CN105120656A - 冷诱导甜味降低的马铃薯 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于制备冷储存的土豆中还原糖和丙烯酰胺的积累下降的植物(例如茄属变种)的材料和方法，所述制备具体通过在液泡转化酶编码基因中产生TALE-核酸酶诱导的突变。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年12月12日提交的美国专利临时申请61/745,003号的优先权。
技术领域
本文提供产生冷诱导甜味降低的土豆变种的材料和方法。
背景技术
土豆(马铃薯(Solanumtuberosum))是重要的食品作物，2011年全球产量预计为324百万公吨(联合国食品与农业组织(FAOSTAT))，2010作物生产数据，faostat.fao.org/site/567/DesktopDefault.aspx？PageID＝567#ancor)。总马铃薯作物中的大部分(美国2010年作物的61％)加工生产为薯片、油炸薯条和其他加工产品。为了给加工产业提供全年的高质量未处理马铃薯，需要在使用前对马铃薯根茎进行‘冷储存’。冷储存具有品种/处理器特异性，其温度范围从3℃-13℃不等，可以储存多至12个月，能够防止萌芽、降低收缩/衰老造成的损失、并使疾病传播最小化。
发明内容
本文提供产生冷诱导甜味(CIS)降低的土豆变种的材料和方法，冷诱导甜味是冷储存期间淀粉转变为简单还原糖、葡萄糖和果糖的现象。高温处理后，葡萄糖/果糖会在美拉德反应中与游离氨基酸接触，产生苦味、深色素产品，其可能含有高水平的丙烯酰胺—疑似细胞毒素/致癌物质。提供CIS降低的马铃薯变种。
本文至少部分基于下述发现：可通过使用序列特异的核酸酶在液泡转化酶(VInv)基因中产生靶向突变或敲除来获得具有低CIS的马铃薯。相比冷储存后油炸的非改造马铃薯中丙烯酰胺的水平，改造的马铃薯在油炸后可具有改良的储存特性和低水平的丙烯酰胺。此外，该马铃薯不携带任何外源DNA，所以监管机构会将其认定为非GM。本文还至少部分基于由序列特异核酸酶产生的具有功能缺失型VInv突变的马铃薯品种的开发。
在一个方面，本发明包括一种茄属(Solanum)植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞的内源的至少两个VInv等位基因中包含突变，从而所述植物、植物部分或植物细胞的液泡转化酶的表达相对没有所述突变的对照茄属植物、植物部分或植物细胞降低。各突变可以是多于一个核苷酸碱基对的缺失。各突变可位于SEQIDNO:27所示的靶序列或位于与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的靶序列；或者位于SEQIDNO:1所示的靶序列或位于与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的靶序列。所述植物、植物部分或植物细胞可用稀有切割内切核酸酶制备(例如转录激活因子样效应子内切核酸酶(TALE-核酸酶))。TALE-核酸酶可结合至SEQIDNO:18-23中任一项所列序列。所述至少两个VInv等位基因各表现为移除内源核酸并且不包含任何外源核酸。每个内源VInv等位基因都可突变。各VInv等位基因表现为移除内源核酸并且不包含任何外源核酸。所述植物、植物部分或植物细胞中可检测不到的液泡转化酶的表达。所述茄属植物、植物部分或植物细胞，其中可为马铃薯植物、植物部分或植物细胞。所述植物、植物部分或植物细胞可经过冷储存条件。所述植物、植物部分或植物细胞的丙烯酰胺水平相对没有所述突变的对照植物、植物部分或植物细胞降低。
在另一方面，本发明包括制备冷诱导甜味降低的茄属植物的方法。所述方法包括(a)使含功能性VInv等位基因的茄属植物细胞群接触靶向内源VInv序列的稀有切割内切核酸酶，(b)从所述群中选择至少两个VInv等位基因已失活的细胞，和(c)使所选植物细胞生长为茄属植物，其中所述茄属植物的冷诱导甜味相对所述VInv等位基因未失活的对照茄属植物降低。该茄属植物细胞可以是原生质体。该方法可包括用编码所述稀有切割内切核酸酶的核酸转化所述原生质体。所述核酸可为mRNA。所述核酸可包含在载体内。该方法可包括向所述原生质体内导入稀有切割内切核酸酶。所述稀有切割内切核酸酶可为TALE-核酸酶。所述TALE-核酸酶可靶向SEQIDNO:27所示的序列或靶向与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的序列，或者可靶向SEQIDNO:1所示的序列或靶向与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的序列。TALE-核酸酶可结合至SEQIDNO:18-23中任一项所列序列。该方法还可包括培养所述原生质体以生成植物株系。所述方法可包括从所述原生质体分离含至少部分VInv基因座的基因组DNA。该茄属植物细胞可以是马铃薯植物细胞。
在另一个方面，本文涉及一种生成食品产品的方法。所述方法可包括(a)提供茄属植物或植物部分，其(i)在所述植物或植物部分的内源的至少两个VInv等位基因中包含突变，从而所述植物、植物部分或植物细胞的液泡转化酶的表达相对没有所述突变的对照茄属植物或植物部分降低，并且(ii)经过低温储存；和(b)从所述植物或植物部分生成食品产品。所述方法还可包括(c)烹饪所述植物或植物部分以获得食品产品，该食品产品的丙烯酰胺水平相对不含所述突变并且在烹饪前经过冷诱导储存的对照烹饪植物或植物部分生成的食品产品降低。所述烹饪植物或植物部分与烹饪前未经冷储存的烹饪茄属植物或植物部分具有约相同的丙烯酰胺水平。各突变可位于SEQIDNO:27所示的靶序列或位于与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的靶序列；或者位于SEQIDNO:1所示的靶序列或位于与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的靶序列。各突变可用稀有切割内切核酸酶制备(例如TALE-核酸酶)。TALE-核酸酶可结合至SEQIDNO:18-23中任一项所列序列。所述茄属植物或植物部分可为马铃薯植物或植物部分。所述茄植物或植物部分中可检测不到的液泡转化酶的表达。
