WO2006014018A1

WO2006014018A1 - ミラクリンを発現する遺伝子組換え植物の作成方法

Info

Publication number: WO2006014018A1
Application number: PCT/JP2005/014705
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Ezura; Hyeon-Jin Sun; Masanobu Kirita; Takanari Ichikawa; Nobuyo Nishizaki
Original assignee: Inplanta Innovations Inc.
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2005-08-04
Publication date: 2006-02-09
Also published as: JP4757801B2; US20090205068A1; JPWO2006014018A1

Abstract

本発明は、植物分子育種技術を用いて周年生産や栽培が容易な有用植物にミラクリン遺伝子を導入してミラクリンを発現するトランスジェニック植物を作製する方法、その方法により作製されたミラクリンを発現するトランスジェニック植物、及びその利用に関する。本発明は、そのトランスジェニック植物において産生されたミラクリンを含む食品添加物、飲食品、又は糖尿病治療薬にも関する。

Description

明細書ミラタリンを発現する遺伝子組換え植物の作成方法技術分野

本発明は、ミラタリンを発現する遺伝子組換え植物の作成とその利用に関する。背景技術

ミラクリンは、ミラクルフルーツ U chadella dulcified) 果実中に含まれる食味修飾タンパク質である。ミラクリンは、 1968 年にミラクルフルーツの機能性成分であることが同定された（Kurihara and Bei dler, Science (1968) 161 (847) p. 1241-1243) 。その後、ミラクリンタンパク質の全アミノ酸配列が決定され (Theeras i lpet al. , J Biol Chem. (1989) 264 (12) , p. 6655- 6659) 、その遺伝子の塩基配列が決定された（Masuda et al. , Gene (1995) 161 , p. 175- 17 7) 。ミラクリン遺伝子の完全長 c D N A配列は、 Masuda et al. , Gene (1995) 161, p. 175-177 に報告されている。ミラクリンには食品中の酸味を甘味に変える働きがあり、例えば、ミラクルフルーツを食べたあとにレモン果実を食べると、オレンジ果実のような甘みを感じる。このような効果からこの果実はミラクルフルーツと呼ばれている。ミラクルフルーツは、熱帯地方の西アフリカ原産の植物であり、現地ではヤシ酒やトウモロコシパンなど酸味のある飲料や食品を食べる前に伝統的に食されている。

このようなミラクリンの機能を利用して、ミラクルフルーツを、体重制限のためのダイエツトゃ糖尿病治療のための食事制限を無理なく行い、食事における力口リー摂取を低減するための補助食品として利用することが試みられている。食事をする前にミラクルフルーツを食べておけば、糖分を減らし、酸味を添加した食品でも十分に満腹感が得られ、無理なく食事量を減らすことができる。その結果、精神的なストレスを感じずにダイエツトゃ食事療法を行うことが可能となる。ミラクルフルーツをこれらの用途に供するには、果実を安定して生産供給する必要がある。しかしながら、現在までのところ十分な量のミラクルフルーツは安定して生産供給されておらず、これらの目的には十分に供されていない。ミラクルフルーツは、熱帯原産の植物であるために、熱帯地域以外で栽培するには周年を通した高温栽培条件が必要になる。そのため、暖房装置など重装備した温室等で栽培されている。また、この機能成分であるミラクリンは、果実中で分解され易く、熱帯地域で生産してそれ以外の地域に十分量を供給するのは技術的 · コスト的に困難である。ミラクルフルーツの持つミラクリンの活性を効果的に活用するには、安定して低コストで周年的に供給する技術の開発が是非とも必要である。ミラタリン自体についても、ダイエツトゃ糖尿病治療の食事療法の補助食品などへの利用が期待されているが、上記の通り十分量の供給は現状では難しい。

栗原らは、ミラクリン遺伝子を導入し発現させた酵母においてミラクリン特異的抗体と反応するタンパク質を産生させることができたこと、しかしそのタンパク質に甘味誘導活性はなかったことを報告している（Kurihara et al. , Foods a nd Food Ingredients Journal Japan No. 174 (1997) 「甘味を誘導する物質（ミラクリン、クルクリン、ストロジン）及ぴ耐熱性甘味タンパク質マビンリンの構造と活性」）。この栗原らのレビューには、ミラクリン遺伝子をタバコ細胞で発現させることにより、ミラクリン特異的抗体と反応するタンパク質を産生させることができたことも報告されている。しかし、タバコで発現されたそのミラクリン遺伝子産物が甘味誘導活性をもっかどうかについての報告はされておらず、ミラクリン遺伝子を植物に導入して発現させることにより甘味誘導活性を有するミラクリンを生産することに成功した例は、現在まで知られていない。発明の開示

本発明は、上記のような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ミラクリンを生産する有用遺伝子組換え植物の作成とその利用方法を提供することにあ

本発明者等は、これまで、世界中の殆どの地域で周年栽培が可能な有用植物、例えばレタスやトマト、また長期間果実収穫が可能な有用植物、例えばイチゴにおいて外来遺伝子を導入して発現させる研究に取り組んできた。そこで本発明者等は、植物分子育種技術を用いて、周年生産や栽培が容易な有用植物にミラクリン遺伝子の導入を試みた結果、ミラクリンを発現する遺伝子組換え植物の作製に成功した。

作製した組換え植物をミラクリン特異抗体を用いて分析した結果、組換え植物はミラクリンをミラクルフルーツに匹敵する濃度で、機能できる型（二量体）で発現していた。

このようにして完成された本発明は、ミラタリンを発現する植物及ぴその作成方法、並びにその利用法に関するものである。

本発明の 1つの態様は、植物にミラクリン遺伝子を導入しミラクリンを発現させる遺伝子組換え植物の作製方法である。ミラクルフルーツからミラクリン c D N Aを単離しミラクリン遺伝子として使用する事ができる。また、ミラクリン遺伝子をベクターに挿入し、ァグロパクテリゥムに導入し、これを植物細胞への遺伝子導入に使用する事ができる。本発明では、このような方法で作製された遺伝子組換え植物が生産するミラクリンを、食品添加物あるいは医薬品、特に糖尿病治療薬として利用することができる。

本発明の別の態様は、ミラクリン遺伝子が導入された、食味修飾活性を有するトランスジェユック植物である。ミラクリン遺伝子としては、以下の（a)〜（f)のうち少なくとも 1つのミラタリン遺伝子が好ましい：

(a) 配列番号 1に示す塩基配列からなる遺伝子；

(b) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ食味修飾を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子；

(c) 配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；

(d) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；

(e) 配列番号 1に示す塩基配列と 7 0 %以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；及び

(f) 配列番号 2に示すァミノ酸配列と 8 5 %以上の同一性を示すァミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。

ここで食味修飾活性とは、典型的には、酸味を甘味に変える活性である。

また上記植物は、レタス、トマト、イチゴ又はシロイヌナズナであることが好ましい。さらに本発明においては、上記トランスジエニック植物は 2倍体植物であることが特に好ましい。

本発明の別の態様は、上記トランスジエニック植物からミラクリンを抽出することを含む、ミラクリンの製造方法である。

本発明のさらなる態様は、上記のトランスジエニック植物において産生されたミラクリンを含む食品添加物である。あるいは本発明の態様は、上記のトランスジエニック植物において産生されたミラクリンを含む飲食品である。この飲食品は、糖尿病患者用のものであることがより好ましい。本発明の別の態様は、上記のトランスジェニック植物において産生されたミラクリンを含む糖尿病治療薬である。

ミラクリンを発現した有用植物は、産業上、様々な有用性がある。 1つは、ダイエット食品の添加物としての利用である。糖分を加えることによって甘味を与えている食品に対して、糖分の代わりに酸とミラクリンを添加することで、カロリーをおさえた状態でも甘味を添加することができる。 1つは、糖尿病患者の食事療法への利用である。糖尿病患者は、糖分の過剰摂取を抑える目的で食事制限が行われる。この食事制限は、食事療法の中で最もストレスのかかる場面である。しかし、ミラクリンを含む飲食品を食事の時に摂取することで無理なく満腹感が得られ、食事療法時のこのようなストレスを解消することができる。それにより、糖尿病治療がスムーズに行われる。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-230205号の明細書及ぴ Z又は図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、ミラクリン遺伝子を植物細胞に導入するためのミラクリン発現べクタ一の構造を示す図である。 p B I E L ₂ Q M I Rは高発現ベクターを示し、 p B I 3 5 SMI Rは通常のベクターを示す。 RBはTーDNAの右端、 NP T I I はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、 T n o sはノパリンシンターゼ遺伝子ターミネータ一、 3 5 S Pは C aMV 3 5 Sプロモーター、 M I Rはミラタリン遺伝子を表す。

