JPH11341929A - ス―パ―オキシドジスムタ―ゼを大量生産する形質転換されたきゅうりの製造方法 - Google Patents
ス―パ―オキシドジスムタ―ゼを大量生産する形質転換されたきゅうりの製造方法Info
- Publication number
- JPH11341929A JPH11341929A JP11105933A JP10593399A JPH11341929A JP H11341929 A JPH11341929 A JP H11341929A JP 11105933 A JP11105933 A JP 11105933A JP 10593399 A JP10593399 A JP 10593399A JP H11341929 A JPH11341929 A JP H11341929A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- transformed
- gene
- producing
- hypocotyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8235—Fruit-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8277—Phosphinotricin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Botany (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明はスーパーオキシドジスムターゼ（superoxide d
ismutase、SOD ）を大量生産する形質転換された植物体
及びその製造方法に関するものとして、より詳しくはき
ゅうり果実で優勢的に発現する遺伝子プロモーターであ
るアスコルベートオキシダーゼプロモーター（ascorbat
e oxidase promoter：ASO プロモーター）、マニホット
培養細胞から分離したSOD 遺伝子及び除草剤耐性bar 遺
伝子を含む植物形質転換用発現プラスミドを用いてアグ
ロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これを植物組織と
共同培養して得た高い抗酸化活性を有する植物体及びそ
の製造方法に関するものである。本発明は組織培養過程
で下胚軸切断面から不定芽を誘導させたあと、植物体を
再分化させるものとしてこの過程で得たきゅうりは従来
の品種よりずっと高いSOD 含有きゅうり果実を開発する
ことができるし、皮膚マッサージパックを含んだ化粧品
の材料、機能性食品の添加剤、医薬品ばかりでなく、除
草剤耐性植物体及び環境ストレス耐性植物体として有用
に使用され得る。
ismutase、SOD ）を大量生産する形質転換された植物体
及びその製造方法に関するものとして、より詳しくはき
ゅうり果実で優勢的に発現する遺伝子プロモーターであ
るアスコルベートオキシダーゼプロモーター（ascorbat
e oxidase promoter：ASO プロモーター）、マニホット
培養細胞から分離したSOD 遺伝子及び除草剤耐性bar 遺
伝子を含む植物形質転換用発現プラスミドを用いてアグ
ロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これを植物組織と
共同培養して得た高い抗酸化活性を有する植物体及びそ
の製造方法に関するものである。本発明は組織培養過程
で下胚軸切断面から不定芽を誘導させたあと、植物体を
再分化させるものとしてこの過程で得たきゅうりは従来
の品種よりずっと高いSOD 含有きゅうり果実を開発する
ことができるし、皮膚マッサージパックを含んだ化粧品
の材料、機能性食品の添加剤、医薬品ばかりでなく、除
草剤耐性植物体及び環境ストレス耐性植物体として有用
に使用され得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はスーパーオキシドジ
スムターゼ（superoxide dismutase、以下「SOD」と略
す）を大量生産する形質転換された植物体及びその製造
方法に関するものである。より詳しくはきゅうり果実に
優勢に発現する遺伝子プロモーターであるアスコルベー
トオキシダーゼプロモーター（ascorbate oxidase prom
oter；以下［ASO プロモーター］と略す）にマニホット
培養細胞から分離されたSOD 遺伝子と除草剤（Basta ）
耐性bar 遺伝子を含む植物形質転換用発現プラスミドを
用いてアグロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これを
植物組織と共同培養して得た植物体及びその製造方法に
関するものとして、本発明のきゅうりは皮膚マッサージ
パックを含んだ化粧品の材料、機能性食品の添加剤、医
薬品ばかりでなく除草剤耐性植物体及び環境ストレス耐
性植物体として有用に使用され得る。
スムターゼ（superoxide dismutase、以下「SOD」と略
す）を大量生産する形質転換された植物体及びその製造
方法に関するものである。より詳しくはきゅうり果実に
優勢に発現する遺伝子プロモーターであるアスコルベー
トオキシダーゼプロモーター（ascorbate oxidase prom
oter；以下［ASO プロモーター］と略す）にマニホット
培養細胞から分離されたSOD 遺伝子と除草剤（Basta ）
耐性bar 遺伝子を含む植物形質転換用発現プラスミドを
用いてアグロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これを
植物組織と共同培養して得た植物体及びその製造方法に
関するものとして、本発明のきゅうりは皮膚マッサージ
パックを含んだ化粧品の材料、機能性食品の添加剤、医
薬品ばかりでなく除草剤耐性植物体及び環境ストレス耐
性植物体として有用に使用され得る。
【０００２】
【従来の技術】植物を含んだ大部分の生物は病菌、害
虫、ビールスなどの生物学的ストレスばかりでなく、地
球環境悪化により生じる各種環境ストレスを受けると生
命維持に必要な必須元素である酸素がスーパーオキシド
陰イオンラジカル、過酸化水素、水酸化ラジカルなどの
活性酸素種（active oxygen species ）に変わることに
なる。これら活性酸素は反応性が高くて深刻な生理的障
害を誘発するが、スーパーオキシド陰イオンラジカル
（superoxide anion radical、・O2）は酸素分子が電子
と反応（２O2＋２e →２・O2）して生じるし、過酸化水
素は鉄存在下で一番毒性の高い活性酸素種である水酸基
ラジカル（hydroxyl radical、・OH）を生成する。生体
内には、このような活性酸素を除去するシステムとして
スーパーオキシドジスムターゼ、パルオキシダ−ゼ（pe
roxidase）、カタラ−ゼ（catalase）などの高分子抗酸
化酵素とビタミンC 、ビタミンE 、グルタチオン（glut
athion）などの抗酸化物質などが多く存在することにな
る。SOD はほとんどの生物に存在し、スーパーオキシド
陰イオンラジカルを除去する酵素である（２・O2 - ＋２
H +→H2O2＋O2）。SOD の作用で生成された過酸化水素
はパルオキシダーゼまたはカタラーゼなどにより毒性の
ない水（H2O ）に変換される。したがって、SOD はスー
パーオキシド陰イオンラジカルを除去し水酸基ラジカル
の生成も予防する作用をするので生体防御機構に主要な
役目をする。前記した通りSOD は環境ストレスにより生
成される生体内活性酸素種を除去する環境耐性因子とし
て重要であり、医薬品、食品、化粧品などに利用できる
可能性が提示されている。また、環境ストレスに強いSO
D の遺伝子を含んだ形質転換された植物体はオゾン、低
温、除草剤などの環境ストレスに強い環境耐性植物に開
発することができる（Plant Physiology、１０、１０４
９−１０５４、１９５５；米国特許５５３８８７８）。
SOD の医薬的用途としては抗炎症剤として関節炎、リュ
マチスなどに有効であるものとして報告されており、虚
血性心疾患、放射線障害防止などに効果のあるものと認
められたことがあるし、最近には紫外線による被害を受
けた皮膚にSODをつける場合、皮膚の表皮内にSOD が浸
透され損傷を受けた皮膚が回復されることに関する研究
も報告されたことがある（Experimental Dermatology、
６、１１６−１２１、１９９７）。このような研究結果
に力づけられてSOD を有効成分とする医薬品の開発が米
国、日本などの地の製薬会社で活発に進められている
し、韓国内においても老化防止用SOD 含有化粧品が開
発、市販されている（SOD と活性酵素調節剤、日本医学
館、１９８９）。しかし、SOD の活性はその持続期間が
長くないのでSOD を主成分とする医薬品または化粧品な
どを製造する場合、SOD の活性を期待し難いので製品と
して出市されるのに制限がある。
虫、ビールスなどの生物学的ストレスばかりでなく、地
球環境悪化により生じる各種環境ストレスを受けると生
命維持に必要な必須元素である酸素がスーパーオキシド
陰イオンラジカル、過酸化水素、水酸化ラジカルなどの
活性酸素種（active oxygen species ）に変わることに
なる。これら活性酸素は反応性が高くて深刻な生理的障
害を誘発するが、スーパーオキシド陰イオンラジカル
（superoxide anion radical、・O2）は酸素分子が電子
と反応（２O2＋２e →２・O2）して生じるし、過酸化水
素は鉄存在下で一番毒性の高い活性酸素種である水酸基
ラジカル（hydroxyl radical、・OH）を生成する。生体
内には、このような活性酸素を除去するシステムとして
スーパーオキシドジスムターゼ、パルオキシダ−ゼ（pe
roxidase）、カタラ−ゼ（catalase）などの高分子抗酸
化酵素とビタミンC 、ビタミンE 、グルタチオン（glut
athion）などの抗酸化物質などが多く存在することにな
る。SOD はほとんどの生物に存在し、スーパーオキシド
陰イオンラジカルを除去する酵素である（２・O2 - ＋２
H +→H2O2＋O2）。SOD の作用で生成された過酸化水素
はパルオキシダーゼまたはカタラーゼなどにより毒性の
ない水（H2O ）に変換される。したがって、SOD はスー
パーオキシド陰イオンラジカルを除去し水酸基ラジカル
の生成も予防する作用をするので生体防御機構に主要な
役目をする。前記した通りSOD は環境ストレスにより生
成される生体内活性酸素種を除去する環境耐性因子とし
て重要であり、医薬品、食品、化粧品などに利用できる
可能性が提示されている。また、環境ストレスに強いSO
D の遺伝子を含んだ形質転換された植物体はオゾン、低
温、除草剤などの環境ストレスに強い環境耐性植物に開
発することができる（Plant Physiology、１０、１０４
９−１０５４、１９５５；米国特許５５３８８７８）。
SOD の医薬的用途としては抗炎症剤として関節炎、リュ
マチスなどに有効であるものとして報告されており、虚
血性心疾患、放射線障害防止などに効果のあるものと認
められたことがあるし、最近には紫外線による被害を受
けた皮膚にSODをつける場合、皮膚の表皮内にSOD が浸
透され損傷を受けた皮膚が回復されることに関する研究
も報告されたことがある（Experimental Dermatology、
６、１１６−１２１、１９９７）。このような研究結果
に力づけられてSOD を有効成分とする医薬品の開発が米
国、日本などの地の製薬会社で活発に進められている
し、韓国内においても老化防止用SOD 含有化粧品が開
発、市販されている（SOD と活性酵素調節剤、日本医学
館、１９８９）。しかし、SOD の活性はその持続期間が
長くないのでSOD を主成分とする医薬品または化粧品な
どを製造する場合、SOD の活性を期待し難いので製品と
して出市されるのに制限がある。
【０００３】このような問題点を解決するため本発明者
は、生体内から分離したSOD を医薬品または化粧品に含
ませる代わりに、SOD を大量生産する植物体を開発しよ
うとしたし、特にSOD を食べられる植物組織で過量発現
させる植物生体反応器（plant bioreactor）システムを
開発しようと研究した。植物組織で特定遺伝子を過量発
現させる植物生体反応器システムに対しては、ワクチン
遺伝子などをバナナなどに導入して形質転換させた植物
体の製造により、食べられるワクチン（edible vaccin
e）を開発しようとする研究が報告されたことがあるが
（Bio ／Technology、13、３７９−３９２、１９９
５）、SOD を食べられる植物体で過量発現させる研究は
報告されたことがない。
は、生体内から分離したSOD を医薬品または化粧品に含
ませる代わりに、SOD を大量生産する植物体を開発しよ
うとしたし、特にSOD を食べられる植物組織で過量発現
させる植物生体反応器（plant bioreactor）システムを
開発しようと研究した。植物組織で特定遺伝子を過量発
現させる植物生体反応器システムに対しては、ワクチン
遺伝子などをバナナなどに導入して形質転換させた植物
体の製造により、食べられるワクチン（edible vaccin
e）を開発しようとする研究が報告されたことがあるが
（Bio ／Technology、13、３７９−３９２、１９９
５）、SOD を食べられる植物体で過量発現させる研究は
報告されたことがない。
【０００４】きゅうり（Cucumis sativus L ．）は食品
として付加価値が高いばかりでなくきゅうりを利用した
マッサージ用パックは栄養分の供給または老廃物及び角
質の除去、炎症に対する鎮症効果、美白、保湿など色々
の効能があって広く利用されている（きゅうり栽培技
術、クレきゅうり試験場、１９９７）。しかし、きゅう
りは前記のような優れた効果があるにも関わらずきゅう
りの果実に含まれているSOD 含量（units ／mg蛋白質）
は他の組織に比べて極めて低いものと知られている。
として付加価値が高いばかりでなくきゅうりを利用した
マッサージ用パックは栄養分の供給または老廃物及び角
質の除去、炎症に対する鎮症効果、美白、保湿など色々
の効能があって広く利用されている（きゅうり栽培技
術、クレきゅうり試験場、１９９７）。しかし、きゅう
りは前記のような優れた効果があるにも関わらずきゅう
りの果実に含まれているSOD 含量（units ／mg蛋白質）
は他の組織に比べて極めて低いものと知られている。
【発明が解決しようとする課題】以上の事情に鑑み、本
発明が解決しようとする課題は、SOD を大量生産する植
物体と、その製造方法および用途を提供することにあ
る。
発明が解決しようとする課題は、SOD を大量生産する植
物体と、その製造方法および用途を提供することにあ
る。
【課題を解決するための手段】ここで、本発明者達は化
粧品、機能性食品及び医薬品などに有効使用されうるSO
D の遺伝子をきゅうり果実に遺伝工学的な方法を導入し
てSOD 活性を増大させると、既存の知られている効能に
加えてSOD まで増大され相乗的効果があるわけでSOD を
優勢に大量生産する植物体を製造する植物生体反応器シ
ステムを開発した。即ち、SOD 遺伝子を含有する植物形
質転換用発現プラスミドを利用してアグラバクテリアに
SOD 遺伝子を導入して、これを植物組織と共同培養して
SOD 遺伝子を大量発現する形質転換された植物体を製造
して本発明を完成した。また、前記SOD で形質転換され
た植物体を作るためには外来遺伝子が導入された形質転
換植物体を大量繁殖させなければならないところ、本発
明者たちはすべての種子植物の系統と品種に関わりなく
再現性のある正常的な形態の再分化体に発達できる新し
い不定芽の誘導方法を確立したし、ともに前記不定芽誘
導方法を利用して外来遺伝子が導入された再分化植物体
が効率的に得られることを確認して本発明を完成した。
粧品、機能性食品及び医薬品などに有効使用されうるSO
D の遺伝子をきゅうり果実に遺伝工学的な方法を導入し
てSOD 活性を増大させると、既存の知られている効能に
加えてSOD まで増大され相乗的効果があるわけでSOD を
