MX2008007458A - Acidos nucleicos y metodos para producir semillas que tienen un complemento diploide completo del genoma materno en el embrion - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a genes DYAD, mutantes de los mismos, y uso de ellos para hacer plantas que retengan la heterocigosidad de la planta madre;la invención también incluye plantas, tejidos de plantas y semillas de plantas que tienen una díada de fenotipo y también retienen la heterocigosidad de la planta madre de manera constitutiva o condicional;la invención esútil para propagar los fenotipos híbridos deseados en una manera de una planta apomíctica y para aumentar la ploidía de un genotipo de planta el cual puede dar como resultado plantas que tienen biomasa aumentada.

Description

ACIDOS NUCLEICOS Y METODOS PARA PRODUCIR SEMILLAS QUE TIENEN UN COMPLEMENTO DIPLOIDE COMPLETO DEL GENOMA MATERNO EN EL EMBRION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso de alelos del gen DYAD producto de gen de Arabidopsis, Boechera, arroz y otras plantas para manipular gametogénesis y desarrollo de semillas para el propósito de producción de semillas que portan un complemento diploide completo del genoma materno en el embrión. La presente invención también se refiere al uso de un gen DYAD alterado para producir un gametofito femenino no reducido sin efecto sustancial sobre el desarrollo del polen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El ciclo de vida de la planta alterna entre una generación de esporofito diploide y una generación de gametofito haploide. La meiosis representa la transición entre las fases de esporofito diploide y gametofito haploide del ciclo de vida de la planta. La meiosis conduce a la formación de esporas haploides. En las plantas, a diferencia de los animales, los productos meióticos sufren divisiones adicionales para formar un gametofito haploide multicelular. La diferenciación de los gametos ocurre en las últimas etapas del desarrollo del gametofito, después de la división de los productos meióticos. El proceso sexual antes de la fertilización por lo tanto comprende dos etapas distintas: esporogénesis que incluye meiosis y la formación de esporas haploides; y gametogénesis que se refiere al desarrollo de las esporas en un gametofito, que comprende el gameto y células asociadas requeridas para la fertilización y para soportar el crecimiento del embrión. La mayoría de las especies vegetales sufren reproducción sexual; sin embargo, algunas especies vegetales son capaces de realizar reproducción asexual. El término apomixis es generalmente aceptado como el reemplazo de reproducción sexual por cualquiera de ciertas formas de reproducción asexual (Koltunow A. y Grossniklauss U. Annu. Rev. Plant Biol. Vol. 54: 547-74, 2003). Apomixis es un método genéticamente controlado de reproducción en las plantas, que implica la formación de semilla en la cual el embrión se forma sin unión de un óvulo y un espermatozoide. Hay tres tipos básicos de reproducción apomíctica: 1 ) aposporia, en la cual el embrión se desarrolla partenogenéticamente a partir de un óvulo cromosómicamente reducido en un saco embrionario derivado del núcleo, 2) diplosporia, en la cual un embrión se desarrolla partenogenéticamente a partir de un óvulo no reducido en un saco embrionario derivado de la célula madre de la megaspora, y 3) embrión adventicio, en el cual un embrión se desarrolla directamente a partir de una célula somática. Los dos primeros tipos de apomixis se clasifican juntos bajo apomixis gametofítica porque en ambos casos el embrión se desarrolla a partir de un gametofito femenino o saco embrionario, mientras que en el embrión adventicio el embrión se desarrolla directamente de una célula somática sin una etapa de gametofito femenino intermedia. La apomixis gametofítica por lo tanto implica dos componentes: i) apomeiosis, o la producción de un gametofito femenino no reducido (saco embrionario) que retiene el gametofito progenitor, y ii) desarrollo partenogenético del embrión, con o sin fertilización de la célula central que se desarrolla en el endospermo. La apomixis es por lo tanto un proceso reproductivo que se desvía de la meiosis femenina y singamia para producir embriones genéticamente idénticos al progenitor materno. Los tres tipos de apomixis tienen potencial económico ya que pueden causar que cualquier genotipo, independientemente de qué tan heterocigoto sea, se reproduzca verdaderamente. Con la reproducción apomíctica, la progenie de genotipos especialmente adaptativos o híbridos mantendría su genotipo en todos los ciclos de vida repetidos. Además de fijar vigor híbrido, la apomixis puede hacer posible la producción híbrida comercial en cultivos en donde los sistemas de restauración de esterilidad o fertilidad masculina eficientes para producir híbridos no son conocidos o no se han desarrollado. La apomixis por lo tanto puede hacer el desarrollo del híbrido más eficiente. La apomixis también simplifica la producción de híbridos e incrementa la diversidad genética en especies vegetales con buenos sistemas de esterilidad masculina. Sería altamente deseable introducir genes que controlen el nivel obligado o alto de apomixis en especies cultivadas y sea capaz de hibridar fácilmente genotipos sexuales y apomícticos de cruza-compatibles para producir híbridos F1 de reproducción verdadera. La transferencia de apomixis a cultivos importantes haría posible el desarrollo de híbridos de reproducción verdadera y producción comercial de híbridos sin una necesidad de esterilidad masculina citoplásmica-nuclear y procedimientos de alto costo y mano de obra intensiva. Un híbrido apomíctico F1 obligado se reproduciría verdaderamente a través de la semilla indefinidamente y se podría considerar que proveyera un método de reproducción vegetativo o clonal a través de la semilla. El desarrollo de reproducir apomícticalmente plantas de cultivo cultivadas también proveería una contribución importante hacia la seguridad de los alimentos en naciones en desarrollo (Spillane C, Steimer A, y Grossniklaus U, Sex. Plant Reprod. 14: 179-187, 2001 ). En realidad, la mayoría de los genes conocidos que controlan la apomixis se encuentran en especies silvestres, que están distantemente relacionadas con las especies cultivadas. Aunque las cruzas interespecíficas pueden ser posibles entre las especies cultivadas y silvestres, el apareamiento de cromosomas entre genomas es usualmente bajo o no existente, conduciendo a falla de este enfoque.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa un conjunto de semillas reducidas en plantas mutantes dyad. El intervalo modal es 1 -10 semillas por planta.

Las figuras 2A y 2B representan viabilidad de polen normal en plantas mutantes dyad usando tinción de Alexander. (Figura 2A) tipo silvestre. (Figura 2B) dyad. Las figuras 3A-3F representan meiosis masculina y femenina en tipo silvestre y muíante dyad. (Figura 3A-figura 3C) tipo silvestre. (Figura 3D-figura 3F) dyad. (Figura 3A, figura 3D) Meiocitos masculinos al final de la meiosis 1 (telofase). (Figura 3B, figura 3E) Meiocitos masculinos en la etapa de tétradas. (Figura^3C7figura~3F) Meiocitos femeninos en la anafase 1 . dyad sufre una meiosis ecuacional. Las figuras 4A-4C representan ploidía de cromosomas de progenie representativa de una planta mutante dyad diploide. (Figura 4A) Célula somática de una planta de progenie triploide que muestra 15 cromosomas. (Figura 4B) Meiosis masculina 1 en una planta de progenie triploide que porta 15 cromosomas que muestra 9:6 segregación. (Figura 4C) Célula somática de una planta de progenie diploide que muestra 10 cromosomas. Las figuras 5A-5E representan la complementación del mutante dyad por el homólogo DYAD de Boechera holboelli: (Figura 5A) mutante dyad que muestra silicuas no alargadas (Figura 5B) mutante dyad transformado con el gen de BhDYAD que muestra semillas con silicuas alargadas. (Figura 5C) Comparación de silicuas de una planta mutante dyad (1 ), una planta complementada (2) y una planta de tipo silvestre (3). (Figura 5D) Silicua disecada de una planta complementada, que muestra conjunto de semillas completo. (Figura 5E) Silicua disecada de una planta de tipo silvestre. La figura 6 es un diagrama que muestra el cassette pBI1O1 .3::0yad::(A)GR usado para construir una línea de complementacion condicional de DYAD. Las figuras 7A-7B son un gel de poliacrilamida que muestra polimorfismo de CAPS para genotipificacion del locus endógeno de DYAD como se describe en el ejemplo 6. Figura 7A: Fragmentos digeridos con HinF1 resueltos a partir de productos amplificados-poriniciadores~de KNEF/KNER. Figura 7B: Fragmentos digeridos con HinF1 resueltos a partir de productos amplificados por iniciadores de KKF/KKR. Las figuras 8A-8D ilustran la complementacion condicional del fenotipo dyad en el ejemplo 6. Figura 8A: Inflorescencia que muestra silicua no alargada (fenotipo dyad) antes y después de tratamiento con dexametasona. La flecha indica la posición de la flor abierta más joven al inicio del tratamiento. 5-7 días después del inicio del tratamiento de silicuas mostró alargamiento (fenotipo de tipo silvestre). Figura 8B: Silicuas aisladas que muestran fenotipo estéril (dyad) antes de tratamiento con dexametasona. Figura 8C: muestra fenotipo de tipo silvestre restaurado después de complementacion condicional por tratamiento con dexametasona. Figura 8D: Silicua abierta que muestra conjunto de semillas completo después de tratamiento con dexametasona. Las figuras 9A-9B muestran la morfología del óvulo después de complementacion condicional de fenotipo dyad en el ejemplo 6.

Figura 9A: Ovulo aclarado que muestra fenotipo dyad y ausencia de saco embrionario en la etapa de óvulo maduro antes del tratamiento con dexametasona. Figura 9B: Saco embrionario restaurado después de tratamiento con dexametasona. Las figuras 10?-10? muestran la variación en tamaño de semillas producidas por el muíante dyad y diferencias en tamaño de semillas obtenidas de cruzas recíprocas entre cepas de Arabidopsis diploide y tetraploide. Figura 10A: Semillas de plantas Col-O diploides de tipo silvestre son uniformemente normales en tamaño. Figure 10: Semillas de una planta tetraploide. Figura 10C: Tamaño de semillas de plantas dyad auto-reproducidas varías entre grande (L), normal (N) y encogidas (S). Figura 10D: Exceso materno ~ semillas de una planta femenina tetraploide cruzada con una planta masculina diploide se encogen. Figura 10?: Exceso paterno ~ semillas de una planta masculina tetraploide cruzada con una planta femenina diploide son más grandes en tamaño cuando se comparan con semillas de una cruza de exceso materno. La figura 1 1 muestra una alineación de las secuencias de proteína de la proteína DYAD de Arabidopsis (SEQ ID NO: 5), Boechera (SEQ ID NO: 18), arroz (SEQ ID NO: 51 ), y de álamo blancor (Populus trichocarpa) (SEQ ID NO: 26), usando Clustal W como en http://www.ebi.ac.uk/clustalw con parámetros por omisión. Las figuras 12A y 12B muestran alineación de las secuencias de polipéptido DYAD del arroz (SEQ ID NO: 51 ) con secuencias de polipéptido DYAD de maíz putativo (SEQ ID NOs: 55 y 54) usando Clustal W (1.82). La figura 12A: Alineación de los aminoácidos DYAD del arroz 1 -147. Figura 12B: Alineación de los aminoácidos DYAD del arroz 317-803. La figura 13 muestra el mapeo de la secuencia de polipéptido DYAD del arroz sobre dos cóntigos de Zea mays identificadas como que comprende secuencias codificadoras de DYAD.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Hay dos estrategias generales que se pueden considerar a fin de introducir apomixis en plantas de cultivo cultivadas. La primera es por introgresión de plantas silvestres con parentesco en especies cultivadas. La segunda es por identificación de genes de especies sexuales que pueden conferir aspectos de apomixis, seguido por piramidacion de estos genes para producir el repertorio completo de apomixis. Estos genes entonces podrían ser introducidos en plantas de cultivo cultivadas usando métodos transgénicos. Por lo tanto, por ejemplo, la expresión de uno o más genes se podría usar para manipular por ingeniería genética apomeiosis, y estos genes se podrían combinar con otro conjunto de genes u otros tratamientos para inducir desarrollo de embrión partenogenético. Los métodos para inducir partenogénesis en plantas se conocen en la técnica (véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,840,567). Un método preferido para inducinr desarrollo partenogenético para usarse con la presente invención es polinizar una planta usando polen que ha sido irradiado, ¡nactivándolo así para fertilización. (Pandey K.K. y Phung M., Theoret. Appl. Genet., Vol. 62:295-300, 1982; Lofti M. et al, Plant Cell Reprod., Vol. 21 :1 121 -1 128, 2003). Este método es preferido porque se ha usado en un número de especies vegetales y parece ser generalmente aplicable, muy fácilmente a plantas que tienen flores incompletas (monoicas y dioicas). Sin embargo, se puede aplicar a plantas hermafroditas que tienen flores completas que se han hecho masculinas-estériles o de las cuales el polen fértil ha sido mecánicamente removido o segregado. La dosis específica de radiación para esterilizar el polen variará dependiendo de los particulares de la especie. En general, una dosis de aproximadamente 10 a 2000 Gray es suficiente. Preferiblemente, la dosis es de aproximadamente 100 a 500 Gray, muy preferiblemente de 200 a 250 Gray. La inducción exitosa de partenogénesis puede ser detectada al tamizar semillas para la presencia de embriones, por ejemplo por disección o por observación de las semillas sobre una caja de luz después del cultivo en un medio líquido como se describe en Lofti M. et al., Plant Cell Reprod., Vol. 21 : 1 121 -1 128, 2003. La introducción del rasgo apomíctico en plantas de cultivo normalmente sexuales se ha intentado. Asker S. (Hereditas, Vol. 91 : 231 -241 , 1979) reporta que los intentos no han tenido éxito con trigo, remolachas azucareras y maíz. La publicación del PCT WO 89/00810 (Maxon et al, 1989) describe la inducción de una forma apomíctica de reproducción en plantas cultivadas usando extractos de plantas de alfalfa estériles no domesticadas. Cuando la inducción de esterilidad masculina se evaluó en sorgo, girasol, mijo aperlado y tomate, se reportó que hubo un conjunto de semillas reducido en sorgo, mijo aperlado y girasol y un conjunto de frutos reducidos en tomate. Aunque la apomixis se usa de manera efectiva en cítricos para producir rizoma uniforme y libre de enfermedades y virus (PáTIévlierJ. E. et al., en Citrus. Proc. Am. Soc. Hort. Sci., Vol. 74: 252-260, 1959) y en hierba de búfalo (Bashaw, Crop Science, Vol. 20: 112, 1980) y Poa (Pepin et al., Crop Science, Vol. 11 : 445-448, 1971 ) para producir cultivares mejorados, no ha sido exitosamente transferida a una planta de cultivo cultivada. El segundo enfoque hacia la manipulación por ingeniería genética de apomixis involucra la identificación y manipulación de genes relacionados con apomixis de especies sexuales. Un punto de vista de desarrollo de la apomixis ha sugerido que la apomixis se relaciona con la reproducción sexual e implica la acción de genes que también juegan un papel en la vía sexual (Tucker M.R. et al., Plant Cell, Vol. 15(7): 1524-1537, 2003). En la reproducción sexual, usualmente una célula madre de la megaspora que surge de la capa hipodérmica hacia el ápice del óvulo en desarrollo se agranda y sufre meiosis y dos divisiones celulares para formar una tétrada lineal de megasporas cada una con un número de cromosoma haploide. Muy comúnmente entre diferentes especies vegetales, las tres esporas más apicales se degeneran mientras la espora chalazal funcional sufre tres rondas de división nuclear acompañadas por expansión celular para formar un saco embrionario con una célula huevo, dos núcleos polares, dos sinérgidas, y tres células antipodales. La apomixis es un proceso que requiere múltiples pasos y el control de la vía completa de apomixis como se ha mostrado en ciertas especies requiere la acción de múltiples genes (van Dijk et al., Heredity, Vol. 83: 715-721 ,1999; Matzk F., et al., Plant Cell, 17(1 ):13-24, 2005). Se ha considerado que los pasos de componente individuales controlados por uno o un subconjunto de genes en la vía que opera en aislamiento tendría un efecto negativo sobre la fertilidad (Spillane, C, Steimer A. y Grossniklaus U., Sex. Plant Reprod. Vol. 14: 179-87, 2001 ), y que es sólo la acción concertada del conjunto completo de genes que comprende la vía entera que es capaz de promover eficientemente la apomixis. El análisis genético y molecular de mutantes de Arabidopsis ha conducido a la identificación de un número de genes que juega un papel en las etapas de esporogénesis y gametogénesis (Yang W. C. y Sundaresan V., Curr. Opin. Plant Biol. Vol. 3(1 ): 53-57, 2000). El muíante dyad de Arabidopsis se identificó como causante de esterilidad femenina (Siddiqi I. et al., Development, Vol. 127(1 ): 197- 207, 2000) y su análisis mostró que las plantas mutantes dyad son defectuosas en meiosis femenina. La mayoría de los meiocitos femeninos en el mutante dyad sufren meiosis de una sola división para dar dos células en lugar de cuatro, seguido por una detención en las etapas posteriores del desarrollo incluyendo gametogénesis. La meiosis masculina, desarrollo de polen, y fertilidad masculina en el mutante dyad se encontró que eran normales (Siddiqi I. et al., Development, Vol. 127( 1 ):197-207, 2000; Reddy T. V., et al., Development, Vol. 130 (24):5975-5987, 2003). El análisis de cromosomas meióticos durante la meiosis femenina indicó que los cromosomas homólogos no sufren sinapsis y que la división de meiosis reduccional 1 es reemplazada por una ecuacional (Agashe B., Prasad C. K. y Siddiqi I, Development, Vol. 129(16), 3935-3943, 2002). Un estudio independíentela conducido a la identificación del gen SWI (Motamayor J. C, et al., Sex. Plant Reprod. Vol. 12:209-218, 2000; Mercier R., et al., Genes and Dev. Vol. 15: 1859-1871 , 2001 ), que es idéntico a DYAD. El gen identificado por estos estudios por lo tanto se refiere como el gen DYAD. El gen DYAD de tipo silvestre de Arabidopsis codifica una proteína de 639 aminoácidos (SEQ ID NO:5). Se han descrito tres alelos del gen DYAD en Arabidopsis. Estos son: i) dyad, que tiene una truncación en el aminoácido 508; la proteína resultante por lo tanto carece de los 130 aminoácidos C-terminales presentes en la proteína de tipo silvestre; ii) sw¡1. 1 que da por resultado la producción de cantidades reducidas de la proteína de tipo silvestre causando que algunos meiocitos femeninos pasen por una división de meiosis ecuacional 1 mientras que otros pasen por una división reduccional; y iii) swi1.2 que crea un codón de detención en la posición 394 y causes un fenotipo femenino similar a dyad pero además también causa defectos en meiosis masculina dando por resultado esterilidad masculina. La posición correspondiente al alelo dyad en Boechera sería una mutación que causa un desplazamiento de marco en la posición 508 de la secuencia de aminoácidos y da por resultado un codón de detención después de diez codones adicionales (es decir, la posición 518). Las posiciones correspondientes en arroz están en 563 y 572, respectivamente. Sin estar limitado por alguna teoría de la invención, los inventores sugieren que una reducción en la cantidad de proteína DYAD que tiene la porción del carboxilo-terminal del polipéptido a la posición 394 (en Arabidopsis, y posiciones correspondientes en otras especies) produce un fenotipo en el cual los meiocitos femeninos sufren una división de meiosis ecuacional 1 , dando por resultado retención del genotipo femenino (y por lo tanto heterocigosidad) en gametos femeninos. La retención de una cantidad normal (o aproximadamente) de la proteína DYAD que tiene el dominio de la posición 394 a la posición 508 (en Arabidopsis y posiciones correspondientes en otras especies) provee el desarrollo de polen normal, mientras que la eliminación de este dominio en la planta produce un fenotipo estéril masculino. Antes de hacer la presente invención, plantas homocigóticas para alelos dyad o swi1.2 no se había reportado que mostrara conjunto de semillas. Las plantas que portan el alelo swi1. 1 se ha reportado que muestran conjunto de semillas reducido cuando son homocigóticas pero las semillas que se producen han sido analizadas con respecto a su constitución cromosomica y se ha encontrado que son diploides, mostrando así que las semillas surgen de una megasporogénesis y megagametogénesis normal (Motamayor J. C, et al., Sex. Plant Reprod. Vol. 12:209-218, 2000). Como se describió anteriormente, las esporas producidas como resultado de la meiosis de una sola división ecuacional en dyad, sw¡1. 1, y sw¡1.2 permanecían detenidas hasta que se hizo la presente invención, no se sabía si alguna de éstas tenía el potencial de desarrollarse en gametos femeninos. Tampoco se sabía hasta que se hizo la presente invención si los cromosomas experimentaban recombinación durante la meiosis femenina de una sola división ecuacional y como resultado los productos de división perdían heterocigocidad paterna. La plausibilidad de recombinación que acompaña una división ecuacional es soportada por estudios en levaduras que demuestran que las células diploides entran a la meiosis, experimentan recombinación meiótica, después se retraen de la meiosis bajo transferencia en el medio de crecimiento y se dividen mitóticamente. Dicha división mitótica puede conducir a pérdida de heterocigosidad para un marcador genético si la recombinación ha tenido lugar entre el gen y el centrómero (Esposito R. E. y Esposito M. S., Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 71 (8): 3172-3176 1974). La presente invención se refiere al hallazgo de que los productos de la división de meiosis ecuacional 1 vista en diferentes plantas mutantes homocigoticas dyad son capaces de dar origen a un saco embrionario no reducido funcional, que tiene los rasgos característicos de apomeiosis, un componente importante de la apomixis. La presente invención se refiere al uso del gen DYAD, especialmente alelos mutantes de los mismos, y sus productos de genes, de Arabidopsis, Boechera, Rice, Populus y otras plantas para manipular la gametogénesis y el desarrollo de semillas para producir semillas cuyo genotipo embrionario contiene un complemento diploide completo del genoma materno. En una modalidad, se producen semillas triploides en Arabidopsis y otros tipos de plantas. La presente invención también provee un método para ta producción de una planta heterótica usando alelos mutantes del gen DYAD y el producto de gen. En algunas modalidades, las plantas y semillas contienen un complemento diploide completo del genoma materno, y no hay contribución del genomapaterno, y por lo tanto representa apomíctica verdadera. En algunos casos de estas modalidades, la planta que contribuye con el genoma materno es un híbrido que tiene una distribución de alelos que tienen un fenotipo deseable, y el método de la invención permite la fijación y fácil propagación de esa combinación de alelos. La presente invención se refiere al uso del gen DYAD y su producto de gen que conduce a la formación de semillas que contienen un complemento diploide completo del genoma materno. Esta invención es útil para hacer plantas triploides que se pueden usar para producir frutos sin semilla, para construir líneas trisomicas para estudios de mapeo, y para el mantenimiento de heterocigocidad de la planta progenitora y apomixis. Los alelos de DYAD usados en la presente invención causan la formación de un saco embrionario no reducido (diploide). La invención también se refiere al uso del gen DYAD para causar la formación de un saco embrionario no reducido sin afectar sustancialmente el desarrollo del polen. La invención además se refiere al uso del gen DYAD para producir poliploides de orden superior al autocruzar triploides, que serían útiles para el propósito de generar plantas con biomasa incrementada. Cabe entender que varias modalidades de la invención presentarán diferentes aspectos de la invención, y pueden proveer diferentes ventajas de la invención. No todas las modalidades gozarán de todas las ventajas de la invención.

