jolloin saadaan pitoisuudeltaan 4 mg/ml oleva ONPG-liuos.
B. Koemenetelmä: 1. Viljelyalustasta otetaan näyte (0DgQ0 alustassa 0,1-0,5), solut sentrifugoidaan ja solukasauma pestään vedellä.
2. Solukasaumaan lisätään 1 millilitra Z-puskuria, 30 ^ul CHCl3:a ja 30 ,ul 0,1 % SDS-liuosta, sekoitetaan, inkuboidaan " 5 minuuttia 30°C:n lämpötilassa.
3. Reaktio käynnistetään lisäämällä 0,2 ml PNPG:tä (4 mg/ml), näyte sekoitetaan.
4. Reaktio pysäytetään lisäämällä 0,5 ml IM Na2C03-liuosta sopivilla hetkillä (A420 a^e ^ · 5. Supernatantin absorbanssi määritetään aallonpituudella 420 nm.
C. β-galaktosidaasin aktlivisuusyksiköiden laskeminen 1 yksikkö U = 1 nanomooli ortonitrofenolia (ONP), joka muodostuu minuutin aikana 30°C:n lämpötilassa, pH-arvossa 7.
94427 102 0ΝΡ:η 1 nanomoolin absorbans-si aallonpituudella 420 nm (A^q) on 0,0045/ kun säteen kulkema matka näytteessä on 1 cm; näin ollen kun absorbanssi on 1 aallonpituudella 420 nm, on näytteessä 222 nanomoolia 0NP:tä/ml, tai 378 nanomoolia/1,7 ml, sillä analysoitavan supernatantin kokonaistilavuus on 1,7 ml.
Täten taulukoissa ilmoitetut tulokset on laskettu kaavasta ^420 U = x 378 t (min)
Taulukossa I esitetyt tiedot osoittavat, että hiivalle vierasta proteiinia, esimerkiksi 8-galaktosidaasia, voi muodostua Pichia pastoris-hiivassa joko siten, että tällaisen proteiinin muodostumista säätelee ravintoalustassa läsnäoleva metanoli tai hiililähteen ehtyminen sen jälkeen, kun soluja on kasvatettu kataboliitteja tukahduttavan hiilen lähteen avulla.
Esimerkki XVI
8-galaktosidaasin tuotannon säätely S. cerevisiae-hiivassa Saccharomyces cerevisiae-hiiva SEY2102, joka vaatii urasiili-, leusiini- ja histidiinitäydennystä pysyäkseen hengissä, muunnettiin plasmideilla pTA013 ja pT76Ul. Transformoidut organismit voitiin eristää helposti valikoimalla ne pesäkkeet, jotka eivät tarvinneet urasiililla täydentämistä kasvaakseen. Eris- . tetyille transformanteille on annettu laboratoriotunnukset • · · SEY2102-pTA013 ja SEY2102-pT76Ul, vastaavasti. SEY2102-pTA0l3 on tallennettu kantakokoelmaan Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, jotta se olisi yleisön käytettävissä taltiointipäivästä, elokuun 31., 1984, lukien.
Tälle kannalle on annettu tunnusnumeroksi NERL Y-15858.
•
Kantojen NRRL Y-15858 ja SEY2102-pT76Ul soluja inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa noin 3-4 sukupolven ajan vähimmäisalustal-la, joka sisältää 20 ^ul/ml histidiiniä ja leusiinia sekä 5 % glukoosia. Tämän jälkeen nämä solut siirrettiin, eli ne otettiin talteen sentrifugoimalla ja siirrettiin YP-alustalle, joka sisälsi 3 % taulukossa II mainittua hiilen lähdettä, ja soluja kasvatettiin noin 5 sukupolven ajan 30°C;n lämpötilassa.
- 94427 103 Tämän jälkeen soluja inkuboitiin edelleen 50 tuntia olosuhteissa, joissa hiilen lähde oli ehtynyt, ja niistä otettiin aika ajoin näytteitä β-galaktosidaasin määrittämiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa II.
