MX2012003981A - Generacion de plantas haploides y cruza de plantas mejorada. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos y composiciones para generar organismos haploides.

Description

GENERACIÓN DE PLANTAS HAPLOIDES Y CRUZA DE PLANTAS MEJORADA Antecedentes de la Invención Aunque los programas de cruza de plantas mundialmente han realizado considerable avance en desarrollar nuevos cultivos con resistencias a enfermedades, rendimientos y otros rasgos útiles mejorados, la cosa como todo depende de seleccionar numerosas plantas para identificar nuevas características deseables. Números muy grandes de progenies de cruzas frecuentemente deben ser cultivados y evaluados en varios años con el fin de seleccionar una o unas pocas plantas con una combinación deseada de rasgos.

La cruza estándar de plantas diploides frecuentemente requiere la selección y retrocruza de un número grande de plantas para obtener el genotipo deseado. Una solución al problema de seleccionar grandes números de progenie ha sido producir plantas haploides, los cromosomas de las cuales pueden ser duplicados usando colchicina u otros medios para obtener instantáneamente plantas doble-haploides homócigas .

Así, mejoras marcadas en la economía de cruce pueden ser obtenidas vía producción haploide duplicada, puesto que la selección y otras eficiencias de procedimiento pueden ser mejoradas marcadamente al utilizar progenies de cruza verdadera (homócigas). Con los esquemas de producción haploides duplicados, se obtiene la homocigocidad en una generación. Así, el cultivador puede eliminar los numerosos ciclos de endogamia innecesaria mediante métodos convencionales para obtener niveles prácticos de homocigocidad. Por supuesto, la verdad homocigocidad para todos los rasgos no es aún obtenible mediante métodos de cruza convencionales.

Breve descripción de la invención La presente invención provee las maneras para producir organismos haploides.

En algunas modalidades, la invención provee una planta transgénica que comprende un cásete de expresión de transgen heterólogo, el cásete de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 o NUF2 alterado, en donde en el evento que el polipéptido alterado recombinant'emente sea expresado en una primera planta que tiene un gen CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 o NUF2 endógeno desactivado correspondiente y la primera planta es cruzada con una planta tipo silvestre, por lo menos 0.1% de la progenie resultante son haploides.

En algunas modalidades, uno o dos alelos de la secuencia de codificación genómica de CENH3, CENPC, IS12, NDC80 o NUF2 endógena de la planta es desactivado o noqueado. En algunas modalidades, todos los alelos de la secuencia de codificación genómica CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 o NUF2 endógena de la planta son inactivados o noqueados. En algunas modalidades, la planta, cuando es cruzada con una planta tipo silvestre, genera por lo menos 0.1% (o por ejemplo, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20% o más) de progenie haploide.

En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido de CENH3 alterado recombinantemente . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos heterologa de por lo menos 5 aminoácidos enlazados a una proteina que comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona, en donde la secuencia de aminoácidos es heterologa al dominio de pliegue de CENH3 histona. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heterologa es enlazada directamente al dominio de pliegue de CENH3 histona y el polipéptido carece de un dominio de cola de CENH3. En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos heterologa es enlazada al dominio de pliegue de CDENH3 histona vía una secuencia de proteina intermedia. En algunas modalidades, la secuencia de. proteina intermedia comprende un dominio de cola de H3 sin CENH3 histona. En algunas modalidades, el dominio de cola de H3 sin CENH3 histona comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 70% idéntica a SEQ ID NO: 95 o un fragmento del mismo de por lo menos 20 aminoácidos de largo.

En algunas modalidades, la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola de CENH3. En algunas modalidades, la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola de H3 histona y un dominio de cola de CENH3 histona heteróloga. En algunas modalidades, el dominio de cola de CVENH3 es heteróloga con el dominio de pliegue de CENH3 histona.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga es de por lo menos 10 aminoácidos de largo. En algunas modalidades, la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola intermedia de H3 histona y un dominio de cola de CENH3 de histona heteróloga. Las secuencias de aminoácidos heterologas comprenden una proteina fluorescente verde. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga disrumpe centrómeros. En algunas modalidades, el dominio de pliegue de CENH3 histona es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos.: 49-94.

En algunas modalidades, el polipéptido comprende un dominio de cola sin CENH3 enlazado a un dominio de CENH3 histona .

En algunas modalidades, el polipéptido comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona y un dominio de cola de CENH3 truncado, en donde el término amino del dominio de cola es truncado en relación con el dominio de cola endógeno de la planta. En algunas modalidades, el dominio de cola de CENH3 truncado carece de tres o más aminoácidos terminales del dominio de cola endógeno. En algunas modalidades, una secuencia de aminoácidos heteróloga es enlazada al término amino del dominio de cola truncado. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga es de por lo menos 10 aminoácidos de largo. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende proteina fluorescente verde. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga disrumpe centrómeros. En algunas modalidades, el dominio de pliegue de CENH3 histona es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos.: 49-94.

En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido CENPC, MIS12, NDC80 y NUF2 alterado recombinantemente .

La presente invención también provee un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende: un dominio de cola sin CENH3 enlazado a un dominio de pliegue de CENH3 histona o un dominio de cola de CENH3 truncado enlazado a un dominio de pliegue de CENH3 histona, en donde el término amino del dominio de cola es truncado.

La presente invención también provee una planta que comprende un CENH3 silenciado o una o dos copias de un alelo de un gen de CENH3 noqueado, desactivado o mutado endógeno.

La presente invención también provee un método para generar una planta haploide, el método comprende: cruzar una planta que expresa una proteína de CENH3 endógena con una planta transgénica que comprende un cásete de expresión de transgen heterólogo, el cásete de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 o NUF2 alterado recombinantemente , en donde, en el caso de que el polipéptido alterado recombinantemente sea expresado en una primera planta que tiene un gen de CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 o NUF2 endógeno desactivado correspondiente y la primera planta es cruzada con una planta tipo silvestre, por lo menos 0.1% de la progenie resultante son haploides y seleccionar la progenie haploide Fl generada de la etapa de cruza .

En algunas modalidades, la planta que expresa una proteína de CENH3 endógeno es un padre de polen de la cruza.

En algunas modalidades, la planta que expresa una proteína de CENH3 endógena es un padre de óvulo de la cruza.

En algunas modalidades, el método comprende además convertir por lo menos una planta haploide seleccionada a una planta haploide duplicada.

Un método de fabricación de una planta transgénica que comprende un cásete de expresión de transgen heterólogo, el cásete de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polipéptido que codifica un polipéptido CENH3, CENPC, MIS12, NDC80 o NUF2 alternado recombinantemente, en donde, en el caso de que el polipéptido alterado recombinantemente sea expresado en una primera planta que tiene un gen de CENH3 , CENPC, MIS12, NDC80 o NUF2 endógeno desactivado correspondiente y la primera planta es cruzada con una planta tipo silvestre, por lo menos 0.1% de la progenie resultante son haploides, el método comprende: transformar células de plantas con un ácido nucleico que comprende el cásete de expresión y seleccionar transformantes que comprenden el ácido nucleico, fabricando mediante esto la planta.

En algunas modalidades, la presente invención provee un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende: una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5 aminoácidos enlazados a una proteina que comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona, en donde la secuencia de aminoácidos es heteróloga al dominio de pliegue de CENH3 histona o una proteina que comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona y un dominio de cola de CENH3 truncado, en donde el término amino del dominio de cola es truncado.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga es enlazada directamente al dominio de pliegue de CENH3 histona. En algunas modalidades, el polipéptido carece de un dominio de cola de CENH3.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heterologa es enlazada al dominio de pliegue de CENH3 histona vía una secuencia de proteina intermedia. En algunas modalidades, la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola de H3 sin CENH3 histona. En algunas modalidades, la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola de CENH3. En algunas modalidades, el dominio de cola de CENH3 es heterologo con el dominio de pliegue de CENH3 histona. En algunas modalidades, el dominio de cola de H3 sinCENH3 histona comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 70% idéntica a SEQ ID No.: 95 o un fragmento de la misma de por lo menos 20 aminoácidos de larga. En algunas modalidades, la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola de H3 histona y un dominio de cola de CENH3 histona heterologa.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heterologa es de por lo menos 3, 5, 10, 15, 20, 30 o 50 aminoácidos de largo, que carece opcionalmente de una estructura secundaria fija.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heterologa comprende proteína fluorescente verde.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heterologa disrumpe centrómeros.

En algunas modalidades, el dominio de pliegue de CENH3 histona es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos . : 49-94.

En algunas modalidades, el polipéptido comprende una proteína que comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona y un dominio de cola de CENH3 truncado, en donde el término amino del dominio de cola es truncado.

En algunas modalidades, el dominio de cola de CENH3 truncado carece de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 o 20 aminoácidos terminales del dominio de cola endógeno. En algunas modalidades, una secuencia de aminoácidos heteróloga es enlazada al término amino del dominio de cola truncado. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga es de por lo menos 3, 5, 10, 15, 20, 30 o 50 aminoácidos de larga. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos •heteróloga comprende proteína fluorescente verde. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga disrumpe centrómeros .

En algunas modalidades, el dominio de pliegue de CENH3 histona es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos. : 49-94.

La presente invención también provee un cásete de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos enlistados anteriormente, en donde el cásete de expresión comprende un promotor enlazado operativamente al polinucleótido que codifica un polipéptido. En algunas modalidades, la invención provee un vector que comprende el cásete de expresión.

En algunas modalidades, la invención provee una planta que comprende el cásete de expresión.

En algunas modalidades, el dominio de cola de histona heterologo comprende un dominio de cola de H3 histona o un dominio de cola de CENH3 histona heterologo.

En algunas modalidades, el polipéptido comprende un dominio de cola de H3 histona y un dominio de cola de CENH3 histona.

En algunas modalidades, la planta comprende un CENH3 silenciado o una o dos copias de un alelo de un gen de CENH3 endógeno bloqueado o mutado.

En algunas modalidades, el cásete de expresión es integrado al cromosoma de la planta.

La presente invención también provee una planta que comprende un CENH3 silenciado o una o dos copias de un alelo de un gen de CENH3 noqueado o mutado.

La presente invención también provee un método para generar una planta haploide. En algunas modalidades, el método comprende cruzar una planta que expresa una proteína de CENH3 endógena con la planta como se describe en la presente (por ejemplo, que expresa una proteína tailswap) y seleccionar una progenie haploide Fl generada de la etapa de cruza .

En algunas modalidades, la planta que expresa una proteina de CENH3 endógena es el padre de polen de la cruza.

En algunas modalidades, la planta que expresa una proteina de CDENH3 endógena es el padre de óvulo de la cruza.

En algunas modalidades, el método comprende además convertir por lo menos una planta haploide seleccionada a una planta haploide duplicada.

Otros aspectos de la invención serán claros del resto del texto en la presente.

DEFINICIONES Un gen o secuencia de proteina "endógena" se refiere a una secuencia no recombinante de un organismo como la secuencia que se presenta en el organismo antes de la mutación humano-inducida de la secuencia. Una secuencia "mutada" se refiere a una secuencia humano-alterada. Ejemplos de mutación humano-inducida incluyen exposición de un organismo a una alta dosis de mutagen químico, radiológico o insercional por propósitos de seleccionar mutantes, también como alteración recombinante de una secuencia. Ejemplos de alteraciones recombinantes humano-inducidas pueden incluir, por ejemplo, fusiones, inserciones, cancelaciones y/o cambios a la secuencia.

El término "promotor" se refiere a regiones o secuencia ubicado corriente arriba y/o corriente abajo del inicio de transducción y que están involucradas en el reconocimiento y enlace de ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor apto de iniciar la transcripción en células de plantas. Un promotor de planta puede ser pero no necesita tener, una secuencia de ácidos nucleicos aislada originalmente de una planta.

El término "enlazado operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor o arreglo de sitios de enlace de factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

El término "planta" incluye plantas enteras, órganos/estructuras vegetativas de brote (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos) , raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, cépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos) , semillas (incluyendo embriones, endospermo y recubrimiento de semillas) y fruta (el ovario maduro), tejido de planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido de tierra y los semejantes) y células (por ejemplo, células de protección, células de huevo, tricomas y los semejantes) y progenie de los mismos. Las clases de plantas que pueden ser usadas en el método de la invención son en general tan amplias como la clase de plantas superiores e inferiores propensas a técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas) , gimnospermas, heléchos y algas multicelulares. Incluye plantas de una variedad de niveles ploides, incluyendo aneuploides, poliploides, diploides, haploides y hemócigos .

Un polinucleótido o secuencia de polipéptidos es "heterólogo a" un organismo o una segunda secuencia si se origina de una especie extraña o si es de la misma especie, está modificado de su forma original. Por ejemplo, un promotor enlazado operativamente a una secuencia de codificación heteróloga se refiere a una secuencia de codificación de una espeacie diferente de aquellas de la cual el promotor fue derivado o si es de la misma especie, una secuencia de codificación que no está asociada naturalmente con el promotor (por ejemplo, una secuencia de codificación diseñada genéticamente o un alelo de un ecotipo o variedad diferente) . En otro ejemplo, un dominio de cola de CNH3 de una primera especie es heterólogo a un dominio de pliegue de CENH3 histona de una segunda especie.

