BR112020020900A2 - Método e kit para manutenção da heterose de plantas - Google Patents

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Abstract

método e kit para manutenção da heterose de plantas. a presente invenção revela um método para usar heterose de planta. o método compreende as seguintes etapas: s1, transformação da meiose de células germinativas de híbridos em semelhante a mitose, de modo a obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; e s2, influenciando e envolvendo o desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética, em que uma proteína envolvida é a proteína mtl.

Description

MÉTODO E KIT PARA MANUTENÇÃO DA HETEROSE DE PLANTAS Campo técnico
[001] A presente invenção relaciona o campo da biotecnologia, especificamente a um método para usar heterose de planta. Anterioridade
[002] A heterose refere-se ao fenômeno de que, no mundo biológico, duas variedades ou espécies relacionadas com fundo gênico diferente são hibridizadas para gerar um híbrido e a geração do híbrido é melhor em traços tais como vigor de crescimento, viabilidade, adaptabilidade e rendimento etc. do que seus parentais. A heterose é um fenômeno comum no mundo biológico, e é amplamente utilizada no cultivo de variedades e na prática produtiva de culturas.
[003] Para a aplicação da heterose na produção agrícola, um dos elos mais importantes é a preparação eficiente de sementes híbridas. Em culturas diclinosas, tais como milho etc. as flores masculinas da linhagem consanguínea materna podem ser removidas manualmente (ou mecanicamente) e o pólen de outra linhagem consanguínea (parental macho) pode ser usado para polinização para obter sementes híbridas. A operação é relativamente simples, portanto, a heterose de milho tem sido utilizada precocemente e o sistema é maduro e amplamente utilizado. Entretanto, há também o problema de que o período de floração de alguns parentais seja inconsistente, o que impossibilita a produção de sementes híbridas em grande escala no campo.
[004] Além disso, as safras monoicas (tais como arroz, trigo etc.) não podem alcançar a produção de sementes híbridas em grande escala removendo o pólen proveniente do parental fêmea. Por exemplo, arroz: no momento, a maneira de resolver tal problema no arroz é usar plantas com características de esterilidade de pólen como o parental fêmea e usar outra variedade como o parental macho para fornecer híbridos de pólen, isto é, um sistema de utilização de heterose usando esterilidade masculina como a tecnologia de núcleo. Dentre estes, a utilização da heterose do arroz pode ser dividida em duas abordagens técnicas. Uma é a tecnologia de hibridização de “método das três linhagens" com esterilidade de pólen de interação nuclear- citoplasmática como a tecnologia de núcleo e a outra é a tecnologia de hibridização de "método das duas linhagens" com estéril macho gênico foto- termo sensível controlado por ciclo de luz natural e temperatura como a tecnologia de núcleo.
[005] Como mostrado na Figura 1A, a tecnologia de hibridização do "método das três linhagens": usa a linhagem núcleo-citoplasmática estéril masculina como parental fêmea e usa a linhagem de manutenção como parental macho para a propagação em batelada de sementes que ainda mantêm as características estéreis; usa a linhagem estéril como parental fêmea e a linhagem restauradora como parental macho para a produção em larga escala de sementes híbridas restaurando a fertilidade do pólen e que possui heterose e as sementes híbridas são usadas para produzir arroz híbrido.
[006] Como mostrado na Figura 1B, a tecnologia de hibridização “método das duas linhagens”: a mesma linhagem de arroz, sob certas condições cujo pólen é fértil e sua fertilidade é usada para propagar as sementes de linhagem estéreis; sob outra condição específica, o pólen é estéril, sua esterilidade é usada para hibridizar com o parental macho para preparar sementes híbridas.
[007] Visto que o arroz híbrido usa a vantagem da primeira geração de híbridos, a separação de traços ou fertilidade ocorrerá ao longo de muitas gerações, portanto, a produção de sementes deve ser realizada todos os anos, o que consome muita mão de obra, recursos materiais e recursos terrestres.
Além disso, o “método das três linhagens” é restrito pela restauração e manutenção da relação e a taxa de utilização dos recursos de germoplasma é baixa; o "método das duas linhagens" é afetado pela temperatura e luz naturais, o rendimento reprodutivo das linhagens estéreis é instável e a autofertilidade das linhagens estéreis induzida em baixa temperatura durante a produção de sementes híbridas leva ao risco de que a pureza das sementes híbridas não alcançará o padrão.
[008] Além disso, algumas literaturas relacionadas reportam a utilização de heterose e genes relacionados à reprodução vegetal, por exemplo: Transformar a meiose de arroz em mitose, (Cell Research (2016) 26: 1242-1254) revela que as sementes apomíticas podem ser usadas para fazer a autofecundação de híbridos de F1 para manutenção de traços excelentes, em que os genes CENH3 expressos por modificação exógena são introduzidos através de hibridização. US 2014/0298507 A1 revela a transformação de gametas de apomixia em embriões clonados ou sementes. Journal of Sichuan University (Natural Science Edition), Vol.29, Nº 2, 1992, revela a aplicação de apomixia na reprodução vegetal e métodos de pesquisa de embriologia celular. Sumário
[009] A presente invenção visa fornecer um método para usar heterose de planta de modo que híbridos possam produzir sementes ou plantas clonadas, melhorando, desse modo, a eficiência da produção de sementes.
[010] A fim de atingir o objetivo acima, de acordo com um aspecto da presente invenção, fornece-se um método para usar heterose de planta. O método compreende as seguintes etapas: S1, transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose para obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; e S2, influenciar e se envolver no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética, em que uma proteína envolvida é a proteína MTL.
[011] Adicionalmente, a mutação genética inclui mutagênese aleatória e mutagênese dirigida; em que a mutagênese aleatória inclui mutagênese química, mutagênese física e mutagênese biológica; a mutagênese dirigida inclui tecnologia de edição gênica, a tecnologia de edição gênica inclui tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas, tecnologia de edição gênica CRISPR/Cpf1, tecnologia de edição gênica TALEN, tecnologia de edição gênica de endonuclease de homing e tecnologia de edição gênica ZFN; a tecnologia de engenharia genética inclui a tecnologia transgênica para induzir a expressão específica, expressão ectópica ou silenciamento gênico de genes.
[012] Adicionalmente, a S1 inclui obter sementes híbridas, transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose para obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética.
[013] Adicionalmente, a S1 inclui editar o parental das sementes híbridas usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética e, em seguida, obter o híbrido através de hibridização interparental, de modo a obter gametas híbridos cuja meiose de células germinativas é transformada em um processo semelhante a mitose.
[014] Adicionalmente, a S1 inclui editar proteínas envolvidas na meiose em plantas para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; em que as proteínas incluem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas, a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO: 13, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO: 14, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO: 15, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO: 16, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,
75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1; uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO: 17, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2; uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO: 18, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1; uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO: 19, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2; uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO: 20, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS;
uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO: 21, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1; uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO: 22, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína P31comet,, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO: 23, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO: 24, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em:
a proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO: 25, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8; a terceira proteína está envolvida na segunda divisão de meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína OSD1 como mostrada na SEQ ID NO: 26, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1; uma proteína TAM como mostrada na SEQ ID NO: 27, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM; uma proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1.
[015] Adicionalmente, a S2 inclui influenciar e se envolver no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas e induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética.
[016] Adicionalmente, a S2 inclui a polinização de pólen induzido de outras plantas para induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas.
[017] Adicionalmente, a S2 inclui induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas através de estimulação física, estresse biótico ou tratamento com agente químico.
[018] Adicionalmente, a S2 inclui induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas através de cultura de anteras ou cultura de pólen.
[019] Adicionalmente, a proteína MTL é uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO: 29, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL.
[020] Adicionalmente, as plantas incluem plantas monocotiledôneas e plantas dicotiledôneas.
[021] Adicionalmente, a planta compreende arroz, milho, sorgo, milhete, cevada, trigo, centeio, aveia, trigo sarraceno, semente de coix, cana- de-açúcar, aspargos, brotos de bambu, cebola nira, inhame, soja, batata, ervilhas, feijão mungo, feijão azuki, fava, feijão-chicote, feijão, lentilha, calopogônio, grão-de-bico, mandioca, batata doce, colza, algodão, beterraba, berinjela, amendoim, chá, hortelã, café, gergelim, girassol, rícino, semente de perilla, cártamo, tomate, pimenta, pepino, couve chinesa, alface, espinafre, alho, couve, mostarda-castanha, Zizania aquatica, cebolinha, abóbora-d'água, abobrinha, esponja vegetal, repolho chinês, rabanete, cebola, melancia, uva, cenoura, couve-flor, abóbora, tabaco, pasto, capim-elefante, capim-chorão, sorgo sudanense, orquídeas, lírios, tulipas e alfafa.
[022] De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornece-se uma planta ou semente que mantém a heterose. A planta ou semente é preparada por qualquer um dentre os métodos acima.
[023] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, fornece-se um kit para manutenção de heterose de plantas. O kit inclui um vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose, e um vetor e/ou reagente para o desenvolvimento de gametas em sementes ou plantas.
[024] Adicionalmente, o vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose é um vetor e/ou reagente usado em mutação genética ou tecnologia de engenharia genética para transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose, preferencialmente o vetor e/ou reagente é um vetor e/ou reagente para mutagênese aleatória ou mutagênese dirigida.
[025] Adicionalmente, a mutagênese aleatória inclui mutagênese química, mutagênese física e mutagênese biológica; a mutagênese dirigida inclui tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas, tecnologia de edição gênica CRISPR/Cpf1, tecnologia de edição gênica TALEN, tecnologia de edição gênica de endonuclease de homing e tecnologia de edição gênica ZFN; a tecnologia de engenharia genética inclui a tecnologia transgênica para induzir a expressão específica, expressão ectópica ou silenciamento gênico de genes.
[026] Adicionalmente, o vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose é um vetor e/ou reagente usado em mutação genética ou tecnologia de engenharia genética para editar proteínas envolvidas na meiose em plantas para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose, em que as proteínas incluem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas, a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO: 13, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO: 14, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO: 15, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,
75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO: 16, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1; uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO: 17, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2; uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO: 18, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1; uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO: 19, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2;
uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO: 20, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS; uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO: 21, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1; uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO: 22, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína P31comet, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO: 23, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO: 24, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO: 25, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8; a terceira proteína está envolvida na segunda divisão de meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína OSD1 como mostrada na SEQ ID NO: 26, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1; uma proteína TAM como mostrada na SEQ ID NO: 27, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM;
uma proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1.
[027] Adicionalmente, o vetor e/ou reagente para o desenvolvimento de gametas em sementes ou plantas, entre eles, incluem um vetor e/ou reagente para induzir gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética para influenciar a proteína MTL envolvida no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas, a proteína MTL é uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO: 29, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL.
[028] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, fornece-se uma planta produzida usando o kit acima. A meiose de células germinativas em plantas é transformada em um processo semelhante a mitose de modo que possa produzir gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica sejam consistentes com híbridos.
[029] Adicionalmente, os gametas das plantas podem ser induzidos a se desenvolver em plantas ou sementes.
[030] Adicionalmente, a planta é um gene mutante ou planta geneticamente modificada, a planta é usada na mutação genética ou tecnologia de engenharia genética para regular proteínas envolvidas na meiose em plantas para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose; a planta é usada na mutação genética ou tecnologia de engenharia genética para influenciar uma quarta proteína envolvida no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas de modo a induzir gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas; em que as proteínas incluem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas, a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO: 13, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO: 14, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO: 15, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,
75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO: 16, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1; uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO: 17, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2; uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO: 18, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1; uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO: 19, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2;
uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO: 20, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS; uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO: 21, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1; uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO: 22, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína P31comet, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO: 23, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO: 24, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO: 25, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8; a terceira proteína está envolvida na segunda divisão de meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína OSD1 como mostrada na SEQ ID NO: 26, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1; uma proteína TAM como mostrada na SEQ ID NO: 27, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM; a proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1; uma proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1; a quarta proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO: 29, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL.
[031] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, fornece-se um método para manutenção da heterose de planta. O método inclui as seguintes etapas: S1, transformar a meiose de células germinativas do híbrido em um processo semelhante a mitose durante a geração de F1 de modo a obter os gametas fêmeas diploides da geração de F1 usando tecnologia de edição gênica; e, S2, influenciar e se envolver no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas para induzir os gametas fêmeas diploides a se desenvolverem em sementes usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética, em que uma proteína influenciada é a proteína MTL.
[032] Adicionalmente, a S1 inclui obter sementes de geração híbrida de F1, transformando a meiose de células germinativas de híbrido em um processo semelhante a mitose, de modo a obter os gametas fêmeas diploides da geração de F1 usando tecnologia de edição gênica.
[033] Adicionalmente, a S1 inclui editar o parental das sementes híbridas usando tecnologia de edição gênica para obter plantas que possui os genes editados, os quais são todos heterozigotos mutantes e, em seguida, obter as sementes híbridas através de hibridização interparental, fazendo a triagem de sementes híbridas que possui uma pluralidade de genes editados, os quais são todos homozigotos mutantes em ambos os parentais, de modo a obter os gametas fêmeas diploides da geração F1 cuja meiose de células germinativas é transformada em um processo semelhante a mitose.
[034] Adicionalmente, a S1 inclui nocautear os genes REC8, OSD1, e PAIR1 para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose, usando tecnologia de edição gênica.
