CN113481231B - 一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株构建方法及获得的菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株构建方法及获得的菌株,所述方法包括将所述菌株中包含的prfA基因的表达改造为可受控制。利用本发明的方法构建的菌株能够高效的生产出含非天然氨基酸的完整蛋白,大幅度降低截断蛋白产生的同时,菌株还能够保持高速生长。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及生产非天然氨基酸的菌株的构建。
背景技术
琥珀密码子(amber)UAG是在大肠杆菌中的使用频率最低的终止密码子,大约7%,当被改造成编码某种非天然氨基酸时,能够影响的内源蛋白质最少,所以是最常被用于建立基因密码子扩展技术的一种密码子。在普通大肠杆菌中通过辅助质粒表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶,再通过表达载体在重组蛋白的阅读框中定点引入琥珀密码子,就可以生产定点插入非天然氨基酸的重组蛋白。但是由于大肠杆菌胞内本身存在将琥珀密码子识别为终止密码子的肽链释放因子RF1,因此导致定点插入非天然氨基酸的重组蛋白产率较低,且存在大量因提前翻译终止而产生的不完整蛋白;甚至一些特殊重组蛋白的结构严重阻碍了某些位点非天然氨基酸插入,因而难以获得完整的含非天然氨基酸重组蛋白。通过直接基因敲除RF1的编码基因prfA来抑制RF1和非天然氨基酸竞争,会导致菌株生长速率大幅度降低,难以应用于工业化发酵生产。
发明内容
本发明通过对大肠杆菌中RF1蛋白表达的改造,解决上述现实问题。
在第一个方面,本发明提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株的构建方法,包括,将所述菌株中包含的prfA基因的表达改造为可受控制。
为实现该方法,可以将所述菌株基因组中prfA基因的表达改造为抑制表达或可诱导表达。
在一种实施方式中,将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达,同时向菌株中引入含有prfA基因、能够表达RF1的质粒,其中,所述质粒中的prfA基因的表达或复制受控制。
优选地,所述质粒中prfA基因的启动子为可诱导表达启动子,以实现可诱导表达。所述可诱导表达启动子如乳糖诱导的tac启动子(GenBank:K01728.1)、lacUV5启动子(GenBank:E02301.1)、T7启动子(GenBank:M38302.1)、T5启动子(GenBank:X00126.1)、阿拉伯糖诱导的araBAD启动子(GenBank:K00953.1)、热诱导的pR/pL启动子(Winstanley,C.,etal."Differential regulation of lambda pL and pR promoters by a cI repressorin a broad-host-range thermoregulated plasmid marker system."Applied andEnvironmental Microbiology 55.4(1989):771-777.)等。
优选地,所述质粒中prfA基因的复制起始位点为条件缺失型复制起始位点,实现质粒在特定条件下停止复制,从而达到控制prfA基因表达的目的。所述条件缺失型复制起始位点如高温条件缺失型复制起始位点pSG5(GenBank:NC_008792.1)、pSC101(GenBank:K00042.1)等。
优选地,将所述基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达是通过基因敲除、基因沉默、基因突变等方式实现,使基因组中的prfA基因不表达RF1蛋白。如,通过在prfA基因两端引入loxP位点,再在适当时间点使用Cre重组酶可诱导基因敲除。
在一种实施方式中,将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为可诱导表达,通过将基因组上的prfA基因启动子更换为可诱导表达启动子。
优选地,所述菌株为大肠杆菌。
其中,prfA基因(Genebank Gene ID:949002)的基因序列、可诱导表达启动子(例如乳糖诱导的tac启动子、lacUV5启动子、T7启动子、T5启动子,阿拉伯糖诱导的araBAD启动子、热诱导的pR/pL启动子等)和复制起始位点等元件都是本领域技术人员能够根据各种基因数据库可查到的。
进一步优选地,所述方法还包括,在菌株中引入编码与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的质粒,这样可以利用琥珀密码子(UAG)编码非天然氨基酸,通过在重组蛋白的编码框中定点插入琥珀密码子,可以生产定点插入非天然氨基酸的重组蛋白。所述与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的质粒如pUltra-pylRS辅助质粒,本领域技术人员可以利用addgene网站(https://www.addgene.org/collections/genetic-code-expansion/)找到相关信息。
在一种优选的实施方式中,一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株的构建方法,所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株,该方法包括:
