CN107250355A - 烟草植物中腋芽生长的遗传控制 - Google Patents

烟草植物中腋芽生长的遗传控制 Download PDF

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Abstract

本公开提供了许多参与烟草中的腋芽生长的序列、使用此类序列的方法、携带对此类序列的修饰或此类序列的转基因的烟草植物、和从自此类植物收获的烟草叶制备的烟草产品。

Description

烟草植物中腋芽生长的遗传控制
发明领域
一般而言，本公开涉及烟草植物。
发明背景
烟草是一种展现出异常强烈的顶端优势的植物物种。来自枝顶端分生组织(shootapical meristem)的分子信号介导有效抑制腋芽生长的激素环境。除去顶端分生组织(也称为“截顶(topping)”)后，信号传导丧失，这使新枝(或“吸根(sucker)”)能够从腋芽形成。吸根增长导致产量和叶质量的损失。已经通过手动除去以及经由化学品的应用控制吸根。对经截顶的植物常规使用马来酰肼(MH)和氟节胺(flumetralin)以抑制腋芽生长(成为吸根(suckering))。然而，用于控制吸根的劳动和化学剂是非常昂贵的。经由常规育种、突变育种和转基因方法控制烟草中的腋芽生长已经是几十年的主要目标，但迄今为止，通过遗传方法尚未实现成功的抑制。因此，具有有限的腋芽生长或无腋芽生长的烟草性状的发展将导致化学剂的使用减少，并且将降低与烟草生产相关的成本和劳动。
发明概述
本文中描述了参与腋芽生长的形成的许多核苷酸和多肽序列。还描述了使用此类序列的方法。本文中描述的方法允许生成在截顶后展现出降低的腋芽生长的烟草植物。
在一个方面，提供了烟草杂种、品种、品系或栽培种，其包括在下列各项中显示的一种或多种核酸中具有突变的植物：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75、或77。在一些实施方案中，植物相对于缺乏突变的植物展现出降低的腋芽生长，并且可以选出。
在一个方面，提供了由烟草杂种、品种、品系或栽培种中任一种生成的种子，所述种子包含一种或多种核酸中的突变。
在另一个方面，提供了制备烟草植物的方法。此类方法一般包括以下步骤：诱导烟草细胞中的诱变以生成诱变细胞；从所述诱变细胞获得一个或多个植物；并且鉴定至少一个植物，所述植物包含在一种或多种具有下列各项中显示的序列的核酸中的突变：SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77。此类方法可以进一步包括鉴定相对于缺乏所述突变的植物展现出降低的腋芽生长的至少一个植物。
在一些实施方案中，使用化学诱变剂或电离辐射诱导诱变。代表性化学诱变剂包括但不限于亚硝酸、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙啶、和甲磺酸乙酯(EMS)。代表性电离辐射包括但不限于x-射线、gamma射线、快中子照射和UV照射。在一些实施方案中，使用TALEN诱导诱变。在一些实施方案中，使用锌指技术诱导诱变。
在另一个方面，提供了用于生成烟草植物的方法。此类方法一般包括以下步骤：将第一烟草系的至少一个植物与第二烟草系的至少一个植物杂交，并且选择具有突变的后代烟草植物。通常，所述第一烟草系的植物在一种或多种具有下列各项中显示的序列的核酸中具有突变：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77。在一些实施方案中，此类方法可以进一步包括选择相对于缺乏所述突变的植物展现出降低的腋芽生长的后代烟草植物。
在又一个方面，提供了烟草产品，其包含来自烟草植物的干叶，所述烟草植物具有在一种或多种具有下列各种中显示的序列的核酸中的突变：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77。在一些实施方案中，相对于来自缺乏所述突变的植物的叶，所述烟草植物展现出降低的腋芽生长。在一些实施方案中，相对于来自缺乏所述突变的植物的叶，所述烟草植物展现出降低的MH残基。
在又一个方面，提供了生产烟草产品的方法。此类方法通常包括从烟草植物提供干叶，所述烟草植物具有在一种或多种具有下列各项中显示的序列的核酸中的突变：SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77；并且使用所述干叶制造烟草产品。在一些实施方案中，相对于来自缺乏所述突变的植物的干叶，所述烟草植物展现出降低的腋芽生长。
如本文中使用，突变可以是点突变、插入、缺失和取代。
在一个方面，提供了转基因烟草，其包含含有核酸分子的植物表达载体，所述核酸分子的长度是至少25个核苷酸并且与下列各项中显示的序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81。在一些实施方案中，核酸分子与下列各项中显示的序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81。在一些实施方案中，核酸分子的表达导致相对于不表达所述核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的植物。
在另一个方面，提供了由本文中描述的任何转基因烟草植物生成的种子，其中所述种子包含所述表达载体。
在另一个方面，提供了转基因烟草植物，其包含长度为至少25个核苷酸的异源核酸分子，其中所述异源核酸分子在严格条件下与下列各项中显示的核酸序列杂交：SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81。在一些实施方案中，异源核酸分子在严格条件下与下列各项中显示的核酸序列杂交：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81。在一些实施方案中，异源核酸分子的表达导致相对于不表达所述核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的植物。
在一些方面，提供了由本文中描述的任何转基因烟草植物生成的种子，其中所述种子包含所述异源核酸分子。
在又一个方面，提供了制备转基因植物的方法。此类方法通常包括表达编码双链RNA分子的转基因，所述双链RNA分子抑制从下列各项中显示的核酸序列的表达：SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77，其中所述双链RNA分子包含与下列各项中显示的序列具有91％或更大的序列同一性的至少25个连续核苷酸：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77。在一些实施方案中，其中所述转基因的表达导致相对于不表达所述转基因的植物展现出降低的腋芽生长的植物。
在另一个方面，提供了烟草产品，其包含来自本文中描述的任何转基因烟草植物的干叶。
在又一个方面，提供了生产烟草产品的方法，所述方法包括提供来自本文中描述的任何转基因烟草植物的干叶；并且使用干叶制造烟草产品。
在又一个方面，提供了降低烟草植物中的腋芽生长的方法。此类方法一般包括将与启动子可操作连接的异源核酸分子导入烟草细胞中以生成转基因烟草细胞，并且从所述转基因烟草细胞再生转基因烟草植物。通常，异源核酸分子包含至少25个核苷酸的长度并且与下列各项中显示的核酸序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81。此类转基因烟草植物展现出降低的腋芽生长。在一些实施方案中，异源核酸分子与如在下列各项中显示的核酸序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81。在一些实施方案中，核酸分子的表达导致相对于不表达所述核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的植物。此类方法可以进一步包括选择至少一个相对于不表达所述异源核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的转基因烟草植物。
在一个实施方案中，核酸为有义取向。在一些实施方案中，核酸为反义取向。在一些实施方案中，使用颗粒轰击、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、显微注射、聚乙二醇介导的转化、脂质体介导的DNA摄取、或电穿孔将所述核酸分子导入所述烟草细胞中。在一些实施方案中，烟草植物选自下组：Burley型、黑暗型(dark type)、烤干型(flue-curedtype)、Maryland型、和Oriental型。在一些实施方案中，烟草植物是选自下组的品种：BU64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟草、GL 26H、GL 338、GL 350、GL 395、GL 600、GL 737、GL939、GL 973、GF 157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K730、NC 196、NC 37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC 95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH 2254、PVH 2275、VA 116、VA 119,、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14x L8LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、‘Perique’烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(TomRosson)Madole、VA 309或VA359。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与方法和物质组合物所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。尽管与本文中所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于实施或测试方法和物质组合物，但在下文中描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和例子仅是说明性的而不意图是限制性的。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。
附图简述
图1A的图显示了使用实时PCR分析对SEQ ID NO:2的基因表达确认。AB0：截顶前的腋芽；AB2：截顶后2小时的腋芽；AB6：截顶后6小时的腋芽；AB12：截顶后12小时的腋芽；AB48：截顶后48小时的腋芽；AB72：截顶后72小时的腋芽；RT0：截顶前的根；RT24：截顶后24小时的根；YL0：截顶前的幼叶；YL24：截顶后24小时的幼叶；ML：成熟叶；MID中脉；SK0：截顶前的茎；SK24：截顶后24小时的茎；SAM：枝顶端分生组织和SCL：衰老的叶。
图1B的图显示了使用实时PCR分析对SEQ ID NO:19的基因表达确认。AB0：截顶前的腋芽；AB2：截顶后2小时的腋芽；AB6：截顶后6小时的腋芽；AB12：截顶后12小时的腋芽；AB48：截顶后48小时的腋芽；AB72：截顶后72小时的腋芽；RT0：截顶前的根；RT24：截顶后24小时的根；YL0：截顶前的幼叶；YL24：截顶后24小时的幼叶；ML：成熟叶；MID中脉；SK0：截顶前的茎；SK24：截顶后24小时的茎；SAM：枝顶端分生组织和SCL：衰老的叶。
图1C的图显示了使用实时PCR分析对SEQ ID NO:29的基因表达确认。AB0：截顶前的腋芽；AB2：截顶后2小时的腋芽；AB6：截顶后6小时的腋芽；AB12：截顶后12小时的腋芽；AB48：截顶后48小时的腋芽；AB72：截顶后72小时的腋芽；RT0：截顶前的根；RT24：截顶后24小时的根；YL0：截顶前的幼叶；YL24：截顶后24小时的幼叶；ML：成熟叶；MID中脉；SK0：截顶前的茎；SK24：截顶后24小时的茎；SAM：枝顶端分生组织和SCL：衰老的叶。
图1D的图显示了使用实时PCR分析对SEQ ID NO:35的基因表达确认。AB0：截顶前的腋芽；AB2：截顶后2小时的腋芽；AB6：截顶后6小时的腋芽；AB12：截顶后12小时的腋芽；AB48：截顶后48小时的腋芽；AB72：截顶后72小时的腋芽；RT0：截顶前的根；RT24：截顶后24小时的根；YL0：截顶前的幼叶；YL24：截顶后24小时的幼叶；ML：成熟叶；MID中脉；SK0：截顶前的茎；SK24：截顶后24小时的茎；SAM：枝顶端分生组织和SCL：衰老的叶。
图1E的图显示了使用实时PCR分析对SEQ ID NO:37的基因表达确认。AB0：截顶前的腋芽；AB2：截顶后2小时的腋芽；AB6：截顶后6小时的腋芽；AB12：截顶后12小时的腋芽；AB48：截顶后48小时的腋芽；AB72：截顶后72小时的腋芽；RT0：截顶前的根；RT24：截顶后24小时的根；YL0：截顶前的幼叶；YL24：截顶后24小时的幼叶；ML：成熟叶；MID中脉；SK0：截顶前的茎；SK24：截顶后24小时的茎；SAM：枝顶端分生组织和SCL：衰老的叶。
图1F的图显示了使用实时PCR分析对SEQ ID NO:45的基因表达确认。AB0：截顶前的腋芽；AB2：截顶后2小时的腋芽；AB6：截顶后6小时的腋芽；AB12：截顶后12小时的腋芽；AB48：截顶后48小时的腋芽；AB72：截顶后72小时的腋芽；RT0：截顶前的根；RT24：截顶后24小时的根；YL0：截顶前的幼叶；YL24：截顶后24小时的幼叶；ML：成熟叶；MID中脉；SK0：截顶前的茎；SK24：截顶后24小时的茎；SAM：枝顶端分生组织和SCL：衰老的叶。
图2是土壤杆菌属转化载体p45-2-7的图的示意图。
图3A显示了各种核酸比对(SEQ ID NO:1,13,33,35,37和55，顶部至底部)。
图3B显示了各种核酸比对(SEQ ID NO:2,14,34,36,38和56，顶部至底部)。