[035] Adicionalmente, a S2 inclui a polinização do gameta fêmea diploide com pólen indutor de haploide para induzir os gametas fêmeas diploides a se desenvolverem em sementes.
[036] Adicionalmente, a S2 inclui nocautear os genes MTL para produzir pólen indutor de haploide usando tecnologia de edição gênica.
[037] Adicionalmente, a S2 inclui o uso do pólen indutor haploide de outras plantas para induzir os gametas fêmeas diploides a se desenvolverem em sementes.
[038] Adicionalmente, nocautear os genes REC8, OSD1, PAIR1 e MTL dos híbridos simultaneamente durante a geração de F1.
[039] Adicionalmente, a planta inclui arroz, milho, sorgo, milhete, cevada e trigo.
[040] Ao aplicar a solução técnica da presente invenção, os híbridos podem produzir sementes clonadas cujos genótipos e ploidia cromossômica são completamente consistentes com os seus próprios, de modo que os híbridos possam ser usados durante um longo tempo e possam ser resolvidos problemas tais como dificuldade na hibridização interparental devido ao florescimento inconsistente etc. baixa produção de sementes e alto custo de híbridos etc. durante o uso de heterose. Breve Descrição das Figuras
[041] As figuras anexas, as quais perfazem este pedido, são fornecidas para entender adicionalmente a presente invenção, as modalidades ilustrativas da presente invenção e a descrição das mesmas se destinam a explicar a presente invenção e não a limitá-la. Nas figuras: Figura 1A demonstra um diagrama esquemático de um processo de tecnologia de reprodução de híbridos de três linhagens do estado da técnica; Figura 1B demonstra um diagrama esquemático de um processo de tecnologia de reprodução híbrido de duas linhagens no estado da técnica; Figuras 2 e 3 demonstram diagramas esquemáticos da manutenção do genótipo de geração de F1 da presente invenção; Figura 4A demonstra os resultados do teste de ploidia celular da planta de geração de F1 Chunyou 84 no Exemplo 1; e Figura 4B demonstra os resultados do teste de ploidia celular das plantas fixadas com heterose no Exemplo 1; Figura 5 mostra os resultados do sequenciamento completo de gene do parental macho C84, parental fêmea 16A, híbrido Chunyou84 (CY84), plantas fixadas com genótipo e ploidia cromossômica no Exemplo 1.
Descrição Detalhada das Modalidades
[042] Deve-se observar que os Exemplos no presente pedido e as características nos Exemplos podem ser combinados entre si sem conflito. Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes com referência às figuras e em conjunto com os Exemplos.
[043] As terminologias envolvidas na presente invenção são explicadas da seguinte maneira:
[044] A heterose se refere ao fenômeno em que a primeira geração do híbrido é superior ao parental em termos de tamanho corporal, taxa de crescimento, fecundidade e características comportamentais.
[045] A meiose se refere à quando a célula germinativa se divide, o cromossomo se duplica apenas uma vez e a célula se divide duas vezes continuamente. Esta é uma maneira especial de reduzir pela metade o número de cromossomos.
[046] A mitose, também conhecida como divisão indireta, foi descoberta em plantas por E. Strasburger (1880). Caracteriza-se pelo aparecimento de fusos e cromossomos durante a divisão celular, de modo que os cromossomos filhos que foram replicados na fase S sejam igualmente distribuídos nas células filhas, tal maneira de divisão é comumente vista em animais e plantas superiores (animais e plantas superiores).
[047] Ploidia cromossômica (número) se refere ao número de cromossomos ou genomas contidos em uma célula, tal como coloração haploide e coloração poliploide.
[048] Gametas fêmeas diploides: os gametas dizem respeito a genoblastos produzidos pelo sistema reprodutor durante a reprodução sexual em organismos, denominados como células germinativas. Os gametas incluem gametas machos e gametas fêmeas; em geral, quando a célula germinativa se divide, o cromossomo se duplica apenas uma vez, a célula se divide duas vezes continuamente e o número de cromossomos é reduzido pela metade. Entretanto, caso o número de cromossomos não seja reduzido pela metade quando os gametas fêmeos são produzidos, mas sejam consistentes com o número de complemento cromossômico na célula somática da espécie, denomina-se gametas fêmeas diploides.
[049] Haploide: Um indivíduo ou célula cujo número de complemento cromossômico somático é igual ao número de complemento cromossômico de gameta da espécie.
[050] Partenogênese, também conhecida como autogênese, se refere a óvulos que podem se desenvolver em novos indivíduos normais sem serem fertilizados.
[051] Na presente invenção, híbridos dizem respeito a plantas ou sementes cujos genótipos são heterozigotos e as progênies de sua reprodução sexual serão geneticamente segregadas.
[052] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, fornece-se um método para usar heterose de planta. O método inclui as seguintes etapas: S1, transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose para obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; e S2, influenciar e se envolver no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética, em que uma proteína influenciada é a proteína MTL.
[053] Em que, a mutação genética inclui mutagênese aleatória e mutagênese dirigida; a mutagênese aleatória inclui mutagênese química, mutagênese física e mutagênese biológica; a mutagênese dirigida inclui tecnologia de edição gênica, preferencialmente, a tecnologia de edição gênica inclui tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas, tecnologia de edição gênica CRISPR/Cpf1, tecnologia de edição gênica TALEN, tecnologia de edição gênica de endonuclease de homing e tecnologia de edição gênica ZFN; a tecnologia de engenharia genética inclui a tecnologia transgênica para induzir a expressão específica, expressão ectópica ou silenciamento gênico de genes.
[054] Especificamente, os métodos comumente usados em mutagênese física incluem raios (raios ultravioletas, raios X, raios Y, raios de nêutrons), microfeixes de laser, feixes de íons, micro-ondas, ultrassom e calor, etc. Os métodos comumente usados em mutagênese química incluem método de imersão, método de esfregaço, método de gotejamento, método de injeção, método de aplicação e método de fumigação. Os mutagênicos químicos incluem: um agente alquilante, um análogo de base, cloreto de lítio, um composto nitroso, uma azida, um antibiótico, hidroxilamina, acridina, dietil sulfato (DFS), 5-bromouracil (5-BU), mostarda de nitrogênio (Nm), N-Metil-N´- nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) etc. Os métodos de mutagênese biológica incluem mutagênese de tratamento de condições espaciais, mutagênese de micro-organismos patogênicos, mutagênese de cultura de tecidos e mutagênese transgênica.
[055] Como um exemplo, a aplicação pode ser o TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes), descrito por McCallum et al., Plant Physiology, 2000, 123, 439-442). A mutagênese dirigida é realizada usando técnicas padrão, as quais são conhecidas na técnica e utilizam recombinação homóloga, preferencialmente em combinação com nucleases tal como TALEN ou CRISPR.
[056] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, o método inclui as seguintes etapas: S1, transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose de modo a obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; e S2 compreende induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas.
[057] Ao aplicar a solução técnica da presente invenção, os híbridos podem produzir sementes ou plantas clonadas cujos genótipos e ploidia cromossômica são completamente consistentes com os seus próprios, de modo que os híbridos possam ser usados durante um longo tempo e possam ser resolvidos problemas tais como dificuldade na hibridização interparental devido ao florescimento inconsistente etc. baixa produção de sementes e alto custo de híbridos etc. durante o uso de heterose.
[058] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, a S1 inclui obter sementes híbridas, transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose para obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética. Por exemplo, a operação específica pode ser: S1 inclui obter sementes de geração híbrida de F1, transformando a meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose, de modo a obter os gametas diploides da geração de F1 usando tecnologia de engenharia genética. A operação específica pode ser: obter sementes híbridas de geração de F1, editar os principais genes envolvidos na meiose, introduzindo o sistema de edição gênica para obter as plantas de geração de F1 editadas geneticamente, os gametas fêmeas das plantas de geração de F1 editadas geneticamente são gametas diploides, preferencialmente, os genes chaves envolvidos na meiose são os três genes REC8, OSD1, e PAIR1.
[059] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, a S1 inclui editar o parental das sementes híbridas usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética e, em seguida, obter as sementes híbridas através de hibridização interparental, de modo a obter gametas híbridos cuja meiose de células germinativas é transformada em um processo semelhante a mitose. Por exemplo, a operação específica pode ser: S1 inclui a edição dos parentais das sementes híbridas usando tecnologia de engenharia genética para obter plantas que possui genes chave envolvidos na meiose são todos mutantes heterozigotos e, em seguida, obter as sementes híbridas através de hibridização interparental, triagem de sementes híbridas que possui genes chave envolvidos na meiose são todos mutantes homozigotos, de modo a obter os gametas fêmeas diploides da geração de F1 cuja meiose das células germinativas é transformada em um processo semelhante a mitose. A operação específica pode ser: obter o parental macho e o parental fêmea das sementes híbridas, respectivamente, editar os três genes chave envolvidos em meiose, introduzindo um sistema de edição gênica, de modo a obter plantas parentais cujos três genes editados geneticamente acima estão todos em um estado heterozigoto, em seguida hibridizar os dois parentais, as sementes resultantes apresentarão genótipos diferentes, entre eles, selecionar sementes cujos três genes acima são mutações homozigóticas. Tais plantas são as sementes da geração de F1 que são esperadas pela presente invenção e os gametas fêmeas das sementes da geração de F1 são gametas fêmeas diploides.
