DD254211A5 - Verfahren zur herstellung von plypeptiden - Google Patents

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David W Stroman
Paul F Brust
Steven B Ellis
Thomas R Gingeras
Michael M Harpold
Juerg F Tschopp
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Philips Petroleum Comp.
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, bestehend in der Zuechtung eines transformierten Hefestammes in einem Naehrmedium, wobei der genannte transformierte Hefestamm in der Lage ist, eine eingelagerte Polypeptidcodiersequenz zu expremieren, welche von rekombinierenden DNA-Material abgeleitet ist. Das erfindungsgemaesse Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass das genannte rekombinierende DNA-Material einen regulatorischen Bereich, der bestimmten Bedingungen genuegen muss, und einen Polypeptidcodierungsbereich umfasst, wobei der genannte regulatorische Bereich in der Lage ist, die Transkription von Messenger-RNA zu kontrollieren, wenn er sich am 5-Ende des genannten Polypeptidcodierungsbereiches, welcher die Produktion der genannten Messenger-RNS codiert, befindet, wobei das genannte Naehrmedium so beschaffen ist, dass es die bestimmten Bedingungen des regulatorischen Bereiches erfuellt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden.
Allgemein betrifft die Erfindung das Gebiet der Rekombinant-DNA-Biotechnik. Nach einem der Aspekte betrifft die Erfindung DNA-Fragmente, welche die Transkription der DNA in die Oberträger-RNA und die Initiierung und Beendigung der Übertragung der Überträger-RNA in Protein regulieren. Nach einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Expressionsvektoren, welche die oben genannten DNA-Fragmente einschließen. Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung neuartige Mikroorganismen, die mit den genannten Expressionsvektoren transformiert werden.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Mit der Entwicklung der Rekombinant-DNA-Technik in den letzten Jahren wurde die gesteuerte Produktion einer gewaltigen Vielfalt von brauchbaren Polypeptiden durch Mikroorganismen möglich. Viele eukaryotische Polypeptide, wie beispielsweise das menschliche Wachstumshormon, Leukozytinterferone, menschliche Insulin und menschliches Proinsulin, wurden bereits durch verschiedene Mikroorganismen produziert. Die weiterführende Anwendung der bereits zur Verfügung stehenden Technik wird es nach den Erwartungen in der Zukunft ermöglichen, eine Vielzahl anderer brauchbarer Polypeptiderzeugnisse durch Mikroorganismen zu produzieren.
Die Grundmethoden, die auf dem Gebiet der Rekombinant-DNA-Technik angewendet werden, sind Fachleuten bekannt. Zu den Elementen, die günstigerweise vorhanden sind, damit ein Wirtsmikroorganismus für die Durchführung der Rekombinant-DNA-Technik nützlich sein kann, gehören die nachstehend genannten, sie sind aber nicht auf diese beschränkt: -(1) ein Gen, das eines oder mehrere gewünschte Polypeptide verschlüsselt und mit den für die Expression im Wirtsmikroorganismus erforderlich angemessenen Steuerfolgen versehen ist,
(2) ein Vektor, in der Regel ein Plasmid, in welchen das Gen eingefügt werden kann. Der Vektor dient als Garantie für die Übertragung des Gens in die Zelle und die Erhaltung der DNA-Folgen in der Zelle sowie einen hohen Expressionswert des genannten Gens, und
(3) ein geeigneter Wirtsmikroorganismus, in welchen der Vektor, der das gewünschte Gen trägt, transformiert werden kann, wobei der Wirtsmikroorganismus auch den Zellularapparat hat, der die Expression der durch das eingefügte Gen kodierten Information ermöglicht.
Ein in der Rekombinant-DNA-Technik angewendetes Grundelement ist das Plasmid, eine extrachromosomale, doppelsträngige DNA, die in einigen Mikroorganismen vorhanden ist. Wenn Plasmide natürlicherweise in Mikroorganismen festgestellt wurden, traten sie oft in Mehrfachkopien je Zelle auf. Neben den natürlich vorkommenden Plasmiden wurde eine Vielzahl von künstlich geschaffenen Plasmiden oder Hybridvektoren hergestellt. Zu der in der Plasmid-DNA verschlüsselten Information gehört die, welche zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen erforderlich ist, d.h., eine sich autonom replizierende Folge oder ein Replikationsursprung. In die Information, welche in der Plasmid-DNA kodiert wird, müssen auch ein oder mehrere phänotypische Selektionscharakteristika einbezogen werden. Die phänotypischen Selektionscharakteristika ermöglichen es, daß Klone der Wirtszellen, welche das interessierende Plasmid enthalten, erkannt und durch bevorzugtes Wachstum der Zellen in selektiven Medien ausgewählt werden.
Der Nutzen von Plasmiden liegt in der Tatsache, daß sie durch die eine oder andere Restriktionsendonuklease oder das eine oder andere Restriktionsenzym, welche jeweils eine spezifische, einzigartige Stelle an der Plasmid-DNA erkennen, spezifisch geteilt werden können. Dadurch können homologe Gene, heterologe Gene, d.h., Gene, die von anderen Organismen als dem Wirt abgeleitet wurden, oder Genfragmente in das Plasmid einbezogen werden durch die Verbindung des geteilten Plasmids und des gewünschten genetischen Materials an den Enden der Teilungsstelle oder an rekonstruierten Enden neben der Teilungsstelle. Das entstandene rekombinierte DNA-Material kann als Hybridvektor bezeichnet werden.
Die DNA-Rekombination erfolgt außerhalb des Wirtsmikroorganismus. Der resultierende Hybridvektor kann durch einen Prozeß in den Wirtsmikroorganismus eingeführt werden, welcher als Transformation bezeichnet wird. Durch Züchten des transformierten Mikroorganismus können große Mengen des Hybridvektors gewonnen werden. Wenn das Gen unter Bezugnahme auf die Abschnitte des Plasmids, welche die Transkription und Übertragung der verschlüsselten DNA-Meldung bestimmen, richtig eingefügt wurde, kann der resultierende Hybridvektor genutzt werden, die Produktion der Polypeptidfolge zu lenken, für die das eingefügte Gen die Kodierung vornimmt. Die Produktion von Polypeptid auf diese Weise wird als Genexpression bezeichnet.
Die Genexpression wird in einem DNA-Bereich eingeleitet, der als Promoterbereich bekannt ist. In derTranskriptionsphase der Expression entrollt sich die DNA, wodurch eine Schablone für die Synthese der Überträger-RNA geschaffen wird. RNA-Polymerase bindet sich an den Promoterbereich und bewegt sich längs der entrollten DNA von deren Ende 3' zum Ende 5', wobei die Information, welche im Kodierungsstrang enthalten ist, in die Überträger-RNA (mRNA) vom Ende 5' zum Ende 3' der mRNA transkribiert wird. Die Überträger-RNA ist wiederum durch Ribosome gebunden, wobei die mRNA in die Polypeptidkette übertragen wird. Jede Aminosäure wird durch ein Nukleotidtriplett oder darin befindlichen Kondon kodiert, in welchem sich das befindet, was man als strukturelles Gen bezeichnen könnte, d. h., der Teil des Gens, der die Aminosäürefolge des expressierten Produkts kodiert. Da drei Nukleotide den Kode für die Produktion jeder Aminosäure bilden, ist es möglich, daß die Nukleotidfolge auf drei unterschiedliche Weisen „gelesen" werden kann. Der spezifische Leserahmen, der das gewünschte Polypeptidprodukt kodiert, wird als richtiger Leserahmen bezeichnet.
Nach dem Binden an den Promoter transkribiert die RNA-Polymerase zuerst einen 5'-Leitabschnitt von mRNA, dann einen Translationsinitiierungs- oder Startkodon, gefolgt von den Nukleotidkodonen innerhalb des eigentlichen strukturellen Gens. Um das gewünschte Genprodukt zu erhalten, muß der Initiierungs-oder Startkondon richtig die Übertragung der Überträger-RNA durch das Riboson im richtigen Leserahmen einleiten. Schließlich werden am Ende des strukturellen Gens Stoppkodone übertragen, welche bewirken, daß zusätzliche Folgen der mRNA nicht in das Peptid durch Ribosome übertragen werden, auch wenn zusätzliche Folgen der mRNA durch die Wechselwirkung der RNA-Polymerase mit der DNA-Schablone gebildet wurden. Folglich bestimmen die Stoppkodone das Ende der Übertragung und damit das Ende der weiteren Einbeziehung von Aminosäuren in das Polypeptidprodukt. Das Polypeptidprodukt kann durch Auflösung der Wirtszelle und Gewinnung des
Produkts durch entsprechende Reinigung aus anderem mikrobischen Protein oder, unter bestimmten Umständen, durch Reinigung des Fermentierungsmediums, in welchem die Wirtszellen gezüchtet wurden und in welches das Polypeptidprodukt abgeschieden wurde, gewonnen werden.
In der Praxis kann die Anwendung der Rekombinant-DNA-Technik Mikroorganismen schaffen, die in der Lage sind, vollkommen heterologe Polypeptide zu expressieren, d. h., Polypeptide, die normalerweise nicht in einem gegebenen Mikroorganismus vorkommen oder von diesem produziert werden, — die sogenannte direkte Expression. Als Alternative dazu kann ein Fusionsprotein expressiert werden, d.h., ein heterologes Polypeptid, das mit einem Teil der Aminosäurefolge eines homologen Polypeptids verschmolzen ist, d. h., von Polypeptiden, die von dem Wildtyp (nicht-transformiertem Typ) des Wirtsmikroorganismus produziert werden oder in diesem vorkommen , — die sogenannte indirkete Expression. Bei der indirekten Expression wird das anfangs gewonnene Fusionsproteinprodukt manchmal für die vorgesehene Verwendung inaktiv gemacht, bis das verschmolzene homologe/heterologe Polypeptid in einer extrazellularen Umgebung getrennt wird. So hat beispielsweise die Zyanogenbromidtrennung von Methioninrückständen Somatostatin, Thymosin Alpha 1 und die Ketten der Komponente A und B des menschlichen Insulins aus verschmolzenen homologen/heterologen Polypeptiden erbracht, während die enzymatische Trennung der definierten Rückstände Beta-Endorphin ergab.
Bisher haben sich die kommerziellen Bestrebungen, bei denen die Rekombinant-DNA-Technik für die Produktion verschiedener Polypeptide angewendet wurde, auf Escherichia coli als Wirtsorganismus konzentriert. In einigen Fällen kann sich E. coli jedoch als Wirtals ungeeignet erweisen. Beispielsweise enthält E. coli eine Reihe toxischer pyrogener Faktoren, welche aus jedem Polypeptid entfernt werden müssen, das als pharmazeutisches Produkt genutzt werden soll. Der Wirkungsgrad, mit dem diese Reinigung erreicht werden kann, schwankt natürlich mit dem jeweiligen Polypeptid. Außerdem können die proteolytischen Aktivitäten von E. coli die Ausbeute bei einigen nutzbaren Produkten ernsthaft einschränken. Diese und andere Erwägungen haben zu einem verstärkten Interesse an anderen Wirten geführt, besonders zur Nutzung eukaryotischer Organismen für die Produktion von Polypeptidprodukten, die sich als vielversprechend erweist.
Die Verfügbarkeit von Mitteln für die Produktion von Polypeptidprodukten in eukaryotischen Systemen, z. B. Hefe, könnte wesentliche Vorteile gegenüber der Nutzung prokaryotischer Systeme wie E. coli für die Produktion von Polypeptiden, die durch Rekombinant-DNA kodiert sind, bringen. Hefe wird schon seit Jahrhunderten für großangelegte Fermentierungen angewendet, während Fermentieruhgen mit E. coli erst in jüngster Zeit im größeren Umfang durchgeführt werden. Hefe kann im allgemeinen zu einer höheren Zelldichte als Bakterien gezüchtet werden und kann der kontinuierlichen Fermentierungsverarbeitung leicht angepaßt werden. So wird das Wachstum von Hefe, beispielsweise Pichia pastoris, auf ultrahohe Zelldichten, d. h., Zelldichten von mehr als 100g/l, von Wegner in US-PS 4414329 (Patent der Phillips Petroleum Co.) beschrieben. Zu den zusätzlichen Vorteilen von Hefewirten gehört die Tatsache, daß viele kritische Funktionen des Organismus, z. B. die oxydative Phosphorylation, innerhalb von Organellen loziert sind und folglich nicht möglichen schädlichen Auswirkungen der Produktion von Polypeptiden, welche den Wirtszellen im Wildtyp fremd sind, durch den Organismus ausgesetzt sind. Als eukaryotischer Organismus kann sich Hefe als fähig erweisen, expressierte Polypeptidprodukte zu glykosylieren, wo eine solche Glykosylation für die Bioaktivität des Polypeptidprodukts wichtig ist. Möglich ist auch, daß Hefe als eukaryotischer Organismus dieselben Kodonpreferenzen wie höhere Organismen aufweist, was zu einer effektiveren Produktion von Expressionsprodukten aus Säugetiergenen oder vom komplementären DNA (cDNA) führen könnte, die aus der Umkehrtranskription von, beispielsweise Säugetier-mRNA gewonnen wurde.
Die Entwicklung von schlecht charakterisierten Hefespezies als Wirts-Vektorsysteme wird durch das fehlende Wissen um die Transformationsbedingungen und geeignete Vektoren stark behindert. Außerdem sind oft auxotrophe Mutationen nicht vorhanden, wodurch eine direkte Selektion für Transformanten durch auxotrophe Komplentation ausgeschlossen wird. Wenn die Rekombinant-DNA-Technik wirklich das halten soll, was sie verspricht, müssen neue Wirts-Vektorsysteme entwickelt werden.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Wirts-Vektorsysteme, welche die Manipulation von DNA erleichtern und die Expression der eingefügten DNA-Folgen optimieren, so daß die gewünschten Polypeptidprodukte unter gesteuerten Bedingungen und mit hoher Ausbeute hergestellt werden können.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zug runde, einen neuartigen regulatorischen Bereich zu schaffen, der auf das Vorhandensein von Methanol entspricht.
Weiterhin soll erfindungsgemäß ein neuartiger katabolitsensitiver regulatorischer Bereich entwickelt werden, der auf das Vorhandensein bestimmter Kohlenstoffquellen, nicht aber auf das Vorhandensein anderer Kohlenstoffquellen anspricht sowie ein neuartiger regulatorischer Bereich, dei auf den Mangel an Kohlenstöffquellen anspricht.
Weiterhin sollen neuartige Vektoren zur Verfügung gestellt werden, welche eine eingefügte Polypeptidkodierungsfolge expressieren können.
Das Ziel derErfindung soll verwirklicht werden unter Verwendung neuartiger Hefestäm me der Art Pichia undSaccharomyces.
Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die Produktion von Polypeptiden unter Anwendung neuartiger Hefestämme, wie sie oben beschrieben wurden, zu entwickeln.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden aus der Beschreibung und dem beigefügten Patentanspruch ersichtlich.
Erfindungsgemäß wurden DNA-Folgen entdeckt, isoliert und charakterisiert, welche die Transkriptien von DNA in die Überträger RNA und die Übertragung der Überträger-RNA steuern, um ein Polypeptidprodukt zu ergeben. Die neuartigen DNA-Folgen dieser Erfindung sind von Nutzen für die Produktion von Polypeptidprodukten durch (a) Hefestämme, die auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen können, (b) Hefestämme, die auf Glukose, Ethanol, Fruktose und ähnlichem wachsen können und c) Hefestämme, die auf Glyzerol, Galaktose, Azetat und ähnlichem wachsen können.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 ist eine Korrelation des Verhältnisses zwischen dem genomischen Klon (pPG6,0) und dem cDNA-Klon (pPC 15,0} für Protein ρ76.
Abb.2 ist eine Korrelation des Verhältnisses zwischen dem genomischen Klon (pPG4,0) und cDNA-Klonen (pPC8,3und pPC8,0) für Protein p72 (Alkoholoxydase).
Abb.3 ist eine Korrelation des Verhältnisses zwischen dem genomischen Klon (pPG 4,8) und dem cDNA-Klon (pPC6,7) für Protein P 40.
Abb.4 zeigt Restriktionskarten der regulatorischen Bereiche der Erfindung von Klon pPG6,0. Abb.5 ist eine Restriktionskarte des regulatorischen Bereiches der Erfindung von Klon pPG4,0. Abb. 6 ist eine Restriktionskarte des regulatorischen Bereichs der vorliegenden Erfindung von Klon pPG4,8. Abb.7 ist eine Restriktionskarte einer Folge der DNA, die vom Ende 3' des strukturellen Gens p76 gewonnen wurde. Abb. 8 zeigt Restriktionskarten von Folgen der DNA, die vom Ende 3' des strukturellen Gens p72 (Alkoholoxydase) gewonnen wurden.
Abb.9 ist eine Restriktionskarte einer Folge der DNA, die vom Ende 3' des strukturellen Gens p40 gewonnen wurde. Abb. 10 ist eine Restriktionskarte des strukturellen Gens von Protein p76 und des regulatorischen Bereichs 5' dafür. Abb. 11 ist eine Restriktionskarte des strukturellen Gens von Protein p40 und des regulatorischen Bereichs 5' dafür. Abb. 12 ist eine Restriktionskarte der cDNA von Protein ρ76. Abb. 13 ist eine Restriktionskarte der cDNA von Protein p72 (Alkoholoxydase). Abb. 14 ist eine Restriktionskarte der cDNA von Protein p40.
Abb. 15 zeigt Restriktionskarten von zwei neuartigen Konstruktionen regulatorischer Bereich p76-1acZ DNA der Erfindung. Abb. 16 ist eine Restriktionskarte einer neuartigen Konstruktion von regulatorischem Bereich ρ 72 (Alkoholoxydase)lacZ DN A der Erfindung.
Abb. 17 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pSAOHL Abb. 18 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pSAOH 5. Abb. 19 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pSAOH 10. Abb. 20 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pTAFH.85. Abb. 21 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pT76 H1. Abb. 22 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pT76 H 2. Abb. 22 a ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pT76 H 3. Abb.22b ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pT76 H4. Abb.23 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pYA2. Abb. 24 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pYA4. Abb. 25 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pYJ 8. Abb. 26 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden ρ YJ 8ACIa. Abb. 27 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pYJ30.
Abb. 28 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pTAFHI und zeigt, wie das Plasmid abgeleitet wurde. Abb. 29 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pTA012 und zeigt, wie das Plasmid abgeleitet wurde. Abb.30 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pTA013. Abb.30a ist eine Restriktionskarte von Plasmid pT76U1.
Abb.31 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pTAO1 und zeigt, wie das Plasmid abgeleitet wurde. Abb. 32 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden pTAF.85 und zeigt, wie das Plasmid abgeleitet wurde. Abb. 33 ist eine Restriktionskarte des Plasmiden YEp 13. Abb. 34 ist eine Restriktionskarte von pBPfi.
In der Patentanmeldung werden die folgenden Abkürzungen verwendet, um die eingesetzten Restriktionsenzyme darzustellen:
A = Asull
B = BamHI
B2 = BgIII
Bc = Bell
C = CIaI
H2 = Hincll
H3 = Hindlll
K = Kpnl
Nd1 = Ndel
Nr = Nrul
Ps = Pstl
Pvi = Pvul
Pv2 = Pvull
R1 = EcoRI
R5 = EcoRV
Rs = Rsal
S = Sail
S3 = Sau3AI
Sc = Sacl
Sm = Smal
Sp = Sphl
Ss = Sstl
St = Stu I
T = Taql
Th = Thal
Xb = Xbal
Xh = Xhol
Xm = Xmal
In den beigefügten Abbildungen sind Restriktionsstellen, die für die Manipulation von DNA-Fragmenten genutzt werden, aber nach der Ligation zerstört werden, durch Einschließen der Abkürzung für die zerstörte Stelle in Klammern gekennzeichnet. Nach der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges DNA-Fragment geschaffen, das aus einem regulatorischen Bereich besteht, der auf wenigstens eine der folgenden Bedingungen anspricht: das Vorhandensein von Methanol, Kohlenstoffquellenstarvation, wenn Zellen auf einem anderen Substrat als Methanol gezüchtet werden, und das Vorhandensein von nichtkatabolitunterdrückenden Kohlenstoffquellen außer Methanol. Der regulatorische Bereich des DNA-Fragments dieser Erfindung kann die Transkription der Überträger-RNA steuern, wenn er am Ende 5'der DNA positioniert ist, welche der Kode für die Produktion der Überträger-RNA gibt. In den Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Mutanten der genannten DNA-Fragmente eingeschlossen.
Außerdem wird in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein DNA-Fragment geschaffen, welches einen regulatorischen Bereich aufweist, der die Polyadenylation, Beendigung der Transkription und Beendigung der Übertragung der Überträger-RNA steuern kann, wenn er am Ende 3' des Polypeptidkodierungsbereiches angeordnet ist, welcher den Kode für die Produktion der Überträger-RNA gibt, wobei die Transkription und Übertragung der Überträger-RNA durch einen regulatorischen Bereich gesteuert werden, welcher auf wenigstens eine derfolgenden Bedingungen anspricht: Das Vorhandensein von Methanol, Kohlenstoffquellenstartvation, wenn Zellen auf einem anderen Substrat als Methanol gezüchtet werden, und das Vorhandensein von nicht-katabolitunterdrückenden Kohlenstoffquellen außer Methanol. In den Rahmen der Erfindung sind auch Mutanten der genannten DNA-Fragmente eingeschlossen.
In Übereinstimmung mit einem speziellen Ausführungsbeispiel sieht die Erfindung DNA-Fragmente vor, welche die Einbeziehung von verschlüsselten Polypeptiden in Peroxisome lenken. Peroxisome sind interzellulare Körper, die in großen Mengen in auf Methanol gezüchteten Hefezellen vorhanden sind. Diese intrazellularen Körper dienen zur Isolierung des einbezogenen Polypeptidproduktes von intrazellularen Flüssigkeiten und Enzymen wie Proteasen.
In Übereinstimmung mit einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung sind Gene für die Kodierung der Produktion von Alkoholoxydase, einem Protein von etwa 40 Kilodalton und einem Protein von etwa 76 Kilodalton vorgesehen. In Übereinstimmung mit einem weiteren Ausführuhgsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind Plasmide und transformierte Organismen, welche die genannten DNA-Fragmente enthalten, vorgesehen.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung sind Methoden für die Produktion von Plasmiden und DNA-Fragmenten der Erfindung sowie von heterologen Polypeptiden, d. h., Polypeptiden, die nicht ursprünglich für die Wirtsorganismen sind, vorgesehen
Isolierung von regulierbaren Genen aus Pichia pastoris
Es wurde eine etwa 20000 Glieder umfassende cDNA-Bibliothek in E. coli mit Poly-A+-RNA erarbeitet, die aus Zellen von Pichia pastoris isoliert wurden, welche auf Methanol als der einzigen Kohlenstoffquelle gezüchtet wurden (siehe Beispiel III). Die Bibliothek wurde durch Hybridisierung gesichtet unter Verwendung von Kinase versetzter Poly-A+-RNA, die aus Pichia pastoris isoliert wurde, die bei Vorhandensein von Methanol oder Ethanol gezüchtet wurde. Nach mehreren Runden dieser Plus-Minus-Sichtung wurden drei distinktive, nicht-homologe cDNA-Klone als Kopien der methanolspezifischen Überträger-RNA identifiziert. Diese Klone wurden als pPC6,4, pPC8,0 und pPC15,0 bezeichnet, und es wurde festgestellt, daß sie in der Länge Einfügen von 470, 750 bzw. 1100 Nukleotiden enthielten.
In dem Versuch, cDNA-Klone von größerer Länge zu erhalten, wurde eine zweite cDNA-Bibliothek unter Anwendung milderer S 1-Nukleasedigestionsbedingungen, als sie für die Erarbeitung der ersten cDNA-Bibliothek angewendet worden waren, erarbeitet, und die Glieder dieser neuen Bibliothek wurden einzeln mit 32P-gekennzeichneten cDNA-Klonen pPC6,4, pPC8,0 und pPC 15,0 gesichtet. Im Ergebnis dessen wurden größere cDNA-Klone isoliert, die den cDNA-Klonen pPC6,4und pPC8,0 entsprachen. Es wurde festgestellt, daß die größeren Klone, pPC6,7 und pPC8,3 Einfügungen von 1 200 bzw. 2100 Nukleotiden enthielten (siehe Abbildungen 2 und 3). Ein cDNA-Klon mit einer größeren Einfügung als 1100 Nukleotide für pPC 15,0 wurde bei der Sichtung von mehr als 40000 cDNA-Klonen nicht festgestellt.
Die Isolierung der genomischen DNA-Fragmente, welche jedem dieser cDNA-Klone entsprachen, erfolgte zunächst durch Ausschneiden und Eiektroeluieren von DNA-Fragmenten von Pichia pastoris der restriktionsendonukleasebehandelten chromosomalen DNA, welche mit 32P-gekennzeichneten pPC 15,0, pPC8,0 oder pPC6,4 hybridisiert wurden, aus Agarosegelen. Die eluierten genomischen DNA-Fragmente wurden dann in Escheria coli geklont und die entsprechenden genomischen Klone durch mehrfaches Sichten mit jeder der oben genannten cDNA-Proben identifiziert.
Das Verhältnis jedes cDNA-Klons zu dem entsprechenden genomischen Klon wird in den Abbildungen 1,2 und 3 veranschaulicht. pPC 15,0 wird innerhalb eines genomischen Fragments 6000 Nukleotid Hindlll kodiert, das in Klon pPG 6,0 vorhanden ist (Abb. 1). Das Ende 5'des durch pPC 15,0 kodierten Gens ist zum Fragment 1300bp Hindlll-EcoRI orientiert, welches in pPG 6,0 enthalten ist, während das Ende 3' des Gens proximal zu den Pstl-Stellen in pPG6,0 ist.
DercDNA-Klon pPC8,3 ist im genomischen Klon pPG4,0 enthalten (Abb. 2). pPG4,0 enthält eine EcoRI-Pvull-Einfügung von 4000 Nukleotiden der angrenzenden genomischen DNA. Die Orientierung von pPC8,3 innerhalb von pPG4,0 bringt das Ende 5' des Gens für diese cDNA nahe an die BamHI-Stellen, während sich das Ende 3' dieses Gens nahe der Pvull-Stelle befindet. Die Orientierung von pPC8,0 (einem verwandten cDNA-Klon) innerhalb von pPG4,0 bringt das Ende 5' dieses cDNA-Klons nahe an die Kpnl-Stelleam Ende.3'von pPG4,0, und das Ende 3' descDNA-Klons befindet sich nahe der Pvull-Stelle. DercDNA-Klon pPC6,7 befindet sich vollkommen in einem genomischen Fragment von 4800 Nukleotid EcoRI-BamHI (Abb.3). Klon pPc6,4 wiederum befindet sich vollständig innerhalb von cDNA-Klon pPC6,7. Da pPC6,7 eine vollständigere Kopie als pPC6,4 war, wurde der letztere nicht weiter untersucht. Das Ende 5' des Gens ist näher am BamHI-Endealsam EcoRI-Ende des genomischen Klons pPG4,8 positioniert (Abb.3). In allen diesen genannten genomischen Klonen sind wenigstens 1,2 Kilobasenpaare flankierender genomischer DNA-Folge, die 5'zu den strukturellen Genen sind, welche in jedem dercDNA-Klone kopiert werden.
