CN116926109A - 一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑方法，涉及基因工程技术领域。本发明将花粉特异性启动子驱动的玉米α‑淀粉酶基因ZmAA1引入CRISPR/Cas9系统，得到程序化花粉自清除CRISPR/Cas(PSEC)系统；当PSEC存在且为半合子的情况下，衍生的单拷贝PSEC系会导致花粉“自杀”，并通过雌配子将PSEC遗传给下一代，且在活体中仍能发挥CRISPR/Cas基因编辑活性以创制受体目标突变。

Description

一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑方法。
背景技术
CRISPR/Cas基因编辑技术在植物基础研究与遗传改良方面具有巨大的前景。CRISPR/Cas表达盒的稳定遗传转化是进行植物基因编辑的主要途径。而有性生殖显花植物异交植物容易造成转基因成分通过花粉扩散到非转基因邻近植物的问题。
以玉米(ZeamaysL.)为例，单株玉米可产生200-500万粒花粉，由于风的传播，推荐的隔离距离为200米。此外，由于蜜蜂等昆虫的觅食，隔离距离甚至可超过3公里。此前有报道称，使用自杀式转基因可以有效杀死含有CRISPR/cas9的T0植物，并产生无转基因的编辑植物。然而，仍有许多有价值的基因编辑应用需要在植物中保留CRISPR/Cas，例如获得体内所需的目标突变体和单倍体诱导耦合编辑。
因此，利用体内保留的CRISPR/Cas基因与花粉自清除CRISPR/Cas(Pollen-Self-El imination CRISPR/Cas9，PSEC)进行基因编辑技术的开发仍是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统，所述系统为将花粉特异性启动子驱动的玉米α-淀粉酶基因ZmAA1引入CRISPR/Cas9系统，得到程序化花粉自清除CRISPR/Cas(PSEC)系统；
所述玉米α-淀粉酶基因ZmAA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述花粉特异性启动子为启动子PG47；
所述启动子PG47的核苷酸序列如下述a1)或a2)或a3)所示：
a1)所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的核苷酸序列；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的核苷酸序列。
进一步的，所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA1、sgRNA5和sgRNA6，能够对受体玉米基因组中的生长调节因子基因进行编辑；
所述sgRNA1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.27第7086-7188位所示；
所述sgRNA5的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.27第7589-7691位所示；
所述sgRNA6的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.27第8092-8194位所示；
所述生长调节因子基因为编码ZmGRF1、ZmGRF5、ZmGRF6蛋白的基因；
所述ZmGRF1基因的核苷酸序列SEQ ID No.8所示；
所述ZmGRF5基因的核苷酸序列SEQ ID No.9所示；
所述ZmGRF6基因的核苷酸序列SEQ ID No.10所示。
进一步的，用于启动所述sgRNA1、sgRNA5、sgRNA6的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmU6-2；
所述启动子ZmU6-2的核苷酸序列如下述b1)或b2)或b3)所示：
b1)所述核苷酸序列SEQ ID No.7所示；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的核苷酸序列；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的核苷酸序列。
进一步的，所述sgRNA1、sgRNA5和sgRNA6识别的靶序列分别为所述受体玉米基因组中编码ZmGRF1、ZmGRF5、ZmGRF6蛋白的DNA片段；
所述sgRNA1识别的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述sgRNA5识别的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述sgRNA6识别的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
进一步的，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白表达盒；
所述Cas9蛋白表达盒自上游至下游依次包括用于启动Cas9蛋白表达的启动子、Cas9蛋白的编码基因和终止子；
所述用于启动Cas9蛋白表达的启动子为玉米UBI启动子，所述终止子为NOS终止子；
所述Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列如下述c1)或c2)或c3)所示：