優勢に大量生産する植物体を製造する植物生体反応器シ
ステムを開発した。即ち、SOD 遺伝子を含有する植物形
質転換用発現プラスミドを利用してアグラバクテリアに
SOD 遺伝子を導入して、これを植物組織と共同培養して
SOD 遺伝子を大量発現する形質転換された植物体を製造
して本発明を完成した。また、前記SOD で形質転換され
た植物体を作るためには外来遺伝子が導入された形質転
換植物体を大量繁殖させなければならないところ、本発
明者たちはすべての種子植物の系統と品種に関わりなく
再現性のある正常的な形態の再分化体に発達できる新し
い不定芽の誘導方法を確立したし、ともに前記不定芽誘
導方法を利用して外来遺伝子が導入された再分化植物体
が効率的に得られることを確認して本発明を完成した。
【０００５】本発明はスーパーオキシドジスムターゼを
大量生産する形質転換された植物体を提供する。本発明
はSOD を大量発現する植物形質転換用発現プラスミドを
利用してアグロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これ
を植物組織と共同培養してSOD を大量生産する形質転換
された植物体の製造方法を提供する。本発明ではSOD を
大量発現する植物転換用発現プラスミドを提供する。本
発明の植物形質転換用発現プラスミドはマニホット培養
細胞から分離したCuZn SOD cDNA （mSOD１）、選抜標
識因子として除草剤Basta の耐性遺伝子（bar ）及びAS
O プロモーターで構成されたASOp＋mSOD１／pGPTV −Ba
r である。本発明では前記した植物転換用発現プラスミ
ドが導入された形質転換されたアグロバクテリアを提供
する。本発明の形質転換されたアグロバクテリアはアグ
ロバクテリアトメファシエンスLBA ４４０４（ASOp＋mS
OD１／pGPTV −Bar ）である。本発明は種子を無菌発芽
させ得た幼植物体の下胚軸上部分の一部分を残して下部
分を切断したあと、下胚軸切断面を培地に接するように
培養して不定芽を高頻度に誘導して、誘導された不定芽
を根誘導培地で根を生成させ苗木に育てたあと、園芸用
床土で馴化させ再分化植物体を製造する方法を提供す
る。また、下胚軸上部分の切断面に有用な外来遺伝子を
導入したあと、そこから不定芽を誘導して正常的に成長
する形質転換された植物体を製造する方法を提供する。
また、本発明のSOD を大量生産する植物体は皮膚マッサ
ージ用パックを包含する化粧品の材料、機能性食品の添
加剤及び医薬品などに使用され得るし、また除草剤耐性
植物と環境ストレス耐性植物開発に利用され得る。
大量生産する形質転換された植物体を提供する。本発明
はSOD を大量発現する植物形質転換用発現プラスミドを
利用してアグロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これ
を植物組織と共同培養してSOD を大量生産する形質転換
された植物体の製造方法を提供する。本発明ではSOD を
大量発現する植物転換用発現プラスミドを提供する。本
発明の植物形質転換用発現プラスミドはマニホット培養
細胞から分離したCuZn SOD cDNA （mSOD１）、選抜標
識因子として除草剤Basta の耐性遺伝子（bar ）及びAS
O プロモーターで構成されたASOp＋mSOD１／pGPTV −Ba
r である。本発明では前記した植物転換用発現プラスミ
ドが導入された形質転換されたアグロバクテリアを提供
する。本発明の形質転換されたアグロバクテリアはアグ
ロバクテリアトメファシエンスLBA ４４０４（ASOp＋mS
OD１／pGPTV −Bar ）である。本発明は種子を無菌発芽
させ得た幼植物体の下胚軸上部分の一部分を残して下部
分を切断したあと、下胚軸切断面を培地に接するように
培養して不定芽を高頻度に誘導して、誘導された不定芽
を根誘導培地で根を生成させ苗木に育てたあと、園芸用
床土で馴化させ再分化植物体を製造する方法を提供す
る。また、下胚軸上部分の切断面に有用な外来遺伝子を
導入したあと、そこから不定芽を誘導して正常的に成長
する形質転換された植物体を製造する方法を提供する。
また、本発明のSOD を大量生産する植物体は皮膚マッサ
ージ用パックを包含する化粧品の材料、機能性食品の添
加剤及び医薬品などに使用され得るし、また除草剤耐性
植物と環境ストレス耐性植物開発に利用され得る。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はSOD を果実に優勢に大量生産する前記植物体を
得るため、ASO プロモーター、mSOD１遺伝子、bar 遺伝
子を包含する植物形質転換用発現プラスミドを利用して
アグロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これを植物組
織と共同培養する。前記植物組織の共同培養課程におい
て、発芽した幼植物体の下胚軸切断面から不定芽を誘導
して器官培養を遂行して植物体を再分化させる。前記器
官培養で植物体を再分化させる課程は幼植物体の種子を
滅菌処理して生長調節物質が添加されない培地で発芽さ
せ、発芽された幼植物体の下胚軸を切断して切断面を培
地に移植、培養することにより不定芽を誘導し不定芽か
ら器官を生成させたあと、幼植物体を園芸用床土に馴化
させることからなる。前記方法で不定芽を誘導するとき
には一般的に下胚軸の切断面を明条件で培養するが、明
条件で培養して不定芽が高頻度に誘導されない一部分の
種子植物の場合には暗条件で一定期間培養したあと、明
条件に移して培養することが望ましい。また、前記不定
芽誘導法においては培養する植物にしたがい発芽３−５
日目の幼植物体の下胚軸の長さが２−３mmあるように切
断し、子葉が一つであるものまたはそれぞれ１／２除去
された二つの子葉を有した下胚軸をその材料として使用
すれば不定芽が高頻度に誘導される。このように本発明
は多様な幼植物体の下胚軸切断面から不定芽を誘導して
正常的な植物体に再分化された植物体を製造する方法を
提供するが、本発明の方法によりきゅうり（Cucumis sa
tivus L ．）、枸杞（Lycium chinense Mill）、唐辛子
（Capsicum annuum L ．）、メロン（Cucumis melo
L．）、インゲン豆（Phaseolus vulgaris L．）及びネ
ギ（Allium fistulosum L ．）から不定芽を高い比率で
得ることができる。したがって、前記不定芽誘導方法は
有用植物の大量繁殖、形質転換植物体開発など植物生命
工学製品開発のため組織培養による植物体再分化が必要
な場合効果的に利用することができる。本発明の不定芽
誘導法は従来の子葉切片を用いた不定芽誘導方法に比べ
て次のような長所がある。第一、子葉切片を培養材料と
して使用するときは不注意により葉原基（leaf primord
ia）が付いた子葉切片を使用することができるので不定
芽が葉原基のような分裂組織から起源される場合がある
が、下胚軸の切断面を使用すれば分裂組織から不定芽が
誘導されることを防止することができる。第二、きゅう
りを含んだうり科植物（Cucubitaceae）の子葉切片を培
養すれば多重の葉のみ誘導され頂端分裂組織が発達しな
く、頂端分裂組織があっても成長が止まり集団矮小化現
象がよく発生する（plant Cell Rep．、９、５５９−５
６２、１９９１；J.Ame ．Soc ．Hort．Sci ．、１１
８、１５１−１５７、１９９３）。しかし、本発明の方
法により幼植物体の下胚軸切断面から誘導された不定芽
は微分化及び矮小化現象が殆ど現れなかった。
本発明はSOD を果実に優勢に大量生産する前記植物体を
得るため、ASO プロモーター、mSOD１遺伝子、bar 遺伝
子を包含する植物形質転換用発現プラスミドを利用して
アグロバクテリアにSOD 遺伝子を導入し、これを植物組
織と共同培養する。前記植物組織の共同培養課程におい
て、発芽した幼植物体の下胚軸切断面から不定芽を誘導
して器官培養を遂行して植物体を再分化させる。前記器
官培養で植物体を再分化させる課程は幼植物体の種子を
滅菌処理して生長調節物質が添加されない培地で発芽さ
せ、発芽された幼植物体の下胚軸を切断して切断面を培
地に移植、培養することにより不定芽を誘導し不定芽か
ら器官を生成させたあと、幼植物体を園芸用床土に馴化
させることからなる。前記方法で不定芽を誘導するとき
には一般的に下胚軸の切断面を明条件で培養するが、明
条件で培養して不定芽が高頻度に誘導されない一部分の
種子植物の場合には暗条件で一定期間培養したあと、明
条件に移して培養することが望ましい。また、前記不定
芽誘導法においては培養する植物にしたがい発芽３−５
日目の幼植物体の下胚軸の長さが２−３mmあるように切
断し、子葉が一つであるものまたはそれぞれ１／２除去
された二つの子葉を有した下胚軸をその材料として使用
すれば不定芽が高頻度に誘導される。このように本発明
は多様な幼植物体の下胚軸切断面から不定芽を誘導して
正常的な植物体に再分化された植物体を製造する方法を
提供するが、本発明の方法によりきゅうり（Cucumis sa
tivus L ．）、枸杞（Lycium chinense Mill）、唐辛子
（Capsicum annuum L ．）、メロン（Cucumis melo
L．）、インゲン豆（Phaseolus vulgaris L．）及びネ
ギ（Allium fistulosum L ．）から不定芽を高い比率で
得ることができる。したがって、前記不定芽誘導方法は
有用植物の大量繁殖、形質転換植物体開発など植物生命
工学製品開発のため組織培養による植物体再分化が必要
な場合効果的に利用することができる。本発明の不定芽
誘導法は従来の子葉切片を用いた不定芽誘導方法に比べ
て次のような長所がある。第一、子葉切片を培養材料と
して使用するときは不注意により葉原基（leaf primord
ia）が付いた子葉切片を使用することができるので不定
芽が葉原基のような分裂組織から起源される場合がある
が、下胚軸の切断面を使用すれば分裂組織から不定芽が
誘導されることを防止することができる。第二、きゅう
りを含んだうり科植物（Cucubitaceae）の子葉切片を培
養すれば多重の葉のみ誘導され頂端分裂組織が発達しな
く、頂端分裂組織があっても成長が止まり集団矮小化現
象がよく発生する（plant Cell Rep．、９、５５９−５
６２、１９９１；J.Ame ．Soc ．Hort．Sci ．、１１
８、１５１−１５７、１９９３）。しかし、本発明の方
法により幼植物体の下胚軸切断面から誘導された不定芽
は微分化及び矮小化現象が殆ど現れなかった。
【０００７】また、前記不定芽誘導方法は有用な外来遺
伝子を下胚軸切断面に導入したあと、そこから不定芽を
誘導して正常的に生長する形質転換された再分化植物体
を効率的に得るのに有用に適用され得る。具体的には本
発明では有用な外来遺伝子が導入されたアグロバクテリ
ウムトメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）
で下胚軸切断面を感染させ形質転換された再分化植物体
を効率的に製造する。
伝子を下胚軸切断面に導入したあと、そこから不定芽を
誘導して正常的に生長する形質転換された再分化植物体
を効率的に得るのに有用に適用され得る。具体的には本
発明では有用な外来遺伝子が導入されたアグロバクテリ
ウムトメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）
で下胚軸切断面を感染させ形質転換された再分化植物体
を効率的に製造する。
【０００８】前記不定芽誘導方法はSOD を大量生産する
植物体の製造方法に利用される。即ち、SOD を大量生産
する前記植物体を製造するため、SOD 遺伝子を含む植物
形質転換用発現プラスミドを利用してアグロバクテリア
にSOD 遺伝子を導入して、これを植物組織と共同培養し
て形質転換された植物体を得る。前記下胚軸切断面から
不定芽を誘導して再分化された形質転換体を作る課程
は、種子を発芽させ下胚軸切断面をSOD 遺伝子を導入し
たアグロバクテリア培養液に浸漬させたあと、共同培養
してSOD 遺伝子を導入した形質転換された不定芽を誘導
及び選抜して、これから器官を形成させたあと、形質転
換された幼植物体を園芸用床土に馴化させることでな
る。植物形質転換用発現プラスミドが導入できるアグバ
クテリア菌株は全部本発明の方法に使用されうる。前記
過程で植物体としては全ての種類の植物を使用すること
ができるが、きゅうり、トマトまたは唐辛子などを包含
した食用可能な果菜類を利用すれば抗酸化活性のある健
康食品、化粧品及び医薬品などに利用できるので望まし
い。
植物体の製造方法に利用される。即ち、SOD を大量生産
する前記植物体を製造するため、SOD 遺伝子を含む植物
形質転換用発現プラスミドを利用してアグロバクテリア
にSOD 遺伝子を導入して、これを植物組織と共同培養し
て形質転換された植物体を得る。前記下胚軸切断面から
不定芽を誘導して再分化された形質転換体を作る課程
は、種子を発芽させ下胚軸切断面をSOD 遺伝子を導入し
たアグロバクテリア培養液に浸漬させたあと、共同培養
してSOD 遺伝子を導入した形質転換された不定芽を誘導
及び選抜して、これから器官を形成させたあと、形質転
換された幼植物体を園芸用床土に馴化させることでな
る。植物形質転換用発現プラスミドが導入できるアグバ
クテリア菌株は全部本発明の方法に使用されうる。前記
過程で植物体としては全ての種類の植物を使用すること
ができるが、きゅうり、トマトまたは唐辛子などを包含
した食用可能な果菜類を利用すれば抗酸化活性のある健
康食品、化粧品及び医薬品などに利用できるので望まし
い。
【０００９】本発明は皮膚マッサージ用パックなどの材
料として有用なSOD を大量生産するきゅうりを含んだ果
菜類を生産するために、きゅうり果実に優勢に発現する
アスコルベートオキシダーゼプロモーター（ascorbate
oxidase promoter；Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 、８
６、１２３９−１２４３、１９８９；Ann ．N ．Y ．Ac
ad．Sci ．、７２１、２４５−２４７、１９９４）、マ
ニホット培養細胞から分離したSOD 遺伝子であるmSOD１
及び遺伝子選抜標識因子である除草剤（Basta）耐性bar
遺伝子を包含する植物形質転換用発現ベクターを使用
する。SOD 遺伝子は３０種以上の多くの植物から分離さ
れているが、本発明においてはSOD 高生産細胞株として
選抜したマニホット（Manihot esculenta ）培養細胞か
ら最初に分離したCuZn SOD遺伝子（mSOD１；配列番号１
参照）を使用した。選抜標識因子に使用した除草剤Bast
a の耐性遺伝子であるbar はStreptomyceshygroscopicu
s自体が生産したホスヒノトリシン（phosphinothrici
n）をアセチル化して無毒化させる酵素であるホスヒノ
トリシンアセチル転移酵素（phosphinothricin acetylt
ransferase）の遺伝子（EMBO 6、2519−2523、1987）と
して形質転換時選抜標識因子（selection marker）また
はホスヒノトリシンを含有した除草剤の抵抗性植物体の
開発に大いに利用されている。ホスヒノトリシンはグル
タミン合成を強力に阻害することで植物体内にアンモニ
ア濃度を増加させ植物体を褐変させ枯死させる。S ．hy
groscopicus が生産するバイラホス（bailaphos）また
はホスヒノトリシンが含有されたバスターは残留性によ
る環境汚染が他の除草剤に比べて少なく効能が優れた非
選択的除草剤である。前記植物体の形質転換過程でマニ
ホット培養細胞から分離したSOD 遺伝子（mSOD１）、除
草剤バスター抵抗性遺伝子（bar ）、きゅうりアスコル
ベートオキシダーゼプロモーター（ASO promoter）など
で構成された発現プラスミド（ASOP＋mSOD１／pGPTV −
Bar 、図１参照）を使用して、アグロバクテリア菌株に
SOD 遺伝子を導入するのが望ましく、このとき、アグロ
バクテリアトメファシエンス菌株を使用するのが望まし
