KR100311609B1 - 종자식물 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아를 고빈도로 유도하는 방법 및 이로부터 재분화 식물체와 형질전환 식물체를 제조하는 방법 - Google Patents

종자식물 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아를 고빈도로 유도하는 방법 및 이로부터 재분화 식물체와 형질전환 식물체를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종자식물에서 유식물체 (seedling)의 하배축 (hypocotyl) 상부로부터 부정아 (adventitious shoot)를 고빈도로 유도하는 방법 및 이로부터 재분화 식물체와 형질전환된 재분화 식물체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 종자를 무균 발아하여 얻은 유식물체의 하배축 윗부분 (upper hypocotyl)의 일부분을 남기고 절단한 후, 그 절단면을 배지에 접하도록 배양하여 부정아를 고빈도로 유도하고, 이렇게 유도된 부정아를 이용하여 재분화 식물체를 제조하는 한편 유용 유전자를 하배축 절단면에 도입한 후 그 곳에서 부정아를 유도하여 정상적으로 생장하는 형질전환된 재분화 식물체를 효율적으로 제조하는 방법을 제공함으로써 기존의 조직배양으로 부정아 및 체세포배의 유도가 어려워 식물체 재분화 빈도가 낮거나 재분화가 되지 않아 개체증식에 많은 어려움이 있는 식물을 정상적인 형태로 재현성있게 재분화시킬 수 있고, 또한 유용한 외래 유전자를 도입시킨 형질전환된 재분화 식물체의 대량증식에도 적용할 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 쌍자엽 식물인 오이, 구기자, 고추, 멜론, 강낭콩 그리고 단자엽 식물인 파를 비롯한 모든 종자식물에서 쉽게 부정아를 유도할 수 있으므로 유용 식물의 대량번식, 유용 형질전환식물체 개발 등 식물생명공학 (plant biotechnology)의 모든 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

종자식물 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아를 고빈도로 유도하는 방법 및 이로부터 재분화 식물체와 형질전환 식물체를 제조하는 방법
본 발명은 종자식물 유식물체 (seedling)의 하배축 (hypocotyl) 상부로부터 부정아 (adventitious shoot)를 고빈도로 유도하는 방법 및 유도된 부정아들로부터 재분화된 식물체와 형질전환된 재분화 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 종자를 무균 발아시켜 얻은 유식물체의 하배축 윗부분 (upper hypocotyl)의 일부분을 남기고 절단한 후, 그 절단면을 배지에 접하도록 배양하여 부정아를 고빈도로 유도하는 방법, 유도된 부정아를 뿌리 유도배지에서 뿌리를 생성시켜 소식물체로 키운 후, 원예용 상토에서 순화시켜 재분화 식물체를 제조하는 방법 및 하배축 윗부분의 절단면에 유용한 외래 유전자를 도입한 후 그 곳에서 부정아를 유도하여 정상적으로 생장하는 형질전환된 재분화 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
종자식물에서 발아한지 얼마 되지 않은 유식물체의 자엽 (cotyledon) 또는 하배축은 조직학적으로 어리고, 분화능이 높아 이들을 조직배양 재료로 사용할 경우 다른 부위의 조직에 비해 부정아 및 체세포배의 유도율이 훨씬 높다 (Ann. Bot., 51, 417-420, 1983; HortScience, 22, 1130, 1987; Plant Cell Tissue Organ Culture, 20, 177-183, 1990; Plant Cell Rep., 9, 559-562, 1991; Plant Cell Tissue Organ Culture, 39, 211-217, 1994; 식물조직배양학회지, 25(2), 125-129, 1998). 지금까지 식물생명공학의 응용으로서 조직배양에 의한 재분화 방법은 주로 자엽 절편 또는 하배축 절편을 각각 배양 재료로 사용하여 부가가치가 높은 식물의 개체를 증식하거나 유용한 유전자를 도입하여 형질전환체를 만드는 연구 등에 이용되어 왔다 (Plant Cell Rep., 9, 245-248, 1990; Plant Cell Rep., 15, 809-814, 1996; 식물조직배양학회지, 25(3), 인쇄중, 1998). 특히, 유용 유전자를 식물의 자엽과 같이 어린 조직에 도입하여 그 조직으로부터 직접 부정아를 유도한 후 재분화시켜 형질전환체를 얻는 방법이 종자식물에서 많이 이용되고 있다. 