KR100546066B1

KR100546066B1 - 베타아밀로이드 유전자의 다중 연결체를 발현하는 형질전환 식물 세포 및 이로부터 배양된 식물

Info

Publication number: KR100546066B1
Application number: KR1020030017766A
Authority: KR
Inventors: 김현순; 염정원; 전재흥; 김미선; 묵인희; 정혁
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2006-01-26
Also published as: US20080213340A1; KR20040083194A; US7700837B2; WO2004083417A1

Abstract

본 발명은 인체의 치매를 유발하는 원인 물질로 알려진 베타아밀로이드 플라그를 형성하는 베타아밀로이드 유전자를 발현하는 형질전환 식물 세포, 형질전환 식물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 베타아밀로이드 유전자를 여러개 연결한 다중베타아밀로이드 유전자를 발현하는 형질전환 식물 세포, 상기 세포를 조직배양시켜 제조되는 형질전환 식물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 식물은 다중베타아밀로이드 단백질을 발현하며, 따라서 상기 식물을 인간의 치매를 예방하기 위한 경구용 백신 조성물 등으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

베타아밀로이드 유전자의 다중 연결체를 발현하는 형질전환 식물 세포 및 이로부터 배양된 식물{The transformed plant cell expressing tandem repeats of β-amyloid gene and plant produced by the same}

도 1은 본 발명의 클로닝벡터에 도입된 3-베타아밀로이드와 5-베타아밀로이드 유전자 크기를 보여주는 전기영동 사진이고,

도 2는 도 1에서 확인한 3-베타아밀로이드와 5-베타아밀로이드 유전자를 pMBP 및 pAT 식물발현벡터내로 도입한 pMBPnAβ 및 pATnAβ형질전환용 벡터를 나타낸 개략도이고,

도 3은 아그로박테리아에 의한 접종 후 캘러스에서 유도되어 증식용 배지에서 자라고 있는 형질전환된 감자 식물과 그의 소괴경형성과정(A 내지 C) 및 토마토의 자엽 절편에서 캘러스의 유도 과정 및 형질전환 식물의 배양과정(D 내지 F)을 보여주는 사진이고,

A; 형성된 캘러스에서 재분화하는 감자 소식물

B; 기내 배양기에서 생육되고 있는 재분화된 감자 소식물

C; 기내소괴경 형성이 진행되고 있는 감자

D; 형성된 캘러스에서 소식물이 재분화되고 토마토

E; 기내 배양기에서 생육하고 있는 재분화된 토마토 소식물

F; 기내 소식물을 화분으로 옮겨 심은 후 온실에서 생육하고 있는 토마토 식물

도 4는 pMBP3Aβ벡터(A), pMBP5Aβ벡터(B) 및 pAT5Aβ벡터(C)로 형질전환된 토마토 또는 감자의 재분화 식물에 존재하는 베타아밀로이드 유전자를 중합효소연쇄반응으로 확인한 전기영동 사진이고,

(A) M; 100 bp 크기의 DNA 분자량 마커

N; 음성대조구

C1, C2; 형질전환되지 않은 정상 토마토 식물

레인 1 - 11; 플라스미드 pMBP3Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 토마토 식물

(B) M; 100 bp 크기의 DNA 분자량 마커

N; 형질전환되지 않은 정상 감자 식물

레인 1 - 5; 플라스미드 pMBP5Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자 식물

(C) M; 100 bp 크기의 DNA 분자량 마커

N; 형질전환되지 않은 정상 감자 식물

레인 1 - 14; 플라스미드 pPAT5Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자 식물

도 5는 도 4에서 PCR 검정으로 선별된 형질전환체를 대상으로 다중베타아밀 로이드 유전자의 전사여부를 알아보기 위하여 mRNA의 발현을 노던 블럿으로 확인한 사진이고,

(A) NC; 형질전환되지 않은 정상 토마토 식물

레인 2 - 8; 플라스미드 pMBP3Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 토마토 식물

(B) NC; 형질전환되지 않은 정상 감자 식물

레인 1 - 3; 플라스미드 pMBP5Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자 식물

(C) N; 형질전환되지 않은 정상 감자 식물

레인 1 - 6; 플라스미드 pPAT5Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자 식물

도 6은 pMBP3Aβ를 발현하는 토마토 식물의 잎(A), pMBP5Aβ를 발현하는 형질전환 감자 식물의 잎(B) 및 pAT5Aβ를 발현하는 형질전환된 감자 소괴경(C)에서의 베타아밀로이드 단백질의 발현을 단일항체 4G8을 이용하여 웨스턴 블럿을 한 결과를 보여주는 전기영동 사진이고,

(A) P; 양성대조구로 사용된 베타아밀로이드 펩타이드

NC; 형질전환되지 않은 정상 토마토 식물

레인 1 - 6; 플라스미드 pMBP3Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 토마토 식물

(B) P; 양성대조구로 사용된 베타아밀로이드 펩타이드

NC; 형질전환되지 않은 정상 감자 식물

(C) P; 양성대조구로 사용된 베타아밀로이드 펩타이드

N; 형질전환되지 않은 정상 감자 식물

레인 1 - 5; 플라스미드 pPAT5Aβ가 도입된 각각 다른 클론인 형질전환 감자 식물

도 7은 웨스턴 블럿으로 다중베타아밀로이드 단백질의 발현이 확인된 형질전환 감자와 토마토 식물에서의 항원성 검정을 위한 ELISA 분석 결과를 보여주는 그래프이다.