Taulukko II
β-galaktosidaasin tuotanto S. cerevisiae-hiivassa β-galaktosidaasi, yksikköä/ODgQO
A. Alkoholioksidaasin säätelevä alue (pTA013)
Hiilen 5 sukupol- Olosuhteet, joissa hiilen lähde lähde, ven jälkeen ehtynyt 3 % ____6 tuntia 20 tuntia 50 tuntia
Glukoosi 0,2 105 66 ei määritetty
Fruktoosi 0,3 30 31 28
Etanoli 23 137 115 77
Glyseroli 640 806 656 788
Galaktoosi 982 960 651 766 B. Polypeptidin p76 säätelevä alue (pT76Ul)
Hiilen 5 sukupol- Olosuhteet, joissa hiilen lähde lähde, ven jälkeen _ehtynyt 3 % _ _ 12 tuntia 25 tuntia 30 tuntia
Glukoosi 2,3 254 815 803
Glyseroli 470 ei määritetty ei määritetty ei määritetty ··.
Nämä tulokset osoittavat, että hiivalle vierasta proteiinia, esimerkiksi β-galaktosidaasia, voidaan tuottaa Saccharomyces cerevisiae-hiivassa siten, että tätä tuotantoa säätää p72-polypeptidin (alkoholioksidaasi) ja p76-polypeptidin säätelevät alueet olosuhteissa, joissa hiilen lähde on ehtynyt, kun : solujen kasvattamiseen käytetään kataboliitteja tukahduttavaa hiilen lähdettä, tai kasvattamalla transformoituja S. cerevisiae-soluja kataboliitteja suhteellisesti tukahduttamatto-man hiilen lähteen avulla, esimerkiksi glyserolin tai galaktoo-sin avulla.
104 - 94427 β-galaktosidaasin ilmentyminen tasoja S. cerevisiae-hiivassa tämän keksinnön mukaisten säätelevien alueiden hallitsemana voidaan verrata niihin ilmentymisen tasoihin, jotka ovat mahdollisia muilla, S. cerevisiae-hiivan säätelemillä promoottoreilla.
Promoottori Hiilen lähde B-galaktosidaasi,
Yksikköä/OD60Q
Sytokromi C- lacZ-fuusio (CYCl) Raffinoosi (3 %) 460
Galaktoosi^ perme- aasi-lacZ-fuusio (Gal2) Galaktoosi (2 %) 450
Invertaasi-lacZ- fuusio (SUC2) Glukoosi (0,1 %) 160 Nähdään, että tämän keksinnön mukainen säätelevä alue on yllättävästi vähintään yhtä tehokas, tai tehokkaampi kuin S. cerevisiae-hiivan luonnolliset promoottorit.
Esimerkki XVII
Southern'in hybridisaatiot hiivan genomisella DNA:11a Yhdeksää erilaista metanolia assimiloivaa hiivaa ja yhtä meta-nolia assimiloimatonta hiivaa kasvatettiin vähimmäisalustalla (IMI, katso esimerkki 1), johon oli lisätty 0,75 % metanolia tai 0,1 % glukoosia, vastaavasti. Koko kromosomaalinen DNA .: eristettiin esimerkissä VI kuvatusti, eli kaikki nukleiinihapot eristettiin, käsiteltiin RNaasi A:11a, uutettiin ensin fenolia, kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, sitten kloroformia ja isoamyylialkoholia sisältävällä seoksella, jonka jälkeen ne saostettiin etanolilla. Saostunut DNA suspen-doitiin uudestaan mahdollisimman pieneen tilavuuteen TE-pusku-ria, ja sentrifugoitiin DNA-liuoksen puhdistamiseksi.
Southern'in hybridisäätiön suodattimet valmistettiin esimerkissä VI kuvatusti, eli 10 ^ug eri hiivalajeista saatua kokonais-DNAsta pilkottiin ylimäärin entsyymillä Hindlll,käsiteltiin elektroforeettisesti, DNA denaturoitiin, geeli neutraloitiin ja 105 94427 DNA siirrettiin nitroselluloosaa oleville suodattimille.