Jeder der oben beschriebenen genomischen und cDNA-Klone wurde beim Northern Regional Research Center of the United States, Peoria, Illinois, deponiert, um nach Erteilung eines Patentes für diese Anmeldung den Zugang zu ermöglichen. Alle Klone wurden in E. coli-Wirten deponiert:
Plasmid Wirt Zugriff-Nr.
pPG6,0 E.coliLE392-pPG6,0 NRRL B-15867
pPG4,8 E.ColiLE392-pPG4,8 NRRL B-15869
pPC15,0 E.coliLE392-pPC15,0 NRRL B-15870
pPC8,3 E.coliLE392-pPC8,3 NRRL B-15871
pPC6,7 E.coliLE392-pPC6,7 NRRL B-15872
pPC8,0 E.coiiMM294-pPC8,0 NRRLB-15873
Einzigartigkeit von pPG6,0, pPG4,0 und pPG4,8 gegenüber methanolassimilierenden Hefen
Jeder der oben beschriebenen cDNA-Klone wurde gekennzeichnet und als Sondierung von chromosomalen DNA-Folgen von einer Reihe methanolassimilierender Hefen und einer methanol-nichtassimilierenden Hefe eingesetzt. Es wurde festgestellt, daß homologe Gene für alle drei der cDNA in im wesentlichen allen methanolassimilierenden Hefen vorhanden sind, eindeutig aber nicht vorhanden sind in der methanolnichtassimilierenden Hefe (S. cerevisiae). Es wird daher angenommen, daß diese Gene einzigartig für methanolassimilierende Hefen sind. Außerdem zeigen die Southem-Hybridisierungsexperimente, die im Beispiel XVII ausführlich beschrieben werden, daß zwischen diesen einzigartigen, auf Methanol ansprechenden Genen von verschiedenen methanolassimilierenden Hefen ein hohes Maß an Homologie besteht. Charakterisierung der RNA-Transkripte der Gene pPG6,0, pPG4,0 und pPG4,8 Der Einfluß von Methanol auf die Expression jedes dieser geklonten Gene kann durch Untersuchung der Wirkung dieser Gene auf die Transkription beobachtet werden. Isolierte Poly-A+-RNAvon Zellen von Pichia pastoris, die mit Ethanol oder Methanol als der einzigen Kohlenstoffquelle gezüchtet wurden, wurde zur Herstellung von Northern-Hybridisierungsfiltern verwendet (siehe Beispiel IV). Drei identische Filterpaare von methanol- und ethanolgezüchteten Zellen (siehe Beispiel I) wurden gesondert mit32P-markierten pPC15,0, pPC8,0 und pPC6,4 sondiert. Die Klone pPC15,0, pPC8,0und pPC6,4 hybridisierten zu RNA-Molekülen (zu etwa 2400,2300 bzw. 1300 Nukleotiden) aus methanolgezüchteten Zellen. Mit den Hybridisierungsproben von RNA, die aus Zellen gewonnen wurde, welche bei Vorhandensein von Ethanol gezüchtet wurden, konnte keine Hybridisierung der Klone pPC 15,0 und pPC8,0 festgestellt werden. Wenn jedoch RNA, die aus auf Ethanol gezogenen Zellen isoliert worden war, mit pPC6,4 sondiert wurde, hybridisierte der Klon zu einem RNA-Molekülzu 1300 Nukleotiden, das mit dem identisch war, das bei methanolgezüchteten Zellen auftrat, aber in einer geschätzten (qualitativ) fünffach kleineren Ebene. Größenbestimmung von Proteinprodukten, die durch pPG 6,0, pPG4,0 und pPG4,8 kodiert wurden Um festzustellen, welche Proteinprodukte durch jeden der oben identifizierten cDNA-Klone kodiert wurden, wurde Poly-A+-RNA von Zellen von Pichia pastoris, die auf Methanol gezüchtet worden waren, selektiv auf jeden der cDN Α-Klone hybridisiert. Die hybrid-selektierte mRNA, d. h., die mRNA, welche auf jeden der cDNA-Klone hybridisierte, wurde dann in vitro übertragen und jedes der Proteinprodukte durch Elektrophorese unter Anwendung von SDS-Denaturisierungsbedingungen aufgelöst (siehe Beispiel V). Die Ergebnisse dieser positiven Hybridisierungs-Translations-in vitro-Experimente zeigten, daß die Klone pPC 15,0, pPC8,3 und pPC6,7 mRNA selektieren, welche Informationen für Polypeptide zu 76000 (p76), 72000 (P72) bzw. 40000 (p40) Dalton kodieren. Dieselben Proteine werden beobachtet, wenn die gesamte Poly-A'+-RNA (d. h., nicht hybrid-selektierte) von auf Methanol gezüchteten Zellen von Pichia pastoris in dasselbe in vitro-System übertragen wird. Identifizierung von p72 als Alkoholoxydase
A. Molekulargewichtsvergleich
Eine Probe von starkauf Alkoholoxydaseprotein angereichertem Material wurde durch Dialyse von geklärten Zellysaten gegenüber H2O hergestellt (siehe Beispiel VII). Durch SDS-Elektrophorese wurde nachgewiesen, daß der kristalline Niederschlag aus dieser Dialyse vorwiegend zwei Polypeptide von 76000 bzw. 72000 Dalton enthielt. Der Niederschlag wurde einer zusätzlichen Reinigung durch Chromatografie auf Sephacryl 200 unterzogen (siehe Beispiel VII), wodurch ersichtlich wurde, daß die Alkoholoxydaseaktivität der Aktivität des gereinigten Polypeptids zu 72000 Dalton entsprach. Die Größe dieses Polypeptids war mit der des Proteinproduktes identisch, das durch cDNA-Klon pPC 8,3 selektiert wurde (siehe Beispiel X).
B. Immunoausfällung
Zusätzliche Beweise dafür, daß die Klone pPC 8,3 und pPG 4,0 das strukturelle Alkoholoxydasegen kodieren, wurden durch ein immunologisches Verfahren ermittelt (Beispiel Xl). Das Proteinpräparat, das aus Pichia pastoris isoliert wurde und die Polypeptide zu 76000 und 72000 Dalton enthielt, wurde zur Bildung spezifischer Antiseren für diese Polypeptide in Kaninchen verwendet. Wenn die hybrid-selektierte Poly-A+-RNA von Klon pPC 8,3 in vitro übertragen wurde, wurde durch die Antiseren, die gegen das Proteinpräparat von Zellen von Pichia pastoris gebildet wurden, nur das Translationsprodukt zu 72000 Dalton ausgefällt.
C. Vergleich der vorhergesagten/tatsächlichen Aminosäurefolge i
Um einen weiteren Beweis zu erbringen, daß Klon pPC 8,3 tatsächlich der cDNA-Klon ist, welcher Alkoholox\ '3se von Pichia pastoris kodiert, wurde die Aminosäurefolge für das Aminoterminalende des Proteins mit der vorhergesagten Aminosäurefolge verglichen, welche durch pPC 8,3 kodiert wurde. Auf diese Weise wurde die NH2-Terminalaminosäurefolge (Folge A) des isolierten Proteins zu 72000 Dalton bestimmt (Beispiel VIII): Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser.
Folge A
Parallel wurde die Nukleotidfolgedes Endes 5' des Gens bestirrimt, das in pPC 8,3 und pPG 4,0 kodiert war. Die vorhergesagte Aminosäurenfolge für die Aminosäuren 2-19 (siehe Folge B), die von den DNA-Folgen sowohl der genomischen als auch der cDNA-Klone abgeleitet wurden, stimmte vollkommen mit den ersten 18 Aminosäuren der oben bestimmten Aminosäurenfolge. (Folge A) für isolierte Alkoholoxydase von Pichia pastoris überein.
Vorhergesagte Aminosäurefolge: Met ala ile pro glu glu phe
Nukleotidfolge (pPC8,3undpPG4,0):
ile
ATC
TAG
leu
CTA
GAT
val
GTT
CAA
5'-AGT 3'-TAC
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giy
GGT CCA
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giy
GGT CCA
CCC GGG
giy
GGA CCT
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TCC
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GAG CTC
ser
AGT
TCA
AAA
giy ser
GGA TCC-3'
CCT AGG-5'
Folge B
Außerdem wurde die vollständige Nukleotidfolge für den Kodierungsbereich des Alkoholoxydasegens bestimmt.
Die bestimmte Nukleotidfolge und die vorhergesagte Aminosäurenfolge werden in Folge B' dargestellt, und sie werden
folgendermaßen angenommen:
Vorhergesagte Aminosäurenfolge:
Met ala ile pro glu glu phe
Nukleotidfolge (pPc8,3undpPG4,0) ile leu val 5'-ATG 3'-TAC GCT CGA ATC TAG CCC GGG GAA CTT GAG CTC TTT AAA ser
asp ATC TAG CTA GAT GTT CAA leu giy giy giy ser ser giy TCC AGG
GAT CTA ile ser giy CTA GAT GGT CCA GGT CCA GGA CCT TTC AGG AGT TCA GGA CCT ser
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TTG AAC gin gin pro CTT GAA ATC TAG GAA CTT GCA CGT GGT CCA GAG CTC AAC TTG leu
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GGT CCA ser ala ser ATC TAG AAC TTG TTC AAG ATG TAC ATG TAC TAC ATG ACC TGG glu
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giy arg ala ala ala val arg thr val pro ser lys
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GGA AAC CAG TTG AAC GGT CCA CAG CCT TCT TTG AAG
gin asp his tyr cys phe phe ser pro tyr arg ile
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glu glu leu ser gin met asp glu ser phe gin glu
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glu tyr arg glu tyr phe glu asp lys pro asp lys
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TCT AGA GAA ACC GCT AGA AGA AGT GAC CAC TTT GCC
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GGT GAG GTC ACT TCT CAC CAC CCT CTG TTC CCA TAC
CCA CTC CAG TGA AGA GTG GTG GGA GAC AAG GGT ATG
ser ser glu ala arg ala leu glu met asp leu glu
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ATG
Folge B'
Ein Vergleich der obigen Nukleotidfolge mit der veröffentlichten (Ledeboer u.a.) Nukleotidfolge für die vorher beschriebene Alkoholoxydase von Hansenula polymorpha weist zahlreiche signifikante Unterschiede auf, so bei der vorhergesagten Aminosäurenfolge, die tatsächlichen Größen des Gens (und des resultierenden Proteins), der Kodonnutzungstendenz und ähnlichen Faktoren.
Identifikation von p76 als Dihydroxyazetonsynthase
Die Nukleotidfolge für die ersten 51 Nukleotide des Gens p76 wurde nach Standardmethoden bestimmt. Aus dieser Folge kann die Aminosäurenfolge für das Aminoterminalende des Proteins p76 vorhergesagt werden: Aminosäurenfolge: met ala arg ile pro lys
Nukleotidfolge: 5'-ATG GCT AGA ATT CCA AAA
3'-TAC CGA TCT TAA GGT
pro val ser thr gin asp asp ile his giy leu
CCA GTA TCG ACA CAA GAT GAC ATT CAT GAA TTG-3'
GGT CAT AGC TGT GTT "CTA CTG TAA CTA CTT AAC-5'
Diese vorhergesagte Aminosäurenfolge für p76 kann verglichen werden mit der veröffentlichten Aminosäurenfolge für das Dihydroxyazetonsynthaseprotein (DHAS-Protein) von Hansenula polymorpha (Manowicz u.a.). Obwohl verschiedene Unterschiede in den Folgen offensichtlich sind, gibt es Ähnlichkeiten zwischen den beiden Proteinen, die wahrgenommen werden können:
Pichia-DHAS: met-ala- arg-ile-pro-lys-pro-
Hansenula-DHAS: met-ser-met-arg-ile-pro-lys-ala-val-ser-thr-gln-asp-asp-ile-his-glu- -leu-ala-ser-val-asn-asp-glu-gln-hingln-arg-ile-
Basierend auf dem signifikanten Grad von Homologie und der ähnlichen Proteingröße (etwa 76000 Dalton) von Pichia-p76 und Hansenula-DHAS wurde p76 tentativ als DHAS von Pichia identifiziert.
Wie oben beim Alkoholoxydasegen läßt ein Vergleich der Nukleotidfolge für die ersten 5T Nukleotide von Pichia-DH-Protein mit der früher veröffentlichten (Janowicz u.a.) Nukleotidfolge für Hansenula-DHAS zahlreiche Unterschiede in der Kodonnutzungsrichtung, der vorhergesagten Aminosäurenfolge, der Gesamtgröße des Gens usw. vermuten. DNA-Fragmente, die regulierbare Promoter von Pichia pastoris enthalten
Die regulatorischen Bereiche 5' der Erfindung sind ausführlich in den Restriktionskarten in den Abbildungen 4, 5 und 6 dargestellt. Der regulatorische Bereich 5', welcher die Expression von Polypeptid p76 steuert, befindet sich in dem DNA-Fragment, das in der Abb.4a dargestellt wird. Es wurde eindeutig nachgewiesen, daß Paarfragment Hindlll-Xhol zu etwa 2,9 Kilobase die regulatorische Funktion enthält, wie das unten ausführlich dargestellt wird.
Da cDNA-Klon pPC 15,0 keine vollständige cDNA-Kopie ist, ist es sehr wahrscheinlich, daß wenigstens ein Teil des in der Abb. 4a dargestellten DNA-Fragments strukturelle Kodierungsfolgen für Polypeptid p76 enthält. So wird angenommen, daß die regulatorische Funktion in dem Paarfragment Hindlll-EcoRI zu etwa 1300 Base enthalten ist, das in der Abb.4b gezeigt wird. Neuartige /3-gala<-tosidasegenhaltige Konstruktionen, die unten ausführlicher behandelt werden, unterstützen diese Annahme. Der regulatorische 3ereich 5', der die Expression von Polypeptid p72 (Alkoholoxydase) steuert, befindet sich in dem DNA-Paarfragment EcoRI-BamHI zu etwa 2000 Base, das in der Abb. 5 gezeigt wird. Neuartige/3-galaktosidasegenhaltige Konstruktionen, die unten ausführlicher behandelt werden, unterstreichen den regulatorischen Charakter dieses DNA-Fragments.
Abb.6 zeigt eine Restriktionskarte für das DNA-Paarfragment BamHI-Sall zu etwa 3 Kilobase, das den regulatorischen Bereich 5' einschließt, welcher die Produktion des Polypeptids p40 steuert. Dieses Fragment ist eindeutig von den regulatorischen Bereichen 5'zu unterscheiden, die in den Abbildungen 4und 5 gezeigt werden, was u.a. auf die verschiedenen Restriktionsstellen innerhalb des DNA-Fragments zurückzuführen ist.
Die Abbildungen 10,2a und 11 geben Restriktionsenzymdaten für die regulatorischen Bereiche und strukturelle Gene für die Polypeptide p76, p72 (Alkoholoxydase) bzw. p40. Folglich gibt die Abb. 10 Details für das Paarfragment Hindlll-Pstl zu 3,8 Kilobase der genomischen DNA von Richia pastoris, weiches die Produktion von Polypeptid ρ 76 steuert und kodiert. Abb. 2a zeigt das Paarfragment EcoRI-Pvull zu 4,0 Kilobase der genomischen DNA von Pichia pastoris, welches die Produktion von Polypeptid p72 (Alkoholoxydase) steuert und kodiert. Abb. 11 zeigt das Paarfragment BamHI-EcoRV zu 3,7 Kilobase von der genomischen DNA von Pichia pastoris, welches die Produktion von Polypeptid p40 steuert und kodiert.
Auch die genomischen Klone, pPG6,0, pPG4,0und pPG4,8 wurden durch Restriktionskarten charakterisiert. So wird Klon pPG 6,0 ausführlich in der Abb. 1 a dargestellt. Als Referenzpunkt wird das Ende 5' des DNA-Fragments als Ursprung betrachtet. Klon pPG 6,0 ist ein Hindlll-Fragment der chromosomalen DNA von Pichia pastoris, welches eine Länge von etwa 6 Kilobasenpaaren hat, und wird durch verschiedene Restriktionsenzyme folgendermaßen gespalten:
Restriktionsenzym Teilungsstellen Abstand vom Ursprung (bp)
Hincll 5 1070,1740,1890,
3320,5520
EcoRI 2 1300,3450
Xhol 1 2860
Pstl 2 3820,4200
Pvull 1 4120
Pvul 1 4950
Restriktionsenzym Teilungsstelle
Hindlll 3
Pstl 1
BamHI 2
Sail 1
BgIII 2
Kpnl 2
Xbal 1.
Stul 1
Ndel Ι
Hincll 2
Sstl . 1
Bell 2
Asull 2
EcoRV 1
Pvull 1
Klon pPG 4,0 wird ausführlich in der Abb. 2 a gezeigt. Der Klon ist ein EcoRI-Hindlll-Fragment derchromosomalen DNA, die eine Länge von etwa 4 Kilobasen-Paaren hat. Unter Bezugnahme auf das Ende 5' des Klons als Ursprung erhält man für pPG4,0 folgende Restriktionsdaten:
Abstand vom Ursprung (bp) 400,600,1840 850
1960,1970 2620 1040,2700 500,2730 3330 3880 420
870,2430 1200 1710,4080 1900,2300 1930 4120
Klon pPG 4,8 wird detailliert in der Abb. 3a gezeigt. Der Klon ist ein BamHi-EcoRI-Fragmentzu 4,8 Kilobasen-Paaren von Chromosomaler DNA von Pichia pastoris mit den folgenden zusätzlichen Restriktionsstellen:
Abstand vom Ursprung (bp) 410
500,3890,4280 1120 2900 4135 3690,3890 4500 4800
Die genomischen Klone pPG6,0, pPG4,0 und pPG 4,8 wurden durch Einsetzen in die einzigartigen Restriktionsstellen auf dem Plasmid pBR322 von E.coli manipuliert. Klon pPG6,0, derein Hindlll-Fragment ist, wurde in die Hindlll-Stelle von pBR322 geklont. Klon pPG4,0 wurde in die EcoRI-Pvull-Stellen von pBR322 geklont, und Klon pPG4,8 wurde in die EcoRI-BamHI-Stellen von pBR322 geklont (siehe Beispiel Vl). Stämme von E.coli, die mitdiesen Plasmiden transformiert wurden, sin im Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, deponiert wurden, um den freien Zugang von Erteilung eines Patentes für diese Anmeldung zu gewährleisten. Die deponierten Stämme erhielten die folgenden Zugriffsnummern:
Genomische Klasse Laborbezeichnung Zugriff-Nr.
pPG6,0 LE392-pPG6,0 NRRL B-15867
pPG4,0 LE392-pPG4,0 NRRL B-15868
pPG4,8 LE392-pPG4,8 NRRLB-15869
Abbildungen 7, 8 und 9 vermitteln Restriktionskartendaten für die regulatorischen Bereiche 3' der Polypeptide p76, p72 (Alkoholoxydase) bzw. p40. Die regulatorischen Bereiche 3' sind bei der Steuerung der Polyadenylation, der Beendigung der Transkription und der Beendigung der Übertragung der Überträger-RNAvon Nutzen, welche durch die vorangehenden Nukleotidfolgend kodiert werden. So dient der regulatorische Bereich 3'vom Polypeptidgen p76, ein EcoRI-Hindlll-Fragmentzu 2,7 Kilobase-Paaren, das in der Abb. 7 gezeigt wird, dazu, die Polyadenylation sowie die Beendigung der Transkription und die Beendigung der Übertragung der mRNA zu steuern, die für Polypeptid p76 kodiert, oder jeder anderen mRNA, die von einem Gen abgeleitet wurde, das oberhalb des regulatorischen Bereiches 3' eingefügt wurde. Das Stul-Pvull-Fragmentzu 0,2 Kilobase-Paaren des Gens ρ 72, das in der Abb. 8 a ausgeführt wurde, dasStul-Hindlll-Fragmentzu 0,3 Kilobase-Paaren von Gen p72aus der Abb. 8 b, das Sall-EcoRI-Fragment zu 3,2 Kilobase-Paaren von Gen p72 aus der Abb. 8c und das Pvull-EcoRI-Fragmentzu1,9 Kilobase-Paaren von Gen p40 aus der Abb. 9 haben denselben Zweck, sowohl hinsichtlich der strukturellen Gene, denen sie beim Wildtyp von Pichia pastoris zugeordnet sind, als auch der fremden (d. h., heterologen) Gene, die oberhalb dieser regulatorischen Bereiche 3' eingefügt werden können.
Restriktionsenzym Teilungsstelle
CIaI 1
Kpnl 3
Pvul 1
Sail 1
Pvull 1
EcoRV 2
BgIII 1
Xmal 1
Da das Alkoholoxydasegen in pPG4,0 innerhalb einiger Hundert Basenpaare der AO-Gen-Transkriptionsbeendigungsstelle endet, wurde die zusätzliche Folge 3', die in der Abb. 8c dargestellt ist, folgendermaßen ermittelt. Der erste Schritt war es, die chromosomal-DNA von Pichia mit EcoRI und Sail aufzuschließen und die aufgeschlossene DNA mit einem 32P-markierten BamHI-Hindlll-Fragmentvom AO-Genzu 2,0kbp nach derSouthem-Fleck-Methodezu hybridisieren. Zu den EcoRI-Sall-Digestionsfragmenten von Pichia, die mit der AO-Genprobe hybridisiert wurden, gehörte ein Fragment zu 3,2kbp, das den Abschnitt 3' des AO-Gens und Folgen kodiert, welche den Terminus 3' des Gens flankieren.
Das AO-Genfragment 3' wurde dann geklont durch Rückgewinnung von EcoRI-Sall-geschnittenen Pichia-DNA-Fragmenten von etwa 3,2 kbp durch Geleluierung und Einsetzen der Fragmentein EcoRI und Sall-aufgespaltenes pBR322. Schließlich wurde ein 'Rekombinantplasmid, pPG 3,2, welches das AO-Gen-Fragment 3' enthält, durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des markierten AO-Genfragments als Sondierung identifiziert. Ein Stamm von E.coli, der mit Piasmis pPG 3,2 transformiert wurde, wurde beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, deponiert, um den freien Zugang nach Erteilung eines Patents für diese Anmeldung zu gewährleisten. Dem deponierten Stamm wurde die Zugriffs-Nr. NRRL B-15999 zugewiesen. Abb. 8 c zeigt eine Restriktionskarte, der Endonukleaseteilungsstellen des DNA-Fragments der Pichia von pPG3,2. Das Fragment enthält etwa 1,5kbp Kodierung des Abschnitts 3'von AO (von Sail auf Hinlll) und etwa 1,7kbp der Folge 3' des AÖ-Gens. Charakterisierung der cDNA-Klone
Die cDNA-Klone für die regulierbaren Gene von Pichia pastoris wurden ebenfalls durch Restriktionskarten charakterisiert. In der Abb. 12 wird diecDNAp76, ein Fragment zu 1,1 Kilobasen-Paaren, gezeigt. Geht man vom Ende 5' der DNA-Folge als dem Ursprung aus, teilt Restriktionsenzym Xhol die p76-cDNA etwa 500 Basenpaare vom Ursprung entfernt, Hincll teilt etwa 950 Basenpaare vom Ursprung und EcoRI teilt die cDNAp76 etwa 1050-1100 Basenpaare vom Ursprung. DercDNA-Klon, der in der Abb. 12 gezeigt wird, sowie die in den Abbildungen 13 und 14 gezeigten cDNA-Klone werden alle mit Pstl-Termini gezeigt. Es sind dies künstlich geschaffene Restriktionsstellen, die durch G-C-Bildung der anfangs gewonnenen komplementären DNA erzeugt werden, um die Klonung der DNA-Fragmente in pBR322 zu erleichtern. Ausgehend von Northem-Hybridisierungsuntersuchungen und der Größe der Polypeptidproduktes wird geschätzt, daß der cDNA-Klon pPC 15,0 eine unvollständige Kopie von mRNA p76 ist, welche nur etwa die Hälfte der vollständigen Überträger-RNA-Folge darstellt. In der Abb. 13 wird eine zusammengesetzte Restriktionskarte für p72-cDNA(Alkoholoxydase) gezeigt, die durch Überlagerung der Klone pPC8,3 und pPC8,0 erstellt wurde. Wie oben wird das Ende 5r der DNA-Folge als Ursprung bezeichnet. Die Behandlung von Alkoholoxydase-cDNA mit einer Reihe von Restriktionsenzymen gibt dann folgende Größenfragmente:
Entfernung vom Ursprung (bp) 20,420
80,90 550 820 820 850 1450 1760 2000
Die Restriktionsenzymkartendarstellung des Endes 3' des Alkoholoxydasegens in den Klonen pPC8,0 und pPC8,3 zeigte, daß cDNA-Klon pPC8,3 etwa 250 Nukleotide der Alkoholoxydase-mRNA-Folge fehlen (Abb.2). Die am Ende 3' der AlkoholoxydasemRNA vorhandenen Folgen sind im cDNA-Klon pPC8,0 vorhanden, der pPC8,3 um etwa 500 Nukleotide überlagert. Abb. 14 zeigt die Restriktionskarte für die cDNA von Polypeptid p40, ein Fragment zu 1,2 Kilobase-Paar. Wenn man das Ende 5' des cDNA-Klons als Ursprung betrachtet, wird Klon pPC6,7 durch Sail (und Hincll) etwa 1 000 Basen vom Ursprung geteilt. Jedes der cDNA-Fragmente wurde in pBR322 geklont, das dann in E.coli übertragen wird. Die transformierten Stämme wurden im Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, deponiert, um nach Erteilung eines Patents für diese Anmeldung den freien Zugang zu ermöglichen. Den deponierten Stämmen wurden folgende Zugriffs-Nr. zugeordnet:
Restriktionsenzym Teilungsstelle
Asull 2
EcoRV 1
BamHI 2
Hincll 1
Sail 1
BgIII 1
Kpnl 1
Xbal 1
Rsal 1
Stul 1
cDNA-Klon Laborbeschreibung Zugriffs-Nr.
pPC15,0 LE392-pPC15,0 NRRL B-15870
pPC8,3 LE392-pPC8,3 NRRL B-15871
pPC8,0 MM94-pPC8,0 NRRL B-15873
PPC 6,7 LE392-pPC 6,7 NRRLB-15872
Jeder der oben beschriebenen cDNA-Klone ist nützlich als Sondierung für die Identifizierung und Isolierung von chromosaler DNA, welche die Produktion von Polypeptiden kodiert, die einzigartig für das Wachstum von Hefe auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle sind. Daher wurden, wie bereits beschrieüen wurde, diese Klone zur Identifizierung von chromosomalen DNA-Fragmenten von P. pastoris verwendet, welche die regulatorischen Bereiche und strukturellen Kodierungsinformationen für die einzigartigen Polypeptide enthalten, welche beobachtet werden, wenn P. pastoris auf Methanol gezogen wird. Auf die gleiche Weise sind diese cDNA-Klone nützlich für die Sondierung bei der Identifizierung und Isolierung von analogen Genen von anderen methanolassimilierenden Hefen, wie beispielsweise Torulopsins molishiana, Hansenula capsuiatum, H. nonfermantes und ähnlichen (siehe Beispiel XVII)
Detaillierte Analyse des Alkoholoxydasegens
Der regulatorische Bereich 5' von Klon pPG4,0 wurde weiter charakterisiert durch die Bestimmung der Nukleotidfolge des Klons oberhalb (5') des Punktes, an dem die strukturelle Information für p72 (Alkoholoxydase) kodiert wird. Die ersten 250 Nukleotide vor der Startstelle der mRNA-Translation (ATG-Kodon) sind vermutlich:
ö'-ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA
ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTA
GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGCCTTA
AACCTTTTTT TTGCGACTGG CTTTTAACGA ATTCGAAACG-3'.