c1)如SEQ ID No.27自5’末端起第447-4547位所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性的核苷酸序列；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑载体，所述载体包括花粉特异性启动子PG47、玉米α-淀粉酶基因ZmAA1、启动子ZmU6-2、sgRNA1的编码基因、sgRNA5的编码基因、sgRNA6的编码基因、RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子、Cas9蛋白表达盒和筛选标记基因；
所述筛选标记基因为抗草铵膦的bar基因。
一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑方法，包括以下步骤：
(1)用植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑载体转化农杆菌；
(2)用农杆菌转染受体玉米的愈伤组织；
(3)将转染后的受体玉米组织经过共培养、恢复培养、抗除草剂阳性筛选、诱导胚状体、分化、再分化、生根壮苗和炼苗步骤，得到转基因阳性株系；
(4)通过PCR选择突变率高的株系；
(5)使用数字微滴pcr(ddPCR)筛选PSEC单拷贝株系；
(6)通过KI/I2染色处理从花药与花粉表型鉴定转基因花粉程序化自清除；
(7)通过PCR验证步骤(6)的结果，得到转基因花粉程序化自清除株系。
一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统在阻止转基因花粉传播中的应用。
一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统在子代中保持基因编辑活性的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
为了构建程序化的PSEC，本发明引入了一个雄性配子体杀死基因，即由花粉特异性启动子(PG47)驱动的玉米α-淀粉酶基因(ZmAA1)，正如之前在CRISPR/Cas9表达盒中成功实现的那样。当PSEC存在且为半合子的情况下，衍生的单拷贝PSEC系会导致花粉“自杀”，并通过雌配子将PSEC遗传给下一代。在回交过程中，当PSEC系与受体自交系杂交，CRISPR/Cas编辑活性被保留，可以产生新的等位基因靶点突变。本发明设计了PSEC多重靶向3个生长调节因子，ZmGRF1，ZmGRF5和ZmGRF6，以获得单突变和/或多突变。
总之，本发明成功地开发了程序化的PSEC系统，该系统使用花粉特异性能量消耗盒在单倍体花粉中出现PSEC时实现花粉自我消除。PSEC可以通过雌性配子体遗传，并在子代中实现良好的CRISPR/Cas9基因组编辑活性。这将极大地缓解人们对转基因元素通过异交大量扩散到自然和农业环境的严重担忧。此外，该技术还可以推广到其他CRISPR/Cas技术以及玉米以外的其他异交植物物种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为基因编辑遗传转化载体图谱；
图2为通过ddPCR鉴定PSEC半合子(+/-)；
图3为KI/I2染色后PSEC株系3-1与其野生型(WT)雄蕊和成熟花粉的比较；
图4为含有PSEC的花粉与不含PSEC花粉之间分离比的卡方检验；
图5为通过PCR对株系3-1花粉碘染色结果进行验证；
图6为T1代获得的单突变、双突变和三突变的突变类型；
图7为花期突变体的表型比较；
图8为从PSEC中获得的ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的单突变、双突变和三重突变体株高表型数据；
图9为PSEC3-1系作为花粉供体和受体时F1代的PSEC鉴定，以及F1代中生长调控因子的突变鉴定；
图10为PSEC系统的工作原理图；
图11为PSEC系统的工作原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料来源：
植物材料：玉米材料主要用于PSEC载体的稳定遗传转化、基因组DNA提取、表型鉴定中的野生型对照以及作为创制F1代材料中的亲本材料；
玉米自交系郑58为市售公开品种，玉米自交系ZC01与B73由未米生物科技(江苏)有限公司提供。玉米自交系JD(吉单)96M与JD96F：JD96M由吉林省农科院选育，JD96F以国外杂交种KX0769为基础材料自交7代选育而成。
本发明使用的载体：基础基因编辑载体CPB(包含Ubiquitin启动子和Cas9蛋白表达盒)。
本发明中的pEASY-Blunt Cloning Kit、Trans5α化学感受态细胞、PEASY-bluntsimple vector和Trans T1感受态细胞均为北京全式金生物技术有限公司的产品。
本发明中所用酶类：高保真PCR酶KOD-Plus(百灵克，KOD-201、同源重组酶pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(全式金，CU101-O1)、普通PCR扩增酶2X MSHiPer Taq PCR mix(聚合美，MF001-ND-Ol)，HindIII限制性内切酶(NEB)等。
本发明所用试剂盒：Axygen AP-GX-50 DNA凝胶回收试剂盒、Axygen AP-MN-P50质粒小提试剂盒等。