图4A是截顶前野生型烟草植物(左)和用RNA构建体#1(SEQ ID NO:29；右)转化的烟草植物的照片。
图4B是截顶后指定时间时野生型植物(顶部)和用RNA构建体#1转化的植物(底部)的照片。
图4C是显示从野生型植物(左)和用RNA构建体#1转化的植物(右)生成的T1代的照片。
图5A显示了来自腋生分生组织特异性启动子P1(来自SEQ ID NO:31中显示的序列的启动子)和启动子P7(SEQ ID NO:32)的表达的GUS染色。
图5B显示了截顶前(0小时)和截顶后(24小时、48小时和144小时)来自启动子P1(P1:GUS表达载体)的表达的GUS染色。
图6A的照片显示了0h(顶部)和截顶后1周(底部)时与野生型植物(左)相比转基因系(RNAi_1(针对BRANCH烟草同源物的SEQ ID NO:83)；右)的T0代的表型。
图6B的照片显示了0h(顶部)和截顶后1周(底部)时与野生型植物(左)相比转基因系(RNAi_1(针对BRANCH烟草同源物的SEQ ID NO:86)；右)的T0代的表型。
图6C的照片显示了截顶后2周与野生型植物(左上和左下)相比T1转基因植物(RNAi_1；右上，右下)的表型。
图6D的图显示了RNAi_1植物的腋生枝的鲜重是野生型植物的鲜重的两倍，指示使烟草中的BRANCH1同源物沉默导致增强的芽长出。
图7A的照片显示了拟南芥属BRANCH1核酸的过表达在截顶后1周(顶部)内相对于野生型植物(左)导致降低的芽长出(右)。
图7B的照片显示了拟南芥属BRANCH1核酸的过表达相对于野生型植物(左)一般影响植物生长(右)。
图8的照片显示了SEQ ID NO:11中显示的核酸序列的过表达导致截顶后增强的芽长出(右)。例示性地，表型针对0小时(顶部)和截顶后1周(底部)与野生型(左)相比一种转基因系。
图9的照片(特写镜头，顶部；整个植物，底部)显示了三种不同转基因系中的RNAi_CET2过表达下调吸根生长，并且导致降低的芽长出。显示了截顶后1周与野生型植物(左)相比RNAi_CET2的三种品系转基因的表型。
图10是截顶后7天拍摄的照片，其显示了RNAi_26的表达相对于野生型植物(左上)降低吸根生长(特写镜头，右上；整个植物，底部)。
图11的照片显示了在具有SEQ ID NO:116中显示的序列的启动子的控制下GUS的分生组织特异性表达。如所标记的：在缺乏SAM的情况下在幼苗中没有观察到表达；在幼苗中，在存在SAM的情况下，可以看到蓝色；在截顶前看到腋芽上的弱表达；在截顶后3天观察到强表达；GUS表达在截顶后5天内淡出；并且GUS表达到截顶后7天是缺乏的。
图12的照片显示了在具有SEQ ID NO:117中显示的序列的启动子的控制下GUS的腋芽特异性表达。如所标记的：在缺乏SAM的情况下在幼苗中没有观察到表达；在存在SAM的情况下，在腋芽中观察到GUS表达；在成熟的植物中，在基部和在侧芽中观察到GUS表达；在花芽中没有观察到GUS表达；并且在截顶前和截顶后持续长达15天在腋芽中观察到强GUS表达。
图13的照片显示了P1启动子控制下的分生组织特异性GUS表达。观察到GUS表达，但是在截顶后(在0小时时)下调。
发明详述
本申请描述了生成没有吸根生长或具有降低的吸根生长的烟草的方法。例如，描述包括：腋芽生长基因序型分析以发现对腋芽发育至关重要的基因；腋芽生长和/或吸根抑制基因的上调；腋芽和/或吸根激活基因的下调；和吸根生长的调节成分的调节；或使用腋芽特异性启动子在腋芽中起始或诱导细胞死亡机制。
本公开基于参与腋芽生长及其调节的编码来自烟草(N.tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的多肽的核酸的发现。本文中描述并且表征了此类核酸SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81，及由其编码的多肽SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82。基于此发现，可以在烟草属种(Nicotiana species)，特别是例如烟草中调节此类核酸序列的表达水平和/或此类多肽的功能。调节多肽功能和/或基因表达可以允许腋芽生长的改善的控制。
核酸和多肽
本文中提供了核酸(见例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81)。如本文中使用，核酸可以包括DNA和RNA，并且包括含有一种或多种核苷酸类似物或主链修饰的核酸。核酸可以是单链或双链，这通常取决于其意图用途。本文中提供的核酸编码多肽(见例如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82)。
还提供了分别与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81，和SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82不同的核酸和多肽。在序列上与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81，和SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54不同的核酸和多肽可以分别与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81，和SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82具有至少50％序列同一性(例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。
在计算百分比序列同一性时，比对两个序列，并且测定两个序列之间的核苷酸或氨基酸残基的相同匹配数目。将相同匹配的数目除以比对区域的长度(即，比对的核苷酸或氨基酸残基的数目)并乘以100以获得百分比序列同一性值。应当理解，比对区域的长度可以是直到最短序列的全长大小的一个或两个序列的一部分。还将理解，单个序列可以与超过一个其它序列比对，因此在每个比对区域上可以具有不同的百分比序列同一性值。
可以使用计算机程序ClustalW和默认参数来执行两个或更多个序列的比对以测定百分比序列同一性，这允许核酸或多肽序列在其整个长度上进行比对(全局比对)。Chenna et al.,2003,Nucleic Acids Res.,31(13):3497-500。ClustalW计算查询和一个或多个主题序列之间的最佳匹配，并比对它们，以便可以测定同一性、相似性和差异。可以将一个或多个残基的缺口插入查询序列、主题序列或两者中以使序列比对最大化。对于核酸序列的快速成对比对，可以使用默认参数(即，字大小：2；窗口大小：4；评分方法：百分比；顶对角线数目；4；和缺口罚分：5)；为了比对多个核酸序列，可以使用以下参数：缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：5.0；和权重转换(weight transition)：是。对于多肽序列的快速成对比对，可以使用以下参数：字大小：1；窗口大小：5；评分方法：百分比；顶对角线数：5；和缺口罚分：3。对于多肽序列的多重比对，可以使用以下参数：权重矩阵：blosum；缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.05；亲水缺口：开启；亲水残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；和残留特异性缺口罚分：开启。可以例如在万维网上在贝勒医学院搜索启动器网站(Baylor College of Medicine Search Launcher website)或欧洲生物信息学研究所网站运行ClustalW。
可以将变化引入核酸分子(例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81)中，从而导致编码的多肽的氨基酸序列(e.g.、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82)的变化。例如，可以使用诱变(例如，定点诱变、转录激活物样效应器核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、PCR介导的诱变、聚簇规则散布短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat，CRISPR)诱变)或通过化学合成具有此类变化的核酸分子将变化引入核酸编码序列中。此类核酸变化可导致在一个或多个氨基酸残基处的保守和/或非保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基用具有相似侧链的不同氨基酸残基替代的取代(参见例如Dayhoff et al.(1978,in Atlas of Protein Sequence andStructure,5(Suppl.3):345-352)，其提供用于氨基酸取代的频率表)，并且非保守取代是其中氨基酸残基用不具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。
如本文中使用，“分离的”核酸分子是不含在自然中在衍生分离的核酸分子的生物体的基因组中核酸的一端或两端侧翼的序列的核酸分子(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或基因组DNA片段)。通常将此类分离的核酸分子引入载体(例如，克隆载体或表达载体)中以方便操作或产生融合核酸分子，下文将更详细地讨论。此外，分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，如重组或合成的核酸分子。
如本文中使用，“纯化”多肽是已经从天然伴随它的细胞成分分离或纯化的多肽。通常，当多肽是至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或99％)(按干重计)不含天然与其关联的多肽和天然存在分子时，认为它是“纯化的”。由于化学合成的多肽本质上与天然伴随它的成分分离，合成多肽是“纯化的”。
可以使用本领域常规技术分离核酸。例如，可以使用任何方法分离核酸，所述方法包括但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链反应(PCR)。一般PCR技术描述于例如PCRPrimer:A Laboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,1995中。重组核酸技术包括例如限制酶消化和连接，其可以拥有分离核酸。分离的核酸也可以作为单个核酸分子或一系列寡核苷酸进行化学合成。
可以通过已知方法例如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析从天然来源(例如，生物样品)纯化多肽。也可以例如通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。此外，可以通过化学合成获得纯化的多肽。可以使用任何合适的方法，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量多肽的纯度。
还提供了含有核酸的载体(例如，编码多肽的核酸)。载体(包括表达载体)是商品化的或可通过本领域常规的重组DNA技术产生。含有核酸的载体可以具有与此类核酸可操作地连接的表达元件，并且还可以包括序列，诸如编码选择性标志物(例如，抗生素抗性基因)的序列。含有核酸的载体可以编码嵌合或融合多肽(即，可操作地连接到异源多肽的多肽，所述异源多肽可以在多肽的N末端或C末端)。代表性的异源多肽是可用于纯化编码多肽的那些(例如，6xHis标签，谷胱甘肽S-转移酶(GST))。
表达元件包括指导和调节核酸编码序列表达的核酸序列。表达元件的一个实例是启动子序列。表达元件还可以包括调节核酸表达的内含子、增强子序列、响应元件或诱导元件。表达元件可以是细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或病毒起源的，并且载体可以包含来自不同起源的元件的组合。如本文中使用，可操作地连接意味着启动子或其它表达元件相对于核酸以使得指导或调节核酸表达的方式(例如符合读码框的方式)在载体中定位。
另外/或者，载体可以包括指导核酸(例如，SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81)同源重组入基因组中的序列。可以指导核酸同源重组入基因组中的代表性序列是本领域已知的，并且包括TALEN序列(例如Cermak et al.,2011,Nuc.AcidsRes.,39:e82)、CRISPR序列(Jiang et al.,2013,Nuc.Acids Res.,41:e188)、或锌指核酸酶(Guo et al.,2010,J.Mol.Biol.,400:96)。
可将如本文所述的载体导入宿主细胞。如本文中使用，“宿主细胞”是指引入核酸的特定细胞，并且还包括携带载体的这种细胞的后代。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，核酸可以在细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)，或昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的并且包括植物细胞。在体内和体外将核酸引入宿主细胞的许多方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙二醇(PEG)转化、热休克、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移。
可以使用任何数目的扩增技术用适当的寡核苷酸(例如引物)对检测核酸(参见例如PCR Primer:A Laboratory Manual,1995,Dieffenbach&Dveksler编,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；及美国专利No.4,683,195；4,683,202；4,800,159；和4,965,188)。已经开发了对初始PCR的许多修饰，并且可以用于检测核酸。