[060] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, a S1 inclui editar proteínas envolvidas na meiose em plantas para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; em que as proteínas incluem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas, a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO:13 (MKLKMNKACDIASISVLPPRRTGGSSGASASGSVAVAVASQPRSQPLS
QSQQSFSQGASASLLHSQSQFSQVSLDDNLLTLLPSPTRDQRFGLHDDSSKRMSSLPASS ASCAREESQLQLAKLPSNPVHRWNPSIADTRSGQVTNEDVERKFQHLASSVHKMGMVV DSVQSDVMQLNRAMKEASLDSGSIRQKIAVLESSLQQILKGQDDLKALFGSSTKHNPDQT SVLNSLGSKLNEISSTLATLQTQMQARQLQGDQTTVLNSNASKSNEISSTLATLQTQMQA DIRQLRCDVFRVFTKEMEGVVRAIRSVNSRPAAMQMMADQSYQVPVSNGWTQINQTP VAAGRSPMNRAPVAAGRSRMNQLPETKVLSAHLVYPAKVTDLKPKVEQGKVKAAPQKP
FASSYYRVAPKQEEVAIRKVNIQVPAKKAPVSIIIESDDDSEGRASCVILKTETGSKEWKVTK QGTEEGLEILRRARKRRRREMQSIVLAS), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO:14 (MVMAQKTKEAEITEQDSLLLTRNLLRIAIYNISYIRGLFPEK
YFNDKSVPALEMKIKKLMPMDTESRRLIDWMEKGVYDALQKKYLKTLLFCICEKEEGPMI EEYAFSFSYPNTSGDEVAMNLSRTGSKKNSATFKSNAAEVTPDQMRSSACKMIRTLVSL MRTLDQMPEERTILMKLLYYDDVTPEDYEPPFFKCCADNEAINIWNKNPLKMEVGNVNS KHLVLALKVKSVLDPCDDNNVNSEDDNMSLDNESDQDNDFSDTEVRPSEAERYIVAPND GTCKGQNGTISEDDTQDPVHEEELTAQVREWICSRDTESLEVSDVLVNFPDISMEMVEDI MERLLKDGLLSRAKKDSYSVNKIADPTTPHIKKEVIMQNVSPTEGTKNSNGDLMYMKALY HALPMDYVSVGKLHGKLDGEASQNMVRKLIEKMVQDGYVKNSANRRLGKAVIHSEVTN RKLLEIKKILEVDIAEQMAIDTNAEPGEPERKDHLSGHEMRDGSTMGCLQSVGSDLTRTR
ELPEPQQNVSMQSGQEASTVDKDPSRTPTSVREASVCSLESGVLGQKVRKSLAGAGGTQ CSQDKRFRKASTVKEPILQYVKRQKSQVQVQVQ), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO:15 (MEVELTNIQKATSSDYWSLASNQYPCGKFPKVSVGVTIPRTSSVSR
GRDAASTAAFEKNLSQGTDGRSRPPKMDNASLQVSPEAANHGGSAKEVPKPVPAKVSV SQPDDNAIEQTGTFSFGTRREQDSHLDQLDRPPLVSSQGKRQVESADKNKPNSEMLRM KLWEILGGTSQNKEAVASPNPEDIETPCQPKSQIANGPSSGRQKVFTSPVPYNIKTPAQFN SQTANKPSSDPIESDSDSPQVVEVRPITRSLGRKKEPTGSTHQDKSGSAKKPLSTHRSTPK QKILDNVFAFNDKCTPKTVGKSANGESGSLRNLRSLSRRAKVEPKKAHCSDRISHKTTQDD MERKVPSKYIPSEKKGEKTNSFSSLSRTGKTAESCSRSPKRERRVNTMANVGARKMQLSE NLLVKTLNDGEHKLSSPQLTSFKSKGKCSSISPQQKENDNTHIPEASDRTAARNSFNSTPSP AANPSPVLRKYSWEHDENPAINGKSGQKDASPLADRFSDMPDDFASPTFAANIKISPHRS KMLDDDLFSSKYPKGVNRSRSTSFTSDPESEPLDKMEKTNELPGSESPNSQEERQNRKQP HLSPLSPIESEGAQISIPSFRKGYKSHKWLSDVDSPDKSSIEHLGRKSHLKEGRKGKRQLTSP THFATSGTQETMSDKEPEKVPENYLTRAFDQLVVVLGRFQTKIKSETRNKSSKILAATGEII RQHLEGVEGQMQADVDKLVNAGKSKRKRLESTFEEQQEKLRILHEKFKEEVNQQLLGCK
NSVEDFEAYHAELKGVADKQKASHKKLLQNAEKTVGAQLSDAETKIAEVQKRARKRMKG LKFVLKELIAETAE), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%,
45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO:16 (MEMVLIMSFRVLLYHRLTAQTGPFKLHCLGILLNSTKDAATYIGDKQ
SLYLNLVNNLRLPSDEIRGEILFVLYKLSLLNATPWDDICDNDNVDLSAIGRSLLQFSLEVLLK TQNDDVRLNCIALLLTLAKKGAFDILLLSDPSLINSAEAEDNVPLNDSLVILFAEAVKGSLLST NIEVQTGTLELIFHFLSSDANIFVLKTLIDQNVADYVFEVLRLSGMRNHLLQSSNASQFLTK LLYVSGNNDPLVISSIKVLSILANSEERFKEKLAIAVSTLLPVLHYVSEIPFHPVQSQVLRLVCI SIINCSGILSLSQEEQIACTLSAILRRHGNGELGMSSETFALVCSMLVEILKLPSADDIQKLPS FIVEASKHAISLTFSHEYDCLFLIPHSLLLLKEALIFCLEGNKDQILRKKSLEDSIIETCETYLLPW LESAIVDGNDEETLSGILQIFQIILSRASDNKSFKFAEMLASSSWFSLSFGFMGLFPTDHVKS AVYLVISSIVDKVLGISYGETIRDACIYLPPDPAELLYLLGQCSSEDFNLASCQCAILVILYVCS FYNERLAADNQILASVEQYILLNGAKFPHEIPGSLMLTLLVHLYAFVRGISFRFGIPHSPEAE KTLFHAMTHKEWDLLLIRVHLIALKWLFQNEELMEPLSFHLLNFCKFFCEDRTVMLSSSTQ LVDIQLIAELVYSGETCISSLLVSLLSQMIKESAEDEVLSVVNVITEILVSFPCTSDQFVSCGIV DALGSIYLSLCSSRIKSVCSLLIFNILHSASAMTFTCDDDAWLALTMKLLDCFNSSLAYTSSE QEWKILIGILCLILNHSANKVLIEPAKAIILNNCLALLMDGIVQEACAKGPSLFQHNQETTFG ELLILMLLLIFFSVRSLQAILEASIDWQEFLQYSDDTESSSVLGIPCHDLCRLMHFGPSPVKLI ASQCLLELLNRISDQRSCLNAELRCSAKYLKSMIAVTEGMVFDQDSRVAENCGACLTVILG WERFGSREKAVIRESKWSRLILEEFAVALTAPGLTSKSFSNQQKIAANIALSLLQLSQVPD WLTSLFSDSLISGIVANLSARNVTAEIVTLFSELMAKNYLNQEHIAGLHNLFQVCRRQAYE
GGGGSKAQPSEQKAAAARCADDVRALLFGMMLEQRACSRATVEMEQQRLLREIDSFFF QESSLREQNSVK), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1;
uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO:17 (MAPPASRPPTPTPTPTANAAASSSRIESPSLRAALAMALIHYNRLP
SRAAAAAAPSPQALLNWKRKAKDRKREILRLREELKLLQDGARGEEMEPPVASCRCHFFD GCGDLPPPTDGDAGEHWVDDVLRRRFVRLVRWKDKRRRLDRSLPTSSLMEYNTEDEVQ QLSLSIDFLVELSDGLFAKREAGSSFTTFSHQAVDFILASLKNILSSEREKEIIEEIINGLVARL MKRMCTTPENAGSVDCSDAQFSLQHLFRKLGNEEFVGQRIILAISQKISNVSEKLLLADPF
DDGFPEMHSNMFIMIQLIEFLISDSFNNWLCRDHFDRKLFEEWVRSILKARKDLEVLDGR NGLYVVYIERVIGRLAREVAPAAHQGKLDLEVLSKLLY), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2; uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO:18 (MAGREKRRRVAALDGEERRRRQEEAATLLHRIRGLVRWV
VAEVAAGRSPTVALHRYQNYCSSASAAAASPCACSYDVPVGTDVLSLLHRGSHASRLNVL LRVLLVVQQLLQQNKHCSKRDIYYMYPSIFQEQAVVDRAINDICVLFKCSRHNLNVVPVA KGLVMGWIRFLEGEKEVYCVTNVNAAFSIPVSIEAIKDVVSVADYILIVEKETVFQRLANDK FCERNRCIVITGRGYPDIPTRRFLRYLVEQLHLPVYCLVDADPYGFDILATYKFGSLQLAYDA
NFLRVPDIRWLGVFTSDFEDYRLPDCCLLHLSSEDRRKAEGILSRCYLHREAPQWRLELEA MLQKGVKFEIEALSACSISFLSEEYIPKKIKQGRHI), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1;
uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO:19 (MAEAGVAAASLFGADRRLCSADILPPAEVRARIEVAVLNFLAALTD
PAAPAISALPLISRGAANRGLRRALLRDDVSSVYLSYASCKRSLTRANDAKAFVRVWKVM EMCYKILGEGKLVTLRELFYTLLSESPTYFTCQRHVNQTVQDVVSLLRCTRQSLGIMASSR GALIGRLVVQGPEEEHVDCSILGPSGHAITGDLNVLSKLIFSSDARYIIVVEKDAIFQRLAED RIYSHLPCILITAKGYPDLATRFILHRLSQTYPNMPIFALVDWNPAGLAILCTYKYGSISMGL
ESYRYACNVKWLGLRGDDLQLIPQSAYQELKPRDLQIAKSLLSSKFLQDKHRAELTLMLET GKRAEIEALYSHGFDFLGKYVARKIVQGDYI), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2; uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO:20 (MPPTMLASVPTRPRSHPFRRRRGAAAAAPPLLPDQIAAAAAAAAKRP
AESSTSASSCFHSEVISATSTTCPTSLAAAQRPEKRPRYQDVDEEQPAASECSEIIGGARPR AAEVEVSESSCLASVLESYLACPEQLANDAETTAYSSAREDLTLSETEEEEEEEEVRSGPCIC TDCSFSPLHESSSSSDDDNAVPSPTFSLFLALAEQFVPFTHPKTPTATDVALQAGEGKRFE DLDNEVSYERFRRRERRGVVARDYIEVYSSMLGSYGRAVVEQRVVMVNWIMEHSQAM KLQPETVFMGIGLMDRFLTRGYVKGSRNLQLLGIACTTLATRIEENQPYNCILQKAFKVGI NTYSRSEVVAMEWLVQEVLDFQCFVTTTHHFLWFYLKAANADDRVEDLAKYLALLSLLD
HKHLSFWPSTVAAAVVALACLATNNESSCHLVMETHMRTKNDDLPECLMSLEWLTNYA S), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS;
uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO:21 (MSAPMEVSFSAPPPPDAASAAAAAPSLVPAVSAAAVAATTVSCS
PQPPTGSPSADDRILVSVEVLLHATSTARAEDVCAAVERMLEARSLSYVDGPVPIPNDDPF LLANVKRIQICDTDEWTENHKVLLFWQVRPVVHVFQLSEDGPGEEPGEDDTLSSFNEWA LPAKEFDGLWESLLYEVGLKQRLLRYAASALLFTEKGVDPCLVSWNRIVLLHGPPGTGKTS LCKALAQKLSIRFKSRYSMCQLIEVNAHSLFSKWFSESGKLVAKLFQKIQEMVEEESNLVFV LIDEVESLAAARQAAISGSEPSDSIRVVNALLTQMDKLKSWPNVIILTTSNITTAIDIAFVDR ADIKAYVGPPTLQARYEILRSCLQELLRVGILTHTQGGNSLCLLSYFSLMENQHCPEVADP
HGSVHLSGLLHKAAEICEGLSGRTLRKLPFLAHASVANPSCCDASAFLHALIQTAQRELSES RG), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1; uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO:22 (MERATTSGGGGGGSQPPRGVGLPLVEVQAAAASLRRSEVFYVVKE
LLGFVLYMHHQIPAVLQNLENEFASLKEEMTEMALPPGEMKPSDQRKYNTRKREVRRRI KKQEKLMNGLSSVFSALQKALDEVPSIEGVLLILGGSLVRPLFVYDITISHGRFDAGSANER
GASKLAQSVSRKAIRALISSGAGSLSYTGPTKLFVLVRCPCTLNLPLDFLPKRDFRYSKKVVP LQMCIKCNIAGIQIDNQQITSIVDASRCTSESTISEVIWFQCKHTIRGLPCKASLEE), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína P31comet, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO:23 (MASSPPPSTASPTSSSPYRKLLHSLIYWAVQRCRMSESPCRLTVSVKR
SPEPAGSSPLRISVSDTGVGSKLEEFLELDALARETPVEKWDGTLLITTTGIDDKAIYRYQFN LQEDTSSSTRFTKLATMYKSRAIFSGTEVCLCLPTEADVDDLILWLVGFVRKIFVLRASNLAC ELFVAQTDSAGSGDVCLSQDSDDVHISITTSSIDRLVSGLKDYALSHANTSDRCEACYMNR DRLKIGTGTAKYVDKRKAKGQLVEVVIMIAPTSSDLSCWMTNCSSTQVLHFVEFIPCPISQ SSLSALMSIDWQSYGFKFKGGFIDDDGNAELQWDNMAFSHVDIAIHTYHEGAVDEWKS SQPERHLLRKALKSALFGLKADHAEDFLSCHGQKVREYVPDLAESIAGLILSSNDQEFQDE
CIALLGLGSDQDLTEGAVRSCIGEKMNRIIEMNDTKENVEHNAPYLFECERFDEDYSLLDE DDPDEDMIFDF), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO:24 (MRHNIKFKSKGTLKIRNTAQISLWKKCSDSMIADQTYLFINRVQDRR
FDEESLRILELSLVAMNVKSFLEVRSRLRDFMRSESVVIFGELTGESMVAKLSVLEFFARAF
ALLGDMESCLAMRYEALNLRQLKSPSCLWLGVSHSEWTKFAVQSMENGFPSIAGKASEN ALLSLKKDSLIEPKSEDNSDILDAAEKVRRLRDSAASLTSSHSGIFIYIVSSLKFAVCNRLLTTF) , uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO:25 (MFYSHQLLARKAPLGQIWMAATLHSKINRKRLDKLDIIKICEEILN
PSVPMALRLSGILMGGVAIVYERKVKALYDDVSRFLIEINEAWRVKPVADPTVLPKGKTQ AKYEAVTLPENIMDMDVEQPMLFSEADTTRFRGMRLEDLDDQYINVNLDDDDFSRAEN HHQADAENITLADNFGSGLGETDVFNRFERFDITDDDATFNVTPDGHPQVPSNLVPSPP RQEDSPQQQENHHAASSPLHEEAQQGGASVKNEQEQQKMKGQQPAKSSKRKKRRKD DEVMMDNDQIMIPGNVYQTWLKDPSSLITKRHRINSKVNLIRSIKIRDLMDLPLVSLISSLE KSPLEFYYPKELMQLWKECTEVKSPKAPSSGGQQSSSPEQQQRNLPPQAFPTQPQVDN DREMGFHPVDFADDIEKLRGNTSGEYGRDYDAFHSDHSVTPGSPGLSRRSASSSGGSGR GFTQLDPEVQLPSGRSKRQHSSGKSFGNLDPVEEEFPFEQELRDFKMRRLSDVGPTPDLL
EEIEPTQTPYEKKSNPIDQVTQSIHSYLKLHFDTPGASQSESLSQLAHGMTTAKAARLFYQ ACVLATHDFIKVNQLEPYGDILISRGPKM), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8; a terceira proteína está envolvida na segunda divisão de meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína OSD1 como mostrada na SEQ ID NO:26 (MPEVRNSGGRAALADPSGGGFFIRRTTSPPGAVAVKPLARRA
LPPTSNKENVPPSWAVTVRATPKRRSPLPEWYPRSPLRDITSVVKAVERKSRLGNAAVRQ QIQLSEDSSRSVDPATPVQKEEGVPQSTPTPPTQKALDAAAPCPGSTQAVASTSTAYLAE
GKPKASSSSPSDCSFQTPSRPNDPALADLMEKELSSSIEQIEKMVRKNLKRAPKAAQPSKV TIQKRTLLSMR), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1;
uma proteína TAM como mostrada na SEQ ID NO:27 (MSSSSRNLSQENPIPRPNLAKTRTSLRDVGNRRAPLGDITNQKN
GSRNPSPSSTLVNCSNKIGQSKKAPKPALSRNWNLGILDSGLPPKPNAKSNIIVPYEDTELL QSDDSLLCSSPALSLDASPTQSDPSISTHDSLTNHVVDYMVESTTDDGNDDDDDEIVNID SDLMDPQLCASFACDIYEHLRVSEVNKRPALDYMERTQSSINASMRSILIDWLVEVAEEYR LSPETLYLAVNYVDRYLTGNAINKQNLQLLGVTCMMIAAKYEEVCVPQVEDFCYITDNTYL RNELLEMESSVLNYLKFELTTPTAKCFLRRFLRAAQGRKEVPSLLSECLACYLTELSLLDYAM
LRYAPSLVAASAVFLAQYTLHPSRKPWNATLEHYTSYRAKHMEACVKNLLQLCNEKLSSD VVAIRKKYSQHKYKFAAKKLCPTSLPQELFL), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM; uma proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO:28 (MCPCVERRAPPGVYYTPPPARTSDHVAAMPMTERRRPPYSCSSSSE
RRDPFHIVHKVPSGDSPYVRAKHAQLIDKDPNRAISLFWTAINAGDRVDSALKDMAVVM KQLGRSDEGIEAIKSFRYLCSFESQDSIDNLLLELYKKSGRIEEEAVLLEHKLQTLEQGMGFG GRVSRAKRVQGKHVIMTIEQEKARILGNLGWVHLQLHNYGIAEQHYRFGFVTKIPNIDYC LVMRALGLERDKNKLCNLAICLMRMSRIPEAKSLLDDVRDSPAESECGDEPFAKSYDRAV EMLAEIESKKPEADLSEKFYAGCSFVNRMKENIAPGTANKNYSDVSSSPASVRPNSAGLYT
QPRRCRLFEEETRGAARKLLFGKPQPFGSEQMKILERGEEEPMKRKKLDQNMIQYLHEFV KDTADGPKSESKKSWADIAEEEEAEEEEEERLQGELKTAEM), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1.