PC; 양성대조구로 사용된 베타아밀로이드 펩타이드

B; 음성대조구로 사용된 반응 완충액

NC; 형질전환되지 않은 정상 감자 식물

T(M)3-6; 플라스미드 pMBP3Aβ가 도입된 형질전환 토마토 식물 6번

T(M)5-1; 플라스미드 pMBP5Aβ가 도입된 형질전환 감자 식물 1번

T(A)5-1; 플라스미드 pPAT5Aβ가 도입된 형질전환 감자 식물 1번

본 발명은 인체의 알츠하이머성 치매를 일으키는 원인 물질 중의 하나로 알려진 독성 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 형질전환 식물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 치매의 원인물질로 알려진 베타아밀로이드 유전자를 3개 혹은 5개 연결시킨 다중 연결체가 도입된 식물 세포 및 이로부터 유도된 식물에 관한 것이다.

1990년 WHO는 안전하고, 열에 안정하며, 경구 투여가 가능할 뿐만 아니라 보다 광범위하게 보급될 수 있는 백신 개발을 목표로 설정한 바 있다. 또한, 연간 60억 달러 규모의 백신 시장은 2003년경에는 130억 달러 규모에 이를 정도로 계속적인 증가 추세에 있다. 현재의 백신 개발 시스템이 가지고 있는 몇 가지 문제점은 고가의 생산설비, 수송과 저장 시에 요하는 냉장설비의 경제적 부담 및 백신 투여의 어려움, 주사를 맞는 것에 대한 사람들의 보편적인 거부감 등이 있다. 따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하고 예방 접종의 혜택을 거의 누리지 못하고 있는 저개발국의 어린이를 위해서라도 대체백신의 개발이 요구되고 있는 것이 세계적인 추세이다. 이러한 대체백신 개발연구 중에서 형질전환 작물을 통한 경구용 식물백신이 그 가능성을 인정받아 백신개발의 새로운 방향으로 자리 매김을 하고 있다. 경구용 식물백신은 재조합 백신의 안전성과 경구백신의 접종에 있어서의 수월성 및 효율성을 접목시킨 방법으로서 항원유전자를 식물 발현벡터를 이용하여 식물에 형질전환시켜 식품을 섭취하듯이 경구투여를 시행함으로써 면역반응을 유도하게 된다.

인구의 고령화 추세에 따라 65세 이상 노인이 1995년에 전체 인구의 5.7%였고 2001년에 UN이 정의하는 고령화 사회인 7%에 진입하게 된다. 이러한 추세로 볼 때 2020년에는 전체인구의 15%가 노인 인구가 될 것으로 예상되고 있다. 현재 우리나라의 치매환자는 최소 50만명으로 추정되고 매년 신규 발생 환자가 1만 - 2만명 이상이 추가로 발생할 것으로 보고 있으며, 역학 조사에 의하면 2020년에는 15가구당 1명 꼴로 치매환자가 발생할 것으로 내다보고 있다. 이중 알츠하이머성 치매는 전체 치매 환자의 최소 60%로 30만명 정도가 있는 것으로 현재 추정되고 있다. 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매는 퇴행성 신경계 질환으로서, 인지기능 장애 증상으로 시작되어 종국에는 인간 본성이 파괴되는 등 장기간에 걸쳐 진행되는 퇴행성 질환이기 때문에 환자를 수용하는 수동적인 방법으로는 도저히 사회 경제적인 부담을 감당할 수 없으므로 예방제 및 원인 치료제를 개발하는 적극적인 시도가 필요하다.

현재까지 개발되었거나 개발 중인 치매 치료 약들은 대부분 원인 치료가 아닌 초기 증상완화제로서 아세틸콜린성 신경세포의 기능을 돕는 것이 주축을 이룬다. 현재까지의 연구결과들을 종합하여 보면 알츠하이머병의 원인은 독성 단백질인 베타아밀로이드가 뇌에 축적되고 이것 의해 유도되는 신경세포 사멸때문이라고 보고되고 있다(Bacskai BJ et al., 2001, Nature medicine 7:369-372; Schenk D. et al., 1999, Nature 400:173-177). 따라서, 베타아밀로이드의 생성 및 독성 저해를 통해 신경계의 퇴행을 근본적으로 저지하는 물질을 개발하는 것이 알츠하이머 병을 예방하고 나아가서 원인을 치료할 수 있는 효과적인 방법이 될 수 있다.

베타아밀로이드는 APP(amyloid precursor protein)라는 제 1형 막 단백질(type Ⅰ internal membrane protein)에서부터 유래된 단백질 분해효소에 의한 대사산물로서 세포의 도메인과 세포막 도메인으로 이루어져 있는 39개 내지 43개의 펩타이드로 구성되어 있다. 상기 베타아밀로이드는 아밀로이드(amyloidogenic) 대사과정 중에서 베타시크리테아제(β-secretase)와 감마 시크리테아제(γ-secretase)라는 단백질 분해 효소의 작용에 의하여 형성된다. 최근의 연구 보고에 의하면 사람의 베타아밀로이드가 발현되어 알츠하이머성 치매가 유발된 형질전환 쥐에 베타아밀로이드를 백신으로 투여한 결과 뇌내에 축적되어진 플라그가 없어지면서 행동장애 현상이 완화되는 현상을 나타내었다고 한다(Chen G. et al., 2000, Nature 408: 975-979; Janus C. et al., 2000, Nature 408:979-982; Morgan D. et al., 2000, Nature 408:982-985).