也可以使用杂交检测核酸。在Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Sections 7.37-7.57,9.47-9.57,11.7-11.8,and 11.45-11.57)中详细讨论了核酸之间的杂交。Sambrook等人公开了小于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的合适的Southern印迹条件(第11.45-11.46节)。长度小于100个核苷酸的序列与第二个序列之间的Tm可以使用第11.46节中提供的公式计算。Sambrook等人另外公开了大于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的Southern印迹条件(见第9.47-9.54节)。长度大于100个核苷酸的序列与第二个序列之间的Tm可以使用Sambrook等人的9.50-9.51节中提供的公式计算。
预杂交和杂交含有核酸的膜的条件以及清洗含有核酸的膜以除去过量且非特异性结合的探针的条件可以在杂交的严格性中起重要作用。这种杂交和清洗可以在适当的情况下在中等或高严格性条件下进行。例如，可以通过降低清洗溶液中的盐浓度和/或通过提高进行清洗的温度使清洗条件变得更严格。仅作为例子，高严格条件通常包括在65℃在0.2X SSC中清洗膜。
此外，解释杂交量可以受到例如标记的寡核苷酸探针的比活性、已经与探针杂交的模板核酸上的探针结合位点的数目以及放射自显影照片或其它检测介质的曝光量影响。本领域普通技术人员将容易理解，尽管可以使用任何数目的杂交和清洗条件来检查探针核酸分子与固定的靶核酸的杂交，但更重要的是检查在相同的杂交、清洗和暴露条件下探针与靶核酸的杂交。优选地，靶核酸在同一膜上。
如果与核酸杂交比与另一种核酸的杂交大至少5倍(例如，至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍)，则认为核酸分子与核酸杂交但不与另一种核酸杂交。可以使用例如PhosphorImager或密度计(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)直接在膜上或从放射自显影照片上量化杂交量。
可以使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。可以使用本领域公知的方法产生对多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可以使用本领域已知的方法将抗体附着到固体支持物，如微量滴定板。在多肽的存在下，形成抗体-多肽复合物。
检测(例如扩增产物、杂交复合物或多肽)通常使用可检测的标记物来完成。术语“标记物”旨在涵盖使用直接标记物以及间接标记物。可检测的标记物包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
具有减少的腋芽生长的植物和制备方法
提供了烟草杂种、变体、品系或栽培种，其具有在本文中描述的一种或多种核酸(例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77)中的突变。如本文中描述，具有在本文中描述的一种或多种核酸(例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75、or 77)中的突变的植物的茎可以展现出降低的腋芽生长(例如与缺乏突变的植物的茎相比)。在一些例子中，具有突变的核酸可以是内源核酸；在一些例子中，可以重组导入具有突变的核酸。
如本文中使用，腋芽生长(或“成为吸根”)描述了在对烟草植物截顶之后在叶和茎之间生长的侧芽(或“吸根”)的产生，如本领域通常所理解的。截顶是指当植物接近成熟时除去茎顶，包括花和直至几个相邻的叶，并导致顶端优势的丧失。如果腋芽生长受到充分控制，则截顶会提高产量和每英亩收获量价值(value-per-acre)，并且对叶的物理和化学性质产生期望的修饰。
制备具有突变的烟草植物的方法是本领域已知的。突变可以是随机突变或靶向突变。对于随机诱变，可以使用例如化学诱变剂、电离辐射或快中子轰击来诱变细胞(例如，烟草细胞)(参见例如Li et al.,2001,Plant J.,27:235-42)。代表性化学诱变剂包括但不限于亚硝酸、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙啶和甲磺酸乙酯(EMS)，而代表性电离辐射包括但不限于x射线、gamma(伽马)射线、快中子照射和紫外线照射。对于每种类型的植物组织，通过实验测定诱变化学品或辐射的剂量，使得获得低于以致死性或生殖不育为特征的阈值水平的突变频率。基于突变的预期频率来估计由诱变处理产生的M1代种子数目或M1植物群体的大小。对于靶向诱变，代表性技术包括TALEN(参见例如Li et al.,2011,Nucleic AcidsRes.,39(14):6315-25)或使用锌指核酸酶(参见例如Wright et al.,2005,The Plant J.,44:693-705)。无论是随机还是靶向，突变可以是点突变、插入、缺失、取代或其组合。
如本文中讨论的，相对于相应的野生型多肽的表达和/或功能，可以突变一个或多个核苷酸以改变编码的多肽的表达和/或功能。应当理解，例如，一个或多个高度保守区域中的突变可能改变多肽功能，而那些保守区域之外的突变可能对多肽功能几乎没有甚至没有影响。此外，单个核苷酸中的突变可产生终止密码子，其将导致截短的多肽，并且取决于截短的程度而导致丧失功能。
优选地，本文中公开的新核酸之一中的突变导致在包含突变的烟草植物中的截顶后，腋芽生长的减少或甚至完全消除。编码序列中的合适类型的突变包括但不限于野生型编码序列中核苷酸的插入、核苷酸的缺失、或转换或颠换。编码序列中的突变可导致编码多肽中一个或多个氨基酸的插入、一个或多个氨基酸的缺失和/或非保守氨基酸取代。在一些情况下，编码序列包含超过一种突变或超过一种类型的突变。
编码序列中的氨基酸的插入或缺失例如可破坏编码多肽的构象。氨基酸插入或缺失也可以破坏对于识别结合配体或多肽活性重要的位点。本领域已知，与较少数目的插入或缺失的氨基酸相比，较大数目的连续氨基酸的插入或缺失更可能使基因产物无功能。此外，一个或多个突变(例如，点突变)可以改变多肽的定位，引入终止密码子以产生截短的多肽，或破坏多肽内的活性位点或域(例如，催化位点或域、结合位点或域)。此外，可以突变靶物或信号序列，从而破坏或改变蛋白质在细胞中的位置。
非保守氨基酸取代可以用不同类别的氨基酸替代一类氨基酸。非保守取代可以使基因产物的电荷或疏水性发生实质性变化。非保守氨基酸取代也可以使残基侧链的体积发生实质性变化，例如用丙氨酸残基取代异亮氨酸残基。非保守性取代的实例包括碱性氨基酸取代非极性氨基酸或极性氨基酸取代酸性氨基酸。
诱变后，M0植物从诱变细胞再生，并且可以对那些植物或所述植物的后续世代(如M1、M2、M3等)筛选感兴趣的序列(例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77)中的突变。可以使用本领域常规方法(例如，杂交、扩增、其组合)或通过评估表型(例如，检测和/或确定腋芽生长)来进行携带感兴趣序列中的突变的植物的筛选。通常，本文中公开的一种或多种核酸序列(例如，SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77)中突变的存在导致与缺乏突变的相应植物(例如，具有相同品种背景)相比，突变体植物中腋芽生长的降低。
如本文中使用，降低的腋芽生长(也称为降低的吸根生长)是指与对照植物相比腋芽数减少(例如，统计学上显著的降低)、腋芽大小(如生物质)的降低(例如，统计学上显著的降低)、和/或腋芽对农艺性能(例如，植物的产量、质量和总体生产力)的影响的降低(例如，统计学上显著的降低)。效果可以以在截顶之后妨碍和/或消除腋芽生长，或者减少和/或消除在截顶后施用化学物质(例如MH和/或氟节胺)的需要证明。如本文中使用，统计学显著的是指使用统计学显著性的适当测量，例如单因素两样本t检验(one-tailed twosample t-test)得到的小于0.05的p值，例如，小于0.025的p值或小于0.01的p值。
M1烟草植物对于突变体等位基因可以是杂合的并且展现出野生型表型。在此类情况下，此类植物的第一代自花传粉后代的至少一部分展现出野生型表型。或者，M1烟草植物可以具有突变体等位基因并展现出突变体表型。尽管存在野生型等位基因，但是此类植物可以是杂合的并且由于诸如显性失活抑制(dominant negative suppression)等现象而展现出突变体表型，或者这些植物可以由于不同等位基因中不同的独立诱导突变而是杂合的。
携带突变体等位基因的烟草植物可用于植物育种计划，以创建新颖有用的栽培种、品系、品种和杂种。因此，在一些实施方案中，将含有至少一种突变的M1、M2、M3或更晚世代的烟草植物与第二烟草植物杂交，并且鉴定出存在突变的杂交后代。应当理解，第二烟草植物可以是本文中所述的物种和品种之一。还应当理解，第二烟草植物可以与同其杂交的植物含有相同的突变、不同突变，或在基因座处是野生型。另外/或者，第二烟草系可以展现出表型性状，诸如例如抗病性、高产量、高级指数(high grade index)、可干处理性(curability)、干处理质量(curing quality)、机械收获、保持能力(holding ability)、叶质量、高度、植物成熟(例如早熟(early maturing)、早熟至中熟(medium maturing)、中熟、中熟至晚熟(late maturing)、或晚熟)、茎大小(例如小、中、大)、和/或每株植物的叶数(例如，小(例如，5-10片叶)、中等(例如11-15片叶)或大(例如16-21)数目的叶)。
使用已知规程进行育种。如本文中所述，DNA指纹法、SNP或类似技术可用于标志物辅助选择(MAS)育种程序以将突变等位基因转移或育种至其它烟草中。可以使用本文中所述的方法对杂交的后代筛选突变，并且可以选择在本文中公开的核酸序列(例如SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77)中具有突变的植物。例如，可以使用本文中列出的技术之一使用由本文中所述的序列或其片段开发的标志物筛选F2或回交世代中的植物。也可以对后代植物筛选腋芽生长，并且可以选择与相应的缺乏突变的植物相比具有减低的腋芽生长的植物。鉴定为拥有突变体等位基因和/或突变体表型的植物可以回交或自花传粉以产生待筛选的第二群体。可以重复回交或其它繁殖规程，直到回收回本亲本的期望的表型。
成功的杂交产生F1植物，其是能育的并且(如果期望的话)可以与亲本系回交。在一些实施方案中，使用标准方法(例如，基于本文中公开的核酸序列用引物进行PCR)筛选F2代中的植物群体的突变或变体基因表达。然后将选定的植物与亲本之一杂交，并且对第一回交(BC1)代植物自花传粉以产生BC1F2群体，对所述BC1F2群体再次筛选变体基因表达。重复回交、自花传粉和筛选的过程，例如至少四次，直到最后的筛选产生可育并且与回归亲本合理相似的植物。如果期望的话，对此植物自花传粉，随后再次筛选后代以确认植物含有突变并展现出变体基因表达。可以使用标准方法生产所选植物的育种者种子，包括例如田间测试(field testing)、无效条件的确认和/或评估腋芽生长的种植。
使用本文中所述的突变体烟草植物的植物育种程序的结果是新颖有用的栽培中、品种、品系和杂种。如本文中使用，术语“品种”是指下述植物群体，所述植物群体共享将其与相同物种的其它植物分离的特征。品种经常但并不总是商业上出售的。虽然拥有一种或多种独特的特征，但是品种的进一步特征在于该品种内的个体之间的非常小的整体变化。“纯系”品种可以通过几代自花传粉和选择，或使用组织或细胞培养技术来自单一亲本的营养繁殖来产生。如与品种区分，“品系”更通常表示非商业使用的一组植物，例如在植物研究中。品系通常在感兴趣的一种或多种特征方面在个体间展现出很少的总体变化，尽管在个体之间可能存在其它性状的一些变化。
品种可以基本上源自另一品系或品种。根据保护植物新品种国际公约(International Convention for the Protection of New Varieties of Plants)(1961年12月2日，如1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)的定义，在下述情况下品种“基本上源自”初始品种：a)它主要源自初始品种，或源自主要源自初始品种，同时保留由初始品的基因型或基因型组合产生的基本特征的表达的品种；b)它与初始品种明显可区分；和c)除了衍生行为导致的差异之外，它在由初始品种的基因型或基因型组合产生的基本特征的表达上与初始品种一致。可以例如通过选择天然或诱导的突变体、体细胞克隆变体(somaclonal variant)、来自初始品种的变体个体植物、回交或转化来获得基本衍生品种。
可以如下产生烟草杂种：防止第一品种的雌性亲本植物(即种子亲本)的自花传粉来，允许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉对雌性亲本植物传粉，并且允许F1杂交种子在雌性植物上形成。可以通过在花发育的早期阶段对花去雄预防雌花植物的自花传粉。或者，可以使用雄性不育的形式在雌性亲本植物上防止花粉形成。例如，雄性不育可以通过细胞质雄性不育(CMS)/核雄性不育、遗传雄性不育、分子雄性不育(其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成)或自交不亲和性产生。含有CMS的雌性亲本植物特别有用。在雌性亲本植物为CMS的实施方案中，雄性亲本植物通常含有生育力恢复基因，以确保F1杂种是能育的。在雌性亲本为CMS的其它实施方案中，可以使用不含生育力恢复系的雄性亲本。由此类亲本产生的F1杂种是雄性不育的。雄性不育杂交种子可以与雄性能育种子间作以在所得的雄性不育植物上提供花粉用于结籽。