[061] Dentre estas, a proteína PAIR1 é envolvida na iniciação da recombinação meiótica e catalisa a formação de lacunas de cadeia dupla de DNA. A exclusão do gene PAIR1 causará perda do processo de recombinação; a proteína REC8 é responsável por ligar proximamente os cromossomos irmãos recém-duplicados e é um fator regulatório chave que garante que os cromossomos irmãos (ou homólogos) sejam corretamente separados e atribuídos às células filhas. A perda de sua função fará com que as cromátides irmãs se separem no final da primeira divisão meiótica e se movam à bipolar; a perda da função do gene OSD1 fará com que a formação de gametas pule diretamente o segundo processo de divisão meiótica.
[062] O nocaute do gene mencionado acima é um método simples e eficaz para transformar a meiose das células germinativas em um processo semelhante a mitose.
[063] A supressão da proteína na presente invenção se refere à mutagênese do gene que codifica a proteína ou seu promotor e a seleção da perda parcial ou completa da atividade proteica, incluindo a obtenção da supressão de proteínas relacionadas pela expressão de RNA de silenciamento em plantas.
[064] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, a S2 inclui influenciar e se envolver no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas e induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética. Em adição, a S2 pode incluir a polinização de pólen induzido a partir de outras plantas para induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas. Por exemplo, a S2 inclui polinizar o gameta fêmea diploide com pólen indutor de haploide para induzir os gametas fêmeas diploides a se desenvolverem em sementes; como outro exemplo, a S2 inclui induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas através de estimulação física, estresse biótico ou tratamento com agente químico; como outro exemplo, a S2 inclui induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas através de cultura de anteras ou cultura de pólen.
[065] Preferencialmente, uma proteína MTL é uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO:29 (MCPCVERRAPPGVYYTPPPARTSDHVAAMPMTERRRPPYSCSSSSE
RRDPFHIVHKVPSGDSPYVRAKHAQLIDKDPNRAISLFWTAINAGDRVDSALKDMAVVM KQLGRSDEGIEAIKSFRYLCSFESQDSIDNLLLELYKKSGRIEEEAVLLEHKLQTLEQGMGFG GRVSRAKRVQGKHVIMTIEQEKARILGNLGWVHLQLHNYGIAEQHYRFGFVTKIPNIDYC LVMRALGLERDKNKLCNLAICLMRMSRIPEAKSLLDDVRDSPAESECGDEPFAKSYDRAV EMLAEIESKKPEADLSEKFYAGCSFVNRMKENIAPGTANKNYSDVSSSPASVRPNSAGLYT
QPRRCRLFEEETRGAARKLLFGKPQPFGSEQMKILERGEEEPMKRKKLDQNMIQYLHEFV KDTADGPKSESKKSWADIAEEEEAEEEEEERLQGELKTAEM), uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL. Em que o pólen indutor pode ser originado a partir de plantas que produzem gametas cujo genótipo e ploidia são consistentes com o híbrido, também pode ser originado a partir de outras plantas. Preferencialmente, o pólen indutor é originado a partir de plantas que produzem gametas fêmeas cujo genótipo e ploidia são consistentes com o híbrido e é obtido por nocaute de genes REC8, OSD1, PAIR1 e MTL simultaneamente no híbrido.
[066] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, as plantas incluem plantas monocotiledôneas e plantas dicotiledôneas; preferencialmente as plantas compreendem arroz, milho, sorgo, milhete,
cevada, trigo, centeio, aveia, trigo sarraceno, semente de coix, cana-de-açúcar, aspargos, brotos de bambu, cebola nira, inhame, soja, batata, ervilhas, feijão mungo, feijão azuki, fava, feijão-chicote, feijão, lentilha, calopogônio, grão-de- bico, mandioca, batata doce, colza, algodão, beterraba, berinjela, amendoim, chá, hortelã, café, gergelim, girassol, rícino, semente de perilla, cártamo, tomate, pimenta, pepino, couve chinesa, alface, espinafre, alho, couve, mostarda-castanha, Zizania aquatica, cebolinha, abóbora-d'água, abobrinha, esponja vegetal, repolho chinês, rabanete, cebola, melancia, uva, cenoura, couve-flor, abóbora, tabaco, pasto, capim-elefante, capim-chorão, sorgo sudanense, orquídeas, lírios, tulipas e alfafa.
[067] O princípio de implementação do presente pedido é o seguinte: o princípio da apomixia no presente pedido é formar embriões diretamente e produzir sementes ignorando o processo de meiose e fertilização, que é dividido principalmente em duas grandes etapas: a primeira etapa: meiose é um processo especial de divisão celular que ocorre durante o período de reprodução de animais e plantas. Durante a meiose, as informações gênicas provenientes dos parentais serão recombinadas para produzir gametas com o número de cromossomos reduzido pela metade.
[068] Após os genes envolvidos em três estágios diferentes e importantes da meiose da planta serem mutados simultaneamente (este material com três mutações é denominado como MiMe, Mitose em vez de meiose), a meiose da planta será transformada em um processo um processo semelhante a mitose.
[069] O número de cromossomos e genótipos nas células de gametas masculinas e femininas produzidas por plantas MiMe são exatamente iguais às células somáticas. Suas progênies autofecundadas são todas tetraploides heterozigotas genotípicas, o que prova que, ao mutar três genes simultaneamente, as plantas híbridas podem contornar o processo de meiose para produzir gametas clonados cujo genótipo é consistente com as células somáticas.
[070] Etapa 2: O gene de fosfolipase específico de pólen (MATRILINEAL, MTL) atua principalmente nos gametas machos vegetais. É um gene que controla a indução de haploides. Foi clonado pela primeira vez em milho. O material indutor haploide mtl pode ser obtido eliminando o gene MTL. No processo de fertilização dupla, o genoma do gameta macho mtl no zigoto é degradado, isto é, o núcleo do espermatozoide paterno não forma um zigoto com o núcleo do ovo receptor, o que induz o núcleo do ovo haploide a se formar em semente.
[071] Portanto, ao modificar simultaneamente os quatro genes endógenos MiMe e MTL nas plantas, obtém-se um material Fixador (Fixação de híbridos) passível de apomixia, isto é, ao contornar o processo de meiose e fertilização para preservar o genoma materno, obtém-se uma planta cuja ploidia celular é diploide e cujo genótipo é exatamente igual àquele do parental Isso prova que, ao modificar simultaneamente quatro genes endógenos, as características de apomixia podem ser introduzidas em plantas híbridas para alcançar a fixação de genótipos heterozigotos.
[072] De acordo com uma modalidade comum da presente invenção, isso inclui as seguintes etapas: 1) transformar a meiose durante a formação do gameta em um processo semelhante a mitose. O estudo verificou que, quando os três genes REC8, OSD1, e PAIR1 envolvidos no estágio de meiose são nocauteados simultaneamente (este material é denominado como MiMe, Mitose em vez de meiose), o cromossomo se duplica apenas uma vez e a célula germinativa se divide uma vez em vez de se dividir duas vezes originalmente,
nos gametas resultantes, o número de cromossomos não foi reduzido pela metade e é consistente com as células somáticas. Isto é, transformar a meiose em um processo semelhante a mitose para alcançar o objetivo de dobrar os cromossomos; 2) os gametas fêmeas produzidos são estimulados por pólen que pode induzir o desenvolvimento de gametas fêmeas, isto é, os gametas fêmeas podem se desenvolver em embriões sem fusão com os cromossomos dos espermatozoides, formando sementes com genótipos exatamente iguais àqueles de células somáticas. Nocautear o gene MTL pode obter pólen que induz a produção haploide. Usando sementes híbridas como base transgênica, nocautear simultaneamente os quatro genes REC8, OSD1, PAIR1 e MTL, usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética. Os gametas fêmeas produzidos por esta planta têm a mesma ploidia cromossômica das células somáticas e devido à destruição do gene MTL, o pólen produzido pode induzir os gametas fêmeas a se desenvolverem em sementes ou plantas, de modo que as sementes ou plantas obtidas não sofram isolamento gênico (separação de características ou fertilidade) e os genótipos sejam exatamente iguais às células mãe (os materiais híbridos de base usados para transgenose) e, por fim, alcançar o objetivo de fixar a heterose.
[073] As Figuras 2 e 3 mostram claramente que o genótipo e a ploidia cromossômica da geração filial de F1 da presente invenção são consistentes com as células mãe híbridas.
[074] De acordo com uma modalidade comum, fornece-se uma planta ou semente que mantém a heterose. A planta ou semente é preparada por qualquer um dos métodos acima, a semente pode fixar bem a heterose.
[075] De acordo com uma modalidade comum, fornece-se um kit para manutenção da heterose de plantas. O kit inclui um vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose e um vetor e/ou reagente para o desenvolvimento de gametas em sementes ou plantas. Preferencialmente, o vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose e o vetor e/ou reagente para induzir partenogênese de gametas vegetais são vetores e/ou reagentes para mutagênese aleatória ou mutagênese dirigida. Em que, a mutagênese aleatória inclui mutagênese química, mutagênese física e mutagênese biológica; a mutagênese dirigida inclui tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas, tecnologia de edição gênica CRISPR/Cpf1, tecnologia de edição gênica TALEN, tecnologia de edição gênica de endonuclease de homing e tecnologia de edição gênica ZFN; a tecnologia de engenharia genética inclui a tecnologia transgênica para induzir a expressão específica, expressão ectópica ou silenciamento gênico de genes.
[076] De acordo com uma modalidade comum, o vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose é um vetor e/ou reagente usado em tecnologia de engenharia genética para suprimir proteínas envolvidas em recombinação meiótica em plantas para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose, em que as proteínas incluem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas, a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO: 13, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO: 14, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO: 15, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO: 16, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1; uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO: 17, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2;
uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO: 18, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1; uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO: 19, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2; uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO: 20, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS; uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO: 21, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1; uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO: 22, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína
P31comet, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO: 23, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO: 24, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO: 25, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8; a terceira proteína está envolvida na segunda divisão de meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em:
uma proteína OSD1 como mostrada na SEQ ID NO: 26, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1; uma proteína TAM como mostrada na SEQ ID NO: 27, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM; uma proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1.
[077] Adicionalmente, o vetor e/ou reagente para o desenvolvimento de gametas em sementes ou plantas, entre eles, incluem um vetor e/ou reagente para induzir gametas a se desenvolver em sementes ou plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética para influenciar a proteína MTL envolvida no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas, a proteína MTL é uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO: 29, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%,
60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL.
[078] Para conveniência de venda e uso, preferencialmente, o kit contém vetor e/ou reagente para nocautear simultaneamente os genes REC8, OSD1, PAIR1 e MTL em híbridos.
[079] De acordo com uma modalidade comum, fornece-se uma planta. A meiose de células germinativas da plantas é transformada em um processo semelhante a mitose de modo que possa produzir gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica sejam consistentes com híbridos; por exemplo, a meiose das células germinativas da planta é transformada em um processo semelhante a mitose de modo que possa produzir gametas cujos cromossomos ploidia e genótipo sejam consistentes com os híbridos. Preferencialmente, as plantas podem induzir os gametas a se desenvolverem em plantas ou sementes.
[080] De acordo com uma modalidade comum, a planta é uma planta geneticamente mutada ou geneticamente manipulada, as proteínas envolvidas em meiose em plantas são reguladas para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose pela mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; a proteína MTL envolvida no desenvolvimento de gametas em plantas é influenciada por mutação genética ou tecnologia de engenharia genética de modo a induzir gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas; em que as proteínas incluem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas, a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em:
uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO: 13, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO: 14, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO: 15, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO: 16, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1; uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO: 17, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2; uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO: 18, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1; uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO: 19, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2; uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO: 20, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS; uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO: 21, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1;
uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO: 22, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína P31comet, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO: 23, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO: 24, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO: 25, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8;
a terceira proteína está envolvida na segunda divisão de meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína OSD1 como mostrada na SEQ ID NO: 26, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1; uma proteína TAM como mostrada na SEQ ID NO: 27, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM; a proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1; uma proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1;
uma proteína MTL é uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO: 29, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL.
