JP2001145430A - 花粉特異的ジンクフィンガー転写因子の遺伝子を用いて花粉稔性を低下させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 雄性不稔に代表される植物形質の改変に有用
な、葯の組織に特異的な遺伝子を利用する遺伝子工学的
手法を提供する。 【解決手段】 （ｉ）特定の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御
する転写因子をコードするＤＮＡ、又は（ｉｉｉ）
（ｉ）もしくは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれか
である核酸と、この核酸に作動可能に連結されたプロモ
ーターとを含む、植物発現カセットを準備し、花粉の発
達を制御する内因性の転写因子を有する植物の細胞を提
供する工程では内因性の転写因子をコードする遺伝子
は、核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
され、発現カセットを植物細胞に導入し、植物細胞を植
物体に再生し、内因性の転写因子の発現が抑制された植
物体を選択する。ただし、（ｉｉ）のＤＮＡは、花粉の
発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡを含まな
い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、雄しべの花粉形成
組織に特異的に発現する遺伝子およびその利用に関す
る。本発明は、特に、小胞子に特異的に発現する、ペチ
ュニア由来のジンクフィンガー型転写因子群（ＺＰＴ２
−５、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１）の遺伝子およ
びその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】花粉の稔性は、農業・園芸における様々
な局面で問題になる。たとえば、交雑育種における交配
の際、自家受粉を避けるために、多くの労力がかかる除
雄（雄しべの除去）の作業が行われる。種苗産業におい
ては、交雑育種によって得られた優れた品種を商業的に
保護したいという立場から、花粉稔性の無い形質が求め
られている。このような要請から、花粉の稔性を制御す
る技術（ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）が
強く求められてきた。従来、特定の作物では、細胞質雄
性不稔性の系統が交雑育種に用いられ、一定の成功を収
めてきた。しかし、細胞質不稔形質は多くの場合、耐病
性の低下などの好ましくない副次効果を伴い、さらに形
質が不安定であること、種子の大量生産が困難なことな
どの問題がある。化学薬品処理によって稔性を低下させ
る方法も研究されているが、安全性評価および作用機作
解明が遅れており、実用化には至っていない。そこで、
遺伝子工学を用いた優れた雄性不稔化技術が求められて
いる。

【０００３】花粉は種子植物における雄性の配偶体であ
る。支持体組織としての葯に取り囲まれた状態で進行す
る花粉の発達は、小胞子形成細胞（花粉母細胞）の減数
分裂直後にあたる四分子期、四分子からの小胞子の放出
期、花粉細胞の拡大および空胞形成に特徴付けられる一
核期、有糸分裂により栄養細胞および生殖細胞への分化
が生じる有糸細胞分裂期、その後の二核期という、各段
階に区分される。これらの段階を経て、最終的に葯が開
裂し、成熟した花粉粒が放出される。従って、小胞子
は、花粉の発達を阻害し、花粉稔性を失わせるための人
為的な制御に最も適した対象組織の一つといえる。

【０００４】上記のように、遺伝子工学による雄性不稔
化技術には大きな期待が寄せられている。特に、小胞子
のような花粉細胞の直接の前駆体において特異的に発現
する遺伝子を利用できれば、植物に好ましくない形質を
付与することなく、雄性不稔化を達成し得る可能性が高
いと考えられる。雄しべの種々の組織に特異的なプロモ
ーター、および、それを含む雄生不稔化のための遺伝子
構築物の例は、いくつか報告されている（Ｓｈｉｖａｎ
ｎａおよびＳａｗｈｎｅｙ編， Ｐｏｌｌｅｎｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃｒｏｐ ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ （Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）ｐ
ｐ．２３７−２５７， １９９７）。しかし、発現の組
織特異性および時期特異性が高い、花粉稔性の制御のた
めに有用な新たな遺伝子に対する要望が継続的に存在し
ている。

