CN102870674A

CN102870674A - 一种红葱组培快速繁殖方法

Info

Publication number: CN102870674A
Application number: CN2012103249680A
Authority: CN
Inventors: 李武; 郑锦荣; 王红星; 王洪峰
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUN HUANAN BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUN HUANAN BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2012-09-05
Filing date: 2012-09-05
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-05
Also published as: CN102870674B

Abstract

本发明公开了一种红葱组培快速繁殖方法，包括如下步骤：剥离红葱鳞茎的叶鞘，挑取无菌的茎尖接种于培养基进行茎尖萌芽培养，至茎尖增长3～5cm；将单芽去除顶端优势后转接于培养基进行丛生芽诱导培养，至诱导出2～5个侧芽；将丛生芽切割成单芽后转接于培养基进行鳞茎诱导与生根培养，诱导出鳞茎且生根。本发明建立了优系红葱的快速繁殖体系，实现了种苗的工厂化育苗生产，实现了快速大量繁殖优系红葱品种。本发明方法简单，快速高效，有效提高了红葱种苗的繁殖效率，采用本发明方法1个鳞茎经一年时间能变成至少10000个鳞茎，即能快速大量繁殖优系品种。

Description

一种红葱组培快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物的组织培养及繁殖方法，具体涉及一种红葱组培快速繁殖方法。

背景技术

红葱（Eleutherine plicata Herb.）又名小红蒜、红葱头、百步还阳、帕波亮，系鸢尾科红葱属多年生草本植物。鳞茎卵圆形，直径2～2.5cm，鳞片肥厚，紫红色，无膜质包被。根柔嫩，黄褐色。叶互生；叶片宽条形或披针形，长25～40cm，宽1.2～2cm，先端渐尖，基部抱茎，有4～5条主脉平行而突出。花茎高30～40cm，上部有3～5分枝，分枝处有叶状苞片。红葱以全草、鳞茎入药，具有清热凉血、活血通经、消肿解毒的功效，主治吐血、咯血、痢疾、经闭腹痛、风湿痹痛、跌打损伤、疮疖肿毒(摘录《中华本草》)。现代医学研究表明，红葱鳞茎含红葱甲素、红葱乙素、红葱丙素及十八烷酸等。红葱能显著增加冠状动脉血流量。民间的经验认为用红葱鳞茎泡酒服有增强体力的作用。

自然条件下，红葱适宜栽培的地区有限，条件苛刻，且主要以鳞茎进行繁殖，退化现象严重，鳞茎越种越小，导致种质资源严重缺乏，制约着规模化生产。特别是广东各地自引种以来，栽培红葱产量一直较低，远远不能满足市场的需要。近年来组织培养技术在药用植物上得到了广泛的应用，这为繁殖能力较差的名贵中草药资源的保存和生产提供了新的快捷途径。利用现代生物技术，用组织培养的方法，在很多植物上已成功实现种苗的工厂化生产，并带来了丰厚的经济效益。

因此，利用组织培养的方法建立优系红葱的繁殖体系，进行种苗的工厂化生产，具有快速大量繁殖优系品种的优势，也可以解决红葱的种质资源及质量问题。建立红葱无菌快繁体系，并提高增殖效率，适宜大规模生产优质种苗，是目前需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红葱组培快速繁殖方法。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

一种红葱组培快速繁殖方法，包括如下步骤：

1) 剥离红葱鳞茎的叶鞘，挑取无菌的茎尖接种于培养基进行茎尖萌芽培养，至茎尖增长3～5cm，所述培养基为：MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L；即以MS 培养基为基本培养基，添加6-BA (6- 苄氨基嘌呤) 2.0 mg/L、NAA (萘乙酸) 0.2mg/L，采用该培养基配方对茎尖直接进行萌芽培养，无须诱导愈伤组织，能有效缩短周期和减少变异；

2) 将单芽去除顶端优势后转接于培养基进行丛生芽诱导培养，至诱导出2～5个侧芽，所述培养基为：MS + 6-BA 3.0～4.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L；采用该培养基，丛芽增殖效率高；

3) 将丛生芽切割成单芽后转接于培养基进行鳞茎诱导与生根培养，诱导出鳞茎且生根，所述培养基为：1/2MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L，即以1/2MS 培养基为基本培养基，添加6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.2mg/L。

