DE202019005554U1 - Rekombinant exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide und Präparate und Formulierungen, die diese enthalten - Google Patents

Rekombinant exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide und Präparate und Formulierungen, die diese enthalten Download PDF

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Abstract

Eine Zusammensetzung umfassend:
a) ein Joghurtprodukt; und
b) ein Miraculin-Polypeptid oder funktionelles Fragment davon in einer getrennten Formulierung, die mit dem Joghurtprodukt zu konsumieren ist.

Description

  • QUERVERWEIS
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen U.S.-Anmeldungen Nrn. 62/639,363, eingereicht am 6. März 2018, und 62/640,491 , eingereicht am 8. März 2018, welche Anmeldungen hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis eingegliedert sind.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • Die vorliegende Anmeldung enthält ein Sequenzprotokoll, welches elektronisch im ASCII-Format eingereicht wurde und hierbei durch Verweis in seiner Gesamtheit eingegliedert wird. Jene ASCII-Kopie, erstellt am 5. März 2019, heißt 53394-701_601_SL.txt und hat eine Größe von 16854 Bytes.
  • HINTERGRUND
  • Geschmacksmodifizierende Wirkstoffe sind in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich aber nicht beschränkt auf menschlichen Verzehr. Geschmacksmodifizierende Wirkstoffe wie etwa Süßstoffe können nützlich sein, um hergestellten Speisen, Getränken und Medikamenten, die oral eingenommen werden einen süßen Geschmack zu verleihen. Speisen und Getränke zum allgemeinen Verzehr, die mit geschmacksmodifizierenden Wirkstoffen hergestellt werden können, umfassen zum Beispiel Backwaren, Süßigkeiten und Softdrinks. Geschmacksmodifizierende Wirkstoffe können auch als Teil von Medikamenten formuliert werden, zusätzlich zu Produkten für den allgemeinen Verzehr. Die Verwendung geschmacksmodifizierender Wirkstoffe wie etwa geschmacksmodifizierender Polypeptide kann verschiedenen Zwecken dienen, wie etwa um den Verzehr des mit dem geschmacksmodifizierenden Polypeptid formulierten Produkts angenehmer zu machen. In manchen Fällen kann die Verwendung geschmacksmodifizierender Wirkstoffe den Geschmack von Speisen für Krebspatienten verbessern, die als Ergebnis einer Krebsbehandlung (z.B. Chemotherapie, Strahlentherapie, usw.) einen veränderten Geschmackssinn haben.
  • Verschiedene Süßstoffe sind verfügbar, einschließlich natürlich vorkommender Kohlenhydrate, wie der aus Pflanzen erhältlichen, und künstlicher Süßstoffe. Jedoch kann der Verzehr großer Mengen natürlicher und künstlicher Süßstoffe mit verschiedenen Gesundheitsrisiken verbunden sein, einschließlich Diabetes und Fettleibigkeit.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • In Anbetracht des Obigen gibt es einen Bedarf für alternative geschmacksmodifizierende Wirkstoffe, die für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich sind, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Herstellung von Speisen, Getränken und Medikamenten. Zum Beispiel können alternative geschmacksmodifizierende Wirkstoffe einen süßeren Geschmack haben als natürlich vorkommende Kohlenhydrate (z.B. Saccharide) und künstliche Süßstoffe, und als Folge kann eine geringere Menge des geschmacksmodifizierenden Wirkstoffs verwendet werden, um einen ähnlichen oder vergleichbaren Süßegrad zu erreichen. Die vorliegende Offenbarung stellt alternative geschmacksmodifizierende Wirkstoffe wie geschmacksmodifizierende Polypeptide bereit, die einen süßen Geschmack verstärken können. Die vorliegende Offenbarung stellt auch Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung alternativer geschmacksmodifizierender Wirkstoffe bereit.
  • Geschmacksmodifizierende Wirkstoffe (z.B. geschmacksmodifizierende Polypeptide) können zu einer Vielzahl von Produkten formuliert werden und können verzehrt werden, um ein gewünschtes Niveau der Geschmacksveränderung zu erreichen. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid in einem Subjekt (z.B. einem Menschen) einen süßen Geschmack hervorrufen. Die vorliegende Offenbarung stellt geschmacksmodifizierende Polypeptide bereit, die zum Beispiel einen süßen Geschmack verleihen, hervorrufen und/oder verstärken können. Die vorliegende Offenbarung stellt auch Verfahren zur Aufreinigung geschmacksmodifizierender Polypeptide aus pflanzlichen Quellen bereit.
  • In einem Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die mindestens eine Kopie einer stabil integrierten heterologen Nukleinsäuresequenz enthält, die ein geschmacksmodifizierendes Protein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Hefezelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus dem Phylum Ascomycota. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Gattung Komagataella oder Kluyveromyces. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Pichia pastoris. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Kluyveromyces lactis. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Bakterienzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Bakterienzelle aus der Spezies Escherichia coli. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine filamentöse Pilzzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Insektenzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Säugerzelle. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Protein selbst geschmackslos. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Protein ein Geschmacksverstärker. In manchen Fällen verstärkt der Geschmacksverstärker einen süßen Geschmack in einem Subjekt. In manchen Fällen ist das Subjekt ein Mensch. In manchen Fällen hemmt das geschmacksmodifizierende Protein einen oder mehr bittere Geschmäcker. In manchen Fällen bindet das geschmacksmodifizierende Protein an einen oder mehr Geschmacksrezeptoren auf der Zunge eines Subjekts. In manchen Fällen umfassen der eine oder mehr Geschmacksrezeptoren mindestens einen Rezeptor für süßen Geschmack Typ 1 (TAS1R). In manchen Fällen ist der mindestens eine Rezeptor für süßen Geschmack Typ 1 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: TAS1R1, TAS1R2 und TAS1R3. In manchen Fällen umfassen der eine oder mehr Geschmacksrezeptoren mindestens einen Rezeptor für bitteren Geschmack Typ 2 (TAS2R). In manchen Fällen ist der mindestens eine Rezeptor für bitteren Geschmack Typ 2 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: TAS2R1, TAS2R50 und TAS2R60. In manchen Fällen kodiert die heterologe Nukleinsäuresequenz ein Miraculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Brazzeinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Pentadinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Curculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Monellinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Thaumatinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, oder ein Mabinlinprotein oder ein funktionelles Fragment davon. In manchen Fällen sezerniert die rekombinante Zelle das geschmacksmodifizierende Protein oder ein funktionelles Fragment davon in ein Kulturmedium. In manchen Fällen exprimiert die rekombinante Zelle das geschmacksmodifizierende Protein oder ein funktionelles Fragment davon intrazellulär. In manchen Fällen ist die heterologe Nukleinsäuresequenz kodonoptimiert für die Expression in der rekombinanten Zelle. In manchen Fällen ist die heterologe Nukleinsäuresequenz operabel verknüpft mit einem induzierbaren Promotor oder einem konstitutiven Promotor. In manchen Fällen umfasst der induzierbare Promotor eine Nukleinsäuresequenz aus einem Aox1-Promotor, einem Aox2-Promotor oder einem Lac4-Promotor. In manchen Fällen ist der konstitutive Promotor ein GAP-Promotor.
  • In einem anderen Aspekt wird ein Kulturmedium bereitgestellt, umfassend die rekombinante Zelle aus einem der Vorhergehenden.
  • In einem anderen Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Miraculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert, das mindestens 90% Identität zu SEQ ID NO: 19 hat und mindestens eine Substitutionsmodifikation im Vergleich zu SEQ ID NO: 19 enthält.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Brazzeinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert, das mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 1-5 hat und mindestens eine Substitutionsmodifikation im Vergleich zu SEQ ID NO: 1 enthält.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Thaumatinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert, das mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 6 oder 7 hat und mindestens eine Substitutionsmodifikation im Vergleich zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 6 oder 7 enthält.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Curculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert, das mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 21 oder 23 hat und mindestens eine Substitutionsmodifikation im Vergleich zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 21 oder 23 enthält.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Monellinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert, das mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 8 oder 9 hat und mindestens eine Substitutionsmodifikation im Vergleich zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 8 oder 9 enthält.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Mabinlinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert, das mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 10-17 hat und mindestens eine Substitutionsmodifikation im Vergleich zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 10-17 enthält.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Pentadinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert, das mindestens 90% Identität zu einem Wildtyp-Pentadinprotein hat und mindestens eine Substitutionsmodifikation im Vergleich zu einem Wildtyp-Pentadinprotein enthält.
  • In einem anderen Aspekt wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das ein nicht natürlich vorkommendes Miraculinprotein kodiert, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Miraculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon mit mindestens 90% Identität zu SEQ ID NO: 19 kodiert.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das ein nicht natürlich vorkommendes Brazzeinprotein kodiert, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Brazzeinprotein oder ein funktionelles Fragment davon mit mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 1-5 kodiert.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das ein nicht natürlich vorkommendes Thaumatinprotein kodiert, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Thaumatinprotein oder ein funktionelles Fragment davon mit mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 6 oder 7 kodiert.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das ein nicht natürlich vorkommendes Curculinprotein kodiert, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Curculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon mit mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 21 oder 23 kodiert.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das ein nicht natürlich vorkommendes Pentadinprotein kodiert, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Pentadinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodiert.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das ein nicht natürlich vorkommendes Monellinprotein kodiert, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Monellinprotein oder ein funktionelles Fragment davon mit mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 8 oder 9 kodiert.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das ein nicht natürlich vorkommendes Mabinlinprotein kodiert, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Mabinlinprotein oder ein funktionelles Fragment davon mit mindestens 90% Identität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 10-17 kodiert.
  • In einem anderen Aspekt wird ein Vektor bereitgestellt, umfassend ein Polynukleotid gemäß irgendeinem der Vorhergehenden und eine heterologe Nukleinsäuresequenz. In einem anderen Aspekt wird eine Zelle umfassend den vorhergehenden Vektor bereitgestellt.
  • In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Isolieren eines heterologen geschmacksmodifizierenden Proteins oder funktionellen Fragments davon aus einem Kulturmedium für rekombinante Zellen bereitgestellt, das Verfahren umfassend: Filtern eines Überstands umfassend das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon aus dem Kulturmedium für rekombinante Zellen durch eine poröse Membran, wodurch das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon isoliert wird. In manchen Fällen umfasst das Verfahren weiter das Inkubieren der rekombinanten Zelle in Zellkulturmedium über eine Zeitspanne. In manchen Fällen sezerniert die rekombinante Zelle das heterologe geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon in den Überstand. In manchen Fällen umfasst das Verfahren weiter vor dem Filtern das Lysieren der rekombinanten Zelle, um das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon in den Überstand freizusetzen. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon ein Miraculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon ein Brazzein oder ein funktionelles Fragment davon. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Pentadinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Curculinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Monellinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Thaumatinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, und einem Mabinlinprotein oder einem funktionellen Fragment davon. In manchen Fällen ist die Menge einer Überstandsverunreinigung gleich oder weniger als 1 Teil pro Million. In manchen Fällen umfasst die poröse Membran Poren im Bereich von etwa 0,01 µm bis etwa 0,5 µm Durchmesser. In manchen Fällen umfasst das Verfahren weiter das Einstellen des pH des gefilterten Überstands auf einen sauren pH. In manchen Fällen umfasst das Verfahren weiter das Einstellen des pH des gefilterten Überstands auf einen basischen pH. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Hefezelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus dem Phylum Ascomycota. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Gattung Komagataella oder Kluyveromyces. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Pichia pastoris. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Kluyveromyces lactis. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Bakterienzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Bakterienzelle aus der Spezies Escherichia coli. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine filamentöse Pilzzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Insektenzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Säugerzelle.
  • In einem anderen Aspekt wird eine orale Dosierungsform umfassend ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid oder ein funktionelles Fragment davon bereitgestellt. In manchen Fällen umfasst die orale Dosierungsform von etwa 0,00001 g bis etwa 0,5 g des rekombinanten geschmacksmodifizierenden Polypeptids oder eines funktionellen Fragments davon pro Einheitsdosis. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Miraculinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Brazzeinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Pentadinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Curculinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Monellinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Thaumatinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, und einem Mabinlinprotein oder einem funktionellen Fragment davon. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon aus einer rekombinanten Zelle aufgereinigt. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon aus einem Kulturmedium für rekombinante Zellen aufgereinigt. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Hefezelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus dem Phylum Ascomycota. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Gattung Komagataella oder Kluyveromyces. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Pichia pastoris. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Kluyveromyces lactis. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Bakterienzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Bakterienzelle aus der Spezies Escherichia coli. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine filamentöse Pilzzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Insektenzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Säugerzelle. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Miraculinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 19. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Brazzeinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 1-5. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Pentadinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu einem Wildtyp-Pentadinprotein. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Thaumatinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 6 oder 7. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Monellinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 8 oder 9. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Mabinlinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 10-17. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Curculinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 21 oder 23. In manchen Fällen umfasst die orale Dosierungsform weiter einen Hilfsstoff. In manchen Fällen umfasst der Hilfsstoff einen pH-Stabilisator. In manchen Fällen ist die orale Dosierungsform in der Form eines Films oder einer Packung. In manchen Fällen ist die orale Dosierungsform in der Form eines Pulvers. In manchen Fällen ist die orale Dosierungsform in der Form eines Aerosols, Dampfes, Sprays oder Nebels. In manchen Fällen ist die orale Dosierungsform verpackt in einen Behälter ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einer Schachtel, einem Rohr, einem Glas, einem Röhrchen, einer Tüte, einer Trommel, einer Flasche und einer Dose. In manchen Fällen enthält der Behälter Informationen, die Benutzungsanweisungen beschreiben. In manchen Fällen ist die Auflösungsrate der oralen Dosierungsform mehr als etwa 80% innerhalb der etwa ersten 30 Minuten nach Eintritt der oralen Dosierungsform in eine Verwendungsumgebung. In manchen Fällen weist die orale Dosierungsform keine Dosisproportionalität auf. In manchen Fällen umfasst das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon keine Xylose.
  • In einem anderen Aspekt wird eine Zusammensetzung formuliert zum Verzehr durch ein humanes Subjekt bereitgestellt, die Zusammensetzung umfassend ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid oder funktionelles Fragment davon. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Miraculinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Brazzeinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Pentadinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Curculinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Monellinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Thaumatinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, und einem Mabinlinprotein oder einem funktionellen Fragment davon. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon aus einer rekombinanten Zelle aufgereinigt. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Protein oder funktionelle Fragment davon aus einem Kulturmedium für rekombinante Zellen aufgereinigt. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Hefezelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus dem Phylum Ascomycota. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Gattung Komagataella oder Kluyveromyces. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Pichia pastoris. In manchen Fällen ist die rekombinante Hefezelle aus der Spezies Kluyveromyces lactis. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine rekombinante Bakterienzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Bakterienzelle aus der Spezies Escherichia coli. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine filamentöse Pilzzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Insektenzelle. In manchen Fällen ist die rekombinante Zelle eine Säugerzelle. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Miraculinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 19. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Brazzeinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 1-5. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Pentadinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu einem Wildtyp-Pentadinprotein. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Thaumatinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 6 oder 7. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Monellinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 8 oder 9. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Mabinlinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 10-17. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein Curculinprotein umfassend eine Sequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu irgendeinem von SEQ ID NOs: 21 oder 23. In manchen Fällen ist die Zusammensetzung als ein essbares Gelerzeugnis formuliert. In manchen Fällen ist das essbare Gelerzeugnis ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Gel, einem Gelee, einem Kompott, einem Püree, einem Fruchthäppchen und einem Gummibonbon. In manchen Fällen ist die Zusammensetzung als ein flüssiges Getränkeerzeugnis formuliert. In manchen Fällen ist das flüssige Getränkeerzeugnis ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Limonadenerzeugnis, einem Safterzeugnis, einem Teeerzeugnis, einem Kaffeeerzeugnis, einem Milcherzeugnis, einem Wassererzeugnis und einem alkoholischen Getränkeerzeugnis. In manchen Fällen ist die Zusammensetzung als ein Milchprodukt formuliert. Im manchen Fällen ist das Milchprodukt ein Joghurterzeugnis. In manchen Fällen umfasst das Joghurterzeugnis: (i) Joghurt; und (ii) das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon. In manchen Fällen umfasst die Zusammensetzung das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon in einer vom Joghurt getrennten Formulierung. In manchen Fällen ist das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon als ein Gel, ein Gelee, ein Kompott oder ein Püree formuliert. In manchen Fällen ist die Zusammensetzung als ein Film formuliert. In manchen Fällen ist der Film eine Beschichtung. In manchen Fällen ist die Beschichtung eine Beschichtung auf der Oberfläche eines festen Substrats. In manchen Fällen ist das feste Substrat ein Utensil. In manchen Fällen ist das Utensil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Strohhalm, einem Löffel, einem Messer und einer Gabel. In manchen Fällen ist die Zusammensetzung als ein gefrorenes Speiseerzeugnis formuliert. In manchen Fällen ist das gefrorene Speiseerzeugnis ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Eiscremeerzeugnis, einem Sorbeterzeugnis, einem Stieleiserzeugnis und einem geraspelten Eiserzeugnis. In manchen Fällen ist das gefrorene Speiseerzeugnis ein Stieleiserzeugnis. In manchen Fällen umfasst das Stieleiserzeugnis das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon als eine Beschichtung auf der Oberfläche des Stieleiserzeugnisses. In manchen Fällen ist die Beschichtung auf der Oberfläche des Stieleiserzeugnisses ein Gel, ein Gelee, ein Kompott oder ein Püree. In manchen Fällen bedeckt die Beschichtung auf der Oberfläche des Stieleiserzeugnisses etwa 1% bis etwa 50% der Oberfläche. In manchen Fällen umfasst die Zusammensetzung kein Saccharid. In manchen Fällen umfasst das rekombinante geschmacksmodifizierende Polypeptid oder funktionelle Fragment davon keine Xylose.
  • In einem anderen Aspekt wird eine Zusammensetzung bereitgestellt umfassend: (i) weniger als etwa 5 Gew.-% eines rekombinanten Miraculinproteins oder Fragments davon; und (ii) Zusätze mit einer Konzentration von mindestens etwa 95 Gew.-%, wobei die Zusätze ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Hilfsstoffen, Trägern, Verdünnern, Lösungsvermittlern, Geschmacksstoffen, Konservierungsmitteln, Farbstoffen, Adjuvantien und jeglicher Kombination davon.
  • In einem anderen Aspekt wird eine Zusammensetzung bereitgestellt umfassend: (i) weniger als etwa 5 Gew.-% eines rekombinanten Brazzeinproteins oder Fragments davon; und (ii) Zusätze mit einer Konzentration von mindestens etwa 95 Gew.-%, wobei die Zusätze ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Hilfsstoffen, Trägern, Verdünnern, Lösungsvermittlern, Geschmacksstoffen, Konservierungsmitteln, Farbstoffen und Adjuvantien.
  • In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins aus einem Pflanzenextrakt bereitgestellt, umfassend: (a) Filtern des Pflanzenextrakts durch eine Membran, wobei ein hydrostatischer Druck eine Menge einer Flüssigkeit gegen eine semipermeable Membran drückt, und dadurch Erhalten eines ersten Filtrats; und (b) Filtern des ersten Filtrats durch eine Nickel-Affinitätssäule oder ein kationisches Harz, und dadurch Erhalten eines aufgereinigten Proteins aus dem Pflanzenextrakt. In einem anderen Aspekt umfasst das Protein einen Affinitätstag. In einem anderen Aspekt ist der Affinitätstag ein Histidintag. In einem anderen Aspekt ist das Protein ein Miraculinprotein. In einem anderen Aspekt umfasst das Verfahren weiter Zentrifugieren des Pflanzenextrakts vor seiner Filterung. In manchen Fällen umfasst das Verfahren weiter Dialysieren des aufgereinigten Proteins aus dem Pflanzenextrakt.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend: (i) Joghurt; und (ii) ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid Miraculin. In manchen Fällen ist das Miraculin aufgereinigtes Miraculin. In manchen Fällen liegt das aufgereinigte Miraculin in der Zusammensetzung in einer Menge von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 0,0050 Gew.-% vor. In manchen Fällen ist das Miraculin in Wunderbeerenpulver enthalten. In manchen Fällen liegt das Wunderbeerenpulver in der Zusammensetzung in einer Menge von etwa 0,05 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% vor. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Brazzein, Curculin, Monellin, Mabinlin, Thaumatin und Pentadin. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend: ein Stieleis umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid Miraculin. In manchen Fällen ist das Miraculin aufgereinigtes Miraculin. In manchen Fällen liegt das aufgereinigte Miraculin in der Zusammensetzung in einer Menge von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 0,0050 Gew.-% vor. In manchen Fällen ist das Miraculin in Wunderbeerenpulver enthalten. In manchen Fällen liegt das Wunderbeerenpulver in der Zusammensetzung in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% vor. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Brazzein, Curculin, Monellin, Mabinlin, Thaumatin und Pentadin. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid in einer Formulierung, die das Stieleis beschichtet. In manchen Fällen ist die Formulierung ein Gel, ein Gelee, ein Kompott oder ein Püree. In manchen Fällen beschichtet die Formulierung etwa 1% bis etwa 50% der Oberfläche des Stieleises. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid.
  • In einem weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend: ein Gummibonbon und ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid Miraculin. In manchen Fällen ist das Miraculin aufgereinigtes Miraculin. In manchen Fällen liegt das aufgereinigte Miraculin in der Zusammensetzung in einer Menge von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,050 Gew.-% vor. In manchen Fällen ist das Miraculin in Wunderbeerenpulver enthalten. In manchen Fällen liegt das Wunderbeerenpulver in der Zusammensetzung in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-% vor. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Brazzein, Curculin, Monellin, Mabinlin, Thaumatin und Pentadin. In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid.
  • EINGLIEDERUNG DURCH VERWEIS
  • Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen sind hierin durch Verweis im selben Umfang eingegliedert, als wenn jede einzelne Veröffentlichung, Patent oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln als durch Verweis eingegliedert erwähnt wäre.
  • Figurenliste
  • Einige neue Merkmale der Erfindung sind in den beigefügten Ansprüchen dargelegt. Ein besseres Verständnis der Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung wird erhalten durch Bezug auf die folgende ausführliche Beschreibung, die veranschaulichende Ausführungsformen darlegt, in denen die Prinzipien der Erfindung angewendet werden, und die beigefügten Zeichnungen, in denen:
    • 1 ein nicht beschränkendes Beispiel der Expression von rekombinantem Miraculin in Kluyveromyces lactis zeigt, wie durch SDS-PAGE/Western-Blot bestätigt.
    • 2 ein nicht beschränkendes Beispiel von Gelfiltrationsergebnissen nach Kationenaustausch-Aufreinigung von in Kluyveromyces lactis exprimiertem rekombinantem Brazzein zeigt.
    • 3 ein nicht beschränkendes Beispiel von aufgereinigtem rekombinantem Brazzein in Kluyveromyces lactis zeigt, wie durch SDS-PAGE/Western-Blot bestätigt.
    • 4 ein nicht beschränkendes Beispiel von Proteinidentifikationsbestätigung durch Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC MS/MS) von in Kluyveromyces lactis exprimiertem rekombinantem Brazzein (-1) zeigt.
    • 5 ein nicht beschränkendes Beispiel der Expression von rekombinantem Miraculin in Pichia pastoris zeigt, wie durch Dot-Blot bestätigt.
    • 6 ein nicht beschränkendes Beispiel der Expression von rekombinantem Brazzein in Pichia pastoris zeigt, wie durch Dot-Blot bestätigt.
    • 7 ein nicht beschränkendes Beispiel der Expression und Aufreinigung von rekombinantem Miraculin in Escherichia coli zeigt, wie durch SDS-PAGE/Western-Blot bestätigt.
    • 8 ein nicht beschränkendes Beispiel der Expression und Aufreinigung von rekombinantem Brazzein in Escherichia coli zeigt, wie durch SDS-PAGE/Western-Blot bestätigt.
    • 9 einen Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich von Brazzeinvarianten und die berechnete äquivalente Konzentration zu einer 4,6%-igen Saccharoselösung zeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Offenbarung stellt geschmacksmodifizierende Wirkstoffe einschließlich geschmacksmodifizierende Polypeptide bereit, die einen Geschmack erzeugen und/oder modifizieren können. In manchen Aspekten können die geschmacksmodifizierenden Wirkstoffe einen süßen Geschmack haben. Hierin offenbarte geschmacksmodifizierende Wirkstoffe können einen Geschmack erzeugen und/oder modifizieren durch Verstärken, Abschwächen und/oder Verändern des Geschmacks. In manchen Aspekten können die geschmacksmodifizierenden Wirkstoffe einen süßen Geschmack erzeugen und/oder modifizieren. In manchen Aspekten können die geschmacksmodifizierenden Wirkstoffe selbst geschmackslos sein. In anderen Aspekten können die geschmacksmodifizierenden Wirkstoffe selbst einen süßen Geschmack haben. Die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Wirkstoffe können in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Herstellung von Speisen, Getränken und Medikamenten. Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung und Aufreinigung der geschmacksmodifizierenden Wirkstoffe sind auch offenbart.
  • Der Geschmackssinn ist eine Form der Chemorezeption, die in Geschmacksrezeptoren im Mund auftritt und eines einer Vielzahl von Mechanismen ist, die Säugetiere verwenden, um Reize und die äußere Umgebung wahrzunehmen. Menschen und andere Säugetiere haben Geschmacksrezeptoren auf Geschmacksknospen der Zunge und anderer Gebiete, einschließlich der Epiglottis. Jede Geschmacksknospe kann eine Pore haben, die sich zur Oberfläche der Zunge hin öffnet und es in den Mund genommenen Molekülen und Ionen erlaubt, die Rezeptorzellen innen zu erreichen.
  • Die Geschmackswahrnehmungen, die salzig, sauer, süß, bitter und umami umfassen, können durch einen oder mehr Mechanismus/en und durch einen oder mehr Geschmacksrezeptor(en) wahrgenommen werden. Geschmacksrezeptoren, die an der Wahrnehmung von Geschmack beteiligt sind, umfassen Geschmacksrezeptoren von Typ 1 (TAS1, z.B. TAS1R2 und TAS1R3) und Geschmacksrezeptoren von Typ 2 (TAS2, z.B. TAS2R1-TAS2R50). Geschmacksrezeptoren von Typ 1 sind generell mit Süße assoziiert, während Geschmacksrezeptoren von Typ 2 generell mit Bitterkeit assoziiert sind. Kombinationen dieser Rezeptoren in Dimeren oder anderen Komplexen können auch zu anderen Geschmackswahrnehmungen beitragen.
  • In manchen Aspekten können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen Geschmack erzeugen, wie etwa einen salzigen, sauren, süßen, bitteren oder Umami-Geschmack. In manchen Ausführungsformen kann ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid einen salzigen Geschmack erzeugen. In manchen Ausführungsformen kann ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid einen sauren Geschmack erzeugen. In manchen Ausführungsformen kann ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid einen süßen Geschmack erzeugen. In manchen Ausführungsformen kann ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid einen bitteren Geschmack erzeugen. In manchen Ausführungsformen kann ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid einen Umami-Geschmack erzeugen.
  • In manchen Aspekten können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen Geschmack modifizieren, wie etwa einen salzigen, sauren, süßen, bitteren oder Umami-Geschmack. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen Geschmack modifizieren, wie etwa einen salzigen, sauren, süßen, bitteren oder Umami-Geschmack verstärken. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen Geschmack modifizieren, wie etwa einen salzigen, sauren, süßen, bitteren oder Umami-Geschmack abschwächen. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen Geschmack modifizieren, wie etwa einen salzigen, sauren, süßen, bitteren oder Umami-Geschmack verändern. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen salzigen Geschmack zu einem aus einem sauren, süßen, bitteren oder Umami-Geschmack verändern. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen sauren Geschmack zu einem aus einem salzigen, süßen, bitteren oder Umami-Geschmack verändern. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen süßen Geschmack zu einem aus einem salzigen, sauren, bitteren oder Umami-Geschmack verändern. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen bitteren Geschmack zu einem aus einem salzigen, sauren, süßen oder Umami-Geschmack verändern. In manchen Fällen können die hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide einen Umami-Geschmack zu einem aus einem salzigen, sauren, süßen oder bitteren Geschmack verändern.
  • Die Ausdrücke „etwa“ und „ungefähr“ wie hierin verwendet bedeuten innerhalb eines annehmbaren Fehlerbereichs für den jeweiligen Wert, wie durch einen Fachmann bestimmt, was davon abhängen wird, wie der Wert gemessen oder bestimmt wird, z.B. von den Beschränkungen des Messsystems. Zum Beispiel kann „etwa“ innerhalb 1 oder mehr als 1 Standardabweichung bedeuten. Alternativ kann „etwa“ einen Bereich von bis zu 20%, bis zu 10%, bis zu 5% oder bis zu 1% eines gegebenen Wertes bedeuten. Zum Beispiel kann etwa bis zu ±20%, ±19%, ±18%, ±17%, ±16%, ±15%, ±14%, ±13%, ±12%, ±11%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% oder ±1%, eines gegebenen Wertes bedeuten. Alternativ, insbesondere mit Bezug auf biologische Systeme und Prozesse, kann der Ausdruck innerhalb einer Größenordnung, vorzugsweise innerhalb des 5-fachen und bevorzugter innerhalb des 2-fachen eines Wertes bedeuten. Wo bestimmte Werte in der Anmeldung und den Ansprüchen beschrieben sind, sollte, wenn nicht anders angegeben, angenommen werden, dass der Ausdruck „etwa“ innerhalb eines annehmbaren Fehlerbereichs für den jeweiligen Wert bedeutet.
  • Wie hierin und den beigefügten Ansprüchen verwendet, umfassen die Singularformen „ein“, „eine“ und „der“ / „die“ / „das“ plurale Referenzen, soweit der Kontext nicht klar Anderes angibt.
  • Geschmacksmodifizierende Polypeptide
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung geschmacksmodifizierende Polypeptide bereit, wie jene, die in Menschen einen süßen Geschmack erzeugen und/oder einen Geschmack modifizieren können. In manchen Fällen können geschmacksmodifizierende Polypeptide der Offenbarung süßschmeckend sein und zum Beispiel einem humanen Subjekt süß schmecken. In manchen Fällen können geschmacksmodifizierende Polypeptide der Offenbarung auch einen Geschmack verändern, so dass ein süßer Geschmack entsteht. Der Geschmack, der zu einem süßen Geschmack verändert wird, kann ein süßer Geschmack oder ein nichtsüßer Geschmack sein. Die offenbarten Polypeptide können einen süßen Geschmack erzeugen und/oder einen süßen Geschmack einer Zusammensetzung verändern, zum Beispiel einer Speise. Die Ausdrücke „Polypeptid“, „Peptid“ und „Protein“ werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Polymere von Aminosäuren jeglicher Länge. Das Polymer kann linear oder verzweigt sein, oder es kann modifizierte Aminosäuren umfassen, und/oder es kann durch Nicht-Aminosäuren unterbrochen sein. Die Ausdrücke umfassen auch ein Aminosäurepolymer das modifiziert wurde, zum Beispiel Disulfidbindungsbildung, Glykosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder jegliche andere Manipulation, wie etwa Konjugation mit einer Markierungskomponente. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „Aminosäure“ auf entweder natürliche und/oder nicht natürliche oder synthetische Aminosäuren, einschließlich Glycin und optische sowohl D- als auch L-Isomere, und Aminosäureanaloga und Peptidomimetika.