【０００５】本発明者らは、最近、ペチュニア由来の新
規な転写因子として、ＰＥＴｈｙＺＰＴ２−５、 ＰＥ
ＴｈｙＺＰＴ３−１、およびＰＥＴｈｙＺＰＴ４−１
（以下、それぞれ、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−１および
ＺＰＴ４−１と略す）を含む７つのジンクフィンガー
（ＺＦ）型転写因子のｃＤＮＡ配列を特定した。そし
て、ノーザンブロット分析から、それぞれの転写因子が
葯特異的に、葯の発達の異なる段階において一過性の発
現を示すことを報告した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｐｌ
ａｎｔ Ｊ．，１３：５７１，１９９８）。しかし、こ
れらの転写因子の植物における生理的な機能および作
用、ならびに転写因子をコードする遺伝子の正確な発現
部位およびその発現調節機構は不明であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、雄性
不稔に代表される植物形質の改変に有用な、花粉に特異
的な遺伝子を利用する遺伝子工学的手法を提供すること
にある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以前にペ
チュニアから単離した、葯特異的な転写因子群（ＺＰＴ
２−５、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１）をコードす
る遺伝子をペチュニアに再導入した。その結果、花粉の
正常な発達が阻害され、花粉の稔性が著しく低下するか
（ＺＰＴ２−５およびＺＰＴ４−１）、または、ほぼ完
全に失われる（ＺＰＴ３−１）ことを見出した。さらに
本発明者らは、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１のゲノ
ム遺伝子からそれぞれ上流領域を単離し、そのプロモー
ター活性の組織特異性を調べた。その結果、一核期から
二核期にかけての小胞子において、プロモーター活性が
組織および時期特異的に発現されることを見出した。本
発明は、これらの知見に基づいて完成された。

【０００８】本発明は、その第１の局面において、雄性
不稔性の植物を作出する方法であって、以下の工程を包
含する方法に関する：（ｉ）配列番号１によって示され
る塩基配列の第１位から第７７７位までの配列を有する
ＤＮＡ、（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発
達を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、または（ｉ
ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのい
ずれかである核酸と、上記核酸に作動可能に連結された
プロモーターとを含む、植物発現カセットを提供する工
程；花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植
物の細胞を提供する工程であって、ここで、内因性の転
写因子をコードする遺伝子は、上記核酸とストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする、工程；発現カセッ
トを植物細胞に導入する工程；発現カセットが導入され
た植物細胞を植物体に再生する工程；および、再生され
た植物体であって、上記核酸が発現されることによっ
て、内因性の転写因子の発現が抑制された植物体を選択
する工程。

【０００９】本発明は、その第２の局面において、雄性
不稔性の植物を作出する方法であって、以下の工程を包
含する方法に関する：（ｉ’）配列番号３によって示さ
れる塩基配列の第１位から第１６４０位までの配列を有
するＤＮＡ、（ｉｉ’）（ｉ’）の塩基配列を有するＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、ま
たは（ｉｉｉ’）（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）の断片で
あるＤＮＡのいずれかである核酸と、上記核酸に作動可
能に連結されたプロモーターとを含む、植物発現カセッ
トを提供する工程；花粉の発達を制御する内因性の転写
因子を有する植物の細胞を提供する工程であって、ここ
で、内因性の転写因子をコードする遺伝子は、上記核酸
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、工
程；発現カセットを植物細胞に導入する工程；発現カセ
ットが導入された植物細胞を植物体に再生する工程；お
よび、再生された植物体であって、上記核酸が発現され
ることによって、内因性の転写因子の発現が抑制された
植物体を選択する工程。

【００１０】本発明は、その第３の局面において、雄性
不稔性の植物を作出する方法であって、以下の工程を包
含する方法に関する：（ｉ”）配列番号５によって示さ
れる塩基配列の第１位から第１９４８位までの配列を有
するＤＮＡ、（ｉｉ”）（ｉ”）の塩基配列を有するＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、ま
たは（ｉｉｉ”）（ｉ”）もしくは（ｉｉ”）の断片で
あるＤＮＡのいずれかである核酸と、上記核酸に作動可
能に連結されたプロモーターとを含む、植物発現カセッ
トを提供する工程；花粉の発達を制御する内因性の転写
因子を有する植物の細胞を提供する工程であって、ここ
で、内因性の転写因子をコードする遺伝子は、上記核酸
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、工
程；発現カセットを植物細胞に導入する工程；発現カセ
ットが導入された植物細胞を植物体に再生する工程；お
よび、再生された植物体であって、上記核酸が発現され
ることによって、内因性の転写因子の発現が抑制された
植物体を選択する工程。

【００１１】ただし、上記（ｉｉ）、（ｉｉ’）および
（ｉｉ”）のＤＮＡは、それぞれ、（ｉｖ）配列番号１
３によって示される塩基配列の第１位から第１８８６位
までの配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子を
コードするＤＮＡを含まない。配列番号１３によって示
される塩基配列は、ペチュニアから単離された別の転写
因子ＺＰＴ３−２をコードするｃＤＮＡ配列である（Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉら、前出）。

【００１２】本発明の上記第１から第３までの局面にお
ける方法は、植物に雄性不稔性を付与する方法として、
利用され得る。

【００１３】上記第１から第３までの局面における１つ
の実施態様において、上記核酸は上記プロモーターに対
して順方向で連結され、上記植物体の細胞内でセンス方
向に転写され得る。