TTTATCATCA TTCCAATTGA CAACTTGAGA
TTATTAGCTT CAAGCTTTTG AGATCAAAAA
ACTTTCATAA ATTTTAACGA ACAACTAATT
Folge C
Es wird angenommen, daß die Promoterfunktion von Klon pPG4,0in dieser Folge von Nukleotidbasen enthalten ist. Um dieses neuartige DNA-Fragment vollständiger zu beschreiben, wurden zusätzlich 301 Nukleotide weiter oberhalb der Folge, die in Folge C ausgeführt wurde, bestimmt. Es wird daher angenommen, daß die ersten 551 Nukleotide vor der Startstelle der mRNA-Translation folgendermaßen lauten:
Ö'-AATGGCCCAAA ATATGACAAA TGGTTCqTTG ACTTCCAAAA
GATTGACGAA GCAGTCTCTC
CGAAACGCAA ATGCATTGTC
GGAATACTGC ACTGTTCTAA
AAGGAAGCTG TTATTAGCTT
CAAGCTTTTG
AGATCAAAAA
ACTGACAGTTT AGCGTGATCT AAATCCTAAC GTCGCCATAC TGCTCAAAAA TATCGCTTCT ATGGGGAAAC -CTCCACATTGT TGATAGCCTA CCCCTACTTG CCCTGTCTTA ACTTTCATAA ATTTTAACGA ACAACTAATT
AAACGCTGTC
CATCCAAGAT
GGCCAGTTGG
CGTTTGTCTT
TAATCTCATT
GAACCCGGTG
AACCCGCTTT
ATGCTTCCAA
ACGTTCATGA
GACAGGCAAT
AACCTTTTTT
TTGCGACTGG
CTTTTAACGA
ATTCGAAACG-3'.
TTGGAACCTA GAACTAAGTT •TCAAAAAGAA GTTTGGTATT AATGCTTAGC GCACCTGTGC TTG G ATG Απα ATTCTG GTG TCAAAATTTA ATATAAACAG TTTATCATCA TTCCAATTGA CAACTTGAGA
Folge D
Es wird angenommen, daß die zusätzlich in der Folge D (im Vergleich zur Folge C) vorhandenen Nukleotide nach einem unbekannten Mechanismus zusätzliche regulatorische Funktionen auf den Promoterbereich übertragen, welcher in der Folge C enthalten ist. Es sollte beachtet werden, daß die Folge D nur eine partielle DNA-Folge für das 1,1 kbp-DNA-Fragment darstellt, welches, wie in den Beispielen XIV und XV gezeigt wird, in der Lage ist, die Genexpression in Hefe steuert. Es kann sein, daß die .zusätzlichen Steuerfunktionen in dem Abschnitt des DNA-Fragments zu 1,1 kbp kodiert werden, welches in der Folge D nicht. ausgeführt wird.
Um dieses neuartige DNA-Fragment zu 1,1 kbp weiter zu beschreiben, wurden zusätzliche Nukleotidfolgen ermittelt, um die Nukleotidfolge des ganzen DNA-Fragments zu 1,1 kbp auszuführen, welches, wie in den Beispielen XIV und XV gezeigt wird, die Genexpression in Hefe zu steuern. Die Nukleotidfolge wird als Folge D' aufgezeichnet:
CGAAAGGTTG AGGTCCATTC GGATACACTA CTCTTCTCTA
GGGCTTGATG GCTACTAACA CCCCCTGGCG AAGCTCCGCA TTTCTGAGTG GCCCAAAACT
ATGACAAAAG GTTCGTTGAA TTCCAAAAGT TTGACGAATG AGTCTCTCTA
AAACGCAAAT GCATTGTCCT GAATACTGCT CTGTTCTAAC
AGGAAGCTGC TATTAGCTTA AAGCTTTTGA
GATCAAAAAA
AATGAAACCT
TCACACATAA
GCAGCAGACG
ACACCATTTT
GAGCTCGCTC
CCATGACTTT
AGGTCATGTT
TTACACCCGA
TGGGGTCAAA
GACAGTTTAA
CGTGATCTCA
ATCCTAACGG
CGCCATACCG
CTCAAAAATA
TCGCTTCTGA
GGGGAAACAA
CCACATTGTA
GATAGCCTAA
CCCTACTTGG
CCTGTCTTAA
CTTTCATAAT
TTTTAACGAC
CAACTAATTA
5'-AGATCTAA
TTTTGCCATC
GTGCCAAACG
TTGCAAACGC
GCATCAAAAC
ATTCCAATTC
ATTAGCCTGT
TGTTTATTTC
ACATCACTCC
TAGTTTCATG
ACGCTGTCTT
TCCAAGATGA
CCAGTTGGTC
TTTGTCTTGT
ATCTCATTAA
ACCCGGTGGC
CCCGCTTTTT
TGCTTCCAAG
CGTTCATGAT
ACAGGCAATA
ACCTTTTTTT
TGCGACTGGT
TTTTAACGAC
TTCGAAACG-3',
CATCCAAAGA
CGACATCCAC
CAACAGGAGG
AGGACTCATC
AGCCAGTTAT
CTTCTATTAG
CTATCCTGGC
CGAATGCAAC
AGATGAGGGC
TTCCCAAATG
GGAACCTAAT
ACTAAGTTTG
AAAAAGAAAC
TTGGTATTGA
TGCTTAGCGC
ACCTGTGCCG
GGATGATTAT
ATTCTGGTGG
CAAAATTTAA
TATAAAOAGA
TTATCATCAT
TCCAATTGAC
AACTTGAGAA
Folge D'
Fachleute werden erkennen, daß im Verhältnis zu den Folgen C und D in dem Abschnitt der Folge D', der sich weiter oberhalb befindet (d. h. in der Richtung 5'), der in den Folgen C und D ausgeführten Nukleotidfolge zusätzliche Steuerfunktionen kodiert werden können.
Um zu bestimmen, wo die RNA-Transkription für das Alkoholoxydasegen eingeleitet wird, wurden die DNA-Folgen um das Ende 5' dieses Gens vom genomischen Klon pPG4,0und vom cDNA-Klon pPC8,3 verglichen. cDNArKlon pPC8,3 enthält etwa 100 Nukleotide eines nicht-übertragenen Bereichs 5' zum Alkoholoxydasegen. Ausgehend von dieser Folge, wurde ein Oligonukleotid von 15 Basen (5'-CTTCTCAAGTtGTCG-S'); komplementär zu den Nukleotiden -29 bis -43, wobei Ader
Translationsstartstelle (ATG-Kodon) als +1 und G in der Richtung 5' als -1 bezeichnet wird, synthetisiert (siehe Beispiel IX) und als PrimerzurWeiterführung längs der Alkoholoxydase-mRNA verwendet, um das Ende 5' zu erreichen. Die cDNA-Folge, die bei diesem Primer-Weiterführungsexperiment gewonnen wurde, verwies auf drei unterschiedliche Transkriptionsinitiierungspunkte für die Alkoholoxydase-mRNA von Pichia pastoris. Die Haupttranskription beginnt in einem Abstand von 114 Nukleotiden vom Translationsinitiierungskodon. Zwei kleinere, alternative Transkriptionen beginnen 117 und 111 Nukleotide oberhalb (5') des Alkoholoxydase-AUG-Kodons.
Die 55 Nukleotide, welche dem Beginn der Alkoholoxydase-mRNA vorausgehen, enthalten eine vermutliche Goldberg-Hogness-Box (TATAA-Box). Die Folge TATAA erscheint in einer Position —40 vom Ende 5' der dominierenden Transkription für die Alkoholoxydase-mRNA und damit 165 Nukleotide oberhalb des Initiierungskodons für dieses Protein.
Der regulatorische Bereich 3' des Alkoholoxydasegens wurde weiter charakterisiert durch die Bestimmung der Nukleotidfolge für etwa 120 Nukleotide unterhalb des Punktes, an dem die strukturelle Information für p72 (Alkoholoxydase) kodiert wird; diese Folge wird unten als Folge D" dargestellt:
5'-TCAAGAGGAT GCTTCATTTT ATAGGATTTT Folge D"
GTCAGAATGC
TGATACTTTT
TTTTGTCAAA
CATTTGCCTG TTATTTGTAA AAAAAAAAAA
AGAGATGCAG CCTATATAGT AAAAAAAAAA-3'
Detaillierte Analyse des Gens p76
Der regulatorische Bereich 5' von Klon pPG 6,0 wurde weiter charakterisiert durch die Bestimmung der Nukleotidfolge des Klons oberhalb (5') des Punktes, an welchem die strukturelle Information für p76 kodiert wird. Es wird angenommen, daß die ersten Nukleotide vor der mRNA-Translationsstartstelle (ATG-Kodon) folgendermaßen lauten:
CACCCATACA AATTCATTGT
AACCAAGGGA TTCCATTTAC
AGATAATÄGA CTCAGCCAAT CCGTTCCATC
TACGAAAGAG AGGCGCGAAT TGTCCGATAC TGTATCATGA CAAATTATAT CTTTCCTATT
ATAAAAAGTT ACAAATTATA CAAACTATCA Folge D"'
ACTATAAACC
TCCGAGTTTA
TTTCAGCTTC
CCCCCACTGG
AAAAAACAAT
TAAAGTCATT
CCTTTGTTGA
GAAAXTTAAX
GAGTTTAGCC
TTCTCCACAT
AGAGACGGAA
AAAGACAACA
CTTGTATCCT
CGTTTTAACT
ACCCCTCTAA
AACATCAAAA-3'
TTAGCAATTG
ATATACTTGC
CTTACCCCAT
AGAGATCCGC
TCGGACAAAT
CCATGCACTC
GCAACACCAT
CGATACCTTG
TAGATATCCT
TCAGTCATAG
ACGGGCATAA
TGCCCCAGTT
GAGTGACCGT
TAAGACCAAA
ACACTAAAGT
5'-TT
AAATAACCCC CCCTATAAGA GAACAGAATC CCAAACGAAC AGAACACTTT CCTTTAGCTG CGTTAGCCAG GAGAAATCTA TAGTGAAGGG ATGGGXAGCT GGGTAACCGC TAAAG MIM TGTGTTTAAT ACCAGTTACA TCACTCTTAT
Es wird angenommen, daß die Promoterfunktion von Klon pPG 6,0 in dieser Folge von Nukleotidbasen enthalten ist, obwohl Fachleute erkennen, daß zusätzliche regulatorische Eigenschaften dann durch Folgen vermittelt werden können, die sich weiter oberhalb der als Folge D'" dargestellten Folgen befinden.
Der regulatorische Bereich 3' von Klon pPG 6,0 wurde weiter charakterisiert durch die Bestimmung der Nukleotidfolge für etwa 180 Nukleotide unterhalb (3') des Punktes, an dem die Strukturinformation für p76 kodiert wird. Diese Folge wird als Folge D"" bezeichnet:
5'-GTCAGCAGTG ATGCTCTCAT TAAACTGGCT TTGGTCAAAC TCAATGGACC Folge D""
TTTCCTGCCA Mil IGGTTT TCCTCCTTTT AAAACTAGGG TACCACATAG-3'
AAGCCATCAA TCTATGTCCG CCTTTCCTGT TCTTTTCCTA
GAGGACGTAC ACGGGGTTCG TGCATTTTAT AAACCTTATG
Expression in transformierter Hefe »
Die oben beschriebenen Plasmide der vorliegenden Erfindung sind bei Hefestämmen von nutzen, die transformiert werden können. Die Regulierung der Genexpressipn in Hefe durch die neuartigen DNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung kann dadurch erreicht werden, daß die transformierten Organismen einer Kohlenstoffquellenstarvation ausgesetzt werden. Die Kohlenstoffquellenstarvation nach der Züchtung auf einer Vielzahl sowohl katabolitunterdrückender als auch nichtkaabolitunterdrückender Kohlenstoffquellen induziert die Expression des Genproduktes, die unter der Steuerung durch die regulatorischen Bereiche der Erfindung bleibt Eine andere Möglichkeit, die Expression des gewünschten Genproduktes in entsprechenden Spezies von transformierter Hefe zu erhalten, ist die Züchtung von transformierten Hefen auf Methanol. Eine weitere Möglichkeit, die Expression des gewünschten Genproduktes zu induzieren, ist die Züchtung der transformierten Hefe auf Medien, die nicht-katabolitunterdrückende Kohlenstoffquellen enthalten.
Die regulatorischen Bereiche dieser Erfindung sind für die Expression in allen Hefestämmen von Nutzen, da gezeigt wurde, daß die regulatorischen Bereiche unter einer Vielzahl von Bedingungen induziert werden können. Auf diese Weise können Hefen, die auf Methanol oder nicht-katabolitunterdrückenden Kohlenstoffquellen gezogen werden können^ veranlaß werden, direkt
fremde, d.h., heterologe Polypeptide zu produzieren; während Hefen, die auf katabolitunterdrückenden Kohlenstoffquellen gezogen werden können, veranlaßt werden können, fremde Polypeptide zu produzieren, wenn man die so gezogenen Hefezellen Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation aussetzt.
Zu den transformierten Hefestämmen, die beim Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, gehören Glieder folgender Gattungen:
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Schizosaccaromyces,
Rhodutorula,
Hansenula,
Torulopsis,
Pichia und
Kluyveromyces.
Hefen dieser Gattungen werden auf Grund der Sicherheit bei ihrer Handhabung, der Wachstumsbedingungen und der Tatsache bevorzugt, daß auch andere ähnliche Faktoren Fachleuten bekannt sind.
Besonders bevorzugte Hefestämme für den Einsatz bei einem Ausführungsbeispiel des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind die Hefestämme, die auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen können. Zu den Hefen, von denen bekannt ist, daß sie auf Methanol wachsen können, gehören Glieder der folgenden Gattungen:
Candida,
Kloeckera,
Saccharimyces,
Rhodotorula,
Hansenula,
Torulopsis und
Pichia.
Da die regulatorischen Bereiche der vorliegenden Erfindung auch durch das Wachstum auf nicht-katabolitunterdrückenden Kohlenstoffquellen sowie unter Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation induziert werden, sind auch Hefestämme, die auf solchen nicht-methanolischen Substraten wachsen können wie: Glukose, Azetat, Glyzerol, Ethanol, Laktose, Galaktose, Fruktose, Sucrose
und ähnlichen und Mischungen von jeweils zwei oder mehreren dieser Substrate, für die Ausführung der Erfindung geeignet. Durch die Züchtung des Wirtsorganismus auf einer geeigneten, nicht katabolitunterdrückbaren, nicht methanolischen Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Glyzerol und Galaktose, oder durch die Züchtung des Wirtsorganismus auf einer geeigneten katabolitunterdrückbaren Kohlenstoffquelle, wie beispielsweise Ethanol, Glukose und Fruktose, und das anschließende Aussetzen des Wirtsorganismus unter Kohlenstoffquellenstarvationsbedingungen kann die Expression eines Gegenproduktes unter der Steuerung der regulatorischen Bereiche der Erfindung erreicht werden.
Außerdem kann, da die regulatorischen Bereiche der Erfindung auf eine Vielzahl von Wachstumsbedingungen ansprechen, sowohl in Begriffen der Induktion als auch der Repression der Expression, die regulierte Expression eines Genprodukts unter der Steuerung der regulatörischen Bereiche der Erfindung erreicht werden. So können beispielsweise Zellen auf einer Kohlenstoffquelle gezogen werden, die nur niedrige Werte der Fremdgenexpression induziert, sie können dann auf Methanol umgestellt werden, wodurch die Genexpression stark induziert wird. Als Alternative dazu kann die regulierte Genexpression durch die Anwendung von Gemischen aus induzierenden/repressierenden Nährstoffen, wie beispielsweise Methanol-Glukose-Gemischen, erreicht werden. Als weitere Alternative können hohe Expressionswerte, die durch Züchtung auf Methanol erreicht werden, im gewünschten Maße durch den Zusatz einer repressiven oder hemmenden Kohlenstoffquelle, beispielsweise Glukose oder Ethanol, zu den Wachstumsmedien verringert werden. Natürlich erkennen Fachleute andere Veränderungen der Nährstoffgemische und der Größenordnung der Nährstoffeinführung, die möglich sind und ein hohes Maß der Steuerung des Pegels der Genexpression ermöglichen, welche aus den regulatorischen Bereichen der Erfindung erzielt wird. Ein besonders bevorzugter Wirtshefestamm ist der Mutant GS115 von Pichia pastoris, ein Mutant, dem die Fähigkeit fehlt, Histidin zu produzieren, und der deshalb als Mutantgenotyp his4. bezeichnet wurde. GS115 wird von Pichia pastoris NRRL Y-11430 abgeleitet und wurde im Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, deponiert, um nach Erteilung eines Patents für diese Anmeldung den Zugang zu diesem Wirtsorganismus zu gewährleisten. Pichia pastoris GS115 erhielt die Zugriff-Nr. NRRL Y-15851 vom 31. August 1984. Dieser besondere Wirt ist vor allem deshalb von Nutzen, weil es ein auxotropher Mutant mit einem Defekt im Histidinweg ist. Die Transformation dieses Wirts mit einem Vektor, der neben anderen DNA-Folgen die HIS4-Genfunktion enthält, ermöglicht die leichte Selektion des transform^, ^en Wirts.
Es wurde nachgewiesen, daß die regulatörischen Bereiche der vorliegenden Erfindung auch von Nutzen für die regulierte Expression von heterologen Genprodukten in Hefestämmen der Gattung Saccharomyces von Nutzen sind, für die eine große Zahl von auxotrophen Mutanten bekannt ist. Zu den weiteren bevorzugten Wirtshefestämmen gehören ATCC 24683 (ein Mutant trp1,ade1,his2, Ieu1, gall, ura1), ATCC 24684 (ein Mutanttrp1, ade 1, his7, gall, ura1), ATCC 32810 (ein Mutanttrp5,arg4, his5, lys 1, ade2, gal2), ATCC34182 (ein Mutant ade3, his, lys, ura), ATCC34352 (ein Mutant ura2), ATCC34353 (ein Mutantura2), ATCC38523 (ein Mutant arg 1, thM), ATCC38626 (ein Mutant leu 2, his4), ATCC38660 (ein Mutant his4, Ieu2, thr4), ATCC42243 (ein Mutant ura3), ATCC42336 (ein Mutant ade1, his4, thr4) ATCC42403 (ein Mutant arg4, Iys7), ATCC42404 (ein Mutant ade1, his4, leu2), ATCC42564 (ein Mutant ura 1, his6), ATCC42596 (ein Mutant his4, leu2, lys 1), ATCC42957 (ein Mutant his4, leu2, thr4, trp5), ATCC42950 (ein Mutant ade), ATCC42951 (ein Mutant ade, leu), ATCC44069 (ein ura 1-Mutant), ATCC44070 (ein Mutant leu2, his4), ATCC44222 (ein his4-Mutant), ATCC44376 (ein Mutant his4, ade2), ATCC44377 (ein Mutant his4, leu 1) und ähnliche, die Fachleuten leicht zugänglich sind.
Fachleute werden erkennen, daß die geeigneten Hefestämme nicht auf auxotrophe Mutanten beschränkt sind. So stellt auch die Transformation von prototrophen Stämmen mit positiven Selektionsmarkierungen, wie beispielsweise antibiotischen Widerstandgenen, ein brauchbares Mittel für die Feststellung und Isolierung von transformierten Stämmen dar.
Auch Escherichia coli ist ein geeigneter Wirt für die Plasmiden der Erfindung. Fachleute werden erkennen, daß viele Stämme von
E. coli geeignete Wirte sind. Nachstehend werden einige der bei der vorliegenden Arbeit eingesetzten Stämme zusammengefaßt:
Stammbezeichnung Zugriff-Nr.
MC 1061 Nichtbekannt
LE 392 ATCC Nr. 33572
MM 294 ATCC Nr. 33625
Transformationsverfahren bei Pichia pastoris
Die Transformation vin Pichia pastoris wurde bisher nicht beschrieben. Die experimentellen Verfahren für die Transformation von Pichia pastoris werden unten ausführlicher beschrieben (Beispiel XII). Um ein Transformationssystem für P. pastoris zu entwickeln, wurde der auxotrophe Mutant. GS115 (NRRL Y-15851) isoliert und als defekt in derHistidinbahn insofern bestimmt, als der Stamm keine feststellbare Histidinoldehydrogenaseaktivität hat.
GS115 (NRRL Y-15851) kann durch enzymatischen Abbau der Zellwände transformiert werden, um Sphäroplaste zu ergeben; die Sphäropiats werden dann mit dertransformierenden DNA gemischt und bei Vorhandensein von Kalziumionen und Polyethylenglykol inkubiert, anschließend in einem selektiven Wachstumsmedium mit Histidinmangel regeneriert. Die transformierende DNA schließt das HIS4-Gen ein, der dem Wirtsstamm fehlt, folglich überleben auf dem verwendeten selektivem Wachstumsmedium nur transformierte Zellen
Isolierung des HIS4-Gens von Pichia Pastoris
Das HIS4-Gen wurde aus dem Stamm P. pastoris NRRL Y-11430 durch partiellen Abbau der gesamten chromosomalen DNA mit Sau3 A, gefolgt durch Zentrifugieren durch Sucrosegradienten isoliert (siehe Beispiel XIII). Fragmente von 5 bis 20 kbp wurden in die Teilungsstelle BamHI des Shuttle-Vektors YEp 13 von S. cerevisiae-E. coli (ATCC37115; Abb. 33) geklont und in E. coli transformiert. Es wurden etwa 50000 Kolonien kombiniert und die gesamte Plasmid-DNA extrahiert. Sphäroplaste des Stammes S. cerevisae 5799-4D (NRRL Y-15859), ein his4ABC-Mutant, wurden mit etwa 1 /ng der DNA-Bibliothek YEp 13 Pichia nach dem Verfahren von Hinnen u.a. (1978) gemischt, anschließend ließt man das Ganze in einem Medium mit Histidinmangel regenerieren. Die Transformation ergab etwa 1 χ 103 prototrophe Hefekolonien aus einer Population von insgesamt 5 χ 107 regenerierbaren Sphäroplasten. Eine parallele Kontrollprobe, die ohne DNA inkubiert wurde, erzeugt keine Kolonien. Die gesamte Hefe-DNA wurde aus 20 der His+-Kolonien extrahiert und zurück in E. coli transformiert. Siebzehn der Hefe-DNA-Präparationen produzierten ampicillinresistente Kolonien. Diese geklonten Fragmente waren weiter charakterisiert durch die Restriktionsenzymsichtung und -kartendarstellung sowie durch ihre Fähigkeit, nach der im Beispiel XIII, § G, beschriebenen Methode mit einem markierten HIS4-Fragment von S. cerevisiaequerzu hybridisieren (Waschungen nach dem Hybridisieren in 2 χ SSC bei 550C). Die HIS4-haltigen Plasmide enthielten jeweils ein oder mehrere Fragmente, die eine Hybridbindung mit dem HIS4-GenvonS. cerevisiae eingingen. Eines dieser HIS 4-haltigen Plasmide wurde erneut geklont, um ein HlS4-haltigesPlasmid zu ergeben, das als pYJ8 bezeichnet und in der Abb. 25 gezeigt wird. Plasmid ρYJ 8 enthält pBR325-Folgen, einschließlich chloramphenikol- und ampicillinresistente Gene, sowie das HlS4-Gen von Pichia.
Das Gen ARG4 wurde aus P. pastoris NRRL Y-11430 unter Anwendung eines analogen Verfahrens und des Arg~-Stamms S2072 A von S. cerevisiae isoliert (ein arg4, Ieu2, trp1, gal2; bezogen vom Yeast Genetic Stock Center, Berkely, CA). Fachleute, werden erkennen, daß andere Markierungsgene von Pichia auf die gleiche Weise unter Verwendung entsprechender Mangelstämme von S. cerevisiae isoliert werden können
Isolierung von autonomen Replikationsfolgen von Pichia pastoris
Eine weitere nützliche Komponente der Vektoren der vorliegenden Erfindung sind von Pichia abgeleitet autonome Replikationsfolgen (PARS), die sowohl die Transformationsfolgehäufigkeit von GS115 (NRRL Y-15851) als auch die Aufrechterhaltung des Plasmids als stabilem, extrachromosomalen Elements verbessern.
Um nach Pichia-ARS zu suchen, wurde die DNA von Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) mit Taql teilweise abgebaut, und es wurden 5 bis 10kbp-Fragmente isoliert und in die einzigartige Clal-Stelle von pYH8ACla geklont. (Siehe Abb.26.) Die Plasmid-DNA wurde aus etwa 10000 His+-Kolonien von Pichia gewonnen und zur Transform ation von E. coli verwendet. Es wurden Plasmide von etwa 10000 ampicillinresistenten Kolonien isoliert und dann in GS115 zurück transformiert. Vierzig der HiS+- Hefekolonien von dieser Unter-Transformation wurden gesondert auf ein selektives Medium aufgestrichen und in getrennten Kulturen im selektiven Medium gezüchtet. Die gesamte Hefe-DNA wurde aus jeder dieser 40 Kolonien extrahiert und in E. coli transformiert. Für die weitere Analyse wurden zwei Plasmide, pYA63 (PARS 1) und pYA90 (PARS 2) ausgewählt, deren Hefe-DNA-Präparationen die meisten ampicillinresistenten E. coli-Kolonien produzierten. Diese beiden Plasmide transformierten Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) mit einer sehr hohen Frequenz und enthielten jeweils eine Einfügung von Fremd-DNA. Als Maß der Fähigkeit der ARS, Plasmide als autonome Elemente von Pichia zu erhalten, wurden Kulturen von Hefezellen, die mit jedem Plasmid transformiert worden waren, im selektiven Medium gezüchtet und periodisch Stichproben genommen. Der Zustand der Plasmidfolgen in den Zellen wurden nach .der Southern-Hybridisierung von unbeschränktem Hefe-DNA nach radioaktiv markierten pBR325 bestimmt. Die Plasmide pYA63 und pYA90 blieben über mindestens 10 Generationen im selektiven Medium in Pichia erhalten (waren aber durch 50 Generationen integriert worden).
Eine der vermutlichen autonomen Replikationsfolgen von Pichia (PARS 1) wurde in verschiedene andere Pichia-Vektoren geklont, um die Fähigkeit zu untersuchen, die transformierende DNA als autonomes Element zu erhalten. Die Plasmide pYJ 30 (Abb.27) und pBPfl (Abb.34) waren auch nach 20 Wachstumsgenerationen auf selektiven Medien (His") und in mehrfachen Kopien je Zelle vorhanden. Die Southem-Blot-Analyse von Zellen, die mit pYJ 30 transformiert wurden, gibt je Zelle etwa 10 Kopien an.