  • Geschmacksmodifizierende Polypeptide der Offenbarung können aus verschiedenen natürlich vorkommenden Quellen isoliert werden, wie etwa Pflanzen und deren Früchten. Geschmacksmodifizierende Polypeptide der Offenbarung können in Proteinexpressionssytemen rekombinant exprimiert werden. In manchen Fällen können die Süßeeigenschaften und die geschmacksmodifizierenden Eigenschaften natürlich vorkommender Polypeptide durch Proteinkonstruktionstechniken verstärkt werden. In manchen Fällen können die Süßeeigenschaften und die geschmacksmodifizierenden Eigenschaften verstärkt werden durch Mutation von nicht mehr als 1 Aminosäure, nicht mehr als 2 Aminosäuren, nicht mehr als 3 Aminosäuren, nicht mehr als 4 Aminosäuren, nicht mehr als 5 Aminosäuren, nicht mehr als 6 Aminosäuren, nicht mehr als 7 Aminosäuren, nicht mehr als 8 Aminosäuren, nicht mehr als 9 Aminosäuren oder nicht mehr als 10 Aminosäuren, verglichen mit einer Wildtypsequenz eines aus einer Pflanze abgeleiteten geschmacksmodifizierenden Proteins.
  • Hierin bereitgestellte geschmacksmodifizierende Polypeptide können einen süßeren Geschmack haben, als natürlich vorkommende Kohlenhydrate (z.B. Saccharide) und künstliche Süßstoffe. Ein nicht beschränkendes Beispiel eines geschmacksmodifizierenden Polypeptids mit einem süßen Geschmack umfasst das Protein Brazzein, das in der westafrikanischen Frucht des Kriechgewächses Oubli (Pentadiplandra brazzeana) gefunden werden kann. In manchen Fällen kann die Süße eines Proteins, wie durch ein humanes Subjekt zum Beispiel in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich bestimmt, größer sein als die von Kohlenhydrat-Süßstoffen und künstlichen Süßstoffen.
  • In manchen Aspekten ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung ein Brazzeinprotein, ein funktionelles Fragment davon, oder eine Mutante davon. Brazzein ist ein Protein mit 54 Aminosäureresten (Tabelle 1) und einem Molekulargewicht von ungefähr 6,5 Kilodaltons (kDa). Auf Grund der Strukturanalyse scheint Brazzein vier Disulfidbindungen in gleichmäßigem Abstand und keine Sulfhydrylgruppen, eine Alpha-Helix und drei Stränge antiparalleler Beta-Faltblätter zu haben. Reste 29-33, 36 und 39-43 sowie der C-Terminus des Proteins könnten am süßen Geschmack des Proteins beteiligt sein. Die Ladung des Proteins könnte in seiner Wechselwirkung mit dem Rezeptor für süßen Geschmack auch eine wichtige Rolle spielen. Tabelle 1. Brazzein und Brazzeinvarianten
    Brazzeinvariante Aminosäuresequenz Süße
    Wildtyp-Brazzein QDKCKKVYENYPVSKCQLANQCNYDCKLDKHARSGECFYD EKRNLQCICDYCEY (SEQ ID NO: 1) -
    Brazzein (-1) DKCKKVYENYPVSKCQLANQCNYDCKLDKHARSGECFYDE KRNLQCICDYCEY (SEQ ID NO: 2) 3X süßer als Wildtyp
    Brazzein (-1) A19K DKCKKVYENYPVSKCQLKNQCNYDCKLDKHARSGECFYDE KRNLQCICDYCEY (SEQ ID NO: 3) 4X süßer als Wildtyp
    Brazzein (-1) H31R E36D E41A DKCKKVYENYPVSKCQLANQCNYDCKLDKRARSGDCFYDA KRNLQCICDYCEY (SEQ ID NO: 4) 4,7X süßer als Wildtyp
    Brazzein (-1) A19K H31R E36D E41A DKCKKVYENYPVSKCQLKNQCNYDCKLDKRARSGDCFYDA KRNLQCICDYCEY (SEQ ID NO: 5) 11X süßer als Wildtyp
  • Auf Gewichtsbasis kann Brazzein 500- bis 2000mal süßer schmecken als Saccharose, verglichen mit einer 10% Saccharose- bzw. 2% Saccharose-Lösung. Saccharose, ein häufig verwendeter Süßstoff, ist ein Disaccharidmolekül bestehend aus Glucose und Fructose.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt auch Brazzeinmutanten mit einem süßeren Geschmack verglichen mit Wildtyp-Brazzein bereit. In manchen Fällen wird eine Brazzeinmutante zum Beispiel von einem humanen Subjekt in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich als mindestens zweimal so süß wie Wildtyp-Brazzein schmeckend wahrgenommen (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 100x, 1000x oder mindestens 10000x so süß wie Wildtyp-Brazzein).
  • Eine hierin bereitgestellte Brazzeinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz von Brazzein in Tabelle 1. Die Ausdrücke „prozentuale (%) Identität“ und „Prozent (%) identisch“, wie hierin mit Bezug auf Polypeptidsequenzen verwendet, beziehen sich auf die Prozentzahl von Aminosäureresten in einer Suchsequenz, die identisch sind zu den Aminosäureresten einer zweiten Referenzpolypeptidsequenz oder eines Teils davon, nach Alignieren der Sequenzen und Einführen von Lücken, falls notwendig, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erreichen, und ohne Berücksichtigung jeglicher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Alignieren für die Zwecke der Bestimmung von prozentualer Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, zum Beispiel unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware wie BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign- (DNASTAR-) Software. Prozentuale Identität kann über die Länge einer gesamten definierten Polypeptidsequenz gemessen werden, zum Beispiel einer Wildtyp-Proteinsequenz oder einer Sequenz wie durch eine bestimmte SEQ ID Nummer definiert, oder kann über eine kürzere Länge gemessen werden, zum Beispiel über die Länge eines Fragments aus einer größeren, definierten Polypeptidsequenz.
  • Eine hierin bereitgestellte Brazzeinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur in Tabelle 1 gezeigten Wildtypsequenz von Brazzein. Eine Brazzeinmutante kann mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Insertionen, Deletionen und/oder Substitutionen verglichen mit der in Tabelle 1 gezeigten Wildtypsequenz von Brazzein haben.
  • In manchen Fällen kann eine Brazzeinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Brazzeinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäureinsertion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäureinsertionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäureinsertion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Brazzeinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuredeletion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Brazzeinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuredeletion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuredeletionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäuredeletion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In einem Beispiel kann eine hierin erwogene Brazzeinmutante eine Aminosäuredeletion am N-Terminus des Proteins haben (z.B. Tabelle 1, Brazzein (-1)). Brazzein (-1) kann, wenn verglichen mit Wildtyp-Brazzein, als zweimal so süß wie Wildtyp-Brazzein schmeckend empfunden werden.
  • In manchen Fällen kann eine Brazzeinmutante der vorliegenden Offenbarung mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuresubstitution(en) verglichen mit Wildtyp-Brazzein haben. In manchen Fällen kann die Aminosäuresubstitution in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Brazzein und dem Geschmacksrezeptor verstärken. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Brazzein und dem Geschmacksrezeptor verringern. In manchen Fällen kann eine Brazzeinmutante mutiert sein an mindestens einem Aminosäurerest ausgewählt aus Aminosäure- (aa) Positionen aa 19, aa 29, aa 30, aa 31, aa 32, aa 33, aa 36, aa 39, aa 40, aa 41, aa 42, aa 43, aa 50 und aa 54 der Wildtypsequenz. Der Wildtyp-Aminosäurerest an jeglicher der genannten Positionen kann durch jegliche geeignete Aminosäure substituiert sein, um einen süßen Geschmack des Proteins zu verstärken oder zu erhöhen. In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure ähnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) wie die Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. konservative Substitution). In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure andere biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) verglichen mit der Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. nicht-konservative Substitution). In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens eine Aminosäuresubstitution ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens zwei Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens drei Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens vier Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens fünf Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens sechs Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens sieben Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In manchen Fällen umfasst eine als geschmacksmodifizierendes Polypeptid nützliche Brazzeinmutante mindestens acht Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: A19K, D29A, D29K, D29N, H31R, E36D, D40A, D40K, E41A, D50K und Y54W. In einem nicht beschränkenden Beispiel kann eine Brazzeinmutante eine Aminosäuredeletion am N-Terminus des Proteins und eine A19K-Subsitution haben (Tabelle 1, Brazzein (-1) A19K). Solch eine Mutante kann eine empfundene Süße haben, die mindestens viermal süßer ist als Wildtyp-Brazzein. In einem anderen nicht beschränkenden Beispiel kann eine Brazzeinmutante eine Aminosäuredeletion am N-Terminus des Proteins und A19K-, H31R-, E36D- und E41A-Subsitutionen haben (Tabelle 1, Brazzein (-1) A19K H31R E36D E41A). Solch eine Mutante kann eine empfundene Süße haben, die mindestens elfmal süßer ist als Wildtyp-Brazzein.
  • Eine Brazzeinmutante der vorliegenden Offenbarung kann jegliche Kombination der hierin beschriebenen Insertionen, Deletionen und Substitutionen haben. Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Brazzein (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung Pentadin sein. Pentadin kann auch in der Frucht des Kriechgewächses Oubli gefunden werden und kann auch in Ausführungsformen hierin als ein süßschmeckendes Polypeptid verwendet werden. Auf Gewichtsbasis kann Pentadin 500mal süßer schmecken als Saccharose.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung eine Pentadinmutante sein. In manchen Fällen wird eine Pentadinmutante zum Beispiel von einem humanen Subjekt in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich als mindestens zweimal so süß wie Wildtyp-Pentadin schmeckend wahrgenommen (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 100x, 1000x oder mindestens 10000x so süß wie Wildtyp-Pentadin). Eine hierin bereitgestellte Pentadinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz von Pentadin. Eine hierin bereitgestellte Pentadinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz von Pentadin. Eine Pentadinmutante kann mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen verglichen mit der Wildtypsequenz von Pentadin haben. Eine Pentadinmutante kann jegliche Kombination von Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen relativ zu einer Wildtypsequenz haben.
  • In manchen Fällen kann eine Pentadinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Pentadinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäureinsertion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäureinsertionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäureinsertion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Pentadinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuredeletion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Pentadinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuredeletion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuredeletionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäuredeletion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Pentadinmutante der vorliegenden Offenbarung mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuresubstitution(en) verglichen mit Wildtyp-Pentadin haben. Eine Pentadinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuresubstitution (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuresubstitutionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen kann die Aminosäuresubstitution in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Pentadin und dem Geschmacksrezeptor verstärken. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Pentadin und dem Geschmacksrezeptor verringern. Der Wildtyp-Aminosäurerest kann durch jegliche geeignete Aminosäure substituiert sein, um einen süßen Geschmack des Proteins zu verstärken oder zu erhöhen. In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure ähnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) wie die Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. konservative Substitution). In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure andere biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) verglichen mit der Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. nicht-konservative Substitution).
  • In manchen Aspekten ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung ein Thaumatin. Thaumatin bezieht sich auf eine Klasse süßschmeckender Proteine, die aus der Frucht der tropischen Pflanze Thaumatococcus danielli isoliert wurden. Zwei Formen von Thaumatin (Thaumatin I und Thaumatin II, Tabelle 2) sind bisher isoliert worden. Thaumatin I ist ein Protein von ungefähr 207 Aminosäuren und hat acht intramolekulare Disulfidbindungen und enthält keine freien Cysteinreste. Auf molarer Basis kann Thaumatin I 10000mal süßer schmecken als gewöhnlich verwendete Zucker. Tabelle 2. Thaumatin-Polypeptide
    Aminosäuresequenz
    Thaumatin I ATFEIVNRCSYTVWAAASKGDAALDAGGRQLNSGESWTINVEPGTNGGKI WARTDCYFDDSGSGICKTGDCGGLLRCKRFGRPPTTLAEFSLNQYGKDYIDIS NIKGFNVPMDFSPTTRGCRGVRCAAFIVGQCPAKLKAPGGGCNDACTVFQT SEYCCTTGKCGPTEYSRFFKRLCPDAFSYVLDKPTTVTCPGSSNYRVTFCPTA (SEQ ID NO: 6)
    Thaumatin II ATFEIVNRCSYTVWAAASKGDAALDAGGRQLNSGESWTINVEPGTKGGKI WARTDCYFDDSGRGICRTGDCGGLLQCKRFGRPPTTLAEFSLNQYGKDYIDI SNIKGFNVPMDFSPTTRGCRGVRCAAFIVGQCPAKLKAPGGGCNDACTVFQ TSEYCCTTGKCGPTEYSRFFKRLCPDAFSYVLDKPTTVTCPGSSNYRVTFCPTA (SEQ ID NO: 7)
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung eine Thaumatinmutante sein (z.B. eine Thaumatin I-Mutante oder eine Thaumatin II-Mutante). In manchen Fällen wird eine Thaumatinmutante (z.B. eine Thaumatin I-Mutante oder eine Thaumatin II-Mutante) zum Beispiel von einem humanen Subjekt in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich als mindestens zweimal so süß wie das Wildtypprotein schmeckend wahrgenommen (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 100x, 1000x oder mindestens 10000x so süß wie Wildtyp-Thaumatin I oder Wildtyp-Thaumatin II). Eine hierin bereitgestellte Thaumatinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine hierin bereitgestellte Thaumatinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine Thaumatinmutante kann mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen verglichen mit der Wildtypsequenz von Thaumatin haben. Eine Thaumatinmutante kann jegliche Kombination der Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen relativ zu einer Wildtypsequenz haben.
  • In manchen Fällen kann eine Thaumatinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Thaumatinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäureinsertion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäureinsertionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäureinsertion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Thaumatinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuredeletion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Thaumatinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuredeletion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuredeletionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäuredeletion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Thaumatinmutante der vorliegenden Offenbarung mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuresubstitution(en) verglichen mit dem Wildtypprotein haben. Eine Thaumatinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuresubstitution (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuresubstitutionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen kann die Aminosäuresubstitution in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Thaumatin und dem Geschmacksrezeptor verstärken. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Thaumatin und dem Geschmacksrezeptor verringern. Der Wildtyp-Aminosäurerest kann durch jegliche geeignete Aminosäure substituiert sein, um einen süßen Geschmack des Proteins zu verstärken oder zu erhöhen. In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure ähnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) wie die Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. konservative Substitution). In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure andere biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) verglichen mit der Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. nicht-konservative Substitution).
  • Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Thaumatin I (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden. Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Thaumatin II (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden.
  • In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung ein Monellin. Monellin bezieht sich auf ein süßes Protein, das ursprünglich in der Frucht des westafrikanischen Busches Dioscoreophyllum cumminsii entdeckt wurde. Monellin besteht aus zwei nicht-kovalent assoziierten Polypeptidketten, einer A-Kette von 44 Aminosäureresten und einer B-Kette von 50 Aminosäureresten (Tabelle 3). Auf molarer Basis kann Monellin 100000mal süßer schmecken als gewöhnlich verwendete Zucker. Auf Gewichtsbasis kann Monellin mehrere Tausend Male süßer schmecken als gewöhnlich verwendete Zucker. Tabelle 3. Monellin-Polypeptide
    Aminosäuresequenz
    Monellin Kette A (44 Aminosäuren) FREIKGYEYQLYVYASDKLFRADISEDYKTRGRKLLRFNG PVPPP (SEQ ID NO: 8)
    Monellin Kette B (50 Aminosäuren) GEWEIIDIGPFTQNLGKFAVDEENKIGQYGRLTFNKVIRP CMKKTIYEEN (SEQ ID NO: 9)
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung eine Monellinmutante sein. Eine Monellinmutante kann in Kette A, Kette B oder in beiden Ketten mutiert sein. In manchen Fällen kann eine Monellinmutante zum Beispiel von einem humanen Subjekt in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich als mindestens zweimal so süß wie das Wildtypprotein schmeckend wahrgenommen werden (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 100x, 1000x oder mindestens 10000x so süß wie Wildtyp-Monellin). Eine hierin bereitgestellte Monellinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine hierin bereitgestellte Monellinmutante kann eine mutierte Kette A haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz von Kette A. Eine hierin bereitgestellte Monellinmutante kann eine mutierte Kette B haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz von Kette B. Eine hierin bereitgestellte Monellinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine hierin bereitgestellte Monellinmutante kann eine mutierte Kette A haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz von Kette A. Eine hierin bereitgestellte Monellinmutante kann eine mutierte Kette B haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz von Kette B. Eine Monellinmutante kann mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen verglichen mit der Wildtypsequenz von Monellin haben. Eine Monellinmutante kann jegliche Kombination von Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen relativ zu einer Wildtypsequenz haben.
  • In manchen Fällen kann eine Monellinmutante (z.B. Kette A, Kette B oder beide Ketten) mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Monellinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäureinsertion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäureinsertionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region von Kette A, Kette B oder beiden Ketten von Monellin haben. In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäureinsertion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Monellinmutante (z.B. Kette A, Kette B oder beide Ketten) mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuredeletion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Monellinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuredeletion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuredeletionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region von Kette A, Kette B oder beiden Ketten von Monellin haben. In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäuredeletion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Monellinmutante (z.B. Kette A, Kette B oder beide Ketten) der vorliegenden Offenbarung mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuresubstitution(en) verglichen mit dem Wildtypprotein haben. Eine Monellinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuresubstitution (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuresubstitutionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region von Kette A, Kette B oder beiden Ketten von Monellin haben. In manchen Fällen kann die Aminosäuresubstitution in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Monellin und dem Geschmacksrezeptor verstärken. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Monellin und dem Geschmacksrezeptor verringern. Der Wildtyp-Aminosäurerest kann durch jegliche geeignete Aminosäure substituiert sein, um einen süßen Geschmack des Proteins zu verstärken oder zu erhöhen. In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure ähnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) wie die Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. konservative Substitution). In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure andere biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) verglichen mit der Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. nicht-konservative Substitution).
  • Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Monellin (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden.
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung Mabinlin sein. Mabinlin ist ein süßes Protein aus Capparis masaikai. Mabinlin kann jegliches von Mabinlin-1, Mabinlin-2, Mabinlin-3 oder Mabinlin-4 sein. Mabinlin-1 kann aus einer Kette A bestehend aus 32 Aminosäureresten und einer Kette B bestehend aus 72 Aminosäureresten bestehen (Tabelle 4, SEQ ID NOs: 10 und 11). Mabinlin-2 kann aus einer Kette A bestehend aus 33 Aminosäureresten und einer Kette B bestehend aus 72 Aminosäureresten bestehen (Tabelle 4, SEQ ID NOs: 12 und 13). Mabinlin-3 kann aus einer Kette A bestehend aus 32 Aminosäureresten und einer Kette B bestehend aus 72 Aminosäureresten bestehen (Tabelle 4, SEQ ID NOs: 14 und 15). Mabinlin-4 kann aus einer Kette A bestehend aus 28 Aminosäureresten und einer Kette B bestehend aus 72 Aminosäureresten bestehen (Tabelle 4, SEQ ID NOs: 16 und 17). Die Kette B eines Mabinlinproteins kann zwei intramolekulare Disulfidbindungen enthalten und kann durch zwei intramolekulare Disulfidbrücken mit der Kette A verbunden sein. Auf Gewichtsbasis kann die Süße eines Mabinlinproteins als etwa 400mal diejenige von Saccharose wahrgenommen werden. Tabelle 4. Mabinlin-Polypeptide
    Aminosäuresequenz
    Mabinlin-1 Kette A (32 Aminosäuren) EPLCRRQFQQHQHLRACQRYIRRRAQRGGLVD (SEQ ID NO: 10)
    Mabinlin-1 Kette B (72 Aminosäuren) EQRGPALRLCCNQLRQVNKPCVCPVLRQAAHQQLYQG QIEGPRQVRQLFRAARNLPNICKIPAVGRCQFTRW (SEQ ID NO: 11)
    Mabinlin-2 Kette A (33 Aminosäuren) QLWRCQRQFLQHQRLRACQRFIHRRAQFGGQPD (SEQ ID NO: 12)
    Mabinlin-2 Kette B (72 Aminosäuren) QPRRPALRQCCNQLRQVDRPCVCPVLRQAAQQVLQR QIIQGPQQLRRLFDAARNLPNICNIPNIGACPFRAW (SEQ ID NO: 13)
    Mabinlin-3 Kette A (32 Aminosäuren) EPLCRRQFQQHQHLRACQRYLRRRAQRGGLAD (SEQ ID NO: 14)
    Mabinlin-3 Kette B (72 Aminosäuren) EQRGPALRLCCNQLRQVNKPCVCPVLRQAAHQQLYQG QIEGPRQVRRLFRAARNLPNICKIPAVGRCQFTRW (SEQ ID NO: 15)
    Mabinlin-4 Kette A (28 Aminosäuren) EPLCRRQFQQHQHLRACQRYLRRRAQRG (SEQ ID NO: 16)
    Mabinlin-4 Kette B (72 Aminosäuren) EQRGPALRLCCNQLRQVNKPCVCPVLRQAAHQQLYQG QIEGPRQVRRLFRAARNLPNICKIPAVGRCQFTRW (SEQ ID NO: 17)
  • In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung eine Mabinlinmutante. Zum Beispiel kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung ein mutiertes Mabinlin-1, ein mutiertes Mabinlin-2, ein mutiertes Mabinlin-3 oder ein mutiertes Mabinlin-4 sein. Eine Mabinlinmutante kann in Kette A, Kette B oder in beiden Ketten mutiert sein. In manchen Fällen kann eine Mabinlinmutante zum Beispiel von einem humanen Subjekt in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich als mindestens zweimal so süß wie das Wildtypprotein schmeckend wahrgenommen werden (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 100x, 1000x oder mindestens 10000x so süß wie das Wildtyp-Mabinlinprotein). Eine hierin bereitgestellte Mabinlinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz eines Mabinlinproteins. Eine hierin bereitgestellte Mabinlinmutante kann eine mutierte Kette A haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz von Kette A. Eine hierin bereitgestellte Mabinlinmutante kann eine mutierte Kette B haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz von Kette B. Eine hierin bereitgestellte Mabinlinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz eines Mabinlinproteins. Eine hierin bereitgestellte Mabinlinmutante kann eine mutierte Kette A haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz von Kette A. Eine hierin bereitgestellte Mabinlinmutante kann eine mutierte Kette B haben, die mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz von Kette B. Eine Mabinlinmutante kann mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen verglichen mit der Wildtypsequenz eines Mabinlinproteins haben. Eine Mabinlinmutante kann jegliche Kombination von Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen relativ zu einer Wildtypsequenz haben.
  • In manchen Fällen kann eine Mabinlinmutante (z.B. Kette A, Kette B oder beide Ketten) mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Mabinlinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäureinsertion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäureinsertionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region von Kette A, Kette B oder beiden Ketten eines Mabinlinproteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäureinsertion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Mabinlinmutante (z.B. Kette A, Kette B oder beide Ketten) mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuredeletion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Mabinlinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuredeletion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuredeletionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region von Kette A, Kette B oder beiden Ketten eines Mabinlinproteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäuredeletion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Mabinlinmutante (z.B. Kette A, Kette B oder beide Ketten) der vorliegenden Offenbarung mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuresubstitution(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Mabinlinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuresubstitution (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuresubstitutionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region von Kette A, Kette B oder beiden Ketten eines Mabinlinproteins haben. In manchen Fällen kann die Aminosäuresubstitution in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Mabinlin und dem Geschmacksrezeptor verstärken. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Mabinlin und dem Geschmacksrezeptor verringern. Der Wildtyp-Aminosäurerest kann durch jegliche geeignete Aminosäure substituiert sein, um einen süßen Geschmack des Proteins zu verstärken oder zu erhöhen. In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure ähnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) wie die Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. konservative Substitution). In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure andere biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) verglichen mit der Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. nicht-konservative Substitution).
  • Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Mabinlin-1 (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden. Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Mabinlin-2 (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden. Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Mabinlin-3 (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden. Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Mabinlin-4 (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden.
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der vorliegenden Offenbarung ein geschmacksveränderndes Polypeptid umfassen. Geschmacksverändernde Polypeptide können in manchen Fällen selbst einen süßen Geschmack haben. In manchen Fällen können geschmacksverändernde Polypeptide einen süßen Geschmack hervorrufen, ohne selbst einen süßen Geschmack zu haben. Geschmacksverändernde Polypeptide können mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirken, wie etwa TAS1R2 (auch als T1R2 bezeichnet) und TAS1R3 (auch als T1R3 bezeichnet). In manchen Fällen können geschmacksverändernde Polypeptide einen süßen Geschmack aus einem sauren Geschmack hervorrufen. In manchen Fällen können geschmacksverändernde Polypeptide einen sauren Geschmack verändern, um einen süßen Geschmack zu ergeben. Nicht beschränkende Beispiele geschmacksverändernder Polypeptide, die aus einer Zusammensetzung, wie etwa einer Speise oder einem Getränk, einen süßen Geschmack ergeben können, umfassen die Proteine Miraculin und Curculin.
  • In manchen Fällen ist das geschmacksmodifizierende Polypeptid Miraculin oder jegliche Variante davon. Miraculin ist ein aus der Frucht von Synsepalum dulcificum extrahiertes Glykoprotein. Wildtyp-Miraculin ist ungefähr 191 Aminosäuren lang (Tabelle 5) und hat Kohlenhydratketten. Das Molekulargewicht des Glykoproteins beträgt 24,6 kDa, einschließlich 3,4 kDa (13,9% des Gewichts) Zucker bestehend (in einem molaren Verhältnis) aus Glucosamin (31%), Mannose (30%), Fucose (22%), Xylose (10%) und Galactose (7%). Miraculin kann als ein Tetramer (~98,4 kDa) oder ein Paar von Dimeren vorliegen. Innerhalb jedes Dimers können zwei Miraculin-Glykoproteine durch eine Disulfidbrücke verbunden sein. Tabelle 5. Aminosäuresequenz von Miraculin
    Aminosäuresequenz
    SIGNAL (29) MKELTMLSLS FFFVSALLAA AANPLLSAA (SEQ ID NO: 18)
    Miraculin DSAPNPVLDIDGEKLRTGTNYYIVPVLRDHGGGLTVSATTPNGTFVCPPRVVQTRKE VDHDRPLAFFPENPKEDVVRVSTDLNINFSAFMPCRWTSSTVWRLDKYDESTGQY FVTIGGVKGNPGPETISSWFKIEEFCGSGFYKLVFCPTVCGSCKVKCGDVGIYIDQKG RRRLALSDKPFAFEFNKTVYF (SEQ ID NO: 19)
  • Sowohl Tetramer-Miraculin als auch natives Dimer-Miraculin in seinem rohen Stadium kann eine geschmacksmodifizierende Aktivität haben, saure Geschmäcker zu verändern um süße Geschmäcker zu ergeben. Miraculin mag selbst nicht süß sein, aber es kann die Wahrnehmung von sauer zu süß ändern. Die Dauer und Intensität der geschmacksmodifizierenden Phänomene kann von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich Miraculinkonzentration, Dauer des Kontakts von Miraculin mit der Zunge und Säurekonzentration.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt auch Miraculinmutanten bereit, die einen Geschmack in einem größeren Maß und/oder für eine längere Zeitdauer ändern können verglichen mit Wildtyp-Miraculin. In manchen Fällen kann eine Miraculinmutante einen Geschmack, zum Beispiel einen Geschmack in einem humanen Subjekt, für eine Zeitdauer mindestens zweimal so lang wie das Wildtypprotein ändern (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x oder 10x so lang wie das Wildtypprotein). In manchen Fällen kann eine Miraculinmutante zum Beispiel von einem humanen Subjekt in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich als mindestens zweimal so süß wie das Wildtypprotein schmeckend wahrgenommen werden (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 100x, 1000x oder mindestens 10000x so süß wie Wildtyp-Miraculin).
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung eine Miraculinmutante sein. Eine hierin bereitgestellte Miraculinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine hierin bereitgestellte Miraculinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine Miraculinmutante kann mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen verglichen mit der Wildtypsequenz von Miraculin haben. Eine Miraculinmutante kann jegliche Kombination von Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen relativ zu einer Wildtypsequenz haben.
  • In manchen Fällen kann eine Miraculinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Miraculinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäureinsertion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäureinsertionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäureinsertion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Miraculinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuredeletion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Miraculinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuredeletion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuredeletionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäuredeletion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Miraculinmutante der vorliegenden Offenbarung mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuresubstitution(en) verglichen mit dem Wildtypprotein haben. Eine Miraculinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuresubstitution (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuresubstitutionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen kann die Aminosäuresubstitution in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Miraculin und dem Geschmacksrezeptor verstärken. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Miraculin und dem Geschmacksrezeptor verringern. Der Wildtyp-Aminosäurerest kann durch jegliche geeignete Aminosäure substituiert sein, um einen süßen Geschmack des Proteins zu verstärken oder zu erhöhen. In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure ähnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) wie die Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. konservative Substitution). In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure andere biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) verglichen mit der Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. nicht-konservative Substitution).
  • Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Miraculin (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden.
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid Curculin oder jegliche Variante davon sein. Curculin ist ein Protein, das Geschmack verändern kann und das auch einen süßen Geschmack aufweist (z.B. süßschmeckend). Curculin kann aus der Frucht von Curculigo latifolia (Hypoxidaceae) isoliert werden. Die aktive Form von Curculin ist ein Heterodimer bestehend aus zwei durch zwei Disulfidbrücken verbundenen monomeren Einheiten. Die reifen Monomere bestehen jeweils aus einer Sequenz von 114 bzw. 113 Aminosäuren (Tabelle 6), die etwa 12,5 kDa (Curculin 1 oder Curculin A) bzw. 12,7 kDa (Curculin 2 oder Curculin B) wiegen. Während jede dieser beiden Isoformen ein Homodimer bilden kann, besitzen diese im Allgemeinen nicht den süßen Geschmack oder die geschmacksmodifizierende Aktivität der heterodimeren Form. Die heterodimere Form wird manchmal als „Neoculin“ bezeichnet. Curculin wird als ein hochintensiver Süßstoff betrachtet, mit einer berichteten relativen Süße, die auf Gewichtsbasis 430-2070mal süßer ist als Saccharose. Tabelle 6. Aminosäuresequenzen von Curculin A und Curculin B
    Aminosäuresequenz
    SIGNAL (22) MAAKFLLTILVTFAAVASLGMA (SEQ ID NO: 20)
    Curculin A DNVLLSGQTLHADHSLQAGAYTLTIQNKCNLVKYQNGRQIWASNTDRRGSGCRLT LLSDGNLVIYDHNNNDVWGASCWGDNGKYALVLQKDGRFVIYGPVLWSLGPNGC RRVNG (SEQ ID NO: 21)
    PROPEP (22) GITVAKDSTEPQHEDIKMVINN (SEQ ID NO: 22)
    Aminosäuresequenz
    SIGNAL (22) MAAKFLLTILVTFAAVASLGMA (SEQ ID NO: 20)
    Curculin B DSVLLSGQTLYAGHSLTSGSYTLTIQNNCNLVKYQHGRQIWASDTDGQGSQCRLTL RSDGNLIIYDDNNMVVWGSDCWGNNGTYALVLQQDGLFVIYGPVLWPLGLNGC RSLN (SEQ ID NO: 23)
    PROPEP (23) GEITVAKDSTEPQHEDIKMVINN (SEQ ID NO: 24)
  • In manchen Fällen kann eine Curculinmutante einen Geschmack, zum Beispiel einen Geschmack in einem humanen Subjekt, für eine Zeitdauer mindestens zweimal so lang wie das Wildtypprotein ändern (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x oder 10x so lang wie das Wildtypprotein). In manchen Fällen kann eine Curculinmutante zum Beispiel von einem humanen Subjekt in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich als mindestens zweimal so süß wie das Wildtypprotein schmeckend wahrgenommen werden (z.B. mindestens 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 100x, 1000x oder mindestens 10000x so süß wie Wildtyp-Curculin).
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid der Offenbarung eine Curculinmutante sein. Eine hierin bereitgestellte Curculinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% identisch ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine hierin bereitgestellte Curculinmutante kann jedes nicht natürlich vorkommende Protein sein, das mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder mindestens 99% homolog ist zur Wildtypsequenz des Proteins. Eine Curculinmutante kann mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen verglichen mit der Wildtypsequenz von Curculin haben. Eine Curculinmutante kann jegliche Kombination von Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen relativ zu einer Wildtypsequenz haben.