"Recombinante" se refiere a un polinucleótido humano-manipulado o una copia o complemento de un polinucleótido humano-manipulado. Por ejemplo, un cásete de expresión recombinante que comprende un promotor enlazado operativamente a un segundo polinucleótido puede incluir un promotor que es heterólogo al segundo polinucleótido como resultado de manipulación humana (por ejemplo, mediante métodos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) o Current Protocole in Molecular Biology, Volúmenes 1-3, John Wiley & Sons, Ic. (1994-1998)). En otro ejemplo, un cásete de expresión recombinante puede comprender polinucleótidos combinados de tal manera que los polinucleótidos son extremadamente no probables de ser encontrados en la naturaleza. Por ejemplo, sitios de restricción humano-manipulados con las secuencias de vector de plásmido pueden flanquear o separar el promotor del segundo polinucleótido. Aquel de habilidad en el arte reconocerá que los polinucleótidos pueden ser manipulados de muchas maneras y no están limitados a los ejemplos anteriores .

Un "transgen" es usado como el término es entendido en el arte y se refiere a un ácido nucleico heterólogo introducido a una célula mediante manipulación molecular humana del genoma de la célula (por ejemplo, mediante transformación molecular) . Asi, una "planta transgénica" es una planta que comprende un transgen, esto es, es una planta modificada genéticamente. La planta transgénica puede ser la planta inicial en la cual el transgen fue introducido, también como progenie de la misma cuyo genoma contiene el transgen .

El término "correspondiente" como es usado en la presente significa "respectivo". Por ejemplo, en donde se dice que una planta contiene una copia alterada recombinantemente de una proteina seleccionada de A, B y C y la planta también contiene una copia endógena mutada "correspondiente" del gen seleccionado de un gen que codifica A, B o C, si la planta contiene una proteina A alterada recombinantemente, la copia endógena mutada correspondiente también seria A. alternativamente, si la planta contiene una proteina B alterada recombinantemente, la copia endógena mutada correspondiente también seria B, etc.

La frase "ácido nucleico" o "secuencia de polinucleótido" se refiere a un polímero de una sola o de doble hebra de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leídas del extremo 5' al extremo 3' . Los ácidos nucleicos pueden también incluir nucleótidos modificados que permiten la lectura correcta por medio de una polimerasa y/o formación de dúplex de doble hebra y no altera significativamente la expresión de un polipéptido codificado por aquel ácido nucleico.

La frase "secuencia de ácido nucleico que codifica" se refiere a un ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína o péptido específico. Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto la secuencia de hebra de ADN que es transcrita a ARN como la secuencia de ARN que es traducida a proteínas. Las secuencias de ácido nucleico incluyen tanto las secuencias de ácido nucleico de plena longitud también como las secuencias sin plena longitud derivadas de las secuencias de plena longitud. Se debe entender además que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia natural o secuencias que pueden ser introducidas para proveer preferencias de codón en una célula huésped específica.

La frase "célula huésped" se refiere a una célula de cualquier organismo. Células huésped ejemplares son derivadas de plantas, bacterias, levaduras, hongos, insectos u otros animales. Métodos para introducir secuencias de polinucleótido a varios tipos de células huésped son bien conocidos en el arte.

Un "cásete de expresión" se refiere a una construcción o constructo de ácido nucleico, que cuando es introducido a una célula huésped (por ejemplo, una célula de planta) da como resultado la transcripción y/o traducción de un ARN o polipéptido, respectivamente. Un cásete de expresión puede dar como resultado transcripción sin traducción, por ejemplo, cuando un siARN u otro ARN de codificación sin proteína es transcrito.

Dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos se dice que son "idénticos" si la secuencia de nucleótidos de residuos de aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias es la misma cuando son alineados para máxima correspondencia como se describe posteriormente en la presente. El término "complementario a" es usado en la presente para dar a entender que la secuencia es complementaria a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia.

Ejemplos de algoritmos que son apropiados para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que son descritos en Altschul et al., Nuc. Acids Res.25: 3389-3402 81977) y Altschul et al., J. Mol. Biol . 215: 403-410 (1990), respectivamente. Elementos de programación para efectuar el análisis de BLAST están disponibles públicamente en la web por medio del Centro nacional para Información de Biotecnología (www.nbcbi. nlm.nih. gov/) . Este algoritmo involucra identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, cualquiera que coincida o satisfaga alguna puntuación de umbral T de valor positivo cuando es alineada con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es denominada como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra) . Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contienen. Los aciertos de palabras son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en tanto que la puntuación de alineación acumulativa pueda ser incrementada. Las puntuaciones acumulativas son calculadas utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación hacia atrás para un par de residuos coincidentes, siempre > 0) y N (puntuación de penalidad para residuos que no coinciden; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección es detenida cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por la cantidad X de su valor obtenido máximo; la puntuación acumulativa va a cero o menor, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa o si alcanza el final ya sea de una secuencia u otra. Los parámetros del algoritmo de BLAST w, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa de BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como predeterminados una longitud de palabra ( ) de 11, una esperanza (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminados una longitud de palabra de 3 y esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Véase Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 89: 10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo de BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias (véase por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5787 (1993) ) . Una medida de similaridad provista por el algoritmo de BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia o correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría por probabilidad. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01 y más preferiblemente menor de aproximadamente 0.001.

El "porcentaje de identidad de secuencia" es determinado al comparar dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o cancelaciones (esto es, separaciones o espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o cancelaciones9 para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado al determinar el número de posiciones en las cuales el residuo de base de ácido nucleico o aminoácidos idénticos ocurren en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número de tales posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

El término "identidad sustancial" de secuencia de polinucleótidos , significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 25% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia designada. Alternativamente, el por ciento de identidad puede ser cualquiera número entero de 25% a 100%, por ejemplo, por lo menos: 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% en comparación con una secuencia de referencia usando los programas descritos en la presente; preferiblemente BLAST utilizando parámetros estándar como se describe posteriormente en la presente. El experimentado en el arte reconocerá que los valores de por ciento de identidad mayores pueden ser ajustados apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta degeneración de codón, similaridad de aminoácido, colocación de cuadro de lectura y los semejantes. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos significa normalmente identidad de secuencia de por lo menos 40%. El por ciento de identidad de polipéptidos puede ser cualquier número entero de 40% a 100%, por ejemplo, por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%. En algunas modalidades, polipéptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se indica anteriormente, excepto que las posiciones de residuos que no son idénticas pueden diferir por cambios de aminoácidos conservadores. Sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; µ? grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amina son asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas • es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre son cisteina y metionina .

Grupos de sustitución de aminoácidos conservadores ejemplares son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina , alanina-valina , ácido aspártico- ácido glutámico y asparagina-glutamina.

Breve descripción de la figura La Figura 1 ilustra una alineación de secuencia de varias proteínas de CENH3 (A. thaliana H3.3 = SEQ ID NO: 1; H3.3 humano = SEQ ID NO: 2, C. albicans = SEQ ID NO: 106; humano = SEQ ID NO 107; A. thaliana = SEQ ID NO: 10; Poplar = SEQ ID NO: 11; arroz = SEQ ID NO: 108) .

Descripción detallada 1. Introducción La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento sorprendente de que la eliminación de un CENH3 endógeno en combinación con la expresión de una proteína heteróloga que comprende un CENH3 alterado da como resultado una planta que tiene propiedades para cruza. Por ejemplo, cuando una planta carece de una proteína de CENH3 endógena y expresa una proteína que comprende (listado de términos amino a término carboxi) una etiqueta de GFP, un dominio de cola sin CENH3 y un dominio de pliegue de CENH3 histona, es cruzada con una planta que tiene una proteína de CENH3 endógena, una porción de la progenie resultante carece de todos los cromosomas derivados de la planta padre que expresa una versión alterada de CENH3. Así, la invención permite la producción de progenie haploide. Las plantas haploides son útiles, por ejemplo, para mejorar y acelerar las cruzas. CENH3 es un miembro del complejo de cinetocora, la estructura de proteina sobre cromosomas en donde las fibras de husillo se anexan durante la división celular. Sin pretender limitar el alcance de la invención, se cree que los resultados observados son debidos en parte a la generación de una proteina de cinetocora que actúa más débilmente que el tipo silvestre, dando como resultado mediante esto complejos de cinetocora .funcionales (por ejemplo, en mitosis), pero que dan como resultado cromosomas de segregación relativamente escasos durante la meiosis en relación con cromosomas que también contienen complejos de cinetocora tipo silvestre del otro padre. Esto da como resultado complejos de cinetocora funcionales cuando la proteina alterada es la única isoforma en la célula, pero cromosomas de segregación relativamente escasos durante la mitosis cuando el padre con cinetocoras alteradas es cruzado con un padre con complejos de cinetocora tipo silvestre. Además de CENH3, otras proteínas de cinetocora incluyen por ejemplo, CENPC, CM21, IS12, NDC80 y NUF2. Así, la presente invención provee plantas, hongos o animales (o células de los mismos) que expresan una proteína de cinetocora mutada recombinante (incluyendo pero no limitados a CENH3 , CENPC, MCM21, MIS12, NDC80 y NUF2) y dusrumpe el centrómero y/o plantas, hongos o animales (o células de los mismos) en los cuales por lo menos una o ambas copias de un alelo del gen de CENH3 endógeno ha sido noqueado, mutado para reducir o eliminar su función o silenciados. Como se explica en más detalle posteriormente en la presente, la proteína de cinetocora mutada puede ser mutada en muchas maneras diferentes, incluyendo pero no limitado a, como una proteína "tailswap" que comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona y una secuencia terminal amino heteróloga. La presente invención también provee métodos para generar una planta haploide al cruzar una planta que expresa una proteína de cinetocora mutada 8incluyendo pero no limitado a una proteína de CVENH3 tailswap) y que no expresa una proteína de CENH3 endógena, con una planta que expresa una proteína de CENH3 endógena.

II. PROTEÍNAS DE CINETOCORA A. PROTEÍNAS DE CENH3 Las proteínas de CENH3 son una clase de proteínas bien caracterizadas que son variantes de las proteínas de histonas de H3 y que son proteínas especializadas asociadas con el centrómero. Las proteínas de CENH3 están caracterizadas por un dominio de cola variable, que no forma una estructura secundaria rígida y un dominio de pliegue de histona conservado compuesto de tres regiones alfa-helicoidales unidas mediante secciones de bucle. Elementos estructurales y funcionales adicionales de proteínas de CENH3 se pueden encontrar en por ejemplo, Cooper et al., Mol. Biol. Evol. 21(9): 1712-8 (2004); Malik et al., Nat. Struct. Biol. 10(11): 882-91 (2003); Black et al., Curr. Opin. Cell Biol. 20(1): 91-100 (2008). Las proteínas de CENH3 son una de las proteínas que forman el complejo de cinetocora.

Una amplia de proteínas de CENH3 han sido identificadas. Véanse por ejemplo, SEQ ID Nos.: 1-48. Se apreciará que la lista anterior no pretendé ser exhaustiva y que secuencias de CENH3 adicionales están disponibles de estudios genómicos o pueden ser identificadas de bases de datos genómicos o mediante técnicas de laboratorio bien conocidas. Por ejemplo, en donde una CENH3 de una planta u otra especie de organismo particular no está fácilmente disponible de una base de datos, se puede identificar y clonar la secuencia genética de CENH3 del organismo utilizando cebadores, que son opcionalmente degenerados, en base a regiones conservadas de otras proteínas de CENH3 conocidas .

La práctica de la presente invención empleará en general métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, biología celular, genética, inmunología y farmacología dentro de la habilidad de aquellos experimentados en el arte. Tales técnicas son explicadas plenamente en la literatura. Véase por ejemplo, Gennaro A.R., editor (1990) Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Co . ; Hardman, J.G. Limbird, L.E. y Gilman, A.G., editores (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics , 10a edición, McGraw-Hill Co . ; Colowick S. et al., editores, ethods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. y Blackwell, C.C., editores (1986) Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis t. et al., editores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Volúmenes I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., editores (1999) Short protocols in Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press ; Newton, C.R. y Graham, A., editores (1997) PCR ( Introduction to Biotechniques Series) 2a edición, Springer Verlag. i. Dominio de pliegue de CENH3 histona Como se indica anteriormente, el dominio de pliegue de CENH3 histona es conservado entre proteínas de CENH3 de diferentes especies. El dominio de pliegue de CENH3 histona puede ser distinguido por tres regiones alfa-helicoidales unidas mediante secciones de bucle. En tanto que se apreciará que la ubicación exacta del dominio de pliegue de histona variará en proteínas de CENH3 de otra especie, se encontrará en el término carboxilo de una proteina de CENH3 endógena (tipo silvestre) . Así, en algunas modalidades, una proteína de CENH3 puede ser identificada en una proteína endógena por tener un dominio terminal carboxilo sustancialmente similar (por ejemplo, por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 85%, 90%, 95% o más de identidad) con cualquiera de SEQ ID Nos: 49-94. Se provee una alineación de una selección de proteínas de CENH3 en la Figura 1 e ilustra áreas de conservación en el dominio de pliegue de histona.

La frontera entre el dominio de cola y el dominio de pliegue de histona de las proteínas de CENH3 está en, dentro de o cerca (esto es, dentro de 5, 10, 15, 20 ó 25 aminoácidos del "P" de) de la secuencia de PGTVAL conservada (SEQ ID NO: 114) . La secuencia de PGTVAL (SEQ ID NO: 114) es de aproximadamente 81 aminoácidos del término N de la proteína de CENH3 de Arabidopsis, aunque la distancia del término N de diferente proteína de CENH3 endógenas varía. Véase, por ejemplo, el listado de secuencias. Así, en algunas modalidades, la región de pliegue de histona de CENH3 empleada en la proteína tailswap incluye todos los aminoácidos C-terminales de una proteína de CENH3 endógena (o una proteína sustancialmente similar a la secuencia endógena) hasta e incluyendo la PGTVAL (SEQ ID NO: 114) . Las SEQ ID NOS: 49-94 reflejan esta opción. En otras modalidades, las proteínas tailswap de la invención pueden comprender más o menos de la secuencia de CENH3. Por ejemplo, en algunas modalidades, tailswap comprenderá la secuencia C-terminal de una proteína de CENH3, pero solamente hasta un aminoácido 5, 10, 15, 20 ó 25 aminoácidos en la dirección C-terminal de la "P" de la secuencia de PGTVAL conservada (SEQ ID NO: 1 14) .