本发明另一方面包括一种从茄属植物或植物部分生成的食品产品，所述茄属植物或植物部分(i)在所述植物或植物部分的内源的各VInv等位基因中包含突变，从而所述植物、植物部分或植物细胞没有功能性VInv等位基因，并且(ii)经过低温储存。各突变可位于SEQIDNO:27所示的靶序列或位于与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的靶序列；或者位于SEQIDNO:1所示的靶序列或位于与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的靶序列。各突变可用稀有切割内切核酸酶制备(例如TALE-核酸酶)。TALE-核酸酶可结合至SEQIDNO:18-23中任一项所列序列。所述食品产品可已烹饪。所述食品产品的丙烯酰胺水平可相对不含所述突变并且在烹饪前经过冷储存的对照植物或植物部分制备的烹饪食品产品降低，所述对照植物或植物部分。所述烹饪食品产品可与未经冷储存的茄属植物或植物部分具有约相同的丙烯酰胺水平。所述茄属植物或植物部分可为马铃薯植物或植物部分(例如来自选自RangerRusset、Atlantic和Burbank的品种)。所述食品产品可为薯片或油炸薯条。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其他特征、目的和优势通过描述、附图以及权利要求书将是显而易见的。
附图说明
图1显示VInvTALE内切核酸酶的靶位点。显示VInv基因的DNA序列(SEQIDNO:1)。下划线序列代表TALE-核酸识别VInv基因的靶序列(SEQIDNOS:18-23)。
图2显示VInv基因中TALE核酸酶诱导的突变的示例。各图上部的线显示VInvTALE-核酸酶的识别位置的DNA序列(下划线)。其他序列显示由不精确的非同源末端连接(NHEJ)诱导的代表性突变。右侧显示缺失的大小。
图3显示“RangerRusset”品种的VInv2基因座的示例性等位基因，其为开发突变植物的种质。区分等位基因类型的诊断性单核苷酸多态性(SNP)以下划线和粗体显示。
图4显示再生突变“RangerRusset”植物的示例性缺失概况。TALE核酸识别位点以下划线表示，SNP位点以阴影表示。
发明详述
马铃薯基因组包含小的酶家族称为转化酶，其在调节源组织(叶片)和库组织(块茎、果实、种子)之间的碳分配中有重要作用。该酶不可逆地催化淀粉→蔗糖→葡萄糖/果糖反应。植物具有三类转化酶，但据信液泡转化酶(VInv)在CIS中有重要作用。
本文提供马铃薯植物品种，具体为VInv活性降低或丧失的马铃薯(S.tuberosum)种。还提供产生此类植物品种的方法、用此类植物品种生产食品产品的方法、和从此类植物品种生产的食品产品。
如本文所用，“植物”和“植物部分”指保留亲本植物的区别特征的细胞、组织、器官、种子和切断的部分(如根、叶和花)。“种子”指在开花时的正常成熟时间点之后由植物胚珠的连续分化形成的任何植物结构，不考虑其在受精还是未受精的情况下形成，也不考虑种子结构是可育的还是不可育的。
术语“等位基因”指特定基因座处基因的一种或多种可选形式中的任一种。在生物体的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座，同源染色体对中的各染色体上存在一个等位基因。相似地，生物体的四倍体细胞中，四条同源染色体组中的各染色体上存在一个等位基因。“杂合”等位基因是位于特定基因座的不同的等位基因，其单独地位于相应同源染色体对上。“纯合”等位基因是位于特定基因座的相同的等位基因，其单独地位于细胞中相应同源染色体对上。
“野生型”在本文中指植物或基因在自然中最常见的典型形式。野生型“VInv等位基因”是编码功能性VInv蛋白的天然产生的VInv等位基因(例如发现于天然产生的马铃薯植物内)，而“非功能性突变VInv等位基因”是不编码功能性VInv蛋白的VInv等位基因。这类“非功能性突变VInv等位基因”可在其核酸序列中包含一个或多个突变，其中该突变导致植物或植物细胞体内没有可检测量的功能性VInv蛋白。
马铃薯基因组通常仅含一个VInv基因，但由于栽培马铃薯是四倍体，各品种中存在多个VInv等位基因。本发明方法可用于灭活至少一个(例如至少两个、至少三个、或全部四个)VInv功能性等位基因，从而从马铃薯细胞中移除至少一些全长RNA转录本和功能性VInv蛋白，并且在一些情况中完全移除所有全长RNA转录本和功能性VInv蛋白。
天然产生的马铃薯VInv核苷酸序列的代表性示例示于表4。本文提供的马铃薯植物、细胞、植物部分、种子或其后代在各同源Vinv等位基因中具有突变，从而所述基因的表达降低或完全受到抑制。因此，在一些情况中，所述植物、细胞、植物部分、种子和后代中VInv基因表达的液泡转化酶的水平不可检测。
可用TALE-核酸酶系统在VInv基因的各等位基因中制备靶向敲除来生成本文所述植物、细胞、植物部分、种子和后代。因此，本文提供用稀有切割内切核酸酶(例如TALE-核酸酶)来生成马铃薯植物和相关产品(例如种子和植物部分)的材料和方法，所述马铃薯植物和相关产品由于VInv基因中的靶向敲除而适于在制备人和动物消耗的食品产品之前冷储存。使用其他序列特异性核酸酶也可用于制备所需植物材料，包括工程改造的寻靶核酸内切酶或锌指核酸酶。
