KR19990072163A

KR19990072163A - 인디카벼의형질전환방법

Info

Publication number: KR19990072163A
Application number: KR1019980704510A
Authority: KR
Inventors: 유우코오 히에이
Original assignee: 미즈노 마사루; 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 1996-10-22
Filing date: 1997-10-22
Publication date: 1999-09-27
Also published as: EP0897013A1; AU4721997A; US6329571B1; EP0897013A4; WO1998017813A1; CA2240454A1; CA2240454C; AU736027B2; JPH10117776A

Abstract

인디카 벼를 고효율로 형질전환할 수 있는 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 방법에서는 인디카 벼 미숙배세포(未熟胚細胞)를 아그로박테리움법에 의해 형질전환하고 형질전환된 세포를 선발하는 배지로서 KNO₃2000∼4000㎎/ℓ, MgSO₄60∼200㎎/ℓ, KH₂PO₄200∼600㎎/ℓ, CaCl₂100∼450㎎/ℓ, (NH₄)₂·SO4 200∼600㎎/ℓ, H₃BO₃1∼7㎎/ℓ, MnSO₄2∼20㎎/ℓ, EDTA 또는 그 염 20∼50㎎/ℓ, Fe 3∼8㎎/ℓ, 미오이노시톨 50∼200㎎/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 0.5∼10㎎/ℓ, 사이토카이닌류 0.01∼5㎎/ℓ 및 당류 5000∼80000㎎/ℓ 및 겔화제를 함유하며 pH가 4.5∼6.5인 배지를 사용한다.

Description

인디카 벼의 형질전환방법

벼의 형질전환방법에는 원형질체를 매개로한 일렉트로포레이션법이나 PEG법이 개발되어 배양이 용이한 자포니카 벼에서 사용되어 왔다. 그러나 이 방법은 원형질체의 재분화계(再分化系)가 확립되어 있는 품종에만 적용가능하며 배양이 곤란한 인디카 벼에 적용한 예는 적다.

파티클건(particle gun)법은 원형질체 배양계를 필요로하지 않기 때문에 광범위한 품종에 적용할 수 있는 새로운 형질전환 방법으로서, 많은 연구기관에서 사용되고 있다. 일반적으로 인디카 벼품종은 배양이 곤란하지만 그중에서도 특히 인디카 벼의 대부분을 점유하는 그룹 1이라고 부르는 품종그룹(Glaszmann J.C.(1987) lsozymes and classification of Asian rice varieties. The or Appl. Genet. 74 : 21-30)은 배양이 곤란한 것으로 알려져 있다. 그러나 크리스터 등이 보고한 파티클건법(Christou P., Ford, T. L. and Kofron. M. (1992) The development of a variety-independent gene-transfer method for rice. TIB TECH 10 : 239-246)에 의한 그룹 1 품종의 형질전환효율은 미숙배(未熟胚)당 2∼3%로 낮고, 다른 그룹의 최근 연구에서도 인디카 벼에서 효율적인 형질전환계를 얻지 못했음을 보고하고 있다(Li L.,Rongda,Q.,Kochko,A.,Fauquet,C.and Beachy,R.N.(1993) An improved rice transformation system using the biolistic method.Plant Cell Report 12 : 250-255).

한편, 아그로박테리움법은 쌍자엽식물(雙子葉植物)에서는 간편하고 안정적인 형질전환 방법으로 널리 이용되어 왔으나 현재까지 벼 등 단자엽식물에는 적용할 수 없는 것으로 알려져 왔다(Potrykus I., (1990) Gene transfer to cereals : an assessment Bio/technology 8 : 535-542). 최근에 단자엽식물인 벼에서 형질전환이 가능하다는 것(WO94/00977 ; WO95/06722 ; Hiei Y., Ohta, S., Komari, T. and Kumashiro, T. (1994) Efficient transformation of rice(Oryza Sativa L.) mediated by transformation by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6 : 271-282)이 명확하게 되어 유용한 형질전환 방법으로서, 금후의 연구의 진전이 기대되고 있다.

한편, 란스 등은 인디카 벼의 완숙종자에서 재분화능(再分化能)을 가진 칼루스를 유도하는데 유효한 NB배지를 개시하고 있다(Iann M. Rance, I.M. et al., Partial desiccation of mature embryo-derived calli, a simple treatment that dramatically enhcnaces the regeneration ability of indica rice, Plant Cell Reports (1994) 13 : 647-651). 그러나, 형질전환세포의 선발에 대한 NB배지의 효과에 대하여는 조사하지 않았다. 리 등은 파티클건법 및 NB에 유사한 배지(NAA, BA 및 L-글루타민을 함유하지 않은)를 사용하여 자포니카 벼에서의 효율적인 형질전환을 보고하였다(Li L. et al., (1993) An improved rice transformation system using the biolistic method. Plant Cell Report 12 : 25-255). 그러나 인디카 벼에 대하여는 효율적으로 형질전환체를 얻을 수 없었음을 보고하였으며, 이 배지를 아그로박테리움법에 적용할 것인가에 대하여도 조사하지 않았다.

상술한 바와 같이 원형질체를 매개로하는 방법에서는 원형질체의 재분화계(再分化系)가 확립되어 있지 않은 품종에는 적용할 수가 없다는 문제점이 있다. 파티클건법의 경우도 지금까지 보고된 바로는 인디카 벼와 같은 배양이 곤란한 품종에서의 형질전환효율은 낮다.

따라서 인디카 벼의 형질전환방법으로 아그로박테리움법을 적용하는 것을 생각하였다. 상기와 같이 아그로박테리움법으로 자포니카 벼를 형질전환하는 방법은 공지이다. 본발명자들은 자포니카 벼에 적용하는 방법을 인디카 벼에도 적용할 수 있을 지를 검토하였다.

