CN102286519A - 一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体 - Google Patents

Abstract

一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体，属于微生物、基因工程技术领域。本发明对T4噬菌体溶菌酶基因密码子组成及限制性核酸内切酶识别位点进行优化，将优化后的T4溶菌酶基因突变体lyMu与经过改造的大肠杆菌表达载体进行重组，获得重组表达载体pEly。表达载体pEly可以用于在大肠杆菌中诱导表达外源基因，在外源基因被诱导表达时T4溶菌酶也同时表达。经诱导表达的细胞经EDTA溶液处理后即自行裂解并释放出细胞内的表达产物。本发明实施后获得的表达载体可以实现多种外源蛋白在大肠杆菌宿主中的表达，宿主菌经EDTA处理释放出表达产物，有利于表达产物的回收。本发明在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。

Description

一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段构建大肠杆菌表达载体，属于微生物、基因工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是现代基因工程中最常用的宿主，具有操作方便、产量高等优点，是表达外源蛋白最常用的宿主。但是大肠杆菌作为蛋白表达宿主也存在着许多缺点，其中之一是大肠杆菌表达外源蛋白时目的产物一般存在于细胞内或周质中，很少有产物能分泌到细胞外。回收胞内产物首先面对的问题就是细胞的破壁问题。大肠杆菌细胞壁外面还有一层外膜，因此使用溶菌酶进行破壁时需要添加表面活性剂破坏外膜，而表面活性剂本身就是蛋白质变性剂，会导致许多目的产物失去活性。因此大肠杆菌的破壁往往需要采用一些物理方法。但是这些方法往往存在一些固有的缺点：机械设备比较昂贵，使用过程中能量消耗较大，同时其产生的机械剪切力也可能会使目的产物失活。

T4噬菌体是一种大肠杆菌烈性噬菌体，在感染大肠杆菌的后期，T4噬菌体会表达两种与其释放有关的蛋白，溶菌酶和穿孔素。溶菌酶具有分解肽聚糖使细菌裂解的功能，但T4噬菌体的溶菌酶自身不带信号肽，只存在于细胞质中无法接触到细胞壁，因此T4溶菌酶本身不能导致宿主菌的裂解。穿孔素蛋白能够改变细胞质膜的通透性，使得溶菌酶可以穿过细胞质膜进入周质空间，进而作用于细胞壁。研究发现EDTA也具有改变细胞膜通透性的功能[修志龙，姜炜，苏志国.细胞破碎技术的研究进展和发展方向.化工进展，1994，(1)：15-21]，在进行细胞裂解时可以替代穿孔素。本专利发明人曾尝试将T4溶菌酶基因与嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因串联表达，在基因表达后期成功利用EDTA实现了宿主菌的裂解及重组过氧化氢酶的回收。然而酶活检测发现，用这一方法回收的重组过氧化氢酶只有重组菌表达的过氧化氢酶总量的50％左右[段叙果，沈微等.可控裂解的产耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建.硕士学位论文，无锡：江南大学，2006]。初步研究发现，裂解液中有大量的菌体没有被完全裂解，推测这一现象可能与重组菌中T4溶菌酶表达量过低有关。对T4溶菌酶密码子组成分析显示，其结构基因中存在多个大肠杆菌稀有密码子，可能是影响蛋白表达量的重要原因。在大肠杆菌细胞中，编码精氨酸的两个密码子AGG和AGA对表达影响最大。在T4溶菌酶基因中存在3个AGA，如能将其突变为大肠杆菌常用的密码子则很可能显著提高T4溶菌酶的表达水平。本发明主要采用定点突变技术优化T4溶菌酶密码子组成并同时优化T4溶菌酶基因的核酸内切酶识别序列。利用经优化的突变基因构建实现大肠杆菌可控裂解的表达载体pEly。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：构建可以用EDTA或其他温和的物理和化学方法控制宿主菌裂解的大肠杆菌表达载体，为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供既能高表达目的产物又便于产物回收的表达载体。