本文中所述的品种、品系和栽培种可用于形成单杂交烟草F1杂种。在此类实施方案中，亲本品种的植物可以生长为基本均匀的相邻群体，以促进从雄性亲本植物到雌性亲本植物的自然异花传粉。通过常规手段选择性地收获在雌性亲本植物上形成的F2种子。还可以批量种植两种亲本植物品种，并且收获雌性亲本上形成的F1杂种种子和由于自花传粉在雄性亲本上形成的种子的混合物。或者，可以进行三系杂交(three-way cross)，其中使用单杂交F1杂种作为雌性亲本，并与不同的雄性亲本杂交。作为另一种备选，可以产生双杂交杂种，其中将两种不同单杂交的F1后代自身杂交。自交不亲和性可以用于在形成双杂交杂种时防止雌性亲本的自花传粉的特别优点。
本文中描述的方法中使用的烟草植物可以是Burley型、黑暗型、烤干型、Maryland型、和Oriental型。本文中描述的方法中使用的烟草植物通常来自烟草，并且可以来自任何数目的烟草品种。品种可以是BU 64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟草、GL 26H、GL 338、GL350、GL 395、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、GF 157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K 149、K326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 196、NC 37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH 2254、PVH 2275、VA 116、VA 119,、KDH959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、‘Perique’烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、或VA359。
除了突变之外，可以减少烟草中腋芽生长的另一种方法是使用抑制性RNA(例如RNAi)。因此，提供了转基因烟草植物，其含有编码至少一个RNAi分子的转基因，所述RNAi分子在表达时沉默至少一种本文中所述的内源性核酸(例如，SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75、或77)。如本文中所述，此类转基因植物展现出降低的腋芽生长(例如，与缺乏或未表达RNAi的植物相比)。
RNAi技术是本领域已知的，并且是转录后基因沉默的非常有效的形式。RNAi分子通常含有在有义和反义方向两者上与靶基因互补的核苷酸序列(例如，长度为约18个核苷酸(例如，长度为约19或20个核苷酸)直至长度为约700个核苷酸)。有义链和反义链可以通过短的“环”序列(例如，长度为约5个核苷酸直至长度约800个核苷酸)连接并在单个转录物中表达，或者可以在单独的载体或构建体上将有义和反义链递送到靶细胞以及在靶细胞中表达。许多公司提供RNAi设计和综合服务(例如，Life Technologies,AppliedBiosystems)。
可以使用植物表达载体表达RNAi分子。RNAi分子的长度通常至少为25个核苷酸，并且与本文中公开的核酸序列(例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77)之一具有至少91％的序列同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或在严格条件下与本文中公开的核酸序列(例如SEQ ID NOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75或77)之一杂交。上文描述了严格条件下的杂交。
此外，可以在植物中过表达本文中描述的某些序列以减少腋芽生长。因此，提供了用在能够驱动植物中表达的启动子的控制下的本文中所述的核酸分子(例如SEQ ID NOs:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81)或其功能片段转化的转基因烟草植物。如本文中讨论的，植物表达载体中使用的核酸分子可以具有与本文所述的序列不同的序列，其可以以百分比序列同一性表示(例如相对于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81)，或者基于序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81杂交的条件表示。
作为使用全长序列的备选，可以使用编码具有期望功能性的多肽片段(本文中称为“功能性片段”)的序列的一部分。当关于核酸使用时，应当理解，它不是拥有功能性的核酸片段，而是编码的多肽片段。基于本文的公开内容和图3中所示的比对，本领域技术人员可以预测可以赋予期望功能性的多肽的部分(例如，一个或多个域)。
驱动植物中编码序列表达的启动子是本领域已知的。代表性的启动子包括例如CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、菜豆球蛋白(phaseolin)启动子，rubisco启动子、玉米醇溶蛋白启动子、ACEI系统启动子、In2启动子或H3组蛋白启动子。此外，本文描述了与腋芽生长相关的组织或发育特异性启动子序列，并且可用于表达或过表达核酸编码序列。与腋芽生长相关的代表性的组织或发育特异性启动子序列示于SEQ ID NO:113、114、115、116、117或118。如本文中所述，编码序列可以是本文中描述的任何核酸编码序列(例如，SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81)；或者，编码序列可以源自导致程序性细胞死亡的基因(例如，编码核糖体失活蛋白的核酸分子、编码在植物在面对病原体(例如，真菌或细菌)时启动的超敏感性响应中牵涉的蛋白质的核酸分子)。仅仅举例来说，如本文中所述的与腋芽生长相关的组织或发育特异性启动子序列可以用于表达或过表达在截顶之后其表达降低的编码序列或涉及凋亡的编码序列。
将核酸(例如，异源核酸)导入植物细胞的方法是本领域已知的，包括例如颗粒轰击、土壤杆菌属介导的转化、显微注射、聚乙二醇介导的转化(例如，原生质体的，参见例如Yoo et al.(2007,Nature Protocols,2(7):1565-72))、脂质体介导的DNA摄取或电穿孔。转化后，转基因植物细胞可以再生成转基因烟草植物。如本文中所述，转基因的表达导致相对于不表达转基因的植物展现出降低的腋芽生长的植物。可以筛选再生的转基因植物的腋芽生长，并且与相应的非转基因植物相比，具有减少腋芽生长的植物可用于例如如本文所讨论的育种程序。
除了腋芽生长相关编码序列的过表达或下调之外，可以使用以下任何方法控制腋芽生长：
a.改变对腋芽发育至关重要的腋芽生长相关调控基因的表达(如实施例7和8中所述)；
b.使用腋芽特异性启动子改变分生组织发育特异性基因；
c.改变激素信号传导，导致腋芽生长抑制。这可以通过由组织特异性或时机特异性(例如，截顶)启动子驱动的激素合成或转运基因的过表达或下调来实现；和
d.使用驱动细胞自杀或毒性基因的腋芽特异性启动子启动腋芽中的细胞死亡机制。
赋予性状如除草剂抗性(有时称为除草剂耐受性)、昆虫抗性或胁迫耐受性的核酸也可以存在于本文中所述的新颖的烟草植物中。赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂例如咪唑啉酮或磺酰脲的抗性的基因可以是合适的。该类别中的示例性基因编码突变体ALS和AHAS酶，如记载于例如美国专利No.5,767,366和5,928,937。美国专利No.4,761,373和5,013,659涉及对各种咪唑啉酮或磺酰胺除草剂有抗性的植物。美国专利No.4,975,374涉及含有编码突变型谷氨酰胺合成酶(GS)的基因的植物细胞和植物，其对由已知抑制GS的除草剂(例如膦丝菌素(phosphinothricin)和甲硫氨酸硫酰亚胺)的抑制有抗性。美国专利No.5,162,602公开了对由环己二酮和芳氧基苯氧基丙酸(aryloxyphenoxypropanoicacid)除草剂的抑制有抗性的植物。
对草甘膦(glyphosate)的抗性的基因也是合适的。参见例如美国专利No.4,940,835和4,769,061。此类基因可以赋予对草甘膦除草剂组合物的抗性，包括但不限于草甘膦盐，诸如三甲基锍盐(trimethylsulphonium salt)、异丙胺盐(isopropylamine salt)、钠盐、钾盐和铵盐。参见例如美国专利No.6,451,735和6,451,732。对膦酰基化合物如草铵膦(glufosinate ammonium)或膦丝菌素以及吡啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和环己酮的抗性的基因也是合适的。参见例如美国专利No.5,879,903；5,276,268；和5,561,236；及欧洲申请No.0 242246。
其它合适的除草剂包括抑制光合作用的除草剂，例如三嗪(triazine)和苄腈(benzonitrile)(腈水解酶)。参见美国专利No.4,810,648。其它合适的除草剂包括2,2-二氯丙酸，烯禾啶(sethoxydim)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶(triazolopyrimidine)除草剂、s-三嗪除草剂和溴苯腈(bromoxynil)。赋予对protox酶的抗性的除草剂也是合适的。参见例如美国专利No.6,084,155和US20010016956。
许多基因是可用的，其赋予对昆虫，例如鳞翅目(Lepidoptera)中的昆虫的抗性。示例性基因包括编码截短的Cry1A(b)和Cry1A(c)毒素的基因。参见例如美国专利No.5,545,565；6,166,302；和5,164,180中描述的基因。还见Vaeck et al.,1997,Nature,328:33-37和Fischhoff et al.,1987,Nature Biotechnology,5:807-813。特别有用的是编码对烟草天蛾(Manduca sexta)(烟草天蛾(hornworm))；绿棉铃虫(Heliothis virescensFabricius)(烟草蚜虫)和/或斜纹夜蛾(S.litura Fabricius)(烟草切根虫(cutworm))展现出杀虫活性的毒素的基因。
烟草产品和制备方法
可以干处理(cured)、老化(aged)、调理(conditioned)和/或发酵来自具有降低腋芽生长的烟草植物的叶。将烟草干处理的方法是众所周知的，并且包括例如晾干(aircuring)、烤干(fire curing)、熏干(flue curing)和晒干。老化也是已知的，并且通常在加压条件下在木桶(例如，大桶)或纸板箱中进行数年(例如2至5年)，水分含量为约10％至约25％(参见例如美国专利No.4,516,590和5,372,149)。调理包括例如如US 2004/0118422或US 2005/0178398中所述的加热、发汗(sweating)或巴氏消毒法步骤，而发酵通常的特征在于高初始含水量、热产生、和干重减轻10％至20％。参见例如美国专利Nos.4,528,993,4,660,577,4,848,373和5,372,149。如果期望的话，烟草也可以进一步加工(例如切割、膨胀、共混、研磨或粉碎)，并用于烟草产品。
烟草产品是本领域已知的，并且包括由烟草制成或衍生的意图用于人消费的产品，包括烟草产品的任何组分、部分或附件。代表性的烟草产品包括但不限于无烟烟草产品、烟草衍生的尼古丁产品、小雪茄烟(cigarillos)、非通风凹槽过滤嘴香烟(non-ventilated recess filter cigarettes)，通风凹槽过滤嘴香烟(vented recess filtercigarette)、雪茄(cigars)、鼻烟(snuff)、烟斗烟草(pipe tobacco)、雪茄烟草、香烟烟草、咀嚼烟草、叶烟草、切碎烟草(shredded tobacco)、和切烟草(cut tobacco)。代表性的无烟烟草产品呢包括例如咀嚼烟草、鼻烟、长切潮湿无烟烟草(long-cut moist smokelesstobacco)、snus、小袋(pouches)、薄膜、片剂、涂覆的榫钉(coated dowel)，棒等。代表性的香烟和其它吸烟制品包括例如包括过滤器元件或杆元件的吸烟制品，其中可抽吸材料的杆元件可以包括烟草混合物内的干烟草。除了本文中所述的烟草之外，烟草产品还可以包括其它成分，例如但不限于粘合剂、增塑剂、稳定剂和/或调味剂(flavorings)。关于烟草制品的实例，参见例如US 2005/0244521；US 2006/0191548；US 2012/0024301；US 2012/0031414；和US 2012/0031416。
本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中描述的方法和物质组合物的范围。
实施例
实施例1：取样、RNA制备和测序
萌发来自TN90(Burley品种)的烟草种子。4周后，将幼苗转移到4英寸盆上。在搁置期(layby stage)时(8-10片完全扩展的叶)，收集总共10份不同样品，包括截顶前的腋芽(Aa)、截顶后的腋芽(Ab,Ac,Ad和Ae(分别2h,6h,24h和72h)、截顶前的根(Ra)、截顶后的根(Rb,Rc(24h和72h))、截顶时的幼叶(YL)、和枝顶端分生组织(ST)用于下一代测序分析。每个时间点由三个独立收集的样品表示。这三个样品充当生物重复。
使用RNeasy植物微型试剂盒(Qiagen，MA)分离来自上述样品的RNA，并使用Agilent Plant RNA Nano试剂盒和2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，CA)测试质量。构建了30个cDNA文库，使用TrueSeq RNA文库准备试剂盒v.2(Illumina)进行索引化(indexing)。将自相同生物重复制备的cDNA文库合并在一起，并在Illumina HiSeq 2000上分析每个合并的重复，100bp单一读段，每个样品具有最少3000万个读段。每道标记两个样品，总共15个测序道。通过ArrayXpress(Raleigh，NC)进行的RNA深度测序测定TN90烟草中的腋芽特异性基因表达。