本文中术语“稀有切割内切核酸酶”指天然或工程改造的蛋白质，其具有针对含有长度为约12-40bp(如长度为14-40、15-36或16-32bp)的识别序列(目标序列)的核酸序列的内切核酸酶活性。典型的稀有切割核酸内切酶在其识别位点内部产生切割，形成具有3′OH或5’OH突出端的4nt交错切口。这些稀有切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶，如野生型寻靶核酸内切酶或其变体蛋白质，更具体地属于十二肽家族(LAGLIDADG(SEQIDNO:28)；参见WO2004/067736)或可以是来自关联DNA结合结构域与具有切割活性的催化结构域的融合蛋白。TAL效应子内切酶核酸(TALE-核酸酶)和锌指核酸酶(ZFN)是DNA结合结构域与核酸内切酶FokI的催化结构域融合的示例。自定义的TALE核酸酶可以商品名TALENTM(法国巴黎的赛勒柯蒂斯公司(Cellectis))购得。关于稀有切割核酸内切酶的综述，参见Baker,NatureMethods9:23-26,2012。
“诱变”在本文中指将突变导入所选DNA序列的过程。内切核酸酶诱导的突变通常获自双链断裂，其引起插入/缺失突变(“插入缺失标记(indels)”)，可由深度测序分析检测。此类突变通常为数个碱基对的缺失，并且具有失活突变等位基因的效果。例如，在本文所述方法中，诱变经由靶向植物细胞中所选DNA序列的TALE-核酸酶生成的双链DNA断裂发生。这类诱变导致“TALE-核酸酶诱导的突变”并降低靶基因的表达。诱变后，可使用已知技术(例如根据自花受粉后的常规生长步骤种植种子)由经处理的细胞再生植物。
术语“表达”在本文中指转录特定核酸序列以生成正义或反义mRNA，和/或翻译RNA分子以生成多肽(如治疗性蛋白质)，伴随或不伴随后续的翻译后事件。
对于植物或植物细胞中的基因或多肽，“降低表达”包括抑制、中断、敲除或敲减基因或多肽，使得基因的转录和/或所编码多肽的翻译与相应对照植物或植物细胞相比降低，所述对照植物或植物细胞中该基因或多肽的表达没有被抑制、中断、敲除或敲减。可使用例如以下方法测量表达水平：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、点印迹杂交、原位杂交、核连缀(nuclearrun-on)和/或核失控(nuclearrun-off)、RNA酶保护或免疫和酶方法(如ELISA、放射性免疫试验和western印迹)。
通常，相对没有所述突变的对照茄属植物，茄属植物、植物部分或植物细胞的液泡转化酶表达降低多于60％(例如多于70％、多于80％或多于90％)。对照茄属植物可为例如转化酶基因发生突变的野生型茄属植物。
在一些情况下，核酸可含有与代表性VInv核苷酸序列具有约75％序列相同性的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可与代表性、天然产生的VInv核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性。
在一些情况中，突变位于本文所述VInv序列所示的靶序列(例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:27)，或位于与本文所述VInv序列所示的靶序列(例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:27)具有至少95％(例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同性的靶序列。
如下所述测定特定核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列之间的序列相同性百分比。首先，使用来自含有BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLASTZ独立版本的BLAST2序列(Bl2seq)程序比较核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列。该BLASTZ独立版本可在fr.com/blast或ncbi.nlm.nih.gov在线获取。解释如何使用Bl2seq程序的说明书可参见BLASTZ附带的自述文件。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两种序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两种核酸序列，如下所述设置选项：-i设为含有待比较的第一核酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二核酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastn；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；-q设为-1；-r设为2；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两种序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastn-oc:\output.txt-q-1-r2。为比较两种氨基酸序列，如下所述设置Bl2seq的选项：-i设为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两种氨基酸序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastp-oc:\output.txt。如果两种比较的序列具有同源性，则指定的输出文件会以经比对序列的形式显示那些同源区域。如果比较的两种序列不具有同源性，则指定的输出文件不会显示经比对的序列。
