CN111154756A - 植物花药花粉发育后期特异性表达启动子及其应用 - Google Patents

植物花药花粉发育后期特异性表达启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开植物花药花粉发育后期特异性表达启动子pOsLSP及其应用，属于植物生物技术领域，具体涉及水稻花药花粉发育后期特异性表达启动子在调控水稻雄性育性中的应用。本发明通过克隆水稻日本晴pOsLSP5和pOsLSP6启动子的核苷酸序列，分别将它们与造粉体转运信号肽基因BT1(TP)和α‑淀粉酶基因ZM‑AA1进行嵌合，构建重组表达载体和进行遗传转化。在pOsLSP启动子驱动下和造粉体转运信号肽的引导下，α‑淀粉酶基因可在晚期花粉中表达并水解淀粉，造成转基因花粉不育，准确性高，并可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态和大量扩繁不育系，省去在杂交制种过程中的人工去雄步骤，在作物种植资源改良和遗传育种等方面具有广阔的应用前景。

Description

植物花药花粉发育后期特异性表达启动子及其应用
技术领域
本发明属于植物生物技术种领域，具体而言，本发明涉及分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物花药花粉中特异转录和/或表达。另外，本发明还涉及包含该DNA的表达盒和植物等，并涉及该DNA的应用。
背景技术
植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，它是位于结构基因5’端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子：组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，其中组织特异性启动子可启动下游基因在某些特定的器官或组织部位表达；而诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。
外源DNA序列可以通过连接到特定的启动子从而启动其在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子和玉米的Ubiquitin-1启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。
此外，在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上基因转化到同一个株系中去，如果采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间。为了提高效率以缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化，但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。
近年来，通过基因工程调控植物花粉育性、创造植物雄性不育系及其恢复系已在一些作物上获得成功，为作物杂种优势的利用开创了新的前景。目前利用基因工程创造雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。如在水稻中利用花粉发育后期特异性表达启动子PG47、造粉体转运信号肽基因BT1(TP)和α-淀粉酶基因ZM-AA1可构建花粉败育系统，造成转基因花粉不育(Chang Zhenyi,Chen Zhufen,Wang Na,et al.(2016)Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seedproduction using a nuclear male sterility gene.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 113,14145-14150)。其中PG47启动子可驱动α-淀粉酶基因ZM-AA1在晚期花粉中表达，信号肽BT1(TP)可引导α-淀粉酶ZM-AA1蛋白进入到造粉体中，α-淀粉酶ZM-AA1蛋白可水解淀粉，任意关键调控元件出现问题都无法导致转基因花粉败育。植物花粉或花药启动子的驱动活性和特异性决定了通过基因工程手段调控花粉育性、创造植物不育系及恢复系的成败。目前已知的驱动活性高且特异性良好的植物花粉或花药特异启动子还相对较少，因此，对重要农作物——水稻的花粉特异表达启动子的克隆和功能分析对于在水稻中利用基因工程调控花粉育性、创造植物雄性不育系，从而为水稻杂种优势资源在水稻育种中的充分利用打下基础。
发明内容
本发明的目的是提供了2个植物花药花粉发育后期特异表达的启动子并应用上述启动子以控制花粉育性的方法。
发明人通过RNA-Seq测序，在水稻中发现2个在晚期花粉(Stage11-12)中特异性高表达基因OsLSP(Late stage pollen-specific)，分别命名为OsLSP5和OsLSP6。具体地，分别取野生型水稻日本晴植株的根、茎、叶、外稃、內稃、雌蕊、花药(Stage 6-12)和胚乳(DAP7和DAP 25)，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以水稻ACTIN基因作为内参照，利用Quantitative Real time-PCR(qRT-PCR)方法，分析OsLSP5和OsLSP6基因在水稻各个组织中的表达情况。
通过qRT-PCR基因表达量检测分析发现OsLSP5和OsLSP6基因只在花药发育后期(Stage11-12)特异性高表达，在根、茎、叶或同时期的其它花器官等组织器官中表达量较低或几乎不表达(如图1所示)。这表明，OsLSP5和OsLSP6基因是花药特异性表达的，且只在花药发育后期(Stage 11-12)中特异性高表达。同时，结合花粉RNA-Seq结果，表明OsLSP5和OsLSP6基因是在花药花粉发育后期特异性表达的。
本发明提供花药花粉发育后期特异性表达基因OsLSP5和OsLSP6的启动子，分别命名为pOsLSP5和pOsLSP6。所述启动子为花药花粉特异性表达启动子，即具有驱动基因在花药花粉发育后期中特异表达的功能。pOsLSP5启动子为自翻译起始位点ATG往上-2335bp的片段序列，如SEQ ID NO:1所示；pOsLSP6启动子为自翻译起始位点ATG往上-1999bp的片段序列，如SEQ ID NO:2所示。