図 2は、組換え体中のミラクリン遺伝子の組込みを調べるサザン解析の結果を示す写真である。非組換え体と 40系銃の組換え体からゲノム DNAを抽出し、サザン解析を行った。（A) 及ぴ（B) は、調製したメンプレンを B' ASにより検出した画像、（C) 及び（D) は、同じメンプレンについてオートラジオグラフィ一により検出した X線フィルム像である。 WTは非組換え体、左側の写真 (A) 及び (C) のレーン 1〜 2 0は、バイナリ一ベクター p B I E L₂QM I Rを導入した組換え体、右側の写真（B) 及び（D) のレーン 1〜2 0は、 p B I 3 5 SMI Rを導入した組換え体を示す。

図 3は、組換え体中のミラクリン遺伝子の転写を調べるノーザン解析の結果を示す写真である。非組換え体と 1 9系統の組換え体から全 RNAを抽出し、ノーザン解析を行った。 WTは非組換え体、左側の写真の 9レーンは、 p B' I E L₂ ΩΜ I Rを導入した組換え体、右側の写真の 1 0レーンは、 p Β' I 3 5 SM I R を導入した組換え体を示す。

図 4は、組換え体中のミラクリンの発現を調べるウェスタン解析の結果を示す図である。非組換え体と 1 8系統の組換え体から全タンパク質を抽出し、ウェスタン解析を行った。 WTは非組換え体、左側の写真の 9レーンは、 p B I E L₂ ΩΜ I Rを導入した組換え体、右側の写真の 9レーンは、 p B I 35 SMI Rを導入した組換え体を示す。 Mは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンタンパク質を示す。

図 5は、ミラクリン遺伝子を導入した組換え（トランスジエニック）トマトの葉におけるミラクリン遺伝子の発現を調べたサザンプロット解析の結果を示す写真である。「野生型」はミラクリン遺伝子を導入していないトマトを示す。他の 1 4レーンには、 p B I 3 5 SMI Rを導入して作製された各組換え体の名称の略称を記載した。

図 6は、ミラクリン遺伝子が導入された組換え（トランスジエニック）トマト個体の葉からのタンパク質抽出物を、非還元条件下で SD S— PAGEにより展開し、ミラクリンを検出したウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。

「マーカー」は、タンパク質分子量マカー、「ミラクリン」は、ミラクリンフルーツから単離されたミラクリンタンパク質を示す。「野生型」はミラクリン遺伝子を導入していないトマトを示す。「 1コピー」のレーン 2— 1、 5— 2、 7 C、 1 1 A、 1 4— 3、 21— 4、 5 6 B、 5 8— 1、 64— 2は、 1コピーのミラクリン遺伝子が導入された形質転換体の名称である。「2コピー」のレーン 4A、 20— 1及び 22 Aは、 2コピーのミラクリン遺伝子が導入された形質転換体の名称である。「多コピー」のレーン 1 5 Aは、 2個を上回るコピー数のミラクリン遺伝子が導入された形質転換体の名称である。レーン 3— 1は、ミラクリン遺伝子によって形質転換されなかった個体（非形質転換体）である。レーン 1 1 A、 20— 1、 1 4- 3以外のレーンのサンプルは、全て 2倍体トマトである。矢印は、二量体サイズのミラクリンタンパク質の存在を示している。

図 7は、還元条件下で SD S— PAGEにより展開した、組換え（トランスジエニック) トマトの葉からのタンパク質抽出物について、ミラクリンを検出したウェスタンプロット解析の結果を示す写真である。 Wtは野生型トマト（ミラクリン遺伝子を導入していないトマト）を示す。 Mは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンタンパク質を示す。 2A、 3A、 6A、 14 Cは、 p B I 3 5 SM I Rを導入して作製された各組換え体の名称である。

図 8は、ミラクリン遺伝子を増幅するためのプライマーを設計した位置を示す図である。ミラクリン遺伝子の c DN A配列（ァクセッション番号 D 38 5 9 8) 上に、各プライマーがハイブリダィズする位置を矢印で示している。矢印の折れ曲がった尾部は、プライマーの 5 ' 末端に含まれるアダプター配列を示す。枠で囲った配列は、ミラタリンタンパク質のシグナル様ぺプチド部分をコードする配列（シグナル様ペプチドコード配列）である。

図 9は、ミラクリン遺伝子の P C R増幅産物の電気泳動写真である。図 9

(A) は、プライマーセット Ml (シグナル様ペプチドコード配列を増幅する）で增幅した PCR産物、図 9 (B) は、プライマーセット M2 (シグナル様ぺプチドコ一ド配列を増幅しない）で増幅した P C R産物の結果である。図 1 0は、ミラタリン遺伝子の P C R増幅断片を挿入した p B i g s 2 1 1 3 S Fベクターのマップである。

図 1 1は、シグナル様ペプチドコード配列を含む増幅産物を導入した M l群の組換えシロイヌナズナの T 2個体におけるミラクリン発現を示す、ウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。ウェスタンプロット解析は、非還元条件下で展開した葉サンプルからのタンパク質抽出物について行った。 P Mは、予備染色されたタンパク質マーカー、 M I Rは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンを示す。 W tは、ミラクリン遺伝子を導入していないシロイヌナズナを示す。 M 1— 1—：!〜 M 1— 9— 2は、 M 1群の T 2個体の名称である。写真の右側の矢印は、二量体のミラクリンを示すバンド及ぴ単量体のミラクリンを示すバンドを明示する。

図 1 2は、シグナル様ぺプチドコード配列を含む増幅産物を導入した M 1群、又はシグナル様ぺプチドコード配列を含まない増幅産物を導入した M 2群の組換ぇシロイヌナズナにおけるミラタリン発現を示す、ウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。ウェスタンプロット解析は、非還元条件下で展開した葉サンプルからのタンパク質抽出物について行った。 P Mは、予備染色されたタンパク質マーカー、 M I Rは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンを示す。 W tは、野生型シロイヌナズナ（ミラクリン遺伝子を導入していないシロィヌナズナ）を示す。 M 1— 4一 4及び M 1— 9— 4は、シグナル様ペプチドコード配列を含む増幅産物を導入した個体、 M 2— 1〜M 2— 6は、シグナル様ぺプチドコード配列を含まない増幅産物を導入した個体の名称である。

発明を実施するための最良の形態

1 . ミラクリン遺伝子とその単離

現在、ミラクルフルーツ Richadella dulcifica) 果実に含まれるミラクリンが産業利用されている。しかし、ミラクルフルーツは熱帯原産の植物であり熱帯地域以外での栽培が非常に困難であるため、十分な量のミラクリンが供給されていない。本発明者等は、この問題を解決する有効な手段は、栽培技術が確立されており、広く世界中で栽培できる植物にミラクリン遺伝子を導入し、ミラクリンタンパク質を生産させることであると考えた。

本発明者等は、一般に公開されている D N Aデータベースに登録されているミラクリン遺伝子の塩基配列情報に基づいて、ミラクルフルーツからミラクリン c D N Aを単離した。本発明に使用したミラクリン遺伝子の c D N Aは、例えば、国際塩基配列データベースにおいてァクセッション番号 D 3 9 5 9 8により入手できる c D N A配列、又は配列表に示された配列番号 1の塩基配列の情報を元にプライマーを調製し、ミラクルフルーツの全 R N Aを鎵型に R T— P C Rを行なうことにより増幅し、調製することができる（実施例 1を参照）。

しかしながら本発明で用いるミラクリン遺伝子は、そのような方法で得られる c D' N Aに限定されず、ミラクリンタンパク質をコードする単離された任意の核酸であってよい。本発明における「ミラクリン」とは、最初にミラクルフルーツの果実から単離された、いわゆる食味修飾活性を有するタンパク質である。ミラクリンの有する「食味修飾活性（味覚修飾活性とも呼ぶ）」とは、主として、酸味を甘味に変える活性、すなわち、ミラクリンの後に口に含んだ酸味のある素材について甘味を感じるように味覚を変化させる活性を言う。本発明のミラクリン遺伝子としては、ミラクルフルーツ Richadella dulcifica) 由来の、ミラクリンをコ一ドする核酸が好ましく、例えば、配列番号 1で示される塩基配列からなる遺伝子、そして配列番号 2のァミノ酸配列（配列番号 1の塩基配列によってコードされているアミノ酸配列）をコードする遺伝子がより好ましい。また本発明のミラクリン遺伝子は、ミラクルフルーツ以外の植物由来のミラクリン遺伝子ホモログも含むものとする (ィ列えば、トマト [_Lycopersicon esculentum^ の L e M i r ( D D B J Z E M B L Z G e n B a n kァクセッション番号 U 7 0 0 7 6 ) 、ダイズのダイズトリプシンインヒビター A及び C (Kuni tz) など）。本発明に使用するミラクリン遺伝子は、ミラクリンの食味修飾活性 (ミラクリン活性）を有するタンパク質をコードする限り、天然のミラクリン遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号 1 ) に 1若しくは複数個の置換、欠失、付加及び Z揷入などの変異が生じた配列からなる遺伝子であってもよい。本発明のミラクリン遺伝子はまた、食味修飾活性を有する,天然のミラクリンのアミノ酸配列

