JP2010115158A

JP2010115158A - 植物体栽培装置及び遺伝子組換えトマトにおける目的タンパク質の生産方法

Info

Publication number: JP2010115158A
Application number: JP2008291219A
Authority: JP
Inventors: Naoya Fukuda; 直也福田; Hiroshi Eomo; 浩江面; Takeshi Mizoguchi; 剛溝口; Kyoko Tanase; 京子棚瀬; Masayoshi Hirai; 正良平井; Hideo Tsunoda; 英男角田
Original assignee: University of Tsukuba NUC
Current assignee: University of Tsukuba NUC
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2010-05-27
Anticipated expiration: 2028-11-13
Also published as: JP5637343B2

Abstract

【課題】植物体栽培装置及び遺伝子組換えトマトにおける目的タンパク質の生産方法を提供する。
【解決手段】植物体に対する光環境を調節する光環境調節手段と、光環境調節手段からの熱を調節する排気手段と、水耕栽培手段と、室内大気中炭酸ガス濃度調節手段とを備える栽培室を積層構造で複数備えることを特徴とする、植物体栽培装置。
【選択図】図１

Description

本発明は、例えば、植物の大量生産に用いられる植物体栽培装置及び遺伝子組換えトマトにおける目的タンパク質の効率的な生産方法に関する。

従来においては、閉鎖空間内の人工光照射下でトマトを生育させ、果実を収穫する実用的技術が存在しなかった。このような技術が存在すれば、外部環境の影響を受けることなく計画的にトマトを生産することが可能である。

一方、従来において、遺伝子組換えトマトにおける目的タンパク質の生産及び蓄積を最適なものとする光環境条件は検討されていなかった。このような光環境条件を設定できれば、遺伝子組換えトマトにおいて目的タンパク質を効率的に生産することできる。

例えば、本願発明者は、ミラクリンを発現する遺伝子組換え植物の作製方法を既に見出している(特許文献１)。ミラクリンは、ミラクルフルーツ(Richadella dulcifica)果実中に含まれる食味修飾タンパク質である。ミラクリンには食品中の酸味を甘味に変える働きがあり、例えば、ミラクルフルーツを食べた後にレモン果実を食べると、オレンジ果実のような甘みを感じる。このようなミラクリンの機能を利用して、ミラクリンを、体重制限のためのダイエットや糖尿病治療のための食事制限を無理なく行い、食事におけるカロリー摂取を低減するための補助食品として利用することが考えられている。

このように、ミラクリン等のタンパク質を遺伝子組換え植物で生産及び蓄積させることは望まれる。

国際公開第2006/014018号パンフレット

そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、閉鎖空間型植物体栽培装置及び当該装置を利用した、遺伝子組換えトマトにおける目的タンパク質の効率的な生産方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、閉鎖系環境における特定の光環境条件下で、遺伝子組換えトマト内において当該遺伝子によりコードされるタンパク質が安定的に蓄積することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、植物体に対する光環境を調節する光環境調節手段と、光環境調節手段からの熱を調節する排気手段と、水耕栽培手段と、室内大気中炭酸ガス濃度調節手段とを備える栽培室を積層構造で複数備えることを特徴とする、植物体栽培装置である。

また、本発明に係る植物体栽培装置は、水耕栽培手段に対して養液を供給及び回収する養液循環手段をさらに備えたものであってよい。

さらに、本発明に係る植物体栽培装置においては、上記光環境調節手段を植物体に対して上面及び側面の双方に配置することが好ましい。

本発明に係る植物体栽培装置において栽培する植物体としては、トマト植物体が挙げられる。

また、本発明は、遺伝子組換えトマト植物体を明期6〜20時間未満、光合成有効光量子束密度に基づく光強度300〜600μmol/m²/s及び炭酸ガス濃度500〜1000ppmの条件下で栽培することを含む、導入遺伝子によりコードされるタンパク質を生産する方法である。当該導入遺伝子例としては、ミラクリンをコードする遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に係る方法では、上述の本発明に係る植物体栽培装置を用いて、遺伝子組換えトマト植物体を栽培することが好ましい。