아그로박테리움에 의한 벼의 형질전환 방법으로서 WO94/00977 및 Hieiet al. (1994)에서 보고된 탈분화조직(脫分化組織)을 사용하는 방법이 먼저 생각된다. 그룹 1로 분류되는 수 종류의 인디카 벼의 칼루스에 아그로박테리움을 이용하여 유전자도입을 시도하였다. 그 결과, 조금이지만 형질전환체를 얻긴 하였으나 재현성 있는 형질전환계를 확립하는 데는 이르지 못했다. 칼루스를 사용하여 형질전환을 하는 경우 세포분열 활성이 높으므로 재분화능을 가진 칼루스를 재료로 사용할 필요가 있다. 그러나 배양이 곤란한 벼품종에서 유전자도입에 적합한 세포분열 활성이 높은 칼루스를 유도하는 것은 용이하지는 않다. 이 때문에 칼루스를 실험대상 조직으로 한 경우에는 적용할 수 있는 품종의 폭이 한정되므로 배양이 곤란한 품종에서는 형질전환체를 용이하게 얻을 수 없다고 생각하였다.

칼루스 이외의 조직으로서, 미숙배를 재료로한 방법(WO95/06722, EP-A-0672752)도 적용 가능한 것으로 생각된다. 그런데 자포니카 벼에 대하여는 유효한 WO95/06722 또는 EP-A-O672752에 기재된 방법을 인디카 벼에 그대로 적용하면 역시 형질전환효율이 낮고 실용적인 형질전환계를 확립할 수 없었다.

발명의 개시

따라서 본 발명의 목적은 인디카 벼를 고효율로 형질전환할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은 예의 연구한 결과 WO95/06722, EP-A-0672752에 기재된 벼의 미숙배세포를 아그로박테리움속(屬) 세균에 의해 형질전환하는 방법에서 있어서 형질전환세포의 선발공정에서 사용하는 배지로서 상기 란스 등의 NB배지를 기본으로한 배지를 사용함으로써 인디카 벼에 있어서도 높은 형질전환 효율을 달성할 수가 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 인디카벼 미숙배세포를 아그로박테리움법에 의해 형질전환하고, 형질전환된 세포를 선발하는 벼의 형질전환 방법에 있어서 형질전환된 세포를 선발하는 배지로서 KNO₃2000∼4000㎎/ℓ, MgSO₄60∼200㎎/ℓ, KH₂PO₄200∼600㎎/ℓ, CaCl₂100∼450㎎/ℓ, (NH₄)₂·SO₄200∼600㎎/ℓ, H₃BO₃1∼7㎎/ℓ, MnSO₄2∼20㎎/ℓ, EDTA 또는 그 염 20∼50㎎/ℓ, Fe 3∼8㎎/ℓ, 미오이노시톨 50∼200㎎/ℓ, 2,4-디시클로로페녹시초산 0.5∼10㎎/ℓ, 사이토카이닌류 0.01∼5㎎/ℓ 및 당류 5000∼80000㎎/ℓ 및 겔화제를 함유하며 pH가 4.5∼6.5인 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 인디카 벼의 형질전환 방법을 제공한다.

본 발명에 의해 종래방법으로는 형질전환 효율이 낮고 재현성이 있는 형질전환을 할 수가 없었던 인디카 벼에 대하여 고효율로 형질전환을 할 수 있게 되었다.

본 발명은 아그로박테리움법에 의한 벼의 형질전환 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 방법에 바람직하게 사용할 수 있는 슈퍼바이너리 벡터 pTOK162 및 pTOK233의 구조를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 형질전환 방법에 제공되는 세포는 인디카 벼의 미숙배세포이다. 인디카 벼중에서는 특히 한정되지 않으나 종래기술에서 형질전환이 특히 곤란한 그룹1(Glaszmann, 위에서 언급됨)로 분류되는 것에 적용한 경우에 특히 위력을 발휘한다. 그룹 1의 인디카 벼에 속하는 품종으로서는 IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72, 신세이와이(新靑矮) 1, 난킨(南京) 11, 미즈바라(水原) 258 등을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 '미숙배'란, 수분후(受粉後)의 성숙과정(成熟過程)에 있는 미성숙종자의 씨눈(배)을 말한다. 또 본 발명의 방법에 제공되는 미숙배의 스테이지(숙기(熟期))는 특히 한정되는 것은 아니고 수분후 어떠한 시기에 채취된 것이라도 된다. 다만, 수정후 2일 이후의 것이 바람직하다. 또 미숙배는 인브리드(inbred), 인브리드간의 F1, 인브리드와 자연수분품종간의 F1, 시판 F1 품종의 미숙배인 것이 바람직하다. 나아가 씨눈 중에서도 배반세포(胚盤細胞)가 바람직하다. 또 미숙배는 아그로박테리움속의 세균과 접촉되기전에 탈분화처리(脫分化處理)를 할 필요는 없다. 여기서 탈분화처리란 분화한 식물조직 세포를 탈분화배지에서 배양하여 무질서하게 증식하는 칼루스 등 미분화상태의 세포괴(細胞塊)를 얻기 위한 처리이다.