本发明所提供的植物花药花粉特异表达启动子，含有如SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1或2所示序列互补的DNA分子，或包含与SEQ ID NO:1或2中所列核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列，或包含来源于SEQ ID NO:1或2序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段，并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸序列在植物花药花粉中的特异性表达。本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与上述2个植物花粉花药特异性启动子核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。含有上述序列的表达载体、转基因细胞系以及宿主菌等均属于本发明的保护范围。扩增本发明所公开的SEQ ID NO:1或2启动子的任一核苷酸片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明所提供的启动子核苷酸序列还可用于从水稻以外的其它植物中分离相应序列，尤其是从其它单子叶植物中进行同源克隆。根据这些相应序列与本文所列启动子序列间的序列同源性，或与本启动子基因的同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本发明所列的SEQ ID NO:1或2启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。
本发明所述的“启动子”是指一种DNA调控区域，其通常包含能指导RNA聚合酶II在特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子还可包含其它识别序列，这些识别序列通常位于TATA盒的上游或5’端，通常被称为上游启动子元件，起调控转录效率的作用。本领域技术人员应该知晓，虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子区域的TATA盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如用于调控编码序列的组织表达性和时间表达功能的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织(例如雄性组织)中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。因此，可选地，pOsLSP5或pOsLSP6启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联使用。
核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5,352,605)、泛素启动子(美国专利No.5,510,474)、IN2核心启动子(美国专利No.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子。
所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行分析：将启动子序列与报告基因可操作性连接，形成可转化的构建体，再将该构建体转入植株中，在获得转基因后代中，通过观察报告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确认其表达特性；或者将上述构建体亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的功能。
用来测试启动子或调控区域功能的适当表达载体的选择将取决于宿主和将该表达载体引入宿主的方法，这类方法是本领域普通技术人员所熟知的。对于真核生物，在载体中的区域包括控制转录起始和控制加工的区域。这些区域被可操作地连接到报告基因，所述报告基因包括GFP、UidA、GUS基因或荧光素酶。包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载体可以被引入完整的组织，例如阶段性花药，或引入愈伤组织，以进行功能验证。
启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(Reporter Gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。将报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有绿色荧光蛋白基因GFP，红色荧光蛋白RFP和β-葡萄糖苷酸酶基因GUS。
此外，本发明的启动子可与并非OsLSP5或OsLSP6基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达，更具体地，在该植株的雄性器官中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。
本发明所公开的pOsLSP5或pOsLSP6启动子，可用于驱动下列异源核苷酸序列的表达，以使转化的植株获得雄性不育的表型。所述异源核苷酸序列可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如α-淀粉酶基因、生长素(auxin)、rotB、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统，还可以是显性的雄性不育基因。
在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作地连接在本发明启动子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。
本发明所提供的启动子序列可分离自任何植物，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括水稻、玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、棉花和高粱。
本发明还包括含有pOsLSP5或pOsLSP6启动子的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表达盒。上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域。