实施例1：PSEC基因编辑遗传转化载体的构建
1：花粉清除模块PG4：Bt1：ZmAA1：NOS的扩增
玉米α-淀粉酶基因ZmAA1连接到来自ZmBt1的淀粉样蛋白信号肽，由花粉特异性PG47启动子驱动。
ZmAA1基因，如SEQ ID No.1所示；启动子PG47基因，如SEQ ID No.2所示；
以实验室已有MGM载体为模板(DOI：10.1016/j.molp.2020.06.003)，设计引物对花粉清除模块PG4：Bt1：ZmAA1：NOS进行PCR扩增，引物序列如下：
PGZMAA-F：5’-CCGAGTCGGTGCTTTTTTTAAGCTTAAACCCGAAGTGGCGAGTTTGGAGTT-3’，如SEQ ID No.3所示；
PGZMAA-R：5’-TTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCTCGTAGACTACACATCGAGATC-3’，如SEQ ID No.4所示；
PCR扩增体系如表1所示。PCR扩增程序如下：94℃2min；94℃15s，55℃30s，68℃30s，35个循环；68℃10min。
表1：PCR反应体系
组分 体积(μl)
DNA模板(100ng/μl) 1
上游引物 1.5
下游引物 1.5
MgSO4 2
10×KODPlusbuffer 5
dNTPs 5
KODPlus 1
H2O 33
Total 50
PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250)回收，回收产物用于载体构建。
2：RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmU6-2的克隆
2-1：启动子ZmU6-2的扩增引物的设计
启动子ZmU6-2扩增引物序列如下：
ZmU6-2-F：5’-AATTGGCCCTTACAAAATAG-3’，如SEQ ID No.5所示；
ZmU6-2-R：5’-GGAGCGGTGGTCGCAGCTGA-3’，如SEQ ID No.6所示。
2-2：PCR扩增
提取玉米自交系郑58的基因组DNA，以玉米自交系郑58的基因组DNA为模板，对启动子ZmU6-2进行PCR扩增。PCR扩增体系同上一步表1所示。PCR扩增程序如下：94℃2min；94℃15s，55℃30s，68℃30s，35个循环；68℃10min。
PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250)回收，将回收的产物连接亚克隆载体-Blunt Simple Cloning Kit(全式金，CB111-01)，转入Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell(全式金，CD501-01)进行转化，挑取单克隆摇菌进行测序，回收产物用于下一步载体构建。
测序结果：启动子ZmU6-2的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
3：载体CPB-ZmU6-2-1：sgRNA1-ZmU6-2-5：sgRNA5-ZmU6-2-6：sgRNA6-PG：zmaa1(PSEC)的构建
受体玉米基因组中生长调节因子基因为编码ZmGRF1、ZmGRF5、ZmGRF6蛋白的基因；CRISPR/Cas9系统中包括三个sgRNA，分别命名为sgRNA1、sgRNA5和sgRNA6；sgRNA1、sgRNA5和sgRNA6识别的靶序列分别为所述受体玉米基因组中编码ZmGRF1、ZmGRF5、ZmGRF6蛋白的DNA片段。
其中sgRNA1识别ZmGRF1，sgRNA5识别ZmGRF5，sgRNA6识别ZmGRF6。
ZmGRF1基因为SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
ZmGRF5基因为SEQ ID No.9示的核苷酸序列；
ZmGRF6基因为SEQ ID No.10示的核苷酸序列；
sgRNA1识别的靶序列为SEQ ID No.11示的DNA分子；
sgRNA5识别的靶序列为SEQ ID No.12示的DNA分子；
sgRNA6识别的靶序列为SEQ ID No.13示的DNA分子。
3-1：片段ZmU6-2、sgRNA1、sgRNA5、sgRNA6的扩增
3-1-1：以步骤2-2中的ZmU6-2为模板，采用ZmU6-2-F1和ZmU6-2-R1引物进行PCR扩增，得到片段ZmU6-2-1；引物序列如下：
ZmU6-2-F1：5’-CGGGTCACGCTGCACTGCACAAGCTAATTGGCCCTTACAAAATAGCTAGAC-3’，如SEQ ID No.14所示；
ZmU6-2-R1：5’-GTGGAAACGCAGCTCGCGCCGGAGCGGTGGTCGCAGCTGAACT-3’，如SEQ IDNo.15所示。
3-1-2：以步骤2-2中的ZmU6-2为模板，采用ZmU6-2-F5和ZmU6-2-R5引物进行PCR扩增，得到片段ZmU6-2-5；引物序列如下：
ZmU6-2-F5：5’-CACCGAGTCGGTGCTTTTTTTAAGCTAATTGGCCCTTACAAAATAGCTAGA-3’，如SEQ ID No.16所示；
ZmU6-2-R5：5’-GTGGAAGCGCAGCTCGCGCCGGAGCGGTGGTCGCAGCTGAACTTA-3’，如SEQID No.17所示。