Näiden suodattimien tapauksessa esihybridisaation olosuhteet käsittivät käsittelyn 50 % ionittomalla formamidilla, 6x SSC-liuoksella, 5x Denhardt'in liuoksella, 1 mM EDTA-liuoksella, O,1 % SDS-liuoksella ja 100 ,ug/ml denaturoidulla lohen sperman DNA:11a, 42 C:n lämpötilassa yön yli. Hybridisaation väliaineena käytettiin samoja olosuhteita, käyttäen avoimen fosfodi-esterisillan kohdalta luettuja (nick-translaatio) "^-koettimia, lopullisena pitoisuutena 10^ cmp/ml. Nämä koettimet käsittivät klooneista pPC 8,3, pPC 15,0 ja pPC 6,7 saadut cDNA-istut-teet (Pstl-kappaleet) sekä 2,7 kiloemäsparin suuruisen, P. pasto-ris-hiivan HIS4-geenin Bglll-DNA-kappaleen. Kutakin näistä koettimista käytettiin erillään hybridisaation identtisillä suodattimilla, hybridisaation tapahtuessa 42°C:n lämpötilassa ja sen kestäessä 24 tuntia. Hybridisoinnin jälkeen suodattimia pestiin kahdesti 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja kolmasti 65°C:n lämpötilassa 15 minuutin ajan liuoksella, joka sisälsi 2x SSC, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS ja 0,1 % natriumpyro-fosfaattia. Muita pesuja kokeiltiin alemmalla lujuudella, eli 55°C:n ja 42°C:n lämpötilassa hybridisaation tulosten varmistamiseksi. Tämän jälkeen suodattimia autoradiografoitiin 72 tunnin ajan. Näiden hybridisaatioiden tulokset on esitetty taulukossa III.
• ·< • v·· - 94427 106
Taulukko III
P. pastoris-hiivan geenien hybridisointi hiivan erilaisiin kromosomaalisiin DNA-ketjuihin -_P. pastoris___ HIM PPC 8.3 pPC 15.0 pPC 6.7 1) P. pastoris + + + + NRRL Y-11430 2) P. pastoris + + + + NRRL Y-1603 3) Hansenula + + + + capsulatum 4) H. henricii + + ^ + j + 5) H. nonfermentans + + + + 6) H. polymorpha ( + ) + + 7) H. wickerhamii + +++ 8) Tor-ulopsis + + + + molischi ana 9) Saccharomyces (+) cerevisiae 10) p. pastoris + +++ NRRL Y-15851
Selitykset: + hybridisaatio (+) heikko hybridisaatio - hybridisaatiota ei havaittu käytetyissä olosuhteissa.
(I ltt I ill 11 I I t ai : : | 107 94427
Taulukossa III esitetyt tulokset osoittavat, että polypepti-dien p76, p72 ja p40 kanssa analogisten polypeptidien geenejä on läsnä jokseenkin kaikissa metanolia assimiloivissa hiivoissa. On huomattava, ettei yhtäkään näistä kolmesta geenistä todettu metanolia assimiloimattomasta hiivasta, S. cerevisiae, saadun DNA:n hybridisaatiolla, kun taas P. pastoris-hiivan HIS4-geenin ja S. cerevisiae-hiivasta peräisin olevan HIS4-geenin välinen homologia voitiin todeta helposti.
Nämä esimerkit on esitetty ainoastaan havainnollistamaan tämän keksinnön käytäntöön soveltamista, ja niitä ei tule pitää tätä keksintöä eikä liitteenä olevia patenttivaatimuksia millään tavalla rajoittavina. Kohtuullisten muunnosten ja sovellutusten, jotka eivät poikkea tämän keksinnön tavoitteista eikä hengestä, katsotaan kuuluvan tälle julkaisulle myönnettyjen patenttioikeuksien piiriin.
·· «
V
Λ 94427 108
Kirjallisuutta
Birnboim ja Doly (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523.
M. G. Douglas et al (19Θ4) Proc. Nat. Acad. Sei. U.S. 81, 3983-3987.
Hinnen et al (1978) Proc. Nat. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933.
Z. A. Janowicz et al (1985) Nucl. Acids Res. 13, 3043-3062.
A. M. Ledeboer et al (1985) Nucl. Acids Res. 13, 3063-3082.
Maxam ja Gilbert (1980) teoksessa Methods in Enzymology 65, 499-560.
Southern (1975) J. Mol. Biol. 98 503-517.
Sanger et al (1980) J. Mol. Biol. 143, 161-178.