在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亚基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽等。
本发明提供了一种表达盒，其特征在于，包含连接有pOsLSP启动子、造粉体转运肽和α-淀粉酶基因等调控序列，以调控水稻雄性生育力。
具体地，所述调控序列包含花粉发育后期特异性表达基因启动子pOsLSP5或pOsLSP6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或2所示；造粉体蛋白转导肽为BT1(TP)信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述玉米α-淀粉酶基因ZM-AA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明提供一种包含上述pOsLSP5或pOsLSP6启动子或表达盒的DNA构建体，以及包含该DNA构建体的重组表达载体。
本发明含有上述的pOsLSP5或pOsLSP6启动子的重组表达载体可通过农杆菌介导法或基因枪法法等常规生物学方法转化水稻细胞或愈伤组织获得独立的转基因细胞或组织，从而获得水稻雄性不育的转基因株系。
所述转基因水稻为外源基因在花粉后期特异表达的转基因水稻，优选为授粉/受精能力增强/削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因水稻。
本发明提供了上述含有pOsLSP5或pOsLSP6启动子的生物材料在降解植物花粉中淀粉的方法。
本发明提供了上述含有pOsLSP5或pOsLSP6启动子的生物材料在调控水稻花粉发育的方法。所述的调控是降解水稻花粉中淀粉酶或诱导水稻雄性不育。
本发明提供了上述含有pOsLSP5或pOsLSP6启动子的生物材料在诱导水稻雄性不育的方法，以产生部分雄性不育植物。所示的植物为禾本科植物。
本发明提供了上述含有pOsLSP5或pOsLSP6启动子的生物材料在影响水稻雄性生育力的方法，以产生部分雄性不育水稻。
在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。
进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁嶙抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。
本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。
本发明还包括所公开的pOsLSP5或pOsLSP6启动子的应用，在某些应用的实施方式中，可以应用本发明所提供的pOsLSP5或pOsLSP6启动子来实现一些育性相关基因突变所获得的雄性不育系的繁殖和保持，所述育性相关基因包括但不限于OsNP1、ZmMs7、Ms26、Ms45和MSCA1等。
本发明的所提供的花药花粉特异表达启动子可用于外源基因在花药中的特异性表达，从而避免该外源基因在植物其它组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花药生长发育相关基因的功能分析和鉴定；可用于雄性不育系、保持系和恢复系的创建；并可应用于花粉败育实验中，从而避免由植物转基因漂移或花粉逃逸所带来的生物安全问题，对植物雄性不育系和恢复系的创造具有重要意义。
本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(Seiichi Toki,Naho Hara,Kazuko Ono,et al.(2006)Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speedtransformation of rice.The Plant Journal.47,969–976；苏益,黄善金,蔺万煌等(2008).根癌农杆菌介导的水稻快速转化方法研究.中国农学通报(J),24(5):83～86)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。
本发明提供的花药花粉特异启动子pOsLSP5或pOsLSP6的优点如下：
(1)花药花粉特异启动子pOsLSP5或pOsLSP6为水稻内源基因，对水稻基因工程十分有利；
(2)转基因植株花粉碘化钾染色实验表明，花粉发育后期特异性表达启动子pOsLSP5或pOsLSP6可驱动α-淀粉酶ZM-AA1基因在晚期花粉中特异性表达，精确地作用于花粉粒中的淀粉，最终使得可育花粉和败育花粉的比例为1:1；
(3)本发明的花药花粉发育后期特异性表达启动子pOsLSP5或pOsLSP6，在造粉体蛋白转运肽BT1(TP)的引导下，可驱动α-淀粉酶基因ZM-AA1在造粉体中特异性表达并水解淀粉；可有效控制转基因的扩散；可用于水稻保持系的保持和不育系的扩繁，并可在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，具有广阔的应用前景；
(4)本明为获得转基因雄性不育植株提供了一种新的方法。
下面通过具体实施方式，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1是OsLSP5和OsLSP6基因在水稻不同组织器官和不同发育时期的花药中的Real-time PCR表达分析。分别取根、茎、叶、外稃、內稃、雌蕊、花药(Stage 6-12)和胚乳(DAP 7和DAP 25)材料进行检测。Stage 6-12分别指取自该材料中不同时期的花药组织，DAP(Day After Pollination)指授粉后的天数。
图2是pOsLSP5和pOsLSP6启动子重组表达载体pSZYJY-14和pSZYJY-15的构建流程图。先由原始载体pCAMBIA1300插入BT1(TP)和ZM-AA1基因后获得中间载体pSZYJY-13，然后再插入pOsLSP5或pOsLSP6序列后得到pSZYJY-14或pSZYJY-15载体。