Definiciones: La frase "secuencia de ácido nucleico" se refiere a la estructura de un polímero de base de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leída del extremo 5' al extremo 3'. En casos un ácido nucleico de doble cadena, un "secuencia de ácido nucleico" incluye su complemento en la otra cadena. Un "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero de ADN o ARN de una sola cadena o de doble cadena (o en algunos casos análogos de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos tales como tiofosfato o análogos de PNA, o nucleótidos que tienen derivados de la base de nucleótido) e incluye ADN cromosómico, plásmidos auto-replicables, polímeros infecciosos de ADN o ARN (o análogos) y ADN o ARN (o análogos) que realiza un papel principalmente estructural. El término "secuencia de polinucleótido" es a menudo intercambiable con "polinucleótido", pero algunas veces se puede referir a la información de la secuencia de la molécula, más que a la molécula per se.

Un "promotor" se define como un arreglo de secuencias de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico operablemente enlazado. Como se usa aquí, un "promotor vegetal" es un promotor que funciona en plantas. Los promotores incluyen secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción, tal como, en el caso de un promotor de polimerasa basal de tipo II, un elemento TATA. Un promotor también opcionalmente incluye elementos incrementador o represor distales, que pueden estar localizados tanto como varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es active bajo regulación ambiental y de desarrollo. El término "operablemente enlazado" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor o arreglo de sitios de unión de factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. Un "cassette de expresión" comprende tres elementos principales: i) un promotor; ii) un segundo polinucleótido, que se puede llamar un "polinucleótido codificador" o "secuencia codificadora" que es operablemente ligada al promotor y cuya transcripción es dirigida por dicho promotor cuando el cassette de expresión es introducido en una células; y iii) un polinucleótido terminador que dirige el cese de transcripción y está localizado inmediatamente hacia el extremo 3' del segundo polinucleótido. El término "planta" incluye plantas enteras, órganos de plantas (v.gr., hojas, tallos, flores, raíces, etc.), semillas y células vegetales y progenie de las mismas. La clase de plantas que se pueden usar en el método de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores sometidas a técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas. Incluyen plantas de una variedad de niveles de ploidía, incluyendo poliploide, diploide, y haploide. En algunas modalidades de la invención, se prefiere que la planta se una planta monoica. Un polinucleótido es "heterólogo a" un organismo o un segundo polinucleótido si tiene una secuencia diferente y se origina de una especie anterior o, si es de la misma especie, es modificada de su forma original. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a una secuencia codificadora heteróloga se refiere a una secuencia codificadora de una especie diferente de aquella de la cual se derivó el promotor o, si es de la misma especie, una secuencia codificadora que es diferente de cualesquiera variantes alélicas que ocurren naturalmente. Un polinucleótido "exógeno a" una planta individual es un polinucleótido que se introduce en la planta por cualesquiera medios distintos a una cruza sexual. Ejemplos de medios por los cuales esto se puede lograr se describen más adelante, e incluyen transformación mediada por Agrobacterium, métodos biolísticos, electroporación, y similares. Dicha planta que contiene el ácido nucleico exógeno se refiere aquí como una planta transgénica de regeneración Rl. Las plantas transgénicas que se originan de cruza sexual o por venta son descendientes de dicha planta. Un "ácido nucleico DYAD" o "secuencia de polinucleótidos DYAD" usada en la invención es una subsecuencia o secuencia de longitud completa de polinucleótido de un ácido nucleico que codifica un polipéptido implicado en el control de meiosis y que, cuando es mutado, permite aspectos de apomixis con respecto a la formación de gametófito femenino no reducido. Un "gen DYAD" comprende un ácido nucleico DYAD junto con un promotor y otras secuencias de control de transcripción y traducción que proveen la expresión de un producto de gen DYAD en una célula hospedero, preferiblemente en una planta. Los genes DYAD son una clase de genes vegetales que producen transcripciones que comprenden porciones codificadoras de proteína que codifican polipéptidos que tienen identidad de secuencia sustancial al polipéptido codificado por el gen DYAD de Arabidopsis (SEQ ID NO:1 ) y se han identificado en arroz (Genbank ID: 62733414) y otras plantas. Un gen DYAD también ha sido identificado en Populus trichocarpa y Zea mays (Ejemplo 9). El gen DYAD está presente en una sola copia en Arabidopsis de tipo silvestre. Más aún, la abundancia de la transcripión es muy baja ya que se expresa sólo en los esporocitos, que constituyen una populación muy pequeña de células en los tejidos reproductivos. El gen DYAD de Arabidopsis ha mostrado previamente que juega un papel crítico en la organización del cromosoma meiótico (Agashe B., Prasad C. K., y Siddiqi L, Development Vol. 129(16): 3935-39432002). Por lo tanto, su función muy probable que sea conservada en otras especies vegetales como lo indica la presencia de un gen estrechamente relacionado en arroz. Los datos en la presente solicitud establecen que Boechera también tiene un gen DYAD estrechamente relacionado en secuencia al gen DYAD de Arabidopsis. En el caso tanto de la expresión de transgenes como la inhibición de genes endógenos (v.gr., por interferencia, antisentido o supresión de sentido de ARN) un experto en la técnica reconocerá que la secuencia de polinucleotido usada no necesita ser idéntica, pero puede ser sólo "sustancialmente idéntica" a una secuencia del gen del cual se derivó o del polinucleotido que ha de ser inhibido. Como se explica más adelante, estas variantes sustancialmente idénticas son específicamente cubiertas por el término ácido nucleico DYAD. En el caso en donde una secuencia de polinucleotido es transcrita y traducida para producir un polipéptido funcional, un experto en la técnica reconocerá que debido a la degeneración del codon un número de secuencias de polinucleótidos codificarán el mismo polipéptido. Estas variantes son específicamente cubiertas por los términos "ácido nucleico DYAD". Además, el término específicamente incluye aquellas secuencias sustancialmente idénticas (determinadas como se describe más adelante) con una secuencia de polinucleótidos DYAD descrita aquí y que codifica polipéptidos que son ya sea mutantes de polipéptidos DYAD de tipo silvestre o retienen la función del polipéptido DYAD (v.gr., que resulta de sustituciones conservativas de aminoácidos en el polipéptido DYAD). Además, variantes pueden ser aquellas que codifican mutantes negativos dominantes como se describe más adelante así como mutantes que no son de sentido o mutantes de desplazamiento de marco que dan por resultado la terminación de traducción prematura. Se dice que dos ácidos nucleicos o polipéptidos son "idénticos" si la secuencia de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, en las dos moléculas es la misma cuando se alinea para correspondencia máxima como se describe más adelante. Los términos "idéntico" o "por ciento de identidad," en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mimos, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por alineación manual e inspección visual. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácido conservativas, en donde residuos de aminoácidos sustituyen a otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (v.gr., carga o carácter hidrofóbico) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. En donde las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la substitución. Medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente esto implica dar puntuación a sustitución conservativa como una concordancia parcial en vez de una completa, incrementando así el porcentaje identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, en donde a un aminoácido idéntico se da una puntuación de 1 y a una sustitución no conservativa se da una puntuación de cero, a una sustitución conservativa se da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de sustituciones conservativas se calcula de conformidad con, v.gr., el algoritmo de Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11 -17 (1988) v.gr., como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., E.U.A.). La frase "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a secuencias o subsecuencias que tienen por lo menos 60%, preferiblemente 80%, muy preferiblemente 90-95% de identidad de nucleótido o residuo de aminoácidos cuando se alinea para correspondencia máxima, sobre una ventana de comparación como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por alineación manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemente de una secuencia de prueba, que tiene complementariedad de secuencia o subsecuencia sustancial cuando la secuencia de prueba tiene identidad sustancial a una secuencia de referencia.

Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, se introducen secuencias de prueba y referencia a una computadora, se diseñan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan los parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Los valores por omisión para los parámetros del programa usualmente se usan, pero se pueden diseñar valores alternativos para los parámetros. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula los por cientos de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa. Una "ventana de comparación", como se usa aquí, incluye referencia a un segmento de posiciones contiguas, típicamente de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, muy usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 posiciones contiguas, en las cuales una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. Métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación pueden ser conducidas, v.gr., por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981 ), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por alineación manual e inspección visual. Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones en pares progresivas para mostrar relación y por ciento de identidad de secuencia. También gráfica un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agregaciones usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng D. F., y Doolittle, R.F., J. Mol. Evol. Vol. 35:351 -360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151 -153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación en pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agregación de dos secuencias alineadas. Esta agregación después se alinea a la siguiente secuencia o más relacionada de secuencias alineadas. Dos agregaciones de secuencias son alineadas por una simple extensión de la alineación en pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones en pares progresivas. El programa se lleva a cabo diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia y diseñando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia se puede comparar con otras secuencias de prueba para determinar la relación de por ciento de identidad de secuencia usando los siguientes parámetros: peso de espacio por omisión (3.00), peso de longitud de espacio por omisión (0.10), y espacios extremos ponderados. Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul S.F., et al., J. Mol. Biol. Vol. 215: 403-410 (1990). Software para realizar análisis de BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información de Biotecnología) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencia de puntuación alta (HSPs) al identificar palabras de longitud corta W en la secuencia de cuestionamiento, que ya sea concuerda o satisface alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de daros. T se refiere como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul S. F., et al., J. Mol. Biol. Vol. 215: 403- 410 (1990)). Estos indicios de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs de longitud más larga que los contienen. Estos indicios de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde la puntuación de alineación acumulativa se pueda incrementar. La extensión de los indicios de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por la cantidad X de su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa llega a cero o más abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o el extremo de cada secuencia se alcanza. Los parámetros del algoritmo BLAST, W3 T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como omisión una longitud de palabra (W) de 1 1 , la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Menikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915 ( 1989)) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, v.gr., Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medición de similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la probabilidad por la cual una concordancia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, muy preferiblemente menor que aproximadamente 0.01 , y muy preferiblemente menor que aproximadamente 0.001 . "Variantes modificadas conservativas" se aplica tanto a secuencia de aminoácidos como a secuencia de ácido nucleicos. Con respecto a la secuencia de ácido nucleicos particular, variantes conservativamente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde los ácido nucleicos no codifican una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos ellos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina) puede ser modificado para dar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido, está implícita en cada secuencia descrita. Una "secuencia esencialmente idéntica" es una en la cual la variación en secuencia no afecta la función destinada de la molécula. En cuanto a secuencias de aminoácidos, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, añade o suprime un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" cuando la alteración da por resultado la substitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de substitución conservativa que proveen aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos contienen cada uno de ellos aminoácidos que son sustituciones conservativas uno para otro: 1 ) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Acido aspértico (D), Acido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). (véase, v.gr., Creighton, Proteínas (1984)). Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo en cruza con los anticuerpos producidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. Por lo tanto, un polipéptido típicamente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren sólo por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos hibridan uno a otro bajo condiciones astringentes, como se describe más adelante. La frase "selectivamente (o específicamente) híbrida a" se refiere a la unión, duplexión o hibridación de una molécula sólo a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones de hibridación astringentes cuando esa secuencia está presente en una mezcla de complejo (v.gr., ADN o ARN celular total o de genoteca). La frase " condiciones de hibridación astringentes" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su subsecuencia objetivo, típicamente en una mezcla de complejo de ácido nucleico, pero no otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid assays", Elsevier (1993). Generalmente, condiciones altamente astringentes se seleccionan para que sean aproximadamente 5-10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica definida, pH. Las condiciones de astringencia baja son generalmente seleccionadas para ser aproximadamente 15-30°C por debajo de la Tm. La Trn es la temperatura (bajo una concentración iónica definida, pH, y concentración nucleica) a la cual 50% de las sondas complementarias al objetivo hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio (puesto que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones astringentes serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que una concentración de aproximadamente 1.0 M de ion de sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de ion de sodio (u otras sales) a pH 7.0 a 873 y la temperatura es por lo menos de aproximadamente 30°C para sondas cortas (v.gr., 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (v.gr., mayor que 50 nucleótidos). Las condiciones astringentes también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es por lo menos dos veces la hibridación de fondo, preferiblemente 10 veces la hibridación de fondo. Los ácidos nucleicos que no hibridan unos a otros bajo condiciones astringentes son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos típicamente hibridan bajo condiciones de hibridación moderadamente astringentes. En la presente invención, el ADN genómino o ADNc que comprende ácidos nucleicos DYAD que se ha de usar en la invención se puede identificar en Southern blots estándares bajo condiciones astringentes usando la secuencias de ácido nucleico descritas aquí. Para los propósitos de esta descripción, las condiciones astringentes adecuadas para dichas hibridaciones son aquellas que incluyen una hibridación en un regulador de pH de 40% de formamida, 1 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, y por lo menos un lavado en 0.1 X a "I X SSC, preferiblemente 0.5X SSC, muy preferiblemente 0.2X SSC a una temperatura de por lo menos aproximadamente 50°C, usualmente de aproximadamente 55°C, hasta aproximadamente 60°C, durante 20 minutos o condiciones equivalentes. Una hibridación positiva es por lo menos dos veces la de fondo. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que la hibridación alternativa y condiciones de lavado se pueden utilizar para proveer condiciones de astringencia similar. Una indicación adicional de que dos polinucleótidos son sustancialmente idénticos es si la secuencia de referencia, amplificada por un par de iniciadores de oligonucleótido, se puede usar como una sonda bajo condiciones de hibridación astringente para aislar la secuencia de prueba de un ADNc o genoteca genómica, o para identificar la secuencia de prueba, v.gr., en análisis de Northern o Southern blot. Un "híbrido de planta" se identifica como una planta obtenida por la cruza de dos cultivares de la misma especie vegetal. Un "híbrido interespecífico" se define como una planta obtenida por la cruza de dos plantas de diferentes especies. Un "progenitor femenino" en un evento reproductivo se define como la planta que tiene la semilla. La presente invención provee un gen DYAD y su producto y métodos que implican la aplicación de enfoques genéticos moleculares para el control de desarrollo de semilla y apomixis. La invención además se refiere a alelos mutantes del gen DYAD que expresan una forma truncada del polipéptido DYAD que carece de la porción C-terminal de la proteína nativa, y causa el desarrollo de un gametofito femenino no reducido mientras al mismo tiempo tiene desarrollo de polen sustancialmente no alterado como lo determinan las pruebas de viabilidad de polen y examen microscópico de segregación cromosómica en meiosis masculina. También se refiere a secuencias de nucleótidos para un alelo de muíante específico femenino de gen DYAD, que codifica un polipéptido DYAD que carece de una porción C-terminal del polipéptido DYAD nativo, y de tal manera que la expresión del polipéptido mutante en plantas específicamente conduce al desarrollo de gametofito femenino no reducido pero no afecta sustancialmente el desarrollo del polen. Dicho alelo mutante expresaría un polipéptido DYAD que, por ejemplo, en el caso de un alelo mutante de Arabidopsis, carece de toda o parte de la porción de las secuencias de polipéptido nativas entre el aminoácido 509 y el aminoácido 639 en SEQ ID NO:5 pero contiene toda la región que codifica secuencias de polipéptido hasta el aminoácido 394. Además, también se provee secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones astringentes a la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 y que codifican derivados de deleción C-terminal de polipéptidos DYAD nativos en donde la deleción corresponde a una región entre el aminoácido 509 y 639 en SEQ ID NO:5 como se determina por comparación con SEQ ID NO:5 usando una ventana de comparación. Porciones correspondientes de proteínas DYAD de Boechera, arroz y Populus pueden ser identificadas por referencia a la figura 1 1 . Las composiciones de la invención también comprenden derivados de deleción C-terminal de secuencias de polipéptido DYAD nativas, y proteínas de fusión y los ácidos nucleicos que las codifican, formadas a partir de los polipéptidos DYAD y secuencias de proteína, tales como proteínas de receptor de hormona glucocorticoide, que transporta condicionalmente la proteína de fusión hacia el núcleo de la célula vegetal. Los métodos de la invención comprenden la expresión de secuencias de polinucleótido DYAD en plantas para producir gametos femeninos no reducidos que retienen el genotipo del progenitor. La producción de dichos gametos femeninos no reducidos es útil para manipular por ingeniería genética la apomixis y para fijar heterosis, así como para la producción de plantas triploides. En una modalidad de la invención, una secuencia de polinucleótido DYAD se puede introducir en el genoma de una planta por cualquiera o varios métodos bien conocidos para transformación en donde se expresa en la planta como ARN de antisentido o de doble cadena conduciendo así a la inhibición del gen DYAD endógeno y causando la producción de gametos femeninos no reducidos. En otra modalidad de la invención, una deleción C-terminal de secuencias de polinucleótido DYAD se introduce en el genoma de una planta como parte de un cassette de expresión y conduce a la formación de gametofitos femeninos no reducidos, mientras al mismo tiempo deja el desarrollo de polen sustancialmente sin ser afectado. La expresión de secuencias de polinucleotido DYAD en plantas que conducen a la formación de gametofito femenino no reducido se puede usar para generar semillas apomícticas por desarrollo partenogenético de la célula huevo en un embrión. La expresión de dichas secuencias de polinucleotido DYAD en híbridos de plantas conduce a la formación de gametos femeninos no reducidos que retienen el genotipo del progenitor conduciendo así a la fijación de heterosis en la siguiente generación. La fijación de heterosis es muy útil ya que permitiría la multiplicación de semillas híbridas al autofijarse sin tener que recurrir a cruzas entre dos cultivares progenitores de diferente genotipo. Otra modalidad más de la invención es la expresión de secuencias de polinucleotido DYAD en híbridos interespecíficos de especies vegetales que conduce a la formación de un gameto femenino no reducido, que se puede usar para generar semilla apomíctica. La generación de dichas semillas apomícticas es útil para la introgresión de genes agronómicamente útiles de una especie vegetal a otra especie. Otra modalidad más de la invención implica la expresión condicional o controlada de secuencias de polinucleotido DYAD o secuencias de polipéptido DYAD y/o las actividades de las mismas. Dicha expresión condicional se puede usar para promover la generación de gametos femeninos no reducidos y por lo tanto semillas apomícticas sólo cuando se desea. Los métodos para efectuar la expresión o actividad condicional de secuencias de polinucleotido y polipéptido en plantas son bien conocidas en la técnica e incluyen pero no se limitan a expresión de gen inducible por etanol (Devaux et al., Plant J., Vol. 36(6): 918-930, 2003), control o actividad inducible por hormona esteroidea (Schena M., Lloyd A. M. y Davis R. W., Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 88(23): 10421 -10425, 1 991 ), y control de expresión mediada por tetraciclina (Bohner S. et al., Plant J. Vol. 9(1 ): 87-95, 1999). El ejemplo 6 siguiente describe una modalidad de la invención en donde la población homogénea de plantas que muestran el fenotipo mutante dyad se puede desarrollar. Lo mismo se puede lograr utilizando ARNi DYAD o condicional o antisentido en el cual el ARNi de DYAD o construcción de antisentido se expresa bajo el control de un promotor condicional. Otra manifestación de la invención es una en la cual una copia complementaria del DYAD se expresa en una planta bajo control de un promotor condicional, en un fondo genético que es homocigótico para un alelo mutante de dyad. Otra manifestación más de la invención utilizaría la cruza de una primera planta que porta ARNi DYAD o construcción de antisentiso expresada bajo control de un promotor que se expresa bajo control de un transactivador y en donde la primera planta carece de transactivador, a una segunda planta que expresa el transactivador. Las secuencias aisladas preparadas como se describe aquí se pueden usar en un número de técnicas, por ejemplo, para suprimir o alterar expresión de gen DYAD endógeno. La modulación de expresión de gen DYAD o actividad DYAD en plantas es particularmente útil, por ejemplo como parte de un sistema para generar semilla apomíctica.