(例えば、配列番号 2のアミノ酸配列）において 1若しくは数個（2〜9個、好ましくは≥〜 5個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。さらに本発明のミラクリン遺伝子は、配列番号 1の塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子であってもよい。あるいは、本発明のミラクリン遺伝子は、配列番号 1に示す塩基配列と少なくとも 85 %以上、好ましくは 90%以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本発明のミラクリン遺伝子はまた、配列番号 2に示すアミノ酸配列と少なくとも 60%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 85%以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

本発明において「ストリンジェントな条件」とは、特異的な核酸ハイプリッドが形成される条件を言い、具体的には、例えば、ナトリウム塩濃度が 1 5〜75 0 mM、好ましくは 50〜 750 mM、より好ましくは 300〜 750 mM、温度が 25〜70°C、より好ましくは 55〜65°C、ホルムアミド濃度が 0〜50 %、より好ましくは 35〜45%となる反応条件をいう。ストリンジェントな条件では、さらに、ハイプリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件を、ナトリゥム塩濃度が ί 5〜 600 mM、好ましくは 50〜 600 mM、より好ましくは 300〜 600 πιΜ、温度が 50〜 70 °C、好ましくは 55〜 70 °C、より好ましくは 60〜65°Cとすることが好適である。

上記のような様々なミラクリン遺伝子は、当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入 (Ausubel ら， 1999, Currennt Protocols in Molecular Biolog y) など周知の技術を利用して既存のミラタリン遺伝子に変異を導入することによって得ることもできる。

本発明において「遺伝子」は、 DNAであっても RNAであってもよい。 DN

Aには少なくともゲノム DNA、 c DNAが含まれ、 RNAには、 mRNAなどが含まれる。本発明のミラクリン遺伝子は、ミラクリン遺伝子の CD S配列（開始コドンから終止コドンまで）以外に非翻訳領域（UTR) などを含んでもよレ、。以上のような本発明のミラクリン遺伝子を含む DNAなどの核酸断片は、当業者であればミラクリン遺伝子の既知配列を利用して、ミラクリン遺伝子を有する生物から抽出した核酸から常法に従って得ることができる。

一実施形態としては、本発明のミラクリン遺伝子を含む DN A断片は、ミラクリンを発現しうる植物の組織から常法により抽出した mRNAを鎳型として、ミラクリン遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いた RT— P CRによる核酸増幅によって、 c DNAとして取得することができる。

こうして得られたミラクリン遺伝子を含む DNA断片は、ベクター中にクローニングしておくことが好都合である。例えば、ミラタリン遺伝子を公知の発現べクタ一、例えば p UC 1 9などの大腸菌発現ベクターに挿入し、それを宿主、例えば B L 2 1株などの大腸菌に導入して、宿主内で発現させることができる。ミラクリン遺伝子を含む DNA断片は、植物用過剰発現（高発現）プロモーターの下流に連結した状態で組換え発現ベクターに組み込んでもよい。ミラクリン遺伝子を含む DNA断片を、ェンハンサ一と植物用過剰発現（高発現）プロモーターの下流に導入した組換え発現ベクターも好適である。その場合、例えば、ミラクリン遺伝子を含む DN A断片の両末端を適当な制限酵素で切断し、その切断断片をベクター中の過剰発現プロモーター下流の適当な制限酵素部位にイン · フレームとなるように揷入して連結すればよい。植物に遺伝子導入するためにァグロバクテリゥム法を用いる場合には、ァグロパクテリゥム由来のプラスミドベクター (例えば p B I 1 0 1若しくは p B I 1 2 1) 又はそれを改変した発現ベクターなどのァグロバタテリゥム法に適したベクターに、ミラクリン遺伝子を組み込むことが好ましい。例えば、植物発現用に開発された公知のベクター（汎用されて 'いる p B I 1 21や p B I 22 1など）のマーカー遺伝子部分を制限酵素を用いて切り出し、これに代えてミラクリン遺伝子を挿入することによって、ァグロバクテリゥム法のためのベクターを構築することができる。この方法により、ミラクリン遺伝子は、通常、過剰発現（高発現）プロモーターの制御下に置かれる。なお、得られたミラクリン遺伝子を含む DNA断片については、塩基配列決定によりその配列を確認することが好ましい。塩基配列決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、ジデォキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えば A B I社製 D N Aシークェンサー P R I S M 3 7 7 X L ) を用いて行えばよレヽ。

本発明において用いる ni R N Aの調製、 c D N Aの作製（R T— P C R ) 、 P C R、ベクター中へのライゲーシヨン、細胞の形質転換、 D N Aの塩基配列決定、プライマーの合成、タンパク質の抽出などの分子生物学的 .生化学的実験法は、通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書としては、例ば、 Sambrookらの Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds.， Sarabrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを拳げることができる。

2 . ミラクリン遺伝子を導入した組換え植物の作製

本発明では、上記のようにして得たミラクリン遺伝子を植物に導入することにより、食味修飾活性を有するトランスジヱニック植物を作製することができる。例えば、後述の実施例 2のようにして、ミラクリン遺伝子を組み込んだァグロパクテリゥム法用の発現ベクターをァグロバクテリゥムに導入し、それをァグロバタテリゥム法による植物細胞への遺伝子導入に使用すればよい。本発明では、ァグロパクテリゥム法に、 p B I 1 2 1由来のベクターを好適に用いることができる。ベクターを導入する植物細胞の形態は、組織、器官、カルスなどの任意の形態であってよい。

本発明においてミラクリン遺伝子を導入する植物は、限定するものではなレ、が、単細胞藻類、裸子植物、双子葉植物若しくは単子葉植物であってよい。本発明では、ミラクリン遺伝子を導入する植物として、レタス、トマト、イチゴ、シロイ ·.ヌナズナ等の作物植物がより好ましい。遺伝子導入効率の高低はあるものの、ァグロパクテリゥム法による遺伝子導入は、イネ、トマト、メロン、レタスなど広く植物において用いられていることが報告されている。なお本発明では、後述のように、ミラクリン遺伝子を 2倍体植物に導入することが特に有用である。

植物細胞へのミラクリン遺伝子の導入法としては、ァグロバタテリゥム法に限らず、エレクトロポレーシヨン法やパーティクルガン法などの直接法も用いることができる。これらの植物形質転換法の詳細は、『島本功、岡田清孝監修「新版モデル植物の実験プロトコール遺伝学的手法からゲノム解析まで」

(2001) 秀潤社』などの一般的な教科書の記載や、 Hiei Y. et al. , "Efficien t transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacteriura and sequence analysis of the boundaries of the T - DNA. " Plant J. (1994) 6, 2 71- 82等の文献を参照すればよい。

ァグロパクテリゥム法によりベクターを導入した植物細胞は、一般に、形質転換細胞を選抜する抗生物質とァグロバタテリゥムを除菌するための抗生物質、及び植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニンなど）を含む組織培養用の培地で培養することにより、植物体の再生を行うことができる。エレクトロポレーション法及びパーティクルガン法でベクターを導入した植物細胞は、

—般に、形質転換細胞を選抜する抗生物質と植物体再生用の植物ホルモン（ォーキシン、サイトカイニンなど）を含む組織培養用の培地で培養することにより、植物体の再生を行うことができる。

例えば、レタスでは、次の方法を用いることができる。ァグロパクテリゥム G V2260 を用いてリーフディスク法により、レタスにミラクリン遗伝子を導入できる。ミラクリン遺伝子を保持したァグロパクテリゥムを 1 0 Omg/Lカナマイシンを含んだ LB培地中でー晚振とう培養し、遠心洗浄の後、ァセトシリンゴン

200 とメルカプトエタノール 1 0 1^を含む]^3液体培地に00₆。。力 S 0.