图3是含重组表达载体pSZYJY-14或pSZYJY-15的转基因水稻的花粉碘染图。左图是野生型对照，中间是含有SZYJY-14转基因植株，右图是SZYJY-15转基因植株。其中白色箭头指示约50％的花粉因败育被染成黄褐色，黑色箭头指示约50％的花粉因可育被染成黑蓝色，标尺为100μm。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，KOD FX Neo高保真酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司(TOYOBO)、载体构建过程中的核酸内切酶、重组连接酶In-Fusion和实时荧光定量PCR试剂盒均购自宝生物工程(北京)有限公司(TaKaRa)，大肠杆菌感受态Trans1-T1和反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech)。实验中所用的载体pCAMBIA1300可购自于CAMBIA公司。
实施例1.OsLPS5和OsLPS6基因的组织表达模式分析
发明人通过RNA-Seq测序，获得了2个在水稻晚期花粉中特异性高表达基因。分别取水稻野生型日本晴植株的根、茎、叶、外稃、內稃、雌蕊、花药(Stage 6-12)和胚乳(DAP 7和DAP 25)，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以水稻ACTIN基因作为内参照，分别设计针对OsLSP5、OsLPS6和ACTIN基因的引物，利用Quantitative Real time-PCR(qRT-PCR)方法，分析了OsLSP5和OsLSP6基因在水稻各个组织中的表达情况。
其中，OsLSP5基因的qRT-PCR引物为：引物1：5'-TCGTTCTCGTCGTGATCCTCCTC-3'(SEQ ID NO:5)和引物2：5'-GCAGATTCACTGCTGGACTCTTCC-3'(SEQ ID NO:6)；OsLSP6基因的qRT-PCR引物为：引物3：5'-GGCGGCATTGTTGGTCGTTGGCTCA-3'(SEQ ID NO:7)和引物4：5'-TCTTGACAAGGAAGCGGACGGAGAA-3'(SEQ ID NO:8)；ACTIN基因的qRT-PCR引物为：引物5：5'-GCTATGTACGTCGCCATCCA-3'(SEQ ID NO:9)和引物6：5'-GGACAGTGTGGCTGACACCAT-3'(SEQID NO:10)。
qRT-PCR检测体系为：
Figure BDA0002357440970000091
加ddH2O补齐至10uL。
qRT-PCR反应条件：95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s,40个循环。
在Real-time PCR仪上进行反应，反应结束后，分析软件输出的数据，得到的Real-time PCR检测结果。结果如图1所示，OsLSP5和OsLSP6基因在花药发育后期(Stage 11-12)特异性高表达，在根、茎、叶或同时期的其它花器官等组织器官中表达量较低或不表达。这表明，本发明的OsLSP5和OsLSP6基因是花药特异性表达，且只在花药发育后期(Stage 11-12)中特异性高表达的基因。
实施例2.BT1(TP)-ZM-AA1融合基因、pOsLSP5启动子、pOsLSP6启动子的克隆
以早期研究报道pZhen18载体为模板(Chang Zhenyi,Chen Zhufen,Wang Na,etal.(2016)Construction ofa male sterility system for hybrid rice breeding andseed production using a nuclear male sterility gene.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 113,14145-14150)，克隆BT1(TP)-ZM-AA1融合基因所需引物为：
引物7：5'-CCGGGGATCCTCTAGAATGGCGGCGACAATGGCAGTGACG-3'(SEQ ID NO:11)；
引物8：5'-GGCCAGTGCCAAGCTTTCAAGGAAAAGACGTTATGCAGTG-3'(SEQ ID NO:12)；
克隆启动子pOsLSP5所需引物为：
引物9：5'-CCATGATTACGAATTCGGCTGATAAATATAAGCATAAGCGAAAG-3'(SEQ ID NO:13)；
引物10：5'-TCGCCGCCATTCTAGAGGCCGATGTAGCTGTTGGTGCTCACCTA-3'(SEQ ID NO:14)；
克隆启动子pOsLSP6所需引物为：
引物11：5'-CCATGATTACGAATTCTAAGGCATAAATGTGTTCTTCCAAAAT-3'(SEQ ID NO:15)；
引物12：5'-TCGCCGCCATTCTAGATGGCGAGCTAGCTAGTTTGTTGGTGTTG-3'(SEQ ID NO:16)；
其中，引物7、10和12中下划线序列为XbaI的酶切位点，引物8中下划线序列为HindIII的酶切位点，引物9和11中下划线序列为EcoRI的酶切位点。引物7、8、9、10、11和12酶切位点左侧的10个碱基为骨架载体重组片段，用于连接载体时进行同源重组连接。
利用BT1(TP)-ZM-AA1融合基因的引物(SEQ ID NO:11和12)，以实验室保存的pZhen18基因载体质粒为模板，进行PCR扩增，反应条件是：94℃预变性3min；98℃变性30s，61℃退火30s，68℃延伸2min，30个循环；68℃延伸5min。扩增产物长度约1500bp，为带有限制性内切酶位点及骨架载体重组片段的BT1(TP)-ZM-AA1融合基因。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。
同时，利用pOsLSP5启动子的引物(SEQ ID NO:13和14)和pOsLSP6启动子的引物(SEQ ID NO:15和16)，以水稻日本晴基因组DNA模板，分别进行扩增，反应条件是：94℃预变性3min；98℃变性30s，61℃退火30s，68℃延伸3min，30个循环；68℃延伸7min。扩增产物长度约2500bp，为带有限制性内切酶位点及骨架载体重组片段的启动子序列。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。
实施例3.表达载体pSZYJY-14和pSZYJY-15的构建
如图2所示，将实施例2中PCR胶回收的BT1(TP)-ZM-AA1融合基因片段在同源重组酶In-fusion的作用下连入用XbaI和HindIII双酶切的载体pCAMBIA1300中，挑取菌落进行PCR检测，选取PCR结果为阳性的菌落进行测序测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pSZYJY-13。