En algunas modalidades, tails ap comprenderá la secuencia C-terminal de una proteina de CENH3, pero solamente hasta un aminoácido 5, 10, 15, 20 ó 25 aminoácidos en la dirección N-terminal de la "P" de la secuencia de PGTVAL conservada (SEQ ID. ii. Dominio de Cola de CENH3 Histona Aunque el dominio de pliegue de histona de CENH3 evoluciona más rápidamente que aquel de los dominios de H3, CENH3 histona convencionales pueden todavía ser alineado. En contraste, los dominios de cola N-terminales de CENH3 son altamente variables aún entre especies estrechamente relacionadas. Los dominios de cola de histona (incluyendo dominios de cola de CENH3) son flexibles y no estructurados, como se muestra por su carencia de fuerte densidad electrónica en la estructura del nucleosoma determinado por cristalografía de rayos X (Luger et al, Nature 389 ( 6648 ) : 251-60 (1997)) . iii. Proteina de CENH3 Matada Cualquier número de mutaciones de CENH3 pueden ser introducidas a una proteína de CENH3 para generar una proteína de CENH3 mutada (incluyendo pero no limitado a alterada recombinantemente) apta de generar plantas haploides cuando es expresada en una planta que carece de o que tiene expresión suprimida de una proteina de CENH3 endógena y en donde la planta transgénica resultante es cruzada con una planta que expresa una proteina de CENH3 tipo silvestre. La proteina de CENH3 mutadas activas pueden ser identificadas, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria, mediante mutagénesis apuntada de un solo aminoácido o múltiples aminoácidos, mediante generación de cancelaciones de dominio de proteina completas o parciales, mediante fusión con secuencias de aminoácidos heterólogas o combinaciones de los mismos. Proteina de CENH3 mutantes "activas" se refiere a proteínas que cuando son expresadas en una planta en la cual CENH3 está bloqueado o desactivado, da como resultado plantas viables, tales plantas viables, cuando son cruzadas con una planta tipo silvestre, producen progenie haploide a más de la frecuencia normal (por ejemplo, por lo menos 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20% o más). La proteína de CENH3 mutadas pueden ser probadas fácilmente mediante la expresión recombinante de la proteína de CENH3 mutada en una planta que carece de proteína de CENH3 endógena, cruzar la planta transgénica (como macho o hembra, dependiendo de la fertilidad) con una proteína de CENH3 tipo silvestre de expresión de planta y luego seleccionar la producción de progenie haploide.

En algunas modalidades, la proteína de CENH3 mostrada es idéntica con la proteína de CENH3 endógena, excepto por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más (por ejemplo, 1-2, 1-4, 1-7) aminoácidos. Por ejemplo, en algunas modalidades, la proteina tipo silvestre endógena de la planta es idéntica o sustancialmente idéntica con cualquiera de SEQ ID Nos.: 1-48 y la proteina de CENH3 mutada difiere de la proteina de CENH3 endógena por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más (por ejemplo, 1-2, 1-4, 1-7) aminoácidos.

En algunas modalidades, la proteina de CENH3 mutada contiene un dominio de pliegue de CENH3 histona idéntico al dominio de pliegue de CENH3 histona de una proteina de CENH3 endógena pero por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más (por ejemplo, 1-2, 1-4, 1-7) aminoácidos. Por ejemplo, en algunas modalidades, el dominio de pliegue de CENH3 histona tipo silvestre endógeno de la planta es idéntico o sustancialmente idéntico con cualquiera de SEQ ID Nos.: 49-94 y la proteina de CENH3 mutada contiene un dominio de pliegue de CENH3 histona que difiere del dominio de pliegue de histona de la proteina de CENH3 endógena por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más (por ejemplo, 1-2, 1-4, 1-7) aminoácidos.

Se cree que los mutantes de CENH3 activos incljuyen por ejemplo, proteínas que comprenden: una secuencia de aminoácidos heteróloga (incluyendo pero no limitado a GFP) enlazada a un dominio de cola truncado o completo de CENH3 o dominio de cola sin CENH3, cualquiera de uno u otro de los cuales es enlazado a un domino de pliegue de CENH3 histona o un dominio de cola truncado de CENH3, un dominio de cola de CENH3 heterólogo o dominio de cola sin CENH3, cualquiera de uno u otro de los cuales es enlazado a un dominio de pliegue de CENH3 histona.

En algunas modalidades, la proteina de CENH3 mutada comprende una fusión de una secuencia de aminoácidos heteróloga amino-terminal al dominio de pliegue de histona de la proteina de CENH3. En general, el dominio de pliegue de histona será idéntico o por lo menos sustancialmente idéntico a la proteina de CENH3 endógena al organismo en el cual la proteina de CENH3 mutada será expresada. En algunas modalidades, la proteina de CENH3 mutada incluirá un dominio de cola de histona que puede ser por ejemplo, un dominio de cola sin CENH3 o un dominio de cola de CENH3.

Se cree que un gran número de diferentes secuencias de aminoácidos, cuando son enlazadas a una proteina que comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona y una secuencia que puede funcionar como o reemplazar un dominio de cola de histona, puede ser usado de acuerdo con la presente invención. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga es enlazada directamente al dominio de pliegue de CENH3 histona. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga es enlazada es una secuencia de aminoácidos intermedia al dominio de pliegue de CENH3 histona. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos intermedia es un dominio de cola de CENH3 intacta o truncada. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga, en combinación con el dominio de pliegue de histona, será suficiente para impedir la mortalidad asociada con la pérdida de CENH3 endógeno, pero someterá a disrupción suficientemente a los centrómeros para permitir la producción de progenie haploide, como se discute en la presente. Asi, en algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos heteróloga comprenderá una porción que es o imita la función de un dominio de cola de histona y opcionalmente puede también comprender una secuencia de aminoácidos global que disrumpe la función de centrómero. En algunas modalidades, por lo menos una porción de la secuencia de aminoácidos heteróloga de la proteina de CENH3 mutada comprende cualquier secuencia de aminoácidos de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, por ejemplo, 10-30, 10-50, 20-50, 30-60 aminoácidos, que carecen opcionalmente de una estructura secundaria estable (por ejemplo, que carece de enrollamiento, hélices u hojas beta) . En algunas modalidades, el dominio de cola tiene menos de 90, 80 o 70% de identidad con el dominio de cola (por ejemplo, los 135 aminoácidos N-terminales) de la proteina de CENH3 endógena al organismo en el cual la proteina de CENH3 mutada será expresada. En algunas modalidades, el dominio de cola de la proteina de CENH3 mutada comprende el dominio de cola de una proteina CENH3 mutada comprende el dominio de cola de una proteina sin CENH3 histona, incluyendo pero no limitado a una proteina de histona de H3. En algunas modalidades, el dominio de cola de la proteina de CENH3 mutada comprende el dominio de cola de una proteina sin CENH3 histona endógena al organismo en el cual la proteina de CENH3 mutada será expresada. En algunas modalidades, el dominio de cola de la proteina de CENH3 mutada comprende el dominio de cola de una cola de CENH3 homologa u ortóloga (de una especie de planta diferente) . Por ejemplo, se ha encontrado que GFP fusionado a un dominio de cola de CENH3 de maíz enlazado a un dominio de pliegue de CENH3 histona de Arabidopsis es activo.

Como se indica anteriormente, en algunas modalidades, el dominio de cola de una histona de H3 (no será confundida con una histona de CENH3) es usado como la producción del dominio de cola de la proteina de CENH3 mutada (esas modalidades son denominadas algunas veces como proteínas "tailswap") . Los dominios de cola de H3 de planta son bien conservados en varios organismos. Por ejemplo, un dominio de cola de H3 común de plantas es SEQ ID NO: 95. Así, en algunas modalidades, la porción de cola heteróloga de la proteína tailswap comprenderá una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica (por ejemplo, por lo menos 70, 80, 90, 95 0 100% idénticas) a SEQ ID NO: 95 o un fragmento del mismo de por lo menos 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos de largo.

En algunas modalidades, la proteina de CENH3 mutada de la invención carecerán de por lo menos una porción (por ejemplo, por lo menos 5, 10, 15, 20, 25 30 o más aminoácidos) de la región N-terminal de CENH3 endógena y asi, en algunas modalidades, tendrá un dominio de cola de CENH3 truncado en comparación con una proteina de CENH3 endógena tipo silvestre. Las proteínas de CENH3 mutadas pueden o pueden no estar enlazadas a una secuencia heteróloga.

Opcionalmente, la secuencia de aminoácidos heteróloga puede comprender o comprender además, una o más secuencias de aminoácidos en el término amino y/o carboxilo y/o en base de los dominios de pliegue de cola e histona. Por ejemplo, en algunas modalidades, la proteína de CENH3 mutada (por ejemplo, una tails ap u otra proteína mutada de CENH3) comprende una secuencia de aminoácidos heteróloga enlazada al extremo amino del dominio de cola. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga es enlazada al término amino de una proteína de CENH3 de otra manera tipo silvestre, en donde la secuencia heteróloga interviene con la función de centrómero. Por ejemplo, se ha encontrado, por ejemplo que la proteína fluorescente verde, cuando es enlazada a CENH3 tipo silvestre, se mete a disrupción suficientemente los centrómeros para permitir la producción de progenie haploide. Se cree que la secuencia heteróloga puede ser cualquier secuencia que disrumpe la capacidad de la proteína de CENH3 para disminuir la función de centrómero. Asi, en algunas modalidades, la secuencia heteróloga comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50 o más kD.

En algunas modalidades, la proteina de CENH3 mutada comprenderá un dominio de proteina que actúa como un marcador detectable o seleccionable . Por ejemplo, una proteina de marcador seleccionable ejemplar es fluorescente o un producto genético de resistencia a antibiótico o herbicidas. Dominios de proteínas seleccionables o detectables son útiles para monitorear la presencia o ausencia de la proteína de CENH3 mutada en un organismo.

B. PROTEÍNAS DE CINETOCORA SIN CENH3 Se cree que otras proteínas que componen .el complejo de cinetocora pueden también ser mutadas y expresadas en una planta que de otra manera no expresa la proteína del complejo de cinetocora .endógena correspondiente para dar como resultado una planta viable que, cuando es cruzada con una planta tipo silvestre que tiene un complejo de cinetocora tipo silvestre, genera progenia haploide a una cierta frecuencia (por ejemplo, por lo menos, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20% o más). Miembros sin CENH3 ejemplares del complejo de cinetocora incluye por ejemplo, CENCP, MCM21, MIS12, NDC80 y NUF2.

Proteínas del complejo de cinetocora sin CENH3 mutados activos (por ejemplo, CENCP, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) pueden ser identificados, por ejemplo mediante mutagénesis aleatoria, mutagénesis apuntada de un solo aminoácido o múltiples aminoácidos, mediante generación o cancelaciones de dominio de proteína completos o parciales, mediante fusión con secuencias de aminoácidos heterólogas o combinaciones de los mismos. Proteínas del complejo de cinetocora sin CENH3 mutantes "activas" se refiere a proteínas que cuando son expresadas en una planta en la cual la proteína del complejo de cinetocora sin CENH3 correspondiente está noqueada o desactivada, da como resultado plantas viables que cuando son cruzadas con una planta tipo silvestre, producen progenie haploxde a más de la frecuencia normal (por ejemplo, por lo menos 1, 5, 10, 20% o más) . En algunas modalidades, polipéptidos CENCP, CM21, MIS12, NDC80 o NUF2 mutantes activos son sustancialmente idénticos a SEQ ID Nos.: 96, 97, 98, 99 o 100, respectivamente. Proteínas del complejo de cinetocora sin CENH3 mutadas (por ejemplo, CENCP, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) pueden ser probadas fácilmente mediante expresión recombinante de la proteína del complejo de cinetocora sin CENH3 mutado en una planta que carece de la proteína del complejo de cinetocora sin CENH3 endógeno, cruzar la planta transgénica 8como macho o hembra, dependiendo de la fertilidad) con una planta que expresa una proteina del complejo de cinetocora sin CENH3 tipo silvestre y luego seleccionar en cuanto a la producción de progenie haploide.

En algunas modalidades, la proteina del complejo de cinetocora sin CENH3 mutado es idéntica con una proteina de complejo de cinetocora de CENH3 endógena pero por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más (por ejemplo, 1-2, 1-4, 1-7) aminoácidos. Por ejemplo; en algunas modalidades, la proteína tipo silvestre endógena de la plantas es idéntica o sustancialmente idéntica con cualquiera de SEQ ID Nos.: 96, 97, 98, 99 o 100 y la proteína del complejo de cinetocora sin CENH3 mutada difiere de la proteína del complejo de cinetocora sin CENH3 endógena por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más (por ejemplo, 1-2, 1-4, 1-7) aminoácidos.

