DE3689411T2

DE3689411T2 - Methode zur erhöten Expression von Polypeptiden in Hefe des Gattung Pichia.

Info

Publication number: DE3689411T2
Application number: DE3689411T
Authority: DE
Inventors: James Michael Cregg
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1985-10-25
Filing date: 1986-10-23
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2006-10-24
Also published as: PH25990A; PL262030A1; ES2152233T3; ATE98695T1; AU593436B2; HU208552B; IN166443B; IE940325L; ZA867650B; DK510786A; ATE197962T1; FI98931C; US4882279A; NZ217809A; FI864319A0; DD255544A5; IE862637L; JP2614215B2; EP0560401B1; NO864275L

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie. Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung die integrative Transformation von Hefe.

Hintergrund

Mit der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie in den letzten Jahren ist die kontrollierte Produktion einer enormen Vielzahl nützlicher Polypeptide durch Mikroorganismen möglich geworden. Viele eukaryontische Polypeptide, wie menschliches Wachstumshormon, Leukozyten- Interferone, menschliches Insulin und menschliches Proinsulin werden bereits durch eine Reihe von Mikroorganismen hergestellt. Die fortgesetzte Anwendung bereits bekannter Techniken läßt in Zukunft die Herstellung einer Vielzahl weiterer nützlicher Polypeptidprodukte durch Mikroorganismen erwarten.
Ein grundlegendes, in der rekombinanten Technologie häufig eingesetztes Element ist das Plasmid, bei dem es sich um extrachromosomale, doppelsträngige DNA handelt, die in einigen Mikroorganismen gefunden wird. Wenn festgestellt wurde, daß Plasmide natürlich in Mikroorganismen vorkommen, dann wurde häufig festgestellt, daß sie in mehreren Kopien pro Zelle vorkommen. Außer natürlich vorkommenden Plasmiden sind eine Reihe künstlicher Plasmide oder Hybridvektoren hergestellt worden. Allerdings ist es der Wirtszelle nicht immer möglich, das Plasmid zu behalten. Vielmehr geht das Plasmid verloren, wenn der Organismus sich fortpflanzt und mehrere Generationen des Wachstums durchläuft. Methoden zur stabilen Einführung fremder DNA in geeignete Wirtsorganismen sind daher von großem Interesse und möglicherweise von großem Wert.
Bisher haben sich großtechnische Anstrengungen zum Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung verschiedener Polypeptide auf Escherichia coli als Wirtsorganismus konzentriert. In einigen Fällen ist E. coli jedoch möglicherweise als Wirt ungeeignet. Z.B. enthält E. coli eine Reihe toxischer pyrogener Faktoren, die aus einem als pharmazeutisches Produkt geeigneten Polypeptid entfernt werden müssen. Der Wirkungsgrad, mit dem diese Reinigung erzielt werden kann, variiert natürlich je nach dem speziellen Polypeptid. Außerdem kann die proteolytische Aktivität von E. coli die Ausbeute einiger nützlicher Produkte stark einschränken. Ferner ist festgestellt worden, daß eine Anzahl von Produkten heterologer Gene, die in E. coli hergestellt worden sind, in einer unlöslichen Form hergestellt worden sind. Diese und andere Überlegungen haben zu einem verstärkten Interesse an alternativen Wirten geführt. Insbesondere ist die Verwendung eukaryontischer Organismen zur Herstellung von Polypeptidprodukten vielversprechend.
Die Verfügbarkeit von Mitteln zur Herstellung von Polypeptidprodukten in eukaryontischen Systemen, z. B. in Hefen, könnte wesentliche Vorteile im Vergleich zur Verwendung prokaryontischer Systeme, wie E. coli, zur Herstellung von Polypeptiden, für die rekombinante DNA codiert, bieten. Hefe wird seit Jahrhunderten bei der großtechnischen Fermentation eingesetzt, im Vergleich zur relativ neuen Entwicklung der großtechnischen Fermentation mit E. coli. Hefe kann im allgemeinen bis zu einer höheren Zelldichte gezüchtet werden, als es bei Bakterien der Fall ist, und sie kann leicht an kontinuierliche Fermentationsprozesse angepaßt werden. In der Tat ist das Züchten von Hefe, wie Pichia pastoris, bis zu ultrahohen Zelldichten, d. h. Zelldichten von mehr als 100 g/l, von Wegner in US- 4 414 329 (übertragen auf Phillips Petroleum Co.) beschrieben worden. Weitere Vorteile von Hefewirten umfassen die Tatsache, daß viele kritische Funktionen des Organismus, z. B. die oxidative Phosphorylierung, sich in Organellen befinden und daher möglichen ungünstigen Einflüssen, die durch die Bildung von Polypeptiden verursacht werden, die den Wildtyp- Wirtszellen fremd sind, nicht ausgesetzt sind. Als eukaryontischer Organismus erweist sich Hefe möglicherweise als fähig, exprimierte Polypeptidprodukte zu glykosylieren, was sich als wertvoll erweisen kann, wenn eine derartige Glykosylierung für die Bioaktivität des Polypeptidprodukts wichtig ist. Es ist auch möglich, daß Hefe als eukaryontischer Organismus die gleiche Codonnutzung wie höhere Organismen zeigt, was eine Tendenz zu einer wirksameren Bildung von Expressionsprodukten von Säugergenen oder von komplementärer DNA (cDNA), die durch reverse Transkription z. B. von Säuger-mRNA erhalten wurde, bedeuten würde.
Die Entwicklung schlecht charakterisierter Hefespezies zu Wirt/Vektor-Systemen wird durch fehlende Kenntnisse über die Transformationsbedingungen und das Fehlen geeigneter Mittel zur stabilen Einführung fremder DNA in die Wirtszelle stark behindert. Außerdem sind auxotrophe Mutanten oft nicht verfügbar, was eine direkte Selektion auf Transformanten durch auxotrophe Komplementierung ausschließt. Wenn die rekombinante DNA-Technologie ihre Versprechen voll erfüllen soll, dann müssen neue Wirt/Vektor-Systeme aufgezeigt werden, die sowohl die Manipulation von DNA erleichtern als auch die Expression inserierter DNA-Sequenzen optimieren, so daß gewünschte Polypeptidprodukte unter kontrollierten Bedingungen und in hoher Ausbeute hergestellt werden können.

Aufgabe der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung einer Alkoholoxidase-Minus-Mutante als Wirt für die verstärkte Herstellung heterologer Proteine in Hefe.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden aus der hier vorgelegten Offenbarung und den Ansprüchen deutlich.

