KR870003197A - Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법 - Google Patents

Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법 Download PDF

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KR870003197A
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프레드릭 브러스트 폴
브래들리 엘리스 스티븐
레이몬드 진저러스 토마스
밀러 하아폴 마이클
프리드리히 초프 유에르크
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제이 이이 휘립프스
휘립프스 피트로오리암 캄파니
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Abstract

내용 없음

Description

DNA 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법.
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 단백질 p76에 대한 게놈 클론(pPG6.0)과 cDNA 클론(pPC15.0)과의 상호관계.
제2도는 단백질 p72(알콜 산화효소)에 대한 게놈클론(pPG4.0)과 cDNA 클론(pPC8.3 및 pP8.0)과의 상호관계
제3도는 단백질 p40에 대한 게놈클론(pPG4.8)과 cDNA 클론(pPC6.7)과의 상호관계.
제17도는 플라스미드 pSAOH 1의 절단도.
제34도는 pBpf 1의 절단도이다.

Claims (94)

  1. 재조합 DNA 물질 유래의 상입된 폴리펩티드 코우팅 서열을 발현시킬 수 있는 형질전환 효모균주를 영양배지내에서 배양하는 것으로 구성되는 폴리펩티드 제조방법에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 하기 (1) (2)로 구성된 특징으로 하는 방법.
    (1) 하기조건 (ⅰ),(ⅱ) 및 (ⅲ)중 적어도 하나에 대한 반응성이 있는 조절부위
    (ⅰ) 상기 DNA 단편을 위한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 메탄올 존재.
    (ⅱ) 상기 DNA 단편을 위한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 메탄올 이외의 비분해 대사질억제 탄소원 존재; 및,
    (ⅲ) 분해다사질억제 탄소 및 에너지원상에서 숙주 미생물을 배양한후, 상기 DNA 단편을 위한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 탄소원 기아현상.
    (2) 폴레펩티드 코우팅 부위(여기서, 상기 조절부위는, 메신저 RNA 의 생산을 암호화하는 상기 폴리펩티드 코우팅 부위의 5' 말단에 위차할 경우 메신저 RNA 의 전사를 조절할 수 있으며, 상기 영양배지는 상기 (1)에 정의된 조건을 제공하는 그러한 배지이다).
  2. 제1항에 있어서, 상기 조절부위가 효모에서 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 효모가 피치아(Pichia) 속(屬)에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 효모가 피치아 파스토리스종(種)의 일원임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 효모가 피치아 파스토리스 NRRL Y-11430임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조절부위가 알콜 산화효소의 생산을 암호화하는 메신저 RNA의 전사를 조절한다는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조절부위가 폴리펩티드 p76의 생산을 암호하하는 메신저 RNA으 전사를 조절한다는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 조절부위가 폴리펩티드 p40의 생산을 암호하하는 메신저 RNA으 전사를 조절한다는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 알콜산화효소의 생산을 암호화하는 RNA의 아래쪽 3' DNA 서열을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 폴리펩티드 p76의 생산을 암호화하는 RNA의 아래쪽 3' DNA 서열을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 폴리펩티드 p40의 생산을 암호화하는 RNA의 아래쪽 3' DNA 서열을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 메신저 RNA가 이종 폴리펩티드의 생산을 암호화함을 특징으로하는 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제5도의 절단도에 재시된 바와같은 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 DNA 단편이 제8도의 절단도들에 제시된 바와 같은 그룹에서 선택된 추가의 단편을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제7항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제4도의 절단도들에 제시된 바와같은 그룹에서 선택된 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 DNA 단편이 제7도의 절단도에 제시된 바와 같은 추가의 단편을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제8항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제6도의 절단도에 제시된 바와같은 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제9도의 절단도에 제시된 바와같은 추가의 단편을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제6항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 메신저 RNA의 생산을 암호화는 DNA의 3' 말단에 위치하며 제8도의 절단도들에 제시된 바와 같은 그룹에서 선택되는 추가의 단편을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제6항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제6항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 제7항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 조절부위가 상기 폴리펩티드 코우팅 부위의 5' 말단에 위치함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드 코우딩 부위가 알콜 산화효소의 생산을 암호화함을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드 코우팅 부위가 폴리펩티드 76의 생산을 암호화함을 특징으로 하는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드 코우팅 부위가 폴리펩티드 p40의 생산을 암호화함을 특징으로 하는 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드 코우팅 부위가 이종 폴리펩티드의 생산을 암호화함을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드가 β-갈락토시다제임을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제15도의 