그러나 대부분의 종자식물의 경우, 자엽 절편을 배양재료로 사용하면 동일 배양조건에서도 식물의 계통 및 품종에 따라 부정아 유도율에 현저하게 차이가 나고, 연구자에 따라 재현성에도 큰 차이가 난다. 또한, 자엽 절편에서 발생한 부정아는 비정상적인 형태가 많아 정상적인 생장이 이루어지지 않는 경우가 많다 (Plant Cell Rep., 9, 559-562, 1991; 식물조직배양학회지, 25(2), 125-129, 1998). 따라서 부정아 유도에 의한 식물체 재분화가 식물생명공학에 응용될 수 있도록 모든 식물의 계통과 품종에 관계없이 조직배양에 의해 부정아가 유도되어 이들로부터 정상적인 형태의 재분화체가 발달할 수 있고, 아울러 이 과정이 항상 재현성 있게 이루어질 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 모든 종자식물의 계통과 품종에 관계없이 조직배양에 의해 정상적인 형태의 재분화체로 발달할 수 있는 부정아의 유도와 그 유도 과정이 항상 재현될 수 있는 방법을 확립하여 여러 종자식물에 적용해 그 가능성을 확인하였으며, 아울러 이러한 방법에서 외래 유전자가 효율적으로 도입된 부정아를 얻을 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 지금까지는 유식물체의 자엽 절편 또는 하배축 절편만을 배양재료로 사용하여 왔으며, 본 발명에서처럼 정단분열조직, 자엽 절편, 하배축 윗부분 포함한 유식물체를 배양하여 하배축의 절단면으로부터 고빈도의 부정아를 유도한 예는 보고된 바 없다.
본 발명은 유용 식물의 대량번식 및 형질전환 식물체 개발 등에 필요한 식물생명공학기술의 핵심기술인 식물조직배양을 이용하여 종자식물로부터 재분화 식물체를 얻을 수 있도록 하기 위해 오이를 비롯한 여러 종자식물의 유식물체를 사용하여 하배축 절단면으로부터 고빈도의 부정아를 유도하고, 이들로부터 재분화 식물체를 제조하는 조직배양 방법과 형질전환된 재분화 식물체를 효율적으로 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
제1a도 내지 제1d도는 오이 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아를 유도한 후 뿌리를 유도하여 완전한 식물체를 얻는 과정을 나타낸 것이고,
제2도는 오이 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아 유도시 종자의 발아 일수에 따른 부정아 유도율을 나타낸 것이고,
제3도는 오이 종자의 발아 5일째인 유식물체의 절단된 하배축에서 부정아 유도시 하배축의 길이에 따른 부정아 유도율을 나타낸 것이고,
제4a도는 구기자 유식물체의 절단된 하배축에서 부정아가 고빈도로 유도된 것을 나타낸 것이고,
제4b도는 고추 유식물체의 절단된 하배축에서 부정아가 고빈도로 유도된 것을 나타낸 것이고,
제4c도는 멜론 유식물체의 절단된 하배축에서 부정아가 고빈도로 유도된 것을 나타낸 것이고,
제4d도는 강낭콩 유식물체의 절단된 하배축에서 부정아가 고빈도로 유도된 것을 나타낸 것이고,
제4e도는 파 유식물체의 절단된 하배축에서 부정아가 고빈도로 유도된 것을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 종자를 무균 발아시켜 얻은 유식물체의 하배축 윗부분의 일부분을 남기고 아래부분을 절단한 후, 이 유식물체의 하배축 절단면 부위를 배지에 접하도록 배양하여 부정아를 고빈도로 유도하는 방법, 유도된 부정아를 뿌리 유도배지에서 뿌리를 생성시켜 소식물체로 키운 후, 원예용 상토에서 순화시켜 재분화 식물체를 제조하는 방법 및 하배축 윗부분의 절단면에 외래 유전자를 도입한 후 그 곳에서 부정아를 유도하여 정상적으로 생장하는 형질전환된 재분화 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
우선 본 발명에서는 종자를 발아시킨 유식물체의 정단분열조직, 자엽 절편, 하배축 윗부분을 포함한 부위를 배양하여 이 절단면으로부터 고빈도의 부정아를 유도함으로써 재분화 식물체를 만드는 새로운 조직배양 방법과 이를 사용하여 효율적인 형질전환된 재분화 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명에서는 종자를 무균 발아하여 얻은 유식물체의 하배축 윗부분을 2-3 mm 정도 남기고 아래부분을 절단한 후, 이 유식물체의 하배축 절단 부위를 배지에 접하도록 배양하여 부정아를 고빈도로 유도하고, 이렇게 유도된 부정아를 이용하여 재분화 식물체를 제조하는 한편 유용한 외래 유전자를 하배축 절단면에 도입한 후 그 곳에서 부정아를 유도하여 정상적으로 생장하는 형질전환된 재분화 식물체를 효율적으로 제조한다.