Darstellung der Erfindung

Erfindungsgemäß ist ein neuartiges Verfahren zur hochgradigen Expression von Polypeptiden in Hefe der Gattung Pichia entwickelt worden. Durch Transformation von Hefe mit einem linearen DNA-Fragment, das an jedem Ende inserierbare DNA-Sequenzen, d. h. Sequenzen mit einer Homologie zum Wirtsgenom, von denen jede eine Länge von mindestens etwa 200 Nucleotiden aufweist, und mindestens ein zusätzliches DNA-Fragment, z. B. ein selektierbares Markergen, das sich dazwischen befindet, umfaßt, werden das Markergen und die flankierenden inserierbaren DNA-Sequenzen von dem Wirt mit hoher Frequenz aufgenommen. Als Folge der Transformation mit dieser linearen DNA werden modifizierte Hefestämme hergestellt, bei denen die DNA-Sequenz an der Stelle der Integration unterbrochen und/oder deleiert worden ist. Das selektierbare Markergen sowie beliebige weitere, als Teil des transformierenden linearen DNA-Fragments eingeschlossene DNA sind dem Genom der Wirtshefe einverleibt worden.
Auf die vorstehend beschriebene Weise in das Genom der Wirtshefe inserierte fremde DNA wird über viele Generationen des Wachstums des Wirtes stabil aufrechterhalten. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung wird daher das Problem eines Verlustes der fremden DNA aufgrund einer Plasmidinstabilität vermieden, das auftritt, wenn fremde DNA statt dessen als Teil eines sich autonom replizierenden extrachromosomalen Fragments bereitgestellt wird oder wenn fremde DNA statt dessen in das Genom als Teil eines kreisförmigen DNA-Moleküls integriert wird. Derartige Integrationen von kreisförmigen DNA-Molekülen führen zur Insertion fremder DNA-Sequenzen in das Wirtsgenom, die von direkten Wiederholungen genomischer Sequenzen des Wirtsgenoms flankiert werden. Da derartige direkte Wiederholungssequenzen Substrate für weitere Rekombinationen sind, ist zwischen direkte Wiederholungssequenzen inserierte fremde DNA instabil.
Die erfindungsgemäße gerichtete genomische Modifizierung ermöglicht zusammen mit dem Fachmann bekannten rekombinanten in vitro-DNA-Techniken einen weiten Bereich präziser genomischer Modifizierungen des Wirts, z. B. die Addition eines oder mehrerer heterologer Gene in das Wirtsgenom, die Veränderung regulatorischer Sequenzen, die die Expression eines nativen Gens kontrollieren, den Ersatz eines nativen Gens durch ein Gen nicht-nativen Ursprungs und dergl.
Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß die durch Methanol induzierte Expression von heterologen Genen in Pichia durch Einsatz eines Stammes von Pichia, bei dem das Gen für primäre Alkoholoxidase von Pichia unterbrochen worden ist, als Wirt für die Genexpression dramatisch verstärkt werden kann.
Es ist ferner festgestellt worden, daß Stämme des Organismus Pichia pastoris ein zweites Alkoholoxidase-Gen aufweisen, was es einem Wirtstamm, bei dem das primäre Alkoholoxidase-Gen unterbrochen worden ist, erlaubt, die Fähigkeit zum Wachstum auf Methanol zu behalten, allerdings bei einer verringerten Wachstumsrate, bezogen auf native Pichia pastoris.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pYMI1.
Fig. 2 erläutert die Insertion eines Abschnitts des Plasmids pYMI1 in den HIS4-Locus des Pichia-Chromosoms.
Fig. 3 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pYJ8.
Fig. 4 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pYMI3a.
Fig. 5 erläutert die Insertion eines Abschnitts des Plasmids pYMI3a in den HIS4-Locus des Pichia-Chromosoms.
Fig. 6 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pBPG1-1.
Fig. 7 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pYMI7.
Fig. 8 erläutert die Insertion eines Abschnitts des Plasmids pYMI7 in den Alkoholoxidase-Locus des Pichia-Chromosoms.
Fig. 9 erläutert die Konstruktion des Plasmids pYM39 aus den Plasmiden pSAOH5 und pTHBS3.
Fig. 10 erläutert die Konstruktion des Plasmids pYMI6 aus den Plasmiden pYM39 und pPG3.2.
Fig. 11 erläutert die Konstruktion des Plasmids pBSAGI5I aus den Plasmiden pYMI6 und pBSAG5I.
Fig. 12 ist eine Restriktionskarte, die ausführlicher als Fig. 11 das Plasmid pBSAGI5I zeigt.
Fig. 13 erläutert die Insertion eines Abschnitts des Plasmids pBSAGI5I in den Alkoholoxidase-Locus des Pichia-Chromosoms.
Fig. 14 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pYMI12a.
Fig. 15 erläutert die Insertion eines Abschnitts des Plasmids pYMI12a in den Locus des zweiten Pichia-Alkoholoxidase-Gens (AOX2).
Fig. 16 ist eine Restriktionskarte des Pichia-Inserts in die auf pBR322 basierenden Plasmide pPG4.0 und pPG3.0. Das in Fig. 16a gezeigte Insert stammt vom Locus des ersten Pichia-Alkoholoxidase-Gens (AOX1), während das in Fig. 16b gezeigte Insert aus dem Locus des zweiten Pichia- Alkoholoxidase-Gens (AOX2) stammt. Fig. 16c zeigt den bekannten, für Alkoholoxidase (AOX) codierenden Abschnitt des AOX1-Genlocus (mit Bezug auf Fig. 16a).
Fig. 17 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pYM25.
Fig. 18 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pT76H3.
Die folgenden Abkürzungen werden in der gesamten Anmeldung verwendet, um die eingesetzten Restriktionsenzyme zu bezeichnen:
Abkürzung Restriktionsenzym
As AsuII
B BamHI
B&sub2; BglII
C ClaI
R&sub1; EcoRI
R&sub5; EcoRV
H&sub3; HindIII
Hp&sub1; HpaI
Kp KpnI
Nr NruI
Ps PstI
Pv&sub2; PvuII
Rs RsaI
S SalI
S3 Sau3AI
Sm Smal
Sp SphI
St Stul
Th ThaI
Xb XbaI
Xh XhoI
In den beigefügten Figuren sind Restriktionsstellen, die zur Manipulation der DNA-Fragmente genutzt wurden, die jedoch bei der Ligation zerstört wurden, durch Einschließen der Abkürzung für die zerstörte Stelle in runde Klammern bezeichnet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur hochgradigen Expression in Hefe bereitgestellt, das die Transformation eines Wirtstammes der Gattung Pichia mit einem seriell angeordneten linearen DNA-Fragment umfaßt, das ein erstes inserierbares DNA-Fragment, ein selektierbares Markergen und ein zweites inserierbares DNA-Fragment umfaßt. Das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment besitzen jeweils eine Länge von etwa 200 Nucleotiden und weisen Nucleotidsequenzen auf, die zu getrennten Abschnitten des nativen Pichia-Genoms an der Stelle, an der die genomische Modifizierung auftreten soll, homolog sind. Bei dem selektierbaren Markergen handelt es sich um ein Gen, dessen Produkt Zellen einen selektierbaren Phänotyp verleiht, die das Gen erhalten, z. B. ein Antibiotikaresistenz-Gen oder ein biosynthetisches Gen, das es der Zelle erlaubt, einen für das Wachstum erforderlichen Nährstoff zu synthetisieren, denn das selektierbare Markergen in einem DNA-Vektor vorhanden ist, dann erlaubt es nur denjenigen Zellen, die den Vektor erhalten, unter selektiven Wachstumsbedingungen zu wachsen. Es ist wesentlich, das selektierbare Markergen zwischen das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment anzuordnen und die inserierbaren DNA-Fragmente in der gleichen Orientierung in bezug aufeinander, wie sie im Genom der Wirtszelle, die der genomischen Modifizierung durch das lineare DNA-Fragment unterliegt, vorhanden sind, anzuordnen.
Erfindungsgemäß wird ferner ein seriell angeordnetes lineares DNA- Fragment zur Verwendung bei dem Verfahren bereitgestellt, das ein erstes inserierbares DNA-Fragment, ein selektierbares Markergen und ein zweites inserierbares DNA-Fragment umfaßt. Das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment besitzen jeweils eine Länge von mindestens etwa 200 Nucleotiden und weisen Nucleotidsequenzen auf, die zu Abschnitten der genomischen DNA von Spezies der Gattung Pichia homolog sind, und die in bezug aufeinander in dem linearen Fragment so angeordnet sind, wie sie im Genom von Pichia vorhanden sind. Das Markergen ist zwischen dem ersten und dem zweiten inserierbaren DNA-Fragment angeordnet.
Das grundlegende Element, mit dem Spezies der Gattung Pichia erfindungsgemäß transformiert werden, enthält als Minimum drei Komponenten:
ein erstes inserierbares DNA-Fragment, ein zweites inserierbares DNA-Fragment und
ein selektierbares Markergen.
Das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment sollen jeweils eine Länge von mindestens etwa 200 Nucleotiden besitzen, wobei Längen im allgemeinen im Bereich von etwa 200 bis zu 5000 Nucleotiden üblicherweise eingesetzt werden. Im Hinblick auf eine einfache Manipulation und Handhabung werden vorzugsweise Fragmente mit etwa 500 bis zu 2000 Nucleotiden eingesetzt.
Als erstes und zweites inserierbares DNA-Fragment geeignete Nucleotidsequenzen sind Nucleotidsequenzen, die zu getrennten Abschnitten der Stelle des nativen Pichia-Genoms homolog sind, an der die genomische Modifizierung auftreten soll. Wenn also z. B. die genomische Modifizierung am Locus des Alkoholoxidase-Gens auftreten soll, dann handelt es sich bei dem ersten und dem zweiten inserierbaren DNA-Fragment um Sequenzen, die zu getrennten Abschnitten des Alkoholoxidase-Genlocus homolog sind. Damit eine erfindungsgemäße genomische Modifizierung auftritt, müssen die beiden inserierbaren DNA-Fragmente in bezug aufeinander in dem linearen Fragment in der gleichen relativen Orientierung vorliegen, wie sie im Pichia-Genom vorliegen.
Die drei minimalen Komponenten der erfindungsgemäß eingesetzten transformierenden DNA sind seriell angeordnet, um ein lineares DNA-Fragment zu bilden, bei dem ein selektierbares Markergen zwischen einem ersten inserierbaren Fragment und einem zweiten inserierbaren Fragment angeordnet ist. Beispielhafte selektierbare Markergene umfassen, ohne Beschränkung hierauf, das ARG4-Gen aus Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae, das HIS4-Gen aus Pichia pastoris und S. cerevisiae, das G418- Phosphotransferase-Gen aus dem transponierbaren Element Tn601 von E. coli und dergl. Der Fachmann erkennt, daß zahlreiche geeignete flankierende Sequenzen, d. h. erste und zweite inserierbare DNA-Fragmente, aus Genen abgeleitet werden können, die aus dem Genom von Pichia pastoris isoliert wurden. Beispielhafte Gene umfassen, ohne Beschränkung hierauf, die Alkoholoxidase-Gene (AOX1 und AOX2; Pichia weist zwei Alkoholoxidase-Gene auf), das Dihydroxyacetonsynthase - Gen (DAS), das Argininsuccinatlyase -Gen (ARG4), das Histidinoldehydrogenase-Gen (HIS4) und dergl.