1になるように懸濁する。このァグロパクテリゥム菌液に種まきして 5日目の無菌のレタス葉切片を浸漬する。ァグロパクテリゥムを感染させたレタス葉切片は、

1 m g/Lベンジルアデニン（BA) 、 0. l mg/Lナフタレン酢酸（NA

A) を含む MS培地で 3日間共存培養する。その後、 0. lmgZL BA、 0. l mg/L NAA、 1 00 m g Z Lカナマイシンを含む選抜 M S培地に移し、

2週間ごとに培地を交換しながら培養する。分化してきたシュートを 0. 0 1m g/L BA、 0. 05 m g / L NAA、 50 m g Lカナマイシンを含む M

S培地に移し、 1〜3 cmぐらいに伸びたシユートを 5 OmgZLカナマイシンを含む発根 MS培地に移す。得られた再生個体について、導入遺伝子の確認を行レ、、形質転換体を確認する。

また、トマトでは、例えば、文献（Ohyama ら， 1995, Plant Cell Physiolog y, 36:369 - 376) に記載の方法を用いることができる。具体的には、トマトの種子を M S培地上に無菌播種し、 2 5 ° (：、 1 6時間照明（約 4 , 0 0 0ルクス）で発芽させる。発芽してきた実生の子葉を 2分割し、導入したい遺伝子を持つァグロノくクテリゥム Agrobacteriwn tumefaciens) ( L B A 4 4 0 4株など）を接種する。ゼァチン 1 m g/Lを含む MS培地上で 2日間共存培養する。続いて、ゼァチン l'mgZL カルべニシリン 2 0 Omg/Lを含む MS培地上で 1週間除菌のための培養を行う。更に、ゼァチン l mgZL カルペニシリン 2 0 Omg ZL、カナマイシン 1 0 0 mg/Lを含む MS培地上で 2週間毎に継代培養する _c ィ長してきたシユートをカノレべニシリン 2 0 Omg/L, カナマイシン 5 Omg ZLを含む MS培地に継代して発根させる。得られた再生個体について、導入遺伝子の確認を行い、形質転換体を確認する。

導入遺伝子の確認は、次の方法で行える。ゲノム DNAに対するサザン解析により、導入遺伝子が核内に組み込まれたかどうかを、ノーザン解析により核内に ,袓み込まれた遺伝子が mRNAに転写されているかどうかを、ウェスタン解析により mRN Aがミラクリンに翻訳されているかどうか確認できる（実施例 4を参照）。ウェスタン解析に使用するミラクリン認識特異抗体は、'大腸菌で発現させたミラタリンを抗原として公知の方法により作製できる (実施例 5を参照) 。本発明のミラクリン遺伝子を導入した組換え植物にて産生されたミラクリンタンパク質は、二量体を形成する。このことは、非還元条件下で S D S _ P AGE ' により展開したタンパク質溶液についてのミラクリン特異抗体を用いたゥエスタン解析によって確認される（例えば図 1 1を参照）。ミラクリンタンパク質の二量体は活性を有している（Kurihara, 1992, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 32(3) : 231-252) 力ミラクリンタンパク質の単量体は活性を有しないことから、本発明の組換え植物に導入したミラクリン遺伝子は、活性のあるミラクリンを蓄積できることが示された。

ミラクリン遺伝子を導入した本発明の組換え植物は、ミラクリンを産生し、それにより、食味修飾活性を有する。すなわち、被験者（好ましくはヒト）が本発明の組換え植物を口に含み（そして好ましくはよく嚙み）、その後、酸味のある素材を口に入れると、酸味の代わりに甘味を感じる。従って、組換え植物が生産するミラクリンの活性（食味修飾活性）は、実施例

6〜8に示すようなバイオアツセィ法により評価できる。直接法では、人がミラクリンを生産している組換え植物を直接口に含み、続いて酸味材料（タエン酸ゃレモン汁など）を口に含むことにより効果を評価できる。抽出法では、組換え植物からミラクリンを公知の方法で抽出し、その抽出液を口に含み、続いて酸味材料（タエン酸ゃレモン汁など）を口に含むことにより効果を評価できる。それらのアツセィでは、口に含んだ酸味材料に対して甘味が感じられた場合、その組換え植物において産生されたミラクリンは活性を有すると判断することができる。レタスやトマトなどは、栽培技術や流通技術が非常に発達しており、世界中のどこの地域でも安定して周年生産が可能である。従ってこれらは、ミラクリンを生産する組換え植物の宿主としては極めて適している。逆に言うと、栽培の容易さの点では、ミラタリン遺伝子を導入する植物は、ミラクノレフルーッ iichadel la dulcifica) のように特定の地域以外では栽培が難しい植物ではない方がよい。しかしながら、ミラクリン遺伝子を導入して発現させる有用植物は、これらに制限されず、食材となりうる全ての植物を含める。

ところで本発明者らは、後述の実施例にも示される通り、ミラクリン遺伝子を 2倍体植物に導入して得られる 2倍体の形質転換（トランスジエニック）植物が、特に高いミラクリン産生能を有することも見出した。本発明者らは、ミラクリン遺伝子が導入された 2倍体植物が、活性のある二量体形態でミラクリンを蓄積すること、及びそのミラクリンが甘味誘導活性を有することを確認した。さらに本発明者らは、ミラクリン遺伝子が導入された 2倍体植物細胞では、発現量の低下が起こりにくいことも見出した。このことから、 2倍体の植物が、ミラクリン遺伝子を高発現させるために特に適していることが判明した。ミラクリン遺伝子が導入された 2倍体のトランスジエニック植物は、活性のあるミラクリンを安定的に大量に産生できるため、ミラクリンの大規模生産用には特に有用である。

栽培の容易性の点からは、ミラクリン遺伝子を導入する 2倍体植物として、 2 倍体の作物植物（栽培種）を用いることがなお好適である。上記 2倍体植物としては、限定するものではないが、例えばトマト、キャベツ、ハクサイ、イネ、トゥモロコシ、ダイズ等の 2倍体が挙げられる。動物では、 2倍体よりも多い染色体数を有する倍数体は、両生類や魚類の一部の例を除いてほとんど知られていない。しかし植物では、同一種内で複数種の倍数体が存在することがしばしば知られている。植物の倍数体は、果実が大きくなるなどの栽培上有利な形質を生じうるため、作物として有利に用いられているものが多い。現在利用されている倍数体の作物植物には天然のものもあれば人為的に作製されたものもある。作物植物の倍数性の例としては、コムギの 2倍体品種 (染色体のセットを 2組もつ）の他に、 4倍体品種（染色体のセットを 4組もつ）、 6倍体品種（染色体のセットを 6組もつ）がある。一方、サッマイモの栽培種は 6倍体、栽培タバコは異質 4倍体（異種のゲノム 2セットずつが組み合わさって生じた倍数体；複 2倍体とも呼ばれる）である。しかしながら、本発明において、ミラクリンの高効率な組換え生産を行う目的では、ミラクリン遺伝子を導入する植物は、上記の通り、倍数体（例えば、 4倍体、 6倍体ゃ複 2倍体）ではなく、 2倍体であることが好ましい。本発明において「2倍体」とは、ゲノム ( 1セットの染色体）を 2組有する植物を意味する。

本発明では、ミラクリン高発現性トランスジエニック植物を作製する上では、 2倍体植物にミラクリン遺伝子を導入し、さらに 2倍体植物を選抜することにより、確実に 2倍体のトランスジエニック植物を得ることがより好ましい。これは、ミラクリン遺伝子を 2倍体植物細胞に導入しても、継代培養などの細胞培養工程において染色体が 4倍体などに自然倍加してしまうことがしばしばあるためである（実施例参照）。 2倍体植物を選抜するためには、ミラクリン遺伝子が導入された細胞をマーカー選択などにより選択的に増殖させ、場合によっては植物体まで生長させて、その植物細胞（植物体の場合は、葉、根などの細胞が好ましい）について、当業者に公知の倍数性検定法によって倍数性を判定し、 2倍体である細胞を選択することが好ましい。限定するものではないが、例えば、目的の植物体の葉由来の細胞について、フローサイトメーター（例えば、パルテック社のフローサイトメーター）を用いて倍数性の検定を行うことができる。この場合、倍数性が既知である植物体由来のサンプルをコントロールとしてそのピークと比較することにより、ミラクリン遺伝子を導入した植物体の倍数性を判定することができる。このような、 2倍体植物にミラクリン遺伝子を導入し、遺伝子導入された植物体から 2倍体植物を選抜することを含むミラクリン高発現性のトランスジエニック植物の製造方法も、本発明には含まれる。

本明細書において用語「トランスジエニック植物」、「組換え植物」及ぴ「（植物の）形質転換体」は、ミラクリン遺伝子が外来遺伝子として導入されている植物を指すために互換的に使用される。本明細書において「トランスジヱニック植物」、「組換え植物」及び「（植物の）形質転換体」は、植物体だけでなく、導入遺伝子を発現しているか又は発現しうる状態で保持している植物細胞、並ぴにその植物細胞を含む器官 [例えば葉、花、茎、根、種子等] 、組織 [例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等] 、及び培養細胞（例えばカルス）なども意味する。本発明の「トランスジエニック植物」、「組換え植物」及ぴ「（植物の）形質転換体」には、遺伝子導入した植物細胞又はそれを含むカルスから再生させた植物体の、子孫個体及びその一部も包含される。一旦、ミラクリンを生産する組換え植物が作出されれば、その繁殖材料（例えば、果実、種子など）は容易に得ることができる。さらに、得られた繁殖材料を基にミラクリンを生産する組換え植物を量産することが可能となる。また、ミラクリンを生産する組換え植物からは、当業者には周知のタンパク質抽出精製法を用いて、大量のミラクリンタンパク質を取得することができる。従って本発明は、組換え植物からミラクリンを含むタンパク質を抽出し、好ましくはさらにミラクリンを分離することにより、ミラタリンを大量生産する方法にも関する。