实施例2：RNA序列分析
分析了来自5个腋芽、3个根和幼叶和茎顶端分生组织各1个的基因表达数据以与其它组织相比鉴定腋芽发育相关基因。将基因读段定位到我们内部的烟草百科(tobaccopedia)基因组数据库(表1)。CLC基因组工作台中的EdgeR用于实施差异基因表达。针对来自其它组织的腋芽特异性表达过滤基因表达数据。对所有p值进行FDR调节，并且使用FDR校正的p值<0.05的截留值。然后，针对高腋芽表达过滤结果。用于吸根控制的差异表达候选基因的列表列于表2中。
表1：使用内部烟草百科数据库的下一代测序读段的定位
样品 定位读段 ％定位 样品 定位读段 ％定位
Aa1 23,920,938 92.03 Ra1 39,732,686 92.02
Aa2 49,392,444 91.21 Ra2 40,262,611 91.16
Aa3 28,288,803 86.23 Ra3 33,248,092 92.13
Ab1 24,848,558 92.2 Rb1 35,937,062 93.06
Ab2 35,727,478 92.23 Rb2 40,036,265 92.43
Ab3 34,000,094 92.25 Rb3 46,268,788 92.34
Ac1 45,951,075 92.04 Rc1 35,595,122 92.84
Ac2 48,242,863 92.15 Rc2 37,925,157 92.25
Ac3 41,733,418 91.67 Rc3 34,832,062 92.18
Ad1 33,474,960 92.08 ST1 48,115,555 92.45
Ad2 31,891,377 92.35 ST2 41,373,361 92.41
Ad3 40,791,919 92.23 ST3 31,760,672 91.85
Ae1 28,758,337 92.04 YL1 41,811,850 92.63
Ae2 38,369,793 92.26 YL2 51,356,432 91.82
Ae3 40,552,134 92.45 YL3 40,252,190 91.95
实施例3：选择的候选基因表达的确认
为了确认选择的候选基因的表达模式，测量来自10-16个不同组织样品(6个腋芽样品(截顶前和截顶后2小时、6小时、12小时、24小时和72小时)、截顶后24小时幼叶、成熟叶、衰老叶、中脉、截顶前的茎、截顶后24小时的茎、茎顶端分生组织、截顶前和截顶后24小时的根)的转录物的相对变化。简言之，使用TRI试剂(Sigma-Aldritch，St.Louis，Mo)分离总RNA。为了除去DNA杂质，用无RNA酶的DNA酶(无Turbo DNA，Ambion，Austin，TX)处理纯化的RNA。为了合成第一cDNA链，利用High Capacity cDNA Kit(Applied Biosystems,FosterCity,CA)转录约10μg的总RNA。为了测量样品中选择的基因转录物的水平，使用SYBR GreenPCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)和表3中列出的基因特异性引物进行RT-PCR。代表性候选基因的实时基因表达验证列在图1A-1G中。
实施例4：全长候选基因克隆、分析和用于验证所选择的实时PCR
鉴定并且注释预测要参与腋芽起始和生长的候选基因(表4)，并且收集来自截顶前、和截顶后12小时、24小时和48小时的TN90植物的腋芽组织的RNA。使用来自Clontech的In-Fusion SMARTER Directional cDNA文库构建试剂盒(Cat#634933)从RNA产生cDNA文库。使用从预测的全长cDNA序列设计的基因特异性引物克隆全长候选基因。通过测序确认全长编码序列，并显示于SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,57,59或69。预测的蛋白质序列显示于SEQ ID NO:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,58,60或70。
表4：选择的候选基因
从RNA序列分析和RT-PCR确认，选择候选推定的全长基因序列进行RNAi和全长土壤杆菌转化分析。候选序列列于表5中，并显示于SEQ ID NO:39,41,43,45,47,49,51,53,61,63,65,71,73,75或77中。预测的蛋白质序列显示于SEQ ID NO:40,42,44,46,48,50,52,54,62,64,66,72,74,76或78中。
基于保守结构域(TCP域)的存在，候选基因中的六种是转录因子基因家族的成员。核苷酸和蛋白质序列比对显示在图3中。该家族成员涉及植物生长和发育调控。认为保守域负责DNA结合启动子中的顺式元件，以调节下游基因。
表5：选定的候选推定基因序列
实施例5：含有RNAi或过度表达构建体的转基因植物的开发和功效测试
为了研究候选基因的功能，产生了三组转基因植物；第一组使用来自烟草的全长编码序列(表4，SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,57,59或69)，第二组使用非烟草来源全长基因(表4，SEQ IDNO:55,67,79或81)；和第三组使用RNAi序列(SEQ ID NO:83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100或101)。使用表达载体p45-2-7(SEQ ID NO:112；图2)，其具有CsVMV启动子和NOS终止子，以及在肌动蛋白2启动子和NOS终止子指导下的具有卡那霉素选择标志物(NPT II)的盒。使用土壤杆菌转化方法将携带感兴趣的转基因的核酸构建体导入烟叶叶片中。参见例如Mayo et al.,2006,Nat Protoc.,1(3):1105-11和Horsch etal.,1985,Science 227:1229-1231。
简言之，从品红盒子种植烟草植物(Narrow Leaf Madole(NLM))，并且将叶盘切成15x150mm板。通过在50ml离心管中以3500rpm将20ml细胞悬浮液离心10分钟收集含有靶质粒的根癌土壤杆菌。除去上清液，并且将土壤杆菌细胞沉淀重悬浮于40ml液体重悬浮培养基中。将约25ml溶液转移到每个15x100mm培养皿中。在那些15x 150mm板中，将烟草叶(避开中脉)切成0.6cm盘。将叶盘上侧朝下放置，添加MS/B5液体重悬浮培养基的薄层，并用#15剃须刀片制成切片。用细点针均匀地戳叶盘。在每个再生板(15x100mm)中将8个盘上侧朝下放置。添加根癌土壤杆菌悬浮液，并且将叶盘温育10分钟。
将叶盘转移到共培养板(1/2MS培养基)中，并且将盘上侧朝下放置为与共培养TOM培养基(具有20g蔗糖/L；1mg/L IAA和2.5mg/L BAP的MS培养基)上覆盖的滤纸接触。用石蜡膜密封板并适当标记。将板在昏暗的光(60-80mE/ms)和18/6光周期在24℃温育三天。将叶盘转移到再生/选择TOM K培养基板(TOM培养基，具有300mg/l卡那霉素)，并在24℃的昏暗光下每周两次传代培养至相同的新鲜培养基，直到枝变得可切除。用镊子取出来自叶的枝，并在24℃和18/6光周期以6080mE/ms的光强度在具有100mg/L卡那霉素的MS基础培养基中插入用于生根。
当具有枝和根的小植株生长得足够大(例如，达到GA7盒的一半以上)时，将它们转移到土壤中以驯化。在转移期间，用自来水从根组织清洗凝胶。将建立的幼苗转移到温室进行进一步分析并结籽。
通过种植植物至搁置(laybe)阶段进行吸根生长表型的功效测试。将这些植物截顶，并且在截顶后的特定时间点时观察腋芽生长。
图4A显示了截顶前野生型烟草植物(左)和用RNA构建体#1(SEQ ID NO:55；右)转化的植物，并且图4B显示了截顶后指定时间时野生型植物(顶部)和用RNA构建体#1转化的植物(底部)。图4C显示了野生型植物(左)和用RNA构建体#1转化的植物(右)的T1代。相对于野生型植物，截顶后腋芽的生长在转基因植物中实质性增加。转基因植物中腋芽生长的启动已经在对植物截顶前开始，并且截顶后生长速率增加长达1周。这些结果证明了RNA构建体#1的表达可能造成芽休眠，并且基因的下调是吸根启动和生长的因素。
表达盒的序列显示在SEQ ID NO:111中，相关部分在左侧指示。
实施例6:启动子克隆、转化和分析
分析了41种候选基因的表达模式，选择了在腋芽中具有高水平表达但在其它组织中低表达水平的基因的启动子(表6)。通过实时PCR分析证实了这些克隆的表达模式(图1)。使用基因特异性引物，通过PCR方法从TN90基因组DNA克隆6个腋生分生组织特异性启动子。启动子的序列示于SEQ ID NO:113-118中。
通过用具有实施例5中所述的相同盒的嵌合候选启动子::β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因的烟草转化来分析候选启动子的表达。通过土壤杆菌属介导的转化将嵌合基因导入NLM系中。根据Crone等人,2001,Plant Cell Environ.,24:869–874的方法，使用Gus染色定位启动子表达。将转基因烟草组织置于冰上的冷90％丙酮中。当收集所有样品时，将样品置于室温下20分钟。从样品中除去丙酮，并且将染色缓冲液(0.2％Triton X-100；50mM NaHPO4缓冲液，pH7.2；2mM氰亚铁酸钾)添加至样品，均在冰上保持样品的情况下。从在DMF中的100mM X-Gluc储备溶液(其必须保持在-20℃的黑暗中)将X-Gluc添加到染色缓冲液至终浓度2mM。从样品中除去染色缓冲液，并且添加具有X-Gluc的新鲜染色缓冲液。将样品在真空下在冰上渗滤15至20分钟。将样品在37℃下温育2小时至过夜。从培养箱中取出样品，并且除去染色缓冲液。通过至95％的乙醇系列(即从10％、30％、50％、70％；如果期望的话，可以将样品加热至60℃以除去叶绿体)避光清洗样品，每步30分钟。最后，将样品保存在100％乙醇中。
用亮视野显微镜(Leica Q500MC，Cambridge，England)以低放大率检查GUS阳性植物组织，并用数码相机拍照。参见图5A和5B。使用本文中所述两种不同启动子(SEQ ID NO:113和115)的实验结果示于图5中。将幼小的幼苗染色。通过蓝色染色标示的GUS表达是在腋芽中浓缩的，指示这两种启动子在腋芽中，而非在茎或叶中是有活性的(图5A)。在SEQ IDNO:113启动子的指导下GUS的表达也在截顶后降低，这与对通过该启动子正常调节的内源基因观察到的基因表达模式一致(图5B)。这些启动子序列可用于仅在或主要在腋芽中表达基因，同时限制在植物的剩余部分中的表达。
表6：启动子分析的选择克隆
重叠群编号 启动子长度 SEQ ID NO
C5787 2248 113
C7651 2800 114
C26207 3356 115
C12866 3150 116
C41568 2964 117
C16249 941 118
实施例7：启动子和基因组合的功效测试
在转基因植物中使用启动子::GUS融合分析检测候选启动子的组织特异性表达模式后，我们构建了连续载体以仅在腋芽中表达候选基因。使用土壤杆菌属介导的转化，产生含有这些构建体的转基因植物。候选基因在转基因植物中的表达可生成抑制腋芽生长的植物，其源自候选基因的抑制或过表达。
下文显示了一些例子：
构建体1：启动子(SEQ ID NO:113)和基因(SEQ ID NO:17)
构建体2：启动子(SEQ ID NO:113)和基因(SEQ ID NO:104)
构建体3：启动子(SEQ ID NO:113)和基因(SEQ ID NO:7)
构建体4：启动子(SEQ ID NO:113)和基因(SEQ ID NO:41)
构建体5：启动子(SEQ ID NO:113)和基因(SEQ ID NO:5)
构建体6：启动子(SEQ ID NO:118)和基因(SEQ ID NO:17)
构建体7：启动子(SEQ ID NO:118)和基因(SEQ ID NO:104)
构建体8：启动子(SEQ ID NO:118)和基因(SEQ ID NO:7)
构建体9：启动子(SEQ ID NO:118)和基因(SEQ ID NO:41)
构建体10：启动子(SEQ ID NO:118)和基因(SEQ ID NO:5)
构建体11：启动子(SEQ ID NO:115)和基因(SEQ ID NO:17)
构建体12：启动子(SEQ ID NO:115)和基因(SEQ ID NO:104)
构建体13：启动子(SEQ ID NO:115)和基因(SEQ ID NO:7)
构建体14：启动子(SEQ ID NO:115)和基因(SEQ ID NO:41)
构建体15：启动子(SEQ ID NO:115)和基因(SEQ ID NO:5)
构建体16：启动子(SEQ ID NO:117)和基因(SEQ ID NO:17)
构建体17：启动子(SEQ ID NO:117)和基因(SEQ ID NO:104)
构建体18：启动子(SEQ ID NO:117)和基因(SEQ ID NO:7)
构建体19：启动子(SEQ ID NO:117)和基因(SEQ ID NO:41)
构建体20：启动子(SEQ ID NO:117)和基因(SEQ ID NO:5)
对构建体1-20的影响的功效测试将在温室和田间条件下进行。将转基因植物和匹配的野生型对照种植到搁置阶段并且截顶。用度量测量吸根生长，所述度量包括吸根总数、吸根生长速率、以及吸根除去后新吸根的出现。这些测量将通过手动或数字成像技术进行。田间效应测试还将决定正常农学实践下所需要的吸根控制化学应用的类型和范围。使用此度量，将基因表达构建体对腋芽起始和生长的影响与相同品种的野生型植物进行比较。同时，将量化这项技术对与吸根控制相关的成本和最终干叶中发现的化学残留物变化的影响。
实施例8：TALEN介导的诱变