【００１４】上記第１から第３までの局面における１つ
の実施態様において、上記核酸は上記プロモーターに対
して逆方向で連結され、上記植物体の細胞内でアンチセ
ンス方向に転写され得る。

【００１５】上記第１から第３までの局面における１つ
の実施態様において、上記植物は双子葉植物である。双
子葉植物は、好ましくはナス科植物であり、より好まし
くはペチュニア属植物である。

【００１６】上記第１から第３までの局面における１つ
の実施態様において、上記発現カセットは植物発現ベク
ターに組み込まれている。

【００１７】本発明の第１から第３までの局面によれば
また、上記いずれかに記載の方法により作出された、雄
性不稔性の植物が提供される。

【００１８】本発明は、その第４の局面において、形質
が改変された植物を作出する方法であって、以下の工程
を包含する方法に関する：（ａ’）配列番号７によって
示される塩基配列の第１位から第２６２４位までの配列
を有するＤＮＡ、または（ｂ’）（ａ’）の一部の配列
を有し、小胞子に特異的なプロモーター活性を示すＤＮ
Ａのいずれかを含むプロモーターと、上記プロモーター
に作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、植物発現
カセットを提供する工程；発現カセットを植物細胞に導
入する工程；および、発現カセットが導入された植物細
胞を、植物体に再生する工程。

【００１９】本発明は、その第５の局面において、形質
が改変された植物を作出する方法であって、以下の工程
を包含する方法に関する：（ａ”）配列番号８によって
示される塩基配列の第１位から第３６３１位までの配列
を有するＤＮＡ、または（ｂ”）（ａ”）の一部の配列
を有し、小胞子に、および任意に葯の開裂組織に、特異
的なプロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含むプ
ロモーターと、上記プロモーターに作動可能に連結され
た異種遺伝子とを含む、植物発現カセットを提供する工
程；発現カセットを植物細胞に導入する工程；および、
発現カセットが導入された植物細胞を、植物体に再生す
る工程。

【００２０】上記第４および第５の局面における１つの
実施態様において、上記形質は稔性であり、形質が改変
された植物は、雄性不稔植物である。従って、本発明の
上記方法は、植物に雄性不稔性を付与する方法として、
利用され得る。

【００２１】上記第４および第５の局面における１つの
実施態様において、上記形質は和合性であり、形質が改
変された植物は自家不和合性植物である。従って、本発
明の上記方法は、植物に自家不和合性を付与する方法と
しても、利用され得る。

【００２２】上記第４および第５の局面における１つの
実施態様において、上記植物は双子葉植物である。双子
葉植物は、好ましくはナス科植物であり、より好ましく
はペチュニア属植物である。

【００２３】上記第４および第５の局面における１つの
実施態様において、上記発現カセットは植物発現ベクタ
ーに組み込まれている。

【００２４】本発明の第４および第５の局面によればま
た、上記いずれかに記載の方法により作出された、形質
が改変された植物が提供される。

【００２５】本発明は、その第６の局面において、以下
の（Ｉ’）または（ＩＩ’）のＤＮＡを含むプロモータ
ーに関する：（Ｉ’）配列番号７によって示される塩基
配列の第１位から第２６２４位までの配列を有するＤＮ
Ａ、または（ＩＩ’）（Ｉ’）の一部の配列を有し、小
胞子に特異的なプロモーター活性を示すＤＮＡ。

【００２６】本発明は、その第７の局面において、以下
の（Ｉ”）または（ＩＩ”）のＤＮＡを含むプロモータ
ーに関する：（Ｉ”）配列番号８によって示される塩基
配列の第１位から第３６３１位までの配列を有するＤＮ
Ａ、または（ＩＩ”）（Ｉ”）の一部の配列を有し、小
胞子に、および任意に葯の開裂組織に特異的なプロモー
ター活性を示すＤＮＡ。

【００２７】本発明は、その第８の局面において上記の
小胞子に特異的なプロモーターのいずれかと、上記プロ
モーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、
植物に雄性不稔性を付与するために有用な植物発現カセ
ットに関する。

【００２８】

【発明の実施の形態】本発明について、以下に、より詳
細に説明する。（ＺＰＴ３−２、ＺＰＴ３−１およびＺ
ＰＴ４−１遺伝子由来の転写因子）本発明の第１から第
３までの局面である、雄性不稔性の植物を作出する方法
において有用な核酸は、以下のいずれかである：（ｉ）
配列番号１によって示される塩基配列の第１位から第７
７７位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉ’）配列番号３
によって示される塩基配列の第１位から第１６４０位ま
での配列を有するＤＮＡ、（ｉ”）配列番号５によって
示される塩基配列の第１位から第１９４８位までの配列
を有するＤＮＡ、または、（ｉ）〜（ｉ”）のいずれか
の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子を
コードするＤＮＡ（すなわち、（ｉｉ）、（ｉｉ’）ま
たは（ｉｉ”））、または、上記いずれかのＤＮＡの断
片（すなわち、（ｉｉｉ）、（ｉｉｉ’）または（ｉｉ
ｉ”））であるＤＮＡ。