: 4 9 •

Claims (17)

109 94427
1. Rekombinanttinen DNA-käppale, jossa on Pichia pastorik-sesta johdettu säätelevä alue, tunnettu siitä, että tämä säätelevä alue reagoi metanolin läsnäoloon siinä kasvatus-alustassa, jonka kanssa mainitun DNA-kappaleen isäntäorga-nismi on kosketuksissa, tämän säätelevän alueen kyetessä säätämään lähetti-RNA:n kopioitumista, kun se sijoitetaan mainittua lähetti-RNA:ta koodaavan DNA-ketjun 5'-päähän, mainitun säätelevän alueen ollessa valittu: (a) säätelevästä alueesta, joka säätelee lähetti-RNA:n kopioitumista, joka koodaa dihydroksiasetonisyntetaasia, jota on saatavissa kloonista pPG6.0 (NRRL B-15867) 5'-HindIII-re-striktiokohdasta 3'-Xhol-restriktiokohtaan, kuten on esitetty kuvassa 4; (b) säätelevästä alueesta, joka säätelee lähetti-RNA:n kopioitumista, joka koodaa alkoholioksidaasia, jota on saatavissa kloonista pPG4.0 (NRRL B-15868) 5'-EcoRI-restriktiokoh-dasta 3'-EcoRV-restriktiokohtaan, kuten on esitetty kuvassa 5; (c) säätelevästä alueesta, joka säätelee lähetti-RNA:n kopioitumista, joka koodaa p40:tä, jota on saatavissa kloonista pPG4.8 (NRRL B-15869) 5'-BamHI-restriktiokohdasta 3'-SalI-restriktiokohtaan, kuten on esitetty kuvassa 6; ja että se valinnaisesti lisäksi käsittää polypeptidiä koodaavan alueen, jossa mainittu säätelevä alue sijaitsee mainitun polypeptidiä koodaavan alueen 5'-päässä, ja että se valinnaisesti lisäksi käsittää polypeptidiä koodaa-vasta alueesta alavirran puolella sijaitsevan DNA:n 3'-ketjun, jossa tämä DNA:n 3'-ketju kykenee säätelemään poly-adenylaatiota, mainitun polypeptidiä koodaavaa aluetta koodaavan lähetti-RNA:n transkriptoitumisen päättymistä ja translaation päättymistä. 94427 110
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu säätelevä alue on peräisin Pichia pastoris -hiivasta NRRL Y-11430.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää yhden tai useamman ylimääräisen DNA-ketjun, joka on peräisin bakteeriperäisen plasmidi-DNA:n, bakteriofagin DNA:n, hiivan plasmidi-DNA:n ja hiivan kramosomaalisen DNA:n muodostamasta ryhmästä.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu hiivan kromosomaalinen DNA käsittää autonomisesti replikoituvan DNA-ketjun sekä merkitsingeenin.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidiä koodaava alue koodaa heterologista polypeptidiä.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että polypeptidiä koodaava alue koodaa alko-holioksidaasia.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidiä koodaava alue koodaa dihydroksiasetonisyntetaasia. ···
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidiä koodaava alue koodaa polypeptidiä p40.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu kappale on suljetun rengasmaisen hybridiplasmidin muodossa.
10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 tai 9 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainitulla kappaleella on seuraa-va nukleotidisekvenssi: 111 94427 5'-ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCÄTAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG- 3' .
11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 tai 9 mukainen DNA-kap-pale, tunnettu siitä, että mainitulla kappaleella on seuraa-va nukleotidisekvenssi: 5'-AATGGCCCAAA CTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA ATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTT TGGTTCGTTG AAATCCTAAC GGCCAGTTGG TCAAAAAGAA ACTTCCAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATT GATTGACGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGC GCAGTCTCTC TATCGCTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGC CGAAACGCAA ATGGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATT ATGCATTGTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCÄTAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA ·· ♦ « CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3'.
12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 tai 9 mukainen DNA-kap- • pale, tunnettu siitä, että mainitulla kappaleella on seuraa- va nukleotidisekvenssi: 112 £4s27 5'-AGATCTAA CATCCAAAGA CGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCAC AGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGG GGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATC CTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTTAT GGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAG GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGC CCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAAC AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGC TTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG GCCCAAA CT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAAT ATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG GTTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC AGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTAT GCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGG • ·« GAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCAT TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC AAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAA GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3' .