转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)技术用于在TN90、K326和Narrow LeafMadole等商业烟草品种中进行基因组修饰。TALEN通过在DNA靶序列中诱导双链断裂(DSB)来实现遗传修饰。可以利用通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性指导修复(HDR)介导的途径进行的随后的DNA断裂修复来引入期望的修饰(例如基因破坏、基因校正或基因插入)。
为了将TALEN和供体DNA导入植物细胞中，使用了PEG介导的原生质体转化。将来自无菌培养物的4-8周龄烟草植物的烟草叶切成小块，并转移到含有具有1.0％纤维素酶onuzuka R10和0.5％Macerozym的灭菌酶溶液的培养皿中。使用干燥器将培养皿中的叶条在黑暗中真空浸渗30分钟。温育后，将消化的叶以45rpm摇动重悬浮230分钟，并且然后通过收集在50ml离心管中过滤通过无菌尼龙过滤器(100μm孔径)。用离心机以100g将置于Lymphoprep上的溶液分离10分钟。使用巴斯德吸管收集原生质体条带，并用等体积的含有NaCl、CaCl2、KCl、MES和葡萄糖的W5n溶液清洗纯化的原生质体，并以2000rpm离心5分钟。将原生质体团粒在W5n溶液中以2x105/ml重悬浮，并在冰上放置30分钟。然后，除去上清液，并且将原生质体团粒重悬浮于过滤灭菌的含有甘露醇，MgCl2和MES的MMM溶液中。
在略有修改的情况下根据Zhang等人(2012)描述的方法进行烟草原生质体的PEG转染。将500μl等分试样的原生质体悬浮液转移到10ml培养管中，并将25μl(10μg)质粒DNA缓慢添加到原生质体悬浮液中。在原生质体DNA溶液中添加525μl PEG溶液，并通过敲击管仔细混合。将管温育20分钟，然后添加2.5ml W5n溶液以终止反应。将溶液在100g下离心5分钟，并用原生质体培养基清洗。将PEG处理的原生质体重悬浮于含有0.1mg/l NAA和0.5mg/lBAP的1ml培养基中，并与1ml低熔点琼脂混合以制备原生质体珠。将原生质体珠在液体培养基中培养，将从原生质球珠生长的愈伤组织转移到固体发芽培养基上。当枝发育良好时，将枝转移到品红色盒子中以进行根形成。当根系完全发育并恢复枝生长时，将植物移植到土壤中。
可用于预防或减少吸根生长的TALEN方法包括：(1)对于烟草品种中靶向基因组整合，设计基因特异性TALEN和具有同源性衍生的重组(HDR)的供体DNA；(2)对于烟草基因组中吸根特异性启动子和靶基因插入；和(3)对于靶基因破坏，使用基因特异性TALEN(用例如非同源末端连接(NHEJ))将TALEN引导至靶基因破坏。
(1)靶向基因组整合：
(A)编码序列对腋芽中具有高度特异性表达的基因的启动子区的靶向基因组整合：
代替使用常规转化方法的随机基因插入，编码序列对腋芽中具有高度特异性表达的基因的启动子区域中的靶向基因组整合可用于通过内源性启动子活性控制编码序列的表达。靶向基因组整合方法的一个实例是启动子(SEQ ID NO:118)和编码序列(SEQ ID NO:1)的组合。使用此类构建体，将编码序列(或一种以上编码序列)同源重组入启动子序列的基因组区域中并由启动子控制。
TALEN供体序列显示在SEQ ID NO:119中(启动子和靶序列有下划线，并且靶基因序列为粗体)，并且TALEN靶序列显示于SEQ ID NO:120(靶序列有下划线)。
(B)启动子和编码序列对腋芽中具有高度特异性表达的基因的启动子区的靶向基因组整合：
为了有效提供双重剂量的启动子控制，可以将吸根特异性启动子和编码序列插入到在腋芽中高度表达的基因的启动子区域中。在这种方法中，两种启动子一起起作用来控制一种或多种编码序列。例如，在启动子(SEQ ID NO:118)的一端中，使用TALEN技术插入包含启动子(SEQ ID NO:113)和编码序列(SEQ ID NO:13)的构建体，从而通过这两种启动子(SEQ ID NO:118和113)指导编码序列的表达。
TALEN供体序列显示于SEQ ID NO:121(内源启动子有下划线，并且外源启动子为斜体，并且靶基因为粗体)。
(C)吸根特异性启动子和编码序列插入
靶向基因整合的另一个选择是通过TALEN将选定的烟草启动子和编码序列插入烟草基因组的有效位置中。
(2)靶基因破坏
为了在不使用RNAi构建体的情况下破坏候选基因的功能，设计了基因特异性TALEN并将其导入烟草细胞，导致缺失或插入以敲除一种或多种内源基因。例如，鉴定编码序列(SEQ ID NO:104)中的潜在TALEN靶位点，并选择该基因的编码序列内的同源重组位点。
TALEN靶序列显示于SEQ ID NO:122(靶序列有下划线)。
实施例9：别的转基因策略
本文描述了调节吸根长出的以下策略。
应用的第一种策略是调节腋芽长出基因表达。拟南芥、稻和大麦的突变体研究提示了调控分枝的遗传途径是复杂的。调节分枝的基因有两大类。一类基因限制了芽的长出，并且由具有增加的分枝的突变体定义。参见例如拟南芥BRANCHED1基因(例如SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:13、35、37、39中所示的可能的烟草同系物)和拟南芥更多腋生分枝(MoreAxillary Branching，MAX)基因。另一类基因促进腋生分生组织发育，并由具有减少的分枝的突变体定义。参见例如拟南芥侧体抑制物(Lateral Suppressor，LAS)基因和烟草中可能的同源物(例如，SEQ ID NO:71或73)以及拟南芥腋生分生组织调节剂(Regulator ofAxillary Meristems，RAX)和可能的烟草同源物(例如，SEQ ID NO:75和77)。
应用的第二种策略是调节烟草细胞分裂素的合成和分布。作为植物激素，细胞分裂素在枝条生长、叶片衰老延缓、根生长抑制，种子萌发和胁迫响应中发挥了许多调节作用。众所周知，细胞分裂素促进腋芽生长。当细胞分裂素直接施用于腋芽或通过木质部流提供时，侧枝增加。细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CKX)是一种降解细胞分裂素的酶。单个CKX基因的过表达建立了细胞分裂素缺陷型植物，并揭示了细胞分裂素是枝分生组织活性的正调节物。另一方面，CKX在稻中的表达降低导致枝分生组织中的细胞分裂素积聚，从而增加芽(诸如花芽)的数目，最终导致籽粒产量(grain yield)提高。基于这些结果，腋芽中的CKX表达可以在将枝顶端分生组织截顶后抑制或延迟烟草中腋芽长出。
截去枝顶端将腋芽从其休眠中释放出来，并且它们开始长出来。源自完整枝顶端的生长素抑制腋芽长出，而通过截去枝顶端诱导的细胞分裂素刺激腋芽长出。通过在腋芽特异性启动子控制下过表达相关酶在腋芽区域中消减细胞分裂素可用于抑制腋生分生组织长出。涉及该策略的候选基因是拟南芥细胞分裂素氧化酶(CKX；编码SEQ ID NO:56的SEQID NO:55)；烟草CKX(SEQ ID NO:57、59或61)；和烟草腺苷磷酸异戊烯基转移酶(IPT)(SEQID NO:61)。
应用的第三种策略是通过破坏腋生顶端分生组织发育来控制腋芽长出。转基因植物中有两种类型的转基因表达：组成性表达和组织特异性表达。如果在某个组织中关键意义的基因在其它组织中是缺少表达的，则组成性基因表达可导致出乎意料的问题。与基因的组成性表达不同，组织特异性表达是靶组织中基因调控的结果。对于组织特异性表达，启动子可以以组织依赖的方式并根据植物的发育阶段来控制给定基因的表达。在我们的情况中，启动子是从在腋芽中特异性表达的基因获得的，并且启动子定义为调节芽中的基因表达。为了控制枝顶端分生组织的吸根生长，启动子(或经修饰的启动子)可用于在烟草植物中指导异源基因的表达。作为腋芽特异性表达的结果，可操作地连接到启动子的异源基因(或转基因)在腋芽中表达，其中转基因的表达是期望的，使植物的其余部分不受转基因表达的影响。
植物的枝分生组织由通过涉及同源盒WUSCHEL(WUS)基因和CLAVATA(CLV)基因信号传导途径的经典反馈途径连续补充的干细胞组成。在腋芽中WUSHEL序列的靶向或CLAVATA基因的过表达改变了途径并引起枝分生组织发育中的缺陷并抑制枝长出。候选基因是WUS(SEQ ID NO:63和65)和CLV3(SEQ ID NO:67)。
克隆并表征了CENTRORADIALIS(CEN)基因，其是金鱼草属(Antirrhinum)中枝分生组织的无限生长所需要的。当在烟草中表达基因时，烟草植物显示延长的营养期，延迟向开花的转变。在烟草中，CET基因(来自“烟草的CEN样基因(CEN-like genes from tobacco)”)在主枝分生组织中不表达；其表达仅限于营养性腋生分生组织。明显的是，CET基因在营养腋生分生组织发育至腋芽生长中起作用，但是它们的实际功能仍然是未知的。当它们的表达使用RNAi_CET构建体沉默时，转基因植物在截顶后显示芽生长迟缓。
实施例10：实验数据
通过在染色溶液(50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0，1mM EDTA，0.5mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-D GlcUA[X-Gluc；Biosynth AG]，0.4％Triton X-100，和各5mM氰化铁/亚铁)中浸没针对GUS对植物组织染色，并在37℃温育6-24小时。
已经显示SEQ ID NO:117中所示的启动子是在截顶前和截顶后15天的腋芽中特异性表达的良好候选物。截顶前的枝顶端分生组织区中没有表达。SEQ ID NO:117中所示的启动子(约2.5kb)是SEQ ID NO:27的序列的5'端上游，所述序列编码真核翻译起始因子3，亚基A(eIF-3A)，即真核生物翻译起始因子3(eIF-3)复合物的组分，该组分对于蛋白质合成起始中的几个步骤是必需的。
通过共转化过表达和/或敲低(使用例如RNAi，在SEQ ID NO:117中所示的启动子的控制下)堆叠几种基因。以下是通过共转化堆叠在一起的构建体和基因。
a)启动子SEQ ID NO:117-RNAi_CET2-26-6，其靶向CET2,SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:49；
b)启动子SEQ ID NO:117-RNAi_CET2-26-6，与启动子SEQ ID NO:117-AtBRC1(SEQID NO:81)共转化；
c)启动子SEQ ID NO:117-RNAi_CET2-26-6，与启动子SEQ ID NO:117-SEQ ID NO:1共转化；和
d)启动子SEQ ID NO:117-SEQ ID NO:1，与启动子SEQ ID NO:117-AtBRC1(SEQ IDNO:81)共转化。
应当理解，虽然在此结合多个不同方面描述了方法和物质组合物，但是各方面的前述描述旨在说明而不是限制方法和物质组合物的范围。其它方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。
附录A
转化盒序列(SEQ ID NO：111)
农杆菌转化质粒p45-2-7序列(SEQ ID NO：112)

Claims (39)

1.烟草杂种、品种、品系或栽培种，其包含在一种或多种具有选自下组的序列的核酸中具有突变的植物：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75和77。
2.权利要求1的烟草杂种、品种、品系或栽培种，其中相对于缺乏所述突变的植物，所述植物展现出降低的腋芽生长。
3.由权利要求1的烟草杂种、品种、品系或栽培种生成的种子，所述种子包含所述一种或多种核酸中的所述突变。
4.制备烟草植物的方法，其包括以下步骤：
诱导烟草细胞中的诱变以生成诱变细胞；
从所述诱变细胞获得一个或多个植物；并且
鉴定至少一个植物，所述植物包含在一种或多种具有选自下组的序列的核酸中的突变：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75、和77。
5.权利要求4的方法，其进一步包括鉴定相对于缺乏所述突变的植物展现出降低的腋芽生长的至少一个植物。
6.权利要求4的方法，其中使用化学诱变剂或电离辐射诱导诱变。
7.权利要求6的方法，其中所述化学诱变剂选自下组：亚硝酸、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙啶、和甲磺酸乙酯(EMS)。
8.权利要求6的方法，其中所述电离辐射选自下组：x-射线、gamma射线、快中子照射和UV照射。
9.权利要求4的方法，其中使用TALEN诱导诱变。
10.权利要求4的方法，其中使用锌指技术诱导诱变。
11.用于生成烟草植物的方法，所述方法包括以下步骤：
将第一烟草系的至少一个植物与第二烟草系的至少一个植物杂交，所述第一烟草系的植物在一种或多种具有选自下组的序列的核酸中具有突变：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75、和77；并且
选择具有所述突变的后代烟草植物。
12.权利要求11的方法，其进一步包括选择相对于缺乏所述突变的植物展现出降低的腋芽生长的后代烟草植物。
13.烟草产品，其包含来自烟草植物的干叶，所述烟草植物具有在一种或多种具有选自下组的序列的核酸中的突变：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75和77。
14.权利要求13的烟草产品，其中相对于来自缺乏所述突变的植物的叶，所述烟草植物展现出降低的腋芽生长。
15.权利要求13的烟草产品，其中相对于来自缺乏所述突变的植物的叶，所述烟草植物展现出降低的MH残基。
16.生产烟草产品的方法，所述方法包括：
从烟草植物提供干叶，所述烟草植物具有在一种或多种具有选自下组的序列的核酸中的突变：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75和77；并且
使用所述干叶制造烟草产品。
17.权利要求16的方法，其中相对于来自缺乏所述突变的植物的干叶，所述烟草植物展现出降低的腋芽生长。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述突变选自下组：点突变、插入、缺失和取代。
19.转基因烟草植物，其包含含有核酸分子的植物表达载体，所述核酸分子的长度是至少25个核苷酸并且与选自下组的序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。