本发明的技术方案：

1、首先利用PCR及定点突变技术，获得密码子及限制性核酸内切酶识别位点优化的T4噬菌体溶菌酶编码基因，命名为lyMu，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。其具有如下特点：1)基因中不含不利于基因表达的密码子AGA；2)基因中不含不利于载体构建的限制性核酸内切酶EcoR I和Mlu I的识别位点，有利于构建重组载体，有利于由此构建的重组载体的应用。

基因lyMu的获得方法：

(1)位于T4溶菌酶基因两端的密码子AGA的定点突变

T4噬菌体的溶菌酶基因，即T4溶菌酶基因，命名为T4 lys，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。对T4溶菌酶结构基因分析显示，其编码精氨酸的密码子中有3个为AGA，为大肠杆菌中对基因表达影响较大的密码子。这3个AGA密码子一个靠近基因的5’端，一个靠近基因3’端。这两个密码子可以在使用PCR方法扩增基因时直接进行突变。在靠近3’端的AGA密码子下游含有一个Mlu I识别位点。Mlu I是基因工程中常用酶切位点，如保留在基因中会对以后构建表达载体及载体的应用带来不便，因此在优化密码子的同时将其突变去除。据此设计长引物用PCR方法扩增T4溶菌酶基因，在PCR过程中实现上述突变。基因扩增产物与pMD18-T Simple载体连接，获得重组质粒。重组质粒命名为pMD-T4ly。

(2)位于T4溶菌酶基因中部的密码子AGA的突变

位于T4溶菌酶编码区238～240位点的密码子AGA难以在基因扩增时实现突变，本发明采用反向PCR方法实现定点突变。对该密码子附近序列分析显示，该基因上游有一EcoR I识别位点。EcoR I是基因工程中最常用的核酸内切酶，如保留在基因中会对以后构建表达载体及载体的应用带来不便，本发明在优化密码子时将该位点一起去除。进一步分析EcoR I识别位点附近序列，如果将EcoRI识别位点上游编码Val的密码子GTT突变为其同义密码子GTC则其下游序列TCGCGG将突变为CCGCGG，即内切酶Sac II的识别位点，基因编码的氨基酸序列不会发生变化。据此设计引物将极大方便定点突变的操作。为此设计并合成一对反向PCR引物，进一步以pMD-T4ly为模板进行反向PCR，扩增产物用Sac II酶切后自连接，获得重组质粒，对所获得的重组质粒测序，序列分析结果显示所获重组质粒中所设计的突变均已实现，突变后的基因命名为lyMu，重组质粒命名为pMD-lyMu。突变后的基因lyMu的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2、控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体，命名为pEly，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。表达载体pEly的大肠杆菌转化子，分类命名为Escherichia coli/pEly，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011212，pEly载体中含有所述密码子及限制性核酸内切酶识别位点优化的T4溶菌酶编码基因lyMu。

表达载体pEly的获得方法：

(1)表达载体pEtac的改造

表达载体pEtac是本专利发明人早期构建的大肠杆菌表达载体[沈微，王正祥，唐雪明等.古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达.中国酿造，2003，124(1)：12-14.]。这个载体以tac启动子控制外源基因表达，但在tac启动子上游存在多个基因工程中常用的酶切位点，以此为基础构建的表达载体可能给后续应用带来不便，需要除去。pEtac2切除了原质粒中tac启动子上游BamH I和Bgl II酶切位点之间的片段，去除了tac启动子上游多个酶切位点。

(2)表达载体pEly的构建

酶切质粒pMD-lyMu，电泳分离回收lyMu基因片段，与质粒pEtac2连接，获得pEly质粒。表达质粒pEly以tac启动子控制外源基因表达，启动子下游多克隆位点含有10个可供选择的酶切位点。多克隆位点下游为T4溶菌酶基因的突变体lyMu基因，lyMu基因带有独立的SD序列，可以与外源基因共转录后独立翻译获得T4溶菌酶，通过添加EDTA等试剂可控制宿主大肠杆菌的自裂解。

3、所述的控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体的应用：利用pEly实现外源基因的表达并利用添加EDTA的方法实现宿主菌的裂解。

材料和方法

普通分子生物学方法：

除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。

引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。

克隆载体pMD18-T Simple为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号为D506A。

反向PCR技术参照文献进行[Ochman H，Gerber AS and Hartl DL(1988)Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction.Genetics 120：621-623]。