然后，将实施例2中胶回收的pOsLSP5或pOsLSP6启动子序列在同源重组酶In-fusion的作用下连入再次用EcoRI和XbaI双酶切的载体pSZYJY-13中，挑取菌落进行PCR检测，选取PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pSZYJY-14或pSZYJY-15。其中，菌落PCR检测所需引物为pCAMBIA1300载体上引物(SEQ IDNO:17和18)，位于所克隆的报告基因和启动子片段两侧。
菌落PCR的检测引物如下所示：
引物13：5'-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3'(SEQ ID NO:17)；
引物14：5'-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3'(SEQ ID NO:18)；
PCR检测体系为：
Figure BDA0002357440970000101
Figure BDA0002357440970000111
加ddH2O补齐至20uL。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸7min。
实施例4.农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的功能鉴定
利用电击法将质粒pSZYJY-14和pSZYJY-15分别转入农杆菌AGL0菌株中，采用农杆菌介导法对水稻进行共转化，分别获得了阳性转基因植株SZYJY-14和SZYJY-15，然后采用碘化钾染色观察花粉染色情况。
配制碘化钾染色液溶液：取2g KI溶于5-10mL蒸馏水中，然后加入用适量的无水乙醇溶解的1g I2，待全部溶解后，再加蒸馏水定容至600mL，贮于棕色瓶中备用。
对水稻转基因植株的成熟花粉进行镜检，并对花粉粒育性进行分析，具体方法如下：
a、花粉采集：取充分成熟将要开花的花药，剥除颖壳，取出花药；
b、镜检：取100uL的碘化钾染色液置于载玻片上，再将花药置于载玻片上，用镊子将花药充分捣碎以利于花粉粒释放，盖上盖玻片，置于低倍显微镜下观察。染色后呈黑蓝色的花粉粒为可育花粉粒，呈黄褐色的为败育花粉粒。
SZYJY-14和SZYJY-15转基因植株的花粉粒经碘化钾染色分析和花粉粒碘染结果(如图3所示)表明：可育花粉与败育花粉符合1:1的分离比例，即约50％花粉表现为雄性不育，不能染成黑蓝色，而约50％花粉可染成黑蓝色；而野生型(或其它不携带花粉特异性高表达启动子的转基因植株)则是完全雄性可育的，即100％花粉可被成黑蓝色。结果说明，pOsLSP5和pOsLSP6启动子可驱动α-淀粉酶ZM-AA1在成熟花粉中特异性表达，从而降解花粉粒中的淀粉，因此导致花粉粒在发育过程中因缺少淀粉而能量供给不足，最终引起花粉败育。由此证明，pOsLSP5和pOsLSP6启动子可驱动α-淀粉酶ZM-AA1在成熟花粉中特异性表达，从而降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其它野生作物品种。
综上所述，本发明所披露的pOsLSP5和pOsLSP6花粉发育后期特异性表达启动子来源于中国水稻品种日本晴，其能够驱动α-淀粉酶基因在晚期花粉中表达，从而降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其它野生作物品种，可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中去雄的步骤。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，利用pOsLSP5和pOsLSP6启动子序列，或对pOsLSP5和pOsLSP6启动子序列作一些修改或改进，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上，利用pOsLSP5和pOsLSP6启动子序列以及对这些启动子序列所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 深圳市作物分子设计育种研究院
深圳广三系农业科技有限公司
<120> 植物花药花粉发育后期特异性表达启动子及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2335
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
ggctgataaa tataagcata agcgaaagga tgatgctgat cctaaatcta ctccaaattt 60
gatgtttttt ggcgtttggg gagcagattc ggacgttttt gggcgtttgg cgtgtgcggt 120
ttctcgtcag cggcgtggtg ccggcttcta tcggttatcc tgcatccgac agaggatcag 180
gcagcactgg ctggcatcac tccactcggt tcgcctttga gtatacagga acagatgaga 240
tagttcaggt aaggccttca acccaatcag ccgaacactt ccgttttatg tggtgtttaa 300
atgtttagga gatgatgatg aagattaagt gtttcacgta aaacgatata ttaataacat 360
gtgattaatt gagttttaat tattacaaac ttgaaaaata gattaatatg atattttaga 420
acaactttca tatagaaagt tttccaccaa acgaaccgtt tagccgtctg aaaagcatac 480
cattttaatc caaaagttta tcctgagaat ttagactatt taccattcaa ttcgcgcgcc 540
ctaacttttt taccaccaaa ttcgcatgcc ctttataata tgtcattggg agtgctaatt 600
agtttatttg gtaccacttt ctctattttt accgtgtttc tcatttctta attccatttg 660
tatttttttt caagatttgt ggacgttttt gcccctgggc ccacctgtca gaaccaaaga 720