현재까지 우리나라 뿐만 아니라 전 세계적으로 사람의 베타아밀로이드 유전자를 식물에서 발현시키고자 하는 시도는 없었으며, 상기 유전자가 도입되어 발현된 형질전환 식물을 베타아밀로이드 플라그를 제거하기 위한 백신으로 사용하고자 하는 목적에 대한 보고 역시 아직까지 전무한 상태이다.

한편, 감자는 그 자체가 완벽한 영양조성을 지닌 세계 4대 주식작물로서 극 한, 극서지방을 제외한 세계 도처에서 재배되어 수많은 인류를 먹여 살리고 있는 작물이기 때문에 성공적인 감자백신이 개발된다면 이는 자연스럽게 세계 전역의 감자 지역으로 전파되어 막대한 수요가 전 세계적으로 창출될 수 있다.

또한, 토마토는 맛과 향이 좋아 전 세계적으로 재배, 소비되고 있으며 식물경구백신의 가장 큰 장점 중의 하나인 생식으로 섭취할 수 있다는 장점이 있어 이미 많은 연구자들에 의해 대상 작물로 선택되어 진 바 있다. 상기 두 종류의 작물은 같은 가지과 작물로서 형질전환이 용이하며 도입된 외부유전자의 발현이 안정적으로 이루어진다는 보고가 다른 유용 유전자의 도입 실험에서 증명된 바 있다. (Chong D.K.X. et al., 1997, Transgenic Res. 6:289-296; Sandhu J.S. et al., 2000, Transgenic Res. 9:127-135)

이에, 본 발명자들은 인체의 알츠하이머성 치매의 예방 및 치료를 목적으로 하는 식물경구백신으로의 사용을 궁극적 목표로 하는 베타아밀로이드 유전자 발현 감자 및 토마토를 개발하기 위하여, 다중베타아밀로이드 유전자를 포함하는 형질전환용 발현벡터 플라스미드를 이용하여 아그로박테리아에 다중베타아밀로이드 유전자를 도입하고, 이를 감자의 잎 또는 토마토의 자엽 조직과 공동 배양하여 다중베타아밀로이드 유전자를 대량 발현하는 감자 및 토마토 식물을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인체의 알츠하이머성 치매의 원인 물질 중의 하나인 베타 아밀로이드 플라그를 만드는 베타아밀로이드 유전자를 발현하는 형질전환 식물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 식물을 유효성분으로 함유하는 경구용 알츠하이머성 치매 예방 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람의 알츠하이머성 치매를 일으키는 원인 물질 중의 하나인 독성 단백질 베타아밀로이드의 유전자를 발현하는 형질전환 식물 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물 세포를 조직배양 방법으로 재분화시켜 제조되는 형질전환 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ⅰ) 베타아밀로이드 다중연결체를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 및 ⅲ) 상기 아그로박테리움과 식물 세포를 공동배양하여 상기 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 상기 형질전환 식물 세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물 세포를 재분화시키는 단계를 포함하는 상기의 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 형질전환된 식물을 유효성분으로 함유하는 경구용 치매 예방 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "기내배양"이란 무균상태의 배양조건이 갖추어진 배양용기내에 서 식물을 배양하는 것을 의미하고, "소괴경"은 앞의 기내배양을 이용하여 감자의 괴경을 콩알크기만큼 축소된 감자의 기내괴경을 일컫는 말이고, "치상"은 식물을 기내배양으로 옮겨놓거나 두는 것을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인체의 알츠하이머성 치매를 유발하는 독성 단백질인 베타아밀로이드 유전자의 다중연결체를 생산하는 형질전환 식물 세포를 제공한다.