Opcionalmente, la secuencia de aminoácidos heteróloga puede comprende una o más secuencias de aminoácidos en el término amino y/o carboxilo y/o enlace de los dominios de cola y pliegue de histona. Por ejemplo, en algunas modalidades, la proteína del complejo de cinetocora sin CENH3 mutado comprende una secuencia de aminoácidos heteróloga enlazada a un término amino de la proteína del complejo de cinetocora sin CENH3. La secuencia heteróloga puede ser cualquier secuencia. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga es enlazada al término amino de una proteína del complejo de cinetocora sin CENH3 de otra manera tipo silvestre, en donde la secuencia heteróloga interfiere con la función del centrómero. En algunas modalidades, la secuencia heteróloga comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50 o más kD.

En algunas modalidades, la proteina del complejo de cinetocora sin CENH3 mutada comprenderá un dominio de proteina que actúa como un marcador detectable o seleccionable. Por ejemplo, una proteina marcadora seleccionable ejemplar es un producto genético de resistencia a antibiótico o herbicida fluorescente. Dominios de proteina seleccionables o detectables son útiles para monitorear la presencia o ausencia de la proteina del complejo de cinetocora sin CENH3 mutado en un organismo.

III. GENERACIÓN DE ORGANISMOS DE LA INVENCIÓN La presente invención provee organismos que no expresan o expresan a niveles reducidos (por ejemplo, menor de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10% de niveles de tipo silvestre) una proteina de CENH3 endógena o proteina del complejo de cinetocora sin CENH3 y opcionalmente que expresan una proteina de CENH3 mutada o proteina del complejo,, de cinetocora sin CENH3 correspondiente. En general, la carencia de una proteina del complejo de cinetocora es mortal, a no ser que sea complementada por lo menos parcialmente por una proteina del complejo de cinetocora mutada, como se describe en la presente. Sin pretender limitar el alcance de la invención, se cree que hay varias maneras para elaborar un organismo que carece de o tiene expresión reducida de una proteina del complejo de cinetocora endógeno pero que expresa una versión mutada de aquella proteina.

En algunas modalidades, se puede generar una mutación de CENH3 en un gen de CENH3 endógeno (o proteina del complejo de cinetocora sin CENH3) que reduce o elimina la actividad o expresión de CENH3 o genera un nocaut del gen de la proteina del complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) . En estas modalidades, se puede generar un organismo heterócigo para el nocaut o mutación de gen e introducir un cásete de expresión para la expresión de la proteina del complejo de cinetocora mutada correspondiente heteróloga al organismo., la progenie del heterocigoto puede luego ser seleccionada que son homócigos para la mutación o nocaut pero que comprenden la proteina del complejo de cinetocora mutada ' heteróloga expresada recombinantemente . Asi, la invención provee plantas, células de plantas u otros organismos en los cuales uno o ambos alelos de CENH3 son noqueados o mutados para carecer significativa o esencialmente por completo de actividad de CENH3, esto es, suficientes para inducir la mortalidad de embrión sin una expresión complementaria de una proteina de complejo de cinetocora mutada como se describe en la presente (por ejemplo, una proteina tailswap) . La invención también provee plantas, células de plantas u otros organismos de los cuales uno o ambos alelos de un gen del complejo de cinetocora sin CENH3 son noqueados o mutados para parecer significativa o esencialmente por completo de la actividad de la proteina del complejo de cinetocora sin CENH3 correspondiente, esto es, suficiente para inducir mortalidad el embrión sin una expresión complementaria de una proteina del complejo de cinetocora mutada como se describe en la presente. En plantas que tienen más de un conjunto diploide de cromosomas (por ejemplo, tetrahaploide) , todos los alelos pueden ser desactivados, mutados o noqueados.

Alternativamente, se puede introducir el cásete de expresión que codifica una proteina de complejo de cinetocora mutada (por ejemplo, incluyendo pero no limitado a una proteina tailswap) a un organismo con un conjunto intacto de alelos de la proteina del complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) y luego silenciar el gen de la proteina del complejo de cinetocora endógeno (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) mediante cualquier manera conocida en el arte. Como ejemplo, se puede introducir o expresar un siARN o microARN en el organismo que reduce o elimina la expresión de la proteina del complejo de cinetocora endógena (por ejemplo, CENH3 , CENPC, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) .

Idealmente, el siARN de silenciamiento u otro agente de silenciamiento es seleccionado para silenciar el gen de la proteina del complejo de cinetocora endógeno (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) pero no interfiere sustancialmente con la expresión de la proteina del complejo de cinetocora mutada (por ejemplo, una proteina tailswap) . En situaciones, en donde el CENH3 endógeno va a ser desactivado, esto se puede obtener, por ejemplo, mediante apuntamiento del siARN a la sección de codificación de cola N-terminal o porciones sin traducir o el mARN de CENH3, dependiendo de la estructura de la proteina del complejo de cinetocora mutada. Alternativamente, el transgen de proteina del complejo de cinetocora mutado puede ser diseñado con nuevo uso de codón, de tal manera que carece de homología de secuencia con el gen de proteína de complejo de cinetocora endógeno y con el siARN de silenciamiento.

IV. REDUCCIÓN O ELIMINACIÓN DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNA DEL COMPLEJO DE CINETOCORA ENDÓGENA Un número de métodos pueden ser usados para inhibir, mutar o desactivar la expresión de una proteína de complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) en plantas. Por ejemplo, tecnología de antisentido puede ser usada convenientemente para desactivar la expresión genética. Para llevar a cabo esto, un segmento de ácido nucleico del gen deseado es" clonado y enlazado operativamente a un promotor, de tal manera que la hebra antisentido de ARN será transcrita. El caset de expresión es luego transformado en plantas y la hebra antisentido de ARN es producida. En células de plantas, se ha sugerido que el ARN antisentido inhibe la expresión genética al impedir la acumulación de mARN que codifica el polipéptido de interés, véase, por ejemplo, Sheehy et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:8805-8809 (1988); Pnueli et al, The Plant Cell 6: 175-186 (1994); y Hiatt et al, patente estadounidense No. 4,801,340.

La secuencia de ácido nucleico antisentido transformada en plantas será sustancialmente idéntica a por lo menos una porción de gen o genes endógenos a ser reprimidos. La secuencia, sin embargo, no tiene que ser perfectamente idéntica para inhibir la expresión. Asi, una molécula de ácido nucleico de antisentido o sentido que codifica solamente una porción de una proteina del complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3., CENPC, CM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) o una porción del mARN de la proteina de complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) (incluyendo pero no limitado a porciones sin traducir del mARN) pueden ser útiles para producir una planta en la cual se suprime la expresión de la proteina del complejo de cinetocora. Los vectores de la presente invención son diseñados opcionalmente de tal manera que el efecto inhibitorio se aplica solamente a una proteína de complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) y no afecta la expresión de otros genes. En situaciones en donde el CENH3 endógeno va a ser desactivado, un método para obtener este objetivo es apuntar la secuencia antisentido a secuencia de CENH3 (por ejemplo, secuencias de mARN de cola o sin traducir) no encontradas en otras proteínas dentro de una familia de genes que exhiben homología u homología sustancial al gen de CENH3.

Para la supre'sión antisentido, la secuencia introducida también necesita ser de plena longitud en relación ya sea con uno u otro del producto de transcripción primario o el mARN plenamente procesado. En general, se puede usar homología más alta para compensar el uso de una secuencia más corta. Además, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrón o exón y la homología de segmentos sin codificación pueden ser igualmente efectivos. Por ejemplo, una secuencia de entre aproximadamente 30 ó 40 nucleótidos puede ser usada y en algunas modalidades, nucleótidos de aproximadamente plena longitud deben ser usados, aunque se puede usar una secuencia de por lo menos 20, 50, 100, 200 ó 500 nucleótidos.

Moléculas de ARN catalíticas o ribozimas pueden también ser usadas para inhibir la expresión de genes de la proteína de complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) . Es posible diseñar ribozimas que se aparean específicamente con virtualmente cualquier ARN objetivo y escinden la cadena fundamental de fosfodiéster en un sitio específico, desactivando mediante esto funcionalmente el ARN objetivo. El llevar a cabo esta escisión, el ribozima no es alterado en sí mismo y así es apto de reciclado y escindir otras moléculas, haciéndola una verdadera enzima. La inclusión de secuencias de ribozima dentro de ARN antisentido confiere actividad de escisión de ARN sobre ellas, incrementando mediante esto la actividad de las construcciones o constructos.

Un número de clases de ribozimas han sido identificados. Una clase de ribozimas es derivada de un número de ARN circulares pequeños que son aptos de auto-escisión y replicación en plantas. Los ARN se replican ya sea solos (ARN viroide) o con un virus auxiliar (ARN satélite) . Ejemplos incluyen ARN de un viroide de sunblotch de aguacate y los ARN satélite de virus de mancha anular de tabaco, virus de estría transitoria de lucerna, virus moteado de tabaco de terciopelo, virus moteado de solanum nodiflorum y virus moteado de trébol subterráneo. El diseño y uso de ribozimas ARN-específieos objetivo es descrito en Haseloff et al. Nature, 334:585-591 (1988).

Otro método de supresión es supresión de sentido (también conocido como co-supresión) . La introducción de casets de expresión en los cuales un ácido nucleico está configurado en la orientación de sentido con respecto al promotor ha mostrado ser un medio efectivo mediante el cual bloquear la transcripción de genes objetivos. Para un ejemplo del uso de este método para modular la expresión de genes endógenos, véase Napoli et al., The Plant Cell 2:279-289 (1990); Flavell, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 91:3490-3496 (1994); Kooter and Mol, Current Opin. Biol. 4: 166-171 (1993); y patentes estadounidenses Nos. 5,034,323, 5,231,020 y 5,283,184.

En general, en donde se desea la inhibición de expresión, ocurre alguna transcripción de la secuencia introducida. El efecto puede ocurrir en donde la secuencia introducida no contiene ninguna secuencia de codificación per se, sino solamente secuencias de intrón o sin traducir homologas a secuencias presentes en el transcripto primario de la secuencia endógena. La secuencia introducida en general será sustancialmente idéntica con la secuencia endógena que pretende ser reprimida. Esta identidad mínima comúnmente será mayor de aproximadamente 65% al objetivo de una secuencia de proteína del complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2), pero una identidad más alta puede ejercer una represión más efectiva de expresión de las secuencias endógenas. En algunas modalidades, se usan secuencias con identidad sustancialmente mayor, por ejemplo por lo menos aproximadamente 80, por lo menos aproximadamente 95% o 100% de identidad son usadas. Como con la regulación de antisentido, el efecto puede ser diseñado y probado para no afectar significativamente la expresión de otras proteínas dentro de una familia similar de genes que exhiben homología u homología sustancial .

Para la supresión de sentido, la secuencia introducida en el caset de expresión, que necesita menos de identidad absoluta, tampoco necesita ser de plena longitud, en relación ya sea con el producto de transcripción primario o el mARN plenamente procesado. Esto puede ser preferido para evitar la producción concurrente de algunas plantas que son agentes que sobreexpresan . Una identidad más alta en una secuencia de longitud más corta que la plena longitud compensa una secuencia más larga menos idéntica. Además, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrón o exón e identidad de segmentos sin codificación serán igualmente efectivos. En algunas modalidades, una secuencia del intervalo de tamaño indicadas anteriormente para regulación antisentido es usada, esto es, 30-40 o por lo menos aproximadamente 20, 50, 100, 200, 500 o más nucleótidos.

La expresión genética endógena puede también ser suprimida por medio de interferencia de ARN (ARNi) (y por supuesto co-supresión puede ser considerada un tipo de ARNi) , que utiliza un ARN de doble hebra que tiene una secuencia idéntica o similar a la secuencia del gen objetivo. ARNi es el fenómeno en el cual cuando un ARN de doble hebra que tiene una secuencia idéntica o similar a aquella del gen objetivo es introducido a una célula, las expresiones tanto del gen exógeno insertado como el gen endógeno objetivo son suprimidas. El ARN de doble hebra puede ser formado a partir de dos ARN complementarios separados o puede ser un solo ARN con secuencias internamente complementarias que forman un ARN de doble hebra. Aunque detalles completos del mecanismo de ARNi son todavía desconocidos, se considera que el ARN de doble hebra introducido es inicialmente escindido en fragmentos pequeños, que luego sirven como índices del gen objetivo de alguna manera, degradando mediante esto el gen objetivo. Se sabe que el ARNi también es efectivo en plantas (véase, por ejemplo, Chuang, C. F. & Meyerowitz, E. M., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 4985 (2000); Waterhouse et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964 (1998); Tabara et al. Science 282:430-431 (1998); Matthew, Comp Funct. Genom. 5: 240-244 (2004); Lu, et al, Nucleic Acids Research 32(21):el71 (2004)). Por ejemplo, para obtener la supresión de la expresión de una proteína de complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) utilizando ARNi, un ARN de doble hebra que tiene la secuencia de un mARN que codifica la proteína del complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) o una secuencia sustancialmente similar de la misma (incluyendo aquellos diseñados no para traducir la proteina) o fragmento de la misma, es introducida a una planta u otro organismo de interés. Las plantas/organismos resultantes pueden luego ser seleccionados por un fenotipo asociado con la proteina objetivo (opcionalmente en presencia de expresión de una proteina tailswap para evitar mortalidad) y/o al monitorear niveles de ARN de estado estable para transcriptos que codifican la proteina. Aunque los genes usados para ARNi no necesitan ser completamente idénticos al gen objetivo, pueden ser por lo menos 70%, 80%, 90%, 95% o más idénticos a la secuencia idéntica objetivo (por ejemplo, secuencia de CENH3 como se describe en la presente) . Véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 2004/0029283 para un ejemplo de una secuencia de siARN no idéntica usada para suprimir la expresión genética. Los constructos o construcciones que codifican una molécula de ARN con una estructura tallo-bucle que no está relacionada con el gen objetivo y que está colocada distantemente a una secuencia especifica para el gen de interés pueden también ser usadas para inhibir la expresión genética objetivo. Véase, por ejemplo, publicación de patente estadounidense No. 2003/0221211.