い。本発明では植物形質転換用アグロバクテリア菌株と
してアグロバクテリアトメファシエンスLBA ４４０４
（Agrobacterium tumefaciens LBA ４４０４）が用いら
れるし、前記植物形質転換用発現プラスミド（ASOp＋mS
OD１／pGPTV −Bar ）を導入したアグロバクテリアトメ
ファシエンスLBA ４４０４（Agrobacterium tumefacien
s LBA ４４０４）（ASOp＋mSOD１／pGPTV −Bar ）を生
命工学研究所付設遺伝資源センター遺伝子銀行に１９９
９年３月６日付で寄託した（受託番号：KCTC０５８５B
P）。
料として有用なSOD を大量生産するきゅうりを含んだ果
菜類を生産するために、きゅうり果実に優勢に発現する
アスコルベートオキシダーゼプロモーター（ascorbate
oxidase promoter；Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 、８
６、１２３９−１２４３、１９８９；Ann ．N ．Y ．Ac
ad．Sci ．、７２１、２４５−２４７、１９９４）、マ
ニホット培養細胞から分離したSOD 遺伝子であるmSOD１
及び遺伝子選抜標識因子である除草剤（Basta）耐性bar
遺伝子を包含する植物形質転換用発現ベクターを使用
する。SOD 遺伝子は３０種以上の多くの植物から分離さ
れているが、本発明においてはSOD 高生産細胞株として
選抜したマニホット（Manihot esculenta ）培養細胞か
ら最初に分離したCuZn SOD遺伝子（mSOD１；配列番号１
参照）を使用した。選抜標識因子に使用した除草剤Bast
a の耐性遺伝子であるbar はStreptomyceshygroscopicu
s自体が生産したホスヒノトリシン（phosphinothrici
n）をアセチル化して無毒化させる酵素であるホスヒノ
トリシンアセチル転移酵素（phosphinothricin acetylt
ransferase）の遺伝子（EMBO 6、2519−2523、1987）と
して形質転換時選抜標識因子（selection marker）また
はホスヒノトリシンを含有した除草剤の抵抗性植物体の
開発に大いに利用されている。ホスヒノトリシンはグル
タミン合成を強力に阻害することで植物体内にアンモニ
ア濃度を増加させ植物体を褐変させ枯死させる。S ．hy
groscopicus が生産するバイラホス（bailaphos）また
はホスヒノトリシンが含有されたバスターは残留性によ
る環境汚染が他の除草剤に比べて少なく効能が優れた非
選択的除草剤である。前記植物体の形質転換過程でマニ
ホット培養細胞から分離したSOD 遺伝子（mSOD１）、除
草剤バスター抵抗性遺伝子（bar ）、きゅうりアスコル
ベートオキシダーゼプロモーター（ASO promoter）など
で構成された発現プラスミド（ASOP＋mSOD１／pGPTV −
Bar 、図１参照）を使用して、アグロバクテリア菌株に
SOD 遺伝子を導入するのが望ましく、このとき、アグロ
バクテリアトメファシエンス菌株を使用するのが望まし
い。本発明では植物形質転換用アグロバクテリア菌株と
してアグロバクテリアトメファシエンスLBA ４４０４
（Agrobacterium tumefaciens LBA ４４０４）が用いら
れるし、前記植物形質転換用発現プラスミド（ASOp＋mS
OD１／pGPTV −Bar ）を導入したアグロバクテリアトメ
ファシエンスLBA ４４０４（Agrobacterium tumefacien
s LBA ４４０４）（ASOp＋mSOD１／pGPTV −Bar ）を生
命工学研究所付設遺伝資源センター遺伝子銀行に１９９
９年３月６日付で寄託した（受託番号：KCTC０５８５B
P）。
【００１０】本発明の方法から得たSOD を大量生産する
果菜類は抗酸化作用が卓越して化粧品の原料として有用
に使用され得るし、以外にも機能性食品の添加剤及び医
薬品などに使用され得るし、特に形質転換されたきゅう
りなどは化粧品として皮膚マッサージ用パックなどに有
用に使用され得る。また、SOD を大量生産する本発明の
果菜類は除草剤バスター耐性及び環境ストレスに対して
耐性も有するので、高温多湿なビニルハウスなどのよう
な高い環境ストレス条件においても栽培できる。
果菜類は抗酸化作用が卓越して化粧品の原料として有用
に使用され得るし、以外にも機能性食品の添加剤及び医
薬品などに使用され得るし、特に形質転換されたきゅう
りなどは化粧品として皮膚マッサージ用パックなどに有
用に使用され得る。また、SOD を大量生産する本発明の
果菜類は除草剤バスター耐性及び環境ストレスに対して
耐性も有するので、高温多湿なビニルハウスなどのよう
な高い環境ストレス条件においても栽培できる。
【００１１】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。下記実施例は本発明を例示するものであって、本発
明の範囲が実施例により限定されるのではない。 実施例１．きゅうり幼植物体の下胚軸切断面から不定芽
誘導及び植物体再分化 器官発生を利用して植物体を再分化させるため、きゅう
り（Cucumis sativusL ．）種子（ヨルムサンチョク、
オンソンベクタタキ、ベクボンタタキ、早生ナクハプ、
長型ナクハプ）を蒸留水に１時間浸漬させ７５％エタノ
ールに１分間１次表面殺菌したあと、２％次塩素酸ナト
リウム（sodium hypochlorite ）溶液で１５分間２次滅
菌させ滅菌水で３回洗滌した。また、滅菌処理された種
子は生長調節物質が添加されていないMS培地（Murashig
e and Skoog 、Physiol ．Plant、１５、４７３−４９
７、１９６２）で発芽させた。種子発芽条件は約１５μ
mol m -2・ s-1の蛍光光の下で１６時間、暗条件８時間
の光周期と２５±１℃の温度であった。きゅうり種子を
多様な時間発芽させたあと、幼植物体の下胚軸の上部分
のみ残して下の部分を切断したあと、この幼植物体の下
培軸切断面が２．０mg／L ゼアチン（zeatin）が添加さ
れたMS培地である不定芽誘導培地に接するように移して
約１５μmol m -2・ s-1の蛍光光下で明１６時間、暗８
時間の光周期で３週間培養して不定芽を誘導して（図２
a 参照）、不定芽誘導率を調査した。前記不定芽から葉
っぱが１−２枚ほど発達したとき（図２b 参照）、これ
らを分離して１．０mg／L インドール酢酸が添加された
MS培地で２週間培養すると根が容易に誘導された（図２
c 参照）。葉っぱが２−３枚でて根がよく発達した苗木
は園芸用床土の花鉢に移して約８０％ほどの湿度を保持
しながら馴化させたあと、完全な植物体に育てた（図２
d 参照）。きゅうり種子の発芽日数にしたがう幼植物体
の下胚軸切断面から不定芽誘導率を調査するため、下胚
軸を２mmほど残して切断した幼植物体（発芽後３、５、
７、９日目）を前記のように培養した。発芽３日目幼植
物体は子葉が二つ、子葉が一つまたはそれぞれ１／２に
切断された子葉を二つ有した幼植物体の下胚軸切断面か
ら不定芽が高頻度で誘導された（図３参照）。子葉を二
つ有した幼植物体は発芽三日目は比較的高い（約７０
％）比率で下胚軸切断面から不定芽が誘導されたが、発
芽５日以後には極めて低い（約３０％以下）誘導率を示
した（図３参照）。したがって、きゅうり幼植物体の下
胚軸切断面から高い比率の不定芽を誘導しようとすると
きは、発芽３−５日目の幼植物体に子葉が一つまたは１
／２除去された二つの子葉を有したものを培養材料とし
て使用するのが適切であることが分かる。また、本実施
例では不定芽誘導時、下胚軸の長さが不定芽誘導率に影
響を与えるのかを調査するため、発芽５日目の幼植物体
の下胚軸を２、３、４、６mm長さで切断して前記不定芽
誘導培地に培養した。その結果幼植物体の下胚軸長さが
長ければ長いほど幼植物体の下胚軸切断面で不定芽の誘
導率が低かった（図４参照）。これは下胚軸上部分の細
胞が不定芽分化能が高いことを示す。また、子葉が二つ
ある幼植物体の場合、下胚軸の長さが長ければ長いほど
不定芽誘導率が著しく減少されるし、下胚軸の長さが約
６mmである場合には根が形成された。このように下胚軸
が長いと生長調節物質の供給にも拘わらず、幼植物体の
切断された下胚軸から根が誘導されるのは培地に添加さ
れたゼアチンの効果が下胚軸と二つの子葉により緩和さ
れたし、幼植物体の頂端分裂組織から生成されたオキシ
ン（auxin ）が作用したからと考えられる。また、子葉
のサイズも不定芽誘導に影響があるが、下胚軸の長さが
２mmであるときは二つの子葉、一つの子葉または１／２
に切断された二つの子葉を有する幼植物体の下胚軸で等
しい不定芽誘導率をみせたが、下胚軸の長さが３mmであ
るときの不定芽誘導率は１／２に切断された二つの子葉
を有する幼植物体の下胚軸がずっと高かった（図４参
照）。また、図３及び図４からみられる通り、子葉が二
つあるときは子葉が一つまたは１／２に切断された二つ
の子葉があるのに比べて不定芽誘導率が著しく減少した
が、これは子葉の数とサイズが下胚軸切断面からの不定
芽誘導に影響があることを示唆する。
る。下記実施例は本発明を例示するものであって、本発
明の範囲が実施例により限定されるのではない。 実施例１．きゅうり幼植物体の下胚軸切断面から不定芽
誘導及び植物体再分化 器官発生を利用して植物体を再分化させるため、きゅう
り（Cucumis sativusL ．）種子（ヨルムサンチョク、
オンソンベクタタキ、ベクボンタタキ、早生ナクハプ、
長型ナクハプ）を蒸留水に１時間浸漬させ７５％エタノ
ールに１分間１次表面殺菌したあと、２％次塩素酸ナト
リウム（sodium hypochlorite ）溶液で１５分間２次滅
菌させ滅菌水で３回洗滌した。また、滅菌処理された種
子は生長調節物質が添加されていないMS培地（Murashig
e and Skoog 、Physiol ．Plant、１５、４７３−４９
７、１９６２）で発芽させた。種子発芽条件は約１５μ
mol m -2・ s-1の蛍光光の下で１６時間、暗条件８時間
の光周期と２５±１℃の温度であった。きゅうり種子を
多様な時間発芽させたあと、幼植物体の下胚軸の上部分
のみ残して下の部分を切断したあと、この幼植物体の下
培軸切断面が２．０mg／L ゼアチン（zeatin）が添加さ
れたMS培地である不定芽誘導培地に接するように移して
約１５μmol m -2・ s-1の蛍光光下で明１６時間、暗８
時間の光周期で３週間培養して不定芽を誘導して（図２
a 参照）、不定芽誘導率を調査した。前記不定芽から葉
っぱが１−２枚ほど発達したとき（図２b 参照）、これ
らを分離して１．０mg／L インドール酢酸が添加された
MS培地で２週間培養すると根が容易に誘導された（図２
c 参照）。葉っぱが２−３枚でて根がよく発達した苗木
は園芸用床土の花鉢に移して約８０％ほどの湿度を保持
しながら馴化させたあと、完全な植物体に育てた（図２
d 参照）。きゅうり種子の発芽日数にしたがう幼植物体
の下胚軸切断面から不定芽誘導率を調査するため、下胚
軸を２mmほど残して切断した幼植物体（発芽後３、５、
７、９日目）を前記のように培養した。発芽３日目幼植
物体は子葉が二つ、子葉が一つまたはそれぞれ１／２に
切断された子葉を二つ有した幼植物体の下胚軸切断面か
ら不定芽が高頻度で誘導された（図３参照）。子葉を二
つ有した幼植物体は発芽三日目は比較的高い（約７０
％）比率で下胚軸切断面から不定芽が誘導されたが、発
芽５日以後には極めて低い（約３０％以下）誘導率を示
した（図３参照）。したがって、きゅうり幼植物体の下
胚軸切断面から高い比率の不定芽を誘導しようとすると
きは、発芽３−５日目の幼植物体に子葉が一つまたは１
／２除去された二つの子葉を有したものを培養材料とし
て使用するのが適切であることが分かる。また、本実施
例では不定芽誘導時、下胚軸の長さが不定芽誘導率に影
響を与えるのかを調査するため、発芽５日目の幼植物体
の下胚軸を２、３、４、６mm長さで切断して前記不定芽
誘導培地に培養した。その結果幼植物体の下胚軸長さが
長ければ長いほど幼植物体の下胚軸切断面で不定芽の誘
導率が低かった（図４参照）。これは下胚軸上部分の細
胞が不定芽分化能が高いことを示す。また、子葉が二つ
ある幼植物体の場合、下胚軸の長さが長ければ長いほど
不定芽誘導率が著しく減少されるし、下胚軸の長さが約
６mmである場合には根が形成された。このように下胚軸
が長いと生長調節物質の供給にも拘わらず、幼植物体の
切断された下胚軸から根が誘導されるのは培地に添加さ
れたゼアチンの効果が下胚軸と二つの子葉により緩和さ
れたし、幼植物体の頂端分裂組織から生成されたオキシ
ン（auxin ）が作用したからと考えられる。また、子葉
のサイズも不定芽誘導に影響があるが、下胚軸の長さが
２mmであるときは二つの子葉、一つの子葉または１／２
に切断された二つの子葉を有する幼植物体の下胚軸で等
しい不定芽誘導率をみせたが、下胚軸の長さが３mmであ
るときの不定芽誘導率は１／２に切断された二つの子葉
を有する幼植物体の下胚軸がずっと高かった（図４参
照）。また、図３及び図４からみられる通り、子葉が二
つあるときは子葉が一つまたは１／２に切断された二つ
の子葉があるのに比べて不定芽誘導率が著しく減少した
が、これは子葉の数とサイズが下胚軸切断面からの不定
芽誘導に影響があることを示唆する。
【００１２】比較例１．きゅうり子葉切片からの不定芽
誘導 器官発生を用いて植物体を再分化させたるため、きゅう
り種子（ニョルムサンチョク、オンソンベクタタキ、ベ
クボンタタキ、早生ナクハプ、長型ナクハプ）を蒸留水
に１時間浸漬させ７５％エタノールに１分間１次表面殺
菌したあと、２％次塩素酸ナトリウム（sodium hypochl
orite ）溶液で１５分間２次滅菌させ滅菌水で３回洗滌
した。また、滅菌処理された種子は生長調節物質が添加
されていないMS培地（Murashige and Skoog 、Physiol
．Plant 、15、473 −497 、1962）で発芽させた。種
子発芽条件は約１５μmol m -2・ s-1の蛍光光下で１６
時間、暗条件８時間の光周期と２５±１℃の温度であっ
た。発芽５日または７日目の子葉の基底部（サイズ約５
×５mm）を切断して培地に移植して培養した。子葉切片
培養のための培地はMS培地に３％蔗糖（sucrose ）と
０．４％フィターゲル（phytagel）を添加したあと、サ
イトカイニン（cytokinin ）［１．０または２．０mg／
L ゼアチン（zeatin）、１．０mg／L ベンジルアデニン
（6 −benzyladenine 、BA）、１．０または３．０mg／
L カイネチン（kinetin ）］単独及びインドール酢酸
（indole−3 −acetic acid 、IAA 、０．１または０．
２mg／L ）と組合処理した組成を有し、pHは５．８で調
整した。培地は１２１℃、１．２気圧で１５分間湿熱滅
菌してペトリ皿（８７×１５mm）にそれぞれ２５mLずつ
分株して、ペトリ皿当五つの子葉切片を培養した。培養
条件は温度２５±１℃と１５μmol m -2・ s-1の蛍光光
下で１６時間、暗条件８時間の光周期にした。子葉切片
をサイトカイニン単独及びインドール酢酸と組合処理さ
れたMS培地に移植して４週間培養したあと、不定芽の発
生を調査した。
誘導 器官発生を用いて植物体を再分化させたるため、きゅう
り種子（ニョルムサンチョク、オンソンベクタタキ、ベ
クボンタタキ、早生ナクハプ、長型ナクハプ）を蒸留水
に１時間浸漬させ７５％エタノールに１分間１次表面殺
菌したあと、２％次塩素酸ナトリウム（sodium hypochl
orite ）溶液で１５分間２次滅菌させ滅菌水で３回洗滌
した。また、滅菌処理された種子は生長調節物質が添加
されていないMS培地（Murashige and Skoog 、Physiol
．Plant 、15、473 −497 、1962）で発芽させた。種
子発芽条件は約１５μmol m -2・ s-1の蛍光光下で１６
時間、暗条件８時間の光周期と２５±１℃の温度であっ
た。発芽５日または７日目の子葉の基底部（サイズ約５
×５mm）を切断して培地に移植して培養した。子葉切片
培養のための培地はMS培地に３％蔗糖（sucrose ）と