본 발명은 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아를 유도하여 정상적인 식물체로 재분화된 식물체를 제조하는 방법을 제공하는데, 구체적으로, 본 발명의 방법에 의하여 오이 (Cucumis sativus L.), 구기자 (Lycium chinense Mill), 고추 (Capsicum annuum L.), 멜론 (Cucumis melo L.), 강낭콩 (Phaseolus vulgaris L.) 및 파 (Allium fistulosum L.)로부터 부정아를 높은 비율로 얻을 수 있음을 확인하였고, 이로부터 본 발명의 방법이 모든 종자식물에 적용될 가능성이 있음을 알 수 있다.
본 발명에서 부정아를 유도할 때에는 일반적으로 하배축의 절단면을 명조건에서 배양하는데, 명조건에서 배양하여 부정아가 고빈도로 유도되지 않는 구기자 및 멜론을 포함하는 일부 종자식물의 경우에는 암조건에서 일정기간 배양한 후 명조건으로 옮겨 배양하여야 부정아가 고빈도로 유도된다.
또한, 배양하는 식물에 따라 발아 3-5일째의 유식물체로부터 자엽이 1개인 것 또는 각각 1/2 제거된 두 개의 자엽을 가진 하배축을 그 재료로 사용하면 부정아가 고빈도로 유도된다.
또한, 본 발명은 유용한 외래 유전자를 하배축 절단면에 도입한 후 그 곳에서 부정아를 유도하여 정상적으로 생장하는 형질전환된 재분화 식물체를 효율적으로 얻는데 유용하게 적용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 유용 유전자를 하배축 절단면에 외래유전자가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로 감염시켜 형질전환된 재분화 식물체를 효율적으로 제조한다.
본 발명에서는 구체적으로 오이의 재분화 식물체를 효과적으로 제조하기 위하여 종자를 멸균 처리하여 생장조절물질이 첨가되지 않은 배지에서 발아시키고, 발아된 유식물체의 하배축의 윗부분을 2 mm 정도 남기고 절단한 후, 절단면을 2.0 mg/L 제아틴 (zeatin)이 첨가된 MS 배지 (Murashige & Skoog, Physiol Plant 15, 473-497, 1962)에 접하도록 배양하여 그 절단면으로부터 부정아를 얻는다 (도 1a 참조). 유식물체의 하배축 절단면에서 유도된 부정아는 잎이 한두장 정도로 발달하였을 때 (도 1b 참조), 이들을 분리하여 1.0 mg/L IAA (3-인돌릴 아세트산; 3-indolylacetic acid)가 첨가된 MS 배지에서 2주간 배양하였을 때 뿌리가 쉽게 유도된다 (도 1c 참조). 이 소식물체는 잎이 2-3장 나오고 뿌리가 잘 발달하였을 때 원예용 상토의 화분에 옮겨 순화시킨 후 완전한 식물체로 키운다 (도 1d 참조).