一旦进行比对，即通过对两种序列中存在相同核苷酸或氨基酸的位置的数目进行计数来测定匹配的数目。将匹配的数目除以鉴定的序列(如SEQIDNO:1)中所列序列长度或连接的长度(如来自鉴定的序列中所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将结果值乘以100，从而测定序列相同性百分比。例如，与SEQIDNO:1中所列序列比对时具有120个匹配的核酸序列与SEQIDNO:1中所列序列具有86.3％相同性(即120÷139x100＝86.3)。应注意序列相同性百分比值四舍五入至小数点后第一位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下四舍五入至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上四舍五入至75.2。还应注意，长度值始终是整数。
可如他处所述进行用于选择内源性目标序列和生成靶向这类序列的TALE-核酸酶的方法。参见例如，PCT公开号WO2011/072246，其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，可使用特异识别TALE-核酸酶识别位点的软件例如(Doyle等,NucleicAcidsRes40:W117-122,2012)。
转录活化样(TAL)效应子发现于黄单胞菌属(Xanthomonas)中的植物病原性细菌中。这些蛋白质通过结合宿主DNA并激活效应器特异性宿主基因在疾病或触发防卫方面起重要作用(参见例如，Gu等，Nature435:1122-1125,2005；Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:10503-10508,2006；Kay等，Science318:648-651,2007；Sugio等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:10720-10725,2007；和等，Science318:645-648,2007)。特异性取决于效应子-可变不完善数目(effector-variablenumberofimperfect)，通常是34个氨基酸重复(Schornack等，J.PlantPhysiol.163:256-272,2006；和WO2011/072246)。多态性主要发生在重复位置12和13，本文将其称为重复可变双残基(RVD)。
TAL效应子的RVD以直接、线性形式对应于其靶位点的核苷酸，一种RVD对应于一种核苷酸，有一些简并性且没有明显的环境依赖性。该蛋白质-DNA识别机制能针对新的靶标特异性TAL效应子进行靶位点预测，以及靶位点选择和对与所选位点具有结合特异性的新TAL效应子进行工程改造。
TAL效应子DNA结合结构域可与其他序列(如核酸内切酶序列)融合，生成靶向特定、经选择的DNA序列的嵌合核酸内切酶并导致在被靶向的序列处或附近的后续DNA切割。DNA中的这类切割(即双链断裂)可通过例如NHEJ或同源重组在野生型DNA序列中诱导突变。在一些情况下，TALE-核酸酶可用于促进复杂基因组中的定点诱变，高度准确且高效地敲除或改变基因功能。如下文实施例所述，靶向马铃薯VInv基因的TALE-核酸酶可用于诱变内源性基因，生成不具有VInv的可检测表达的植物。可使用一些内切核酸酶(如FokI)以二聚物形式起作用的现象来提高TALE-核酸酶的靶标特异性。例如，在一些情况下，可使用靶向不同DNA序列的一对TALE-核酸酶单体(如图1中所示带下划线的靶序列)。当两个TALE-核酸酶识别位点紧邻时，如图1所示，无活性的单体可聚集在一起以生成切割DNA的功能性酶。通过需要DNA结合来激活核酸酶，可建立高度位点特异性的限制性酶。
使用TALE-核酸酶来生成在内源性基因中具有突变的马铃薯植物、植物细胞或植物部分的方法包括，例如，本文实施例中所述的那些。例如，可将一种或多种编码靶向所选VInv序列(如图1所示的VInv序列)的TALE-核酸酶的核酸转化至植物细胞(如原生质体)中，该核酸在其中表达。在一些情况中，可将一种或多种TALE-核酸酶蛋白导入植物细胞(例如原生质体)。随后可以例如如上文所述通过基于核酸的试验或基于蛋白质的试验检测表达水平，或者使用基于核酸的试验(例如PCR和DNA测序，或PCR之后的T7E1试验；Mussolino等，NucleicAcidsRes.39:9283-9293,2011)检测基因组基因座处的突变，从而对细胞或细胞生成的植物细胞系或植物部分进行后续分析以确定是否已将突变导入靶位点。在T7E1试验中，可从汇集的愈伤组织中分离基因组DNA，并可对VInv的TALE-核酸酶识别位置的侧接序列进行PCR扩增。然后扩增产品可变性或重新退火。若所述重新退火的片段形成异源双链体，则T7内切核酸酶I在错配位置进行切割。可通过凝胶电泳观察消化的产物，以定量TALE-核酸酶的诱变活性。
近期，已基于II型原核CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)适应性免疫系统的RNA-引导的Cas9核酸酶开发新的基因组工程改造工具(参见例如,Belahj等,PlantMethods9:39,2013)。本系统可用于切割侧接有短序列基序(称为前间区序列邻近基序(PAM))的DNA序列。通过工程改造与靶序列互补的特异crRNA来实现切割，其可与酿脓链球菌(S.pyogenes)中异源表达的内切核酸酶Cas9关联入活细胞。crRNA/Cas9复合物中，双tracrRNA:crRNA结构作为引导RNA将内切核酸酶Cas9导向关联的靶序列。由于Vinv基因的核苷酸序列中存在数种PAM基序，可将对Vinv基因特异的crRNA设计为在转染有并表达Cas9内切核酸酶和crRNA的茄属植物细胞内的全部或部分Vinv等位基因引入突变或使其失活。本方法在一些示例中可用作TALE核酸酶的替代，从而获得本文所述的植物。