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 tai 9 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainitulla kappaleella on seuraa-" va nukleotidisekvenssi: 113 £4427 5' -TT CACCCATACA ACTATAAACC TTAGCAATTG AAATAACCCC AATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA AACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC TTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAAC AGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTT CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTG CCGTTCCATC CCTTTGTTGA GCAACACCAT CGTTAGCCAG TACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT TAGTGAAGGG TGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCT TGTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGC CAAATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGTTTTT CTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAAT ATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACA ACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTAT CAAACTATCA AACATCAAAA-3'.
14. Transformoitu hiivakanta, joka on saatu transformoimalla Pichia pastorls -Isäntää llmentymisvektorilla, jossa on yhdistelmä-DNA-materlaallaf tunnettu siitä, että mainittu yhdistelmä-ONA-materiaali käsittää patenttivaatimuksen l mukaisen DNA-kappaleen.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen hiivakanta, tunnettu siitä, että mainittu Pichia pastoris -isäntä on GS 115 (NRRL Y-15851).
16. Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukaista transformoitua hiivakantaa elatusaineessa ja aiheutetaan ψφ 114 Γ / ' n 17 ilmentyminen metanolin läsnäollessa ja otetaan talteen poly-peptidit.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravinnealusta patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukaisen transformoidun hiivakannan kasvattamiseksi sisältää metanolia.
FI854142A 1984-10-30 1985-10-23 Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa FI94427C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US66639184 1984-10-30
US06/666,391 US4808537A (en) 1984-10-30 1984-10-30 Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use
US06/780,102 US4855231A (en) 1984-10-30 1985-09-25 Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US78010285 1985-09-25

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI854142A0 FI854142A0 (fi) 1985-10-23
FI854142L FI854142L (fi) 1986-05-01
FI94427B FI94427B (fi) 1995-05-31
FI94427C true FI94427C (fi) 1995-09-11

Family

ID=27099454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI854142A FI94427C (fi) 1984-10-30 1985-10-23 Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4855231A (fi)
EP (2) EP0483115A3 (fi)
JP (5) JP2502508B2 (fi)
KR (1) KR930001117B1 (fi)
CN (1) CN1011243B (fi)
AR (1) AR242988A1 (fi)
AT (1) ATE83263T1 (fi)
AU (1) AU572002B2 (fi)
CA (1) CA1340733C (fi)
DD (1) DD254211A5 (fi)
DE (1) DE3586889T2 (fi)
DK (1) DK496385A (fi)
ES (1) ES8609458A1 (fi)
FI (1) FI94427C (fi)
GR (1) GR852611B (fi)
HU (1) HU205627B (fi)
IE (1) IE930804L (fi)
IL (1) IL76765A (fi)
NO (1) NO178076C (fi)
NZ (1) NZ213842A (fi)
PL (1) PL158965B1 (fi)
PT (1) PT81399B (fi)
YU (1) YU46695B (fi)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5741672A (en) * 1984-07-27 1998-04-21 Unilever Patent Holdings B.V. Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5032516A (en) * 1985-10-25 1991-07-16 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
US4882279A (en) * 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4818700A (en) * 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
IL81817A0 (en) * 1986-03-14 1987-10-20 Phillips Petroleum Co Methanol and glucose responsive yeast regulatory regions
ZA872534B (en) * 1986-05-08 1987-11-25 Phillips Petroleum Co Yeast production of streptokinase
IL82935A0 (en) * 1986-08-12 1987-12-20 Phillips Petroleum Co Secretion of heterologous proteins from yeast
US5002876A (en) * 1986-09-22 1991-03-26 Phillips Petroleum Company Yeast production of human tumor necrosis factor
ES2056799T3 (es) * 1987-07-17 1994-10-16 Rhein Biotech Ges Fur Biotechn Moleculas de adn codante para las regiones de control fmdh y gen estructural para una proteina que tiene una actividad de fmdh y su uso.
ATE248925T1 (de) * 1988-01-05 2003-09-15 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur herstellung von proteinen oder proteinhaltigen genprodukten
FI891695A (fi) * 1988-04-11 1989-10-12 Phillips Petroleum Co Expression av laxtillvaexthormon i methyltrofisk jaest av slaektet pichia.