상기에서, 식물은 감자 또는 토마토와 같은 가지과 식물인 것이 바람직하며 형질전환은 상기 세포내로 아그로박테리움의 도입을 통하여 이루어지는 것이 바람직하다. 상기에서 아그로박테리움의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LB4404인 것이 더욱 바람직하다. 또한 상기 아그로박테리움에 다중베타아밀로이드 유전자를 도입하기 위한 발현벡터로 카나마이신 저항성 유전자, CaMV35 프로모터와 감자의 파타틴(patatin) 프로모터 등으로 구성된 발현 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하나(도 2 참조), 반드시 여기에 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 다중베타아밀로이드를 생산하는 감자 및 토마토 식물을 제조하기 위하여, 다중베타아밀로이드 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현 플라스미드를 이용하여 아그로박테리아에 다중베타아밀로이드 유전자 를 도입하고, 이를 기내 배양하고 있는 감자 식물의 잎 절편과 발아된지 일주일 정도 지난 토마토의 유묘에서 자엽 절편과 공동배양하여 형질전환된 식물을 얻었다. 상기 식물 조직과의 공동 배양 과정에 있어서, 잎 절편을 칼로 절단하여 상처를 낸 다음 상처 부위에서 형성된 캘러스에서 기관을 분화시키는 과정을 수행하여 식물을 재분화시켰다(도 3 참조). 형질전환된 재분화 개체는 각각의 식물에 알맞는 조직배양 방법에 의하여 번식시키며, 특히 감자의 경우 소괴경 형성은 9% 이상의 고농도의 당이 첨가된 배양조건에서 대량으로 유도하는 조건으로 실시한다. 상기 다중베타아밀로이드 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 아그로박테리움 균주는 모두 본 발명의 범위에 포함되며, 상기 발현벡터와 아그로박테리움 균주는 실시예에서 제시된 감자 및 토마토 이외 다양한 작물에도 응용이 가능하다. 즉, 상기 다중베타아밀로이드를 발현하는 식물세포에 특별히 제한이 있는 것은 아니며, 식용 가능한 작물인 것이 바람직하고, 특히 우리나라 전역에서 재배 가능한 감자, 토마토, 상추 등과 같이 사람들이 쉽게 접할 수 있는 것을 선택하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서는 치매 환자의 뇌에서 분리한 APP(amyloid precursor protein) 유전자로부터 40개 내지 42개의 펩타이드로 이루어진 베타아밀로이드의 양방향 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 실시한 다음 베타아밀로이드 cDNA를 얻었다. 약 120 bp 정도되는 단일 베타아밀로이드 유전자는 식물 내에서의 발현을 검출하기가 쉽지 않기 때문에, 본 발명에서는 식물내에서 베타아밀로이드의 발현양을 높이기 위하여 단일의 베타아밀로이드를 직렬 형태로 3개 또는 5개로 연결시켰다. 상기 다중베타아밀로이드 유전자를 클로닝 벡터내로 도입시킨 후 염기서열 확인 작업을 통하여 3개 또는 5개의 다중베타아밀로이드를 연결하는 작업 후에도 전체 염기가 보존됨을 확인하였다(도 1 참조).

본 발명자들은 상기 다중베타아밀로이드 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 2003년 3월 10일자로 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC 10444BP로 기탁하였다.

상기에서, 식물은 감자 또는 토마토인 것이 바람직하며, 상기 재분화는 그 방법에 있어서 특별히 제한되는 것은 아니나 조직배양으로 캘러스를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어지는 것이 바람직하다.

상기 다중베타아밀로이드 유전자가 도입된 아그로박테리움을 조직배양 중의 감자 세포 및 토마토 세포로 구성된 절단된 조직과 공동배양시킴으로써 상기 감자 식물을 형질전환시킬 수 있으며, 상기 형질전환된 식물은 재분화 과정 중에 다중베타아밀로이드를 발현한다. 본 발명의 실시예를 통하여 제조된 형질전환된 감자를 분석한 결과, 웨스턴 블럿 및 ELISA 분석(도 6 및 도 7 참조)으로 다중베타아밀로이드 유전자의 발현됨을 확인할 수 있었으며, 궁극적으로 치매에 대한 백신 기능을 할 수 있는 감자 및 토마토를 개발하였다.

또한, 본 발명은 ⅰ) 치매 유발물질인 베타아밀로이드의 다중 연결체를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 및 ⅲ) 상기 아그로박테리움과 식물 세포를 공동배양하여 상기 세포들을 형질전환시키는 단계를 포함하는 상기 형질전환 식물 세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에서는 인체의 치매를 유발하는 베타아밀로이드의 다중 연결체 유전자를 감자 및 토마토에 도입하여 그의 발현을 유도하였다. 즉, 3개 또는 5개의 다중연결된 베타아밀로이드 유전자를 CaMV35S(콜리플라워 모자이크 바이러스 35S) 프로모터 또는 감자의 파타틴(patatin) 프로모터 등으로 구성된 발현벡터(도 2 참조)를 이용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주에 도입하였으며, 발현벡터가 도입된 상기 균주를 사용하여 감자 및 토마토 세포를 형질전환시켰다.

보다 구체적으로, 발현벡터가 도입된 균주의 제작과정을 살펴보면 다음과 같다. 3개 또는 5개의 베타아밀로이드 유전자를 연결하여 클로닝한 후, 상기의 유전자를 각각 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고 CaMV35S 프로모터를 이용하는 pMBPnAβ벡터 또는 감자의 괴경에 특이적으로 발현하는 파타틴 단백질의 프로모터를 이용하는 pATnAβ벡터와 같은 식물 형질전환용 발현벡터에 도입한 후에, 상기 벡터를 각각 아그로박테리움 튜메파이신스 LB4404 균주에 삽입시켰다. 이때, 다중베타아밀로이드 유전자의 전체 염기가 상기 발현벡터로 도입되어 보존됨을 PCR을 통해 확인하였다. 상기 균주를 감자 및 토마토 세포와 공동배양함으로써 형질전환 감자 및 토마토 세포를 제조하였다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기의 형질전환 감자 및 토마토 세포의 제조와 함께, 상기 균주를 감자 및 토마토 세포로 이루어진 잎 절편과 공동배양함으로써 형질전환된 감자 및 토마토 식물을 제조하였다.