Es sollte festgestellt werden, ob die Plasmide pSAOH5 (siehe Abb. 18) und pT76H4 (siehe Abb. 22 b), die PARS1 im Zusammenhang mitpYJ30bzw. pBPfl enthalten, eine ähnliche Stabilität wie die Plasmide aufweisen, von denen sie abgeleitet wurden. Zellen, welche diese Vektoren enthielten, wurden für etwa 50 Generationen unter selektiven Bedingungen (His") bei
Vorhandensein von Glukose gezogen. Die Zellen wurden dann auf nichtselektive Bedingungen (His+) übertragen, und es wurde der Verlust an Prototrophie beobachtet. Die Stabilität dieser Plasmide war mit der Stabilität von pYJ 30 vergleichbar, einschließlich des raschen Verlusts der His-Prototrophie nach der Verlagerung auf nichtselektrive Medien. Es wird daher angenommen, daß Experimente, welche mit Plasmiden ausgeführt wurden, die die autonome Replikationsfolge PARS 1 enthalten, Ergebnisse der Genexpression aus derautonomen Plasmid-DNA bringen. Neuartige, das /3-Galaktosidasegen enthaltene Konstruktionen
Um die Fähigkeit der regulatorischen Bereiche der vorliegenden Erfindung, die Produktion von Proteinprodukten zu steuern, nachzuweisen, wurden neuartige DNA-Konstruktionen erarbeitet. So wurde das Gen E. coli lacZ in verschiedene Plasmide unter der Steuerung durch die regulatorischen Bereiche der Gene gebracht, welche Polypeptid p72 (Alkoholoxydase) oder p76 kodieren. Die Herstellung der Plasmide pSAOH 1, pSAOH 10, pTAFH.85, pT76H 1, pT76H3 und pT76H4 wird im Beispiel XIV beschrieben.
Die Einführung von Verschmelzungen regulatorischer Bereich -/3-Galaktosidasegen der Erfindung in die Wirtshefezellen wird hier zwar unter Verwendung von Plasmiden als Einführungsvehicle beschrieben, Fachleuten wird jedoch klar sein, daß die Konstruktion aus reglilatorischem Bereich und strukturellem Gen nicht über ein Plasmid in die Zelle eingeführt werden muß. Es kann also jedes Molekül eingesetzt werden, daß in Hefe gehalten werden kann. Die Konstruktionen aus regulatorischem Bereich und strukturellem Gen der Erfindung können daher über andere Vektoren als Plasmide manipuliert werden. Als Alternative kann die Konstruktion aus regulatorischem Bereich und strukturellem Gen in das Chromoson der Wirtshefezelle integriert werden. Fachleute werden auch erkennen, daß der Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht auf die Produktion von /3-Galaktosidase unter der Steuerung durch die regulatorischen Bereiche beschränkt ist, die hier beschrieben wird. Die Vielfalt der Polypeptide, die unter der Steuerung der regulatoriscnen Bereiche der Erfindung produziert werden können, wird nur durch die Vorstellung des Lesers beschränkt. Es gibt viele Verfahren für die Herstellung von DNA-Folgen, die eine Kodierung für die gewünschten Polypeptide vornehmen. Beispielsweise können Oligonukleotide unterschiedlicher Länge nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene dieser Oligonukleotide können auf Grund deren spezifischer Basenpaarungseigenschaften zu längeren, doppelsträngigen Molekülen zusammengebaut werden. Die Komponentenoligonukleotide dieses doppelsträngigen Moleküls können durch die Enzym-DNA-Ligase gekoppelt (verbunden) werden. Als Alternative können DNA-Moleküle mit der gewünschten Kodierungsfolge durch die Verwendung der Enzymreverstranskriptase synthetisiert werden unter Verwendung der auf das gewünschte Polypeptid bezogenen Überträger-RNA als Schablone für die Wirkung der Reverstranskriptase. Eine weitere Möglichkeit ist die Klonung der genomischen DNA-Fragmente und die Beobachtung, ob eine direkte Expression des gewünschten Produkts erfolgt.
Die DNA-Folge, welche den Kode für das gewünschte Polypeptid überträgt/kann durch eine Vielzahl von Methoden für die Herstellung der Konstruktion aus regulatorischem Bereich und strukturellem Gen modifiziert werden. Beispielsweise können die Enden der DNA, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, mit der Enzym-DNA-Ligase verbunden werden, um doppelsträngige Moleküle zu kürzen, welche die Nukleotidfolge enthalten, erkannt durch spezifische Restriktionsendonukleasen, sogenannte Verbindungsrholeküle (Linker-Moleküle). Der Abbau dieser Moleküle mit einer spezifischen Restriktionsendenuklease nach der Bindung erzeugt Termini, welche den spezifizierten Restriktionsendenukleaseerkennungsstellen an den Enden der hergestellten DNA-Folge entsprechen.
Drei spezifische Konstruktionen von regulatorischem Bereich und /3-Galaktosidasegen, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit hergestellt wurden, werden in Begriffen von Restriktionskartendaten in den Abbildungen 15 und 16 beschrieben. Die in der Abb. 15a gezeigte Restriktionskarte beschreibt eine Konstruktion, welche aus einem 0,85 Kilobasenpaar Hind lll-BamHI-Abschnitt besteht, der aus dem regulatorischen Bereich 5'von pPG 6,0 abgeleitet wurde, und dem Gen lacZ von E. coli (gezeigt wird das 3,6 Kilobasepaar BamHI-Nrul-Fragment). Diese Konstruktion ist in jedem der Plasmide pTAFH.85. pT76 H1 und pT76H 2 vorhanden, die später ausführlich beschrieben werden (siehe Beispiel XIV). Die in der Abb. 15b gezeigte Restriktionskarte beschreibt eine Konstruktion, welche besteht aus dem 1,3 Kilobasepaar Hindlll-EcoRI-Abschnitt, abgeleitet aus dem regulatorischen Bereich 5' von pPG6,0, und dem Gen lacZvon E. coli. Diese Konstruktion ist in jedem der Plasmide pT76U1, pT76H3und pT76H4 vorhanden, die unten ausführlich beschrieben werden (siehe Beispiel XIV).
Abb. 16 ist eine Restriktionskarte einer Konstruktion, die besteht aus einem 1,1 Kilobasepaar EcoRI-BamHI-Fragment, abgeleitet von einem Abschnitt des regulatorischen Bereichs 5'von pPG4,0, und dem Gen lacZ von E. coli. Diese Konstruktion ist in jedem der Plasmide pSAOH 1, pSAOH5 und pSAOH 10 vorhanden, die unten ausführlich beschrieben werden (siehe Beispiel XIV). Plasmid pSAOHI wird schematisch in der Abb. 17 dargestellt. Es wird gezeigt, daß das Plasmid neben der Verschmelzung von regulatorischem Bereich und /3-Galaktosidasegen, die ausführlich in der Abb. 16 gezeigt wird, folgende Komponenten enthält:
(a) pBR322-Folgen, einschließlich des Gens AmpR;
(b) Gen HIS4von Pichia pastoris
(c) 2μ Kreis-DNA von S. cerevisiae und
(d) das unterbrochene Gen URA3 von S. cerevisiae.
Das Plasmid hat daher die Fähigkeit, sich in Wirten E. coli und in Hefewirten zu transformieren und zu replizieren.
Es sind selektierbare Markierungen für die Manipulation der DNA in Wirten von E. coli oder Hefe vorhanden.
Plasmid pSAOH5wird schematisch in der Abb. 18gezeigt. Das Plasmid ist dem oben beschriebenen pSAOH 1 ähnlich, es wurden aber die 2 μ Kreis-DNA von ö. cerevisiae und ein Teil des HIS4-Gens von Pichia pastoris, das die DNA flankiert, gelöscht, während eine autonome Replikationsfolge von Pichia pastoris (PARS 1 von pYJ 30) hinzugefügt wurde.
Plasmid pSAOHIO wird schematisch in der Abb. 19 gezeigt. Das Plasmid enthält:
(a) die Verschmelzung regulatorischer Bereich -/3-Galaktosidase;
(b) pBR325-Folgen, einschließlich der Gene, die Tetrazyklinresistenz, Chlorampheniklresistenz und Ampicillinresistenz (tetR, cam" bzw. ampR) übertragen, und
(c) Gen HIS4 von S. cerevisiae (wie oben beschrieben aus Plasmid pYA2 gewonnen).
Die Plasmide pTAFH.85, pT76H1 und pT76H2 sind den drei oben beschriebenen Plasmiden analog, es wurde jedoch die Verschmelzung regulatorischer Bereich -/3-Galaktosidasegen aus der Abb. 15a (statt der in Abb. 16 beschriebenen Verschmelzung) eingesetzt.
Die Plasmide pT76 H 3 und pT76H4sind pSAOHI bzw. pSAOH 5 analog, es wurde jedoch die Verschmelzung regulatorischer Bereich -/3-Galaktosidasgen aus der Abb. 15b (statt der in der Abb. 16 beschriebenen Verschmelzung) eingesetzt.
Plasmid pTAFH.85 wird schematisch in der Abb. 20 gezeigt und besteht aus
(a) der Verschmelzung regulatorischer Bereich -/3-Galaktosidasegen, die in der Abb. 15a gezeigt wird;
(b) pBR322-Folgen, einschließlich des Gens amp";
(c) HIS4-Gen von Pichia pastoris;
(d) 2 u Kreis-DNA von S. cerevisiae und
(e) dem unterbrochenen URA3-Gen von S. cerevisiae.
Plasmid pT76H1 wird schematisch in der Abb. 21 gezeigt und besteht aus
(a) der Verschmelzung regulatorischer Bereich -/3-Galaktosidasegen, in der Abb. 15a gezeigt wird;
(b) pRB322-Folgen, einschließlich des Gens ampR, und
(c) Gen HIS4von Pichia pastoris und der autonomen Replikationsfolge (PARS1). Plasmid pT76H2 wird schematisch in der Abb. 22 gezeigt und besteht aus
(a) der Verschmelzung regulatorischer Bereich — /3-Galaktosidasegen, die in der Abb. 15a gezeigt wird;
(b) pBR325-Folgen, einschließlich der Gene, die Tetrazyklinresistenz, Chloramphenikolresistenz und Ampicillinresistenz übertragen, und
(c) Gen HIS4 von S. cerevisiae.
Plasmid pT76H3 wird schematisch in der Abb.22a gezeigtund bestehtaus
(a) der Verschmelzung regulatorischer Bereich —/3-Galaktosidasegen, die in der Abb. 15b gezeigt wird;
(b) pBR322-Folgen, einschließlich des Gens amp";
(c) Gen HIS4 von Pichia pastoris;
(d) 2 u Kreis-DNA von S. cerevisiae und
(e) dem unterbrochenen Gen URA3 von S. cerevisiae.
Plasmid pT76H4 wird schematisch in der Abb. 2 b gezeigt und bestehtaus
(a) der Fusion von regulatorischem Bereich — /3-Galaktosidasegen, die in der Abb. 15b gezeigt wird;
(b) pBR322-Folgen, einschließlich des Gens amp";
(c) Gen HIS4 von Pichia pastoris und
(d) der autonomen Replikationsfolge (PARS 1) und Pichia pastoris
Expression von /3-Galaktosidase in Hefe
Pichia pastoris GS115 (NRRL Y15851) wurde mit den oben beschriebenen neuartigen, das /3-Galaktosidasegen enthaltenden Konstruktionen transformiert. Einige der daraus entstandenen transformierten Hefestämme wurden beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture deponiert und erhielten folgende Zugriffsnummern:
Wirt Plasmid Zugriffs-Nr. des trans
formierten Stamms
GS115 pSAOHI NRRL Y-15852
GS115 pSAOH5 NRRLY-15853
GS 115 pSAOmo NRRL Y-15854
GS115 pTAFH.85 NRRLY-15855
GS115 pT76H1 NRRLY-15856
GS115 pT76H2 NRRL Y-15857
Die neuartigen, das /3-Galaktosidasegen enthaltenden Konstruktionen wurden auch zur Transformation von E. coli verwendet. Auch transformierte Bakterienstämme wurden beim Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, deponiert, um die Verfügbarkeit nach Erteilung eines Patents für diese Anmeldung zu gewährleisten. Den transformierten Stämmen wurden folgende Zugriffsnummern zugewiesen:
Wirt Plasmid Zugnffs-Nr. des trans
formierten Stamms
MC 1061 pSAOH1 NRRLB-15861
MC1061 pSAOH5 NRRL B-15862
MC 1061 pSAomo NRRL B-15863
MC 1061 pTAFH.85 NRRLB-15864
MC 1061 pT76H1 NRRL B-15865
MC 1061 pT76H2 NRRL B-15866
MC 1061 pTA013 NRRL B-15875
MC 1061 pT76H3 NRRLB-18000
MC 1061 pT76H4 NRRLB-18001
MC 1061 pT76U1 NRRLB-18002
Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851), das mit jedem der ersten achtoben beschriebenen Plasmiden, welche die Verschmelzungen von regulatorischem Bereich von Alkoholxydase und p76 und lacZ-Gen der Erfindung enthalten, transformiert wurde, wurde auf einem minimalen Medium, ergänzt mit Biotin und Glukose als Kohlenstoffquelle, bis zur stationären Phase gezüchtet. Sobald die Zellen die stationäre Phase erreicht hatten, wurden sie auf ein minimales Medium übertragen, das mit Biotin und Methanol als Kohlenstoffquelle ergänzt wurde. Nachdem die Zellen über etwa 3 bis 5 Generationen bei 30°C gezogen wurden, wurden sie. auf ein frisches Minimalmedium übertragen, das mit Biotin ergänzt wurde, und auf Glukose oder Methanol als Kohlenstoffquelle gezogen. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben der Kulturen entnommen und auf das Vorhandensein von /3-Galaktosidase un Alkoholoxydase nach Methoden analysiert, welche in den Beispielen VII und XV ausführlich beschrieben werden.
Es wurde festgestellt, daß Zellen, die auf Glukose als Kohlenstoffquelle gezogen wurden, keine feststellbaren Werte von /3-Galaktosidase oder Alkoholoxydase enthielten, während Zellen, die auf Methanol als der einzigen Kohlenstoffquelle gezogen wurden, signifikante Werte sowohl von Alkoholoxydase als auch /3-Galaktosidas enthielten. Es wurde festgestellt, daß auch die auf Glukose gezogenen Zellen, wenn sie Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation ausgesetzt wurden, meßbare Mengen an Alkoholoxydase und O-Galaktosidase hervorbrachten. Damit ist klar, daß die regularorischen Bereiche der Erfindung sowohl auf das Vorhandensein von Methanol als auch auf Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation ansprechen. Als Nachweis, daß die regulatorischen Bereiche der Erfindung auf das Wachstum auf nichtkatabolitunterdrückenden Kohlenstoffquellen wie auch auf Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation ansprechen, wurden ein Plasmid, das den regulatorischen Bereich von Alkoholoxydase enthält, pTA013, sowie ein Plasmid, das den regulatorischen Bereich von p76 enthält, pT76 U1, dazu verwendet, einen nichtmethanolnutzenden Hefestamm, Saccharomyces cerevisiae, zu transformieren. Einer der eingesetzten transformierten Stämme mit der Laborbezeichnung SEY2102-pTA013 wurde beim Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, deponiert, um nach Erteilung eines Patents für diese Anmeldung den Zugriff zu garantieren. Dem transformierten Stamm wurde die Zugriffs-Nr. NRRL Y-15858 zugewiesen. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-15858 und SEY2102-pT76U1 Wurden auf Glukose, Fruktose, Ethanol, Glyzerol und Galaktose über etwa fünf Generationen gezogen, dann den Bedingungen einer Kohlenstoffquellenstarvation ausgesetzt. Die übliche Analyse nach /3-Galaktosidase (siehe Beispiel XV) nach fünf Generationen zeigte, daß auf Glyzerol und Galaktose gezogene Zellen große Mengen an /3-Galaktosidase produzierten, während auf Glukose und Fruktose gezogene Zellen im wesentlichen keine /3-Galaktosidase produzierten. Wenn /3-Galaktosidase nach 6 Stunden unter Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation gemessen wurde, konnte die Produktion mäßiger Mengen von ß-Galaktosidase durch die transformierten Organismen, die auf Glukose und Fruktose gezogen wurden, und von beachtlichen Mengen von /3-Galaktosidase durch die auf Glyzerol und Galaktose gezogenen Zellen beobachtet werden. Die regulatorischen Bereiche der Erfindung sind also in der Lage, die Produktion von Proteinprodukten in genetisch sehr unterschiedlichen Wirten zu steuern und sind nicht auf die Verwendung methanolnutzender Stämme beschränkt.
Ausführungsbeispiel
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
Die Pufferstoffe und Lösungen, die in den folgenden Beispielen eingesetzt werden, haben die nachstehend gegebene Zusammensetzung:
1 M-Trispuffer 121,1g Tris-Base in 800 ml H2/; pH-Wert durch Zusatz konzentrierter (35 %) wäßriger HCI auf gewünschten
Wert abstimmen, Lösung vorabschließender pH-Wert-Abstimmung auf Zimmertemperaturabkühlen lassen, aufein Endvolumen von 1 !verdünnen.
S-Puffer 1,5 M Sorbitol in 0,04 M Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,6.
PK-Puffer 0,14 M NaCI', 1 %Natriumdodekylsulfat (SDS), 0,01 IVIEDTA in 0,05 M (pH-Wert 8,4) Tris-Puffer.
ETS-Puffer 1OmM, 0,2 % SDS in 0,01 M (pH-Wert 7,4) Tris-Puffer.
TE-Puffer 1,OmM EDTA in 0,01 M Tris-Puffer (pH-Wert 7,4).
SSC 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumzitrat, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 abgestimmt.
TAE 4OmM Essigsäure, 5 mM EDTA in 0,02 M Trispuffer (pH-Wert 8,3).
PBS(Phosphat- 10mMNatriumphosphat(pH-Wert7,0)
gepufferte 0,15MNaCI
Salzlösung)
Laemmli-Be- 62,5 mM Tris-HCI (pH-Wert 6,8), 2 % SDS, 10 % Glyzerol, 5 % 2-Merkaptoethanol, 0,01 % Bromphenol Blau
lastungspuffer
RIPA-Puffer 1 % NP40 (Sigma), 1 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS in PBS
20 χ SSPE 20 mMEDTA, 0,16 M NaOH, 0,2 M NaH2PO4 · H2O 3,6 M NaCI, abgestimmt mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0
Denhardts- 5 gFicoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon,
Lösung (5Ox) 5 g Hinderserumalbumin (BSA; Pentax-Fraktion V) mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml gebracht
Prehydridi- 5 s SSPE, 5 χ Denhardts-Lösung, 50 % deionisiertes Formamid, 0,2 % SDS,
zationspuffer 200 ^m/ml zerkleinertes und denaturisiertes Heringssperma-DNA
LB-Medium 5gBacto-Trypton,5gBacto-Hefeextrakt
(Luria-Bertani) 2,5 g NaCI in 1 !Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 abgestimmt
SD-Medium 6,75 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (DIFCO), 2 % Dextrose in 11 Wasser
YPD-Medium 1 %Bacto-Hefeextrakt, 2%Bacto-Pepton
2% Dextrose
SED 1 M Sorbitol, 25 mMEDTA, 5OmM DTT
SCE-Puffer 9,1 g Sorbitol, 1,47 g Natriumzitrat, 0,168 g EDTA, 50 ml H2O, mit HCI auf einen pH-Wert von 5,8 abgestimmt
GaS 1 M Sorbitol, 1OmMCaCI2, Filtersterilisation
PEG-Lösung 20%Polyethylenglykol —3350
10mMCaCI2,1OmMTris-HCI (pH-Wert7,4), Filtersteriiisation
SOS 1 M Sorbitol, 0,3 χ YPD-Medium, 1OmM CaCI2
Formamid- . 0,1 %Xylolzylenol FF, 0,2 %Brompehnol Blau
Färbemischung 1OmM EDTA, 95% deionisiertes Formamid
Abdeckgel 76,8 g Harnstoff, 24 ml Akrylamidmaterial, 8 ml 1OxTBE, auf ein Endvolumen von 160 ml bringen
Akrylamid- 38 g Akrylamid, 2 g bis(N,N-Methylenbisakrylamid), Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100,0 ml
material zusetzen
Unteres Gel 14,4g Harnstoff, 3,0 g Sukrose, 7,5 ml 1OxTBE, 4,5 ml Akrylamidmaterial, 0,3 ml Bromphenol-Blau-Lösung
(0,01 g/ml), Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 30 ml zusetzen
Prähybridizationspuffer für Hybridisationsselektion 0,5 M NETS-Puffer 10XRT-Puffer dilRT Diedeoxy:
ddTTP dNTP-Mischung
50% Formamid,0,75% Μ NaCI, 0,1 MTris,pH-Wert7,4,0,008 M EDTA, 0,5% SDS, 200/ig/ml Kaninchenleber-tRNA (Sigma)
0,5MNaCUOmMEDTA
10mMTRIS,pH-Wert7,4,0,2%SDS
500 mM NaCI, 340 mMTRIS, pH-Wert 8,3
60 mM MgCI2,50 mM DTT (Dithiothreitol)
4μΙ H20,1 μ\ 10X RT-Puffer, 5μΙ Reverstranskriptase, 15 U/ul (Life Sicence, Inc.)
0,49 mM
0,1165 mM
0,369 mM
0,82 mM
0,625 mMdGTP
0,625 mM dATP
0,625 mM TTP
1,125 mM dATP, 1,125 mMdCTP
1,125 mM dGTP, 1,125 mM TTP in 1 X RT-Puffer
Soweit nichts anderes angegeben ist, stellen die oben genannten Lösungen die Grundkonzentration (1 x) dar, die angewendet wird. In den Beispielen wird dort, wo andere Konzentrationswerte angewendet werden, diese Tatsache durch die Bezeichnung der Lösung als das Vielfache der Grundkonzentration (1 x) zum Ausdruck gebracht. In den Beispielen werden folgende Abkürzungen mt folgender Bedeutung verwendet:
EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure
TMED Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethylendiamin
DDT Diethiothreitol
BSA Rinderserumalbumin
EtBr Ethidiumbromid
Ci Curie
dATP Deoxyadenosintriphosphat
dGTP Deoxyguanosintriphosphat
TTP Thymidintriphosphat
dCTP Deoxyxzytidintriphosphat -
dXTP „generischer" Deoxytriphsphatnukleotid
Oligo(dT)12_i8 Quelle: Collaborative Research, Inc. Zymolyase 60000 Quelle: Miles Laboratories Mehrere Verfahren, die auf Routinebasis durchgeführt werden, werden nach einem Standardverfahren oder-protokoll ausgeführt, das nachstehend beschrieben wird.
Das Zentrifugieren erfolgt über eine Zeitspanne und mit einer Geschwindigkeit, die ausreichen, um eine klare obenaufschwimmende Schicht zu bilden. Im allgemeinen erfolgt das Zentrifugieren von Hefezellen bei wenigstens 1 500 g für die Dauer von mindestens 5min.
Nukleinsäureextraktionen mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol schließen den Schritt ein, die nukleinsäurehaltige Lösung mit einem gleichen Volumen eines Volumengemisches von 50:48:2 von Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol in Kontakt zu bringen. Extraktionen mitChloroform/lsoamylalkohol schließenden Schritt ein, die zu behandelnde Lösung mit einem gleichen Volumen eines Volumengemischs von 48:2 von Chloroform und Isoamylalkohol in Kontakt zu bringen.
Wenn ausgesagt wird, daß ein Gel, Filter usw. in einer spezifizierten Lösung gewaschen oder getränkt wird, wurde das ganze Gel oder der ganze Filter und ähnliches in einem geeigneten Gefäß (Pfanne, Schale, Fläschchen usw.) untergetaucht, um die gesamte Oberfläche des Gels, Filters oder ähnlichem mit der interessierenden Lösung in Kontakt zu bringen.
Die Ethanolausfällung von Nukleinsäuren beinhaltet zunächst die Abstimmung des Salzgehaltes der nukleinsäurehaltigen Lösung, dann die Kontaktherstellung zwischen Lösung und zwei Volumen von kaltem Ethanol.
Beispiel I Wachstum und Vorbereitung von Hefezellen ;
Pichia pastoris NRRL Y-11430 wurde unter begrenzten Kohlenstoffbedingungen in einer kontinuierlichen K; '*ur bei 30°C mit Methanol oder Ethanol als der einzigen Kohlenstoffquelle in einem Minimalmedium aus IM 1-Salzen gezogen, wie es von Wegner in US-PS 4414329 beschrieben wurde. IM1-Minimalmedium enthalten je Liter des Mediums 36mM KH2PO4, 23mM (NH4I2SO4,2mM MgSO4,6,7mM KCI, 0,7mM CaCI2, 0,2AiMCUSO4 -5H20,1,25μΜ Kl, 4,5,UMMnSO4, 2μΜ Na2MoO4, 0,75μΜ H3BO3,17,5/LiMZnSO4,44,5μΜ FeCI2 und 1,6μΜ Biotin. Die auf Methanol gezogenen Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 140g/l (Trockengewicht) bei einer Verweilzeit von etwa 12 Stunden gezogen. Die auf Ethanol gezogenen Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 90g/l bei einer Verweilzeit von etwa 11,5 Stunden gezogen. Wenn Methanol oder Ethanol in den Fermentator eingeführt wurden, wurden Ausgangsmaterialien mit einer Konzentration von 20% bzw. 45% Alkohol verwendet.
Zehn Gramm von im Fermentator gezüchteten Zellen von Pichia pastoris wurden durch Zentrifugation aufgefangen und zu etwa 108 Zellen/ml in 0,1 M Tris (pH-Wert 8,0), der 1 % 2-Merkaptoethanol enthielt, wieder zur Suspension gebracht. Diese Zellen wurden für die Dauer von 5 bis 10 Minuten bei 370C inkubiert und durch Zentrifugieren aufgefangen. Das Pellet wurde einmal mit 30ml S-Puffer gewaschen und erneut in 5ml S-Puffer je Gramm Zellen zur Suspension gebracht. Der Zellensuspension wurde Zymolyase (Miles Biochemicals) zugesetzt, so daß man eine Endkonzentration von 500μg/ml erhielt. Die Zellen wurden bei 37°C
für die Dauer von 20 Minuten inkubiert und dann zentrifugiert; die obenaufschwimmende Schicht wurde weggetan und das Zellenpellet aufgenommen. Dieses Pellet wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und zur späteren Verwendung bei -7O0C bewahrt.
Beispie! II
Isolierung von Hefe-RNA
Die Gesamtzellen-RNA wurd durch Pulverisieren des nach Beispiel I hergestellten Pellets mit Mörser und Stößel und weitere Aufspaltung des gefrorenen Pellets in einem Waring-Blender (Mischer) im Vorhandensein von flüssigem Stickstoff für die Dauer von etwa 2 bis 5 Minuten hergestellt. Das pulverisierte Pellet wurde in einer Konzentration von 7,5 ml je Gramm Zellen PK-Puffer zugesetzt. Dem erneut zur Suspension gebrachten Pellet wurde Proteinase K (Boehringer Mannheim) zugesetzt, so daß sich eine Endkonzentration von 400/xg/ml ergab, und die Suspension wurde bei Zimmertemperatur für 10min inkubiert. Dieses Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, gefolgt von einer Chloroform/Isoamylalkoholextraktion. Nukleinsäuren wurden durch Abstimmung der Lösung von 0,25M NaCI und den Zusatzt von Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde erneut in einem Miriimalvolumen von ETS-Puffer zur Suspension gebracht, d. h., das Puffervolumen, das zur Auflösung der Nukleinsäuren ausreichend war; im allgemeinen etwa 100/^g bis zu etwa 1 mg DNA je ml Lösung. Diese Lösung wurde wieder mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, dann mit Chloroform/Isoamylalkohol und schließlich mit Äthanol ausgefällt.