[081] Os efeitos benéficos da presente invenção serão adicionalmente ilustrados em combinação com os exemplos abaixo. Etapas ou reagentes que não são descritos em detalhes nos exemplos a seguir podem ser alcançados por meios técnicos convencionais ou reagentes convencionais na técnica. Exemplo 1
1. Neste exemplo, o híbrido F1 usado é Chunyou84, uma variedade de arroz híbrido comercial e aprovada. Chunyou84 é uma nova combinação de arroz híbrido intersubespecífico Japonica-non-indica-restaurador, cultivada usando a linhagem estéril japonica tardia de floração precoce Chunjiang 16A e a indica-Japonica tipo intermediário de ampla compatibilidade e linhagem restauradora C84. O arroz híbrido tem as vantagens de alto potencial de rendimento, alta produção de sementes, excelentes características agronômicas abrangentes, boa resistência à vento e ampla adaptabilidade etc. O material de base de transformação gênica usado neste exemplo é o calo induzido pelo sementes de F1 de arroz híbrido e não passou pelo estágio de reprodução sexuada. Portanto, o material de geração de T0 transgênico o obtido após o transgene ser consistente com a planta F1 arroz híbrido com base na base gênica.
2. Construção de vetores de nocaute multigênicos.
[082] As etapas principais são as seguintes (detalhes específicos também podem ser verificados em CN201510485573.2):
1) Construção de um único alvo SK-gRNA:
[083] Os quatro sítios a seguir foram selecionados como sítios para o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 para nocautear sítios REC8, OSD1, PAIR1 e MTL (sequência PAM indicada pelo sublinhado): sítio de nocaute de gene OSD1 (SEQ ID NO: 1):
CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG sítio de nocaute de gene PAIR1 (SEQ ID NO: 2):
AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG sítio de nocaute de gene REC8 (SEQ ID NO: 3):
CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG sítio de nocaute de gene MTL (SEQ ID NO: 4):
GGTCAACGTCGAGACCGGCAGG
[084] Duas sequências de DNA complementares foram projetadas, respectivamente: adição de GGCA antes da sequência direta e adição de AAAC antes da sequência complementar reversa; há dois sítios de restrição AarI em SK-gRNA. Após digestão com AarI, um vetor com extremidades pegajosas foi formado; após desnaturação e recozimento dos iniciadores diretos e reversos projetados da sequência alvo, T4 ligase foi ligada ao vetor intermediário SK-gRNA previamente construído para formar um único gRNA alvo; 2) A concatenação de múltiplos gRNAs e a construção do vetor de expressão binária final: usando as características de BglII e BamHI, NheI e XbaI, SalI e XhoI sendo o isocaudarner, o gRNA foi polimerizado: SK-gRNA OSD1 foi digerido com KpnI e XhoI como vetores; SK-gRNA PAIR1 foi digerido com SalI e XbaI para fornecer o fragmento de sgRNA PAIR1, SK-gRNA REC8 foi digerido com NheI e BamHI para fornecer fragmento de sgRNA REC8, e SK-gRNA MTL foi digerido com BglI e
KpnI para fornecer o fragmento de sgRNA de MTL, uma etapa rápida de polimerização de gRNA dentro dos 4 acima foi realizada; por fim, o fragmento gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL polimerizado foi digerido com KpnI e BglII, os fragmentos foram recuperados e ligados ao vetor binário pC1300-Cas9 que expressa a proteína Cas9 (entre sítios KpnI e BamHI) e, por fim, o vetor de nocaute multigene pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL dos quais os quatro genes REC8, OSD1, PAIR1 e MTL foram nocauteados simultaneamente, foi obtido e que foi usado para transgenose para preparar multi-mutante de arroz.
3. Produção de plantas transgênicas.
[085] O vetor de expressão binária de nocaute multigene pC1300- Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL foi transferido para a cepa EHA105 Agrobacterium tumefaciens por eletroporação e o vetor de expressão binária foi transferido para o calo do arroz Chunyou84 usando transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. O método específico de transformação é esterilizar os embriões de sementes de arroz híbrido Chunyou84 e, em seguida, inoculá-los no meio para induzir calos. Após 1 semana de cultura, calo embriogênico de crescimento vigoroso, amarelo claro e relativamente solto foi selecionado como o receptor de transformação. A cepa EHA105 contendo possui plasmídeo pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL foi usada para infectar calo de arroz, após cultivada no escuro a 25 °C durante 3 dias, o calo resistente e as mudas transgênicas foram triadas no meio de seleção contendo possui 50 mg/L de higromicina. As mudas transgênicas que crescem normalmente em meio de seleção de higromicina foram selecionadas.
4. Identificação de mutantes quádruplos por sequenciamento
[086] O método de biologia molecular foi usado para identificar as mutações de genes-alvo. O DNA genômico de plantas transgênicas foi extraído de uma única planta pelo método CTAB e a banda alvo foi amplificada por PCR. Par iniciador usado: OSD1-F (SEQ ID NO:5): atctccaggatgcctgaagtgag OSD1-R (SEQ ID NO:6): cctagactgctactcttgctagtgat PAIR1-F (SEQ ID NO:7): ctgtacctgtgcatctaattacag PAIR1-R (SEQ ID NO:8): ccccatcttatgtactgagcttgccag REC8-F (SEQ ID NO:9): gcgacgcttcactcgaagatca REC8-R (SEQ ID NO:10): cgccatgcctcgttgatctcaa MTL-F (SEQ ID NO:11): acagtgactagtgacaaacgatcg MTL-R (SEQ ID NO:12): gatcgcgtcagcatgatgcgtgtac
[087] Os produtos de PCR obtidos foram enviados a uma empresa de sequenciamento e OSD1-F, PAIR1-F, REC8-F, MTL-F foram utilizados como iniciadores de sequenciamento para sequenciamento. Os resultados foram alinhados com a sequência de tipo selvagem. Os resultados do sequenciamento são bimodais. A estratégia de códon degenerado foi usada para análise (http://dsdecode.scgene.com/ para análise de padrão de pico) para obter informações de mutação diretamente. Mutantes quádruplos cujos quatro genes são todos mutações bialélicas foram removidos.
5. Identificação de plantas fixadas em genótipo e ploidia na primeira geração filial. 1) Entre as plantas de primeira geração filial das plantas mutantes quádruplas identificadas, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[088] O método específico é o seguinte:
[089] Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a
1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides.
[090] A Figura 4A mostra os resultados do teste de ploidia celular da planta de geração de F1 Chunyou84; e a Figura 4B mostra os resultados do teste de ploidia celular das plantas fixadas com heterose. 2) Sequenciamento completo do genoma.
[091] As folhas de dois Chunjiang parentais 16A e C84, Chunyou84 e a primeira geração filial fixada em ploidia (4 plantas foram selecionadas aleatoriamente) foram selecionadas e o DNA foi extraído para sequenciamento completo do genoma. De acordo com os resultados do sequenciamento completo de genoma (Figura 5): há muitos genótipos homozigotos diferentes entre Chunjiang 16A e C84. Os genótipos do híbrido Chunyou84 nesses sítios estão em um estado heterozigoto com genótipos de Chunjiang 16A e C84. Os genótipos das 4 plantas testadas eram consistentes com Chunyou84 e todas eram heterozigotas. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que o genótipo era totalmente compatível com a célula mãe híbrida. Exemplo 2
1. Neste exemplo, foram usados a linhagem de manutenção Chunjiang 16B e o tipo intermediário indica-japonica de ampla compatibilidade e a linhagem restauradora C84. O material de base de transformação gênica usado neste exemplo é o calo induzido por sementes parentalas.
2. Construção de vetores de nocaute multigênicos.
[092] As principais etapas são as seguintes 1) Construção de um único alvo SK-gRNA:
[093] Os quatro sítios a seguir foram selecionados como sítios para o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 para nocautear sítios REC8, OSD1, PAIR1 e MTL (sequência PAM indicada pelo sublinhado): sítio de nocaute de gene OSD1 (SEQ ID NO: 1):
CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG sítio de nocaute de gene PAIR1 (SEQ ID NO: 2):
AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG sítio de nocaute de gene REC8 (SEQ ID NO: 3):
CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG sítio de nocaute de gene MTL (SEQ ID NO: 4):
GGTCAACGTCGAGACCGGCAGG
[094] Duas sequências de DNA complementares foram projetadas, respectivamente: adição de GGCA antes da sequência direta e adição de AAAC antes da sequência complementar reversa; há dois sítios de restrição AarI em SK-gRNA. Após digestão com AarI, um vetor com extremidades pegajosas foi formado; após desnaturação e recozimento dos iniciadores diretos e reversos projetados da sequência alvo, T4 ligase foi ligada ao vetor intermediário SK-gRNA previamente construído para formar um único gRNA alvo; 4) A concatenação de múltiplos gRNAs e a construção do vetor de expressão binária final:
usando as características de BglII e BamHI, NheI e XbaI, SalI e XhoI sendo o isocaudarner, o gRNA foi polimerizado: SK-gRNA OSD1 foi digerido com KpnI e XhoI como vetores; SK-gRNA PAIR1 foi digerido com SalI e XbaI para fornecer o fragmento de sgRNA PAIR1, SK-gRNA REC8 foi digerido com NheI e BamHI para fornecer fragmento de sgRNA REC8, e SK-gRNA MTL foi digerido com BglI e KpnI para fornecer o fragmento de sgRNA de MTL, uma etapa rápida de polimerização de gRNA dentro dos 4 acima foi realizada; por fim, o fragmento gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL polimerizado foi digerido com KpnI e BglII, os fragmentos foram recuperados e ligados ao vetor binário pC1300-Cas9 que expressa a proteína Cas9 (entre sítios KpnI e BamHI) e, por fim, o vetor de nocaute multigene pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL dos quais os quatro genes REC8, OSD1, PAIR1 e MTL foram nocauteados simultaneamente, foi obtido e que foi usado para transgenose para preparar arroz multi-mutante.
3. Produção de plantas transgênicas.
[095] O vetor de expressão binária de nocaute multigene pC1300- Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL foi transferido para a cepa Agrobacterium tumefaciens EHA105 por eletroporação e o vetor de expressão binária foi transferido para o calo de Chunjiang 16B e C84 usando transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. O método específico de transformação é esterilizar os embriões das sementes e depois inoculá-las no meio indutor de calos. Após 1 semana de cultura, calo embriogênico de crescimento vigoroso, amarelo claro e relativamente solto foi selecionado como o receptor de transformação. A cepa EHA105 contendo possui plasmídeo pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL foi usada para infectar calo de arroz, após cultivada no escuro a 25 °C durante 3 dias, o calo resistente e as mudas transgênicas foram triadas no meio de seleção contendo possui 50 mg/L de higromicina. As mudas transgênicas que crescem normalmente em meio de seleção de higromicina foram selecionadas.
4. Os materiais Chunjiang 16B e C84 cujos quatro genes são de mutação heterozigótica foram identificados por sequenciamento e, em seguida, os hibridizaram para remover plantas híbridas cujos quatro genes são mutações.
[096] O método de biologia molecular foi usado para identificar as mutações de genes-alvo. O DNA genômico de plantas transgênicas foi extraído de uma única planta pelo método CTAB e a banda alvo foi amplificada por PCR. Par iniciador usado: OSD1-F (SEQ ID NO:5): atctccaggatgcctgaagtgag OSD1-R (SEQ ID NO:6): cctagactgctactcttgctagtgat PAIR1-F (SEQ ID NO:7): ctgtacctgtgcatctaattacag PAIR1-R (SEQ ID NO:8): ccccatcttatgtactgagcttgccag REC8-F (SEQ ID NO:9): gcgacgcttcactcgaagatca REC8-R (SEQ ID NO:10): cgccatgcctcgttgatctcaa MTL-F (SEQ ID NO:11): acagtgactagtgacaaacgatcg MTL-R (SEQ ID NO:12): gatcgcgtcagcatgatgcgtgtac
[097] Os produtos de PCR obtidos foram enviados a uma empresa de sequenciamento e OSD1-F, PAIR1-F, REC8-F, MTL-F foram utilizados como iniciadores de sequenciamento para sequenciamento. Os resultados foram alinhados com a sequência do tipo selvagem para obter as informações de mutação diretamente.
[098] Após remover os materiais Chunjiang 16B e C84 com mutações heterozigotas, intercruzá-las e remover plantas híbridas com mutações bialélicas na geração de F1.
5. As sementes de plantas híbridas foram coletadas e as plantas fixadas por ploidia e genótipo foram identificadas na primeira geração filial.
1) Entre as plantas de primeira geração filial das plantas mutantes triplas identificadas, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[099] O método específico é o seguinte:
[0100] Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a
1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides. 2) Sequenciamento completo do genoma.