3 . 飲食品及び医薬品

本発明は、本発明の組換え植物が生産したミラクリンを含有する飲食品、'食品添加物にも関する。本発明はまた、本発明の組換え植物が生産したミラクリンを有効成分として含む医薬品にも関する。

本発明の組換え植物が生産するミラクリンは、食味修飾活性として酸味を甘味に変える活性を有する。従って、本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含有する飲食品、食品添加物、又は医薬品（治療薬、予防薬又は生活改善薬など）は、限定するものではないが、例えば、糖尿病の予防や糖尿病患者の治療効果の促進のため（例えば、食事療法におけるストレス緩和のため）に有用である。本発明の導入されたミラクリン遺伝子が発現している組換え植物は、その植物体自体を食品として利用してもよいし、植物体の一部を食品又は食品添加物として使用してもよいし、植物体若しくは植物体の一部（葉など）から抽出したミラクリン若しくはミラタリンを含むタンパク質画分を飲食品、食品添加物又は医薬品として使用してもよレ、。本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含有する飲食品、食品添加物及ぴ医薬品に関する本発明の 1つの態様は、ミラクリンを発現している本発明の組換え植物の植物体、その組換え植物の植物体の一部（葉や種子など）、又はその植物体若しくは植物体の一部から抽出したミラクリン含有タンパク質を含む、飲食品、食品添加物又は医薬品である。

本明細書において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品及び機能性食品を包含する。本発明の飲食品には、本発明の組換え植物が生産するミラクリンに加えて、酸味材料（レモン汁、クェン酸など）を添加することが好ましい。ミラクリンは酸味を甘味に変える性質を持っていることから、本発明の飲食品は、酸味材料を添加する代わりに、糖分含量を減らしたものであることが好ましい。本発明の組換え植物が生産するミラクリンを添加する飲食品は、特に限定されない。例えば飲料として果物 ·野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどうなどの果汁や、トマト、ニンジンなどの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワインなど）、炭酸飲料及び清涼飲料、発酵乳（ヨーグルトな 'ど）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、お茶系飲料（緑茶、紅茶及びウーロン茶など）等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新 · ソフトドリンクス」（2003) (株式会社光琳) 等を参考にすることができる。

本発明の組換え植物が生産するミラクリンを添加する食品は、特に限定されず

、生鮮食品であってもよいし、加工食品であってもよい。例えば、プリン、ゼリ一、アイスクリーム類、ケーキ、キャンディ、パスタ、うどん、かまぼこ、ハム

、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、豆腐、スープ、パン、魚の切り身、カロェ肉、野菜、きのこなどの様々な食品を例示することができる。

本発明の組換え植物が生産するミラタリンを含有する飲食品として、機能性食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、 ί列えば、特定保健用食品（条件付きトクホ [特定保健用食品]を含む）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（ FA0/WH0合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim ) が適用される健康食品を包含する。

本発明の機能性食品として好ましいより具体的な例には、病者用食品、妊産婦 •授乳婦用粉乳、高齢者用食品等の特別用途食品がある。

本発明の組換え植物が生産するミラタリンを含有する機能性食品の好ましい例として、保健機能食品が拳げられる。保健機能食品制度は、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象としている。この制度の下、保健機能食品は、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の 2種類の類型からなる。さらに、条件付きトクホ [特定保健用食品]等の新たな類型もある。

本発明の機能性食品は、酸味を甘味に変える活性を有する。従って本発明の機能性食品は、肥満に悩む人や糖尿病を患う人が食事療法を行う際に糖分を摂取しなくても甘味を味わえるようにするため、肥満や糖尿病の治療効果を生活面から促進する効果がある。本発明の機能性食品（好ましくは、特定保健用食品又は条件付きトクホ [特定保健用食品] ) は、糖分摂取を無理なく抑制できることについて、記載又は表示したものであってよい。そのような記载又は表示は、保健機能食品制度において定められた規定に基づいて表示承認されたものでありうる。例えば本発明の機能性食品においては、「糖分摂取量の抑制に役立つ」「痩せたい人の食生活改善に役立つ」などの記載が考えられる。 ' 本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジエル剤などの製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、粉状茶葉、菓子など）であってもよい。

本発明の組換え植物が生産するミラタリンの飲食品における含量は特に限定されず、場合に応じて様々であってよい。具体的な含量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。しかし通常は、本発明の組換え植物が生産するミラクリンの量が、 0 . 0 0 1〜 1 0 0重量⁰ /₀、特に 0 . ：!〜 1 0 0重量％となるような含量が適当である。

本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤、着色料、香料、保存料、乳化剤、酸化防止剤、 p H調整剤、化学調味料、増粘剤、消泡剤、結着剤等が挙げられる。さらに、ォタネニンジンエキス、ェゾゥコギェキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添加してもよい。本発明の飲食品は、糖分の摂取を無理なく低減させたいヒト、家畜、愛玩動物

、実験（試験）動物等を含む哺乳動物が摂取するためのものであることが好ましレ、。特に、痩せたい人、肥満の人、及ぴ糖尿病患者などの、糖分の摂取を無理なく低減させることが望まれる人が、本発明の飲食品を摂取する対象として好ましレ、。太りやすい人及び糖尿病予備軍なども、本発明の飲食品を摂取する対象として好ましい。

本発明は、本発明の組換え植物が生産するミラタリンを含む食品添加物にも関する。本発明の食品添加物には、ミラクリンの他に、慣用的に使用されている各種添加物がさらに添加されていてもよい。本発明の食品添加物は、上記のような本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含む飲食品を製造するために使用できる。

本発明は、本発明の組換え植物が生産するミラクリンを有効成分として含有する、医薬品にも関する。

本発明の医薬品には、製薬上許容される担体又は添加物を配合してもよい。このような担体及び添加物の例として、水、製薬上許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、グリセリン、プロピレングリコーノレ、ポリエチレンダリコール、パラフィン、ステアリルアルコール、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ラタトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。使用される添加物は、製剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の医薬品は、さらに他の薬理成分を含有していてもよい。

本発明の医薬品は、基本的には経口製剤である。本発明の医薬品は、口腔内で作用させる必要があることから、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、バッカル剤、トローチ剤などの固形製剤、ジエル剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の剤形であってよい。

上記経口固形製剤には、製薬上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有してもよい。また、経口液体製剤は、製薬上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有してもよい。

本発明の医薬品の投与量は、投与対象の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。

本発明の医薬品を投与する対象は、糖分の摂取を無理なく低減させたいヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物であることが好ましい。特に、痩せたい人、肥満の人、及び糖尿病患者などの、糖分の摂取を無理なく低減させることが望まれる人が、対象として好ましい。太りやすい人及ぴ糖尿病予備軍なども対象として好ましい。

本発明の「医薬品」の好適な 1つの具体例としては、糖尿病治療薬が挙げられる。この糖尿病治療薬には、例えば糖尿病予防改善剤が含まれる。この糖尿病予防改善剤には、食事療法におけるストレスを緩和する糖尿病患者のための生活改善剤を包含する。あるいは、本発明の「医薬品」の好適な別の具体例としては、肥満治療薬が挙げられる。この肥満治療薬には、例えば肥満予防改善剤が含まれる。この肥満予防改善剤には、食事療法におけるストレスを緩和する肥満患者のための生活改善剤を包含する。本明細書において「予防改善剤」とは、当該疾患の発症を予防する効果及ぴノ又は疾患の症状等を改善する効果の両方を示す医薬品を意味する。実施例

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

実施例 1 ：ミラクリン遺伝子のクローエングとシークェンス解析

本実験では、ミラタリン遺伝子をクローニングする材料としてミラクルフルーッとその葉を用い、以下の方法により遺伝子を獲得した。ミラクルフルーツとその葉からフエノールー SD S法を用いて全 RNAを抽出し、 RT—P CRハイキット（Toyobo)を用いて c DNAを合成した。得られた c D N Aを鏡型にして、ミラクリン遺伝子の c DNA情報（Matuda et al. , 1995)に基づいて設計した 2 つの特異的プライマー（制限酵素 Xb a Iサイトを付加したセンスプライマー 5' - TTTTCTAGAATGAAGGAATTAACAATGCT-3 ' (配列番号 3 ) と制限酵素 S a c Iサィトを付加したアンチセンスプライマー 5' -TTTGAGCTCTTAGAAGTATACGGTTTTGT- 3' (配列番号 4) ) を用い、ミラクリン c DNAを P CRによって増幅した。 P CRは、 9 5 °Cで 5分間の熱変性のあと、 95°Cで 1分間、 5 7°Cで 1分間、 72 °Cで 2分間を 1サイクルとして 40サイクル行った。 P C R産物は、 X b a I と S a c Iで切断し、 p UC 1 9にサプクローニングした（p UCMR L 1 9) 。クローン化した断片は、 DNAシークェンサ一 AB I 3 1 0と DNA Seq uencing Kit Big Dye Terminator cycle sequencing Ready Reaction (.Applied Biosyste MS , Tokyo)を用いて、塩 ·基配列の決定を行い、データベース上の登録配列（D D B Jァクセッション番号 D 3 95 98) と同一であることを確認した。クローン化断片の塩基配列上の、ミラクリン遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの配列を配列番号 1に示す。配列番号 1の塩基配列にコードされるミラクリンタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。実施例 2 ：植物発現ベクターの構築とァグロパクテリゥムへの導入

pUCMRL 1 9プラスミドを保持する大腸菌（JM1 09) からプラスミドを常法に従って抽出した。このプラスミドからミラクリン遺伝子部分を制限酵素

X b a I と S a c Iで切り出し、植物癸現用のバイナリーベクター p B I 1 2 1 と p B I 1 2 1の C a MV 3 5 Sプロモーター領域を改変したベクター（高発現ベクター）の GU S遺伝子部分にクローニングした。このプラスミドを p B 1 3