형질전환에 사용되는 아그로박테리움속의 세균은 Ti 플라스미드 또는 Ri 플라스미드를 가지고 있는 것으로서, 종래부터 쌍자엽 식물의 형질전환에 사용되던 것을 사용할 수가 있다. 이들의 대부분은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 Ti 플라스미드의 비루런스영역(vir 영역) 유래의 DNA 영역을 포함하는 벡터를 가지고 있으며, 식물에 부여하려고 하는 형질의 유전자는 이 벡터에 삽입되든지 또는 이 벡터와는 다른 플라스미드에 존재하며, 상동(相同) 재조합 등에 의해 Ti 플라스미드로 생체내(in vivo)에서 삽입되는 것이다. 또 오키쿠(小鞠) 등은 강병원성이고 형질전환 효율이 매우 높은 아그로박테리움 투메파시엔스 A 281 균주(Hood, E. E. et al., 1984 ; Biotech. 2 : 702-709, Hood. E. E. et al., 1986 ; J. Bacteriol. 168 : 1283-1290, Komari, T. et al., 1986 ; J. Bacteriol. 166 : 88-94, Jin, S. et al., 1987 ; J. Bacteriol. 169 : 4417-4425, Komari, T., 1989 ; Plant Science 60 : 223-229, ATCC37349)에 함유되는 Ti 플라스미드 pTiBo542의 비루런스영역(vir 영역) 유래의 DNA 영역을 포함하는 벡터를 개발하였다(특개평 4-222527호). 본 발명에서는 아그로박테리움 투메파시엔스 A 281에 함유된 Ti 플라스미드 pTiBo542의 비루렌스영역, 아그로박테리움속 세균의 Ti 플라스미드 또는 Ri 플라스미드의 T-DNA의 좌·우측 경계부분의 배열 및 이들 좌·우측 경계부분 사이에 위치하는 소망의 유전자를 가진 벡터를 「슈퍼바이너리벡터」라고 부른다. 본 발명에서는 이와같은 슈퍼바이너리벡터를 바람직하게 사용할 수가 있다.

이와같은 슈퍼바이너리벡터의 예로서 pTOK162(특개평 4-222527호, 미국특허 제5,591,616호, EP-A-O604662)를 들 수가 있다. 그 구조를 도 1에 나타낸다. 이 플라스미드는 대장균 및 아그로박테리움 투메파시엔스에서 증식 가능한 pTOK154 플라스미드(Ti 플라스미드에서 유도된 공지의 pGA472 플라스미드와 pVCK101이라는 공지의 광숙주역(廣宿主域) 프라스미드로부터 후술하는 방법에 의해 제작된, T영역을 포함하는 플라스미드)에 이미 클론화되어 있던 pTiBo542의 비루런스 영역유래의 상기 15.2 킬로베이스의 Kpnl 단편(virB, virG, virC 각 유전자를 함유)을 삽입한 것이다. 이 pTOK154에는 T영역의 2개의 경계배열과 그사이에 인디카 벼에 도입하고자 하는 유전자로서 카나마이신 내성유전자가 배열되어 있는데, 이것은 인디카 벼에 도입하고자 하는 유전자가 pTiBo542의 비루런스 영역유래의 클론화된 DNA 단편을 함유하는 플라스미드상에 배치되어 있는 예이다. 또, pTOK162와 pGL2-IG(WO95/06722)에서 유도된 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt) 및 피마자의 인트론 부착 GUS 유전자를 pTOK162의 T-DNA 영역중에 상동재조합에 의해 삽입한 pTOK233(Hiei et al., 위에서 언급함)도 바람직한 슈퍼바이너리벡터의 일례이다. pTOK233의 구조를 도 1에 나타낸다.

인디카 벼에 삽입하고자 하는 소망의 유전자는 상기 플라스미드의 T-DNA 영역중의 제한효소부위에 통상의 방법에 의해 삽입할 수가 있으며 플라스미드가 가진 약제 내성 등 적당한 선택 마커에 의거하여 선택할 수 있다. 다만 도 1에 나타내는 pTOK162와 같이 대형으로 다수의 제한부위를 가진 것은 통상의 서브클로닝 수법으로는 소망의 DNA를 T영역내에 도입하는 것이 반드시 용이하지 않을 때가 있다. 이와같은 경우에는 아그로박테리움 투메파시엔스 세포의 세포내(in vivo)계에서의 상동재조합(Herrera-Estrella, L. et al., 1983 ; EMBO J. 2 : 987-995, Horsch, R. H. et al., 1984 ; Science 223 : 496-498)을 이용함으로써 목적 DNA를 pTOK162에 도입하는 것이 가능하다. 즉, 예를들면 먼저, pTOK162를 아그로박테리움 투메파시엔스에 도입하고 계속해서 DNA를 도입한 pBR322 플라스미드(유사한 플라스미드를 함유함)를 도입한다. pTOK162의 DNA에는 pBR322와 상동인 부분이 있으므로 pBR322 유도체는 상동배열을 매개로한 재조합에 의하여 pTOK162에 삽입된다. pBR322는 pTOK162와 다르며 아그로박테리움 투메파시엔스에서는 복제할 수 없으므로 이와 같이 삽입된 상태(pTOK162 :: pBR322 유도체라 한다)가 아니면 아그로박테리움 투메파시엔스에서 생존할 수 없다. 그리고 pTOK162와 pBR322 유도체 각각에 특이적인 특성(약제내성 등)에 따라 선발하면 pTOK162 :: pBR322 유도체를 가진 아그로박테리움 투메파시엔스를 얻을 수 있다. 또 pTOK12를 가진 아그로박테리움 투메파시엔스에 각종의 플라스미드를 도입하여 연구한 바, pBR322 유도체의 선발 마커로서는 전치인자 Tn7(De Greve, H. H. et al., 1981 ; Plasmid 6 : 235-248) 유래의 스펙티노마이신 내성유전자(SP)가 우수하다는 것이 판명되었다. 따라서, 이미 소망의 유전자가 pBR322에 클론화되어 있는 경우에는 SP 유전자를 그 플라스미드에 삽입하면 아그로박테리움 투메파시엔스 내의 상동재조합에 의해 pTOK162의 T영역에 소망의 유전자를 도입할 수가 있다. 또 그외의 경우에는 pBR322 유래의 DNA와 SP 유전자로 구성되는 플라스미드를 준비하여 두고 여기에 소망의 유전자를 삽입하는 방법도 생각된다. 이때 T영역의 경계배열을 활용하면 최종적으로 pTOK162상에서 카나마이신 내성유전자와 소망의 유전자를 따로따로 T영역내에 배치하는 것도 가능하다. 카나마이신 내성을 마커로서 식물을 형질변환한 경우, 양 T영역 공히 도입되는 경우도 상당한 비율로 생기는 것이므로 목적유전자의 도입은 충분히 달성할 수 있다. 또 양 T영역이 따로따로 염색체에 삽입되는 경우도 있을 수 있으므로 후에 목적 유전자를 카나마이신 내성유전자에서 분리하는 것도 가능하게 된다.