本発明に係る植物体栽培装置によれば、閉鎖空間内の人工光照射下で、安定的にトマト等の植物を大量に生産することができる。また、本発明に係る方法によれば、遺伝子組換えトマトにおいて、導入遺伝子によりコードされる目的タンパク質の蓄積が安定化し、有用タンパク質を大量生産することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
図１に示すように、本発明に係る植物体栽培装置１は、植物体２に対する光環境を調節する光環境調節手段３と、光環境調節手段からの熱を調節する排気手段４と、水耕栽培手段５と、室内大気中炭酸ガス濃度調節手段(図１中には示されていない)とを備える栽培室６を積層構造で複数備える。

ここで、植物体２とは、植物体全体、植物体の苗、器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞を意味する。好ましくは、植物体２は苗である。また、植物体２としては、水耕栽培により栽培することができる植物体であればいずれの植物体であってもよく、例えば、トマト、キュウリ、イチゴ、ピーマン、レタス、チンゲンサイ、ホウレンソウ等の植物体が挙げられる。好ましくは、植物体２はトマト植物体である。

光環境調節手段３としては、例えば蛍光灯の光源等が挙げられる。光環境調節手段３は、植物体２に対して均一に光を照射するために、植物体２に対して上面及び側面の双方に配置されることが好ましい。例えば、図２に示すように、光環境調節手段３(蛍光灯)が栽培室６の天井面と植物体２の配置に平行して(すなわち、栽培室６の側面から側面へ)配置されている。

排気手段４としては、例えば換気扇(ファン)が挙げられる。例えば、図２に示すように、排気手段４は、栽培室６の背面に配置される。

水耕栽培手段５は、植物体２を水耕栽培するための手段を意味する。例えば、水耕栽培手段５としては、水耕栽培用ベッド等が挙げられる。また、水耕栽培方法としては、薄膜水耕(Nutrient Film Technique；以下、「NFT」と呼ぶ)が挙げられる。NFTは、緩やかな傾斜を有する平面上に、養液を薄く(少量ずつ)流下させる水耕栽培を意味する。NFTにより植物体２を栽培すべく、例えば図３に示すように、植物体栽培装置１は、養液を供給及び回収する養液循環手段を備えることができる。養液循環手段では、循環タンク７から養液が給液１０として供給され、水耕栽培手段５を通過した養液は排液１１として循環タンク７に回収する。なお、循環タンク７内の養液量に応じて、養液は、養液自動調合装置８により、養液ストック９と水道水１３から養液が自動制御で調合される。調合された養液は養液タンク１２より、循環タンク７に回収された養液と共に水耕栽培手段５へと供給される。

室内大気中炭酸ガス濃度調節手段とは、栽培室６における炭酸ガス(二酸化炭素)濃度調節手段を意味する。当該室内大気中炭酸ガス濃度調節手段として、例えば炭酸ガス濃度測定手段と炭酸ガス濃度調節条件を制御する手段とを備えたものとすることができる。

さらに、栽培室６には、室内温度調節手段を備えていてもよい。室内温度調節手段として、例えば温度測定手段と温度調節条件を制御する手段とを備えたものとすることができる。

植物体栽培装置１においては、栽培室６が積層構造により複数(例えば、2、3、4、5個又はそれ以上)配置される。このように、植物体栽培装置１は、積層多段階式栽培装置とすることで、狭い閉鎖空間において単位床面積あたりにして大量に植物体を栽培することができる。

以上に説明するように、本発明に係る植物体栽培装置によれば、閉鎖空間内の人工光照射下で、安定的に且つ連続的に植物体を大量に生産することができる。例えば、本発明に係る植物体栽培装置によれば、23〜40 kg/m²/年の収量でトマトを生産することができる。

また、本発明に係る植物体栽培装置では、植物体の状態に合わせて調光することも可能である。そこで、本発明に係る植物体栽培装置において、好適な光環境条件下で遺伝子組換えトマト植物体を栽培し、当該遺伝子組換えトマト植物体内において導入遺伝子によりコードされる目的タンパク質を大量に生産することができる。