【００２９】本発明における上記核酸は、好ましくは
（ｉ）、（ｉ’）または（ｉ”）のＤＮＡ、すなわち、
ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−１またはＺＰＴ４−１をコー
ドするＤＮＡ、または、その断片であり、より好ましく
は（ｉ）、（ｉ’）または（ｉ”）のＤＮＡである。

【００３０】本明細書において「転写因子」とは、遺伝
子の調節領域のＤＮＡに結合してｍＲＮＡの合成を制御
するタンパク質をいう。ある種の転写因子は、そのＤＮ
Ａ結合ドメインにジンクフィンガー（ＺＦ）モチーフと
呼ばれる保存性の高いアミノ酸配列を有することが知ら
れている。ＺＰＴ２−５は、Ｃｙｓ２／Ｈｉｓ２型（Ｅ
ＰＦファミリー）のジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク
質であって、１７６アミノ酸からなる全長のアミノ酸配
列内に２つのＺＦモチーフを含み、さらにＤＬＮＬ配列
と称される疎水性領域を含む転写因子である。ＺＰＴ３
−１は、同様に、ＥＰＦファミリーのＺＦタンパク質で
あって、４３７アミノ酸からなる全長のアミノ酸配列内
に３つのＺＦモチーフを含み、さらにＤＬＮＬ配列を含
む転写因子である。ＺＰＴ４−１は、同様に、ＥＰＦフ
ァミリーのＺＦタンパク質であって、４７４アミノ酸か
らなる全長のアミノ酸配列内に４つのＺＦモチーフを含
み、さらにＤＬＮＬ配列を含む転写因子である。いずれ
も、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（前出）を参照のこと。ＺＰ
Ｔ２−５、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１をコードす
るｃＤＮＡ配列（配列番号１、３および５）を、それぞ
れ、対応する推定アミノ酸配列（配列番号２、４および
６）と共に図１Ａ〜１Ｂ、図２Ａ〜２Ｃおよび図３Ａ〜
３Ｄに示す。

【００３１】本明細書において、核酸またはＤＮＡの
「断片」とは、植物体に導入され、適切な様式で発現さ
れたときに、当該植物の内因性の転写因子の発現を抑制
し得る断片をいう。この断片は、上記（ｉ）、
（ｉ’）、（ｉ”）、（ｉｉ）、（ｉｉ’）または（ｉ
ｉ”）のＤＮＡの、ジンクフィンガーモチーフをコード
する領域以外から選択され、少なくとも約４０塩基対以
上、好ましくは約５０塩基対以上、より好ましくは約７
０塩基対以上、さらに好ましくは約１００塩基対以上の
長さを有する。

【００３２】本明細書において、ハイブリダイゼーショ
ンのための「ストリンジェントな条件」とは、特定の塩
基配列（例えば、ペチュニア由来のＺＰＴ２−５、ＺＰ
Ｔ３−１またはＺＰＴ４−１をコードするＤＮＡ）と、
これと相同性の高い他の塩基配列（例えば、ペチュニア
以外の植物に存在する、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−１ま
たはＺＰＴ４−１のホモログをコードするＤＮＡ）との
オリゴヌクレオチド二本鎖を形成させるのに十分な条件
を意図する。本発明に適用されるストリンジェントな条
件の代表的な例として、次の条件が挙げられる：１Ｍ
ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、³²Ｐ
標識プローブＤＮＡ（１ｘ１０⁷ｃｐｍ）および５０μ
ｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、６０℃で１６
時間ハイブリダイズさせた後、２ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳ
で６０℃、３０分間の洗浄を２回繰り返す。

【００３３】本発明における、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３
−１およびＺＰＴ４−１をコードするＤＮＡ、およびこ
れらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡを単
離するためには、公知の転写因子の遺伝子によりコード
されるアミノ酸配列の保存領域に対応するデジェネレー
トプライマー対を用い得る。このプライマー対を用い
て、植物のｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡを鋳型とし
てＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いて、同じ植物のｃＤＮＡライブラリー
またはゲノミックライブラリーをスクリーニングするこ
とができる。そのようなプライマー対の例として、５’
−ＣＡＲＧＣＮＹＴＮＧＧＮＧＧＮＣＡＹ−３’（配列
番号９）と、３’−ＲＴＧＮＣＣＮＣＣＮＡＲＮＧＣＹ
ＴＧ−５’（配列番号１０）との組合せが挙げられる
（ここで、Ｎはイノシンであり、ＲはＧまたはＡであ
り、そしてＹはＣまたはＴである）。上記プライマー配
列は、それぞれ、上記ＺＰＴ転写因子群のジンクフィン
ガーモチーフに含まれるアミノ酸配列ＱＡＬＧＧＨに対
応する。