보다 구체적으로, 감자 식물에 도입하기 위하여 기내배양으로 유지하고 있던 감자의 줄기에서 잎의 주령이 1주일 이하된 어린 잎을 상처 면이 많게 절단한 뒤 아그로박테리아 배양액에 침지시킨 다음 공동 배양하고, 캘러스 유도 배지로 옮겨서 배양하여 캘러스의 형성을 유도했다. 또한 토마토의 경우 기내에서 발아시켜 발아된 지 1주일 정도 된 자엽을 절단하여 아그로박테리아 배양액에 침지시킨 다음 공동 배양하고, 캘러스 유도 배지로 옮겨서 배양하여 캘러스의 형성을 유도했다.

상기 형질전환된 감자와 토마토 캘러들로부터 소식물을 얻고, 얻어진 소식물을 약 4주일 정도 증식시킨 다음, 감자는 소괴경 형성을 위해 9% 이상의 고농도 당배지에서 두 달 가량 배양하여 약 1g 정도의 소괴경을 얻었다. 반면, 토마토는 온실로 옮겨 주어 큰 식물로 생장시켰다.

본 발명자들은 상기 형질전환된 감자와 토마토에 도입된 다중베타아밀로이드 유전자를 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction) 등으로 확인하였 다(도 4 참조). 또한 형질전환 감자에서 총 RNA을 추출하여 베타아밀로이드에 특이적인 전사체의 발현을 확인하기 위하여 노던 블럿을 실시하여 확인하였다(도 5 참조). 식물에서의 다중베타아밀로이드 단백질의 발현은 웨스턴 블럿과 ELISA 분석을 하여 알아보았다. 그 결과 파타틴(patatin) 프로모터에 연결하여 5-베타아밀로이드 유전자를 도입한 식물, CaMV35S 프로모터에 5-베타아밀로이드를 연결한 유전자를 도입한 감자형질전환체, 3-베타아밀로이드가 CaMV35S 프로모터에 연결된 토마토 형질전환개체들에서 정상 식물에서 보이지 않는 단백질 발현을 확인할 수 있었으며, 이는 다중베타아밀로이드 유전자의 도입에 의해 특이적으로 나타나는 것이었다.

또한, 본 발명은 상기의 형질전환 식물을 유효성분으로 함유하는 경구용 치매 예방 백신 조성물을 제공한다.

상기에서, 식물은 감자 또는 토마토인 것이 바람직하며, 상기 조성물은 형질전환 식물 그대로 사용하거나 건조시킨 후 분말 형태로 사용할 수 있으며, 또한 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분으로서 식물의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 유효성분인 식물은 통상 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 특정한 최대 허용범위가 없이 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 조성물을 포함하는 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 식물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 반드시 이에 한정되지 않음은 당업자에게 있어서 자명하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 식물의 배양

<1-1> 감자의 배양

본 발명에 사용한 감자 식물은 각종 병원균과 바이러스가 없는 감자 품종 데지레 씨감자(Solamum tuberosum cv. Desiree)에서 싹을 틔운 뒤 생장점을 포함하여 가능한 작게 절단한 후 70% 에탄올로 표면살균하여 조직배양으로 유지하였다. 표면살균된 감자를 증류수로 세척한 다음 10% 소듐하이포클로라이드(sodium hypochloride) 용액에서 10분 동안 살균처리 한 후 증류수로 3번 헹구어 물기를 제거하였고 MS 염(Duchefa co., Cat. No. M0221)에 서당(sucrose)을 3% 첨가한 기본배지에 치상하여 줄기의 생장을 유도하였다. 배양기내에서 줄기의 생육이 왕성하게 이루어 진 다음 2주일 간격으로 계대배양하는 방식으로 감자 식물의 조직배양을 유지하였다. 기내소괴경 형성용 배지는 MS 기본배지에 90 g/L의 서당을 첨가한 것 을 사용하였으며 배양환경은 8시간의 광주기와 17℃의 배양온도에서 감자 식물 조직을 배양하였다. 기내소괴경 형성은 증식용 배양조건에서 2내지 3주 정도 자란 감자줄기의 아랫부분을 치상하였으며, 치상 후 약 2주일부터 저장줄기가 부풀어 오르기 시작하며 8주 정도가 지나면 1g 이상의 성숙된 소괴경을 얻을 수 있었다.

생겨난 지 1주일 정도 된 잎을 절단하여 형질전환을 위한 아그로박테리아와의 공동배양에 사용하였다. 캘러스 형성을 위해 사용한 배지는 MS 배지에 3%의 서당, 8% 한천 그리고 2.0 mg/L 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)(Sigma co., Cat No. D08407)를 첨가하고 배지의 수소이온농도는 5.8로 조정하였다. 상기의 형질전환된 잎 절편을 이틀 동안 2,4-D가 들어있는 캘러스 유도 배지에서 배양 한 다음 0.01 mg/L NAA(Sigma co., Cat No. N-0375), 0.1 mg/L GA₃(Sigma co., Cat No. G7645) 및 2.0 mg/L Zeatin(Duchefa co., Cat No. Z0917)이 들어 있는 재분화 배지로 옮겨주었다. 옮겨준 지 1주일 만에 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고 4주 경과 후부터 소식물이 출현하였다. 상기 소식물을 분리가 가능할 정도까지 배양한 다음 MS 기본 배지로 옮겨 주어 정상 식물과 동일한 과정으로 증식시키면서 소괴경 형성을 유도하였다.