숙주(宿主)가 되는 아그로박테리움속 세균으로서는 특히 제한되지 않으나 아그로박테리움 투메파시엔스를 바람직하게 사용할 수가 있다.

플라스미드를 아그로박테리움 투메파시엔스 등 아그로박테리움속 세균에 도입하는 조작은 종래법, 예를들면 세균의 3계교잡법(三系交雜法)(Ditta, G. et al., 1980 ; Pro. Natl, Acad, Sci. USA 77 : 7347-7351)에 의해 행할 수가 있다.

이렇게 조제된 아그로박테리움속 세균에는 pTOK162 유래의 비루런스 능력이 높은 DNA가 함유되므로 높은 효율로 인디카 벼의 형질 전환을 하는 것이 가능하다.

또한 본 발명에서는 인디카 벼에 도입하고자 하는 유전자는 종래의 기술과 같이 T영역의 경계 배열의 사이에 배치되지만, 아그로박테리움속 세균내의 Ti플라스미드상에 배치하여도 되고 또는 다른 플라스미드상에 배치하여도 된다.

아그로박테리움속 세균으로 인디카 벼의 미숙배를 형질전환하는 방법은 미숙배를 단순히 아그로박테리움속 세균과 접촉시킴으로써 행할 수가 있다. 예를들면 10⁶∼10¹¹세포/㎖ 정도의 세포농도의 아그로박테리움속 세균 현탁액을 조제하여 이 현탁액에 미숙배를 3∼10분간 정도 침지후, 고체배지상에서 수일간 공존배양 함으로써 행할 수가 있다. 형질전환에 제공하는 미숙배는 2,4-D 존재하에서의 배양 등의 탈분화처리를 할 필요는 없다.

형질전환한 미숙배는 그후 탈분화상태에서 형질전환 세포의 선발 증식하는 것이 바람직하다. 선발은 상기 소망의 유전자의 발현 및 마커(약제내성등)에 의거하여 행할 수가 있다. 탈분화 상태의 세포는 정상개체(正常個體) 재생능력을 가진 칼루스인 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서는 형질전환 세포의 선발을 상기의 조성 및 pH를 가진 배지상에서 행한다. 상기 조성에서의 사이토카이닌류의 바람직한 예로서 6-벤질아미노푸린을 들 수가 있다. 또 상기 조성에서의 당의 바람직한 예로서 말토스, 자당 및 글루코스 및 이들의 혼합물을 들 수가 있다. 겔화제로서는 한천 아가로스, 게란검(ゲランガム) 등을 들수가 있다. 이들은 배지를 겔화시키기 위한 것이며 그 배합량은 겔화를 행하는데 적당한 양이면 특히 한정하지 않으며 통상 2∼10g/ℓ 정도이다. 상기 조성에 대하여 적어도 Kl 0.5∼2㎎/ℓ, ZnSO₄0.7∼5㎎/ℓ, Na₂MoO₄0.1∼0.3㎎/ℓ, CuSO₄0.01∼0.02㎎/ℓ, CoCl₂0.01∼0.02㎎/ℓ, 니코틴산 0.25∼10㎎/ℓ, 피리독신 0.25∼5㎎/ℓ 및 티아민 0.05∼20㎎/ℓ를 더 함유하는 배지도 바람직하게 사용할 수가 있다. 이 조성에 더하여 적어도 카사미노산 100∼3000㎎/ℓ, 프롤린 100∼3000㎎/ℓ, 글루타민 100∼3000㎎/ℓ 및 α-나프탈린초산 0.01∼5㎎/ℓ를 더 함유하는 배지도 바람직하게 사용할 수가 있다. 또, 상기의 각 조성에 더하여 1000∼60,000㎎/ℓ의 당 알코올을 더욱 함유하는 것도 바람직하게 사용할 수가 있다. 여기서 당알코올의 바람직한 예로서는 만니톨 및 솔비톨을 들 수가 있다. 약제내성에 의해 선발을 경우에는 상기의 조성에 더하여 당해 약제를 함유하는 것은 말할 것도 없다. 또 선발은 2∼5회 정도 하는 것이 바람직하다. 이 경우 1차선발 기간은 2∼3주간 정도가 바람직하며 2차선발 기간은 2주간정도가 바람직하다. 선발을 복수회 하는 경우 어느 선발도 상기 배지상에서 이루어지지만 성분의 함량이 상기 범위내에서 다른 배지를 다른 선발공정에서 사용하여도 된다.

형질전환 세포로부터 식물체의 재분화는 공지의 방법(Rance et al., 1994 위에서 언급됨)에 의해 행할 수가 있다. 이 경우 재분화배지에도 선발약제를 가하는 것이 바람직하다. 이것에 의해 소망의 형질을 획득한 식물체, 바람직하기는 소망의 형질을 획득하면서 정상의 번식기능을 가진 형질전환 식물체를 재생할 수가 있다. 또 이들의 구체적 조작의 예가 하기 실시예에 상세히 기술되어 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다. 다만 하기 실시예는 예시를 위해서만 기재하는 것이며 어떠한 의미에서도 한정적으로 해석하여서는 안된다.

실시예 1, 비교예 1∼3

(1) 아그로박테리움의 균사 및 플라스미드

숙주박테리아로 LBA4404(ATCC 37349)를, 벡터로 상기 pTOK233(도 1참조)을 사용하였다.