ここで、遺伝子組換えトマト植物体とは、外来遺伝子として導入された遺伝子(導入遺伝子)を発現しているか又は発現する状態で保持しているトマト植物体を意味する。遺伝子組換えトマト植物体は、植物に対する一般的な形質転換方法を用いて導入遺伝子で形質転換することにより作製することができる。例えば、形質転換方法としては、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が挙げられる。これらの植物形質転換法の詳細は、『島本功、岡田清孝監修「新版モデル植物の実験プロトコール遺伝学的手法からゲノム解析まで」（2001）秀潤社』等の一般的な教科書の記載や、Hiei Y．et al．，「Efficient transformation of rice（Oryza sativa L．）mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T−DNA．」, Plant J．（1994）6, 271-282等の文献を参照することができる。

導入遺伝子としては、例えば、ミラクリンをコードする遺伝子(以下、「ミラクリン遺伝子」という)等が挙げられる(特許文献１)。

本発明に係るタンパク質の生産方法では、遺伝子組換えトマト植物体を、例えば上述の本発明に係る植物体栽培装置において、所定の室内炭酸ガス濃度における短日強光条件下で栽培することで、トマト植物体内(例えば、トマト果実内)において導入遺伝子によりコードされる目的タンパク質を安定的に蓄積させることができる。短日強光条件としては、例えば、明期6〜20時間未満(好ましくは8〜20時間未満、特に好ましくは16時間)、且つ光合成有効光量子束密度に基づく光強度300〜600μmol/m²/s(好ましくは400〜600μmol/m²/s、特に好ましくは500μmol/m²/s)の条件が挙げられる。また、炭酸ガス濃度としては、例えば500〜1000ppmが挙げられる。なお、気温は、トマト植物体が生育する温度であればよく、例えば明期において20〜25℃(好ましくは23〜25℃、特に好ましくは25℃)、暗期において15〜20℃(好ましくは18〜20℃、特に好ましくは20℃)が挙げられる。

本発明に係るタンパク質の生産方法では、当業者に周知のタンパク質抽出精製法を用いて、大量の目的タンパク質を取得することができる。すなわち、遺伝子組換えトマト植物体から目的タンパク質を含む抽出物を抽出し、好ましくはさらに目的タンパク質を分離することにより、目的タンパク質を得ることができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕本発明に係る植物体栽培装置におけるミラクリン遺伝子組換えトマトを用いたミラクリン生産
1.植物体栽培装置
植物体栽培装置を、室内に温度及び二酸化炭素濃度の調節が可能な3.1m×4.5m×2.4mのプレハブ内に設置した。当該栽培装置は、幅94cm奥行き86cm高さ82cmの栽培室を2段積み重ねた構造を有し、4室の栽培室で1つの栽培装置とした。

各栽培室には上部にインバーターを付けた32W蛍光灯を12本配置し、さらに植物間照明装置として栽培用の樋と平行に24W蛍光灯3本を2カ所に配置した。栽培室正面奥には通風用のファンを3つ設置した。植物体栽培装置としては、改良型NFT方式を採用した。各栽培室に90cm×16cm×9cmの樋を3つ設置し、養液が循環できるように給液部と排液部を設けた。各樋には60Lの循環タンクから養液が供給され、植物が吸収できなかった養液は同じ循環タンクに回収されることとなる。循環タンク内の養液が不足した場合は、自動で調合された養液(大塚処方(EC=2.0ｄS/m))を貯蔵する養液タンクから循環タンクへと供給されるように設計した。

2.材料及び方法
35Sプロモーターの制御下で恒常的にミラクリン遺伝子を発現する組換えトマト(導入品種Moneymaker)の固定済みT4世代種子を供試した(特許文献１)。当該種子を5cm×5cm×5cmのロックウールに播種し、インキュベーター内において250μmol/m²/sの光条件下で育苗した。

30日間の育苗後、得られた苗を、苗テラス(大洋興業(株))に移動し10日間さらに育苗した後、上記植物体栽培装置に定植した。定植後、一本仕立てとして整枝し、第1果房から上位3枚の本葉を残して摘心した。植物体栽培装置では、長日条件(20時間照明/4時間暗黒)と短日条件(16時間照明/8時間暗黒)に設定した。さらに、光強度を強光(500μmol/m²/s)と弱光(400μmol/m²/s)を設定し、各光条件を組み合わせて4処理区を設けた。気温は、全ての栽培条件で明期25℃暗期20℃とした。また、CO₂濃度はいずれも1000ppmに維持した。