本文还涵盖可引入其他茄属基因中的突变，从而例如：
-通过改良天冬酰胺合成中涉及的基因表达进一步降低丙烯酰胺；
-通过降低多酚氧化酶-5的表达来防止黑点瘀青；
-通过降低elF4E基因表达防止马铃薯病毒Y；
-防止晚疫病；或
-改善线虫、除草剂或昆虫抗性。
因此，本文所述方法可用于获得茄属特性叠加的基因。
本文还提供用马铃薯植物品种生产食品产品的方法以及该方法生产的食品产品，所述马铃薯植物品种具有降低的CIS。本文提供的方法可包括例如提供或制备马铃薯植物或植物部分，所述植物或植物部分在两个或更多内源VInv等位基因中含TALE-核酸诱导的突变并经历冷储存；以及使用标准烹饪和/或生产方法从所述植物或植物部分生产食品产品(包括但不限于薯片、油炸薯条、马铃薯薄片和土豆泥)。在一些实施方式中，CIS降低可表现为其苦味和/或深色素与对照植物或植物部分生产的食品产品中观察到的苦味和/或深色素相比减少，所述对照植物或植物部分不含突变的VInv等位基因并且经历冷储存。在一些实施方式中，所述食品产品(例如用本发明方法如烹饪植物或植物部分生产的食品产品)的丙烯酰胺水平与内源VInv等位基因中不具有突变且经历冷储存的马铃薯植物或植物部分所生产的食品产品中的丙烯酰胺水平相比降低。在一些情况汇总，该食品产品的丙烯酰胺水平与不经历冷储存的马铃薯植物或植物部分所生产的食品产品中的丙烯酰胺水平相当。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1-工程改造序列特异的核酸酶以诱变VInv基因
为使马铃薯中VInv基因的等位基因完全失活或敲除，设计了序列特异性核酸酶，其靶向起始密码子附近的蛋白质编码区。使用特异识别TALE-核酸酶识别位点的软件设计三种TALE-核酸酶对以在编码序列的前200bp内靶向VInv基因家族。VInv基因的TALE核酸酶识别位点在图1中带下划线并列于表1。使用与他处所述的那些方法类似的方法合成TALE核酸酶(Cermak等，NucleicAcidsRes.39:e82,2011；Reyon等，Nat.Biotechnol.30:460-465,2012；和Zhang等，Nat.Biotechnol.29:149-153,2011)。
实施例2-酵母中VInvTALE-核酸酶活性
为评估靶向VInv基因的TALE-核酸酶的活性，通过与他处所述方法(Christian等，Genetics186:757-761,2010)类似的方法在酵母中进行活性试验。对于这些试验，构建靶质粒，其中将TALE-核酸酶识别位点克隆至非功能性β-半乳糖苷酶报告基因中。靶位点侧接β-半乳糖苷酶编码序列的直接重复，从而如果报告基因被TALE-核酸酶切割，则在直接重复之间会发生重组并修复β-半乳糖苷酶基因的功能。因此，β-半乳糖苷酶活性被用于测量TALE-核酸酶切割活性。
在酵母试验中，所有VInvTALE-核酸酶对(VInv_T01、VInv_T02和VInv_T03)在两种不同温度条件(即37℃和30℃)下具有高切割活性。将切割活性对基准核酸酶I-SceI进行标准化。结果总结在表2中。
实施例3-马铃薯中VInvTALE-核酸酶在其内源靶位置的活性
通过在原生质体中表达TALE-核酸酶并研究TALE-核酸酶靶位点的通过NHEJ导入的突变，来测量马铃薯中内源性靶位点处TALE-核酸酶活性。原生质体制备的方法如他处所述进行(Shepard,GeneticImprovementofCrops/Emergent Techniques《作物/新兴技术的遗传改良》(185-219页),Rubenstein,Gengenbach,Philips,和Green(编辑),明尼苏达大学出版社,明尼苏达州明尼阿波利斯,1980(Univ.ofMinnesotaPress,Minneapolis,MN,1980)；以及Shepard和Totten,PlantPhysiol.60:313-316,1977)。简单地说，马铃薯微型块茎种植在潮湿蛭石中并在低光条件下生长3-5周。收集完全伸展的嫩叶并进行表面消毒并分离原生质体。
如他处所述通过PEG介导的转化将编码TALE-核酸酶的质粒与编码YFP的质粒导入马铃薯原生质体(Yoo等，NatureProtocols2:1565-1572,2007)。处理后24小时，通过使用荧光显微镜监测YFP荧光来评价转化的原生质体的等分试样，从而检测转化效率。收获剩余的转化的原生质体，并通过基于CTAB的方法制备基因组DNA。使用从原生质体制备的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增包含TALE-核酸酶识别位点的272-bp片段。通过个体克隆直接测序法和454焦磷酸测序法(Pyro-Sequencing)分析等位基因型。将认为间隔子区域中具有插入缺失(indel)突变的测序读数视作来源于通过NHEJ进行的经切割TALE-核酸酶识别位点的不精确修复。诱变频率计算为具有NHEJ突变的测序读数数目除以总测序读数。随后通过转化效率对数值进行标准化。
VInvTALE-核酸酶对VInv_T01、VInv_T02和VInv_T03针对其靶基因的活性概括于表3。TALE-核酸酶诱导VInvT1,VInvT2,和VInvT3中的NHEJ突变的范围为3.6％-9.5％。TALE-核酸酶诱导VInvT1,VInvT2,和VInvT3中的突变的示例示于图2。