(2) 실험품종 및 조직

실험품종으로는 IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72 신세이와이(新靑矮)1, 난킨(南京)11, 미즈바라(水原)258을 사용하였다. 개화후 10-14일째의 미숙종자의 이삭을 채취하여 70% 에탄올로 수초, 트윈 20을 함유하는 1% 차아염소산 나트륨수용액에서 15분간 멸균처리 하였다. 멸균수로 수회세정 후 실체현미경하에서 길이 1.5∼2㎜의 미숙배를 가려내었다.

(3) 접종 및 공존배양

50㎎/ℓ 하이그로마이신 및 50㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 배지(Chilton M-D. et al. (1974) Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71 : 3672-3676)에서 3-7일간 배양한 아그로박테리움의 콜로니를 백금이(白金耳)로 긁어내어 AAM배지(Hieiet al. 1994. 위에서 언급됨)중에 현탁하여 접종액으로 하였다. 균밀도는 2∼3×10⁸/㎖로 조정하였다.

가려낸 미숙배에 박테리아 현탁액 1㎖를 가하여 30초간 볼텍스로 진탕하였다. 5∼10분간 정치(靜置)한 후 박테리아 현탁액이 부착된 미숙배를 공존배양용 NB-AS 배지상에 배반(胚盤)이 위를 향하도록 심고 25℃ 암실에서 4∼5일간 공존배양을 하였다. 또 여기서 사용한 NB-AS배지의 조성은 Rance et al(1994)(위에서 언급됨)에 기재된 NB배지에서 L-글루타민을 제하고 아세토시린곤 100μM, 자당 20g/ℓ, D-글루코스 10g/ℓ, 시플라크(Sea Plaque) 아가로스 12.5g/ℓ를 가한 것이다. 즉, 그 조성은 KNO₃, 2830㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 185㎎/ℓ, KH₂PO₄400㎎/ℓ, CaCl₂·2H₂O 166㎎/ℓ, (NH₄)₂·SO₄463㎎/ℓ, KI 0.7㎎/ℓ, H₂BO₃3.0㎎/ℓ, MnSO₄·H₂O 10㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂0 2.0㎎/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25㎎/ℓ, CuSO₄·5H₂O 0.025㎎/ℓ, CoCl₂·6H₂O 0.025㎎/ℓ, Na₂·EDTA 37.3㎎/ℓ, Fe₂SO₄·7H₂O 27.8㎎/ℓ, 미오이노시톨 100㎎/ℓ, 니코틴산 1.0㎎/ℓ, 염산피리독신 1.0㎎/ℓ, 염산티아민 10㎎/ℓ, 카사미노산 300㎎/ℓ, L-프롤린 300㎎/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ, α-나프탈렌초산 1㎎/ℓ, 6-벤질아미노푸린 1㎎/ℓ, 아세토시린곤 100μM, 자당 20g/ℓ, D-글루코스 10g/ℓ, 시플라크(Sea Plaque) 아가로스 12.5g/ℓ, pH 5.2 였다.

(4) 형질전환세포의 선발

공존배양후 신장한 묘 가지를 메스로 채취하여 3㎎/ℓ, 하이그로마이신을 함유하는 NBM 배지상에 이식하여 30℃ 암실에서 3∼4일간 배양하였다. 다음에 미숙배를 20∼50㎎/ℓ 하이그로마이신을 함유하는 NBM(실시예1), 2N6M(비교예1), CCM(비교예2), MSM(비교예3)의 각 1차 선발배지에 이식하고, 30℃ 명실에서 2∼3주간 배양하였다. 미숙배의 배반상(胚盤上)에 형성된 하이그로마이신 내성 칼루스를 20㎎/ℓ 하이그로마이신을 함유하는 NB2 배지 혹은 30㎎/ℓ 하이그로마이신을 함유하는 CCM 배지에 이식하여 2주간 30℃ 명실에서 2차 선발을 하였다. 동 NB2 배지 혹은 하이그로마이신 농도를 50㎎/ℓ로한 CCM 배지를 사용하여 또 10-14일 간격으로 1∼3회(3∼5차선발)행하여, 단단한 구상(球狀)의 배아(胚芽)가 형성된 칼루스를 선발 및 증식을 하였다. 또 여기서 사용한 NBM, 2N6M, CCM, MSM, NB2 배지의 조성을 이하에 나타낸다. 또 이들 선발배지에는 하기 조성에 다시 250㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하였다.

NBM 배지

KNO₃2830㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 185㎎/ℓ, KH₂PO₄400㎎/ℓ, CaCl₂·2H₂O 166㎎/ℓ, (NH₄)₂·SO₄463㎎/ℓ, Kl 0.75㎎/ℓ, H₃BO₃3.0㎎/ℓ, MnSO₄·H₂O 10㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 2.0㎎/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25㎎/ℓ, CuSO₄·5H₂O 0.025㎎/ℓ, CoCl₂·6H₂O 0.025㎎/ℓ, Na₂·EDTA 37.3㎎/ℓ, Fe₂SO₄·7H₂O 27.8㎎/ℓ, 미오이노시톨 100㎎/ℓ, 니코틴산 1.0㎎/ℓ, 염산피리독신 1.0㎎/ℓ, 염산티아민 10㎎/ℓ, 카사이노산 300㎎/ℓ, L-프롤린 300㎎/ℓ, L-글루타민 300㎎/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ, α-나프탈린초산 1㎎/ℓ, 6-벤질아미노푸린 1㎎/ℓ, D-말토스 30g/ℓ, 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ, pH5.8