3-1-3：以步骤2-2中的ZmU6-2为模板，采用ZmU6-2-F6和ZmU6-2-R6引物进行PCR扩增，得到片段ZmU6-2-6；引物序列如下：
ZmU6-2-F6：5’-CACCGAGTCGGTGCTTTTTTTAAGCTAATTGGCCCTTACAAAATAGCTAGA-3’，如SEQ ID No.18所示；
ZmU6-2-R6：5’-GTGGAAGCGCAGCTCGTGCCGGAGCGGTGGTCGCAGCTGAACTTA-3’，如SEQID No.19所示。
sgRNA的序列如SEQ ID No.20所示；
3-1-4：以sgRNA为模板，采用sgRNA1-F和sgRNA1-R为模板进行PCR扩增，得到片段sgRNA1，引物序列如下：
sgRNA1-F：5’-GGCGCGAGCTGCGTTTCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，如SEQ IDNo.21所示；
sgRNA1-R：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’，如SEQ ID No.22所示。
3-1-5：以sgRNA为模板，采用sgRNA5-F和sgRNA5-R为模板进行PCR扩增，得到片段sgRNA5，引物序列如下：
sgRNA5-F：5’-GGCGCGAGCTGCGCTTCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，如SEQ IDNo.23所示；
sgRNA5-R：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’，如SEQ ID No.24所示。
3-1-6：以sgRNA为模板，采用sgRNA6-F和sgRNA6-R为模板进行PCR扩增，得到片段sgRNA6，引物序列如下：
sgRNA6-F：5’-GGCACGAGCTGCGCTTCCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3’，如SEQ IDNo.25所示；
sgRNA6-R：5’-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’，如SEQ ID No.26所示。
3-2：重叠PCR
3-2-1：以步骤3-1-1获得的片段ZmU6-2-1和sgRNA1为模板，采用ZmU6-2-F1和sgRNA1-R引物进行PCR扩增，得到重叠PCR产物ZmU6-2-1：sgRNA1。
3-2-2：以步骤3-1-2获得的片段ZmU6-2-5和sgRNA5为模板，采用ZmU6-2-F5和sgRNA5-R引物进行PCR扩增，得到重叠PCR产物ZmU6-2-5：sgRNA5。
3-2-3：以步骤3-1-3获得的片段ZmU6-2-6和sgRNA6为模板，采用ZmU6-2-F6和sgRNA6-R引物进行PCR扩增，得到重叠PCR产物ZmU6-2-6：sgRNA6。
上述重叠PCR反应体系均如表2所示。
表2：重叠PCR反应体系
3-3：用HindⅢ限制性内切酶37℃酶切CPB载体3小时，得到CPB线性化大片段；将重叠PCR产物ZmU6-2-1：sgRNA1与CPB线性化大片段用重组酶(全式金，CU101-01)进行重组，50℃重组15min，然后转化测序；
将正确的测序载体用HindⅢ限制性内切酶酶切，以上述同样方法连接ZmU6-2-5：sgRNA5，并转化测序；
再以上述同样方法连接ZmU6-2-6：sgRNA6，并转化测序；
再以上述同样方法连接PG4：Bt1：Zmaa1：NOS，并转化测序；
将正确的测序载体CPB-ZmU6-2-1：sgRNA1-ZmU6-2-5：sgRNA5-ZmU6-2-6：sgRNA6-PG：zmaa1命名为载体PSEC(载体图谱如图1所示)。
载体PSEC(1)部分的核苷酸序列，如SEQ ID No.27所示；
载体PSEC(2)部分的核苷酸序列，如SEQ ID No.28所示；
载体PSEC(1)+PSEC(2)为完整的载体PSEC核苷酸序列(22435bp)。
因为序列表系统上传限制16000bp，只能将其拆分。
其中，PSEC(1)序列自5’末端起第115-367位所示的核苷酸为NOS终止子，第399-446位所示的核苷酸为核定位序列(NLS)，第447-4547位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白的编码基因，第4572-4592位所示的核苷酸为核定位信号(SV40NLS)，第4599-4664位所示的核苷酸为3×FLAG标签，第4691-6662位所示的核苷酸序列为玉米UBI启动子，第6691-7085位所示的核苷酸序列为启动子ZmU6-2，第7086-7188位所示的核苷酸序列为sgRNA1的编码基因(sgRNA1识别的靶序列如SEQ ID No.11所示)，第7194-7588位所示的核苷酸序列为启动子ZmU6-2，第7589-7691位所示的核苷酸序列为sgRNA5的编码基因(sgRNA5识别的靶序列如SEQ ID No.12所示)，第7697-8091位所示的核苷酸序列为启动子ZmU6-2，第8092-8194位所示的核苷酸序列为sgRNA6的编码基因(sgRNA6识别的靶序列如SEQ ID No.13所示)，第8200-10975位所示的核苷酸序列为启动子PG47，第10976-11200位所示的核苷酸序列为Bt1，第11201-12463位所示的核苷酸序列为Zmaa1，第12464-12716位所示的核苷酸为NOS终止子；