Aislamiento de ácidos nucleicos DYAD Generalmente, la nomenclatura y los procedimientos de laboratorio en tecnología de ADN recombinante descritos más adelante son aquellos conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Técnicas estándares se usan para clonación, aislamiento, amplificación y purificación de ADN y ARN. Generalmente, reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares se realizan de conformidad con las especificaciones del fabricante. Estas técnicas y algunas otras técnicas son generalmente realizadas de conformidad con Sambrook et al., Molecular Cloning- -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989). El aislamiento de ácidos nucleicos DYAD se puede lograr por un número de técnicas. Por ejemplo, sondas de oligonucleótido basadas en las secuencias descritas aquí se pueden usar para identificar el gen deseado en un ADNc o genoteca de ADN genómico. Para construir genotecas genómicas, segmentos grandes de ADN genómico son generadas por fragmentación aleatoria, v.g., usando endonucleasas de restricción, y son ligadas con un ADN de vector para formar concatémeros que pueden ser empacados en el vector apropiado. Para preparar una genoteca de ADNc, ARNm es aislado del órgano deseado, tal como óvulos, y una genoteca de ADNc contiene la transfección de gen DYAD, se prepara a partir del ARNm. Alternativamente, ADNc se puede preparar a partir de ARNm extraído de otros tejidos en los cuales los genes DYAD u homólogos son expresados. El ADNc o genoteca genómica se puede determinar selectivamente usando una sonda basada en la secuencia de un gen DYAD clonado descrito aquí. Las sondas se pueden usar para hibridar con ADN genómico o secuencias de ADNc para aislar genes homólogos en la misma o diferentes especies de plantas. Alternativamente, anticuerpos producidos contra un polipéptido DYAD se pueden usar para determinar selectivamente una genoteca de expresión de ARNm. Alternativamente, los ácidos nucleicos de interés se pueden amplificar a partir de muestras de ácido nucleico usando técnicas de amplificación. Por ejemplo, la tecnología de reacción de cadena de polimerasa (PCR) se puede usar para amplificar las secuencias de genes DYAD directamente de ADN genómico, ADNc, de genotecas genómicas o genotecas de ADNc. PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas que han de ser expresadas, para hacer ácidos nucleicos para usarse como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciación de ácido nucleico o para otros propósitos. Para una vista general de PCR, véase PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. y White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990). Iniciadores y sondas apropiados para identificar secuencias de DYAD de tejidos vegetales se generan a partir de comparaciones de las secuencias provistas aquí con otros genes relacionados con DYAD o las proteínas que codifican. Por ejemplo, DYAD de Boechera holboelli se puede comparar con el gen estrechamente relacionado del arroz (Genbank ID No. 50917243). Usando estas técnicas, un experto en la técnica puede identificar regiones conservadas en los genes o polipéptidos descritos aquí para preparar las secuencias de iniciador y sonda apropiadas. Los iniciadores que hibridan específicamente a regiones conservadas en genes relacionados con DYAD se pueden usar para amplificar secuencias de especies vegetales ampliamente divergentes. Técnicas de hibridación de ácido nucleico estándares que usan las condiciones descritas anteriormente se pueden usar para identificar ADNc o clones genómicos de longitud completa.

Control de actividad o expresión de gen DYAD Puesto que los genes DYAD están implicados en el control de meiosis y ploidía del gametofito femenino, la inhibición de la actividad o expresión de gen de DYAD endógeno es útil en un número de contextos. Por ejemplo, la inhibición de expresión o modificación de la actividad de DYAD mediante el uso de un alelo que porta una deleción C-terminal como se describió antes se puede usar para la producción de frutos sin semilla o con semilla pequeña/degradada (referidos como "frutos sin semilla"). En la mayoría de las especies vegetales, la creación de triploides causa defectos en la formación de células germinales debido a la segregación desequilibrada de cromosomas en meiosis y conduce a la ausencia de semillas o la formación de semillas pequeñas/degradadas. La inhibición de expresión o actividad de DYAD endógeno puede permitir el control de ploidia. Por lo tanto en algunas modalidades de plantas de la invención en las cuales la actividad de DYAD es inhibida o modificada, las semillas están ausentes o son degradadas y se producen frutos sin semilla. Otro uso de los ácidos nucleicos de la invención es en el desarrollo de líneas de plantas apomícticas (es decir, en las cuales ocurren procesos de reproducción asexual en el óvulo, véase, Kolrunow A., Plant Cell, Vol.5: 1425-1437 (1993) para una discusión de apomixis). La apomixis provee un medio novedoso para seleccionar y fijar genotipos heterocigóticos complejos que no pueden ser fácilmente mantenidos por reproducción tradicional. Por lo tanto, por ejemplo, nuevas líneas híbridas con rasgos deseados (es decir, vigor híbrido) se pueden obtener y mantener fácilmente. Un experto en la técnica reconocerá que un número de métodos se puede usar para modular la actividad de DYAD o expresión de gen. La actividad de DYAD puede ser modulada en la célula vegetal a niveles de gen, transcripción, post-transcripción, traducción o post-traducción. Las técnicas para modular la actividad de DYAD en cada uno de estos niveles son generalmente bien conocidos por los expertos en la técnica y algunas se describen aquí en forma breve. Los métodos para introducir mutaciones genéticas en genes de plantas son bien conocidos. Por ejemplo, semillas u otro material vegetal se puede tratar con una sustancia química mutagénica, de conformidad con técnicas estándares. Dichas sustancias químicas incluyen pero no se limitan a las siguientes: sulfato de dietilo, etilenimina, metansulfonato de etilo y N-nitroso-N-etilurea. Alternativamente, la radiación ionizante de fuentes tales como, por ejemplo, rayos X, rayos gama o neutrones rápidos se puede usar. Plantas que portan mutaciones en secuencias de gen DYAD pueden ser identificadas por determinación selectiva molecular de poblaciones en acervo de plantas mutagenizadás usando iniciadores de PCR para amplificar secuencias de nucleotido DYAD seguido por análisis de producto de PCR para identificar plantas que portan mutaciones genéticas en secuencias de polinucleótido DYAD. Los métodos para determinar selectivamente e identificar plantas que portan mutaciones en secuencias de gen específicas han sido descritas (Henikoff S., Bradley T. J. y Comai L, Plant Physiol. Vol. 135(2): 630-636, 2004). Alternativamente, la recombinación homologa se puede usar para inducir perturbaciones de gen objetivo al deletar específicamente o alterar el gen DYAD in vivo (véase Grewal y Klar, Genetics 146: 1221 -1238 (1997) y Xu et al., Genes Dev. 10: 241 1 -2422 (1996)). La recombinación homologa se ha demostrado en plantas (Puchta et al., Experientia 50: 277-284 (1994), Swoboda et al., EMBO J. 13: 484-489 (1994); Offringa et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 7346-7350 (1993); y Kempin et al. Nature 389:802-803 (1997)). Al aplicar la tecnología de recombinación homologa a los genes de la invención, mutaciones en porciones seleccionadas de secuencias de gen DYAD (incluyendo regiones hacia el extremo 5', hacia el extremo 3' e intragénica) tales como aquellas descritas aquí se hacen in vitro y después se introducen en la planta deseada usando técnicas estándares. Puesto que se sabe que la eficiencia de recombinación homologa depende de los vectores usados, el uso de vectores que dirigen genes dicistrónicos como lo describe Mountford et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 4303-4307 (1994); y Vaulont et al. Transgenic Res. 4: 247-255 (1995)" se usan convenientemente para incrementar la eficiencia de selección para expresión de gen DYAD alterada en plantas transgénicas. El gen mutado interactuará con el gen de tipo silvestre objetivo de tal manera que la recombinación homologa y el reemplazo objetivo del gen de tipo silvestre ocurrirán en células vegetales transgénicas, dando por resultado la supresión de actividad de DYAD. Alternativamente, oligonucleótidos compuestos de una extensión contigua de residuos de ARN y ADN en una conformación dúplex con tapas de pasador dobles sobre los extremos se pueden usar. La secuencia de ARN/ADN está diseñada para alinearse con la secuencia del gen DYAD objetivo y para contener el cambio de nucleótido deseado. La introducción del oligonucleotido quimérico en un plásmido de T-ADN extracromosómico da por resultado la conversión de gen DYAD eficiente y específica dirigida por moléculas quiméricas en un pequeño número de células vegetales transformadas. Este método se describe en Cole-Strauss et al. Science 273:1386-1389 (1996) y Yoon et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 2071 -2076 (1996). La expresión de gen puede ser inactivada usando técnicas de ADN recombinantes al transformar células vegetales con construcciones que comprenden transposones o secuencias de T-ADN. Mutantes DYAD preparados por estos métodos son identificados de conformidad con técnicas estándares. Por ejemplo, los mutantes pueden ser detectados por PCR o detectando la presencia o ausencia de ARNm de DYAD, v.gr., por Northern blots o transcripción inversa, seguido por PCR (RT-PCR). Los^mutantes~ también se pueden seleccionar probando para alteraciones en fertilidad, meiosis femenina y desarrollo de megaespora. Las secuencias de ácido nucleico aisladas preparadas como se describe aquí también se pueden usar en un número de técnicas para controlar la expresión de gen DYAD endógeno a varios niveles. Subsecuencias de las secuencias descritas aquí se pueden usar para controlar la transcripción, acumulación de ARN, traducción y similares. Un número de métodos se pueden usar para inhibir la expresión de gen en plantas. Por ejemplo, la tecnología de interferencia de ARN (ARNi) se puede usar convenientemente. Para lograr esto, el segmento de ácido nucleico del gen deseado es clonado como una repetición invertida en la cual las dos copias son separadas por un separador que puede ser comúnmente entre 5 y 2000 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 30 y 500 nucleótidos, y muy preferiblemente entre 50 y 200 nucleótidos. La repetición invertida es operablemente ligada a un promotor seguido por un terminador de tal manera que ambas copias serán transcritas y darán origen a una especie de ARN que es autocomplementaria a lo largo de toda o parte de su longitud. La construcción después es transformada en plantas y se produce ARN de doble cadena. Como otro ejemplo, la tecnología de antisentido se puede usar convenientemente para inhibir la expresión de gen DYAD. Para lograr esto, un segmento de ácido nucleico del gen deseado es clonado y operablemente enlazado a un promotor de tal manera que la cadena de antisentido de ARN será transcrita. La construcción después es transformada en plantas y la cadena de antisentido de ARN es producida. En células vegetales, se ha sugerido que la supresión de antisentido puede actuar en todos los niveles de regulación de gen incluyendo la supresión de traducción de ARN (véase, Bourque Plant Sci. (Limerick) 105: 125-149 (1995); Pantopoulos en Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol. 48. Cohn, W. E. y K. Moldave (Ed.). Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., USA; London, Inglaterra, RU. p. 181 -238; Heiser et al. Plant Sci. (Shannon) 127: 61 -69 (1997)) y para prevenir la acumulación de ARNm que codifica la proteína de interés (véase, Baulcombe Plant Mol. Bio. 32:79-88 (1996); Prins y Goldbach Arch. Virol. 141 : 2259-2276 (1996); Metzlaff et al. Cell 88: 845-854 (1997), Sheehy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:8805-8809 (1988), y Hiatt et al., patente de E.U.A. No. 4,801 ,340). El segmento de ácido nucleico que ha de ser introducido generalmente será sustancialmente idéntico a por lo menos una porción del gen o genes DYAD endógenos que han de ser reprimidos. Sin embargo, la secuencia no necesita ser perfectamente idéntica para inhibir la expresión. Los vectores de la presente invención se pueden diseñar de tal manera que el efecto inhibidor se aplique a otros genes dentro de una familia de genes que presentan homología u homología sustancial al gen objetivo. Para supresión de antisentido, la secuencia introducida también no necesita ser de longitud completa en relación ya sea con el producto de transcripción primario o ARNm completamente procesado. Generalmente, la homología superior se puede usar para compensar el uso de una secuencia más corta. Además, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrón o exón, y homología segmentos no codificadores puede ser igualmente efectiva. Normalmente, una secuencia de entre aproximadamente 30 ó 40 nucleotidos y aproximadamente nucleotidos de longitud completa se deben usar, a través de una secuencia de por lo menos aproximadamente 100 nucleotidos es preferida, una secuencia de por lo menos aproximadamente 200 nucleotidos es más preferida y una secuencia de aproximadamente 500 a aproximadamente 1700 nucleotidos es especialmente preferida. Un número de regiones de genes pueden ser dirigidas para suprimir la expresión de gen DYAD. Los objetivos pueden incluir, por ejemplo, las regiones codificadoras, intrones, secuencias de uniones de exón/intrón, regiones no traducidas 5' ó 3', y similares. En algunas modalidades, las construcciones pueden se diseñadas para eliminar la capacidad de proteínas reguladoras a unirse a secuencias de gen DYAD que son requeridas para su expresión específica de célula y/o tejido. Dichas secuencias reguladoras de transcripción pueden estar localizadas ya sea 5'-, 3'-, o dentro de la región codificadora del gen y ya sea pueden promover (elemento regulador positivo) o reprimir (elemento regulador negativo). Estas secuencias pueden ser identificadas usando análisis de deleción estándar, bien conocida por los expertos en la técnica. Una vez que las secuencias son identificadas, una construcción de antisentido que dirige esas secuencias es introducida en plantas para controlar la transcripción de gen en tejido particular, por ejemplo, en el desarrollo de óvulos y/o semilla. La formación de triple hélice basada en oligonucleótidos se puede usar para perturbar la expresión de gen DYAD. El ADN triplex puede inhibir la transcripción y replicación del ADN, generar mutaciones específicas de sitio, digerir ADN e inducir recombinación homologa (véase, v.gr., Havre y Glazer J. Virology 67:7324-7331 (1993); Scanlon et al. FASEB J. 9:1288-1296 (1995); Giovannangeli et al. Biochemistry 35: 10539-10548 (1996); Chan y Glazer J. Mol. Medicine (Berlín) 75: 267-282 (1997)). ADNs de triple hélice se pueden usar para dirigir las mismas secuencias identificadas para la regulación de antisentido. Moléculas de ARN catalítico o ribozimas también se pueden usar para inhibir la expresión de genes DYAD. Es posible diseñar ribozimas que se apareen específicamente con casi cualquier ARN objetivo, y digieran la estructura de base de fosfodiéster en un lugar específico, inactivando funcionalmente de esta manera el ARN objetivo. Al llevar a cabo esta digestión, la ribozima no es autoalterada, y por lo tanto es capaz de reciclar y digerir otras moléculas, haciéndola una enzima verdadera. La inclusión de secuencias de ribozima dentro de ARNs de antisentido confiere actividad de digestión de ARN sobre las mismas, incrementando así la actividad de las construcciones. Por lo tanto, las ribozimas se pueden usar para dirigir las mismas secuencias identificadas para regulación de antisentido. Un número de clases de ribozimas se han identificado. Una clase de ribozimas se deriva de un número de ARNs circulares pequeños que son capaces de autodigerirse y de replicarse en plantas. Los ARNs se replican ya sea solos (ARNs de viroide) o con un virus auxiliar (ARNs de satélite). Ejemplos incluyen ARNs de viroide de aguacate y los ARNs satélites de virus de manchas de anillo de tabaco, virus veteado transitorios de lúceme, virus del moteado del tabaco de velvet, virus del moteado de Solanum nodiflorum y virus del moteado de trébol subterráneo. El diseño y uso de ribozimas específicas de ARN objetivo se describe en Zhao y Pick Nature 365:448-451 (1993); Eastham y Ahlering J. Urology 156:1 186-1 188 (1996); Sokol y Murray Transgenic Res. 5:363-371 (1996); Sun et al. Mol. Biotechnology 7:241 -251 (1997); y Haseloff et al. Nature, 334:585-591 (1988). Otro método de supresión es cosupresión de sentido. La introducción de ácido nucleico configurado en la orientación de sentido se ha demostrado que es un medio efectivo por el cual se bloquea la transcripción de genes objetivo. Para un ejemplo del uso de este método para modular la expresión de genes endógenos (véase Assaad et al. Plant Mol. Bio. 22: 1067- 1085 (1993); Flavell Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 3490-3496 (1994); Stam et al. Annals Bot. 79: 3-12 (1997); Napoli et al., The Plant Cell 2:279-289 (1990); y patentes de E.U.A. Nos. 5,034,323, 5,231 ,020, y 5,283,184). El efecto supresor puede ocurrir en donde la secuencia introducida no contiene secuencia codificadora como tal, pero sólo secuencias de ¡ntrón o no traducidas homologas a secuencias presentes en la transcripción primaria de la secuencia endógena. La secuencia introducida generalmente será sustancialmente idéntica a la secuencia endógena que ha de ser reprimida. Esta identidad mínima será típicamente mayor que aproximadamente 65%, pero una identidad más alta podría ejercer una represión más efectiva de expresión de las secuencias endógenas. La identidad sustancialmente mayor de más de aproximadamente 80% es preferida, aunque aproximadamente 95% de identidad absoluta sería más preferida. Igual que con la regulación de antisentido, el efecto se debe aplicar a cualesquiera otras proteínas dentro de una familia similar de genes que presentan homología u homología sustancial. Para supresión de sentido, la secuencia introducida, que necesita menos de identidad absoluta, también necesita no ser de longitud completa, en relación ya sea con el producto de transcripción primario o ARNm completamente procesado. Este se puede preparar para evitar producción concurrente de algunas plantas que sean sobre expresadas. Una identidad mayor en una secuencia de longitud más corta que la completa compensa una secuencia más larga menos idéntica. Además, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrón o exón, y la identidad de segmentos no codificadores será igualmente efectiva. Normalmente, una secuencia de los intervalos de tamaño anteriormente señalados para regulación de antisentido se usa. Además, las mismas regiones de gen señaladas para regulación de antisentido pueden ser dirigidas usando tecnologías de co-supresión. Alternativamente, eliminando las proteínas que son requeridas para expresión de gen específicas de células DYAD puede modular la actividad de DYAD. Por lo tanto, la expresión de proteína reguladora y/o las secuencias que controlan la expresión de gen DYAD pueden ser moduladas usando los métodos aquí descritos. Otro método es el uso de supresión de ARNt manipulada por ingeniería genética de traducción de ARNm de DYAD. Este método implica el uso de ARNt supresores para transactivar genes objetivo que contienen codones de detención prematuros (véase, Betzner et al. Plant J. 1 1 :587-595 (1997); y Choisne et al. Plant J. 1 1 : 597-604 (1997). Una línea de planta que contiene un gen DYAD consecutivamente expresado que contiene un codón de detención ámbares primero creado. Múltiples líneas de plantas, cada una conteniendo construcciones de gen supresor de ARNt bajo la dirección de promotores específicos de tipos célula también son generados. La construcción de gen de ARNt es después cruzada en la línea de DYAD para activar la actividad de DYAD de una manera dirigida. Estas líneas de supresor de ARNt también se podrían usar para dirigir la expresión de cualquier tipo de gen a los mismos tipos de célula o tejido. La producción de formas dominante-negativas de polipéptidos DYAD que son defectuosas en sus capacidades para unirse a otras proteínas es un medio conveniente para inhibir la actividad de DYAD endógena. Este enfoque implica la transformación de plantas con construcciones que codifican polipéptidos DYAD mutantes que forman complejos defectuosos con proteínas endógenas y de esta manera evitan que se forme apropiadamente el complejo. El polipéptido mutante puede variar a partir de la secuencia que ocurre normalmente al nivel de estructura primaria por sustituciones, adiciones, deleciones y similares de aminoácidos. Estas modificaciones se pueden usar en un número de combinaciones para producir la cadena de proteína modificada final. El uso de mutantes dominante-negativos para inactivar genes objetivo se describe en Mizukami et al. Plant Cell 8:831 -845 (1996). Otra estrategia para afectar la capacidad de una proteína DYAD para interactuar consigo misma o con otras proteínas implica el uso de anticuerpos específicos para DYAD. En este método, la expresión específica de célula de Abs específico de DYAD se usa para inactivar dominios funcionales a través de reconocimiento de anticuerpo:antígeno (véase, Hupp et al. Cell 83:237-245 (1995)).