优选的，剥离红葱鳞茎的叶鞘前，将鳞茎进行表层消毒。

优选的，表层消毒方法是：将鳞茎依次用水洗净，70～75%酒精中漂洗20～30 s，0.1%HgCl₂消毒10～15 min，无菌水洗去鳞茎上残余的HgCl₂。

优选的，表层消毒方法是：将鳞茎依次用水洗净，70%酒精中漂洗30 s，0.1% HgCl₂消毒10 min，无菌水洗去鳞茎上残余的HgCl₂。

优选的，剥离红葱鳞茎的叶鞘，挑取无菌的茎尖，该方法是用经过消毒的刀将鳞茎的叶鞘沿着叶鞘基部层层环割，至叶鞘全部剥离完，取出带有部分球茎组织的茎尖。

优选的，剥离红葱鳞茎的叶鞘，挑取无菌的茎尖的方法，包括如下步骤：

1) 叶鞘环割剥离：固定鳞茎的基部，用刀尖从叶鞘包口外下刀，沿着叶鞘基部逆时针环割，并层层剥离叶鞘；

2) 茎尖挑取：叶鞘剥离完毕后，用刀尖在最后剥离的叶鞘内侧、茎尖外缘的地方，逆时针插刀一圈，将带有部分球球茎组织的茎尖挑离出来。

优选的，茎尖萌芽培养条件为：光照10h/d，光照强度1500～3000lx，温度25℃。

优选的，丛生芽诱导培养条件为：光照10h/d，光照强度1500～3000lx，温度25℃。

优选的，鳞茎诱导与生根培养条件：光照14h/d，光照强度1500～3000lx，温度28℃。该培养阶段采用1/2MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L的培养基配方，并采用14h/d的光照时间，28℃的培养温度进行培养，生长的鳞茎粗大且生根效果好。

本发明的有益效果是：

为了探索扩大种源的途径，本发明方法利用组织培养的方法，红葱鳞茎叶鞘环割剥离的无菌茎尖挑取方法、茎尖快速萌芽的适宜培养配方及条件、丛生芽高增殖率诱导的适宜培养配方及条件、快速生根壮苗的适宜培养配方及光温条件等研究，建立了优系红葱的快速繁殖体系，实现了种苗的工厂化育苗生产，实现了快速大量繁殖优系红葱品种。

本发明方法简单，快速高效，有效提高了红葱种苗的繁殖效率，采用本发明方法1个鳞茎经一年时间能变成至少10000个鳞茎，即能快速大量繁殖优系品种，本发明还具有移入大田栽培后存活率高，苗系品质高等特点。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

一种红葱组培快速繁殖方法，包括如下步骤：

1) 外植体表层消毒：以当年生红葱鳞茎为外植体，将鳞茎用水洗净，除去死皮老皮，先于70%（v/v）酒精中漂洗30 s，再用0.1%（w/v）HgCl₂消毒10 min，最后用无菌水冲洗5次，充分洗去残余的 HgCl₂，以下实验均在无菌环境下进行；

2) 叶鞘环割剥离：用夹子夹住鳞茎基部，用经过高温消毒的手术刀的刀尖从叶鞘包口外下刀，沿着叶鞘基部逆时针环割，并层层剥离叶鞘，其中每剥离一层叶鞘需要重新换经高温消毒的手术刀；

3) 茎尖挑取：叶鞘剥离完毕后，用刀尖在最后剥离的叶鞘内侧、茎尖外缘的地方，逆时针插刀一圈，将带有部分球茎组织的茎尖挑离出来；

4) 茎尖萌芽培养：将挑取无菌的茎尖接种于MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L培养基上，在光照 10h/d、光照强度1500～3000lx、温度25℃条件下培养20天，茎尖增长3～5cm；

5) 丛生芽诱导培养：将单芽去除顶端优势后转接于MS + 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L培养基上，在光照10h/d、光照强度1500～3000lx、温度25℃条件下培养25天，诱导出2～5个侧芽；然后再切取丛芽（单丛含2～3个芽）接种到MS + 6-BA 3.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L 培养基上于上述培养条件下进行继代增殖；

6) 鳞茎诱导与生根培养：将丛生芽切割成单芽后转接于1/2MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L培养基上，在光照 14h/d、光照强度1500～3000lx、温度28℃条件下培养25天，诱导出鳞茎的同时根系长出且苗长到3～5cm。

本发明方法基于下列试验研究，其结果如下：

（1）外植体表层消毒及剥离红葱鳞茎的叶鞘后无菌茎尖的挑取：

外植体表层消毒步骤中采用0.1% HgCl₂的消毒时间分别设为5min、10min、15min，考察采用0.1% HgCl₂的不同消毒时间对红葱茎尖组培污染率和芽长势的影响。