实施例4-VInv中具有TALE-核酸酶诱导突变的马铃薯系的再生
生成VInv基因的一个或多个等位基因中存在突变的马铃薯系。从表面消毒的叶片中分离原生质体，并用编码下述之一的质粒进行转化：(i)TALE-核酸酶VInv_T01(ii)TALE-核酸酶VInv_T02；(iii)TALE-核酸酶VInv_T03；或(iv)YFP。通过递送YFP质粒监测转化效率，其使用荧光显微镜或通过流式细胞术来观察。
经过PEG-介导的转化，用他处所述方法和培养基培养原生质体(Gamborg等PlantTissueCultureMethodsandApplicationsinAgriculture《植物组织培养方法和农业应用》(115-153页),Thorpe(编辑),学院出版社公司，纽约州纽约，1981(AcademicPress,Inc.,NewYork,NY,1981))，仅做稍稍改良。原生质体以1x105/ml细胞浓度在小皮氏培养皿中重悬于液体平板培养基内，25℃暗储存。转化后14天，当大部分原生质体大部分分裂至少一次时，将原生质体培养物在P.-培养基悬浮液中稀释两倍。转化后26天，将原生质体培养物置于固体储器(10ml)的CUL培养基上(Haberlach等，PlantScience39:67-74,1985)。此时，肉眼可见原生质体衍生的愈伤组织。
转化后65天，鉴定为突变体(例如使用实施例5所述方法)的原生质体衍生的愈伤组织转移到固体储器的DIF培养基中(Haberlach等，同上)。每隔两周将愈伤组织转移到新鲜DIF培养基中。出芽后，将其切割并置于固体储器的R.-培养基中(Gamborg等，同上)。将这些个体愈伤组织转移至生芽培养基。生根后，将其转移到土壤中并生长至成熟用于生产块茎。
实施例5-VInv中具有TALE-核酸酶诱导突变的马铃薯系的验证
在转化后一个月评估所有VInv等位基因中具有突变的马铃薯细胞系。通过PCR扩增靶基因座然后测序来验证VInv基因中具有推定突变的植物。图4显示单一植物(示为St116_1)的所有等位基因中回收的突变。鉴于马铃薯为四倍体，已记录许多基因座具有三个或更少的等位基因(Draffehn等BMCPlantBiol.10:271,2010)。在这些实验中所用的品种“RangerRussett”中，仅鉴定到三个野生型等位基因(SEQIDNO:28,29和30；图3)。植物St116_1携带的突变如SEQIDNO:32,33和34所示，分别具有4bp,4bp和17bp缺失。
实施例6-突变体马铃薯系具有所需表型
对从突变体和对照块茎的mRNA提取物所生成的cDNA进行定量实时PCR来测定VInv的转录定量(Bhaskar等，PlantPhysiol.154(2):939-948,2010)。用他处(Livak和Schmittgen,Method.Methods25:402-408,2001)所述比较循环阈值法定量分析VInv表达下降。为了评估丙烯酰胺水平，从冷储存块茎加工薯片而不进行重整。轴向切割马铃薯块茎以获得切片并在植物油中于187℃炸2分钟或直到气泡停止。将炸薯片冷却5-8分钟至室温(22℃)，用研钵和研杵彻底研磨，粉末用于用他处(Bhaskar等，同上)所述方法进行丙烯酰胺分析。为了评估冷储存后块茎中的糖组分，用前述证实的方法(Bethke和Busse,Am.J.PotatoRes.85:414-421,2008)进行比色葡萄糖试验。
表4
马铃薯VInv全CDS；GenBankJN661860；SEQIDNO:27)
ATGGCCACGCAGTACCATTCCAGTTATGACCCGGAAAACTCCGCCTCCCATTACACATTCCTCCCGGATCAACCCGATTCCGGCCACCGGAAGTCCCTTAAAATCATCTCCGGCATTTTCCTCTCCTCTTTCCTTTTGCTTTCTGTAGCCTTCTTTCCGATCCTCAACAACCAGTCACCGGACTTGCAGAGTAACTCCCGTTCGCCGGCGCCGCCGTCAAGAGGTGTTTCTCAGGGAGTCTCCGATAAGACTTTTCGAGATGTCGTCAATGCTAGTCACGTTTCTTATGCGTGGTCCAATGCTATGCTTAGCTGGCAAAGAACTGCTTACCATTTTCAACCTCAAAAAAATTGGATGAACGATCCTAATGGTCCATTGTACCACAAGGGATGGTATCATCTTTTTTATCAATACAATCCAGATTCAGCTATTTGGGGAAATATCACATGGGGCCATGCCGTATCCAAGGACTTGATCCACTGGCTCTACTTGCCTTTTGCCATGGTTCCTGATCAATGGTACGATATTAACGGTGTCTGGACTGGGTCCGCTACCATCCTACCCGATGGTCAGATCATGATGCTTTATACCGGTGACACTGATGATTATGTGCAAGTGCAAAATCTTGCGTACCCCACCAACTTATCTGATCCTCTCCTTCTAGACTGGGTCAAGTACAAAGGCAACCCGGTTCTGGTTCCTCCACCCGGCATTGGTGTCAAGGACTTTAGAGACCCGACCACTGCTTGGACCGGACCCCAAAATGGGCAATGGCTCTTAACAATCGGGTCTAAGATTGGTAAAACGGGTATTGCACTTGTTTATGAAACTTCCAACTTCACAAGCTTTAAGCTATTGGATGAAGTGCTGCATGCGGTTCCGGGTACGGGTATGTGGGAGTGTGTGGACTTTTACCCGGTATCGACTGAAAAAACAAACGGGTTGGACACATCATATAACGGCCCGGGTGTAAAGCATGTGTTAAAAGCAAGTTTAGATGACAATAAGCAAGATCACTATGCTATTGGGACGTATGACTTGACAAAGAACAAATGGACACCCGATAAGCCGGAATTGGATTGTGGAATTGGGTTGAAGCTGGATTATGGGAAATATTATGCATCAAAGACATTTTATGACCCGAAGAAACAACGAAGAGTACTGTGGGGATGGATTGGGGAAACTGATAGTGAATCTGCTGACCTGCAGAAGGGATGGGCATCTGTACAGAGTATTCCAAGGACAGTGCTTTACGACAAGAAGACAGGGACACATCTACTTCAGTGGCCAGTTGAAGAAATTGAAAGCTTAAGAGCGGGTGATCCTATTGTTAAGCAAGTCAATCTTCAACCAGGTTCAATTGAGCTACTCCATGTTGACTCAGCTGCAGAGTTGGATATAGAAGCCTCATTTGAAGTGGACAAAGTCGCGCTCCAGGGAATAATTGAAGCAGATCATGTAGGTTTCAGCTGCTCTACTAGTGGAGGTGCTGCTAGCAGAGGCATTTTGGGACCATTTGGTGTCGTTGTAATTGCTGATCAAACGCTATCTGAGCTAACGCCAGTTTACTTCTTCATTTCTAAAGGAGCTGATGGTCGAGCTGAGACTCACTTCTGTGCTGATCAAACTAGATCCTCAGAGGCTCCGGGAGTTGCTAAACGAGTTTATGGTAGTTCAGTACCCGTGTTGGACGGTGAAAAACATTCGATGAGATTATTGGTGGACCACTCAATTGTGGAGAGCTTTGCTCAAGGAGGAAGAACAGTCATAACATCGCGAATTTACCCAACAAAGGCAGTGAATGGAGCAGCACGACTCTTCGTTTTCAATAATGCCACAGGGGCTAGCGTGACTGCCTCCGTCAAGATTTGGTCACTTGAGTCGGCTAATATTCGATCCTTCCCCTTGCAAGACTTGTAA
其他实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
Claims (48)
1.一种茄属植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞的内源的至少两个VInv等位基因中包含突变，从而所述植物、植物部分或植物细胞的液泡转化酶的表达相对没有所述突变的对照茄属植物、植物部分或植物细胞降低。
2.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中各所述突变是多于一个核苷酸碱基对的缺失。
3.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中各所述突变位于SEQIDNO:27所示靶序列或位于与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的靶序列。
4.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中各所述突变位于SEQIDNO:1所示靶序列或位于与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的靶序列。
5.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞采用稀有切割内切核酸酶制备。
6.如权利要求5所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述稀有切割内切核酸酶是转录激活因子样效应子内切核酸酶(TALE-核酸酶)。
7.如权利要求6所述的植物、植物部分或植物细胞，所述TALE-核酸酶结合至SEQIDNO:18-23中任一项所示的序列。
8.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述至少两个VInv等位基因各表现为移除内源核酸并且不包含任何外源核酸。
9.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中每个内源VInv等位基因发生突变。
10.如权利要求9所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述VInv等位基因各表现为移除内源核酸并且不包含任何外源核酸。
11.如权利要求9所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞检测不到液泡转化酶表达。
12.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述茄属植物、植物部分或植物细胞是马铃薯植物、植物部分或植物细胞。
13.如权利要求1所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞经过冷储存条件。
14.如权利要求13所述的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞的丙烯酰胺水平相对没有所述突变的对照植物、植物部分或植物细胞降低。
15.一种制备冷诱导甜味降低的茄属植物的方法，所述方法包括：
(a)使含功能性VInv等位基因的茄属植物细胞群接触靶向内源VInv序列的稀有切割内切核酸酶，
(b)从所述群中选择至少两个VInv等位基因已失活的细胞，和