Die transformierenden linearen DNA-Fragmente können eine Reihe weiterer DNA-Sequenzen enthalten, z. B. heterologe Gene, d. h. Gene oder Abschnitte von Genen, die normalerweise nicht an dem Locus des Genoms, an dem die Insertion in die Wirtszelle auftreten soll, gefunden werden, wobei deren Expression in P. pastoris erwünscht ist. Allgemein bezieht sich der Ausdruck heterolog auf DNA, die für die Pichia-Wirtszelle nicht nativ ist. Das heterologe Gen kann wahlweise mit einer regulatorischen Region, die unabhängig die Bildung des heterologen Genprodukts steuert, kombiniert sein, oder das heterologe Gen kann in der transformierten Zelle unter dem Einfluß der nativen regulatorischen Region des Gens, das durch den Transformationsprozeß unterbrochen worden ist, exprimiert werden.
Außerdem kann das bei der Ausführung der Erfindung eingesetzte transformierende lineare DNA-Fragment auch bakterielle Plasmid-DNA, z. B. pBR322- oder pBR325-Sequenzen, umfassen. Derartige bakterielle Sequenzen sind für die in vitro-Manipulation und für die Herstellung dieser DNA-Sequenzen durch Amplifikation in E. coli nützlich.
Eine besonders nützliche Form der transformierenden linearen DNA ist ein geschlossenes kreisförmiges Plasmid, das folgende Bestandteile umfaßt
ein erstes inserierbares DNA-Fragment,
ein zweites inserierbares DNA-Fragment,
ein selektierbares Markergen und bakterielle Plasmid-DNA.
Dieses Plasmid kann auch zusätzliche DNA-Sequenzen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, enthalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das geschlossene kreisförmige Plasmid aus zwei Abschnitten konstruiert, und zwar aus dem "transformierenden" Abschnitt und dem "bakteriellen" Abschnitt. Der transformierende Abschnitt umfaßt in serieller Anordnung das erste inserierbare DNA-Fragment, das selektierbare Markergen und das zweite inserierbare DNA-Fragment, wobei das erste und das zweite inserierbare DNA- Fragment in bezug aufeinander so angeordnet sind, wie sie im Genom von Pichia vorliegen, wobei das selektierbare Markergen zwischen dem ersten inserierbaren DNA-Fragment und dem zweiten inserierbaren DNA-Fragment angeordnet ist. Der bakterielle Abschnitt wird anschließend so angeordnet, daß er das erste inserierbare DNA-Fragment und das zweite inserierbare DNA-Fragment miteinander verbindet, wobei ein geschlossener, kreisförmiger Vektor gebildet wird.
Der geschlossene, kreisförmige Vektor, der, wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben, hergestellt wurde, kann eingesetzt werden, um große Mengen des Plasmids in E. coli herzustellen, wobei das Plasmid anschließend isoliert und mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut wird, um den transformierenden Abschnitt von dem bakteriellen Abschnitt abzuspalten.
Der lineare transformierende Abschnitt der Hefe-DNA kann dann eingesetzt werden, um Stämme der Gattung Pichia zu transformieren und die gewünschte genomische Modifizierung zu bewirken.
Natürlich erkennt ein Fachmann, daß der "transformierende" Abschnitt des geschlossenen kreisförmigen Plasmids, das vorstehend beschrieben wurde, zusätzliche DNA-Sequenzen enthalten kann. Zum Beispiel können die in vitro zur Manipulation und zur Herstellung der DNA durch Amplifikation in E. coli eingesetzten bakteriellen Sequenzen Teil der transformierenden DNA sein, d. h. die bakteriellen Sequenzen können, wie die Sequenzen des selektierbaren Markergens, ebenfalls zwischen dem ersten inserierbaren DNA-Fragment und dem zweiten inserierbaren DNA-Fragment angeordnet sein. Wenn eine derartige Konfiguration von DNA-Komponenten eingesetzt wird, dann werden die bakteriellen Sequenzen ebenfalls dem Genom des Hefewirts einverleibt, der dem erfindungsgemäßen Verfahren zur genomischen Modifizierung unterworfen wird.
Die Transformation von Pichia pastoris ist bereits von Stroman et al. in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 666 579 (übertragen auf Phillips Petroleum Company) beschrieben worden. Die zur Transformation von Pichia pastoris angewandten experimentellen Verfahren werden nachstehend ausführlicher erläutert (vgl. Beispiel 1). Hefestämme der Gattung Pichia können durch enzymatischen Verdau der Zellwände unter Bildung von Sphäroplasten transformiert werden; die Sphäroplasten werden anschließend mit der transformierenden DNA gemischt und in Gegenwart von Calciumionen und Polyethylenglykol inkubiert und dann in einem selektiven Wachstumsmedium regeneriert. Die transformierende DNA umfaßt ein selektierbares Markergen, das die Selektion von Zellen, die die transformierende DNA aufgenommen haben, erlaubt, da nur transformierte Zellen fähig sind, unter den angewandten selektiven Wachstumsbedingungen zu überleben und zu wachsen (die selektiven Wachstumsbedingungen sind eine Funktion des selektierbaren Markergens, das als Teil der transformierenden DNA eingesetzt wird).
Wenn Stämme von Pichia, bei denen das primäre Alkoholoxidase-Gen (AOX1) unterbrochen wurde, als Wirte für die Expression heterologer Strukturgene eingesetzt wurden, dann wurde überraschenderweise beobachtet, daß der Grad der Expression des heterologen Genprodukts, wenn es sich unter der Kontrolle bestimmter Promotoren (z. B. AOX1- oder DAS-Promotoren) befindet, um ein Mehrfaches erhöht wurde, verglichen mit dem Grad der Expression, der erzielt wurde, wenn ein vollständig Alkoholoxidase-kompetenter Wirt eingesetzt wurde. Als Ergebnis dieser Beobachtung und weiterer Untersuchungen dieses Phänomens ist festgestellt worden, daß es eine allgemeine Methode zur Erhöhung des Expressionsgrades in Wirtsorganismen für heterologe Strukturgene gibt, die das Züchten des Wirtstammes unter Nährstoffmangelbedingungen auf einem Substrat, für die eine starke, auf das Substrat ansprechende Promotorregion vorhanden ist, umfaßt, wobei das heterologe Gen sich unter der regulatorischen Kontrolle dieses starken, auf das Substrat ansprechenden Promotors befindet.
Die für die erfindungsgemäße verstärkte Genexpression erforderlichen "Nährstoffmangelbedingungen" können bereitgestellt werden, indem entweder die Zellen mit begrenzten Mengen eines Nährstoffs versehen werden oder indem ein mutierter Wirt, für den als Folge der Mutation unter bestimmten Wachstumsbedingungen hinsichtlich eines Nährstoffes ein Mangel besteht, eingesetzt wird. Wenn es also z. B. gewünscht ist, den Grad der Expression von heterologen Genen, die unter der Kontrolle der starken Alkoholoxidase- oder Dehydroxyacetonsynthase-Promotoren gehalten werden, zu verstärken, wobei beide Promotoren auf die Gegenwart von Methanol im Wachstumsmedium ansprechen, dann bewirken sowohl die Verwendung eines Wirts, der hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Nutzung von Methanol teilweise defekt ist, als auch die Anwendung Methanol-beschränkter Wachstumsbedingungen bei einem vollständig Alkoholoxidase-kompetenten Wirt die erforderlichen Nährstoffmangelbedingungen, so daß eine verstärkte Genexpression erzielt wird.
Man nimmt an, daß die Methode zur Verstärkung der Expression von heterologen Genprodukten, die in dieser Anmeldung beschrieben wird, eine allgemeine Methode ist, die für beliebige Organismen, für die Promotoren vorhanden sind, die auf einen Nährstoffmangel ansprechen, nützlich ist. Indem also ein heterologes Gen unter der Kontrolle einer derartigen Promotorregion angeordnet wird und der Wirtsorganismus anschließend unter Bedingungen einer Nährstoffbegrenzung im Hinblick auf den Nährstoff/die Nährstoffe, die bewirken, daß der starke Promotor angeschaltet wird, gezüchtet werden, sollte eine verstärkte Genexpression auftreten. Das gegenwärtig bevorzugte Mittel, um Nährstoff-begrenzte Wachstumsbedingungen bereitzustellen, besteht darin, einen mutierten Wirtsorganismus einzusetzen, der teilweise defekt hinsichtlich seiner Fähigkeit, den Nährstoff/die Nährstoffe zu metabolisieren, ist, was dazu führt, daß von einigen Promotoren in einem wesentlich höheren Grad exprimiert wird, als in einem nicht mutierten Wirt. Für Pichia ist dies, wie ausführlicher in Beispiel V beschrieben wird, gezeigt worden.
Wenn ein Stamm von Pichia pastoris, bei dem daß primäre Alkoholoxidase-Gen durch das erfindungsgemäße Verfahren zur genomischen Modifizierung unterbrochen wurde, mit Methanol als Kohlenstoffquelle gezüchtet wurde, dann wurde überraschenderweise festgestellt, daß derartige Stämme, die einen Defekt im primären Alkoholoxidase-Gen aufweisen, immer noch fähig waren, auf Methanol zu wachsen, allerdings mit einer verringertem Geschwindigkeit, bezogen auf Pichia-Zellen vom Wildtyp. Diese Beobachtung deutet das mögliche Vorhandensein eines zweiten Alkoholoxidase-Gens bei Methanol nutzenden Stämmen von Pichia an.
Das Absuchen einer Bibliothek von chromosomaler DNA aus Pichia führte zur Isolierung eines 3 kbp umfassenden Fragments, das für einen Abschnitt eines zweiten Alkoholoxidase-Gens (AOX2) zu codieren scheint. Das Fragment ist als Insert in pBR322 (an der einzigen BamHI-Stelle) hinterlegt worden. Das Plasmid wird als pPG3.0 bezeichnet und liegt im E. coli-Wirt LE392 vor. Dieser Stamm ist beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt worden, um einen öffentlichen Zugang bei Erteilung dieser Anmeldung als Patent sicherzustellen. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18022.
Eine Restriktionskarte von pPG3.0 ist in Fig. 16b gezeigt, wo es mit einem genomischen Fragment des primären Alkoholoxidase-Gens, pPG4.0, verglichen wird. Letzteres Fragment ist bereits offenbart und ausführlich beschrieben worden, und zwar von Strotman et al. in der US-Anmeidung mit der Seriennummer 666 391 (übertragen auf Phillips Petroleum Company). Ein Vergleich der beiden Alkoholoxidase-Gene (vgl. Fig. 16) macht deutlich, daß es sich bei den beiden Fragmenten nicht lediglich um überlappende Abschnitte des gleichen genomischen Locus handelt. Es besteht klar eine gewisse Homologie zwischen den beiden Fragmenten, wofür das Vorhandensein von mehreren gemeinsamen Restriktionsstellen in beiden Fragmenten ein Beleg ist. Die den beiden Genen AOX1 und AOX2 gemeinsamen Restriktionsstellen sind in Fig. 16 durch Sterne markiert. Die Existenz mehrerer Restriktionsstellen in jedem Fragment, die im anderen Fragment nicht vorhanden sind, zeigt jedoch an, daß mehrere Unterschiede zwischen den Fragmenten auf der Ebene der Nucleotide bestehen.
Die Erfindung wird nun ausführlicher mit Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele erläutert.