또한 본 발명은 오이 종자의 발아 일수에 따른 유식물체의 절단된 하배축으로부터 부정아 유도율을 조사하기 위해 발아 후 3, 5, 7, 9일째인 유식물체의 하배축을 2 mm 정도 남기고 절단한 후 상기 방법으로 배양한다. 발아 3, 5일째 유식물체는 자엽이 1개 (1C+H) 또는 1/2로 절단된 자엽을 2개 [(1/2C +1/2C) + H] 가진 유식물체의 하배축 절단면에서 고빈도 (약 80-90%)로 부정아가 유도되었다 (도 2 참조). 그러나 완전한 자엽이 2개 (2C+H)일 때는 발아 3일째 유식물체의 절단면에서만 약 70%의 부정아 유도율을 보였고, 그 이후의 유식물체에서는 부정아 유도율이 매우 낮았다 (도 2 참조). 한편, 유식물체의 하배축의 절단면으로부터 부정아 유도시 하배축의 길이가 부정아 유도율에 영향을 주는지 알아보기 위해 발아 5일째의 유식물체 하배축의 길이를 각각 2, 3, 4, 6 mm 정도 남기고 절단하여 유식물체를 배양하였을 때 하배축의 길이가 길수록 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아의 유도율이 낮았다 (도 3 참조). 그러나 오이 유식물체가 자엽이 1개 또는 1/2로 절단된 자엽을 두 개 가지고, 하배축의 길이가 2 mm 정도의 길이인 유식물체를 배양하였을 때 부정아가 고빈도 (약 80-90%)로 유도되었다 (도 3 참조).
상기 실험의 결과로부터 유식물체의 하배축 절단면으로부터 높은 비율의 부정아를 유도하고자 할 경우에는 발아 3-5일째의 유식물체에 자엽이 1개인 것 또는 각각 1/2 제거된 두 개의 자엽을 가진 것을 배양 재료로 사용하는 것이 바람직하며, 하배축은 윗부분의 길이가 2-3 mm 정도가 되도록 절단하는 것이 적절하다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 방법은 구기자, 고추, 멜론, 강낭콩, 파 등 모든 종자식물을 대상으로 하여 적용이 가능하기 때문에 유용 식물의 대량번식, 형질전환 식물체 개발 등 식물생명공학 제품개발을 위해 조직배양에 의한 식물체 재분화가 필요할 경우 효과적으로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
오이 유식물체의 하배축 절단면으로부터 부정아 유도 및 식물체 재분화
본 발명은 오이 종자를 증류수에 1시간 동안 침지시킨 후 75% 에탄올에 1분간 1차 표면 살균한 다음 2% 차아염소산나트륨 용액에서 15분간 2차 멸균시킨 후 멸균수로 3회 세척하였다. 멸균 처리된 종자는 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS (Murashige & Skoog, Physiol Plant 15, 473-497, 1962) 배지에 발아시켜, 유식물체의 하배축의 윗부분만 남기고 아래부분을 절단한 후, 이 유식물체의 절단된 하배축 부위를 2.0 mg/L 제아틴 (zeatin)이 첨가된 MS 배지에 접하도록 옮겨 약 15 μmol m-2·s-1의 형광빛 아래에서 명 16시간, 암 8시간의 광주기로 3주간 배양하여 부정아 유도율을 조사하였다.