5 SM I Rと p B I E L₂QM I Rとした（図 1 ) 。このプラスミドを保持する大腸菌 JMl 09は、抗生物質カナマイシン 10 OmgZLを含む LB培地で培養して維持した。続いて、この 2つのプラスミドをそれぞれァグロパクテリゥム GV 2260にエレクトロポレーション法により形質転換した。この形質転換したァグロパクテリゥム GV2260 (p B I 35 SMI R又は p B I E L₂QM I Rを導入）は、カナマイシン 1 0 Omg/Lを含む LB培地で培養して維持した。実施例 3 ：レタス組換え体の作成

p B I 35 SMI R又は p B I EL₂QMI Rを保持するァグロバタテリゥム GV 2260を用いてリーフディスク法により、レタス（品種：カイザー、 2倍体品種）にミラクリン遺伝子を導入した。形質転換したァグロパクテリゥムを 1 0 OmgZLカナマイシンを含んだ LB培地中でー晚振とう培養し、遠心洗浄の後、ァセトシリンゴン 200 μ Mとメルカプトェタノール 10 μΜを含む MS液体培地に OD₆。。が 0. 1になるように懸濁した。このァグロバタテリゥム菌液には種蒔して 5日目の無菌のレタス葉切片を浸漬させた。ァグロパクテリゥムを感染させたレタス葉切片は、 1 mgZLベンジルアデニン (B A) 、 0. lmg ZL 1—ナフタレン酢酸（NAA) を含む MS培地で 3日間共存培養した。その後、 0. 1 mg/L BA、 0. lmg/L NAA、 100mg/Lカナマィシンを含む選抜 M S培地に移し、 2週間ごとに培地を交換しながら培養した。分化してきたシユートを 0. 0 lmg/L BA、 0. 05mg/L NAA, 50 m gノ Lカナマイシンを含む MS培地に移し、 1〜 3 c mぐらいに伸びたシユートを 5 OmgZLカナマイシンを含む発根 MS培地に移した。この培地で根を形成した個体から形質転換個体を選抜した。実施例 4 ：組換えレタスの解析

発根培地で根を形成した 40個体の形質転換体の葉からゲノム D N Aを抽出した。得られたゲノム DN A 1 0 / gを X b a Iで切断し、ミラクリンコード領域の P CR増幅断片を³² P標識したプローブを用いてサザンプロット解析を行つた。その結果、いずれの個体からもシグナルが見られ、ミラクリン遺伝子が導入されていることが確かめられた（図 2)。続いて、ミラクリン遺伝子の導入が確認された個体から 1 9個体をランダムに選びノーザン解析を行った（図 3) 。その結果、調べた 1 9個体のうち 1 3個体でミラクリン遺伝子が発現していることが確認された。次に、ノーザン解析を行った結果ミラクリン遺伝子からの mR N A発現の確認された個体について、実施例 5で作成したミラクリン認識特異抗体を用いてウェスタン解析を行った（図 4) 。その結果、ノーザン解析で強い発現をしていた組換え体ではタンパク質レベルでもミラタリンが強く発現していることが確かめられた。実施例 5 ：ミラクリン認識特異抗体の作成

抗原用のタンパク質を調製するために制限酵素 B a mH Iサイトを付加したセンスプライマー 5， -TAGGATCCGATTCGGCACCCAATCCGGTT-3 ' (配列番号 5 ) と制限酵素 S a c Iサイトを付加したアンチセンスプライマー 5， -TTTGAGCTCTTAGAAGT ATACGGTTTTGT-3' (配列番号 4) を用いて、 p U C 1 9にサブクローニングした全長のミラクリン cDN A (pUCMRL 1 9) を鎳型にして P C Rを行った。その P CR産物（ァクセッション番号 D 38 5 9 8で得られるミラタリン遺伝子の c D NA配列の 94— 6 6 9番目の塩基を含む）を制限酵素 B a mH Iと S a c Iで処理し、同じ制限酵素で処理した N末に 6 XH i sタグをコードする配列を付加することができる大腸菌発現用ベクター P QE 30 (Qiagen, Chatsworth, Calif) にクローニングした（p QEMRL 30) 。 I PTG (イソプロピル一 jS— D—チォガラクトビラノシド）により発現を誘導した融合タンパク質は H i s— T r a pカラム (Amersham Pharmacia Biotech, UK) で精製した。この精製した融合タンパク質を抗原としゥサギに免疫して抗血清を得た（Scrum, Tokyo, Japan) 。抗血清から抗原特異的抗体を精製するために制限酵素 B a mH Iサイトを付加したセンスプライマー 5 ' 一 TAGGATCCGATTCGGCACCCAATCCGGTT-3， (配列番号 5) と制限酵素 X h o Iサイトを付加したアンチセンスプライマー 5' - T

TCTCGAGGAACGCCGAGAAATTGATGTT-3， (配列番号 6 ) を設計し、 p U C 1 9にサブクローニングした (pUCMRL 1 9) 全長のミラクリン c DNAを鍚型にして

P CRを行った。その P C R産物（ミラクリン遺伝子の 94一 3 60番目の塩基を含む）を制限酵素 B a inH I と X h o Iで処理し、同じ制限酵素で処理した N 末に G S T (ダルタチオン S— トランスフェラーゼ) をコードする配列を付加する大腸菌発現用ベクター p GE X 4 T— 1 (Araersham Pharmacia Biotech, UK) にク口一エングした ( p GE XMR L) 。 I P T G (イソプロピル一 β— D—チォガラタトピラノシド）により発現を誘導した融合タンパク質は G S Τ—トラップカラム（Amersham Pharmacia Biotech, UK) で精製した。この精製した融合タンノク¾を CNB r —activated Sepharose 4 Fast Flow column (Amersham Pha rmacia Biotech, UK) にカップリングさせたァフィ二ティカラムを用いて抗血清から抗原特異的抗体を精製した。実施例 6 ：組換えレタスが生産するミラクリンのバイオアツセィ

実施例 4でミラクリンの発現が確認された組換えレタスの葉 1 0 gを水でよく洗浄し、口の中でよく嚙んで 5分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗って、 0. 0 2Mのクェン酸を味わい、その甘さと 0. 1〜1Mのショ糖標準液の甘さを比較することによりバイオアツセィを行った。また、ミラクリンの発現が確認された組換えレタスの葉 1 0 gに 0. 5M N a C 1 1 0 m Lを加えてタンパク質を抽出し、 0. 0 1 M N a HC 0₃溶液に透析した溶液をテストに用いた。甘味誘導活性の評価は、 5 mLのタンパク質溶液を口の中で 5分間含み舌によくなじませた後吐き出し、脱イオン水で口をすすいで 0. 0 2 Mのクェン酸を味わい、その甘味の強さを 0. 1〜 1 Mのショ糖標準液の甘さと比較することにより行った。

さらに、実施例 4においてミラクリンの発現が確認された組換えレタス及ぴミラクリン遺伝子を導入していない非組換えレタスのそれぞれの葉 2 gを、上 f己と同様に、水でよく洗浄し、口の中でよく嚙んで、 5分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗って、 0. 0 2Mのクェン酸を味わい、その甘さと 0. 1〜1 Mのショ糖標準液の甘さを比較することによりバイオアツセィを行つた。比較のために、ミラクルフルーツ 1個の皮を剥きその果実を 5分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗ってから、 0. 0 2Mのクェン酸を味わい、その甘さと 0. 1〜 1 Mのショ糖標準液の甘さを比較した。この結果を表 1に示す。

表 1 ：組換えレタスの甘味誘導活性の評価

表 1中、被験者が同等の甘さであると感じたショ糖の濃度が大文字 oで示されている。このように、レタスで発現させたミラクリンは、ミラクルフルーツに含まれるミラクリンと同程度の強さの甘味誘導活性を示した。なお組換えレタスでは、世代が進むと、ミラクリンの発現量が低下する傾向にあった。実施例 Ί ：組換えトマトの作製