Beispiele

Die in den folgenden Beispielen eingesetzten Puffer und Lösungen haben die nachstehend angegebene Zusammensetzung:
1 m Tris-Puffer 121,1 g Tris-Base in 800 ml H&sub2;O; Einstellung des pH-Wertes auf den gewünschten Wert durch Zugabe konzentrierter (35%iger) wäßriger HCl; Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur vor der endgültigen pH-Wert-Einstellung; Verdünnen auf ein Endvolumen von 1 l.
TE-Puffer 1,0 millimolar EDTA in 0,01 m (pH-Wert: 7,4) Tris-Puffer
LB-Medium (Luria-Bertani Medium) 5 g Bacto-Trypton
5 g Bacto-Hefeextrakt
2,5 g NaCl
in 1 l Wasser, pH-Wert mit NaOH auf 7,5 eingestellt
2B-Medium 0,2% NH&sub4;PO&sub4;
1,2% Na&sub2;HPO&sub4;
0,013% MgSO&sub4;·7H&sub2;O
0,074% CaCl&sub2;·2H&sub2;O
2 ug/ml Biotin
1 ug/ml Thiamin
100 ug/ml Tryptophan
0,4% Dextrose
0,2% Casaminosäure
YPD-Medium 1% Bacto-Hefeextrakt
2% Bacto-Pepton
2% Dextrose
SD-Medium 6,75 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (DIFCO)
2% Dextrose in 1 l Wasser
SED 1 m Sorbit
25 millimolar EDTA
50 millimolar DTT
SCE-Puffer 9,1 g Sorbit
1,47 g Natriumcitrat
0,168 g EDTA
50 ml H&sub2;O
--pH-Wert mit HCl auf 5,8 eingestellt
CaS 1 m Sorbit
10 millimolar CaCl&sub2;
-- Sterilfiltration
PEG-Lösung 20% Polyethylenglykol-3350
10 millimolar CaCl&sub2;
10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4)
-- Sterilfiltration
SOS 1 m Sorbit
0,3 x YPD-Medium
10 millimolar CaCl&sub2;
Die nachstehenden Abkürzungen werden in den Beispielen mit der folgenden Bedeutung verwendet:
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
SDS Natriumdodecylsulfat
DTT Dithiothreit.

Beispiel 1

Transformationsverfahren für Pichia pastoris

A. Zellwachstum

1. Überimpfe eine Kolonie von Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) in etwa 10 ml YPD-Medium und züchte die Zellen 15 bis 20 Stunden unter Schütteln bei 30ºC.
2. Verdünne die Zellen nach etwa 12 bis 20 Stunden auf einen OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von etwa 0,01 bis 0,1 und halte die Zellen etwa 6 bis 8 Stunden bei 30ºC im YPD-Medium in der logarithmischen Wachstumsphase.
3. Impfe nach etwa 6 bis 8 Stunden 100 ml YPD-Medium mit 0,5 ml der Vorkultur bei einem OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von etwa 0,1 (oder einer äquivalenten Menge) an. Schüttle etwa 12 bis 20 Stunden bei 30ºC.
4. Ernte die Kultur, wenn der OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert etwa 0,2 bis 0,3 beträgt (nach etwa 16 bis 20 Stunden), durch Zentrifugation bei 1500 g für 5 Minuten.

B. Herstellung von Sphäroplasten

1. Wasche Zellen einmal mit 10 ml sterilem Wasser (Alle Zentrifugationen für die Stufen 1 bis 5 werden bei 1500 g für 5 Minuten durchgeführt).
2. Wasche Zellen einmal in 10 ml frisch bereitetem SED-Medium.
3. Wasche Zellen zweimal in 10 ml sterilem 1 m Sorbit.
4. Resuspendiere Zellen in 10 ml SCE-Puffer.
5. Gib 5 bis 10 ul von 4 mg/ml Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories) zu. Inkubiere Zellen etwa 30 bis 60 Minuten bei 30ºC.
Da die Herstellung von Sphäroplasten eine kritische Stufe im Transformationsverfahren ist, sollte die Bildung der Sphäroplasten wie folgt beobachtet werden: Gib Proben von 100 ul der Zellen zu 900 ul von 5% SDS und 900 ul von 1 m Sorbit vor oder unmittelbar nach der Zugabe von Zymolyase und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubationszeit. Beende die Inkubation zu dem Zeitpunkt, zu dem Zellen in SDS, nicht jedoch in Sorbit einer Lyse unterliegen (üblicherweise zwischen 30 und 60 Minuten Inkubation).
6. Wasche Sphäroplasten zweimal in 10 ml sterilem 1 m Sorbit durch Zentrifugation bei 1000 g für 5 bis 10 Minuten. (Die Zeit und Geschwindigkeit der Zentrifugation können variieren; zentrifugiere ausreichend, um die Sphäroplasten zu pelletieren, aber nicht so stark, daß sie durch die Kraft zerreißen.)
7. Wasche Zellen einmal in 10 ml sterilem CaS.
8. Resuspendiere Zellen in insgesamt 0,6 ml CaS.

C. Transformation

1. Gib DNA-Proben (bis zu 20 ul Volumen) in sterile Polypropylenröhrchen von 12·75 mm. (Die DNA sollte sich in Wasser oder in TE-Puffer befinden; für maximale Transformationsfrequenzen mit kleinen DNA-Mengen ist es ratsam, etwa 1 ul von 5 mg/ml mit Ultraschall behandelter E. coli- DNA zu jeder Probe zu geben.)
2. Gib 100 ul der Sphäroplasten zu jeder DNA-Probe und inkubiere etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Gib 1 ml an PEG-Lösung zu jeder Probe und inkubiere etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Zentrifugiere die Proben bei 1000 g für 5 bis 10 Minuten und dekantiere die PEG-Lösung.
5. Resuspendiere die Proben in 150 ul SOS und inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Gib 850 ul steriles 1 m Sorbit zu und plattiere Proben wie vorstehend beschrieben.

D. Regeneration der Sphäroplasten

1. Rezept für Regenerationsagarmedium:
a. Agar-KCl: 9 g Bacto-Agar, 13,4 g KCl, 240 ml H&sub2;O; autoklaviere.
b. 10·Glucose: 20 g Dextrose, 100 ml Wasser; autoklaviere.
c. 10·SC: 6,75 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 100 ml H&sub2;O, autoklaviere. (Gib beliebige gewünschte Aminosäuren oder Nucleinsäuren bis zu einer Konzentration von 200 ug/ml vor oder nach dem Autoklavieren zu.)
d. Gib 30 ml 10·Glucose und 30 ml 10·SC zu 240 ml der geschmolzenen Agar-KCl-Lösung. Gib 0,6 ml von 0,2 mg/ml Biotin und beliebige andere gewünschte Aminosäuren oder Nucleinsäuren in einer Konzentration von 20 ug/ml zu. Halte geschmolzenen Regenerationsagar bei 55 bis 60ºC.
2. Plattieren von Transformantenproben:
Gieße Bodenagarschicht aus 10 ml Regenerationsagar pro Platte mindestens 30 Minuten, bevor die Transformationsproben fertig sind. Verteile Proben von 10 ml des Regenerationsagars in Röhrchen in einem Bad bei 45 bis 50ºC in der Zeit, in der sich die Transformationsproben in SOS befinden. Gib die vorstehend beschriebenen Transformationsproben in die Röhrchen mit den Regenerationsagar und gieße sie auf die Bodenagarschicht der Platten.
3. Bestimmung der Qualität der Sphäroplastenzubereitung:
Entferne 10 ul einer Probe und verdünne 100fach durch Zugabe von 990 ul 1 m Sorbit. Entferne 10 ul der 100fachen Verdünnung und verdünne zusätzlich 100fach durch Zugabe einer zweiten Menge an 990 ul 1 m Sorbit. Streiche 100 ul beider Verdünnungen auf Agarplatten mit einem Gehalt an YPD-Medium, um die Konzentration von nicht in Sphäroplasten umgewandelten ganzen Zellen, die in der Zubereitung verblieben sind, zu bestimmen. Gib 100 ul jeder Verdünnung zu 10 ml Regenerationsagar, der mit 40 ug/ml Histidin angereichert ist, um die Gesamtmenge an regenerierbaren Sphäroplasten zu bestimmen. Gute Werte für einen Transformationsversuch sind 1 bis 3·10&sup7; gesamte regenerierbare Sphäroplasten/ml und etwa 1·10³ ganze Zellen/ml.
4. Inkubiere die Platten 3 bis 5 Tage bei 30ºC.