０．４％フィターゲル（phytagel）を添加したあと、サ
イトカイニン（cytokinin ）［１．０または２．０mg／
L ゼアチン（zeatin）、１．０mg／L ベンジルアデニン
（6 −benzyladenine 、BA）、１．０または３．０mg／
L カイネチン（kinetin ）］単独及びインドール酢酸
（indole−3 −acetic acid 、IAA 、０．１または０．
２mg／L ）と組合処理した組成を有し、pHは５．８で調
整した。培地は１２１℃、１．２気圧で１５分間湿熱滅
菌してペトリ皿（８７×１５mm）にそれぞれ２５mLずつ
分株して、ペトリ皿当五つの子葉切片を培養した。培養
条件は温度２５±１℃と１５μmol m -2・ s-1の蛍光光
下で１６時間、暗条件８時間の光周期にした。子葉切片
をサイトカイニン単独及びインドール酢酸と組合処理さ
れたMS培地に移植して４週間培養したあと、不定芽の発
生を調査した。
【表１】 前記表１で分かるように、きゅうり子葉切片のみを培養
する既存の方法で培養したときは幼植物体の不定芽誘導
率が最大２０％を超えなかった（図３参照）。
する既存の方法で培養したときは幼植物体の不定芽誘導
率が最大２０％を超えなかった（図３参照）。
【００１３】比較例２．体細胞胚発生によるきゅうり下
胚軸からの植物再分化 本比較例はきゅうり種子を比較例１の子葉切片培養と同
一な方法で暗所から発芽させて、発芽５日目下胚軸を切
断（長さ５−１０mm）して培養した。培地はMS培地に
３、５、１０％蔗糖と０．４％フィターゲル及び１．０
mg/L ２、４− D（2 、4 −dichlorophenoxy acetic a
cid ）を添加した組成を有するようにしてpHは５．８に
調整した。下胚軸切片から誘導された胚発生カルス（em
bryogeniccallus）は前記と同一な条件の培地で継代培
養することにより胚発生カルスのみを選別し、そのうち
良好なもののみを保持、増殖させた。胚発生カルスから
体細胞胚が発生するように２、４−D が添加された培地
で２週間培養したあと、２、４−D を添加してないMS培
地に移して培養した。前記培養４週が経過すると、殆ど
大部分の下胚軸切片から白いカルスが誘導されたし、一
部薄黄色のカルスも稀に誘導された。薄黄色のカルスの
みを分離して継代培養を実施すれば培地の接合面で粘性
が強く透明なカルスが生成されるが、これらから黄色の
胚発生カルスが誘導されたが２．５％ほどの低い頻度で
あった。胚発生カルスは暗所で３％蔗糖条件で培養した
場合、下胚軸材料の２．３％ほどの低い頻度できゅうり
品種中ナクハプ係（早生ナクハプ、長型ナクハプ）のみ
で誘導された。他のきゅうり品種では蔗糖の濃度を１０
％まで高めて培養した場合にも胚発生カルスが全く誘導
されなかった。
胚軸からの植物再分化 本比較例はきゅうり種子を比較例１の子葉切片培養と同
一な方法で暗所から発芽させて、発芽５日目下胚軸を切
断（長さ５−１０mm）して培養した。培地はMS培地に
３、５、１０％蔗糖と０．４％フィターゲル及び１．０
mg/L ２、４− D（2 、4 −dichlorophenoxy acetic a
cid ）を添加した組成を有するようにしてpHは５．８に
調整した。下胚軸切片から誘導された胚発生カルス（em
bryogeniccallus）は前記と同一な条件の培地で継代培
養することにより胚発生カルスのみを選別し、そのうち
良好なもののみを保持、増殖させた。胚発生カルスから
体細胞胚が発生するように２、４−D が添加された培地
で２週間培養したあと、２、４−D を添加してないMS培
地に移して培養した。前記培養４週が経過すると、殆ど
大部分の下胚軸切片から白いカルスが誘導されたし、一
部薄黄色のカルスも稀に誘導された。薄黄色のカルスの
みを分離して継代培養を実施すれば培地の接合面で粘性
が強く透明なカルスが生成されるが、これらから黄色の
胚発生カルスが誘導されたが２．５％ほどの低い頻度で
あった。胚発生カルスは暗所で３％蔗糖条件で培養した
場合、下胚軸材料の２．３％ほどの低い頻度できゅうり
品種中ナクハプ係（早生ナクハプ、長型ナクハプ）のみ
で誘導された。他のきゅうり品種では蔗糖の濃度を１０
％まで高めて培養した場合にも胚発生カルスが全く誘導
されなかった。
【００１４】実施例２．枸杞、唐辛子、メロン、インゲ
ン豆、ネギなどの幼植物体下胚軸切断面から不定芽誘導 本実施例では前記実施例１と殆ど同一な方法で、多くの
種子植物の不定芽から再分化された植物体を得た。即
ち、木本性である枸杞（Lycium chinense Mill）、果菜
類である唐辛子（Capsicum annuum L ．）、うり科植物
であるメロン（Cucumis melo L．）、豆科植物であるイ
ンゲン豆（Phaseolus vulgaris L．）そして単子葉植物
であるネギ（Allium fistulosum L ．）の種子を実施例
１と同様の方法で滅菌して発芽させたあと、幼植物体の
子葉をそれぞれ１／２ずつまたは全部切り取って、下胚
軸は約２mmほど残して切断した後、この幼植物体の下胚
軸切断部位を２．０mg/Lゼアチンが添加されたMS培地に
接するように移した。きゅうりにおいてと同様に枸杞、
唐辛子、メロン、インゲン豆、ネギなどにおいても約３
週ぶりに幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が高頻
度に誘導された（図５a 〜図５e 参照）。唐辛子、イン
ゲン豆、ネギはきゅうり幼植物体培養のように最初から
明条件で培養して不定芽が高頻度に誘導されるが、枸
杞、メロンの場合には最初から明条件で培養すれば不定
芽が高頻度で誘導されなく暗条件で２週間ほど培養した
後、明条件に移して培養したとき不定芽がよく誘導され
た。
ン豆、ネギなどの幼植物体下胚軸切断面から不定芽誘導 本実施例では前記実施例１と殆ど同一な方法で、多くの
種子植物の不定芽から再分化された植物体を得た。即
ち、木本性である枸杞（Lycium chinense Mill）、果菜
類である唐辛子（Capsicum annuum L ．）、うり科植物
であるメロン（Cucumis melo L．）、豆科植物であるイ
ンゲン豆（Phaseolus vulgaris L．）そして単子葉植物
であるネギ（Allium fistulosum L ．）の種子を実施例
１と同様の方法で滅菌して発芽させたあと、幼植物体の
子葉をそれぞれ１／２ずつまたは全部切り取って、下胚
軸は約２mmほど残して切断した後、この幼植物体の下胚
軸切断部位を２．０mg/Lゼアチンが添加されたMS培地に
接するように移した。きゅうりにおいてと同様に枸杞、
唐辛子、メロン、インゲン豆、ネギなどにおいても約３
週ぶりに幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が高頻
度に誘導された（図５a 〜図５e 参照）。唐辛子、イン
ゲン豆、ネギはきゅうり幼植物体培養のように最初から
明条件で培養して不定芽が高頻度に誘導されるが、枸
杞、メロンの場合には最初から明条件で培養すれば不定
芽が高頻度で誘導されなく暗条件で２週間ほど培養した
後、明条件に移して培養したとき不定芽がよく誘導され
た。
【００１５】実施例３．カサッバスーパーオキシドジス
ムターゼ遺伝子のクロニング及び塩基配列決定と形質転
換発現ベクター製作 前記実施例で開発された不定芽誘導方法を利用してSOD
を高発現して大量製造することのできる形質転換された
きゅうりを開発するため、植物形質転換用発現ベクター
を製造した（図１参照）。本実施例で使用された植物形
質転換用発現ベクターは、きゅうり果実に優勢に発現す
るアスコルベートオキシダーゼプロモーターをプロモー
ターとして包含し、カサッバ（Manihot esculenta ）培
養細胞から分離したmSOD１をSOD 構造遺伝子として包含
し、除草剤であるバスター（Basta ）に対して耐性を持
たせるbar 遺伝子を選抜標識因子（selection marker）
として包含する。本実施例では前記ベクターを制作する
ため、先ずカサッバでSOD 遺伝子をクロニングしその塩
基配列を決定した。SOD 遺伝子は３０種以上の多い植物
から分離されているが、本発明ではSOD 高生産細胞株に
選抜されたカサッバ培養細胞から最初に分離したCuZn
SOD 遺伝子（mSOD１、配列番号１）を使用した。カサッ
バから全長（full−length）のSOD cDNAをクロニング
するため、先ずUni −ZAPベクター（Staratagene 社）
を利用して制作されたカサッバ培養細胞のcDNAライブラ
リ（library ）を探索（screening ）した。より詳しく
は、先ずSOD 高生産細胞株に選抜されたカサッバ培養細
胞の継代培養２０日目の細胞から精製したmRNAを鋳型で
cDNAを PCRで合成した後、Gigapack IIIパッキジング抽
出物（Gigapack III packaging extract、Stratagene
社）を利用して４×１０5pfu（plaque forming unit ）
のcDNAライブラリを制作したし、これらを２×１０10pf
u ／mLに増幅させることでカサッバ培養細胞のcDNAライ
ブラリを完成した。カサッバ培養細胞cDNAライブラリス
クリニングに使用する探針（probe ）を合成するため、
既に知られている多種類の植物体SOD 塩基配列のうち相
同性の高い部分から制作された配列番号３のSODF１と配
列番号４のSODR２の変形性プライマー（degenerated pr
imer）を使用したし、上から完成したカサッバcDNAライ
ブラリを鋳型で利用した。二つのプライマーを使用して
合成された３１２bpのPCR 産物をpBluescript ベクター
（Stratagene社）のEcoRV 位置に接合（ligation）した
あと、E ．coliに導入したし、これからプラスミド DNA
を分離したあと、X ba Iとsal I を処理して約０．５kb
の挿入配列を有したプラスミドを選抜した。選抜された
プラスミドの塩基配列を決定した結果SOD 遺伝子である
ことが確認された。これをカサッバ培養細胞のcDNAライ
ブラリを探索するための探針として利用した。カサッバ
培養細胞SOD 遺伝子のクロニングのためのcDNAライブラ
リ探索は、前記０．５kbのPCR 産物を32P −dCTPで標識
して遂行した。４×１０6pfuのパージライブラリを２回
にかけてスクリーニングした結果、５０余個の独立した
プラグ（plaque）を得た。そのうち、１０個を選抜して
塩基配列を決定した結果、配列番号１の塩基配列を有す
る一つの全長（full length ）CuZnSOD cDNA（mSOD
１）を分離した。カサッバ培養細胞から分離したmSOD１
は８０１bpで、１５２個のアミノ酸になったORF （open
reading frame）を有し、ポリ（A ）テール［poly−
（A ）tail］と暫定的なポリ（A ）テール信号（polyad
enylation signal ）であるAATAAA配列を有していた
し、この配列はポリ（A ）テールの１９０bp上流（upst
ream）に位置した（配列番号１参照）。前記ORF を塩基
配列を翻訳して得たアミノ酸配列（配列番号１参照及び
配列番号２参照）を他の植物体のCuZnSOD のアミノ酸配
列と比較した結果、５個所（MVKAEAVL、PGLHGFHVH 、GD
TTNGC 、DDLGRGGHELS 、TGNAGGR ）のアミノ酸配列がよ
く保存されていた。特に暫定的な銅結合座（His−４
５、His −４７、His −６２、His −７０、His −７
９、Asp −８２、His−１１９）が存在した。前記でク
ロニングしたカサッバSOD （mSOD１）、きゅうりの果実
優勢発現プロモーターであるASO プロモーター及びバス
ター抵抗性遺伝子bar を連結した植物形質転換用ベクタ
ー（図１参照）を製作するために、先ずASO プロモータ
ーをpBluescript （Stratagene社）に挿入した。即ち、
日本奈良先端大学院大学で分譲されたASO プロモーター
（Ann ．N ．Y ．Acad．Sci ．７２１．２４５−２４
７、１９９４）をHind IIIとEcoR Iの制限酵素配列を有
しているプライマー（配列番号５、配列番号６）でPCR
増幅させた後、このPCR 産物（約１．１kb）をHindIII
とEcoR Iで切断してpBluescript KSベクターのHind III
／EcoR Iの位置に挿入してベクターASOp／pBluescript
を得た。先に分離されたmSOD１遺伝子をASOp／pBluescr
ipt に挿入するため、Pst I とBamH Iの制限酵素配列を
有したプライマー（配列番号７、配列番号８）と全長の
mSOD１ cDNA 鋳型を利用してmSOD１PCR 産物（約０．７
８kb）を得て、更にこのPCR 産物を前記ベクターのPst
I ／BamH I間に挿入してベクターASOp＋mSOD１／pBlues
cript を得た。ASOp＋mSOD１のHind III−BamH I断片を
植物形質転換用バイナリベクター（binary vector ）で
あるpBI101（Clontech社）に挿入させるため、前記ASOp
＋mSOD１／pBluescript をHind IIIとBamH Iに切断した
あと、BamH I位置を鈍端（blunt end ）に作る傍ら、pB
I101をHind IIIとSac I に切ったあと、Sac I 部位を鈍
端に作り、その間に前記ASOp＋mSOD１／pBluescript の
Hind III−BamH I断片を挿入してベクターASOp＋mSOD１
／pBI101を得た。最後に、ベクター ASOp ＋mSOD１／pB
I101の選抜標識因子をbar に転換するためにベクターpG
PTV −Bar （Plant Mol ．Biol．２０、１１９５−１１
９７、１９９２；受託番号ATCC７７３９１）を使用し
た。即ち、前記ASOp＋mSOD１／pBI101をHind IIIで切断
しEcoR Iに部分切断（partial digestion ）して得た約
２kb断片をpGPTV −Bar のHind III／EcoR I位置に挿入
してベクターASOp＋mSOD１／pGPTV −Bar を完成した
（図１参照）。完成された前記ベクターをアグロバクテ
リウムトメファシエンスLBA ４４０４に導入させるた
め、大腸菌（E ．coli）から分離したASOp＋mSOD１／ p
GPTV−BarをアグロバクテリウムトメファシエンスLBA
４４０４と混ぜて液体窒素に５分間浸したあと、３７℃
で５分間置いた。１ml YEP溶液［１％バクト−ペプトン
（bacto −peptone ）、１％バクト−イースト抽出液
（bacto −yeast extract ）、０．５％塩化ナトリウ
ム］を添加して２８℃で震湯培養した後、５０mg／L カ
ナマイシンと１００mg／L リパンピシンが添加されたYE
P 固体培地［１．５％バクト−アガー（bacto −agar）
を含んだYEP 培地］に敷いて２８℃で二日間培養してコ
ロニー（colony）を得た。前記ベクターが導入された菌
株をアグロバクテリアトメファシエンスLBA ４４０４
（ASOp＋mSOD１／pGPTV −Bar ）と命名して１９９９年
３月６日付で生命工学研究所内の遺伝子銀行に寄託番号
KCTC−０５８５BP号で寄託した。
ムターゼ遺伝子のクロニング及び塩基配列決定と形質転
換発現ベクター製作 前記実施例で開発された不定芽誘導方法を利用してSOD
を高発現して大量製造することのできる形質転換された
きゅうりを開発するため、植物形質転換用発現ベクター
を製造した（図１参照）。本実施例で使用された植物形
質転換用発現ベクターは、きゅうり果実に優勢に発現す
るアスコルベートオキシダーゼプロモーターをプロモー
ターとして包含し、カサッバ（Manihot esculenta ）培
養細胞から分離したmSOD１をSOD 構造遺伝子として包含
し、除草剤であるバスター（Basta ）に対して耐性を持
たせるbar 遺伝子を選抜標識因子（selection marker）
として包含する。本実施例では前記ベクターを制作する