2N6M 배지

N6 무기염류, N6 비타민(Chu C.-C. (1978) The N6 medium and its appli cations to anther culture of cereal crops. In proc. Symp. Plant Tissue Culture. Peking : Science Press, pp. 43-50)에 카사미노산 1g/ℓ, 2,4-디클로로페녹시 초산 2㎎/ℓ, D-말토스 30g/ℓ 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ을 가한 것이다. 즉, KNO₃2830㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 185㎎/ℓ, KH₂PO₄400㎎/ℓ, CaCl₂·2H₂O 166㎎/ℓ, (NH₄)₂·SO₄463㎎/ℓ, Kl 0.8㎎/ℓ, H₃BO₃1.6㎎/ℓ, MnSO₄·4H₂O 3.3㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 1.5㎎/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25㎎/ℓ, CuSO4·5H2O 0.025㎎/ℓ, Na₂·EDTA 37.3㎎/ℓ, Fe₂SO₄·7H₂O 27.8㎎/ℓ, 니코틴산 0.5㎎/ℓ, 염산피리독신 0.5㎎/ℓ, 염산티아민 1.0㎎/ℓ, 카사노미산 1g/ℓ, 글리신 2㎎/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ, D-말토스 30g/ℓ 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ, pH5.8

CCM 배지

CC 배지(Potrykus I et al(1979) Callus formation from cell culture protoplasts of corn (Zea mays L.). Theor. Appl. Genet. 54:209-214; Hartke S. et al.(1989) Somatic embryogenesis and plant regeneration from various indica rice(Oryza Sativa L.) Genotypes. J. Genet & Breed. 43 : 205-214)에 D-말토스 30g/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ를 가한 것이다. 즉, KNO₃1212㎎/ℓ, NH₄NO₃640㎎/ℓ, CaCl₂·2H₂O 588㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 247㎎/ℓ, KH₂PO₄136㎎/ℓ, FeSO₄·7H₂O 27.8㎎/ℓ, Na₂EDTA 37.3㎎/ℓ, H₃BO₃3.1㎎/ℓ, MnSO₄·4H₂O 11.15㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 5.76㎎/ℓ, KI 0.83㎎/ℓ, NaMoO₄·2H₂O 0.24㎎/ℓ, CuSO₄·5H₂O 0.025㎎/ℓ, CoSO₄·7H₂O 0.028㎎/ℓ, 니코틴산 6㎎/ℓ, 염산티아민 8.5㎎/ℓ, 염산피리독신 1㎎/ℓ, 글리신 2㎎/ℓ, 미오이노시톨 90㎎/ℓ, 코코넛수 100㎎/ℓ(Gibco 社), 만니돌 36.43g/ℓ, D-말토스 30g/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ, 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ pH 5.8

MSM 배지

MS 무기염류, MS 비타민(Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 : 473-497)에 카사미노산 1g/ℓ, D-말토스 30g/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ, 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ를 가한 것이다. 즉, NH₄NO₃1650㎎/ℓ, KNO₃1900㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 370㎎/ℓ, KH₂PO₄170㎎/ℓ, CaCl₂·2H₂O 440㎎/ℓ, Kl 0.83㎎/ℓ, H₃BO₃6.2㎎/ℓ, MnSO₄·4H₂O 22.3㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 8.6㎎/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25㎎/ℓ, CuSO₄·5H₂O 0.025㎎/ℓ, CoCl₂·6H₂O 0.025㎎/ℓ, Na₂·EDTA 37.3㎎/ℓ, Fe₂SO₄·7H₂O 27.8㎎/ℓ, 미오이노시톨 100㎎/ℓ, 니코틴산 0.5㎎/ℓ, 염산피리독신 0.5㎎/ℓ, 염산티아민 0.1㎎/ℓ, 글리신 2.0㎎/ℓ, 카사미노산 1g/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ, D-말토스 30g/ℓ, 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ, pH5.8

NB2 배지

KNO₃2830㎎/ℓ, MgSO₄·7H₂O 185㎎/ℓ, KH₂PO₄400㎎/ℓ, CaCl₂·2H₂O 166㎎/ℓ, (NH₄)₂·SO₄463㎎/ℓ, Kl 0.7㎎/ℓ, H₃BO₃3.0㎎/ℓ, Mn_SO₄·H₂O 10㎎/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 2.0㎎/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.25㎎/ℓ, CuSO₄·5H₂O 0.025㎎/ℓ, CoCl₂·6H₂O 0.025㎎/ℓ, Na₂·EDTA 37.3㎎/ℓ, Fe₂SO₄·7H₂O 27.8㎎/ℓ, 미오이노시톨 100㎎/ℓ, 니코틴산 1.0㎎/ℓ, 염산 피리독신 1.0㎎/ℓ, 염산티아민 10㎎/ℓ, 카사미노산 300㎎/ℓ, L-프롤린 300㎎/ℓ, L-글루타민 300㎎/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 2㎎/ℓ, α-나프탈렌초산 1㎎/ℓ, 6-벤질아미노푸린 0.2㎎/ℓ, D-말토스 30g/ℓ, D-마니톨 30g/ℓ, 게란검(상품명 Gelrite, Sigma 社) 2.5g/ℓ, pH5.8

다음에 선발된 칼루스를 40㎎/ℓ 하이그로마이신을 함유하는 NBM 재분화전배양배지(再分化前培養培地)에 이식하고 약 10일간 30℃ 명실에서 배양하였다.

(5) 형질전환체의 재분화 및 GUS 발현의 조사

재분화전 배양에 의해 얻어진 하이그로마이신 내성의 배아가 형성된 칼루스를 여과지를 깐 샤레 내에서 건조처리를 한 후(Rance et al. 1994(위에서 언급됨)) RN배지(Rance et al. 1994(위에서 언급됨)에서 당성분을 30g/ℓ D-말토스로한 RNM 재분화배지(30㎎/ℓ 하이그로마이신을 함유)상에 치상하였다. 2-3주간후 재분화 식물을 30㎎/ℓ 하이그로마이신을 함유하는 MSI(1/2 농도의 MS 주요무기염, MS 미량무기염, MS 비타민, 1g/ℓ 카사미노산, 0.2㎎/ℓ 인돌낙산, 15g/ℓ 자당 3g/ℓ Gelrite, pH5.8) 발근배지에 이식하여 25℃ 명실에서 약 3주간 배양하였다. 얻어진 하이그로마이신 내성의 재분화식물의 엽편(葉片)을 X-Gluc 처리함으로써 GUS 발현을 조사하였다(Hiei et al., 1994. 위에서 언급됨). 재분화 개체를 다시 500배의 Hyponex 수용액중에 이식하여 25℃ 밝은 조건하에서 10일간 육묘한 후 온실내의 포트에 이식하였다.