Uso de ácidos nucleicos de la invención para incrementar la expresión de gen DYAD Secuencias aisladas preparadas como se describe aquí también se pueden usar para introducir la expresión de un ácido nucleico DYAD particular para mejorar o incrementar la expresión de gen endógena. La expresión incrementada también se puede usar, por ejemplo, para incrementar el crecimiento vegetativo al evitar que la planta forme conjuntos de semillas. En dondé~lal3obreexpres¡ón de un gen se desea, el gen deseado de una especie diferente se puede usar para reducir los efectos de supresión de sentido potenciales. Un experto en la técnica reconocerá que los polipéptidos codificados por los genes de la invención, igual que otras proteínas, tienen diferentes dominios que realizan funciones diferentes. Por lo tanto, las secuencias de gen no necesitan ser de longitud completa, siempre que el dominio funcional deseado de la proteína sea expresado. Cadenas de proteína modificadas también pueden ser fácilmente diseñadas utilizando varias técnicas de ADN recombinante y conocidas por los expertos en la técnica y descritas con detalle, más adelante. Por ejemplo, las cadenas pueden variar desde la secuencia que ocurre naturalmente al nivel de estructura primaria por sustituciones, adiciones, deleciones y similares de aminoácidos. Estas modificaciones se pueden usar en un número de combinaciones para producir la cadena de proteína modificada final.

Preparación de vectores recombinantes Para usar secuencias asiladas en las técnicas anteriores, vectores de ADN recombinante adecuados para transformación de células vegetales se preparan. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies vegetales superiores son bien conocidas y se describen en la literatura técnica y científica. Véase, por ejemplo, Weising et al. Ann. Rev. Genet. 22:421 -477 (1988). Una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido deseado, por ejemplo, una secuencia de~ADNc que codifica una proteína de longitud completa, o una proteína de fusión de DYAD a una secuencia de localización intracelular o una proteína de DYAD truncada, preferiblemente se combinará con secuencias reguladoras de inicio de transcripción y traducción que dirigirán la transcripción de la secuencia de gen en los tejidos destinados de la planta transformada. Por ejemplo, se puede utilizar para sobreexpresión, un fragmento de promotor de planta que dirija la expresión del gen en todos los tejidos de una planta regenerada. Dichos promotores se refieren aquí como promotores "constitutivos" y son activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de inicio de transcripción del virus de mosaico de la coliflor (CaMV) 35S. El promotor 1 '- o 2'- derivado de T-ADN de Agrobacterium tumafaciens, y otras regiones de inicio de transcripción de varios genes de plantas conocidos por los expertos en la técnica. Dichos genes incluyen, por ejemplo, ACT1 1 de Arabidopsis (Huang et al. Plant Mol.

Biol. 33: 125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong et al., Mol. Gen. Genet. 251 :196-203 (1996)), el gen que codifica desnaturasa de proteína portadora de estearoilo-acilo de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe et al. Plant Physiol. 104:1 167-1 176 (1994)), GPc1 de maíz (GenBank No. X15596, Martínez et al. J. Mol. Biol 208:551 -565 ( 1989)), y Gpc2 de maíz (GenBank No. U45855, Manjunath et al., Plant Mol. Biol. 33:97-1 12 (1997)). Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión del ácido nucleico DYAD en un tejido específico o de otra puede estar bajo control ambiental o de desarrollo más preciso. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada o la presencia de luz. Dichos promotores se refieren aquí como promotores "inducibles" o "específicos de tejido". Un experto en la técnica reconocerá que un promotor específico de tejido puede impulsar la expresión de secuencias operablemente ligadas en tejidos distintos a tejido objetivo. Por lo tanto, como se usa aquí, un promotor específico de tejido es uno que impulsa la expresión preferiblemente en el tejido objetivo, pero también puede conducir a alguna expresión en otros tejidos. Expresión condicional, expresión específica de tejido o una combinación de las dos se puede lograr usando un transactivador, en donde el ácido nucleico DYAD se puede colocar bajo control de un promotor sintético que es impulsado por un transactivador heterólogo o sintético. La expresión específica de tejido y/o condicional del transactivador entonces impulsaría la expresión correspondiente del ácido nucleico DYAD. Ejemplos de sistemas transactivables e inducibles que se han usado en plantas incluyen mGa14:VP16/UAS, pOp/LhG4, GVE/VGE, GVG, pOp6/LhGR, y XVE (revisado en Moore et al., The Plant Journal 45: 651 -683 (2006)). Ejemplos de promotores bajo control de desarrollo incluyen promotores que inician transcripción únicamente (o sólo primariamente) en ciertos tejidos, tales como frutos, semillas ó flores. Promotores que dirigen la expresión de ácidos nucleicos en óvulos, flores o semillas son particularmente útiles en la presente invención. Como se usa aquí, un promotor específico de semilla es uno que dirige la expresión en tejidos de semilla. Dichos promotores pueden ser, por ejemplo, específicos de óvulo (que incluye promotores que dirigen la expresión en tejidos maternos o el gametofito femenino, tales como células huevo o la célula central), específico de embrión, específico de endospermo, específico de integumento, específico de cubierta de semilla o alguna combinación de los mismos. Ejemplos incluyen un promotor del gen BEL1 específico de óvulo descrito en Reiser et al. Cell 83:735-742 (1995) (GenBank No. U39944), y el promotor del gen DUET específico de meiocito masculino (Reddy T. V., et al., Development, Vol. 130 (24):5975-5987, 2003). Otros promotores específicos de semilla adecuados se derivan de los siguientes genes: MAC1 de maíz (Sheridan et al. Genetics 142:1009-1020 (1996), Cat3 de maíz (GenBank No. L05934, Abler et al. Plant Mol. Biol. 22:10131 -1038 (1993), el gen que codifica oleosina 18kD de maíz (GenBank No. J05212, Lee et al. Plant Mol. Biol. 26:1981 -1987 ( 1 994)), viviparous-1 de Arabidopsis (Genbank No. U93215), el gen que codifica oleosina de Arabidopsis (Genbank No. Z17657), Atmycl de Arabidopsis (Urao et al. Plant Mol. Biol. 32:571 -576 (1996), la familia de gen de proteína de almacenamiento de semilla 2S de Arabidopsis (Conceicao et al. Plant J. 5:493-505 (1994)) el gen que codifica oleosina 20kD de Brassica napus (GenBank No. M63985), napA de Brassica napus (GenBank No. J02798, Josefsson et al. JBL 26: 12196- 301 (1987), la familia de gen de napin de Brassica napus (Sjodahl et al. Planta 197:264-271 (1995), el gen que codifica la proteína de almacenamiento 2S de Brassica napus (Dasgupta et al. Gene 133:301 -302 (1993)), los genes que codifican oleosina A (Genbank No. U091 18) y oleosina B (Genbank No. U091 19) de soya y el gen que codifica proteína rica en azufre de peso molecular bajo de soya (Choi et al. Mol . Gen., Genet. 246:266-268 (1995)). Además, las secuencias promotoras de los genes DYAD descritos aquí se pueden usar para impulsar la expresión de los polinucleotidos DYAD de la invención o secuencias heterólogas. Si se desea la expresión de polipéptido adecuada, una región de poliadenilacion en el extremo 3' de la región codificadora se debe incluir. La región de poliadenilacion se puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales, o de T-ADN. El vector que comprende las secuencias (v.g., promotores o regiones codificadoras) de genes de la invención típicamente comprenderá un gen marcador, que confiere un fenotipo selecciónatele a las células vegetales. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, particularmente resistencia a antibióticos, tales como resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicida, tal como resistencia a clorosulfuron o Basta.

Producción de plantas transgénicas Construcciones de AD'NTclé la invención se pueden introducir en el genoma de la planta hospedero deseada por una variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, la construcción de ADN se puede introducir directamente en el ADN genómico de la célula vegetal usando técnicas tales como electroporacion y microinyeccion de protoplastos de células vegetales, o las construcciones de ADN se pueden introducir directamente a tejido vegetal usando métodos balísticos, bombardeo de partículas de ADN. Las técnicas de microinyeccion se conocen en la técnica y se describen bien en literatura científica y de patentes. La introducción de construcciones de ADN usando precipitación de polietilenglicol se describe en Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporacion se describen en Fromm et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). Las técnicas de transformación balística se describen en Klein et al. Nature 327:70-73 (1987). Alternativamente, las construcciones de ADN se pueden combinar con regiones flanqueadoras de T-ADN adecuadas e introducir en vector hospedero de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del hospedero de Agrobacterium tumefaciens dirigirá la inserción de la construcción y marcador adyacente al ADN de la célula vegetal cuando la célula sea infectada por la bacteria. Técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desensamble y uso de vectores binarios, se describen bien en la literatura científica. Véase, por ejemplo Horsch et al. Science 233:496-498 (1984), y Fraley et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983). Las células vegetales transformadas que se derivan por cualquiera de las técnicas de transformación anteriores se pueden cultivar para regenerar una planta entera que posea el genotipo transformado y por lo tanto el fenotipo deseado tal como masa de semilla incrementada. Dichas técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, típicamente basándose en marcador de biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con las secuencias de nucleótido deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21 -73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callos de plantas, explantes, órganos o partes de los mismos. Dichas técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987).

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para conferir rasgos deseados esencialmente en cualquier planta. Por lo tanto, la invención tiene uso sobre una amplia gama de plantas que incluyen especies de los géneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus. Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea. Un experto en la técnica reconocerá que después de que el cassette de expresión se incorpora establemente en plantas transgénicas y se confirma que es operable, se puede introducir en otras plantas mediante cruza sexual. Cualquier número de técnicas de reproducción estándares se pueden usar, dependiendo de la especie que sea cruzada. Semilla obtenida de plantas de la presente invención se puede analizar de conformidad con procedimientos bien conocidos para identificar plantas con el rasgo deseado. Si se usan técnicas de antisentido u otras técnicas para controlar la expresión de gen DYAD, RT-PCR o Northern blot se pueden usar para determinar selectivamente las plantas deseadas. Además, la presencia de desarrollo reproductivo independiente de fertilización puede ser detectado. Las plantas se pueden determinar selectivamente, por ejemplo, para la capacidad para formar semillas sin embrión, formar semillas que abortan después de la fertilización, o producir frutos en ausencia de fertilización. Estos procedimientos dependerán en parte de la especie vegetal particular que se esté usando, pero se llevará a cabo con métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los siguientes ejemplos se dan a manera de ilustración de la presente invención y no deben considerarse para limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPL0 1 El mutante dyad muestra la fertilidad femenina defectuosa y establecimiento de semilla reducido El mutante dyad se aisló en un tamiz para mutantes estériles de Arabidopsis entre una población de plantas M2 mutagenizadas por EMS (Siddiqi I. et. al. Development Vol. 127(1 ): 197-207 (2000)). El análisis de fertilidad por cruzas recíprocas indicó que el mutante fue estéril femenino pero fértil masculino. El análisis de esporogénesis femenina y desarrollo de óvulo indicó que dyad sufrió meiosis femenina defectuosa dando por resultado una sola división meiótica debido a la progresión defectuosa a través del ciclo celular meiótico, seguido por detención y falla para desarrollar gametos femeninos en la mayoría de los óvulos. El análisis de meiosis femenina por observaciones de preparaciones de cromosomas de meiocitos indicó que la meiosis femenina fue anormal en el mutante dyac. los cromosomas no tuvieron sinapsis y sufrieron una división ecuacional en lugar de una dvisión reduccional, que normalmente tendría lugar en la meiosis 1 (Agashe B., Prasad C. K., y Siddiqi L, Development Vol. 129(16): 3935-3943 (2002)). Como se muestra en la figura 1 , el conjunto de semillas en el mutante dyad es altamente reducido cuando se compara con el tipo silvestre y se observó variación en el grado de conjunto de semillas entre diferentes plantas mutantes dyad. El conjunto de semillas fue esporádico y aleatorio de tal manera que no se observó uniformidad en términos de número entre las plantas en la población. El modo para el conjunto de semillas fue 1 -10 por planta pero varió hasta un máximo de aproximadamente 275 que se observó rara vez ( 1 en 500 plantas).

EJEMPLO 2 Meiosis y fertilidad masculinas son normales en el mutante dyad La viabilidad del polen se examinó usando tinción de Alexander y se encontró que el polen era completamente viable y comparable con el tipo silvestre (figura 2A y figura 2B). El examen de meiosis masculina por análisis de extensiones de cromosomas de meiocitos indicó que la meiosis masculina fue normal y dio por resultado la producción de una tétrada de esporas haploides (figuras 3A-3F). La meiosis masculina, fertilidad masculina y desarrollo del polen así como la función fueron por lo tanto normales en el mutante dyad. Por otra parte, la meiosis femenina es anormal en dyad. No se ve que ocurra la sinapsis de cromosomas homólogos y la división de meiosis reduccional 1 de la meiosis femenina de tipo silvestre (figura 3C) es reemplazada por una ecuacional en dyad (figura 3E).

EJEMPLO 3 Semillas obtenidas del mutante dyad germinan para dar plantas triploides Es posible que las semillas producidas en el mutante dyad surjan de una meiosis normal en una pequeña minoría de meiocitos femeninos, que dan origen a un saco embrionario funcional normal que después es fertilizado por polen haploide para desarrollarse en semilla. Si este fuera el caso, estas semillas representarían escapes de la meiosis femenina anormal que tienen lugar en el mutante dyad. Para examinar esta posibilidad, las semillas (n=169) de plantas dyad se hicieron germinar y se encontró que germinaban con alta eficiencia (>90%) y producían plántulas morfológicamente normales excepto unas cuantas que dieron plántulas anormales (10%). No se observaron casos de variaciones en forma, simetría y número de cotiledones en las plántulas que germinaron. Esto contrasta con plántulas derivadas de otros mutantes meióticos tales como AtSpo11 -1 y AtDmd que sufren segregación aleatoria de cromosomas en meiosis 1 , dando por resultado una proporción más alta de progenie aneuploide que muestra un intervalo de anormalidades en desarrollo en la etapa de plántula (Grelon M. et al., The EMBO J., Vol 20: 589-600, 2001 , Couteau F. et al., Plant Cell, Vol. 1 1 (9): 1623-1634, 1999). El crecimiento vegetativo de plántulas al transferir al suelo también fue normal y dio origen a plantas en las cuales el crecimiento vegetativo fue similar al tipo silvestre así como las plantas mutantes dyad progenitoras. La principal diferencia observada fue en tamaño de flor cuando las plantas empezaron a florecer. En la mayoría de las plantas (n=41/52) un incremento comparativo en el tamaño de la flor se observó como el del tipo silvestre. El tamaño de la flor incrementado posiblemente se pudo atribuir al incremento en vigor o influencias ambientales favorables. Puesto que las plantas se hacen crecer en ambiente controlado, se descarta la última posibilidad. La otra razón posible para incrementar el tamaño de órganos florales podría ser el incremento en ploidía. El incremento en ploidía se manifiesta por el incremento en tamaño de estructuras vegetativa y florales, particularmente los granos de polen (Altmann T., et al., Plant Cell Reports. Vol. 13: 652 - 656, 1994). Los botones de las flores de plantas aleatoriamente recolectadas se examinaron para su nivel de ploidía por análisis de cromosomas en células somáticas y en meiocitos masculinos. Se encontró al examinar preparaciones cromosómicas meióticas que en 17 de 19 casos las plantas fueron triploides y los 2 restantes se encontró que eran diploides (figuras 4A-4C). Puesto que el desarrollo del polen y meiosis masculina son normales en el mutante dyad mientras una meiosis femenina reduccional es reemplazada por una división ecuacional, estos resultados sugieren que la mayoría de las semillas que son triploides se produce a partir de la fertilización de una célula huevo no reducida (diploide) por un esperma haploide normal y no se producen a partir de una meiosis femenina normal en la mayoría de los óvulos, es decir, la mayoría de las semillas no representan escapes de la meiosis anormal.

EJEMPLO 4 Plantas triploides derivadas de dyad muestran retención de todos los marcadores heterociqóticos Las semillas triploides formadas en el muíante dyad podrían ser producto de fertilización de un saco embrionario no reducido por un polen haploide normal que sería consistente con la meiosis femenina ecuacional que tiene lugar en dyad. Si dicho saco embrionario no reducido se forma a partir de una megaspora no reducida que surge del producto de una división ecuacional de la célula madre de la megaspora en donde los cromosomas permanecen como univalentes y no sufren recombinación, entonces el genotipo del saco embrionario no reducido será idéntico al de la planta progenitora diploide. Por lo tanto, si la planta progenitora es heterocigotica para un marcador molecular entonces la progenie triploide también será heterocigotica para ese marcador. Si un marcador no ligado al centrómero se considera en una condición heterocigotica, entonces en ausencia completa de recombinación 100% de transmisión de heterocigocidad paterna se logrará en el gameto femenino resultante y la progenie triploide. Si la recombinación y cruzamiento tienen lugar, entonces 100% de heterocigocidad no se mantendrá en las progenies triploides resultantes. Para un marcador que no está ligado al centrómero, se puede esperar homocigocidad en el saco embrionario no reducido a una frecuencia de 33% y en la progenie triploide a una frecuencia de 16.7% mientras que en ausencia completa de recombinación no habrá homocigotos. La formación de sacos embrionarios no reducidos sin pérdida de heterocigocidad es altamente deseable para manipulación genética de apomíxis y fijación de heterosis. Los inventores de la presente usaron microsatélites para medir la pérdida de heterocigocidad entre la progenie triploide de plantas mutantes dyad. Las plantas mutantes dyad se identificaron en una población F2 segregante de una cruza entre Nossen de tipo silvestre (No-O) y ecotipos de mutante dyad Columbia (Col). Los marcadores candidatos se distribuyeron a través de los cinco cromosomas de Arabidopsis y a diferencia del centrómero (>35 cM) se obtuvieron de la base de datos TAIR (www.arabidopsis.org). Las plantas progenitoras usadas para generar la población F2 se examinaron para evaluar el polimorfismo y con base en los resultados se escogieron 5 marcadores diferentes (cuadro 1 ) en 4 cromosomas diferentes a las plantas mutantes F2 del genotipo 50 e identificaron aquellos marcadores para los cuales cada planta fue heterocigótica. Las semillas autocruzadas se recolectaron de las 50 plantas F2 individualmente y se hicieron crecer como 50 familias diferentes que consistían de un número variable de plantas hermanas. Esto dio un total de 196 plantas distribuidas a través de 50 familias. Todos los miembros de cada familia se genotipificaron con respecto a aquellos marcadores para los cuales la planta progenitora fue heterocigótica para dar entre 74-119 plantas distribuidas a través de todas las 50 familias F2 para cada marcador.