ため、先ずカサッバでSOD 遺伝子をクロニングしその塩
基配列を決定した。SOD 遺伝子は３０種以上の多い植物
から分離されているが、本発明ではSOD 高生産細胞株に
選抜されたカサッバ培養細胞から最初に分離したCuZn
SOD 遺伝子（mSOD１、配列番号１）を使用した。カサッ
バから全長（full−length）のSOD cDNAをクロニング
するため、先ずUni −ZAPベクター（Staratagene 社）
を利用して制作されたカサッバ培養細胞のcDNAライブラ
リ（library ）を探索（screening ）した。より詳しく
は、先ずSOD 高生産細胞株に選抜されたカサッバ培養細
胞の継代培養２０日目の細胞から精製したmRNAを鋳型で
cDNAを PCRで合成した後、Gigapack IIIパッキジング抽
出物（Gigapack III packaging extract、Stratagene
社）を利用して４×１０5pfu（plaque forming unit ）
のcDNAライブラリを制作したし、これらを２×１０10pf
u ／mLに増幅させることでカサッバ培養細胞のcDNAライ
ブラリを完成した。カサッバ培養細胞cDNAライブラリス
クリニングに使用する探針（probe ）を合成するため、
既に知られている多種類の植物体SOD 塩基配列のうち相
同性の高い部分から制作された配列番号３のSODF１と配
列番号４のSODR２の変形性プライマー（degenerated pr
imer）を使用したし、上から完成したカサッバcDNAライ
ブラリを鋳型で利用した。二つのプライマーを使用して
合成された３１２bpのPCR 産物をpBluescript ベクター
（Stratagene社）のEcoRV 位置に接合（ligation）した
あと、E ．coliに導入したし、これからプラスミド DNA
を分離したあと、X ba Iとsal I を処理して約０．５kb
の挿入配列を有したプラスミドを選抜した。選抜された
プラスミドの塩基配列を決定した結果SOD 遺伝子である
ことが確認された。これをカサッバ培養細胞のcDNAライ
ブラリを探索するための探針として利用した。カサッバ
培養細胞SOD 遺伝子のクロニングのためのcDNAライブラ
リ探索は、前記０．５kbのPCR 産物を32P −dCTPで標識
して遂行した。４×１０6pfuのパージライブラリを２回
にかけてスクリーニングした結果、５０余個の独立した
プラグ（plaque）を得た。そのうち、１０個を選抜して
塩基配列を決定した結果、配列番号１の塩基配列を有す
る一つの全長（full length ）CuZnSOD cDNA（mSOD
１）を分離した。カサッバ培養細胞から分離したmSOD１
は８０１bpで、１５２個のアミノ酸になったORF （open
reading frame）を有し、ポリ（A ）テール［poly−
（A ）tail］と暫定的なポリ（A ）テール信号（polyad
enylation signal ）であるAATAAA配列を有していた
し、この配列はポリ（A ）テールの１９０bp上流（upst
ream）に位置した（配列番号１参照）。前記ORF を塩基
配列を翻訳して得たアミノ酸配列（配列番号１参照及び
配列番号２参照）を他の植物体のCuZnSOD のアミノ酸配
列と比較した結果、５個所（MVKAEAVL、PGLHGFHVH 、GD
TTNGC 、DDLGRGGHELS 、TGNAGGR ）のアミノ酸配列がよ
く保存されていた。特に暫定的な銅結合座（His−４
５、His −４７、His −６２、His −７０、His −７
９、Asp −８２、His−１１９）が存在した。前記でク
ロニングしたカサッバSOD （mSOD１）、きゅうりの果実
優勢発現プロモーターであるASO プロモーター及びバス
ター抵抗性遺伝子bar を連結した植物形質転換用ベクタ
ー（図１参照）を製作するために、先ずASO プロモータ
ーをpBluescript （Stratagene社）に挿入した。即ち、
日本奈良先端大学院大学で分譲されたASO プロモーター
（Ann ．N ．Y ．Acad．Sci ．７２１．２４５−２４
７、１９９４）をHind IIIとEcoR Iの制限酵素配列を有
しているプライマー（配列番号５、配列番号６）でPCR
増幅させた後、このPCR 産物（約１．１kb）をHindIII
とEcoR Iで切断してpBluescript KSベクターのHind III
／EcoR Iの位置に挿入してベクターASOp／pBluescript
を得た。先に分離されたmSOD１遺伝子をASOp／pBluescr
ipt に挿入するため、Pst I とBamH Iの制限酵素配列を
有したプライマー（配列番号７、配列番号８）と全長の
mSOD１ cDNA 鋳型を利用してmSOD１PCR 産物（約０．７
８kb）を得て、更にこのPCR 産物を前記ベクターのPst
I ／BamH I間に挿入してベクターASOp＋mSOD１／pBlues
cript を得た。ASOp＋mSOD１のHind III−BamH I断片を
植物形質転換用バイナリベクター（binary vector ）で
あるpBI101（Clontech社）に挿入させるため、前記ASOp
＋mSOD１／pBluescript をHind IIIとBamH Iに切断した
あと、BamH I位置を鈍端（blunt end ）に作る傍ら、pB
I101をHind IIIとSac I に切ったあと、Sac I 部位を鈍
端に作り、その間に前記ASOp＋mSOD１／pBluescript の
Hind III−BamH I断片を挿入してベクターASOp＋mSOD１
／pBI101を得た。最後に、ベクター ASOp ＋mSOD１／pB
I101の選抜標識因子をbar に転換するためにベクターpG
PTV −Bar （Plant Mol ．Biol．２０、１１９５−１１
９７、１９９２；受託番号ATCC７７３９１）を使用し
た。即ち、前記ASOp＋mSOD１／pBI101をHind IIIで切断
しEcoR Iに部分切断（partial digestion ）して得た約
２kb断片をpGPTV −Bar のHind III／EcoR I位置に挿入
してベクターASOp＋mSOD１／pGPTV −Bar を完成した
（図１参照）。完成された前記ベクターをアグロバクテ
リウムトメファシエンスLBA ４４０４に導入させるた
め、大腸菌（E ．coli）から分離したASOp＋mSOD１／ p
GPTV−BarをアグロバクテリウムトメファシエンスLBA
４４０４と混ぜて液体窒素に５分間浸したあと、３７℃
で５分間置いた。１ml YEP溶液［１％バクト−ペプトン
（bacto −peptone ）、１％バクト−イースト抽出液
（bacto −yeast extract ）、０．５％塩化ナトリウ
ム］を添加して２８℃で震湯培養した後、５０mg／L カ
ナマイシンと１００mg／L リパンピシンが添加されたYE
P 固体培地［１．５％バクト−アガー（bacto −agar）
を含んだYEP 培地］に敷いて２８℃で二日間培養してコ
ロニー（colony）を得た。前記ベクターが導入された菌
株をアグロバクテリアトメファシエンスLBA ４４０４
（ASOp＋mSOD１／pGPTV −Bar ）と命名して１９９９年
３月６日付で生命工学研究所内の遺伝子銀行に寄託番号
KCTC−０５８５BP号で寄託した。
【００１６】実施例４．きゅうり下胚軸切断面からのSO
D 遺伝子導入と形質転換きゅうりの製造 本発明の不定芽誘導法は有用な外来遺伝子を導入させた
形質転換植物体を効率的に得るのに有用である。本実施
例においてはきゅうり幼植物体下胚軸切断面に前記アグ
ロバクテリウムトメファシエンスLBA ４４０４（ASOp＋
mSOD１／ pGPTV−Bar ）を感染させることで前記ベクタ
ーをきゅうりに導入した。先ず、前記実施例１で例示さ
れた方法の通り、きゅうり種子を無菌状態でMS培地で発
芽させて発芽された幼植物体の下胚軸の上部分中の一部
を切断したあと、子葉と下胚軸上部分のある切片体を５
０mg／L カナマイシンと１００mg／L リパンピシン（ri
fampicin）が添加された YEP溶液で二日間育ったアグロ
バクテリアと共に３時間共同培養したあと、水分を除去
し２．０mg／L ゼアチンが含有されたMS寒天培地に下胚
軸切断面が培地に接するようにして約１５μmol m -2・
s -1の蛍光光条件で明１６時間、暗８時間の光周期、２
５±１℃の培養室で四日間培養した。その次に幼植物体
の下胚軸切片体を２．０mg／L ゼアチン、３００mg／L
クラフォラン（claforan）と２．０mg／L バスターが含
有されたMS寒天培地（選抜培地）に移してアグロバクテ
リウムを除去しながら形質転換された不定芽を選抜し
た。このとき、１週間隔に同一選抜培地で継代培養しな
がらバスター抵抗性を有した形質転換された不定芽を誘
導した（図６a 参照）。選抜培地で４週間培養したとき
下胚軸切断面からバスター抵抗性を有した不定芽が誘導
された。このように誘導された不定芽を選抜して葉っぱ
が発達した後にそれぞれの個体を１．０mg／L インドー
ル酢酸が添加された培地（根誘導培地）に移して根を誘
導した後（図６b 参照）、形質転換された個体を馴化さ
せたあと、花鉢に移して温室で生育させた（図６c 参
照）。葉っぱの数が３−４枚ほど育った幼植物体のう
ち、１０個体を任意に選抜して葉っぱから染色体DNA
（genomic DNA）を分離したあと、きゅうり植物体への
bar 遺伝子導入要否をPCR で確認した。このとき用いた
プライマーは配列番号９と配列番号１０によりそれぞれ
記載される。その結果、バスター抵抗性を有した個体の
約６０％から０．５kbのbar 遺伝子のバンドが確認され
た（図７参照）。PCR により形質転換が確認された個体
を馴化させたあと、花鉢に移して温室で生育させた。本
実施例を通じてきゅうりの果実で優勢に発現するプロモ
ーターを利用してSOD 遺伝子をきゅうり植物体に導入し
て正常的な植物体に発達させ得ることが確認された。
D 遺伝子導入と形質転換きゅうりの製造 本発明の不定芽誘導法は有用な外来遺伝子を導入させた
形質転換植物体を効率的に得るのに有用である。本実施
例においてはきゅうり幼植物体下胚軸切断面に前記アグ
ロバクテリウムトメファシエンスLBA ４４０４（ASOp＋
mSOD１／ pGPTV−Bar ）を感染させることで前記ベクタ
ーをきゅうりに導入した。先ず、前記実施例１で例示さ
れた方法の通り、きゅうり種子を無菌状態でMS培地で発
芽させて発芽された幼植物体の下胚軸の上部分中の一部
を切断したあと、子葉と下胚軸上部分のある切片体を５
０mg／L カナマイシンと１００mg／L リパンピシン（ri
fampicin）が添加された YEP溶液で二日間育ったアグロ
バクテリアと共に３時間共同培養したあと、水分を除去
し２．０mg／L ゼアチンが含有されたMS寒天培地に下胚
軸切断面が培地に接するようにして約１５μmol m -2・
s -1の蛍光光条件で明１６時間、暗８時間の光周期、２
５±１℃の培養室で四日間培養した。その次に幼植物体
の下胚軸切片体を２．０mg／L ゼアチン、３００mg／L
クラフォラン（claforan）と２．０mg／L バスターが含
有されたMS寒天培地（選抜培地）に移してアグロバクテ
リウムを除去しながら形質転換された不定芽を選抜し
た。このとき、１週間隔に同一選抜培地で継代培養しな
がらバスター抵抗性を有した形質転換された不定芽を誘
導した（図６a 参照）。選抜培地で４週間培養したとき
下胚軸切断面からバスター抵抗性を有した不定芽が誘導
された。このように誘導された不定芽を選抜して葉っぱ
が発達した後にそれぞれの個体を１．０mg／L インドー
ル酢酸が添加された培地（根誘導培地）に移して根を誘
導した後（図６b 参照）、形質転換された個体を馴化さ
せたあと、花鉢に移して温室で生育させた（図６c 参
照）。葉っぱの数が３−４枚ほど育った幼植物体のう
ち、１０個体を任意に選抜して葉っぱから染色体DNA
（genomic DNA）を分離したあと、きゅうり植物体への
bar 遺伝子導入要否をPCR で確認した。このとき用いた
プライマーは配列番号９と配列番号１０によりそれぞれ
記載される。その結果、バスター抵抗性を有した個体の
約６０％から０．５kbのbar 遺伝子のバンドが確認され
た（図７参照）。PCR により形質転換が確認された個体
を馴化させたあと、花鉢に移して温室で生育させた。本
実施例を通じてきゅうりの果実で優勢に発現するプロモ
ーターを利用してSOD 遺伝子をきゅうり植物体に導入し
て正常的な植物体に発達させ得ることが確認された。
【００１７】
【発明の効果】前記で察してみた通り、本発明は、きゅ
うり果実に優勢に発現するプロモーター（ASO promote
r）、SOD 酵素遺伝子（mSOD１）、除草剤抵抗性遺伝子
（bar ）を含む植物形質転換用発現プラスミドを導入し
たアグロバクテリアを利用して形質転換させ、このとき
発芽された種子から下胚軸切断面から得られた不定芽か
ら植物体を再分化させることで、従来品種より果実にず
っと高いSOD 活性を有する植物体特にきゅうり果実を製
造することができる。これらSOD を大量生産するきゅう
り植物体は皮膚マッサージ用パックを含んだ化粧品の材
料、機能性食品の添加剤、医薬品などで有用に使用され
ることでできるだけでなく、除草剤耐性及び環境ストレ
ス耐性で利用が期待される。また、本発明の植物体再分
化方法は既存の組織培養法よりずっと確実で便利に再分
化植物体及び形質転換された再分化植物体増殖などに適
用することができるので、不定芽及び体細胞胚の誘導が
難しくて植物体再分化頻度が低くまたは再分化ができな
くて個体増殖が難しい植物に適用でき、有用植物の大量
繁殖、有用形質転換植物体開発などに有用に使用され得
る。 配列目録： （１）一般情報 出願人：韓国化学技術院 発明の名称：スーパオキシドジスムターゼを大量生産する形質転換されたきゅう りの製造方法 配列の数：１０ （２）配列番号１の情報 配列の特性： 長さ：８０１ タイプ：DNA 鎖の数：２重 形態：直線状 起源：Manihot esculenta 配列の特徴： 特徴を示す記号：コーディング配列 存在位置：（５５）．．（５１０） 配列の特徴： 特徴を示す記号： polyA site 存在位置：（７８１）．．（８０１） 配列の特徴： 特徴を示す記号：polyA signal 存在位置：（６１１）．．