Die Nukleinsäuren wurden erneut in einem Minimalvolumen von TE-Puffer aufgelöst. Die in dieser Lösung vorhandene RNA wurde entweder du rchZentrifugation durch ein CsCI-Polster zu 4 ml (1 gCsCI/ml, 1 mM EDTA iniOmMTris-Puffer [pH-Wert 7,4]) oder durch Ausfällen angereichert, wozu die Lösung 2M LiCI gemacht wurde, über Nacht bei 4-80C aufbewahrt und die RNA dann durch Zentrifugation aufgefangen wurde. Die PoIy-A+-RNA wurde aus der Lösung durch Affinitätschromatografie auf Oligo(dT)zellulosekolonnen selektiert. Im allgemeinen wurden 0,25g Oligo(dT)zellulose, Typ 3 (Collaborative Research), je 5 bis 10 mg der gesamten RNA für die Chromatographie vorbereitet. 0,25g Oligo(dT) zellulose wurden in 2 ml ETS-Puffer aufgeschlämmt und in eine kleine, silikonisierte Glaskolonne gegossen. Diese Oligo(dT)zellulosekolonne wurde durch Ablagerung von 10ml 0,1 IVI NaOH über der Oligo(dT)zellulose und Durchlaufenlassen der Waschlösung durch die Oligo(dT)zellulosematrix gewaschen. Auf die gleiche Weise wurde die Oligo(dT)-Zellulose dann mit 10ml ETS-Puffer und abschließend mit 10ml von 0,5M NETS-Puffer gewaschen.
Die gesamte RNA (5 bis 10mg) wurde weiter in ETS-Puffer mit einer Konzentration von nicht mehr als etwa 10mg/mlzur Suspension gebracht, für die Dauer von 2 min in ein Wasserbad von 650C gegeben und dann sofort auf Eis gebracht. Die RNA-Lösung konnte sich dann auch Zimmertemperatur erwärmen, und es wurde eine Vorratslösung von 5M NaCI zugegeben, um eine Endkonzentration des Salzes in der RNA-Lösung von 0,5M NaCI zu erreichen. Die resultierende RNA-Lösung wurde auf die vorbereitete Oligo(dt)zellulosekolonne aufgebracht, anschließend ließ man sie langsam, mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 Tropfen/5s, durch die Kolonne fließen. Das aus dem Kolonnenboden ausfließende Material wurde in einem Rohr aufgefangen und erneut oben auf die Kolonne aufgebracht. Das aus dem Kolonnenboden ausfließende Material wurde ein zweites Mal oben auf die Kolonne gebracht, so daß die RNA-Lösung insgesamt dreimal durch die Oligo(dT)zellulosekolonne geführt wurde. Nach dem letzten Durchgang durch die Kolonne wurde das Material aufgefangen und als Poly-A'-RNA gekennzeichnet, d. h. Nicht-PoIy-A-RNA. Die Kolonne wurde dann mit 30ml von 0,5M NETS-Puffer gewaschen, und abschließend wurde die PoIy-A-I-RNA' aus der Kolonne durch Einführung von 5 ml ETS-Puffer auf die Kolonne und langsames Durchfließenlassen eluiert, wobei die Poly-A+-RNA-Fraktion in der 5-ml-Fraktion aufgefangen wurde, die aus dem Boden der Kolonne austrat. Ausgehend von der Annahme, daß in der Poly-A+-RNA-Fraktion kein NaCI vorhanden war, wurde die NaCI-Konzentration dieser Fraktion auf 0,25 M abgestimmt und RNA mit Ethanol ausgefällt.
Beispiel III Aufbau der cDNA-Bibliothek, des cDNA-Archivs
Komplementäre DNA-Klone (cDNA-Klone) wurden folgendermaßen synthetisiert. Zehn Mikrogramm von Poly-A+-RNA, die nach dem Beispiel Il hergestellt wurden, wurden wieder in 7μ.Ι H2O zur Suspension gebracht und auf eine Endkonzentration von 2,7 mM CH3HgOH gebracht, anschließend erfolgte bei Zimmertemperatur die Inkubation für die Dauer von 5 min. Der erste Strang von cDNA wurde bei 42°C für die Dauer von 15 min in 50μ.Ι einer Lösung synthetisiert, welche 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert bei 420C 8,3,10mM MgCI2,3OmM 2-Merkaptoethanol, 70 mM KCI, 500μΜ jeweils von dATP, dGTP und TTP, 200μΜ dCTP, 25(ug/ml Oligo(dT), 25^Ci a-32P dCTp (32,5pMol) und 120 Einheiten Reverstranskriptase (Life Sciences Inc.) enthielt. Dieses Reaktionsgemisch wurde bei 370C weitere 15min inkubiert. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 2μΙ von 0,5M EDTA und 0,5jul von 20% SDS beendet. Die Reaktion wurde auf 0,3M NaOH abgestimmt und bei 650C für die Dauer von 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch durch den Zusatz von 10μΙ1 M-Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) und die Abstimmung des Reaktionsgemisches auf 0,21 M HCI neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol extrahiert, dann noch einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol und abschließend über einer Sephadex G 50-Kolonne in einem TE-Puffer chromatografie!·! Die radioaktveeinsträngigecDNAwurde in eine Fraktion geppolt und auf 100μΙ konzentrier. intweder durch Butanolextraktion oder durch Verdampfung mittels Zentrifugieren unter Vakuum. Die einsträngige cDNA wurde mit Ethanol aus der konzentrierten Lösung ausgefällt, cDNA durch Zentrifugieren aufgefangen aund in 100μΙ Wasser wieder zur Suspension gebracht.
Die wäßrige, einsträngige cDNA-Lösung wurde auf 2,5M Ammoniumazetat abgestimmt, mit Ethanol ausgefällt, durch Zentrifugieren aufgefangen und in 20 ml Wasser wieder zur Suspension gebracht. Diese einsträngige DNA-Lösung wurde mit 5OmM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4), der 5mM MgCI2,1 mM 2-Merkaptoethanol, 250/zM jeweils von dATP, dGTP und TTP, 125μΜ dCTP, 25,uCia-32P-dCTP( 32,5 pMol) und 8 Einheiten von Klenow-Fragment-DNA-Poll (New England Biolabs) enthielt, auf ein Endvolumen von 50μΙ gebracht. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert, um den komplementären zweiten DNA-Strang zu einer einsträngigen cDNAzu synthetisieren. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 2μΙ 0,5 M EDTA beendet. Die doppelsträngigecDNAwurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, dann mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und über einer Sephades G 50-Kolonne in TE-Puffer chromatografiert. Die doppelsträngigen cDNA-Fraktionen wurden gepoolt und der Pool wie für die einsträngige cDNA beschrieben konzentriert und ausgefällt. ,
Nach der abschließenden Ethanolausfällung und dem Auffangen der doppelsträngigen cDNA durch Zentrifugieren wurde das Pellet in 20,25/nl Wasser wiederzur Suspension gebracht, dann auf ein Endvolumen von 50 μΙ mit 50 MMTris-Puffer (pH-Wert 8,3 bei 420C), welcher 10 mM MgCI2,3OmM 2-Merkaptoethanol, 70 mM KCI, 500μΜ dXTP und 150 Einheiten Reverstranskriptase enthielt, gebracht. Die resultierende Lösung wirde bei 42°C für die Dauer von 15 min inkubiert, um den Abschluß der Synthese des zweiten Strangs der cDNA zu gewährleisten. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 2μΙ 0,5M EDTA beendet und wie bei dereinsträngigen cDNA-Reaktion konzentriert und ausgefällt.
Das doppelsträngige cDNA-Pellet wurde in 42μΙ H2O wieder zur Suspension gebracht, und die Lösung wurde auf ein Endvolumen von 47μΙ gebracht durch den Zusatz von 5μΙ einer Vorratslösung, welche 2,8M NaCI, 200 mM NaOAc und 45 mM ZnSO4 enthielt, dann mit HCI auf einen pH-Wert von 4,5 bei 22°C abgestimmt. Um die Haarnadelschleife abzubauen, wurden mit drei unterschiedlichen Konzentrationen von SrNuklease (Sigma) drei gesonderte Reaktionen ausgeführt. Es wurden eine Einheit, 10 Einheiten oder 100 Einheiten von SrNuklease zugesetzt, um das Reaktionsvolumen auf 50μΙ zu bringen, und die Reaktion wurde bei 220C für die Dauer von 30 min inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch den Zusatz von 2μΙ 0,5 M EDTA und 2,67 μΙ von 2 M Tri's-Base beendet. Als Träger wurden θμ-g Kaninchenleber-tRNA zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde wie oben beschrieben konzentriert und ausgefällt, mit der Ausnahme, daß die DNA-Pellets in TE-Puffer, nicht in Wasser erneut suspendiert wurden. Nach der abschließenden Ausfällung wurde das Pellet in 20μΙ TE-Puffer zur Suspension gebracht und eine Endmenge von 50μΙ in Terminaltransferasepuffer (BRL) hergestellt, der 1OpMoI von a-32P-dCTP, 2μΜ dCTP und 21 Einheiten von Terminaltransferase (Ratliff Biochem) enthielt. Die resultierende Lösung wurde bei 37°C 30min inkubiert, um den Poly-d(C)-Abschnitt des Endes 3'-OH der doppelsträngigen cDNA hinzuzufügen. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 5μΙ0,5 M EDTA beendet, extrahiert, chromatografie!! und als Ethanolpräzipitat aufbewahrt.
Die doppelsträngige, d(C)-geschwänzte cDNA wurde entweder direkt zu Poly-d(G)-geschwänzter pBR322 gemacht, offen an der Pstl-Stelle, oder zuerst auf Sepharose CL4B-200-Kolonne größenfraktioniert (Fraktionen von 25μ.Ι). Für das unfraktionierte Archiv wurden 150 ng der doppelsträngigen, poly-d(C)-geschwänzten cDNAin 180μΙ von lOmMTris-Puffer (pH-Wert 7,4) vergütet, was 0,1 M in NaCI und 1 mM in EDTA ist, auf 900ng von d(G)-geschwänzterpBR322, offen an der Pstl-Stelle. Jede der 25μΙ-ΡΓ8ΐ<ΐϊοηβη des fraktionierten Archivs wurde auf 125 g poly-d(G)-geschwänzter pBR322 in einem Endvolumen von 50μΙ des oben beschriebenen Vergütungsmediums vergütet. Die Vergütungsreaktionen wurden 3 Minuten bei 65°C, dann 2 Stunden bei 420C inkubiert, anschließend erfolgte eine langsame Abkühlung auf Zimmertemperatur.
Die vergütete cDNA-Bibliothek wurde in kompetente E. coli LE392 (ATCC 33572) transformiert, wobei folgendermaßen gearbeitet wurde: Ein Inokulum von LE392 wurde über Nacht bei 37°Cin einem 2xLB-Medium gezogen. Fünf Milliliter dieser über Nacht gezogenen Kultur wurden in 200 ml frischen 2x LB-Medium inokkuliert und auf einen OD60O von 0,2-0,3 bei 370C gezogen. Diese Kultur wurdefür die Dauer von 10 min auf Eis gebracht, und die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren bei 4°C aufgefangen. Das Zellenpellet wurde in 80 ml eiskaltem 0,1 M CaCI2 wieder zur Suspension gebracht und 25 min bei 40C in kubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 4°C gewonnen, das Zellenpellet in 2 ml eiskaltem 0,1 M CaCI2 wieder zur Suspension gebracht und vor der Verwendung wenigstens 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Dann wurden 200 ml der Zellen je 50μΙ Vergütungsmischung für die Transformation verwendet. Die kompetenten Zellen und die DNA wurden kombiniert und bei etwa 40C für zehn Minuten inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 370C für die Dauer von 5 Minuten, und abschließend für 10 Minuten auf Eis gebracht. Dem Transformationsgemisch wurde eine gleiche Menge 2x LB-Medium zugesetzt und dieses bei 370C für die Dauer von 45 Minuten inkubiert. Die transformierten Zellen wurden mit 250μΙ/Ρΐ3«β auf 2x LB-Platten zu 150 mm aufgebracht, welche Ιδμς/ιηΙΤβίΓΒζγ^ϊη enthielten. Die Platten wurden bei 37 "C für die Dauer von 24 Stunden inkubiert und bei 40C aufbewahrt.
Replikafilter wurden hergestellt durch das Aufbringen von Nitrozellulosefiltern auf einen Originalfilter, der zum Abheben der Kolonien von der Platte verwendet wurde. Diese Replika-Filter wurden auf 2 χ LB-Tet-Platten (15 μg/mlTetrazyklin) inkubiert. Die Kolonien auf den Filtern wurden für die Sondierung durch Übertragung der Filter auf 2x LB-Tet-Platten hergestellt, welche 200μg/ml Chloramphenikol enthielten, Inkubation der Filter bei 370C für die Dauer von wengistens 12 Stunden, anschließendes Auflösen der Kolonien durch Aufschwimmen der Filter in einem wässrigen Medium, das aus 1,5 M NaCI und 0,5M NaOH besteht, für die Dauer von 10 Minuten. Die Filter wurden dann durch Aufschwimmen auf einem wäßrigen Medium, das aus 1,5M NaCI und 0,5M Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) besteht, für die Dauer von 15 Minuten neutralisiert, diese Neutralisierung wurde dann wiederholt. Dann wurden die Filter zunächst luftgetrocknet und dann unter Vakuum bei 7O0C für die Dauer von 2 Stunden getrocknet.
Beispiel IV Koloniehybridisierung
Die vakuumgetrockneten Nitrolzellulosefilter, welche das cDNA-Archiv enthielten (hergestellt, wie das im vorstehenden Beispiel beschrieben wurde) werden bei 420C für die Dauer von 5 Stunden in einem Vorhybridisationspuffer vorhybridisiert. Die Filter wurden dem Vorhybrdisationspuffer entnommen und leicht mit der behandschuhten Hand in 5x SSPE abgerieben, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Filter wurden in Hydrisationspuffer gegeben (wie Vorhybridisationspuffer, aber ausgenommen 1 χ Denhardt-Lösung). Es wurde 32P-gekennzeichnete, einsträngige cDNA (106cpm/ml) oder endgekennzeichnete Poly-A+-RNA auf die Filterfür 17 Stunden bei 420C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die FiI: ^r kurz in 2x.SSPE bei 22°C gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen bei65°Cin 0,1 χ SSPE für jeweils 10 Minuten.
Die Endmarkierung von Poly-A+-mRNA erfolgte durch den Zusatz von 2μg Poly-A+-mRNAzu einem Volumen von 50μΙ, das 50 M Tris-Puffer (pH-Wert 9,5) enthielt, Erhitzen auf 100°Cfür die Dauer von drei Minuten und rasches Abschrecken auf Eis. Diese RNA-Lösung wurde auf ein Endvolumen von 200μΓ verdünnt und auf 50mMTris (pH-Wert 9,5) 1OmM MgCI2, 5mM DDT und 50 pMol von 32P-a-ATP abgestimmt. Es wurden 10 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim) zugesetzt, und das Gemisch wurde ein Stunde lang bei 370C inkubiert. Die Kinasereaktion wurde durch den Zusatz von 10μΙ 0,5M EDTA beendet, mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und durch Sephadex G 50 chromatografie!!, um die nichteinbezogene radioaktive Markierung zu entfernen.
Beispiel V Northern-Hybridisierungen
Zwei bis fünf Mikrogramm Poly-A+-mRNA wurden für die Dauer von 5 Minuten bei 650C in 10mM-Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) erhitzt, der 50% Formamid, 2,2M Formaldehyd und 0,5mM EDTA enthielt. Die resultierende Lösung wurde auf
Zimmertemperatur abgekühlt, und es wurde eine entsprechende Menge (im allgemeinen etwa 0,2 Volumen auf der Grundlage des Volumens der behandelten Probe) von 5x Proben-Puffer (0,5% SDS, 0,025% Bromophenol Blau, 25% Glyzerol, 25mM EDTA) zugesetzt. Die Proben wurden auf ein 1,5%iges Agarosegel gebracht, das in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) hergestellt wurde, welcher 1,1 M Formaldehyd enthielt, und in demselben Puffer einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde mit Akridin-Orange (33/i£g/ml) in 1OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) gefärbt, durch Tränken des Gels in demselben Puffer für die Dauer von 10 Minuten entfärbt, wenigstens 10 Minuten in 10x SSPE getränkt und die RNA auf Nitrozellulose transferiert, wie das im Beispiel Vl beschrieben wird.
Beispiel Vl
Isolierung der genomischen DNA und Klone
Genomische DNA von Pichia wurde unter Anwendung der Methode isoliert, die im Beispiel Il für die RNA-Isolierung von Pichia beschrieben wurde. Das Nukleinsäurepellet wurde in einem Minimalvolumen von TE-Puffer erneut zur Suspension gebracht und mit 20/xg/ml Ribonukjease Afür 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde auf 0,14M NaCI gebracht und mit Proteinase K bei 200/zg/ml für die Dauer von 15 Minuten bei 220C behandelt. Die entstandene Lösung wurde zuerst mit Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol und dann mit Chloroform/Isoamylalkohdl extrahiert und anschließend mit Ethanol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde in einem Minimal volumen TE-Puffer wieder zur Suspension gebracht und zentrifugiert, um die DNA-Lösung zu klären. .
Zehn Mikrogramm der genomischen DNA von Pichia, die wie im vorherigen Abschnitt beschrieben hergestellt worden waren, wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen (BRL) abgebaut und auf 1 % Agarosegel, das TAE enthielt, einer Elektrophorese unterzogen. Die DNA-Fragmente im Gel wurden durch Tränken des Gels in 1,5 M NaCI, 0,5 Μ NaOH für die Dauer von 20 Minuten denaturiert. Das Gel wurde durch Tränken in 1,5 M NaCI, 0,5 M Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) für die Dauer von 20 Minuten neutralisiert. Vorderübertragung wurde das Gel wenigstens 5 Minuten lang in 10x SSPE getränkt. Ein Nitrozelluloseblatt wurde auf die Größe des Gels geschnitten, in Wasser benetzt und kurz in 10x SSPE getränkt. Dieser Filter wurde oben auf das Gel gelegt, das wiederum auf ein Stück Parafilm gebracht wurde. Oben auf die Nitrozellulose wurde ein Bogen Whatmann-Filterpapier und ein Stapel Papierhandtücher gelegt, um die DNA aus dem Gel zu ziehen und auf die Nitrozellulose zu übertragen. Um die Übertragung zu erleichtern, wurde ein Gewicht auf den'Stapel gelegt. Die Übertragung der DNA auf diese Weise konnte über wenigstens 3 Stunden erfolgen. Nach der Übertragung wurde der Filter kurz in 5x SSPE getränkt, luftgetrocknet und unter Vakuum bei 7O0C für die Dauer von 2 Stunden getrocknet. Komplementäre genomische Fragmente wurde durch Hybridisierung auf die nicktranslaterierten cDNA-KlonepPC 8,0, pPC 6,4 und pPC 15,0 unter Anwendung der gleichen Vorhybridisierungs-, Hybridisierungsund Waschpuffer wie im Beispiel IV identifiziert. ,
200 ng der cDNA-Klone wurden über die Dauer von 90 Minuten bei 140C in 30μΙ einer Lösung nick-translateriert, welche 5OmM Tris-HCI (pH-Wert 7,4), 1OmM MgSO4,100μΜ DTT, 50/xg/ml BSA, jeweils 20μΜ dGTP,TTP und dATP, 31,24pMol 32P-a-dCTP (3200Ci/mMol, NEN), 2 Einheiten DNA Poll (BRL) von E. coli und 0,02ng DNasel enthielt. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 1 μΙ 0,5 M EDTA und 1 μ,120%iger SDS beendet. Die'markierte DNA-Lösung wurde auf eine Endkonzentration von 0,3 M NaOH gebracht und dann für 3 Minuten in siedendes Wasser gegeben. Dieses Gemisch wurde auf einer Sephadex G50-Kolonne chromatografie!"! Die markierten DNA-Fraktionen wurden gepoolt, es wurde die spezifische Aktivität bestimmt und die Probe bei Hydridisationsexperimenten eingesetzt.
Genomische Fragmente, die auf die cDNA-Proben hybridisiert wurden, wurden durch den Abbau von 200μg genomischer DNA von Pichia mit verschiedenen Restriktionsenzymen (BRL) und die Elektrophorese des abgebauten Stoffs auf einem 1%igen Agarosegel in TAE-Puffer isoliert. Das Band mit der entsprechenden Größe wurde aus dem Agarosegel geschnitten, die DNA elektroeluiert, durch eine Elutip-Koionne (Schleicher und Schuell) geleitet und mit Ethanol ausgefällt.
Dieelektroeiuierten Fragmente wurde in Wasser wieder zur Suspension gebracht, und 200 ng Fragmente wurden an 500 ng von pBR322 gebunden, das an der entsprechenden Restrikationsstelle geteilt und, wenn notwendig, dephosphoryliert wurde. Die Ligationsreaktion wurde in 300μΙ von 66 mM Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) durchgeführt, der 6,6mM MgCI2,1OmM DDT, 0,4mM ATP, 25μg/ml BSA und 40-80 Einheiten von T4-DNA-Ligase enthielt, dann erfolgte die Inkubation bei 40C für 24 Stunden. Das Ligationsgemisch wurde direkt in kompetente Zellen von LE392 E. coli transformiert. Die Zellen wurden wie im Beispiel III kompetent gemacht, auf die gleiche Weise erfolgte auch die Transformation. Es wurde eine Reihe von drei Transformationen mit 10, 40 und 100 ng von pBR322 (plus Einfügung) durchgeführt, jede Transformation in 100μΙ kompetenter Zellen. Die Zellen wurden wie im Beispiel III auf Platten gebracht, mit der Ausnahme, daß die antibiotische Selektion 50μg/ml Ampicillin betrug. Die Klone wurden auf Nitrozellulose übertragen, repliziert und für die Hybridisierung vorbereitet, wie das im Beispiel III beschrieben wurde. Die Filter wurden mit dem entsprechenden nick-translaterierten cDNA-Fragment sondiert. Streifengereinigte Kolonien, die in der Hybridisierung positiv waren, wurden auf folgende Weise zur Herstellung zusätzlichen Plasmid verwendet.
Das plasmidtragende E. coli LE392 wurde bis zu OD6oo von 1,0 in 1x LB-Medium gezogen, das 50μg/ml Ampicillin enthielt, und über Nacht durch den Zusatz von Chloramphenikol zu einer Endkonzentration von 200μg/ml vergrößert. Die Zellen wurden in 0,8% NaCI, 20 mM Tris-Puffer (pH-Wert 8,0), 20 mM EDTA gewaschen, dann in 25% Sucrose, 50 mM Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) und 2OmM EDTA mit450μg/ml Lysozom einer Lysozombehandlung unterzogen. Die Lysis wurde durch .'3n Zusatz von 5M NaCI zu einer Endkonzentration von 2,0 M erreicht, gefolgt durch den Zusatz eines gleichen Volumens von 0,2% Triton X-100 und 4OmM EDTA. Die Präparation wurde durch Schleudern bei 2000011/minfürdie Dauer von 45 Minuten geklärt. Die obenaufschwimmende Schicht wurde dann mitPhenol/Chloroform/lsoamylalkohol extrahiert, mit Chloroform/Isoamykalkohol extrahiert und mit EtOH ausgefällt. Das Pellet wurde in TE-Puffer wieder zur Suspension gebracht, mit RNase A behandelt, mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohole und mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Festes CsCI wurde zugesetzt, um eine Endkonzentration von 800μg/ml zu erreichen, und EtBr wurde zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu erreichen. Die resultierende Lösung wurde in einem Rotor Vti50 bei 49000 U/min 18-20 Stunden bei 20°C rotiert. Das Plasmidband wurde durch UV-Fluoreszens sichtbar gemacht und unter Verwendung von Nadel und Spritze aus dem Rohr gezogen. Die Plasmidlösung wurde viermal mit n-Butanol extrahiert und bei -20°C ethanolausgefällt. Die Ethanolausfällung wurde wenigstens zweimal wiederholt, um alles CsCI zu entfernen. Das Plasmid wurde bei —200C als Ethanolausfällung aufbewahrt.
Beispiel VII
Reinigung von Alkoholoxydase
Proteinproben von Pichia pastoris-Zellen, die auf Methanol gezogen wurden, wie das im Beispiel I beschrieben ist, wurden durch Lysis von Hefezellen vorbereitet, gefolgt von einem Schleudervorgang zu Klären, um Zelltrümmer zu entfernen. Dabei wurde folgendes Verfahren angewendet: Ein Teil des Fermentatosausflusses wurde weggenommen und mit Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,5 abgestimmt, anschließend erfolgt die Homogenisierung auf einem Gerät Dyno-Mill Modell KDL unter Verwendung eines Behälters mit einem Fassungsvermögen von 0,61 in einem kontinuierlichen Vorgang bei 3O0C unter Anwendung einer Bandkombination Nr. 3 und eines Flusses von 20-30 ml/h. Die Kugeln in der Mühle waren bleifreie Glaskugeln mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,5 mm. Das resultierende Homogenisat wurde bei 5°C zentrifugiert und mit 20000 Xg für die Dauer von 30 Minuten, so daß man eine zellenfreie obenaufschwimmende Schicht erhielt.
Sechs Portionen der zellenfreien obenaufschwimmenden Schicht zu je 130 ml wurden in Zelluloseazetat-Dialysebeutel gegeben und bei 5°C anhand von etwa 81 destilliertem Wasser dialysiert. Nach 4 Tagen wurde die wäßrige Phase jedes Beutels dekantiert. Die in den Beuteln verbleibenden Feststoffe bestanden aus zwei Typen. Die dünne, obere, weiße Schicht wurde sorgfältig entfernt und weggeworfen. Der untere Feststoff war braun-gelb und bestand aus kristalliner Alkoholoxydase. Ein Teil der kristallinen Alkoholoxydase wurde in destilliertem Wasser (etwa das Zehnfache des Volumens des Feststoffs) aufgelöst, und eine Analyse nach der Farbstoff-Peroxydase-Methode zeigte eine Aktivität von 94EU/ml. Die spezifische Aktivität von Alkoholoxydase war 10,4EU/mg Protein.
Der kristalline Niederschlag, der bei der oben beschriebenen Dialyse entstand, wurde anhand von 0,05M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) dialysiert und auf eine 2 χ 200cm-Sepachryl 200-Kolonne (Pharmacia) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer geeicht wurde. Fraktionen von 3,5 ml wurden bei einer Durchflußmenge von 10 ml/h aufgefangen und auf ihre Alkoholoxydaseaktivität untersucht.
Die Alkoholoxydaseaktivitätfürdie Reaktion mit Methanol wurde nachfolgendem Analyseverfahren bestimmt (Farbstoff-Peroxydase-Methode). Ein Farbstoff-Puffer-Gemisch wurde durch Mischen von 0,1 einer o-Dianisidinlösung (1 Gew.-%o-Dianisidin in Wasser) mit 12ml durchlüfteten 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) hergestellt. Das Analysegemisch wurde mit 2,5ml des Farbstoff-Puffer-Gemischs, 50/xl Methanol, 10μΙ einer Peroxydaselösung (1 mg Meeretich-Peroxydase-Sigma, Typ II) und 25μΙ der Alkoholoxydaselösung hergestellt. Das Analysegemisch wurde bei 25°C in einer Küvette von 4x1x1 cm aufbewahrt, und es wurde die Zunahme des Absorptionsgrades durch den Farbstoff bei 460 nm für 2 bis 4 Minuten aufgezeichnet. Die Enzymaktivität wurde folgendermaßen berechnet:
ΔΑ
Aktivität (μΜοΙ/min/ml oder Enzymeinheiten/ml) = x 11,5
min
wobei 11,5 ein Faktor ist, derauf einer Standardkurve basiert, welche mit bekannten Aliquoten von H2O2 erstellt wurde, und ΔΑ die Änderung im Absorptionsgrad während des Versuchsintervalls ist.