【００３４】従って、本発明に適用されるストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件はまた、ＰＣＲの条
件としても規定され得、代表的な例においては、上記デ
ジェネレートプライマー（配列番号９および１０）が用
いられ得る。この際のＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分
間の変性の後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、
そして７２℃で１分間を３０サイクル繰り返し、最後
に、７２℃で７分間インキュベーションを行う条件であ
り得る。

【００３５】ＰＣＲは、市販のキットおよび装置の製造
者の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い
得る。遺伝子ライブラリーの作製法、および遺伝子のク
ローニング法なども当業者に周知である。例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８９）を参照のこと。得られた遺伝子
の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析
法または市販されている自動シーケンサーを利用して決
定し得る。

【００３６】本明細書において、転写因子が「花粉の発
達を制御する」とは、代表的には、この転写因子の発現
が阻害されるとき、花粉の形態または機能において有意
な変化が観察されることをいう。本発明における転写因
子は、代表的には、それをコードする遺伝子の発現が阻
害されることにより、好ましくは約７５％以上、より好
ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上
の花粉細胞を、成熟する前に死滅せしめる。ここで、転
写因子の発現が阻害されるとは、ノーザンブロット法に
より測定したとき、ｍＲＮＡの量が、野生型のコントロ
ール植物と比較して約１０分の１以下になることをい
う。

【００３７】上記のようなスクリーニングによって単
離、同定された遺伝子によってコードされる転写因子
（すなわち、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ
４−１、およびこれらのホモログ）が花粉の発達を制御
することは、本明細書の開示に従って形質転換植物を作
出し、その花粉の特性を観察することによって、確認し
得る。

【００３８】本発明においては、花粉の発達を制御する
転写因子をコードするＤＮＡを利用して、植物細胞にお
いて、当該ＤＮＡと同一のまたは相同な塩基配列を含む
内因性遺伝子の発現を抑制し得る。標的となる内因性遺
伝子もまた、花粉の発達を制御する転写因子である。本
発明の方法によれば、好ましくは、花粉の発達を制御す
る内因性転写因子以外の発現を実質的に抑制することな
く、内因性転写因子の発現のみを選択的に抑制すること
によって、植物に雄性不稔性が付与される。

【００３９】すなわち、本発明における発現抑制技術が
適用される植物細胞は、花粉の発達を制御する内因性の
転写因子を有する植物の細胞であって、この内因性の転
写因子をコードする遺伝子は、上記ＺＰＴ２−５、ＺＰ
Ｔ３−１またはＺＰＴ４−１、またはこれらのホモログ
のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するものとして規定される。ここで「ストリンジェント
な条件」の定義は、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−１および
ＺＰＴ４−１のホモログの特定に関連して上述した条件
と同じである。本発明の範囲を限定する意図ではない
が、上記方法によって雄性不稔性を付与し得る植物は、
上記ＺＰＴ遺伝子群が単離されたペチュニア、または上
記ＺＰＴホモログをコードする遺伝子が単離された植物
と、進化系統学上近縁の植物であることが望ましい。こ
こで、進化系統学上近縁とは、代表的には同じ目に分類
され、好ましくは同じ科に分類され、より好ましくは同
じ属に分類され、さらに好ましくは同じ種に分類される
植物である。もっとも、花粉の発達が種子植物の生殖に
不可欠である事実を考慮すれば、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ
３−１およびＺＰＴ４−１と同一または類似の機能を果
たす転写因子が他の植物にも広く存在し得ることは容易
に理解される。

【００４０】内因性遺伝子の発現を抑制するための手法
として、代表的にはコサプレッションおよびアンチセン
ス技術を利用し得る。コサプレッションは、植物細胞に
組み換え遺伝子を導入したとき、その遺伝子自体、およ
びその遺伝子の一部と相同な配列を含む内因性遺伝子の
両者の発現が抑制されることをいう。コサプレッション
が利用される場合、本発明における発現カセットは、転
写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を、プロモー
ターに対して順方向で連結された形態で含む。転写因子
をコードするＤＮＡまたはその断片は、発現カセットと
して植物細胞に導入された後、プロモーターの制御下で
センス方向に転写され得る。この導入ＤＮＡの作用によ
り、所望とする遺伝子発現の抑制が可能となる。コサプ
レッションは、形質転換植物の一部の個体で認められ、
他の個体では十分に起こらない場合が多い。そのため、
通常、遺伝子発現が意図されたように抑制された個体
が、慣用的な手順に従って選択される。