载体PSEC(2)序列第40-669位所示的核苷酸序列为PSV1StaA，第1098-2171位所示的核苷酸序列为PSV1RepA，第3101-3689位所示的核苷酸序列为复制子ori，第5114-5908位所示的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因，第6435-6609位所示的核苷酸序列为CaMVpoly(A)signal，第6616-7167位所示的核苷酸序列为抗草铵膦的bar基因，第7212-7888位所示的核苷酸序列为CaMV35s增强型启动子。
实施例2：PSEC植株的获得及鉴定
4：PSEC植株的获得
4-1：农杆菌的制备
将实施例1制备的载体PSEC转化农杆菌BMGV3301(北京博迈德基因技术有限公司，CC3201)，取50ul农杆菌感受态细胞，冰上融化，加入1ug质粒DNA，混匀；液氮速冻5min，37℃热激5min，立即置于冰上2min；加入1mlYEB培养基，28℃(130rpm)震荡培养4h；10000rpm离心15S后，弃900ul上清，留50-100ul重悬细胞细胞后进行图板；封口置于28℃培养2d，得到重组菌。挑取重组菌克隆接种于300μl无抗性YEP液体培养基(牛肉膏10g、酵母膏10g、NaCl5g溶于1L蒸馏水)，220rpm振荡培养4h，然后接种于含卡那霉素抗性基因的YEP固体平板上，28℃培养48h，挑取单克隆进行鉴定，将经鉴定正确的农杆菌-80℃保存，待用于下述农杆菌转化实验。
4-2：农杆菌介导的玉米遗传转化
4-2-1：受体材料的处理
将玉米自交系ZC01种子浸泡水中37℃4h，在28℃平皿中萌发48h，将发芽后的种子置于装营养土的盆中培养，待授粉后10天，选取幼胚做为诱导愈伤组织材料。在操作台中将玉米幼穗用75％(体积分数)乙醇消毒10min，无菌水冲洗干净后，晾干。用手术刀切掉籽粒一半，然后用镊子将幼胚分离出来，放置无菌水中待用。
4-2-2：愈伤组织诱导和继代培养
将幼胚放置N6培养基(BINDER，AA958)，28℃暗培养一周，将生长旺盛，颜色鲜艳的愈伤组织切成小块，放置在N6培养基上继续培养，每两周继代一次，保持愈伤组织的良好状态，并选取长势良好的愈伤组织，待用。
4-2-3：农杆菌侵染
取出步骤4-1中保存的农杆菌，接种摇菌，待OD600值为0.8左右，5000r/min离心10min，收集菌体，用侵染buffer(1L侵染buffer是将4g含N6 vitamin的N6 Salts，2mg2，4-D，100mg肌醇，0.7gL-脯氨酸，68.4g蔗糖，36g葡萄糖，1mL AgNO3(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)和水混匀得到的，PH5.2)悬浮菌体，使OD600值为0.5左右，然后28℃，150r/min振荡0.5h，得到侵染液。将(2)中选取的长势良好的愈伤组织浸泡侵染buffer中1h，然后转移至含农杆菌的侵染液浸泡15min，晾干，得到侵染后的愈伤组织。
4-2-4：共培养、恢复培养
将侵染后的愈伤组织放至共培养基(1L共培养基是将4g含N6 vitamin的N6Salts，2mg2，4-D，30g蔗糖，8g琼脂，1mL AgNO3(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)，3mLL-半胱氨酸(100mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，20℃培养3天，转至恢复培养基(1L恢复培养基是将4g含N6 vitamin的N6 Salts，2mg2，4-D，0.7gL-脯氨酸，30g蔗糖，0.5gMES，4g植物凝胶，1mLAgNO3(10mg/mL)，1mL头孢霉素(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)培养10天，然后转至加入草铵膦的恢复培养基筛选阳性愈伤组织。
4-2-5：分化、再分化、生根、炼苗
将上述阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基(1L诱导胚状体培养基是将4.43g含MS vitamin的MS Salts(含肌醇)，0.25mg2，4-D，30g蔗糖，5mg6-BA，4g植物凝胶，1mL Cefo(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，暗培养2周，然后转至分化培养基(1L分化培养基是将4.43g含MS vitamin的MS Salts(含肌醇)，30g蔗糖，4g植物凝胶，1mL Cefo(250mg/mL)和水混匀得到的，PH5.8)，待长出绿苗后转移至生根培养基(1L生根培养基是将2.215g1/2MS，30g蔗糖，51.55mg MS vitamin，4g植物凝胶和水混匀得到的，PH5.8)生根，长到一定高度，暴露在空气中炼苗培养3天，移苗。
4-2-6：Bar试纸条筛选阳性植株
取植株叶片3厘米左右，放入管中研磨充分，加入500μl的buffer，插入Bar试纸条(上海佑隆生物科技有限公司，目录号：EnviroLogix AS03)，出现阳性条带的植株即为T0代阳性转基因植株。