実施例 1及び 2で作製した p B I 35 SMI Rと、 p B I EL₂QM I Rを保持するァグロバタテリゥム GV 2260を用いて、リーフディスク法により、トマト（品種： M o n e y m a k e r、 2倍体品種）にミラクリン遺伝子を導入した。形質転換したァグロバタテリゥムを 1 00 mgZL カナマイシンを含んだ LB培地中で一晩振とう培養し、遠心洗浄の後、ァセトシリンゴン 200 μΜ とメルカプトエタノール 1 0； Μを含む MS液体； ¾地に OD₆。。が 0. 1になるように懸濁した。このァグロバタテリゥム菌液に種まきして 7日目の無菌のトマト子葉切片を浸漬させた。ァグロパクテリゥムを感染させたトマト葉切片は、 1 5 m g/L ゼァチン（Z e a t i n) を含む M S培地で 3日間共存培養した。その後、 lmgノ L ゼァチン、 1 0 OmgZLカナマイシンを含む選抜 MS培地に移し、 2週間ごとに培地を交換しながら培養することにより伸びたシユートを 5 Omg/Lカナマイシンを含む発根 MS培地に移した。この培地で根を形成した個体から形質転換個体を選抜した。

発根 M S培地で根を形成した形質転換個体の葉からゲノム D' N Aを抽出しサザン解析を行い、導入遺伝子を検定した（図 5) 。その結果、'調べたいずれの個体からもシグナルが見られ、ミラタリン遺伝子が導入されていることが確かめられた。ミラクリン遺伝子が導入されたトランスジエニックトマトについては、フロ一サイトメーター (パルテック社) を用いて、倍数性の検定を行った。

続いて、ミラクリン遺伝子の導入が確認された個体の葉からタンパク質を抽出し、実施例 5で作製したミラクリン特異抗体を用いて、常法によりウェスタン解析を行った。非還元条件下で S D S一 PAGEを行った後にウェスタンブロット解析を行った結果を図 6に示す。図 6中、レーン 1 1 A、 20— 1、及び 14— 3は、フローサイトメ一ターでの測定により 4倍体であることが示された個体由来のサンプルであった。それ以外のレーンのサンプルは、いずれも 2倍体個体由来の.サンプルであった。そして、 2倍体のトランスジエニックトマト由来のサンプル全てについて、活性型とされる二量体のサイズのミラクリンタンパク質が検出された。一方、 4倍体のトランスジエニックトマトである系統 1 1 A及び 20 一 1にそれぞれ由来するサンプルについては、ミラタリンは全く検出されなかつた。 4倍体のトランスジェニックトマトである系統 14 - 3由来のサンプについてはミラクリンの発現自体は確認されたが、その発現量は 2倍体の場合と比較して半分以下であり、大幅に少なかった。一方、 2倍体のトランスジェニックトマト由来のサンプルについて、還元条件下で SDS— PAGEを行った後にゥヱスタンブロット解析を行った結果を図 7に示す。図 Ίでは単量体のサイズのミラクリンが検出された。還元条件下では二量体が分離して単量体になると考えられることから、図 7からは、二量体を形成したミラクリンがトランスジエニックトマトで産生されたことが示された。これらの結果に示されるように、組換え（トランスジエニック）トマトでの強いミラクリンの発現が確認された。

上記でミラクリンの発現が確認されたトランスジエニックトマト及ぴミラクリン遺伝子を導入していない非組換えトマトのそれぞれの果実 2 gを水でよく洗浄し、口の中でよく嚙んで 5分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗って、 0 . 0 2 Mのクェン酸を味わい、その甘さと 0 . 1〜1 Mのショ糖標準液の甘さを比較することによりバイオアツセィを行った。さらなる比較のために、ミラクルフルーツ 1個の皮を剥きその果実を 5分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗ってから、 0 . 0 2 Mのクェン酸を味わい、その甘さと 0 . 1〜1 Mのショ糖標準液の甘さを比較した。この結果の一例を表 2 に示す。表 2 ：組換えトマトの甘味誘導活性の評価

ショ糖の濃度（M)

被験者サンプル

0 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0. 6 0. 7 0. 8 0. 9 1. 0

A ミラクルフルーツ o

非組換えトマト O

龃換えトマト（2倍体） o

B ミラクルフルーツ o

非組換えトマト o

組換えトマト（2倍体） o

C ミラクルフルーツ o

非組換えトマト o

組換えトマト（2倍体） o

D ミラクルフルーツ o

非組換えトマト o

組換えトマト（2偌体） o 表 2中、被験者が同等の甘さであると感じたショ糖の濃度が大文字〇で示されている。このように、トマト（ここでは 2倍体）で発現させたミラクリンは、ミラクルフルーツに含まれるミラクリンと同程度の強さの甘味誘導活性を示した。一方、 4倍体に倍加したトランスジヱニック（組換え）トマト系統 1 4— 3の果実を用いた場合には、クェン酸について感じた甘味はごく弱いものであり、その甘味誘導活性はかなり低いと考えられた。実施例 8 ：組換ぇシロイヌナズナの作製

ミラクルフルーツから、 Dynabeads mRNA DIRECT Kit (DYNAL社製； Prod No.61 0.11&610.12)を使用して mRNAを抽出し、それを铸型として、 Super Script F irst-Strand Synthesis System for RT - PCR(Imdtrogen社製； Cat. No.11904-018 ) を使用して逆転写反応により c DNAを作製した。

得られた c DNAを铸型とし、 P CRによりミラタリン遺伝子を含む DNA断片を増幅した。具体的には、 P CR用のプライマーセットとして、シグナル様配列を含めたミラクリンタンパク質をコードする領域を増幅するプライマーセット Ml、及びシグナル様配列を含まないが、メチォニンをコードする AT Gを付加したミラクリンタンパク質部分をコードする領域を増幅するプライマーセット M 2の 2セットを設計した（図 8) 。これらのプライマーにはクローニング用ァダプターを付加した（図 8) 。

•プライマーセット Ml ：下線部はシグナル様ぺプチドコード配列の 5 ' 末端側配列、増幅サイズは 753 b p)

フォワードプライマー MN 1 : 5'- ATTACATTTTACATTCTACAACTACATCTAGAGGCCA AATCGGCCatgaaggaattaac aatgctctct -3' (配列番号 7 ) [大文字：アダプタ一配列]

リバースプライマー MC 1 : 5，- CGAGCTCGCGGCCGCCCCGGGGATCCTCTAGAGGCCCTT ATGGCCttagaagtatacggttttgttgaac -3' (配列番号 8 ) [大文字：アダプター配列]

•プライマーセット M2 (シグナル様ぺプチドコード配列を含まない；増幅サイズは 6 6 9 b p)

フォワードプライマー MN2 : 5' - ATTACATTTTACATTCTACAACTACATCTAGAGGCCA AATCGGCCATGgattcgg cacccaatccggt _3' (配列番号 9 ) [大文字：アダプタ一配列]

リバースプライマ一 MC 1 : 5に CGAGCTCGCGGCCGCCCCGGGGATCCTCTAGAGGCCCTT

ATGGCCttagaagtatacggttttgttgaac -3' (配列番号 8) [大文字：アダプター配列]

用いた P CR反応液組成は、総量 3 0 μ 1当たり、プライマーセット Ml又は M 2の各プライマー 1 5 pM、 cDNA 3 μ 1、 1 0 X P CRバッファー 3 μ 1 、 d NT P s 3 しポリメラーゼ酵素 0. 3 μ 1、滅菌水 2 0. 4 μ 1 (1 O XP CRバッファー、 dNTP s、ポリメラーゼ酵素は T0Y0B0 rTaq DNA Poly raerase Code; TAP- 211を使用）であった。 P CR反応は、 95°Cで 5分の熱変性の後、 94 で0. 5分の変性、 6 1でで0. 5分のアニーリング、 72¾で1 分の伸長を 1サイクルとして 40サイクル行った。

得られた PCR産物を電気泳動し、増幅産物の大きさを確認した。図 9に示す通り、プライマーセット Ml、 M2とも、上記增幅サイズに適合するバンドを確認できた。次いで、これらのバンドの PCR増幅断片を切り出し、常法により精製を行った。精製後のこれら.の P CR断片は、それぞれ、発現ベクター p B i g s 2 1 1 3 S F (p B I G 2 1 1 3Nに2っのS f i Iサイトを付加したもの。 Ta ji et al. , Plant J29, 417- 426参照）中へ挿入した（図 1 0) 。得られた組換え発現ベクターを、次にエレクト口ポレーシヨンにより、大腸菌コンビテントセル（DH10B株）に遺伝子導入した。 5 Omg/Lカナマイシン存在下で陽性コロニーを単離し、それを鐃型にプライマーセット Ml又は M2を用いたコロニー P CRを行い、 P CR産物を電気泳動した。プライマーセット M 1及ぴ M2のそれぞれについて、それらの増幅サイズと一致するサイズのインサートが挿入された発現ベクターを有するコロニーが確認された。