【００４１】アンチセンスは、植物細胞に組み換え遺伝
子を導入したとき、導入遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）
が、内因性遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相補的な配
列とハイブリッドを形成して、内因性遺伝子がコードす
るタンパク質の翻訳が阻害されることをいう。アンチセ
ンスが利用される場合、本発明における発現カセット
は、転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を、プ
ロモーターに対して逆方向で連結された形態で含む。転
写因子をコードするＤＮＡまたはその断片は、発現カセ
ットとして植物細胞に導入された後、プロモーターの制
御下でアンチセンス方向に転写され得る。このアンチセ
ンス転写物の作用により、所望とする遺伝子発現の抑制
が可能となる。

【００４２】（ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１遺伝子
由来のプロモーター）本発明の第４および第５の局面で
ある、形質が改変された植物を作出する方法において有
用なプロモーターは、（ａ’）配列番号７によって示さ
れる塩基配列の第１位から第２６２４位までの配列を有
するＤＮＡ、（ａ”）配列番号８によって示される塩基
配列の第１位から第３６３１位までの配列を有するＤＮ
Ａ、または、（ａ’）または（ａ”）の一部の配列を有
し、小胞子に特異的なプロモーター活性を示すＤＮＡの
いずれかを含むプロモーターである。本発明における上
記プロモーターは、好ましくは（ａ’）または（ａ”）
のプロモーター、すなわち、ＺＰＴ３−１またはＺＰＴ
４−１遺伝子のプロモーターである。

【００４３】ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１遺伝子の
プロモーター領域の、組識特異的な発現活性に必須でな
い配列を除去して得られる、小胞子に特異的なプロモー
ター活性を有する配列は、本発明の範囲内にある。この
ような配列は、常法に従ってプロモーターのデリーショ
ン実験を行うことによって、得ることができる。簡潔に
は、ＺＰＴ３−１またはＺＰＴ４−１遺伝子のプロモー
ター領域の様々な欠失変異体（例えば、ＺＰＴ３−１ま
たはＺＰＴ４−１遺伝子のプロモーター領域を、５’上
流側から種々の長さに欠失させた変異体）と、適切なレ
ポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子）とを融合した
プラスミドを用いて、欠失変異体の組識特異的プロモー
ター活性を測定することによって、その活性に必須な領
域を特定し得る。

【００４４】いったんプロモーター活性に必須の領域が
特定されると、さらにその領域内の配列または隣接配列
を改変して、プロモーターの発現活性の程度を高めるこ
とも可能である。このようにして得られる改変体もま
た、小胞子に特異的なプロモーター活性を示す限り、本
発明の範囲内にある。

【００４５】本発明において、「小胞子に特異的なプロ
モーター活性を示す」とは、プロモーターが、天然の植
物中で、または任意の構造遺伝子に連結させた発現カセ
ットとして植物に導入されたときに、ＤＮＡの転写を開
始させることにより遺伝子の発現を指示する能力を、小
胞子において特異的に示すことを意味する。ここで「特
異的」とは、同じ植物体の花の、他のすべての組織（タ
ペート層、花糸、花柱、花頭、花弁、萼（がく）などを
含む；ただし葯の開裂組織を除く）よりも、プロモータ
ーの発現活性が高いことをいう。上記特異的なプロモー
ターは、好ましくは、同じ植物体の花の他のすべての組
織および花以外の部分（根、葉、茎など）よりも、プロ
モーターの発現活性が高く、より好ましくは、同じ植物
体の花の他のすべての組織および花以外の部分において
実質的に活性を示さない。「葯の開裂組織に特異的なプ
ロモーター活性を示す」も、上記と同様に定義される。
発現活性の程度は、常法に従って、小胞子におけるプロ
モーターの発現レベルと、花の他の組識における同じプ
ロモータの発現レベルとを比較することによって、評価
され得る。プロモーターの発現レベルは、通常、そのプ
ロモーターの制御下で発現される遺伝子産物の産生量に
よって決定される。