gagagatttc tctctggatc gaaatcgatc gatgcctcca ggcaacgccc gagaccggca 780
tcggcaccgt cgaccctaag ctccgccggt gagcgctgac gccccgcccg ccggacgcga 840
cccaccccgc cgacgggcac caaattctcg tcggggaccg ggatcatggt gggaggtgga 900
ggcggagaag gtggtggcgg agctgcggga gaggtgcgca acgccgacgt cgctgctgct 960
ctctgcatcg acaagctccc cactgggtca gtcaggatac ctgcaaatgc atcgcctcct 1020
ctgaatcctg aatttctgat ttgtgttcat agcgtcagaa acaggagtga cagtagatag 1080
atatctgaaa atgatgggtt cacactgatt agtgggaggc gctcggcctg ggcggtggcg 1140
ccaggctgcg gtggtcggag ccggtgctcg gcagtggggt gccggcgctc ggcggcgggg 1200
ttaccggcgc acggggcggt gggggtggtg gggcgtcgag tgccgcggcg gcgcccggcg 1260
gcggggttgg tggcgcccga cggcggggtt ggtcgcgtcc ggcggcggcg ctcaccggtg 1320
gagctcgggg tcgacggcgc caatgccggt ctcgggcgct gcctggaggg atcgatcgat 1380
ttcgatccag atagaaatct ctctttggtt ctgacaggtg ggcccagggg caaaaacgtc 1440
tataaatttt aaaaaaatat acaaatggaa ttaagaaatg agaaacacag taaaaataga 1500
gaaagtggta ctaaatagac taattagcac tcccaatgtc atattataga gggcatacga 1560
atttggtggt aaaaaggttg agacgtgcga attggatggt aaatagtcta aattcttgtt 1620
tatcctacac tttcataaga accgaacagg aagaggtccg ccataaaatg aaaattatat 1680
ggttccgaat attccgattt ggccgccaaa aatacaaaca ggtagggcgt gtttaactgc 1740
cactaattat ctcatcatgt caccaagtta agtaggtttt ggccgagcta gaaacctact 1800
tggttcatac cacacttgta ataagatttt ttttcatggt catatgattt ccacgtgtca 1860
ttaacctatg aaagtgtgac aaaattgctc tctgctagtt aaagtgtggc tttacctttt 1920
gttagccaca taatcacgta gcatgttagc ttagaaaagt atggcaagct ttgacaattt 1980
tggaatgcca acaaaacagc cccgaatgtt cattttctat tgtgagatcg tgtcgtatac 2040
ctccactctg gcacaaacta gacacatgca ttgtttgact gttcaaattc gagagaccac 2100
gatgatcgcg ccggatcgaa gggaacattg gccacacgtc gaatgtattg gtcaggcatc 2160
taaaaatgga caccgtcaca gtagggctac ccaaaaatag ccaccgcctc acgtataaat 2220
ccaccccgcg tgagccttcc ctcccatcat caagtcaccc accaagcgaa gcaaacccat 2280
cgcatcaacc accaaatcga aggcacgtag gtgagcacca acagctacat cggcc 2335
<210> 2
<211> 1999
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
taaggcataa atgtgttctt ccaaaatatt gttgtggggc tatatataag catgattttg 60
aatatatata ttgtttatag aggatgcatt gaaaaattat actccctccc tcccaaattg 120
atcatcatat aatggaattc aaaatttctc aaattaatca tcatatacct gcatgtacac 180
agatttcatc agaatacaat tactgcagca tggcagaata tgtgcatgct aaggtgtaat 240
tggcatggtg ttttaatcga tgcatgcatt gtgggagaat gtgtgcttga tgtcttgatt 300
gatgtgattt aaattatcct tggtcttggt gcataagcat atatgatgat caatttggga 360
aggagggagt atttggtcag ttttcattga gatgattgtt ggtgtttgat tttccaaagt 420
tttatagtat gtccaattcg atgtagtccg tttctcattt ttagcttgtt aaaaatgttg 480
taaaagtcaa atttacactt ggtttttctt tttcatgaaa aaaaattgtt gaatcgacca 540
tattgtgatc taaaattata agcataaagc atcgatgcat catttagctt actcagatgc 600
gagaacaaat tgtaagtcac attaatccca tctcaggtat taatgagtgg taatggatag 660
atattaatga gtggtaatgg atagagtgca agtgaaacct gcatttggag gagctaagtt 720
aagtatcata tcatatagtt ggctaaggcc ctgagctata gtcaacaaca aagtttataa 780