(1)通过CRISPR技术敲除菌株基因组的prfA基因;
(2)构建含pSG5复制起始位点和araBAD启动子以及prfA基因的质粒;
(3)向步骤(1)得到的菌株基因组prfA基因敲除的菌株中转入步骤(2)的质粒和表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的辅助质粒,如pUltra-pylRS辅助质粒,即得。
在第二个方面,提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株,所述菌株能够表达与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶,并且所述菌株中prfA基因的表达受控制。
优选地,上述菌株通过本发明的方法构建获得。
在第三个方面,提供一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的方法,包括:将编码所述重组蛋白的基因引入本发明所述的菌株中,培养所述菌株,使其表达所述重组蛋白。
优选地,所述方法包括:1)构建prfA基因表达受控制的菌株;2)向菌株中引入表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的辅助质粒及表达目的重组蛋白的表达质粒;3)在菌株生长阶段,诱导prfA基因表达;在重组蛋白表达阶段,诱导prfA基因停止表达,同时诱导重组蛋白表达。
在本发明中,RF1的编码基因prfA的表达受到控制,可以获得接近100%将UAG用于编码非天然氨基酸的菌株,在菌株扩增阶段控制菌株产生足量RF1来维持菌株的高速生长,而在诱导表达阶段使pfrA基因不表达,从而接近100%的产能用于生产完整的重组蛋白。利用本发明的方法构建的菌株能够高效的生产出含非天然氨基酸的完整蛋白,大幅度降低截断蛋白产生的同时,菌株还能够保持高速生长。
附图说明
图1示出了大肠杆菌中prfA基因的敲除,其中图A为示意图,图B为筛选时凝胶电泳结果;
图2表示质粒pRF1图谱;
图3表示NCB21(DE3)、共转化了质粒pRF1和辅助质粒pUltra-pylRS的BL21(DE3)以及NCB21(DE3)-不含pRF1三个菌株的生长曲线图;
图4表示定点插入非天然氨基酸的蛋白质的表达情况比对。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。且下述的实施例所使用的实验方法若无特殊说明,均为常规的标准实验方法。下述的实施例中所用的实验材料和试剂等,若无特殊说明,均可从商业途径得到。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如J.萨姆布鲁克(Joseph Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件,或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。
以下实施例通过对菌株进行多步改造,从而获得能够高效生产定点插入非天然氨基酸重组蛋白的大肠杆菌菌株。简单概括包括了以下步骤:(1)通过CRISPR技术敲除菌株基因组的prfA基因,从而获得100%将琥珀密码子UAG用于编码非天然氨基酸的菌株;(2)构建一个温度敏感型(含pSG5复制起始位点)的质粒,该质粒上含有一个阿拉伯糖诱导表达的prfA基因(含araBAD启动子),且该质粒与表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的辅助质粒及表达目的重组蛋白的表达质粒相容,且筛选标记不同;(3)将步骤(2)构建的质粒与辅助质粒、重组蛋白表达质粒共转化至步骤(1)得到的菌株中即得最终的菌株;(4)通过在培养基中添加阿拉伯糖促进菌株高速生长,当进入诱导表达阶段则提高培养温度使温敏型质粒停止复制,添加IPTG诱导重组蛋白表达及非天然氨基酸定点插入,从而生产出含非天然氨基酸的重组蛋白。
实施例1.构建prfA基因敲除质粒
采用CRISPR技术,敲除BL21(DE3)菌株(购自Thermo ScientificTM,货号:EC0114)基因组(GenBank:AM946981.1)上的prfA基因。其具体操作如下:
首先使用引物prfA-tgF(SEQ ID NO.1)和引物prfA-tgR(SEQ ID NO.2)两条引物,以质粒pTargetF(ADDGENE#62226)为PCR模板,扩增出全长约2.5kb的DNA片段。将PCR产物纯化后,使用DpnI限制性内切酶切模板DNA,再将酶切产物进行纯化回收,然后转化Top10感受态细胞。以壮观霉素筛选重组转化子。并通过挑选重组转化子提取质粒后经测序获得质粒pTarget-prfA,序列为SEQ ID NO.3。该质粒表达的引导gRNA,可以引导Cas9蛋白将基因组上的prfA基因靶标位置双链DNA切断的功能。
prfA-tgF | ATGCCGAAGCCCGCCGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.1) |
prfA-tgR | CCAGCGGCGGGCTTCGGCATACTAGTATTATACCTAGGAC(SEQ ID NO.2) |
SEQ ID NO.3
质粒pTarget-prfA
CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCTGGATCCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTATGCCGAAGCCCGCCGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTAGATCTATTACCCTGTTATCCCTACTCGAGTTCATGTGCAGCTCCATAAGCAAAAGGGGATGATAAGTTTATCACCACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCGTGCTATGATCGACTGATGTCATCAGCGGTGGAGTGCAATGTCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAAGATGCCGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGCTCATAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCGCGAACGCGTAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA。
实施例2.构建无痕敲除prfA基因的同源重组的DNA片段
以BL21(DE3)的基因组DNA为PCR模板,使用引物prfA-5F和引物prfA-5R扩增prfA基因敲除过程中用于同源重组的5’端同源臂DNA片段。以BL21(DE3)的基因组DNA为PCR模板,使用引物prfA-3F和引物prfA-3R扩增prfA基因敲除过程中用于同源重组的3’端同源臂DNA片段。将上述两个同源臂DNA片段纯化回收后混合作为重叠PCR模板,使用引物prfA-5F和引物prfA-3R进行重叠PCR,得到用于同源重组的DNA片段,该片段含有约0.48kb的5’端同源臂和约0.45kb的3’端同源臂。
prfA-5F | CCAGGCAGAGCAAGTT(SEQ ID NO.4) |
prfA-5R | GGGAAGTTGTAAGTCATCTCACGCATTTCAG(SEQ ID NO.5) |
prfA-3F | AAATGCGTGAGATGACTTACAACTTCCCACAGG(SEQ ID NO.6) |
prfA-3R | GCTCCACCAGACACTCCGT(SEQ ID NO.7) |
实施例3.构建prfA基因缺失的菌株
首先在BL21(DE3)菌株中通过转化引入质粒pCAS(ADDGENE,#60847),再使用得到的菌株制备感受态细胞,在制备感受态细胞的过程中培养基添加20mM阿拉伯糖,诱导pCAS质粒上的λred系统表达。使用上述制备的同源重组片段和质粒pTarget-prfA进行共转化,并经过卡那霉素和壮观霉素共筛选得到候选的单菌落。将候选的单菌落进行菌落PCR验证,使用引物prfA-5uF和引物prfA-3dR进行PCR验证,如图1A所示,正确敲除产物约1.6kb,而未成功敲除的菌株PCR产物则约2.3kb,如图1B所示,挑选的10个候选单菌落中又有8个符合正确敲除的结果。再将正确敲除了prfA基因的菌株进行培养,30℃条件下,在培养基中添加IPTG诱导进行pTarget-prfA质粒消除,再通过将培养温度调高到37℃消除pCAS质粒,最终得到prfA基因缺失且不含任何质粒的菌株BL21(DE3)::ΔprfA。
prfA-5uF | GTGATTGCCCTGAGTGA(SEQ ID NO.8) |
prfA-3dR | TGAAGATGTGGGTCCTG(SEQ ID NO.9) |
实施例4.构建条件缺失并且可诱导表达RF1的质粒
以BL21基因组DNA作为PCR模板,使用引物RF1-F和RF1-R扩增prfA基因的开放阅读框及3’端的序列,得到约1.15kb的DNA片段。以pCAS质粒DNA为PCR模板,使用引物Ara-F和引物Ara-R扩增含有araC基因和araB启动子的约1.28kb的DNA片段。以pCAS质粒DNA为PCR模板,使用引物Rep101-F和引物Rep101-R扩增含有温敏型复制起始位点pSG5和卡那霉素抗性基因的约2.93kb的DNA片段。将3个PCR扩增得到的DNA片段,纯化回收后使用HiFi DNAAssembly Master Mix试剂(NEB#E5520S)进行重组连接,然后将重组产物转化Top10感受态细胞。使用卡那霉素筛选重组子,并在30℃条件下培养。挑选重组子提取质粒并进行酶切和测序验证,得到质粒pRF1,图谱见图2。
RF1-F | CTAAGGAGGTTATAAAAAATGAAGCCTTCTATCGTT(SEQ ID NO.10) |
RF1-R | AAGGCGAAGCGGCATGCTTTCAGCATCACGCCGCG(SEQ ID NO.11) |
Ara-F | ACGTGGCTTTCCCTGCAGTAGGGGTTCCGCGCACAT(SEQ ID NO.12) |
Ara-R | AACGATAGAAGGCTTCATTTTTTATAACCTCCTTAG(SEQ ID NO.13) |
Rep101-F | CGCGGCGTGATGCTGAAAGCATGCCGCTTCGCCTT(SEQ ID NO.14) |
Rep101-R | ATGTGCGCGGAACCCCTACTGCAGGGAAAGCCACGT(SEQ ID NO.15) |
实施例5.获得能够应用于高效生产定点插入非天然氨基酸重组蛋白的大肠杆菌菌株。