Los polinucleótidos de ARNi pueden abarcar el ARN objetivo de plena longitud o pueden corresponder a un fragmento del ARN objetivo. En algunos casos, el fragmento tendrá menos de 100, 200, 300, 400, 500 600, 700, 800, 900 ó 1,000 nucleótidos correspondientes a la secuencia objetivo. Además, en algunas modalidades, estos fragmentos son de por lo menos, por ejemplo, 10, 15, 20, 50, 100, 150, 200 o más nucleótidos de longitud. En algunos casos, fragmentos para uso en ARNi serán por lo menos sustancialmente similares a regiones de una proteina objetivo que no se presentan en otras proteínas en el organismo o pueden ser seleccionados para tener poca similaridad con otros transcriptos de organismos como sea posible, por ejemplo, seleccionados por comparación a secuencias al analizar bases de datos de secuencias disponibles públicamente.

Los vectores de expresión que expresan siARN transitoria y establemente transíectadas han sido diseñados para expresar ARN de horquilla pequeños, que son procesados in vivo a moléculas de siARN aptas de llevar a cabo el silenciamiento gen-específico (Brummelkamp et al., Science 296:550-553 (2002), y Paddison, et al., Genes & Dev. 16:948-958 (2002) ) . El silenciamiento genético post-transcripcional mediante ARN de doble hebra es discutido en detalle adicional por Hammond et al. Nature Rev Gen 2: 110-119 (2001), Fire et al. Nature 391: 806-811 (1998) y Timmons and Fire Nature 395: 854 (1998).

Aquel de habilidad en el arte reconocerá que el transcripto de sentido (incluyendo pero no limitados a siARN) ' o antisentido debe ser apuntado a secuencias con la mayor varianza entre miembros de familia en donde el objetivo es apuntar solamente un miembro de la familia de histona (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) .

Todavía otra manera para suprimir la expresión de un gen de planta endógeno es mediante expresión recombinante de un microARN que suprime un objetivo (por ejemplo, un gen de CENH3, CENPC, CM21, MIS 12, NDC80 ó NUF2) . Los microARN artificiales son ARN de una sola hebra (por ejemplo de entre 18-25 mers, en general 21 mers), que no son encontrados normalmente en plantas y que son procesados de precursores de miARN endógenos. Sus secuencias son diseñadas de acuerdo con los determinantes de selección objetivo de miARN de planta, de tal manera que el microARN artificial silencia específicamente su(s) gen (es) objetivo propuesto y son en general descritos en Schwab et al, The Plant Cell 18: 1121- 1133 (2006) también como los métodos a base de internet de diseñar tales microARN como se describe en la misma. Véase también, publicación de patente estadounidense No. 2008/0313773.

Métodos para introducir mutaciones genéticas a genes de plantas y seleccionar plantas con rasgos deseados son bien conocidos y pueden ser usados para introducir mutaciones o para noquear una proteina del complejo de cinetocoro (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) . Por ejemplo, semillas u otro material de planta puede ser tratado con un polinucleótido insercional mutagénico (por ejemplo, transposón, T-ADN, etc.) o sustancia química, de acuerdo con técnicas estándar. Tales sustancias químicas incluyen pero no están limitadas a lo siguiente: sulfato de dietilo, etilen imina, metansulfonato de etilo y N-nitroso-N-etilurea. Alternativamente, se puede usar radiación ionizante de fuentes tales como rayos X o rayos gamma. Plantas que tienen una proteína de complejo de cinetocora mutado (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 ó NUF2) pueden luego ser identificados, por ejemplo, mediante fenotipo o mediante técnicas moleculares.

Cadenas de proteína modificadas pueden también ser diseñadas fácilmente utilizando varias técnicas de ADN recombinantes bien conocidas para aquellos experimentados en el arte y descrito por ejemplo, en Sambrook et al, supra. También se puede usar hidroxilamina para introducir mutaciones de una sola base a la región de codificación del gen (Sikorski et al., Meth. Enzymol., 194:302-318 (1991)). Por ejemplo, las cadenas pueden variar de la secuencia que se presenta naturalmente a nivel de estructura primaria por sustituciones, adiciones, cancelaciones de aminoácidos y los semejantes. Estas modificaciones pueden ser usadas en un número de combinaciones para producir la cadena de proteina modificada final.

Alternativamente, se puede usar recombinación homologa para inducir modificaciones de gen apuntada o knockouts al apuntar específicamente al gen de proteína del complejo de cinetocora (por ejemplo, CENH3, CENPC, MCM21, MIS12, NDC80 o NUF2) in vivo (véase, en general, Grewal y Klar, Genetics, 146: 1221-1238 (1997) y Xu et al., Genes Dev., 10:241 1-2422 (1996)) . La recombinación homologa ha · sido demostrada en plantas (Puchta et al., Experientia, 50:277-284 (1994); Swoboda et al., EMBO J. , 13:484-489 (1994); Offringa et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:7346- 7350 (1993); y Kempin et al., Nature, 389:802-803 (1997) ) .

Al aplicar tecnología de recombinación homologa a los genes de la invención, mutaciones en porciones seleccionadas de secuencias del gen de proteína del complejo de cinetocora (incluyendo 5' corriente arriba, 3' corriente abajo y regiones intragénicas ) tales como aquellas reveladas en la presente se hacen in vi tro y luego introducidas a la planta deseada utilizando técnicas estándar. Puesto que la eficiencia de la recombinación homologa se sabe que es dependiente de los vectores usados, el uso de los vectores de apuntamiento genético dicistrónico como se describe por ountford et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:4303-4307 (1994); y Vaulont et al, Transgenic Res., 4:247-255 (1995) son usados convenientemente para incrementar la eficiencia de seleccionar la expresión genética de CENH3 alterada en plantas transgénicas . El gen.mutado interactuará con el gen tipo silvestre objetivo de tal manera que la recombinación homologa y el reemplazo apuntado del gen tipo silvestre ocurrirá en células de planta transgénica, dando como resultado la supresión de la actividad del complejo de cinetocora .

V. PREPARACIÓN DE VECTORES RECOMBINANTES Para usar secuencias aisladas en las técnicas anteriores, vectores de ADN recombinantes apropiados para transformación de células de plantas son preparados. Técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y son descritas en la literatura técnica y científica, por ejemplo, eising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Una secuencia de ADN que codifica 'por el polipéptido deseado, por ejemplo las fusiones de proteína tailswap como se describe en la presente y/o siARN, antisentido, u otras construcciones de silenciamiento, serán combinadas con secuencias reguladoras de y inicio de transcripción y traducción que dirigirán la transcripción de la secuencia del gen en los tejidos propuestos de la planta transformada .

Por ejemplo, un fragmento de promotor de planta puede ser empleado que dirigirá la expresión del gen en todos los tejidos de una planta regenerada. Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión del polinucleótido de la invención de manera especifica del tejido (promotores tejido-especifico), órgano (promotores órgano-especifico) o pueden ser de otra manera bajo control ambiental más preciso (promotores inducibles) . Ejemplos de promotores tejido-específicos bajo control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solamente en ciertos tejidos, tales como fruta, semillas, flores, pistilos y anteras. Promotores apropiados incluyen aquellos de genes que codifican proteínas de almacenamiento o la proteína de membrana de cuerpo de lípido, oleosina.

Si se desea la expresión de polipéptido apropiada, una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región de codificación debe ser incluida. La región de poliadenilación puede ser derivada del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas o de T-ADN.

El vector que comprende las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones de codificación) de genes de la invención pueden también comprender, por ejemplo, un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable sobre células de plantas. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocida, particularmente resistencia a antibiótico, tal como resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o resistencia a herbicida, tal como resistencia a clorosulfuron o Basta.

Promotores constitutivos Un promotor o un fragmento activo del mismo, puede ser empleado que dirigirá la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteina de fusión de la invención, en todos los tejidos de células transformadas, tales como aquellas de una planta regenerada. Tales promotores son denominados en la presente como promotores "constitutivos" y son activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estado de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen aquellos de virus que infectan plantas, tales como región de inicio de transcripción 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV) (véase, por ejemplo, Dagless, Arch. Virol. 142: 183-191.(1997)); el promotor 1'- o 2' - derivado de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens (véase por ejemplo, Mengiste supra (1997); O'Grady, Plant Mol. Biol. 29:99-108) (1995)); el promotor del virus de mosaico de tabaco; el promotor del virus de mosaico de Figwort (véase por ejemplo, Maiti, Transgenic Res. 6: 143-156) (1997)); promotores de actina, tales como el promotor de gen de actina de Arabídopsís (véase por ejemplo, Huang, Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1997)); promotores del gen de alcohol deshidrogenasa (Adh) (véase por ejemplo, Millar, Plant Mol.

Biol. 31:897-904 (1996)); ACTll de Arabidopsis (Huang et al, Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong et al, Mol. Gen. Genet . 251: 196-203 (1996)), el gen que codifica la proteina portadora de estearoil-acilo desaturasa de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe et al, Plant Physiol. 104: 1167-1176 (1994)), GPcl de maíz (GenBank No. X15596, Martínez et al, J. Mol. Biol. 208:551-565 (1989)), Gpc2 de maíz (GenBank No. U45855, Manjunath et al, Plant Mol. Biol 33:97-112 (1997)), otra regiones de inicio de traducción de varios genes de plantas conocidos para aquellos de habilidad en el arte. Véase también Holtorf, "Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana," Plant Mol. Biol. 29:637-646 (1995) . Promotores constitutivos adicionales incluyen, por ejemplo, los promotores del gen de poliubiquitina de Arabidopsis thaliana, UBQ3 y UBQ10, (Norris et al, Plant Mol. Biol. 21:895 (1993)), son también útiles para dirigir la expresión genética .

Promotores Inducibles Se puede usar opcionalmente un promotor inducible para controlar (1) la expresión de un microARN artificial, siARN u otro polinucleótido de silenciamiento, (2) y simultáneamente activar la expresión de la proteína mutada transgénica (por ejemplo, tailswap) o (3) tanto (1) como (2). Esto tendría la ventaja de tener una planta normal (una que podría tener fertilidad más alta) hasta la inducción, lo que luego crearía gametos separados para inducir haploides.

Promotores Tejido-Específicos Una alternativa es regular descendentemente la proteína endógena (por ejemplo, mediante silenciamiento genético) en un tejido específico (por ejemplo, por lo menos en los gametofitos maduros (ya sea polen o saco embrional) ) y reemplazarlo solamente en este tejido con un promotor específico que impulsa la expresión de una proteína tailswap. En algunas modalidades, el mismo promotor tejido-específico es usado para impulsar un micro ARN artificial, siARN u otro polinucleótido de silenciamiento _ y el transgén de codificación tailswap de rescate.

VI. PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS O CÉLULAS DE PLANTAS Los constructos de ADN de la invención pueden ser introducidos al genoma del huésped de planta deseado mediante una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, la construcción de ADN puede ser introducida directamente al ADN genómico de la célula de planta utilizando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de célula de planta o las construcciones de ADN pueden ser introducidas directamente al tejido de planta utilizando métodos biolísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Alternativamente, las construcciones de ADN pueden ser combinadas con regiones de flanqueo de T-ADN apropiadas e introducidas a un vector huésped de Agrobacterium turnefaciens convencional. Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium turnefaciens dirigirán la inserción de la construcción y marcador adyacente al ADN de la célula de planta cuando la célula es -infectada por la bacteria.

Técnicas de microinyección son conocidas en el arte y bien descritas en la literatura científica y de patente. La introducción de construcciones de ADN utilizando precipitación de polietilenglicol es descrita en' Paszkowski et al., Embo J. 3:2717-2722 (1984). Técnicas de electroporación son descritas en Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). Técnicas de transformación biolísticas son descritas en Klein et al., Nature 327:70-73 (1987) .

Técnicas de transformación moderadas por Agrobacterium turnefaciens, incluyendo desarme y uso de vectores binarios, son bien descritas en la literatura científica. Véase, por ejemplo Horsch et al., Science 233:496-498 (1984), y Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983) .

Las células de plantas transformadas que son derivadas mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden ser cultivadas para regenerar una planta entera que posee el genotipo transformado y asi el fenotipo deseado, tal como resistencia a enfermedad incrementada en comparación con una planta testigo que no fue transformada o fue transformada con un vector vacio. Tales técnicas de regeneración dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de cultivo del cultivo de tejido, que dependen comúnmente de un marcador de biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas de protoplastos cultivados es descrita en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración puede también ser obtenida de callos de planta, explarítas, órganos o partes de las mismas. Tales técnicas de regeneración son descritas en general en Klee et al., Ann. Rev. Of Plant Phys. 38:467-486 (1987).

Los ácidos nucleicos y polipéptido codificados de la invención pueden ser usados para conferir las características descritas en la presente, incluyendo la habilidad para generar progenie haploide, como se describe en la presente, sobre esencialmente cualquier planta. Asi, la invención tiene uso en un amplio intervalo de plantas, incluyendo dicotiledóneas o monocotiledóneas , incluyendo por ejemplo, especies de los géneros Asparagus, Atropa, Avena, Brassica , Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucúrbita , Daucus, Fragaria , Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocadlis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca , Linum, Lolium, Lycopersicon , Malus, Manihot, Majorana , Medicago, Nicotiana , Oryza, Panicum, Pennisetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna, y Zea.