오이 종자의 발아 일수에 따른 유식물체의 하배축 절단면으로부터 부정아 유도율을 조사하기 위해 하배축을 2 mm 정도 남기고 절단한 유식물체 (발아 후 3, 5, 7, 9일째)를 배양하였다. 발아 3일째 유식물체는 자엽이 2개, 자엽이 1개 또는 각각 1/2로 절단된 자엽을 2개 가진 유식물체의 하배축 절단면으로부터 부정아가 고빈도로 유도되었다 (도 2 참조). 자엽을 2개 가진 유식물체는 발아 3일째는 비교적 높은 (약 70%) 비율로 하배축 절단면에서 부정아가 유도되었지만 발아 5일 이후에는 매우 낮은 (30% 이하) 유도율을 나타내었다 (도 2 참조). 따라서 유식물체의 하배축 절단면으로부터 높은 비율의 부정아를 유도하고자 할 때는 발아 3-5일째의 유식물체에 자엽이 1개 또는 각각 1/2 제거된 두 개의 자엽을 가진 것을 배양 재료로 사용하는 것이 가장 적절하다는 것을 알 수 있었다. 한편, 오이의 자엽 절편만을 배양하는 기존의 방법으로 배양하였을 때는 유식물체의 발아 일수와 관계없이 부정아 유도율이 최대 20%를 넘지 못하였다 (도 2 참조). 따라서 자엽 절편만을 배양재료로 사용하는 것보다 본 발명의 방법을 사용하는 것이 훨씬 높은 비율로 부정아를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 자엽 절편을 배양재료로 사용할 때는 부주의에 의해 엽원기가 붙은 자엽 절편을 사용할 수 있어 부정아가 엽원기 같은 분열조직에서 기원되는 경우가 있는데, 하배축의 절단면을 사용하면 분열조직에서 부정아가 유도되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 오이를 포함한 박과 식물 (Cucurbitaceae)의 자엽 절편을 배양하면 여러 겹의 잎만이 유도되어 정단분열조직이 발달하지 않고, 정단분열조직이 있어도 성장이 멈춰 집단 왜소화 현상이 자주 발생한다 (Plant Cell Rep., 9, 559-562, 1991; J. Amer. Soc. Hort. Sci., 118, 151-157, 1993). 그러나 본 발명의 방법에 의해 유식물체의 하배축 절단면에서 유도된 부정아는 미분화 및 집단 왜소화 현상이 거의 나타나지 않았다. 상기 부정아로부터 잎이 1-2장 정도 발달하였을 때 (도 1b 참조), 이들을 분리하여 1.0 mg/L IAA 가 첨가된 MS 배지에서 2주간 배양하면 뿌리가 쉽게 유도되었다 (도 1c 참조). 잎이 2-3장 나오고 뿌리가 잘 발달한 소식물체는 원예용 상토의 화분에 옮겨 약 80% 정도의 습도를 유지하면서 순화시킨 후 완전한 식물체로 키웠다 (도 1d 참조).
[실시예 2]
오이 유식물체의 하배축 절단면으로부터 부정아 유도에 미치는 하배축 길이 및 자엽 크기의 영향
본 발명은 유식물체의 하배축의 절단면으로부터 부정아 유도시 하배축의 길이가 부정아 유도율에 영향을 주는지 알아보기 위해 발아 5일째인 유식물체의 하배축을 2, 3, 4, 6 mm 길이로 절단하여 2.0 mg/L 제아틴이 첨가된 MS 배지에 배양하였다. 그 결과 유식물체의 하배축 길이가 길수록 유식물체의 하배축 절단면에서 부정아의 유도율이 낮았다 (도 3 참조). 이는 유식물체의 하배축 윗부분의 세포가 부정아 분화능이 높다는 것을 나타낸다. 자엽이 2개 있는 유식물체의 경우 하배축의 길이가 길수록 부정아 유도율이 현저하게 감소되고, 하배축의 길이가 약 6 mm인 경우에는 뿌리가 형성되었다. 이와 같이 하배축이 길면 생장조절물질의 공급에도 불구하고, 유식물체의 절단된 하배축에서 뿌리가 유도되는 것은 배지에 첨가된 제아틴의 효과가 하배축과 2개의 자엽에 의해 완화되었고, 유식물체의 정단분열조직에서 생성된 옥신 (auxin)이 작용하였기 때문으로 생각된다. 또한, 자엽의 크기도 부정아 유도에 영향이 있는데, 하배축의 길이가 2 mm 일 때는 2개의 자엽, 1개의 자엽 또는 1/2로 절단된 2개의 자엽을 가지는 유식물체의 하배축에서 비슷한 부정아 유도율을 보였지만, 하배축의 길이가 3 mm 일 때의 부정아 유도율은 1/2로 절단된 2개의 자엽을 가지는 유식물체의 하배축에서 훨씬 높았다 (도 3 참조). 또한, 도 2 및 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 자엽이 2개 있을 때는 자엽이 1개 또는 1/2로 절단된 2개의 자엽이 있는 것에 비해 부정아 유도율이 현저하게 감소하였는데 이것은 자엽의 크기가 부정아 유도에 영향이 있다는 것을 시사한다. 상기 부정아들은 상기 <실시예 1>에서 언급한 것과 같은 방법으로 순화시킴으로써 재분화된 오이 식물체를 얻을 수 있었다. 상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>의 방법은 대부분의 종자식물을 대상으로 개체증식 및 외래유전자를 도입하고자 하는 데 이용될 수 있다.