<1-2> 토마토의 배양

재배용 토마토인 도태랑 품종의 토마토 씨앗을 먼저 70% 에탄올로 가볍게 표면살균하여 증류수로 헹군 다음, 10% 소듐하이포클로라이드 용액에서 10분 동안 살균처리 한 후 증류수로 3번 헹구어 물기를 제거하고 MS 염에 서당을 3% 첨가한 기본배지에 치상하여 발아를 유도하였다. 발아한 지 1주일 정도 지나면 자엽이 전개되는데 이를 절단하여 형질전환을 위한 아그로박테리아와의 공동배양에 사용하였다. 캘러스 형성을 위해 사용한 배지는 MS 배지에 3%의 서당, 8% 한천 그리고 1.0 mg/L Zeatin을 첨가하고 배지의 수소이온농도는 5.8로 조정하였다. 상기의 과정으로 형성된 자엽 절편은 상기 실시예 <1-1>에서와 동일한 캘러스 유도 배지에서 배양 한 다음 2.0 mg/L Zeatin이 들어 있는 재분화 배지로 옮겨주었다. 옮겨준 지 1주일 만에 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스의 형성이 시작되었고 4주 경과 후부터 소식물이 출현하였다.

<실시예 2> 감자 및 토마토 잎 절편으로 다중베타아밀로이드 유전자를 도입

<2-1> 식물 형질전환용 플라스미드의 제조

본 발명의 감자 및 토마토를 형질전환 시키기 위한 플라스미드 pMBP3Aβ, pMBP5Aβ및 pAT5Aβ(도 2 참조)를 제조하였다. 상기 벡터는 인간의 베타아밀로이드 유전자의 3개 연결체(3-베타아밀로이드)와 5개 연결체(5-베타아밀로이드)를 CaMV35S 프로모터에 연결한 것(pMBP3Aβ, pMBP5Aβ)과 감자 괴경 특이적 발현 프로모터인 파타틴(patatin) 프로모터에 연결한 구조(pAT5Aβ)를 가진다. 본 발명에서는 pBI121 벡터(Clontech co., Cat. No. 6018-1)에서 GUS 유전자가 제거하여 만든 식물 형질전환용 벡터 pMBP1를 BamHⅠ으로 절단한 뒤 CaMV35S 프로모터와 nos 터미네이터 사이에 각각 서열번호 1로 기재되는 3-베타아밀로이드 유전자와 서열번호 2 로 기재되는 5-베타아밀로이드 유전자를 삽입시켰다. 반면, 파타틴 프로모터는 리우 등이 보고한(Liu et al., Plant Mol Biol 17: 1139-1154, 1991) 염기서열을 바탕으로 하여 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 제작한 후 PCR을 수행하여 클로닝에 이용하였다. PCR로 증폭시킨 파타틴 프로모터를 pBI121 벡터의 CaMV35S 프로모터에 대체하여 만든 식물 형질전환용 pATGUS 벡터에서 KpnⅠ과 SacⅠ제한효소로 GUS 유전자를 잘라내고 서열번호 2로 기재되는 5-베타아밀로이드 유전자를 삽입시켜 pAT5Aβ 벡터를 제작하였다. 상기 벡터들은 선발표지로서 카나마이신 저항성 유전자인 nptⅡ를 가지고 있다. 이렇게 제작된 각 벡터의 플라스미드 DNA를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)(Gibco BRL co., Cat. no.18313-015)로 도입하고 식물의 형질전환에 사용하였다.

<2-2> 식물에 아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 형질전환

감자와 토마토의 잎 절편으로 다중베타아밀로이드 유전자를 도입시키기 위하여, 실시예 1에서 제조된 감자 줄기를 배양시킨 후 7일이 지나지 않은 잎들 및 발아된 지 일주일 정도 지난 토마토의 자엽 약 100여개를 선별하여 아그로박테리아 투메파시엔스 LBA 4404(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)(Gibco BRL, Cat. No. 18313-015) 배양액에 10분 동안 침지시킨 다음, 멸균된 페이퍼 위에서 수분을 완전히 제거하고 감자 잎은 2.0 mg/L 2,4-D가 들어있는 공동배양 배지에, 토마토의 자엽 절편은 1.0 mg/L Zeatin이 들어 있는 공동배양 배지에 치상하여 이틀동안 배양 하였다. 상기 과정은 잎 절편의 상처부위로부터 캘러스 유도를 잘 하기 위한 것이며, 이 때 카나마이신과 같은 항생제는 첨가하지 않아야 아그로박테리아 균이 식물 유전자 내로 삽입될 기회를 높여 주게 된다. 상처 부위로부터 캘러스의 형성이 유도될 무렵 감자 잎 절편은 0.01 mg/L NAA(α-NaphthaleneAcetic Acid), 0.1 mg/L GA₃₍gibberellin)및 2.0 mg/L Zeatin이 함유된 MS 배지(Duchefa co., Cat. No. M0221)로 옮겨 소식물의 재분화를 유도하였고, 토마토의 자엽 절편은 2.0 mg/L Zeatin이 들어 있는 MS 배지(Duchefa co., Cat. No. M0221)로 옮겨주었다. 이 때 카나마이신 100 mg/L을 첨가하여 형질전환된 식물만이 재분화되도록 선발압력을 가하였고, 잎 절편에 묻어 있거나 식물내로 도입되지 않고 남아있는 아그로박테리아을 제거하기 위하여 카베니실린(Duchefa co., C0109) 1,000 mg/L을 배양배지에 첨가하였다. 형질전환된 소식물이 재분화되는 기간동안 약 2주 간격으로 새로운 배지로 옮겨 주었다.