Beispiel II

Gerichtete Insertion des Saccharomvces-ARG4-Gens und von pBR322 und Deletion des Pichia-HIS4-Gens in GS190 (NRRL Y-18014)

Fig. 1 zeigt Plasmid pYMI1, und Fig. 2 zeigt ein Diagramm von Ereignissen, die zur gerichteten Insertion des Plasmids in das Genom von P. pastoris führen. Der Vektor wurde entworfen, um das ARG4-Gen von Saccharomyces und DNA-Sequenzen von pBR322 in den HIS4-Locus von Pichia zu inserieren, wobei gleichzeitig der gesamte HIS4-Gen-Locus aus dem Pichia- Genom deletiert wird. Weitere Sequenzen, wie Expressionskassetten, können leicht in pYMI1 inseriert und anschließend auf ähnliche Weise in das Genom von P pastoris einverleibt werden.
Das Plasmid pYMI1 besteht aus einem EcoRI-BamHI-Fragment, das in situ am 5'-Ende des HIS4-Gens von Pichia angeordnet ist, und einem EcoRI- ClaI-Fragment, das am 3'-Ende des HIS4-Gens von Pichia angeordnet ist. Beide das HIS4-Gen flankierende Fragmente können aus dem Plasmid pYJ8 (erhältlich in E. coli als Wirt vom Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, als NRRL B-15889; vgl. Fig. 3) erhalten werden, und sie sind etwa 400 bp lang und in pYMI1 an ihren EcoRI-Enden verknüpft. Als einen selektierbaren Marker enthält der pYMI1-Vektor ein 2,6 kbp umfassendes HindIII-SaII-Fragment aus pYM25 (erhältlich in E. coli als Wirt als NRRL B-18015; vgl. Fig. 17), das für Argininsuccinatlyase aus Saccharomyces (das ARG4-Genprodukt) codiert. Wenn pYMI1 mit EcoRI geschnitten wird, dann wird es linear, wobei die das HIS4-Gen flankierenden Fragmente sich an seinen Enden befinden.
Der P. pastoris arg4-Stamm GSI90 (NRRL Y-18014) wurde mit dem mit EcoRI geschnittenen pYMI1 transformiert, wobei man einen Arginin-prototrophen Stamm (Arg&spplus;) erhielt. Das Regenerationsagarmedium wurde mit 40 ug/ml Histidin angereichert, um zu verhindern, daß ein Selektionsdruck gegenüber Transformanten, die Histidin als Folge der HIS4-Gendeletion erforderten, ausgeübt wurde.
Die Arg&spplus;-Transformanten wurden anschließend auf Transformanten abgesucht, die als Folge der Deletion des HIS4-Gens His geworden waren. Zum Absuchen auf His -Transformanten wurde der Regenerationsagar mit den eingebetteten Arg&spplus; -Kolonien in ein steriles, 50 ml fassendes Röhrchen, das 25 ml steriles Wasser enthielt, überführt. Der Agar wurde anschließend durch Mischen mit einem Homogenisator der Bezeichnung Brinkman Instruments Polytron bei der Einstellung 5 für 1 Minute pulverisiert. Die Hefezellen wurden von dem Agar durch Filtration über drei Schichten steriler Gaze abgetrennt. Ein Teil der Hefezellen wurde anschließend mit Ultraschall behandelt, verdünnt und auf SD-Medium-Agarplatten, die mit 40 ug/ml Histidin angereichert waren, ausgestrichen.
Für die Behandlung mit Ultraschall wurden Proben der Zellen auf einen A&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 0,1 verdünnt und 10 Sekunden in einer Vorrichtung der Bezeichnung Sonifier Cell Disrupter 350 (Branson Sonic Power Co.) bei einer Leistungseinstellung von 4 mit Ultraschall behandelt, wobei diese Behandlung ausreichend ist, um die Zellen zu trennen, ohne die Überlebensfähigkeit der Zellen zu verringern. Nach 2 bis 3 Tagen wurden Kolonien, die auf den SD plus Histidin-Agarplatten gewachsen waren, auf einen Satz von SD-Platten, eine mit und eine ohne Histidin, replicaplattiert.
Der Anteil der Arg&spplus; His&supmin;-Kolonien betrug im Mittel 0,7 Z der gesamten Arg+-Transformanten. Genomische DNA aus drei Arg&spplus; His&supmin;-Stämmen wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung untersucht. Das gesamte HIS4-Gen fehlte in allen drei, und das lineare Plasmid war inseriert, wie unten in Fig. 2 gezeigt ist.
Außer der Tatsache, daß der Stamm GS190-pYMI1 Histidin, aber kein Arginin mehr für sein Wachstum erfordert, wurden keine weiteren Änderungen hinsichtlich der erforderlichen Nährstoffe oder der Wachstumsraten beobachtet.

Beispiel III

Deletion des HIS4-Gens von P. pastoris NRRL Y-11430

Fig. 4 zeigt das Plasmid pYMI3a, und Fig. 5 zeigt Ereignisse, die zur linearen Insertion eines Fragments aus dem Plasmid in den HIS4-Locus des Stammes P. pastoris NRRL Y-1143O führen. Der Vektor enthält das G418- Resistenzgen (G418®) aus pBPG1-1 (erhältlich vom United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, in E. coli als Wirt als Stamm NRRL B-18020; vgl. Fig. 6) als selektierbaren Marker. Das G418®-Gen wurde aus pBPG1-1 auf einem ungefähr 2,2 kbp umfassenden BamHI (pBR322-Stelle)/BglII (PARS1-Stelle)-Fragment entnommen und in die BglII-Stelle von pYJ8 (NRRL B-15889; vgl. Fig. 3) inseriert, wobei das 2,7 kbp umfassende BglII-Fragment, das das HIS4-Gen aus Pichia enthält, ersetzt wurde.
Der Vektor pYMI3a wurde mit EcoRI verdaut, wobei man ein 2,9 kbp umfassendes Fragment erhielt, das das G418®-Gen enthielt, das von etwa 450 und 250 bp DNA aus der unmittelbar in 5'-Position bzw. in 3'-Position des HIS4-Gens angeordneten Region flankiert wurde. Das mit EcoRI geschnittene Plasmid wurde in den P. pastoris-Wirt transformiert.
Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, in Gegenwart von 300 ug/ml des Antibiotikums G418 zu wachsen, selektiert. Für die G418-Selektion wurde das Regenerationsagarmedium im Hinblick auf das in Beispiel I, Teil D beschriebene Medium, wie folgt modifiziert:
1. Rezept für Regenerationsagarmedium:
a. Agar-Sorbit: 9 g Bacto-Agar, 54,6 g Sorbit, 240 ml H&sub2;O; autoklaviere.
b. 10·Glucose: 20 g Dextrose, 100 ml H&sub2;O; autoklaviere.
c. 10·YP: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 100 ml H&sub2;O, autoklaviere.
d. Gib 30 ml von 10·Glucose und 30 ml von 10·YP zu 240 ml geschmolzener Agar-Sorbit-Lösung. Halte das geschmolzene Regenerationsagarmedium bei 55 bis 60ºC.
2. Plattieren von Transformanten. Probe:
Mindestens 30 Minuten bevor die Transformationsproben fertig waren, wurden 10 ml/Platte Bodenagarschicht des Regenerationsagarmediums, das mit 600 ug/ml G418 angereichert war, gegossen. In der Zeit, in der sich die Transformantenproben in SOS befanden, wurden Proben von 10 ml des Regenerationsagarmediums (ohne G418) in Röhrchen in einem Bad bei 45 bis 50ºC verteilt. Wenn die Transformantenproben fertig waren, wurden Proben davon in die Röhrchen mit dem Regenerationsagar gegeben und auf 10 ml Bodenagarschicht mit einem Gehalt an G418 gegossen. Die Platten wurden 3 bis 5 Tage bei 30ºC inkubiert.
Nachdem sich Kolonien auf den Regenerationsagarplatten mit G418 gebildet hatten, wurden die Zellen auf ihre Fähigkeit, ohne Histidin zu wachsen, untersucht. Zellen wurden aus dem Regenerationsagar extrahiert, mit Ultraschall behandelt und auf SD-Medium-Agarplatten, die mit 40 ug/ml Histidin angereichert waren, ausgestrichen, wie es in Beispiel II beschrieben ist. Nach 2 bis 3 Tagen Inkubation bei 30ºC wurden die Kolonien auf SD-Medium-Agar-Platten mit und ohne Histidin replicaplattiert.
Ungefähr 0,1% der G418®-Kolonien waren His (2 von ungefähr 2000 abgesuchten). Southern-Blot-Hybridisierungs-Versuche zeigten, daß das HIS4-Gen aus dem Genom der beiden His&supmin;-Stämme deletiert war und daß beide Genome das G418®-Gen enthielten, wie es in Fig. 5 gezeigt ist. Einer dieser His&supmin;-Stämme, dem die Laborbezeichnung KM31 gegeben wurde (erhältlich vom United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Center in Peoria, Illinois, als NRRL Y-18018), wurde erfolgreich mit mehreren HIS4 enthaltenden, auf Pichia basierenden Plasmiden, wie pSAOH5 (erhältlich in E. coli als Wirt als NRRL B-15862), transformiert, was weiter belegt, daß es sich bei KM31 um einen Organismus mit einer spezifischen HIS4-Gen-Deletion.
Dies ist das erste Mal, daß P. pastoris NRRL Y-11430 vom "Wildtyp" direkt (d. h. ohne zuerst ein auxotrophes Derivat zu isolieren und zu charakterisieren) transformiert wurde. Ein möglicher Vorteil dieser HIS4-mutierten Stämme besteht darin, daß sie, da sie durch die gerichtete Insertions/Deletions-Methode konstruiert wurden, frei von sekundären Mutationen sind, die wahrscheinlich in auxotrophen Pichia-Wirten bestehen, die z. B. durch chemische Mutagenese hergestellt wurden, wie GSI15 (NRRL Y- 15851) und GS19O (NRRL Y-18014).
Es ist darauf hinzuweisen, daß die Deletion des Pichia-HIS4-Gens aus dem Pichia-Genom durch Insertion des EcoRI-Fragments aus pYMI3a nicht zur Addition großer Abschnitte von pBR322 führte (wie es auftrat, wenn pYMI1 inseriert wurde; vgl. Beispiel 11). Da die meisten autonomen ARS- basierten Pichia-Expressionsvektoren, wie pSAOH5 (vgl. Fig. 9), hauptsächlich aus Sequenzen von pBR322 und dem Pichia HIS4-Gen bestehen, weisen diese autonomen Vektoren eine geringe Homologie mit dem Genom dieser Pichia HIS4-Deletionswirte auf, und sie sollten daher nicht häufig integriert werden.