VII. MÉTODOS DE CRUZA MEJORADOS El cruce de plantas que carecen de una proteina del complejo de cinetocora endógena y expresan una proteina del complejo de cinetocora mutada activa como sé describe en la presente (por ejemplo, como tailswap u otra proteina del complejo de cinetocora de CENH3 o sin CENH3 mutada) ya sea como un padre de polen u óvulo a una planta que expresa una proteina de complejo de cinetocora endógena (por ejemplo, proteina de CENH3, CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) dará como resultado en que por lo menos algo de progenie (por ejemplo, por lo menos 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20% o más) que son haploides y comprenden solamente cromosomas de la planta que expresan la proteina del complejo de cinetocora. Asi, la presente invención permite la generación de plantas haploides que tienen todos sus cromosomas de una planta de interés al cruzar la planta de interés con una planta que expresa transgénicamente la proteina del complejo de cinetocora mutada y recolectar la semilla haploide resultante.

Como se indica anteriormente, la planta que expresa una proteina de CENH3 tipo silvestre endógena puede ser cruzada ya sea como uno u otro del padre macho o hembra. Un aspecto único de la presente invención es que permite la generación de una planta (u otros organismos) que tienen solamente los cromosomas nucleares de padre macho y un citoplasma padre hembra con mitocondrias asociadas y plastidos asociados, cuando el padre tailswap es el padre macho .

En tanto que las plantas que carecen de un gen de CENH3 endógeno y expresan una proteina de CENH3 mutada compuesta de un dominio de cola de H3 de GFP-histona -pliegue de CENH3 histona tienen fertilidad macho limitada, se ha encontrado que las plantas que carecen de un gen de CENH3 endógeno y expresan tanto una proteina de CENH3 mutada compuesta del dominio de cola de GFP-histona - pliegue de CENH3 histona y CENH3 de GFP tipo silvestre da como resultado plantas con fertilidad macho más alta haciéndolas convenientes para uso como padre macho, también como hembra, en la cruza. En general, la invención provee la expresión de dos o más diferentes proteínas del complejo de cinetocora mutadas en una planta (por ejemplo, una planta que carece de la expresión de la(s) proteína (s) del complejo de cinetocora endógena correspondiente.

Una vez generadas, las plantas haploides pueden ser usadas para una variedad de intentos útiles, incluyendo pero no limitados a la generación de plantas haploides duplicadas, que comprenden una copia duplicada exacta de cromosomas. Tales plantas haploides mutadas son de uso particular para acelerar la cruza de plantas, por ejemplo. Una amplia variedad de métodos son conocidos para generar organismos haploides duplicados a partir de organismos haploides.

Células haploides somáticas, embriones haploides, semillas haploides o plantas haploides producidas a partir de semillas haploides pueden ser tratados con un agente de duplicación de cromosoma. Plantas haploides dobles homócigas pueden ser regeneradas a partir de células haploides al poner en contacto las células haploides, incluyendo pero no limitados a callo haploide, con agentes de duplicación de cromosoma, tal como colchicina, herbicidas anti-microtúbulo u óxido nitroso para crear células haploides dobles homócigas.

Métodos de duplicación de cromosoma son revelados en, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 5,770,788; 7,135,615 y publicación de patente estadounidense No. 2004/0210959 y 2005/0289673; Antoine-Michard, S. et al., Plant Cell, Tissue Organ Cult., Cordrecht, the Netherlands, Kluwer Academic Publishers 48 (3) : 203-207 (1997); Kato, A. , Maize Genetics Cooperation Newsletter 1997, 36-37; y Wan, Y. et al., Trends Genetics 77: 889-892 (1989). Wan, Y. et al., Trends Genetics 81: 205-211 (1991), las revelaciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los métodos pueden involucrar, por ejemplo, poner en contacto la célula haploide con óxido nitroso, herbicidas anti-microtúbulo o colchicina. Opcionalmente, los haploides pueden ser transformados con un gen heterólogo de interés, si se desea .

Plantas haploides dobles pueden ser cruzadas adicionalmente con otras plantas para generar Fl, F2 o generaciones subsecuentes de plantas con rasgos deseados.

VIII. Organismos sin plantas Se cree que la invención es también funcional en organismos sin plantas que no tienen cromosomas de sexo sin coincidir. Aquellos de habilidad en el arte pueden asi generar una proteina del complejo de cinetocora mutada (incluyendo pero no limitado a una proteina tailswap) en base a una secuencia de proteina del complejo de cinetocora del organismo particular (por ejemplo, CENH3 , CENPC, MCM21, MIS 12, NDC80 o NUF2) y noqueo del gen de proteina del complejo de cinetocora endógeno correspondiente como sea apropiado para aquellos organismos. Organismos sin planta ejemplares para los cuales se cree que la invención es aplicable, incluyen, pero no están limitados a levadura y otros hongos, también como animales que carecen de sexo sin coincidir (por ejemplo, XY) u otros cromosomas para quienes los haploides no son viables.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar pero no limitar la invención reivindicada.

La producción de plantas haploides que heredan cromosomas de solamente un padre pueden acelerar extensamente la cruza de plantas (Dunwell, J. M., Plant Biotechnol J in press; Forster, B. P. et al., Trends Plant Sci 12:368-75 (2007); Forster, B. P. & Thomas, W. T. B. in Plant Breeding Reviews (ed. Janick, J. ) 57-88 (John Wiley & Sons, Inc., 2005) ) . Los haploides generados de un individuo heterócigo y convertidos a diploide crean lineas homócigas instantáneas, omitiendo generaciones de endogamia. Dos métodos son usados en general para producir haploides: Primero, las células de gametofito cultivadas pueden ser regeneradas a plantas haploides (Guha, S. & Maheshwari , S. C, Nature 204:497 (1964)), pero muchas especies y genotipos son recalcitrantes a este proceso (Forster, B. P. et al., Trends Plant Sci 12:368-75 (2007); edzony, . et al. in Advances in Haploid Production in Higher Plants (eds. Touraev, A., Forster, B. P. & Jain, S. M.) 1-33 (Springer, 2009)). Segundo, haploides pueden ser inducidos de cruzas interespecíficas raras, en las cuales un genoma padre es eliminado después de la fertilización (Bains, G. S. & Howard, H. W. , Nature 166:795 (1950); Barclay, I. R. , Nature 256:410-411 (1975); Burk, L. G. et al., Science 206:585 (1979); Clausen, R. E. & Mann, M. C, Proc Nati Acad Sci U S A 10: 121-124 (1924); Hougas, H. W. & Peloquin, S. J. , Nature 180: 1209-1210 (1957); Kasha, · K. J. & Kao, K. N., Nature 225:874-6 (1970)). La base molecular para la eliminación de genoma no está entendida, pero una teoría postula que centrómeros de las dos especies padre interactúan desigualmente con el huso mitótico, provocando pérdida de cromosoma selectiva (Bennett, M. D. et al., Chromosoma 54: 175-200 (1976); Finch, R. A., Chromosoma 88:386-393 (1983); Laurie, D. A. & Bennett, M . D., Genome 32:953-961 (1989)). En la presente se muestra que el que haploide Arabidopsis thaliana puede ser generado fácilmente por medio de semillas al manipular una sola proteína de centrómero, la histona centrómero-específica CENH3/CENP-A. Cuando mutantes nulos de cenh3 que expresan proteínas de CENH3 alteradas son cruzadas con tipo silvestre, los cromosomas de mutantes son eliminados, produciendo progenie haploide. Los haploides son convertidos espontáneamente a diploides fértiles por medio de no reducción mitótica, permitiendo que su genotipo sea perpetuado. Los haploides maternales y parternales pueden ser generados por medio de cruzas recíprocas. La eliminación de genoma centrómero-moderada también ha sido aprovechada para convertir un tetraploide natural Arabidopsis a un diploide, reduciendo su ploidea para simplificar la cruza. Ya que CENH3 es universal en eucariontes, el método se puede extender para producir haploides en cualquier especie de planta.

Los centrómeros son los sitios cromosomales se anexan a microtúbulos de huso para moderar la herencia fiel del genoma durante la división celular. Son epigenéticamente especificados por incorporación de CENH3 (CENP-A en humanos, HTR12 en A. thaliana (T albert, P. B. et al., Plant Cell 14: 1053-66 (2002))), una variante de H3 de histona que reemplaza H3 convencional en nucleosomas centroméricos (Henikoff, S. & Dalai, Y., Curr Opin Genet Dev 15: 177-84 (2005))). Cenh3-1, un mutante nulo embrión-mortal en A. thaliana que permite reemplazar completamente CENH3 natural con variantes modificadas, fue aislado. Plantas cenh3-l complementadas por CENH3 proteína-marcado fluorescente verde transgénico (GFP-CENH3) tiene un fenotipo tipo silvestre. cenh3-l puede también ser rescatado por "GFP-tailswap", un transgén en el cual el dominio de cola N-terminal hipervariable de CENH3 fue reemplazado con la cola de H3 convencional, utilizando la variante H3.3 (codificada por Atlgl3370) . GFP-tailswap fue etiquetado en su término N con GF y contenía la cola N- terminal de H3 fusionada al dominio de pliegue de histona de CENH3 como sigue: Cola de H3: MARTKQSARKSHGGKAPTKQLATKAARKSAPTTGGVKKPHRFR (SEQ ID NO: 95) unida al dominio de pliegue de CENH3 histona: PGTVALKEIRHFQKQTNLLI PAASFIREVRS ITHMLAPPQI RWTAEALVALQEAAED YLVGLFSDSMLCAIHARRVTLM KDFELARRLGGKGRPW (SEQ ID NO: 109) .

Las plantas de "GFP-tailswap" {cenh3-l rescatado por un transgén de GPF-tailswap) mostró mitosis exacta, ya que la aneuploidia en células somáticas no fue detectada. Sin embargo, las plantas de GFP-tailswap fueron estériles en el florecimiento, indicando que pueden tener un defecto especifico en meiosis. GFP-tailswap fue en su mayoría estéril macho, aunque podría ser usado como donador de polen si muchas anteras eran acumuladas. Cuando son cruzadas como la hembra con el macho tipo silvestre, las plantas de GFP-tailswap fueron 60-70% como tan fértiles como el tipo silvestre .

Cuando GFP-tailswap fue polinizado mediante tipo silvestre, varios fenotipos inusuales en la progenie Fl fueron observados. Primero, - 80-95% de óvulos fertilizados abortaron prematuramente en el desarrollo, produciendo semillas no viables (Tabla 1) .

Tabla 1 Plantas haploides que contienen solamente el genoma nuclear de su padre tipo silvestre Segundo, mientras que se esperaba que la descendencia viable fueran heterócigos diploides por cenh3-l y hemicigos para el transgén de GFP-tailswap, 10 de 16 plantas tuvieron CENH3 tipo silvestre y carecían de GFP-tailswap. Cada una de estas plantas fueron estériles a pesar de tener un genotipo tipo silvestre. Además, la cruza de GFP-tailswap con un macho mutante de cuarteto también produjo descendencia Fl estéril (3/5 plantas) que mostraron el fenotipo mutante cuartete del polen fusionado, a pesar del hecho de que cuartete es recesivo y se esperaba que el padre de GFP-tailswap transmitiera un alelo CUARTETE tipo silvestre. Estas observaciones sorprendentes sugirieron que la progenie estéril había perdido cromosomas de su madre de GFP-tailswap y así tuvieron menos cromosomas que el diploide A. thaliana (2n = 10) . El cariotipo de estas plantas fue examinado y se encontró que son haploides que contienen solamente cinco cromosomas.

Ya que los centrómeros controlan la herencia de cromosoma, se razonó que los cromosomas que entraron al cigoto que contiene la variante de GFP-tailswap de CENH3 serían despreciados y perdidos, creando plantas haploides con cromosomas solamente de su padre tipo silvestre. Para confirmar esto, plantas de GFP-tailswap (en el acceso Col-0) fueron cruzadas con varios accesos polimórficos y haploides Fl de genotipo para marcadores en todos los cinco cromosomas de A. thaliana (Tabla 1) . Sin consideración del padre tipo silvestre usado, las plantas haploides contenían invariablemente solo cromosomas tipo silvestre (haploides paternales), indicando que el genoma de GFP-tailswap fue eliminado (un total de 42 haploides fueron genotipados) .

Además, los resultados muestran que el proceso de inducir haploides mediante eliminación de genoma centrámero-moderado es independiente del genotipo del padre tipo silvestre.

La eliminación de genoma inducida por alteraciones de CENH3 no especifica al transgén de GFP-tailswap. La cruza de mutantes de cenh3-l complementados por GFP-CENH3 con el tipo silvestre también produjo plantas haploides, pero a una frecuencia más baja que GFP-tailswap (Tabla 1) . No se observó progenie haploide de plantas de GFP-tailswap o plantas GFP-CENH3 auto-fertilizadas (Tabla 1) . Los resultados sugieren que perturbaciones generales en la estructura del centrómero son suficientes para impedir la segregación de cromosoma durante la mitosis cigótica, creando un embrión haploide cuando los cromosomas que contienen CENH3 mutantes compiten con el tipo silvestre en el mismo huso.

Haploides son generados eficientemente de una cruza GFP-tailswap x tipo silvestre, que comprende 25-45% de descendencia viable (Tabla 1) . La progenie restante fue ya sea híbridos diploides o híbridos aneuploides que muestran los fenotipos de desarrollo típicos de plantas de A. thaliana con más de 10 cromosomas (Henry, I. M. et al., Genetics 170: 1979-88 (2005)) (Tabla 1). La aneuploidía podría también tomar en cuenta el alto nivel de aborto de semillas en una cruza de GFP-tailswap x tipo silvestre, ya que algunos embriones con cariotipos desequilibrados pueden ser no viables .