[0101] As folhas de dois Chunjiang parentais 16B e C84, Chunyou84 e as plantas de primeira geração filial fixada em ploidia (2 plantas foram selecionadas aleatoriamente) foram selecionadas e o DNA foi extraído para sequenciamento completo do genoma. De acordo com os resultados do sequenciamento completo de genoma: há muitos genótipos homozigotos diferentes entre Chunjiang 16B e C84. Os genótipos do híbrido Chunyou84 nesses sítios estão em um estado heterozigoto com genótipos de Chunjiang 16B e C84. Os genótipos das 2 plantas testadas eram consistentes com Chunyou84 e todas eram heterozigotas. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que o genótipo era totalmente compatível com a célula mãe híbrida. Exemplo 3
1. Neste exemplo, o híbrido F1 usado é Chunyou84, uma variedade de arroz híbrido comercial e aprovada. Chunyou84 é uma nova combinação de arroz híbrido intersubespecífico Japonica-non-indica-restaurador, cultivada usando a linhagem estéril japonica Chunjiang 16A e a indica-Japonica tipo intermediário de ampla compatibilidade e linhagem restauradora C84. O arroz híbrido tem as vantagens de alto potencial de rendimento, alta produção de sementes, excelentes características agronômicas abrangentes, boa resistência à vento e ampla adaptabilidade etc. O material de base de transformação gênica usado neste exemplo é o calo induzido pelo sementes de F1 de arroz híbrido e não passou pelo estágio de reprodução sexuada. Portanto, o material de geração de T0 transgênico o obtido após a transgene é consistente com a planta F1 arroz híbrido com base na base gênica.
2. Construção de vetores de nocaute multigênicos.
[0102] As principais etapas são as seguintes 1) Construção de um único alvo SK-gRNA:
[0103] Os três sítios a seguir foram selecionados como sítios para o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 para nocautear sítios REC8, OSD1 e PAIR1 (sequência PAM indicada pelo sublinhado): sítio de nocaute de gene OSD1 (SEQ ID NO: 1):
CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG sítio de nocaute de gene PAIR1 (SEQ ID NO: 2):
AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG sítio de nocaute de gene REC8 (SEQ ID NO: 3):
CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG
[0104] Duas sequências de DNA complementares foram projetadas, respectivamente: adição de GGCA antes da sequência direta e adição de AAAC antes da sequência complementar reversa;
há dois sítios de restrição AarI em SK-gRNA. Após digestão com AarI, um vetor com extremidades pegajosas foi formado; após desnaturação e recozimento dos iniciadores diretos e reversos projetados da sequência alvo, T4 ligase foi ligada ao vetor intermediário SK-gRNA previamente construído para formar um único gRNA alvo; 2) A concatenação de três gRNAs e a construção do vetor de expressão binária final: usando as características de BglII e BamHI, NheI e XbaI, SalI e XhoI sendo o isocaudarner, o gRNA foi polimerizado; por fim, o fragmento gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 polimerizado foi digerido com KpnI e BglII e os fragmentos foram recuperados e ligados ao vetor binário pC1300-Cas9 que expressa a proteína Cas9 (entre sítios KpnI e BamHI) e, por fim, o vetor nocaute multigene pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 dos quais os três genes REC8, OSD1 e PAIR1 foram nocauteados simultaneamente, foi obtido e que foi usado para transgenose para preparar multi-mutante de arroz.
3. Produção de plantas transgênicas.
[0105] O vetor de expressão binária de nocaute multigene pC1300- Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1-gRNA MTL foi transferido para a EHA105 cepa Agrobacterium tumefaciens (AgroBacterium tumefaciens) por eletroporação e o vetor de expressão binária foi transferido para o calo do arroz Chunyou84 usando transformação mediada por agrobacterium tumefaciens. O método específico de transformação é esterilizar os embriões de sementes de arroz híbrido Chunyou84 e, em seguida, inoculá-los no meio para induzir calos. Após 1 semana de cultura, calo embriogênico de crescimento vigoroso, amarelo claro e relativamente solto foi selecionado como o receptor de transformação. A cepa EHA105 contendo possui plasmídeo pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 foi usada para infectar calo de arroz, após cultivada no escuro a 25 °C durante 3 dias, o calo resistente e as mudas transgênicas foram triadas no meio de seleção contendo possui 50 mg/L de higromicina. As mudas transgênicas que crescem normalmente em meio de seleção de higromicina foram selecionadas.
4. Identificação de mutantes triplos por Sequenciamento
[0106] O método de biologia molecular foi usado para identificar as mutações de genes-alvo. O DNA genômico de plantas transgênicas foi extraído de uma única planta pelo método CTAB e a banda alvo foi amplificada por PCR. Par iniciador usado: OSD1-F (SEQ ID NO:5): atctccaggatgcctgaagtgag OSD1-R (SEQ ID NO:6): cctagactgctactcttgctagtgat PAIR1-F (SEQ ID NO:7): ctgtacctgtgcatctaattacag PAIR1-R (SEQ ID NO:8): ccccatcttatgtactgagcttgccag REC8-F (SEQ ID NO:9): gcgacgcttcactcgaagatca REC8-R (SEQ ID NO:10): cgccatgcctcgttgatctcaa
[0107] Os produtos de PCR obtidos foram enviados a uma empresa de sequenciamento e OSD1-F, PAIR1-F, e REC8-F foram utilizados como iniciadores de sequenciamento para sequenciamento. Os resultados foram alinhados com a sequência de tipo selvagem. Os resultados do sequenciamento são bimodais. A estratégia de códon degenerado foi usada para análise (http://dsdecode.scgene.com/ para análise de padrão de pico) para obter informações de mutação diretamente.
[0108] Entre estes, os mutantes com mutações bialélicas nesses 3 sítios são plantas que podem produzir gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com células somáticas.
5. Usando o mutante triplo como parental fêmea, o pólen proveniente de outra planta indutora de haploide foi polinizada para induzir os gametas fêmeas a se desenvolverem em sementes, e um grande número de híbridos que mantiveram a heterose foram obtidos.
6. Identificação de plantas fixadas em genótipo e ploidia na primeira geração filial. 1) Entre as plantas de primeira geração filial das plantas mutantes triplas identificadas, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[0109] O método específico é o seguinte: Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a 1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides. 2) Sequenciamento completo do genoma.
[0110] As folhas de dois Chunjiang parentais 16A e C84, Chunyou84 e a primeira geração filial fixada em ploidia (4 plantas foram selecionadas aleatoriamente) foram selecionadas e o DNA foi extraído para sequenciamento completo do genoma. De acordo com os resultados do sequenciamento completo de genoma: há muitos genótipos homozigotos diferentes entre Chunjiang 16A e C84. Os genótipos do híbrido Chunyou84 nesses sítios estão em um estado heterozigoto com genótipos de Chunjiang 16A e C84. Os genótipos das 4 plantas testadas eram consistentes com Chunyou84 e todas eram heterozigotas. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que o genótipo era totalmente compatível com a célula mãe híbrida. Exemplo 4
1. Neste exemplo, o híbrido F1 usado é Chunyou84, uma variedade de arroz híbrido comercial e aprovada. Chunyou84 é uma nova combinação de arroz híbrido intersubespecífico Japonica-non-indica-restaurador, cultivada usando a linhagem estéril japonica Chunjiang 16A e a indica-Japonica tipo intermediário de ampla compatibilidade e linhagem restauradora C84. O arroz híbrido tem as vantagens de alto potencial de rendimento, alta produção de sementes, excelentes características agronômicas abrangentes, boa resistência à vento e ampla adaptabilidade etc. O material de base de transformação gênica usado neste exemplo é o calo induzido pelo sementes de F1 de arroz híbrido e não passou pelo estágio de reprodução sexuada. Portanto, o material de geração de T0 transgênico o obtido após a transgene é consistente com a planta F1 arroz híbrido com base na base gênica.
2. Construção de vetores de nocaute multigênicos.
[0111] As principais etapas são as seguintes 1) Construção de um único alvo SK-gRNA:
[0112] Os três sítios a seguir foram selecionados como sítios para o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 para nocautear sítios REC8, OSD1 e PAIR1 (sequência PAM indicada pelo sublinhado): sítio de nocaute de gene OSD1 (SEQ ID NO: 1):
CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG sítio de nocaute de gene PAIR1 (SEQ ID NO: 2):
AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG sítio de nocaute de gene REC8 (SEQ ID NO: 3):
CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG
[0113] Duas sequências de DNA complementares foram projetadas, respectivamente: adição de GGCA antes da sequência direta e adição de AAAC antes da sequência complementar reversa; há dois sítios de restrição AarI em SK-gRNA. Após digestão com AarI, um vetor com extremidades pegajosas foi formado; após desnaturação e recozimento dos iniciadores diretos e reversos projetados da sequência alvo, T4 ligase foi ligada ao vetor intermediário SK-gRNA previamente construído para formar um único gRNA alvo; 2) A concatenação de três gRNAs e a construção do vetor de expressão binária final: usando as características de BglII e BamHI, NheI e XbaI, SalI e XhoI sendo o isocaudarner, o gRNA foi polimerizado; por fim, o fragmento gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 polimerizado foi digerido com KpnI e BglII e os fragmentos foram recuperados e ligados ao vetor binário pC1300-Cas9 que expressa a proteína Cas9 (entre sítios KpnI e BamHI) e, por fim, o vetor nocaute multigene pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 dos quais os três genes REC8, OSD1 e PAIR1 foram nocauteados simultaneamente, foi obtido e que foi usado para transgenose para preparar multi-mutante de arroz.
3. Produção de plantas transgênicas.
[0114] O vetor de expressão binária de nocaute multigene pC1300- Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 foi transferido para a EHA105 cepa Agrobacterium tumefaciens (AgroBacterium tumefaciens) por eletroporação e o vetor de expressão binária foi transferido para o calo do arroz Chunyou84 usando transformação mediada por agrobacterium tumefaciens. O método específico de transformação é esterilizar os embriões de sementes de arroz híbrido Chunyou84 e, em seguida, inoculá-los no meio para induzir calos. Após 1 semana de cultura, calo embriogênico de crescimento vigoroso, amarelo claro e relativamente solto foi selecionado como o receptor de transformação. A cepa EHA105 contendo possui plasmídeo pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 foi usada para infectar calo de arroz, após cultivada no escuro a 25 °C durante 3 dias, o calo resistente e as mudas transgênicas foram triadas no meio de seleção contendo possui 50 mg/L de higromicina. As mudas transgênicas que crescem normalmente em meio de seleção de higromicina foram selecionadas.
4. Identificação de mutantes triplos por Sequenciamento
[0115] O método de biologia molecular foi usado para identificar as mutações de genes-alvo. O DNA genômico de plantas transgênicas foi extraído de uma única planta pelo método CTAB e a banda alvo foi amplificada por PCR. Par iniciador usado: OSD1-F (SEQ ID NO:5): atctccaggatgcctgaagtgag OSD1-R (SEQ ID NO:6): cctagactgctactcttgctagtgat PAIR1-F (SEQ ID NO:7): ctgtacctgtgcatctaattacag PAIR1-R (SEQ ID NO:8): ccccatcttatgtactgagcttgccag REC8-F (SEQ ID NO:9): gcgacgcttcactcgaagatca REC8-R (SEQ ID NO:10): cgccatgcctcgttgatctcaa
[0116] Os produtos de PCR obtidos foram enviados a uma empresa de sequenciamento e OSD1-F, PAIR1-F, e REC8-F foram utilizados como iniciadores de sequenciamento para sequenciamento. Os resultados foram alinhados com a sequência de tipo selvagem. Os resultados do sequenciamento são bimodais. A estratégia de códon degenerado foi usada para análise (http://dsdecode.scgene.com/ para análise de padrão de pico) para obter informações de mutação diretamente.
[0117] Entre estes, os mutantes com mutações bialélicas nesses 3 sítios são plantas que podem produzir gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com células somáticas.
5. Após o desenvolvimento dos mutantes triplos até um certo estágio, as anteras ou pólens foram retiradas por operação asséptica, respectivamente, e inoculadas no meio de anteras configurado artificialmente para induzir a formação de calos, sendo então as plantas obtidas por meio de cultura de tecidos.
6. Identificação de plantas fixadas com genótipo e ploidia nas plantas de cultura de tecidos. 1) Entre as plantas de primeira geração filial das plantas mutantes triplas identificadas, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[0118] O método específico é o seguinte:
[0119] Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a
1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides. 2) Sequenciamento completo do genoma.
[0120] As folhas de dois Chunjiang parentais 16A e C84, Chunyou84 e a primeira geração filial fixada em ploidia (4 plantas foram selecionadas aleatoriamente) foram selecionadas e o DNA foi extraído para sequenciamento completo do genoma. De acordo com os resultados do sequenciamento completo de genoma: há muitos genótipos homozigotos diferentes entre Chunjiang 16A e C84. Os genótipos do híbrido Chunyou84 nesses sítios estão em um estado heterozigoto com genótipos de Chunjiang 16A e C84. Os genótipos das 4 plantas testadas eram consistentes com Chunyou84 e todas eram heterozigotas. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que o genótipo era totalmente compatível com a célula mãe híbrida. Exemplo 5
1. Neste exemplo, o híbrido F1 usado é Chunyou84, uma variedade de arroz híbrido comercial e aprovada. Chunyou84 é uma nova combinação de arroz híbrido intersubespecífico Japonica-non-indica-restaurador, cultivada usando a linhagem estéril japonica Chunjiang 16A e a indica-Japonica tipo intermediário de ampla compatibilidade e linhagem restauradora C84. O arroz híbrido tem as vantagens de alto potencial de rendimento, alta produção de sementes, excelentes características agronômicas abrangentes, boa resistência à vento e ampla adaptabilidade etc. O material de base de transformação gênica usado neste exemplo é o calo induzido pelo sementes de F1 de arroz híbrido e não passou pelo estágio de reprodução sexuada. Portanto, o material de geração de T0 transgênico o obtido após a transgene é consistente com a planta F1 arroz híbrido com base na base gênica.