Insgesamt 0,1 ^g des Gesamtproteins von jeder Fraktion wurde auch nach der Gelelektrophorese mitSDS-Polyakrylamid (12%) auf den Gehalt an Alkoholoxydase untersucht.
Beispiel VIII DNA- und Proteinfolgen
Die Bestimmung der DNA-Folgen wurde nach der Methode der Dideoxykettenverlängerung unter Verwendung des Bakteriophagen M 13 (Sanger u.a., 1980) oder nach der chemischen Modifikationsmethode (Maxam und Gilbert, 1980) vorgenommen. Die DNA-Fragmente, welche dem Ende5'des Alkoholoxydasegens entsprachen, wurden in die M13mp8- und M13mp9-Vektoren eingeführt oder für die chemische Modifikationsmethode unter Verwendung der in diesem Bereich verfügbaren Restrfktionsenzymstellen endmarkiert.
Das Fragment 71 Obp Hindlll/Sall von pPG 4,0 wurde für die Maxam-Gilbert-Folge dadurch endmarkiert, daß zuerst 33^g des Plasmids mit Hindill abgebaut wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, mit Chloroform/ Isoamylalkohol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 31 μΙ Wasser wieder zur Suspension gebracht. 100μΟ von 32P-a-dCTP (3200Ci/mMol) und 2 Einheiten von Klenow-Fragment-DNA Poll wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um ein Endvolumen von 50μΙ zu ergeben, das 400μΜ dATP, 400μΜ dGTP, 50mMTris-Puffer (pH-Wert 7,4), 1OmM MgSO4 und 1 mM DDT enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 370C für die Dauer von einer Stunde inkubiert, die Reaktion dann durch den Zusatz von 2μΙ von 0,5M EDTA gestoppt. Das Gemisch wurde dann mit Phenol/ C+iloroform/lsoamylalkohol extrahiert, anschließend mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, auf einer Sephadex G-50-Kolonne chromatografiert, und die markierten Nukleinsäurefraktionen wurden gepoolt und mit Ethanol ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren wurde das DNA-Pellet in Wasser wieder zur Suspension gebracht und mit Sail abgebaut. Diese Substanz wurde auf 1 % Agarosegel in TAE-Puffer einer Elektrophoresebehandlung unterzogen, und das 710 bp-Band wurde aus dem Gel geschnitten, die DNA elektroeluiert, mit Butanol exrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das Fragment wurde in 100μΙ TE-Puffer wieder zur Suspension gebracht, auf 2,5M Ammoniumazetat abgestimmtund dann mit Ethanol ausgefällt. Das resultierende DNA-Fragment wurde in TE-Puffer mit einer Konzentration von 50000cpm/μΙ wieder zur Suspension gebracht. Die vier Basenmodifikationsreaktionen wurden folgendermaßen durchgeführt: (a) die G-Reaktion (Guanin-Reaktion) wurde 8 Minuten bei 220C inkubiert und enthielt 1μΙ (50000cpm) des markierten DNA-Fragments-, 4μΙ Wasser, 200μΙ von 5OmM Natriumkakodylat, pH-Werte 8,0,1 mM EDTA (DMS-Puffer) und 1 μΙ Dimethylsulfat. Die Reaktion wurden durch den Zusatz von 50μΙ DMS-Stopp-Puffer beendet, der 1,5M Natriumazetat (pH-Wert 7,0), 1M 2-Merkaptoethanol und 100;ug/ml tRNA enthielt, dann wurde Ethanol (750μΙ) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde mindestens 15 Minuten bei -7O0C gehalten, (b) Die G/A-Reaktion (Guanin/Adenin-Reaktion) wurde 10 Minuten bei 22°C inkubiert und enthielt 2μΙ (100000cpm) des markierten DNA-Fragments, 8μΙ Wasser und 30μΙ Methansäure. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 200μΙ von Hz-Stopp-Puffer (0,3 M Natriumazetat, pH-Wert 5,5,0,1 M EDTA und 25μg/ml eRNA) beendet, dann wurde Ethanol (750μΙ) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde für wenigstens 15 min bei -7O0C gehalten, (c) dieT/C-Reaktion (Thymin/Zystosin-Reaktion) wurde für 10 Minuten bei 220C inkubiert und enthielt 2μΙ (lOOOOOcpm) des markierten DNA-Fragments, 18μΙ Wasser und 30μΙ Hydrazin. Die Reaktion wurde wie oben unter (b) beschrieben beendet, (d) die C-Reaktion (Zystosin-Reaktion) wurde für 10 Minuten bei 220C inkubiert und enthielt 1 μΙ (50000cpm) des markierten DNA-Fragments, 4μΙ Wasser, 15μΙ von 5M NaCI und 30μΙ Hydrazin. Die Reaktion wurde wie oben in (b) beschrieben beendet.
Die DNA-Pellets wurden durch Zentrifugieren gewonnen, in 250μΙ von 0,3 IVI Natriumazetat, pH-Wert 5,5, wieder zur Suspension gebracht und mit 750μ\ 95%igen Ethanol ausgefällt. Die Pellets wurden durch Zentrifugieren gewonnen, 5 Minuten unter Vakuum getrocknet und die DNA durch erneutes Suspendieren der Pellets in "ΙΟΟμΙ einer 1 bis 10%igen (V/V) Verdünnung von Piperidin gespalten. Die Teilungsreaktion wurde bei 9O0C für 30 min inkubiert und durch den Zusatz von 500μΙ 98%igen Ethanol, 60mM Natriumazetat (pH-Wert 5,5) und 10/*g/ml tRNA beendet. Das Reaktionsgemisch wurde in ein Trockeneis/Ethanol-Bad (etwa -7O0C) gegeben und dort etwa 5 Minuten gehalten, die DNA-Fragmente wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Fragmente wurden in 50μΙ von 0,3 Μ Natriumazetat (pH-Wert 5,5) wieder zur Suspension gebracht und dann mit 100μ\ 95%igen Ethanol ausgefällt. Diese Ethanolausfällung wird wiederholt, die Pellets wurden mit 95%igem Ethanol gewaschen und während desZentrifugierens unter Vakuum verdampft. Die Pellets wurden in 10μΙ 80%igen Formamids, 1OmM NaOH, 1 mM EDTA, 0,1 % Xylolzyanolund0,1 % Bromphenol Blau wiederzurSuspension gebracht. Auf einem 10%igen, 0,4mm starken Polyakrylamidgel in TBE-Puffer wurden 2 ^3 3μΙ elektroeluiert.
Die Aminosäurefolge von Alkoholoxydase wurde durch Sequemat, Inc. (Watertown, Maa.) unter Verwendung von 2mg der gereinigten Alkoholoxydase von Pichia pastoris bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die ersten 18 Aminosäuren des reifen Proteins folgende Reihenfolge haben: Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.
Beispiel IX
Bestimmung der Transkriptionsinitiierungsstelle von Alkoholoxydase
Um zu bestimmen,:Wo sich der Anfang für die mRNA für Alkoholoxydase befindet, wurde ein Primerweiterführungsexperiment unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotiden durchgeführt, der von den DNA-Folgen des Endes 5' des Alkoholoxydasegensals Primer und 10/u.g der Poly-A+-mRNA von Pichia pastoris als Schablone kopiert wurde. Zehn Mikrogramm von Poly-A+-mRNA von Pichia pastoris wurden mit 3/ng des Primers (5'-CTT CTC AAG TTG TCG-3') in einem Endvolumen von 9,3ul kombiniert, das aus 43 mM NaCI, 29,2 mM Tris-Puffer (pH-Wert 8,3), 5,2 mM MgCI2 und 4,3 mM DTT bestand. Die Nukleinsäuren wurden bei 7O0C fünf Minuten lang denaturiert und wieder vergütet durch langsames Erwärmen auf 22°C. Dieses Gemisch wurde in ein Rohr gegeben, welches 4μΙ des dNTP-Gemischs von 0,8/xl RT-Puffer und 1 μ\ 32P- -dCTP (800Ci/mMol) enthielt. Drei Mikroliter dieses Gemisches wurden jeweils 1 μ,Ι der entsprechenden ddNTP zugesetzt. Die letzten 3/xl des Gemischs wurden 1 μ\ Wasser zugesetzt. Die Reaktionen wurden durchden Zusatz von 1 μ\ dil RT eingeleitet und bei 420C für die Dauer von 15 Minuten inkubiert. Die Reaktioen würden durch den Zusatz von 1μ.Ι dil RT eingeleitet und bei 420C für die Dauer von 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 3/xl Chase RT bei 42 0C für 15 Minuten gechast. Durch den Zusatz von 7,5μ.Ι Formamid-Färbe-Gemisch wurden die Reaktionen gestoppt, und 4-5μ\ wurden auf einem 0,4mm starken Gradientengel in IxTBE einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 10%iger Essigsäure mit 10% Methanol 20 Minuten lang fixiert. Das Gel wurde unter Vakuum getrocknet und für die Belichtung eines XAR-Röntgenfilms verwendet. Das Gradientengel wurde folgendermaßen hergestellt:-300/xl von 10%igem Ämmoniumpersulfat und 14/λΙ TEMED wurden 30 ml des oberen Gels zugesetzt; 75/xl von 10%igem Ammoniumpersulfat und 3,5/JTEMED wurden 7 ml des unteren Gels zugesetzt, 6ml des oberen Gels wurden in eine Pipette hochgezogen, anschließend wurden 6ml des unteren Gels in dieselbe Pipette gezogen. Das Gel wurde zwischen die Gelplatten gegossen, gefolgt von 22 ml des oberen Gels.
Beispiel X
mRNA-Hybridisationsselektion und in vitro-Translationen
Positive Hybridisations-Translationsexperimente wurden durch Linearisierung von 20/xg geklönter genomischer DNA von Pichia (hergestellt wie im Beispiel Vl) durch Abbau mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen durchgeführt. Diese DNA wurde denaturiert, wozu die Lösung 0,3M NaOH gemacht wurde, und bei 650C für 10 Minuten inkubiert. Die denaturierte, DNA-enthaltende Lösung wurde rasch auf Eis abgeschreckt und durch Abstimmung auf.0,5M Tris · HCI neutralisiert. Der denaturierten DNA wurde unmittelbar vor der Bindung der DNA an Nitrozellulosefilter ein gleiches Volumen von 2Ox SSPE zugesetzt. Vorder Aufbringung der DNA auf die Nitrozellulosefilter (Schleicherund Schuell BA 83, 9 mm Durchmesser) wurden die Filter durch Benetzung mit H2O, Sieden für 10 Minuten und dreifaches Spülen in 10x SSPE vorbereitet. Dann wurden 10/j.g der DNA an jeden Filter durch Aufbringung der DNA auf den Filter, Lufttrocknen und abschließendes Trocknen der Filter unter Vakuum bei 70°C für die Dauer von 2 Stunden gebunden.
Vorder Prähybridisation wurden die Filter mit der gebundenen DNA in 1 ml sterilen Wassers gegeben und eine Minute bei 1000C erhitzt, auf Eis gekühlt, durch Wirbeln in 1 ml sterilem Wasser gespült und mit 1 ml Prähybridisationspuffer gespült. Die Filter wurden in 1 ml Prähybridisationspuffer vorhybridisiert, dann wurden 40^g (2/*g/ml ETS) Poly-A+-mRNA direkt dem Prähybridisationspuffer zugesetzt. Das Hybridisationsgemisch wurde für 10 Minuten auf 650C erhitzt und dann bei 42°C für 24 Stunden inkubiert.
Nach der Hybridisation wurden die Filter zweimal kurz in 1 χ SSPE gewaschen, das 0,5% SDS bei 220C enthielt, siebenmal in 1 χ SSPE, das 0,5% SDS bei 500C enthielt, wobei jede Waschung 5 Minuten dauerte, dreimal in 0,1 χ SSPE bei 5O0C für jeweils 5 Minuten und einmal in 0,1 χ SSPE bei 650CfUr 10 Minuten. Die RNA wurde aus den Filtern durch einminütiges Sieden ίη300μΙ H2O, das 15yug Kaninchenleber-tRNA enthielt, eluiert. Die eluierte RNA wurde schnell in einem Trockeneis-Ethanol-Bad gefroren. Man ließ sich das RNA-Gemisch auf Zimmertemperatur erwärmen, und die Filter wurden entfernt. Dann wurde das RNA-' Gemisch durch Abstimmung des Mediums auf 2,5M Ammoniumazetat und zweimaliges Ausfällen mit Ethanol ausgefällt und schließlich in 100/xl H2O wiederzurSuspension gebracht, bevor es lyophilisiert wurde.
Translationen wurden nach den Standardmethoden durchgeführt, die Fachleuten bekannt sind, beispielsweise nach den Anweisungen, die in den in vitro-Kaninchenretikulozytlysattranslationskästen von New England Nuclear gegeben werden. Proteinprodukte wurden auf 8% Polyarkrylamidgelen, die 4,5% Stapelgel enthielten, einer Elektrophorese unterzogen.
Beispiel Xl
Antiserumpräparationen und Immünoausfällungen - ·
Antiseren, die in Kaninchen gegen einen Extrakt aus Pichia pastoris-Zellen, welche sowohl p72- (Alkoholoxydase) als auch p76-Polypeptide enthielten, gezogen wurden, wurden nach Standardverfahren hergestellt. Die Extrakte wurden vor der Injektion anhand von PBS dialysiert. Im Verlauf von 8 Wochen erhielt jedes Kaninchen 3 Injektionen, die jeweils aus 1 mg Gesamtprotein in einem Volumen von 0,1 ml mit 0,2ml Freunds-Komplettadjuvans bestanden. Die Injektionen wurden intradermal an 6 bis 10 Stellen im Kaninchen vorgenommen. Nach Ablauf der acht Wochen wurde den Kaninchen Blut abgenommen, und die Seren wurden anhand gereinigter Alkoholoxydase von Pichia pastoris nach dem Doppeldiffusionsverfahren nach Ouchterlony geprüft.
Gereinigte Kaninchen-Anti-p72- (Alkoholoxydase) und -anti^ö-Proteinantikörperwurden durch Affinitätschromatografie der gesamten Antiseren durch eine CNBr-gekoppelte p72-(Alkoholoxydase)-p76-Sepharose-4B-Kolonne (Pharmacia) gewonnen. Ein Gramm CNBr-aktiviertes Gelwurden durch Hydrieren des Gels für die Dauer von 15 Minuten in 200 ml von 1 mM HCI, gefolgt von dreimaliger Waschung in 50 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natriumkarbonat [pH-Wert 8] und 0,5 M NaCI), hergestellt. Fünf Milliliter einer Lösung von 6 mg/ml p72-p76 in Kopplungspuffer wurden dem Gel zugesetzund über Nacht vorsichtig bei 4°C gerührt. Ungebundenes Protein wurde durch dreimaliges Waschen in 50ml mit Kopplungspuffer entfernt. Die verbleibenden aktiven Gruppen wurden durch eine zweistündige Inkubation in 1 M Ethanolamin (pH-Wert 8) ausgeschaltet. Nichtkovalent gebundenes Material wurde aus dem Gel durch eine 50-ml-Waschung mit 2M Natriumthiozyanat in PBS entfernt. Vor der Chromatografie der Antiseren wurde das Gel abschließend mit 3 x 50 ml PBS gewaschen. Fünf Milliliter der geklärten Anti-p72-p76-Antiseren wurden mit dem Gel gemischt und unter schwachem Rühren für die Dauer von 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Gemisch aus Antiserum-Gel wurde dann mit der Pipette in eine 1 x 8cm-Kolonne gegeben und mit 150ml PBS gewaschen. Gereinigter Antikörper wurde aus der Kolonne mit 6ml 2M Natriumthiozynat in PBS eluiert. Nach dem Eluieren aus dem Gel wurde der gereinigte Antikörper extensiv anhand von PBS dialysiert, das 0,02% Natriumazid enthielt.
Die affinitätsgereinigten Antiseren wurden einem in vitro-Translationsgemisch in PBS, 1 % NP40 zugesetzt und über Nacht bei 4CC inkubiert. Der Antikörper-Antigen-Komplex wurde mit Pansorbin(Calbiochem) auf Eis für 2,5 Stunden ausgefällt. Pansorbin wurde durch Waschen in RIPA-Puffer vorbereitet. Die Pansorbin-Ausfällen wurden viermal in RIPA-Puffer gewaschen und in Laemmli-Belastungspuffer aufgelöst, bevor sie der Elektrophorese unterzogen werden.
Beispiel XII Transformationsverfahren für Pichia pastoris A. Zellenkultur
1. Eine Kolonie von Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) wird in etwa 10 ml YPD-Medium inokkuliert und die Kultur bei 3O0C für 12 bis 20 Stunden geschüttelt.
2. Nach etwa 12 bis 20 Stunden werden die Zellen auf OD6oo von etwa 0,01-0,1 verdünnt und in der log-Wachstumsphase im YPD-Medium bei 30°C für etwa 6 bis 8 Stunden gehalten.
3. Nach etwa 6 bis 8 Stunden werden 100ml des YPD-Mediums mit 0,5 ml der Saatkultur bei OD600VOn etwa 0,1 (oder einer gleichwertigen Menge) inokkuliert. Bei 3O0CfUr etwa 12 bis 20 Stunden schütteln.
4. Kultur ernten, wenn OD6oo etwa 0,2-0,3 beträgt (nach etwa 16 bis 20 Stunden) durch Zentrifugieren bei 1 500 g für 5 Minuten.
B. Präparation von Sphäroplasten
1. Zellen einmal in 10 ml sterilem Wasser waschen. (AlleZentrifugierungen für die Schritte 1 bis 5 werden für die Dauer von 5 Minuten bei 1500g ausgeführt.)
2. Zellen einmal in 10ml frisch bereiteter SED waschen.
3. Zellen zweimal in 10ml sterilem 1 M-Sorbitol waschen.
4. Zellen in 10 ml SCE-Puffer wieder zur Suspension bringen.
5. 5 bis 1ΟμΙ von 4mg/ml Zymolyse 60000 (Miles Laboratories) zusetzen. Zellen bei 3O0C für etwa 30 bis 60 Minuten inkubieren. Da die Herstellung der Sphäroplaste ein kritischer Schritt im Transformationsverfahren ist, sollte man die Sphäroplastbildung folgendermaßen überwachen: 100/xl-Aliquote von Zellen zu 900μΙ 5%iger SDS und 900/xl von 1 Μ Sorbitol vor und unmittelbar nach dem Zusatz von Zymolyase und zu verschiedenen Zeiten während der Inkubationsperiode zusetzen. Die Inkubation an dem Punkt stoppen, wo sich die Zellen in SDS, nicht aber in Sorbitol auflösen (in der Regel nach 30 bis 60 Minuten Inkubation).
6. Die Sphäroplaste zweimal in 10ml sterilem 1 M Sorbitol durch Zentrifugieren bei 1000g für 5 bis 10 Minuten waschen. (Zeit und Geschwindigkeit des Zentrifugierens können unterschiedlich sein; es muß ausreichend zentrifugiert werden, um die Sphäroplaste zu pelletieren, aber nicht so stark, daß sie durch die Kraft reißen.)
7. Zellen einmal in 10ml sterilem GaS waschen.
8. Zellen in insgesamt 0,6ml CaS wieder zur Suspension bringen.
C. Transformation
1. DNA-Proben (bis zu 20μΙ Volumen) zu sterilen Polypropylenrohren von 12 x 75 mm hinzufügen. (DNA sollte in Wasser oder TE-Puffer sein; um maximale Transformationshäufigkeiten mit kleinen DNA-Mengen zu erreichen, ist es ratsam, etwa 1 μΙ 5 mg/ml sonizierte E. coli-DNA jeder Probe zuzusetzen.
2. 100μΙ Sphäroplaste jeder DNA-Probe zusetzen und bei Zimmertemperatur über etwa 20 Minuten inkubieren.
3. 1ml PEG-Lösung jeder Probe zusetzen und bei Zimmertemperatur über etwa 15 Minuten inkubieren.
4. Proben bei 1 000g 5 bis 10 Minuten zentrifugieren und PEG-Lösung dekantieren.
5. Proben in 1<50μΙ SOS wieder zur Suspension bringen und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
6. 850μΙ steriles 1 M Sorbitol zusetzen und Aliquote der Proben wie unten beschrieben auf Platten bringen.
D. Regeneration der Sphäroplaste
1. Rezeptur für das Regenerations-Agar-Medium:
a. Agar-Sorbitol — 9g Bacto-Agar, 54,6g Sorbitol, 240ml H2O, Autoklavbehandlung. i
b. 10X Glukose — 20g Dextrose, 100ml H2O, Autöklavbehandlung.
c. KXSC — 6,75g Hefestickstoffbase ohneAminosäuren, 100ml H2O,Autoklavbehandlung. (Jede gewünschte Aminosäure oder Nukleinsäure bis zu einer Konzentration von 200μg/ml vor oder nach der Autoklavbehandlung zusetzen.)
d. 30ml 10X Glukose und 30ml 10X SCzu 240 ml geschmolzener Agar-Sorbitol-Lösung zusetzen. 0,6ml von 0,2mg/ml Biotin und jeder anderen gewünschten Aminosäure oder Nukleinsäure bis zu einer Konzentration von 20μg je ml zusetzen. Geschmolzenes Regenerations-Agar bei 55 bis 60°C halten.
2. Plattieren der Transformationsproben:
Eine Agar-Bodenschicht von 10 ml Regenerationsagar je Platte wenigstens 30 Minuten, bevor die Transformationsproben fertig sind, aufgießen. 10-ml-Aliquote von Regenerations-Agar auf Röhrchen in einem 45-50°C warmem Bad während der Zeit verteilen, zu der sich die Transformationsproben in SOS befinden. Den Röhrchen mit Regenerations-Agar Aliquote der oben beschriebenen Transformationsproben hinzufügen und auf die Bodenschicht von Agar auf die Platten gießen. Eine Menge jeder Probe zu den 10-ml-Aliquoten des geschmolzenen Regenerations-Agars, das bei 45-500C gehalten wird, zugeben und auf jede der Platten gießen, die eine feste Agar-Bodenschicht von 10 ml Regenerations-Agar aufweisen.
3. Bestimmung der Qualität der Sphäroplastpräparationen:
1OjLtI einer Probe abnehmen und um das Hundertfache durch den Zusatz von 990μΙ1 M Sorbitol verdünnen. 10μΙ der hundertfachen Verdünnung abnehmen und noch einmal um das Hundertfache durch den Zusatz eines zweiten 990/j.l-Aliquot von 1 M'Sorbitol verdünnen.Ί 00μΙ beider Verdünnungen auf YPD-Agar-Medium auf Platte streichen und die Konzentration der nicht aus Sphäroplasten bestehenden ganzen Zellen bestimmen, die noch im Präparat enthalten sind. 100μΙ jeder Verdünnung zu 10 ml Regenerations-Agar zugeben, das mit40/u.g/ml Histidin ergänzt wird, um die Gesamtmenge der regenerierbaren Sphäroplastezu bestimmen. Gute Werte fürein Transformationsexperimentsind 1-3 x 107generierbare Gesamtsphäroplaste/ml und etwa 1 χ 103 ganze Zeilen/ml.
4. Platten bei 3O0CfUr 3 bis 5 Tage inhibieren.
Beispiel XII!
Isolierung des HIS4-Gens von Pichia pastoris und der autonomen Replikationsfolgen
A. Stämme
Zu den eingesetzten Stämmen gehören:
(a) Pichia pastoris-Stamm NRRL Y-11430;
(b) Pichia pastoris GS115 (his4; NRRLY-15851);
(c) S. cerevisiae-Stamm 5799-4D (his4-260 his4-39; NRLL Y-15859) und
(d) E. coli-Stamm 848 (F" met thi gal T1" 080s hscR" hscM+).
B. Plasmide
pYA2 (sielie Abb. 23; besteht aus dem HIS4-Gen von S. cerevisiae auf einem 9,3kbp-Pstl-Fragment, eingefügt an der Pstl-Stelle von pBR325) war die Quelle der HIS4-Genfragmen von S. cerevisiae und wurde in einem E. coli-Wirt deponiert und ist als NRRL B-15874 verfügbar
YEp13 ist von der American Type Culture Collection verfügbar und erhielt die Zugriff-Nr. ATCC 37115.
C. Medien
Pichia pastoris wurde auf YPD- (reich) oder IMG- (Minimal-) Medium gezogen. IMG, ein Minimalmedium, hat folgende Zusammensetzung:
1. IM1-SaI1Je in einer Endkönzentration von 36,7 mM KH2PO4, 22,7 mM (NH4J2SO4,2,0 mM MgSO4 7 H2O, 6,7 mM KCI, 0,7mM CaCI2 · 2H2O, hergestellt als eine 10x Vorratslösung und im Autoklaven behandelt;
2. Spurensalzen in einer Endkonzentration von 0,2μΜ CuSO4 · 5H20,1,25μΜ Kl, 4,5μΜ MnSO4 · H2O, 2,0μΜ NaMoO4- 2H2O, 0,75μΜ H3BO3,17,5μΜ ZnSO4 · 7H20,44,5μ.Μ FeCI3 · 6H2O, hergestellt als eine 40Ox Vorratslösung und filtersterilisiert,·
3. 0,4/u,g/ml Biotin und
4. 2% Dextrose.
E. coli wurde entweder in LB-Medium oder in 2B-Medium (0,2% NH4PO4,1,2% Na2HPO4,0,013% MgSO4 · 7H20,0,074% CaCI2. 2H20,1/u.g/mlThiamin und 0,4% Dextrose), ergänzt mit 100/xg je ml Tryptophan und 0,2% Cadaminosäuren, gezogen.
D. DNA-Isolierung
1. Große Präparation von Hefe-DNA
DNA-Präparationen von Pichia pastoris und S. cerevisiae wurden ausgeführt durch Züchten von Hefezellen in 100ml Minimalmedium, bis A6oo gleich 1 bis 2, anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 2000g für 5 Minuten geerntet. Die Zellen wurden einmal in H2O, einmal in SED und einmal in 1M Sorbitol gewaschen und dann in 5ml 0,1 M Tris-HCI (pH-Wert 7,0) zur Suspension gebracht, was 1 M in Sorbitol entspricht. Die Zellen wurden mit 50 bis 100μΙ einer Lösung von4mg/ml Zymolase 60000 (Miles Laboratories) gemischt und bei 300C für eine Stunde inkubiert, um die Zellwände abzubauen. Das Sphäroplastpräparat wurde dann bei 1000g für 5 bis 10 Minuten zentrifugiert und in Lysis-Puffer (0,1 % SDS, 1OmM Tris-HCI (pH-Wert 7,4), 5mM EDTA und 5OmM NaCI) zur Suspension gebracht. Zu jeweils 100/j.g/ml wurde Proteinase K (Boehringer Mannheim) und RNase A (Sigma) gegeben und die Mischungen bei 370C für 30 Minuten inkubiert. DNA wurde durch vorsichtiges Mischen des Präparats mit einem gleichen Volumen von chloroformhaltigen Isoamylalkohol (24:1, V/V) deproteinisiert, und die Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 12000g für 20 Minuten getrennt. Die obere (wäßrige) Phase wurde in ein frisches Röhrchen abgegossen und mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die Phasen wurden wie oben getrennt und die obere Phase in ein Röhrchen gegeben, das 2 bis 3 Volumen kaltes, 100%iges Ethanol enthielt. Die Probe wurde vorsichtig gemischt, und die DNA wurde durch Spulen auf einen Plastestab aufgenommen. Die DNA wurde sofort in 1 ml TE-Puffer aufgelöst und über Nacht bei 4°C anhand von 100 Volumen TE-Puffer dialysiert.