将质粒pRF1和辅助质粒pUltra-pylRS(Chatterjee A,Sun S B,Furman J L,etal.AVersatile Platform for Single-and Multiple-Unnatural Amino AcidMutagenesis in Escherichia coli[J].Biochemistry,2013,52(10):1828-1837.)共转化实施例3获得的BL21(DE3)::ΔprfA感受态细胞,使用壮观霉素和卡那霉素共同筛选转化子,挑选得到同时获得两种抗性的菌株,命名为NCB21(DE3),该菌株即可应用于高效生产定点插入非天然氨基酸的重组蛋白。培养该菌株并制备感受态细胞。30℃温度培养条件下使用添加1mg/mL阿拉伯糖的LB培养基进行培养,对比共转化了质粒pRF1和辅助质粒pUltra-pylRS的BL21(DE3)菌株、NCB21(DE3)菌株(共转有质粒pRF1和pUltra-pylRS)以及仅转化辅助质粒pUltra-pylRS的prfA基因敲除菌株NCB21(DE3)-不含pRF1,结果见图3,可以看到BL21(DE3)和NCB21(DE3)生长差异较小,证明pRF1质粒对prfA基因缺失菌株的生长有明显促进作用。
实施例6.NCB21(DE3)菌株用于生产非天然氨基酸定点插入重组蛋白
将质粒pET21a-rhGH-K145转化NCB21(DE3)的感受态细胞,该质粒为商业化pET21a(Novagen)的多克隆位点插入重组人生长激素rhGH的编码阅读框,且其第145氨基酸的密码子被替换为琥珀密码子UAG。挑取转化后的单克隆,接种于含氨苄青霉素100mg/L、壮观霉素100mg/L、卡那霉素100mg/L、0.5g/L阿拉伯糖的LB培养基中,30℃180rpm培养过夜。以1/100的接种量,将活化后的菌液接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L、壮观霉素100mg/L、卡那霉素100mg/L、0.1g/L阿拉伯糖的LB培养基中,37℃180r/min振荡培养至OD600约为0.5~0.8,加入诱导剂IPTG至终浓度1mM,加入非天然氨基酸NAEK至终浓度1mM,37℃180r/min诱导培养24h。诱导结束后,取1mL菌液12000g离心,弃上清收集菌体,用100μL PBS重悬菌体,并进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,结果如图4所示。使用NCB21(DE3)进行表达时基本没有不完整蛋白产生,而作为对照的BL21(DE3)菌株,在共转化辅助质粒pUltra-pylRS和表达质粒pET21a-rhGH-K145一起表达的情况下会有大量的不完整蛋白积累。
上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株的构建方法,其中,将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达,同时向菌株中引入含有prfA基因、能够表达RF1的质粒,其中,所述质粒中的prfA基因的表达或复制受控制,即,所述表达受控制为可诱导表达,所述复制受控制为实现质粒在特定条件下停止复制、从而达到控制prfA基因表达的目的;所述质粒中prfA基因的启动子为araBAD启动子,所述质粒中prfA基因的复制起始位点为高温条件缺失型复制起始位点pSG5或pSC101;
所述方法还包括,在菌株中引入编码与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的质粒,所述编码与天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶正交的非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的质粒为pUltra-pylRS辅助质粒;
其中,含有prfA基因、能够表达RF1的质粒与pUltra-pylRS辅助质粒及表达目的重组蛋白的表达质粒相容,且筛选标记不同。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其中,将所述菌株基因组中的prfA基因的表达改造为抑制表达是通过基因敲除、基因沉默或基因突变实现。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其中,所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株,该方法包括:
(1)通过CRISPR技术敲除菌株基因组的prfA基因,得到步骤(1)菌株;
(2)构建含pSG5复制起始位点和araBAD启动子以及prfA基因的质粒;
(3)向步骤(1)得到的菌株中转入步骤(2)的质粒和pUltra-pylRS辅助质粒。
4.一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的菌株,所述菌株通过权利要求1~3任一项所述的方法构建获得。
5.一种生产含非天然氨基酸重组蛋白的方法,包括:将编码所述含非天然氨基酸重组蛋白的基因引入权利要求4所述的菌株中,培养所述菌株,使其表达所述含非天然氨基酸重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述方法包括:1)构建prfA基因表达受控制的菌株;2)向菌株中引入表达非天然氨基酸tRNA/tRNA合成酶的辅助质粒及表达目的含非天然氨基酸重组蛋白的表达质粒;3)在菌株生长阶段,诱导prfA基因表达;在含非天然氨基酸重组蛋白表达阶段,诱导prfA基因停止表达,同时诱导含非天然氨基酸重组蛋白表达。
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