Beispiel IV

Unterbrechen des primären Alkoholoxidase-Gens Pichia-Stämme, denen die Alkoholoxidase-Gene fehlen (das primäre Alkoholoxidase-Gen wird hier als AOX1 und das sekundäre Alkoholoxidase- Gen als AOX2 bezeichnet), sind mindestens aus zwei Gründen von Interesse. Erstens als eine Hilfe bei Untersuchungen zur Regulation der Genexpression durch Methanol. Z.B. können, wie in Beispiel VII ausführlicher beschrieben wird, mit einem mutierten Stamm, bei dem die Gene AOX1 und AOX2 defekt sind, Hinweise darauf erhalten werden, ob es sich bei Methanol oder bei einigen anderen Metaboliten (Formaldehyd, Format und dergl.) um das tatsächlich induzierende Molekül der durch Methanol regulierten Gene handelt. Zweitens besteht ein Interesse an einem AOX-defektes Pichia- Stamm, da die Möglichkeit besteht, daß ein derartiger Stamm heterologe Genprodukte in höheren Konzentrationen exprimiert, wie ausführlicher in den Beispielen V und VI beschrieben wird.
Um das AO-Gen zu unterbrechen, wurde das Plasmid pYMI7 erzeugt (Fig. 7). Das Plasmid wurde durch Insertion eines 2,9 kbp umfassenden RamHI-SalI-Fragments aus dem Plasmid pYM25 (NRRL B-18015; vgl. Fig. 17), das das ARG4-Gen aus Saccharomyces enthält, in das mit BamHI-geschnittene pPG4.0 (NRRL B-15868; vgl. Fig. 16a für eine Restriktionskarte des Pichia-Abschnitts dieses Plasmids) konstruiert. Die Insertion führt zu einer Deletion von etwa 600 bp aus dem 5'-Abschnitt des AOX1-Gens (etwa 1/4 des Gens). Das Plasmid pYMI7 wurde durch Verdau mit PvuII und EcoRI linearisiert und in PPF1 (arg4 his4, NRRL Y-18017) durch Selektion auf Arg&spplus;-prototrophe Zellen transformiert. Die Transformanten wurden aus dem Regenerationsagar extrahiert und mit Ultraschall behandelt, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. Sie wurden auf SD-Medium-Agarplatten mit einem Gehalt an 0,1% Glucose (anstelle von 2%) und 40 ug/ml Histidin aus gestrichen. Resultierende Kolonien wurden anschließend auf einen Satz von SD-Medium-Agarplatten (mit einem Gehalt an Histidin) mit den folgenden Kohlenstoffquellen replicaplattiert: 1) kein Kohlenstoff; 2) 0,5% Methanol; und 3) 2% Glucose. Etwa 81,0% der Arg&spplus;-Kolonien konnten nicht normal auf Methanol wachsen. Southern-Blot-Analyse der genomischen DNA von zwei dieser Methanol nicht nutzenden Stämme, d. h. KM71 und KM72, bestätigte, daß das AOX1-Gen in diesen Stämmen unterbrochen war und daß der Vektor inseriert war, wie es unten in Fig. 8 gezeigt ist.
Die hinsichtlich Alkoholoxidase defekten PPFI-pYM17-Konstrukte mit dem Genotyp (his4 aox1::SARG4) sind von großem potentiellem Wert. Da z. B. der Stamm his4 ist, können Pichia-Vektoren, die das HIS4-Gen als einen selektierbaren Marker enthalten, wie pSAOH5 (NRRL B-15862; vgl. Fig. 9), in diesen Wirt transformiert werden, wie es ausführlicher im nachstehenden Beispiel V beschrieben wird.

Beispiel V

Durch Methanol regulierte Expression des lacZ-Gens in einem hinsichtlich Alkoholoxidase defekten Mutantenstamm von Pichia pastoris

Dieses Beispiel beschreibt Versuche zur Expression des lacZ-Gens im Pichia-Wirt KM71 (eine hinsichtlich Alkoholoxidase defekte PPF1-pYMI7- Konstruktion), die, wie in Beispiel IV beschrieben, hergestellt wurde.
Bei dem Aox1&supmin;-Wirt für diese Vergleichsversuche handelte es sich um KM71 (his4 aox1::SARG4) und bei dem Aox1&spplus;-Wirt um PPF1 (arg4 his4; NRRL Y-18017). Die in beide Stämme transformierte AOX1-Promotor-lacZ-Expressionskassette befand sich auf dem PlasmidpSAOH5 (vgl. Fig. 9, NRRL B- 15862). Mehrere stabile His&spplus;-Transformanten beider Stämme wurden isoliert. Ihre genomische DNA wurde durch Southern-Blot-Analyse untersucht, um einen Satz von übereinstimmenden Stämmen zu erhalten, die jeweils pSAOH5 am AOX1-Promotor-Locus integriert enthielten. In ähnlicher Weise wurde das Dihydroxyacetonsynthase (DAS)-Promotor-lacZ-Fusionsgen in KM71 und PPFI auf dem Plasmid pT76H3 (vgl. Fig. 18; NRRL B-18000) durch Selektion auf Histidinprototrophie transformiert.
Jeder der vier Stämme wurde zunächst in einem SD-Medium gezüchtet, mit der Ausnahme von 2·Glycerin als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle anstelle von 2·Glucose. Jede der Kulturen wurde anschließend umgestellt, d. h. durch Zentrifugation gesammelt und in ein anderes Medium, d. h. SD-Medium mit 0,5% Methanol als einziger Kohlenstoffquelle, übertragen. Proben dieser Kulturen wurden auf β-Galactosidase untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I β-Galactosidase, Einheiten/ug* Zeit, Std. Aox1&spplus;-Wirt Aox1&supmin;-Wirt Promotor→ AOX1 DAS *β-Galactosidase-Assay A. Erforderliche Lösungen: 1. Z-Puffer: Endkonzentration Na&sub2;HPO&sub4;·7H&sub2;O NaH&sub2;PO&sub4; KCl MgSO&sub4;·7H&sub2;O 2-Mercaptoethanol fülle auf 1 l auf; der pH-Wert sollte 7 betragen.
2. o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG) Löse 400 mg ONPG (Sigma N-1127) in 100 ml destilliertem Wasser, um eine Lösung mit 4 mg/ml ONPG herzustellen.