(6) 형질전환체의 서던블로팅(Southern blotting)분석 및 후대(後代)에서 도입유전자의 발현

GUS 발현을 나타낸 재분화 개체의 잎에서 추출한 DNA를 제한효소 Hindlll 또는 Kpnl로 처리하여 hpt 또는 GUS 유전자를 프로브로한 분석을 하였다. 서던블로팅분석에 대하여는 Sambrook 등의 방법(1990)에 의하여 행하였다(Sambrook, J. et al., Molecular cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press).

형질전환체를 식재하여 얻은 종자(自殖次世代種子)를 호르몬이 없는 MS배지에 파종하고 발아 후 엽편을 X-Gluc 처리하여 GUS 발현을 조사하였다. 또 같은 종자를 50㎎/ℓ 하이그로마이신을 함유하는 호르몬이 없는 MS 배지에 이식하여 하이그로마이신에 대한 저항성을 조사하였다.

결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다.

표 1. 1차 선발에서의 기본배지의 비교

(품종 : IR24, 균계 : LBA4404/pTOK233)

1차선발배지	하이그로마이신농도(㎎/ℓ)	실험된 미성숙배수(A)	선발칼루스수	재분화계통수	GUS+재생계통수(B)*	형질전환효율(B/A:%)
			1차				3차	전배양
2N6MMSMCCMNBMNBM	2050502020	26282532120	18151260240	32618123	3121376	2011167	2011163	7.70.04.034.452.5

* 독립의 GUS 양성식물의 계통수(클론은 함유되어 있지 않다).

2, 3 차선발배지에는 NB2 배지(20㎎/ℓ 하이그로마이신)을 사용하였다.

재분화전배양배지에는 NBM 배지(40㎎/ℓ 하이그로마이신)을 사용하였다.

재분화배지에는 RNM 배지(30㎎/ℓ 하이그로마이신)을 사용하였다.

표 2. 1차 선발에서의 기본배지의 비교

(품종 : IR36, 균계 : LBA4404/pTOK233)

1차선발배지	하이그로마이신농도(㎎/ℓ)	실험된 미성숙배수(A)	선발칼루스수	재분화계통수	GUS+재생계통수(B)*	형질전환효율(B/A:%)
			1차				3차	전배양
2N6MCCMNBMNBMNBM	2050202020	35323590100	181253162185	683385112	68203759	24153352	23143350	5.79.440.036.750.0

2차선발배지에는 CCM 배지(30㎎/ℓ 하이그로마이신)을 사용하였다.

3-5 차선발배지에는 CCM 배지(50㎎/ℓ 하이그로마이신)을 사용하였다.

재분화전배양배지에는 NB배지(40㎎/ℓ 하이그로마이신)을 사용하였다.

재분화배지에는 RNM 배지(30㎎/ℓ 하이드로마이신)을 사용하였다.

표 3 LBA4404/pTOK233에 의한 인디카 벼의 형질전환결과

품 종	실험된 미숙성배수(A)	HygR 칼루스선발계통수	재분화계통수	GUS+재생식물계통수(B)*	형질전환효율(B/A : %)
IR8IR24IR26IR36IR54IR64IR72난긴 11미즈바라 258신세이와이 1	603212063359010042307950575740	3113763820375923387630313527	1911672815345220135328232519	1811632714335019135028212418	30.034.452.542.940.036.750.045.243.363.356.036.842.145.0

** 2차선발이후의 배지에는 CCM 배지를 사용하였다.

이하, 상기 실험결과에 대하여 설명한다.

(1) 형질전환세포의 선발

1차 선발배지에서 2-3주간 배양한 후 NBM 배지에서는 CCM, MSM 및 2N6M 배지에 비하여 대단히 고빈도로 하이그로마이신 내성 칼루스가 얻어졌다(표1, 표2). 1차선발과정의 미성숙배에 대하여 X-Gluc 처리에 의한 GUS 유전자의 발현을 조사한 결과 NBM 배지에서 배양한 미성숙배의 배반상(胚盤上)에 형성된 복수의 세포괴가 각각 똑같은 GUS 발현을 나타내고 있는 것을 확인하였다. CCM 및 MSM 배지에서는 배반전체가 비대하며 GUS 발현영역의 특이한 증식은 거의 보이지 않았다. 즉, NBM 배지에서는 유전자도입 영역이 선택적인 증식을 나타나기 때문에 1미성숙배당, 복수의 독립한 하이크로마이신 내성의 세포괴를 얻을 수가 있다. 이것에 대하여 CCM 및 MSM배지에서는 유전자도입 영역의 선택적인 증식을 보이지 않으며 배반의 표층세포 전체가 칼루스화하는 경향이 있었다. 이 때문에 CCM 및 MSM 배지에서 1차선발을 한 경우 하이그로마이신 내성의 세포괴를 확인 선발하는 것은 곤란하였다.

CCM 및 MSM 배지의 하이그로마이신의 농도를 20, 30㎎/ℓ로 낮게한 경우에는 하이그로마이신을 첨가하지 않는 경우와 같이 배반전체가 증식을 나타내었다.

또, 2N6M 배지에서는 NBM배지에 비하여 미성숙배에서 선발되는 칼루스의 수가 적고 생장(生長)이 늦은 경향이 보였다. Christou 등은 파티클 건법을 MS 및 CC배지를 형질전환세포의 선발에 사용하고 있으나(Christou P. et al., (1991) Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomic ally important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Bio/technology 9 : 957-962 ; Christou P., Ford, T. L. and Kofron, M. (1992) The development of a variety-independent gene-transfer method for rice. TIB TECH 10 : 239-246), 본 비교예에서의 경우와 같이 얻어진 형질전환체의 수는 적었다.