[실시예 3]
구기자, 고추, 멜론, 파 등의 유식물체 하배축 절단면으로부터 부정아 유도
본 발명은 여러 종자식물의 부정아로부터 재분화된 식물체를 얻기 위해 상기 <실시예 1>과 거의 동일한 방법으로 실시하였다. 즉 목본성인 구기자, 과채류인 고추, 박과 식물인 멜론, 콩과 식물인 강낭콩 그리고 단자엽식물인 파의 종자를 오이와 같은 방법으로 멸균하여 발아시킨 후, 유식물체의 자엽을 각각 1/2씩 또는 전부 잘라 내고, 하배축은 약 2 mm 정도 남기고 절단한 후, 이 유식물체의 하배축 절단 부위를 2.0 mg/L 제아틴이 첨가된 MS 배지에 접하도록 옮겼다. 오이 유식물체의 하배축 절단면에서와 같이 구기자, 고추, 멜론, 강낭콩, 파 등에서도 유식물체의 절단된 하배축으로부터 부정아가 고빈도로 유도되었다 (도 4a 내지 도 4e 참조). 고추, 강낭콩, 파는 오이 유식물체 배양과 같이 처음부터 명조건에서 배양하여 부정아가 고빈도로 유도되었지만, 구기자, 멜론의 경우에는 처음부터 명조건에서 배양하면 부정아가 유도되지 않았고 암조건에서 2주일 정도 배양한 후, 명조건으로 옮겨 배양하였을 때 부정아가 잘 유도되었다.
본 실시예를 통하여 여러 종자식물에서 유식물체의 하배축 절단면을 배양하여 고빈도로 부정아를 유도하고, 이들로부터 재분화체를 얻을 수 있는 가능성이 확인되었다. 따라서 상기 방법은 종자식물들의 개체 증식 및 외래 유전자를 도입하고자 하는데에 이용될 수 있다.
[실시예 4]
오이 하배축 절단면에서 부정아 유도에 의한 재분화방법을 이용한 외래유전자의 형질전환
본 발명은 유용 유전자를 하배축 절단면에 도입한 후 이로부터 부정아를 유도하여 정상적으로 생장하는 형질전환된 재분화 식물체를 효율적으로 얻는데 유용하다. 본 실시예에서는 오이 유식물체 하배축 절단면에 본 발명자들에 의해 출원 (대한민국 특허출원 제 98-13205호)된 방법으로 카나마이신 저항성유전자 (NPT Ⅱ)를 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens LBA 4404) 방법으로 오이에 형질전환시켰다. 우선 오이 종자를 상기 실시예 1의 방법으로 MS 배지에서 발아시키고, 유식물체의 하배축의 윗부분만 남기고 아래부분을 절단한 후, 이 유식물체의 절단된 하배축 부위 (250개)를 10 μM 아세토시린곤 (acetosyringone)이 함유된 아그로박테리움 투메파시엔스 배양액에 10분 동안 침지시킨 후, 수분을 제거하고 2.0 mg/L 제아틴이 함유된 MS 한천배지에 옮겨 약 15 μmol m-2·s-1의 형광빛 아래에서 명 16시간, 암 8시간의 광주기로 4일간 공동배양하였다. 유식물체의 하배축 절편을 아그로박테리아에 감염시킨 후 2.0 mg/L 제아틴, 300 mg/L 크라포란 (claforan)과 100 mg/L 카나마이신이 함유된 MS 한천배지 (선발배지)에 옮겨 아그로박테리아를 제거하면서 형질전환된 부정아를 선발하였다. 1주 간격으로 동일 선발배지에서 계대배양하여 카나마이신 저항성을 지닌 형질전환된 부정아를 유도하였다. 선발배지에서 4주간 배양하였을 때 처음 이식한 유식물체의 하배축 절단면 중 약 50%에서 부정아가 유도되었다. 카나마이신 저항성을 가진 부정아를 절단하여 1.0 mg/L IAA가 첨가된 발근 배지에 옮겨 뿌리를 유도하였다. 잎의 수가 3-4장 되는 소식물체 잎의 염색체 DNA (genomic DNA)내의 NPT Ⅱ 유전자의 존재여부를 PCR로 확인한 결과, 카나마이신 저항성을 가진 개체의 약 80%에서 PCR 산물로 0.7 kb의 NPT Ⅱ DNA 밴드가 관찰되었다. 