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
NZ228774A (en) * 1988-04-25 1991-05-28 Phillips Petroleum Co Hbv particles containing pres 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells
IL89992A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
IL89989A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts
IL89993A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts
DE3851535T2 (de) * 1988-12-20 1995-02-02 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Mutanter Stamm von einem methylotrophen Organismus und Verfahren zur Herstellung eines Proteins in methylotrophen Organismus.
AU5196290A (en) * 1989-02-13 1990-09-05 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells
GB8924883D0 (en) * 1989-11-03 1989-12-20 Shell Int Research Expression vector and polypeptide synthesis
US5264554A (en) * 1990-01-19 1993-11-23 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Platelet cell adhesion molecule and variants thereof
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
JPH06500470A (ja) * 1990-09-04 1994-01-20 メルク　エンド　カンパニー　インコーポレーテッド メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
DE69232666T2 (de) * 1991-04-01 2003-03-20 Merck & Co., Inc. Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung
CA2058820C (en) * 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) * 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
US5834262A (en) * 1992-01-06 1998-11-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Oxidation of glycolic acid to glyoxylic acid using a microbial cell transformant as catalyst
DK0558024T3 (da) * 1992-02-28 1996-11-18 Suntory Ltd Ny vektor med en ved hjælp af methanol og/eller glycerol inducerbar promotor
US5708141A (en) * 1992-05-11 1998-01-13 Corvas International, Inc. Neutrophil inhibitors
CZ225795A3 (en) * 1993-03-03 1996-02-14 Du Pont Enzymatically active glycolate oxidase, process for preparing thereof, transformed methylotropic yeast, nucleic acid sequence and plasmid
ATE279516T1 (de) 1993-03-08 2004-10-15 Merck & Co Inc Menschliche neuronale nikotin-acetylcholin- rezeptor-verbindungen und methoden ihres einsatzes
AU6415594A (en) * 1993-03-25 1994-10-11 Biosource Genetics Corporation (pichia pastoris) alcohol oxidase (zza1) and (zza2)
WO1994024284A1 (en) 1993-04-20 1994-10-27 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Human n-methyl-d-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US5912122A (en) * 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US6001581A (en) * 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US6638905B2 (en) * 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
WO1995013299A1 (en) * 1993-11-08 1995-05-18 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US5453161A (en) * 1993-11-12 1995-09-26 Enichem S.P.A. Polyamic acid to polyimide conversion by microwave heating
US5945275A (en) * 1994-10-18 1999-08-31 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5863894A (en) * 1995-06-05 1999-01-26 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5866542A (en) * 1994-10-18 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
EP0788546B9 (en) 1994-10-18 2007-06-13 Dendreon Corporation Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
CA2202351A1 (en) * 1994-10-18 1996-04-25 George Phillip Vlasuk Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
US5866543A (en) * 1995-06-05 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5872098A (en) * 1995-06-05 1999-02-16 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
US6720140B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
US6143557A (en) 1995-06-07 2000-11-07 Life Technologies, Inc. Recombination cloning using engineered recombination sites
WO1997017450A2 (en) * 1995-11-09 1997-05-15 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
EP0911416B1 (en) 1997-10-01 2006-05-17 DSM IP Assets B.V. Protein production process
CN100342008C (zh) * 1997-10-24 2007-10-10 茵维特罗根公司 利用具重组位点的核酸进行重组克隆
US7351578B2 (en) * 1999-12-10 2008-04-01 Invitrogen Corp. Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
CN101125873A (zh) * 1997-10-24 2008-02-20 茵维特罗根公司 利用具重组位点的核酸进行重组克隆
WO2000001731A1 (fr) * 1998-07-06 2000-01-13 Tosoh Corporation Proteine fusionnee avec liaison directe du recepteur il-6 a il-6
EP1114148A4 (en) * 1998-08-28 2004-12-22 Invitrogen Corp SYSTEM FOR RAPID HANDLING OF NUCLEIC ACID SEQUENCES
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
US6720174B1 (en) 1999-01-28 2004-04-13 Novozymes A/S Phytases
CA2363924A1 (en) 1999-03-02 2000-09-08 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
US6440414B1 (en) * 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
US6261820B1 (en) * 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
EP2011874A1 (en) 1999-11-12 2009-01-07 Fibrogen, Inc. Recombinant gelatin in vaccines
AU785483B2 (en) 1999-12-10 2007-09-20 Invitrogen Corporation Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
US7033776B2 (en) * 1999-12-17 2006-04-25 Amgen Inc. Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases
WO2001077351A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vectors and methods for dual protein expression in pichia pastoris and escherichia coli
US7244560B2 (en) * 2000-05-21 2007-07-17 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US7449308B2 (en) * 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
DK1522590T3 (da) 2000-06-28 2009-12-21 Glycofi Inc Fremgangsmåde til fremstilling af modificerede glykoproteiner
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
JP4092194B2 (ja) 2000-06-30 2008-05-28 フランダース インターユニバーシティ インスティテュート フォア バイオテクノロジー （ヴィーアイビー） ピキアパストリス（ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）におけるタンパク質糖鎖修飾
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
MXPA03009059A (es) * 2001-04-05 2004-10-15 Univ Nebraska Secuencias de nucleotidos reguladoras de alcohol oxidasa 1 para expresion de genes heterologos en levadura.