CUADRO 1 Análisis para marcador de progenie de plantas dyad para medir la pérdida de heterocigocidad y recombinación. a La cifra entre paréntesis en la columna 6 representa el porcentaje de homocigotos del total de plantas analizadas para ese marcador. De 196 plantas determinadas selectivamente se obtuvieron 35 plantas que fueron homocigóticas para por lo menos un marcador para el cual la planta progenitora fue heterocigótica. La ploidía de 22 de estas 35 plantas se determinó llevando a cabo preparaciones cromosónicas meióticas. Se encontró que 21 fueron diploides y otra hiperdiploide que tenía 13 cromosomas. Por lo tanto, de conformidad con el análisis, se encontró que la pérdida de heterocigocidad era casi exclusivamente sólo en diploides. De las plantas que no mostraron pérdida de heterocigocidad, 15 plantas se escogieron al azar de familias F2 separadas y se examinaron para su ploidía. Se encontró que todas las 15 eran triploides. Los resultados por lo tanto indican que no hay perdida de heterocigocidad en triploides que constituyen la mayoría de la clase de progenie de una planta mutante dyad diploide. La falla para encontrar pérdida de heterocigocidad en triploides también descarta un posible mecanismo alternativo para su formación, a saber polispermia, es decir, fertilización de un gameto femenino haploide por dos gametos masculinos separados, que también predecirían la pérdida de heterocigocidad. Los hallazgos muestran que la progenie triploide de plantas mutantes dyad surgen de la fertilización de un saco embrionario no reducido que retiene el genotipo de la planta progenitora. La formación de un saco embrionario no reducido es un aspecto clave de apomixis.

EJEMPLO 5 Aislamiento y caracterización funcional del homólogo de DYAD de Boechera holboelli La región codificadora genómica 3 kB del homólogo de DYAD de los accesos Boechera holboellii facultativamente apomícticos, Greenland diploide y Colorado triploide (Naumova T. N., et al, Sex. Plant Reprod. Vol. 14: 195-200, 2001 ) se clonaron usando iniciadores Bho5Bam (SEQ ID NO:39) y Bho3Bam (SEQ ID NO:40). El clon genómico BhDYAD (SEQ ID NO: 16) fue operablemente ligado al promotor de DYAD de Arabidopsis y se usó para transformar plantas mutantes dyad para prueba de complementación. El ADNc de BhDYAD también se amplificó y se secuenció (SEQ ID NO: 17). La transformación de infiltración bajo vacío in planta mediado por Agrobacterium movilizó la construcción de expresión a plantas F1 que fueron heterocigóticas para dyad. Se obtuvieron 42 transformantes de los cuales 9 transformantes fueron homocigóticos para el alelo muíante dyad como se determinó por CAPS y marcadores de microsatélite que flanquean el locus de dyad (Agashe B, Prasad C. K., y Siddiqi L, Development Vol. 129(16): 3935-3943 (2002)). De los 9 transformantes, 4 transformantes mostraron complementación del fenotipo mutante dyad, que se puede juzgar por las silicuas bien alargadas (figuras 5A-5E) que se encontró que contenían un conjunto de semillas completo. Las 5 plantas restantes fueron estériles posiblemente debido a cosupresión.

Crecimiento de plantas de Arabidopsis La cepa de Arabidopsis que portaba el mutante dyad fue como se describió en un principio (Siddiqi I., et. al., Development. Vol. 127(1 ): 197-207 (2000)). La población F2 usada para análisis de marcador de microsatélite se derivó de una cruza entre la cepa No-O (ecotpo Nossen) y mutante dyad en el fondo de ecotipo Col-O como se describe (Siddiqi L, et. al., Development. Vol. 127(1 ): 197-207 (2000)). Las plantas se hicieron crecer en un ambiente controlado como se describe (Siddiqi L, et. al., Development. Vol. 127(1 ): 197- 207 (2000)). Para hacer germinar las semillas en cajas de Petri, las semillas se esterilizaron en la superficie con etanol durante 10 min seguido por tratamiento de las mismas con 0.025% de cloruro mercúrico durante 5 min. Además, las semillas se lavaron tres veces con agua estéril para remover cualesquiera trazas de cloruro mercúrico. Las semillas se suspendieron en 0.5% de agar superior lukewarm y se expandieron uniformemente sobre placas de agar MS (0.7%) complementadas con 2% de sacarosa. Las placas se dejaron secar durante una hora en una campana de flujo laminar y las placas se sellaron con parapelícula y se mantuvieron en un cuarto frío a 4°C para estratificación durante 3 días. Después de eso, las placas de cambiaron a una cámara de crecimiento. Las frecuencias de germinación se contaron después de dos semanas. Para hacer crecer las semillas en las macetas, el medio sintético usado para el crecimiento de plantas se preparó mezclando una proporción igual de Soilrita: Perlita: Vermiculita (Keltech Energies Ltd., Karnataka 574 108, India). La mezcla de la maceta se aplicó uniformemente a las macetas perforadas en la parte inferior permitiendo elevación capilar y las macetas se remojaron en solución IX MS que contenía sales mayores: CaC (4 mM), MgSO4 ( 1 .5 mM), KN03 (18.8 mM), NH4N03 (20.6 mM), KH2P04 (1 .25 mM, pH 5.6), Fe-EDTA (20 mM) a la cual se añadió por litro 1 mi (1000X) de sales menores: (H3B03 (70 mM), MnCI2 (14 mM), CuS04 (0.5 mM), ZnS04 (1 mM), NaMoO4 (0.2 mM), NaCI (10 mM), CoCI2 (0.01 mM)). Las semillas se diseminaron uniformemente sobre la superficie de la maceta y se cubrieron con envoltura de Sarán y se mantuvo a 4-8°C durante 3 días para estratificación y después se cambiaron a una cámara de crecimiento. En el caso de transplante, las macetas se cubrieron con envoltura de Sarán después de que las pántulas fueron transferidas al medio de suelo y colocadas directamente en la cámara de crecimiento. La envoltura de Sarán se removió una vez que las plantas se establecieron en la mezcla de maceta. El riego se hizo a intervalos regulares usando agua destilada.

Análisis del conjunto de semillas La población segregante F2 que portaba una mutación dyad en el fondo de ecotipo Col-O se usó para dar la puntuación de la frecuencia de conjunto de semillas en las plantas homocigóticas dyad, las plantas mutantes dyad se dejaron crecer hasta su etapa final cuando la planta cesó a flor. Después de esta etapa, el riego se mantuvo para permitir que las silicuas alcanzaran madurez de cosecha. Mientras tanto, las silicuas más bajas que se volvieron amarillas y estaban a punto de quebrarse se abrieron individualmente y las semillas si acaso las había se cosecharon sobre una base de planta individual. Asimismo, las semillas necesarias se cosecharon a intervalos regulares para evitar posible pérdida de semillas. Finalmente, las semillas recolectadas se pusieron en acervo sobre una base de planta individual para contar el número total de semillas por planta.

Viabilidad del polen La tinción vital para microsporas en la antera se hizo como describe (Alexander M. P., Stain Technol. Vol. 44(3): 1 17-122, 1971 ).

Preparaciones meióticas El análisis de preparaciones meióticas masculinas y femeninas son como se describe (Agashe B, Prasad C. K., y Siddiqi L, Development Vol. 129(16): 3935-3943"(2002)).

Aislamiento de ADN de la planta El ADN genómico para análisis de marcador de microsatélite se aisló de conformidad con el método descrito por Dellaporta S. L, et al. , Plant Mol . Bio. Rep., Vol. 1 : 19-21 (1983) con modificaciones menores. Aproximadamente 500 mg de tejido foliar se recolectó de una planta individual en 1 .5 mi de tubos de Eppendorf y se congeló en nitrógeno líquido. Después el tejido se molió a un polvo fino usando un micropistilo. A este polvo se añadió 200 µ? de regulador de pH de extracción recién preparado (100 mM de Tris (pH 8), 50 mM de EDTA, 500 mM de NaCI, 1 .4% de SDS, y 10 mM de ß-mercaptoetanol) y se homogeneizó finamente con el micropistilo. Después, un volumen igual de 2X CTAB se añadió y la mezcla se sometió a acción de remolino suavemente. Después, la mezcla se incubó a 65°C durante 5 minutos en un baño de agua en agitación. Después de que la muestra se dejó enfriar y un volumen igual de 24:1 de cloroformo:alcohol isoamílico se añadió y se mezcló suavemente y se centrifugó durante 10 min a 13000 rpm. La fase acuosa que contenía el ADN fue transferida a un tubo de Eppendorf fresco y 2/3 volúmenes de isopropanol enfriado con agua se añadió para precipitar el ADN. El ADN se formó en pastilla por centrifugación a 4°C a 13000 rpm durante 20 min. A la pastilla de ADN se dio un lavado de 70% de etanol y la pastilla se secó con aire durante 30 minutos y se suspendió en 50 µ? de agua estéril o regulador de pH TE (pH 8.0) que contenía ARNasa libre de ADNasa (20 ug/ml).

Análisis de marcador Con base en la supervivencia progenitora de los ecotipos Col-O y No-O, 5 marcadores de microsatélite de 4 cromosomas diferentes que son razonablemente desligados al centrómero se escogieron. Estos marcadores se usaron en una población segregante F2 (No-O x Col-O {dyad)) para escoger plantas dyad que son heterocigóticas para un marcador dado. Las semillas de estas plantas dyad se recolectaron y germinaron en cajas de Petri individuales de tal manera que cada progenie constituye una hermana de la planta madre dyad particular. Asimismo, los datos sobre plantas hermanas de varias plantas que fueron heterocigóticas para un marcador dado se consideraron juntas para análisis de marcador. La lista de marcadores de microsatélite y su localización son como se describe en el cuadro 1 . Las secuencias de iniciador usadas para amplificar los microsatélites son del sitio web TAIR (www.arabidopsis.org): nga162 nga162F SEQ ID N0:6 nga162R SEQ ID N0:7 nga225 nga225F SEQ ID NO:8 nga225R SEQ ID N0:9 nga168 nga168F-SEQ ID NO: 10 nga168R SEQ ID NO: 1 1 nga1 107 nga1 107F SEQ ID NO:12 nga1 107R SEQ ID NO: 13 nga6 nga6F SEQ ID NO: 14 nga6R SEQ ID NO: 15 PCR se llevó a cabo en regulador de pH 1 X PCR (Perkin Elmer) que contenía 2 mM de MgCI, 0.2 mM de cada dNTP, 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Perkin-Elmer/Cetus), y 5 pmoles de iniciadores hacia adelante y en reversa que flanquean iniciadores a una temperatura de templado de 55°C con una extensión a 72°C durante 20 segundos. Los productos de PCR se resolvieron en un gel de poliacrilamida de 8% a 150V durante 3 hr y se tiñeron con bromuro de etidio y se capturaron usando un sistema de documentación de gel Syngene (Synoptics Inc. R.U.).

Materiales vegetales Los accesos Greenland diploide y Colorado triploide facultativamente apomícticos de Boechera holboellii fueron cortesía de Kim Boutilier (Naumova T. N., et al., Sex. Plant Reprod. Vol. 14: 195-200, 2001 ). Las plantas se hicieron crecer en macetas que contenían el medio como se describe para Arabidopsis y se hicieron crecer bajo condiciones idénticas a las de Arabidopsis.

Clonación del promotor de DYAD Una región de promotor de DYAD de 1 .8 kb se amplificó a partir de ecotipo Col-O usando los iniciadores pg2r4 (SEQ ID NO: 48) y PDYBAM (SEQ ID NO: 47) y el producto se clonó en un vector pGEMT (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Clonación de homólogo de DYAD de Boechera holboellii La región codificadora genómica del homólogo de DYAD de Arabidopsis de Boechera holboellii (BhDYAD) se amplificó con iniciadores que portaban un sitio BamHI en el extremo 5': Bho5BAM (SEQ ID NO: 39) y Bho3BAM. (SEQ ID NO: 40). El fragmento 3kb resultante se clonó en pGEMT.

Construcción de vector binario pCAMBIA1300 que impulsa BhDYAD bajo el promotor de DYAD de Arabidopsis El Bh DYAD fue liberado de pGEMT como un fragmento BamHI de 3 kb y se clonó en un vector pCAMBIA1300 que portaba un marcador higromicina seleccionable por la planta. La orientación se verificó usando los iniciadores BDY3 (SEQ ID NO: 36) y OCSR (SEQ ID NO: 38). La región de promotor de DYAD de 1 .6 kb (SEQ ID NO: 22) fue liberada como un fragmento Sad del vector pGEMT y se insertó corriente arriba de un BhDYAD en el vector pCAMBIA1300. La orientación del promotor con respecto a la secuencia genómica de BhDYAD se confirmó usando iniciadores ismr4 (SEQ ID-NO: 37 )y bdyl (SEQ ID NO:35) Concordancia triproqenitora La transferencia del vector binario construido anteriormente pCAMBIA en Agrobacterium (AGLI) fue mediante concordancia triprogenitora como se describe (Agashe B, Prasad C. K., y Siddiqi I, Development, Vol. 129(16): 3935-3943 (2002)).

Transformación de plantas de Arabidopsis Para análisis de complementación de BhDYAD, plantas F1 de Col-O x dyad fueron transformadas con la construcción que portaba BhDYAD impulsado por el promotor de DYAD de Arabidopsis. La transformación por infiltración bajo vacío in planta mediada por Agrobacterium se llevó a cabo de conformidad con Bechtold N. y Pelletier G., Métodos Mol. Biol., Vol. 82: 259-66 (1998).

Selección de transformantes Semillas TO de plantas F1 infiltradas bajo vacío se colocaron en una caja de Petri que contenía 0.8% de Bacto Agar, 1 mM de KN03 y 1 % de sacarosa con 20 pg/ml de higromicina. Después de estratificación en frío durante 3 días, las placas fueron transferidas a una cámara de crecimiento. Los transformantes que son resistentes a higromicina se pueden identificar tan temprano como 5 días después de la transferencia en virtud de raíz bien alargada, hipocotilo erecto y hojas con cotiledones bien extendidos. Los transformantes seleccionados fueron después transferidos a placas MS que contenían higromicina y después de que se estableció la resistencia fueron finalmente transferidos al medio de suelo. Además, las plantas fueron verificadas para la presencia de inserto usando iniciador bdy3 y OCSR como se describió en un principio.

Genotipificación para ciqosidad en locus de dyad Los tres genotipos de la población F2 de dyad segregante fueron identificados por los marcadores CAPS codominantes (Konieczny A. y Ausubel F. M., Plant J., Vol. 4(2): 403-410, 1993) y microsatélites viables. Las secuencias flanqueadoras del alelo muíante dyad se derivan de ecotipo erecto de Landsberg y las del alelo de tipo silvestre tienen secuencia de ecotipo Colombia. Por lo tanto, las SNPs en estas secuencias flanqueadoras se utilizaron para desarrollar marcadores CAP que están estrechamente ligados a y que flanquean cualquier lado del locus dyad (KNEF (SEQ ID NO:31 ) y KNER(SEQ ID NO:32), KKF(SEQ ID NO:33) y KKR(SEQ ID NO:34)) e iniciadores de marcador de microsatélite (KMF (SEQ ID NO:29 y KMR (SEQ ID NO:30)) que están estrechamente enlazados a DYAD (Agashe B, Prasad C. K., y Siddiqi L, Development Vol. 129(16): 3935-3943 (2002)). La genotipificación en el locus dyad usando los marcadores anteriores fue como se describe (Agashe B, Prasad C. K., y Siddiqi L, Development Vol. 129(16): 3935-3943 (2002)).

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc Botones individuales bien desarrollados de una planta Greenland diploide se usaron para aislamiento de ARN total por reactivo de TriZol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. 4 pg de ARN total se usaron para la síntesis de ADNc de primera cadena usando el sistema de elección Superscript™ para síntesis de ADNc (GIBCO BRL). El ADNc se amplificó posteriormente para clonación usando los iniciadores 5RF3(SEQ ID NO: 41 ) y Bho3BAM (SEQ ID NO:40). El fragmento de 1 .9 KB resultante se clonó en pGEMT y se secuenció. Los resultados se presentan en el listado de secuencias como SEQ ID NO: 17. La secuencia de aminoácidos de la proteína DYAD correspondiente se muestra en SEQ ID NO: 18.

EJEMPLO 6 Construcción de un alelo condicional de DYAD desarrollo de una población homogénea de plantas transgénicas que muestran el fenotipo mutante dyad La estrategia usada para construir un alelo condicional del gen DYAD se basó en fusionar el dominio de unión de hormona del receptor de glucocorticoide de rata (GR) (SEQ ID NO: 27) al C-terminal de DYAD e integrando la construcción de fusión en el genome de las plantas que eran homocigóticas para el alelo mutante dyad (dy/dy). La proteína de fusión DYAD-GR como tal no es capaz de complementar el mutante dyad debido a que el dominio GR confiere localización citoplásmica en ausencia de hormona esteroidea, mientras que el sitio de acción de DYAD es el núcleo. Sin embargo, en presencia de la hormona esteroidea, la proteína de fusión es liberada del sitio de unión citoplásmica y se vuelve capaz de translocar al núcleo en donde puede complementar al mutante dyad. Los pasos en la construcción fueron los siguientes: el vector binario de la planta pBI 101 .3 fue digerido con BamHI más Sad para remover el gen reportero GUS y lo reemplaza por un fragmento BamHI-Sac 1 que comprende el dominio GR (A.M. Lloyd et al., Science 266, 436-139 (1994)). El plásmido resultante se denominó pBI101 .3::GR. Enseguida, los iniciadores DyCF (SEQ ID NO: 43) y DyPB (SEQ ID NO: 42) (que contiene la secuencia para modificar el codón de terminación e introduce sitios de restricción para BamHI y Pstl) se usaron para amplificar por PCR una región C-terminal de 304 bp del gen DYAD. La secuencia modificada se clonó como un fragmento Pstl de 216 bp en el plásmido pBS (KS)::Dyad que portaba un clon genómico de 5.8 kb (SEQ ID NO:28) que contenía el gen DYAD entero correspondiente a las coordenadas 9684 a 3878 del clon MFG13 de Pl (Ace No. AB025621 ) para dar pBS(KS)::Dyad*. El plásmido resultante contenía un gen DYAD cuyo codón de terminación TGA había sido reemplazado por GGG y que también portaba un sitio BamHI junto con el codón reemplazado. El fragmento Sall-BamHI de 269 bp de pBSII(KS)::Dyad* que contenía los nucleótidos 9684 a 9416 de MFG13 se clonó en pBI101 .3::GR después de digestión con .Sail plus BamHI. La porción restante de DYAD de 9417-5335 se clonó después como un fragmento BamHI-BamHI de pBS(KS)::Dyad* en el producto del paso previo que dio por resultado una fusión de marco del dominio GR al C-terminal de DYAD. El plásmido final denominado pB1 01 .3::DyadAGR está representado en la figura 6. La construcción se introdujo en la cepa de Agrobacteriurn AGLI por concordancia triparental usando la cepa de E. coli auxiliar HB 101 [pRK2013]. La región T-ADN se transformó en plantas Arabidopsis (TO) que eran heterocigoticas para el alelo mutant dyad (+/dy) por transformación in planta (Bechtold N. y Pelletier G., Métodos Mol. Biol., Vol. 82: 259-66, 1998). Las plántulas T1 resistentes a kanamicina se seleccionaron sembrando las semillas en placas de agar MS que contenían kanamicina (50 mg/litros) y se transfirieron a placas de MS + kanamicina para confirmar el fenotipo resistente. Los transformantes fueron después identificados por PCR usando iniciadores DyCF (SEQ ID NO:43) y GRrev (SEQ ID NO:44). Las plántulas resistentes a kanamicina confirmadas fueron transferidas al suelo y se hicieron crecer a la etapa adulta. Después del crecimiento de pedúnculos con flores y desarrollo las primeras 8-10 silicuas, las plantas se regaron cada tres días con 10 µ? de dexametasona además de ser rociadas diariamente con 10 µ? de dexametasona + 0.015% de Silwet L-77. Se notó que varias plantas que mostraron esterilidad antes del tratamiento con dexametasona desarrollaron silicuas fértiles 5-7 días después del inicio de tratamiento con dexametasona. La parte del material vegetal se usó para análisis Southern para determinar el número de copias de la inserción y también se genotipificó con respecto al locus dyad usando marcadores CAPS basados en PCR estrechamente ligados y que flanqueaban al locus dyad. El mutante dyad se aisló originalmente en el fondo Ler y después fue introgresado en la cepa Col. Por lo tanto, el alelo Ler de los marcadores CAPS es diagnóstico para el mutante dyad mientras que el alelo Col es indicativo de tipo silvestre (figura 7A y figura 7B). Inserciones de una sola copia fueron identificadas entre plantas que tenían por lo menos una copia del alelo mutante dyad y semillas de estas plantas se colocaron en placas con MS + kanamicina. Las plántulas resistentes a la kanamicina fueron transferidas al suelo y fueron genotipificadas con respecto al locus dyad. Las plantas que eran homocigóticas para el alelo mutante dyad fueron identificadas y se hicieron crecer a etapa adulta. Después del crecimiento del pedúnculo con flores, todas las plantas fueron alimentadas con agua durante la fase inicial hasta la apertura de las primeras 8-10 flores seguido por riego con una solución que contenía dexametasona como se describió antes. Las líneas que mostraron esterilidad condicional fueron identificadas por determinación selectiva de diferentes inserciones de copia individuales. Como un ejemplo, una línea No. 33 mostrada en las figuras 8A-8D dio plantas mutantes dyad (dy/dy) todas las cuales mostraron esterilidad durante la fase inicial de crecimiento reproductivo y que se volvieron fértiles después de tratamiento con dexametasona. Los óvulos de botones aislados antes del tratamiento con dexametasona mostraron el fenotipo de muíante dyad, mientras que aquellos aislados después del tratamiento con dexametasona mostraron el fenotipo de tipo silvestre (figuras 9A y 9B). Las semillas se recolectaron de plantas mutantes dyad homocigóticas para dar familias T3 y familias T3 que eran homocigóticas para la inserción de DYAD-GR fueron identificadas por determinación selectiva para familias, que dieron todas las plántulas resistentes a kanamicina. Estos resultados ilustran la construcción de un alelo condicional de DYAD y su introducción en plantas dando por lo tanto plantas que muestran el fenotipo de mutante dyad bajo un conjunto de condiciones (la ausencia de dexametasona) y el fenotipo de tipo silvestre cuando se alimentan (o rocían) con dexametasona. Estos resultados también permiten el desarrollo de una población homogénea de plantas todas las cuales muestran el fenotipo de mutante dyad.