B. Assay:

1. Entnehme eine Probe aus dem Kulturmedium (20 bis 50 OD&sub6;&sub0;&sub0; an Hefezellen), zentrifugiere und wasche das Zellpellet mit kaltem sterilem Wasser.
2. Gib 1 ul 40%igen Z-Puffer und 0,2 ug mit Säure gewaschener Glaskügelchen (0,45 bis 0,50 mm) zum Zellpellet. Halte alle Proben auf Eis. Behandle das Gemisch mit einer Vortex-Vorrichtung bei der höchsten Einstellung viermal für jeweils 1 Minute. Die Proben sollten zwischen den Behandlungen mindestens 1 Minute auf Eis gehalten werden.
3. Übertrage Lysate in Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere Minuten in einer Mikrozentrifuge bei 4ºC. Übertrage die Überstände in frische Mikrozentrifugenröhrchen und halte die Extrakte auf Eis.
4. Die Konzentration an gesamtem Protein im Extrakt wurde nach der Bio-Rad-Laboratories-Proteinassay-Methode (Bradford) bestimmt. Dazu wurde das konzentrierte Bio-Rad-Farbreagenz mit dem vierfachen Volumen an entionisiertem Wasser verdünnt und durch Whatman-3MM-Papier filtriert. Eine Eichkurve wurde dann durch Zugabe von 3, 10, 30 und 100 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 100 uL Z-Puffer zu einem Satz von Glasröhrchen (13·100 mm), die jeweils 2,5 ml des Farbstoffreagenzes enthielten, aufgestellt. Die Proben wurden gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, und ihre optischen Dichten bei 595 nm wurden bestimmt. Bei den Extrakten wurden Proben von 3, 10 und 30 ul mit einer Lösung mit einem Gehalt an Z-Puffer auf 100 ul gebracht und, wie vorstehend beschrieben, auf den Proteingehalt untersucht. Der Wert der Proteinkonzentration für jeden Extrakt wurde dann unter Verwendung der BSA-Eichkurve interpoliert.
5. Beim β-Galactosidase-Assay wurden 10 ul einer 10·Verdünnung des Extraktes zu ml Z-Puffer gegeben, und das Gemisch wurde 5 Minuten bei 30ºC inkubiert.
6. Starte die Reaktion durch Zugabe von 0,2 ml ONPG (4 mg/ml), unterwerfe das Gemisch einer Vortex-Behandlung.
7. Beende Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml einer 1 m Na&sub2;CO&sub3;-Lösung zu geeigneten Zeitpunkten (üblicherweise zwischen 1 und 30 Minuten und bei A&sub4;&sub2;&sub0;< 1).
8. Lies Extinktion des Überstandes bei 420 nm ab.

C. Berechnung der β-Galactosidase-Aktivitätseinheiten:

1 U = 1 nMol pro Minute bei 30ºC und einem pH-Wert von 7 gebildetes o-Nitrophenol (ONP).
1 nMol ONP hat bei 420 nm (A&sub4;&sub2;&sub0;) bei 1 cm Schichtdicke eine Extinktion von 0,0045; eine Extinktion von 1 bei 420 nm entspricht also 222 nMol ONP/ml oder 378 nMol/1,7 ml, da das Gesamtvolumen des analysierten Überstandes 1,7 ml beträgt. In den Tabellen angegebene Einheiten wurden also wie folgt berechnet.
U - A&sub4;&sub2;&sub0;/t(min)·378
Jede der vier Kulturen zeigte fast keine nachweisbare β-Galactosidase-Aktivität während der Glycerin-Wachstumsphase. Etwa 10 bis 20 Stunden nach Umstellung auf ein Methanol-Medium zeigten die beiden Kulturen, die die AoX1-lacZ- bzw. die DAS-lacZ-Expressionskassette im Aox1&spplus;-Wirt enthielten, eine sich bei etwa 20 Einheiten β-Galactosidase-Aktivität pro ug Protein einpegelnde β-Galactosidase-Aktivität. Die AOX1-lacZ-Kassette im Aox1&supmin;-Wirt zeigte jedoch eine Aktivität, die etwa 60 Einheiten pro ug erreichte. Auch die DAS-lacZ-Kassette im Aox1&supmin;-Wirt zeigte einen Anstieg des β-Galactosidase-Aktivitätsspiegels. Der transformierte Aox1&supmin;-Wirt KM71 exprimierte also β-Galactosidase bei einer 2 bis 3fachen Konzentration, bezogen auf den transformierten isogenen Aox1&spplus;-Stamm PPF1.

Beispiel VI

Insertion des Hepatitis B-Oberflächenantigen-Gens und Deletion des AOX1-Gens

In diesem Beispiel einer gerichteten Insertion/Deletion wurde die gesamte codierende Sequenz des AOX1-Gens deletiert, und das Hepatitis β- Oberflächenantigen-Gen (HBsAg) wurde unter der Kontrolle des AOX1-Gen- Promotors, der im Genom verblieb, inseriert. Für die Konstruktion dieses P. pastoris-Wirts wurde das Plasmid pBSAGI5I erzeugt (hinterlegt in E. coli als Wirt beim Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, in Peoria, Illinois, und ohne Einschränkung der Öffentlichkeit bei Erteilung des Patents für diese Anmeldung unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18021 zugänglich; Fig. 12). Das Plasmid enthält ein 1,0 kbp umfassendes Fragment aus das 5'-Ende des AOX1-Gens flankierenden Sequenzen, gefolgt von der Hepatitis B-Oberflächenantigen- Sequenz (HBsAg-Sequenz) und dem 300 bp umfassenden AOX1-Terminatorfragment, wobei alle Fragmente so angeordnet sind, wie es in den Fig. 9, 10 und 11 gezeigt ist. Der Expressionskassette folgte ein 2,7 kbp umfassendes Fragment, das für das Pichia-HIS4-Gen codiert, und schließlich ein 1,5 kbp umfassendes PvuII-Fragment, das Sequenzen in 3'-Richtung vom AOX1-Gen enthält. Wenn pBSAGI5I mit BglII verdaut wurde, dann wurde ein 7,2 kbp umfassender linearer Vektor freigesetzt, der 0,85 kbp der 5'- AOX1-Gensequenz an einem Ende und 1,1 kbp der 3'-AOX1-Sequenz am anderen Ende enthielt. Das mit BglII geschnittene pBSAGI5I wurde in GS115 durch Selektion auf Histidinprototrophie transformiert. Die Transformanten wurden aus dem Regenerationsagar extrahiert und mit Ultraschall behandelt, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. Anschließend wurden sie auf SD-Medium-Agarplatten mit 0,1% Glucose (anstelle von 2,0%) ausgestrichen. Die resultierenden Kolonien wurden dann auf minimale Agarplatten mit folgenden Kohlenstoffquellen replicaplattiert: 1) keine Kohlenstoffquelle, 2) 0,5 Z Methanol und 3) 2% Glucose. Im Mittel konnten 32% der untersuchten Kolonien nicht normal auf Methanol wachsen.
Die Southern-Blot-Analyse genomischer DNA aus zwei Methanol nicht nutzenden Kulturen zeigte, daß das AOX1-Gen deletiert war und daß die Vektorsequenzen, wie in Fig. 13 gezeigt, inseriert waren.
Beim Züchten in Methanol exprimierte der GS115-pBSAGI5I-Stamm (aox1::HBsAg-HIS4) HBsAg in höheren Konzentrationen, als es von ähnlich transformierten Zellen, die hinsichtlich Alkoholoxidase voll kompetent waren, exprimiert wurde.

Beispiel VII

Identifikation des zweiten Alkoholoxidase-Gens von P. pastoris durch die gerichtete Insertionstechnik