  • In manchen Fällen kann eine Curculinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäureinsertion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Curculinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäureinsertion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäureinsertionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei inserierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäureinsertion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Curculinmutante mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuredeletion(en) verglichen mit dem Wildtypprotein enthalten. Eine Curculinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuredeletion (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuredeletionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren konsekutive Aminosäuren sein (z.B. einander benachbarte Aminosäuren). In manchen Fällen können mindestens zwei deletierte Aminosäuren nicht konsekutive Aminosäuren sein. In manchen Fällen kann/können die Aminosäuredeletion(en) in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt.
  • In manchen Fällen kann eine Curculinmutante der vorliegenden Offenbarung mindestens eine (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Aminosäuresubstitution(en) verglichen mit dem Wildtypprotein haben. Eine Curculinmutante der vorliegenden Offenbarung kann mindestens eine Aminosäuresubstitution (z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Aminosäuresubstitutionen) am N-Terminus, am C-Terminus oder in einer inneren Region des Proteins haben. In manchen Fällen kann die Aminosäuresubstitution in einer Region des Proteins erfolgen, die mit einem Geschmacksrezeptor wechselwirkt. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Curculin und dem Geschmacksrezeptor verstärken. In manchen Fällen kann die Substitution die Wechselwirkung zwischen Curculin und dem Geschmacksrezeptor verringern. Der Wildtyp-Aminosäurerest kann durch jegliche geeignete Aminosäure substituiert sein, um die geschmacksverändernde Aktivität des Proteins zu verstärken oder zu erhöhen. In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure ähnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) wie die Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. konservative Substitution). In manchen Fällen kann die substituierte Aminosäure andere biochemische Eigenschaften (z.B. Ladung, Hydrophobizität, Größe) verglichen mit der Wildtyp-Aminosäure haben (z.B. nicht-konservative Substitution).
  • Ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassend Curculin (z.B. Wildtyp, Fragment davon oder Mutante davon) kann mit einer geeigneten Dissoziationskonstante an einen Rezeptor für süßen Geschmack binden.
  • II. Verfahren zur Herstellung geschmacksmodifizierender Polypeptide
  • Geschmacksmodifizierende Wirkstoffe der vorliegenden Offenbarung können aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert werden und durch eine Vielzahl von Proteinexpressionssystemen rekombinant hergestellt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf zellbasierte Expressionssysteme und zellfreie Expressionssysteme. Nicht beschränkende Beispiele von für die Herstellung hierin offenbarter geschmacksmodifizierender Polypeptide nützlichen Proteinexpressionssystemen umfassen auf prokaryotischen Zellen basierende Expressionssysteme (z.B. Archaeensysteme, z.B. bakterielle Systeme) und auf eukaryotischen Zellen basierende Expressionssysteme (z.B. Pilzzellen (filamentöse Pilzzellen), z.B. Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen).
  • Um ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid in einem zellbasierten Expressionssystem zu exprimieren, kann ein für das Polypeptid kodierendes Gen zu Beispiel durch einen Expressionsvektor in eine Wirtszelle des Expressionssystems eingeführt werden. Ein für das geschmacksmodifizierende Polypeptid kodierendes Polynukleotidgen kann mit verschiedenen Verfahren erzeugt werden, einschließlich molekularer Klonierung und Synthese. Molekulare Klonierungsverfahren können Mutagenese (z.B. stellengesteuerte Mutagenese), Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung (z.B. Restriktionsenzymverdau und Ligation), Polymerasekettenreaktion (PCR) und Überlappungsextension beinhalten. Synthese kann chemische Synthese (z.B. Gensynthese) umfassen. Die Gensequenz kann für jegliches gewünschte Expressionssystem kodonoptimiert sein.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung einen Vektor bereit, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid kodiert. In manchen Fällen stellt die vorliegende Offenbarung einen Vektor bereit, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Brazzeinpolypeptid, einem Thaumatinpolypeptid, einem Monellinpolypeptid, einem Mabinlinpolypeptid, einem Pentadinpolypeptid, einem Miraculinpolypeptid oder einem Curculinpolypeptid kodiert. In manchen Fällen kann die Nukleinsäuresequenz mindestens 80% Sequenzidentität (z.B. mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität) haben zur Sequenz von in Tabelle 1 gezeigtem Wildtyp-Brazzein, in Tabelle 2 gezeigten Thaumatin-Polypeptiden, in Tabelle 3 gezeigten Monellin-Polypeptiden, in Tabelle 4 gezeigten Mabinlin-Polypeptiden, in Tabelle 5 gezeigtem Miraculin oder in Tabelle 6 gezeigtem Curculin. Das resultierende Polynukleotidgen kann in einen Klonierungsvektor und/oder einen Expressionsvektor eingefügt werden.
  • Die kodierende Sequenz kann durch eine Vielzahl von Verfahren in einen Vektor eingefügt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Restriktionsenzymverdau, Ligation und homologe Rekombination. Der Vektor kann in der Lage sein, in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Wirtszellen von Expressionssystemen zu replizieren und die Polynukleotide zu exprimieren. Ein Vektor kann verschiedene Komponenten enthalten, die auf Kompatibilität mit der jeweiligen Wirtszelle eingestellt und optimiert werden können. Ein Klonierungsvektor und/oder Expressionsvektor kann zusätzliche Nukleinsäuresequenzen umfassen, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein Markergen (z.B. einen Selektionsmarker wie etwa ein Antibiotikaresistenzgen), ein Enhancer-Element, einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle, eine Signalsequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • In manchen Aspekten kann ein Expressionsvektor, der ein ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid kodierendes Polynukleotid enthält, weiter einen Promotor umfassen. Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, konstitutive Promotoren, induzierbare Promotoren und Hybridpromotoren. Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, acu-5, adhl+, Alkoholdehydrogenase (ADH1, ADH2, ADH4), AHSB4m, AINV, alcA, a-Amylase, alternative Oxidase (AOD), Alkoholoxidase I (AOX1), Alkoholoxidase 2 (AOX2), AXDH, B2, CaMV, Cellobiohydrolase I (cbhl), ccg-1, cDNAl, zelluläres Filamentpolypeptid (cfp), cpc-2, ctr4+, CUP1, Dihydroxyacetonsynthase (DAS), Enolase (ENO, ENO1), Formaldehyd-Dehydrogenase (FLD1), FMD, Formiat-Dehydrogenase (FMDH), G1, G6, GAA, GAL1, GAL2, GAL3, GAL4, GAL5, GAL6, GAL7, GAL8, GAL9, GAL10, GCW14, gdhA, gla-1, a-Glucoamylase (glaA), Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (gpdA, GAP, GAPDH), Phosphoglycerat-Mutase (GPM1), Glycerolkinase (GUT1), HSP82, inv1+, Isocitrat-Lyase (ICL1), Acetohydroxysäure-Isomeroreduktase (ILV5), KAR2, KEX2, b-Galactosidase (lac4), LEU2, melO, MET3, Methanoloxidase (MOX), nmtl, NSP, pcbC, PET9, Peroxin 8 (PEX8), Phosphoglyceratkinase (PGK, PGK1), phol, PH05, PH089, Phosphatidylinositol-Synthase (PIS1), PYK1, Pyruvatkinase (pki1), RPS7, Sorbitol-Dehydrogenase (SDH), 3-Phosphoserin-Aminotransferase (SER1), SSA4, SV40, TEF, Translationselongationsfaktor 1 alpha (TEF1), THI11, Homoserinkinase (THR1), tpi, TPS1, Triosephosphat-Isomerase (TPI1), XRP2 und YPT1.
  • In manchen Aspekten kann ein Expressionsvektor, der ein ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid kodierendes Gen enthält, einen auxotrophen Marker umfassen (z.B. adel, arg4, his4, ura3, met2).
  • In manchen Aspekten kann ein Expressionsvektor, der ein ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid kodierendes Gen enthält, einen selektierbaren Marker umfassen (z.B. ein Resistenzgen). In manchen Fällen kann ein Resistenzgen Resistenz gegen Zeocin, Ampicillin, Blasticidin, Kanamycin, Nurseothricin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Triclosan oder Ganciclovir verleihen.
  • In manchen Fällen kann ein Expressionsvektor, der ein ein hierin offenbartes geschmacksmodifizierendes Polypeptid kodierendes Gen enthält, auch eine Polynukleotidsequenz umfassen, die ein Signalpeptid kodiert. Ein Signalpeptid, auch bekannt als Signalsequenz, Zielsignal, Lokalisierungssignal, Lokalisierungssequenz, Sekretionssignal, Transitpeptid, Leadersequenz oder Leaderpeptid, kann die Sekretion eines Polypeptids oder Polynukleotids unterstützen. Extrazelluläre Sekretion eines rekombinant exprimierten Proteins aus einer Wirtszelle kann die Proteinaufreinigung erleichtern. Zum Beispiel kann die Gewinnung eines rekombinanten Proteins aus einem Zellkulturüberstand zu bevorzugen sein gegenüber dem Lysieren von Wirtszellen, um eine komplexe Mischung aus Proteinen freizusetzen, einschließlich intrazellulärer Proteine der Wirtszelle. Sekretion kann in manchen Fällen die schädlichen Wirkungen verringern, die intrazelluläre Überexpression eines heterologen Proteins auf eine Wirtszelle haben kann, wie etwa Toxizität oder eine verringerte Wachstumsrate. Sekretion kann in manchen Fällen erhöhte Proteinproduktion erlauben, verglichen mit intrazellulärer Expression in einer Wirtszelle mit beschränktem Volumen, um die synthetisierten Proteine zu speichern. Sekretorische Produktion eines Proteins kann in manchen Fällen posttranslationale Modifizierung oder Verarbeitung erleichtern (z.B. Proteinfaltung, Bildung von Disulfidbrücken und Glykosylierung).
  • Der Klonierungs- und/oder Expressionsvektor kann dann zur Replikation/ Amplifikation und/oder Proteinexpression in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Polynukleotide können auf jegliche Art in Wirtszellen eingeführt werden. Zellen können durch Einführen eines exogenen Polynukleotids transformiert werden, zum Beispiel durch direkte Aufnahme, Endozytose, Transfektion, F-Paarung, PEG-vermittelte Protoplastenfusion, Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation, biolistische Transformation, chemische Transformation oder Elektroporation.
  • Das exogene Polynukleotid kann nach seiner Einführung als ein nicht-integrierter Expressionsvektor (wie ein Plasmid) oder ins Wirtszellgenom integriert aufrechterhalten werden. Sobald die Vektoren zur Proteinproduktion in eine Wirtszelle eingeführt sind, können Wirtszellen in konventionellen Nährmedien kultiviert werden, die geeignet modifiziert sind, um Promotoren zu induzieren, Transformanten auszuwählen und/oder die die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene zu amplifizieren.
  • Da verschiedene Wirtszellen Charakteristika und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Verarbeitung und Modifikation von Proteinprodukten haben können, können geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Verarbeitung des exprimierten Proteins sicherzustellen. In manchen Fällen kann eine Wirtszelle ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus: Bakterien, Pilzen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Säugerzellen und jeglicher Kombination davon.
  • In manchen Fällen ist eine für die Expression eines hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptids ausgewählte Wirtszelle eine Archaeenzelle. Nicht beschränkende Beispiele von Archaeen-Wirtszellen umfassen Pyrococcus furiosus, Metallosphera sedula, Thermococcus litoralis, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus jannaschii, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus, Pyrococcus woesei, Sulfolobus shibatae und Varianten davon. In manchen Fällen ist eine für die Expression eines hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptids ausgewählte Wirtszelle eine bakterielle Zelle. Geeignete bakterielle Wirtszellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, BL21 E. coli, E. coli Stamm DE3, E. coli M15, DHSu, DH103, HB101, B. subtilis-Zellen, Pseudomonas fluorescens-Zellen und Cyanobakterienzellen wie Synechococcus elongates-Zellen.
  • Nicht beschränkende Expressionsvektoren zur Verwendung in Archaeen- und bakteriellen Wirtszellen umfassen pCWori, pGEX-Vektoren (z.B. pGEX-2T, pGEX-3X, pGEX-4T, pGEX-5X, pGEX-6P), pET-Vektoren (z.B. pET-21, pET-21 a, pET-21 b, pET-22 pET-23, pET-24), pACYC-Vektoren (z.B. pACYDuet-1), pDEST-Vektoren (z.B. pDEST14, pDEST15, pDEST24, pDEST42), pBR322 und seine Derivate, pQE-Vektoren, pBluescript-Vektoren, pNH-Vektoren, lambda-ZAP-Vektoren, ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T, pRSET, pCR-TOPO-Vektoren, pSyn_Vektoren, pChlamy_1-Vektoren, pGEMI und pMAL.
  • In manchen Aspekten kann eine für die Expression eines hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptids ausgewählte Wirtszelle eine Pilzzelle sein. Die Pilzzelle kann eine Hefezelle oder ein filamentöser Pilz sein. Hefe kann umfassen, ist aber nicht beschränkt auf, Arxula spp., Arxula adeninivorans, Kluyveromyces spp., Kluyveromyces lactis, Pichia spp., Pichia angusta, Pichia pastoris, Saccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Schizosaccharomyces pombe, Tetrahymena sp., Hansenula sp., Blastobotrys sp., Candida sp., Zygosaccharomyces sp., Debaryomyces sp. Yarrowia spp. und Yarrowia lipolytica. Pilze können auch umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Agaricus spp., Agaricus bisporus, Aspergillus spp., Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Colletotrichum spp., Colletotrichum gioeosporiodes, Endothia spp., Endothia parasitica, Fusarium spp., Fusarium graminearum, Fusarium solani, Mucor spp., Mucor miehei, Mucor pusillus, Myceliophthora spp., Myceliophthora thermophila, Neurospora spp., Neurospora crassa, Penicillium spp., Penicillium camemberti, Penicillium canescens, Penicillium chrysogenum, Penicillium (Talaromyces) emersonii, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Pleurotus spp., Pleurotus ostreatus, Rhizomucor spp., Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus, Rhizopus spp., Rhizopus arrhizus, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, Trichoderma spp., Trichoderma altroviride, Trichoderma reesei und Trichoderma vireus.
  • In manchen Aspekten kann eine für die Expression eines hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptids ausgewählte Wirtszelle eine Insektenzelle sein. Geeignete Insektenwirtszellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Sf9-Zellen aus Spodoptera frugiperda, Sf21-Zellen aus Spodoptera frugiperda, Hi-Five-Zellen, BTI-TN-5B1-4 Trichophusia ni-Zellen und Schneider 2- (S2-) Zellen und Schneider 3- (S3-) Zellen aus Drosophila melanogaster.
  • In manchen Aspekten kann eine für die Expression eines hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptids ausgewählte Wirtszelle eine Säugerzelle sein. Nicht beschränkende Beispiele von Säugerwirtszellen umfassen HEK293-Zellen, HeLa-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen, Jurkat-Zellen, NSO-Hybridomzellen, Babyhamsternieren- (BHK-) Zellen, MDCK-Zellen, NIH-3T3-Fibroblastenzellen und jegliche andere aus einer Säugerzelle abgeleitete immortalisierte Zelllinie.
  • Nicht beschränkende Beispiele von Expressionsvektoren zur Verwendung in eukaryotischen Wirtszellen umfassen pXT1, pSGS, pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40, pcDNA3.3, pcDNA4/TO, pcDNA6/TR, pLenti6/TR, pMT-Vektoren, pKLAC1-Vektoren, pKLAC2-Vektoren, pQE-Vektoren, pYepSec1, pMFa, pJRY88, pYES2, PGAPZ, pTEF-MF, BacPak baculovirale Vektoren, pAdeno-X adenovirale Vektoren und pBABE retrovirale Vektoren.
  • Zur Herstellung der hierin offenbarten geschmacksmodifizierenden Polypeptide verwendete Wirtszellen können in zur Kultivierung der ausgewählten Wirtszellen geeigneten Medien wachsen gelassen werden. Nicht beschränkende Beispiele von geeigneten Medien für bakterielle Wirtszellen umfassen Luria Broth (LB) plus notwendige Ergänzungen wie etwa ein Selektionsmittel, z.B. Ampicillin. Nicht beschränkende Beispiele von geeigneten Medien für Hefewirtszellen umfassen YNB- (Hefe-Stickstoffbasis-) Medium, YCB- (Hefe-Kohlenstoffbasis-) Medium, YPD- (Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-) Medium, YPG (Hefeextrakt-Pepton-Glycerin-) Medium und YPAc- (Hefeextrakt-Pepton-Acetat-) Medium. Nicht beschränkende Beispiele von geeigneten Medien für Säugerwirtszellen umfassen Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), DMEM mit ergänztem fötalem Rinderserum (FBS) und RPMI-1640.
  • Wirtszellen können bei einer geeigneten Temperatur für Proteinexpression und/oder richtige Proteinfaltung kultiviert werden. In manchen Fällen können die Wirtszellen bei einer Temperatur von etwa 15°C, etwa 16°C, etwa 17°C, etwa 18°C, etwa 19°C, etwa 20°C, etwa 21°C, etwa 22°C, etwa 23°C, etwa 24°C, etwa 25°C, etwa 26°C, etwa 27°C, etwa 28°C, etwa 29°C, etwa 30°C, etwa 31°C, etwa 32°C, etwa 33°C, etwa 34°C, etwa 35°C, etwa 36°C, etwa 37°C, etwa 38°C oder etwa 39°C kultiviert werden. In manchen Fällen können die Wirtszellen bei einer Temperatur von zwischen etwa 15°C bis etwa 39°C, z.B. zwischen etwa 25°C bis etwa 37°C, zwischen etwa 27°C bis etwa 35°C oder zwischen etwa 29°C bis etwa 33°C kultiviert werden.
  • Der pH des Mediums kann jeder geeignete pH für Proteinexpression und/oder richtige Proteinfaltung sein. In manchen Fällen kann der pH des Mediums abhängig vom Stadium der Proteinexpression variieren (zum Beispiel, Wirtszellenverdopplung mit minimaler Proteinproduktion ggü. langsamem Wirtszellenwachstum mit maximaler Proteinproduktion). In manchen Fällen kann der pH des Zellkulturmediums etwa pH 3,0, etwa pH 3,5, etwa pH 4,0, etwa pH 4,5, etwa pH 5,0, etwa pH 5,5, etwa pH 6,0, etwa pH 6,5, etwa pH 7,0 oder etwa pH 7,5 sein. In manchen Fällen kann der pH des Zellkulturmediums zwischen etwa pH 4,0 bis etwa 8,0 sein, z.B. zwischen etwa pH 5,0 bis etwa 7,0 oder zwischen etwa pH 5,5 bis etwa 6,5. Der pH kann vom Wirtsorganismus abhängen.
  • Eine Wirtszelle kann weiter glykokonstruiert sein, zum Beispiel durch Modifizierung oder Konstruktion seiner Glykosylierungspfade, um einem anderen Organismus (z.B. einer Pflanze) stärker zu ähneln.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung eine rekombinante Hefezelle bereit, umfassend mindestens eine Kopie einer stabil integrierten heterologen Nukleinsäuresequenz, die ein geschmacksmodifizierendes Protein oder funktionelles Fragment davon kodiert. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Protein süßer schmecken als ein Kohlenhydrat (z.B. ein Saccharid) und/oder ein künstlicher Süßstoff. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Protein selbst geschmackslos sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Protein einen Geschmack verstärken, zum Beispiel einen süßen Geschmack. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Protein beinahe null Kalorien in einer vorbestimmten Portionsgröße haben. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Protein in einer vorbestimmten Portionsgröße eine glykämische Last von null oder ungefähr null haben. Das geschmacksmodifizierende Protein kann einen süßen Geschmack in jeglichem geeigneten Subjekt verstärken, wie einem Menschen, Primatensäuger, oder Nicht-PrimatenSäuger. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Protein einen oder mehr bittere Geschmäcker hemmen.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Protein an einen oder mehr Geschmacksrezeptoren auf einer Zunge des Subjekts binden. In manchen Fällen können die ein oder mehr Geschmacksrezeptoren mindestens einen Geschmacksrezeptor von Typ 1 (TAS1R) umfassen. Der mindestens eine Geschmacksrezeptor von Typ 1 kann TAS1R1, TAS1R2, TAS1R3 oder eine Kombination davon sein. In manchen Fällen können die ein oder mehr Geschmacksrezeptoren mindestens einen Geschmacksrezeptor von Typ 2 (TAS2R) umfassen. Der mindestens eine Geschmacksrezeptor von Typ 2 kann TAS2R1, TAS2R50, TAS2R60 oder eine Kombination davon sein.
  • Die heterologe geschmacksmodifizierende Nukleinsäuresequenz kann ein Miraculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Brazzeinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Curculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Monellinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Thaumatinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, ein Mabinlinprotein oder ein funktionelles Fragment davon, oder ein Pentadinprotein oder ein funktionelles Fragment davon in einer Hefezelle kodieren.
  • In manchen Fällen kann die geschmacksmodifizierende Nukleinsäuresequenz ein Miraculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon kodieren. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle Miraculinprotein oder ein funktionelles Fragment davon in ein Kulturmedium sezernieren. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus dem Phylum Ascomycota sein. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus der Gattung Komagataella oder Kluyveromyces sein. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus der Art Pichia pistoris sein. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus der Art Kluyveromyces lactis sein.
  • Die heterologe geschmacksmodifizierende Nukleinsäuresequenz kann für Expression in der Hefezelle kodonoptimiert sein. Die mindestens eine heterologe Nukleinsäuresequenz kann operabel mit einem induzierbaren Promotor verknüpft sein. Der induzierbare Promotor kann eine Nukleinsäuresequenz aus einem Aox1-Promotor, einem Aox2-Promotor oder einem Lac4-Promotor umfassen. Die mindestens eine heterologe Nukleinsäuresequenz kann operabel mit einem konstitutiven Promotor verknüpft sein. Der konstitutive Promotor kann eine Nukleinsäuresequenz aus einem GAP-Promotor umfassen.
  • In manchen Aspekten können geschmacksmodifizierende Polypeptide in in-vitro-Translationssystemen hergestellt werden. Ein in-vitro-Translationssystem bezieht sich allgemein auf ein Translationssystem, das ein zellfreier Extrakt ist, der Elemente zur Translation eines RNA-Moleküls in ein Protein enthält. Ein in-vitro-Translationssystem kann Ribosomen, tRNAs, den Initiator Methionyl-tRNAMet, Proteine oder an der Translation beteiligte Komplexe umfassen, z.B. elF2, elF3, den Kappen-bindenden (CB-) Komplex umfassend das Kappen-bindende Protein (CBP) und eukaryotischen Initiationsfaktor 4F (elF4F). Eine Vielzahl von in-vitro-Translationssystemen sind erhältlich. Nicht beschränkende Beispiele von in-vitro-Translationssystemen umfassen eukaryotische Lysate wie Kaninchen-Retikulozyten-Lysate, Kaninchen-Oozyten-Lysate, humane Zelllysate, Insektenzelllysate und Weizenkeimextrakte.
  • Geschmacksmodifizierende Polypeptide, die mittels hierin offenbarter rekombinanter Proteinexpressionssysteme hergestellt wurden, können vergleichbare Süßeeigenschaften wie in natürlichen Quellen wie Pflanzen gefundene Proteine haben. Ein Unterschied in der wahrgenommenen Süße zwischen rekombinant hergestellten Polypeptiden und aus natürlichen Quellen isolierten Polypeptiden kann um weniger als 20% variieren (z.B. weniger als 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger). Geschmacksmodifizierende Polypeptide, die mittels hierin offenbarter rekombinanter Proteinexpressionssysteme hergestellt wurden, können vergleichbare geschmacksmodifizierende Eigenschaften wie in natürlichen Quellen gefundene Proteine haben. Ein Unterschied im Ausmaß der Geschmacksmodifikation (z.B. empfundene Süße) zwischen rekombinant hergestellten Polypeptiden und aus natürlichen Quellen isolierten Polypeptiden kann um weniger als 20% variieren (z.B. weniger als 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger). Ein Unterschied in der Länge der Dauer der Geschmacksmodifikation zwischen rekombinant hergestellten Polypeptiden und aus natürlichen Quellen isolierten Polypeptiden kann um weniger als 20% variieren (z.B. weniger als 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger).
  • Die rekombinant hergestellten Polypeptide können glykosyliert sein. Das Glykosylierungsmuster rekombinant hergestellter Polypeptide kann vom natürlich vorkommenden Protein ununterscheidbar sein. In manchen Fällen kann das Glykosylierungsmuster rekombinant hergestellter Polypeptide vom natürlich vorkommenden Protein unterscheidbar sein.
  • In manchen Aspekten umfasst ein rekombinant hergestelltes Polypeptid der Offenbarung keine Xylose. In manchen Fällen umfassen weniger als 10% der mit einem rekombinant hergestellten Polypeptid der Offenbarung (z.B. über Glykosylierung) verknüpften Zuckergruppen Xylose. Zum Beispiel umfassen weniger als etwa 10%, weniger als etwa 9,5%, weniger als etwa 9%, weniger als etwa 8,5%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 7,5%, weniger als etwa 7%, weniger als etwa 6,5%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5,5%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4,5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3,5%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2,5%, weniger als etwa 2%, weniger als etwa 1,5%, weniger als etwa 1% oder weniger als etwa 0,5% der mit einem rekombinant hergestellten Polypeptid der Offenbarung (z.B. über Glykosylierung) verknüpften Zuckergruppen Xylose.
  • Ein Unterschied im Molekulargewicht, zum Beispiel, zwischen rekombinant hergestellten Polypeptiden und aus natürlichen Quellen isolierten Polypeptiden kann um weniger als etwa 20% variieren (z.B. weniger als 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger). In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Protein ein höheres Molekulargewicht haben als ein aus natürlichen Quellen isoliertes Protein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Protein ein niedrigeres Molekulargewicht haben als ein aus natürlichen Quellen isoliertes Protein. Ein Unterschied in der Proteinstabilität, zum Beispiel, zwischen rekombinant hergestellten Polypeptiden und aus natürlichen Quellen isolierten Polypeptiden kann um weniger als etwa 20% variieren (z.B. weniger als 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger). In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Protein stabiler sein als aus natürlichen Quellen isolierte Proteine. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Protein weniger stabil sein als aus natürlichen Quellen isolierte Proteine.
  • Bei geschmacksmodifizierenden Polypeptiden, die mehrere Polypeptidketten umfassen, kann das rekombinant exprimierte Protein nichtkovalent assoziiert sein. In manchen Fällen können die Polypeptidketten durch Disulfidbindungen verknüpft sein. In manchen Fällen können die rekombinant exprimierten Proteine als Monomere, Dimere (z.B. Heterodimere, Homodimere) oder Tetramere auftreten.
  • III. Gewinnung und Aufreinigung geschmacksmodifizierender Polypeptide
  • Hierin beschriebene exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide können zum Beispiel aus dem Überstand einer Zellkultur gewonnen und/oder aufgereinigt werden, wenn das exprimierte Protein durch die Wirtszelle ins Zellkulturmedium sezerniert wird. Hierin beschriebene exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide können in manchen Fällen aus der Wirtszelle gewonnen werden, wenn zum Beispiel das Protein intrazellulär exprimiert wird. Proteine können aus dem intrazellulären Raum durch Zerstören der Wirtszelle, beispielsweise durch osmotischen Schock, Sonifizierung oder Lyse, gewonnen werden. Wenn die Zellen zerstört sind, können Zelltrümmer durch Zentrifugation oder Filtration entfernt werden und die exprimierten Proteine können aus dem Zelllysat entfernt oder gewonnen werden.
  • In manchen Aspekten können die Polypeptide unter Verwendung von in vitro- oder zellfreien Proteinsynthesesystemen hergestellt werden, zum Beispiel mittels eines zellfreien Translationssystems umfassend einen Zellextrakt wie Escherichia coli-Zellextrakt, Kaninchen-Retikulozyten-Zellextrakt, Weizenkeimzellextrakt oder Insektenzellextrakt. Das exprimierte Protein kann aus dem Zellextrakt durch jedes geeignete Verfahren gewonnen, isoliert und/oder optional aufgereinigt werden.
  • Polypeptide können aus Überständen und Lysaten durch jegliche einer Vielzahl von Verfahren gewonnen und/oder isoliert werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf chemische Extraktion, Säulenchromatographie und Filtration. Die Polypeptide können mittels einer Vielzahl von Verfahren aufgereinigt werden, einschließlich Flüssigkeitschromatographie, wie etwa normaler oder reverse-Phase-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) und dergleichen; Affinitätschromatographie, wie etwa mit anorganischen Liganden, monoklonalen Antikörpern (z.B. Immunaffinität) und lonenaustausch (z.B. Anionenaustausch, Kationenaustausch); hydrophober Wechselwirkungschromatographie; Größenausschlusschromatographie; Chromatographie mit immobilisierten Metallchelaten; Gelelektrophorese; Ethanolfällung; und jeglicher Kombination davon. In manchen Fällen können die Polypeptide durch Zentrifugation und/oder Filtration aufgereinigt werden, einschließlich Sterilfiltration, Tiefenfiltration, Tangentialfluss-Filtration, Ultrafiltration (UF), Diafiltration (DF) und Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF).
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Isolieren eines heterologen geschmacksmodifizierenden Proteins oder eines funktionellen Fragments davon aus einem Kulturmedium rekombinanter Hefezellen bereit. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus dem Phylum Ascomycota sein. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus der Gattung Komagataella oder Kluyveromyces sein. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus der Art Pichia pastoris sein. In manchen Fällen kann die rekombinante Hefezelle aus der Art Kluyveromyces lactis sein.
  • In manchen Aspekten kann das Verfahren das Filtrieren eines Überstands mit dem geschmacksmodifizierenden Protein oder funktionellen Fragment davon aus dem Hefezell-Kulturmedium durch eine poröse Membran umfassen, wodurch das Protein isoliert wird. In manchen Fällen kann das Verfahren das Inkubieren der rekombinanten Hefezelle über eine Zeitdauer umfassen, so dass die Hefezelle das geschmacksmodifizierende Protein in den Überstand sezerniert.
  • Das geschmacksmodifizierende Protein kann jegliches hierin bereitgestellte Polypeptid sein. Das geschmacksmodifizierende Protein kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus: einem Miraculinprotein oder funktionellen Fragment davon, einem Brazzeinprotein oder funktionellen Fragment davon, einem Curculinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Monellinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Thaumatinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, einem Mabinlinprotein oder einem funktionellen Fragment davon, und einem Pentadinprotein oder einem funktionellen Fragment davon. In manchen Fällen kann das heterologe Protein ein geschmacksmodifizierendes Protein sein, und das geschmacksmodifizierende Protein kann Miraculin oder ein funktionelles Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das heterologe Protein ein geschmacksmodifizierendes Protein sein, und das geschmacksmodifizierende Protein kann Brazzein oder ein funktionelles Fragment davon sein.
  • Die poröse Membran kann Poren jeglicher geeigneten Größe haben. Die Porengröße kann ausgewählt werden, um entweder das heterolog exprimierte Polypeptid auszuschließen und unerwünschte Verunreinigungen zurückzuhalten oder unerwünschte Verunreinigungen auszuschließen und das heterolog exprimierte Polypeptid zurückzuhalten. In manchen Fällen kann die poröse Membran Poren im Bereich von etwa 0,01 µm bis etwa 0,5 µm Durchmesser, von etwa 0,1 µm bis etwa 0,4 µm Durchmesser oder von etwa 0,2 µm bis etwa 0,3 µm Durchmesser umfassen. Die poröse Membran kann Poren umfassen, die einen Durchmesser von mindestens etwa 0,01 µm, etwa 0,02 µm, etwa 0,03 µm, etwa 0,04 µm, etwa 0,05 µm, etwa 0,06 µm, etwa 0,07 µm, etwa 0,08 µm, etwa 0,09 µm, etwa 0,1 µm, etwa 0,2 µm, etwa 0,3 µm, etwa 0,4 µm, etwa 0,5 µm, etwa 0,6 µm, etwa 0,7 µm, etwa 0,8 µm, etwa 0,8 µm, etwa 0,9 µm oder etwa 1 µm haben.