2. Kleine Präparationen von Hefe-DNA
Fünf Milliliter von Hefekulturen wurden im Minimalmedium bis zu A6oo gleich 1-5 gezogen und durch Zentrifugieren bei 2000g für die Dauer von 5 Minuten geerntet. Die Zellen wurden in TmI SED zur Suspension gebracht und in ein 1,5ml-Mikrofliehröhrchen gegeben, einmal in 1 M Sorbitol gewaschen und in 0,5 ml 0,1 M Tris-HCL (pH-Wert 7,4) wieder zur Suspension gebracht, was 1 M Sorbitol entspricht. Es wurde Zymolase 60000 (10μΙ einer Lösung von 4 μg/ml) zugesetzt, und die Zellen wurden für 30 bis 60 Minuten bei 3O0C inkubiert. Dann wurden die Zellen eine Minute lang zentrifugiert, in Lysis-Puffer zur Suspension gebracht und bei 65-7O0C inkubiert. Nach 15Minutenwurden die Proben mit 100μΙ von 5 M Kaliumazetat gemischt, 15 Minuten im Eisbad gehalten und dann 5 Minuten zentrifugiert. Die obenaufschwim'menden Schichten wurden in ein frisches Mikrofliehröhrchen dekantiert, das 1 ml 100%iges Ethanol enthielt, gemischt und für die Dauer von 10s zentrifugiert. Abschließend wurden die DNA-Pellets 10 bis 15 Minuten luftgetrocknet und in 50μΙ TE-Puffer aufgelöst.
3. E. coli-DNA-lsolierungen im großen Umfang
E. Coli-Kulturen für große Plasmidpräparationen (0,5 bis 11) wurden bei 370C unter Schütteln in einem 2B-Medium gezogen, das wie oben ergänzt war und das entsprechende Antibiotikum aufwies. Zellen, die pBR322-abgeleitete Plasmide enthielten, wurden zu Kulturen von A550 von etwa 0,7 gezogen, zu welchem Zeitpunkt eine ausreichende Menge Chloramphenikol zugesetzt wurde, um eine Konzentration von 100μg je ml zu ergeben, und die Zellen wurden etwa 15 Stunden später geerntet. Stämme, die pBR325-abgeleitete Plasmide enthielten, wurden in das ergänzte 2B-Medium bei einem A550-Ausgangswert von etwa 0,01-0,05 inokkuliert und unter Schütteln bei 37°Cfür 20 bis 24 Stunden inkubiert, bevor geerntet wurde.
4. Kleine E. coli-DNA-Präparationen
Für schnelle Plasmidisolierungen im geringen Umfang wurden 2 ml Kulturen im ergänzten 2B-Medium mit Antibiotikum über Nacht bei 370C unter Schütteln gezogen und durch Zentrifugieren in 1,5-ml-Mikrofliehröhrchen geerntet. Plasmide von allen Präparationen wurden nach der alkalinen Lysis-Methode isoliert, die von Bimboim und DoIy (1979) beschrieben wurde.
E. Restriktions-DNA-und Fragmentisolierung
Restriktionsenzyme wurden von den New England Biolabs und den Bethseda Research Laboratories bezogen, und der Abbau wurde nach Routinetechniken ausgeführt. Restriktionskarten wurden durch den Vergleich paralleler Abbauvorgänge von Plasmiden mit und ohne eingefügte DNA erstellt. Restriktionsfragmente wurden durch Elektroeluierung aus Agarosegels in Streifen von Whatman 3-MM-Papier gereinigt, ergänzt durch Dialyserohre. Die Fragmente wurden aus dem Papier und den Röhrchen durch drei- bis viermaliges Waschen mit 0,1- bisO,2ml-Volumen einer Lösung gewonnen, welche 0,1 M NaCI, 5OmM Tris-HCI (pH-Wert 8,0) und 1 mM EDTA enthielt. Abschließend wurden die Fragmente mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und wieder in einem kleinen Volumen von TE-Puffer aufgelöst.
F. Aufbau des P. pastoris-Archivs in E. coli
Für den Aufbau des DNA-YEpI3-Archivs von Pichia pastoris wurden 100^g YEp13 mit BamHI vollständig abgebaut und mit alkaliner Kalbsinterestinalphosphatase behandelt, um das Terminal-5'-Phosphat von der DNA zu entfernen. Ein Aliquot zu ΙΟΟμ-g des Wildtyps von Pichia pastoris DNA von Pichia pastoris (NRRL Y-11430) wurde teilweise mit 10 Einheiten von Sau3A I durch Inkubation bei 37°Cfür die Dauer von 5 Minuten in einem Gesamtvolumen von 1 ml abgebaut Für Fragmente von 5 bis 10kbp wurde eine Größenselektion durch Zentrifugieren durch 5-20% Sukrosegradienten vorgenommen. Ein Mikrogramm des Vektors und 2/xg von Sau3A I-Fragmenten von Pichia pastoris wurden mit 20 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Bethseda Research Laboratories) in einem Gesamtvolumen von 200μΙ gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die verbundenen DNA wurden in E. coli durch den Zusatz des gesamten Ligationsreaktionsgemischs zu 2 ml von kompetenten Zellen von E. coli 848 transformiert und durch Inkubation bei O0C für die Dauer von 15 Minuten. Das Gemisch wurde für 5 Minuten auf 370C erwärmt, worauf 40 ml LB-Medium zugesetzt und die Inkubation bei 37°C eine weitere Stunde fortgesetzt wurden. Dann wurde Ampicillin zugesetzt, um eine Konzentration von insgesamt 100^g/ml zu erhalten, worauf die Inkubation eine weitere Stunde weitergeführt wurde. Abschließend wurden die Zellen bei 3000g für 10 Minuten zentrifugiert, in 1 ml frischem LB-Medium wieder zur Suspension gebracht und in gleichen Aliquoten auf 10 LB-Agar-Platten aufgebracht, welche 10O/xg/ml Ampicillin enthielten. Die etwa 50000 Kolonien, die entstanden, wurden von den Platten abgekratzt, und ein Teil der Zellen wurde in 500 ml des ergänzten 2B-Mediums bei einem Ausgangswert von A55ovon etwa 0,1 inokkuliert. Die Kultur wurde gezogen, und das Plasmid wie oben beschrieben extrahiert. Von den Kolonien, die für das Archiv zusammengefaßt wurden, waren 96 und 100 tetrazyklinsensitiv, und 7 von 10 untersuchten enthielten Plasmide mit eingefügter DNA.
Für die Schaffung des DNA-pYJSiCIa-Archivs von Pichia pastoris wurden 50/Ag pYJ8,iCla vollständig mit CIaI abgebaut und mit alkaliner Kalbsintenstinalphosphatase behandelt, um dasTreminai-5'-Phosphataus der DNA zu entfernen. Ein 100/xg-Aliquot der DNA von Pichia pastoris NRRL Y-15851 wurde teilweise mit 20 Einheiten von Taql durch Inkubation bei 65°Cin einem Gesamtvolumen von 1 ml für die Dauer von 5 Minuten abgebaut. Fragmente von 5 bis 10kbp wurden größenselektiert durch Elektroeluierung aus einem 0,5%igen Agarosegel (siehe Beispiel II, Abschnitt E). Ein Mikrogramm des Vektors und 2/ig von Taql-Fragmenten von Pichia pastoris wurden mit 20 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Bethseda Research Laboratories) in einem Gesamtvolumen von 200 μ.Ι gemischt und über Nacht bei 40C inkubiert. Die verbundenen DNA wurden in E. coli durch den Zusatz des vollständigen Ligationsreaktionsgemischs zu 2 ml kompententer Zellen von E. coli 848 und Inkubation bei O0CfUr die Dauer von 15 Minuten transformiert. Das Gemisch wurde für 5 Minuten auf 370C erwärmt, danach wurden 40ml LB-Medium zugesetzt und die Inkubation bei 37°C über eine Stunde weitergeführt. Es wurde Ampicillin zu einer Gesamtkonzentration von 100/u.g/mi zugesetzt und die Inkubation eine weitere Stunde fortgesetzt. Schließlich wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 3000g zentrifugiert, in 1 ml frischem LB-Medium wieder zur Suspension gebracht und in gleichen Aliquoten auf 10 LB-Agar-Platten ' gebracht, welche 100/n,g/ml Ampicillin enthielten. Die etwa 10000 Kolonien, die entstanden, wurden von den Platten abgekratzt, und einTeil der Zellen wurde in 500ml des ergänzten 2B-Mediums bei einem Ausgangswert von Α550νοη etwa 0,1 inokkuliert. Die Kultur wurde gezogen und das Plasmid extrahiert, wie das oben beschrieben worden ist.
G. Southern-Hybridisationen
Für die Übertragung von großen oder überspulten DNA-Molekülen auf Nitrozellulose wurde die DNA zuerst teilweise hydrolysiert durch Tränken von Agarosegels in 0,25M HCI für die Dauer von 10 Minuten vorder Alkalidenatu ration. Die Hybridisierung von markierten Fragmenten von HIS4-Gen von S. cerevisiae auf DNA von Pichia pastoris erfolgte bei Vorhandensein von 50% Formamid, 6x SSC, 5x Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA und 100^g/ml denaturierter Heringssperma-DNA bei 420C. Die Waschungen nach der Hybridisation wurden in 1x SSC, 1 mM EDTA, 0,1% SDS und 1,0% Natriumpyrophosphat bei 65°C ausgeführt. DNA wurde 32P-markiert, wie das im Beispiel IV beschrieben wurde. H. DNA-Folge
Die DNA-Folge wurde nach der Dideoxynukleotidkettenterminationsmethode von Sanger u.a. (1980) ausgeführt. I. Hefetransformationen
5. cerevisiae-Transformationen wurden nach der Sphäroplastgenerationsmethode von Hinnen u.a. (1978) ausgeführt. Pichia pastoris-Transformationen wurden nach dem oben beschrieber -"i Verfahren ausgeführt.
J. Analyse der Pichia pastoris-Transformanten
Die Fähigkeit des einzelnen Plasmids, als autonomes Element in Zellen von Pichia pastoris erhalten zu bleiben, wurde folgendermaßen bestimmt: Eine Transformant-Kolonie wurde von einer Regenerations-Agar-Platte genommen und auf eine SD-Medium-Agar-Platte gestrichen und mit flüssigem IMG-Medium inokkuliert. Die SD-Platte wurde bei 3O0C 3 Tage inkubiert, danach wurde von dieser Platte eine einzelne Kolonie entnommen, auf eine zweite SD-Platte gestrichen und in eine zweite Flasche von IMG-Medium inokkuliert. Dieses Verfahren wurde ein drittes Mal wiederholt. Die 3 IMG-Kulturen wurden bei 3O0C unter Schütteln auf einen A6oo-Wert von etwa 1-2 gezogen und dann durch Zentrifugieren geerntet. DNA von den Hefekulturen wurde wie oben extrahiert, bei 30 V und 3OmAfUr 10-15 Stunden einer Elektrophoresebehandlung in 0,8%igen Agarosegels unterzogen, auf Nitrozellulose transferiert und auf 32P-markierte pBR322 oder pBR325 hybridisiert, wie das oben beschrieben wurde. Als Kontrollproben wurden parallel mit den experimentellen Proben eine Probe, die 10ng des aus E. coli isolierten Plasmids enthielt, und eine Probe, welche 1-2Mg nichttransformierter DNA von Pichia pastoris GS115 enthielt, der Elektrophoresebehandlung unterzogen.
K. Isolierung der DNA-Folgen von Pichia
DNA-Fragmente, welche das Gen HSI4 von Pichia enthielten, wurden aus einem Pichia-DNA-Archiv anhand ihrer Fähigkeit isoliert, S. cerevisiae his4-Stämme zu komplementieren. Das Archiv war aus teilweise abgebauten Sau3AI-Fragmenten zu 5-20 kb des Wildtyps von Pichia-DNA, eingefügt in die BamHI-Stelle des Shuttle-Vektors YEpI 3 von S. cerevisiae-E. coli, aufgebaut. Sphäroplaste von S. cerevisiae NRRL Y-15859(5799-40, ein his4ABC~-Stamm) wurden nach der Methode von Hinnen u.a. (1978) erzeugt, mit dem Pichia-DNA-Archiv gemischt und konnten sich anschließend in einem Medium mit Histidinmangel regenerieren. Die Transformation ergab etwa 1 χ 103propotrophe Hefekolonien aus einer Population von 5 χ 107 vollständig regenerierbaren Sphäroplasten. Die Hefegesamt-DNA wurde aus 20 der His+-Kolonien extrahiert und in E. coli transformiert. Siebzehn der Hefe-DNA-Präparationen erzeugten ampicillinresistente Kolonien und jede enthielt Plasmid, das aus YEp13 und der Einsatz-DNA bestand. Um zu bestätigen, daß die His+-transformationsplasmide das Gen HIS4von Pichia enthielten und nicht ein DNA-Fragment mit Unterdrückeraktivität, wurden Restriktionsdigeste der Plasmide auf ein markiertes DNA-Fragment hybridisiert, welches einen großen Teil des Gens HIS4 von S. cerevisiae enthielt, und bei geringer Schärfe ausgewaschen. Jedes der Plasmide, welche die his4S. Cerevisiae-Stämme komplementierte, enthielt Folgen, die auf das Gen HIS4von S. cerevisiae hybridisiert wurdeni
Um nach DNA-Fragmenten zu suchen, welche eine Pichia-ARS-Aktivität aufweisen, wurde DNA von Pichia pastoris GS115 (NNRL Y-15851) teilweise mit TaqI abgebaut, und 5 bis 10kbp-Fragmente wurden isoliert und in die einzigartige Clal-Stelle von pYJ8ACla geklont. (Siehe Abb. 26.) Plasmid-DNA wurde aus etwa 10000 His+-Kolonien von Pichia gewonnen und zur Transformation von E. coli verwendet. Plasm ide von etwa 10000 ampicillin resistenten Kolonien wurden isoliert und dann zurück auf GS115 transformiert. Vierzig der His+-Hefekolonien von dieser Unterarchivtransformation wurden gesondert auf ein selektives Medium gestrichen und in gesonderten Kulturen im selektiven Medium gezogen. Die gesamte Hefe-DNA aus jeder dieser 40 Kulturen wurde extrahiert und in E. coli transformiert. Zwei Plasmide, pYA63 (PARS1) und pYA90 (PARS2), deren Hefe-DNA-Präparationen die meisten ampicillinresistenten E.coli-Kolonien produzierten, wurden weiter für die Analyse ausgewählt. Diese beiden Plasmide transformierten Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) mit einer sehr hohen Frequenz, und jedes enthielt eine Einfügung von Fremd-DNA.
Beispiel XIV Konstruktion von Verschmelzungen (Fusionen) regulatorischer Bereich-lacZ-Gen
A. Konstruktionen regulatorischer Bereich p72 (Alkoholoxydase)
Plasmid pPG 4,0, ein pBR322-Vektor, welcher das genomische DNA-Fragment EcoRI-Pvull zu 4 Kilobasepaar von Pichia pastoris enthält, wurde mit Bstl geschnitten, an denen die Teilung erfolgte, dann mit BamHI geschnitten, um ein 1,12 kbp-DNA-Fragment zu ergeben, welches den regulatorischen Bereich der Alkoholoxydase und die Kodierungsinformationen für die ersten 15 Aminosäuren von Alkoholoxydase enthält. Dieses DNA-Fragment zu 1,12kbp hat folgende Nukleotidfolge:
1,12 kbp Bj
"S.-Nukelase" CTA GGT GGT G
bellandelxes Ende GAT CCA CCa CCT AC- 4,
Alkoholoxydas IeU11 gly12glyi3
Dieses 1,12kbp wurde in das EcoRI/Smal/BamHI-Verbindungsglied (geteilt mit BamHI und Smal) des Shuttle-Vektors pSEY101 von E. coli-S. cerevisiae gebunden, Douglas u.a., 1984
Vektor pSEY101 enthält das lacZ-Gen von E. coli und ein PolyVerbindungsglied mit folgender Nukleotidfolge
R1 Sm B
....älATTCCCÜGGG.
GGATCCC GTC . GTl
CTTAAGGGßCCCTAGGG CAG CAA.... 'Is 'ν -κ
R. Sm B v'alg VaI10..fi-Galaktosidase
um das Plasmidhybrid pTA011 zu ergeben (siehe Abb.29).
Da die Fusion regulatorischer Bereich-lacZ von pTA011 hinsichtlich der Produktion von /3-Galaktosidas in der Phase verschoben ist, wie das in Folge E gezeigt wird:
Folge E
R1 B
1 1,12kbp I
....GAATTCCC CTA GGT GGT GGA TCC CGT CGT T
...CTTAAGGG GAT CCA CCA CCT AGG GCA GCA A
T T
R1 B
IeU11 gly12 gly13 gly14 ser15 arg arg
Vektor pTAO11 wird an der einzigartigen BamHI-Stelle geteilt und das folgende SmAI-Verbindungsglied (Smal-Linker) eingefügt:
GATCAGC C^G GT.
TGGGCCCACTAG
:t~
Sm
wodurch der Hybridvektor pTA012 entsteht, der die folgende Nukleotidfolge für die Fusion regulatorischer Bereich lacZ hat:
Folge F
R1 Sm
1 1,12kbp I
....GAATTCCC CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG TGA TCC CGT CGT
...CTTAAGGG GAT CCA CCA CCT AGT GGG CCC ACT AGG GCA GCA
T T
R1 . Sm
IeU11 gly12 gly13 glyu ser15 pro stop ser arg arg
und damit ist die Fusion von regulatorischer Bereich-lacZ von pTA012 noch immer im Verhältnis zum Leserahmen von LacZin der Phase verschoben. Um die N-Terminalkodierungsinformation für das strukturelle Alkoholoxydasegen in einen offenen Leserahmen mit der strukturellen lacZ-Genzu bringen, wurde pTA012 mit EcoRI-Smal behandelt und das resultierende DNA-Fragment in pSEY101 gebunden, das ebenso mit EcoRI undSmal behandelt worden war, so daß der Hybridvektor pTA013 entstand. (Siehe Abb.30 und die untenstehende Nukleotidfolge:)
Folge G
R, Sm B
I 1,12kbp I 4
....GAATTCCC CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG GAT CCC GTC GTT
...CTTAAGGG GAT CCC CCC CCT AGT GGG CCC CTA GGG CAG CAA
T t T
R1 Sm B
IeU11 gly12 gly13 glyu ser15 pro gly asp pro val9 vaho---/3-gal
Der Vektor pTA013 wurde dann zur Transformation von S. cerevisiae für weitere Untersuchungen verwendet, die unten im Beispiel XV beschrieben werden.
Vektor pTA013 wurde dann mit Pstl oder Pstl-Nrul geteilt und die Fusion von regulatorischer Bereich-lacZ, die im geteilten Fragment enthalten war, mit dem das HIS4-Gen enthaltenden Fragment der Shuttle-Vektoren pTAFHI (siehe Abb. 28), pYJ30 (siehe Abb.27) oderpYA2 (siehe Abb.23) gebunden, um die Plasmide pSAOHI, pSAOH5 bzw. pSAOHIOzu ergeben.
pTA013plus Resultierendes Plasmid
pTAFH1 pSAOHI
pYJ30 pSAOH5
pYA2 pSASOHIO
B. Konstruktionen regulatorischer Bereich p76
Fusionen regulatorischer Bereich-lacZ-Gen wurden mit dem regulatorischen Bereich p76 folgendermaßen hergestellt.
1. Verwendung des vollständigen Abschnittes 5'von pPG 6,0
Das EcoRI-Fragmentzu 1,35kb-Paar von pPG6,0 wurde in die einzigartige ECoRI-Stelle von pSEY101 geklont, einen Shuttle-Vektorvon E. coli-S. cerevisiae, wodurch sich Plasmid pT76U1 ergab (Abb. 30 a). Vektor pT76U1 wurde dann mit Pstl-Nrul geteilt und das größere DNA-Fragment mit dem das HIS4-Gen enthaltenden Fragment des Shuttle-Vektors pTAFHI verbunden (Abb.28), wie das oben beschrieben wurde, und ergab pT76H3, oder mit dem EcoRi-endgefüllten Psfl-ECoRI-Fragmentvon Shuttle-Vektor pBPfl (siehe Abb.34) und ergab pT7c5H4.
2. Verwendung eines Bal31-Abbaus von 5'-pPG6,0
Ein EcoRI-Fragmentzu 1,35kb-Paar von pPG6,0 wurde in die einzigartige EcoRI-Stelle von pSEY8 geklont, einen Shuttle-Vektor von E. coli-S. cerevisiae, der auch eine einzigartige Sall-Stelle angrenzend an die EcoRI-Stelle hat, in welche die Pichia-DNA eingefügt wird, wodurch das Plasmid pTA01 entsteht (siehe Abb. 31). Das Plasmid pTA01 wurde mit Sail geteilt und mit Bal31-Exonuklease behandelt, um stumpfendige Fragmente vom regulatorischen Bereich von Polypeptid p76 von unterschiedlicher Länge zu produzieren. Die stumpfendigen Fragmente wurden durch Teilung mit EcoRI vom Rest des Plasmids pSEY8 befreit. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden in dasEcoRI-Smal-Verbindungsglied von pSEY101 geklont und ergaben u.a. Plasmid pTAF.85 (siehe Abb. 32). Plasmid pTAF.85 ist analog zu pTA011,dasin der Abb. 29 gezeigt wird, wobei anstelle des regulatorischen Bereichs von p72 (Alkoholoxydase) der regulatorische Bereich p76 vorhanden ist.
Vektor pTAF.85 wurde dann auf gleiche Weise wie Vektor pTA013 behandelt und ergab die Plasmide pTAFH.85, pT76H1 und pT76H2. Es wurden daher folgende Vektoren geteilt und gebunden:
pTAF.85plus Resultierendes Plasmid
pTAFHI ' PTAFH.85
pYJ30 pT76H1
pYA2 pT76H2
Beispiel XV
Regulierung der/3-Galaktosidaseproduktion in Pichia pastoris
Es wurde die Produktion von ß-Galaktosidase durch verschiedene Transformanten von Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851), die auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen und unter unterschiedlichen Bedingungen gezogen worden waren, untersucht. Die transformierten Stämme wurden in Minimalmedium gezogen, das 0,5/ig/ml Biotin und 0,1 % Glukose bei 300C enthielt, bis sie die stationäre Phase erreichten. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren gewonnen und auf Minimalmedium übertragen, das 0,5/ig/ml Biotin und 0,5% Methanol enthielt, und bei 3O0C über 3 bis 5 Generationen gezogen. Nach diesem ersten Wachstum auf Methanol wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen und in ein frisches Minimalmedium übertragen, welches 0,5yu.g/ml .Biotin und entweder 0,1 % Glukose oder 0,3% Methanol als Kohlenstoffquelle enthielt. Die Zellen wurden dann bei 3O0C über etwa 80 Stunden inkubiert, wobei regelmäßig Proben entnommen wurden, um die Werte von Alkoholoxydase und /3-Galaktosidase zu bestimmen. Nach etwa 20 bis 50 Stunden war die Kohlenstoffquelle erschöpft und die Zellen wurden unter diesen Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation gehalten. Die Ergebnisse wurden in derTabelle I zusammengefaßt.
Tabelle I
Maximalwerte (Inkubationszeit, h) von /3-Galaktosidase und Alkoholoxydase (Einheiten/OD60o) in Transformanten von Pichia pastoris NRRL Y-15851
/3-Galaktosidasea Glukosestarvation 0,3%Menol Alkoholoxydasea Glukosestarvation 0,3% Methanol
Plasmid 1% Glukose 660(20) 567(20) 886(20) 1361(0) 1168(0) 1559(0) 1 Glukose 35 60 167 530 550 425
pSAOm pSAOH5 pSAomo 0 0,1-0,2 0 0 o · 0
pTAFH.85 0 0,17(80) 0,5 781 0 nd nd
pT76H1 0 3,20(80) 0 3100 0 nd nd
pT76H2 0 nd nd 0 nd nd
pT76H3 0 20 0 nd nd
pT76H4 0,3-0,6 40(80) 0 nd nd
a Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen, und es wurden Analysen der /3-Galaktosidase- und Alkoholoxydase durchgeführt, wie das im Text beschrieben wird.
Alkoholoxydase wurde nach der Farbstoff-Peroxydase-Methode, die oben beschrieben wurde(siehe Beispiel VII) bestimmt, /3-Galaktosidase nach dem folgenden Verfahren:
/3-Galakosidaseanalyse:
A. Erforderliche Lösungen:
Z-Puffer Endkonzentration
Na2HPO4-7 H2O 16,1g 0,06 M
NaH2PO4 5,5 g 0,04 M
KCI 0,75 g 0,01 M
MgSO4 · 7 H2O 0,246 g 0,001 M
2-Merkaptoethanol 2,7 ml 0,05 Μ aus 11 auffüllen, pH-Wert sollte 7 betragen.
O-Nitrophenyl-^-D-Galaktosid (ONPG):
400mg ONPG (Sigma N-1127) in 100ml destilliertem Wasser auflösen, um 4mg/ml ONPG-Lösung herzustellen.
B. Analyseverfahren
1. Ein Alliquot aus dem Kulturmedium entnehmen (0,1-0,5OD60O der Hefezellen), zentrifugieren und Zellenpellet mit Wasser waschen.
2. "71Jm Zellenpellet 1 ml Z-Puffer, 30μΙ CHCI3 und 30μΙ 0,1%ige SDS, wirbeln, 5 Minuten bei 300C inkubieren.
3. Reaktion durch den Zusatz von 0,2 ml ONPG (4 mg/ml) einleiten, wirbeln.
4. Reaktion durch den Zusatz von 0,5 ml einer 1 M-Na2CO3-Lösung zu entsprechenden Zeitpunkten stoppen (A420 < 1).
5. Absorptionsgrad der obenaufschwimmenden Schicht bei 420 nm ablesen;
C. Berechnung der/3-Galaktosidaseaktivitätseinheiten:
1 U = 1 nMol Orthonitrophenol (ONP), das je Minute bei 30°C und einem pH-Wert von 7 gebildet wird. 1 nMol ONP hat einen Absorptionsgrad bei 420 nm (A420) von 0,0045 bei einer Bahnlänge von 1 cm; folglich stellt ein Absorptionsgrad von 1 bei 420nm 222nMol OPN/ml oder378nMol/1,7ml dar, da das Gesamtvolumen der obenaufschwimmenden Schicht, das analysiert wird, 1,7 ml beträgt. Folglich werden die in den Tabellen angegebenen Einheiten berechnet nach der Formel:
U = χ 378 t(min)
Aus den in der Tabelle I gegebenen Ergebnissen geht hervor, daß ein Protein, das für Hefe fremd ist, d.h., /3-Galaktosidase, in Pichia pastoris produziert werden, reguliert entweder durch das Vorhandensein von Methanol im Nährmedium oder durch Kohlenstoffquellenstarvation nach dem Wachstum auf einem katabolitunterdrückenden Kohlenstoff.