aatactaaga gaataccaat ctattgcaaa ggatctaaaa taaatacacc attagttcca 840
actttaaata gaaaaaatat ttacactacc aatgtgttgc aaaggatctg gaaaatatac 900
agtttattcc aaactttaaa tgtaaagaac taataaatct ttaaggccaa aaaaatgtag 960
tggtgattta tggttcctca tccatcgtat gcctagcctc acttccacgc cctcttaagt 1020
ggttcccgca cacatgatgt cccttcccct tgcacgattg gaggcatgcc ctctaatgcc 1080
caccaccccg tcaaaatcca tccaccatcc ttccccggtg cttgcccatg tacctcctct 1140
cacatgtagc tctcatgctg catggatgta acaatgtgtg cacccgccaa ttaaaaatca 1200
attgaattta aagtgtactc ttgtttgaag tacaatctac actaacatct ggaattgcaa 1260
gattattttc cccagggcca tgcgctcctc cccacctatg ccttgtcgag ttgtcatctt 1320
gtattcatgt caaatgtatt gcaatgactg ccaccaccac tcgatatcca actaggtgtg 1380
ctctaccata ttaattagca ccatccccat ctcgccatag acgctaacct atgtcccttc 1440
tcacagagcc acaatgggct agcacttgag cccctccatc gctgccaagg taccatcaac 1500
atcgagctgc tgatggcccc tatgccacat ctactatgca tgccacaccg ttgcccctct 1560
gtgcctggcc atcaatccta accgttagct ctaccacccc tttgttttcc actagcatct 1620
tcgcccctta tttgttcatg cgttgctcca catcctccat aaacggcatg atgaggtaat 1680
tcatttttat tgtataactt aaaaaataag tagagaagat atgggaatgc gtagctactt 1740
tttgagaggt ccgcttgtcc tgcaccagcg aaacaaccgg gactaccagg tttgcatcta 1800
tttataggaa ttgcattaga gttgctcaac gaaagagcca gccaacgatc tctatgctgc 1860
accatgcgtc cctgcctagt tttctttgcc ccctgccacc ataaatacgc acccagctgc 1920
aacatggatc accaaacaca tcgatccatt cctttcaaga aacaagaaag acaacaccaa 1980
caaactagct agctcgcca 1999
<210> 3
<211> 225
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 3
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60
ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcg 225
<210> 4
<211> 1336
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 4
gcctgcggcc tggtccaggc acaagtcctc ttccaggggt ttaactggga gtcgtgcaag 60
cagcagggag gctggtacaa caggctcaag gcccaggtcg acgacatcgc caaggccggc 120
gtcacgcacg tctggctgcc tccaccctcg cactccgtct cgccacaagg ctacatgcca 180
ggccgcctat acgacctgga cgcgtccaag tacggcacgg cggcggagct caagtccctg 240
atagcggcgt tccacggcag gggcgtgcag tgcgtggcgg acatcgtcat caaccaccgg 300
tgcgcggaaa agaaggacgc gcgcggcgtg tactgcatct tcgagggcgg gactcccgac 360
gaccgcctgg actggggccc cgggatgatc tgcagcgacg acacgcagta ctcggacggg 420
acggggcacc gcgacacggg cgaggggttc gcggcggcgc ccgacatcga ccacctcaac 480
ccgcgcgtgc agcgggagct ctccgcctgg ctcaactggc tcaggtccga cgccgtgggg 540
ttcgacggct ggcgcctcga cttcgccaag ggctactcgc cggccgtcgc cagaatgtac 600
gtggagagca cggggccgcc gagcttcgtc gtcgcggaga tatggaactc gctgagctac 660
agcggggacg gcaagccggc gcccaaccag gaccagtgcc ggcaggagct gctggactgg 720
acgcgggccg tcggcgggcc cgccatggcg ttcgacttcc ccaccaaggg cctgctgcag 780
gcgggcgtgc agggggagct gtggcggctg cgcgacagct ccggcaacgc ggccggcctg 840
atcgggtggg cgcccgagaa ggccgtcacc ttcgtcgaca accatgacac cgggtcgacg 900
cagaagctct ggccgttccc atcagacaag gtcatgcagg gctacgccta catcctcacc 960