WO2002095055A2 (en) * 2001-05-21 2002-11-28 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in isolation of nucleic acid molecules
US6645739B2 (en) 2001-07-26 2003-11-11 Phoenix Pharmacologies, Inc. Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same
CA2482485A1 (en) * 2002-04-15 2003-10-30 Merck & Co., Inc. Matrix analysis of gene expression in cells (magec)
US7252933B2 (en) 2002-06-26 2007-08-07 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast
US20040204953A1 (en) * 2002-07-17 2004-10-14 Lincoln Muir Subscription based systems, methods and components for providing genomic and proteomic products and services
US7118901B2 (en) * 2002-12-18 2006-10-10 Roche Diagnostics Operations, Inc. Recombinant bovine pancreatic desoxyribonuclease I with high specific activity
ATE387494T1 (de) * 2002-12-20 2008-03-15 Hoffmann La Roche Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
CA2536635C (en) 2003-08-25 2015-05-12 Funzyme Biotechnologies Sa Novel fungal proteins and nucleic acids encoding same
US8293503B2 (en) 2003-10-03 2012-10-23 Promega Corporation Vectors for directional cloning
DE602004027538D1 (de) 2003-12-01 2010-07-15 Life Technologies Corp Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon
ES2337684T3 (es) * 2003-12-05 2010-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Carboxipeptidasa b recombinante y su purificacion.
MY146082A (en) * 2005-09-14 2012-06-29 Sanofi Aventis Deutschland Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin
AT504588B1 (de) * 2006-11-16 2008-08-15 Univ Graz Tech Nukleinsäure-promotor
US9200270B2 (en) * 2008-03-03 2015-12-01 Abbvie Inc. Methods for transforming yeast
KR20110101198A (ko) 2008-12-12 2011-09-15 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 재생 가능 자원으로부터의 선형 다이카르복실산의 제조 방법
EP2258855A1 (en) 2009-05-28 2010-12-08 Universität für Bodenkultur Wien Expression sequences
AU2010334383B2 (en) 2009-12-21 2014-10-02 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
MX368546B (es) 2011-05-20 2019-10-07 Alderbio Holdings Llc Producción en alta pureza de proteínas multi-subunitarias tales como anticuerpos en microbios transformados tal como pichia pastoris.
CN103890178A (zh) 2011-08-19 2014-06-25 奥尔德生物控股有限责任公司 转化微生物如巴斯德毕赤酵母中多亚基蛋白如抗体的高滴度和高纯度生成的多拷贝方案
KR101954389B1 (ko) 2011-10-07 2019-03-06 론자 리미티드 조절가능한 프로모터
US9150870B2 (en) 2013-03-15 2015-10-06 Lonza Ltd. Constitutive promoter
KR102202477B1 (ko) 2013-03-15 2021-01-13 룬드벡 시애틀 바이오파마슈티컬즈, 인크. 효모 및 기타 형질전환 세포에서 폴리펩티드의 고수율 발현을 위한 온도 전환
EP2970994B1 (en) 2013-03-15 2019-07-17 Lonza Ltd Constitutive promoter
EP3754012A1 (en) 2013-03-15 2020-12-23 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibody purification and purity monitoring
CN105143243B (zh) 2013-03-21 2020-03-13 国家科学和工业研究组织 三螺旋蛋白的纯化
MX362515B (es) 2013-04-30 2019-01-22 Donald Danforth Plant Science Center Proteinas péptidos y métodos de uso de las plantas antifúngicas.