Secuencia de dominio de receptor de glucocorticoide usada en este estudio (914 pb) (SEQ ID NO: 27) GGATCCTGAAGCTCGAAAAACAAAGAAAAAAATCAAAGGGATrCAGCAAG CCACTGCAGGAGTCTCACAAGACACTTCGGAAAATCCTAACAAAACAATAG TTCCTGCAGCATTACCACAGCTCACCCCTACCTTGGTGTCACTGCTGGAGGT GATTGAACCCGAGGTGTTGTATGCAGGATATGATAGCTCTGTTCCAGATTC AGCATGGAGAATTATGACCACACTCAACATGTTAGGTGGGCGTCAAGTGAT TGCAGCAGTGAAATGGGCAAAGGCGATACCAGGCTTCAGAAACTTACACCT GGATGACCAAATGACCCTGCTACAGTACTCATGGATGTTTCTCATGGCATTT GCCCTGGGTTGGAGATCATACAGACAATCAAGTGGAAACCTGCTCTGCTTT GCTCCTGATCTGATTATTAATGAGCAGAGAATGTCTCTACCCTGCATGTATG ACCAATGTAAACACATGCTGTTTGTCTCCTCTGAATTACAAAGATTGCAGGT ATCCTATGAAGAGTATCTCTGTATGAAAACCTTACTGCTTCTCTCCTCAGTT CCTAAGGAAGGTCTGAAGAGCCAAGAGTTATTTGATGAGATTCGAATGACT TATATCAAAGAGCTAGGAAAAGCCATCGTCAAAAGGGAAGGGAACTCCAG TCAGAACTGGCAACGGTTTTACCAACTGACAAAGCTTCTGGACTCCATGCA TGAGGTGGTTGAGAATCTCCTTACCTACTGCTTCCAGACATTTTTGGATAAG ACCATGAGTATTGAATTCCCAGAGATGTTAGCTGAAATCATCACTAATCAG ATACCAAAATATTCAAATGGAAATATCAAAAAGCTTCTGTTTCATCAAAAA TGACTGACCTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC Secuencia genómica dyad usada para clonar como un fragmento Salí en pBS(KS)::Dyad (5807 pb) (SEQ ID NO: 28) GTCGACTTTTTGTTTGACCAGTGTATTTGGTTTGACTTCAGATTTGGCAAGT ACGAAGÍCTTATGCGCTTTTGCAATCGAAACAAGGGAAAAATCTGTACTTTG TTAGCTGCGTGACTTGAGCTCTTTGGTCCGGAGACGGTAGAAGACGACAAA GCACTGACCTTTCATCTCTCGGCGATCGAAAAAATCACTCTCTTTCCTCATC AGACCCGACCCGTTATGAAGGTATCCAGACCCGTTTATTTTGATCCATCTCA TAGTCGGATCCCCAAAAAAATTCAGCTTAGATTGGCCCATTTAGGCCCGTTT ACAGTTTTTTACTTTTT CTTAATTrATCTTTTTAACATCTTA TTGACTCAACAAAAAAATATAACTTAAATGTATTGTTGACTGTTTTTGATAA TTAAGAAAAAAATATTTTTAAATTATTAAAAATATTrGTTGACTCAACAAAA AAATATAACTTAAATGTATTGGGCAAATAATCATGGTCATAAGTCCTCAAG CTTATTATTTGTTTTGATTGGTTTAAATACTTTATAAAAAAAATATCAATTAT ATCATGTTATTACGTAAATTAAGCTTTTTGATTTTAAAAAAGCTTCAGCTCA ATAAAGAAAAACAGATTCAGTTATCATTGGAGTATAAAATTGGTCGATACA TTAGAGACATTAATCCTTACATCATAAACAATTTAATGTGAATAAAACATC ATAAATCACATATCATTATCCGAAAATAATCATATGTAAGAATAATCACTG TGACAAAAAAAAAAAACAATTCCTCACGTGTGTAGTCGGTCCCCACTCTAG TAGCAGTAGCTTAATGATGCCTTCTCCGCACGTGTAACACGAAATTTATTCG CTACGGCCAATTACATTAACCTTCAGGTCTTATCACCGTTAAATTTTCAAAA TGACACACGTGGCATCAATCCGTAATATCACTACGTCTGCTTTCAATCTTTC ATTGTAGATGATTTCGTACACCAATTTCCGCGAACGTTTACAGTTTAGATAC AGTTTGAGGGCAAATCTGTCAATATACGCCAACTTGCTGCGAAAGCAATAT AGTCACGTGCCGTGCACACGCATATAAGACTCACACACTCACACCACTCTC TCTCTCTCTCTAACCTCATATATAAAGCCACCTCCCAGATTCATTAAATGCG ACATTTCAAAACTTTTCTTTTTGCTGTCTTCCCCATAAGCTCTCTGCTGATTA AAAAGATTTT TGGTATAAAACAAAATTCTTCAAATATTTCTGGGT TATGT TTTCTCTCTATTTCTCAGAAATGCTTTAATTTCTCCATCCGCGTCCATGTTTT TTTTTCTCCGTTGCTGATTTTGATTTTTTTAATCCAGTGAAAAGG AAGATTATCGAGAGCAAAAATCATGAGTGTAAGATCTCTCTCGCTCTCAGA TTTTATTTTT TTCGCTGTGATATAAATGGCTCAGTCACTATCAGTCTCATGA TGAGAAAAATAAAACTCATCACCGCTTGATTCTGTTTCCTTAGTGTCTCCCA CGCGCGTACCAGAAAGCGCGTGTGTGTTTCTTGTTATACTCGCAGAGTCAG GTTTTTTCAAATATATTCTCTCCAGGCAGCAGCAACAACAACAAACCGATTT TTTCATTATTCCTTATAACAATTTTTGATTCTCCAGAAAAAAAATATCTCTCT TAGT TTTCTCTTGTTCTACAGAGTACGATGTTCGTGAAACGGAATCCGATT AGAGAAACCACCGCCGGGAAAATCT ITCGCCGTCGTCACCGACTTTGAAT GGTAAACTACTGAAGCTATAGTTTCTTCGTTTTTGTTGATTTTCTCGCTTCTC TTCTAATTTCTGAATTTTTGGTTTGGGTTrGTTCTTACAGTTGCAGTCGCGCA TATAAGAGCTGGATCTTATTACGAAATCGATGCTTCGATTCTTCCTCAGAGA TCGCCGGAAAATCTTAAATCGATTAGAGTCGTCATGGTATTCACTCGATTCT CTGCTTTTTTCACCTTTTATTATAGACAGATCTCGTTTTTTGTTGT^ GGTTTTCGAGTGATTTTTTAAGGTTTATTGATGCAGGTGAGCAAAATCACGG CGAGTGACGTGTCTCTCCGGTACCCAAGCATGTTTTCACTCCGATCGCATTT CGATTACAGTAGGATGAACCGGAATAAACCGATGAAGAAGAGGAGTGGTG GTGGTCTTCTTCCTGTTTTCGACGAGAGTCATGTGATGGCTTCGGAGCTAGC TGGAGACTTGCTTTACAGAAGAATCGCACCTCATGAACTTTCTATGAATAG AAATTCCTGGGGTTTCTGGGTTTCTAGTTCTTCTCGCAGGAACAAATTTCCA AGAAGGGAGGTGGTTTCTCAACCGGCGTACAATACTCGTCTCTGTCGCGCT GCTTCACCGGAGGGAAAGTGCTCGTCTGAGCTGAAATCGGGAGGGATGATC AAGTGGGGAAGGAGATTGCGTGTGCAGTATCAGAGTCGGCATATTGATACT AGGAAGAATAAGGAAGGTGAGGAGAGTTCTAGAGTGAAGGATGAAGTTTA CAAAGAAGAAGAGATGGAGAAAGAAGAGGATGATGATGATGGGAATGAA ATAGGAGGCACTAAACAAGAGGCAAAGGAGATAACTAATGGAAATCGTAA GAGAAAGCTGATTGAATCAAGTAGTGAGAGAGTGGGTGAGAAAGCTAAGG TTTATGATCAGAAGAAGGAAACTCAAATTGTGGTTTATAAGAGGAAATCAG AGAGGAAGTTCATTGATAGATGGTCTGTTGAGAGGTAAAATGCATAAAAAT TAACGAATTTTATGATCTCTGAATTTGGATTTTCCTTGGTTCTATTGATTGAT TGTGGTTAATTTTGAAGGTACAAACTAGCTGAGAGGAACATGTTAAAAGTG ATGAAGGAGAAGAATGCAGTGTTTGGCAACTCCATACTCAGGCCAGAGTTG AGGTCAGAAGCAAGGAAGCTGATTGGTGACACAGGTCTATTGGATCATCTG CTTAAGCACATGGCTGGTAAGGTGGCTGCTGGAGGTCAAGATAGGTTTATG AGAAAGCACAATGCAGATGGGGCAATGGAGTATTGGTTGGAGAGTTCTGAT TTGATTCACATAAGGAAAGAAGCAGGAGTTAAAGATCCTTACTGGACTCCT CCACCTGGTTGGAAGCT GGTGACAACCCTTCTCAAGATCCTGTCTGCGCTG GAGAAATCCGTGACATCAGAGAAGAATTAGCTAGCCTGAAAAGGTAGAAA AGTTATTGAATTGGTTATACGATCATCTCCCT TAGTTGTCTTATTGCAATTT TAACTCATGTCTGTCTTGGTCTTGAGAAGAGAATTGAAGAAACTTGCGTCA AAGAAGGAAGAGGAGGAGCTTGTTATCATGACTACGCCTAATTCTTGTGTT ACTAGTCAGAATGATAATCTGATGACTCCAGCAAAGGTAAGAGCTCGAAAC AATAGCTGAGGCCTCTCTCTTGTGAAAATGTTTTATGCTACTTTGTGAACAT CTCTGCTGCTTTTTCTTAGGAAATCTACGCTGATCTGCTGAAAAAGAAATAC AAAATTGAGGACCAGCTAGTGATTATTGGAGAAACCTTGCGTAAAATGGAG GTATGTATATCCCTAGATTGAGTTTCCAAGTAGACACAAACCCTTACTTAAA ATGTAAAATCTTGATTTAGTAACTATCACAAGTAGTCATAGGAAACTCCCTT GGAGGATAACAGTGAACCATGTAAAATGGGCCCATTTAGCGTATGTGATAA ATGATTTCCTCTGTCTCTATGAGAGACCACTTTGCTGATAGTCGAATAATGA TGAAACATTTGTGTTACTATAAATGCAAATATTGCAGGAAGACATGGGATG GCTTAAGAAAACAGTGGACGAGAACTATCCTAAAAAGCCAGACTCAACAG AGACACCTTTGCTACTAGAGGATTCACCACCAATACAGACACTAGAAGGAG AAGTGAAGGTGGTGAACAAGGGTAACCAAATCACAGAGTCACCTCAAAAC AGAGAAAAAGGAAGGAAGCATGATCAACAAGAAAGATCACCACTTTCACT AATAAGCAACACTGGTTTCAGAATCTGCAGGCCTGTGGGGATGTTCGCATG GCCCCAATTGCCTGCTCTTGCTGCTGCTACTGATACTAATGCTTCTTCGCCA AGTCACAGACAAGCCTACCCATCCCCTTTTCCAGTCAAGCCACTTGCAGCT AAGCGTCCTCTTGGCTTGACGTTTCCCTTCACCATCATACCCGAAGAAGCTC CCAAGAATCTCTTCAACG TTGAAGTTGTCACTGGAAACTGATGCATCAGA TCTTACTTTCCCTACAAGTAAGCTGATGTGAACTGGTAAGGTCTCTTCCATG AAATATATAATAACTTACAAGCGAGCAGGTATTTAAAAGTACCACTTATAT TTATATAAGGAACTATATTTATGGGAATAATTTGGCAACTTTTTGAAATTAT TCCTCTTTAATTTAGGGATTTTACGTCTCTGGTTAT AATTATATATAGAGA GAGATGATTTGAAATAGAGAGGCT ATCATAGGAATATATTCTTTTGAAAG ACAGGGATCATCATATTCTGTATTACTGAACAATTTCTATAATGATACAGTT ATATATATATATATATACTTATTATTCAATTCCTAGCGCTTTTGATTTTAAAT ATATTATTTTCGTGTAGTTGATTAATTTTGAAAAACTTGTATTACGCATATG AATTATGTCCCGTTGATCTATAAAAATCATATTTTGCGATTAAGCACAAACT ATAAAAGTATGTTTAAGTTCCTGCGGGTTGACCAGTTTCACTTTAAAATCTT GGTCTTTGGGATGAGTTTGCCGATAAATTTTGTGACTTATGGTTATCTAATA ATACGAATGTTATACTTTCCAAAATTTTGAAAAAAACAATATGAATACTTTAT TATTATCTTTITCCTTCCATTTCTCTTCCCGCGTTTTGTTGTTCGACCGATCTT GTAGTACATGTGTTCTAATTTGAACGTCGAGAACCATTAAAGAAGGAAGAA AGAAAAGAAAAAAAAAAACTTTTTTCTCATTTCGAGATTTCCTAACCATTTG GTGGTGCAGGTTTAAGTTTCGCTCGCTCTCCTAAAACCAAACGTCCAAACC CGTTCTCTAGACTAGTTCTGCTGCGAAACACGACACACACCAAGTCACCAA " TATTACTTGAATCCACGTCAAATAAACAATGGTCATTCAATATGGTTAATGC AACACTCGAGTAACTTTATTITCAAAGAAATTTGCACAAAGTCATGTTATGA TATGGTGTATAATATTTGTGTATATATCCGGCCAAAAAACATAACAAGTTTT TTATAAAA L^AAAAATTAATTATATATCTAAAATATAGAATAGCTAGTAAT AAAACIAGTGAGAAACAAATTTAAAACAAATl'AAGCAACTATGTTATTTGC CAAATTGACAATTTl'AAATATTATGGCGTATTITAAAAAAAATTAGGAGCCA CITGTGATTTATTTGTATCAACTAGTAAATTTTAAACATAAAAATCAT TAT AAATATAAATAAATATl'ATCATATTTATGTAGAAAGAGTCTCATCAGTCTG ATAGl'CAAirACl GTGCGCAAAGAAATTTGACGAAAGGGGTTACAAAAAA ATGGCCAGCACAGCATCATCATGTCCCCGACCTTATATTATAAGATTTGTAT ATTTTATCCATAAATTGTATATAACCGTCGAC EJEMPLO 7 Semilla autocruzada del mutante dyad que son triploides (3n) contienen una contribución diploide (2n) del gameto femenino Se llevaron a cabo cruzas recíprocas entre plantas de Arabidopsis de tipo silvestre tetraploides (4n) y (2n). En ambos casos, las semillas que se produjeron son triploides. Sin embargo, cuando el progenitor masculino fue tetraploide y el progenitor femenino fue diploide, las semillas que se produjeron fueron grandes, mientras que cuando el progenitor masculino fue diploide y el progenitor femenino fue tetraploide las semillas se encogieron. Estos resultados se ilustran en las figuras 10?-10? y los pesos de 100 semillas para cada categoría de semilla se muestran en el cuadro 2.

CUADRO 2 Peso de 100 semillas obtenidas de plantas de varias cruzas Peso de la Categoría de la semilla semilla en uo Semillas Diploid Columbia WT 2142 Tetraploid Landsberg erecta 3352 Diploid Columbia x Tetraploid La-er pg (exceso paterno) 3004 Tetraploid La-er x Diploid Columbia (exceso materno) 1302 Semillas de categoría más grande dyad 3453 Semillas de categoría normal dyad 2012 Semillas de categoría encogida dyad 1379 Estos hallazgos reproducen lo que se conoce en la técnica anterior (Scott RJ et al., Development 125, 3329-3341 , 1998). Sin estar limitado por alguna teoría de mecanismo, la no equivalencia de los genomas paterno y materno en la regulación de desarrollo de semillas se ha explicado de conformidad con la teoría de conflicto progenitor-descendiente (Haig D. y Westoby M., Am. Nat. Vol. 134: 147-155, 1989) como se produce a partir de la competencia para asignación de recursos entre el progenitor materno que limita el crecimiento del embrión favoreciendo la distribución equitativa de recursos entre todas las semillas, y cada embrión cuya condición es incrementada acumulando mayores recursos. De conformidad con Haig D. y Westoby M., Am. Nat. Vol. 1 34: 147-155, 1989, genes improntados que son maternalmente expresados en el embrión actuarían para limitar el crecimiento del embrión mientras que los genes paternalmente expresados favorecerían el crecimiento del embrión. Por lo tanto, las semillas que contienen un equivalente de genoma paterno adicional serían más grandes que las normales debido a un exceso de dosis de productos de gen que promueven el crecimiento del embrión mientras las semillas que contienen un genoma materno adicional equivalente sería más pequeño que el normal debido a un exceso de dosis de productos de gen que limitan el crecimiento del embrión.

Para enfrentar las contribuciones materna y progenitora en semillas autocruzadas del mutante dyad las semillas fueron analizadas con respecto al tamaño. Las semillas autocruzadas obtenidas de plantas mutantes dyad fueron heterogéneas en tamaño y se clasificaron en cualquiera de tres categorías: grande, normal y encogida como se ilustra en las figuras 10A-10D.