Das Vorhandensein eines zweiten Alkoholoxidase-Gens kann aus folgenden Beobachtungen geschlossen werden: 1) Southern-Blots, bei denen Sonden entweder von AOX-cDNA oder einer genomischen DNA mit durch Restriktionsenzyme verdauter genomischer Pichia-DNA hybridisiert wurden, zeigten mindestens zwei Banden; 2) ursprünglich wurden zwei genomische Pichia-DNA-Fragmente isoliert, die zueinander ähnlich, jedoch nicht identisch waren (vgl. Fig. 16); und 3) mutierte Pichia-Stämme, wie KM71 und GS115-pBSAGI5I, bei denen das primäre AOX-Gen (AOX1) deletiert oder unterbrochen war, konnten immer noch auf Methanol wachsen und enthielten eine Alkoholoxidase-Aktivität. Die Wachstumsrate und die AOX-Aktivität bei auf Methanol gezüchteten Zellen dieser Aox&supmin;-Stämme waren wesentlich geringer als bei isogenen Aox1&spplus;-Stämmen. Daher scheint es, daß das zweite AOX-Gen (AOX2) bei einer niedrigeren Konzentration exprimiert wird oder daß sein Produkt weniger aktiv im Hinblick auf Methanol ist. In Beispiel IV wurde gezeigt, daß das Pichia-DNA-Fragment in pPG4.0 das AOX1-Gen enthält.
Die überzeugendste Methode, um zu zeigen, daß das genomische DNA- Fragment aus pPG3.0 mindestens einen Abschnitt des AOX2-Gens enthält, besteht in der Konstruktion eines mutierten Stammes, bei dem das vermutete AOX2-Gen unterbrochen oder deletiert worden ist. Dazu wurde der gerichtete Vektor pYMI12a konstruiert (Fig. 14). Das Plasmid besteht hauptsächlich aus pPG3.0 (Fig. 16b), das das vermutete AOX2-Gen in einem 3,0 kbp umfassenden BamHI-Fragment enthält. Ein 2,7 kbp umfassendes BglII-Fragment, das das Pichia-HIS4-Gen enthält, wurde aus pYJ8 isoliert (Fig. 3; NRRL B-15889) und an die Stelle der Sequenzen inseriert, die zwischen der BglII-Stelle und der am weitesten links befindlichen KpnI-Stelle von pPG3.0 angeordnet waren. (Die KpnI-Stelle wurde vor der Insertion mit einem Oligonucleotidadapter in eine BglII-Stelle umgewandelt; die BamHI- Stelle des HIS4-Gens wurde durch Auffüllen vor der Insertion in pPG3.0 zerstört.) Ein Vergleich des AOX1-Gens und des vermuteten AOX2-Gens (Fig. 16) zeigt, daß diese Konstruktion zur Deletion von etwa 800 bp aus dem mittleren Abschnitt von AOX2 führen sollte. Durch Verdau von pYMI12a mit BamHI wurde ein 4,5 kbp umfassender linearer Vektor freigesetzt der das HIS4-Gen-Fragment enthielt, das von 1,1 kbp bzw. 0,7 kbp umfassenden Fragmenten des vermuteten A0X2-Locus flankiert wurde (vgl. Fig. 15).
Dieser lineare Vektor wurde in den Aox1&supmin;-Stamm KM71 (aox1 his4::SARG4) transformiert, und die Transformanten wurden durch Selektion auf Histidinprototrophie isoliert. Die Transformanten wurden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Nutzung von Methanol durch Replikaplattierung auf Sätze von Agarplatten untersucht.
Der nicht transformierte Aox1&supmin;-Stamm KM71 wuchs auf Methanol-Platten so langsam, daß, wenn Methanol in den Agar gegeben wurde, es verdampfte, bevor ein nennenswertes Wachstum beobachtet werden konnte. Dieses Problem wurde gelöst, indem den Zellen Methanol in der Gasphase zugeführt wurde. Bei diesem Verfahren wurden etwa 0,2 ml 100%iges Methanol unter dem Deckel der Platte angeordnet, die keine Kohlenstoffquelle im Agarmedium enthielt. Man beließ die Platte bei Raumtemperatur, und der Deckel wurde alle 2 bis 4 Tage durch einen frisches Methanol enthaltenden Deckel ersetzt. Nach etwa 1 bis 2 Wochen war der Unterschied im Methanol- Wachstum des Wildtyps (Aox1&spplus; Aox2&spplus;) und der mutiertem Stämme (Aox1&supmin; Aox2&spplus;) und (Aox1&supmin; Aox2&supmin;) klar.
Nach dem Zuführen des Methanols in der Gasphase wurde festgestellt, daß etwa 0,1% der His&spplus;-Transformanten des Aox1&supmin;-Stammes unfähig waren, auf Methanol zu wachsen. DNAs aus acht Aox1&supmin; Aox2&supmin; His&spplus;-Transformanten wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung analysiert. Drei dieser DNA-Proben enthielten den linearen pYMI12a-Vektor, der, wie in Fig. 15 gezeigt, inseriert war. Die Analyse einer Aox1&supmin; Aox2&supmin;-Doppelmutante KM7121 (NRRL Y-18019) zeigte, daß der Stamm absolut nicht auf Methanol wächst und daß der Stamm keine nachweisbare AOX-Aktivität aufweist. Aus diesen Ergebnissen mit KP7121 ist klar, daß das Pichia-Fragment in pPG3.0 Sequenzen eines zweiten AOX-Gens enthält und daß außer diesen beiden Alkoholoxidasen keine weitere Methanol-oxidierende Aktivität in P. pastoris besteht.
Die Beispiele sind lediglich vorgelegt worden, um die Ausführung der Erfindung zu erläutern, und sie sollten nicht dahingehend verstanden werden, daß sie den Schutzumfang der Erfindung oder der beigefügten Ansprüche in irgendeiner Weise beschränken. Vernünftige Variationen und Modifikationen, die nicht vom Wesen und Geist der Erfindung abweichen, liegen im Umfang des gewünschten und nachgesuchten Patentschutzes.

Claims

1. Verfahren zur hochgradigen Expression von Polypeptiden in einem Hefewirt, gekennzeichnet durch Einsatz eines Stammes der Gattung Pichia als Hefewirt zur hochgradigen Genexpression,

Transformation des Hefewirts mit einem seriell angeordneten linearen DNA-Fragment, das

ein erstes inserierbares DNA-Fragment,

eine starke, auf Substrat ansprechende regulatorische Region,

ein heterologes Strukturgen,

ein selektierbares Markergen und

ein zweites inserierbares DNA-Fragment umfaßt;

wobei das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment jeweils eine Länge von etwa 200 Nucleotiden besitzen und Nucleotidsequenzen aufweisen, die zu getrennten Abschnitten des nativen Hefewirtgenoms homolog sind;

wobei das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment in bezug zueinander in dem linearen DNA-Fragment in der gleichen Weise orientiert sind, wie sie in dem Hefewirtgenom orientiert sind;

wobei das heterologe Strukturgen sich unter der Kontrolle der regulatorischen Region befindet;

wobei das Konstrukt aus regulatorischer Region/heterologem Gen sowie das selektierbare Markergen zwischen dem ersten und dem zweiten inserierbaren DNA-Fragment angeordnet sind, und

Züchten des auf diese Weise transformierten Hefewirts unter Nährstoffmangelbedingungen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährstoffmangelbedingungen durch Zufuhr begrenzter Mengen des Substrats als Nährstoff zu den Zellen bereitgestellt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährstoffmangelbedingungen durch Einsatz eines mutierten Wirts bereitgestellt werden, der als Folge der Mutation teilweise defekt hinsichtlich seiner Fähigkeit ist, das Substrat zu metabolisieren.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Substrat um Methanol handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtstamm der Gattung Pichia, der mit dem seriell angeordneten linearen DNA-Fragment transformiert werden soll, ein unterbrochenes primäres Oxidase-Gen (AOX1-Gen) trägt und daß das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment unter Fragmenten mit einer Länge im Bereich von etwa 200 bis 5000 Basenpaare

des Dihydroxyacetonsynthase-Gens,

des Argininsuccinatlyase-Gens,

des Histidinoldehydrogenase-Gens und

des Alkoholoxidase-Gens ausgewählt sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtstamm der Gattung Pichia, der mit dem seriell angeordneten linearen DNA-Fragment transformiert werden soll, ein intaktes primäres Oxidase-Gen (AOX1-Gen) trägt und daß das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment unter Fragmenten mit einer Länge im Bereich von etwa 200 bis 5000 Basenpaaren des primären Oxidase-Gens (AOX1-Gens) ausgewählt sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment durch eine der in den Fig. 1, 4, 7, 12 oder 14 gezeigten Restriktionskarten identifiziert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Wirtstamm der Gattung Pichia um dem Stamm Pichia pastoris handelt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Wirt der Gattung Pichia pastoris um Pichia pastoris (GS115 NRRL Y-15851), Pichia pastoris (GS190 NRRL Y-18014), Pichia pastoris (KM31 NRRL Y-18018), Pichia pastoris (KM71, erhältlich durch Transformation des Stammes PPF1 mit dem Plasmid pYM17 (Fig. 7)) oder Pichia pastoris (PPF1 NRRL Y-18017) handelt.

10. Verwendung eines seriell angeordneten linearen DNA-Fragments in einem Verfahren nach Anspruch 1, umfassend

ein erstes inserierbares DNA-Fragment,

eine starke, auf Substrat ansprechende regulatorische Region,

ein heterologes Strukturgen,

ein selektierbares Markergen und

ein zweites inserierbares DNA-Fragment;

wobei das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment in bezug aufeinander in dem linearen DNA-Fragment so orientiert sind, wie sie in dem Hefewirtgenom orientiert sind;

wobei das Konstrukt aus regulatorischer Region/heterologem Strukturgen sowie das selektive Markergen zwischen dem ersten und dem zweiten inserierbaren DNA-Fragment angeordnet sind.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment unter Fragmenten mit einer Länge im Bereich von etwa 200 bis 5000 Basenpaaren

des Dihydroxyacetonsynthase-Gens,

der Alkoholoxidase-Gene,

des Argininsuccinatlyase-Gens und

des Histidinoldehydrogenase-Gens ausgewählt sind.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite inserierbare DNA-Fragment durch eine der in den Figuren 1, 4, 7, 12 oder 14 gezeigten Restriktionskarten identifiziert werden.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das lineare DNA-Fragment ferner bakterielle Plasmid-DNA umfaßt.

14. Verwendung eines geschlossenen kreisförmigen Plasmids, umfassend den linearen DNA-Abschnitt nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und bakterielle Plasmid-DNA.