【００４６】上記の特異的プロモーターを利用する本発
明の方法は、植物の生殖に関連する形質を改変すること
が意図される。ここで「改変」とは、形質転換後の植物
における生殖器官の少なくとも一部が、形質転換前の植
物（野生種または園芸品種）に存在していた機能を失う
か、形質転換前の植物に存在しなかった機能を獲得する
か、または形質転換前の植物と比べて特定の機能の程度
が増強もしくは低減されることをいう。このような形質
の改変は、本発明におけるプロモーターに作動可能に連
結された任意の異種遺伝子が、この遺伝子を導入された
形質転換植物において、プロモーターの制御下で小胞子
に特異的に発現される結果として生じ得る。多くの組織
特異的プロモーターにおいて、その組織特異性が種間を
越えて保存されていることは周知であるので、本発明の
プロモーターもまた幅広い植物種に適用し得ることが容
易に理解される。形質の改変の程度は、形質転換後の植
物の形質を、形質転換前の植物の形質と比較することに
より評価され得る。改変される好ましい形質としては、
雌性不稔および自家不和合性が挙げられるが、これらに
限定されない。

【００４７】本発明のプロモーターは、例えば、公知の
ｃＤＮＡをプローブとして用いて、植物のゲノミックラ
イブラリーをスクリーニングし、そして対応のゲノミッ
ククローンからコード領域の上流配列を単離することに
より得ることができる。ｃＤＮＡの例として、上述した
ペチュニア由来の転写因子であるＺＰＴ３−１およびＺ
ＰＴ４−１のｃＤＮＡが挙げられる。

【００４８】本発明におけるプロモーターは、天然から
単離されたものに限定されず、合成ポリヌクレオチドも
含み得る。合成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のよ
うにして配列決定されたプロモーターの配列またはその
活性領域を、当業者に周知の手法によって合成または改
変することにより入手し得る。

【００４９】（発現カセットおよび発現ベクターの構
築）本発明における転写因子をコードするＤＮＡは、当
業者に周知の方法を用いて、適切なプロモーターに作動
可能に連結された発現カセットとして、公知の遺伝子組
換え技術を用いて、植物細胞に導入され得る。同様に、
本発明における小胞子特異的プロモーターは、所望の異
種遺伝子に作動可能に連結された発現カセットとして、
植物細胞に導入され得る。

【００５０】上記転写因子に連結され得る「プロモータ
ー」は、植物で発現する任意のプロモーターを意味し、
構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および
誘導性プロモーターのいずれをも含み得る。

【００５１】「構成的プロモーター」は、植物細胞内外
の刺激と関係なく一定のレベルで構造遺伝子を発現せし
めるプロモーターをいう。異種遺伝子が植物の他の組織
または器官で発現しても、植物に望ましくない形質を与
えない場合には、構成的プロモーターの使用が簡便であ
り、好ましい。構成的プロモーターの例としては、カリ
フラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモ
ーター（Ｐ３５Ｓ）、およびノパリン合成酵素のプロモ
ーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定され
ない。

【００５２】「組織特異的プロモーター」は、本発明に
おいては、少なくとも小胞子において特異的に構造遺伝
子を発現せしめるプロモーターをいう。このような組織
特異的プロモーターには、本発明におけるＺＰＴ３−１
およびＺＰＴ４−１遺伝子由来のプロモーターに加え
て、葯特異的に発現活性を示す他の公知のプロモーター
が含まれる。したがって、小胞子特異的プロモーターと
転写因子をコードする配列とを含む、天然のＺＰＴ３−
１およびＺＰＴ４−１遺伝子の発現カセット自体を、必
要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて、使用す
ることも本発明の範囲に含まれる。

【００５３】「誘導性プロモーター」は、化学薬剤、物
理的ストレスなどの特定の刺激を与えたときに構造遺伝
子を発現せしめ、刺激の非存在下では発現活性を示さな
いプロモーターをいう。誘導性プロモーターの例として
は、オーキシンで誘導可能な、グルタチオン Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）プロモーター（ｖａｎ ｄｅ
ｒ Ｋｏｐ，Ｄ．Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉ
ｏｌ．，３９：９７９，１９９９）が挙げられるが、こ
れに限定されない。

【００５４】本明細書において、用語「発現カセット」
または「植物発現カセット」とは、本発明における転写
因子をコードするＤＮＡと、これに作動可能に（すなわ
ち、当該ＤＮＡの発現を制御し得るように）連結された
植物発現プロモーターとを含む核酸配列、ならびに、本
発明における小胞子特異的プロモーターと、これに作動
可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺
伝子とを含む核酸配列をいう。

【００５５】上記の小胞子特異的プロモーターに連結さ
れ得る「異種遺伝子」とは、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ
４−１遺伝子以外のペチュニアにおける内因性遺伝子、
もしくはペチュニア以外の植物における内因性遺伝子、
または植物に対して外来の遺伝子（例えば、動物、昆
虫、細菌、および真菌に由来する遺伝子）であって、そ
の遺伝子産物の発現が小胞子において所望される任意の
遺伝子をいう。本発明における異種遺伝子の好ましい例
は、コードする遺伝子産物が細胞毒性を示し、その発現
によって花粉の発達を阻害する遺伝子である。このよう
な遺伝子の具体例としてｂａｒｎａｓｅ遺伝子（Ｂｅａ
ｌｓ，Ｔ．Ｐ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ｂ．，Ｐ
ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，９：１５２７，１９９７）が挙げ
られるが、これに限定されない。