La distribución de clase de tamaño de 7 plantas mutantes dyad individuales se muestra a continuación: CUADRO 3 Distribución de clase de tamaño para semillas de plantas mutantes dyad Planta No. N L S 1 . 18 7 79 2. 44 26 64 3. 25 25 36 4. 47 21 33 5. 46 5 52 6. 58 16 98 7. 16 6 37 Total 254 106 399 Las semillas de cada clase nueva se muestrearon de plantas múltiples, germinadas y se hicieron crecer en las plantas. La ploidía de cada planta se determinó por conteos cromosómicos en preparaciones meióticas. Los resultados se indican en el cuadro 4 siguiente: CUADRO 4 Ploidía de plantas de cada clase de semilla en mutantes dyad autocruzados Los números entre paréntesis indican el porcentaje de plantas totales examinadas en cada categoría Estos datos muestran que la mayoría de los triploides se encogen en tamaño y se constituye la porción mayor de la categoría encogida de semilla. La observación que la mayoría de los triploides se encogen indica que surgen a partir de un exceso de contribución materna (2n) y no de un exceso de contribución paterna que por lo tanto sería 1 n en los triploides. Junto con el hallazgo del ejemplo 4 que todos los triploides retienen heterocigocidad paterna, estos resultados indican que la retención de heterocigocidad se obtiene del progenitor femenino, y por lo tanto que los triploides surgen a partir de un gameto femenino nop reducido que retiene heterocigocidad paterna. Para confirmar qué triploides en dyad surgen de una contribución femenina 2n, se cruzó un mutante dyad como un femenino con la línea ETC60 (tipo silvestre para DYAD) como un masculino para dar semillas F1 . La línea ETC60 (descrita en la solicitud de patente de E.U.A. No. 10/857,539) porta una sola copia de un transposón Ds que porta un gen de resistencia a la kanamicina. Siguiendo la segregación de resistencia a la kanamicina después de la cruza de F1 a plantas dipoides de tipo silvestre, es posible determinar la contribución de ploidía del gameto masculino en la planta F1 . Las semillas de la primera cruza se hicieron germinar y las plántulas se~transf¡rieron~a suelo. Seis plantas F1 se probaron para la presencia del gen de resistencia a la kanamicina usando iniciadores específicos de gen de resistencia a la kanamicina (KanF SEQ ID NO: 49 y KanR SEQ ID NO: 50) así como para una copia del transposón en ETC60 usando un iniciador Ds5-2 específico de transposón (SEQ ID NO: 45) en combinación con un iniciador específico de gen GLTF (SEQ ID NO:46). Todas las seis plantas fueron positivas para el elemento de Ds que porta resistencia a la kanamicina y también fueron tan fértiles como se esperaría para plantas cruzadas que contienen una copia de tipo silvestre de DYAD. La ploidía de las seis plantas se examinaron usando preparaciones de cromosomas meióticos. Se encontró que 3 plantas fueron triploides con 15 cromosomas, 2 plantas tuvieron 16 cromosomas, y 1 tuvo 7 cromosomas. Estos resultados sugieren la probabilidad de que los gametos femeninos surjan de esporas no reducidas/hiperdiploides. La fertilización de los gametos femeninos no reducidos por un polen haploide daría (casi) triploides que son simplex para el gen de resistencia a la kanamicina (Kkk).

Alternativamente, los triploides podrían surgir de la fertilización de un gameto femenino haploide por un gameto masculino no reducido o dos gametos masculinos reducidos en cuyo caso los triploides serían dúplex para el gen de resistencia a la kanamicina (KKk). Si una planta en condición simplex se cruza con una planta de tipo silvestre que no porta resistencia a la kanamicina entonces la relación de segregación para resistencia a la kanamicina con respecto a susceptibilidad en las plantas resultantes será 1 :1. Sin embargo, si una planta en condición dúplex se cruza con una planta de tipo silvestre, entonces la relación de segregación se esperaría que fuera 5:1. Las cruzas se llevaron a cabo para dos de las plantas triploides obtenidas anteriormente para tipo silvestre y las semillas obtenidas se calificaron para segregación de resistencia a la kanamicina. Los resultados mostrados en el cuadro 5 indican 1 :1 de segregación para resistencia a la kanamicina descartando polispermia, y muestran que los triploides surgen de gametos femeninos no reducidos.

CUADRO 5 Segregación de fenotipo Kan" en cruzas * Puesto que las semillas son el resultado de una cruza de un progenitor triploide a un progenitor diploide, unas cuantas semillas no se espera que germinen debido a aneuploidía. ** La prueba de significancia para bondad de ajuste para una relación 1 :1 se calcula excluyendo semillas sin germinar. *** La prueba de significancia para bondad de ajuste para una relación 5:1 se calcula incluyendo las semillas sin germinar en la categoría KanR. Teóricamente, sólo 50% de las semillas sin germinar se deben incluir en cualquier categoría (basada en la relación de plántulas KanR y Kans obtenidas) pero a fin de incrementar el nivel de significancia que se ha incluido en el lote sin germinar entero en categoría KanR. Esto descarta que aun cuando se incluye el lote sin germinar entero en la categoría KanR la bondad de ajuste para la relación 5:1 no es significativa y por lo tanto soporta fuertemente una condición que favorece sólo la relación 1 :1. S Significativo para prueba de ?2 que indica que no sigue la relación dada NS No significativo para prueba ?2 que indica que sigue la relación dada.

EJEMPLO 8 El gen DYAD secuencia codificadora de álamo blanco (Populus trichocarpa) Un ejemplo adicional de un gen DYAD de álamo blanco se encuentra en http://www.ornl.gov/sci/ipqc. La traducción de la porción codificadora de la secuencia de ADNe provee una secuencia de aminoácidos que se compara con la secuencia de aminoácidos de la proteína DYAD de tipo silvestre de Arabidopsis thaliana usando el programa Clustal W en la figura 1 1 . AtDyad homólogo Populus trichocarpa como en http://www.ornl.gov/sci/ipqc Región genómica (SEQ ID NO: 24) EXON INTRON Incluyendo 2444 pb hacia el extremo 5' de la primera ATG cattcgttatggctaacggagtcactgggccttacatgcatccacagaccaggtgccggagtgctggtgcaaaaccaatttati gaamctgaacaattggagacgaaataaatgtctttacttcttcaaacccttgatttaaaagtaaatgtattatct ttattgatt^ attcaattcctagaattagtagcltgaagaamattaaaütatca^ atctcaatttacttataaattgaagaataccttcttaaaaataaaalaaaa gtgtggtgtgggtacagagaagaatattaatatacccgagctggaactagaaggtcacccgccatatccaatgaggcaatcc cgaacctetcccacaagc^gcatccgccacgíggtcagaagctacagaggttatgacctggctaaacgattggctaccagg aaccaatggct x tcaaaggccatagataaataaatotaagagccagtttctttagctctcaactctctcaaccatctatacaaca tttccagaggcaacaagactcgggaggggtaaaacggtaaaatgggagacgtiactgtagaggagggagggggggacca gaatccagglcacgtgaggcgcatcccgíctggtaataatcattactatttttttctctctttatagcagaaatgcaccaccatcgtt ggtttcacaacagaaaaaactccctcccccttctctctgcgttttcte^^ tagcttttgaaacagaaattgaaaaaaaaaggtctcgttttatatttatttttgctgUtaa ttaattaatgctggtg(ag«actctttggctggttgaatcggtgctggtactggaiaaaacatctcaaaaggaatgacccat1tgc atgtcattaagggglgcatgtgtttgaatgaggaatt aaacaagicctgacatgagtatgcatmcctgtggttaacaga†^ gttgtttggctcctggaagattctcaaaattgagatncaagctcaaaagtgtttttgatacacmccaagcttcatgatctttaattt accagtgg^gtttttcctagtta^gtattttaaaggtcgcataatgatcggtagta^^ cttgttttcagtctctgcgtaccaacaatatagagattctcctggctgtgcaagaatcactatatctatctatctatctatcaggcctt aaccttgctttcttttctgatcaatccttgtgtttatgattgattaatgagato^ tgattttccctttctttaatcatgtccalatatgtttattcgccggggggccgggaaggacgagaggtacgactagciaglatlaac ttgtgcagttgaaactgmctctatgtgcagaagatgactacxiatggagctggttgatgttgcagtgatagaccacccatcggtg agtttgtlctc1cttctcctcaatcc<¾ctcccact(rt8actc8^ cgtaacccacgcgctcttttatctctcaaatcaagtcgctgattactagtctactaaagttttcaaatactcaaccgaattcxtaatct ttg ctcacgctcacacacataccaaatccacacgcgcgtcTCctacaatttgttacgcaaatcaaaccccgctctacacatcct tggtgcccaagtaagtgaaatgatgattttacataacaaaaa«:acataattatte^^ tcgagtaTtgcacacgaggggcttatgcatacataaatcclcaccccttttaaaggagaagggcaatacag gattttggtt:gtg cttgtgaaaatgcaggaaataaaaaggaggcagaactccgaggacgccgatagaaggctttttttgggcggacattgcctgc atcacccaacatttaccacagcaccaccatttggtaatatttgtaacacacacgcacacacgcccgagcaacaaatctctccct cttttttatcccttttgtttcctctctctctctct^ gctagrtctactcctatagctcacagtactgcaagtacgtagtaciart^ GTTTTCCA CGCTAA GA G CTCTTGTTTCTGA TCAAAA TAA GGAA TTCTCTGA TT A CTCTTTGTTTTCCA TGCTTAA TAA TGAA GA CCCA GCTGA GCA TA TTAAA GTG A GCTCTTTTTA TGAA GTTGA TCA CTCCAAGCTGCCTCA TAAA TCCCCTGA TCA A CTCAA CAAAA CCCGGGTTGTGA rCOTATl TTTATAC AATTCAA CAATATT CTTAAACCCGGCTCAACATTT!TrTCTCT GnTCTCCTTGA ATAA ATATCTCAGGTGtd TGAAAA GA CCA GGA TGA GAGTC TCGCTGA GGTTTCCAA GCA TCAATTCTCTAA GA TGTTA CTTCAA TGA GA TTGA A GCTA TTAA TTA CAA GAAA GA CATGAAAA CGAA GAA GCA GCA GCTA CCA GCA TTCGA CGAGAAA TACA TTA TA GGA TCA GAA GTTGCA GGGGAA GCTCTTTA TA GGA GAA TCTCTTCTCAA GAAA TGGCA GACAAGA GTTA CTCA TGGA GTTTCTG GA TGGTTAAA CA TCCTTCGGTTTCA CCTCGAAAA GTGTCA TA CCCA CCTA CAA GTA CTCA TGTTAA TA/U TTTGTIGGTGCAA GGAA GGTGTCTCTCA TGTCTGA G CTCAACGGGA CA GGCA TGGTTAAGTGGGGTCA GCGCCGGCA GGTCA GGTTC TTGGCTAAA CA CGTAGA GGA TAAA CGTGAAA TA GTGA fGCA TCGAA GGA TT TGA TTAAAA GCGAA GAA GA GAAA GA CA GTGA TGGTA GTGA TGA TGA CA CA GA CGA TGA GGACGA GGA GGA GGTCGA TGTTAA GTTA GTA GTAAACAA GTCAA GT GAA GCTAAAA GGAAA TTA CGTAA GA GAAA GTGTCAA GGTGGGTCTGGTA TTA GCAAA TTA TCA CCAAAAAA GAAAA GGCGTAAAA TTGAAAA GAA GA i CCA GA T TGTGGTCTA TA GGCAAAA GAA GAA CAAA CTCA TCAAGAATTGTATTGACAGA T GGTCTGCGGGGAGGTAAlAAAGCTrnATTAGTTAATAAA TAAATTCAGA TCGTCAl TGlOTTAATATATTnTITGATTAGTGTCTATATGTAGCTAGCTA ATT GG i TGGGTGATTTCTGTGA¾GG AAAGGTAATGAAAGAGCAAAA TGCTGTGTTTCGA CGCCCAA ?GG??? GGCCA GAATTGA GAGCTGA GGCACGGAA GTTGA TTGGGGA TA CTGGGCTGTTA GA CC ACTTGTTGAA GCA TA TGTCA GGGAA GGTGGCTCCGGGA GGA GAA GA GAGA TT CA GAA GGA GGCA TAA CGCA GA TGGA GCAA TGGA GTA TTGGCTGGA GAA GGC TGA TTTGGTTGA TA TCA GGAAA GA G C1 GGTGTGCA GGA TCCTTA TTGGA CA CCTCCA CCTGGGTG GAAA CCTGGTGA TAA TCCTA GTCA GGA TCCA GJ' TTGTG CTA GA GA GA TCAA GGAA CTCA GA GAA GAAA TTGCTAAAA TTAAA GGGTACTG GTCCTTCTGri TAACTAGGATTGATTGTCTTTCAATTTTGTGTGGTCTTTTA GCTTGTrAGTGCTGITGATCTGGTAATGCCCACCAGTTTTTCTCTGTTACTCT TGGGGTGAATTGTGTGCGCTACrGATTCCATCTCTCGCGTATGTGTTGTTCT TATGGGGGGCAGGGAGA TGGA GGCAA TGGTGTCTAAAAAA CA CGGGGA GGA A TTA GCAA TGGTGGCA GCA CCGAA TTA TTCTCCTA CAA GTCA GGA CA TGGA G CA TGA CAA CTTCTTAA TTCCACTGAA GGT A ATAGATATG AAAGTTTG ACCAG AmTTGGACTGACCCAAGTTCTrCTCT GACAAl CATGTACTATTTTTGCA GGAAATGTACA TTGA TTTGGTGAA TAA GAAGGTAAA GA TGGA GGAACAACTA AA GGAAA TTTCA GAA TCTTTGTA TGGGA TGAA GOTAGGAGAGCATGAGAATT CTTCCTTTAATAATTATCATTTTCTTTTCAAlTGAAGTGTGTAAGATTrGATA TGAATGATTCTTTCCACGTTATGACGTTCTGGGTGCTACTAGTGTATATAAG ATTCGTTCAAATAAGAAATTCCTGGGTGATTGCATGATCCACATCATTGAA AGATGGTAGTAACAAACTGACCATCTGATGCATGTATCTATTCTAGATAAT AAGTTGATGCATAAATTGCCATGAAACCATlTGAGAAGCTGTTATA r AG AGGC^GTGATATGGGAGTG^ GCTTA GCCAGAC AGATTTTTGCAATTATT^, AGTTCAATrrAAAGCTCAAAATCCCACATrAAATAGTrTCATAAATGATGA ATGTTCTG CAGTGGATTTCCGTTGTCCTTGGTAGTACT'rTCTAATCTGGAC AGCATTTAT'A TGTAACAATGATACGCTTAATGATGATCrrAGGATGAATTG G rAGTTATGAATTTAGTTGTCC rAC \.GTGCAACGGG<3AGGCTTGGCTGCA TTTATTGTTGTAGCATTTAATTATGCATIOAACGCGGTCATTATTGTGATGA TGGAAATA TTTAATTG ?? GCAGGAA GAAA TGGA GAA GCTAAAAACCA GA GT GGA GAAA-JGAAA GAGAGCA GAA TCAA CTGAAAA GCCA GCTTTA TTAATGGGC TCAA CA GA GTCAA TCA CGCCA GCA GGAA CTGGAA GAAA GGGGAAA GGA GTA ATGCA TCA GGAAAAA GAA GCAACGGTTTTA GGGGAA TCAGCACAAGAACAA T GCAA G TCA TCA TCA GGAGGCA TCA TA GCA CCAA GAA CA GAA TCA CCA GCA CC AA CGGA GGACA GGGCA GCAAA GA TA GA GA GGCTGAAAA GCGGGTTTA GAA T A TGCAA GCCCCA GGGAA GTTTCCTGTGGCCGGA TA TGA CTA CCTTAA CCCCT CA CCCTCA GGTTGTGGTCCTA CTA GAA GA CCTCA TTGCGGTA CAAA CA CCTC CCTCA GTGTCCTCCA CTA CA CCAAAA CAA TCTCA CTTCCTCTTTGCTCCTCCA TCTCAAA CCCATA CACCCCA CCGTA CTTTCCCTGTGAA GCCA TTA GCTGA GA G AA GGCCTGTCA CCA TTCCCCA i TCCA CA GCTGCCA CGA CTCCAA CCA GCTGT CCTCCCCTTGA TCAAA TGA CTCA CTCCCA GTA TGA GAA TA GCA GCA TTTCCA C TTCTA CTA CCA TCA CCA CCA CTA CCAAAA CCCCTCTCA TCAA CCTTAA TGA GC CA CTGAA TA CCAA TCAAA CTGA TGA TTA TGGA TTGTTTTA TGGGTCTCA GTCT CA TGCTGAA GCCTCTCCTCA CCCTGTCA CTTA CCAA A GAA GA CA TCA TCAAAA TGTGA CCA CCA GTA TTGCCA TGCCAA G7OTATGTGTACTTATC AAATCfCAA TTTCAATrCATACCCATATTTTAGTGATACTATCATAGTATACAAGTTGACT CCTrTTTCATTTTCTGTATGTTrTACACAG TTGGGA CCCACAAA GAAA GGGA T GA TGA GCCAA TGGGAGGAAGGTGA TCGGA GAAAA GGAA TGA TAA GGTA CTG TGA GCA GTGTGA GCA GCAA CA GGGA TGCTCCTCTGCCTCTTCCA TTGCA TCT TCTTCCTTGCCAA TGGGAAA GGGGA CTTGGTTGGCTCTGGCTA CTTCTAÁGG CTTCCGTGGA GCA CAAA TCTAAAA GGGGTTAA AC AATCTAT AATAATA ATAG TAGTAGTAA AA GGCTAGTTTATTATGCTAGAGTAGTTATTAGTTAAACCC CTGG^ -ACATTGATTAGGTTGGGTrj"CACTTAATGCrrrrCCCTGTCrrTG GGCAAGGAATCTTCTTAACATAG'1'TATATACATATGGCATATACAAGGCAC .AAAGAGCTTTTAGCGTATAGGAAAA Transcripción/CDS como en la base de datos (2493 pb) (SEQ ID : 25) atgtcgttttccacgctaagagctcttgtttctgatca^ ccagctgagcalattaaagígagctctttttatgaag tgatcactccaagCi gcctcataaatcccctgatcaactcaacaaaac ccgggttgtgatggtgaatgaaaagaccaggatgagagtctcgctgaggtttccaagcatcaattctctaagatgttacttcaat gagattgaagcMíaattacaagaaagacatgaaaacgaagaagcagcagctaccagcattcgacgagaaataoattatag gatcagaagttgcaggggaagctctttataggag-iatctcttctcaagaaatggcagacaagagttactcatggagmc ggat ggttaaacatccttcggtttcacctcgaaaagtgteatacccacrt^ tgtctctcatgtctgagctcaacgggacaggcatggttaagtggggtcagcgccggcaggtcaggttcttggctaaacacgta gaggataaacgtgaaatagtgattgcatcgaaggatttgattaaaagcgaagaagagaaagacagtgatggtagtgatgatg acacagacgatgaggacgaggaggaggtcgatgttaagttagtagtaaacaagtcaagtgaagctaaaaggaaattacgta agagaaagtgtcaaggtgggtctggtattagcaaattatcaccaaaaaagaaaaggcgtaaaattgaaaagaagaaccagat tgtggíc aggcaaaagaagaacaaactcatcaagaattctattgacagatggtctgcggggaggtataaattggctgagg aaaacatgttuaaggtaatgaaagagcaaaatgtrtgtgtttcgacgcccaatttlaaggccagaattgagagctgaggcacgg aagttgattggggatactgggctgttagaccacttgttgaagcatatgtcagggaaggtggctccgggaggagaagagagat tcagaaggaggcataacgcagatggagcaatggagtattggctggagaaggctgat tggltgatatcaggaaagaggctg gtgtgcaggatccttattggacacctccacctgggtggaaacctgg gataatcctagtcaggatccagtttgígctagagaga tcaaggaactcagagaagaaattgctaaaaítaaaggggagatggaggcaatggtgtctaaaaaacacggggaggaattag caatggtggcagcaccgaattattctcctacaagtcaggacatggag atgacaacttcttaattccactgaaggaaatgtacat tgatttggtgaataagaaggtaaagatggaggaacaactaaaggaaatttcagaatctttgtatgggutgaaggaagaaatg agaagctaaaa ccagagtggagaaatcaaacagagcagaatcaactgaaaagccagctttattaatgggctcaacagagt caatcacgccagcaggaactggaagaaaggggaaaggagtaatgcatcaggaaaaagaagcaacggttttaggggaatc agcacaagaacaatgcaagtcatcatcaggaggcatcatagcaccaagaacagaatcaccagcaccaacggaggacagg gcag<¾aagatagagaggctgaaaagcgggtttagaa gcaagccccagggaagtttcctgtggccggatatgactacct taacccctcacccrtcaggttgtggtcctactagaagacctcattgcggíacaaacacctccctcagtgtcctccactacaccaa aacaatctcacttcctcttlgctcctccatctcaaacccatacac ccacxigtactttccctgtgaagccattagctgagagaagg cctgtcaccattccccaatccacagctgccacgactccaaccagctgtcctccccttgatcaaatgactcactcccagtatgag aatagcagcatttccacttctactaccatcaccaccactaccaaaacccctctcatcaaccttaatgagccactgaataccaalc aaactgatgat ggattgttttatgggtctcagtctcatgctgaagc^ aaaatgtgaccaccagtattgccatgccaagíttgggacccacaaagaaagggatgatgagccaatgggaggaaggtgatc ggagaaaaggaatgataaggtactgtgagcagtgtgagcagcaacagggatgctcctctgcctctlcx;attgcatcttcttcctl gccaatgggaaaggggacttggltggctctggctacttctaaggcttccgtggagcacaaatctaaaaggggttaa Secuencia de proteína como en la base de datos (830aa) (SEQ ID NO: 26) >eugene3.00030791 [Poptrl :554158] MSFSTLRALVSDQNKEFSDYSLFSMLN EDPAEfflKVSSFYEVDHS LPHKSPD QI^KTCVVMVN¾KTl¾IvmVSXRFPS^ FDEK^TIGSFA^GEALYRRISSQEMADKSYSWSFWMVra^^ ITVNKFVGARKVSLMSELNGTGMV^ KSEEEKDS GSDDDTDDEDEEEVDVKLW KSSEAKRKLRKRKCQGGSGIS L SPKKKRR- íKKNQrVVYRQKKmLlKNSmRW NAVFRRPILRPELRAEAJ IQJGDTGLLDHLLIÜ^SGKVAPGGEERPRRRHNAD GAMEY^XEI<A LVDIRKIAGVQDPYWTPPPG KPGDNPSQDPVCARE1KELR EEIAKJKGEMEAMVSKKHGEE LAM VAAPN YSPTSQDMEHDNFL P?LKEM Y1DL \T KV EEQL EISESLYG KEEMEK KTRVEKS ITPAGTGRKGKGVlvfl-IQEKEATVLGESAQEQCKSSSGGIIAPRTESPAPTEDRAA lERLKSGTOCKPQGSFL DMTTLTPHPQVVVLLEDLlAVQTlYSVSSrrPKQ SHFLFAPPSQmiTHRTFPV PLAERl^WJPQSTAA-rrPTSCPPLDQMTHSQYE NSSISTSTTITTIT TTLmLNEPLNTNQTDDYGLFYGSQSHAEASPHPVTYQllR HHQNVT SIAlVlPSLGFTKKGMMSQ EGDRRKGMTRYCEQCEQQQGCSvSASS IA SS SLPMGKGTWL AL ATS KA S VEHKSKRG * EJEMPLO 9 Identificación de polinucleótidos v polipéptidos DYAD de maíz Una búsqueda del genoma de maíz usando TBLASTN y la proteína DYAD de arroz (SEQ ID NO: 51 ) como cuestionamiento en el sitio web (www.plantgdb.org) reveló la presencia de un gen DYAD putativo dentro de una región del genoma de maíz correspondiente a los cóntigos ZmGSStucI 1 -12-04.1016.1 (SEQ ID NO:52) y ZmGSStucI 1 -12-04.1016.2 (S EQ ID NO:53). La anotación de la región usando GENSCAN (http://genes.mit.edu) en combinación con edición manual condujo a la identificación de secuencias de polipéptido de maíz putativas que pudieran ser alineadas con secuencias de polipéptido DYAD de arroz (figura 12A y figura 12B). La presente invención abarca el uso de dichas secuencias de polipéptido secuencias de polipéptido de maíz y secuencias de polinucleótido que~codif¡can dichos polipéptidos. Las secuencias de polipéptido obtenidas de Z. mays son mapeadas a las secuencias de nucleotidos del contigo como se muestra por las coordenadas de nucleótido siguientes. Las secuencias de polipéptido Zm DYAD parciales ensambladas codificadas por las secuencias de contigo también se muestran. ZmGSStucI 1 -12-04.1016.1 (SEQ ID NO: 52) Coordenadas y traducción conceptual 5335 ESKDGDPR GVKRYI 4882; 4724 EQLLCK DYSSLK 4662; 4142 EKYQRA.... QVLCLK 4080; 3805 DMCEN EVSSFK 3743; 3605 EKYEHI FLSFK 3522; 3413 DQLVVAL GLTRRDV 2865: 2697 DTSSS LATPSYC 2563; Polipéptido ensamblado de Z. mays: (SEQ ID NO:54) ESrOXjDPRHGKDR SAERYAAAEKjSLL UMRSílDAl^GAPVMRQVLREEAR inGDTGLLDFILLKI AGRVPEGSVHRFRRR NADGAMEY \nLEPAELA£VlU<: QAGVSDPYWWPPGWKPGDDVSLVAGDlLVKRQVEELTEEV GV RYffiQLL CKDDGDFGAERDYSSLKEKYQRAVRANEKLEKQVLCLKDMCENVYQ .Í GET, KKEVSSFKEKYEIIlADKNDKLEEQVn SS SFLSFKDQLVVATXLELAPSEAVP RIALFVASGEQMTGTVIQGGQDRAERKSSFRVCKPQGICFLLPSMASGMTIGRG ASSTCPAAA"rPGPGPRSTSFPSMPGLPRSSRGPVEVVAAASGLDEHV PGAI-IF STPPSASSTODAAKLQLSLPSPRSPLQPQKLFDTVTAAASGFSPQ L^IFSGLTR RJDVDTSSSSSGACGSGLLEGKRVLFDADAGGISAVGTELALATPSYC ZmGSStud 1-12-04.1016.2 (SEQ ID NO: 53) Coordenadas y traducción conceptual 774 MSLFIS 757; 574 KPQVKK PTYHA 418;315 GAFYEID SIRVVK 237; 144 VSECTN SNHAAR 1 ; Polipéptido ensamblado de Z mays: (SEQ ID NO: 55) MSLFISKPQVK YYF ia TSSSHSR^?KDDVN??STIQPRSPLSRQSLTFDAIPT YHAGAFYEroilDKLPPKSPlHLKS^ APGTGPELDERFVMSSNHAAR EJEMPLO 10 Un procedimiento general para partenogénesis Determinación de dosis de irradiación óptima: 1. Recolectar anteras de una planta progenitora masculina de la misma especie o especie relacionada que la planta progenitora femenina para usarse e irradiar con radiación ionizante en un intervalo de dosis que comprende 1 , 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100, 150, 200 krad. 2. Polinizar flores emasculadas o flores femeninas de la planta femenina que difiere del progenitor de polen irradiado para portar uno o más marcadores fenotípicos recesivos o bien con respecto a marcadores de ADN (microsatélite, CAPS o RAPD). Preferiblemente, el uso de 10-50 flores para polinización en cada dosis de radiación ionizante. 3. Recolectar semillas de flores polinizadas y semillas de acervo de flores que se polinizaron con polen que recibió la misma dosis de radiación. 4. Germinar semillas y hacer crecer a plantas para dar aproximadamente 20-100 plantas para cada dosis de irradiación. 5. La puntuación del genotipo de plantas con respecto al marcador fenotípico o marcadores de ADN y calcular la proporción de plantas que asemejan el progenitor materno. 6. Escoger una dosis que da una combinación óptima tanto de un alto porcentaje de plantas viables como alta proporción de plantas que se asemejan al progenitor materno. Inducción de partenogénesis en una planta mutante dyad: 1. Polinizar una plante mutante dyad con polen irradiado usando una dosis apropiada de radiación ionizante determinado como se describió antes. 2. Recolectar semillas. 3. Hacer germinar semillas y hacerlas crecer en plantas. Identificación de plantas partenogenéticas: 1 . Calificar a las plantas con respecto a un marcador fenotípico recesivo portado por el progenitor femenino. Las plantas que muestran el fenotipo recesivo se clasifican como partenogenéticas. Además, las plantas pueden ser calificadas para marcadores ADN aislando el ADN de tejido vegetal seguido por análisis de ADN con respecto a marcadores polimórficos. Las plantas que muestran patrones de marcador que son característicos del progenitor femenino y carecen de las bandas del marcador para el progenitor masculino se clasifican como partenogenéticas. El porcentaje de plantas partenogenéticas de un experimento de polinización por lo tanto se pueden calcular. 2. Plantas partenogenéticas se pueden examinar paras marcadores para los cuales el progenitor femenino fueron heterocigotos. Aquellas plantas que retienen heterocigocidad para todos los marcadores para lo cual el progenitor mutante dyad femenino fue heterocigotico son plantas apom ícticas. Las referencias para posibles marcadores moleculares que se pueden usar para diferentes especies de cultivo se listan a continuación: Trigo: www.gramene.org 1 . Torada et al. (2006). SSR-based linkage map with new markers using an intraspecifi'c population of common wheat. Theor Appl Genet. Abril de 2006;1 12(6):1042-51 . 2. Song et al. (2005). Development and mapping of microsatellite (SSR) markers in wheat. Theor Appl Genet. Febrero de 2005;1 10(3):550-60. Arroz: www.gramene.org 1 . Harushima et al. (1998). A high-density rice genetic linkage map with 2275 markers..." Genetics 148: 479-494. 2. Causse et al. (1994). Saturated molecular map of the rice genome based on an ¡nterspecific backcross population. Genetics. Diciembre -de-1994;138(4): 1251 -74. Maíz: Coe et al. (2002). "Access to the maize genome: an integrated physical and genetic map". Plant Physiol. 128: 9-12. www.gramene.org Cebada: www.gramene.org: Wenzl et al. (2006). A high-density consensus map of barley linking DArT markers to SSR, RFLP and STS loci and agricultural traits. BMC Genomics. 12 de agosto de 2006;7(l):206 Avena: www.gramene.org De Koeyer et al. (2004). A molecular linkage map with associated QTLs from a hulless x covered spring oat population. Theor Appl Genet. Mayo de 2004;108(7): 1285-98. Mijo aperlado: www.qramene.org An integrated genetic map and a new set of simple sequence repeat markers for pearl millet, Pennisetum glaucum. Theor Appl Genet. Noviembre de 2004;109(7): 1485-93.