절단도에 제시된 바와 같은 그룹에서 선택되는 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제16도의 의 절단도에 제시된 바와 같은 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제25항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제2도의 의 절단도에 제시된 바와 같은 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제27항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제10도의 의 절단도에 제시된 바와 같은 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 제11도의 의 절단도에 제시된 바와 같은 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제24항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 폴리펩티드 코우딩 부위의 아래쪽 3'DNA 서열을 더포함하며, 상기 3' DNA 서열은 폴리아데닐화, 폴리펩티드 코우딩 부위에 의해 암호화된 메신저 RNA 의 전사 종료 및 번역 종료를 조절할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  37. 제24항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 세균 플라스미드 DNA, 박테리오파아지 DNA, 효모플라스미드 DNA 또는 효모 염색제 DNA로부터 유래돈 추가의 DNA 서열하나 또는 그 이상을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 효모 염색체 DNA가 자발적 복제 DNA 서열과 유전자로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 세균 플라스미드 DNA, 박테리오파아지 DNA, 효모플라스미드 DNA 또는 효모 염색체 DNA로부터 유래된 추가의 DNA 서열 하나 또는 그 이상을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 효모 염색체 DNA가 자발적 복제 DNA 서열과 마아커 유전자로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  41. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 메신저 RNA 의 생산을 암호화하는 폴리펩티드 코우팅부위의 3'말단에 위치할 경우 폴리아데닐화, 메신저 RNA의 전자종료 및 번역종료를 조절할 수 있는 첫번째 조절부위 및 메신저 RNA 의 전사와 번역을 조절하고 하기 조건(ⅰ),(ⅱ) 및 (ⅲ) 중 적어도 하나에 대한 반응성이 있으며, 메신저 RNA의 생산을 암호화하는 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법;
    (ⅰ) 상기 DNA 단편을 위한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 메탄올 존재;
    (ⅱ) 상기 DNA 단편을 위한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 메탄올 이외의 비-분해대사질억제 탄소원 존재;및,
    (ⅲ) 분해대사질억제 탄소 및 에너지원상에서 숙주 미생물을 배양한후, 상기 DNA 단편을 이한 숙주 미생물과 접촉되는 배지내에서의 탄소운 기아현상.
  42. 제41항에 있어서, 상기 DNA 단편이 제7도의 절단도에 제시된 바와 같음을 특징으로 하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 DNA 단편이 제8도의 절단도에 제시된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 DNA 단편이 제9도의 절단도에 제시된 바와 같음을 특징으로 하는 방법.
  45. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 알콜 산화효소의 생산을 암호화하는 유전자 또는 그의 부단위, 혹은 그러한 유전자나 부단위의 등가물로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 유전자나 제13도의 절단도에 제시된 바와 같음을 특징으로 하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 유전자가 제2a도의 절단도에 제시된 바와 같은 염색체 DNA의 플랭킹(flanking)부위를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  48. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이 폴리펩티드 p76생산을 암호화하는 유전자 또는 그의 부단위, 혹은 글한 유전자나 부단위의 등가물로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48항에 잇어서, 상기 유전자가 제12도의 절단도에 제시된 바와 같음을 특징으로 하는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 유전자가 제1a도의 절단도에 제시된 바와같은 염색체 DNA의 플랭킹 부위를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  51. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA물질이 폴리펩티드 p40의 생산을 암호화하는 유전자 또는 그의 부단위, 혹은 그러한 유전자나 부단위의 등가물로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 유전자가 제14도의 절단도에 제시된 바와 같음을 특징으로 하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 유전자가 제3a도의 절단도에 제시된 바와 같은 염색체 DNA의 플랭킹 부위를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제39항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질 폐환(閉環)잡종 플라스미드 형태의 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질의 적어도 일부분은 비-세균성 삽입물의 절단도가 제1a도(pPG6.0)와 같은 잡종 플라스미드로부터 유리됨을 특징으로 하는 방법.
  56. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질의 적어도 일부분은 비-세균성 삽입물의 절단도가 제2a도(pPG4.0)와 같은 잡종 플라스미드로부터 유리됨을 특징으로 하는 방법.
  57. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질의 적어도 일부분은 비-세균성 삽입물의 절단도가 제3a도(pPG4.8)와 같은 잡종 플라스미드로부터 유리됨을 특징으로 하는 방법.
  58. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질의 적어도 일부분은 비-세균성 삽입물의 절단도가 제1b도(pPG15.0)와 같은 잡종 플라스미드로부터 유리됨을 특징으로 하는 방법.
  59. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질의 적어도 일부분은 비-세균성 삽입물의 절단도가 제2b도(pPG8.3)와 같은 잡종 플라스미드로부터 유리됨을 특징으로 하는 방법.
  60. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질의 적어도 일부분은 비-세균성 삽입물의 절단도가 제2c도(pPG8.0)와 같은 잡종 플라스미드로부터 유리됨을 특징으로 하는 방법.