NBM 배지에서 NAA 및 BA를 제거한 2,4-D 단독의 배지에서는 재분화능을 가진 내성의 배아가 형성된 칼루스를 얻는 것은 곤란하였다. 이것으로부터 BA 등의 사이토카이닌류는 재분화능을 가진 배아가 형성된 칼루스를 유도하기 위하여 필요하다고 생각되었다. Li 등(1993)(위에서 언급됨)은 NB 배지의 NAA, BA 및 L-글루타민을 함유하지 않은 배지에서 형질전환 세포의 선발을 하였으나 인디카 벼에서는 약간의 재생개체가 얻어진 것 뿐인 것을 보고한 바, 본 비교예에서의 결과와 일치하고 있다.

1차선발의 배양기간은 2-3주간이 적당하며 그 이상 배양을 계속하면 미숙배의 배반상에 형성된 칼루스가 필요이상으로 증식하여 미숙배당 복수의 독립한 선발칼루스를 얻는 것이 곤란하게 될 뿐 아니라 칼루스의 형태가 불량이 되는 경향이 있었다.

(2) 2차선발이후의 배양

실험한 10품종 중 8품종에 대하여는 NB2 배지상에서 칼루스는 배아가 형성된 상태로 증식하였다. IR36 및 IR72품종에 대하여는 비교의 결과 NB2 배지 보다 CCM 배지(30∼50㎎/ℓ 하이그로마이신, 250㎎/ℓ 세포탁심)의 쪽에서 형태가 양호한 칼루스가 유지되었다.

NBM 배지에서 1차 선발을 한 시험구에서는 다른배지에 비하여 2, 3차 선발에서도 대단히 많은 칼루스가 내성을 유지하고 있었다(표 1, 2). 2차선발 이후의 배양은 거의 2주간마다 하였으나 3주간 이상 배양을 계속하면 칼루스가 갈변하여 형태가 불량이 되는 경향이 있었다. 선발은 3차선발 혹은 4, 5차 선발까지 한 후 재분화 전배양을 하였다.

(3) 재분화 배양

10품종 모두 높은 효율로 재분화 개체가 얻어져 재분화가 곤란한 품종은 특별히 확인할 수 없었다. 또 발근배지(發根培地)에는 IBA(0.2㎎/ℓ)를 첨가한 MSI 배지가 호르몬이 없는 배지 보다 발근을 명확하게 촉진하여 적당하였다. 또 발근배지에 하이그로마이신의 첨가(30㎎/ℓ)는 식물체의 단계에서 하이그로마이신 내성개체의 선발에 유효하였다.

(4) 형질전환효율

재분화한 개체의 부분은 잎에서 똑같은 GUS 발현을 나타내었다(표 3). NBM 배지에서 1차선발을 하는 배양계를 사용한 경우 실험한 10품종 모두에서 미숙배당 30% 이상의 대단히 높은 효율로 하이그로마이신 내성 또 GUS 발현을 나타내는 형질전환체가 얻어졌다(표 1, 2, 3).

(5) 서던블로팅 분석 및 후대(後代)에의 유전

GUS 발현을 나타낸 재생개체는 서던블로팅분석의 결과, 조사한 전개체에서 도입유전자가 확인됨과 동시에 T-DNA는 각 개체 마다에 벼 게놈의 임의의 부위에 도입되어 있는 것을 확인하였다. 후대의 GUS 발현 및 하이그로마이신 내성의 조사결과 멘델의 법칙에 적한한 유전자 분리가 관찰되었다.

Claims

인디카 벼 미숙배 세포를 아그로박테리움법에 의해 형질전환하여 형질전환된 세포를 선발하는 벼의 형질전환방법에 있어서,

형질전환된 세포를 선발하는 배지로서, KNO₃2000∼4000㎎/ℓ, MgSO₄60∼200㎎/ℓ, KH₂PO₄200∼600㎎/ℓ, CaCl₂100∼450㎎/ℓ, (NH₄)₂·SO₄200∼600㎎/ℓ, H₃BO₃1∼7㎎/ℓ, MnSO₄2∼20㎎/ℓ, EDTA 또는 그염 20∼50㎎/ℓ, Fe 3∼8㎎/ℓ, 미오이노시톨 50∼200㎎/ℓ, 2,4-디클로로페녹시초산 0.5∼10㎎/ℓ, 사이토카이닌류 0.01∼5㎎/ℓ 및 당류 5000∼80,000㎎/ℓ 및 겔화제를 함유하며, pH가 4.5∼6.5인 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 인디카 벼의 형질전환방법.
제 1 항에 있어서, 상기 사이토카이닌류가 6-벤질아미노푸린인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단류가 말토스, 자당 및 글루코스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 적어도 Kl 0.5∼2㎎/ℓ, ZnSO₄0.7∼5㎎/ℓ, Na₂MoO₄0.1∼0.3㎎/ℓ, CuSO₄0.01∼0.02㎎/ℓ, CoCl₂0.01∼0.02㎎/ℓ, 니코틴산 0.25∼10㎎/ℓ, 피리독신 0.25∼5㎎/ℓ 및 티아민 0.05∼20㎎/ℓ을 더 함유하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 배지는 적어도 카사미노산 100∼3000㎎/ℓ, 프롤린 100∼3000㎎/ℓ, 글루타민 100∼3000㎎/ℓ 및 α-나프탈린초산 0.01∼5㎎/ℓ를 더 함유하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 1000∼60000㎎/ℓ의 당알코올을 더 함유하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 당알코올은 만니톨 또는 솔비톨인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인디카 벼는 그룹 1에 속하는 방법.