Los haploides uniparentales pueden contener el genoma ya sea uno u otro de su padre hembra o macho. Los haploides fueron también obtenidos al cruzar una hembra tipo silvestre con GFP-tailswap como el donador de polen (Tabla 1) . En este caso, la progenie haploide son puramente de origen maternal. El genotipado del genoma de plastido demostró que ambos haploides maternales y paternales contenían el citoplasma de su padre materno. Ya sea uno u otro de haploide maternales o paternales fueron elaborados utilizando plantas de GFP-tailswap como el padre macho o hembra respectivamente en una cruza con el tipo silvestre. La proporción de haploides y aneuploxdes fue mucho más baja si una hembra tipo silvestre era cruzada con un macho de GFP-tailswap (Tabla 1) . Se tiene la hipótesis de que si CENH3 es expresado anteriormente en el desarrollo del genoma maternal (tipo silvestre) , el CENH3 tipo silvestre podría ser incorporado a cromosomas paternos derivados de GFP-tailswap, impidiendo la eliminación de genoma en una cruza tipo silvestre x GFP-tailswap.

Las plantas de A. thaliana haploides son morfológicamente similares a diploides, pero son comparativamente más pequeñas de tamaño. Temprano en el desarrollo vegetativo, los haploides tienen hojas de roseta más estrechas. Después del disparo, los haploides producen más hojas de meristemos secundarios. Las flores haploides son más pequeñas que las flores diploides, siguiendo la tendencia general que el tamaño de flor se incrementa con la ploidia en A. thaliana. Los haploides son en general estériles. Contienen una sola copia de cada cromosoma y no pueden sufrir apareamiento homólogo en meiosis, dando como resultado gametos que no contienen un pleno complemento de cromosomas. Las plantas haploides maternales y paternales tienen morfología adulta similar. Esto es consistente con el hecho de que toda la impresión documentada en A. thaliana ocurre en el endosperma de corta vida, una estructura confinada a la semilla- Para aprovechar el potencial de haploides en mejora de cultivo, su genoma debe ser duplicado para generar diploides fértiles (haploides doblados) (Forster, B. P., et al. Trends Plant Sci 12:368-75 (2007)). Una inspección estrecha de haploides de A. thaliana reveló que silicuas aleatorias tenían una o dos semillas. Cada planta haploide producía un total de 50-2500 semillas dependiendo del acceso parental tipo silvestre (Tabla SI).

Tabla SI . Número de semillas diploides espontáneas producidas por haploides de A. thaliana Una mayoría (95%) de estas semillas parecieron normales y dieron surgimiento a diploides fértiles. Para tratar cómo los haploides dan surgimiento a semillas diploides, se analizó la segregación de cromosoma durante la meiosis macho de haploide. Durante la profase I, los cinco cromosomas permanecieron separados como univalentes, los cuales se alinearon apropiadamente en la metafase I. En la anafase I, la mayoría de los meiocitos mostraron segregación reduccional desequilibrada (4-1, 3-2, etc.) . La meiosis II en estos casos dio surgimiento a tetradas aneuploides. En una pequeña minoría de células de anafase I, los 5 univalentes migraron hacia un polo (segregación 5-0) . En la meiosis II subsecuente, los cromátidos hermana se segregaron igualmente, dando surgimiento a diadas haploides y gametos viables. Asi, se supone que la no reducción ocasional tanto durante la meiosis . haploide macho como hembra produjo haploides duplicados por medio de auto-fertilización, consistente con observaciones previas (Chase, S. S., Botanical Review 35: 117-167 (1969); Jauhar, P. P. et al., Crop Science 40: 1742-1749 (2000) ) . En instancias raras, la duplicación de cromosoma espontáneo en tejidos somáticos de plantas de A. thaliana haploides fue observada; una rama lateral de la inflorescencia principal (2 de 78 plantas) o una silicua aleatoria (6 de 78 plantas) mostraron un conjunto de semilla completo. El inhibidor de polimerización de microtúbulo colchicina también induce duplicación de cromosoma somática en A. thaliana haploide y brotes diploides que se regeneran después de tratamiento muestra un conjunto de semilla completo. Aunque haploides de A. thaliana han sido producidos por medio de cultivos de antera (Avetisov, V. A., Genetika, 12: 17-25 (1976)), diploides espontáneos recuperados en estos experimentos fueron según se dice estériles (Scholl, R. & Amos, J. A., Z Pflanzenphysiol 96:407-414 (1980)), y el método no ha sido adoptado ampliamente. La facilidad de generar haploides por medio de semilla al alterar CENH3 y de convertir haploides a diploides permite que la generación a gran escala de haploides duplicados en A. thaliana.

Muchos cultivos comerciales son poliploides (Udall, J. A. & Wendel, J. F. , Crop Sci, 46:S3-S14 (2006)), pero el análisis genético de poliploides es tedioso. Reducir la ploidia de estos cultivos facilitará una cruza fácil, de tal manera que se probó si la eliminación de genoma moderado por centrómero podría escalar descendentemente un tetraploide a diploide . A. thaliana es predominantemente diploide, pero existen los accesos tetraploides (Henry, I. . et al., Genetics 170: 1979-88 (2005)). GFP-tailswap fue cruzado con el tetraploide natural Warschau-1 (Wa-1) y aunque más del 98% de las semillas fueron abortadas, proteína de Fl viable incluía plantas diploides sintéticas que contienen solamente cromosomas Wa-1 (Tabla 1) . Por consiguiente, es posible extender la eliminación de genoma moderada por centrómero a la mitad de la ploidia de poliploides.

Previamente se tenía la hipótesis de que la incompatibilidad de centrómero provocaba la eliminación de genoma selectivo en cruces de interespecies (Bennett, M. D. et al., Chromosoma 54: 175-200 (1976); Finch, R. A., Chromosoma 88:386-393 (1983); Laurie, D. A. & Bennett, M. D. , Genome 32:953-961 (1989); Heppich, S. et al., TheorAppl Genet 61: 101-104 (1982); Jin, W. et al., Plant Cell 16:571-81 (2004)), pero no se sabía como los centrómeros podrían ser manipulados para obtener esto. Se estableció una base práctica para diseñar la eliminación de genoma al alterar CENH3, una proteína esencial para la función de centrómero en todos los eucariontes. El hecho de que los haploides fueron producidos tanto en transgenes de GFP-tailswap y GFP-CENH3 sugiere que múltiples alteraciones diferentes a la proteina pueden inducir eliminación de genoma en otras plantas. Las plantas de A. thaliana que coexpresan proteínas tipo silvestre y GFP-tailswap o GFP-CENH3 no actúan como inductor haploide. Por consiguiente, el método depende actualmente en reemplazar CENH3 natural con una variante alterada. Una mutación de cenh3 o un método de silenciamiento de gen tal como interferencia de ARN podría ser usado para reducir o eliminar la función de CENH3 endógena en una especie nueva.

Líneas que inducen haploide han sido descritas en los céspedes (Coe, E. H., American Naturalist 93:381-382 (1959); Hagberg, A. & Hagberg, G. , Hereditas 93:341-343 (1980); Kermicle, J. L . , Science 166: 1422-1424 (1969)), pero su base genómica no es conocida, excepto para el gametofito indeterminado de maíz (ig) (Evans, M. M . , Plant Cell 19:46-62 (2007)). El efecto de ig puede ser limitado a maíz, debido a que mutaciones en el ortólogo de ig de A. thaliana AS2 no fenocopia su efecto (Orí, N. et al., Development 127:5523-32 (2000)). Nuestro proceso tiene ventajas clave con respecto a métodos actuales para producir plantas haploides. 1) No se necesita ningún cultivo de tejido, removiendo una fuente principal de dependencia de genotipo. 2) El mismo inductor produce haploides maternales y paternales. 3) La cruza de un mutante de cenh3 como la hembra transfiere el genoma nuclear del padre macho a un citoplasma heterólogo. Esto podría acelerar la producción de líneas estériles macho citoplásmicas para fabricar semilla híbrida. 4) La eliminación de genoma ocurre entre padres que son isogénicos excepto por alteraciones de CENH3, evitando barreras de fertilidad inherente a las cruzas amplias.

La eliminación de genoma por cambios en CENH3 probablemente ocurre durante las primeras pocas mitosis cigóticas, cuando los centrómeros de los dos padres son cargados con diferentes poblaciones de proteínas de CENH3. La expresión tanto en los genes de CENH3 tipo silvestre como mutantes en ciclos celulares subsecuentes debe igualar rápidamente la cantidad de las dos proteínas en centrómeros individuales. La mitosis cigótica es normal en GFP-tailswap y en plantas GFP-CENH3, debido a que haploides de plantas auto-fertilizadas no fueron observados. Además, las plantas de GFP-CENH3 tienen un fenotipo completamente tipo silvestre. Diferencias sutiles en enlace de ADN de centrómero, ensamble de cinetocora o acoplamiento a microtúbulos de huso pueden ser suficientes para frenar la segregación de cromosomas que contienen CENH3 alterado, dando como resultado la eliminación de genoma. Los puntos de verificación de ciclo celular en plantas deben ser relajados lo suficientemente para permitir que cromosomas tipo silvestre y mutantes segreguen diferencialmente y supuestamente permitan citocinesis sin segregación de cromosoma completo. El mecanismo preciso de eliminación de genoma en nuestros experimentos sigue siendo desconocido.

Secuencias de ADN de centrómero y la proteína de CENH3 ambas evolucionan rápidamente y diferencias de centrómero han sido propuestas para crear barreras de especie (Henikoff, S. et al, Science 293: 1098-102 (2001)). Aunque nuestros experimentos utilizaron proteínas etiquetadas, indican que cambios en CENH3 pueden inducir pérdida de cromosoma específica en un cigoto híbrido.

Resumen de Métodos Materiales de Plantas cenh3-l es una transición de G a A en el nucleótido 161 en relación con ATG = +1 y muta un aceptor de empalme conservado en el segundo intrón. Los transgenes de GFP-CENH3 y GFP-tailswap contenían un GFP N-terminal y usaron el promotor y terminador de CENH3 endógeno. La ubicación del transgén de GFP-tailswap fue determinada mediante TAIL-PCR, permitiendo determinar si el transgén era homócigo o hemócigo. La línea estéril macho C24/Ler fue una donación del Dr Luca Comai (Universidad de California, Davis) . La esterilidad macho fue conferida por el transgén de barnasa A9. las plantas fueron cultivadas bajo 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad a 20 grados C.

Preparación y genotipado de ADN genómico La preparación de ADN genómico y genotipado de PCR fueron efectuados utilizando métodos estándar.

Análisis citogenético Para analizar el avance meiotico y para determinar la ploidia, esparcimiento de cromosoma mitóticos y meioticos de antera fueron preparados de acuerdo con los protocolos publicados.

Materiales de Planta cenh3-l fue aislado mediante procedimiento de TILLING (Comai, L. & Henikoff, S., Plant J 45:684-94 (2006)) . La población de TILLING fue creada al mutagenizar Arabidopsis thaliana en el acceso Col-0 con etilmetansulfonato, utilizando protocolos estándar. Cenh3-1 fue aislado mediante TILLING utilizando el análisis de escisión heteroduplex CEL1, con cebadores de PCR específicos para el gen de CENH3/HTR12.

Se predice que cenh3-l disrumpe el empalme normal de CENH3, debido a que muta un sitio de aceptor de empalme conservado al comienzo del segundo exón de codificación. La traducción de un mARN que contiene el primer exón de codificación empalmado a un sitio incorrecto dentro de CENH3 se predice que produce solamente 18 aminoácidos correctos. Ya que el dominio de pliegue de histona de CENH3 comienza en el residuo de aminoácido 82, se cree que cenh3-l es un alelo nulo (esto es apoyado por su fenotipo embrión-mortal) .

La clonación de los transgenes de GFP-CENH3 y GFP-tailswap y la construcción de la salinas de cenh3-l GFP-CENH3 y cenh3-l GFP-tailswap complementadas son descritas en cualquier parte (Ravi, Comai, Sundaresan, Chan et al., manuscrito en preparación) . Secuencias de cebador y plenos detalles están disponibles sobre pedido.

Para cruzar el tipo silvestre como la hembra a GFP-tailswap como el macho se usó un microscopio de disección para observar directamente la deposición de polen sobre el estigma {GFP-tailswap es en su mayoría macho-estéril). La cantidad de polen viable en flores individuales de GFP-tailswap varía. Las flores que mostraron claramente cantidades más altas de polen fueron seleccionadas y polinizadas con más de 60 anteras (10 flores de GFP-tailswap) por estima tipo silvestre para obtener el conjunto de semilla reportado en la Tabla 1. Utilizando un optivisor (lente de amplificación) y aproximadamente 12 anteras (2 flores de GFP-tailswap) por estigma tipo silvestre, se obtuvo un conjunto de semillas mucho más bajo por silicua.

El porcentaje de semillas normales fue determinado mediante inspección visual utilizando un microscopio de disección .

Las semillas de cruces GFP-tailswap x tipo silvestre fueron mostradas sembradas en placas de 1 x MS que contienen sacarosa al 1% para maximizar la eficiencia de germinación, particularmente de semilla que tenia una apariencia anormal. Las semillas de germinación tardía fueron frecuentemente haploides.

El mutante cuartete usado fue qrtl-2 (Francis, K. E . et al., Plant Physiol 142: 1004-13 (2006)).