WO2015031950A1 (en) 2013-09-09 2015-03-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified bacterial collagen-like proteins
WO2016120764A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Aspergillus oryzae prolyl endopeptidases and use thereof in degradation of polypeptides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK368882A (da) * 1981-08-25 1983-02-26 Alan John Kingsman Expessions vektorer
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
EP0096910B1 (en) * 1982-05-19 1989-04-19 Unilever N.V. Yeast of the genus kluyveromyces modified for the expression of preprothaumatin or its various allelic and modified forms or their maturation forms
EP0118551A1 (en) * 1982-09-15 1984-09-19 Collaborative Research Inc. Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
EP0423890A3 (en) * 1984-07-27 1991-07-03 Unilever Nv Use of oxidoreductases in bleaching and/or detergent compositions and their preparation by microorganisms engineered by recombinant dna technology
US4885242A (en) * 1984-10-30 1989-12-05 Phillips Petroleum Company Genes from pichia histidine pathway and uses thereof
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia

Also Published As

Publication number Publication date
CN1011243B (zh) 1991-01-16
US4855231A (en) 1989-08-08
PT81399B (pt) 1987-11-11
KR930001117B1 (ko) 1993-02-18
AU4875285A (en) 1986-06-12
JPS61173781A (ja) 1986-08-05
AR242988A1 (es) 1993-06-30
PL256012A1 (en) 1986-09-23
DK496385A (da) 1986-05-01
DD254211A5 (de) 1988-02-17
NO178076C (no) 1996-01-17
NO178076B (no) 1995-10-09
PT81399A (en) 1985-11-01
CN85109718A (zh) 1986-08-20
JP2552807B2 (ja) 1996-11-13
EP0483115A3 (en) 1992-05-06
EP0183071A2 (en) 1986-06-04
DE3586889T2 (de) 1993-04-15
CA1340733C (en) 1999-09-14
GR852611B (fi) 1986-03-04
EP0183071A3 (en) 1987-09-23
NZ213842A (en) 1991-11-26
YU46695B (sh) 1994-04-05
DK496385D0 (da) 1985-10-29
DE3586889D1 (de) 1993-01-21
JPH08173161A (ja) 1996-07-09
HU205627B (en) 1992-05-28
ATE83263T1 (de) 1992-12-15
EP0183071B1 (en) 1992-12-09
FI854142L (fi) 1986-05-01
IE930804L (en) 1986-04-30
EP0483115A2 (en) 1992-04-29
ES548307A0 (es) 1986-09-01
YU169585A (en) 1991-04-30
JPH08196275A (ja) 1996-08-06
IL76765A (en) 1991-06-30
KR870003197A (ko) 1987-04-15
HUT38678A (en) 1986-06-30
ES8609458A1 (es) 1986-09-01
FI94427B (fi) 1995-05-31
JP2502508B2 (ja) 1996-05-29
NO854312L (no) 1986-05-02
FI854142A0 (fi) 1985-10-23
JPH0698789A (ja) 1994-04-12
PL158965B1 (pl) 1992-10-30
JP2552808B2 (ja) 1996-11-13
AU572002B2 (en) 1988-04-28
JPH06233686A (ja) 1994-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI94427C (fi) Säätelyalue heterologista geeni-ilmaisua varten hiivassa
US4808537A (en) Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use
EP0123811B1 (en) The use of the gal 1 yeast promoter
FI94426B (fi) Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille
FI98931C (fi) Menetelmä polypeptidien korkeatasoiseksi ilmentämiseksi Pichia-suvun hiivassa
FI80720B (fi) Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.
FI95929B (fi) Hepatitis B pinta-antigeenin tuotanto hiivassa
US5330901A (en) Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
EP0263311A2 (en) Yeast production of human tumor necrosis factor
FI104497B (fi) DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta
FI104639B (fi) Hepatiitti B:n S- ja PreS2 -proteiinien ilmentäminen metylotrooppisissa hiivoissa
EP0118551A1 (en) Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
US5310660A (en) Method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription
GB2217332A (en) Expression of salmon growth hormone in methylotrophic yeast of genus pichia

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC.

BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC.

MA Patent expired