20.权利要求19的转基因烟草植物，所述核酸分子与选自下组的序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。
21.权利要求19的转基因烟草植物，其中所述核酸分子的表达导致相对于不表达所述核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的植物。
22.由权利要求19的转基因烟草植物生成的种子，其中所述种子包含所述表达载体。
23.转基因烟草植物，其包含长度为至少25个核苷酸的异源核酸分子，其中所述核酸分子在严格条件下与选自下组的核酸序列杂交：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。
24.权利要求23的转基因烟草植物，所述异源核酸分子在严格条件下与选自下组的核酸序列杂交：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。
25.权利要求23的转基因烟草植物，其中所述异源核酸分子的表达导致相对于不表达所述核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的植物。
26.由权利要求23的转基因烟草植物生成的种子，其中所述种子包含所述异源核酸分子。
27.制备转基因植物的方法，其包括表达编码双链RNA分子的转基因，所述双链RNA分子抑制来自选自下组的核酸序列的表达：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75和77，其中所述双链RNA分子包含与选自下组的序列具有91％或更大的序列同一性的至少25个连续核苷酸：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、69、71、73、75和77。
28.权利要求27的方法，其中所述转基因的表达导致相对于不表达所述转基因的植物展现出降低的腋芽生长的植物。
29.烟草产品，其包含来自权利要求19-21或23-25中任一项的转基因烟草植物的干叶。
30.生产烟草产品的方法，所述方法包括：
提供来自权利要求19-21或23-25中任一项的转基因烟草植物的干叶；并且
使用所述干叶制造烟草产品。
31.降低烟草植物中的腋芽生长的方法，其包括将与启动子可操作连接的异源核酸分子导入烟草细胞中以生成转基因烟草细胞，并且从所述转基因烟草细胞再生转基因烟草植物，所述异源核酸分子包含至少25个核苷酸的长度并且与选自下组的核酸序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81，其中所述转基因烟草植物展现出降低的腋芽生长。
32.权利要求31的方法，所述异源核酸分子与选自下组的核酸序列具有至少91％的序列同一性：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81。
33.权利要求31的方法，其中所述核酸分子的表达导致相对于不表达所述核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的植物。
34.权利要求31的方法，其进一步包括选择至少一个相对于不表达所述异源核酸分子的烟草植物展现出降低的腋芽生长的转基因烟草植物。
35.权利要求31的方法，其中所述核酸为有义取向。
36.权利要求31的方法，其中所述核酸为反义取向。
37.权利要求27或31的方法，其中使用颗粒轰击、土壤杆菌属介导的转化、显微注射、聚乙二醇介导的转化、脂质体介导的DNA摄取、或电穿孔将所述核酸分子导入所述烟草细胞中。
38.权利要求27或31的方法，其中所述烟草植物选自下组：Burley型、黑暗型(darktype)、烤干型(flue-cured type)、Maryland型、和Oriental型。
39.权利要求27或31的方法，其中所述烟草植物是选自下组的品种：BU 64、CC 101、CC200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC700、CC 800、CC 900、CC 1063、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao烟草、GL 26H、GL 338、GL 350、GL 395、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、GF157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 196、NC37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC 95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH2254、PVH 2275、VA 116、VA 119,、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal SmithMadole、OXFORD 207、‘Perique’烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309或VA359。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108450227A (zh) * 2018-01-30 2018-08-28 山东博华高效生态农业科技有限公司 一种葡萄的整枝方法
CN109715810A (zh) * 2016-03-11 2019-05-03 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产烟杈减少或消除的烟草植物和制品的组合物和方法
CN111108205A (zh) * 2017-09-11 2020-05-05 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产烟杈减少或消除的烟草植物和制品的组合物和方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113652416A (zh) 2014-10-06 2021-11-16 奥驰亚客户服务有限公司 烟草植物中腋芽生长的遗传控制
CN108779156A (zh) * 2016-01-15 2018-11-09 基根奈公司 修饰植物中侧向出芽的方法和从所述方法产生的植物
BR112018014438A2 (pt) * 2016-01-15 2018-12-26 British American Tobacco Investments Ltd método para modificação de brotamento lateral, método para produzir uma planta, planta, material de propagação de plantas, folha, método, célula, produto de tabaco, extrato de planta, uso da planta, semente, uso do polinucleotídeo
EP3437465A4 (en) 2016-03-30 2019-10-16 Japan Tobacco Inc. TOBACCO AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME
CN106497946A (zh) * 2016-10-21 2017-03-15 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草腋芽生长调控基因NtIPT1及其克隆方法与应用
CN106350524A (zh) * 2016-11-04 2017-01-25 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草腋芽生长调控基因NtBRC1及其克隆方法与应用
CN106636140A (zh) * 2016-11-08 2017-05-10 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草干旱响应基因NtXERICO及其克隆方法与应用
BR112019019030A2 (pt) 2017-03-16 2020-04-22 Japan Tobacco Inc planta de tabaco e método de produção da mesma
EP3597744A4 (en) 2017-03-16 2021-01-20 Japan Tobacco Inc. TOBACCO PLAN AND ITS PRODUCTION PROCESS
WO2020028632A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Altria Client Services Llc Optimized tissue-preferred promoter and uses thereof
JP2022535742A (ja) * 2019-05-29 2022-08-10 アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 吸枝が低減または消失したタバコ植物および製品を産生するための組成物および方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1824774A (zh) * 2004-11-12 2006-08-30 贾朝钧 一种打顶后无腋芽烟草的培育方法
CN101048508A (zh) * 2004-09-29 2007-10-03 先进技术(剑桥)有限公司 植物发育和形态学的修饰
EP2383344A4 (en) * 2009-01-13 2012-06-13 Consejo Superior Investigacion REGULATORY GENES OF PLANT BREEDING, PROMOTERS, GENETIC CONSTRUCTS CONTAINING THEM AND USES THEREOF

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4091823A (en) 1976-07-12 1978-05-30 Liggett Group Inc. Cyclogeraniol and derivatives thereof as tobacco flavorants
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
US4660577A (en) 1982-08-20 1987-04-28 R.J. Reynolds Tobacco Company Dry pre-mix for moist snuff
US4528993A (en) 1982-08-20 1985-07-16 R. J. Reynolds Tobacco Company Process for producing moist snuff
US4516590A (en) 1982-11-26 1985-05-14 Philip Morris Incorporated Air-cured bright tobacco filler, blends and smoking articles
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US4732856A (en) 1984-04-03 1988-03-22 Carnegie Institution Of Washington Transposable elements and process for using same
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4678904A (en) 1984-07-06 1987-07-07 Technology Dynamics, Inc. Optical measuring device using a spectral modulation sensor having an optically resonant structure
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5254799A (en) 1985-01-18 1993-10-19 Plant Genetic Systems N.V. Transformation vectors allowing expression of Bacillus thuringiensis endotoxins in plants
US4638816A (en) 1985-03-22 1987-01-27 Philip Morris Incorporated Smoking compositions containing a glycosylamine flavorant additive
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US4975374A (en) 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US4848373A (en) 1987-04-13 1989-07-18 Helme Tobacco Company Nicotine removal process and product produced thereby
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5085325A (en) 1988-03-08 1992-02-04 Simco/Ramic Corporation Color sorting system and method