  • In manchen Aspekten kann das Verfahren das Einstellen des pH des filtrierten Übertands umfassen. Zum Beispiel kann der filtrierte Überstand auf einen sauren pH eingestellt werden. In manchen Fällen kann der filtrierte Überstand auf einen basischen pH eingestellt werden.
  • In manchen Fällen können Verunreinigungen in der gewonnenen Polypeptidprobe verbleiben. In manchen Fällen können eine oder mehr im gewonnen Protein vorhandene Verunreinigungen aus einer Wirtszelle sein. Zum Beispiel kann das Gemisch Verunreinigungen umfassen ausgewählt aus Wirtszellproteinen, Wirtszellmetaboliten, konstitutiven Wirtszellproteinen, Nukleinsäuren, Endotoxinen, Viren, produktbezogenen Verunreinigungen, Lipiden, Medienzusätzen und Medienderivaten. In einem spezifischen Fall ist die Kultur eine Hefezellkultur, wie etwa eine K. lactis-Kultur, und die eine oder mehr Verunreinigungen umfassen Hefezellproteine, Hefezellmetaboliten und/oder Hefezellnukleinsäuren.
  • In manchen Aspekten kann der Gesamtgehalt der Verunreinigungen weniger als etwa 20 Gew.-% (w/w), weniger als etwa 19% w/w, weniger als etwa 18% w/w, weniger als etwa 17% w/w, weniger als etwa 16% w/w, weniger als etwa 15% w/w, weniger als etwa 14% w/w, weniger als etwa 13% w/w, weniger als etwa 12% w/w, weniger als etwa 11% w/w, weniger als etwa 10% w/w, weniger als etwa 9% w/w, weniger als etwa 8% w/w, weniger als etwa 7% w/w, weniger als etwa 6% w/w, weniger als etwa 5% w/w, weniger als etwa 4% w/w, weniger als etwa 3% w/w, weniger als etwa 2% w/w, weniger als etwa 1% w/w, weniger als etwa 0,9% w/w, weniger als etwa 0,8% w/w, weniger als etwa 0,7% w/w, weniger als etwa 0,6% w/w, weniger als etwa 0,5% w/w, weniger als etwa 0,4% w/w, weniger als etwa 0,3% w/w, weniger als etwa 0,2% w/w, weniger als etwa 0,1% w/w oder weniger sein.
  • In manchen Fällen kann die Verunreingungskonzentration etwa 1 bis etwa 10 Teile pro Million (ppm), etwa 1 bis etwa 20 ppm, etwa 1 bis etwa 30 ppm, etwa 1 bis etwa 40 ppm, etwa 1 bis etwa 50 ppm, etwa 1 bis etwa 100 ppm, etwa 1 bis etwa 1000 ppm, etwa 10 bis etwa 100 ppm, etwa 20 bis etwa 100 ppm, etwa 50 bis etwa 200 ppm oder etwa 50 bis etwa 500 ppm sein. In manchen Fällen ist die Verunreingungskonzentration etwa 1 ppm, etwa 5 ppm, etwa 10 ppm, etwa 15 ppm, etwa 20 ppm, etwa 25 ppm, etwa 30 ppm, etwa 35 ppm, etwa 40 ppm oder etwa 50 ppm. In manchen Fällen ist die Verunreingungskonzentration weniger als etwa 1000 ppm, etwa 500 ppm, etwa 400 ppm, etwa 300 ppm, etwa 200 ppm, etwa 150 ppm, etwa 100 ppm, etwa 75 ppm, etwa 50 ppm, etwa 40 ppm, etwa 30 ppm, etwa 20 ppm oder etwa 10 ppm.
  • Die aufgereinigten Polypeptide können in jedem geeigneten Puffer oder Medium und bei jeder gewünschten Konzentration gelagert werden. In manchen Fällen kann das Polypeptid in einem flüssigen Träger gelagert werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Wasser, einem Alkohol, Propylenglykol, Triacetin, mittelkettigen Triglyceriden, Glycerin und Kombinationen davon. In manchen Fällen kann der flüssige Träger Wasser sein.
  • In manchen Fällen kann das Polypeptid in fester Form gelagert werden. In manchen Fällen kann das Polypeptid in kristalliner Form gelagert werden. In manchen Fällen kann das Polypeptid in amorpher Form sein. In manchen Fällen kann das Polypeptid einen festen Träger beschichten. In manchen Fällen kann der feste Träger Partikel sein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Lactose, modifizierter Lebensmittelstärke, Gummi arabicum, Maltodextrin, modifizierter Maisstärke, Dextrose, Xanthangummi, Carboxymethylcellulose, Cellulosegel, Cellulosegummi, Natriumcaseinat, Carrageenan und Kombinationen davon.
  • In manchen Fällen ist der Gesamtpolypeptidgehalt mindestens etwa 70 Gew.-% (w/w), mindestens etwa 71% w/w, mindestens etwa 72% w/w, mindestens etwa 73% w/w, mindestens etwa 74% w/w, mindestens etwa 75% w/w, mindestens etwa 76% w/w, mindestens etwa 77% w/w, mindestens etwa 78% w/w, mindestens etwa 79% w/w, mindestens etwa 80% w/w, mindestens etwa 81% w/w, mindestens etwa 82% w/w, mindestens etwa 83% w/w, mindestens etwa 84% w/w, mindestens etwa 85% w/w, mindestens etwa 86% w/w, mindestens etwa 87% w/w, mindestens etwa 88% w/w, mindestens etwa 89% w/w, mindestens etwa 90% w/w, mindestens etwa 91% w/w, mindestens etwa 92% w/w, mindestens etwa 93% w/w, mindestens etwa 94% w/w, mindestens etwa 95% w/w, mindestens etwa 96% w/w, mindestens etwa 97% w/w, mindestens etwa 98% w/w oder mindestens etwa 99% w/w.
  • In manchen Fällen ist der Gesamtpolypeptidgehalt mindestens etwa 0,01 mg/ml, mindestens etwa 0,02 mg/ml, mindestens etwa 0,03 mg/ml, mindestens etwa 0,04 mg/ml, mindestens etwa 0,05 mg/ml, mindestens etwa 0,06 mg/ml, mindestens etwa 0,07 mg/ml, mindestens etwa 0,08 mg/ml, mindestens etwa 0,09 mg/ml, mindestens etwa 0,1 mg/ml, mindestens etwa 0,2 mg/ml, mindestens etwa 0,3 mg/ml, mindestens etwa 0,4 mg/ml, mindestens etwa 0,5 mg/ml, mindestens etwa 0,6 mg/ml, mindestens etwa 0,7 mg/ml, mindestens etwa 0,8 mg/ml, mindestens etwa 0,9 mg/ml oder mindestens etwa 1,0 mg/ml.
  • IV. Gewinnung geschmacksmodifizierender Polypeptide aus Pflanzen
  • In manchen Aspekten können geschmacksmodifizierende Agentien der vorliegenden Offenbarung aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert werden. Geschmacksmodifizierende Agentien der vorliegenden Offenbarung können auch rekombinant durch eine Vielzahl von Proteinexpressionssystemen hergestellt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf zellbasierte Expressionssysteme und zellfreie Expressionssysteme, wie vorgehend beschrieben.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Aufreinigung geschmacksmodifizierender Polypeptide aus Pflanzen und/oder Pflanzenextrakten bereit. Pflanzen oder Beeren davon, die die geschmacksmodifizierenden Polypeptide enthalten, können homogenisiert werden, um Pflanzenextrakte zu liefern. Pflanzenzellen können Pflanzenzelllyse unterworfen werden, um Pflanzenextrakte zu liefern. Geschmacksmodifizierende Polypeptide in Extrakten und Lysaten können durch eine Vielzahl von Verfahren gewonnen und/oder isoliert werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf chemische Extraktion, Säulenchromatographie und Filtration. Die Polypeptide können mittels einer Vielzahl von Verfahren aufgereinigt werden, einschließlich Flüssigkeitschromatographie, wie etwa normaler oder reverse-Phase-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) und dergleichen; Affinitätschromatographie, wie etwa mit anorganischen Liganden, monoklonalen Antikörpern (z.B. Immunaffinität) und lonenaustausch (z.B. Anionenaustausch, Kationenaustausch); hydrophober Wechselwirkungschromatographie; Größenausschlusschromatographie; Chromatographie mit immobilisierten Metallchelaten; Gelelektrophorese; Ethanolfällung; und jeglicher Kombination davon. Die Polypeptide können durch Zentrifugation und/oder Filtration aufgereinigt werden, einschließlich Sterilfiltration, Tiefenfiltration, Tangentialfluss-Filtration, Ultrafiltration (UF), Diafiltration (DF) und Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF).
  • In manchen Aspekten kann ein Verfahren zum Aufreinigen eines Proteins aus einem Pflanzenextrakt zuerst Filtern des Pflanzenextrakts mit dem geschmacksmodifizierenden Polypeptid oder funktionellen Fragment davon durch eine poröse Membran umfassen, um ein erstes Filtrat zu erhalten. Die poröse Membran kann Poren jeglicher geeigneten Größe haben. Die Porengröße kann ausgewählt werden, um entweder das heterolog exprimierte Polypeptid auszuschließen und unerwünschte Verunreinigungen zurückzuhalten oder unerwünschte Verunreinigungen auszuschließen und das heterolog exprimierte Polypeptid zurückzuhalten. In manchen Fällen kann die poröse Membran Poren im Bereich von etwa 0,01 µm bis etwa 0,5 µm Durchmesser, von etwa 0,1 µm bis etwa 0,4 µm Durchmesser oder von etwa 0,2 µm bis etwa 0,3 µm Durchmesser umfassen. Die poröse Membran kann Poren umfassen, die einen Durchmesser von mindestens etwa 0,01 µm, etwa 0,02 µm, etwa 0,03 µm, etwa 0,04 µm, etwa 0,05 µm, etwa 0,06 µm, etwa 0,07 µm, etwa 0,08 µm, etwa 0,09 µm, etwa 0,1 µm, etwa 0,2 µm, etwa 0,3 µm, etwa 0,4 µm, etwa 0,5 µm, etwa 0,6 µm, etwa 0,7 µm, etwa 0,8 µm, etwa 0,9 µm oder etwa 1 µm haben.
  • In manchen Fällen kann ein hydrostatischer Druck angewendet werden, um eine Menge einer Flüssigkeit gegen eine semipermeable Membran zu drücken. In manchen Fällen kann die gegen die semipermeable Membran gedrückte Flüssigkeit mit einer Rate im Bereich von etwa 550 ml/Minute bis etwa 650 ml/Minute fließen, z.B. von etwa 575 ml/Minute bis etwa 625 ml/Minute. In manchen Fällen kann die Flussrate der Flüssigkeit etwa 550 ml/Minute, etwa 575 ml/Minute, etwa 600 ml/Minute, etwa 625 ml/Minute oder etwa 650 ml/Minute sein.
  • In manchen Fällen kann der hydrostatische Druck im Bereich von etwa 20 psi bis etwa 30 psi, etwa 22 psi bis etwa 28 psi oder etwa 24 psi bis etwa 36 psi liegen. In manchen Fällen kann der hydrostatische Druck etwa 15 psi, etwa 20 psi, etwa 25 psi, etwa 30 psi oder etwa 35 psi betragen. Der Pflanzenextrakt kann vor dem Filtrieren zentrifugiert werden. Danach kann das erste Filtrat durch eine Nickelaffinitätssäule filtriert werden, wodurch ein aufgereinigtes Protein aus dem Pflanzenextrakt erhalten wird. In manchen Fällen kann das Protein einen Histidintag umfassend mindestens zwei Histidin-Aminosäurereste umfassen.
  • Das aufgereinigte Protein kann aus dem Pflanzenextrakt dialysiert werden. Das Verfahren kann Einstellen des pH des filtrierten Überstands umfassen. Zum Beispiel kann der filtrierte Überstand auf einen sauren pH eingestellt werden. In manchen Fällen kann der filtrierte Überstand auf einen basischen pH eingestellt werden.
  • Verunreinigungen können in der gewonnenen Polypeptidprobe verbleiben. Eine oder mehr im gewonnen Protein vorhandene Verunreinigungen können aus der Pflanze und/oder Pflanzenzellen sein. Zum Beispiel kann das Gemisch Verunreinigungen umfassen ausgewählt aus Pflanzenzellproteinen, Pflanzenzellmetaboliten, konstitutiven Pflanzenzellproteinen, Nukleinsäuren, Endotoxinen, Viren und jeglicher Kombination davon.
  • In manchen Aspekten kann der Gesamtgehalt der Verunreinigungen weniger als etwa 20 Gew.-% (w/w), weniger als etwa 19% w/w, weniger als etwa 18% w/w, weniger als etwa 17% w/w, weniger als etwa 16% w/w, weniger als etwa 15% w/w, weniger als etwa 14% w/w, weniger als etwa 13% w/w, weniger als etwa 12% w/w, weniger als etwa 11% w/w, weniger als etwa 10% w/w, weniger als etwa 9% w/w, weniger als etwa 8% w/w, weniger als etwa 7% w/w, weniger als etwa 6% w/w, weniger als etwa 5% w/w, weniger als etwa 4% w/w, weniger als etwa 3% w/w, weniger als etwa 2% w/w, weniger als etwa 1% w/w, weniger als etwa 0,9% w/w, weniger als etwa 0,8% w/w, weniger als etwa 0,7% w/w, weniger als etwa 0,6% w/w, weniger als etwa 0,5% w/w, weniger als etwa 0,4% w/w, weniger als etwa 0,3% w/w, weniger als etwa 0,2% w/w, weniger als etwa 0,1% w/w oder weniger sein.
  • In manchen Fällen kann die Verunreingungskonzentration etwa 1 bis etwa 10 Teile pro Million (ppm), etwa 1 bis etwa 20 ppm, etwa 1 bis etwa 30 ppm, etwa 1 bis etwa 40 ppm, etwa 1 bis etwa 50 ppm, etwa 1 bis etwa 100 ppm, etwa 1 bis etwa 1000 ppm, etwa 10 bis etwa 100 ppm, etwa 20 bis etwa 100 ppm, etwa 50 bis etwa 200 ppm oder etwa 50 bis etwa 500 ppm sein. In manchen Fällen ist die Verunreingungskonzentration etwa 1 ppm, etwa 5 ppm, etwa 10 ppm, etwa 15 ppm, etwa 20 ppm, etwa 25 ppm, etwa 30 ppm, etwa 35 ppm, etwa 40 ppm oder etwa 50 ppm. In manchen Fällen ist die Verunreingungskonzentration weniger als etwa 1000 ppm, etwa 500 ppm, etwa 400 ppm, etwa 300 ppm, etwa 200 ppm, etwa 150 ppm, etwa 100 ppm, etwa 75 ppm, etwa 50 ppm, etwa 40 ppm, etwa 30 ppm, etwa 20 ppm oder etwa 10 ppm.
  • Zusammensetzungen umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide
  • Die vorliegende Offenbarung stellt weiter Zusammensetzungen umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide bereit, die einem Subjekt verabreicht werden können. Die Zusammensetzung kann oral verabreicht werden, zum Beispiel als eine orale Dosierung. Nicht beschränkende Beispiele geschmacksmodifizierender Polypeptide, die für Zusammensetzungen hierin erwogen werden, umfassen jegliches hierin beschriebene geschmacksmodifizierende Polypeptid (oder funktionelle Fragmente davon), einschließlich der Proteine Brazzein, Pentadin, Thaumatin (z.B. Thaumatin I, Thaumatin II), Monellin, Mabinlin (z.B. Mabinlin-1, Mabinlin-2, Mabinlin-3, Mabinlin-4), Miraculin, Curculin. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid rekombinant exprimiert werden (z.B. in einer rekombinanten Hefe, einem rekombinanten Bakterium oder einer rekombinanten Säugerzelle) und gemäß der Offenbarung aufgereinigt werden. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid natürlich hergestellt werden (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). In einem nicht beschränkenden Beispiel kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid unaufgereinigt aus einer natürlichen Pflanzenquelle sein (z.B. gefriergetrocknetes Beerenpulver umfassend das geschmacksmodifizierende Polypeptid). In einem anderen nicht beschränkenden Beispiel kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid aus einer natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Zusammensetzungen der Offenbarung können die Form von Flüssigkeiten, Aerosolen und Feststoffen annehmen, deren nicht beschränkende Beispiele Lösungen, Elixiere, Sirupe, Getränke (z.B. Kaffee, Tee, Säfte, Brausen), Breie, Suspensionen, Emulsionen, Kolloide, Aerosole, Dämpfe, Sprays, Nebel, Filme, Tabletten, Pillen, Kapseln, Gele, Gelees, Kompotts, Pürees, Gelatinen, Pastillen, harte Süßigkeiten, Eiscreme, gefrorene Leckereien (z.B. Stieleis) und andere gefrorene Zubereitungen, Waffeln, Pulver, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung, Beschichtungen und dergleichen umfassen.
  • Die Zusammensetzungen können in einer Einheitsdosisform formuliert sein. Der Ausdruck „Einheitsdosisform(en)“ wie hierin verwendet bezieht sich auf physisch diskrete Einheiten, die als einzelne Dosen für humane Subjekte und andere Säuger geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge geschmacksmodifizierendes Polypeptid enthält, die berechnet ist, um den gewünschten Geschmackseffekt zu erzielen. Die Menge an aufgereinigtem Polypeptid oder funktionellem Fragment davon pro Einheitsdosis kann ausgewählt werden, um ein gewünschtes Niveau und/oder Dauer geschmacksmodifizierender Polypeptidaktivität zum Beispiel in einem humanen Subjekt zu erreichen, und kann weiter von der jeweiligen Formulierung abhängen. Der Ausdruck „Dosis“ wie hierin verwendet bezieht sich auf die Quantität von geschmacksmodifizierendem Polypeptid, das einem Subjekt auf einmal (Einheitsdosis) oder in zwei oder mehr Verabreichungen über ein definiertes Zeitintervall verabreicht wird.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung eine orale Dosisform umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid bereit. In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein Brazzeinprotein oder jegliches funktionelle Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinant exprimiertes Brazzeinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon sein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Brazzeinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon aufgereinigt sein. In manchen Fällen kann das Brazzeinprotein natürlich hergestellt sein (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). Das natürlich hergestellte Brazzeinprotein kann unaufgereinigt oder aus der natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch zur Sequenz von Wildtyp-Brazzein in Tabelle 1 sein.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein Pentadinprotein oder jegliches funktionelle Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinant exprimiertes Pentadinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon sein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Pentadinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon aufgereinigt sein. In manchen Fällen kann das Pentadinprotein natürlich hergestellt sein (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). Das natürlich hergestellte Pentadinprotein kann unaufgereinigt oder aus der natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch zur Sequenz von Wildtyp-Pentadin sein.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein Thaumatinprotein (z.B. Thaumatin I, Thaumatin II) oder jegliches funktionelle Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinant exprimiertes Thaumatinprotein (z.B. Thaumatin I, Thaumatin II) oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon sein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Thaumatinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon aufgereinigt sein. In manchen Fällen kann das Thaumatinprotein natürlich hergestellt sein (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). Das natürlich hergestellte Thaumatinprotein kann unaufgereinigt oder aus der natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch zur Sequenz von Wildtyp-Thaumatin I oder -Thaumatin II in Tabelle 2 sein.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein Monellinprotein oder jegliches funktionelle Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinant exprimiertes Monellinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon sein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Monellinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon aufgereinigt sein. In manchen Fällen kann das Monellinprotein natürlich hergestellt sein (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). Das natürlich hergestellte Monellinprotein kann unaufgereinigt oder aus der natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch zur Sequenz von Wildtyp-Monellin in Tabelle 3 sein.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein Mabinlinprotein (z.B. Mabinlin-1, Mabinlin-2, Mabinlin-3, Mabinlin-4) oder jegliches funktionelle Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinant exprimiertes Mabinlinprotein (z.B. Mabinlin-1, Mabinlin-2, Mabinlin-3, Mabinlin-4) oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon sein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Mabinlinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon aufgereinigt sein. In manchen Fällen kann das Mabinlinprotein natürlich hergestellt sein (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). Das natürlich hergestellte Mabinlinprotein kann unaufgereinigt oder aus der natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch zur Sequenz eines Wildtyp-Mabinlinproteins (z.B. Mabinlin-1, Mabinlin-2, Mabinlin-3, Mabinlin-4) in Tabelle 4 sein.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein Miraculinprotein oder jegliches funktionelle Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinant exprimiertes Miraculinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon sein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Miraculinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon aufgereinigt sein. In manchen Fällen kann das Miraculinprotein natürlich hergestellt sein (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). Das natürlich hergestellte Miraculinprotein kann unaufgereinigt oder aus der natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch zur Sequenz von Wildtyp-Miraculin in Tabelle 5 sein.
  • In manchen Aspekten kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein Curculinprotein oder jegliches funktionelle Fragment davon sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinant exprimiertes Curculinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon sein. In manchen Fällen kann das rekombinant exprimierte Curculinprotein oder jegliches funktionelle Fragment oder Mutante davon aufgereinigt sein. In manchen Fällen kann das Curculinprotein natürlich hergestellt sein (z.B. durch eine natürliche Pflanzenquelle). Das natürlich hergestellte Curculinprotein kann unaufgereinigt oder aus der natürlichen Pflanzenquelle aufgereinigt sein. Das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch zur Sequenz von Wildtyp-Curculin in Tabelle 6 sein.
  • In manchen Aspekten kann die orale Dosierungsform mindestens etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg, etwa 0,500 mg, etwa 0,525 mg, etwa 0,550 mg, etwa 0,575 mg, etwa 0,600 mg, etwa 0,625 mg, etwa 0,650 mg, etwa 0,675 mg, etwa 0,700 mg, etwa 0,725 mg, etwa 0,750 mg, etwa 0,775 mg, etwa 0,800 mg, etwa 0,825 mg, etwa 0,850 mg, etwa 0,875 mg, etwa 0,900 mg, etwa 0,925 mg, etwa 0,950 mg, etwa 0,975 mg oder etwa 1000 mg aufgereinigtes Polypeptid pro Einheitsdosis umfassen.
  • In manchen Aspekten kann die orale Dosierungsform höchstens etwa 0,500 mg, etwa 0,475 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,002 mg oder etwa 0,001 mg aufgereinigtes Polypeptid pro Einheitsdosis umfassen.
  • In manchen Aspekten kann die orale Dosierungsform von etwa 0,001 mg bis etwa 0,5 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,4 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,3 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,2 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,1 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,090 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,080 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,070 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,060 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,050 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,040 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,030 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,020 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,010 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,009 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,008 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,007 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,006 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,005 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,004 mg, etwa 0,001 mg bis etwa 0,003 mg oder etwa 0,001 mg bis etwa 0,002 mg aufgereinigtes Polypeptid pro Einheitsdosis umfassen.
  • In manchen Aspekten kann der Gesamtpolypeptidgehalt in einer oralen Dosierungsform etwa 1 Gew.-% (w/w), etwa 2% w/w, etwa 3% w/w, etwa 4% w/w, etwa 5% w/w, etwa 6% w/w, etwa 7% w/w, etwa 8% w/w, etwa 9% w/w, etwa 10% w/w, etwa 11% w/w, etwa 12% w/w, etwa 13% w/w, etwa 14% w/w, etwa 15% w/w, etwa 16% w/w, etwa 17% w/w, etwa 18% w/w, etwa 19% w/w, etwa 20% w/w, etwa 21% w/w, etwa 22% w/w, etwa 23% w/w, etwa 24% w/w, etwa 25% w/w, etwa 26% w/w, etwa 27% w/w, etwa 28% w/w, etwa 29% w/w, etwa 30% w/w, etwa 31% w/w, etwa 32% w/w, etwa 33% w/w, etwa 34% w/w, etwa 35% w/w, etwa 36% w/w, etwa 37% w/w, etwa 38% w/w, etwa 39% w/w, etwa 40% w/w, etwa 41% w/w, etwa 42% w/w, etwa 43% w/w, etwa 44% w/w, etwa 45% w/w, etwa 46% w/w, etwa 47% w/w, etwa 48% w/w, etwa 49% w/w, etwa 50% w/w, etwa 51% w/w, etwa 52% w/w, etwa 53% w/w, etwa 54% w/w, etwa 55% w/w, etwa 56% w/w, etwa 57% w/w, etwa 58% w/w, etwa 59% w/w, etwa 60% w/w, etwa 61% w/w, etwa 62% w/w, etwa 63% w/w, etwa 64% w/w, etwa 65% w/w, etwa 66% w/w, etwa 67% w/w, etwa 68% w/w, etwa 69% w/w, etwa 70% w/w, etwa 71% w/w, etwa 72% w/w, etwa 73% w/w, etwa 74% w/w, etwa 75% w/w, etwa 76% w/w, etwa 77% w/w, etwa 78% w/w, etwa 79% w/w, etwa 80% w/w, etwa 81% w/w, etwa 82% w/w, etwa 83% w/w, etwa 84% w/w, etwa 85% w/w, etwa 86% w/w, etwa 87% w/w, etwa 88% w/w, etwa 89% w/w, etwa 90% w/w, etwa 91% w/w, etwa 92% w/w, etwa 93% w/w, etwa 94% w/w, etwa 95% w/w, etwa 96% w/w, etwa 97% w/w, etwa 98% w/w oder etwa 99% w/w sein.
  • Hierin offenbarte geschmacksmodifizierende Polypeptide können zu einem oder mehr Zusatzstoffen zugegeben oder mit ihnen gemischt werden. Zusatzstoffe können zum Beispiel verwendet werden, um die mit der Herstellung der hierin beschriebenen Zusammensetzungen, z.B. Dosierungsformen, assoziierten Prozesse zu erleichtern. Diese Prozesse können zum Beispiel Agglomeration, Luftsuspensionskühlung, Luftsuspensionstrocknung, Verballung, Koazervation, Komminution, Kompression, Pelletisierung, Kryopelletisierung, Verkapselung, Extrusion, Granulation, Homogenisierung, Einschlusskomplexierung, Lyophilisierung, Nanoverkapselung, Schmelzen, Mischen, Formen, Pfannenbeschichtung, Dehydrierung, Lösungsmitteldehydrierung, Sonifizierung, Sphäronisierung, Sprühkühlung, Sprüherstarrung, Sprühtrocknung oder andere Prozesse umfassen.
  • In verschiedenen hierin beschriebenen Ausführungsformen verwendete geeignete Zusatzstoffe können, als nicht beschränkende Beispiele, Adsorbierungsmittel, Antiadhäsionsmittel, Antikoagulantien, Antischaummittel, Antioxidantien, Antiklumpmittel, antistatische Agentien, Binder, Gallensäuren, Pufferanten, Füllstoffe (auch als Hilfsstoffe bezeichnet), Chelierungsmittel, Koagulantien, Färbemittel, Zusatzlösungsmittel, Opakisierungsmittel, Erstarrungsmittel, Kühlmittel, Kryoprotektanten, Verdünnungsmittel, Entfeuchtungsmittel, Trocknungsmittel, Desensibilisierungsmittel, Sprengmittel, Dispersionsagentien, Enzyminhibitoren, Gleitstoffe, Füllmaterial, Hydrierungsmittel, Supersprengmittel, Gummis, Schleimstoffe, Wasserstoffbindungsmittel, Enzyme, Geschmacksstoffe, Feuchthaltemittel, Befeuchtungsmittel, Schmieröle, Ionenaustauschharze, Schmierstoffe, Weichmacher, pH-modifizierende Agentien, Konservierungsmittel, Festigungsmittel, Lösungsmittel, Lösungsvermittler, Spreitmittel, Süßungsmittel, Stabilisatoren, Oberflächenvergrößerungsmittel, Suspensionsmittel, Verdickungsmittel, viskositätserhöhende Agentien, Wachse und Mischungen davon umfassen. In manchen Fällen kann ein Zusatzstoff Volumen und/oder Masse zu einer Zusammensetzung, z.B. einer oralen Dosierungsform, hinzufügen. In manchen Fällen kann ein Zusatzstoff die funktionelle Leistung und/oder physikalischen Charakteristika der Zusammensetzung verbessern. In manchen Fällen kann ein Zusatzstoff die Haltbarkeit der Zusammensetzung erhöhen. Zusatzstoffe sind vorzugsweise nichttoxisch für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann eine Lebensmittelfarbe umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Lebensmittelfarben, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen FD&C Gelb #5, FD&C Gelb #6, FD&C Rot #40, FD&C Rot #3, FD&C Blau Nr. 1, FD&C Blau Nr. 2, FD&C Grün Nr. 3, Carotenoide (z.B. Safran, β-Carotin), Annatto, Betanin, Blaue Klitorie, Karamellfarbe, Chlorophyllin, Holunderbeersaft, Lykopen, Karmin, Pandan, Paprika, Kurkuma, Kurkuminoide, Chinolingelb, Karmoisin, Ponceau 4R, Patentblau V und Grün S.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann auch einen pH-Einsteller umfassen, auch als ein Puffer bezeichnet. Nicht beschränkende Beispiele von pH-Einstellern, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Tris-Puffer, Kaliumphosphat, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Zitronensäure, Natriumcitrat, Natriumbicarbonat und Chlorwasserstoffsäure. Ein pH-Einsteller kann als ein pH-Stabilisator dienen.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann ein Stabilisierungsmittel oder ein Bindemittel umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Stabilisierungsmitteln oder Bindemitteln, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Kappa-Carrageenan, lota-Carrageenan, Lambda-Carrageenan, Triethylcitrat, Xanthangummi, Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxymethylcellulose und Polyacrylamide.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann ein Emulsionsmittel umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Emulsionsmitteln, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen ein Tensid, ein Polysaccharid, ein Lectin und ein Phospholipid.
  • In manchen Fällen kann das Emulsionsmittel ein Tensid sein. Nicht beschränkende Beispiele von Tensiden umfassen Polysorbat, zum Beispiel Polysorbat 20 (TWEEN® 20), Polysorbat 40 (TWEEN® 40), Polysorbat 60 (TWEEN® 60), Polysorbat 61 (TWEEN® 61), Polysorbat 65 (TWEEN® 65), Polysorbat 80 (TWEEN® 80) und Polysorbat 81 (TWEEN® 81); Poloxamer (Polyethylen-Polypropylen-Kopolymere), zum Beispiel Poloxamer 124 (PLURONIC® L44), Poloxamer 181 (PLURONIC® L61), Poloxamer 182 (PLURONIC® L62), Poloxamer 184 (PLURONIC® L64), Poloxamer 188 (PLURONIC® F68), Poloxamer 237 (PLURONIC® F87), Poloxamer 338 (PLURONIC® L108), Poloxamer 407 (PLURONIC® F127); Polyoxyethylenglykol-Dodecylether, zum Beispiel BRIJ® 30 und BRIJ® 35; 2-Dodecoxyethanol (LUBROL®-PX); Polyoxyethylen-Octylphenylether (TRITON® X-100); Natriumdodecylsulfat (SDS); 34(3-Cholamidopropyl)dimethylammoniol-l-propansulfonat (CHAPS); 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO); Saccharose-Monolaureat; und Natriumcholat.
  • In manchen Fällen kann das Emulsionsmittel ein Polysaccharid sein. Nicht beschränkende Beispiele von Polysacchariden umfassen Guarkernmehl, Agar, Alginat, Calgen, ein Dextran (z.B. Dextran 1K, Dextran 4K, Dextran 40K, Dextran 60K und Dextran 70K), Dextrin, Glykogen, Inulin, Stärke (z.B. Maisstärke, Tapiokastärke), ein Stärkederivat (wie etwa Hydroxymethylstärke, Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, Hydroxybutylstärke und Hydroxypentylstärke), Hetastärke, Cellulose, FICOLL, Methylcellulose (MC), Carboxymethylcellulose (CMC), Hydroxyethylcellulose (HEC), Hydroxypropylcellulose (HPC), Hydroxyethylmethylcellulose (NEMC), Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC); Polivinylacetate (PVA); Polivinylpyrrolidone (PVP), auch als Providone bekannt, mit einem K-Wert von weniger als oder gleich 18, einem K-Wert größer als 18 oder weniger als oder gleich 95, oder einem K-Wert größer als 95, wie etwa PVP 12 (KOLLIDON® 12), PVP 17 17), PVP 25 25), PVP 30 30), PVP 90 90); und Polyethylenimine (PEI).