将经过表层消毒灭菌后的鳞茎按叶鞘处理方式设置“50%切除”、“100%剥离”等2个水平，其中，“50%切除”指将鳞茎切去外围50%左右的叶鞘而形成 0.5cm×0.5cm×0.5cm 的方块，将其接种于茎尖萌芽培养基上；“100%剥离”是实施例的叶鞘环割剥离及茎尖挑取方法。考察不同取芽方式对红葱茎尖组培污染率和芽长势的影响。

不同灭菌时间及取芽方式对红葱组培污染率和芽长势的影响见表1，由表1可知，本发明的叶鞘环割剥离后的茎尖挑取办法（即“100%剥离处理”）有利于降低污染率和提高组培芽的增长高度；对外植体升汞消毒时间越长（10～15分钟）越有利于降低污染率，但15min消毒处理对芽的生长有抑制作用。故，经实施例步骤1）的外植体表层消毒方法、及步骤2）灭菌取芽的效果最好，即能有效降低污染率，也能提高芽长势从而缩短培养周期。

Figure 2012103249680100002DEST_PATH_IMAGE001

（2）茎尖萌芽培养:

将茎尖接种到不同浓度激素配比的MS培养基上，用于萌芽培养。不同浓度激素配比对红葱外植体萌芽及芽质量的影响见表2，由表可知，不同浓度配比中，以MS+2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA 为最佳，该配方更有利于红葱茎尖萌发和提高其苗体质量。

（3）丛生芽诱导培养：

将单芽切除顶端优势后接种到不同浓度激素配比的MS培养基上，用于丛生芽诱导培养。不同浓度激素配比对红葱组培苗增殖效率和丛生芽质量的影响见表3，由表可知，不同浓度配比中，以MS+3.0～4.0 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA为宜，该配方更有利于红葱丛生芽诱导培养，并能提高其增殖效率(即增量倍数)。

Figure 2012103249680100002DEST_PATH_IMAGE003

（4）鳞茎诱导与生根培养：

将丛生芽切割成单芽后转接到不同培养基上，进行生根壮苗培养。MS、1/2MS两种不同培养基、不同浓度激素配比、不同光照时间及培养温度对红葱鳞茎的诱导和生根的影响见表4，由表可知，不同培养基配方中，以1/2MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA 为宜，该配方更有利于红葱鳞茎诱导与生根培养，并能提高其幼苗质量。此外，红葱鳞茎诱导与生根培养阶段和以上继代增殖阶段在适宜光照时间、适宜培养温度上存在一定差异，即鳞茎诱导与生根培养阶段在14h/d的较长光照条件和28℃的较高温度条件下鳞茎粗大且发根效果更好。

Claims

1.一种红葱组培快速繁殖方法，包括如下步骤：

1)剥离红葱鳞茎的叶鞘，挑取无菌的茎尖接种于培养基进行茎尖萌芽培养，至茎尖增长3～5cm，所述培养基为：MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L；

2)将单芽去除顶端优势后转接于培养基进行丛生芽诱导培养，至诱导出2～5个侧芽，所述培养基为：MS + 6-BA 3.0～4.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L；

3)将丛生芽切割成单芽后转接于培养基进行鳞茎诱导与生根培养，诱导出鳞茎且生根，所述培养基为：1/2MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：剥离红葱鳞茎的叶鞘前，将鳞茎进行表层消毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：表层消毒方法是：将鳞茎依次用水洗净，70～75%酒精中漂洗20～30 s，0.1% HgCl₂消毒10～15 min，无菌水洗去鳞茎上残余的HgCl₂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：表层消毒方法是：将鳞茎依次用水洗净，70%酒精中漂洗30 s，0.1% HgCl₂消毒10 min，无菌水洗去鳞茎上残余的HgCl₂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：剥离红葱鳞茎的叶鞘，挑取无菌的茎尖，该方法是用经过消毒的刀将鳞茎的叶鞘沿着叶鞘基部层层环割，至叶鞘全部剥离完，取出带有部分球茎组织的茎尖。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：剥离红葱鳞茎的叶鞘，挑取无菌的茎尖的方法，包括如下步骤：

1)叶鞘环割剥离：固定鳞茎的基部，用刀尖从叶鞘包口外下刀，沿着叶鞘基部逆时针环割，并层层剥离叶鞘；

2)茎尖挑取：叶鞘剥离完毕后，用刀尖在最后剥离的叶鞘内侧、茎尖外缘的地方，逆时针插刀一圈，将带有部分球球茎组织的茎尖挑离出来。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：茎尖萌芽培养条件为：光照10h/d，光照强度1500～3000lx，温度25℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：丛生芽诱导培养条件为：光照10h/d，光照强度1500～3000lx，温度25℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：鳞茎诱导与生根培养条件：光照14h/d，光照强度1500～3000lx，温度28℃。