  61. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질의 적어도 일부분은 비-세균성 삽입물의 절단도가 제3b도(pPG6.7)와 같은 잡종 플라스미드로부터 유리됨을 특징으로 하는 방법.
  62. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제17도(pSAOH1)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제18도(pSAOH5)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  64. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제19도(pSAOH10)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  65. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제20도(pTAFH.85)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  66. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제21도(pT76F1)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  67. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제22도(pT76F2)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  68. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제22a도(pT76F3)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  69. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제22b도(pT76F4)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  70. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제30도(pTAO13)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  71. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 물질이, 제30a도(pT76U1)의 절단도를 갖는 잡종 플라스미드로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  72. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 효모가 메탄올, 포도당, 아세테이트, 에탄올, 글리세롤, 자당, 유당, 가당 및 갈락토즈로부터 선택되는 적어도 한개의 탄소 및 에너지원상에서 배양될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 형질저놘 효모균주가 캔디다, 클로케라, 사카로마이세스, 로도토롤라, 한세놀라, 토롤롭시스, 피치아, 시조사카로마이세스 및 클루이베로마이세스로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 탄소 및 에너지원으로 메탄올 상에서 배양될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 캔디다, 클로케라, 사카로마이세스, 로도토톨라, 한세눌라, 토룰롭시스 및 피치아 속(屬)으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 피치아속으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 사카로마이세스 속으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  78. 제1항에 있어서, 상기 효모균주가 피치아 파스토리스 NRRL Y-15852(GS115-pSAOH1)임을 특징으로 하는 방법.
  79. 제1항에 있어서, 상기 효모균주가 피치아 파스토리스 NRRL Y-15853(GS115-pSAOH5)임을 특징으로 하는 방법.
  80. 제1항에 있어서, 상기 효모균주가 피치아 파스토리스 NRRL Y-15854(GS115-pSAOH10)임을 특징으로 하는 방법.
  81. 제1항에 있어서, 상기 효모균주가 피치아 파스토리스 NRRL Y-15855(GS115-pTAFH.85)임을 특징으로 하는 방법.
  82. 제1항에 있어서, 상기 효모균주가 피치아 파스토리스 NRRL Y-15856(GS115-pT76H1)임을 특징으로 하는 방법.
  83. 제1항에 있어서, 상기 효모균주가 피치아 파스토리스 NRRL Y-15857(GS115-pT76H2)임을 특징으로 하는 방법.
  84. 제1항에 있어서, 상기 효모균ㅈ가 사카로마이세스 세레비시애 NRRL Y-15858(SEY 2102-pTAO13)임을 특징으로 하는 방법.
  85. 제1항에 있어서, 상기 영양배지는 메탄올을 함유하고, 상기 재조합 DNA 물질은 폴리펩티드 코우팅 부위의 5'말단에 위치한 메탄올 반응성 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 캔디다, 클로케라, 사카로마이세스, 도로토롤라, 한세눌라, 토룰롭시스 및 피치아 속(屬)으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  87. 제1항에 있어서, 상기 영양배지는 적어도 하나의분해대사질 비-억제 탄소원으로 구성되고; 상기 재조합 DNA 물질은, 형질전환 효모균주와 접촉되는 배지내의 분해대사질비-억제 탄소원 존재에 대한 반응성이 있고 상기 폴리펩티드 코우팅 부위의 5' 말단에 위치하는 DNA 단편으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 분해대사질 비-억제탄소원이 글리세롤과 갈락토즐부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주가 캔디다, 클로케라, 시카로마이세스, 로도토롤라, 한세눌라, 토롤롭시스, 피치아, 시조사카로마이세스 및 클루이베로마이세슬부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  90. 제1항에 있어서, 상기 영앵배지는 적어도 하나의 에너지원으로 구성되고; 상기 재조합 DNA 물질은, 형질전환 효모균주를 전술한 바와같은 적어도 하나의 분해대사질 억제탄소 및 에너지원상에서 배양한후 형질전환 효모균주와 접촉되는 배지내에서의 탄소원 기아현상에 대한 반응성이 있고 상기 폴리펩티드 코우팅 부위의 5' 말단에 위치하는 조절부위로 구성되며;단계(a)의 생성물에게 탄소원 기아조건을 가해줌을 특징으로 하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 적어도 하나의 분해대사질억제탄소 및 에너지원이 포도당, 에탄올 및 과당으롭터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  92. 제90항에 있어서, 상기 분해대사질억제 탄소원이 포도당임을 특징으로 하는 방법.
  93. 제90항에 있어서, 상기 형질전환 효모균주 캔디다, 클로케라, 사카로마이세스, 로도토롤라, 한세눌라, 토롤롭시스, 피치아, 시조사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 속(屬)으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  94. 제1항 내지 제93항중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드를 분리하고 정제하는 것으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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