따라서, 하배축 절단면에서 얻어지는 고빈도의 부정아 유도 방법을 이용한 외래유전자를 형질전환시키는 방법이 유용 형질전환 식물체를 효율적으로 개발하는데 효과적이라는 사실이 입증되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 종자식물에서 유식물체의 하배축 윗부분의 일부분을 남기고 그 아래부분을 절단한 후, 이 유식물체의 하배축 절단 부위를 배지에 접하도록 배양하여 고빈도의 부정아를 유도하는 방법이다. 이러한 방법은 기존의 조직 배양법보다 훨씬 확실하고 편리하게 재분화 식물체 및 형질전환된 재분화 식물체 증식 등에 적용할 수 있으므로, 부정아 및 체세포배의 유도가 어려워서 식물체 재분화 빈도가 낮거나 재분화가 되지 않아 개체증식과 외래유전자를 도입하여 형질전환체를 만드는 것이 어려운 식물에 적용할 수 있어 유용 식물의 대량번식, 유용 형질전환 식물체 개발 등 식물생명공학의 각 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. (1) 무균발아 3-5일째인 유식물체(seedling)의 자엽 일부분 및 하배축 윗부분 (upper hypocotyl)을 2-3mm 남기고 그 아래 부분을 절단하는 단계; (2) 그 절단면이 배지에 접하도록 하여 명조건에서 배양하는 단계로 구성되는 종자식물 유식물체의 하배축 절단면으로부터 부정아 (adventitious shoot)를 고빈도로 유도하는 방법.
  2. (1) 무균발아 3-5일째인 유식물체(seedling)의 자엽 일부분 및 하배축 윗부분 (upper hypocotyl)을 2-3mm 남기고 그 아래 부분을 절단하는 단계; (2) 그 절단면이 배지에 접하도록 하여 암조건에서 배양하는 단계; (3) 명조건으로 옮겨서 배양하는 단계로 구성되는 종자식물 유식물체의 하배축 절단면으로부터 부정아 (adventitious shoot)를 고빈도로 유도하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 유식물체는 자엽이 1개인 것 또는 각각 1/2 제거된 2개의 자엽을 가진 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 부정아를 고빈도로 유도하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 종자식물은 오이, 구기자, 고추, 멜론, 강낭콩 및 파 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부정아를 고빈도로 유도하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항의 방법으로 유도된 부정아를 뿌리 유도배지에서 뿌리를 생성시켜 소식물체를 키운 후, 원예용 상토에서 순화시킴으로써 재분화 식물체를 제조하는 방법.
  6. (1) 종자식물 유식물체의 자엽 일부분 및 하배축 윗부분을 2-3mm 남기고 그 아래 부분을 절단하는 단계; (2) 그 절단면에 외래 유전자를 도입시켜 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로 감염시키는 단계; (3) 감염된 절단면을 배지에 접하도록 하여 부정아를 유도하는 단계; (3) 유도된 부정아를 뿌리 유도배지에서 뿌리를 생성시켜 소식물체로 키우는 단계; (4) 소식물체를 원예용 상토에서 순화시키는 단계로 구성되는 형질전환된 재분화 식물체의 제조 방법.
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한국 원예학회지(제32권 제3호, 1991) 제345 내지 제354면 *
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