果実が緑熟及び赤熟になった段階でそれぞれ収穫し、正常果と異常果数を記録した上で、果実重量を計測した。また、果実内におけるミラクリン遺伝子の発現強度をReal time PCR法で測定した。加えて、ミラクリンタンパク質の蓄積の有無についてウエスタンブロット法を用いて確認した。

3.結果及び考察
結果を下記の表１及び図４〜７に示す。

正常果実数は、長日強光下で多く、尻腐れ果の数は短日弱光下で多くなった(表１及び図４)。

一方、日長に関係なく強光下では、収穫までの日数は少なくなることに加えて、1株当たりの収量も緑熟果の場合は50%以上、赤熟果では40%以上、それぞれ多くなった(表１及び図５)。

図６は、果実内のミラクリン遺伝子の発現強度(ユビキチン遺伝子に対する相対発現強度)を示す。また、図７は、果実内におけるミラクリンタンパク質の蓄積の有無についてのウエスタンブロット結果を示す。なお、図７における「Pレーン」は、精製したミラクリンタンパク質サンプル(陽性対照)である。

図６から判るように、ミラクリン遺伝子の発現強度は、緑熟、赤熟果実ともに長日強光下で他の栽培条件と比較して少なくなった。さらに、緑熟果実及び赤熟果実のミラクリンタンパク質の蓄積を確認すると、緑熟果実及び赤熟果実ともに長日強光下の果実ではバンドの強度にバラツキがあった(図７)。

上述の植物体栽培装置を用いた栽培試験結果より、短日強光条件が最も効率よくミラクリン蓄積組換えトマトを生産できる光条件ではないかと考えられた。また、本実施例で設定した環境条件下において、育苗圃と本圃を分けて栽培する場合、年間5回程度の収穫を行うことが可能となり、1回収穫の場合には約5kg/m²/年、5回収穫の場合には約25 kg/m²/年のトマト収量となる試算結果を得た。また、育苗期間等の短縮を図れば6回収穫で約30 kg/m²/年のトマト収量も可能である。加えて、目的タンパク質収量にはその熟度が影響しないことが判明している。そこで、遺伝子組換えトマトにおける導入遺伝子によりコードされる目的タンパク質の生産を意図した場合には、成熟前果実を収穫する前提とした栽培期間の短縮により、最終的には40 kg/m²/年の遺伝子組換えトマト収量も可能である。

さらに、本実施例により、ミラクリンタンパク質の蓄積量が長日強光下以外では安定していることが明らかとなった。

本発明に係る植物体栽培装置の概略構成図である。本発明に係る植物体栽培装置の正面図及び側面図である。本発明に係る植物体栽培装置における養液循環手段を示す図である。トマト果実の品質に及ぼす光環境の影響を示すグラフである。トマト果実の総重量に及ぼす光環境の影響を示すグラフである。トマト果実内のミラクリン遺伝子の発現強度を示すグラフである。トマト果実内のミラクリンタンパク質の蓄積の有無についてのウエスタンブロット結果を示す写真である。

符号の説明

１．植物体栽培装置、２．植物体、３．光環境調節手段、４．排気手段、５．水耕栽培手段、６．栽培室、７．循環タンク、８．養液自動調合装置、９．養液ストック、１０．給液、１１．排液、１２．養液タンク、１３．水道水

Claims

植物体に対する光環境を調節する光環境調節手段と、
光環境調節手段からの熱を調節する排気手段と、
水耕栽培手段と、
室内大気中炭酸ガス濃度調節手段と、
を備える栽培室を積層構造で複数備えることを特徴とする、植物体栽培装置。
水耕栽培手段に対して養液を供給及び回収する養液循環手段をさらに備えることを特徴とする、請求項１記載の装置。
上記光環境調節手段を植物体に対して上面及び側面の双方に配置することを特徴とする、請求項１記載の装置。
上記植物体がトマト植物体であることを特徴とする、請求項１記載の装置。
遺伝子組換えトマト植物体を、明期6〜20時間未満、光合成有効光量子束密度に基づく光強度300〜600μmol/m²/s及び炭酸ガス濃度500〜1000ppmの条件下で栽培することを含む、導入遺伝子によりコードされるタンパク質を生産する方法。
上記導入遺伝子がミラクリンをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
請求項１記載の装置において遺伝子組換えトマト植物体を栽培することを特徴とする、請求項５記載の方法。