2. Construção de vetores de nocaute multigênicos.
[0121] As principais etapas são as seguintes 1) Construção de um único alvo SK-gRNA:
[0122] Os três sítios a seguir foram selecionados como sítios para o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 para nocautear sítios REC8, OSD1 e PAIR1 (sequência PAM indicada pelo sublinhado):
sítio de nocaute de gene OSD1 (SEQ ID NO: 1):
CTGCCGCCGACGAGCAACAAGG sítio de nocaute de gene PAIR1 (SEQ ID NO: 2):
AAGCAACCCAGTGCACCGCTGG sítio de nocaute de gene REC8 (SEQ ID NO: 3):
CCCATGGCACTAAGGCTCTCCG
[0123] Duas sequências de DNA complementares foram projetadas, respectivamente: adição de GGCA antes da sequência direta e adição de AAAC antes da sequência complementar reversa; há dois sítios de restrição AarI em SK-gRNA. Após digestão com AarI, um vetor com extremidades pegajosas foi formado; após desnaturação e recozimento dos iniciadores diretos e reversos projetados da sequência alvo, T4 ligase foi ligada ao vetor intermediário SK-gRNA previamente construído para formar um único gRNA alvo; 2) A concatenação de três gRNAs e a construção do vetor de expressão binária final: usando as características de BglII e BamHI, NheI e XbaI, SalI e XhoI sendo o isocaudarner, o gRNA foi polimerizado; por fim, o fragmento gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 polimerizado foi digerido com KpnI e BglII e os fragmentos foram recuperados e ligados ao vetor binário pC1300-Cas9 que expressa a proteína Cas9 (entre sítios KpnI e BamHI) e, por fim, o vetor nocaute multigene pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 dos quais os três genes REC8, OSD1 e PAIR1 foram nocauteados simultaneamente, foi obtido e que foi usado para transgenose para preparar multi-mutante de arroz.
3. Produção de plantas transgênicas.
[0124] O vetor de expressão binária de nocaute multigene pC1300- Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8-gRNA PAIR1 foi transferido para a EHA105 cepa
Agrobacterium tumefaciens (AgroBacterium tumefaciens) por eletroporação e o vetor de expressão binária foi transferido para o calo do arroz Chunyou84 usando transformação mediada por agrobacterium tumefaciens. O método específico de transformação é esterilizar os embriões de sementes de arroz híbrido Chunyou84 e, em seguida, inoculá-los no meio para induzir calos. Após 1 semana de cultura, calo embriogênico de crescimento vigoroso, amarelo claro e relativamente solto foi selecionado como o receptor de transformação. A cepa EHA105 contendo plasmídeo pC1300-Cas9-gRNA OSD1-gRNA REC8- gRNA PAIR1 foi usada para infectar calo de arroz, após cultivada no escuro a 25 °C durante 3 dias, o calo resistente e as mudas transgênicas foram triadas no meio de seleção contendo 50 mg/L de higromicina. As mudas transgênicas que crescem normalmente em meio de seleção de higromicina foram selecionadas.
4. Identificação de mutantes triplos por Sequenciamento
[0125] O método de biologia molecular foi usado para identificar as mutações de genes-alvo. O DNA genômico de plantas transgênicas foi extraído de uma única planta pelo método CTAB e a banda alvo foi amplificada por PCR. Par iniciador usado: OSD1-F (SEQ ID NO:5): atctccaggatgcctgaagtgag OSD1-R (SEQ ID NO:6): cctagactgctactcttgctagtgat PAIR1-F (SEQ ID NO:7): ctgtacctgtgcatctaattacag PAIR1-R (SEQ ID NO:8): ccccatcttatgtactgagcttgccag REC8-F (SEQ ID NO:9): gcgacgcttcactcgaagatca REC8-R (SEQ ID NO:10): cgccatgcctcgttgatctcaa
[0126] Os produtos de PCR obtidos foram enviados a uma empresa de sequenciamento e OSD1-F, PAIR1-F, e REC8-F foram utilizados como iniciadores de sequenciamento para sequenciamento. Os resultados foram alinhados com a sequência de tipo selvagem. Os resultados do sequenciamento são bimodais.
A estratégia de códon degenerado foi usada para análise (http://dsdecode.scgene.com/ para análise de padrão de pico) para obter informações de mutação diretamente.
[0127] Entre estes, os mutantes com mutações bialélicas nesses 3 sítios são plantas que podem produzir gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com células somáticas.
5. Partenogênese induzida quimicamente
[0128] O material de arroz que nocauteou simultaneamente os três genes de REC8, OSD1 e PAIR1 foi levado. Antes da floração do arroz, foi realizada a emasculação por gluma de corte de acordo com a técnica geral de hibridização e, em seguida, as espigas de arroz foram imersas na solução de tratamento de 5-50 mg/L de hidrazida maleica ou 2-20 mg/L de 6-benzilamino adenina durante 2 a 3 minutos, ensacando firmemente para impedir a entrada de pólen. Vinte dias após o tratamento, embriões imaturos ou grãos foram retirados e cultivados para obtenção de plantas partenogênicas.
6. Identificação de plantas fixadas em genótipo e ploidia na primeira geração filial. 1) Entre as plantas de primeira geração filial das plantas mutantes triplas identificadas, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[0129] O método específico é o seguinte:
[0130] Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a
1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides. 2) Sequenciamento completo do genoma.
[0131] As folhas de dois Chunjiang parentais 16A e C84, Chunyou84 e a primeira geração filial fixada em ploidia (4 plantas foram selecionadas aleatoriamente) foram selecionadas e o DNA foi extraído para sequenciamento completo do genoma. De acordo com os resultados do sequenciamento completo de genoma: há muitos genótipos homozigotos diferentes entre Chunjiang 16A e C84. Os genótipos do híbrido Chunyou84 nesses sítios estão em um estado heterozigoto com genótipos de Chunjiang 16A e C84. Os genótipos das 4 plantas testadas eram consistentes com Chunyou84 e todas eram heterozigotas. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que o genótipo era totalmente compatível com a célula mãe híbrida. Exemplo 6
1. Mutagênese mutante e triagem
[0132] Na variedade de soja Zhonghuang39, através de mutagênese EMS, as progênies foram triadas por tecnologia de sequenciamento de alto rendimento para obter plantas cujos REC8 e OSD1 são mutações heterozigóticas, respectivamente. Através da hibridização entre plantas heterozigóticas e da triagem de progênies, plantas cujos REC8 e OSD1 são mutações heterozigóticas foram obtidas; na variedade de soja Qihuang34, através de mutagênese EMS, as progênies foram triados por tecnologia de sequenciamento de alto rendimento para obter plantas cujos SPO11-1 e CENH3 são mutações heterozigóticas, respectivamente. Através da hibridização entre plantas heterozigóticas e de triagem de progênies, plantas cujos SPO11-1 e
CENH3 são mutações heterozigóticas foram obtidas; as plantas cujo REC8 e OSD1 são mutações heterozigotas e as plantas cujos SPO11-1 e CENH3 são mutações heterozigotas foram hibridizadas, as progênies foram triadas para obter plantas cujos quatro genes são mutações heterozigotas.
2. Construção de vetor transgênico
[0133] Um vetor binário com EC1.2oócito expresso especificamente para conduzir a expressão de CENH3 de tipo selvagem foi construído e o vetor foi transformado em plantas cujos quatro genes são todos mutações heterozigotas; as progênies de plantas autofecundadas foram identificadas e triadas para obter uma única planta cujo genes REC8, OSD1, SPO11-1 e CENH3 são todos mutações homozigóticas e tem Ec1.2:: Componentes transgênicos CenH3, as sementes autofecundadas da planta foram coletadas.
3. Identificação de plantas fixadas em genótipo e ploidia na primeira geração filial. 1) Entre as plantas de primeira geração filial, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[0134] O método específico é o seguinte:
[0135] Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a
1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides.
2) Teste de genótipo.
[0136] A progênie fixada em ploidia (4 plantas foram selecionadas aleatoriamente) e as folhas das plantas da geração anterior foram selecionadas para extrair DNA; 16 sítios heterozigotos foram selecionados aleatoriamente a partir dos materiais híbridos da geração anterior e os iniciadores de detecção foram projetados. O teste do genótipo foi realizado nas plantas da primeira geração filial e verificou-se que os genótipos das 4 plantas em 16 sítios eram exatamente iguais àqueles da geração anterior, isto é, todos eram heterozigotos. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que o genótipo heterozigoto não sofreu recombinação ou separação. Exemplo 7
1. Neste exemplo, o híbrido F1 usado é o híbrido de milho Jiahe158, o qual é uma combinação de LD140 × LD975.
2. Construção de vetores de nocaute multigênicos.
[0137] As principais etapas são as seguintes 1) Construção de um único alvo SK-gRNA:
[0138] Os quatro sítios a seguir foram selecionados como sítios para o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 para nocautear sítios REC8, OSD1, PAIR1 e MTL de milho (sequência PAM indicada pelo sublinhado): sítio de nocaute de gene OSD1Zm (SEQ ID NO: 30):
TCTGCCTGTACTGGAGTTATTGG sítio de nocaute de gene PAIR1Zm (SEQ ID NO: 31):
GGATTGCTGCGACAGCGGCTGGG sítio de nocaute de gene REC8Zm (SEQ ID NO: 32):
GGAAGTCCCACGAGTAATTATGG sítio de nocaute de gene MTLZm (SEQ ID NO: 33):
GGAAGGCGAGGATGGTTCCCGGG
2) A concatenação de múltiplos gRNAs e a construção do vetor de expressão binária final: usando as características de BglII e BamHI, NheI e XbaI, SalI e XhoI sendo o isocaudarner, o gRNA foi polimerizado: SK-gRNA ZmOSD1 foi digerido com KpnI e XhoI como vetores; SK-gRNA ZmPAIR1 foi digerido com KpnI e XhoI para fornecer o fragmento de ZmPAIR1 sgRNA, SK-gRNA ZmREC8 foi digerido com NheI e BamHI para fornecer fragmento de sgRNA ZmREC8, e SK-gRNA ZmMTL foi digerido com BglI e KpnI para fornecer o fragmento de ZmREC8 sgRNA, uma etapa rápida de polimerização de gRNA dentro dos 4 acima foi realizada; por fim, o fragmento gRNA ZmOSD1-gRNA ZmREC8-gRNA ZmPAIR1-gRNA ZmMTL polimerizado foi digerido com KpnI e BglII, os fragmentos foram recuperados e ligados ao vetor binário pC1300-Cas9 que expressa a proteína Cas9 (entre sítios KpnI e BamHI) e, por fim, o vetor de nocaute multigene pC1300-Cas9-gRNA ZmOSD1-gRNA ZmREC8-gRNA ZmPAIR1-gRNA ZmMTL dos quais os quatro genes REC8, OSD1, PAIR1 e MTL de milho foram nocauteados simultaneamente, foi obtido e que foi usado para transgenose para preparar milho multi-mutante.
3. Produção de plantas transgênicas.
[0139] O vetor de nocaute multigene de milho obtido na etapa anterior foi transferido para LBA4404 cepa Agrobacterium tumefaciens por eletroporação e este vetor de expressão binária foi transferido para o calo do híbrido de milho Jiahe158 por transformação mediada por agrobacterium tumefaciens. Após o milho ser polinizado, ele foi ensacado artificialmente durante 9-12 dias, as espigas fêmeas foram retiradas e descascadas das brácteas e borrifadas com álcool 75% quando cada bráctea era descascada para desinfetar a superfície, um tamanho de 1,0- 1,2 mm de embriões imaturos foram colhidos sob a bancada limpa com uma lâmina, em seguida, colocados em solução hiperosmótica para uso posterior e o tempo na solução hiperosmótica não deve ultrapassar 1 hora. Quando Agrobacterium tumefaciens foi cultivada para um valor de OD600 de 0,8, as bactérias foram coletadas por centrifugação, usando 1 mol/L de suspensão, após ressuspensa, acetoseringona foi adicionada a uma concentração final de 200 μmol/L, esta solução bacteriana foi usada para infectar os embriões imaturos durante 5 minutos, em seguida a mistura foi transferida para um meio de cocultura e cultivada no escuro a 25 °C durante 7 dias. Os embriões imaturos foram transferidos para um meio de seleção contendo possui 15 mg/L de higromicina e um meio de regeneração no período posterior para fazer a triagem de calos resistentes e plantas transgênicas.
4. Identificação de mutantes quádruplos por sequenciamento
[0140] O método CTAB foi usado para extrair DNA genômico de milho transgênico a partir de uma única planta e Hi-Tom foi usado para identificar a mutação do gene alvo (detalhes específicos podem ser verificados em CN201710504178.3).
5. Identificação de plantas de milho fixadas em genótipo e ploidia na primeira geração filial. 1) Entre as plantas de primeira geração filial dos milhos mutantes quádruplos identificados, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[0141] O método específico é o seguinte:
[0142] Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a
1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides. 2) Sequenciamento completo do genoma.
[0143] As folhas de dois parentais LD140 e LD975, Jiahe158 e as plantas de milho de primeira geração filial fixadas em ploidia foram testadas e o DNA foi extraído para sequenciamento completo de genoma. Os genótipos das plantas de milho da primeira geração filial testados eram consistentes com Jiahe158 e são todos heterozigotos. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que os genótipos eram totalmente consistentes com as células mãe híbridas. Exemplo 8
1. Neste exemplo, o híbrido F1 usado é o híbrido de tomate Elisa, o parental fêmea é a linhagem consanguínea tolerante a baixa temperatura “Syi2-4” e o parental macho é a linhagem consanguínea resistente a doenças de alta qualidade “S28”.