（６１６） 配列の表示：配列番号１ tctcgatctt ctctgtctaa gctctaaagg ggtgctctga gatcacgtaa aaca 54a tg gtg aag gct gaa gct gtt ctt acc agt agt gag ggg gtt agc gga 1 02 Met Val Lys Ala Glu Ala Val Leu Thr Ser Ser Glu Gly Val Ser Gly 1 5 10 15 aca atc ttc ttt acc caa gaa gga gat ggt cct acc act gta act gga 150 Thr Ile Phe Phe Thr Gln Glu Gly Asp Gly Pro Thr Thr Val Thr Gly 20 25 30 aac att tcc ggc ctt aag cca ggg ctt cat ggg ttc cac gtc cat gcc 198 Asn Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Leu His Gly Phe His Val His Ala 35 40 45 ctt gga gac aca aca aac ggt tgc atg tca act ggg cca cac ttt aac 246 Leu Gly Asp Thr Thr Asn Gly Cys Met Ser Thr Gly Pro His Phe Asn 50 55 60 cct tct ggc aaa gat cat ggt gcc cct gag gat gag att cgt cat gct 294 Pro Ser Gly Lys Asp His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Ile Arg His Ala 65 70 75 80 ggt gat ctg gga aat gtc act gct ggt gat gat ggc act gct agt ttc 342 Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Asp Asp Gly Thr Ala Ser Phe 85 90 95 aca att att gac aag cat att cct ctt tct ggt caa aat tca atc ata 390 Thr Ile Ile Asp Lys His Ile Pro Leu Ser Gly Gln Asn Ser Ile Ile 100 105 110 gga agg gca gtt gtt gtt cat gca gat cct gat gat ctt ggc agg gga 438 Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Asp Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly 115 120 125 gga cat gaa ctc agt aaa acc acc gga aat gct ggt ggc aga gta gca 4 86 Gly His Glu Leu Ser Lys Thr Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Val Ala 130 135 140 tgc ggt att att ggt ttg cga gga tagagtgctt ctccagagat caataacaag 5 40 Cys Gly Ile Ile Gly Leu Arg Gly 145 150 acaaagacag ctgaaacatg cacagccgga caacctttag aagaacgtta ggagaccatt 6 00 aactcatttg aataaaagaa agaataatac tgtagttttg gctggtttgg tcttgtgatc 6 60 tcaagatggt gtatgctttg tatggtttcg tgaagtttat tgaactttga actttttcga 7 20 atggtagggc ttgctctttg tctggtccaa attcaggccg tggatgtttt atactgcttt 7 80 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 801 （２）配列番号２の情報 配列の特性： 長さ：１５２ タイプ：蛋白質 起源：Manihot esculenta 配列の表示：配列番号２ Met Val Lys Ala Glu Ala Val Leu Thr Ser Ser Glu Gly Val Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ile Phe Phe Thr Gln Glu Gly Asp Gly Pro Thr Thr Val Thr Gly 20 25 30 Asn Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Leu His Gly Phe His Val His Ala 35 40 45 Leu Gly Asp Thr Thr Asn Gly Cys Met Ser Thr Gly Pro His Phe Asn 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Asp His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Ile Arg His Ala 65 70 75 80 Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Asp Asp Gly Thr Ala Ser Phe 85 90 95 Thr Ile Ile Asp Lys His Ile Pro Leu Ser Gly Gln Asn Ser Ile Ile 100 105 110 Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Asp Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly 115 120 125 Gly His Glu Leu Ser Lys Thr Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Val Ala 130 135 140 Cys Gly Ile Ile Gly Leu Arg Gly 145 150 （２）配列番号３の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：degenerate primer SODF１ 配列の表示：配列番号３ cttggncttc atggnttcca （２）配列番号４の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：degenerate primer SODR２ 配列の表示：配列番号４ ctnccaccag catttccagt （２）配列番号５の情報 配列の特性： 長さ：３２ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Hind III−tag PCR primer for ASOp 配列の表示：配列番号５ gcgcaagctt ctaaatattc tcttttaatt tg （２）配列番号６の情報 配列の特性： 長さ：２４ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：EcoR I−tag PCR primer for ASOp 配列の表示：配列番号６ gcgcgaattc ttcgaagggt tgag （２）配列番号７の情報 配列の特性： 長さ：２５ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Pst I −tag PCR primer for msod １ 配列の表示：７ gcgcctgcag tctcgatctt ctctg （２）配列番号８の情報 配列の特性： 長さ：２５ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：BamH I−tag PCR primer for msod１ 配列の表示：配列番号８ gcgcggatcc aacatccacg gcctg （２）配列番号９の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Bar primer１ 配列の表示：配列番号９ ggtctgcacc atcgtcaacc （２）配列番号１０の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Bar primer２ 配列の表示：配列番号１０ tcagatctcg gtgacgggca
うり果実に優勢に発現するプロモーター（ASO promote
r）、SOD 酵素遺伝子（mSOD１）、除草剤抵抗性遺伝子
（bar ）を含む植物形質転換用発現プラスミドを導入し
たアグロバクテリアを利用して形質転換させ、このとき
発芽された種子から下胚軸切断面から得られた不定芽か
ら植物体を再分化させることで、従来品種より果実にず
っと高いSOD 活性を有する植物体特にきゅうり果実を製
造することができる。これらSOD を大量生産するきゅう
り植物体は皮膚マッサージ用パックを含んだ化粧品の材
料、機能性食品の添加剤、医薬品などで有用に使用され
ることでできるだけでなく、除草剤耐性及び環境ストレ
ス耐性で利用が期待される。また、本発明の植物体再分
化方法は既存の組織培養法よりずっと確実で便利に再分
化植物体及び形質転換された再分化植物体増殖などに適
用することができるので、不定芽及び体細胞胚の誘導が
難しくて植物体再分化頻度が低くまたは再分化ができな
くて個体増殖が難しい植物に適用でき、有用植物の大量
繁殖、有用形質転換植物体開発などに有用に使用され得
る。 配列目録： （１）一般情報 出願人：韓国化学技術院 発明の名称：スーパオキシドジスムターゼを大量生産する形質転換されたきゅう りの製造方法 配列の数：１０ （２）配列番号１の情報 配列の特性： 長さ：８０１ タイプ：DNA 鎖の数：２重 形態：直線状 起源：Manihot esculenta 配列の特徴： 特徴を示す記号：コーディング配列 存在位置：（５５）．．（５１０） 配列の特徴： 特徴を示す記号： polyA site 存在位置：（７８１）．．（８０１） 配列の特徴： 特徴を示す記号：polyA signal 存在位置：（６１１）．．（６１６） 配列の表示：配列番号１ tctcgatctt ctctgtctaa gctctaaagg ggtgctctga gatcacgtaa aaca 54a tg gtg aag gct gaa gct gtt ctt acc agt agt gag ggg gtt agc gga 1 02 Met Val Lys Ala Glu Ala Val Leu Thr Ser Ser Glu Gly Val Ser Gly 1 5 10 15 aca atc ttc ttt acc caa gaa gga gat ggt cct acc act gta act gga 150 Thr Ile Phe Phe Thr Gln Glu Gly Asp Gly Pro Thr Thr Val Thr Gly 20 25 30 aac att tcc ggc ctt aag cca ggg ctt cat ggg ttc cac gtc cat gcc 198 Asn Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Leu His Gly Phe His Val His Ala 35 40 45 ctt gga gac aca aca aac ggt tgc atg tca act ggg cca cac ttt aac 246 Leu Gly Asp Thr Thr Asn Gly Cys Met Ser Thr Gly Pro His Phe Asn 50 55 60 cct tct ggc aaa gat cat ggt gcc cct gag gat gag att cgt cat gct 294 Pro Ser Gly Lys Asp His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Ile Arg His Ala 65 70 75 80 ggt gat ctg gga aat gtc act gct ggt gat gat ggc act gct agt ttc 342 Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Asp Asp Gly Thr Ala Ser Phe 85 90 95 aca att att gac aag cat att cct ctt tct ggt caa aat tca atc ata 390 Thr Ile Ile Asp Lys His Ile Pro Leu Ser Gly Gln Asn Ser Ile Ile 100 105 110 gga agg gca gtt gtt gtt cat gca gat cct gat gat ctt ggc agg gga 438 Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Asp Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly 115 120 125 gga cat gaa ctc agt aaa acc acc gga aat gct ggt ggc aga gta gca 4 86 Gly His Glu Leu Ser Lys Thr Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Val Ala 130 135 140 tgc ggt att att ggt ttg cga gga tagagtgctt ctccagagat caataacaag 5 40 Cys Gly Ile Ile Gly Leu Arg Gly 145 150 acaaagacag ctgaaacatg cacagccgga caacctttag aagaacgtta ggagaccatt 6 00 aactcatttg aataaaagaa agaataatac tgtagttttg gctggtttgg tcttgtgatc 6 60 tcaagatggt gtatgctttg tatggtttcg tgaagtttat tgaactttga actttttcga 7 20 atggtagggc ttgctctttg tctggtccaa attcaggccg tggatgtttt atactgcttt 7 80 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 801 （２）配列番号２の情報 配列の特性： 長さ：１５２ タイプ：蛋白質 起源：Manihot esculenta 配列の表示：配列番号２ Met Val Lys Ala Glu Ala Val Leu Thr Ser Ser Glu Gly Val Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ile Phe Phe Thr Gln Glu Gly Asp Gly Pro Thr Thr Val Thr Gly 20 25 30 Asn Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Leu His Gly Phe His Val His Ala 35 40 45 Leu Gly Asp Thr Thr Asn Gly Cys Met Ser Thr Gly Pro His Phe Asn 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Asp His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Ile Arg His Ala 65 70 75 80 Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Asp Asp Gly Thr Ala Ser Phe 85 90 95 Thr Ile Ile Asp Lys His Ile Pro Leu Ser Gly Gln Asn Ser Ile Ile 100 105 110 Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Asp Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly 115 120 125 Gly His Glu Leu Ser Lys Thr Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Val Ala 130 135 140 Cys Gly Ile Ile Gly Leu Arg Gly 145 150 （２）配列番号３の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：degenerate primer SODF１ 配列の表示：配列番号３ cttggncttc atggnttcca （２）配列番号４の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：degenerate primer SODR２ 配列の表示：配列番号４ ctnccaccag catttccagt （２）配列番号５の情報 配列の特性： 長さ：３２ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Hind III−tag PCR primer for ASOp 配列の表示：配列番号５ gcgcaagctt ctaaatattc tcttttaatt tg （２）配列番号６の情報 配列の特性： 長さ：２４ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：EcoR I−tag PCR primer for ASOp 配列の表示：配列番号６ gcgcgaattc ttcgaagggt tgag （２）配列番号７の情報 配列の特性： 長さ：２５ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Pst I −tag PCR primer for msod １ 配列の表示：７ gcgcctgcag tctcgatctt ctctg （２）配列番号８の情報 配列の特性： 長さ：２５ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：BamH I−tag PCR primer for msod１ 配列の表示：配列番号８ gcgcggatcc aacatccacg gcctg （２）配列番号９の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Bar primer１ 配列の表示：配列番号９ ggtctgcacc atcgtcaacc （２）配列番号１０の情報 配列の特性： 長さ：２０ タイプ：DNA 鎖の数：１重 形態：直線状 分子の種類：ヘキサン（合成オリゴヌクレオチド） 配列の特徴： その他情報：Bar primer２ 配列の表示：配列番号１０ tcagatctcg gtgacgggca