目的のサイズのィンサートが揷入されていたコロニーを搔き取り、培地でサブカルチャーした後、常法により大腸菌プラスミドを抽出した。これらのプラスミドのインサートを配列決定したところ、プライマーセット Ml、 M2ともに、ミラクリン遺伝子の塩基配列から予測される増幅断片の配列と一致することが確認された。

これらの大腸菌プラスミドを、エレクト口ポレーシヨンにより、ァグロパクテリウム GV 3 101株中に形質転換した。この形質転換体は、 50mgZL 力ナマイシンを含む L B培地で選択的に培養した。

続いて、得られたァグロバタテリゥム形質転換体を用いて、フローラルデイツビング法により、ァグロパクテリゥムを介してシロイヌナズナヘ遣伝子を導入した。具体的には、文献（Cloughら， 1995， Plant J 16, 735-743) に記載の方法に従い、形質転換したァグロバタテリゥムを 50 m g Lカナマイシンを含んだ L B培地中で一晚振とう培養した後、菌を遠心して回収し、 5%ショ糠を含む M S液体培地に懸濁後、その懸濁液に、播種して約 1. 5ヶ月経過したシロイヌナズナ野生型 C o 1ー₀ (2倍体）の地上部全体を浸して感染させた。その後、ジッパー付の袋にシロイヌナズナを入れ、密封して 1 日、ジッパーを開封して 1日置き、その後袋から出し、種子が収穫できるまで生育させた。

こうして処理したシロイヌナズナから種子（T 1) を収穫し、これを B AM培地に播種し、 20 m g Lハイグロマイシン及ぴ 10 Omg/Lセフオタキシムナトリウムによる薬剤選抜を行った。その結果、プライマーセット Mlによる増幅産物を用いた形質転換体（以下、 Ml群と称する）が 9個体（Ml— 1、 Ml 一 2、 Ml— 3、 Ml— 4、 Ml— 5、 Ml— 6、 Ml— 7、 Ml— 8、 Ml— 9 ) 、プライマーセット M2による増幅産物を用いた形質転換体（M2群と称する）が 6個体（M2— 1、 M2— 2、 M2— 3、 M2— 4、 M2— 5、 M2— 6 ) 得られた。これらの形質転換体（T 1個体）は、その後、土へ移植し、生育させた。

葉が大きくなるまで生長させた後、各個体から 2〜3枚の葉（l O Omg程度 ) をサンプリングした。 Ml群由来の葉サンプル及び M2群由来の葉サンプルは

、群毎にひとまとめにし、それを用いて、 6人の被験者により味覚試験を行った

。被験者はレモン汁を口に含んでその酸味を確認した。その後被験者は、口内を洗浄した後、葉サンプルを口の中で約 1分間よく嚙んで吐き出し、再度レモン汁を舐めた。その結果、 6人の被験者は、全員一致して同じ味覚の変化を確認した。 Ml群の T 1個体については、全員が、葉サンプルを嚙んだ後に舐めたレモン汁に甘味を感じた。対照的に、 Μ 2群の Τ 1個体については、全員が、葉サンプルを嚙んだ後に舐めたレモン汁の味に変^を感じなかった。従って、 Ml群の植物体には多量のミラクリンタンパク質が活性状態で含まれていることが確認された。一方、 M2群の植物体には、味覚の変化での確認ができなかったため、ミラクリンタンパク質は含量が少ないか、活性が弱いかのどちらかと考えられた。次に、上記で得られた Ml群の形質転換体について、個体毎に種子を収穫し、各個体（ライン）当たり 50粒ずつの種子を含む B' AM培地に播種し、 20mg /Lハイグロマイシン及び 10 OmgZLセフオタキシムナトリゥムによる薬剤選抜を行った。選抜された形質転換体（T2個体）を、各ライン当たり 4〜 9個体ずつ土に移植し、生育させた。

葉が大きくなるまで生長させた後、これらの T 2個体から、 2〜3枚の葉（1 O Omg程度）をサンプリングした。サンプリングした葉は、ライン毎に 1つにまとめて、味覚の変化を確認した。確認には酸味材料としてレモン汁を使用し、上記と同様にして行った。

この結果、ライン Ml— 4、 Ml— 9、 Ml— 2、 Ml— 5由来のサンプルについて、被験者は、葉サンプルを嚙んだ後に舐めたレモン汁に甘味を感じた。特にライン M— 4由来のサンプルについては強い甘味が感じられた。従って、 Ml 群の植物体における活性のあるミラクリンタンパク質の発現能は、 T 1個体から後代へ受け継がれたことが示された。

さらに、上記で作製した Ml群の T 2個体（下記の表 3に示すサンプリングした個体）、及び M2群の T 1個体（M2— 1〜M2— 6の 6個体）の葉サンプルから常法によりタンパク質を抽出し、それを非還元条件下で SDS— PAGEにかけ、それをメンブレンに転写した後、実施例 5で作製したミラタリン認識特異抗体を用いて、ウェスタンプロット法によりサンプル中のミラクリンタンパク質を検出した。表 3 ：生育させた M l群の T 2個体と葉のサンプリング状況

*各ラインの上段は、 T 2個体の名称を示す。〇は、ウェスタンブロット解析のために葉をサンプリングした個体を示す。この結果の代表例を、図 1 1及ぴ図 1 2に示す。図 1 1に示すように、 M l群では、調べた全ラインの T 2個体について、精製したミラクリンタンパク質（二量体）と同じ移動度のバンドが観察された。

—方、図 1 2では、 M 1群の M l— 4一 4及ぴ M l— 9一 4個体については、精製したミラクリンタンパク質（二量体）と同じ移動度のバンドが観察された。しかし M 2群の個体については、精製したミラクリンタンパク質（二量体）と同じ移動度のバンドはごく薄いものしか観察されなかった。

以上の味覚試験及ぴゥュスタンブロットの結果から、シグナル様ペプチド配列を含むミラクリンタンパク質をコードする D N Aを導入したトランスジエニックシロイヌナズナ（M l群）では、ミラクリンタンパク質が発現され、活性のある二量体状態で存在していることが示された。通常ミラクルフルーツ 1個の重量は 1 . 5 g程度であるのに対し、シロイヌナズナの葉わずか約 1 0 O m g程度でミラクリンタンパク質が発現され活性が確認できた。一方、シグナル様ペプチド配列を含まないミラクリンタンパク質部分をコードする D N Aを導入したトランスジエニックシロイヌナズナ（M 2群）では、ごく僅かのミラクリンタンパク質しか生産されないことが示された。従ってミラタリン遺伝子の発現にはシグナル様ぺプチド配列をコードする塩基配列が必要だと考えられた。産業上の利用可能性

本発明において提供されたミラクリン遺伝子を導入した組換え植物を利用することにより、ミラクリンを安定的に大量に供給できるようになる。本発明では、食用となる汎用農作物でミラクリンを発現させるので、日常的な食材としてミラクリンを発現する植物を利用できるようになる。また、ミラクルフルーツと同レベルで発現させることができるため、発現させたミラクリンを抽出して食品添加物として利用することも可能である。ミラクリン遺伝子を導入した組換え植物やその植物材料を用いれば、ミラタリンのダイエツトゃ医療目的での利用が容易になる。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1 . ミラクリン遺伝子が導入された、食味修飾活性を有するトランスジェニック植物。

2 . ミラタリン遗伝子が、以下の（a)〜（f)のうち少なくとも 1つのミラクリン遺伝子である、請求項 1に記載のトランスジニック植物。

(a) 配列番号 1に示す塩基配列からなる遺伝子；

(b) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ食味修飾を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子；

(c) 配列番号 2に示すァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；

(d) 配列番号 2に示すァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；

(e) 配列番号 1に示す塩基配列と 7 0 %以上の同一性を示す塩基配列からなり

、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；及び

(f) 配列番号 2に示すァミノ酸配列と 8 5 %以上の同一性を示すァミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子

3 . 章味修飾活性が、酸味を甘味に変える活性である、. 請求項 1又は 2に記載のトランスジエニック植物。

4 . 前記植物がレタス、トマト、イチゴ又はシロィヌナズナである、請求項 1 〜 3のいずれか 1項に記載のトランスジエニック植物。

5 . 2倍体植物である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のトランスジェニック植物。

6 . 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のトランスジエニック植物からミラクリンを抽出することを含む、ミラクリンの製造方法。

7 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック植物において産生されたミラタリンを含む食品添加物。

8 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック植物において産生されたミラクリンを含む飲食品。

9 . 糖尿病患者用の、請求項 8に記載の飲食品。

1 0 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のトランスジ産生されたミラクリンを含む糖尿病治療薬。