  • In manchen Fällen kann das Emulsionsmittel ein Lectin sein. Nicht beschränkende Beispiele von Lectinen, die in Zusammensetzungen hierin umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide verwendet werden können, umfassen Mannosebindende Lectine, Galactose/N-Acetylgalactosamin-bindende Lectine, N-Acetylglucosaminbindende Lectine, N-Acetylneuramin-bindende Lectine, N-Acetylneuraminsäure-bindende Lectine und Fucose-bindende Lectine. Nicht beschränkende Beispiele von Lectinen umfassen Concanavain A, Linsenlectin, Schneeglöckchenlectin, roin, Erdnussagglutinin, j-Acain, Zottelwickenlectin, Weizenkeimagglutinin, Holunderbeerenlectin, Maackia anurensis-Leukoagglutinin, Maackia anurensis-Hämagglutinin, Ulex europaeus-Agglutinin und Aleuria aurantia-Lectin.
  • In manchen Fällen kann das Emulsionsmittel ein Phospholipid sein. Nicht beschränkende Beispiele von Phospholipiden, die in Zusammensetzungen hierin umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide verwendet werden können, umfassen Diacylglyceride und Phosphosphingolipide. Nicht beschränkende Beispiele von Diacylglyceriden umfassen eine Phosphatidsäure (Phosphatidat) (PA), ein Phosphatidylethanolamin (Cephalin) (PE), ein Phosphatidylcholin (Lecithin) (PC), ein Phosphatidylserin (PS) und ein Phosphoinositid einschließlich Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylinositol-Phosphat (PIP), Phosphatidylinositol-Bisphosphat (PIP2) Phosphatidylinositol-Trisphosphat (PIP3). Nicht beschränkende Beispiele von Phosphosphingolipiden umfassen ein Ceramid-Phosphorylcholin (Sphingomyelin) (SPH), Ceramid-Phosphorylethanolamin (Sphingomyelin) (Cer-PE) und Ceramid-Phosphorylglycerin.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann ein Salz umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Salzen, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Säuresalz, Alkalisalz, organisches Salz, anorganisches Salz, Phosphate, Chloridsalze, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Magnesiumperchlorat, Calciumchlorid, Ammoniumchlorid, Eisenchloride und Zinkchloride.
  • Zusammensetzungen der Offenbarung umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide können ein Feuchthaltemittel umfassen. Feuchthaltemittel, die auch als Befeuchtungsmittel bezeichnet werden können, können in Zusammensetzungen hierin aufgenommen werden, um das Zurückhalten von Feuchtigkeit zu fördern. In manchen Fällen können Feuchthaltemittel die Menge an Wasser kontrollieren, die in die Zusammensetzung eintritt oder aus ihr austritt. Ein Feuchthaltemittel kann ein wässriges oder nicht wässriges Lösungsmittel sein. Nicht beschränkende Beispiele von Feuchthaltemitteln, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Mineralöl, Glycerin, Glycerolformal, Miglyol (z.B., Miglyol 812, Miglyol 840), Solutol HS 15 (Polyglykol-Mono- und Diester von 12-Hydroxystearinsäure), Ethylenglykol, Propylenglykol, Methoxypropanol, Diethylenglykol-Monoethylether, Diethylenglykol-Monomethylether, Diethylenglykol-Monobutylether, Tetraglykol, Triethylenglykol, Butyldiglykol, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, n-Methylformamid, Dipropylenglykol-n-Butylether, Ethanol, Isopropanol, Methanol, EthylenglykolMonoethylether, Ethylenglykol-Monomethylether, Dipropylenglykol-Monomethylether, Dipropylenglykol-Monomethylether, Dipropylenglykol-Monomethylether, Triethylenglykol-Monoethylether, Triethylenglykol-Monomethylether, Polyethylenglykole, Methoxypolyethylenglykole, Polypropylenglykole, Polybutylenglykole, Diethylenmonoethylether-Acetat, Diethylenmonobutylether-Acetat, Monomethylacetamid, flüssige Polyoxyethylenglykole, 2-Pyrrolidon, Propylencarbonat, Butylencarbonat, Tetrahydrofurfurylalkohol, Solketal, Xylen, Dimethylisosorbid, kurz-, mittel- und langkettige und aromatische Fettsäuren, zum Beispiel Buttersäure, Caprinsäure, Bernstein-, Adipin-, Sebacin-, Caprylsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Strearinsäure, Linolsäure und Benzoesäure, Triglyceride, zum Beispiel Rizinusöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Leinsamenöl, Distelöl, Erdnussöl, Sojabohnenöl, Kokosnussöl, Olivenöl, Maisöl und Mandelöl. Eine Zusammensetzung hierin kann ein Feuchthaltemittel wie Glycerin, Glycerol, Sorbitol, Polyethylenglykol, Propylenglykol und ein essbares polyhydrisches Alkohol umfassen. In manchen Fällen können Zusammensetzungen hierin Glycerin umfassen. Glycerin in Zusammensetzungen hierin kann pflanzliches Glycerin sein, hergestellt aus Pflanzenölen (z.B., Palmöl, Palmstearin, Palmkernöl, Kokosnussöl und Sojabohnenöl), tierisches Glycerin aus tierischen Fetten, oder synthetisches Glycerin hergestellt aus Rohrsirupzucker, Maissirupzucker oder Propylen.
  • Das Feuchthaltemittel kann in der Zusammensetzung in jeder geeigneten Konzentration vorliegen, um zum Beispiel eine gewünschte Menge an Wasser in der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten. In manchen Fällen kann eine Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid ein Feuchthaltemittel in einer Konzentration von mindestens etwa 0,01% w/w, etwa 0,05% w/w, etwa 0,1% w/w, etwa 0,2% w/w, etwa 0,3% w/w, etwa 0,4% w/w, etwa 0,5% w/w, etwa 0,6% w/w, etwa 0,7% w/w, etwa 0,8% w/w, etwa 0,9% w/w, etwa 1,0% w/w, etwa 1,5% w/w, etwa 2,0% w/w, etwa 2,5% w/w, etwa 3,0% w/w, etwa 3,5% w/w, etwa 4,0% w/w, etwa 4,5% w/w oder etwa 5,0% w/w umfassen. In manchen Fällen kann eine Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid ein Feuchthaltemittel in einer Konzentration von nicht mehr als etwa 5,0% w/w, etwa 4,5% w/w, etwa 4,0% w/w, etwa 3,5% w/w, etwa 3,0% w/w, etwa 2,5% w/w, etwa 2,0% w/w, etwa 1,5% w/w, etwa 1,0% w/w, etwa 0,9% w/w, etwa 0,8% w/w, etwa 0,7% w/w, etwa 0,6% w/w, etwa 0,5% w/w, etwa 0,4% w/w, etwa 0,3% w/w, etwa 0,2% w/w, etwa 0,1% w/w, etwa 0,05% w/w oder etwa 0,01% w/w umfassen.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann einen Nährstoff umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Nährstoffen, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Makronährstoffe, Mikronährstoffe, essenzielle Nährstoffe, nichtessenzielle Nährstoffe, Ballaststoffe, Aminosäuren, essenzielle Fettsäuren, Omega-3-Fettsäuren und konjugierte Linolsäure.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann ein Kohlenhydrat umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Kohlenhydraten, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Zucker, Saccharose, Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Maltose, Mannose, Allulose, Tagatose, Xylose, Arabinose, Maissirup mit hohem Fructosegehalt, Maissirup mit hohem Maltosegehalt, Maissirup (z.B. glucosefreien Maissirup), Monosaccharide, Disaccharide und Polysaccharide (z.B. Polydextrose, Maltodextrin).
  • Eine Zusammensetzung hierin kann ein Gummi umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Gummis, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Gummi arabicum, Gellangummi, Guarkernmehl, Johannisbrotkernmehl, Akaziengummi, Cellulosegummi und Xanthangummi.
  • Konservierungsmittel und Antioxidantien können mit Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden, um den Verfall der Formulierung zu verhindern oder zu verzögern. Nicht beschränkende Beispiele von Konservierungsmitteln, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Methylparaben, Propylparaben, quaternäre Ammoniumsalze, Benzalkoniumchlorid, Ester von p-Hydroxybenzoesäure und Borsäure. Nicht beschränkende Beispiele von Antioxidantien, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen freie Radikalfänger wie Tocopherole, Alkylgallate, butylierte Hydroxyanisole und butylierte Hydroxytoluole; Reduktionsmittel wie Ascorbinsäure und Natriummetabisulfit; und Antioxidantien-Synergisten wie Zitronensäure, Weinsäure und Lecithin.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann ein Vitamin umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Vitaminen, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Niacin, Riboflavin, Pantothensäure, Thiamin, Folsäure, Vitamin A, Vitamin B6, Vitamin B12, Vitamin D, Vitamin E, Lutein, Zeaxanthin, Cholin, Inositol und Biotin.
  • Eine Zusammensetzung hierin kann ein Ernährungselement umfassen. Nicht beschränkende Beispiele von Ernährungselementen, die mit geschmacksmodifizierenden Polypeptiden in Zusammensetzungen hierin gemischt werden können, umfassen Calcium, Eisen, Magnesium, Phosphor, Kalium, Natrium, Zink, Kupfer, Mangan, Selen, Chlor, Jod, Schwefel, Kobalt, Molybdän und Brom.
  • Hierin offenbarte Zusatzstoffe können, während sie als bestimmte Eigenschaften habend beschrieben werden, eine Kombination von Eigenschaften haben und für eine Kombination von Zwecken nützlich sein. Zum Beispiel kann Zitronensäure in Zusammensetzungen hierin sowohl als ein Konservierungsmittel als auch als ein Geschmacksstoff verwendet werden.
  • VI. Zubereitungen geschmacksmodifizierender Polypeptide
  • Zur oralen Verabreichung können Zusammensetzungen umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide die Form von Pulvern, Flüssigkeiten, Getränken (z.B. Kaffee, Tee, Säften, Brausen), Lösungen, Elixieren, Sirupen, Breien, Suspensionen, Emulsionen, Kolloiden, Aerosolen, Dämpfen, Sprays, Nebeln, Filmen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Gelen, Gelees, Kompotts, Gelatinen, Pastillen, harten Süßigkeiten, Waffeln, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung, Beschichtungen und dergleichen annehmen.
  • Zusammensetzungen umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide können so formuliert werden, dass sie jegliches geeignete Auflösungsprofil haben, wenn sie als eine orale Dosis verabreicht werden. Eine Auflösungsrate jener oralen Dosierungsform kann mehr als etwa 80% (z.B. mehr als etwa 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%) innerhalb etwa 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 20 Minuten, 25 Minuten oder 30 Minuten nach Eintritt der Dosisform in eine Verwendungsumgebung (z.B. Mundhöhle) betragen. Die orale Dosisform muss keine Dosisproportionalität aufweisen.
  • In manchen Aspekten haben Zusammensetzungen der Offenbarung weniger Kalorien pro Portion verglichen mit einer äquivalenten Zusammensetzung umfassend Zucker. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung der Offenbarung 50% weniger Kalorien, 55% weniger Kalorien, 60% weniger Kalorien, 65% weniger Kalorien, 70% weniger Kalorien, 75% weniger Kalorien, 80% weniger Kalorien, 85% weniger Kalorien, 90% weniger Kalorien oder 95% weniger Kalorien haben als eine äquivalente Zusammensetzung umfassend Zucker.
  • In manchen Aspekten kann eine Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid weniger Zucker enthalten als eine äquivalente Zusammensetzung ohne das geschmacksmodifizierende Polypeptid. Zum Beispiel kann eine Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid 50% weniger Zucker, 55% weniger Zucker, 60% weniger Zucker, 65% weniger Zucker, 70% weniger Zucker, 75% weniger Zucker, 80% weniger Zucker, 85% weniger Zucker, 90% weniger Zucker oder 95% weniger Zucker enthalten als eine äquivalente Zusammensetzung ohne das geschmacksmodifizierende Polypeptid.
  • Aerosol
  • Zusammensetzungen umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide können oral in der Form eines Aerosols verabreicht werden. In manchen Aspekten kann ein Aerosol ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann ein Aerosol ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann ein Aerosol der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann ein Aerosol der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • Ein Aerosol umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid kann zum Beispiel durch Inhalation verabreicht werden. Eine Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann in einem geeigneten Träger, z.B. einem nichttoxischen Treibmittel, suspendiert oder aufgelöst und direkt in die Mundhöhle verabreicht werden. Zum Beispiel kann eine Aerosolformulierung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid in einem Treibmittel oder einer Mischung von Lösungsmittel und Treibmittel aufgelöst, suspendiert oder emulgiert sein, z.B. zur Verabreichung als ein orales Spray oder Inhalat. Aerosolformulierungen können jedes annehmbare Treibmittel unter Druck enthalten, wie etwa ein kosmetisch oder dermatologisch oder pharmazeutisch annehmbares Treibmittel.
  • Eine Aerosolformulierung für Inhalationen und Inhalate kann so beschaffen sein, dass das geschmacksmodifizierende Polypeptid in der Mundhöhle zum Beispiel eines humanen Subjekts angewendet wird. Inhalationslösungen können zum Beispiel durch einen Zerstäuber verabreicht werden. Inhalationen umfassend fein pulverisierte oder flüssige Zusammensetzungen können der Mundhöhle als ein Aerosol einer Lösung oder Suspension des geschmacksmodifizierenden Polypeptids in einem Treibmittel verabreicht werden, z.B. um bei der Abgabe zu helfen. Treibmittel können verflüssigte Gase sein, einschließlich Halogenkohlenwasserstoffe, zum Beispiel Fluorkohlenstoffe wie fluorierte chlorierte Kohlenwasserstoffe, Fluorchlorkohlenwasserstoffe und Chlorkohlenwasserstoffe, sowie Kohlenwasserstoffe und Kohlenwasserstoffether.
  • Halogenkohlenwasserstoff-Treibmittel können Fluorkohlenstoff-Treibmittel, in denen alle Wasserstoffe durch Fluor ersetzt sind, Fluorchlorkohlenstoff-Treibmittel, in denen alle Wasserstoffe durch Chlor und mindestens ein Fluor ersetzt sind, wasserstoffhaltige Fluorkohlenstoff-Treibmittel und wasserstoffhaltige Fluorchlorkohlenstoff-Treibmittel umfassen. Kohlenwasserstoffe können zum Beispiel Propan, Isobutan, n-Butan, Pentan, Isopentan und Neopentan umfassen. Eine Mischung von Kohlenwasserstoffen kann auch als Treibmittel verwendet werden. Ether-Treibmittel umfassen zum Beispiel Dimethylether sowie die Ether. Eine Aerosolformulierung der Offenbarung kann auch mehr als ein Treibmittel derselben Klasse umfassen, wie etwa zwei oder mehr Fluorkohlenstoffe; oder mehr als ein, mehr als zwei, mehr als drei Treibmittel verschiedener Klassen, wie etwa ein Fluorkohlenwasserstoff und ein Kohlenwasserstoff. Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung können auch mit einem komprimierten Gas verabreicht werden, z.B. einem inerten Gas wie Kohlenstoffdioxid, Distickstoffoxid oder Stickstoff.
  • Aerosolformulierungen können auch andere Bestandteile umfassen, zum Beispiel Ethanol, Isopropanol, Propylenglykol sowie Tenside und andere Bestandteile wie etwa Öle und Detergentien. Diese Bestandteile können dazu dienen, die Formulierung zu stabilisieren und/oder Ventilkomponenten zu schmieren.
  • Die Aerosolformulierung kann unter Druck verpackt werden und kann unter Verwendung von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Pulvern und halbfesten Zubereitungen als ein Aerosol formuliert werden. Zum Beispiel kann eine Lösungs-Aerosolformulierung eine Lösung eines geschmacksmodifizierenden Polypeptids in (im Wesentlichen) reinem Treibmittel oder als ein Gemisch von Treibmittel und Lösungsmittel umfassen. Das Lösungsmittel kann verwendet werden, um das Polypeptid zu lösen und/oder die Verdunstung des Treibmittels zu verlangsamen. Lösungsmittel können zum Beispiel Wasser, Ethanol und Glykole umfassen. Jegliche Kombination geeigneter Lösungsmittel kann verwendet werden und optional mit Konservierungsmitteln, Antioxidantien und/oder anderen Aerosolbestandteilen kombiniert werden. Antimikrobielle Wirkstoffe, antifungale Wirkstoffe und/oder Konservierungsmittel können auch in der Formulierung enthalten sein.
  • Eine Aerosolformulierung zur oralen Verabreichung kann eine wässrige Lösung sein, die zur Verabreichung an die Mundhöhle in Tropfen oder Sprays beschaffen ist. Eine Aerosolformulierung kann auch eine Dispersion oder Suspension sein. Eine Suspensions-Aerosolformulierung kann eine Suspension eines geschmacksmodifizierenden Polypeptids und ein Dispersionsmittel umfassen. In der vorliegenden Offenbarung nützliche Dispersionsmittel umfassen zum Beispiel Sorbitantrioleat, Oleyalkohol, Ölsäure, Lecithin und Maisöl. Eine Suspensions-Aerosolformulierung kann auch Schmiermittel, Konservierungsmittel, Antioxidans und/oder andere Aerosolbestandteile umfassen.
  • Eine Aerosolformulierung umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann jegliche geeignete Menge geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Die Aerosolformulierung kann pro Dosis oder Einzelverabreichung etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg, etwa 0,500 mg, etwa 0,525 mg, etwa 0,550 mg, etwa 0,575 mg, etwa 0,600 mg, etwa 0,625 mg, etwa 0,650 mg, etwa 0,675 mg, etwa 0,700 mg, etwa 0,725 mg, etwa 0,750 mg, etwa 0,775 mg, etwa 0,800 mg, etwa 0,825 mg, etwa 0,850 mg, etwa 0,875 mg, etwa 0,900 mg, etwa 0,925 mg, etwa 0,950 mg, etwa 0,975 mg oder etwa 1000 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Eine Aerosolformulierung umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid pro Dosis oder Einzelverabreichung umfassen.
  • Flüssigkeiten
  • In manchen Aspekten kann eine Zusammensetzung der Offenbarung eine Flüssigkeit (z.B. eine wässrige Suspension) umfassend ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine flüssige Zusammensetzung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine flüssige Zusammensetzung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine flüssige Zusammensetzung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • Flüssige Zusammensetzungen (z.B. eine wässrige Suspension) umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide können oral verabreicht werden. Die Suspension kann als eine Flüssigkeit eingenommen werden oder als Tropfen oder ein Nebel in die Mundhöhle appliziert werden. Die Suspension kann zum Beispiel eine Lösung, ein Elixier, ein Sirup, ein Brei, eine Suspension oder eine Emulsion sein. Wässrige Suspensionen zur oralen Verwendung können ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid mit einem wässrigen Lösungsmittel und einem oder mehr annehmbaren Hilfsstoffen, wie einem Suspensionsmittel (z.B. Methylcellulose), einem Befeuchtungsmittel (z.B. Glycerin, Lecithin, Lysolecithin und/oder einem langkettigen Fettalkohol), sowie Färbemittel, Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe und dergleichen enthalten.
  • Eine flüssige Zusammensetzung umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann jegliche geeignete Menge geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Die flüssige Zusammensetzung kann pro Dosis etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg, etwa 0,500 mg, etwa 0,525 mg, etwa 0,550 mg, etwa 0,575 mg, etwa 0,600 mg, etwa 0,625 mg, etwa 0,650 mg, etwa 0,675 mg, etwa 0,700 mg, etwa 0,725 mg, etwa 0,750 mg, etwa 0,775 mg, etwa 0,800 mg, etwa 0,825 mg, etwa 0,850 mg, etwa 0,875 mg, etwa 0,900 mg, etwa 0,925 mg, etwa 0,950 mg, etwa 0,975 mg oder etwa 1000 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Eine flüssige Zusammensetzung umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid umfassen.
  • Im Falle einer Flüssigkeit kann sich eine Dosis auf jedes geeignete Volumen an Flüssigkeit beziehen, um die gewünschte Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid zu verabreichen. Zum Beispiel kann sich eine Dosis auf ein Volumen von etwa 1 ml, etwa 2 ml, etwa 3 ml, etwa 4 ml, etwa 5 ml, etwa 6 ml, etwa 7 ml, etwa 8 ml, etwa 9 ml oder etwa 10 ml einer Lösung von geschmacksmodifizierendem Polypeptid bei einer bestimmten Konzentration von geschmacksmodifizierendem Polypeptid beziehen. Im Fall eines Sprays kann sich eine Dosis auf jegliche Anzahl von Sprühstößen, um eine gewünschte Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid zu verabreichen, beziehen. Zum Beispiel kann sich die Gesamtzahl von Sprühstößen in einer Dosis zu einem Gesamtvolumen von etwa 1 ml, etwa 2 ml, etwa 3 ml, etwa 4 ml oder etwa 5 ml einer Lösung von geschmacksmodifizierendem Polypeptid bei einer bestimmten Konzentration von geschmacksmodifizierendem Polypeptid aufsummieren. In manchen Fällen umfasst eine Dosis mindestens 1, 2, 3, 4, oder 5 Sprühstöße.
  • In manchen Formulierungen können Öle oder nichtwässrige Lösungsmittel verwendet werden. Alternativ können Emulsionen, Suspensionen oder andere Zubereitungen, zum Beispiel liposomale Zubereitungen, verwendet werden.
  • Dünne Filme
  • In manchen Aspekten kann eine hierin offenbarte Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid als ein dünner Film formuliert sein. In manchen Fällen kann eine Dünnfilmzusammensetzung der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine Dünnfilmzusammensetzung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine Dünnfilmzusammensetzung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine Dünnfilmzusammensetzung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • Der dünne Film kann oral verabreicht werden. Wenn er in der Mundhöhle platziert wird, kann sich der dünne Film darin auflösen oder desintegrieren und geschmacksmodifizierende Polypeptide vom Film freisetzen. In manchen Fällen kann ein dünner Film an einem Objekt angebracht sein, zum Beispiel einem Essbesteck, und das geschmacksmodifizierende Polypeptid kann oral verabreicht werden, wenn Essen mit dem Objekt, z.B. Essbesteck, konsumiert wird. In einem Beispiel kann ein dünner Film an einem Löffel angebracht sein und der dünne Film kann durch Essen oder Speichel aufgelöst werden, wenn der Löffel verwendet wird, um Essen zu konsumieren. In einem anderen Beispiel kann der dünne Film an der Innenseite eines Strohhalms angebracht sein. Der dünne Film kann durch ein flüssiges Getränk aufgelöst werden, wenn der Strohhalm verwendet wird, um das flüssige Getränk zu konsumieren.
  • Ein dünner Film (der auch als ein „oromukosales Filmpräparat“, „orodispersibler Film“ oder „Schmelzfilm“ bezeichnet werden kann) kann eine Kombination von mindestens einem Träger (z.B. Flimbildner oder Filmbildungsmittel) und einem geschmacksmodifizierenden Polypeptid umfassen. Filmbildner können geschmacksmodifizierende Polypeptide aufnehmen und Struktur, Form und Auflösungsverhalten der Filmzubereitung beeinflussen. Nicht beschränkende Beispiele von Filmbildnern, die in dünnen Filmen umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide hierin verwendet werden können, umfassen Cellulose, Cellulosederivate, Acryl- und Methacrylsäurepolymere, Polyvinylalkohole, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidon und Derivate, Polysaccharide und auf Stärke basierende Polymere.
  • Nicht beschränkende Beispiele von Filmbildnern, die hierin verwendet werden können, umfassen Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylcellulose, Natrosol®, Tylose® H300, Klucel®, Klucel® E, Klucel® L, Klucel® J, Klucel® G, Klucel® M, Klucel® H, Klucel® EF, Klucel® LF, Klucel® JF, Klucel® GF, Klucel® MF, Klucel® HF, Klucel® EXF, Klucel® LXF, Klucel® JXF, Klucel® GXF, Klucel® MXF, Klucel® HXF, Pharmacoat® 603, Pharmacoat® 606, Methocel® E4M, Polyethylenglykol-Polyvinylalkohol-Kopolymere, Kollicoat® IR, Kollicoat® protect, Natriumcarboxymethylcellulose, Polysaccharide von Maltotriose, Pullulan®, Lycoat® RS720, Lycoat® RS780, Lycoat® NG und Hydroxyethylmethylcellulose.
  • Dünne Filme können unter Verwendung anderer Bestandteile hergestellt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine Lebensmittelsäure, ein Salz einer Lebensmittelsäure, ein Puffersystem, einen Füllstoff, einen Komplexbildner, ein Vernetzungsmittel, einen oder mehr Geschmackstoffe, eine oder mehr Farben und Kombinationen davon.
  • Nicht beschränkende Beispiele von Lebensmittelsäuren zur Verwendung in bestimmten Ausführungsformen umfassen Zitronensäure und Ascorbinsäure. In manchen Aspekten kann ein dünner Film der vorliegenden Offenbarung Lycoat® RS870, Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), eine Lebensmittelfarbe, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Glycerin (z.B. pflanzliches Glycerin), Wasser und ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen.
  • Die Kombination von Filmbildner und geschmacksmodifizierendem Polypeptid kann geformt werden, so dass sie einen dünnen Film ergibt. Der dünne Film kann, wenn er in der Mundhöhle platziert wird, sich in der Mundhöhle unter der Einwirkung von Feuchtigkeit auflösen oder desintegrieren und das geschmacksmodifizierende Polypeptid freisetzen. Die Dimensionen des Films können ausgewählt werden, um eine gewünschte Auflösungsrate und/oder -profil zu erreichen. Die Dimensionen des Films können jegliche geeigneten Dimensionen sein, um eine gewünschte Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid bereitzustellen, zum Beispiel in den Einheiten von g/Dosis, mg/Dosis oder µg/Dosis.
  • In manchen Aspekten hat der dünne Film die Form eines Rechtecks mit einer Länge und einer Breite. In manchen Fällen ist der Film etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm lang. In manchen Fällen ist der Film mindestens etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm lang. In manchen Fällen ist der Film etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm breit. In manchen Fällen ist der Film mindestens etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm breit. Der Film kann die Form eines Quadrats haben. Der Film kann die Form eines Kreises haben.
  • Die Dicke des Films kann etwa 50 µm, etwa 75 µm, etwa 100 µm, etwa 125 µm, etwa 150 µm, etwa 175 µm, etwa 200 µm, etwa 225 µm, etwa 250 µm, etwa 275 µm, etwa 300 µm, etwa 325 µm, etwa 350 µm, etwa 375 µm, etwa 400 µm, etwa 425 µm, etwa 450 µm, etwa 475 µm, etwa 500 µm, etwa 525 µm, etwa 550 µm, etwa 575 µm, etwa 600 µm, etwa 625 µm, etwa 650 µm, etwa 675 µm, etwa 700 µm, etwa 725 µm, etwa 750 µm, etwa 775 µm, etwa 800 µm, etwa 825 µm, etwa 850 µm, etwa 875 µm, etwa 900 µm, etwa 925 µm, etwa 950 µm, etwa 975 µm oder etwa 1000 µm betragen. Die Dicke eines solchen Films kann weniger als etwa 1 mm betragen, z.B. weniger als etwa 500 µm, weniger als etwa 400 µm, weniger als etwa 300 µm, weniger als etwa 200 µm oder weniger als etwa 100 µm.
  • Ein dünner Film umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann jegliche geeignete Menge geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Zum Beispiel kann jeder dünne Film etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg oder etwa 0,500 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Ein dünner Film umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid umfassen.
  • Nicht beschränkende Beispiel oraler dünner Filme umfassend Miraculin sind in Beispielen 7 und 22 offenbart. In manchen Fällen kann der dünne Film rekombinantes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann der dünne Film aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pflanze) aufgereinigtes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin von etwa 0,1% w/w bis etwa 1,0% w/w betragen. Zum Beispiel kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin in einer Dünnfilmzusammensetzung etwa 0,1% w/w, etwa 0,2% w/w, etwa 0,3% w/w, etwa 0,4% w/w, etwa 0,5% w/w, etwa 0,6% w/w, etwa 0,7% w/w, etwa 0,8% w/w, etwa 0,9% w/w oder etwa 1,0% w/w betragen. In manchen Fällen kann der dünne Film Wunderbeerenpulver umfassen.
  • Kaubares
  • In manchen Aspekten kann eine hierin offenbarte Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid als etwas Kaubares formuliert sein. In manchen Fällen kann eine kaubare Zusammensetzung der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine kaubare Zusammensetzung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine kaubare Zusammensetzung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine kaubare Zusammensetzung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • Das Kaubare kann in manchen Fällen in einer festen Form sein. Nicht beschränkende Beispiele von festen Formen umfassen eine Tablette, eine Pille, ein Pulver, eine Kapsel, feste Dispersion, eine feste Lösung, eine bioerodierbare Dosierungsform, Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung, Dosierungsformen mit pulsierender Freisetzung, multipartikuläre Dosierungsformen, Pellets oder Körnchen. Hierin offenbarte geschmacksmodifizierende Polypeptide können als eine einzelne Kapsel oder in Mehrkapsel-Dosierungsformen verabreicht werden.
  • In manchen Aspekten kann eine Zusammensetzung in fester Form ein essbares Gel oder Fruchtleder sein, das oral verabreicht werden kann. Essbare Gele und Fruchtleder können in der Mundhöhle aufgelöst und/oder gekaut werden, wobei das geschmacksmodifizierende Polypeptid aus dem Gel oder Leder freigesetzt wird. Ein Gel bezieht sich allgemein auf ein kolloidales System, in dem ein Netzwerk von Partikeln sich durch das Volumen eines flüssigen Mediums erstreckt. Obwohl Gele hauptsächlich aus Flüssigkeiten bestehen können und damit Dichten ähnlich zu Flüssigkeiten aufweisen können, können Gele auf Grund des Netzwerks von Partikeln, das sich durch das Volumen des flüssigen Mediums erstreckt, die strukturelle Kohärenz von Feststoffen haben. Gele können allgemein als feste, geleeartige Materialien erscheinen.
  • Nicht beschränkende Beispiele von essbaren Gelzusammensetzungen zur Verwendung hierin umfassen Geldesserts, Puddings, Gelees, Pasten, Kleinigkeiten, Aspike, Marshmallows, Gummibonbons und dergleichen. Essbare Gelmischungen können zu körnigen Feststoffen pulverisiert sein, zum Beispiel körnigen oder festen Geliermitteln oder -zutaten, zu denen eine Flüssigkeit hinzugegeben werden kann, um eine essbare Gelzusammensetzung zu bilden. Nicht beschränkende Beispiele von Flüssigkeiten zur Verwendung in Ausführungsformen hierin umfassen Wasser, Molkereiflüssigkeiten, Molkereianalogflüssigkeiten, Säfte, Alkohol, alkoholische Getränke, Kaffee und kaffeeartige Getränke, Tee und teeartige Getränke, und Kombinationen davon. Nicht beschränkende Beispiele von Molkereiflüssigkeiten, die in bestimmten Ausführungsformen verwendet werden können, umfassen Milch, Sauermilch, Sahne, flüssige Molke, Joghurt und Mischungen davon. Nicht beschränkende Beispiele von Molkereianalogflüssigkeiten, die in bestimmten Ausführungsformen verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Sojamilch, Nussmilche und milchfreien Kaffeeweißer. Nicht beschränkende Beispiele von Säften, die hierin verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Traubensaft, Apfelsaft, Orangensaft und Kranbeerensaft. Wie hierin verwendet beziehen sich die Ausdrücke „Geliermittel“ und „Gelierzutat“ auf jegliches Material, das ein kolloidales System in einem flüssigen Medium bilden kann. Nicht beschränkende Beispiele von Gelierzutaten umfassen Gelatine, Alginat, Carrageenan, Gummi, Pektin, Konjak, Agar, Lebensmittelsäure, Lab, Stärke, Stärkederivate und Kombinationen davon. Eine Vielzahl von Stärken sind zur Verwendung verfügbar, von denen nicht beschränkende Beispiele Stärken aus Mais, Weizen, Reis, Buchweizen, Gerste, Hafer, Hirse, Roggen, Sorghum, Kartoffel, Süßkartoffel, Tapioka/Maniok, Pfeilwurz, Sago, Arracacha, Banane, Kochbanane, Malanga, Kudzu, Oka, Blumenrohr, Taro, Yams, Kastanien, essbaren Bohnen (z.B. Linsen, Ackerbohnen, Mungbohnen) und Erbsen umfassen. In manchen Fällen können Stärkederivate verwendet werden. Stärkederivate können in manchen Fällen modifizierte Stärken sein, die Verfahren einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Hydroxypropylierung und Quervernetzung unterworfen wurden. Die Menge an in einer essbaren Gelmischung oder essbaren Gelzusammensetzung verwendeter Gelierzutat kann abhängig von einer Anzahl von Faktoren variieren, wie etwa der verwendeten Gelierzutat, der verwendeten flüssigen Basis, und den gewünschten Eigenschaften des Gels.