La esterilidad del macho y la línea C24/Ler fue conferida por el transgen de A9-barnasa (Bushell, C. et al., Plant Cell 15: 1430-42 (2003); Paul, W. et al., Plant Mol Biol 19: 611-22 (1992) ) .

En el experimento de GFP-tailswap x a-1, la progenie de la cruza de GFP-tailswap x Wa-1 que contenía solamente cromosomas Wa-1 fue confirmada como diploide utilizando esparcimiento de cromosoma. Las plantas que fueron heterócigas para algunos cromosomas (marcadores Col-0 y Wa-1) y homócigas para otros cromosomas (marcadores Wa-1 solamente) fueron puntuadas como aneuploides. La descendencia triploide (heterócigas para marcadores en todos los cromosomas) no fueron encontradas. Un' subconjunto de plantas fueron cariotipadas adicionalmente por medio de esparcimiento de cromosoma para confirmar aneuploidia.

Análisis cifcogenético Esparcimientos de cromosomas mitóticos y meioticos de antera fueron preparados de acuerdo con protocolos publicados (Ross, K. J. et al., Chromosome Res 4:507-16 (1996) ) .

Tratamiento con colchicina El tratamiento con colchicina de plantas haploides en desarrollo utilizaron un protocolo publicado previamente con modificaciones menores (Josefsson, C. et al., Curr Biol 16: 1322-8 (2006)). Una solución de colchicina al 0.25%, Silwet al 0.2% fue preparada y se colocó una gota de 20 µ? sobre el meristema antes del disparo. Las plantas se enfermaron transitoriamente después de tratamiento con colchicina. Después de la recuperación, inflorescencias fértiles aparecieron de meristemas secundarios indicando duplicación de cromosoma exitoso. Las plantas haploides pueden también ser tratadas después del disparo, aunque la proporción de éxito es considerablemente más baja.

Ejemplo 2 GFP-maíztai1swap crea haploides Fl en una craza tipo silvestre Se creó una quimera en la cual la cola de CENH3 de A. thaliana de CENH3 es reemplazada con del dominio de cola de CENH3 (SEQ ID NO: 102) de maíz (Zea mays) , generando mediante esto una fusión de la cola de CENH3 de maíz y el dominio de CENH3 histona de A. thaliana y transformó la fusión a heterocigotos de cenh3-l. Como se esperaba, esta proteína de GFP-maístailswap fue apuntada a cinetocoras y rescató el fenotipo embrión-mortal de cenh3-l. Las plantas complementadas fueron más estériles que las plantas complementadas con GFP-tailswap, pero tuvieron fertilidad limitada cuando se usaron como la hembra. Cuando las hembras de GFP-maiztailswap de cenh3-l fueron cruzadas con machos tipo silvestre, 2 haploides, 3 diploides y 5 aneuploides fueron encontrados entre un total de 10 progenies de Fl . mCherry-tailswap crea haploides Fl en vina cruza con tipo silvestre Se creó un transgen en el cual la etiqueta de GFP en GFP-tailswap fue reemplazada con una etiqueta de mCherry N-terminal (mCherry (SEQ ID NO: 105) es una versión monomérica de la proteína fluorescente roja) ) . Del término N a término C, esta proteína contiene mCherry, el dominio de cola de H3.3 de Arabidopsis thaliana y el dominio de pliegue de histona de CENH3 de Arabidopsis thaliana. Los transgenes de mCherry -tailswap fueron transformados a heterocigotos de cenh3-l. Cuando las plantas de mCherry-tailswap cenh3-l complementadas fueron cruzadas como hembras a macho tipo silvestre, 1 haploide, 6 aneuploides y 4 diploides fueron observados de 11 progenie de Fl .

La construcción de mCherry-tailswap fue elaborada como un vector de CP 169 pCAMBIA 1300 con un promotor de HTR. El inserto incluía un sitio Mlu I seguido por el. Sal I Xbal de mcherry N-terminal seguido por el terminador de HTR 12. El fragmento tailswap de H3 fue sintetizado mediante PCR de superposición y sometido a digestión con Sail +Xba I y clonado a CP 169 para fabricar la construcción de mcherrytailswap .

Un transgen tailswap sin etiqueta de GFP complementa una mutación de cenh3-l. Las plantas complementadas crean haploides de Fl en una cruza a tipo silvestre Un transgen fue creado en el cual la etiqueta de GFP en GFP-tailswap fue removida. Del término N al término C, esta proteína contiene el dominio de cola de Arabidopsis thaliana H3.3 y el dominio de pliegue de histona de transgenes de CENH3 tailswap de Arabidopsis thaliana fueron transformados a heterocigotos de cenh3-l. Cuando plantas tailswap cenh3-l complementado, fueron cruzadas como hembras a machos tipo silvestre, 4 haploides, 27 aneuploides y 67 diploides . fueron observados de 95 progenies de Fl.

La co-expresión de diferentes variantes de CENH3 crea propiedades deseables en una cepa de eliminación de genoma .

. La planta de GFP-tailswap descrita previamente (plantas imitantes cenh3-l rescatadas por un transgen de GFP-tailswap) es un inductor haploide muy eficiente, pero es difícil cruzarla como el donador de polen debido a que es en su mayoría estéril macho. GFP-CENH3 (plantas mutantes de cenh3-l rescatadas por un transgen de a GFP-CENH3) es un inductor haploide más débil pero es mucho más fértil. Se encontró que la co-expresión de GFP-CENH3 y GFP-tailswap en plantas cenh3-l produciría polen más viable que GFP-tailswap, y todavía induce eliminación de genoma cuando estas plantas fueron cruzadas a diploide o tetraploide tipo silvestre. Por supuesto, cenh3-l que portan ambos de los transgenes de GFP-CENH3 y GFP-tailswap {GEM; Eliminación de genoma provocado por una mezcla de variantes de cenh3) producen polen amplios para cruce, ante la viabilidad de polen fue todavía más bajo que el tipo silvestre.

El cruce de hembras de GEM a machos tipo silvestre produjo 2 haploides de Fl de 50 progenies. Cuando hembras tipo silvestre fueron cruzadas a machos de GEM, un haploide fue encontrado de 104 progenies.

Las plantas de GEM son una mejora principal con respecto a GFP-tailswap o GFP-CENH3 cuando el padre tipo silvestre es un tetraploide que tiene gametos diploides.

Cuando plantas GEM fueron cruzadas como macho o hembra, a tipo silvestre tetraploide, los cromosomas del padre de GEM fueron eliminados en un subconjunto de progenie de Fl (Tabla 3) . GEM es fértil ya sea como macho o hembra y eliminación de genoma eficiente cuando es cruzado por un padre tetraploide con gametos diploides.

Tabla 2. Cruza entre GEM y plantas tipo silvestre diploides producen eliminación de genoma.

Tabla 3. Cruza entre GEM y plantas tipo silvestre tetraploides produce eliminación de genoma.

Métodos para construcción de GFP-maízetailswap El transgen de CENH3 tailswap de maíz fue construido al fusionar en cuadro la cola N-terminal de CENH3 de maíz (correspondiente a l-61aa) y el dominio de pliegue de CENH3 de Arabidopsis (correspondiente a 82-179aa) mediante PCR de superposición. El dominio de cola de N terminal de maíz (206 bp) fue amplificado de cADN de maíz de las combinaciones de cebador CP 384 (5'- NNNNgtcgacATGGCTCGAACCAAGCACCA-3' (SEQ ID NO: 110), el sitio de Salí está en cursivas) y CP 572 (5' CAACGGTTCCTGGCCTCCAGCGGTGGC-3 ' (SEQ ID NO: 111) ) . El HFD de Arabidopsis (950 bp) fue amplificado de ADN genómico utilizando combinaciones de cebador CP 571 (5'-GCCACCGCTGGAGGCCAGGAACCGTTG-3 ' (SEQ ID NO: 112)) y CP 375 (5' -NNNNtctgaTCACCATGGTCTGCCTTTTCCTCC-3' (SEQ ID NO: 113), el sitio de Xbal está en cursivas) . Los fragmentos resultantes fueron purificados por gel y usados como plantilla para fusionarlos en una PCR de supreposición utilizando combinaciones de cebador CP 384 y CP 375. El fragmento de 1.15kb resultante es clonado como un fragmento de Sall-Xbal en un vector binario CP 93 (derivado de CAMBIA 1300) . El vector de CP 93 la secuencia de codificación de GFP corriente arriba en cuadro con el sitio Sall-Xbal y su expresión es controlada por las secuencias reguladoras 5' y 3' del gen de CENH3 de Arabidopsis.

Se comprenderá que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son por propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios a luz de los mismos serán sugeridos para las personas experimentadas en el arte y serán incluidos dentro del espíritu y alcance de la solicitud y alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica caracterizada porque comprende un caset de expresión de transgen heterólogo, el caset de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido CENH3, CENPC, MIS 12, NDC80 o NUF2 alterado recombinantemente, en donde, en el caso de que el polipéptido alterado recombinantemente sea expresado en una primera planta que tiene un gen de CENH3, CENPC, MIS 12, NDC80 o NUF2 endógeno desactivado correspondiente y la primera planta es cruzada con una planta tipo silvestre, por lo menos 0.1% de la progenie resultante son haploides.

2. La planta de la reivindicación 1, caracterizado porque uno o dos alelos de la secuencia de codificación genómica de CENH3, CENPC, MIS 12, NDC80 o NUF2 endógena de la planta es desactivada o noqueada.

3. La planta de la reivindicación 2, caracterizado porque todos los alelos de la secuencia de codificación genómica de CENH3, CENPC, MIS 12, NDC80 o NUF2 endógena de la planta es desactivada o noqueada.

4. La planta de la reivindicación 1, caracterizada porque la planta, cuando es cruzada con una planta tipo silvestre, genera por lo menos 0.1% de progenie haploide.

5. La planta de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido es un polipéptido de CENH3 alterado recombinantemente .

6. La planta de la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos heteróloga de por lo menos 5 aminoácidos enlazada a un proteina que comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona, en donde la secuencia de aminoácidos es heteróloga al dominio de pliegue de CENH3 histona.

7. La planta de la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga está enlazada directamente al dominio de pliegue de CENH3 histona y el polipéptido carece de un dominio de cola de CENH3.

8. La planta de la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga está enlazada al dominio de pliegue de CENH3 histona via una secuencia de proteina intermedia.

9. La planta de la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de proteina comprende intermedia comprende un dominio de cola de H3 sin CENH3 histona.

10. La planta de la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola de CENH3.

11. La planta de la reivindicación 10, caracterizada porque el dominio de cola de CENH3 es heterólogo al dominio de pliegue de CENH3 histona.

12. La planta de la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga es de por lo menos 10 aminoácidos de largo.

13. La planta de la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido comprende un dominio de cola sin CENH3 enlazado a un dominio de pliegue de CENH3 histona.

14. La planta de la reivindicación 9, caracterizada porque el dominio' de cola de H3 sin CENH3 histona comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 70% idéntica a SEQ ID NO: 95 o un fragmento del mismo de por lo menos 20 aminoácidos de larga.

15. La planta de la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de proteina intermedia comprende un dominio de cola de H3 histona y un dominio de cola de CENH3 histona heterólogo.

16. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 8-15, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende proteina fluorescente verde.

17. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 7-15, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos heteróloga disrumpe centrómeros.

18. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 7-15, caracterizado porque el dominio de pliegue de CENH3 histona es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49-94.

19. La planta de la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido comprende un dominio de pliegue de CENH3 histona y un dominio de cola de CENH3 truncado, en donde el término amino del dominio de cola es truncado en relación con el dominio de cola endógeno de la planta.

20. . La planta de la reivindicación 19, caracterizado porque el dominio de cola de CENH3 truncado carece de tres o más aminoácidos terminales del dominio de cola endógeno.

21. La planta de la reivindicación 19, caracterizada porque una secuencia de aminoácidos heteróloga es enlazada al término amino del dominio de cola truncado.

22. La planta de la reivindicación 21, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga es de por lo menos 10 aminoácidos de larga.

23. La planta de la reivindicación 21, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende proteina fluorescente verde.

24. La planta de la reivindicación . 21, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga disrumpe centrómeros.

25. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 19-24, caracterizado porque el dominio de pliegue de CENH3 histona es seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49-9 .

26. La planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de CENPC, MIS 12, NDC80 y NUF2 alterado recombinantemente .

27. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende: un dominio de cola sin CENH3 enlazado a un dominio de pliegue de CENH3 histona o un dominio de cola de CENH3 truncado enlazado a un dominio de pliegue de CENH3 histona, en donde el término amino del dominio de cola es truncado.

28. Una planta caracterizada porque comprende un CENH3 silenciado o una o dos copias de un alelo de un gen de CENH3 endógeno noqueado, desactivado o mutado.

29. Un método de generar una planta haploide, el método está caracterizado porque comprende, cruzar una planta que expresa una proteina de CENH3 endógena con la planta de la reivindicación 1 y seleccionar la progenie haploide de Fl generada de la etapa de cruza.

30. El método de la reivindicación 29, caracterizado porque la planta que expresa una proteína de CENH3 endógena es el polen padre de la cruza.

31. El método de la reivindicación 29, caracterizado porque la planta que expresa una proteína de CENH3 endógena es el óvulo padre de la cruza.

32. El método de la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además convertir por lo menos una planta haploide seleccionada a una planta haploide duplicada .

33. Un método para la fabricación de la planta de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: transformar células de plantas con un ácido nucleico que comprende el caset de expresión y seleccionar transformantes que comprenden el ácido nucleico, fabricando mediante esto la planta.