Beispiel XVI
Regulierung der Produktion von /3-Galaktosidase in S. cerevisiae ·
Saccharomyces cerevisiaeSEY2102, ein Stamm, der zum Überleben Uracil, Lazin und Histidinergänzung braucht, wurde mit den Plasmiden pTAO13 und pT76U1 transformiert. Die transformatierten Organismen konnten leicht durch Selektion nach den ' Kolonien isoliert werden, welche keine Uracilsupplementation für das Wachstum brauchten. Die isolierten Tranformanten erhielten die Laborbezeichnung SEY2102-pTA013 bzw. SEY2102-pT76U1. SEY2102-pTA013 wurde beim Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, deponiert, um den freien Zugriff zu gewährleisten. Deponierungsdatum war der 31. August 1984. Dieser Stamm erhielt die Zugriff-Nr. NRRLY-15858.
Zellen von NRRLY-15858 und SEY2102-pT76U1 wurden bei 3O0C über etwa 3 bis 4 Generatoren in Minimalmedium inkubiert, welches 20/ig/ml Histidin und Leuzin und 5% Glukose enthielt. Die Zellen wurden dann verlagert, d.h., durch Zentrifugieren gewonnen und in ein YP-Medium mit 3% der Kohlenstoffquelle, welche in der Tabelle Il angegeben ist, übertragen und über 5 Generationen bei 3O0C gezogen. Die Zellen wurden dann über weitere 50 Stunden unter Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation inkubiert, und in regelmäßigen Abständen wurden Proben auf /3-Galakosidase untersucht. Die Ergebnisse wurden in der Tabelle Il zusammengefaßt.
Tabelle!!
Produktion von /3-Galaktosidase durch S. cerevisiae-ß-Galaktosidase, Einheiten/OD60o
A. Regulatorischer Bereich von Alkoholoxydase (pTAO13) Kohlenstoff- Nach 5
quelle (3%) Generationen
Starvationsbedingungen
6h 20 h 50r
105 66 nd
30 31 28
137 115 77
806 656 788
960 651 766
Starvationsbedingungen
Glukose Fruktose Ethanol Glyzerol Galaktose
0,2 0,3 23
640
982
B. Regulatorischer Bereich ρ 76 (pT76U1) Kohlenstoff- Nach 5
quelle (5%) Generationen
Glukose Glyzerol
2,3
470
815 nd
Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß ein hefefremdes Protein, d. h., /3-Galaktosidase, von Saccahromyces cerevisiae produziert werden, reguliert durch die regulatorischen Bereiche p72 (Alkoholoxydase) und p76 unter den Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation, wenn für das Wachstum eine katabolitunterdrückende Kohlenstoffquelle eingesetzt wird, oder durch das Wachstum der transformierten Zellen von S. cerevisiae auf einer relativ nicht-katabolitunterdrückenden Kohlenstoffquelle wie Glyzerol oder Galaktose.
Die Expressionswerte für /3-Galaktosidase in S. cerevisiae unter der Steuerung durch die regulatorischen Bereiche dieser Erfindung können verglichen werden mit den Expressionswerten, die bei anderen durch S. cerevisiae regulierten Promotern möglich sind.
Promoter
Kohlenstoffquelle
/3-Galaktosidase, Einheiten/OD60o
Zytochrom-C-lacZ-
Fusion (CYC1) Raffinose(3%)
Galaktose-Permease-Iac-Z-Fusion
(GAL 2) Galaktose (2%)
Invertase-lacZ-Fusion (SUC 2) Glukose.(0,1 %)
460
450 160
Man kann feststellen, daß der regulatorische Bereich der Erfindung überraschenderweise mindestens ebenso, wenn nicht effektiver als Promoter ist, die S. cerevisiae innewohnen.
Beispiel XVII Southern-Hybridisationen mit genomischer Hefe-DNA
Neun verschiedene methanolassimilierende Hefen und eine methanolnichtassimilierende Hefe wurden auf Minimalmedium (IM 1, Siehe Beispiel I) plus 0,75% Methanol oder 1,0% Glukose gezogen. Die gesamte chromosomaletJNA wurde wie im Beispiel Vl isoliert, d. h., die gesamten Nukleinsäuren wurden isoliert, mit RNase A
behandelt, zuerst mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und dann mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und abschließend mit Ethanol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde in einem Minimalvolumen von TE-Puffer wieder zur Suspension gebracht und zentrifugiert, um die DNA-Lösung zu klären.
Southern-Hybridisationsfilter wurden wie im Beispiel Vl hergestellt, d.h., 10μg der Gesamt-DNAvon den verschiedenen Hefespezies wurde mit einem Überschuß an Hindlll abgebaut, einer Elektrophoresebehandlung unterzogen, die DNA denaturiert, das Gel neutralisiert und die DNA auf Nitrozellulosefilter übertragen. Zu den Prähybridisationsbedingungen für diese Filter gehörte die Behandlung mit 50% entionisiertem Formamid, 6x SSC, 5x Denhardt-Lösung, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS und 100μg/ml denaturierter Lachsperma-DNA bei 42°C über Nacht. Dieselben Bedingungen wurden für das Hybridisationsmedium unter Verwendung von 32P-nick-translaterierten Proben bei einer Endkonzentration von 106cpm/ml angewendet. Diese Proben wiederum wiesen dCNA-Einsätze (Pstl-Fragmente) von den Klonen pPC8,3, pPC15,0 und pPC6,7 sowie ein Bglll-DNA-Fragment zu 2,7 kbp des HIS4-Gens von P. pastoris auf. Jede dieser Proben wurde gesondert auf identischen Filtern für die Hybridisation genutzt, die 24 Stunden bei 420C dauerte. Nach der Hybridisation wurden die Filter zweimal 15 Minuten bei Zimmertemperatur und dreimal 15 Minuten bei 65"C in einer Lösung gewaschen, die 2x SSC, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat enthielt. Andere Waschungen wurden bei geringerer Härte, d. h., bei 550C und 42°C, versucht, um die Hybridisationsergebnisse zu bestätigen. Dann wurden die Filter über 72 Stunden einer Autoradiographbehandlung unterzogen. Die Ergebnisse dieser Hybridisationen sind in derTabelle III zusammengefaßt worden.
Tabelle III
Hybridisation von Genen von P. pastoris auf verschiedene chromosomale Hefe-DNA*
Pichia pastoris
HIS 4 pPC8,3 pPC15,0 pPC6,7
1) P. pastoris
NRRL Y-11430 + + + +
2) P. pastoris
NRRL Y-1603 + + + +
3) Hansenulacapsulatum + + + +
4) H. henricii + + (+) +
5) H. nonfermantans + + + . +
6) H. polymorpha (+) + (+) +
7) H.wickerhamii + + + +
8) Torulopsis
molischiana + + + +
9) Saccharomyces
cerevisiae (+) - - —
10) P. pastoris
NRRLY-15851 + + + + '
* Legende: + Hybridisation
(+) schwache Hybridisation
- Unter den angewendeten Bedingungen wurde keine Hybridisation festgestellt
Aus den in der Tabelle III gezeigten Ergebnisse wird deutlich, daß Gene für Polypeptide, die analog zu ρ76, ρ72 und ρ40 sind, in tatsächlich allen methanolassimilierenden Hefen vorhanden sind. Es ist zu beachten, daß keines dieser drei Gene durch Hybridisation von DNA von der methanol-nichtassimilierenden Hefe, S. cerevisiae, festgestellt wurde, während eine Homologie zwischen dem Gen HIS4 von P. pastoris und dem Gen HIS 4 von P. pastoris und dem Gen HIS4 von S. cerevisiae leicht festgestellt werden konnte.
Die Beispiele wurden nur gegeben, um die Ausführung der Erfindung zu veranschaulichen, sie sollten nicht als Einschränkung des Rahmens der Erfindung oder des beigefügten Patentanspruchs betrachtet werden. Es wird davon ausgegangen, daß angemessene Veränderungen und Modifikationen, die nicht vom Wesen und Geist der Erfindung abweichen, durch den Rahmen des angestrebten und gewünschten Patentschutzes erfaßt werden.
Bibliografie
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Claims (92)

1. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, bestehend in der Züchtung eines transformierten Hefestamms in einem Nährmedium, wobei der genannte transformierte Hefestamm in der Lage ist, eine eingelagerte Polypeptidcodiersequenz zu exprimieren, welche von rekombinierendem DNA-Material abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material umfaßt
(1) einen regulatorischen Bereich, der mindestens einer derfolgenden Bedingungen genügt:
(1) das Vorhandensein von Methanol in dem Kulturmedium, in dem sich ein Wirtsorganismus für das genannte DNA-Fragment befindet,
(ii) das Vorhandensein einer anderen nicht katabolitunterdrückenden Kohlenstoffquelle als Methanol in dem Kulturmedium, in dem sich ein Wirtsorganismus für das genannte DNA-Fragment befindet, oder
(iii) Kohlenstoffquellenstarvation in dem Kulturmedium, in dem sich ein Wirtsorganismus für das genannte DNA-Fragment nach dem Wachstum des Wirtsorganismus in einer katabolitunterdrückenden Kohlenstoff- und Energiequelle befindet; und
(2) einen Polypeptidcodierungsbereich;
wobei der genannte regulatorische Bereich in der Lage ist, die Transkription von Messenger-RNA zu kontrollieren, wenn er sich am 5'-Ende des genannten Polypeptidcodierungsbereichs, welcher die Produktion der genannten Messenger-RNS codiert, befindet; und wobei das genannte • Nährmedium so beschaffen ist, daß es die in (1 !definierten Bedingungen erfüllt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte regulatorische Bereich von Hefe abgeleitet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Hefe aus der Gattung Pichia gewählt wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Hefe ein Vertreter der Art Pichia pastoris ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Hefe Pichia pastoris NRRL Y-11430 ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte regulatorische Bereich die Transkription der Messenger-RNA gesteuert, welche die Produktion von Alkoholoxidase codiert.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte regulatorische Bereich die Transkription der Messenger-RNA steuert, welche die Produktion des Polypeptids p76 codiert.
8. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte regulatorische Bereich die Transkription der Messenger-RNA steuert, welche die Produktion des Polypeptids ρ 40 codiert.
9. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem die 3'-Sequenz der DNA unterhalb der DNA enthält, welche die Produktion von Alkoholoxidase codiert.
10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem die 3'-Sequenz der DNA unterhalb der DNA enthält, welche die Produktion des Polypeptids p76 codiert.
11. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem die 3'-Sequenz der DNA unterhalb der DNA enthält, welche die Produktion des Polypeptids p40 codiert. /
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Messenger-RN^-. die Produktion eines heterologen Polypeptids codiert.
13. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält/das durch die Restriktionskarte in Abbildung 5 charakterisiert ist. ·
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte DNA-Fragment außerdem ein zusätzliches Fragment enthält, welches aus der Gruppe gewählt wird, die durch die Restriktionskarten in Abbildung 8 gekennzeichnet ist.
15. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, welches aus der Gruppe gewählt wird, die durch die Restriktionskarten in Abbildung 4 gekennzeichnet ist.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte DNA-Fragment außerdem das zusätzliche Fragment enthält, welches durch die Restriktionskarte in Abbildung 7 ghekennzeichnet ist.
17. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, das durch die Restriktionskarte in Abbildung 6 gekennzeichnet ist.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem das zusätzliche Fragment enthält, welches durch die Restriktionskarte in Abbildung 9 gekennzeichnet ist.
19. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Fragment mit der nachfolgenden Nucelotidsequenz enthält:
5'-ATGCTTCCAa
ACGTTCATGA
GACAGGCAAT
AACCTTTTTT
TTGCGACTGG
CTTTTAACGA
ATTCGAAACG-3'.
GATTCTGGTG
TCAAAATTTA
ATATAAACAG
TTTATCATCA
TTCCAATTGA
CAACTTGAGA
GGAATACTGC ACTGTTCTAA AAGGAAGCTG TTATTAGCTT CAAGCTTTTG AGATCAAAAA
TGATAGCCTA
CCCCTACTTG
CCCTGTCTTA
ACTTTCATAA
ATTTTAACGA
ACAACTAATT
Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem ein zusätzliches Fragment enthält, das sich am 3'-Ende der DNA befindet, welche die Produktion der Messenger-RNA codiert; wobei das genannte zusätzliche Fragment aus der Gruppe gewählt wird, welche durch die Restriktionskarten in Abbildung 8 gekennzeichnet ist. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Fragment mit folgender Nucleotidsequenz enthält:
5'-AATGGCCCAAA
ATATGACAAA
TGGTTCGTTG
ACTTCCAAAA
GATTGACGAA
GCAGTCTCTC
CGAAACGCAA
ATGCATTGTC
GGAATACTGC
ACTGTTCTAA
AAGGAAGCTG
TTATTAGCTT
GAAGCTTTTG
AGATCAAAAA
CTGACAGTTT
AGCGTGATCT
AAATCCTAAC
GTCGCCATAC
TGCTCAAAAA
TAJCGCTTCT
ATGGGGAAAC
TCCACATTGT
TGATAGCCTA
CCCCTACTTG
CCCTGTCTTA
ACTTTCATAA
ATTTTAACGA
ACAACTAATT
AAACGCTGTC CATCCAAGAT GGCCAGTTGG CGTTTGTCTT TAATCTCATT GAACCCGGTG AACCCGCTTT ATGCTTCCAA ACGTTCATGA' GACAGGCAAT AACCTTTTTT TTGCGACTGG CTTTTAACGA ATTCGAAACG-3'.
TTGGAACCTA
GAACTAAGTT
TCAAAAAGAA
GTTTGGTATT
AATGCTTAGC
GCACCTGTGC
TTGGATGATT
GATTCTGGTG
TCAAAATTTA
ATATAAACAG
TTTATCATCA
TTCCAATTGA
CAACTTGAGA
22. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Fragment mit folgender Nucleotidsequenz enthält:
CGAAAGGTTG
AGGTCCATTC
GGATACACTA
CTCTTCTCTA
GGGCTTGATG
GCTACTAACA
AATGAAACCT
TCACACATAA
GCAGCAGACG
ACACCATTTT
GAGCTCGCTC
CCATGACTTT
5'-AGATCTAA TTTTGCCATC GTGCCAAACG TTGCAAACGC GCATGAAAAC ATTCCAATTC ATTAGCCTGT
CATCCAAAGA
CGACATCCAG
CAACAGGAGG
AGGACTCATC
AGCCAGTTAT
CTTCTATTAG
CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGC
TTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG · TTCCCAAATG
GCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAAT
ATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG
GTTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC
TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA
TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC
AGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG
AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCI I I I I GGATGATTAT
GCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGG
GAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA
CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA
AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACC I I I Il I I TTATCÄTCAT
TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC
AAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAA
GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3'.
23. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Fragment mit folgender Nucleotidsequenz enthält:
5'-TT
CACCCATACA ACTATAAACC TTAGCAATTG AAATAACCCC
AATTCATTGT ' TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA
AACCAAGGGA ,TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC
TTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAAC
AGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTT
CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTG
CCGTTCCATC CCTTTGTTGA GCAACACCAT CGTTAGCCAG
TACGAAAGAG · GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA
AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT TAGTGAAGGG
TGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCT
TGTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGC
CAAATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGI I I Il
CTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAAT
ATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACA
ACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTAT CAAACTATCA AACATCAAAA-3'
24. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte regulatorische Bereich sich am 5'-Ende des genannten Polypeptidcodierungsbereichs befindet.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Polypeptidcodierungsbereich die Produktion von Alkohokixidase codiert.
26. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Fragment mit derfolgenden Nucleotidsequenz enthält: /
ATC CCC GAA GAG TTT
TAG GGG CTT CTC AAA
GGA TTC AGT GGA TTC
CCT AGG TCA CCT AGG
AAC TTG GAC CAC TCC
TTG AAC CTG GTG AGG
GCA GGT GAG AAC CAA
CGT CCA CTC TTG GTT
27. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Polypeptidcodierungsbereich die Produktion des Polypeptide p76 codiert.
28. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Polypeptidcodierungsbereich die Produktion des Polypeptids p40 codiert.
29. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Polypeptidcodierungsbereich die Produktion eines heterologen Polypeptids codiert.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte heterologe Polypeptid /3-Galactosidase ist.
31. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, welches aus der Gruppe ausgewählt wird, die durch die Restruktionskarten in Abbildung 15 charakterisiert wird.
32. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, welches durch die Restriktionskarte in Abbildung 16 charakterisiert wird.
33. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, welches durch die Restriktionskarte in Abbildung 2 charakterisiert wird.
34. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, welches durch die Restruktionskarte in Abbildung 10 charakterisiert wird.
35. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, welches durch die Restriktionskarte in Abbildung 11
charakterisiert wird.
36. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem eine 3'-Sequenz der DNA abwärts des Polypeptidcodierbereichs enthält, wobei die genannte 3'-Sequenz der DNA in der Lage ist, die Polyadenylierung, Beendigung der Transkription und Beendigung der Translation der Messenger-RNA zu steuern, die durch den genannten Polypeptidcodierbereich codiert wird.
37. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, welche abgeleitet werden von
Bakterienplasmid-DNA,
Bakteriophagen-DNA,
Hefeplasmid-DNA oder
Hefechromosomen-DNA.
38. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Hefechromosomen-DNA eine autonom replizierende DNA-Sequenz und ein Markierungsgen enthält.
39. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material außerdem eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, welche abgeleitet werden von
Bakterienplasmid-DNA,
Bakteriophagen-DNA,
Hefeplasmid-DNA oder
Hefechromosomen-DNA.
40. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Hefechromosomen-DNA eine autonom replizierende DNA-Sequenz und ein Markierungsgen enthält.
41. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, welches einen ersten regulatorischen Bereich enthält, der in der Lage ist, die Polyadenylierung, Beendigung der Transkription und Beendigung der Translation der Messenger-RNS zu steuern, wenn er sich am 3'-Ende des Polypeptidcodierungsbereichs, welcher die Produktion der genannten Messenger-DNS codiert, befindet; und einen zweiten regulatorischen Bereich; wobei die Transkription und Translation der genannten Messenger-RNA durch einen zweiten regulatorischen Bereich gesteuert wird; wobei der genannte zweite regulatorische Bereich auf mindestens einer der folgenden Bedingungen anspricht:
(i) Das Vorhandensein von Methanol in dem Kulturmedium, in dem sich der Wirtsorganismus für das genannte DNA-Fragment befindet, und
(ii) das Vorhandensein einer nichtkatabolitunterdrückenden Kohlenstoffquelle außer Methanol in dem Kulturmedium, in dem sich der Wirtsorganismus für das genannte DNA-Fragment befindet, und
(iii) die Kohlenstoffquellenstarvation in dem Kulturmedium, mit dem der Wirtsorganismus für das genannte DNA-Fragment nach dem Wachstum des Wirtsorganismus auf einer katabolitunterdrückenden Kohlenstoff-und Energiequelle in Kontakt ist; und wobei der genannte regulatorische Bereich in der Lage ist, die Transkription der Messenger-RNA zu steuern, wenn er sich am 5'-Ende der DNA befindet, welche die Produktion der genannten Messenger-RNA codiert.
42. Verfahren gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte DNA-Fragment durch die Restriktionskarte in Abbildung 7 charakterisiert ist.
43. Verfahren gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte DNA-Fragment aus der durch die Restriktionskarte in Abbildung 8 charakterisierten Gruppe ausgewählt wird.
44. Verfahren gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte DNA-Fragment durch die Restriktionskarte in Abbildung 9 charakterisiert wird.
45. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Gen enthält, das die Produktion von Alkoholoxidase codiert, oder eine Untereinheit eines solchen Gens oder ein Äquivalent eines solchen Gens oder eine Untereinheit desselben.
46. Verfahren gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Gen durch die Restriktionskarte in Abbildung 13 charakterisiert wird.
47. Verfahren gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Gen außerdem' flankierende Bereiche von Chromosomen-DNA enthält, wie sie durch die Restriktionskarte in Abbildung 2a charakterisiert werden.
48. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Gen enthält, das die Produktion des Polypeptids p76 codiert, oder eine Untereinheit desselben oder ein Äquivalent eines solchen Gens oder eine Untereinheit desselben.
49. Verfahren gemäß Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Gen durch die Restriktionskarte in Abbildung 12 charakterisiert wird.
50. Verfahren gemäß Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Gen außerdem flankierende Regionen von Chromosomen-DNA enthält, wie sie durch die Restriktionskarte in Abbildung 1 a gekennzeichnet wird.
51. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß-das genannte rekombinierende DNA-Material ein Gen enthält, welches die Produktion des Polypeptids p40 codiert, oder eine Untereinheit desselben oder ein Äquivalent eines solchen Gens oder eine Untereinheit desselben.
52. Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Gen durch die Restriktionskarte in Abbildung 14 charakterisiert wird.
53. Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Gen außerdem flankierende Regionen von Chromosomen-DNA enthält, wie sie durch die Restriktionskarte in Abbildung 3a charakterisiert wird.
54. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, das die Gestalt eines geschlossenen ringförmigen Hybridplasmidshat.
55. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des genannten rekombinierenden DNA-Materials von einem Hybridplasmid abgeleitet ist, bei dem der nichtbakterielle Einschub die in Abbildung 1 a dargestellte Restriktionskarte (pPG 6.0) hat.
56. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des genannten rekombinierenden DNA-Materials von einem Hybridplasmid abgeleitet ist, bei dem der nichtbakterielle Einschub die in Abbildung 2a dargestellte Restriktionskarte (pPG4.0) hat.
57. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des genannten rekombinierenden DNA-Materials von einem Hybridplasmid abgeleitet ist, bei dem der nichtbakterielle Einschub die in Abbildung 3a dargestellte Restriktionskarte (pPG4.8) hat.
58. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des genannten rekombinierenden DNA-Materials von einem Hybridplasmid abgeleitet ist, bei dem der nichtbakterielle Einschub die in Abbildung 1 b dargestellte Restriktionskarte (pPC15.0) hat.
59. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des genannten rekombinierenden DNA-Materials von einem Hybridplasmid abgeleitet ist, bei dem der nichtbakterielle Einschub die in Abbildung 2 b dargestellte Restriktionskarte (pPC8.3) hat.
60. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des genannten rekombinierenden DNA-Materials von einem Hybridplasmid abgeleitet ist, bei dem der nichtbakterielle Einschub die in Abbildung 2c dargestellte Restriktionskarte hat (pPC8.0).
61. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des genannten rekombinierenden DNA-Materials von einem Hybridplasmid abgeleitet ist, bei dem der nichtbakterieile Einschub die in Abbildung 3b dargestellte Restriktionskarte (pPC6.7) hat.
62. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 17 dargestellte Restriktionskarte (pSAOHDhat.
63. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 18 dargestellte Restriktionskarte (pSAOH5)hat.
64. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 19 dargestellte Restriktionskarte (pSAOHIO)hat.
65. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 20 dargestellte Restriktionskarte (pTAFH.85) hat.
66. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 21 dargestellte Restriktionskarte (pT76H1)hat.
67. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 22 dargestellte Restriktionskarte (pT76H2)hat.
68. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 22a dargestellte Restriktionskarte (pT76H3)hat.
69. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 22 b dargestellte Restriktionskarte (pT76H4)hat.
70. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybridplasmid enthält, das die in Abbildung 30 dargestellte Restriktionskarte (pTAO13)hat.
71. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein Hybrldplasmid enthält, das die in Abbildung 30a dargestellte Restriktionskarte (pT76U1)hat.
72. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte transformierte Hefe auf mindestens einer der Kohlenstoff- und Energiequellen wachstumsfähig ist, welche ausgewählt werden aus
Methanol Glucose Acetat Ethanol Glycerol Saccharose Lactose Fructose und Galactose.
73. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformierte Hefestamm ausgewählt wird aus Candida Kloeckera Saccharomyces Rhodotorula Hansenula Torulopsis Pichia
Schizosaccharomyces Kluyveromyces.
74. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformeirte Hefestamm auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle wachstumsfä.hig ist.
75. Verfahren gemäß Anspruch 74, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformierte Hefestamm ausgewählt wird aus den Gattungen Candida Kloeckera Saccharomyces Rhodotorula Hansenula . Torulopsis und Pichia.
76. Verfahren gemäß Anspruch 75, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformierte Hefestamm aus der Gattung Pichia ausgewählt wird.
77. Verfahren gemäß Anspruch 72 oder 73, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformierte Hefestamm aus der Gattung Saccharomyces ausgewählt wird.
78. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hefestamm Pichia pastoris NRRL Y-15852 (GS 115-pSAOH 1) ist.
79. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hefestamm Pichia pastoris NRRL Y-15853 (GS 115-pSAOH 5) ist.
80. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hefestamm Pichia pastoris NRRL Y-15854 (GS 115-pSAOH 10) ist.
81. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hefestamm Pichia pastoris NRRL Y-15855 (GS 115-pTAFH.85) ist.
82. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hefestamm Pichia pastoris NRRL Y-15856 (GS 115-pT76 H 1) ist.
83. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hefestamm Pichia pastoris NRRL Y-15857 (GS 115-pT76 H2) ist.
84. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hefestamm Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-15858 (SEY2102-pTA013) ist.
85. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Nährmedium Methanol enthält und das genannte rekombinierende DNA-Material ein auf Methanol ansprechendes DNA-Fragment enthält, das sich am 5'-Ende des genannten Polypeptidcodierbereichs befindet.
86. Verfahren gemäß Anspruch 85, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformierte Hefestamm aus den Gattungen
Candida
Kloeckera Saccharomyces Rhodotorula Hansenula Torulopsis und Pichia
ausgewähtwird.
87. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Nährmedium mindestens eine nichtkatabolitunterdrückende Kohlenstoffquelle enthält und daß das genannte rekombinierende DNA-Material ein DNA-Fragment enthält, das auf das Vorhandensein einer nichtkatbolitunterdrückenden Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium anspricht, mit dem der transformierte Hefestamm in Kontakt ist, und das sich am 5'-Ende des genannten Polypeptidcodierbereichs befindet.
88. Verfahren gemäß Anspruch 87, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte nichtkatabolitunterdrückende Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Glycerol und Galactose ausgewählt wird.
89. Verfahren gemäß Anspruch 88, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformierte Hefestamm ausgewählt wird aus Candida
Kloeckera
Saccharomyces Rhodotorula Hansenula Torulopsis Pichia
Schizosaccharomyces Kluyveromyces.
90. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Nährmedium mindestens eine Kohlenstoff- und Energiequelle enthält und daß das genannte rekombinierende DNA-Material einen regulatorischen Bereich enthält, der auf die Kohlenstoffquellenstarvation in dem Kulturmedium anspricht, mit dem der transformierte Hefestamm nach dem Wachstum des transformierten Hefestammes auf der genannten mindestens einen katabolitunterdrückenden Kohlenstoff- und Energiequelle in Kontakt ist, daß der genannte regulatorische Bereich sich am 5'-Ende des genannten Polypeptidcodierbereichs befindet und daß das Produkt der Stufe (a) den Bedingungen der Kohlenstoffquellenstarvation unterworfen wird.
91. Verfahren gemäß Anspruch 90, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine katabolitunterdrückende Kohlenstoff- und Energiequelle aus der Gruppe Glucose, Ethanol und Fructose ausgewählt wird.
92. Verfahren gemäß Anspruch 90, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte katabolitunterdrückende Kohlenstoffquelle Glucose ist.
93. Verfahren gemäß Anspruch 90, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte transformierte Hefestamm aus den Gattungen:
Candida
Kloeckera
Saccharomyces . ·
Rhodotorula Hansenula Torulopsis Pichia
Schizosaccharomyces und Kluyveromyces ausgewählt wird. .
94. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dieses die Isolierung und Reinigung des genannten Polypeptids umfaßt.
Hierzu 23 Seiten Zeichnungen
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