  • Essbare Gelmischungen und essbare Gele können unter Verwendung anderer Zutaten hergestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, eine Lebensmittelsäure, ein Salz einer Lebensmittelsäure, ein Puffersystem, einen Füllstoff, einen Komplexbildner, ein Vernetzungsmittel, einen oder mehr Geschmackstoffe, eine oder mehr Farben und Kombinationen davon. Nicht beschränkende Beispiele von Lebensmittelsäuren zur Verwendung in bestimmten Aspekten umfassen Zitronensäure und Ascorbinsäure.
  • In manchen Aspekten kann ein essbares Gel der vorliegenden Offenbarung Gelatine als die Gelierzutat, Kranbeerensaft als die flüssige Basis, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Wasser und das geschmacksmodifizierende Polypeptid umfassen.
  • In manchen Fällen kann ein essbares Gel der vorliegenden Offenbarung ein Gummibonbon sein. In manchen Fällen ist das Gummibonbon wie in Beispiel 11 oder Beispiel 20 beschrieben. In einem bestimmten Aspekt kann ein Gummibonbon der Offenbarung eine oder mehr der folgenden Zutaten umfassen: Gelatine, Wasser, Saft (z.B. Apfelsaftkonzentrat, Kranbeerensaft), Stärke (z.B. Maisstärke), Guarkernmehl, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Polysorbat 20, Aromaöl (z.B. Brombeeraromaöl), Lebensmittelfarbe (z.B. rote Lebensmittelfarbe) und das geschmacksmodifizierende Polypeptid.
  • In manchen Fällen kann ein Gummibonbon ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann ein Gummibonbon ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanzenquelle) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann ein Gummibonbon ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanzenquelle) nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid (z.B. Beerenpulver) umfassen. In manchen Fällen kann ein Gummibonbon, das kein geschmacksmodifizierendes Polypeptid enthält (z.B. ein saures Gummibonbon) mit einer Formulierung (z.B. einem anderen Gummibonbon) konsumiert werden, die das geschmacksmodifizierende Polypeptid enthält. In solchen Fällen kann das saure Gummibonbon, wenn es mit einer Formulierung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid konsumiert wird, süß schmecken.
  • Ein Gummibonbon umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann jegliche geeignete Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid umfassen. Zum Beispiel kann ein Gummibonbon etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg oder etwa 0,500 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Ein Gummibonbon umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid umfassen.
  • In manchen Fällen kann das Gummibonbon rekombinantes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann das Gummibonbon aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pflanze) aufgereinigtes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin von etwa 0,001% w/w bis etwa 0,050% w/w betragen. Zum Beispiel kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin in einem Gummibonbon etwa 0,001% w/w, etwa 0,005% w/w, etwa 0,010% w/w, etwa 0,015% w/w, etwa 0,020% w/w, etwa 0,025% w/w, etwa 0,030% w/w, etwa 0,035% w/w, etwa 0,040% w/w, etwa 0,045% w/w oder etwa 0,050% w/w betragen. In manchen Fällen kann das Gummibonbon Wunderbeerenpulver umfassen. In manchen Fällen kann die Menge an Wunderbeerenpulver von etwa 0,1% w/w bis etwa 15% w/w betragen. Zum Beispiel kann die Menge an Wunderbeerenpulver in einer Joghurtformulierung etwa 0,1% w/w, etwa 0,5% w/w, etwa 1,0% w/w, etwa 1,5% w/w, etwa 2,0% w/w, etwa 2,5% w/w, etwa 3,0% w/w, etwa 3,5% w/w, etwa 4,0% w/w, etwa 4,5% w/w, etwa 5,0% w/w, etwa 5,5% w/w, etwa 6,0% w/w, etwa 6,5% w/w, etwa 7,0% w/w, etwa 7,5% w/w, etwa 8,0% w/w, etwa 8,5% w/w, etwa 9,0% w/w, etwa 9,5% w/w, etwa 10,0% w/w, etwa 10,5% w/w, etwa 11,0% w/w, etwa 11,5% w/w, etwa 12,0% w/w, etwa 12,5% w/w, etwa 13,0% w/w, etwa 13,5% w/w, etwa 14,0% w/w, etwa 14,5% w/w oder etwa 15,0% w/w betragen. In manchen Fällen kann ein Gummibonbon sowohl aufgereinigtes Miraculin als auch Wunderbeerenpulver umfassen.
  • Ein essbares Gel kann zu jeglicher Form geformt werden. In manchen Fällen kann das essbare Gel zu einer Blockform, zum Beispiel einem Würfel, geformt werden. Das Gel kann, wenn es in der Mundhöhle platziert wird, in der Mundhöhle aufgelöst oder gekaut werden. Die Dimensionen des Gels können jegliche geeigneten Dimensionen sein, um eine gewünschte Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid bereitzustellen, zum Beispiel in den Einheiten von g/Dosis, mg/Dosis oder µg/Dosis. Das Gel kann in der Form eines Blocks vorliegen, mit einer Länge, einer Breite und einer Höhe. In manchen Fällen ist das Gel etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm lang. In manchen Fällen ist das Gel mindestens etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm lang. In manchen Fällen ist das Gel etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm breit. In manchen Fällen ist das Gel mindestens etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm breit. In manchen Fällen ist das Gel etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm hoch. In manchen Fällen ist das Gel mindestens etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm hoch. Das Gel kann in der Form eines Würfels vorliegen. Während hierin eine rechtwinklige Form beschrieben wird, kann jegliche Form verwendet werden. In manchen Fällen kann die Form geometrisch sein. In manchen Fällen kann die Form nichtgeometrisch sein.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Fruchtleder“ auf ein essbares Lebensmittelprodukt, das eine Textur ähnlich zu Leder hat. Fruchtleder können aus einem Püree einer Frucht hergestellt und zur Konsistenz von Leder getrocknet werden. In einem Beispiel kann ein Fruchtleder durch Kombinieren von Stärke (z.B. Tapiokastärke), Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), Polysorbat 20, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Glycerin (z.B. pflanzlichem Glycerin), Wasser und einem geschmacksmodifizierenden Polypeptid hergestellt werden. Die Mischung kann dehydriert werden, zum Beispiel durch Zwangsluftströmung.
  • Ein Fruchtleder kann zu jeglicher gewünschten Form geformt werden. Das Fruchtleder kann, wenn es in der Mundhöhle platziert wird, in der Mundhöhle aufgelöst oder gekaut werden. Die Dimensionen des Fruchtleders können jegliche geeigneten Dimensionen sein, um eine gewünschte Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid bereitzustellen, zum Beispiel in den Einheiten von g/Dosis, mg/Dosis oder µg/Dosis. Das Fruchtleder kann eine dünne Schicht sein. Die dünne Schicht kann in manchen Fällen aufgerollt und/oder zusammengefaltet sein, um eine dreidimensionale Struktur zu ergeben. In manchen Fällen kann das Fruchtleder zu einem Zylinder geformt sein, mit einer Länge und einem Durchmesser. In manchen Fällen kann das Fruchtleder einen Durchmesser von etwa 0,1 cm, etwa 0,2 cm, etwa 0,3 cm, etwa 0,4 cm, etwa 0,5 cm, etwa 0,6 cm, etwa 0,7 cm, etwa 0,8 cm, etwa 0,9 cm, etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,5 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm haben. In manchen Fällen kann das Fruchtleder einen Durchmesser von mindestens etwa 0,1 cm, etwa 0,2 cm, etwa 0,3 cm, etwa 0,4 cm, etwa 0,5 cm, etwa 0,6 cm, etwa 0,7 cm, etwa 0,8 cm, etwa 0,9 cm, etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,5 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm haben. In manchen Fällen kann das Fruchtleder etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm lang sein. In manchen Fällen kann das Fruchtleder mindestens etwa 1 cm, etwa 1,25 cm, etwa 1,5 cm, etwa 1,75 cm, etwa 2,0 cm, etwa 2,25 cm, etwa 2,50 cm, etwa 2,75 cm, etwa 3,0 cm, etwa 3,25 cm, etwa 3,5 cm, etwa 3,75 cm, etwa 4,0 cm, etwa 4,25 cm, etwa 4,5 cm, etwa 4,75 cm oder etwa 5,0 cm lang sein.
  • In manchen Aspekten kann eine Zusammensetzung umfassend ein hierin beschriebenes geschmacksmodifizierendes Polypeptid als eine Tablette formuliert sein. In manchen Fällen kann eine Tablettenzusammensetzung der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine Tablettenzusammensetzung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine Tablettenzusammensetzung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine Dünnfilmzusammensetzung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • Eine Tablette kann, ohne Beschränkung, eine Suspensionstablette, eine sich schnell auflösende Tablette, eine auf Biss desintegrierende Tablette, eine schnell desintegrierende Tablette, eine Brausetablette oder ein Caplet sein. In manchen Fällen können geschmacksmodifizierende Polypeptide in geeigneten Verhältnissen mit einem Träger mit der notwendigen Bindungskapazität gemischt und zu der gewünschten Form und Größe komprimiert werden. Geeignete Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Zucker, Lactose, Pektin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Tragant, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, ein niedrig schmelzendes Wachs, Kakaobutter und dergleichen. Geschmacksmodifizierende Polypeptide können bei Konzentrationsniveaus im Bereich von etwa 0,5%, etwa 5%, etwa 10%, etwa 20%, etwa 30%, etwa 50%, etwa 60%, etwa 70%, etwa 80% oder etwa 90% des Gewichts der Gesamtzusammensetzung oraler Dosierungsformen enthalten sein, in einer ausreichenden Menge, um eine gewünschte Dosierungseinheit bereitzustellen.
  • In manchen Aspekten kann eine Zusammensetzung umfassend ein hierin beschriebenes geschmacksmodifizierendes Polypeptid ein Pulver sein. In manchen Fällen kann eine Pulverzusammensetzung der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine Pulverzusammensetzung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine Pulverzusammensetzung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine Pulverzusammensetzung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • Nicht beschränkende Beispiele von Pulvern umfassen ein steril verpacktes Pulver, ein dispensierbares Pulver oder ein Brausepulver. Eine Pulverformulierung kann in manchen Fällen ein fein zerteilter Feststoff sein, der eine Mischung mit fein zerteilten geschmacksmodifizierenden Polypeptiden ist. Zum Beispiel kann eine Pulverformulierung durch feines Zerteilen einer Tablette oder Pille hergestellt werden.
  • In manchen Aspekten kann eine Zusammensetzung umfassend ein hierin beschriebenes geschmacksmodifizierendes Polypeptid eine Kapsel sein. In manchen Fällen kann eine Kapselzusammensetzung der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine Kapselzusammensetzung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine Kapselzusammensetzung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine Kapselzusammensetzung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • Kapseln können Weichkapseln oder Hartkapseln sein. Kapseln können beispielsweise aus Gelatine tierischen Ursprungs oder HPMC pflanzlichen Urpsrungs hergestellt werden.
  • Etwas Kaubares umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid kann jegliche geeignete Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann etwas Kaubares etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg oder etwa 0,500 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Etwas Kaubares umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid umfassen.
  • Getränke
  • In manchen Aspekten kann eine hierin offenbarte Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid als ein flüssiges Getränk formuliert sein. In manchen Fällen kann eine flüssige Getränkezusammensetzung der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine flüssige Getränkezusammensetzung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine flüssige Getränkezusammensetzung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine flüssige Getränkezusammensetzung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • In manchen Fällen kann das flüssige Getränk Kaffee oder ein Kaffeeprodukt sein. In manchen Fällen kann das flüssige Getränk Tee oder ein Teeprodukt sein. In manchen Fällen kann das flüssige Getränk eine Limonade oder ein Limonadenprodukt sein. In manchen Fällen kann das flüssige Getränk Saft (z.B. Fruchtsaft) oder ein Saftprodukt sein. In manchen Fällen kann das flüssige Getränk Wasser sein. Andere nicht beschränkende Beispiele hierin vorgesehener flüssiger Getränke umfassen Molkereimilch und andere flüssige Molkereiprodukte, Nuss-„Milche“ (z.B. Mandelmilch) und andere „Milch“-Produkte (z.B. Sojamilch, Kokosmilch, Reismilch), Kombucha, Alkohol und alkoholische Getränke (z.B. Bier, Wein, Spirituosen, Apfelwein), und heiße Schokolade.
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid direkt zur flüssigen Getränkeformulierung gegeben oder hineingemischt werden. In anderen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid in einer getrennten Formulierung vorliegen, die das flüssige Getränkeprodukt begleitet. In einem nicht beschränkenden Beispiel kann das flüssige Getränk ein konzentriertes Kaffeeprodukt sein, das in einem wegwerfbaren Behälter oder Kapsel zur einmaligen Verwendung bereitgestellt wird (z.B. K-Cups® zur Verwendung mit einer Keurig®-Kaffeemaschine). In einem anderen nicht beschränkenden Beispiel kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid auch in einen Flaschenverschluss (z.B. in einen Limonadenflaschenverschluss) geladen werden, um mit dem flüssigen Getränk konsumiert zu werden. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid als ein Film oder eine Beschichtung eines Strohhalms bereitgestellt werden (z.B. auf der Innenfläche des hohlen Bereichs des Strohhalms, oder auf der Außenfläche des Mundstückbereichs des Strohhalms), der getrennt oder mit einem flüssigen Getränk geliefert werden kann.
  • Ein flüssiges Getränk umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid kann jegliche geeignete Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid umfassen. Zum Beispiel kann ein flüssiges Getränk etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg oder etwa 0,500 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Ein flüssiges Getränk umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid umfassen.
  • Joghurtprodukte
  • In manchen Aspekten kann eine hierin offenbarte Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid als ein Joghurtprodukt formuliert sein. In manchen Fällen kann ein Joghurtprodukt der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann ein Joghurtprodukt ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann ein Joghurtprodukt der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann ein Joghurtprodukt der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid direkt zum Joghurtprodukt gegeben oder hineingemischt werden. In anderen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid in einer getrennten Formulierung vorliegen, die mit dem Joghurtprodukt konsumiert werden soll. Zum Beispiel kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid als ein Gel, Gelee, Kompott oder Püree formuliert sein. In manchen Fällen kann das Gel, Gelee, Kompott oder Püree als eine Schicht oder ein Film bereitgestellt werden, die das Joghurtprodukt überlagert (z.B. als eine aromatisierte Gelschicht umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, die eine Joghurtzusammensetzung überlagert). In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid in einer getrennten Formulierung bereitgestellt werden, die das Joghurtprodukt begleitet (z.B. als ein „Beiwagen“ einer Joghurtverpackung bereitgestellt werden, z.B. als ein Gel, Gelee, Kompott oder Püree). In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid als eine Beschichtung oder ein Film auf der Oberfläche eines Utensils (z.B. eines Löffels) bereitgestellt werden, das mit dem Joghurtprodukt geliefert oder verkauft oder verwendet werden kann.
  • Ein Joghurtprodukt umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid kann jegliche geeignete Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid umfassen. Zum Beispiel kann ein Joghurtprodukt etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg oder etwa 0,500 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Ein Joghurtprodukt umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid umfassen.
  • Ein nicht beschränkendes Beispiel eines Joghurtprodukts umfassend ein Miraculin ist in Beispiel 18 offenbart. In manchen Fällen kann das Joghurtprodukt rekombinantes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann das Joghurtprodukt aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pflanze) aufgereinigtes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin von etwa 0,0001% w/w bis etwa 0,0050% w/w betragen. Zum Beispiel kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin in einer Joghurtformulierung etwa 0,0001% w/w, etwa 0,0005% w/w, etwa 0,0010% w/w, etwa 0,0015% w/w, etwa 0,0020% w/w, etwa 0,0025% w/w, etwa 0,0030% w/w, etwa 0,0035% w/w, etwa 0,0040% w/w, etwa 0,0045% w/w oder etwa 0,0050% w/w betragen. In manchen Fällen kann das Joghurtprodukt Wunderbeerenpulver umfassen. In manchen Fällen kann die Menge an Wunderbeerenpulver von etwa 0,05% w/w bis etwa 5% w/w betragen. Zum Beispiel kann die Menge an Wunderbeerenpulver in einer Joghurtformulierung etwa 0,05% w/w, etwa 0,1% w/w, etwa 0,5% w/w, etwa 1,0% w/w, etwa 1,5% w/w, etwa 2,0% w/w, etwa 2,5% w/w, etwa 3,0% w/w, etwa 3,5% w/w, etwa 4,0% w/w, etwa 4,5% w/w oder etwa 5,0% w/w betragen.
  • Gefrorene Formulierungen
  • In manchen Aspekten kann eine hierin offenbarte Zusammensetzung umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid als eine gefrorene Formulierung bereitgestellt werden. In manchen Fällen kann eine gefrorene Formulierung der Offenbarung ein aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein rekombinantes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Fällen kann das aufgereinigte geschmacksmodifizierende Polypeptid ein aus einer natürlichen Quelle (z.B. einer Pflanze) aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen. In manchen Aspekten kann eine gefrorene Formulierung ein nicht aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pulver ganzer Beeren) umfassen. In manchen Fällen kann eine gefrorene Formulierung der Offenbarung ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid wie hierin offenbart umfassen, das entweder rekombinant hergestellt oder natürlich hergestellt ist. Zum Beispiel kann eine gefrorene Formulierung der Offenbarung eines oder mehr umfassen von: Brazzein, Pentadin, Thaumatin, Monellin, Mabinlin, Miraculin und Curculin; oder jegliches funktionelle Fragment davon; oder jegliche Mutante davon.
  • In manchen Aspekten kann die gefrorene Formulierung ein gefrorenes Nahrungsmittelprodukt sein. In manchen Fällen kann das gefrorene Nahrungsmittelprodukt eine Eiscreme oder ein Eiscremeprodukt sein. In manchen Fällen kann das gefrorene Nahrungsmittelprodukt Sorbet sein. In manchen Fällen kann das gefrorene Nahrungsmittelprodukt ein Stieleis sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid direkt zum gefrorenen Nahrungsmittelprodukt gegeben oder hineingemischt werden. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid in einer getrennten Formulierung zum Verzehr mit dem gefrorenen Nahrungsmittelprodukt bereitgestellt werden. In manchen Fällen kann die getrennte Formulierung eine Beschichtung oder eine Schicht auf der Oberfläche eines gefrorenen Nahrungsmittelprodukts sein.
  • In einem bestimmten Beispiel kann das gefrorene Nahrungsmittelprodukt ein Stieleis sein. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid dem Stieleis direkt bereitgestellt werden. In manchen Fällen kann das geschmacksmodifizierende Polypeptid als ein Gel, Gelee, Kompott, Püree oder Pulver bereitgestellt werden. In manchen Fällen kann das Gel, Gelee, Kompott, Püree oder Pulver die Oberfläche des Stieleises beschichten (z.B. im oberen Teil des Stieleises, oder die gesamte Oberfläche des Stieleises bedeckend). In manchen Fällen kann das Gel, Gelee, Kompott, Püree oder Pulver etwa 1 bis etwa 50% des Stieleises bedecken oder beschichten. Zum Beispiel kann das Gel, Gelee, Kompott, Püree oder Pulver etwa 1%, etwa 5%, etwa 10%, etwa 15%, etwa 20%, etwa 25%, etwa 30%, etwa 35%, etwa 40%, etwa 45% oder etwa 50% des Stieleises bedecken oder beschichten.
  • Ein gefrorenes Nahrungsmittelprodukt umfassend ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid kann jegliche geeignete Menge an geschmacksmodifizierendem Polypeptid umfassen. Zum Beispiel kann ein gefrorenes Nahrungsmittelprodukt etwa 0,001 mg, etwa 0,002 mg, etwa 0,003 mg, etwa 0,004 mg, etwa 0,005 mg, etwa 0,006 mg, etwa 0,007 mg, etwa 0,008 mg, etwa 0,009 mg, etwa 0,010 mg, etwa 0,015 mg, etwa 0,020 mg, etwa 0,025 mg, etwa 0,030 mg, etwa 0,035 mg, etwa 0,040 mg, etwa 0,045 mg, etwa 0,050 mg, etwa 0,055 mg, etwa 0,060 mg, etwa 0,065 mg, etwa 0,070 mg, etwa 0,075 mg, etwa 0,080 mg, etwa 0,085 mg, etwa 0,090 mg, etwa 0,095 mg, etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,425 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,475 mg oder etwa 0,500 mg aufgereinigtes geschmacksmodifizierendes Polypeptid umfassen. Ein gefrorenes Nahrungsmittelprodukt umfassend geschmacksmodifizierende Polypeptide kann zum Beispiel zwischen etwa 0,100 mg und etwa 0,500 mg, zwischen etwa 0,125 mg und etwa 0,475 mg, zwischen etwa 0,150 mg und etwa 0,450 mg, zwischen etwa 0,175 mg und etwa 0,425 mg, zwischen etwa 0,200 mg und etwa 0,400 mg, zwischen etwa 0,225 mg und etwa 0,375 mg, zwischen etwa 0,250 mg und etwa 0,350 mg oder zwischen etwa 0,275 mg und etwa 0,325 mg aufgereinigtes Polypeptid umfassen.
  • Nicht beschränkende Beispiele von Stieleis oder einer Stieleisbeschichtung (z.B. Püree) umfassend Miraculin sind in Beispielen 15-17 und 21 offenbart. In manchen Fällen kann das Stieleis oder die Stieleisbeschichtung rekombinantes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann das Stieleis oder die Stieleisbeschichtung aus einer natürlichen Quelle (z.B. Pflanze) aufgereinigtes Miraculin umfassen. In manchen Fällen kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin von etwa 0,0001% w/w bis etwa 0,0050% w/w betragen. Zum Beispiel kann die Menge an aufgereinigtem Miraculin in einem Stieleis oder einer Stieleisbeschichtung etwa 0,0001% w/w, etwa 0,0005% w/w, etwa 0,0010% w/w, etwa 0,0015% w/w, etwa 0,0020% w/w, etwa 0,0025% w/w, etwa 0,0030% w/w, etwa 0,0035% w/w, etwa 0,0040% w/w, etwa 0,0045% w/w oder etwa 0,0050% w/w betragen. In manchen Fällen kann das Stieleis oder die Stieleisbeschichtung Wunderbeerenpulver umfassen. In manchen Fällen kann die Menge an Wunderbeerenpulver von etwa 0,1% w/w bis etwa 5% w/w betragen. Zum Beispiel kann die Menge an Wunderbeerenpulver in einem Stieleis etwa 0,1% w/w, etwa 0,5% w/w, etwa 1,0% w/w, etwa 1,5% w/w, etwa 2,0% w/w, etwa 2,5% w/w, etwa 3,0% w/w, etwa 3,5% w/w, etwa 4,0% w/w, etwa 4,5% w/w oder etwa 5,0% w/w betragen. In manchen Fällen kann ein Stieleis oder eine Stieleisbeschichtung sowohl aufgereinigtes Miraculin als auch Wunderbeerenpulver umfassen.
  • In einem bestimmten Aspekt kann eine Stieleisformulierung der Offenbarung eine oder mehr der folgenden Zutaten umfassen: Fruchtpüree (z.B. Mangopüree, Passionsfruchtpüree, Erdbeerpüree, Ananaspüree, usw.), Wasser, Salz, Orangenblütenwasser, Rosenwasser, Saft (z.B. Limettensaft, Zitronensaft), natürliche Aromen, und das geschmacksmodifizierende Polypeptid.
  • Verpackung
  • In manchen Aspekten können Zusammensetzungen hierin umfassend orale Dosierungen in einem Behälter verpackt werden. In manchen Aspekten können Zusammensetzungen hierin umfassend orale Dosierungen in einem Behälter verpackt werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einer Schachtel, einer Röhrchen, einem Glas, einer Phiole, einer Tasche, einem Beutel, einer Trommel, einer Flasche und einer Dose. Der Behälter kann Informationen enthalten, die Anweisungen zum Verzehr der Zusammensetzung beschreiben.
  • BEISPIELE
  • Verschiedene Aspekte der Offenbagung werden durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht.
  • Beispiel 1: Miraculin-Expression und Aufeinigung aus K. lactis
  • Zur Expression von Miraculin in K. lactis wurde zunächst eine Viel-Kopien-K. lactis-Kolonie erzeugt. Das Miraculin-Gen wurde für K. lactis kodonoptimiert. Das Gen wurde dann synthetisiert und in den pKLAC2-Vektor (New England Biolabs N3742S) kloniert. Das synthetisierte Plasmid (2 µg) wurde mit dem Restriktionsenzym Sacll (New England Biolabs) verdaut und die Expressionskassette wurde gelgereinigt. Die Expressionskassette wurde gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers in K. lactis GG799 kompetente Zellen (New England Biolabs C1001S) transformiert. Viel-Kopien-Kolonien wurden mittels Kolonie-PCR unter Verwendung der Integrationsprimer 2 und 3 aus dem Kit (New England Biolab E1000S) gescreent.
  • Die ausgewählte Viel-Kopie-Kolonie wurde dann in 2 ml YPGlu (∼pH 5) Medium für 18 Stunden bei 30°C unter Schütteln (250 rpm) gezüchtet. Anschließend wurde 1 ml der Übernachtkultur in 50 ml YPGlu (~pH 5) Medium beimpft und 18 Stunden bei 30°C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. 10 ml der Übernachtkultur wurden in 500 ml YGU (∼pH 4) Medien plus 1 mM DTT überführt und 72 Stunden bei 16°C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. Nach 72 Stunden wurden die Kulturen durch Zentrifugation bei 10.000xg über 20 Minuten bei 4°C geerntet. Das Zellpellet wurde mittels SDS-PAGE analysiert und auf eine PVDF-Membran für Western Blot übertragen. Anti-Miraculin-Antikörper wurden verwendet, um das Vorhandensein von Miraculin zu bestätigen (1). Der Überstand wurde gesammelt und der pH-Wert wurde, falls erforderlich, auf pH 4 eingestellt. Der Überstand wurde mit einem 0,22-µm-PES-Filter filtriert.
  • Das Miraculin wurde dann durch Kationenaustauschreinigung gereinigt. Zunächst wurde eine HiPrep SPXL 16/10-Säule (GE Healthcare Life Sciences 28936540) mit 100 ml milli-Q Wasser gewaschen. Die Säule wurde mit 40 ml Puffer A (20 mM Natriumcitrat, pH 4) bei 5 ml/min äquilibriert. Anschließend wurde der filtrierte Kulturüberstand bei 5 ml/min auf die äquilibrierte Säule geladen. Als nächstes wurde die Säule mit Puffer A bei 5 ml/min gewaschen, bis die OD280 unter 100 mAU lag. Dann wurde die Säule mit 100 ml 100 mM NaCl in 20 mM Natriumcitrat (10% von Puffer B, (1 M NaCl in 20 mM Natriumcitrat, pH 4)) gewaschen. Danach wurde das Miraculin 40 Minuten lang mit NaCI-Gradient eluiert (bei t=0 Minuten A:B=90:10, bei t=40 Minuten A:B=0:100 (5 ml/min)). 5 ml Fraktionen wurden für 200 ml gesammelt und der Peak erscheint bei 40~60% Gradient. (400 mM ~ 600 mM NaCl). Die Elutionsfraktionen wurden mittels Dot-Blot analysiert. Anti-Miraculin-Antikörper wurden verwendet, um das Vorhandensein von Miraculin zu bestätigen (1).
  • Nach der Reinigung wurde das Protein konzentriert und einem Pufferaustausch unterzogen. Fraktionen, die den Peak enthielten, wurden vereinigt und mit Amicon Ultra-15-Zentrifugalfiltereinheiten mit Ultracel-10-Membran (Millipore Sigma UFC901024) konzentriert. Gemäß den Anleitungen des Herstellers wurde der Pufferaustausch mit eiskaltem Flaschenwasser durchgeführt (8 ml bis ~2 ml für jeden Zyklus, 6 Zyklen mit Wasser). Die Probe wurde auf eine Konzentration von OD280=0,6 (in Wasser) eingestellt.
  • Die folgenden Kulturmedien und Lösungen wurden verwendet.
    1. A. 40% Glucoselösung
      • 400 g Glucose in 500 ml milli-Q Wasser geben.
      • Durch Rühren auflösen, auf 50°C erwärmen und das Volumen mit milli-Q Wasser auf 1 l einstellen.
      • Mit 0,22-µm-Filter sterilfiltrieren.
    2. B. YPGlu-Medium
      • 10 g Hefeextrakt und 20 g Bacto-Pepton in 950 ml milli-Q Wasser auflösen.
      • Den pH-Wert mit HCl auf 5,0 einstellen.
      • 20 Minuten lang bei 121°C autoklavieren. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      • Aseptisch 50 ml sterile 40%ige Glucose zugeben.
    3. C. YGU-Medium
      • 12 g Hefeextrakt, 26 g Galactose und 5 g Harnstoff in 800 ml milli-Q Wasser auflösen.
      • Den pH-Wert mit HCl auf 4,0 einstellen.
      • Das Endvolumen mit milli-Q Wasser auf 1 l bringen.
      • Mit 0,22-µm-Filter sterilfiltrieren. (Harnstoff nicht autoklavieren)
    4. D. 20 mM Natriumcitrat, ∼pH 4
      • 3,84 g Zitronensäure in 900 ml Milli-Q Wasser auflösen.
      • Den pH-Wert mit NaOH auf 4,0 einstellen.
      • Endvolumen mit milli-Q Wasser auf 1 l bringen.
    5. E. 1 M NaCl in 20 mM Natriumcitrat, ∼pH 4
      • 3,84 g Zitronensäure und 58,4 g NaCl in 900 ml milli-Q Wasser auflösen.
      • Den pH-Wert mit NaOH auf 4,0 einstellen.
      • Endvolumen mit milli-Q Wasser auf 1 l bringen.
  • Beispiel 2: Brazzein-Expression und Aufreinigung aus K. lactis
  • Zur Expression von Brazzein in K. lactis wurde zunächst eine Viel-Kopien-K. lactis-Kolonie erzeugt. Das Brazzein (dBRZ, Brazzein-1)-Gen wurde für K. lactis kodonoptimiert. Das Gen wurde dann synthetisiert und in den pKLAC2-Vektor (New England Biolabs N3742S) kloniert. Das synthetisierte Plasmid (2 µg) wurde mit dem Restriktionsenzym Sacll (New England Biolabs) verdaut und die Expressionskassette wurde gelgereinigt. Die Expressionskassette wurde gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers in K. lactis GG799 kompetente Zellen (New England Biolabs C1001S) transformiert. Viel-Kopien-Kolonien wurden mittels Kolonie-PCR unter Verwendung der Integrationsprimer 2 und 3 aus dem Kit (New England Biolab E1000S) gescreent.
  • Die ausgewählte Viel-Kopien-Kolonie wurde dann in 2 ml YPGlu (~ pH 5) Medium 18 Stunden bei 30°C unter Schütteln (250 rpm) gezüchtet. Anschließend wurde 1 ml der Übernachtkultur in 50 ml YPGlu (~ pH 5) Medium beimpft und 18 Stunden bei 30°C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. 10 ml der Übernachtkultur wurden in 500 ml YPGal (~ pH 5) Medium überführt und 96 Stunden bei 30°C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. Nach 96 Stunden wurden die Kulturen durch Zentrifugation bei 10.000xg über 20 Minuten bei 4°C geerntet. Der Überstand wurde gesammelt und der pH-Wert wurde mit Zitronensäure auf pH 4 eingestellt. Der Überstand wurde mit einem 0,22-µm-PES-Filter filtriert.
  • Das Brazzein wurde dann durch Kationenaustauschreinigung gereinigt. Zuerst wurde eine HiPrep SPXL 16/10-Säule (GE Healthcare Life Sciences 28936540) mit 100 ml milli-Q Wasser gewaschen. Die Säule wurde mit 40 ml Puffer A (20 mM Natriumcitrat, pH 4) bei 5 ml/min äquilibriert. Anschließend wurde der filtrierte Kulturüberstand bei 5 ml/min auf die äquilibrierte Säule geladen. Als nächstes wurde die Säule mit Puffer A bei 5 ml/min gewaschen, bis die OD280 unter 100 mAU lag. Dann wurde die Säule mit 100 ml von 100 mM NaCl in 20 mM Natriumcitrat (10% des Puffers B, (1 M NaCl in 20 mM Natriumcitrat, pH 4)) gewaschen. Als nächstes wurde das Brazzein 40 Minuten lang mit einem NaCl-Gradienten eluiert (bei t=0 Minuten A:B=90:10, bei t=40 Minuten A:B=0:100 (5 ml/min)). 5 ml Fraktionen wurden für 200 ml gesammelt und der Peak erscheint bei 40~60% Gradient (400 mM ~ 600 mM NaCI). Das Protein wurde unter Verwendung von Gelfiltration mit HiPrep 16/60 S-100 (GE Healthcare Life Sciences 17116501) weiter gereinigt (2).
  • Nach der Reinigung wurde das Protein konzentriert und einem Pufferaustausch unterzogen. Fraktionen, die den Peak enthielten, wurden vereinigt und mit Amicon Ultra-15-Zentrifugalfiltereinheiten mit Ultracel-3-Membran (Millipore Sigma UFC900324) konzentriert. Gemäß den Anleitungen des Herstellers wurde der Pufferaustausch mit eiskaltem Flaschenwasser durchgeführt (8 ml bis ~2 ml für jeden Zyklus, 6 Zyklen mit Wasser). Die Probe wurde auf eine Konzentration von OD280=0,7 (in Wasser) eingestellt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE getrennt und auf eine PVDF-Membran für den Western Blot übertragen. Ein Anti-Brazzein-Antikörper wurde verwendet, um das Vorhandensein von Brazzein zu bestätigen (3). Eine Proteinidentifikationsanalyse mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) wurde verwendet, um das Vorhandensein von Brazzein zu bestätigen (4).
  • Die folgenden Kulturmedien und Lösungen wurden verwendet.
    1. A. 40% Glucoselösung oder 40% Galactoselösung
      • 400 g Glucose oder Galactose in 500 ml milli-Q Wasser geben.
      • Durch Rühren auflösen, bei 50°C erwärmen und das Volumen mit milli-Q Wasser auf 1 l einstellen.
      • Mit 0,22-µm-Filter sterilfiltrieren.
    2. B. YPGlu & YPGal-Medium
      • 10 g Hefeextrakt und 20 g Bacto-Pepton in 950 ml Milli-Q Wasser auflösen.
      • Den pH-Wert mit HCl auf 5,0 einstellen.
      • 20 Minuten lang bei 121°C autoklavieren. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      • Aseptisch 50 ml sterile 40% Glucose für YPGlu oder 40%ige Galactose für YPGal hinzufügen.
    3. C. 20 mM Natriumcitrat, ∼pH 4
      • 3,84 g Zitronensäure in 900 ml Milli-Q Wasser auflösen.
      • Den pH-Wert mit NaOH auf 4,0 einstellen.
      • Endvolumen mit milli-Q Wasser auf 1 l bringen.
    4. D. 1 M NaCl in 20 mM Natriumcitrat, ∼pH 4
      • 3,84 g Zitronensäure und 58,4 g in 900 ml milli-Q Wasser auflösen.
      • Den pH-Wert mit NaOH auf 4,0 einstellen.
      • Endvolumen mit milli-Q Wasser auf 1 l bringen.
  • Beispiel 3: Miraculin-Expression aus P. Pastoris
  • Zur Expression von Miraculin in P. Pastoris wurde zunächst eine Viel-Kopien-P. Pastoris-Kolonie erzeugt. Das Miraculin-Gen wurde für P. Pastoris kodonoptimiert. Das Gen wurde dann synthetisiert und in einen modifizierten pPIC9K-Vektor (Thermo Fisher Scientific V17520) mit GAP-Promotor kloniert. Das synthetisierte Plasmid (2 µg) wurde mit dem Restriktionsenzym Sall (New England Biolabs) linearisiert und gelgereinigt. Das linearisierte Plasmid wurde gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers (Thermo Fisher Scientific K171001) in P. Pastoris GS115 kompetente Zellen (Thermo Fisher Scientific C18100) transformiert. Viel-Kopien-Kolonien wurden durch YPD-Platten mit 4 mg/ml Geneticin gescreent.
  • Die ausgewählte Viel-Kopien-Kolonie wurde dann in 4 ml MGY (~ pH 4) Medium bei 28°C unter Schütteln (250 rpm) gezüchtet. Anschließend wurde alle 24 Stunden 1 ml der Kultur für eine Dot-Blot-Analyse zur Bestätigung der Proteinexpression und -sekretion geerntet. Die Proben wurden durch Zentrifugation bei 14.000 rpm 2 Minuten geerntet. Der Überstand wurde gesammelt und für den Dot-Blot auf eine Nitrozellulosemembran geladen. Die Miraculin-Expression im Überstand der Pichia-Kultur wurde bestätigt (5).
  • Die ausgewählte Viel-Kopien-Kolonie wurde dann in 4 ml MGY (~pH 4) Medium 18 Stunden bei 28°C unter Schütteln (250 rpm) kultiviert. Anschließend wurden 3 ml der Übernachtkultur in 500 ml MGY (~pH 4)-Medien beimpft und 48 Stunden bei 28°C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Kulturen durch Zentrifugation bei 10.000xg über 20 Minuten bei 4°C geerntet. Der Überstand wurde gesammelt und der pH-Wert wurde, falls erforderlich, auf pH 4 eingestellt. Der Überstand wurde mit einem 0,22-µm-PES-Filter filtriert.
  • Das Miraculin wurde dann durch Kationenaustauschreinigung gereinigt. Zunächst wurde eine HiPrep SPXL 16/10-Säule (GE Healthcare Life Sciences 28936540) mit 100 ml milli-Q Wasser gewaschen. Die Säule wurde mit 40 ml Puffer A (20 mM Natriumcitrat, pH 4) bei 5 ml/min äquilibriert. Anschließend wurde der filtrierte Kulturüberstand bei 5 ml/min auf die äquilibrierte Säule geladen. Als nächstes wurde die Säule mit Puffer A bei 5 ml/min gewaschen, bis die OD280 unter 100 mAU lag. Dann wurde die Säule mit 100 ml von 100 mM NaCl in 20 mM Natriumcitrat (10% des Puffers B, (1 M in 20 mM Natriumcitrat, pH 4)) gewaschen. Danach wurde das Miraculin 40 Minuten lang mit NaCI-Gradient eluiert (bei t=0 Minuten A:B=90:10, bei t=40 Minuten A:B=0:100 (5 ml/min)). 5 ml Fraktionen wurden für 200 ml gesammelt und der Peak erschien bei 40~60% Gradient (400 mM ~ 600 mM NaCI). Die Elutionsfraktionen wurden mittels Dot-Blot analysiert. Anti-Miraculin-Antikörper wurden verwendet, um das Vorhandensein von Miraculin zu bestätigen (5).
  • Nach der Reinigung wurde das Protein konzentriert und einem Pufferaustausch unterzogen. Fraktionen, die den Peak enthielten, wurden vereinigt und mit Amicon Ultra-15-Zentrifugalfiltereinheiten mit Ultracel-10-Membran (Millipore Sigma UFC901024) konzentriert. Gemäß den Anleitungen des Herstellers wurde der Pufferaustausch mit eiskaltem Flaschenwasser durchgeführt (8 ml bis ~2 ml für jeden Zyklus, 6 Zyklen mit Wasser). Die Probe wurde auf eine Konzentration von OD280=0,6 (in Wasser) eingestellt.
  • Beispiel 4: Brazzein-Expression aus P. Pastoris
  • Zur Expression von Brazzein in P. Pastoris, wurde zunächst eine Viel-Kopien- P. Pastoris-Kolonie erzeugt. Das Brazzein-Gen wurde für P. Pastoris kodonoptimiert. Das Gen wurde dann synthetisiert und in einen modifizierten pPIC9K-Vektor (Thermo Fisher Scientific V17520) mit GAP-Promotor kloniert. Das synthetisierte Plasmid (2 µg) wurde mit Restriktionsenzym Sall (New England Biolabs) linearisiert und gelgereinigt. Das linearisierte Plasmid wurde gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers (Thermo Fisher Scientific K171001) in P. Pastoris GS115 kompetente Zellen (Thermo Fisher Scientific C18100) transformiert. Viel-Kopien-Kolonien wurden durch YPD-Platten mit 4 mg/ml Geneticin gescreent.
  • Die ausgewählte Viel-Kopien-Kolonie wurde dann in 4 ml MGY (~ pH 4) Medium bei 28°C unter Schütteln (250 rpm) gezüchtet. Anschließend wurde alle 24 Stunden 1 ml der Kultur für eine Dot-Blot-Analyse zur Bestätigung der Proteinexpression und -sekretion geerntet. Die Proben wurden durch Zentrifugation bei 14.000 rpm 2 Minuten geerntet. Der Überstand wurde gesammelt und für den Dot-Blot auf eine Nitrozellulosemembran geladen. Die Brazzein-Expression im Überstand der Pichia-Kultur wurde bestätigt (6). Die Expression im großen Maßstab wird gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers (Thermo Fisher Scientific K171001) durchgeführt.
  • Beispiel 5: Miraculin-Expression aus E.coli
  • Das offene Leseraster von Miraculin wurde zunächst in den pET-28a(+)-Vektor (Novagen) kloniert. Kompetente BL21-DE3-Zellen (New England Biolabs C25271) wurden entsprechend den Herstellerangaben transformiert. 100 µl der Transformation wurden einer 5-ml-Kultur von LB mit geeigneten Antibiotika hinzugefügt. Die Kultur wurde über Nacht bei 37°C gezüchtet. Eine 100-ml-Kultur wurde von der Starterkultur beimpft und auf eine Ausgangs-OD600 von 0,6 wachsen gelassen, bevor sie mit 500 µM IPTG induziert wurde. Die Induktion erfolgte für 24 Stunden bei 16°C. 1 ml der Kultur wurde geerntet und bei 14.000xg pelletiert. 100 µl SDS-Probenpuffer mit 50 mM TCEP wurden dem Zellpellet hinzugefügt. Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran für Western Blot übertragen. Anti-Miraculin-Antikörper wurden verwendet, um das Vorhandensein von Miraculin zu bestätigen (7).
  • Beispiel 6: Brazzein-Expression aus E.coli
  • Das offene Leseraster von Brazzein wurde zunächst in den pET-28a(+)-Vektor (Novagen) kloniert. Kompetente BL21-DE3-Zellen (New England Biolabs C25271) wurden nach Herstellerangaben transformiert. 100 µl der Transformation wurden einer 5-ml-Kultur von LB mit geeigneten Antibiotika hinzugefügt. Die Kultur wurde über Nacht bei 37°C gezüchtet. 100 ml der Kultur wurden von der Starterkultur beimpft und bis zu einer Ausgangs-OD600 von 0,6 wachsen gelassen, bevor sie mit 500 µM IPTG induziert wurden. Die Kultur wurde 3 Stunden lang bei 28°C gezüchtet. Die Kultur wurde 15 Minuten lang bei 14.000xg zentrifugiert. Die Zellen wurden durch Vortexen mit Glasperlen in einem 4°C-Kühlschrank aufgebrochen. Es wurden 100 ml Extraktionspuffer (50 mM NaCl, 20 mM Natriumcitrat, 50 mM Ascorbinsäure, 5% Polyvinylpolypyrrolidon, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 µM Leupeptin) hinzugefügt und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 14.000xg entfernt. Der Überstand wurde durch eine 0,22-µm-PES-Membran filtriert, bevor er auf eine kalibrierte HiTrap SP FF-Säule (GE 17515701) geladen wurde. Nicht gebundene Proteine wurden durch Waschen mit 20 mM Natriumcitrat entfernt, bis A280 unter 100 mAU abgelesen wurde. Gebundene Proteine wurden mit einem salzbasierten Gradienten (von 0 mM bis 1 M NaCl) über 100 ml eluiert. Die Fraktionen wurden konzentriert und die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran für den Western Blot übertragen. Ein Anti-Brazzein-Antikörper wurde verwendet, um das Vorhandensein von Brazzein zu bestätigen (8).
  • Beispiel 7: Dünnfilm
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin umfasst, zu einem oralen dünnen Film formuliert. Tabelle 7. Formulierung eines oralen Dünnfilms (~8 Portionen)
    Inhaltsstoffe Menge
    LycoatⓇ RS780 0,56 g
    Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC, 2%) 1,2 ml
    Rote Lebensmittelfarbe (FD&C Rot # 40) 6 µl
    Gemischte Lösung von Zitronensäure und
    Ascorbinsäure 1,5 ml
    Pflanzliches Glycerin (4%) 1,5 ml
    Gereinigtes Miraculin Protein (0.5 mg/ml) 4 ml
    H2O 11,8 ml
  • Lycoat® RS780 ist eine vorgelatinierte modifizierte Erbsenstärke, die von ROQUETTE America Inc. erhalten wurde. Die 2% Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC, Methocel F50 Lebensmittelqualität) wurde durch Auflösen von 2 g HPMC in 100 ml H2O hergestellt. Die gemischte Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure wurde durch Auflösen von 0,46 g Zitronensäure und 0,4 g Ascorbinsäure in 50 ml H2O hergestellt. Das 4% pflanzliche Glycerin (USP Lebensmittelqualität) wurde durch Auflösen von 4 g pflanzlichem Glyzerin in 100 ml H2O hergestellt.
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um dünne orale Filme herzustellen, die Miraculin umfassen. Zunächst wurden 0,56 g Lycoat® RS780 in Wasser gelöst und zur besseren Auflösung etwa 5-7 Minuten auf einer Heizplatte erhitzt. Nach mindestens einer Stunde unter ständigem Rühren wurden der Lycoat® RS780-Lösung 1,2 ml 2% HPMC zugegeben und mindestens eine Stunde lang gemischt. Dann wurden der Polymerlösung 6 µl rote Lebensmittelfarbe (FD&C Rot #40) hinzugefügt und eine weitere Stunde lang gemischt. Anschließend wurden der Polymerlösung 1,5 ml der gemischten Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure hinzugefügt und mindestens eine weitere Stunde lang gemischt. Dann wurde der Filmlösung 1 ml 4%iges pflanzliches Glycerin zugesetzt und mindestens eine Stunde lang gemischt. Dann wurden 4 ml der gereinigten Miraculin-Protein-Flüssigkeit (in einer Konzentration von 0,5 mg/ml) zur Filmlösung hinzugefügt und mindestens 40 Minuten lang gemischt. Dann wurden 20 ml der Filmlösung auf eine Filmform gegossen, die eine quadratische Petrischale (9 cm x 9 cm) umfasste, und der Film wurde durch Trocknen bei Raumtemperatur mit Zwangsluftstrom geformt, bis der Film ein konstantes Gewicht erreichte (etwa 8 Stunden). In bevorzugten Beispielen ist die endgültige Filmlösung blasenfrei, bevor sie auf die Filmform gegossen wird. Schließlich wurde der getrocknete Film von der Petrischale abgezogen und in Streifen von 3,2 cm x 2 cm geschnitten und in einer versiegelten Verpackung bei Raumtemperatur gelagert.
  • Die resultierenden dünnen Filme in diesem Beispiel enthielten jeweils etwa 0,250 mg gereinigtes Miraculin. Dünnfilmpräparate können mehr oder weniger Miraculin enthalten. Beispielsweise können Dünnfilmpräparate etwa 0,100 mg, etwa 0,125 mg, etwa 0,150 mg, etwa 0,175 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,225 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,275 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,325 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,375 mg oder etwa 0,400 mg Miraculin enthalten.
  • Beispiel 8: Essbares Gel
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin umfasst, zu einem essbaren Gel formuliert. Tabelle 8. Formulierung von Gelee (~24 Portionen)
    Inhaltsstoffe Menge
    Wunderfruchtpulver 9 g
    Kranbeerensaft 140 ml
    Geschmacksneutrale Gelatine 18 g
    Gemischte Lösung von Zitronensäure und
    Ascorbinsäure 15 ml
    H2O 155 ml
  • Pures Wunderfruchtpulver (Beerenpulver von Synsepalum dulcificum) wurde von Miracle Fruit Farm, FL, gekauft. Die gemischte Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure wurde durch Auflösen von 0,46 g Zitronensäure und 0,4 g Ascorbinsäure in 50 ml H2O hergestellt.
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um essbare Gele herzustellen, die Miraculin enthalten. Das Fruchtpulver (9 g) wurde mit 15 ml der gemischten Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure und mit 65 ml H2O gemischt, bis das Pulver gleichmäßig in der flüssigen Lösung verteilt war. Dann wurden 18 g geschmacksneutrale Gelatine in 90 ml erhitztem H2O aufgelöst. Dann wurden 140 ml kalter Kranbeerensaft zu der geschmacksneutralen Gelatinelösung gegeben und gut vermischt. Die Fruchtpulverlösung wurde dann zu der Mischung aus Gelatine und Kranbeerensaft gegeben, und die resultierende Mischung wurde gut vermischt. Die endgültige Lösung wurde in eine Geleeform gegossen und in einem Kühlschrank mindestens 3 Stunden lang bis zur Festigkeit gelagert. Das verfestigte Gelee wurde schließlich in kleine Würfel geschnitten und in einem luftdichten Behälter in einem Kühlschrank aufbewahrt.
  • Die resultierenden essbaren Gele in diesem Beispiel enthielten jeweils etwa 0,375 g Fruchtpulver. Fruchtpulver kann neben Polypeptid auch andere Beerenbestandteile, wie Fruchtfleisch und Schale, enthalten. Fruchtpulver kann höchstens 50 Gew.-% Miraculin enthalten (z.B. höchstens etwa 45 %, etwa 40 %, etwa 35 %, etwa 30 %, etwa 25 %, etwa 20 %, etwa 15 %, etwa 10 %, etwa 5 %, etwa 4 %, etwa 3 %, etwa 2 %, etwa 1 %, etwa 0,1 % oder weniger). Ein essbares Gel kann weniger als etwa 200 mg, etwa 100 mg, etwa 50 mg, etwa 10 mg, etwa 5 mg, etwa 4 mg, etwa 3 mg, etwa 2 mg, etwa 1 mg, etwa 0,900 mg, etwa 0,800 mg, etwa 0,700 mg, etwa 0,600 mg, etwa 0,500 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,150 mg oder etwa 0,100 mg Miraculin-Polypeptid enthalten.
  • Beispiel 9: Fruchthäppchen (8 Portionen)
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin enthält, zu Fruchthäppchen formuliert.
    Inhaltsstoffe Menge
    Tapiokastärke 1.39 g
    Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC, 2%) 5 ml
    Polysorbat 20 (Lebensmittelqualität) 5 ml
    Gemischte Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure 5 ml
    Wunderfruchtpulver 5 g
    Pflanzliches Glycerin (4%) 8 ml
  • Die 2% Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC, Methocel F50 Nahrungsmittelqualität) wurde durch Auflösen von 2 g HPMC in 100 ml H2O hergestellt. Die gemischte Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure wurde durch Auflösen von 0,46 g Zitronensäure und 0,4 g Ascorbinsäure in 50 ml H2O hergestellt. Die Lösung aus Polysorbat 20 (USP, Kosher Pure, Nahrungsmittelqualität) wurde durch Mischen von 1,825 g Polysorbat 20 mit 50 ml H2O hergestellt. Das 4% pflanzliche Glycerin (USP, Nahrungsmittelqualität) wurde durch Auflösen von 4 g pflanzlichem Glycerin in 100 ml H2O hergestellt. Wunderfruchtpulver (Beerenpulver von Synsepalum dulcificum) wurde von der Miracle Fruit Farm, FL, gekauft.
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um Fruchthäppchen herzustellen, die Miraculin enthalten. Zuerst wurden 1,39 g Tapiokastärke in Wasser gelöst und erhitzt, bis sie ein Gel bildeten. Dann wurde die Tapiokastärkelösung eine Stunde lang kontinuierlich gerührt. Als nächstes wurden der Stärkelösung 5 ml 2% HPMC hinzugefügt und mindestens eine Stunde lang gemischt. Dann wurden 5 ml Polysorbat 20-Lösung hinzugefügt und die Lösung eine weitere Stunde lang gemischt. Anschließend wurden 5 ml der gemischten Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure zur Mischung zugegeben und mindestens eine Stunde lang gemischt. Dann wurden der Lösung 8 ml 4% pflanzliches Glycerin zugegeben und mindestens eine Stunde lang gemischt. Anschließend wurden 5 g Fruchtpulver zu der Lösung hinzugefügt und die Lösung mindestens 40 Minuten lang gemischt. Dann wurden 45 ml der endgültigen Lösung auf eine Form gegossen, die eine quadratische Petrischale (9 cm x 9 cm) umfasste. Die Fruchthäppchen wurden durch Trocknen der Lösung bei Raumtemperatur mit Zwangsluftstrom gebildet, bis die Mischung auf der Petrischale ein konstantes Gewicht erreichte. Schließlich wurde die Mischung von der Petrischale abgezogen und das entstandene Fruchtprodukt aufgerollt und in 8 Stücke geschnitten. Die Fruchthäppchen wurden in einem luftdichten Behälter in einem Kühlschrank aufbewahrt.
  • Die resultierenden Fruchthäppchen in diesem Beispiel enthalten jeweils etwa 0,625 g Fruchtpulver. Fruchtpulver kann neben Polypeptid auch andere Beerenbestandteile, wie Fruchtfleisch und Schale, enthalten. Fruchtpulver kann höchstens etwa 50 Gew.-% Miraculin enthalten (z.B. höchstens etwa 45 %, etwa 40 %, etwa 35 %, etwa 30 %, etwa 25 %, etwa 20 %, etwa 15 %, etwa 10 %, etwa 5 %, etwa 4 %, etwa 3 %, etwa 2 %, etwa 1 %, etwa 0,1 % oder weniger). Ein Fruchtkaubonbon kann weniger als etwa 350 mg, etwa 300 mg, etwa 250 mg, etwa 200 mg, etwa 150 mg, etwa 100 mg, etwa 50 mg, etwa 10 mg, etwa 5 mg, etwa 4 mg, etwa 3 mg, etwa 2 mg, etwa 1 mg, etwa 0,900 mg, etwa 0,800 mg, etwa 0,700 mg, etwa 0,600 mg, etwa 0,500 mg, etwa 0,450 mg, etwa 0,400 mg, etwa 0,350 mg, etwa 0,300 mg, etwa 0,250 mg, etwa 0,200 mg, etwa 0,150 mg oder etwa 0,100 mg Miraculin-Polypeptid enthalten.
  • Beispiel 10: Extraktion von Miraculin aus Wunderbeeren
  • In diesem Beispiel wurde das Miraculin aus Wunderbeeren extrahiert. Zuerst wurden 600 g Beeren (~356 Beeren) abgewogen. Eine Lösung von 0,5 M NaCI+5 mM EDTA (29,2 g NaCl + 10 ml 0,5 M EDTA in 1 I MilliQ H2O) wurde im Verhältnis 1:1 verwendet, um das Beerenfleisch von den Beerenkernen und -schalen zu trennen (~600 ml Lösung für 600 g Beeren).
  • Die Beeren wurden in Chargen von 300 g verarbeitet. Zuerst wurde die Hälfte der ersten Charge Beeren in ein großes Plastikbecherglas mit 1 Liter (1 I) Inhalt gegeben. Dann wurden den Beeren im Becherglas 150 ml eiskaltes 0,5 M NaCI+EDTA und 0,35 g Ascorbat hinzugefügt. Die Beeren wurden mit einem Handrührgerät gemischt, während sich das Becherglas auf Eis befand. Die restliche Hälfte der Beeren wurde in das Becherglas gegeben, wenn eine angemessene Trennung von Fruchtfleisch und Kernen beobachtet wurde. Die Beeren wurden weiter mit dem Handmixer gemischt, bis ein geeignetes Ausmaß an Trennung für die gesamte Beerencharge festgestellt wurde. Die Mischung wurde in eine Salatschleuder gegeben und die Salatschleuder wurde verwendet, um Flüssigkeit von Kernen und Schalen zu trennen. Die Flüssigkeit wurde in einem separaten Behälter gesammelt und auf Eis gelegt.
  • Die Schalen und Kerne in der Salatschleuder wurden zurück in das Becherglas gegeben und weitere 150 ml 0,5 M NaCl wurden in das Becherglas gegeben. Die Beerenkerne und -schalen wurden mit einem Handrührgerät gemischt, um ein Fruchtfleisch zu erhalten, das auf den Kernen zurückblieb. Die Mischung wurde erneut in die Salatschleuder gegeben, um die Flüssigkeit von den Kernen zu trennen. Die Flüssigkeit wurde in einem separaten Behälter gesammelt und auf Eis gelegt. Die Mischung wurde noch 1-2 Mal geschleudert, um die restliche Flüssigkeit von den Kernen und Schalen aufzufangen. Aus 300 g ganzen Beeren wurden durchschnittlich 103 g Beerenextrakt (ohne das Gewicht des zugesetzten NaCl), durchschnittlich 61,2 g Beerenschalen und durchschnittlich 136 g der gesamten Kerne gewonnen. Das gesammelte Gesamtvolumen betrug etwa 400 ml ~ 450 ml des gesamten Beerenextrakts. Dies wurde für die zweite Beerencharge wiederholt, um insgesamt etwa 800 ml ~ 900 ml Beerenextrakt aus ~600 g Beeren zu erhalten.
  • Ascorbat (0,704 g) wurde zu den gesammelten 800 ml ~ 900 ml Beerenextrakt (~5) hinzugefügt. Der Beerenextrakt wurde von einer Küchenmaschine unter Verwendung von 10-Sekunden-Impulsen für 6 Impulse gemischt. Zwischen jedem 10-Sekunden-Impuls gab es eine Pause von 10 Sekunden. Die Beerenextraktlösung wurde dann in 250 ml Zentrifugenflaschen gegeben und 1 Stunde lang bei 14.000 rpm und 4°C zentrifugiert.
  • Während der Zentrifugation wurden die Pumpe und der Ultrafiltrations-/Diafiltrationsfilter (UFDF) mit MilliQ H2O (3x 500 ml) und anschließend einmal mit Dialysepuffer gespült. Die Pumpe wurde bei 600 ml/Minute mit 10-15 psi am hinteren Manometer betrieben.
  • Nach der Zentrifugation wurde der Beerenextrakt unter Vakuum durch 70 mm Whatman #3-Filterpapier in einen vorgekühlten Filterkolben auf Eis filtriert. Der filtrierte Beerenextrakt wurde dann mit einer 500-ml-Flasche auf Eis in UFDF geladen. Der Extrakt wurde mit 600 ml/Minute und einem Druck von etwa 25~30 psi max. durch die Flasche gepumpt. Nach der Beladung des Extrakts wurde ein Schlauch verwendet, um eiskalten Dialysepuffer in den Beerenextrakt zu tropfen und das Volumen bei 200 ~ 250 ml zu halten, um ein Pseudogleichgewicht herzustellen. Die Dialyse wurde mit 2,5 I Dialysepuffer durchgeführt. Ungefähr 300 ml der dialysierten Probe wurden aus dem UFDF-System entnommen. Der pH-Wert der dialysierten Probe wurde mit 1 M Tris-Base auf pH 7,28 ~ 7,29 eingestellt. Die pH-eingestellte, dialysierte Probe wurde dann bei 14.000 rpm 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert.
  • Während der Zentrifugation wurden zwei Chromatographie-Säulen vorbereitet. Jede Säule enthielt 10 ml Nickelharzaufschlämmung und befand sich in einer Kühlbox. Jede Säule wurde mit 25 ml Wasser und anschließend mit 50 ml Bindepuffer gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Säulen mit Hilfe eines Ringständers vertikal gestapelt, und der Ausgang der oberen Säule wurde über Schläuche mit dem Eingang der unteren Säule verbunden.
  • Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mit einer 0,22 µm Corning-PES-Membran filtriert. Die filtrierte Probe (~300 ml) wurde durch Schwerkraftfluss auf die verbundenen Säulen geladen. Die Probe wurde nacheinander durch beide Säulen fließen gelassen. Die Säulen wurden mit 150 ml Beladungspuffer pH 7,3 gewaschen. Dann wurden die beiden Säulen getrennt und die Elutionsfraktionen für jede Säule getrennt gesammelt. Jede Säule wurde mit ~25 ml Elutionspuffer eluiert, wobei etwa 1 in jedem der beschrifteten 2-ml-Microfuge-Röhrchen gesammelt wurde. (#1~5 für eine 5 ml Fraktion, #6-15 für 1 ml Fraktionen, #16-25 für 5 ml Fraktionen). Alle Fraktionen wurden auf Eis aufbewahrt. EDTA wurde in die eluierten Proben (Peakfraktionen mit OD280>0,2) bis zu einer Endkonzentration von 2 mM (4 µl 0,5 M EDTA in 1 ml) zugegeben. Alle Peakfraktionen wurden bei -20°C gehalten.
  • Anschließend wurde der Pufferaustausch mittels UFDF durchgeführt. UFDF (kleine Säule) wurde 3x mit MilliQ H2O gespült; die Pumpe wurde mit 300 ml/Minute und durchschnittlich 10 psi betrieben. Der Druck wurde reduziert und die Pumpgeschwindigkeit auf 150 ml/Minute reduziert. MilliQ. H2O wurde aus der Maschine gepumpt. Für den Extrakt wurde ein Eisbad geschaffen und der Extrakt wurde in ein 150-ml-Becherglas gegeben. Die UFDF wurde mit 300 ml/Minute 20 psi am vorderen Ende und 25 psi am hinteren Ende durchgeführt. Das Flüssigkeitsvolumen im Becherglas wurde auf etwa 30 ml reduziert. Sobald das Flüssigkeitsniveau 30 ml erreicht hatte, wurde der Druck reduziert und 100 ml MilliQ H2O in das Becherglas gegeben. Dies wurde 7x wiederholt (unter Zugabe von insgesamt 700 ml MilliQ H2O). Das Flüssigkeitsniveau wurde so niedrig wie möglich reduziert und aufgefangen. Die Pumpe wurde umgedreht, um mehr Extrakt aus dem System zu sammeln.