(c)使所选植物细胞生长为茄属植物，其中所述茄属植物的冷诱导甜味相对所述VInv等位基因未失活的对照茄属植物降低。
16.如权利要求15所述的方法，所述茄属植物细胞是原生质体。
17.如权利要求16所述的方法，包括用编码所述稀有切割内切核酸酶的核酸转化所述原生质体。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸是mRNA。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸包含在载体内。
20.如权利要求15所述的方法，包括将稀有切割内切核酸酶蛋白导入所述原生质体。
21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述稀有切割内切核酸酶是TALE-核酸酶。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述TALE-核酸酶靶向SEQIDNO:27所示的序列，或靶向与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的序列。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述TALE-核酸酶靶向SEQIDNO:1所示的序列，或靶向与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的序列。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述TALE-核酸酶结合至SEQIDNO:18-23中任一项所示的序列。
25.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括培养所述原生质体以生成植物株系。
26.如权利要求16所述的方法，包括从所述原生质体分离含至少部分VInv基因座的基因组DNA。
27.如权利要求15所述的方法，所述茄属植物细胞是马铃薯植物细胞。
28.一种生成食品产品的方法，所述方法包括：
(a)提供茄属植物或植物部分，其(i)在所述植物或植物部分的内源的至少两个VInv等位基因中包含突变，从而所述植物、植物部分或植物细胞的液泡转化酶的表达相对没有所述突变的对照茄属植物或植物部分降低，并且(ii)经过冷储存；和
(b)从所述植物或植物部分生成食品产品。
29.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括：
(c)烹饪所述植物或植物部分以获得食品产品，该食品产品的丙烯酰胺水平相对不含所述突变并且在烹饪前经过冷诱导储存的对照烹饪植物或植物部分生成的食品产品降低。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述烹饪植物或植物部分与烹饪前未经冷储存的烹饪茄属植物或植物部分具有约相同的丙烯酰胺水平。
31.如权利要求28所述的方法，其中各所述突变位于SEQIDNO:27所示靶序列或位于与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的靶序列。
32.如权利要求28所述的方法，其中各所述突变位于SEQIDNO:1所示靶序列或位于与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的靶序列。
33.如权利要求28所述的方法，其中各所述突变采用稀有切割内切核酸酶制备。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述稀有切割内切核酸酶是TALE-核酸酶。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述TALE-核酸酶结合至SEQIDNO:18-23中任一项所示的序列。
36.如权利要求28所述的方法，其中所述茄属植物或植物部分是马铃薯植物或植物部分。
37.如权利要求28所述的方法，其中所述茄属植物或植物部分中检测不到液泡转化酶表达。
38.一种从茄属植物或植物部分生成的食品产品，所述茄属植物或植物部分(i)在所述植物或植物部分的内源的各VInv等位基因中包含突变，从而所述植物、植物部分或植物细胞没有功能性VInv等位基因，并且(ii)经过冷储存。
39.如权利要求38所述的食品产品，其中各所述突变位于SEQIDNO:27所示靶序列或位于与SEQIDNO:27具有至少95％相同性的靶序列。
40.如权利要求38所述的食品产品，其中各所述突变位于SEQIDNO:1所示靶序列或位于与SEQIDNO:1具有至少95％相同性的靶序列。
41.如权利要求38所述的食品产品，其中各所述突变采用稀有切割内切核酸酶制备。
42.如权利要求41所述的食品产品，其中所述稀有切割内切核酸酶是TALE-核酸酶。
43.如权利要求42所述的食品产品，其中所述TALE-核酸酶结合至SEQIDNO:18-23中任一项所示的序列。
44.如权利要求38所述的食品产品，其中所述食品产品已烹饪。
45.如权利要求44所述的食品产品，其中所述食品产品的丙烯酰胺水平相对不含所述突变并且在烹饪前经过冷储存的对照植物或植物部分制备的烹饪食品产品降低。
46.如权利要求44所述的食品产品，其中所述烹饪的食品产品与未经冷储存的茄属植物或植物部分具有约相同的丙烯酰胺水平。
47.如权利要求38所述的食品产品，其中所述茄属植物或植物部分是马铃薯植物或植物部分。
48.如权利要求38所述的食品产品，其中所述食品产品是薯片或油炸薯条。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151202 |