【図１】本発明で使用した植物形質転換用発現ベクター
システムを示したものである。
システムを示したものである。
【図２】きゅうり幼植物体の下胚軸切断面から不定芽を
誘導したあと、根を誘導して完全な植物体を得る過程を
示したものである。 ２ａ：下胚軸切断面から不定芽が誘導されたもの ２ｂ：前記不定芽から葉っぱが発達したもの ２ｃ：根が誘導されたもの ２ｄ：花鉢に移され馴化された再分化植物体を示したも
の
誘導したあと、根を誘導して完全な植物体を得る過程を
示したものである。 ２ａ：下胚軸切断面から不定芽が誘導されたもの ２ｂ：前記不定芽から葉っぱが発達したもの ２ｃ：根が誘導されたもの ２ｄ：花鉢に移され馴化された再分化植物体を示したも
の
【図３】きゅうり幼植物体の下胚軸切断面から不定芽誘
導のとき、種子の発芽日数にしたがう不定芽誘導率を示
したものである。 ２Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を二つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 １Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を一つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 （１／２Ｃ＋１／２Ｃ）＋Ｈ：半分に切断された子葉を
二つ有した幼植物体の下胚軸切断面においての不定芽誘
導率、 １／２Ｃ：子葉切片のみを培養したときの不定芽誘導率
を示す。
導のとき、種子の発芽日数にしたがう不定芽誘導率を示
したものである。 ２Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を二つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 １Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を一つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 （１／２Ｃ＋１／２Ｃ）＋Ｈ：半分に切断された子葉を
二つ有した幼植物体の下胚軸切断面においての不定芽誘
導率、 １／２Ｃ：子葉切片のみを培養したときの不定芽誘導率
を示す。
【図４】きゅうり種子の発芽５日目の幼植物体の切断さ
れた下胚軸から不定芽誘導のとき、下胚軸の長さによる
不定芽誘導率を示したものであり、 ２Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を二つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 １Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を一つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 （１／２Ｃ＋１／２Ｃ）＋Ｈ：半分に切断された子葉を
二つ有した幼植物体の下胚軸切断面においての不定芽誘
導率を示したものである。
れた下胚軸から不定芽誘導のとき、下胚軸の長さによる
不定芽誘導率を示したものであり、 ２Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を二つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 １Ｃ＋Ｈ：完全な子葉を一つ有した幼植物体の下胚軸切
断面においての不定芽誘導率、 （１／２Ｃ＋１／２Ｃ）＋Ｈ：半分に切断された子葉を
二つ有した幼植物体の下胚軸切断面においての不定芽誘
導率を示したものである。
【図５】枸杞、唐辛子、メロン、インゲン豆、ネギ幼植
物体の切断された下胚軸から不定芽が高頻度で誘導され
ることを示したものである。 ５ａ：枸杞幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が高
頻度に誘導されたことを示したものである。 ５ｂ：唐辛子幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が
高頻度に誘導されたものである。 ５ｃ：メロン幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が
高頻度で誘導されたことを示したものである。 ５ｄ：インゲン豆幼植物体の切断された下胚軸から不定
芽が高頻度に誘導されたことを示したものである。 ５ｅ：ネギ幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が高
頻度に誘導されたことを示したものであり、
物体の切断された下胚軸から不定芽が高頻度で誘導され
ることを示したものである。 ５ａ：枸杞幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が高
頻度に誘導されたことを示したものである。 ５ｂ：唐辛子幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が
高頻度に誘導されたものである。 ５ｃ：メロン幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が
高頻度で誘導されたことを示したものである。 ５ｄ：インゲン豆幼植物体の切断された下胚軸から不定
芽が高頻度に誘導されたことを示したものである。 ５ｅ：ネギ幼植物体の切断された下胚軸から不定芽が高
頻度に誘導されたことを示したものであり、
【図６】スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を含んだ
アグロバクテリアをきゅうり下胚軸切断面から得られた
不定芽と共同培養して得た形質転換されたきゅうり幼植
物体の製造過程を示したものである。 ６ａ：形質転換された不定芽 ６ｂ：根が誘導された不定芽 ６ｃ：花鉢で育っている形質転換された個体を示したも
のであり、
アグロバクテリアをきゅうり下胚軸切断面から得られた
不定芽と共同培養して得た形質転換されたきゅうり幼植
物体の製造過程を示したものである。 ６ａ：形質転換された不定芽 ６ｂ：根が誘導された不定芽 ６ｃ：花鉢で育っている形質転換された個体を示したも
のであり、
【図７】形質転換された植物体に導入されたスーパーオ
キシドジスムターゼ遺伝子を重合酵素連鎖反応で確認し
たものである。レーン（lane）１、２、４、５、８、１
０はPCR 結果形質転換体に確認されたもの、N １は非形
質転換体から分離されたDNA を鋳型にしたPCR 産物、N
２はDNA 鋳型を添加していないPCR 産物、M はDNA サイ
ズマーカ（size marker ）、P はベクターASOp＋mSOD１
／pGPTV −Bar を鋳型にしたPCR 産物を示す。
キシドジスムターゼ遺伝子を重合酵素連鎖反応で確認し
たものである。レーン（lane）１、２、４、５、８、１
０はPCR 結果形質転換体に確認されたもの、N １は非形
質転換体から分離されたDNA を鋳型にしたPCR 産物、N
２はDNA 鋳型を添加していないPCR 産物、M はDNA サイ
ズマーカ（size marker ）、P はベクターASOp＋mSOD１
／pGPTV −Bar を鋳型にしたPCR 産物を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｋ 31/00 ６１７ 31/00 ６１７ 35/78 35/78 Ｓ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 9/02 9/02 5/00 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 キム，ジェ−フーネ 大韓民国，テジョン−シ 305−345，ユソ ン−ク，シンスン−ドン 214−16，＃201 (72)発明者 リー，ヘン−スーン 大韓民国，テジョン−シ 305−333，ユソ ン−ク，オウン−ドン，ハンビット エー ピーティ．＃126−502 (72)発明者 クオン，スク−ユーン 大韓民国，テジョン−シ 305−333，ユソ ン−ク，オウン−ドン 99，ハンビット エーピーティ．＃102−1802
Claims (13)
- 【請求項１】きゅうり果実に優勢に発現する遺伝子プロ
モーター、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD ）遺伝
子、除草剤抵抗性bar 遺伝子を含む植物形質転換用発現
ベクターを製造し、この発現ベクターでアグロバクテリ
アを形質転換させて形質転換されたアグロバクテリアを
製造し、形質転換されたアグロバクテリアを植物組織と
共同培養して再分化させることを特徴とする形質転換さ
れた植物体の製造方法。 - 【請求項２】植物体は、きゅうり（Cucumis sativus L
．）、トマト（Lycopersicon esculentum ）、枸杞（L
yciam chinese Mill ）、唐辛子（Capsicum annuum L
．）、メロン（Cucumis melo L．）、インゲン豆（Pha
seolus vulgaris L．）及びネギ（Allium fistulosum L
．）からなる群から選ばれた少なくとも１つであるこ
とを特徴とする請求項１記載の形質転換された植物体の
製造方法。 - 【請求項３】遺伝子プロモーターはきゅうり果実に優勢
に発現するアスコルベートオキシダーゼ（ascorbate ox
idase ）プロモーターを使用することを特徴とする請求
項１または２に記載の形質転換された植物体の製造方
法。 - 【請求項４】スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子はカ
サッバから分離した配列番号１のスーパーオキシドジス
ムターゼ遺伝子（mSOD１）であることを特徴とする請求
項１から３までのいずれかに記載の形質転換された植物
体の製造方法。 - 【請求項５】発現プラスミドはASOp＋mSOD１／pGPTV −
Bar であることを特徴とする請求項１から４までのいず
れかに記載の形質転換された植物体の製造方法。 - 【請求項６】形質転換されたアグロバクテリアは前記発
現プラスミドで形質転換されたアグロバクテリアトメフ
ァシエンス LBA４４０４（ASOp＋mSOD１／pGPTV −Bar
）（受託番号：KCTC０５８５BP）であることを特徴と
する請求項１から５までのいずれかに記載の形質転換さ
れた植物体の製造方法。 - 【請求項７】共同培養方法は幼植物体の下胚軸上部分
（upper hypocotyl ）の一部分を残して切断し、下胚軸
の切断面に形質転換されたアグロバクテリアを感染させ
て、その切断面を不定芽誘導培地に接するようにして培
養することを特徴とする請求項１から６までのいずれか
に記載の形質転換された植物体の製造方法。 - 【請求項８】共同培養したあと、再分化方法は感染され
た組織を選抜培地で培養して、誘導された不定芽を根誘
導培地で苗木に育てたあと、園芸用床土で馴化させるこ
とを特徴とする請求項７記載の形質転換された植物体の
製造方法。 - 【請求項９】下胚軸は下胚軸上部分を２−３mm残してそ
の下部分を切断することを特徴とする請求項７または８
に記載の形質転換された植物体の製造方法。 - 【請求項１０】培養は発芽３−５日目の幼植物体から子
葉が一つまたはそれぞれ１／２が除去された二つを有し
たものを使用することを特徴とする請求項７から９まで
のいずれかに記載の形質転換された植物体の製造方法。 - 【請求項１１】請求項１から１０までのいずれかに記載
の方法により製造された形質転換された植物体。 - 【請求項１２】請求項１１の形質転換された植物体を有
効成分とする皮膚マッサージ用パックを含んだ化粧品の
材料及び機能性食品の添加剤。 - 【請求項１３】除草剤（Basta ）抵抗性植物体に使用さ
れる請求項１１の形質転換された植物体。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019980013205A KR100270910B1 (ko) | 1998-04-14 | 1998-04-14 | 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 대량생산하는 형질전환된 식물체, 그의 제조방법 및 용도 |
| KR1019980033947A KR100311609B1 (ko) | 1998-08-21 | 1998-08-21 | 종자식물 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아를 고빈도로 유도하는 방법 및 이로부터 재분화 식물체와 형질전환 식물체를 제조하는 방법 |
| KR1998-33947 | 1999-04-06 | ||
| KR1998-13205 | 1999-04-06 | ||
| KR1999-11848 | 1999-04-06 | ||
| KR1019990011848A KR100360339B1 (ko) | 1999-04-06 | 1999-04-06 | 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 대량 생산하는 형질전환된 오이의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11341929A true JPH11341929A (ja) | 1999-12-14 |
| JP3307604B2 JP3307604B2 (ja) | 2002-07-24 |
Family
ID=27349712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10593399A Expired - Fee Related JP3307604B2 (ja) | 1998-04-14 | 1999-04-13 | スーパーオキシドジスムターゼを大量生産する形質転換されたきゅうりの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6084152A (ja) |
| EP (1) | EP0952224B1 (ja) |
| JP (1) | JP3307604B2 (ja) |