Escherichia coli JM109有时简写为E.coli JM109或称为大肠杆菌JM109为大连宝生物工程有限公司产品。

含过氧化氢酶的重组质粒pBV220-perA为本专利发明人前期工作中构建[段叙果，沈微等.耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建及其发酵条件.食品与生物技术，2006，25(2)：74-78.]。

大肠杆菌表达载体pEtac为本专利发明人在前期工作中构建[沈微，王正祥，唐雪明等.古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达.中国酿造，2003，124(1)：12-14.]。

含有野生型T4噬菌体溶菌酶基因T4 lys的质粒pHS1403由美国Oregon州立大学霍华德休斯医学研究所的Brian W.Matthews教授赠送。

DNA操作使用的酶和试剂盒

除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品Ex Taq，产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时附赠，缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶中回收DNA片段的试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号分别为DV807A和DV805A。

其他试剂，

除非提及，所有试剂及培养基配制中使用的水均为蒸馏水。

大肠杆菌裂解实验试剂

EDTA(100mmol/L)溶液：称取18.6g Na₂EDTA，加入约800mL水，然后用NaOH滴定至pH 7.0，再定容至1L。

Tris(100mmol/L)溶液：称取1.2g Tris固体溶于100mL水中。

HCl(100mmol/L)溶液：取浓盐酸1.6mL稀释于200mL的水中。

Tris-HCl(50mmol/L)溶液：量取50mL 100mmol/L的Tris溶液与29.2mL 100mmol/L的HCl溶液混匀，稀释至100mL，得到pH 8.0的Tris-HCl溶液。

Buffer TE(EDTA浓度为10mmol/L，Tris-HCl浓度为2mmol/L)：加入100mmol/L的EDTA 400μL，50mmol/L的Tris-HCl 160μL，再定容至4mL。

Buffer T(Tris-HCl浓度为2mmol/L)：加入50mmol/L的Tris-HCl 160μL，再定容至4mL。

诱导大肠杆菌基因表达使用的IPTG为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号为D9030A。

过氧化氢为国产分析纯试剂

培养基

LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。

过氧化氢酶酶活检测方法

过氧化氢酶酶活检测按文献[段叙果，沈微等.耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建及其发酵条件.食品与生物技术，2006，25(2)：74-78.]描述进行。

本发明的有益效果：本发明实施后获得的表达载体pEly可用于多种蛋白在大肠杆菌中的表达，表达宿主菌可以用EDTA或其他温和的化学试剂控制裂解，便于产物的回收。本发明为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供既能高表达目的产物又便于产物回收的表达载体。

生物材料样品保藏：表达载体pEly的大肠杆菌转化子，分类命名为Escherichia coli/pEly，已保藏在中国典型培养物保藏中心，该中心地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2011年6月24日，保藏编号为CCTCC NO：M 2011212。

附图说明

图1大肠杆菌表达载体pEtac2的物理图谱。

图中符号意义如下：Ptac：大肠杆菌tac启动子；Tt7：来源于T7噬菌体的转录终止子；Kan^r：卡那霉素抗性基因；ori：来源于大肠杆菌质粒pBR322的大肠杆菌质粒复制原件；lacI：大肠杆菌乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因。

图2控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体pEly的物理图谱。

图中符号意义如下：Ptac：大肠杆菌tac启动子；lyMu：密码子及核酸内切酶识别位点优化的T4溶菌酶编码基因，该基因没有独立的启动子但有独立的SD序列。Tt7：来源于T7噬菌体的转录终止子；Kan^r：卡那霉素抗性基因；ori：来源于大肠杆菌质粒pBR322的大肠杆菌质粒复制原件；lacI：大肠杆菌乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因。表达质粒pEly以tac启动子控制外源基因表达，启动子下游多克隆位点含有10个可供选择的酶切位点。多克隆位点下游为T4溶菌酶基因的突变体lyMu基因，lyMu基因带有独立的SD序列，可以与外源基因共转录后独立翻译获得T4溶菌酶，通过添加EDTA等试剂可控制宿主大肠杆菌的自裂解。

图3重组菌E.coli/pEly在不同缓冲液中的裂解照片。

1.E.coli/pEly在Buffer TE中的裂解情况；2.E.coli/pEly在Buffer T中的裂解情况。

具体实施方式

通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：T4溶菌酶基因的密码子及核酸内切酶识别位点优化

1)位于基因两端的密码子AGA的定点突变

原始的T4溶菌酶结构基因全序列为SEQ ID NO：3。对T4溶菌酶结构基因分析显示，其编码精氨酸的密码子中有3个为AGA，为大肠杆菌中对基因表达影响较大的密码子，会严重降低基因的表达水平。这3个密码子一个靠近基因的5’端，一个靠近基因3’端。这两个密码子可以在使用PCR方法扩增基因时直接进行突变。在靠近3’端的AGA密码子下游含有一个Mlu I识别位点。Mlu I是基因工程中常用酶切位点，如保留在基因中可能对以后构建表达载体及载体的应用带来不便，因此本发明在优化密码子的同时将其突变去除。据此设计两条长引物如下：

Ply 01：

5’-AATT

TAGGCCTTAGGATCCAGGTACCAACGCGTCTGCAGGCTAGCTTAACAAGGTTCAAAATTAAGGAGGTAACTT

AATATATTTGAAATGTTACGTATAGATGAACGTCTT

CTTAAA ATCTATAA-3’(SEQ IDNO：4)

Ply 02：

5’-AATT

AATTGTCGACTTATAGATTTTTAT

CCCAAGTGCCAGT

AAACGTTGTAATGAC-3’(SEQ ID NO：5)

引物Ply 01与T4溶菌酶基因5’端一致，其中稀有密码子AGA在引物中改成大肠杆菌常用的密码子CGA(以方框粗体显示)。在结构基因起始密码子ATG上游引入控制翻译起始的SD序列(以单下划线显示)，为便于操作引物Ply 01中引入多个内切酶识别位点。

引物Ply 02与T4溶菌酶基因3’端互补，其中密码子AGA更改为CGA(引物中为互补序列TCG，以方框粗体显示)。引物中Mlu I识别位点ACGCGT更改为ATGCGT(以方框显示)。

以含有野生型T4噬菌体溶菌酶基因T4 lys的质粒pHS1403为模板，以Ply01、Ply 02为引物进行PCR扩增，获得一个0.6kb左右的扩增片段，纯化后与pMD 18-T Simple连接，在氨苄青霉素平板上筛选转化子。任选一个转化子提取质粒后用Sal I酶切，电泳鉴定。结果显示，该质粒经Sal I酶切后获得2.6kb和0.6kb大小的两个片段，符合T4溶菌酶基因扩增产物与pMD18-T载体重组质粒应有特征。质粒命名为pMD-T4ly。

2)位于基因中部的密码子AGA的突变

位于T4溶菌酶编码基因(SEQ ID NO：3)238～240位点的密码子AGA难以在基因扩增时实现突变，本发明采用反向PCR方法实现定点突变。对该密码子附近序列分析显示，该基因上游有一EcoR I识别位点。EcoR I是基因工程中最常用的核酸内切酶，如保留在基因中可能对以后构建表达载体及载体的应用带来较大不便，本发明在优化密码子时将该位点一起去除。进一步分析EcoR I识别位点附近序列，如果将EcoR I识别位点上游编码Val的密码子GTT突变为其同义密码子GTC则其下游序列TCGCGG将突变为CCGCGG，即内切酶Sac II的识别位点。据此设计引物将极大方便定点突变的操作。为此设计反向PCR引物如下：

Plyr 01：5’-AATTTG

AATGCTAAATTAAAAC-3’(SEQID NO：6)

Plyr 02：5’-AATTACAGCAGCATCAAC-3’(SEQ ID NO：7)

引物Plyr 01与编码链序列一致，其中T4溶菌酶结构基因238～240位置的Arg密码子AGA更改为大肠杆菌常用密码子CGT(方框粗体显示)。与原序列中EcoR I识别位点GAATTC对应的序列更改为GTATTC。与T4溶菌酶原始基因中TCGCGG(225～230)对应的序列更改为CCGCGG(以方框字符底纹显示)，即Sac II识别位点。

引物Plyr 02序列与模板链一致，其中与原基因中CCGCGT对应的序列更改为CCGCGG(以方框字符底纹显示)，即Sac II识别位点。

以pMD-T4ly为模板，以Plyr 01、Plyr 02为引物进行反向PCR，扩增产物用Sac II酶切后自连接，转化E.coli JM109，在氨苄青霉素平板上筛选转化子，任选20个转化子提取质粒，以EcoR I酶切后电泳检测。结果显示仅1个转化子所含质粒不能被EcoR I切开，可能已经实现了预计突变。将该质粒纯化后送上海生工生物工程公司测序，结果显示该质粒针对T4溶菌酶基因所设计的突变均已实现，突变后的基因命名为lyMu。突变后的基因核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

实施例2：质粒pEtac2构建

质粒pEtac以BglII和BamH I双酶切，酶切产物电泳分离回收其中约5.4kb左右的片段，纯化后自连接，连接产物转化E.coli JM109，在卡那霉素平板上筛选转化子。任选4个转化子提取质粒，以Bgl II酶切，结果显示4个质粒均不能被Bgl II切开，符合pEtac2应有特点。BglII和BamH I是同尾酶，酶切后产生相同粘末端，可以互相退火连接，但连接后原有酶切位点消失，两种酶均不能切开新的位点。原pEtac载体中Bgl II和BamH I位点之间有Nco I酶切位点，将BglII和BamH I位点之间的片段切除后Nco I将不能切开新的质粒。任选一个质粒酶切电泳显示，所选质粒不能被Bgl II和Nco I切开，但可以被EcoR I切开。在tac启动子下游的EcoR I依然存在所以可以被EcoR I切成线形。酶切鉴定结果显示所选质粒符合pEtac2质粒应有特点。

表达载体pEtac是本专利发明人前期构建的大肠杆菌表达载体。这个载体以tac启动子控制外源基因表达，但在tac启动子上游存在多个基因工程中常用的酶切位点，以此为基础构建的表达载体可能给后续应用带来不便。本发明获得的pEtac2切除了原质粒中tac启动子上游BamH I和Bgl II酶切位点之间的片段，去除了tac启动子上游多个酶切位点。载体pEtac2的物理图谱见附图1。

实施例3pEly表达载体的构建

质粒pMD-lyMu经Sal I酶切后电泳分离回收其中约580bp左右的lyMu基因片段。质粒pEtac2经Xho I酶切后与上述回收片段连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，在卡那霉素平板上筛选转化子。共选取20个转化子提取质粒，以这些质粒为模板，用下列引物进行PCR。

Ply 03：5’-TTACGTATAGATGAACGTC-3’(SEQ ID NO：8)

Pkan：5’-GTTTCATTTGATGCTCGATG-3’(SEQ ID NO：9)

PCR扩增条件为95℃变性5min，扩增反应25个循环(94℃50s，56℃60s，72℃1min)，延伸72℃5min。其中1个转化子所提质粒为模板PCR获得一1.2kb左右的扩增片段。引物Ply 03与T4溶菌酶结构基因5’端一致，引物Pkan与质粒pEtac2多克隆位点下游序列互补，只有当lyMu基因正向插入pEtac2多克隆位点获得的转化子质粒为模板才能扩增出1.2kb左右的片段。由此可见，所选质粒为lyMu基因正向插入pEtac2所获重组质粒，质粒命名为pEly。进一步以Mlu I酶切鉴定重组质粒pEly。质粒pEtac2多克隆位点上游1.1kb左右有一Mlu I酶切位点，lyMu基因5’端由引物带入一个Mlu I识别位点，如果lyMu基因正向插入pEtac2质粒则酶切后获得一1.1kb的短片段和一4.9kb左右的长片段。如果lyMu基因反向插入pEtac2质粒则酶切后获得一1.8kb左右的短片段和一4.2kb左右的长片段。酶切电泳结果显示，质粒pEly经Mlu I酶切后获得4.9kb和1.1kb大小的两个片段，与预计的lyMu基因正向插入所获重组质粒特征相符合，表明T4溶菌酶基因片段已经成功正向连接入pEtac2质粒中。所获质粒确实为pEly质粒。质粒pEly物理图谱如附图2所示。