5：转基因植株的基因型鉴定
对T0代阳性转基因植株进行ZmGRFl、ZmGRF5和ZmGRF6基因编辑突变基因型检测(测序检测)。
5-1：植物基因组提取
提取步骤4中获得的T0代阳性转基因植株的基因组DNA，具体步骤如下：
取T0代阳性转基因植株新鲜叶片放入干净研钵中，加入液氮研磨至粉末状，移至2mL离心管中，加入800μl65℃预热的CTAB缓冲液(500mLCTAB缓冲液是将50mL 1M Tris-7.5，70mL 5M NaCl、50mL 0.5M EDTA(PH8.0)、5.0g CTAB、5.0mL 14Mβ-巯基乙醇与ddH2O混匀得到的，CTAB提取液现用现配，β-巯基乙醇最后于通风橱下加入)，迅速颠倒混匀，65℃水浴40min，冷却室温，加入800μl氯仿：异戊醇(24：1)，混匀后12000rpm离心10min，转移上清至新管，加入5μlRNase，37℃水浴1h，加入氯仿：异戊醇(24：1)再抽提一遍，离心转移上清至新管，加入0.7倍体积预冷异丙醇，混匀置于-20℃静置30min，离心去上清，用70％(体积分数)乙醇洗涤两次，置于超净台中晾干，加入50μl ddH2O溶解DNA。
5-2：转基因植株基因型鉴定
5-2-1：以25株T0代阳性转基因植株的基因组DNA为模板，采用引物Cas9-F和Cas9-R进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，引物序列如下：
Cas9-F：5’-CCATCGTCAACCACTACATCG-3’，如SEQ ID No.29所示；
Cas9-R：5’-CAACCGGAAAGTGACCGTGA-3’，如SEQ ID No.30所示；
然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
结果表明：25株T0代阳性转基因植株的PCR扩增产物均得到大小为568bp的目的条带，而野生型玉米植株ZC01(WT)中没有扩增得到目的条带。
5-2-2：以25株T0代阳性转基因植株的基因组DNA为模板，分别采用引物GRF1-F和GRF1-R、GRF5-F和GRF5-R、GRF6-F和GRF6-R进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，引物序列如下：
GRF1-F：5’-ccgtacctggggaggaaac-3’，如SEQ ID No.31所示；
GRF1-R：5’-ctgagatcctttgcagttccac-3’，如SEQ ID No.32所示；
GRF5-F：5’-cgtatttgatcctttggtcttattgg-3’，如SEQ ID No.33所示；
GRF5-R：5’-catcgtccgacgggagag-3’，如SEQ ID No.34所示；
GRF6-F：5’-gtctgagcggagctaagatgg-3’，如SEQ ID No.35所示；
GRF6-R：5’-ggatacgtgacagaggttgcag-3’，如SEQ ID No.36所示；
然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并送测序。统计突变率，突变率＝发生删除植株数/总植株数。
结果表明：从1-1到25-1的25株T0代阳性转基因植株中，在PCR扩增并进行桑格测序，1-1、3-1、9-1、23-1和24-1中GRF1、GRF5、GRF6均发生突变，选择这5个株系使用数字液滴pcr(ddPCR)来鉴定它们的PSEC拷贝数。
5-3：基于数字微滴PCR技术的转基因拷贝数鉴定
根据上一步基因型检测结果筛选出5个突变率高的株系，用于数字液滴pcr(ddPCR)来筛选PSEC单拷贝株系。
5-3-1：利用FastPure Plant DNA Isolation Mini Kit试剂盒，对材料叶片基因组DNA进行提取。通过IMPLEN P330nanophotometer对提取的总DNA进行定量，保留A260/A280介于1.8到2.0的样品。为了验证基因组纯度与完整性，取100ng全基因组DNA进行琼脂糖凝胶分析。取1μg完整的基因组利用HindⅢ限制性内切酶进行过夜酶切，并取100ng酶切样品通过琼脂糖凝胶分析，保证基因组切割彻底。
5-3-2：取无菌PCR管加入11μL 2×ddPCRTM Supermixfor Probes(No dUTP)，10-20ng酶解DNA(体积2μL)，Bar-F/Bar-R/ADH1-F/ADH1-R引物各900nM(体积各2μL)，PROBE-Bar/PROBE-ADH1探针各227nM(体积各0.5μL)总体积22μL的反应体系。利用移液器将体系反复吹吸数十下，过程中避免出现气泡。将混合好的样品转移至微滴发生卡的样品槽处，注意避免气泡产生。随后向微滴发生卡的最下一列孔中加入微滴发生油。将微滴发生卡套上对应的橡胶垫后放入QX200微滴发生仪中，按下开关键后生成微滴。将生成好的微滴全部吸至ddPCR96孔反应板盖上锡箔热封膜，在配套的热封膜机上180℃加热30s后取出PCR反应板转移至T100PCR仪中，以以下反应程序进行PCR：(1)95℃600s降温速度2℃/s；(2)94℃30s降温速度2℃/s；(3)61℃60s降温速度2℃/s，(2)-(3)循环40次；(4)98℃600s降温速度2℃/s；(5)12℃结束。