상기 형질전환된 잎 절편을 2주 간격으로 동일 선발배지로 계대배양하였고, 배양 8주가 경과된 후에 약 50개체의 소식물을 얻을 수 있었다. 기내배양에서 키운 식물을 정상식물과 비교하였을 때 비정상적인 형태는 관찰되지 않았으며, 감자는 소괴경형성용 배지로 옮겨 생육을 관찰한 결과 정상적인 감자 소괴경까지 수확할 수 있었다. 토마토는 기내 소식물을 화분으로 옮겨 생육을 관찰한 결과 정상적인 개체로 생장함을 확인하였다(도 3). 상기의 결과로부터, 다중베타아밀로이드 유전자가 감자 및 토마토 식물에 안정적으로 도입되어 정상적인 식물로 생육됨을 확인하였다.

<실시예 3> PCR 분석에 의한 다중베타아밀로이드 유전자의 도입 확인

다중베타아밀로이드 유전자가 식물내로 도입된 것을 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하였다. 구체적으로, 카나마이신이 함유된 배지에서 선발된 소식물의 잎 절편으로부터 염색체 DNA를 분리한 후 서열번호 5로 기재되는 정방향 프라이머와 서열번호 6로 기재되는 역방향 프라이머를 이용하여 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 2분간 변성시키고, 94℃에서 45초, 65℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 순서로 20회 반응을 반복한 다음 마지막 반응에서 72℃에서 5분간 반응시킴으로서 상기 반응을 종료시켰다. 아가로스 젤에서 반응액을 확인해 본 결과 0.75 kb의 5-베타아밀로이드의 DNA 밴드와 0.4 kb 3-베타아밀로이드 DNA 밴드를 확인하였다(도 1 및 도 4). 상기 결과로부터, 형질전환된 감자와 토마토 식물에서 선발표식인자인 NPTⅡ 유전자의 존재를 항생제 선발배지 선별을 통해 간접적으로 알 수 있었고 다중베타아밀로이드 유전자가 감자와 토마토 내에 존재하고 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 형질전환된 감자 및 토마토 식물에서의 다중베타아밀로이드의 전사체 분석

상기 감자 및 토마토의 형질전환체에서 RNA의 발현여부를 먼저 관찰하여 개체의 확실한 선발효과를 가지고자 하였다. pMBP5Aβ를 포함하는 형질전환체 감자 의 잎과 신초부분을 포함하여 1g 정도를 채취하여 총 RNA를 추출하였고, pAT5Aβ를 포함하는 형질전환체 감자는 형성된 소괴경 1g을 취하여 총 RNA를 추출하였다. pMBP3Aβ를 포함하는 토마토 형질전환체는 잎과 신초 부분을 포함하여 1g을 취한 후 RNA 분석에 사용하였다. 정제된 RNA를 정량한 뒤 30㎍을 19.8%의 포름알데하이드가 함유된 1% 아가로스 젤에 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤은 특별한 전처리 없이 젤 상의 RNA를 나일론 막으로 전이시켰다. 전이된 RNA를 나일론 막에 고정시키기 위하여 1200 ×μJ/㎠의 강도로 자외선 조사를 2회 실시하였다. RNA가 고정되어 있는 나일론 막에서 베타아밀로이드에 특이적인 RNA 밴드를 육안으로 확인하기 위하여, 먼저 DIG 표지가 부착되어 있는 탐침을 50℃에서 16시간 동안 나일론 막에 붙이고 DIG을 검출할 수 있는 진단키트(Boeringer Mannheim co., cat no. 1093 657)를 이용하여 베타아밀로이드에 특이적인 RNA 밴드를 가시화하였다. 그 결과, 선발된 감자 형질전환체 5개체, 토마토 형질전환체 7개체에서 다중연결체 베타아밀로이드의 특이적인 전사체를 확인하였다(도 5).

<실시예 5> 다중베타아밀로이드 단백질의 발현 분석

형질전환 감자와 토마토 식물에서 발현하는 다중베타아밀로이드 단백질을 웨스턴 블럿으로 분석하였다(도 6). pMBP5Aβ를 발현하는 독립적인 4개의 형질전환 감자 잎에서 단백질을 추출하였고, pAT5Aβ를 발현하는 독립적인 5개의 형질전환 감자 소괴경에서 단백질을 추출하였다. 또한, pMBP3Aβ를 발현하는 독립적인 6개체의 형질전환 토마토의 잎에서 단백질을 각각 추출하였다. 사용한 추출버퍼는 PBS 버퍼(pH7.2), 10 mM EDTA, 1 mM 프로티나제 억제 칵테일(proteinase inhibitor cocktail)(Roche co., cat no. 1873580), 0.1% 트리톤 X-100, 5 mM β-머캅토에탄올의 혼합물을 시료 무게의 절반 부피로 계산하여 첨가하였고, 이 때 모든 추출 조건을 4℃ 전후로 조절하였으며 신속한 추출이 이루어지도록 하였다.