实施例4用EDTA控制重组菌E.coli/pEly的裂解

接种重组菌E.coli/pEly于液体LB培养基中，培养至对数后期，加入IPTG至终浓度为5mmol/L，诱导3h。8,000r/m离心3min收集细胞，分别用含EDTA的Buffer TE和不含EDTA的Buffer T悬浮细胞。大约2h后，以Buffer TE悬浮的细胞悬液逐步变成透明而以Buffer T缓冲液悬浮的细胞悬液没有明显变化(附图3)。可见添加EDTA可以使重组菌E.coli/pEly自裂解。

实施例5以质粒pEly实现外源基因的表达及裂解回收

以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的过氧化氢酶基因为例，研究以pEly载体表达外源基因及通过自裂解释放目标产物的功能。以含有嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因(perA)的质粒pBV220-perA为模板，以下列引物进行PCR：

PperA 01：5’-AATTACCGGAATTCATGGAAAATCAAAATCGTCAG-3’(SEQID NO：10)

PperA 02：5’-AATTACCGCTGCAGTTAAGCGGTGACCGATTC-3’(SEQ IDNO：11)

PCR扩增获得一个2.1kb左右的片段，与过氧化氢酶基因perA一致，PCR片段用PCR产物纯化柱纯化后以EcoR I和Pst I酶切，与经相同酶切的质粒pEly连接，转化E.coli JM109，获得多个转化子。任选一个转化子提取质粒以Pst I和EcoR I酶切电泳，结果显示质粒经EcoR I和Pst I酶切后获得6.0kb和2.1kb大小的两个片段，与perA基因插入表达载体pEly后获得的重组质粒pEly-perA应有特征一致。可见上述质粒即为pEly-perA。在重组质粒pEly-perA中，过氧化氢酶基因perA和T4溶菌酶基因突变体lyMu均位于tac启动子下游，在tac启动子控制下两条基因被共同转录在一条mRNA上，由于两条基因上游均有独立的翻译控制区所以能独立翻译产生各自编码的蛋白。含重组质粒pEly-perA的重组大肠杆菌命名为Escherichia coli/pEly-perA，简写为E.coli/pEly-perA。

接种重组菌E.coli/pEly-perA于液体LB培养基中，培养至对数后期，加入IPTG至终浓度为5mmol/L，诱导3h。8,000r/m离心3min收集细胞，分别用含EDTA的Buffer TE和不含EDTA的Buffer T悬浮细胞。大约2h后分别检测上清液酶活。结果显示，Buffer TE悬浮细胞获得的上清液中过氧化氢酶酶活为65U/mL，以Buffer T悬浮细胞获得的上清液中过氧化氢酶酶活力为3.6U/mL。另一份以Buffer T悬浮细胞后以超声波进行细胞破碎，检测结果显示以超声波破碎细胞获得的破碎液酶活为78U/mL。假设超声波破碎细胞对酶的回收率为100％，则以Buffer TE处理细胞获得的回收率为83％。可见载体pEly能成功实现外源蛋白的表达，通过EDTA的处理绝大部分的目标产物能通过细胞裂解而释放到培养液中。显然，载体pEly也可用于其他蛋白在大肠杆菌宿主中的表达。

Claims (5)

1.一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体，命名为pEly，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.权利要求1所述表达载体构建过程中获得的密码子及限制性核酸内切酶识别位点优化的T4噬菌体溶菌酶编码基因，命名为lyMu，其核苷酸序列为SEQID NO：2。

3.根据权利要求2所述基因lyMu，其特征在于：

(1)基因中不含不利于基因表达的密码子AGA；

(2)基因中不含不利于载体构建的限制性核酸内切酶EcoR I和Mlu I的识别位点。

4.权利要求1所述表达载体pEly的大肠杆菌转化子，分类命名为Escherichiacoli/pEly，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011212；pEly载体中含有权利要求2所述密码子及限制性核酸内切酶识别位点优化的T4溶菌酶编码基因lyMu。

5.权利要求1所述的控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体的应用，其特征在于：利用pEly实现外源基因的表达并利用添加EDTA的方法实现宿主菌的裂解。

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