5-3-3：反应结束后，将PCR板放入QX200微滴分析仪进行读数。原始数据经过Bio-Rad QuantaSoftTM(v1.6.6.0320)软件进行分析。其中用于区分阴性微滴和阳性微滴的阈值由软件自动生成。
结果表明，农杆菌介导的未成熟胚稳定转化PSEC应用于玉米自交系ZC01，共获得了25个独立的玉米T0转化事件。在对目标突变频率进行初步评估后，从25个转化事件中选择5个使用数字微滴pcr(ddPCR)来描述它们的PSEC拷贝数(s)(图2)。以一个内源二倍体基因ZmADH1作为内参，株系3-1和24-1携带PSEC/-半合子拷贝(图2右上)。用株系3-1的荧光探针振幅所表示的PSEC-Cas9/ZmADH1水平显示了微滴数量的绝对定量(图2下)。因此，选择株系3-1进行进一步表征。
6：转基因植株的表型验证
花粉染色验证PSEC
花粉碘染：取野生型ZC01和步骤5-3鉴定出的株系3-1的花粉，用KI/I2染色处理，显微镜下观察。对黄色和紫色花粉进行卡方检验。
株系3-1的生长和开花，甚至雄蕊和花药都与野生型ZC01相似。如图3所示，经KI/I2染色处理后，株系3-1的雄蕊颜色明显较WT浅，近半数花粉无紫色染色，这些观察结果与我们之前使用相同的元件在玉米中产生不育雄花的表型相一致。
对株系3-1的花粉中代表PSEC单倍体缺失或存在的黄色/紫色花粉数的比值进行卡方检验，得到的比值为1：1(χ2<χ20.05，1；图4)。这些数据符合预期的PSEC/-单拷贝的分离比，且其中一半含有PSEC的单倍体花粉耗尽了淀粉的能量资源而不育。
为了进一步确认PSEC的存在与否，在体视显微镜下将株系3-1的约100粒深染色花粉和100粒无染色花粉各用一个样本管仔细取样。将这些样品微量提取纯化花粉DNA，进行Cas9PCR扩增，每个重复3个。如图5所示，PCR结果验证了基于KI/I2染色确定PSEC是否存在的方法。
说明本发明成功获得了可以程序化花粉自清除的CRISPR/Cas基因编辑植株。
实施例3：PSEC可以通过雌性配子体遗传，并在子代实现良好的CRISPR/Cas9基因编辑活性
将株系3-1进行自交，获得F1代玉米。播种F1代后取玉米叶片样品，提取DNA，经过PCR扩增ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6，扩增产物用Sanger测序对株系3-1的子代进行基因分型，以确定目标突变。鉴定了ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的单突变、双突变和三重突变组合的所有可能的和同源突变类型(图6)。我们创制的ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6全套敲除突变体为为基因功能研究和育种应用的株高选择提供了良好的基础。大致上，所有类型的ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6KO突变体都显示出代表性个体不同程度的株高缩短(图7)。由于所保留的PSEC已被证实具有较高的突变活性，因此可以在子代中进一步筛选这些靶点的明确KO突变。
为进一步检验遗传的PSEC/-是否保持高效的目标突变活性，对株系3-1为母本的F1组合中各40粒种子进行分析。其中17.5％～95％的ZmGRF1、ZmGRF5和/或ZmGRF6在每个靶位点均有设计的同源/双等位基因突变(图7)。这些数据表明，通过与PSEC/-作为母本进行杂交，可以有效地产生期望的突变。
为了验证PSEC/-的转基因元件的传播和遗传特性，以株系3-1作为花粉供体和受体，分别与3个自交系JD96M、JD96F和B73杂交(图9)。以3-1系为花粉供体，用Cas9PCR分析JD96M×3-1、JD96F×3-1和B73×3-1组合产生的272、357和272个F1种子。这些种子中都不包含Cas9元件，表明PSEC不能通过花粉传播和遗传。相比之下，3-1×JD96M、3-1×JD96F和3-1×B73组合产生的近半数F1种子被鉴定到PSEC存在。这些数据与我们的预期一致，即PSEC/-只能通过雌性配子体传播和遗传。
总结：为了构建程序化的PSEC，本发明引入了一个雄性配子体杀死基因，即由花粉特异性启动子(PG47)驱动的玉米α-淀粉酶基因(ZmAA1)，正如之前在CRISPR/Cas9表达盒中成功实现的那样(图1)。当PSEC存在且为半合子的情况下，衍生的单拷贝PSEC系会导致花粉“自杀”，并通过雌配子将PSEC遗传给下一代(图10)。在回交过程中，当PSEC系与受体自交系杂交，CRISPR/Cas编辑活性被保留，可以产生新的等位基因靶点突变(图11)。本发明设计了PSEC多重靶向3个生长调节因子，ZmGRF1，ZmGRF5和ZmGRF6，以获得单突变和/或多突变(图1)。
总之，本发明成功地开发了程序化的PSEC系统，该系统使用花粉特异性能量消耗盒在单倍体花粉中出现PSEC时实现花粉自我消除。PSEC可以通过雌性配子体遗传，并在子代中实现良好的CRISPR/Cas9基因组编辑活性。这将极大地缓解人们对转基因元素通过异交大量扩散到自然和农业环境的严重担忧。此外，该技术还可以推广到其他CRISPR/Cas技术以及玉米以外的其他异交植物物种。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述系统为将花粉特异性启动子驱动的玉米α-淀粉酶基因ZmAA1引入CRISPR/Cas9系统，得到程序化花粉自清除CRISPR/Cas(PSEC)系统；