2. Construção de vetores de nocaute multigênicos.
[0144] As principais etapas são as seguintes 1) Construção de um único alvo SK-gRNA:
[0145] Os quatro sítios a seguir foram selecionados como sítios para o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 para nocautear sítios REC8, OSD1, SPO11 e MTL de tomate (sequência PAM indicada pelo sublinhado): sítio de nocaute de gene OSD1Sl (SEQ ID NO: 34):
CAGAAGCAGGGAGAATGGCAGG sítio de nocaute de gene SPO11Sl (SEQ ID NO: 35):
TGAGGATCTCGCTCGAGGTAGG sítio de nocaute de gene REC8Sl (SEQ ID NO: 36):
GCACAGGAGGAACCTGCTAAGG sítio de nocaute de gene MTLSl (SEQ ID NO: 37):
TGATTGCCGGAACGAGCACCGG 2) A concatenação de múltiplos gRNAs e a construção do vetor de expressão binária final: usando as características de BglII e BamHI, NheI e XbaI, SalI e XhoI sendo o isocaudarner, o gRNA foi polimerizado: SK-gRNA SlOSD1 foi digerido com KpnI e XhoI como vetores; SK-gRNA SlSPO11 foi digerido com SalI e XbaI para fornecer o fragmento de SlSPO11 sgRNA, SK-gRNA SlREC8 foi digerido com NheI e BamHI para fornecer fragmento de SlREC8 sgRNA, e SK-gRNA SlMTL foi digerido com BglI e KpnI para fornecer o fragmento de SlMTL sgRNA, uma etapa rápida de polimerização de gRNA dentro dos 4 acima foi realizada; por fim, o fragmento gRNA SlOSD1-gRNA SlREC8-gRNA SlPAIR1-gRNA SlMTL polimerizado foi digerido com KpnI e BglII, os fragmentos foram recuperados e ligados ao vetor binário pC1300-Cas9 que expressa a proteína Cas9 (entre sítios KpnI e BamHI) e, por fim, o vetor de nocaute multigene pC1300-Cas9-gRNA SlOSD1-gRNA SlREC8-gRNA SlSPO11-gRNA SlMTL dos quais os quatro genes REC8, OSD1, SPO11 e MTL de tomate foram nocauteados simultaneamente, foi obtido e que foi usado para transgenose para preparar tomate multi-mutante.
3. Produção de plantas transgênicas.
[0146] O vetor nocaute multigene de tomate obtido na etapa anterior foi transferido para EHA105 cepa Agrobacterium tumefaciens por eletroporação através do método de disco foliar e esse vetor de expressão binária foi transferido para o calo do híbrido de tomate Elisa por transformação mediada por agrobacterium tumefaciens.
[0147] As sementes de tomate foram tratadas assepticamente e semeadas em meio 1/2 MS, cultivadas no escuro durante 2-3 dias, após a germinação, cultivadas sob luz. Após 10-12 dias, quando os cotilédones das mudas estavam totalmente expandidos, mas nenhuma folha verdadeira foi formada, os cotilédones foram selecionados como explantes, as duas extremidades dos cotilédones foram cortadas, a parte do meio foi dividida em duas horizontalmente, e os pedaços pequenos eram os discos foliares. Os discos foliares foram inoculados em meio de pré-cultivo com as folhas voltadas para cima e pré-cultivados durante 2 dias. O disco foliar cotilédone pré- cultivado foi embebido com a solução de bactéria agrobacterium tumefaciens preparada, a qual foi totalmente infiltrada durante 5 minutos, o disco foliar foi devidamente blotado com papel de filtro estéril, com o verso da folha voltado para cima, cultivado no escuro durante 48-72 horas a uma temperatura de cultura de 28 °C. Os discos foliares cocultivados com agrobacterium tumefaciens foram transferidos para meio estéril e cultivados sob luz. Após 5 dias, os discos foliares foram transferidos ao meio de triagem e transferidos uma vez a cada 14 dias. Quando o botão resistente cresceu cerca de 2 cm, foi cortado do explante e transferido ao meio de enraizamento. Após o sistema de raiz se desenvolver, foi transplantado ao solo.
4. Identificação de mutantes quádruplos por sequenciamento
[0148] O método CTAB foi usado para extrair DNA genômico de tomate transgênico a partir de uma única planta e Hi-Tom foi usado para identificar a mutação do gene alvo (detalhes específicos podem ser verificados em CN201710504178.3).
5. Identificação de plantas de tomate fixadas em genótipo e ploidia na primeira geração filial. 1) Entre as plantas de primeira geração filial dos tomates mutantes quádruplos identificados, a citometria de fluxo foi usada para fazer a triagem da ploidia celular e foram obtidas as plantas com a mesma ploidia celular das plantas parentalas.
[0149] O método específico é o seguinte: Uma certa quantidade de tecido vegetal foi colocada em uma placa de Petri de vidro, 1-2 mL de tampão de lise vegetal LB01 foi adicionado, o mesmo foi picado com uma lâmina (esta operação foi sempre realizada em gelo); a solução de dissociação na placa de Petri foi aspirada e filtrada através de uma rede de náilon de 50 μm em um tubo de centrífuga; centrifugado a 1.200 rpm, 4 °C durante 5 min; o sobrenadante foi descartado, 450 μL de LB01 foram adicionados, o qual foi corado com 25 μL de PI pré-resfriado (1 mg/mL) e RNase A (1 mg/mL) durante 10 min no escuro, testado na máquina para remover plantas diploides. 2) Sequenciamento completo do genoma.
[0150] As folhas de dois parentais “Syi2-4” e “S28”, o híbrido de tomate Elisa e as plantas de tomate de primeira geração filial fixadas em ploidia foram testadas e o DNA foi extraído para sequenciamento completo de genoma. Os genótipos das plantas de tomate da primeira geração filial testados eram consistentes com Elisa e são todos heterozigotos. Do ponto de vista da biologia molecular, comprovou-se que os genótipos eram totalmente consistentes com as células mãe híbridas.
[0151] Além disso, todos os vetores e reagentes usados neste exemplo estão inclusos no kit deste exemplo.
[0152] A descrição acima é apenas a modalidade preferencial da presente invenção, não se destina a limitar a presente invenção e várias modificações e mudanças podem ser feitas na presente invenção para os técnicos no assunto.
Qualquer modificação, substituição equivalente, melhoria e semelhantes feitas dentro do espírito e princípio da presente invenção devem ser incluídos no escopo de proteção da presente invenção.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para manutenção da heterose de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: S1, transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose para obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; e S2, influenciar e se envolver no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas, usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação genética compreende mutagênese aleatória e mutagênese dirigida; em que a mutagênese aleatória compreende mutagênese química, mutagênese física e mutagênese biológica; a mutagênese dirigida compreende tecnologia de edição gênica, em que a tecnologia de edição gênica compreende tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas, tecnologia de edição gênica CRISPR/Cpf1, tecnologia de edição gênica TALEN, tecnologia de edição gênica de endonuclease de homing e tecnologia de edição gênica ZFN; e em que a tecnologia de engenharia genética compreende a tecnologia transgênica para induzir a expressão específica, expressão ectópica ou silenciamento gênico de genes.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a S1 compreende obter sementes híbridas, transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose para obter gametas cujo genótipo e ploidia cromossômica são consistentes com híbridos usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a S1 compreende editar o parental das sementes híbridas usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética e, em seguida, obter o híbrido através de hibridização interparental, de modo a obter gametas híbridos cuja meiose de células germinativas é transformada em um processo semelhante a mitose.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a S1 compreende editar proteínas envolvidas na meiose em plantas para realizar a transformação da meiose de células germinativas em um processo semelhante a mitose usando mutação genética ou tecnologia de engenharia genética; em que as proteínas compreendem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas: a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA, e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO: 13, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO: 14, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO: 15, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO: 16, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1; uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO: 17, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2; uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO: 18, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1; uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO: 19, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%,
55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2; uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO: 20, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS; uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO: 21, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1; uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO: 22, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína P31comet, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO: 23, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO: 24, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada partir do grupo que consiste em: uma proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO: 25, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8; a terceira proteína está envolvida na segunda divisão da meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína OSD1 como mostrada na SEQ ID NO: 26, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1; uma proteína TAM como mostrada na SEQ ID NO: 27, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%,
55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM; uma proteína TDM1 como mostrada na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a S2 compreende influenciar e se envolver no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas e induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a S2 compreende a polinização de pólen induzido de outras plantas para induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a S2 compreende induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas através de estimulação física, estresse biótico ou tratamento com agente químico.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a S2 compreende induzir os gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas através de cultura de anteras ou cultura de pólen.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma proteína envolvida na S2 é a proteína MTL.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína MTL é uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO:
29, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas compreendem plantas monocotiledôneas e plantas dicotiledôneas.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas compreendem arroz, milho, sorgo, milhete, cevada, trigo, centeio, aveia, trigo sarraceno, semente de coix, cana-de-açúcar, aspargos, brotos de bambu, cebola nirá, inhame, soja, batata, ervilhas, feijão mungo, feijão azuki, fava, feijão-chicote, feijão, lentilha, calopogônio, grão-de-bico, mandioca, batata doce, colza, algodão, beterraba, berinjela, amendoim, chá, hortelã, café, gergelim, girassol, rícino, semente de perilla, cártamo, tomate, pimenta, pepino, couve chinesa, alface, espinafre, alho, couve, mostarda-castanha, zizania aquatica, cebolinha, abóbora-d'água, abobrinha, esponja vegetal, repolho chinês, rabanete, cebola, melancia, uva, cenoura, couve-flor, abóbora, tabaco, pasto, capim-elefante, capim- chorão, sorgo sudanense, orquídeas, lírios, tulipas e alfafa.
14. Kit para manutenção da heterose de plantas para uso no método definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose, e um vetor e/ou reagente para o desenvolvimento de gametas em sementes ou plantas.
15. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose é um vetor e/ou reagente usado em mutação genética ou tecnologia de engenharia genética para transformar a meiose de células germinativas de híbridos em um processo semelhante a mitose, preferencialmente o vetor e/ou reagente é um vetor e/ou reagente para mutagênese aleatória ou mutagênese dirigida.
16. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a mutagênese aleatória compreende mutagênese química, mutagênese física e mutagênese biológica; em que a mutagênese dirigida compreende a tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas, tecnologia de edição gênica CRISPR/Cpf1, tecnologia de edição gênica TALEN, tecnologia de edição gênica de endonuclease de homing e tecnologia de edição gênica ZFN; e em que a tecnologia de engenharia genética compreende a tecnologia transgênica para induzir a expressão específica, expressão ectópica ou silenciamento gênico de genes.
17. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o vetor e/ou reagente capaz de transformar a meiose de células germinativas em plantas em um processo semelhante a mitose é um vetor e/ou reagente usado em mutação genética ou tecnologia de engenharia genética para editar proteínas envolvidas em meiose em plantas para realizar a transformação de meiose de células germinativas em um processo semelhantes a mitose, em que as proteínas compreendem uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína, entre elas: a primeira proteína é uma proteína envolvida na formação de quebra de fita dupla de DNA, e a primeira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em:
uma proteína PAIR1 como mostrada na SEQ ID NO: 13, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR1; uma proteína PAIR2 como mostrada na SEQ ID NO: 14, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR2; uma proteína PAIR3 como mostrada na SEQ ID NO: 15, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PAIR3, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PAIR3; uma proteína PRD1 como mostrada na SEQ ID NO: 16, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD1; uma proteína PRD2 como mostrada na SEQ ID NO: 17, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína PRD2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína PRD2; uma proteína SPO11-1 como mostrada na SEQ ID NO: 18, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-1; uma proteína SPO11-2 como mostrada na SEQ ID NO: 19, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SPO11-2, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SPO11-2; uma proteína SDS como mostrada na SEQ ID NO: 20, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína SDS, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína SDS; uma proteína CRC1 como mostrada na SEQ ID NO: 21, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína CRC1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína CRC1;
uma proteína P31comet como mostrada na SEQ ID NO: 22, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína P31comet, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína P31comet; uma proteína MTOPVIB como mostrada na SEQ ID NO: 23, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTOPVIB, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTOPVIB; uma proteína DFO como mostrada na SEQ ID NO: 24, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína DFO, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína DFO; a segunda proteína está envolvida no controle da adesão entre os cromossomos irmãos durante a meiose, e a segunda proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína REC8 como mostrada na SEQ ID NO: 25, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína REC8, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína REC8;
a terceira proteína está envolvida na segunda divisão da meiose, e a terceira proteína é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma proteína OSD1 como mostrado na SEQ ID NO: 26, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína OSD1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína OSD1; uma proteína TAM como mostrado na SEQ ID NO: 27, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TAM, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TAM; uma proteína TDM1 como mostrado na SEQ ID NO: 28, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína TDM1, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína TDM1.
18. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o vetor e/ou reagente para o desenvolvimento de gametas em sementes ou plantas compreende, entre eles, um vetor e/ou reagente para induzir gametas a se desenvolverem em sementes ou plantas usando mutação genética e tecnologia de engenharia genética para influenciar a proteína MTL envolvida no desenvolvimento de gametas ou embriões em plantas, em que a proteína MTL é uma proteína MTL como mostrada na SEQ ID NO: 29, uma proteína que possui pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência com a proteína MTL, ou uma proteína que possui pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de similaridade de sequência com a proteína MTL.
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