  • Ein weiterer Pufferaustausch wurde mit Millipore-Filtersäulen durchgeführt. Alle Proben wurden gekühlt und/oder auf Eis aufbewahrt. Zuerst wurden 15 ml Millipore-Filtersäulen gewaschen, indem etwa 7-8 ml MilliQ H2O in den Filter geladen und mindestens 10 Minuten lang bei 5000xg bei 4°C zentrifugiert wurden. Der Durchfluss und das im Filter verbliebene Wasser wurden abgegossen. Elutionsproben wurden vereinigt und auf die Filtersäulen geladen. Jede Filtersäule wurde mit maximal 7-8 ml Elutionsproben gefüllt. Nachdem die Proben geladen waren, wurden die Säulen 20 Minuten lang bei 5000xg und 4°C zentrifugiert. Der Durchfluss wurde abgegossen.
  • Nachdem alle Elutionsproben durch die Millipore-Filtersäulen gelaufen waren, wurden die Säulen gewaschen. Die Säulen wurden durch Zugabe von Wasser an der Oberseite des Etikettenstreifens gewaschen (Gesamtvolumen von etwa 7 ml). Die Säulen wurden dann 15 Minuten lang bei 5000xg und 4°C zentrifugiert. Nach jedem Zentrifugieren wurde der Durchfluss abgegossen.
  • Puffer Rezepte
  • UFDF Dialysepuffer
    MW Molarität Einwaage
    NaCl 58,44 0,5 116,88 g
    Citrat 192,124 0,01 7,68 g
    dH2O hinzufügen auf 4
    Liter
    pH mit 10 N NaOH auf ~3,5 einstellen
    Vor Verwendung auf Eis auf ~ 0°C abkühlen Binde-/Waschpuffer
    MW Molarität Einwaage
    NaCl 58,44 0,5 29,22 g
    Citrat 192,124 0,01 1,92 g
    Tris Base 121,14 0,02 2,42 g
    dH2O hinzufügen auf 1
    Liter
    pH mit 10 N NaOH auf ~7,3 einstellen
    Vor Verwendung auf Eis auf ~ 0°C abkühlen
  • Elutionspuffer
    • Gleiches Rezept wie Bindepuffer
    • Auf pH ~4,68 einstellen
    • Vor Verwendung auf Eis auf ~ 0°C abkühlen
  • Beispiel 11: Miraculin-Gummibonbons
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin umfasst, in Gummibonbons mit Fruchtgeschmack formuliert. Tabelle 10. Formulierung von Miraculin in Gummibonbons (79 Gummibonbons)
    Inhaltsstoffe
    Teil I.
    Gelatine, 250 Bloom 25 g
    Wasser 40 ml
    Teil II.
    Konzentrierter Apfelsaft 44 ml
    Maisstärke 5 g
    Guarkernmehl 3 g
    Teil III.
    Wunderbeerenpulver 10 g
    Mischung von Zitronensäure und Ascorbinsäure 7,5 ml
    Kranbeerensaft 20 ml
    Miraculin-Lösung (0,6 mg/ml) 8 ml
    Polysorbat 20 2,5 ml
    Brombeer-Aromaöl 0,5 ml
    Zitronensäure 3,2 g
    Rote Lebensmittelfarbe 18 µl
  • Die gemischte Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure wurde durch Auflösen von 0,46 g Zitronensäure und 0,4 g Ascorbinsäure in 50 ml H2O hergestellt. Die Lösung aus Polysorbat 20 (USP, Kosher Pure, Lebensmittelqualität) wurde durch Mischen von 1,825 g Polysorbat 20 mit 50 ml H2O hergestellt. Pures Wunderfruchtpulver (Beerenpulver von Synsepalum dulcificum) wurde von Miracle Fruit Farm, FL, bezogen.
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um Gummibonbons mit Miraculin herzustellen. Zunächst wurden Gelatine und Wasser (Teil I) in einem heißen Wasserbad 5 Minuten lang vorgewärmt. Dann wurde die Gelatine in das Wasser gequirlt, bis alle Klumpen verschwunden waren. Die Gelatinelösung wurde bei mittlerer bis niedriger Hitze etwa 25 Minuten lang kontinuierlich erhitzt, und die Lösung wurde so lange gerührt, bis die gesamte Gelatine geschmolzen und glatt und glasartig geworden war.
  • Als nächstes wurden 5 g Maisstärke in 14 ml Apfelsaftkonzentrat gelöst (Teil II). 30 ml Apfelsaftkonzentrat wurden bei mittlerer bis niedriger Hitze erhitzt, und die Stärkemischung wurde in den warmen Apfelsaft gequirlt. Dann wurden 3 g Guarkernmehl zu der Mischung hinzugefügt und kontinuierlich gerührt, bis sich eine gelartige Textur gebildet hatte.
  • Als nächstes wurde die vorgemischte Zitronensäure- und Ascorbinsäurelösung, Polysorbat 20, und Kranbeerensaft zum Wunderbeerenpulver hinzugefügt und gut vermischt. Als nächstes wurden Zitronensäure, Brombeer-Aromaöl und rote Lebensmittelfarbe zur Wunderbeerenlösung (Teil III) hinzugefügt, gefolgt von der Miraculin-Lösung.
  • Als nächstes wurde die Gelatine-Lösung (Teil I) zur Stärke-Guarkernmehl-Lösung (Teil II) hinzugefügt. Nachdem die Stärke eingedickt war, wurde die Lösung der Hitze entzogen. Als nächstes wurde die Wunderbeerenlösung (Teil III) der Gelatine- und Stärkemischung zugegeben und gut vermischt. Die endgültige flüssige Mischung wurde dann in einen Gummiformbehälter gegossen (8 x 12 Zoll großer Behälter mit 5 verschiedenen Arten von Tierformen: ein Bär, ein Löwe, ein Affe, ein Pinguin und ein Wurm). Die Form wurde im Kühlschrank aufbewahrt, bis die Mischung fest war. Schließlich wurden die Gummis aus der Form entfernt, die Oberflächen der Gummis mit Öl besprüht (z.B. Avocadoöl, anderes pflanzliches Öl), auf ein Tablett gelegt und vor dem Verpacken über Nacht unter Zwangsluft getrocknet.
  • Beispiel 12: Saure Gummibonbons.
  • In diesem Beispiel wurden aromatisierte Gummibonbons so formuliert, dass sie mit Miraculin-Gummibonbons verzehrt werden können (siehe Beispiel 11). Tabelle 11. Formulierung von Apfel-Gummibonbons (79 Gummibonbons)
    Inhaltsstoffe
    Teil I.
    Gelatine, 250 Bloom 25 g
    Wasser 40 ml
    Teil II.
    Konzentrierter Apfelsaft 50 ml
    Maisstärke 5 g
    Guarkernmehl 3 g
    Teil III.
    Apfelsaft 30 ml
    Zitronensäure 12,8 g
    Apfel-Aromaöl 0,5 ml
    Grüne Liqua-Gel-Lebensmittelfarbe 18 µl
  • Die folgenden Schritte wurden zur Herstellung von sauren Gummibonbons mit Apfelgeschmack durchgeführt. Zuerst wurde die Gelatine mit Wasser (Teil I) in einem heißen Wasserbad 5 Minuten lang vorgewärmt. Als nächstes wurde die Gelatine in das Wasser gequirlt, bis alle Klumpen verschwunden waren. Die Gelatine-Lösung wurde bei mittlerer bis niedriger Hitze etwa 25 Minuten lang kontinuierlich erhitzt und so lange gerührt, bis die gesamte Gelatine geschmolzen war und die Lösung glatt und glasartig geworden war.
  • Anschließend wurden 5 g Maisstärke in 15 ml kaltem Apfelsaftkonzentrat gelöst (Teil II). Die restlichen 35 ml Apfelsaftkonzentrat wurden bei mittlerer bis niedriger Hitze erhitzt. Dann wurde die Stärkelösung in den warmen konzentrierten Apfelsaft gequirlt, und dann 3 g Guarkernmehl hinzugefügt und kontinuierlich gerührt, bis sich eine gelartige Konsistenz gebildet hatte.
  • Anschließend wurden 12,8 g Zitronensäure, 0,5 ml Apfel-Aromaöl und 18 µl grüner Liqua-Gel-Lebensmittelfarbe zu 30 ml Apfelsaft (Teil III) gegeben und beiseite gestellt. In einigen Beispielen können 15 ml ungesüßter Apfelquellstoff 15 ml des konzentrierten Apfelsaftes in Teil III ersetzen.
  • Als nächstes wurde die Gelatine-Lösung (Teil I) in die Stärke-Guarkernmehl-Lösung (Teil II) gegossen. Sobald die Stärkelösung eingedickt war, wurde sie der Hitze entzogen. Als nächstes wurde die Mischung aus Teil III in die Mischung aus Gelatine und Stärke-Guarkernmehl-Lösung (Teil I und II) gegeben und gut vermischt. Dann wurde die endgültige Flüssigkeit in Gummiformen gegossen und im Kühlschrank gelagert, bis sie fest war. Schließlich wurden die Gummis aus der Form entfernt und die Oberfläche der Gummis mit Öl (z.B. Avocadoöl oder einem anderen Pflanzenöl) besprüht. Die Gummis wurden auf ein Gestell gelegt und vor dem Verpacken über Nacht unter Zwangsluft getrocknet.
  • Beispiel 13: Saure Gummibonbons mit Zitronen- und Limettengeschmack.
  • In diesem Beispiel wurden saure Gummibonbons mit Zitronen- und Limettengeschmack für den Verzehr mit Miraculin-Gummibonbons formuliert (siehe Beispiel 11). Tabelle 12. Formulierung von Zitronen- und Limettengummibonbons (79 Gummibonbons)
    Inhaltsstoffe
    Teil I.
    Gelatine, 250 Bloom 25 g
    Wasser 40 ml
    Teil II.
    Konzentrierter Orangensaft 50 ml
    Maisstärke 5 g
    Guarkernmehl 3 g
    Teil III.
    Frischer Zitronensaft 30 ml
    Zitronensäure 12,8 g
    Zitronen-Aromaöl 0,25 ml
    Limetten-Aromaöl 0,25 ml
    Gelbe Liqua-Gel Lebensmittelfarbe 18 µl
  • Die folgenden Schritte wurden zur Herstellung von sauren Gummibonbons mit Zitronen- und Limettengeschmack durchgeführt. Zuerst wurde die Gelatine mit Wasser (Teil I) in einem heißen Wasserbad 5 Minuten lang vorgewärmt. 25 g Gelatine wurden in 40 ml Wasser gequirlt, bis alle Klumpen verschwunden waren. Dann wurde die Gelatine-Lösung bei mittlerer bis niedriger Hitze etwa 25 Minuten lang erhitzt, und die Mischung wurde kontinuierlich gerührt, bis die gesamte Gelatine geschmolzen und glatt und glasartig geworden war.
  • Als nächstes wurden 5 g Maisstärke in 15 ml kaltem Orangensaftkonzentrat gelöst (Teil II). Die restlichen 35 ml Orangensaftkonzentrat wurden bei mittlerer bis niedriger Hitze erhitzt. Dann wurde die Stärkelösung in den warmen Orangensaft gequirlt, und dann wurden 3 g Guarkernmehl zur Mischung hinzugefügt und kontinuierlich gerührt, bis sich eine gelartige Textur gebildet hatte.
  • Anschließend wurden 12,8 g Zitronensäure, 0,25 ml Zitronen-Aromaöl, 0,25 ml Limetten-Aromaöl und 18 µl gelbe Liqua-Gel Lebensmittelfarbe zu 30 ml frischem Zitronensaft (Teil III) gegeben und die Mischung beiseite gestellt.
  • Als nächstes wurde die Gelatine-Lösung (Teil I) mit der Stärke-Guarkernmehl-Lösung (Teil II) vermischt. Sobald die Stärkemischung eingedickt war, wurde sie der Hitze entzogen. Als nächstes wurde die gelbe Zitronensaftlösung (Teil III) zu der Mischung aus Gelatine (Teil I) und Stärke-Guarkernmehl (Teil II) hinzugefügt und gut vermischt. Dann wurde die endgültige Lösung in Gummiformen gegossen und im Kühlschrank gelagert, bis sie fest war. Als nächstes wurden die Gummis aus den Formen entfernt und die Oberflächen mit Öl (z.B. Avocadoöl, anderes Pflanzenöl) besprüht. Schließlich wurden die Gummis auf ein Gestell gelegt und vor dem Verpacken über Nacht unter Zwangsluft getrocknet.
  • Beispiel 14: Gefriergetrocknetes Miraculin-Spray
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin umfasst, zu einem gefriergetrockneten Miraculin-Spray formuliert. Tabelle 13. Formulierung von Miraculin-Spray (16 Portionen)
    Inhaltsstoffe
    Gereinigtes Miraculin-Protein (0,6 mg/ml) 2 ml
    Ascorbinsäure 1 mg
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um ein Spray herzustellen, das aus Wunderbeeren gereinigtes Miraculin umfasst. Zuerst wurde eine Mini-Sprühflasche (3 ml) mit 2 ml Miraculin-Lösung (0,6 mg/ml) gefüllt. Als nächstes wurde die Miraculin-Lösung mit einem Lyophilisator (ATR FD 3.0) 24 Stunden lang gefriergetrocknet. Anschließend wurde 1 mg Ascorbinsäurepulver in die gefriergetrocknete Miraculin-Sprühflasche gegeben. Das gefriergetrocknete Miraculin-Pulver ist bei Raumtemperatur stabil. Anschließend wurde das gefriergetrocknete Miraculin vor der Anwendung erneut mit 2 ml Wasser gelöst. Es ergaben sich 32 Sprühstöße pro 2 ml Lösung (2 Sprühstöße pro Portion).
  • Beispiel 15: Mango- und Maracuja-Stieleis
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin umfasst, zu einem Mango-Maracuja-Stieleis formuliert. Tabelle 14. Formulierung eines Mango-Maracuja-Stieleis (6 Portionen)
    Inhaltsstoffe
    Teil I. Mangopüree 330 g
    Maracujapüree 90 g
    Wasser 30 g
    Orangenblütenwasser 0.15 g
    Salz 0,45 g
    Teil II. Erdbeerpüree 18 g
    Wunderbeerenpulver 1.5 g
    Miraculin-Lösung (0,5 mg/ml) 2,4 ml
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um Stieleis mit Mango-Maracuja-Geschmack herzustellen, die Miraculin umfassen. Zuerst wurden das Mangopüree (17-19 Brix), das Maracujapüree (13-15 Brix), Wasser, Orangenblütenwasser und Salz miteinander vermischt (Teil I) und dann unter hoher Scherung (z.B. Mixer, Verflüssiger, etc.) verarbeitet, bis eine glatte, homogene Mischung entstand. In einigen Beispielen können die Fruchtpürees nach Ermessen des Betreibers so kombiniert werden, dass der Gesamtzuckergehalt im Produkt zwischen 5-10% des Gesamtgewichts der flüssigen Zubereitung liegt. In einigen Fällen können die Fruchtpürees ganz oder teilweise in einem Verhältnis von 1:1 durch ganze Früchte ersetzt werden. Anschließend wurden die Stieleis-Formen mit einer Menge von etwa 2,5-3 Unzen, bezogen auf das Gewicht der Mischung, gefüllt und eingefroren (ruhend oder nicht ruhend), bis die Mischung fest war und eine minimale Innentemperatur von -20°C erreichte.
  • Als nächstes wurden das Erdbeerpüree, das Wunderbeerenpulver und die Miraculin-Lösung kombiniert (Teil II), und die Zutaten unter hoher Scherung (z.B. mit einem Mixer, Verflüssiger etc.) verarbeitet, bis man eine glatte, homogene Mischung zum Eintauchen erhielt. Das Wunderbeerenpulver (Beerenpulver von Synsepalum dulcificum) wurde von Miracle Fruit Farm, FL, bezogen.
  • Als nächstes wurde das Stieleis aus den Formen entfernt und etwa 10-20% der Eisspitze in die vorbereitete Wunderbeeren-Überzugsmischung getaucht und entfernt, so dass insgesamt etwa 2-4 Gramm der Überzugsmischung auf dem Stieleis haften blieben. Der Wunderbeerenüberzug wurde etwa 10-20 Sekunden lang auf der Oberfläche des Stieleises einfrieren gelassen. Schließlich wurde das gefrorene Stieleis verpackt und in einem Gefrierschrank bei einer Temperatur von mindestens -20°C bis zur Verwendung oder bis zu einem Jahr gelagert.
  • Beispiel 16. Erdbeer-Frucht-Stieleis.
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin umfasst, zu einem Erdbeer-Frucht-Stieleis formuliert. Tabelle 15. Formulierung von Erdbeer-Frucht-Stieleis (6 Portionen)
    Inhaltsstoffe
    Teil I. Erdbeerpüree 540 g
    Wasser 18 g
    Zitronensaft 42 g
    Rosenwasser 0,3 g
    Salz 0,45 g
    Teil II. Erdbeerpüree 18 g
    Wunderbeerenpulver 1,5 g
    Miraculin-Lösung (0,5 mg/ml) 2,4 ml
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um Erdbeer-Frucht-Stieleis herzustellen, das Miraculin umfasst. Zuerst wurden das Erdbeerpüree, Wasser, Zitronensaft, Rosenwasser und Salz miteinander vermischt (Teil I), und dann wurden die Zutaten unter hoher Scherung (z.B. Mixer, Verflüssiger etc.) verarbeitet, bis eine glatte, homogene Mischung entstand. In einigen Beispielen können die Fruchtpürees im Verhältnis 1:1 durch ganze Früchte der gleichen Sorte ersetzt werden. Abhängig vom sensorischen Profil und der Brix-Messung des Fruchtpürees (oder der ganzen Frucht) kann das Verhältnis von Frucht : Wasser : Zitronensaft den Produktspezifikationen angepasst werden. Als nächstes wurden Stieleis-Formen mit einer Menge von ca. 2,5-3 Unzen nach Gewicht gefüllt und eingefroren (ruhend oder nicht-ruhend), bis die Mischung fest war und eine minimale Innentemperatur von -20°C erreichte.
  • Als nächstes wurden das Erdbeerpüree, das Wunderbeerenpulver und die Miraculin-Lösung gemischt (Teil II), und die Zutaten unter hoher Scherung (z.B. Mixer, Verflüssiger etc.) verarbeitet, bis man eine glatte, homogene Mischung zum Eintauchen erhielt. Das Wunderbeerenpulver (Beerenpulver von Synsepalum dulcificum) wurde von Miracle Fruit Farm, FL, bezogen. Als nächstes wurden das Stieleis aus den Formen entfernt und etwa 10-20% der Eisspitze in die vorbereitete Wunderbeeren-Überzugsmischung getaucht und entfernt, so dass insgesamt etwa 2-4 Gramm der Überzugsmischung auf dem Stieleis haften blieben. Der Wunderbeerenüberzug wurde etwa 10-20 Sekunden lang auf der Oberfläche des Stieleises gefrieren gelassen. Schließlich wurde das gefrorene Stieleis verpackt und in einem Gefrierschrank bei mindestens -20°C bis zur Verwendung oder bis zu einem Jahr gelagert.
  • Beispiel 17: Ananas-Frucht-Stieleis
  • In diesem Beispiel wurde ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin enthält, zu einem Ananas-Frucht-Stieleis formuliert. Tabelle 16. Formulierung von Ananas-Frucht-Stieleis (6 Portionen)
    Inhaltsstoffe
    Teil I. Ananaspüree 510 g
    Limettensaft 60 g
    Wasser 30 g
    Natürliche Aromen 0,025-0,1 g
    Salz 0,45 g
    Teil II. Erdbeerpüree 18 g
    Wunderbeerenpulver 1,5 g
    Miraculin Lösung (0,5 mg/ml) 2,4 ml
  • Die folgenden Schritte wurden durchgeführt, um Ananas-Frucht-Stieleis herzustellen, das Miraculin umfasst. Zuerst wurden das Ananaspüree, Wasser, Limettensaft, Wasser, Salz und natürliche Aromen miteinander vermischt (Teil I), und dann wurden die Zutaten unter hoher Scherung (z.B. Mixer, Verflüssiger usw.) verarbeitet, bis eine glatte, homogene Mischung entstand. Anschließend wurden Stieleisformen mit einer Menge von etwa 2,5-3 Unzen nach Gewicht gefüllt und eingefroren (ruhend oder nicht ruhend), bis die Mischung fest war und eine minimale Innentemperatur von -20°C erreichte.
  • Als nächstes wurden das Erdbeerpüree, das Wunderbeerenpulver und die Miraculin-Lösung gemischt (Teil II) und die Zutaten unter hoher Scherung (z.B. Mixer, Verflüssiger usw.) verarbeitet, bis man eine glatte, homogene Mischung zum Eintauchen erhielt. Das Wunderbeerenpulver (Beerenpulver von Synsepalum dulcificum) wurde von Miracle Fruit Farm, FL, bezogen. Als nächstes wurde das Stieleis aus den Formen genommen und etwa 10-20% der Spitze des Stieleises wurde in die vorbereitete Wunderbeerenüberzugsmischung getaucht und herausgenommen, so dass insgesamt etwa 2-4 Gramm der Überzugsmischung auf dem Stieleis haften blieben. Der Wunderbeerenüberzug wurde etwa 10-20 Sekunden lang auf der Oberfläche des Stieleises gefrieren gelassen. Schließlich wurden die gefrorenen Stieleise verpackt und in einem Gefrierschrank bei mindestens -20°C bis zur Verwendung oder bis zu 1 Jahr gelagert.
  • Beispiel 18. Joghurt
  • In diesem Beispiel wird ein geschmacksmodifizierendes Polypeptid, das Miraculin enthält, zu Joghurt formuliert. Tabelle 17. Miraculin in Naturjoghurt
    Rezept Nr. 1 2 3 4
    Miraculin (0.5 mg/ml) 0,25 0,5 0,6 1
    Miraculin (mg) 0,125 0,25 0,3 0,5
    Naturjoghurt (g) 30 30 30 30
    % w Miraculin 0,0004 0,0008 0,0010 0,0017
  • In diesem Beispiel war das Naturjoghurt Siggis 4%-Milchfett Naturjoghurt. Tabelle 18. Wunderbeerenpulver in Naturjoghurt
    Rezept Nr. 1 2 3 4 5
    Wunderbeerenpulver (g) 0,1 0,125 0,25 0,5 1
    Naturjoghurt (g) 30 30 30 30 30
    % w Wunderbeerenpulver 0,33 0,42 0,83 1,67 3,33
    Formulierung In haltsstoff Menge
    1 YC-470 Pellets 2g
    2% Milch 1600 ml
    2 YoFlexⓇ Mild 2.0 2g
    2% Milch 1600 ml
    3 Yo-FlexⓇ YC-X11 2g
    2% Milch 1600 ml
  • Verfahren:
  • 1600 ml Milch wurden in einem Topf bei mittelhoher Hitze auf 195°F erhitzt. Die Milch wurde häufig umgerührt, um ein Anbrennen der Milch zu verhindern. Die Milch wurde der Hitze entzogen und sie wurde auf 110°F abkühlen gelassen. Um die konzentrierte Stammlösung der Kultur herzustellen, wurde temperierte Milch in sterilen 4 oz. Bechern durch Zugabe von 2 g YC-470, Yo-Flex Mild 2.0 oder Yo-Flex YC-X11 zu 100 ml warmer Milch beimpft. Die Mischung wurde zur Homogenisierung 10-15 Minuten lang gerührt. Der Rest der Milch (1500 ml) wurde mit 15 ml Stammlösung in einer Konzentration von 2% beimpft und gründlich gemischt. Die Temperatur und der pH-Wert der Milch wurden vor der Inkubation bei 104°F - 118°F über 9 Stunden gemessen. Am Ende der Inkubationszeit wurde ein Joghurtbehälter zur schnellen Abkühlung in ein Eisbad gestellt, bevor er im Kühlschrank gelagert wurde. Die Joghurt-Formulierungen wurden in einem Seite-an-Seite-Geschmacksvergleich verglichen. Joghurt-Formulierung #1 (z.B. mit YC-470) ergab den am besten schmeckenden Joghurt.
  • In diesem Beispiel war das Joghurt Siggis 4% Milchfett Naturjoghurt. Wunderbeerenpulver wurde von Miracle Fruit Farm, FL, gekauft.
  • Beispiel 19. Miraculin-Spray
  • Tabelle 19.
    Nr. des Sprays 2 4 6
    Volumen (ml) 0,125 0,25 0,375
    Miraculin-Lösung (mg) 0,075 0,15 0,225
    % Gewicht 0,06 0,06 0,06
    1) 1 ml Spray enthält 16 Sprays;
    2) Konzentration von Miraculin: 0,6 mg/ml.
  • Beispiel 20. Miraculin Gummibonbon
  • Tabelle 20.
    Portionsgröße Rezept 1 Rezept 2 Rezept 3
    Miraculin (mg) 0,12 0,18 0,25
    Wunderbeerenpulver (g) 0,256 0,256 0,256
    Gummigewicht (g) 2 2 2
    % w (Miraculin) 0,0060 0,0090 0,0125
    % w (Wunderbeere) 12,8 12,8 12,8
  • Jedes Gummigewicht beträgt ~1g, und die Portionsgröße beträgt 2.
  • Beispiel 21. Miraculin-Stieleis
  • Tabelle 21. Wunderbeerenpulver in Stieleis
    Rezept Nr. 1 2 3 4
    Wunderbeerenpulver (g) 0,125 0,25 0,5 1
    Stieleis (g) 100 100 100 100
    % w Wunderbeerenpulver 0,125 0,25 0,5 1
    Tabelle 22. Miraculin in Stieleis
    Rezept Nr. 1 2 3
    Miraculin (mg) 0,1 0,15 0,2
    Stieleis (g) 100 100 100
    % w Miraculin 0,00010 0,00015 0,00020
    Tabelle 23. Wunderbeerenpulver und Miraculin in Stieleis
    Rezept Nr. 1 2 3
    Miraculin (mg) 0,1 0,15 0,2
    Wunderbeerenpulver (g) 0,25 0,25 0,25
    Stieleis (g) 100 100 100
    % w Miraculin 0,00010 0,00015 0,00020
    % w Wunderbeerenpulver 0,25 0,25 0,25
  • Beispiel 22. Oraler Dünnfilm
  • Tabelle 24.
    Nr. Tablett Lösung (g) Nettogewicht (g) nach Trocknung (g) Nettogewicht (g) Film
    1 11,942 14,642 2,70 12,093 0,151 0,531
    2 11,836 14,648 2,81 12,187 0,351 0,442
    3 11,754 14,632 2,88 12,218 0,464 0,485
    4 12,023 14,643 2,62 12,221 0,198 0,533
    5 11,663 14,327 2,66 12,184 0,521 0,481
    6 11,704 14,33 2,63 12,372 0,668 0,563
    7 11,54 14,283 2,74 12,048 0,508 0,429
    8 11,67 14,308 2,64 12,186 0,516 0,465
    9 11,78 14,066 2,29 12,279 0,499 0,489
    10 11,698 14,047 2,35 12,147 0,449 0,512
    11 11,67 14,037 2,37 12,152 0,482 0,506
    12 11,404 13,791 2,39 11,951 0,547 0,575
    Summe 31,07 5,35 6,011
    Miraculin (mg) 28,8 mg
    %w Miraculin 0,54 % 0,48 %
  • Beispiel 23. Fruchtgel
  • Tabelle 25.
    Inhaltsstoffe Menge für 24 Portionen
    Pures Wunderfruchtpulver (g) 9
    Kranbeerensaft (ml) 140
    Geschmacksneutrale Gelatine (g) 18
    Gemischte Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure (ml) 15
    H2O (ml) 155
    Fruchtgel (g) 14,04
    Pures Wunderfruchtpulver (g) 0,38
    % Gewicht von Wunderbeerenpulver 2,67
  • Beispiel 24. Fruchthäppchen
  • Tabelle 26.
    Inhaltsstoffe Menge für 8 Portionen
    Tapiokastärke (g) 1,39
    Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC, 2%) (ml) 5
    Polysorbat 20 (Nahrungsmittelqualität) (ml) 5
    Gemischte Lösung aus Zitronensäure und Ascorbinsäure (ml) 5
    Pures Wunderfruchtpulver (g) 5
    Pflanzliches Glycerin (4%) (ml) 8
    H2O (ml) 22
  • Beispiel 25. Limonade
  • Tabelle 27. Limonadenformulierung (Portionsgröße: 2500 ml Flaschen)
    Inhaltsstoff Menge
    Limettenöl 500 µl
    Wasser 1000 ml
    Zitronensäure 4,4 g
    Miraculin (0,6 mg/ml) 1 ml
    1. Limettenöl und Zitronensäure in das Wasser geben und unter Rühren auflösen.
    2. Wasser unter Verwendung der Sodastrahlmaschine für eine Minute oder bis es ausreichend karbonisiert ist karbonisieren.
    3. 1 ml der Miraculin-Lösung in den Flaschenverschluss geben, die beim ersten Schluck eingenommen werden soll.
  • Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hier gezeigt und beschrieben worden sind, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass solche Ausführungsformen nur als Beispiel dienen. Zahlreiche Variationen, Änderungen und Substitutionen werden dem Fachmann nun in den Sinn kommen, ohne von der Erfindung abzuweichen. Es versteht sich, dass bei der Ausübung der Erfindung verschiedene Alternativen zu den hier beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden können. Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Ansprüche den Umfang der Erfindung definieren und dass Verfahren und Strukturen innerhalb des Umfangs dieser Ansprüche und ihrer Äquivalente dadurch abgedeckt werden.
    Figure DE202019005554U1_0001
    Figure DE202019005554U1_0002
    Figure DE202019005554U1_0003
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    Figure DE202019005554U1_0006
    Figure DE202019005554U1_0007
    Figure DE202019005554U1_0008
    Figure DE202019005554U1_0009
    Figure DE202019005554U1_0010
    Figure DE202019005554U1_0011
    Figure DE202019005554U1_0012
    Figure DE202019005554U1_0013
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 62/640491 [0001]

Claims (13)

  1. Eine Zusammensetzung umfassend: a) ein Joghurtprodukt; und b) ein Miraculin-Polypeptid oder funktionelles Fragment davon in einer getrennten Formulierung, die mit dem Joghurtprodukt zu konsumieren ist.
  2. Die Zusammensetzung aus Anspruch 1, wobei die getrennte Formulierung eine Schicht ist, die das Joghurtprodukt überlagert.
  3. Die Zusammensetzung aus irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei das Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon in einer Konzentration von etwa 0,100 mg bis etwa 0,500 mg, von etwa 0,125 mg bis etwa 0,475 mg, von etwa 0,150 mg bis etwa 0,450 mg, von etwa 0,175 mg bis etwa 0,425 mg, von etwa 0,200 mg bis etwa 0,400 mg, von etwa 0,225 mg bis etwa 0,375 mg, von etwa 0,250 mg bis etwa 0,350 mg, oder von etwa 0,275 mg bis etwa 0,325 mg vorliegt.
  4. Die Zusammensetzung aus irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei das Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon aus einer Pflanze aufgereinigt ist.
  5. Die Zusammensetzung aus Anspruch 4, wobei die Pflanze Synsepalum dulcificum ist.
  6. Die Zusammensetzung aus irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei das aufgereinigte Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 0,0050 Gew.-% vorliegt.
  7. Die Zusammensetzung aus irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei das Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon als Pulver ganzer Beeren bereitgestellt wird.
  8. Die Zusammensetzung aus irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei das Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon ein rekombinantes Miraculin-Polypeptid ist.
  9. Die Zusammensetzung aus Anspruch 8, wobei das rekombinante Miraculin-Polypeptid rekombinant in einer Hefezelle hergestellt ist.
  10. Die Zusammensetzung aus Anspruch 9, wobei die Hefezelle aus der Art Pichia pastoris ist.
  11. Die Zusammensetzung aus irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung weniger Zucker enthält als eine äquivalente Zusammensetzung, die das Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon nicht umfasst.
  12. Die Zusammensetzung aus irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung mindestens 50% weniger Zucker umfasst als als eine äquivalente Zusammensetzung, die das Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon nicht umfasst.
  13. Die Zusammensetzung aus Anspruch 11 oder 12, wobei das Miraculin-Polypeptid oder funktionelle Fragment davon in der äquivalenten Zusammensetzung durch Zucker ersetzt wurde.
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