Sorgo: Chittenden et al. (1994). "A detailed RFLP map of Sorghum bicolor Theor. Appl. Genet. 87: 925-933. Brassica olerácea: Bohuon et al. (1 998). "Comparison of a Brassica olerácea genetic map with the genome of Arabidopsis thaliana". Genetics 150: 393-401 . Brassica júncea: Pradhan et al. (2003). A high-density linkage map in Brassica júncea (Indian mustard) using AFLP and RFLP markers. Theor Appl Genet. Febrero de-2003; 106(4):607-14. Brassica napus: Piquemal et al. (2005). Construction of an oilseed rape (Brassica napus L.) genetic map with SSR markers. Theor Appl Genet. Noviembre de 2005; 1 1 1 (8):1514-23. Brassica rapa: Kole et al. (1997). Genetic linkage map of a Brassica rapa recombinant inbred population. J. Hered. 88:553-557 Algodón: Rong et al. (2004). "A 3347-locus genetic recombination map ..." Genetics 166: 389-417. Tomate: Zhang et al. (2002). A molecular linkage map of tomato displaying chromosomal locations of resistance gene analogs based on a Lycopersicon esculentum x Lycopersicon hirsutum cross. Genome. Febrero de 2002; 45(l): 133-46. Berenjena: Doganlar et al. (2002)A comparative genetic linkage map of eggplant {Solanum melongena) and its implications for genome evolution in the solanaceae. Genetics 161 (4):1697-71 1 Capsicum: Genome mapping in capsicum and the evolution of genome structure ¡n the solanaceae. Genetics 152(3): 1 183-202. Papa: Tanksley et al. (1992). High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. Genetics 132(4): 1 141 -1 160. Soya: Ferreira et al. (2000). Soybean genetic map of RAPD markers assigned to an existing scaffold RFLP map. J. Hered. 91 (5): 392-396. Populus: Yin et al. (2001 ). Preliminary interspecific genetic maps of the populus genome constructed from RAPD markers. Genome. Agosto de 2001 ;44(4):602-9. Tuskan et al. (2004). Characterization of microsatellites revealed by genomic sequencing of Populus trichocarpa. Canadian J. Forest Res. 34( 1 ): 85-93. Una muestra de la cepa DH5a de E. coli transformada con el plásmido pB1101 .3::DyadAGR se ha depositado en la International Depository Authority, Microbial Type Culture Collection Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC, Institute of Microbial Technology (IMTECH), Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Sector-39A, Chandigarh - 160 036, India). La muestra se depositó el 1 de diciembre de 2006 y tiene la referencia interna No. BI507. Una muestra que comprende por lo menos 2500 semillas de una población F2 de una cruza entre el mutante dyad como masculino para una planta femenina de tipo silvestre, y que segrega para el mutante dyad se ha depositado en el American Type Culture Collección (Manassas, VA20108, E.U.A.). La muestra se envió el 1 de diciembre de 2006 y tiene la referencia interna No. ISDYF2C. Una muestra que comprende por lo menos 2500 semillas (derivadas de la línea no. 33) que son homocigóticas para dyad y para la inserción de DyadAGR y que muestra fertilidad condicional en respuesta a dexametasona se ha depositado en el American Type Culture Collección (Manassas, VA 20108, E.U.A.). La muestra se envió el 1 de diciembre de 2006 y tiene la referencia interna No. 33-5DYGR. Varios artículos de la literatura periódica científica y de patentes se citan aquí. Cada uno de esos artículos se incorporan aquí por referencia en su totalidad y para todos los propósitos por dicha cita.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Una planta que comprende un genoma homocigótico para un alelo mutante dyad y que expresa condicionalmente una proteína DYAD en el núcleo de las células de la planta. 2. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la planta se vuelve condicionalmente fértil femenina. 3. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la planta se vuelve condicional para la retención de heterocigocidad paterna femenina en las semillas que produce dicha planta. 4.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el genoma comprende por lo menos una copia de un polinucleotido que codifica una proteína DYAD fusionada a un dominio de unión de ligando de receptor de hormona esteroidea. 5. - La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el dominio de unión de ligando de receptor de hormona esteroidea es un dominio de unión de ligando de receptor de hormona esteroidea de glucocorticoide. 6. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el alelo dyad es uno en el cual una proteína DYAD truncada en una posición de aminoácido de 508 a 572 se expresa. 7. - La planta de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el alelo dyad comprende un polinucleotido que tiene la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 , o tiene una secuencia de nucleotidos que hibridarán con el complemento de un polinucleotido de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de 40% de formamida, 1 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, o equivalente para el mismo. 8. - La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína DYAD es codificada por un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 4 o de SEQ ID NO: 17 o de SEQ ID NO: 23 o de SEQ ID NO: 25 o por un polinucleotido que híbrida al complemento de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de 40% de formamida, 1 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, o equivalente para el mismo. 9. - La planta de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la proteína DYAD es codificada por un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 4 o de SEQ ID NO: 17 o de SEQ ID NO: 23 o de SEQ ID NO: 25 o por un polinucleotido que híbrida al complemento de SEQ ID NO: 1 , o SEQ ID NO: 23, o SEQ ID NO: 25 bajo condiciones de 40% de formamida, 1 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, o equivalente para el mismo. 10. - Un método para hacer una semilla que retiene heterocigocidad de un progenitor femenino que comprende: i) polinizar una planta progenitora femenina que es homocigotica para dyad con polen de una planta progenitora masculina, o autocruzar dicha planta homocigótica para dyad y ii) obtener semilla de dicha planta progenitora femenina polinizada. 1 1 .- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque las semillas son de tamaño normal o son encogidas en tamaño. 12.- El método dé conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el polen usado en el paso i) ha sido irradiado. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el polen usado en el paso i) es fértil y las semillas obtenidas en el paso ii) son triploides. 14.- Un método para obtener semillas que tienen un genoma embrionario que es homocigótico para un alelo dyad y proveer una planta que es condicional para la expresión de una proteína DYAD en el núcleo de las células de dicha planta, que comprende i) autocruzar una primera planta que es heterocigótica u homocigótica para un alelo dyad y comprende una construcción de expresión que condicionalmente expresa proteína DYAD en el núcleo y seleccionar para obtener una segunda planta que es homocigótica para dyad y para la construcción de expresión; ii) obtener las semillas de la segunda planta o las semillas de una planta descendente de la segunda planta y seleccionar aquellas semillas que son normales o encogidas en tamaño. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la segunda planta es condicional para retención de heterocigocidad paterna femenina en el embrión de semillas producidas por la segunda planta. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la segunda planta es condicional para esterilidad femenina. 17. - Un método para obtener una planta que es homocigótica para un alelo dyad es condicional para la expresión de un proteína DYAD en el núcleo de células de la planta, que comprende i) autocruzar una primera planta que es heterocigótica u homocigótica para un alelo dyad y para una construcción de expresión que condicionalmente expresa proteína DYAD en el núcleo y seleccionar para obtener una segunda planta que es homocigótica para dyad y para la construcción de expresión; ii) introducir las segundas plantas seleccionadas a la condición bajo la cual la proteína DYAD es expresada. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la segunda planta es condicional para la retención de heterocigocidad paterna femenina en el embrión de semillas producidas por la planta T2. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la segunda planta es condicional para esterilidad femenina. 20. - Una semilla o un tejido de la planta de la reivindicación 1 . 21 . - Una semilla obtenida por el método de la reivindicación 10. 22. - Una semilla triploide obtenida por el método de la reivindicación 13. 23.- Un método para mantener una línea de planta homocigótica para dyad que comprende propagar una planta de la reivindicación 1 bajo condiciones suficientes para expresión de la proteína DYAD. 24. - Un método para mantener una línea de planta homocigótica para dyad que comprende propagar una planta de la reivindicación 4 bajo condiciones suficientes para la expresión de la proteína DYAD. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la condición comprende aplicar una hormona esteroidea a dicha planta. 26. - Un método para obtener una planta que comprende una copia de un gen DYAD que es condicionalmente expresado en el núcleo, que comprende i) autocruzar una primera planta que comprende una construcción de expresión que condicionalmente expresa proteína DYAD en el núcleo de dicha planta o cruzar dos de las primeras plantas para obtener segundas plantas y seleccionar una segunda planta que presenta silicuas acortadas o frutos encogidos, o conjunto de semillas reducido; ii) introducir dicha segunda planta seleccionada a la condición bajo la cual la proteína DYAD es expresada. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la primera planta es de tipo silvestre con respecto a DYAD, heterocigotica para dyad u homocigotica para dyad. 28. - Un método para obtener una planta que condicionalmente expresa una proteína DYAD de tipo silvestre en el núcleo de células de dicha planta que comprende transformar células de una planta con un vector que comprende una construcción que condicionalmente expresa una proteína DYAD de tipo silvestre en el núcleo de células de dicha planta. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la planta es una que es homocigotica para dyad. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la planta es una que es heterocigotica para dyad. 31 . - Una planta que es homocigotica para una construcción que provee expresión condicional de proteína DYAD de tipo silvestre en el núcleo de células de dicha planta. 32. - Una construcción de expresión que confiere expresión condicional de un gen DYAD en el núcleo de una célula vegetal. 33. - La construcción de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque dicha célula vegetal es una célula madre de megaspora. 34. - La construcción de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque dicho gen DYAD se fusiona a un dominio de unión de ligando de receptor de hormona esteroidea. 35. - La construcción de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque el dominio de unión de ligando de receptor de hormona esteroidea es un dominio de unión de ligando de receptor de glucocorticoide. 36. - Un polinucleótido aislado en donde el polinucleótido o su complemento codifica un polipéptido que tiene la secuencia IGDTGLLDHLLKHM o una porción continua del mismo, dicha porción comprende por lo menos cinco aminoácidos correspondientes a una porción conservada de proteína DYAD. 37. - Un polinucleótido aislado en donde el polinucleótido o su complemento codifica un polipéptido que tiene la secuencia HNADGAMEYWLE o una porción continua del mismo, dicha porción comprende por lo menos cinco aminoácidos correspondientes a una porción conservada de proteína DYAD. 38. - Un polinucleótido aislado en donde el polinucleótido o su complemento codifica un polipéptido que tiene la secuencia DPYWTPPPGWK o una porción continua del mismo, dicha porción comprende por lo menos cinco aminoácidos correspondientes a una porción conservada de proteína DYAD. 39. - Un polinucleótido aislado en donde el polinucleótido o su complemento codifica un polipéptido que tiene la secuencia FRICKP o FRICRP, o una porción continua del mismo, dicha porción comprende por lo menos cinco aminoácidos correspondientes a una porción conservada de proteína DYAD. 40.- El uso del polinucleótido como se reclama en las reivindicaciones 36 a 39 para aislar un gen DYAD o porción del mismo.