| DE (1) | DE69918216D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102870674A (zh) * | 2012-09-05 | 2013-01-16 | 广州白云华南生物科技有限公司 | 一种红葱组培快速繁殖方法 |
| CN111909953A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-11-10 | 东北林业大学 | 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法 |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6544399B1 (en) | 1999-01-11 | 2003-04-08 | Applied Materials, Inc. | Electrodeposition chemistry for filling apertures with reflective metal |
| KR100447920B1 (ko) * | 2002-01-09 | 2004-09-08 | (주)넥스젠 | 오이 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 오이 |
| NL1022270C2 (nl) | 2002-12-24 | 2004-06-25 | Nunhems Zaden Bv | Volledige echte meeldauwresistentie en volledige vrijheid van necrose in komkommer, Cucumis sativus L. |
| JP5771611B2 (ja) * | 2009-09-02 | 2015-09-02 | アクセス ビジネス グループ インターナショナル エルエルシーＡｃｃｅｓｓ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｌｃ | 皮膚修復のための組成物および方法 |
| US8847022B2 (en) | 2012-10-19 | 2014-09-30 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 55507 CUP |
| US9234207B2 (en) | 2012-11-05 | 2016-01-12 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 5545 CUP |
| FR2999386B1 (fr) * | 2012-12-17 | 2015-04-03 | Bionov | Composition pour stimuler la vitalite des plantes |
| US10172316B2 (en) | 2015-03-10 | 2019-01-08 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 53016 CUP |
| US10172315B2 (en) | 2015-03-10 | 2019-01-08 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 55513 CUP |
| US10201145B2 (en) | 2015-03-10 | 2019-02-12 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 52007 CUP |
| US10098311B2 (en) | 2015-09-15 | 2018-10-16 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 43003 CUL |
| US10064352B2 (en) | 2015-10-07 | 2018-09-04 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 53019 CUP |
| US10492409B2 (en) | 2016-12-01 | 2019-12-03 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 55516 CUP |
| US10271504B2 (en) | 2016-12-07 | 2019-04-30 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 53031 CUP |
| US10264753B2 (en) | 2016-12-07 | 2019-04-23 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 53025 CUP |
| US10448592B2 (en) | 2017-03-21 | 2019-10-22 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 52010 CUP |
| US10709102B2 (en) | 2017-06-01 | 2020-07-14 | Nunhems B.V. | Tomato variety NUN 09194 TOF |
| US10716272B2 (en) | 2017-08-04 | 2020-07-21 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 51024 CUP |
| EP3846773B1 (en) * | 2018-09-03 | 2023-12-20 | Arterra Bioscience S.p.A. | Industrial applications of plant cell extracts comprising sod enzymes of extremophilic micro-organisms |
| CN110583411A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-20 | 怀化市九天界生态农业科技有限公司 | 一种黄精育苗方法 |
| US11690340B2 (en) | 2020-02-28 | 2023-07-04 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 53050 CUP |
| US11445673B2 (en) | 2020-07-02 | 2022-09-20 | Nunhems B.V. | Cucumber variety NUN 83067 CUL |
| CN111926033A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-11-13 | 上海交通大学 | 一种基于草铵膦为筛选标记的甜瓜遗传转化方法 |
| CA3124484A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-12 | Nunhems B.V. | Cucumber variety nun 32361 cus |
| CN113462663A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-10-01 | 贵州百穗农特产品有限公司 | 一种超氧化物歧化酶的生产方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4943674A (en) * | 1987-05-26 | 1990-07-24 | Calgene, Inc. | Fruit specific transcriptional factors |
| US5538878A (en) * | 1988-08-08 | 1996-07-23 | Calgene, Inc. | Superoxide dismutase expression in plants |
| EP0359617A3 (en) * | 1988-09-02 | 1990-04-04 | Plant Genetic Systems, N.V. | Stress-tolerant plants |
| FR2651504B1 (fr) * | 1989-08-11 | 1993-09-10 | Biosem | Plantes transgeniques appartenant a l'espece cucumis melo. |
| FR2716884B1 (fr) * | 1994-03-03 | 1996-10-04 | Bio Obtention Sc | Extrait protéique de cucumis melo à activité antioxydante et procédé de préparation, composition cosmétique ou pharmaceutique ou composition alimentaire contenant un tel extrait. |
-
1999
- 1999-04-13 JP JP10593399A patent/JP3307604B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-14 DE DE69918216T patent/DE69918216D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-14 EP EP99302909A patent/EP0952224B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-14 US US09/291,562 patent/US6084152A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102870674A (zh) * | 2012-09-05 | 2013-01-16 | 广州白云华南生物科技有限公司 | 一种红葱组培快速繁殖方法 |
| CN111909953A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-11-10 | 东北林业大学 | 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法 |
| CN111909953B (zh) * | 2020-06-05 | 2023-07-07 | 东北林业大学 | 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3307604B2 (ja) | 2002-07-24 |
| EP0952224B1 (en) | 2004-06-23 |
| EP0952224A3 (en) | 2001-04-04 |
| US6084152A (en) | 2000-07-04 |
| DE69918216D1 (de) | 2004-07-29 |
| EP0952224A2 (en) | 1999-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3307604B2 (ja) | スーパーオキシドジスムターゼを大量生産する形質転換されたきゅうりの製造方法 | |
| KR19990072163A (ko) | 인디카벼의형질전환방법 | |
| Hu et al. | A combination of overgrowth-control antibiotics improves Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation efficiency for cultivated tomato (L. esculentum) | |
| RU2333245C2 (ru) | Способы получения растений с улучшенным ростом в условиях ограничения уровня азота | |
| JP3174048B2 (ja) | ＣｕｃｕｍｉｓＭｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物 | |
| Wada et al. | Stable and efficient transformation of apple | |
| US20050150015A1 (en) | Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same | |
| JP5020253B2 (ja) | 花茎組織を用いたハクサイの形質転換体の製造方法及びそれから生産される軟腐病抵抗性の向上した形質転換体 | |
| KR100402513B1 (ko) | 유전자 조작을 통한 식물체의 효과적인 형질전환 방법 | |
| KR100270910B1 (ko) | 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 대량생산하는 형질전환된 식물체, 그의 제조방법 및 용도 | |
| KR100856930B1 (ko) | 자트로파 속 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 자트로파 | |
| JPWO2006057306A1 (ja) | ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法 | |
| KR101987663B1 (ko) | 식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법 | |
| CN109956996B (zh) | 一种谷子产量相关蛋白SiAMP1及其编码基因与应用 | |
| JPH10512451A (ja) | グルタチオンｓ−トランスフェラーゼをコードするデオキシリボ核酸およびその使用 | |
| KR100360339B1 (ko) | 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 대량 생산하는 형질전환된 오이의 제조방법 | |
| KR100711144B1 (ko) | 수세미 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 수세미 | |
| KR100447920B1 (ko) | 오이 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 오이 | |
| CN113264992A (zh) | 一种梨形番茄材料的制备方法 | |
| CN116574701B (zh) | 组蛋白去甲基化酶SlJMJ10及其编码基因和在调控番茄果实大小中的应用 | |
| KR100496028B1 (ko) | 제초제 저항성 고추 식물체의 제조방법 | |
| CN109439678B (zh) | 番茄samdc1基因在培育无籽番茄中的应用 | |
| KR101198648B1 (ko) | 직접 신초 유도를 통한 오이 계통의 형질전환 방법 및 상기방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체 | |
| KR100953762B1 (ko) | 벼에서 분리된 병 저항성 증진 및 단간 유도 유전자를포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질 전환체, 및 이 형질전환체의 제조방법 | |
| KR100471131B1 (ko) | ＧＬＯａｓｅ 유전자 및 ＰＭＩ 유전자를 함유한 재조합벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물 및 그 식물의 생산방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |