KR20200140367A

KR20200140367A - 식물 잡종 강세를 이용하는 방법

Info

Publication number: KR20200140367A
Application number: KR1020207032225A
Authority: KR
Inventors: 커지엔 왕; 춘 왕
Original assignee: 차이나 내셔널 라이스 리서치 인스티튜트
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2019-03-06
Publication date: 2020-12-15
Also published as: US20210363537A1; BR112020020900A2; CN109943585A; CN111394386A; CA3096898A1; EP3777525A4; EA202092307A1; WO2019196576A1; EP3777525A1; ZA202006748B; JP2021520223A; CN109943585B; PH12020551675A1; AU2023200393A1; AU2019250836A1

Abstract

본 발명은 식물 잡종 강세를 이용하는 방법을 공개하였다. 상기 방법은, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 얻는 단계 S1; 그리고 유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주는 단계 S2를 포함하되, 여기에 관련된 단백질은 MTL 단백질이다. 본 발명의 기술적 방안을 적용하면, 교잡종은 자기 유전자형 및 염색체 배수성과 완전히 일치한 복제 종자 또는 식물체를 생성하여 잡종 강세가 장기간 이용될 수 있도록 하고, 종래의 잡종 강세 이용에 있어서 개화기가 불일치한 것 등 원인에 의해 친본 간 교잡이 어렵고, 종자 생산량이 낮으며, 교잡종 비용이 높은 등 문제를 해결할 수 있다.

Description

식물 잡종 강세를 이용하는 방법

본 발명은 생물 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로 식물 잡종 강세를 이용하는 방법에 관한 것이다.

잡종 강세는 생물계에서 두 개의 유전 기초가 서로 다른 품종 간 또는 비슷한 종 간 교잡을 진행하면, 그 교잡 제1대가 성장세, 생활력, 적응성과 산량 등 형질에서 양친보다 뛰어난 현상을 가리킨다. 잡종 강세는 생물계의 보편적인 현상으로서, 농작물의 품종 배양과 생산 실천에 널리 활용되고 있다.

잡종 강세가 농업 생산에서의 응용에 대해, 가장 중요한 고리의 하나는 교잡종을 고효율적으로 제조하는 것이다. 옥수수 등 자웅이화 작물에서는 인공(또는 기계)에 의해 모본 근교계의 수꽃을 제거하고, 다른 한 근교계(부본)의 꽃가루로 수분하여 교잡 종자를 획득할 수 있어 조작이 상대적으로 간단하고 수행하기 쉽기에, 옥수수의 잡종 강세는 일찍부터 이용되고 체계적으로 성숙되어 응용이 광범위하다. 하지만 일부 친본들의 개화시기가 일치하지 않아 경작지에서 대규모적으로 교잡하고 종자를 생산할 수 없는 문제도 있다.

또한 벼, 밀 등과 같은 자웅동화 작물은 모본의 꽃가루를 제거하는 방식에 의해 교잡 종자를 대규모적으로 제조할 수 없다. 벼를 예로, 현재 벼에서 이 문제를 해결하는 방법은 웅성불임 특성을 갖는 식물체를 모본으로 이용하고, 다른 한 품종을 부본으로 꽃가루를 제공하여 교잡하는 것으로, 즉 웅성불임을 기술적 핵심으로 하는 잡종 강세 이용 체계이다. 벼 잡종 강세의 이용은 또한 두 가지 방법으로 나뉠 수 있으며, 하나는 세포질 유전적 웅성불임을 기술 핵심으로 하는 “3계법” 교잡 기술이고, 다른 하나는 일장 주기, 온도의 조절을 받는 환경감수성 유전적 웅성불임을 기술 핵심으로 하는 “2계법” 교잡 기술이다.

도 1A에 도시된 “3계법” 교잡 기술: 세포질 유전적 웅성불임계를 모본으로 이용하고, 유지계를 부본으로 하여 불임 특성을 유지하고 있는 종자를 대량 번식시키며, 불임계를 모본으로 이용하고, 회복계를 부본으로 웅성 가임성이 회복되고 잡종 강세를 가진 잡종 종자를 대규모적으로 생산하며, 상기 교잡 종자는 교잡벼의 생산에 사용된다.

도 1B에 도시된 “2계법” 교잡 기술: 동일한 벼 계통이 일정한 조건에서는 웅성 가임성이고, 그 가임성을 이용하여 불임계 종자를 번식하며, 다른 특정적인 조건에서는 웅성 불임성이고, 그 불임성을 이용하여 부본과 교잡하여 교잡 종자를 제조한다.

교잡벼는 1대 잡종 강세를 이용하는 것이기에, 앞으로 여러 세대에 걸쳐 형질 또는 임성이 분리된다. 따라서 해마다 종자를 제조해야 하고, 대량의 인력, 물력과 토지 자원을 소모하게 된다. 한편, “3계법”은 회복계와 유지계 사이 관계의 제약을 받아 생식질 자원에 대한 이용률이 낮으며, “2계법”은 자연 온도와 일장의 영향을 받아 불임계의 번식 산량이 불안정하고, 교잡 종자 제조 기간에 저온이 불임계의 자가 수정 결실을 유도하기에 교잡 종자의 순도가 기준에 미달할 위험이 있다.

또한, 일부 관련 문헌들에서는 잡종 강세의 이용 및 식물 생식에 관련된 유전자를 보도하였는데, 예를 들어 문헌[Turning rice meiosis into mitosis, (Cell Research (2016) 26:1242-1254)]에는 무수정 생식하는 종자에 의해 F1 잡종이 자가 번식하여 우량한 형질을 유지할 수 있다는 내용이 개시되어 있으며, 이 중 교잡에 의해 외래 보수 발현되는 CENH3 유전자를 도입하였다. US 2014/0298507 A1에는 무수정에 의해 배우자를 복제 배아 또는 종자로 전환하는 방법이 개시되어 있다. 문헌[사천대학학보(자연과학판), Vol.29 No.2 1992]에는 무수정 생식이 식물 육종에서의 응용 및 세포 배아학 연구방법이 개시되어 있다.

본 발명은 식물 잡종 강세를 이용하는 방법을 제공하여 교잡종이 복제 종자 또는 식물체를 생성하도록 함으로써 종자 생산효율을 향상시키는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따르면 식물 잡종 강세를 이용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열(mitosis-like)로 전환함으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자(gamete)를 얻는 단계 S1; 그리고 유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주는 단계 S2를 포함하되, 여기에 관련된 단백질은 MTL 단백질이다.

또한, 유전자 돌연변이는 무작위 돌연변이 유발(random mutagenesis)과 부위 특이적 돌연변이 유발(directed mutagenesis)을 포함하되, 무작위 돌연변이 유발은 화학적 돌연변이 유발, 물리적 돌연변이 유발과 생물학적 돌연변이 유발을 포함하고, 부위 특이적 돌연변이 유발은 유전자 편집 기술을 포함하되, 유전자 편집 기술은 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, CRISPR/Cpf1 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술, 호밍 엔도뉴클레아제 유전자 편집 기술(homing endonuclease gene editing technology)과 ZFN 유전자 편집 기술을 포함하며, 유전자 공학 기술은 형질전환기법(transgene technology)에 의해 유전자의 특이적 발현(specific expression), 전좌 발현(ectopic expression) 또는 유전자 침묵(gene silencing)을 유발하는 것을 포함한다.

또한, 단계 S1은 교잡종(hybrid seeds)을 채취하고, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 얻는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S1은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 친본을 편집한 다음, 친본 간 교잡에 의해 교잡종을 얻어서 생식세포의 감수분열이 유사한 유사분열로 전환된 교잡종 배우자를 획득하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S1은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질을 편집하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 단계를 포함하되, 이 중에서 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하며,

제1 단백질은 DNA 이중가닥 손상(DNA double-strand break)의 형성에 관여하는 단백질이고, 제1 단백질은

서열번호 13으로 표시된 PAIR1 단백질, PAIR1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PAIR1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 14로 표시된 PAIR2 단백질, PAIR2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PAIR2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 15로 표시된 PAIR3 단백질, PAIR3 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PAIR3 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 16으로 표시된 PRD1 단백질, PRD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PRD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 17로 표시된 PRD2 단백질, PRD2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PRD2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 18로 표시된 SPO11-1 단백질, SPO11-1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 SPO11-1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 19로 표시된 SPO11-2 단백질, SPO11-2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 SPO11-2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 20으로 표시된 SDS 단백질, SDS 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 SDS 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 21로 표시된 CRC1 단백질, CRC1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 CRC1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 22로 표시된 P31^comet 단백질, P31^comet단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 P31^comet 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 23으로 표시된 MTOPVIB 단백질, MTOPVIB 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 MTOPVIB 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 24로 표시된 DFO 단백질, DFO 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 DFO 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,

제2 단백질은 감수분열기 자매 염색체 간의 접착을 제어하는데 관여하고, 제2 단백질은

서열번호 25로 표시된 REC8 단백질, REC8 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 REC8 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,

제3 단백질은 감수분열의 제2차 분열에 관여하고, 제3 단백질은

서열번호 26으로 표시된 OSD1 단백질, OSD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 OSD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 27로 표시된 TAM 단백질, TAM 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 TAM 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 28로 표시된 TDM1 단백질, TDM1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 TDM1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택된다.

또한, 단계 S2는 유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주어, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S2는 다른 식물체의 유도 꽃가루를 주고, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S2는 물리적 자극, 생물학적 스트레스 또는 화학약제 처리에 의해, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S2는 꽃밥 배양 또는 꽃가루 배양에 의해 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다.

또한, MTL 단백질은 서열번호 29로 표시된 MTL 단백질, MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질이다.

또한, 식물은 단자엽 식물과 쌍자엽 식물을 포함한다.

또한, 식물은 벼, 옥수수, 수수, 조, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 메밀, 율무, 사탕수수, 아스파라거스, 죽순, 부추, 참마, 콩, 감자, 완두, 녹두, 팥, 잠두, 동부콩, 강남콩, 강낭콩, 돌콩, 병아리콩, 카사바, 고구마, 유채, 목화, 사탕무, 가지, 땅콩, 찻잎, 박하, 커피, 참깨, 해바라기, 피마자, 들깨, 홍화, 토마토, 고추, 오이, 청경채, 상추, 시금치, 마늘, 양배추, 갓, 줄, 대파, 동과, 애호박, 수세미외, 배추, 무우, 양파, 수박, 포도, 당근, 콜리플라워, 호박, 담배, 목초, 코끼리풀, 수크령, 수단 그라스, 난초, 백합, 튤립, 개자리(rice, maize, sorghum, millet, barley, wheat, rye, oats, buckwheat, coix seed, sugar cane, asparagus, bamboo shoots, allium tuberosum, yams, soybeans, potatoes, peas, mung beans, adzuki beans, vicia faba, vigna sesquipedalis, phaseolus vulgaris, lens culinaris, calopogonium mucunoides, chickpeas, cassava, sweet potato, rape, cotton, beets, eggplant, peanuts, tea, mint, coffee, sesame, sunflower, ricinus communis, perillaseed, safflower, tomato, pepper, cucumber, brassica chinensis, lettuce, spinach, garlic, brassica oleracea, brassica juncea, zizania aquatica, welsh onion, benincasa hispida, zucchini, loofah, chinese cabbage, radish, onion, watermelon, grape, carrot, cauliflower, pumpkin, tobacco, pasture, pennisetum purpureum schumach, pennisetum alopecuroides, sorghum sudanense, orchids, lilies, tulips and alfalfa)를 포함한다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 잡종 강세를 보유하는 식물 또는 종자를 제공한다. 상기 식물 또는 종자는 상기 어느 한 가지 방법에 의해 제조된다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 식물이 잡종 강세를 유지하도록 하는 시약 키트를 제공한다. 상기 시약 키트는 식물 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약, 그리고 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 하는 벡터 및/또는 시약을 포함한다.

또한, 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술에 의해 교잡종의 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 벡터 및/또는 시약으로서, 바람직하게는 무작위 돌연변이 유발 또는 부위 특이적 돌연변이 유발의 벡터 및/또는 시약이다.

또한, 무작위 돌연변이 유발은 화학적 돌연변이 유발, 물리적 돌연변이 유발과 생물학적 돌연변이 유발을 포함하고, 부위 특이적 돌연변이 유발은 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, CRISPR/Cpf1 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술, 호밍 엔도뉴클레아제 유전자 편집 기술과 ZFN 유전자 편집 기술을 포함하며, 유전자 공학 기술은 형질전환기법에 의한 유전자의 특이적 발현, 전좌 발현 또는 유전자 침묵을 유발하는 것을 포함한다.

또한, 식물 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질을 편집하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 벡터 및/또는 시약이며, 이 중에서 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하되,

제1 단백질은 DNA 이중가닥 손상의 형성에 관여하는 단백질이고, 제1 단백질은

또한, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 하는 벡터 및/또는 시약은, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 MTL 단백질에 영향을 주어, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 벡터 및/또는 시약을 포함하되, MTL 단백질은 서열번호 29로 표시된 MTL 단백질, MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질이다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상술한 시약 키트를 사용하여 생성한 식물을 제공한다. 상기 식물의 생식세포의 감수분열은 유사한 유사분열로 전환됨으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 생성할 수 있다.

또한, 식물의 배우자는 유도되어 식물체 또는 종자로 발달할 수 있다.

또한, 식물은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술로 개조된 식물이고, 식물에는 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술이 이용되어 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질이 조절됨으로써 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하며, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술이 이용되어 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 제4 단백질에 영향을 줌으로써 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하되, 이 중에서 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하며,

제2 단백질은 감수분열기 자매 염색체 간의 접착을 조절하는데 관여하고, 제2 단백질은

서열번호 28로 표시된 TDM1 단백질, TDM1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 TDM1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,

제4 단백질은

서열번호 29로 표시된 MTL 단백질, MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 식물의 잡종 강세를 유지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 유전자 편집 기술을 이용하여 교잡종을 F1 세대에 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 F1 세대의 이배체 암배우자를 얻는 단계 S1; 그리고 유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주어 이배체 암배우자가 종자로 발달하도록 유도하는 단계 S2를 포함하되, 여기에 관련된 단백질은 MTL 단백질이다.

또한, 단계 S1은 교잡 F1 세대 종자를 채취하고, 유전자 편집 기술을 이용하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 F1 세대의 이배체 암배우자를 얻는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S1은 유전자 편집 기술을 이용하여 교잡종의 친본을 편집하고, 편집된 각각의 유전자가 모두 이형접합 돌연변이인 식물체를 얻은 다음, 친본 간 교잡에 의해 교잡종을 얻고, 교잡종에서 두 개 친본 중 편집된 복수의 유전자가 모두 동형접합 돌연변이(homozygous mutant)인 식물체를 선별하여, 생식세포의 감수분열이 유사한 유사분열로 전환된 F1 세대의 이배체 암배우자를 획득하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S1은 유전자 편집 기술을 이용하여 REC8, OSD1, PAIR1 유전자를 넉아웃(knocking out)시킴으로써 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S2는 이배체 암배우자에게 반수체 유도계 꽃가루를 주어서 이배체 암배우자가 종자로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S2는 유전자 편집 기술을 이용하여 MTL 유전자를 넉아웃시킴으로써 반수체 유도계 꽃가루를 생성하는 단계를 포함한다.

또한, 단계 S2는 다른 식물체의 반수체 유도계 꽃가루를 사용하여 이배체 암배우자가 종자로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다.

또한, 교잡종은 F1 세대에 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL 유전자를 동시에 넉아웃시켰다.

또한, 식물은 벼, 옥수수, 수수, 조, 보리 및 밀을 포함한다.

본 발명의 기술적 방안을 적용하면, 교잡종은 자기 유전자형과 완전히 일치한 복제 종자를 생성하여 교잡종이 장기간 이용될 수 있도록 하고, 종래의 잡종 강세 이용에서 개화기가 불일치한 등 원인에 의해 친본 간 교잡이 어렵고, 종자 생산량이 낮으며, 교잡종 비용이 높은 등 문제를 해결할 수 있다.

본 출원의 일부를 구성하는 명세서 첨부도면은 본 발명에 대한 보다 깊은 이해를 제공하기 위한 것이며, 본 발명의 예시적 실시예 및 그 설명은 본 발명을 해석하기 위한 것으로, 본 발명에 대한 부당한 한정을 이루지 않는다. 첨부 도면에서
도 1A는 기존 기술 중 3계 교잡 육종 기술의 예시적인 흐름도를 나타낸다.
도 1B는 기존 기술 중 2계 교잡 육종 기술의 예시적인 흐름도를 나타낸다.
도 2와 도 3은 본 발명의 F1 세대 유전자형 유지 양상을 예시적으로 나타낸다.
도 4A는 실시예 1에서 F1 세대 식물체 춘우(春優) 84의 세포 배수성 검출 결과를 나타낸다. 그리고
도 4B는 실시예 1에서 잡종 강세 고정 식물체의 세포 배수성 검출 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 1에서 부본 C84, 모본 16A, 교잡종 춘우(春優) 84(CY84), 그리고 유전자형과 염색체 배수성 고정 식물체의 전장 유전체 염기서열 분석 결과이다.

모순되지 않는 한, 본 출원 중의 실시예 및 실시예 중의 특징들은 서로 조합이 가능하다. 이하, 첨부 도면을 참조하고 실시예와 함께 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다.

본 발명에서 다루는 용어는 아래와 같이 해석된다.

잡종 강세(heterosis): 잡종 제1대가 크기, 생장률, 번식력 및 행동 특성 면에서 모두 친본보다 우월한 현상을 가리킨다.

감수분열: 생식세포가 분열할 때 염색체는 한번만 복제되고 세포는 연속 2회 분열하는데, 이는 염색체 수가 절반으로 줄어드는 특수한 분열 방식이다.

유사분열(mitosis): 간접분열이라고도 하며, E. Strasburger가 1880년에 식물에서 발견한 것으로, 세포가 분열하는 과정에 방추체와 염색체가 나타나 S기에서 복제된 딸염색체가 딸세포에 균등하게 배분되도록 하는 것이 특징이며, 이런 분열 방식은 고등 동식물(동물과 고등 식물)에서 흔히 볼 수 있다.

염색체 배수성(chromosome ploidy): 일배성, 다배수성과 같이 세포에 포함된 염색체의 세트 수 또는 유전자 세트 수를 가리킨다.

이배체 암배우자: 배우자는 생물이 유성생식을 진행할 때 생식계통에서 생성되는 성숙한 성세포를 가리키며, 생식세포라 약칭하며, 배우자는 수배우자(male gamete)와 암배우자(female gamete)로 나뉜다. 일반적으로 생식세포가 분열할 때, 염색체는 한번만 복제되고 세포는 연속 2회 분열되며, 염색체의 수가 절반으로 줄어든다. 하지만 암배우자가 생성될 때 염색체의 수가 절반으로 줄어들지 않고 본 물종의 체세포 염색체 세트 수와 일치하면 이배체 암배우자라고 한다.

반수체: 체세포의 염색체 세트 수가 본 물종의 배우자 염색체 세트 수와 같은 개체 또는 세포.

처녀생식(parthenogenesis): 단성생식이라고도 하며, 즉 난자가 수정을 거치지 않고도 정상적인 새로운 개체로 발달할 수 있는 것을 말한다.

본 발명에서 교잡종은 유전자형이 이형접합된 식물체 또는 종자를 가리키며, 그 유성생식 후대는 유전 분리가 발생한다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 식물 잡종 강세를 이용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 얻는 단계 S1; 그리고 유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주는 단계 S2를 포함하되, 여기에 관련된 단백질은 MTL 단백질이다.

여기서, 유전자 돌연변이는 무작위 돌연변이 유발과 부위 특이적 돌연변이 유발을 포함하되, 무작위 돌연변이 유발은 화학적 돌연변이 유발, 물리적 돌연변이 유발과 생물학적 돌연변이 유발을 포함하고, 부위 특이적 돌연변이 유발은 유전자 편집 기술을 포함하되, 바람직하게는, 유전자 편집 기술은 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, CRISPR/Cpf1 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술, 호밍 엔도뉴클레아제 유전자 편집 기술과 ZFN 유전자 편집 기술을 포함하며, 유전자 공학 기술은 형질전환기법에 의한 유전자의 특이적 발현, 전좌 발현 또는 유전자 침묵을 유발하는 것을 포함한다.

구체적으로, 물리적 돌연변이 유발에 자주 쓰이는 방법은, 방사선(자외선, X선, γ선, 중성자선), 레이저 마이크로빔, 이온빔, 마이크로파, 초음파, 열력 등을 포함한다. 화학적 돌연변이 유발에 자주 쓰이는 방법은, 침지법(immersion method), 도말법(smear method), 액적법(drip method), 주사법(injection method), 시비법(application method) 및 훈증법(fumigation method)을 포함하며, 화학적 돌연변이 유기제는 알킬화제, 염기 유사체, 염화리튬, 니트로소 화합물, 아지드화물, 항생제, 하이드록실아민, 아크리딘, 다이에틸 설페이트(Diethyl sulphate)(DES), 5-브로모유라실(5-BU), 메클로레타민(mechlorethamine)(nitrogen mustard: Nm), N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘(N-methyl-N'-Nitro-N-nitrosoguanidine)(NTG) 등을 포함한다. 생물학적 돌연변이 유발 방법은, 공간 조건 돌연변이 유발, 병원미생물 돌연변이 유발, 조직 배양 돌연변이 유발, 유전자변형 돌연변이 유발을 포함한다.

응용 실례로는 문헌[McCallum et al., Plant Physiology, 2000, 123, 439-442]에 기술된 TILLING(부위 특이적 유전체 국부 돌연변이 유발, Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)을 들 수 있다. 표준 기술을 이용하여 부위 특이적 돌연변이 유발을 진행하는데, 상기 표준 기술은 당업계에 공지된 기술이고 상동 재조합이며, 바람직하게는 TALEN 또는 CRISPR와 같은 뉴클레아제와의 조합이다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 상기 방법은, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 얻는 단계 S1; 그리고 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계 S2를 포함한다.

본 발명의 기술적 방안을 적용하면, 교잡종은 자기 유전자형과 완전히 일치한 복제 종자 또는 식물체를 생성하여 교잡종이 장기간 이용될 수 있도록 하고, 종래의 잡종 강세 이용에서 개화기가 불일치한 등 원인에 의해 친본 간 교잡이 어렵고, 종자 생산량이 낮으며, 교잡종 비용이 높은 등 문제를 해결할 수 있다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 단계 S1은 교잡종을 채취하고, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 교잡종 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 얻는 단계를 포함한다. 예를 들어, 구체적으로 단계 S1은 교잡 F1 세대 종자를 채취하고, 유전자 공학 기술을 이용하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 F1 세대의 이배체 배우자를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 구체적인 방법은, 교잡 F1 세대 종자를 채취하고, 유전자 편집 시스템을 도입하여 감수분열에 관여하는 관련 핵심 유전자를 편집하여 유전자가 편집된 F1 세대 식물체를 획득하는 것이며, 상기 유전자가 편집된 F1 세대 식물체의 암배우자, 즉, 이배체 배우자이고, 바람직하게는, 감수분열에 관여하는 관련 핵심 유전자는 REC8, OSD1, PAIR1 세 개 유전자이다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 단계 S1은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 친본을 편집한 다음 친본 간 교잡에 의해 교잡종을 얻어서 생식세포의 감수분열이 유사한 유사분열로 전환된 교잡종 배우자를 획득하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 구체적으로 단계 S1은 유전자 편집 기술을 이용하여 교잡종의 친본을 편집하고, 감수분열에 관여하는 관련 핵심 유전자가 모두 이형접합 돌연변이 상태인 이형접합 돌연변이체를 얻은 다음, 친본 간 교잡에 의해 교잡종을 얻고, 교잡종에서 감수분열에 관여하는 관련 핵심 유전자가 모두 동형접합 돌연변이인 식물체를 선별하여, 생식세포의 감수분열이 유사한 유사분열로 전환된 F1 세대의 이배체 암배우자를 획득하는 단계를 포함한다. 구체적인 방법은, 교잡종의 부본과 모본을 각각 채취하고, 유전자 편집 기술을 도입하여, 상술한 세 개의 감수분열에 관여하는 관련 핵심 유전자를 편집하고, 유전자가 편집된 상술한 세 개 유전자가 모두 이형접합 상태인 친본 식물체를 획득한 다음, 이 두 개 친본을 교잡하여 맺은 종자는 서로 다른 유전자형을 나타내게 되는데, 그 중에서 상술한 세 개 유전자가 모두 동형접합 돌연변이인 종자를 선택하며, 이런 식물체인즉 본 발명에서 얻고자 하는 F1 세대 종자이고, 상기 F1 세대 종자의 암배우자인즉 이배체 암배우자이다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 단계 S1은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질을 편집하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 단계를 포함하되, 이 중에서 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하며,

서열번호 13(MKLKMNKACDIASISVLPPRRTGGSSGASASGSVAVAVASQPRSQPLS QSQQSFSQGASASLLHSQSQFSQVSLDDNLLTLLPSPTRDQRFGLHDDSSKRMSSLPASSASCAREESQLQLAKLPSNPVHRWNPSIADTRSGQVTNEDVERKFQHLASSVHKMGMVVDSVQSDVMQLNRAMKEASLDSGSIRQKIAVLESSLQQILKGQDDLKALFGSSTKHNPDQTSVLNSLGSKLNEISSTLATLQTQMQARQLQGDQTTVLNSNASKSNEISSTLATLQTQMQADIRQLRCDVFRVFTKEMEGVVRAIRSVNSRPAAMQMMADQSYQVPVSNGWTQINQTPVAAGRSPMNRAPVAAGRSRMNQLPETKVLSAHLVYPAKVTDLKPKVEQGKVKAAPQKPFASSYYRVAPKQEEVAIRKVNIQVPAKKAPVSIIIESDDDSEGRASCVILKTETGSKEWKVTKQGTEEGLEILRRARKRRRREMQSIVLAS)으로 표시된 PAIR1 단백질, PAIR1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PAIR1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 14(MVMAQKTKEAEITEQDSLLLTRNLLRIAIYNISYIRGLFPEK YFNDKSVPALEMKIKKLMPMDTESRRLIDWMEKGVYDALQKKYLKTLLFCICEKEEGPMIEEYAFSFSYPNTSGDEVAMNLSRTGSKKNSATFKSNAAEVTPDQMRSSACKMIRTLVSLMRTLDQMPEERTILMKLLYYDDVTPEDYEPPFFKCCADNEAINIWNKNPLKMEVGNVNSKHLVLALKVKSVLDPCDDNNVNSEDDNMSLDNESDQDNDFSDTEVRPSEAERYIVAPNDGTCKGQNGTISEDDTQDPVHEEELTAQVREWICSRDTESLEVSDVLVNFPDISMEMVEDIMERLLKDGLLSRAKKDSYSVNKIADPTTPHIKKEVIMQNVSPTEGTKNSNGDLMYMKALYHALPMDYVSVGKLHGKLDGEASQNMVRKLIEKMVQDGYVKNSANRRLGKAVIHSEVTNRKLLEIKKILEVDIAEQMAIDTNAEPGEPERKDHLSGHEMRDGSTMGCLQSVGSDLTRTRELPEPQQNVSMQSGQEASTVDKDPSRTPTSVREASVCSLESGVLGQKVRKSLAGAGGTQCSQDKRFRKASTVKEPILQYVKRQKSQVQVQVQ)로 표시된 PAIR2 단백질, PAIR2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PAIR2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 15(MEVELTNIQKATSSDYWSLASNQYPCGKFPKVSVGVTIPRTSSVSR GRDAASTAAFEKNLSQGTDGRSRPPKMDNASLQVSPEAANHGGSAKEVPKPVPAKVSVSQPDDNAIEQTGTFSFGTRREQDSHLDQLDRPPLVSSQGKRQVESADKNKPNSEMLRMKLWEILGGTSQNKEAVASPNPEDIETPCQPKSQIANGPSSGRQKVFTSPVPYNIKTPAQFNSQTANKPSSDPIESDSDSPQVVEVRPITRSLGRKKEPTGSTHQDKSGSAKKPLSTHRSTPKQKILDNVFAFNDKCTPKTVGKSANGESGSLRNLRSLSRRAKVEPKKAHCSDRISHKTTQDDMERKVPSKYIPSEKKGEKTNSFSSLSRTGKTAESCSRSPKRERRVNTMANVGARKMQLSENLLVKTLNDGEHKLSSPQLTSFKSKGKCSSISPQQKENDNTHIPEASDRTAARNSFNSTPSPAANPSPVLRKYSWEHDENPAINGKSGQKDASPLADRFSDMPDDFASPTFAANIKISPHRSKMLDDDLFSSKYPKGVNRSRSTSFTSDPESEPLDKMEKTNELPGSESPNSQEERQNRKQPHLSPLSPIESEGAQISIPSFRKGYKSHKWLSDVDSPDKSSIEHLGRKSHLKEGRKGKRQLTSPTHFATSGTQETMSDKEPEKVPENYLTRAFDQLVVVLGRFQTKIKSETRNKSSKILAATGEIIRQHLEGVEGQMQADVDKLVNAGKSKRKRLESTFEEQQEKLRILHEKFKEEVNQQLLGCKNSVEDFEAYHAELKGVADKQKASHKKLLQNAEKTVGAQLSDAETKIAEVQKRARKRMKGLKFVLKELIAETAE)로 표시된 PAIR3 단백질, PAIR3 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PAIR3 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 16(MEMVLIMSFRVLLYHRLTAQTGPFKLHCLGILLNSTKDAATYIGDKQ SLYLNLVNNLRLPSDEIRGEILFVLYKLSLLNATPWDDICDNDNVDLSAIGRSLLQFSLEVLLKTQNDDVRLNCIALLLTLAKKGAFDILLLSDPSLINSAEAEDNVPLNDSLVILFAEAVKGSLLSTNIEVQTGTLELIFHFLSSDANIFVLKTLIDQNVADYVFEVLRLSGMRNHLLQSSNASQFLTKLLYVSGNNDPLVISSIKVLSILANSEERFKEKLAIAVSTLLPVLHYVSEIPFHPVQSQVLRLVCISIINCSGILSLSQEEQIACTLSAILRRHGNGELGMSSETFALVCSMLVEILKLPSADDIQKLPSFIVEASKHAISLTFSHEYDCLFLIPHSLLLLKEALIFCLEGNKDQILRKKSLEDSIIETCETYLLPWLESAIVDGNDEETLSGILQIFQIILSRASDNKSFKFAEMLASSSWFSLSFGFMGLFPTDHVKSAVYLVISSIVDKVLGISYGETIRDACIYLPPDPAELLYLLGQCSSEDFNLASCQCAILVILYVCSFYNERLAADNQILASVEQYILLNGAKFPHEIPGSLMLTLLVHLYAFVRGISFRFGIPHSPEAEKTLFHAMTHKEWDLLLIRVHLIALKWLFQNEELMEPLSFHLLNFCKFFCEDRTVMLSSSTQLVDIQLIAELVYSGETCISSLLVSLLSQMIKESAEDEVLSVVNVITEILVSFPCTSDQFVSCGIVDALGSIYLSLCSSRIKSVCSLLIFNILHSASAMTFTCDDDAWLALTMKLLDCFNSSLAYTSSEQEWKILIGILCLILNHSANKVLIEPAKAIILNNCLALLMDGIVQEACAKGPSLFQHNQETTFGELLILMLLLIFFSVRSLQAILEASIDWQEFLQYSDDTESSSVLGIPCHDLCRLMHFGPSPVKLIASQCLLELLNRISDQRSCLNAELRCSAKYLKSMIAVTEGMVFDQDSRVAENCGACLTVILGWERFGSREKAVIRESKWSRLILEEFAVALTAPGLTSKSFSNQQKIAANIALSLLQLSQVPDWLTSLFSDSLISGIVANLSARNVTAEIVTLFSELMAKNYLNQEHIAGLHNLFQVCRRQAYEGGGGSKAQPSEQKAAAARCADDVRALLFGMMLEQRACSRATVEMEQQRLLREIDSFFFQESSLREQNSVK)으로 표시된 PRD1 단백질, PRD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PRD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 17(MAPPASRPPTPTPTPTANAAASSSRIESPSLRAALAMALIHYNRLP SRAAAAAAPSPQALLNWKRKAKDRKREILRLREELKLLQDGARGEEMEPPVASCRCHFFDGCGDLPPPTDGDAGEHWVDDVLRRRFVRLVRWKDKRRRLDRSLPTSSLMEYNTEDEVQQLSLSIDFLVELSDGLFAKREAGSSFTTFSHQAVDFILASLKNILSSEREKEIIEEIINGLVARLMKRMCTTPENAGSVDCSDAQFSLQHLFRKLGNEEFVGQRIILAISQKISNVSEKLLLADPFDDGFPEMHSNMFIMIQLIEFLISDSFNNWLCRDHFDRKLFEEWVRSILKARKDLEVLDGRNGLYVVYIERVIGRLAREVAPAAHQGKLDLEVLSKLLY)로 표시된 PRD2 단백질, PRD2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 PRD2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 18(MAGREKRRRVAALDGEERRRRQEEAATLLHRIRGLVRWV VAEVAAGRSPTVALHRYQNYCSSASAAAASPCACSYDVPVGTDVLSLLHRGSHASRLNVLLRVLLVVQQLLQQNKHCSKRDIYYMYPSIFQEQAVVDRAINDICVLFKCSRHNLNVVPVAKGLVMGWIRFLEGEKEVYCVTNVNAAFSIPVSIEAIKDVVSVADYILIVEKETVFQRLANDKFCERNRCIVITGRGYPDIPTRRFLRYLVEQLHLPVYCLVDADPYGFDILATYKFGSLQLAYDANFLRVPDIRWLGVFTSDFEDYRLPDCCLLHLSSEDRRKAEGILSRCYLHREAPQWRLELEAMLQKGVKFEIEALSACSISFLSEEYIPKKIKQGRHI)로 표시된 SPO11-1 단백질, SPO11-1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 단백질, 또는 SPO11-1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 19(MAEAGVAAASLFGADRRLCSADILPPAEVRARIEVAVLNFLAALTD PAAPAISALPLISRGAANRGLRRALLRDDVSSVYLSYASCKRSLTRANDAKAFVRVWKVMEMCYKILGEGKLVTLRELFYTLLSESPTYFTCQRHVNQTVQDVVSLLRCTRQSLGIMASSRGALIGRLVVQGPEEEHVDCSILGPSGHAITGDLNVLSKLIFSSDARYIIVVEKDAIFQRLAEDRIYSHLPCILITAKGYPDLATRFILHRLSQTYPNMPIFALVDWNPAGLAILCTYKYGSISMGLESYRYACNVKWLGLRGDDLQLIPQSAYQELKPRDLQIAKSLLSSKFLQDKHRAELTLMLETGKRAEIEALYSHGFDFLGKYVARKIVQGDYI)로 표시된 SPO11-2 단백질, SPO11-2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 SPO11-2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 20(MPPTMLASVPTRPRSHPFRRRRGAAAAAPPLLPDQIAAAAAAAAKRP AESSTSASSCFHSEVISATSTTCPTSLAAAQRPEKRPRYQDVDEEQPAASECSEIIGGARPRAAEVEVSESSCLASVLESYLACPEQLANDAETTAYSSAREDLTLSETEEEEEEEEVRSGPCICTDCSFSPLHESSSSSDDDNAVPSPTFSLFLALAEQFVPFTHPKTPTATDVALQAGEGKRFEDLDNEVSYERFRRRERRGVVARDYIEVYSSMLGSYGRAVVEQRVVMVNWIMEHSQAMKLQPETVFMGIGLMDRFLTRGYVKGSRNLQLLGIACTTLATRIEENQPYNCILQKAFKVGINTYSRSEVVAMEWLVQEVLDFQCFVTTTHHFLWFYLKAANADDRVEDLAKYLALLSLLDHKHLSFWPSTVAAAVVALACLATNNESSCHLVMETHMRTKNDDLPECLMSLEWLTNYAS)으로 표시된 SDS 단백질, SDS 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 SDS 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 21(MSAPMEVSFSAPPPPDAASAAAAAPSLVPAVSAAAVAATTVSCS PQPPTGSPSADDRILVSVEVLLHATSTARAEDVCAAVERMLEARSLSYVDGPVPIPNDDPFLLANVKRIQICDTDEWTENHKVLLFWQVRPVVHVFQLSEDGPGEEPGEDDTLSSFNEWALPAKEFDGLWESLLYEVGLKQRLLRYAASALLFTEKGVDPCLVSWNRIVLLHGPPGTGKTSLCKALAQKLSIRFKSRYSMCQLIEVNAHSLFSKWFSESGKLVAKLFQKIQEMVEEESNLVFVLIDEVESLAAARQAAISGSEPSDSIRVVNALLTQMDKLKSWPNVIILTTSNITTAIDIAFVDRADIKAYVGPPTLQARYEILRSCLQELLRVGILTHTQGGNSLCLLSYFSLMENQHCPEVADPHGSVHLSGLLHKAAEICEGLSGRTLRKLPFLAHASVANPSCCDASAFLHALIQTAQRELSESRG)로 표시된 CRC1 단백질, CRC1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 CRC1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 22(MERATTSGGGGGGSQPPRGVGLPLVEVQAAAASLRRSEVFYVVKE LLGFVLYMHHQIPAVLQNLENEFASLKEEMTEMALPPGEMKPSDQRKYNTRKREVRRRIKKQEKLMNGLSSVFSALQKALDEVPSIEGVLLILGGSLVRPLFVYDITISHGRFDAGSANERGASKLAQSVSRKAIRALISSGAGSLSYTGPTKLFVLVRCPCTLNLPLDFLPKRDFRYSKKVVPLQMCIKCNIAGIQIDNQQITSIVDASRCTSESTISEVIWFQCKHTIRGLPCKASLEE)로 표시된 P31^comet 단백질, P31^comet 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 P31^comet 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 23(MASSPPPSTASPTSSSPYRKLLHSLIYWAVQRCRMSESPCRLTVSVKR SPEPAGSSPLRISVSDTGVGSKLEEFLELDALARETPVEKWDGTLLITTTGIDDKAIYRYQFNLQEDTSSSTRFTKLATMYKSRAIFSGTEVCLCLPTEADVDDLILWLVGFVRKIFVLRASNLACELFVAQTDSAGSGDVCLSQDSDDVHISITTSSIDRLVSGLKDYALSHANTSDRCEACYMNRDRLKIGTGTAKYVDKRKAKGQLVEVVIMIAPTSSDLSCWMTNCSSTQVLHFVEFIPCPISQSSLSALMSIDWQSYGFKFKGGFIDDDGNAELQWDNMAFSHVDIAIHTYHEGAVDEWKSSQPERHLLRKALKSALFGLKADHAEDFLSCHGQKVREYVPDLAESIAGLILSSNDQEFQDECIALLGLGSDQDLTEGAVRSCIGEKMNRIIEMNDTKENVEHNAPYLFECERFDEDYSLLDEDDPDEDMIFDF)으로 표시된 MTOPVIB 단백질, MTOPVIB 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 MTOPVIB 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 24(MRHNIKFKSKGTLKIRNTAQISLWKKCSDSMIADQTYLFINRVQDRR FDEESLRILELSLVAMNVKSFLEVRSRLRDFMRSESVVIFGELTGESMVAKLSVLEFFARAFALLGDMESCLAMRYEALNLRQLKSPSCLWLGVSHSEWTKFAVQSMENGFPSIAGKASENALLSLKKDSLIEPKSEDNSDILDAAEKVRRLRDSAASLTSSHSGIFIYIVSSLKFAVCNRLLTTF)로 표시된 DFO 단백질, DFO 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 DFO 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,

서열번호 25(MFYSHQLLARKAPLGQIWMAATLHSKINRKRLDKLDIIKICEEILN PSVPMALRLSGILMGGVAIVYERKVKALYDDVSRFLIEINEAWRVKPVADPTVLPKGKTQAKYEAVTLPENIMDMDVEQPMLFSEADTTRFRGMRLEDLDDQYINVNLDDDDFSRAENHHQADAENITLADNFGSGLGETDVFNRFERFDITDDDATFNVTPDGHPQVPSNLVPSPPRQEDSPQQQENHHAASSPLHEEAQQGGASVKNEQEQQKMKGQQPAKSSKRKKRRKDDEVMMDNDQIMIPGNVYQTWLKDPSSLITKRHRINSKVNLIRSIKIRDLMDLPLVSLISSLEKSPLEFYYPKELMQLWKECTEVKSPKAPSSGGQQSSSPEQQQRNLPPQAFPTQPQVDNDREMGFHPVDFADDIEKLRGNTSGEYGRDYDAFHSDHSVTPGSPGLSRRSASSSGGSGRGFTQLDPEVQLPSGRSKRQHSSGKSFGNLDPVEEEFPFEQELRDFKMRRLSDVGPTPDLLEEIEPTQTPYEKKSNPIDQVTQSIHSYLKLHFDTPGASQSESLSQLAHGMTTAKAARLFYQACVLATHDFIKVNQLEPYGDILISRGPKM)로 표시된 REC8 단백질, REC8 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 REC8 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,

서열번호 26(MPEVRNSGGRAALADPSGGGFFIRRTTSPPGAVAVKPLARRA LPPTSNKENVPPSWAVTVRATPKRRSPLPEWYPRSPLRDITSVVKAVERKSRLGNAAVRQQIQLSEDSSRSVDPATPVQKEEGVPQSTPTPPTQKALDAAAPCPGSTQAVASTSTAYLAEGKPKASSSSPSDCSFQTPSRPNDPALADLMEKELSSSIEQIEKMVRKNLKRAPKAAQPSKVTIQKRTLLSMR)으로 표시된 OSD1 단백질, OSD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 OSD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 27(MSSSSRNLSQENPIPRPNLAKTRTSLRDVGNRRAPLGDITNQKN GSRNPSPSSTLVNCSNKIGQSKKAPKPALSRNWNLGILDSGLPPKPNAKSNIIVPYEDTELLQSDDSLLCSSPALSLDASPTQSDPSISTHDSLTNHVVDYMVESTTDDGNDDDDDEIVNIDSDLMDPQLCASFACDIYEHLRVSEVNKRPALDYMERTQSSINASMRSILIDWLVEVAEEYRLSPETLYLAVNYVDRYLTGNAINKQNLQLLGVTCMMIAAKYEEVCVPQVEDFCYITDNTYLRNELLEMESSVLNYLKFELTTPTAKCFLRRFLRAAQGRKEVPSLLSECLACYLTELSLLDYAMLRYAPSLVAASAVFLAQYTLHPSRKPWNATLEHYTSYRAKHMEACVKNLLQLCNEKLSSDVVAIRKKYSQHKYKFAAKKLCPTSLPQELFL)로 표시된 TAM 단백질, TAM 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 TAM 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;

서열번호 28(MCPCVERRAPPGVYYTPPPARTSDHVAAMPMTERRRPPYSCSSSSE RRDPFHIVHKVPSGDSPYVRAKHAQLIDKDPNRAISLFWTAINAGDRVDSALKDMAVVMKQLGRSDEGIEAIKSFRYLCSFESQDSIDNLLLELYKKSGRIEEEAVLLEHKLQTLEQGMGFGGRVSRAKRVQGKHVIMTIEQEKARILGNLGWVHLQLHNYGIAEQHYRFGFVTKIPNIDYCLVMRALGLERDKNKLCNLAICLMRMSRIPEAKSLLDDVRDSPAESECGDEPFAKSYDRAVEMLAEIESKKPEADLSEKFYAGCSFVNRMKENIAPGTANKNYSDVSSSPASVRPNSAGLYTQPRRCRLFEEETRGAARKLLFGKPQPFGSEQMKILERGEEEPMKRKKLDQNMIQYLHEFVKDTADGPKSESKKSWADIAEEEEAEEEEEERLQGELKTAEM)로 표시된 TDM1 단백질, TDM1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 TDM1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택된다.

이 중에서, PAIR1 단백질은 초기 감수분열 재조합의 발생에 관여하고, DNA 이중가닥 절단의 형성을 촉진하며, PAIR1 유전자의 결실은 재조합 과정의 결실을 일으킨다. REC8 단백질은 새로 복제된 자매 염색체를 긴밀하게 연결시켜주는 역할을 하며, 자매(또는 상동)염색체가 정확하게 분리되고 딸세포에 배분되도록 보장하는 핵심 조절인자로서, REC8 단백질의 기능이 부재하면 자매 염색분체가 감수 제1분열 말기에 분리되어 세포 양극으로 이동하게 된다. OSD1 유전자 기능의 부재는 배우자의 형성이 감수 제2분열 과정을 건너뛰게 한다.

상술한 유전자를 넉아웃시키는 것은 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 간편하고 효과적인 방법이다.

본 발명에 기술된 억제 단백질은 돌연변이 유발 암호화 단백질의 유전자 또는 그 프로모터에 의하여, 단백질의 활성을 일부 또는 전부 잃어버리게 하는 것을 말하여, 이 중에는 식물에서 침묵 RNA를 발현함으로써 관련 단백질에 대한 억제를 획득하는 것이 포함된다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 단계 S2는 유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주어, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다. 또한, 단계 S2는 다른 식물체의 유도 꽃가루를 주어서, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 에를 들어, 단계 S2는 이배체 암배우자에게 반수체 유도계 꽃가루를 주어서 이배체 암배우자가 종자로 발달하도록 하는 단계를 포함한다. 또 예를 들어, 단계 S2는 물리적 자극, 생물학적 스트레스 또는 화학약제 처리에 의해, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다. 그리고 또 예를 들어, 단계 S2는 꽃밥 배양 또는 꽃가루 배양에 의해 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, MTL 단백질은 서열번호 29(MAASYSCRRTCEACSTRAMAGCVVGEPASAPGQRVTLLAIDGGGIRGLIPGTILAFLEARLQELDGPDARLADYFDCIAGTSTGGLITAMLAAPGDHGRPLFAASDINRFYLDNGPLIFPQKRCGMAAAMAALTRPRYNGKYLQGKIRKMLGETRVRDTLTNVVIPTFDVRLLQPTIFSTYDAKSMPLKNALLSDICISTSAAPTYLPAHCFQTTDDATGKVREFDLIDGGVAANNPTMVAMTQITKKIMVKDKEELYPVKPSDCGKFLVLSVGTGSTSDQGMYTARQCSRWGIVRWLRNKGMAPIIDIFMAASSDLVDIHAAVMFQSLHSDGDYLRIQDNTLHGDAATVDAATRDNMRALVGIGERMLAQRVSRVNVETGRYVEVPGAGSNADALRGFARQLSEERRARLGRRNACGGGGEGEPSGVACKR)로 표시된 MTL 단백질, 상기 MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질이다. 이 중에서, 상기 유도계 꽃가루는 유전자형과 배수성이 교잡종과 일치한 배우자를 생성하는 식물체에서 유래할 수 있고, 다른 식물체에서 유래할 수도 있으며, 바람직하게는, 유도계 꽃가루는 유전자형과 배수성이 교잡종과 일치한 암배우자를 생성하는 식물체에서 유래하고, 교잡종에서 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL 유전자를 동시에 넉아웃시킴으로써 달성한다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 식물은 단자엽 식물과 쌍자엽 식물을 포함하며, 바람직하게는 벼, 옥수수, 수수, 조, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 메밀, 율무, 사탕수수, 아스파라거스, 죽순, 부추, 참마, 콩, 감자, 완두, 녹두, 팥, 잠두, 동부콩, 강남콩, 강낭콩, 돌콩, 병아리콩, 카사바, 고구마, 유채, 목화, 사탕무, 가지, 땅콩, 찻잎, 박하, 커피, 참깨, 해바라기, 피마자, 들깨, 홍화, 토마토, 고추, 오이, 청경채, 상추, 시금치, 마늘, 양배추, 갓, 줄, 대파, 동과, 애호박, 수세미외, 배추, 무우, 양파, 수박, 포도, 당근, 콜리플라워, 호박, 담배, 목초, 코끼리풀, 수크령, 수단 그라스, 난초, 백합, 튤립, 개자리를 포함한다.

본 출원의 구현 원리는 이하와 같다.

본 출원이 무수정 생식을 구현하는 원리는 감수분열과 수정과정을 거치지 않고 배아를 직접 형성하여 종자를 산생하는 것으로, 주로 크게 두 단계로 나뉜다.

1단계: 감수분열은 동식물이 생식시기에 발생하는 특수한 세포 분열 과정이다. 감수분열 시, 부본과 모본에서 유래된 유전 정보가 재조합되면서 염색체 수가 절반으로 감소된 배우자를 생성한다.

식물의 감수분열 시기의 세 개 서로 다른 중요한 단계에 관여하는 유전자들을 동시에 돌연변이시키면(이 3중 돌연변이 물질을 MiMe, Mitosis instead of Meiosis라고 명명함), 식물체의 감수분열이 유사한 유사분열 과정으로 전환된다.

MiMe 식물체가 생성하는 암배우자와 수배우자의 세포 중 염색체 수 및 유전자형은 체세포와 완전히 일치하고, 이들의 자가 교배 후대는 모두 유전자형이 이형접합인 사배체로서, 세 개 유전자를 동시에 돌연변이시키면 교잡 식물이 감수분열 과정을 거치지 않고 체세포와 유전자형이 일치한 복제 배우자를 생성할 수 있음을 증명한다.

2단계: 꽃가루 특이적 포스포리파아제 유전자(MATRILINEAL, MTL)는 주로 식물 수배우자에 작용하며, 반수체 유도를 제어하는 유전자로, 옥수수에서 먼저 복제되었다. MTL 유전자를 넉아웃시킴으로써 반수체 유도물질 mtl을 획득할 수 있다. 중복수정 과정에서, 접합자 중 mtl 수배우자의 유전체는 분해되고, 즉 부본의 정핵이 수용체의 난핵과 접합자를 형성하지 못하고 난핵 반수체의 결실을 유도한다.

따라서, 식물에서 MiMe 및 MTL이 네 개 내생성 유전자를 동시에 개조하여, 무수정 생식이 가능한 Fix(Fixation of hybrids) 물질, 즉 감수분열과 수정과정을 거치지 않고 모본 유전체를 보존하는 방식에 의해 세포 배수성이 이배체이고 유전자형이 친본과 완전히 일치한 식물체를 얻었다. 이로부터 네 개 내생성 유전자를 동시에 개조하면 무수정 생식 특성을 교잡 식물에 도입할 수 있어 이형접합 유전자형의 고정을 실현할 수 있다는 것을 입증하였다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 이하 단계를 포함한다. 1) 배우자 형성 과정의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환한다. 연구에 따르면, 감수분열 시기에 관여하는 REC8, OSD1, PAIR1 세 개 유전자를 동시에 넉아웃시킨 다음(이 물질을 MiMe, Mitosis instead of Meiosis라 명명함), 염색체를 한 번 복제하면, 생식세포는 원래의 두 번 분열에서 한 번 분열로 변하고, 이렇게 형성된 배우자에서 염색체 수는 절반으로 줄어들지 않고 체세포와 일치하다는 것이 발견되었다. 즉, 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써, 염색체를 배가하는 목적을 달성한다. 2) 생성된 암배우자는 암배우자의 발달을 유도하는 꽃가루의 자극을 받아, 즉 암배우자는 정세포 염색체와 융합하지 않고도 배아로 발달되어, 체세포 유전자형과 완전히 일치한 종자를 형성한다. MTL 유전자를 넉아웃시키면 유도 반수체가 생성한 꽃가루를 획득할 수 있다. 교잡 종자를 형질전환 배경으로 하고, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL 네 개 유전자를 동시에 넉아웃시키면, 상기 식물체가 생성한 암배우자는 체세포와 같은 염색체 배수성이며, 또한 MTL 유전자가 파괴되었기에, 생성된 꽃가루는 암배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도할 수 있고, 이렇게 얻은 종자 또는 식물체는 유전자 분리(형질 또는 임성의 분리)가 발생하지 않았으며, 유전자형이 모세포(형질전환에 사용되는 배경 물질 교잡종)와 똑같아서, 최종적으로 잡종 강세를 고정하는 목적을 달성한다.

도 2와 도 3은 본 발명의 F1 자손대 유전자형 및 염색체 배수성이 잡종 모세포와 일치함을 분명히 나타내었다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 잡종 강세를 보유하는 식물 또는 종자를 제공한다. 상기 식물 또는 종자는 상술한 어느 한 가지 방법에 의해 제조되며, 상기 종자는 교잡 우세를 잘 고정할 수 있다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 식물이 잡종 강세를 유지하도록 하는 시약 키트를 제공한다. 상기 시약 키트는 식물 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약, 그리고 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 하는 벡터 및/또는 시약을 포함한다. 바람직하게는, 식물 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약, 그리고 식물 배우자가 처녀생식을 하도록 유도하는 벡터 및/또는 시약은, 무작위 돌연변이 유발 또는 부위 특이적 돌연변이 유발의 벡터 및/또는 시약이다. 이 중에서, 무작위 돌연변이 유발은 화학적 돌연변이 유발, 물리적 돌연변이 유발과 생물학적 돌연변이 유발을 포함하고, 부위 특이적 돌연변이 유발은 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, CRISPR/Cpf1 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술, 호밍 엔도뉴클레아제 유전자 편집 기술과 ZFN 유전자 편집 기술을 포함하며, 유전자 공학 기술은 형질전환기법에 의한 유전자의 특이적 발현, 전좌 발현 또는 유전자 침묵을 유발하는 것을 포함한다.

한 모식적인 실시양태에 따르면, 식물 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약은 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 감수분열 재조합에 관여하는 단백질을 억제하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 벡터 및/또는 시약이며, 이 중에서 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하되,

판매와 사용에 편리하기 위해, 바람직하게는, 시약 키트는 교잡종에서 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL 유전자를 동시에 넉아웃시키는 벡터 및/또는 시약을 포함하였다.

본 발명의 한 모식적인 실시양태에 따르면, 식물을 제공한다. 상기 식물의 생식세포의 감수분열은 유사한 유사분열로 전환됨으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 식물의 생식세포의 감수분열은 유사한 유사분열로 전환됨으로써 교잡종과 염색체 배수성 및 유전자형이 일치한 배우자를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 식물은 배우자가 식물체 또는 종자로 발달하도록 유도할 수 있다.

한 모식적인 실시양태에 따르면, 식물은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술로 개조된 식물이고, 식물은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질을 조절함으로써 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하며, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 배우자 발달 과정에 관여하는 MTL 단백질에 영향을 줌으로써, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하되, 이 중에서 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하며,

MTL 단백질은 서열번호 29로 표시된 MTL 단백질, MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질이다.

아래에 실시예와 함께 본 발명의 유익한 효과를 보다 깊이 설명할 것이며, 이하 실시예에서 상세하게 기술하지 않은 단계 또는 시약은 모두 당업계의 일반적인 기술수단 또는 일반 시약을 사용하여 구현할 수 있다.

실시예 1

1. 본 실시예에서 사용된 F₁ 교잡종은 심의를 거친 상품화 교잡벼 품종인 춘우(春優) 84이다. 춘우(春優) 84는 조기개화 만숙성 자포니카 불임계 춘강(春江) 16A와 인디카 자포니카 중간형 광친화성 회복계 C84를 짝을 지어 육성한 자포니카-인디카 교잡벼의 새로운 조합이다. 상기 교잡벼는 수확 잠재력이 크고, 종자 생산량이 높으며, 종합적인 농예 형질이 우수하고, 도열병 저항성이 훌륭하며, 적응성이 넓은 장점을 가지고 있다. 본 실시예에서 사용한 유전적 형질전환 배경 물질은 교잡벼 F₁ 종자를 이용하여 유도 획득한 캘러스이며, 유성 번식 단계를 거치지 않았기에 형질전환 후 획득한 형질전환 T₀ 세대 물질은 유전 배경 상 교잡벼 F₁ 식물체와 일치하다.

2. 다유전자 넉아웃 벡터의 구축

주요 절차는 아래와 같다(자세한 사항은 CN201510485573.2 참조):

1) 단일 목표 SK-gRNA의 구축:

이하 네 개 부위를 선택하여 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템이 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL을 넉아웃하는 부위(밑줄로 표시된 PAM 서열)로 함:

OSD1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 1): CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG

PAIR1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 2): AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG

REC8 유전자 넉아웃 부위(서열번호 3): CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG

MTL 유전자 넉아웃 부위(서열번호 4):GGTCAACGTCGAGACCGGCAGG

두 개의 상보 DNA 서열을 설계하여, 각각 순방향 서열 앞에 GGCA를 추가하고, 역방향 상보 서열 앞에 AAAC를 추가하였다.

SK-gRNA에는 두 개의 AarI 제한효소 절단 부위가 있고, AarI에 의한 제한효소 절단 후 점착성 말단을 갖는 벡터를 형성하며, 설계된 타깃 서열을 전진 프라이머 및 역전사 프라이머에 의해 변성하고 어닐링한 후, T4 연결효소가 앞서 구축된 중간 벡터 SK-gRNA에 연결되어 단일 목표gRNA를 형성하였다.

2) 복수의 gRNA의 연쇄 및 최종 바이너리 발현 벡터의 구축:

BglII와 BamHI, NheI과 XbaI, SalI과 XhoI이 절단 후 같은 점착성 말단을 갖는 제한효소(isocaudomer)인 특성을 이용하여 gRNA의 중합을 진행하였다. SK-gRNA OSD1을 KpnI과 XhoI에 의해 제한효소 절단하여 벡터로 삼고, SK-gRNA PAIR1을 SalI과 XbaI에 의해 제한효소 절단하여 PAIR1 sgRNA 단편을 제공하고, SK-gRNA REC8을 NheI과 BamHI에 의해 제한효소 절단하여 REC8 sgRNA 단편을 제공하고, SK-gRNA MTL을 BglII와 KpnI에 의해 제한효소 절단하여 MTL sgRNA 단편을 제공하여, 4개 이내 gRNA를 원스텝으로 빠르게 중합시키고, 마지막에 중합된 gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL 단편을 KpnI과 BglII에 의해 제한효소 절단하고 단편을 회수하여, Cas9 단백질을 발현하는 바이너리 벡터 pC1300-Cas9(KpnI과 BamHI 부위 사이)에 연결시키고, 최종적으로 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL 네 개 유전자를 동시에 넉아웃할 수 있는 다유전자 넉아웃 벡터 pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL을 획득하여 형질전환에 의해 벼 다중 돌연변이체를 제조하는데 사용하였다.

3. 형질전환 식물체의 획득

다유전자를 넉아웃시킨 바이너리 발현 벡터 pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL을 전기충격법에 의해 아그로박테리움(AgroBacteriumtumefaciens) 라인 EHA105에 삽입하고, 아그로박테리움 매개 형질전환기법을 이용하여 상기 바이너리 발현 벡터를 춘우(春優) 84의 캘러스에 삽입하였다. 형질전환의 구체적인 방법은, 교잡벼 춘우(春優) 84 종자의 배아를 멸균한 후, 캘러스를 유도하는 배지에 접종하는 것이다. 1주 동안 배양한 후, 생장이 왕성하고 색갈이 연한 노란색이며 비교적 성긴 캘러스를 선택하여 형질전환의 수용체로 사용하였다. pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL 플라스미드를 함유한 EHA105 균주를 이용하여 벼 캘러스를 감염시키고, 암조건 25℃에서 3일 동안 배양한 후, 50 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유한 선택 배지에서 저항성 캘러스와 형질전환 식물체를 선별하였다. 히그로마이신 선택 배지에서 정상적으로 생장한 형질전환 식물체를 선택하였다.

4. 염기서열 분석에 의한 4중 돌연변이체 감별

생물분자학적 방법을 이용하여 목표 유전자 돌연변이 양상을 감별하였다. CTAB법으로 단일 포기에서 형질전환 식물 유전체 DNA를 추출하고, PCR로 목표 밴드를 증폭한다. 사용된 프라이머쌍

OSD1-F(서열번호 5): atctccaggatgcctgaagtgag

OSD1-R(서열번호 6): cctagactgctactcttgctagtgat

PAIR1-F(서열번호 7): ctgtacctgtgcatctaattacag

PAIR1-R(서열번호 8): ccccatcttatgtactgagcttgccag

REC8-F(서열번호 9): gcgacgcttcactcgaagatca

REC8-R(서열번호 10): cgccatgcctcgttgatctcaa

MTL-F(서열번호 11): acagtgactagtgacaaacgatcg

MTL-R(서열번호 12): gatcgcgtcagcatgatgcgtgtac

얻어진 PCR 산물을 염기서열 분석회사에 보내어, 각각 OSD1-F, PAIR1-F, REC8-F, MTL-F를 염기서열 분석 프라이머로 사용하여 염기서열을 분석하였다. 얻은 결과를 야생형 서열과 비교하였다. 염기서열 분석 결과 이중 피크인 경우, 축퇴 코돈 전략 분석(http://dsdecode.scgene.com/ 피크 그래프 분석 진행)으로 직접 돌연변이 정보를 획득한다. 그 중에서 네 개 유전자가 모두 이중대립인자성 돌연변이인 4중 돌연변이체를 선별하였다.

5. 자손 제1대에서 배수성과 유전자형이 고정된 식물체를 감별하였다.

1) 감별해 얻은 4중 돌연변이체 식물의 자손 제1대 식물체에서 유세포 분석을 이용하여 세포 배수성의 선별을 진행하고, 세포 배수성이 모체 식물체와 일치한 식물체를 선별하여 얻었다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

일정량의 식물 조직을 채취하여 유리 페트리 접시에 넣고, 1 내지 2㎖ 식물 용해 버퍼 LB01을 첨가하고, 칼로 잘게 잘랐다(이 조작은 시종 얼음 위에서 수행함). 페트리 접시 내의 해리용액을 흡수하고, 50㎛ 나일론 망으로 원심 분리관에 여과하였다. 1200 rpm으로 4℃에서 5 min 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 450㎕의 LB01, 25㎕의 예냉된 PI(1㎎/㎖)와 RNase A(1㎎/㎖)를 첨가하여 10 min 동안 암조건에서 염색하고, 기기로 검출하여 이배체 식물체를 선별해내었다.

도 4A는 F1 세대 식물체 춘우(春優) 84의 세포 배수성 검출 결과를 나타낸다. 그리고 도 4B는 잡종 강세 고정 식물체의 세포 배수성 검출 결과를 나타낸다.

2) 전장 유전체 염기서열 분석

두 개 친본 춘강(春江)16A와 C84, 춘우(春優) 84 및 배수성이 고정된 자손 제1대(무작위로 4포기 선택함) 식물체의 잎을 선택하고, DNA를 추출하여 전장 유전체 염기서열 분석을 진행하였다. 전장 유전체 염기서열 분석 결과에 따르면(도 5), 춘강(春江)16A와 C84 사이에는 많은 서로 다른 동형접합 유전자형이 존재하며, 교잡종 춘우(春優) 84는 이들 부위에서의 유전자형이 모두 춘강(春江) 16A도 있고 C84 유전자형도 있는 이형접합 상태를 나타내고, 검출된 4포기 식물체의 유전자형은 춘우(春優) 84와 일치하며, 모두 이형접합 상태인 것으로, 유전자형이 잡종 모세포와 완전히 일치하다는 것을 분자생물학적으로 증명하였다.

실시예 2

1. 본 실시예에서는 유지계 춘강(春江) 16B와 인디카 자포니카 중간형 광친화성 회복계 C84를 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 유전적 형질전환 배경 물질은 친본 종자를 이용하여 유도 획득한 캘러스이다.

2. 다유전자 넉아웃 벡터의 구축

주요 절차는 아래와 같다.

1) 단일 목표 SK-gRNA의 구축:

OSD1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 1): CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG

PAIR1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 2): AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG

REC8 유전자 넉아웃 부위(서열번호 3): CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG

MTL 유전자 넉아웃 부위(서열번호 4):GGTCAACGTCGAGACCGGCAGG

4) 복수의 gRNA의 연쇄 및 최종 바이너리 발현 벡터의 구축:

3. 형질전환 식물체의 획득

다유전자가 넉아웃된 바이너리 발현 벡터 pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL을 전기충격법에 의해 아그로박테리움(AgroBacteriumtumefaciens) 라인 EHA105에 삽입하고, 아그로박테리움 매개 형질전환기법을 이용하여 상기 바이너리 발현 벡터를 춘강(春江) 16B와 C84의 캘러스에 삽입하였다. 형질전환의 구체적인 방법은, 종자의 배아를 멸균한 후, 캘러스를 유도하는 배지에 접종하는 것이다. 1주 동안 배양한 후, 생장이 왕성하고 색갈이 연한 노란색이며 비교적 성긴 캘러스를 선택하여 형질전환의 수용체로 사용하였다. pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL 플라스미드를 함유한 EHA105 균주를 이용하여 벼 캘러스를 감염시키고, 암조건 25℃에서 3일 동안 배양한 후, 50 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유한 선택 배지에서 저항성 캘러스와 형질전환 식물체를 선별하였다. 히그로마이신 선택 배지에서 정상적으로 생장한 형질전환 식물체를 선택하였다.

4. 네 개 유전자가 모두 이형접합 돌연변이인 춘강(春江) 16B와 C84 물질을 염기서열 분석하여 감별한 다음 교잡을 진행하고, 후대에서 네 개 유전자가 모두 돌연변이된 교잡 식물체를 선별해내었다.

OSD1-F(서열번호 5): atctccaggatgcctgaagtgag

OSD1-R(서열번호 6): cctagactgctactcttgctagtgat

PAIR1-F(서열번호 7): ctgtacctgtgcatctaattacag

PAIR1-R(서열번호 8): ccccatcttatgtactgagcttgccag

REC8-F(서열번호 9): gcgacgcttcactcgaagatca

REC8-R(서열번호 10): cgccatgcctcgttgatctcaa

MTL-F(서열번호 11): acagtgactagtgacaaacgatcg

MTL-R(서열번호 12): gatcgcgtcagcatgatgcgtgtac

얻어진 PCR 산물을 염기서열 분석회사에 보내어, 각각 OSD1-F, PAIR1-F, REC8-F, MTL-F를 염기서열 분석 프라이머로 사용하여 염기서열을 분석하였다. 얻은 결과를 야생형 서열과 비교하면 돌연변이 정보를 직접 획득할 수 있다.

이형접합 돌연변이인 춘강(春江)16B와 C84 물질을 선별해낸 다음, 서로 교잡시켜 F1 세대에서 이중대립인자성 돌연변이된 교잡 식물체를 선별하였다.

5. 교잡 식물체의 종자를 받아서 자손 제1대에서 배수성과 유전자형이 고정된 식물체를 감별하였다.

1) 감별해 얻은 3중 돌연변이체 식물의 자손 제1대 식물체에서 유세포 분석을 이용하여 세포 배수성의 선별을 진행하고, 세포 배수성이 모체 식물체와 일치한 식물체를 선별하여 얻었다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

2) 전장 유전체 염기서열 분석

두 개 친본 춘강(春江)16B와 C84, 춘우(春優) 84 및 배수성이 고정된 자손 제1대(무작위로 2포기 선택함) 식물체의 잎을 선택하고, DNA를 추출하여 전장 유전체 염기서열 분석을 진행하였다. 전장 유전체 염기서열 분석 결과에 따르면, 춘강(春江)16B와 C84 사이에는 많은 서로 다른 동형접합 유전자형이 존재하며, 교잡종 춘우(春優) 84는 이들 부위에서의 유전자형이 모두 춘강(春江) 16B도 있고 C84 유전자형도 있는 이형접합 상태를 나타내고, 검출된 2포기 식물체의 유전자형은 춘우(春優) 84와 일치하며, 모두 이형접합 상태인 것으로, 유전자형이 잡종 모세포와 완전히 일치하다는 것을 분자생물학적으로 증명하였다.

실시예 3

1. 본 실시예에서 사용된 F₁ 교잡종은 심의를 거친 상품화 교잡벼 품종인 춘우(春優) 84이다. 춘우(春優) 84는 불임계 춘강(春江) 16A와 인디카 자포니카 중간형 광친화성 회복계 C84를 짝을 지어 육성한 인디카-자포니카 교잡벼의 새로운 조합이다. 상기 교잡벼는 수확 잠재력이 크고, 종자 생산량이 높으며, 종합적인 농예 형질이 우수하고, 도열병 저항성이 훌륭하며, 적응성이 넓은 장점을 가지고 있다. 본 실시예에서 사용한 유전적 형질전환 배경 물질은 교잡벼 F₁ 종자를 이용하여 유도 획득한 캘러스이며, 유성 번식 단계를 거치지 않았기에 형질전환 후 획득한 형질전환 T₀ 세대 물질은 유전 배경 상 교잡벼 F₁ 식물체와 일치하다.

2. 다유전자 넉아웃 벡터의 구축

주요 절차는 아래와 같다.

1) 단일 목표 SK-gRNA의 구축:

이하 세 개 부위를 선택하여 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템이 REC8, OSD1 및 PAIR1을 넉아웃하는 부위(밑줄로 표시된 PAM 서열)로 함:

OSD1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 1): CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG

PAIR1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 2): AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG

REC8 유전자 넉아웃 부위(서열번호 3): CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG

2) 세 개 gRNA의 연쇄 및 최종 바이너리 발현 벡터의 구축:

BglII와 BamHI, NheI과 XbaI, SalI과 XhoI이 절단 후 같은 점착성 말단을 갖는 제한효소(isocaudomer)인 특성을 이용하여 gRNA의 중합을 진행하였다. 마지막에 중합된 gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 단편을 KpnI과 BglII에 의해 제한효소 절단하고 단편을 회수하여, Cas9 단백질을 발현하는 바이너리 벡터 pC1300-Cas9(KpnI과 BamHI 부위 사이)에 연결시키고, 최종적으로 REC8, OSD1 및 PAIR1 세 개 유전자를 동시에 넉아웃할 수 있는 다유전자 넉아웃 벡터 pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1을 획득하여 형질전환에 의해 벼 다중 돌연변이체를 제조하는데 사용하였다.

3. 형질전환 식물체의 획득

다유전자가 넉아웃된 바이너리 발현 벡터 pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA를 전기충격법에 의해 아그로박테리움(AgroBacteriumtumefaciens) 라인 EHA105에 삽입하고, 아그로박테리움 매개 형질전환기법을 이용하여 상기 바이너리 발현 벡터를 춘우(春優) 84의 캘러스에 삽입하였다. 형질전환의 구체적인 방법은, 교잡벼 춘우(春優) 84 종자의 배아를 멸균한 후, 캘러스를 유도하는 배지에 접종하는 것이다. 1주 동안 배양한 후, 생장이 왕성하고 색갈이 연한 노란색이며 비교적 성긴 캘러스를 선택하여 형질전환의 수용체로 사용하였다. pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 플라스미드를 함유한 EHA105 균주를 이용하여 벼 캘러스를 감염시키고, 암조건 25℃에서 3일 동안 배양한 후, 50 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유한 선택 배지에서 저항성 캘러스와 형질전환 식물체를 선별하였다. 히그로마이신 선택 배지에서 정상적으로 생장한 형질전환 식물체를 선택하였다.

4. 염기서열 분석에 의한 3중 돌연변이체 감별

OSD1-F(서열번호 5): atctccaggatgcctgaagtgag

OSD1-R(서열번호 6): cctagactgctactcttgctagtgat

PAIR1-F(서열번호 7): ctgtacctgtgcatctaattacag

PAIR1-R(서열번호 8): ccccatcttatgtactgagcttgccag

REC8-F(서열번호 9): gcgacgcttcactcgaagatca

REC8-R(서열번호 10): cgccatgcctcgttgatctcaa

얻어진 PCR 산물을 염기서열 분석회사에 보내어, 각각 OSD1-F, PAIR1-F, REC8-F를 염기서열 분석 프라이머로 사용하여 염기서열을 분석하였다. 얻은 결과를 야생형 서열과 비교하였다. 염기서열 분석 결과 이중 피크인 경우, 축퇴 코돈 전략 분석(http://dsdecode.scgene.com/ 피크 그래프 분석 진행)으로 직접 돌연변이 정보를 획득한다.

이 중에서, 이 세 개 부위는 모두 이중대립인자성 돌연변이된 돌연변이체로서, 체세포와 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 생성할 수 있는 식물체이다.

5. 3중 돌연변이체를 모본으로 하고, 다른 반수체 유도계 식물체 꽃가루를 주어서, 암배우자가 종자로 발달하도록 유도하여, 잡종 강세를 유지하는 교잡종을 대량 얻을 수 있다.

6. 자손 제1대에서 배수성과 유전자형이 고정된 식물체를 감별하였다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

2) 전장 유전체 염기서열 분석

두 개 친본 춘강(春江)16A와 C84, 춘우(春優) 84 및 배수성이 고정된 자손 제1대(무작위로 4포기 선택함) 식물체의 잎을 선택하고, DNA를 추출하여 전장 유전체 염기서열 분석을 진행하였다. 전장 유전체 염기서열 분석 결과에 따르면, 춘강(春江)16A와 C84 사이에는 많은 서로 다른 동형접합 유전자형이 존재하며, 교잡종 춘우(春優) 84는 이들 부위에서의 유전자형이 모두 춘강(春江) 16A도 있고 C84 유전자형도 있는 이형접합 상태를 나타내고, 검출된 4주 식물체의 유전자형은 춘우(春優) 84와 일치하며, 모두 이형접합 상태인 것으로, 유전자형이 잡종 모세포와 완전히 일치하다는 것을 분자생물학적으로 증명하였다.

실시예 4

2. 다유전자 넉아웃 벡터의 구축

주요 절차는 아래와 같다.

1) 단일 목표 SK-gRNA의 구축:

OSD1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 1): CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG

PAIR1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 2): AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG

REC8 유전자 넉아웃 부위(서열번호 3): CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG

2) 세 개 gRNA의 연쇄 및 최종 바이너리 발현 벡터의 구축:

3. 형질전환 식물체의 획득

다유전자를 넉아웃시킨 바이너리 발현 벡터 pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL을 전기충격법에 의해 아그로박테리움(AgroBacteriumtumefaciens) 라인 EHA105에 삽입하고, 아그로박테리움 매개 형질전환기법을 이용하여 상기 바이너리 발현 벡터를 춘우(春優) 84의 캘러스에 삽입하였다. 형질전환의 구체적인 방법은, 교잡벼 춘우(春優) 84 종자의 배아를 멸균한 후, 캘러스를 유도하는 배지에 접종하는 것이다. 1주 동안 배양한 후, 생장이 왕성하고 색갈이 연한 노란색이며 비교적 성긴 캘러스를 선택하여 형질전환의 수용체로 사용하였다. pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 플라스미드를 함유한 EHA105 균주를 이용하여 벼 캘러스를 감염시키고, 암조건 25℃에서 3일 동안 배양한 후, 50 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유한 선택 배지에서 저항성 캘러스와 형질전환 식물체를 선별하였다. 히그로마이신 선택 배지에서 정상적으로 생장한 형질전환 식물체를 선택하였다.

4. 염기서열 분석에 의한 3중 돌연변이체 감별

OSD1-F(서열번호 5): atctccaggatgcctgaagtgag

OSD1-R(서열번호 6): cctagactgctactcttgctagtgat

PAIR1-F(서열번호 7): ctgtacctgtgcatctaattacag

PAIR1-R(서열번호 8): ccccatcttatgtactgagcttgccag

REC8-F(서열번호 9): gcgacgcttcactcgaagatca

REC8-R(서열번호 10): cgccatgcctcgttgatctcaa

5. 3중 돌연변이체가 일정한 단계로 발달한 후, 각각 무균 조작에 의해 꽃밥 또는 꽃가루를 채취하여 인공으로 배치한 꽃밥 배지에 접종하고, 캘러스 형성을 유도하여 조직 배양을 통해 식물체를 얻었다.

6. 조직 배양한 식물체에서 배수성과 유전자형이 고정된 식물체를 감별하였다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

2) 전장 유전체 염기서열 분석

두 개 친본 춘강(春江)16A와 C84, 춘우(春優) 84 및 배수성이 고정된 자손 제1대(무작위로 4주 선택함) 식물체의 잎을 선택하고, DNA를 추출하여 전장 유전체 염기서열 분석을 진행하였다. 전장 유전체 염기서열 분석 결과에 따르면, 춘강(春江)16A와 C84 사이에는 많은 서로 다른 동형접합 유전자형이 존재하며, 교잡종 춘우(春優) 84는 이들 부위에서의 유전자형이 모두 춘강(春江) 16A도 있고 C84 유전자형도 있는 이형접합 상태를 나타내고, 검출된 4주 식물체의 유전자형은 춘우(春優) 84와 일치하며, 모두 이형접합 상태인 것으로, 유전자형이 잡종 모세포와 완전히 일치하다는 것을 분자생물학적으로 증명하였다.

실시예 5

2. 다유전자 넉아웃 벡터의 구축

주요 절차는 아래와 같다.

1) 단일 목표 SK-gRNA의 구축:

OSD1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 1): CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG

PAIR1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 2): AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG

REC8 유전자 넉아웃 부위(서열번호 3): CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG

2) 세 개 gRNA의 연쇄 및 최종 바이너리 발현 벡터의 구축:

3. 형질전환 식물체의 획득

4. 염기서열 분석에 의한 3중 돌연변이체 감별

OSD1-F(서열번호 5): atctccaggatgcctgaagtgag

OSD1-R(서열번호 6): cctagactgctactcttgctagtgat

PAIR1-F(서열번호 7): ctgtacctgtgcatctaattacag

PAIR1-R(서열번호 8): ccccatcttatgtactgagcttgccag

REC8-F(서열번호 9): gcgacgcttcactcgaagatca

REC8-R(서열번호 10): cgccatgcctcgttgatctcaa

5. 화학적으로 처녀생식 유도

REC8, OSD1, PAIR1 세 개 유전자가 넉아웃된 벼 물질을 채취하여, 벼 꽃이 피기 전에 일반적인 교잡기술에 의해 제웅한 다음, 벼 이삭을 처리액 5~50 mg/L 말레산하이드라지드 또는 2~20 mg/L 6-벤질아미노푸린에 2-3min 동안 담그고, 꽃가루가 들어가는 것을 막기 위해 봉투를 단단히 씌웠다. 처리 20일 후, 미숙배 또는 낟알을 채취하고 배양하여, 처녀생식한 식물체를 획득하였다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

2) 전장 유전체 염기서열 분석

실시예 6

1. 돌연변이체 돌연변이 유발 및 선별

대두 품종 중황(中黃) 39에서, EMS 돌연변이 유발에 의해 후대에서 고처리량 시퀀싱 기술을 통해 REC8과 OSD1이 각각 이형접합 돌연변이인 식물체를 선별하여 얻고, 이형접합 식물체 간 교잡과 후대 선별을 통해 REC8과 OSD1이 모두 이형접합 돌연변이인 식물체를 얻었다. 대두 품종 제황(齊黃) 34에서, EMS 돌연변이 유발에 의해, 후대에서 고처리량 시퀀싱 기술을 통해 SPO11-1과 CENH3 유전자가 각각 이형접합 돌연변이인 식물체를 선별하여 얻고, 이형접합 식물체 간 교잡과 후대 선별을 통해, SPO11-1과 CENH3이 모두 이형접합 돌연변이인 식물체를 얻었다. REC8과 OSD1이 이형접합 돌연변이인 식물체와 SPO11-1과 CENH3이 모두 이형접합 돌연변이인 식물체를 교잡하여, 후대에서 네 개 유전자가 모두 이형접합 돌연변이인 식물체를 선별하여 얻었다.

2. 형질전환 벡터 구축

난세포가 특이적으로 발현하는 EC1.2 유전자 프로모터 구동 야생형 CENH3이 발현하는 바이너리 벡터를 구축하여, 상기 벡터를 4개 유전자가 모두 이형접합 돌연변이인 식물체에 형질전환하였다. 식물체의 자가 교배 후대에서 REC8, OSD1, SPO11-1과 CENH3 유전자가 모두 동형접합 돌연변이이고 EC1.2::CENH3 형질전환 성분을 가진 단일 포기를 선별하여 얻고, 상기 식물체 상의 자가 교배 종자를 수득하였다.

3. 자손 제1대에서 배수성과 유전자형이 고정된 식물체를 감별하였다.

1) 자손 제1대에서, 유세포 분석을 이용하여 세포 배수성의 선별을 진행하고, 세포 배수성이 모체 식물체와 일치한 식물체를 선별하여 얻었다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

2) 유전자형 검출

배수성이 고정된 자손 제1대(무작위로 4포기 선택함), 그리고 그 전 세대 식물체의 잎을 선택하여 DNA를 추출하였다. 그 전 세대 교잡 물질에서 무작위로 16개의 이형접합 상태의 부위를 선별하여 검출 프라이머를 설계하였다. 자손 제1대 식물체의 유전자형을 검출한 결과, 상기 4포기 식물체가 16개 부위의 유전자형이 그 전 세대와 완전히 일치하다는 것을 발견하였다. 즉 모두 이형접합 상태로서, 이형접합 유전자형이 재조합과 분리가 발생하지 않았음을 분자생물학적으로 증명하였다.

실시예 7

1. 본 실시예에서 사용한 F₁ 교잡종은 옥수수 교잡종 가화(佳禾) 158이고, LD140×LD975에 의해 짝을 지었다.

2. 다유전자 넉아웃 벡터의 구축

주요 절차는 아래와 같다.

1) 단일 목표 SK-gRNA의 구축:

ZmOSD1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 30):TCTGCCTGTACTGGAGTTATTGG

ZmPAIR1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 31):GGATTGCTGCGACAGCGGCTGGG

ZmREC8 유전자 넉아웃 부위(서열번호 32):GGAAGTCCCACGAGTAATTATGG

ZmMTL 유전자 넉아웃 부위(서열번호 33):GGAAGGCGAGGATGGTTCCCGGG

2) 복수의 gRNA의 연쇄 및 최종 바이너리 발현 벡터의 구축:

BglII와 BamHI, NheI과 XbaI, SalI과 XhoI이 절단 후 같은 점착성 말단을 갖는 제한효소(isocaudomer)인 특성을 이용하여 gRNA의 중합을 진행하였다. SK-gRNA ZmOSD1을 KpnI과 XhoI에 의해 제한효소 절단하여 벡터로 삼고, SK-gRNA ZmPAIR1을 SalI과 XbaI에 의해 제한효소 절단하여 ZmPAIR1 sgRNA 단편을 제공하고, SK-gRNA ZmREC8을 NheI과 BamHI에 의해 제한효소 절단하여 ZmREC8 sgRNA 단편을 제공하고, SK-gRNA ZmMTL을 BglII와 KpnI에 의해 제한효소 절단하여 ZmMTL sgRNA 단편을 제공하여, 4개 이내 gRNA를 원스텝으로 빠르게 중합시키고, 마지막에 중합된 gRNA ZmOSD1-gRNA ZmREC8-gRNA ZmPAIR1-gRNA ZmMTL 단편을 KpnI과 BglII에 의해 제한효소 절단하고 단편을 회수하여, Cas9 단백질을 발현하는 바이너리 벡터 pC1300-Cas9(KpnI과 BamHI 부위 사이)에 연결시키고, 최종적으로 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL 네 개 유전자를 동시에 넉아웃할 수 있는 다유전자 넉아웃 벡터 pC1300-Cas9-gRNA ZmOSD1-gRNA ZmREC8-gRNA ZmPAIR1-gRNA ZmMTL을 획득하여, 형질전환에 의해 옥수수 다중 돌연변이체를 제조하는데 사용하였다.

3. 형질전환 식물체의 획득

먼저 단계에서 획득한 옥수수 다유전자 넉아웃 벡터를 전기충격법에 의해 아그로박테리움 균주 LBA4404에 삽입하고, 아그로박테리움 매개 형질전환기법을 이용하여 상기 바이너리 발현 벡터를 옥수수 교잡종 가화(佳禾) 168 캘러스에 삽입하였다. 옥수수를 수분한 후 9-12일 동안 봉투를 씌우고, 암이삭을 채취하여 포엽을 벗기고, 매 한층의 포엽을 벗길 때마다 75%의 알코올을 뿌려 표면을 소독하며, 칼로 무균 작업대에서 1.0-1.2 mm 크기의 미숙배를 골라서 고침투액에 넣어 준비하며, 침투액에 담그는 시간은 1시간을 초과하지 않았다. 아그로박테리움을 OD600값 0.8까지 배양했을 때, 원심분리하여 균체를 수집하고, 1 ㏖/ℓ 현탁액으로 재현탁한 후 아세토시린곤을 첨가하여 최종 농도가 200μ㏖/ℓ가 되도록 하고, 상기 용균액으로 미숙배를 5min 동안 감염시킨 다음, 공동배지에 옮기고 25℃ 암조건에서 7일 동안 배양하고, 미숙배를 15 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유한 선택 배지 및 후반의 재생 배지에 옮겨 저항성 캘러스와 형질전환 식물체를 선별하였다.

4. 염기서열 분석에 의한 4중 돌연변이체 감별

CTAB법으로 단일 포기에서 형질전환 옥수수 유전체 DNA를 추출하고, Hi-Tom으로 목표 유전자 돌연변이 양상을 감별하였다(자세한 사항은 CN201710504178.3 참조).

5. 자손 제1대에서 배수성과 유전자형이 고정된 옥수수 식물체를 감별하였다.

1) 감별해 얻은 4중 돌연변이체 옥수수의 자손 제1대 식물체에서 유세포 분석을 이용하여 세포 배수성의 선별을 진행하고, 세포 배수성이 모체 식물체와 일치한 식물체를 선별하여 얻었다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

2) 전장 유전체 염기서열 분석

두 개 친본 LD140와 LD975, 가화(佳禾) 158 및 배수성이 고정된 자손 제1대 옥수수 식물체의 잎을 선택하고, DNA를 추출하여 전장 유전체 염기서열 분석을 진행하였다. 검출된 자손 제1대 옥수수 식물체의 유전자형은 가화(佳禾) 158과 일치하며, 모두 이형접합 상태인 것으로, 유전자형이 잡종 모세포와 완전히 일치하다는 것을 분자생물학적으로 증명하였다.

실시예 8

1. 본 실시예에서 사용한 F₁ 교잡종은 토마토 교잡종 앨리사(艾麗莎)로서, 그 모본은 저온 저항성 근교계 “S이(以) 2-4(Syi2-4)”이고, 부본은 양질 내병성 근교계 “S28"이다.

2. 다유전자 넉아웃 벡터의 구축

주요 절차는 아래와 같다.

1) 단일 목표 SK-gRNA의 구축:

이하 네 개 부위를 선택하여 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템이 토마토 REC8, OSD1, SPO11 및 MTL을 넉아웃하는 부위(밑줄로 표시된 PAM 서열)로 함:

SlOSD1 유전자 넉아웃 부위(서열번호 34): CAGAAGCAGGGAGAATGGCAGG

SlSPO11 유전자 넉아웃 부위(서열번호 35): TGAGGATCTCGCTCGAGGTAGG

SlREC8 유전자 넉아웃 부위(서열번호 36): GCACAGGAGGAACCTGCTAAGG

SlMTL 유전자 넉아웃 부위(서열번호 37): TGATTGCCGGAACGAGCACCGG

2) 복수의 gRNA의 연쇄 및 최종 바이너리 발현 벡터의 구축:

BglII와 BamHI, NheI와 XbaI, SalI과 XhoI이 절단 후 같은 점착성 말단을 갖는 제한효소(isocaudomer)인 특성을 이용하여 gRNA의 중합을 진행하였다. SK-gRNA SlOSD1을 KpnI와 XhoI로 제한효소 절단하여 벡터로 삼고, SK-gRNA SlSPO11을 SalI과 XbaI로 제한효소 절단하여 SlSPO11 sgRNA 단편을 제공하고, SK-gRNA SlREC8을 NheI과 BamHI로 제한효소 절단하여 SlREC8 sgRNA 단편을 제공하고, SK-gRNA SlMTL을 BglII와 KpnI로 제한효소 절단하여 SlMTL sgRNA 단편을 제공하여, 4개 이내 gRNA를 원스텝으로 빠르게 중합시키고, 마지막에 중합된 gRNA SlOSD1-gRNA SlREC8-gRNA SlPAIR1-gRNA SlMTL단편을 KpnI과 BglII로 제한효소 절단하고 단편을 회수하여, Cas9 단백질을 발현하는 바이너리 벡터 pC1300-Cas9(KpnI과 BamHI 부위 사이)에 연결시키고, 최종적으로 토마토 REC8, OSD1, SPO11 및 MTL 네 개 유전자를 동시에 넉아웃할 수 있는 다유전자 넉아웃 벡터 pC1300-Cas9-gRNA SlOSD1-gRNA SlREC8-gRNA SlSPO11-gRNA SlMTL을 획득하여, 형질전환에 의해 토마토 다중 돌연변이체를 제조하는데 사용하였다.

3. 형질전환 식물체의 획득

엽편법을 통해 먼저 단계에서 획득한 토마토 다유전자 넉아웃 벡터를 전기충격법에 의해 아그로박테리움 균주 EHA105에 삽입하고, 아그로박테리움 매개 형질전환기법을 이용하여 상기 바이너리 발현 벡터를 토마토 교잡종 앨리사(艾麗莎) 캘러스에 삽입하였다.

토마토 종자는 무균 처리하여 1/2 MS 배지에 뿌리고, 암배양 2-3일하여 발아한 후, 광배양하여 10-12일 후, 새싹이 자엽은 충분히 펴졌으나 진엽이 생성되지 않았을 때, 자엽을 외식체로 선택하여, 자엽의 양단을 절제하고, 중간 부분을 가로로 둘로 나누어 자른 작은 단편이 바로 엽편이다. 엽편을 전배양 배지에 접종하고, 엽편의 정면이 위로 향하게 2일 동안 전배양했다. 전배양한 자엽 엽편을 준비한 아그로박테리움 용균액에 담그고, 5분 동안 충분히 침윤시키고, 무균 여과지로 엽편을 적당히 흡수 건조시키고, 엽편 뒷면이 위로 향하게 48-72시간 동안 28℃에서 암배양하였다. 아그로박테리움과 공동 배양한 엽편을 탈균 배지에 옮기고 광배양하였다. 5일 후 엽편을 선별 배지에 옮기고, 14일마다 한번씩 옮겼다. 내성 싹이 2cm 좌우로 자랐을 때, 외식체로부터 잘라내어, 발근 배지에 옮기고, 근계가 발달된 후에 토양속에 옮겨 심었다.

4. 염기서열 분석에 의한 4중 돌연변이체 감별

CTAB법으로 단일 포기에서 형질전환 토마토 유전체 DNA를 추출하고, Hi-Tom으로 목표 유전자 돌연변이 양상을 감별하였다(자세한 사항은 CN201710504178.3 참조).

5. 자손 제1대에서 배수성과 유전자형이 고정된 토마토 식물체를 감별하였다.

1) 감별해 얻은 4중 돌연변이체 토마토의 자손 제1대 식물체에서 유세포 분석을 이용하여 세포 배수성의 선별을 진행하고, 세포 배수성이 모체 식물체와 일치한 식물체를 선별하여 얻었다.

구체적인 방법은 아래와 같다.

2) 전장 유전체 염기서열 분석

두 개 친본 “S이(以) 2-4(Syi2-4)”와 “S28”, 토마토 교잡종 앨리사(艾麗莎) 및 배수성이 고정된 자손 제1대 토마토 식물체의 잎을 선택하고, DNA를 추출하여 전장 유전체 염기서열 분석을 진행한다. 검출된 자손 제1대 토마토 식물체의 유전자형은 앨리사(艾麗莎)와 일치하며, 모두 이형접합 상태인 것으로, 유전자형이 잡종 모세포와 완전히 일치하다는 것을 분자생물학적으로 증명하였다.

한편, 본 실시예에서 사용된 모든 벡터와 시약은 본 실시예의 시약 키트에 포함된다.

상술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과한 것으로, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 본 발명은 다양한 변경과 변화가 있을 수 있다. 본 발명의 사상과 원칙 내에서 진행되는 어떠한 수정, 균등치환, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위에 포함되어야 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> CHINA NATIONAL RICE RESEARCH INSTITUTE <120> METHOD USING PLANT HYBRID VIGOR <130> WO/2019/196576 <140> PCT/CN2019/077154 <141> 2019-03-06 <150> CN 201810325528.4 <151> 2018-04-12 <150> CN 201811205889.1 <151> 2018-10-16 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> OSD1 Gene Knockout site <220> <221> primer_bind <222> (20)..(22) <223> PAM Sequence <400> 1 ctgccgccga cgagcaacaa gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> PAIR1 Gene Knockout site <220> <221> primer_bind <222> (20)..(22) <223> PAM Sequence <400> 2 aagcaaccca gtgcaccgct gg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> REC8 Gene Knockout site <220> <221> primer_bind <222> (20)..(22) <223> PAM Sequence <400> 3 cccatggcac taaggctctc cg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<222> (1)..(22) <223> Primer REC8-R <400> 10 cgccatgcct cgttgatctc aa 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <223> Primer MTL-F <400> 11 acagtgacta gtgacaaacg atcg 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Primer MTL-R <400> 12 gatcgcgtca gcatgatgcg tgtac 25 <210> 13 <211> 492 <212> PRT <213> Plant <400> 13 Met Lys Leu Lys Met Asn Lys Ala Cys Asp Ile Ala Ser Ile Ser Val 1 5 10 15 Leu Pro Pro Arg Arg Thr Gly Gly Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly 20 25 30 Ser Val Ala Val Ala Val Ala Ser Gln Pro Arg Ser Gln Pro Leu Ser 35 40 45 Gln Ser Gln Gln Ser Phe Ser Gln Gly Ala Ser Ala Ser Leu Leu His 50 55 60 Ser Gln Ser Gln Phe Ser Gln Val Ser Leu Asp Asp Asn Leu Leu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Pro Ser Pro Thr Arg Asp Gln Arg Phe Gly Leu His Asp Asp 85 90 95 Ser Ser Lys Arg Met Ser Ser Leu Pro Ala Ser Ser Ala Ser Cys Ala 100 105 110 Arg Glu Glu Ser Gln Leu Gln Leu Ala Lys Leu Pro Ser Asn Pro Val 115 120 125 His Arg Trp Asn Pro Ser Ile Ala Asp Thr Arg Ser Gly Gln Val Thr 130 135 140 Asn Glu Asp Val Glu Arg Lys Phe Gln His Leu Ala Ser Ser Val His 145 150 155 160 Lys Met Gly Met Val Val Asp Ser Val Gln Ser Asp Val Met Gln Leu 165 170 175 Asn Arg Ala Met Lys Glu Ala Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ile Arg Gln 180 185 190 Lys Ile Ala Val Leu Glu Ser Ser Leu Gln Gln Ile Leu Lys Gly Gln 195 200 205 Asp Asp Leu Lys Ala Leu Phe Gly Ser Ser Thr Lys His Asn Pro Asp 210 215 220 Gln Thr Ser Val Leu Asn Ser Leu Gly Ser Lys Leu Asn Glu Ile Ser 225 230 235 240 Ser Thr Leu Ala Thr Leu Gln Thr Gln Met Gln Ala Arg Gln Leu Gln 245 250 255 Gly Asp Gln Thr Thr Val Leu Asn Ser Asn Ala Ser Lys Ser Asn Glu 260 265 270 Ile Ser Ser Thr Leu Ala Thr Leu Gln Thr Gln Met Gln Ala Asp Ile 275 280 285 Arg Gln Leu Arg Cys Asp Val Phe Arg Val Phe Thr Lys Glu Met Glu 290 295 300 Gly Val Val Arg Ala Ile Arg Ser Val Asn Ser Arg Pro Ala Ala Met 305 310 315 320 Gln Met Met Ala Asp Gln Ser Tyr Gln Val Pro Val Ser Asn Gly Trp 325 330 335 Thr Gln Ile Asn Gln Thr Pro Val Ala Ala Gly Arg Ser Pro Met Asn 340 345 350 Arg Ala Pro Val Ala Ala Gly Arg Ser Arg Met Asn Gln Leu Pro Glu 355 360 365 Thr Lys Val Leu Ser Ala His Leu Val Tyr Pro Ala Lys Val Thr Asp 370 375 380 Leu Lys Pro Lys Val Glu Gln Gly Lys Val Lys Ala Ala Pro Gln Lys 385 390 395 400 Pro Phe Ala Ser Ser Tyr Tyr Arg Val Ala Pro Lys Gln Glu Glu Val 405 410 415 Ala Ile Arg Lys Val Asn Ile Gln Val Pro Ala Lys Lys Ala Pro Val 420 425 430 Ser Ile Ile Ile Glu Ser Asp Asp Asp Ser Glu Gly Arg Ala Ser Cys 435 440 445 Val Ile Leu Lys Thr Glu Thr Gly Ser Lys Glu Trp Lys Val Thr Lys 450 455 460 Gln Gly Thr Glu Glu Gly Leu Glu Ile Leu Arg Arg Ala Arg Lys Arg 465 470 475 480 Arg Arg Arg Glu Met Gln Ser Ile Val Leu Ala Ser 485 490 <210> 14 <211> 609 <212> PRT <213> Plant <400> 14 Met Val Met Ala Gln Lys Thr Lys Glu Ala Glu Ile Thr Glu Gln Asp 1 5 10 15 Ser Leu Leu Leu Thr Arg Asn Leu Leu Arg Ile Ala Ile Tyr Asn Ile 20 25 30 Ser Tyr Ile Arg Gly Leu Phe Pro Glu Lys Tyr Phe Asn Asp Lys Ser 35 40 45 Val Pro Ala Leu Glu Met Lys Ile Lys Lys Leu Met Pro Met Asp Thr 50 55 60 Glu Ser Arg Arg Leu Ile Asp Trp Met Glu Lys Gly Val Tyr Asp Ala 65 70 75 80 Leu Gln Lys Lys Tyr Leu Lys Thr Leu Leu Phe Cys Ile Cys Glu Lys 85 90 95 Glu Glu Gly Pro Met Ile Glu Glu Tyr Ala Phe Ser Phe Ser Tyr Pro 100 105 110 Asn Thr Ser Gly Asp Glu Val Ala Met Asn Leu Ser Arg Thr Gly Ser 115 120 125 Lys Lys Asn Ser Ala Thr Phe Lys Ser Asn Ala Ala Glu Val Thr Pro 130 135 140 Asp Gln Met Arg Ser Ser Ala Cys Lys Met Ile Arg Thr Leu Val Ser 145 150 155 160 Leu Met Arg Thr Leu Asp Gln Met Pro Glu Glu Arg Thr Ile Leu Met 165 170 175 Lys Leu Leu Tyr Tyr Asp Asp Val Thr Pro Glu Asp Tyr Glu Pro Pro 180 185 190 Phe Phe Lys Cys Cys Ala Asp Asn Glu Ala Ile Asn Ile Trp Asn Lys 195 200 205 Asn Pro Leu Lys Met Glu Val Gly Asn Val Asn Ser Lys His Leu Val 210 215 220 Leu Ala Leu Lys Val Lys Ser Val Leu Asp Pro Cys Asp Asp Asn Asn 225 230 235 240 Val Asn Ser Glu Asp Asp Asn Met Ser Leu Asp Asn Glu Ser Asp Gln 245 250 255 Asp Asn Asp Phe Ser Asp Thr Glu Val Arg Pro Ser Glu Ala Glu Arg 260 265 270 Tyr Ile Val Ala Pro Asn Asp Gly Thr Cys Lys Gly Gln Asn Gly Thr 275 280 285 Ile Ser Glu Asp Asp Thr Gln Asp Pro Val His Glu Glu Glu Leu Thr 290 295 300 Ala Gln Val Arg Glu Trp Ile Cys Ser Arg Asp Thr Glu Ser Leu Glu 305 310 315 320 Val Ser Asp Val Leu Val Asn Phe Pro Asp Ile Ser Met Glu Met Val 325 330 335 Glu Asp Ile Met Glu Arg Leu Leu Lys Asp Gly Leu Leu Ser Arg Ala 340 345 350 Lys Lys Asp Ser Tyr Ser Val Asn Lys Ile Ala Asp Pro Thr Thr Pro 355 360 365 His Ile Lys Lys Glu Val Ile Met Gln Asn Val Ser Pro Thr Glu Gly 370 375 380 Thr Lys Asn Ser Asn Gly Asp Leu Met Tyr Met Lys Ala Leu Tyr His 385 390 395 400 Ala Leu Pro Met Asp Tyr Val Ser Val Gly Lys Leu His Gly Lys Leu 405 410 415 Asp Gly Glu Ala Ser Gln Asn Met Val Arg Lys Leu Ile Glu Lys Met 420 425 430 Val Gln Asp Gly Tyr Val Lys Asn Ser Ala Asn Arg Arg Leu Gly Lys 435 440 445 Ala Val Ile His Ser Glu Val Thr Asn Arg Lys Leu 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Ala Ala Ser Thr Ala Ala Phe Glu Lys Asn Leu Ser Gln Gly Thr 50 55 60 Asp Gly Arg Ser Arg Pro Pro Lys Met Asp Asn Ala Ser Leu Gln Val 65 70 75 80 Ser Pro Glu Ala Ala Asn His Gly Gly Ser Ala Lys Glu Val Pro Lys 85 90 95 Pro Val Pro Ala Lys Val Ser Val Ser Gln Pro Asp Asp Asn Ala Ile 100 105 110 Glu Gln Thr Gly Thr Phe Ser Phe Gly Thr Arg Arg Glu Gln Asp Ser 115 120 125 His Leu Asp Gln Leu Asp Arg Pro Pro Leu Val Ser Ser Gln Gly Lys 130 135 140 Arg Gln Val Glu Ser Ala Asp Lys Asn Lys Pro Asn Ser Glu Met Leu 145 150 155 160 Arg Met Lys Leu Trp Glu Ile Leu Gly Gly Thr Ser Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Ala Val Ala Ser Pro Asn Pro Glu Asp Ile Glu Thr Pro Cys Gln Pro 180 185 190 Lys Ser Gln Ile Ala Asn Gly Pro Ser Ser Gly Arg Gln Lys Val Phe 195 200 205 Thr Ser Pro Val Pro Tyr Asn Ile Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asn Ser 210 215 220 Gln Thr Ala Asn Lys Pro Ser Ser Asp Pro Ile Glu Ser Asp Ser Asp 225 230 235 240 Ser Pro Gln Val Val Glu Val Arg Pro Ile Thr Arg Ser Leu Gly Arg 245 250 255 Lys Lys Glu 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Claims

식물 잡종 강세를 유지하는 방법으로서,
유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 얻는 단계 S1; 및
유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주는 단계 S2를 포함하되, 여기에 관련된 단백질은 MTL 단백질인 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 유전자 돌연변이는 무작위 돌연변이 유발과 부위 특이적 돌연변이 유발을 포함하되, 상기 무작위 돌연변이 유발은 화학적 돌연변이 유발, 물리적 돌연변이 유발과 생물학적 돌연변이 유발을 포함하고, 상기 부위 특이적 돌연변이 유발은 유전자 편집 기술을 포함하되, 상기 유전자 편집 기술은 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, CRISPR/Cpf1 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술, 호밍 엔도뉴클레아제 유전자 편집 기술과 ZFN 유전자 편집 기술을 포함하며, 상기 유전자 공학 기술은 형질전환기법에 의해 유전자의 특이적 발현, 전좌 발현 또는 유전자 침묵을 유발하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 S1은 교잡종을 채취하고, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 상기 교잡종 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 S1은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 교잡종의 친본을 편집한 다음, 친본 간 교잡에 의해 교잡종을 얻어서 생식세포의 감수분열이 유사한 유사분열로 전환된 교잡종 배우자를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 S1은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질을 편집하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 단계를 포함하되, 상기 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하며,
상기 제1 단백질은 DNA 이중가닥 손상의 형성에 관여하는 단백질이고, 상기 제1 단백질은
서열번호 13으로 표시된 PAIR1 단백질, 상기 PAIR1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 14로 표시된 PAIR2 단백질, 상기 PAIR2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 15로 표시된 PAIR3 단백질, 상기 PAIR3 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR3 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 16으로 표시된 PRD1 단백질, 상기 PRD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PRD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 17로 표시된 PRD2 단백질, 상기 PRD2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PRD2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 18로 표시된 SPO11-1 단백질, 상기 SPO11-1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SPO11-1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 19로 표시된 SPO11-2 단백질, 상기 SPO11-2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SPO11-2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 20으로 표시된 SDS 단백질, 상기 SDS 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SDS 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 21로 표시된 CRC1 단백질, 상기 CRC1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 CRC1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 22로 표시된 P31^comet 단백질, 상기 P31^comet 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 P31^comet 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 23으로 표시된 MTOPVIB 단백질, 상기 MTOPVIB 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 MTOPVIB 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 24로 표시된 DFO 단백질, 상기 DFO 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 DFO 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,
상기 제2 단백질은 감수분열기 자매 염색체 간의 접착을 제어하는데 관여하고, 상기 제2 단백질은
서열번호 25로 표시된 REC8 단백질, 상기 REC8 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 REC8 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,
상기 제3 단백질은 감수분열의 제2차 분열에 관여하고, 상기 제3 단백질은
서열번호 26으로 표시된 OSD1 단백질, 상기 OSD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 OSD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 27로 표시된 TAM 단백질, 상기 TAM 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 TAM 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 28로 표시된 TDM1 단백질, 상기 TDM1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 TDM1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 S2는 유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 주어, 상기 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 S2는 다른 식물체의 유도 꽃가루를 주어서, 상기 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 S2는 물리적 자극, 생물학적 스트레스 또는 화학약제 처리에 의해, 상기 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 S2는 꽃밥 배양 또는 꽃가루 배양에 의해 상기 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 MTL 단백질은 서열번호 29로 표시된 MTL 단백질, 상기 MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 식물은 단자엽 식물과 쌍자엽 식물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 식물은 벼, 옥수수, 수수, 조, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 메밀, 율무, 사탕수수, 아스파라거스, 죽순, 부추, 참마, 대두, 감자, 완두, 녹두, 팥, 잠두, 동부콩, 강남콩, 강낭콩, 돌콩, 병아리콩, 카사바, 고구마, 유채, 목화, 사탕무, 가지, 땅콩, 찻잎, 박하, 커피, 참깨, 해바라기, 피마자, 들깨, 홍화, 토마토, 고추, 오이, 청경채, 상추, 시금치, 마늘, 양배추, 갓, 줄, 대파, 동과, 애호박, 수세미외, 배추, 무우, 양파, 수박, 포도, 당근, 콜리플라워, 호박, 담배, 목초, 코끼리풀, 수크령, 수단 그라스, 난초, 백합, 튤립, 개자리를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 잡종 강세를 보유하는, 식물 또는 종자.
제1항의 방법에 사용되는 식물이 잡종 강세를 유지하도록 하는 시약 키트에 있어서, 상기 시약 키트는 식물 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약, 그리고 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 하는 벡터 및/또는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시약 키트.
제14항에 있어서,
상기 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술에 의해 교잡종의 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 벡터 및/또는 시약으로서, 바람직하게는 무작위 돌연변이 유발 또는 부위 특이적 돌연변이 유발의 벡터 및/또는 시약인 것을 특징으로 하는, 시약 키트.
제15항에 있어서,
상기 무작위 돌연변이 유발은 화학적 돌연변이 유발, 물리적 돌연변이 유발과 생물학적 돌연변이 유발을 포함하고, 상기 부위 특이적 돌연변이 유발은 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술, CRISPR/Cpf1 유전자 편집 기술, TALEN 유전자 편집 기술, 호밍 엔도뉴클레아제 유전자 편집 기술과 ZFN 유전자 편집 기술을 포함하며, 상기 유전자 공학 기술은 형질전환기법에 의해 유전자의 특이적 발현, 전좌 발현 또는 유전자 침묵을 유발하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시약 키트.
제14항에 있어서,
상기 식물 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하도록 하는 벡터 및/또는 시약은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질을 편집하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 벡터 및/또는 시약이며, 상기 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하되,
상기 제1 단백질은 DNA 이중가닥 손상의 형성에 관여하는 단백질이고, 상기 제1 단백질은
서열번호 13으로 표시된 PAIR1 단백질, 상기 PAIR1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 14로 표시된 PAIR2 단백질, 상기 PAIR2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 15로 표시된 PAIR3 단백질, 상기 PAIR3 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR3 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 16으로 표시된 PRD1 단백질, 상기 PRD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PRD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 17로 표시된 PRD2 단백질, 상기 PRD2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PRD2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 18로 표시된 SPO11-1 단백질, 상기 SPO11-1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SPO11-1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 19로 표시된 SPO11-2 단백질, 상기 SPO11-2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SPO11-2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 20으로 표시된 SDS 단백질, 상기 SDS 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SDS 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 21로 표시된 CRC1 단백질, 상기 CRC1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 CRC1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 22로 표시된 P31^comet 단백질, 상기 P31^comet 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 P31^comet 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 23으로 표시된 MTOPVIB 단백질, 상기 MTOPVIB 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 MTOPVIB 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 24로 표시된 DFO 단백질, 상기 DFO 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 DFO 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,
상기 제2 단백질은 감수분열기 자매 염색체 간의 접착을 제어하는데 관여하고, 상기 제2 단백질은
서열번호 25로 표시된 REC8 단백질, 상기 REC8 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 REC8 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,
상기 제3 단백질은 감수분열의 제2차 분열에 관여하고, 상기 제3 단백질은
서열번호 26으로 표시된 OSD1 단백질, 상기 OSD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 OSD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 27로 표시된 TAM 단백질, 상기 TAM 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 TAM 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 28로 표시된 TDM1 단백질, 상기 TDM1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 TDM1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 시약 키트.
제14항에 있어서,
상기 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 하는 벡터 및/또는 시약은, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 MTL 단백질에 영향을 주어, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하는 벡터 및/또는 시약을 포함하되, 상기 MTL 단백질은 서열번호 29로 표시된 MTL 단백질, 상기 MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는, 시약 키트.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 시약 키트를 사용하여 생성된 식물에 있어서, 상기 식물의 생식세포의 감수분열은 유사한 유사분열로 전환됨으로써 교잡종과 유전자형 및 염색체 배수성이 일치한 배우자를 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는, 식물.
제19항에 있어서,
상기 식물의 배우자는 유도되어 식물체 또는 종자로 발달할 수 있는 것을 특징으로 하는, 식물.
제20항에 있어서,
상기 식물은 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술로 개조된 식물이고, 상기 식물에는 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술이 이용되어 식물에서 감수분열에 관여하는 단백질이 조절됨으로써 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하며, 유전자 돌연변이 또는 유전자 공학 기술이 이용되어 식물에서 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 제4 단백질에 영향을 줌으로써, 배우자가 종자 또는 식물체로 발달하도록 유도하되, 상기 단백질은 제1 단백질, 제2 단백질과 제3 단백질을 포함하며,
상기 제1 단백질은 DNA 이중가닥 손상의 형성에 관여하는 단백질이고, 상기 제1 단백질은
서열번호 13으로 표시된 PAIR1 단백질, 상기 PAIR1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 14로 표시된 PAIR2 단백질, 상기 PAIR2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 15로 표시된 PAIR3 단백질, 상기 PAIR3 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PAIR3 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 16으로 표시된 PRD1 단백질, 상기 PRD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PRD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 17로 표시된 PRD2 단백질, 상기 PRD2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 PRD2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 18로 표시된 SPO11-1 단백질, 상기 SPO11-1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SPO11-1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 19로 표시된 SPO11-2 단백질, 상기 SPO11-2 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SPO11-2 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 20으로 표시된 SDS 단백질, 상기 SDS 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 SDS 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 21로 표시된 CRC1 단백질, 상기 CRC1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 CRC1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 22로 표시된 P31comet 단백질, 상기 P31comet 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 P31comet단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 23으로 표시된 MTOPVIB 단백질, 상기 MTOPVIB 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 MTOPVIB 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 24로 표시된 DFO 단백질, 상기 DFO 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 DFO 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,
상기 제2 단백질은 감수분열기 자매 염색체 간의 접착을 조절하는데 관여하고, 상기 제2 단백질은
서열번호 25로 표시된 REC8 단백질, 상기 REC8 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 REC8 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,
상기 제3 단백질은 감수분열의 제2차 분열에 관여하고, 상기 제3 단백질은
서열번호 26으로 표시된 OSD1 단백질, 상기 OSD1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 OSD1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 27로 표시된 TAM 단백질, 상기 TAM 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 TAM 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질;
서열번호 28로 표시된 TDM1 단백질, 상기 TDM1 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 TDM1 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되며,
상기 제4 단백질은
서열번호 29로 표시된 MTL 단백질, 상기 MTL 단백질과 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 일치성을 갖는 단백질, 또는 상기 MTL 단백질과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 유사성을 갖는 단백질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 식물.
식물 잡종 강세를 유지하는 방법으로서,
유전자 편집 기술을 이용하여 교잡종을 F1 세대에 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 F1 세대의 이배체 암배우자를 얻는 단계 S1; 및
유전자 돌연변이와 유전자 공학 기술을 이용하여 식물 배우자 또는 배아 발달 과정에 관여하는 것에 영향을 줌으로써, 상기 이배체 암배우자가 종자로 발달하도록 유도하는 단계 S2를 포함하되, 관련된 단백질은 MTL 단백질인 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제22항에 있어서,
상기 S1은 교잡 F1 세대 종자를 채취하고, 유전자 편집 기술을 이용하여 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환함으로써 F1 세대의 이배체 암배우자를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제22항에 있어서,
상기 S1은 유전자 편집 기술을 이용하여 교잡종의 친본을 편집하고, 편집된 각각의 유전자가 모두 이형접합 돌연변이인 식물체를 얻은 다음, 친본 간 교잡에 의해 교잡종을 얻고, 교잡종에서 두 개 친본 중 편집된 복수의 유전자가 모두 동형접합 돌연변이인 식물체를 선별하여, 생식세포의 감수분열이 유사한 유사분열로 전환된 F1 세대의 이배체 암배우자를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서,
상기 S1은 유전자 편집 기술을 이용하여 REC8, OSD1, PAIR1 유전자를 넉아웃시킴으로써 생식세포의 감수분열을 유사한 유사분열로 전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제22항에 있어서,
상기 S2는 상기 이배체 암배우자에게 반수체 유도계 꽃가루를 주어서 상기 이배체 암배우자가 종자로 발달하도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제26항에 있어서,
상기 S2는 유전자 편집 기술을 이용하여 MTL 유전자를 넉아웃시킴으로써 반수체 유도계 꽃가루를 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제26항에 있어서,
상기 S2는 다른 식물체의 반수체 유도계 꽃가루를 사용하여 상기 이배체 암배우자가 종자로 발달하도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제25항에 있어서,
상기 교잡종은 F1 세대에 REC8, OSD1, PAIR1 및 MTL 유전자를 동시에 넉아웃시킨 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.
제22항에 있어서,
상기 식물은 벼, 옥수수, 수수, 조, 보리 및 밀을 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 잡종 강세를 유지하는 방법.