所述玉米α-淀粉酶基因ZmAA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述花粉特异性启动子为启动子PG47；
所述启动子PG47的核苷酸序列如下述a1)或a2)或a3)所示：
a1)所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的核苷酸序列；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA1、sgRNA5和sgRNA6，能够对受体玉米基因组中的生长调节因子基因进行编辑；
所述sgRNA1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.27第7086-7188位所示；
所述sgRNA5的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.27第7589-7691位所示；
所述sgRNA6的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.27第8092-8194位所示；
所述生长调节因子基因为编码ZmGRF1、ZmGRF5、ZmGRF6蛋白的基因；
所述ZmGRF1基因的核苷酸序列SEQ ID No.8所示；
所述ZmGRF5基因的核苷酸序列SEQ ID No.9所示；
所述ZmGRF6基因的核苷酸序列SEQ ID No.10所示。
4.根据权利要求3所述的一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统，其特征在于，用于启动所述sgRNA1、sgRNA5、sgRNA6的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmU6-2；
所述启动子ZmU6-2的核苷酸序列如下述b1)或b2)或b3)所示：
b1)所述核苷酸序列SEQ ID No.7所示；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的核苷酸序列；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述sgRNA1、sgRNA5和sgRNA6识别的靶序列分别为所述受体玉米基因组中编码ZmGRF1、ZmGRF5、ZmGRF6蛋白的DNA片段；
所述sgRNA1识别的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述sgRNA5识别的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述sgRNA6识别的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
6.根据权利要求1所述的一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白表达盒；
所述Cas9蛋白表达盒自上游至下游依次包括用于启动Cas9蛋白表达的启动子、Cas9蛋白的编码基因和终止子；
所述用于启动Cas9蛋白表达的启动子为玉米UBI启动子，所述终止子为NOS终止子；
所述Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列如下述c1)或c2)或c3)所示：
c1)如SEQ ID No.27自5’末端起第447-4547位所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性的核苷酸序列；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
7.一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑载体，其特征在于，所述载体包括花粉特异性启动子PG47、玉米α-淀粉酶基因ZmAA1、启动子ZmU6-2、sgRNA 1的编码基因、sgRNA5的编码基因、sgRNA6的编码基因、RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子、Cas9蛋白表达盒和筛选标记基因；
所述筛选标记基因为抗草铵膦的bar基因。
8.一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用权利要求7所述载体转化农杆菌；
(2)用农杆菌转染受体玉米的愈伤组织；
(3)将转染后的受体玉米组织经过共培养、恢复培养、抗除草剂阳性筛选、诱导胚状体、分化、再分化、生根壮苗和炼苗步骤，得到转基因阳性株系；
(4)通过PCR选择突变率高的株系；
(5)使用数字微滴pcr(ddPCR)筛选PSEC单拷贝株系；
(6)通过KI/I2染色处理从花药与花粉表型鉴定转基因花粉程序化自清除；
(7)通过PCR验证步骤(6)的结果，得到转基因花粉程序化自清除株系。
9.权利要求1所述一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统在阻止转基因花粉传播中的应用。
10.权利要求1所述一种植物程序化花粉自清除CRISPR/Cas系统在子代中保持基因编辑活性的应用。
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