catccaggag tcccctgcat tttctacgac cacatgttcg actggaacct gaagcaggag 1020
atatccacgc tgtctgccat cagggcgcgg aacggcatcc gcgccgggag caagctgcgg 1080
atcctcgtgg cggacgcgga cgcgtacgtg gccgtcgtcg acgagaaggt catggtgaag 1140
atcgggacaa ggtacggcgt gagcagcgtg gtcccgtcgg atttccaccc ggcggcgcac 1200
ggcaaggact actgcgtctg ggagaaagcg agcctccgcg tcccggcggg gcgccaccta 1260
tagcagctca gattgctcag tcttgtgctg cattgcaaac acagcagcac gacactgcat 1320
aacgtctttt ccttga 1336
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgttctcgt cgtgatcctc ctc 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagattcac tgctggactc ttcc 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcggcattg ttggtcgttg gctca 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcttgacaag gaagcggacg gagaa 25
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctatgtacg tcgccatcca 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggacagtgtg gctgacacca t 21
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccggggatcc tctagaatgg cggcgacaat ggcagtgacg 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggccagtgcc aagctttcaa ggaaaagacg ttatgcagtg 40
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccatgattac gaattcggct gataaatata agcataagcg aaag 44
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgccgccat tctagaggcc gatgtagctg ttggtgctca ccta 44
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccatgattac gaattctaag gcataaatgt gttcttccaa aat 43
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgccgccat tctagatggc gagctagcta gtttgttggt gttg 44
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccaggcttta cactttatgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcgattaagt tgggtaacgc 20

Claims (10)

1.一种花药花粉发育后期特异性表达启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列选自下列组的序列之一：
（a）具有SEQ ID NO：1或2所示的序列；
（b）在严格条件下能够与（a）所述序列的DNA杂交的DNA序列；
（c）包含SEQ ID NO：1或2中至少100个连续核苷酸的DNA序列；和
（d）与（a）-（c）之任一所述序列互补的DNA序列，
所述花药花粉发育后期特异性表达启动子能够驱动目标基因在植物花药花粉发育后期组织中特异性表达。
2.一种表达盒或重组表达载体，其特征在于，所述表达盒或重组表达载体包含权利要求1中所述的花药花粉发育后期特异性表达启动子，并且上述启动子在有效连接的调控序列调控下表达。
3.根据权利要求2所述表达盒或重组表达载体，其特征在于，所述调控序列含造粉体蛋白转导肽和α-淀粉酶基因。
4.根据权利要求2所述表达盒或重组表达载体，其特征在于，所述的含造粉体蛋白转导肽为BT1(TP)信号肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述的α-淀粉酶基因为ZM- AA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.一种权利要求1所述的花药花粉发育后期特异性表达启动子的应用，其特征在于，所述花药花粉发育后期特异性表达启动子用于驱动外源基因在植物中表达，以调控植物的育性。
6.一种降解植物花粉中淀粉的方法，其特征在于，包括通过表达权利要求1所述影响雄性生育力的花药花粉发育后期特异性表达启动子或权利要求2-4任一项所述表达盒以降解植物花粉粒中的淀粉。
7.一种调控植物花粉发育的方法，其特征在于，包括利用权利要求6所述降解植物花粉粒中淀粉的方法以调控花粉发育。
8.一种诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述调控植物花粉发育的方法以产生部分雄性不育植物。
9.一种影响植物雄性生育力的方法，其特征在于，包括利用权利要求8所述诱导植物雄性不育的方法以产生部分雄性不育植物植株。
10.一种阻断植物花粉中外源基因扩散的方法，其特征在于，将权利要求2-4任一项所述水稻花药花粉发育后期特异性表达启动子的表达盒转化植物愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化和生根培养来获得转基因花粉败育的转基因植物，使转基因植物花粉无法正常授粉，进而降解植物中外源基因扩散。
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