그 결과, pMBP5Aβ 발현 형질전환 감자의 경우 3개체(pMBP5Aβ-1, 5, 6번 개체)와 pAT5Aβ 발현 형질전환 감자의 경우 2개체(pAT5Aβ-1, 3번 개체)에서 보다 뚜렷한 20 kDa의 특이적인 단백질 밴드를 확인하였다. pMBP3Aβ를 발현하는 형질전환 토마토는 4개체들(pMBP3Aβ-6, 8, 13, 23번 개체)에서 약 12 kDa에 이르는 특이적인 단백질 발현 밴드를 확인하였다. 상기 모든 베타아밀로이드 특이적인 밴드는 정상 식물인 대조구에서는 관찰되지 않았으며, 서열번호 6으로 기재되며 42개의 펩타이드 서열을 가지는 베타아밀로이드는 4 kDa에서 뚜렷한 발현 밴드를 보임으로서 모든 실험의 반응이 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다.

동일한 방법으로 추출한 형질전환 감자와 토마토의 단백질로 샌드위치면역활성측정(Enzyme-linked Immunogy Sandwich Assay, 약칭 ELISA)을 수행하여 식물 발현 단백질의 항원력을 확인하였다. 각 벡터별로 단백질의 발현율이 가장 높은 것으로 판단되는 토마토의 pMBP3Aβ-6번 개체, 감자 형질전환체 pMBP5Aβ-1번 개체 및 pAT5Aβ-1번 개체를 대상으로 분석을 실시하였다.

그 결과, 대조구로 사용한 베타아밀로이드 펩타이드는 흡광도가 0.967에 이르렀으며 형질전환되지 않은 대조 식물에서는 0.087의 값을 보였다. 또한,토마토 pMBP3Aβ-6 개체의 흡광도는 0.172, 감자 pMBP5Aβ-1은 0.120, pAT5Aβ-1은 0.251을 나타내었다. 몇 차례의 반복 실험을 통해 이들 개체들의 값이 대조식물구에 비해 2-3배 정도 높은 값을 보이는 것을 확인하였다(도 7).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 인체의 알츠하이머성 치매를 유발하는 원인 물질인 독성 단백질 베타아밀로이드 유전자의 다중연결체를 감자와 토마토 식물내로 도입시켰고 이들 단백질을 과발현하는 형질전환 식물을 개발하였다. 이러한 식물의 개발은 우리가 일반적으로 쉽게 접할 수 있는 식품인 감자나 토마토를 먹음으로써 치매를 예방, 치료할 수 있는 식물경구백신 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> The transformed plant cell expressing tandem repeats of beta-amyloid gene and plant produced by the same <130> 3p-02-26B <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggatgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc 60 tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt 120 gtcatagcgc agatgctgga tgcagaattc cgacatgact caggatatga agttcatcat 180 caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc 240 atggtgggcg gtgttgtcat agcgcagatg ctggatgcag aattccgaca tgactcagga 300 tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt 360 gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt ga 402 <210> 2 <211> 672 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggatgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc 60 tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt 120 gtcatagcgc anatgctgga tgcagaattc cgacatgact cangatatga agttcatcat 180 caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc 240 atggtgggcg gtgttgtcat agcgcanatg ctggatgcag aattccgaca tgactcanga 300 tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc tttgcanaag atgtgggttc aaacaaaggt 360 gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgc atatgctgga tgcagaattc 420 cgacatgact cangatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg 480 ggttcaaaca aaggggcaat cattggactc atggtgggcg gggttgtcat agcgcatatg 540 ctggatgcag aattccgaca tgactcanga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc 600 tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggg gcaatcattg gactcatggt gggcggggtt 660 gtcatagcgt ga 672 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of patatin promoter <400> 3 ggatccccca tactttgagt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of patatin promoter <400> 4 ggtacccaaa ttttgttggt g 21 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of beta-amyloid <400> 5 ggtaccggat ccgccatgga tgcagaa 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of beta-amyloid <400> 6 gagctcggat ccaactcacg ctatgac 27

Claims

베타아밀로이드 유전자를 발현하는 형질전환 가지과 식물 세포.
제 1항에 있어서, 상기 식물은 감자 또는 토마토인 것을 특징으로 하는 형질전환 가지과 식물 세포.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 베타아밀로이드 유전자가 3개 또는 5개 다중 연결된 것을 특징으로 하는 형질전환 가지과 식물 세포.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 형질전환은 상기 세포내로 베타아밀로이드 유전자를 포함하는 벡터의 도입을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 가지과 식물 세포.
베타아밀로이드 유전자가 도입된 아그로박테리움 투메파시스(Agrobacterium tumefaciens)LB4404(수탁번호: KCTC 10444BP).
제 1항의 형질전환 식물 세포를 조직배양 방법으로 재분화시켜 제조되는 형질전환 가지과 식물.
제 6항에 있어서, 상기 식물은 감자 또는 토마토인 것을 특징으로 하는 형질전환 가지과 식물.
제 7항에 있어서, 상기 재분화는 조직배양으로 캘러스를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 가지과 식물.
제 1항의 형질전환 식물 세포를 조직배양으로 재분화시키는 단계를 포함하는 제 6항의 형질전환 가지과 식물의 제조 방법.
제 6항의 형질전환 가지과 식물을 유효성분으로 함유하는 경구용 치매 예방 백신 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 가지과 식물은 감자 또는 토마토인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.