US5013658A (en) 1988-05-13 1991-05-07 Dna Plant Technology Corporation Transposon tagging of genes in transformed plants
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US4987907A (en) 1988-06-29 1991-01-29 Helme Tobacco Company Chewing tobacco composition and process for producing same
US5162602A (en) 1988-11-10 1992-11-10 Regents Of The University Of Minnesota Corn plants tolerant to sethoxydim and haloxyfop herbicides
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5164180A (en) 1989-05-18 1992-11-17 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5767366A (en) 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
US5372149A (en) 1992-03-25 1994-12-13 Roth; David S. Sterilization process in the manufacturing of snuff
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
DE69425903T2 (de) 1993-12-09 2001-02-15 Thomas Jefferson University Ph Verbindungen und verfahren zur ortsspezifischen mutation in eukaryotischen zellen
US5491081A (en) 1994-01-26 1996-02-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean cyst nematode resistant soybeans and methods of breeding and identifying resistant plants
US6808904B2 (en) 1994-06-16 2004-10-26 Syngenta Participations Ag Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US5689035A (en) 1995-09-26 1997-11-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brown stem rot resistance in soybeans
ATE443437T1 (de) 1995-10-13 2009-10-15 Dow Agrosciences Llc Modifiziertes bacillus thuringiensis gen zur kontrolle von lepidoptera in pflanzen
US5760012A (en) 1996-05-01 1998-06-02 Thomas Jefferson University Methods and compounds for curing diseases caused by mutations
US5731181A (en) 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
DE19631255A1 (de) 1996-08-02 1998-02-05 Amazonen Werke Dreyer H Rüttelegge
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
KR20010020375A (ko) 1997-04-30 2001-03-15 무레 미카엘 에프. 간세포에서 유전적 병소를 교정하기 위한 재조합에 의해 만들어진 올리고뉴클레오염기의 ｉｎ ｖｉｖｏ에서의 용도
CA2298886A1 (en) 1997-08-05 1999-02-18 Kimeragen, Inc. The use of mixed duplex oligonucleotides to effect localized genetic changes in plants
GB9819693D0 (en) 1998-09-10 1998-11-04 Zeneca Ltd Glyphosate formulation
US6410872B2 (en) 1999-03-26 2002-06-25 Key Technology, Inc. Agricultural article inspection apparatus and method employing spectral manipulation to enhance detection contrast ratio
WO2000058035A1 (en) 1999-03-29 2000-10-05 Src Vision, Inc. Multi-band spectral sorting system for light-weight articles
US6451732B1 (en) 1999-06-04 2002-09-17 Syngenta, Limited Herbicidal compositions of glyphosate trimesium
CA2804117A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Thomas Schmulling Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology
EP1458874A2 (en) * 2001-12-10 2004-09-22 Thomas Schmulling Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology comprising expression of plant cytokinin oxidase
US6930492B2 (en) 2002-08-29 2005-08-16 Malcam Ltd. Using surface microwaves for measuring and determining density and/or moisture content of a material
US7025066B2 (en) 2002-10-31 2006-04-11 Jerry Wayne Lawson Method of reducing the sucrose ester concentration of a tobacco mixture
US20040118422A1 (en) 2002-12-19 2004-06-24 Swedish Match North Europe Ab Tobacco dough and a method for its manufacture
CN104397869B (zh) 2003-11-07 2016-06-08 美国无烟烟草有限责任公司 烟草组合物
US8627828B2 (en) 2003-11-07 2014-01-14 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco compositions
WO2005063060A1 (en) 2003-12-22 2005-07-14 U.S. Smokeless Tobacco Company Conditioning process for tobacco and/or snuff compositions
GB2416139A (en) * 2004-07-16 2006-01-18 Howard Paul Davis Mist injector for gas treatment
US20070199097A1 (en) * 2004-09-03 2007-08-23 U.S. Smokeless Tobacco Company Tobacco plants having a mutation in a nicotine demethylase gene
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
ATE530656T1 (de) 2005-02-23 2011-11-15 Univ North Carolina State Veränderung des alkaloidgehaltes in tabak durch modifikation spezifischer cytochrome p450 gene.
US7741548B2 (en) 2005-05-12 2010-06-22 University Of Connecticut Method and composition for increasing branching and flowering response in plants
CN101802215A (zh) 2006-10-12 2010-08-11 孟山都技术有限公司 植物微rna及其使用方法
US8319011B2 (en) 2006-12-15 2012-11-27 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity
CN101939431B (zh) 2007-11-12 2015-01-28 北卡罗来纳州立大学 通过修饰特定细胞色素p450基因改变烟草生物碱含量
US8953158B2 (en) 2009-09-04 2015-02-10 Danny S. Moshe Grading of agricultural products via hyper spectral imaging and analysis
EA033565B1 (ru) 2010-01-15 2019-11-05 Univ North Carolina State Композиции и способы, предназначенные для минимизации синтеза норникотина в растениях табака
CA2796346C (en) 2010-04-14 2018-10-02 Altria Client Services Inc. Preformed smokeless tobacco product
WO2012019025A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Frank Scott Atchley Fabric having tobacco entangled with structural fibers
CN103458716B (zh) 2010-08-05 2017-11-10 奥驰亚客户服务公司 复合无烟烟草产品、系统及方法
CN102943075B (zh) * 2012-10-16 2014-08-13 中国农业科学院作物科学研究所 棉花GhTCP2基因启动子及其应用
CN113652416A (zh) 2014-10-06 2021-11-16 奥驰亚客户服务有限公司 烟草植物中腋芽生长的遗传控制

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101048508A (zh) * 2004-09-29 2007-10-03 先进技术(剑桥)有限公司 植物发育和形态学的修饰
CN1824774A (zh) * 2004-11-12 2006-08-30 贾朝钧 一种打顶后无腋芽烟草的培育方法
EP2383344A4 (en) * 2009-01-13 2012-06-13 Consejo Superior Investigacion REGULATORY GENES OF PLANT BREEDING, PROMOTERS, GENETIC CONSTRUCTS CONTAINING THEM AND USES THEREOF

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109715810A (zh) * 2016-03-11 2019-05-03 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产烟杈减少或消除的烟草植物和制品的组合物和方法
US11807860B2 (en) 2016-03-11 2023-11-07 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having reduced or eliminated suckers
CN111108205A (zh) * 2017-09-11 2020-05-05 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产烟杈减少或消除的烟草植物和制品的组合物和方法
US11879130B2 (en) 2017-09-11 2024-01-23 Altria Client Services Llc Compositions and methods for producing tobacco plants and products having reduced or eliminated suckers
CN108450227A (zh) * 2018-01-30 2018-08-28 山东博华高效生态农业科技有限公司 一种葡萄的整枝方法

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