【００５６】「植物発現ベクター」は、発現カセットに
加えて、さらに種々の調節エレメントが、宿主植物の細
胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をい
う。好適には、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およ
びエンハンサーを含み得る。植物発現ベクターのタイプ
および使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に
応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ
領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテ
リウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入
の効率を高める。

【００５７】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡ
に転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加
に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの
安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼす
ことが知られている。ターミネーターの例としては、ノ
パリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、
およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５
Ｓターミネーターが挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００５８】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマ
イシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、
これらに限定されない。

【００５９】本発明における植物発現ベクターは、当業
者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植
物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクタ
ーまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、こ
れらに限定されない。

【００６０】（形質転換植物の作出）上述のように構築
された発現カセット、またはこれを含む発現ベクター
は、公知の遺伝子組換え技術を用いて、所望の植物細胞
に導入され得る。導入された発現カセットは、植物細胞
中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中
のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれ
る各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）
に含まれるＤＮＡをも含む。

【００６１】本明細書において、用語「植物」は、単子
葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物
は、双子葉植物である。双子葉植物は、離弁花亜綱およ
び合弁花亜綱のいずれも含む。好ましい亜綱は、合弁花
亜綱である。合弁花亜綱は、リンドウ目、ナス目、シソ
目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグ
サ目、アカネ目、マツムシソウ目、およびキク目のいず
れも含む。好ましい目は、ナス目である。ナス目は、ナ
ス科、ハゼリソウ科、ハナシノブ科、ネナシカズラ科、
およびヒルガオ科のいずれも含む。好ましい科は、ナス
科である。ナス科は、ペチュニア属、チョウセンアサガ
オ属、タバコ属、ナス属、トマト属、トウガラシ属、ホ
オズキ属、およびクコ属などを含む。好ましい属は、ペ
チュニア属、チョウセンアサガオ属、およびタバコ属で
あり、より好ましくは、ペチュニア属である。ペチュニ
ア属は、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ種、Ｐ．ａｘｉｌｌａｒｉ
ｓ種、Ｐ．ｉｎｆｌａｔａ種、およびＰ．ｖｉｏｌａｃ
ｅａ種などを含む。好ましい種は、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ
種である。「植物」は、特に他で示さない限り、花を有
する植物体および植物体から得られる種子を意味する。

【００６２】「植物細胞」の例としては、花、葉、およ
び根などの植物器官における各組織の細胞、カルスなら
びに懸濁培養細胞が挙げられる。

【００６３】植物細胞への植物発現ベクターの導入に
は、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウム
を介する方法、および直接細胞に導入する方法が用いら
れ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例
えば、Ｎａｇｅｌらの方法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ６７：３２５（１９９０））が
用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで
（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバ
クテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグ
ロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法に
より植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクター
を直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレー
ション法、パーティクルガン、リン酸カルシウム法、お
よびポリエチレングリコール法などがある。これらの方
法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物
に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。

【００６４】植物発現ベクターを導入された細胞は、例
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。

【００６５】再生した植物体において、導入した植物発
現ベクターが機能的であることは、当業者に周知の手法
を用いて確認し得る。例えば、内因性遺伝子の発現の抑
制を目的とする場合、この確認は、ノーザンブロット解
析を用いた転写レベルの測定によって行い得る。このよ
うにして、内因性の転写因子の発現が抑制された所望と
する形質転換植物体を選択することができる。組織特異
的プロモーターを用いた異種遺伝子の発現を目的とする
場合も、異種遺伝子の発現の確認は、通常、対象組織か
ら抽出されたＲＮＡを試料とするノーザンブロット解析
を用いて行い得る。この解析法の手順は当業者に周知で
ある。

【００６６】本発明の方法に従って内因性の転写因子の
発現が抑制され、花粉の稔性が低下したことは、例え
ば、転写因子をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで
形質転換して得られた植物の花粉の形態を、必要に応じ
て組識化学的染色を行ったうえ、顕微鏡観察することで
確認できる。

【００６７】また、本発明の方法に従ってプロモーター
が小胞子に特異的に発現されたことは、例えば、プロモ
ータとＧＵＳ遺伝子とが作動可能に連結された発現ベク
ターで形質転換して得られた植物における、葯を含む花
の組織でのＧＵＳ活性の分布を、常法により組識化学的
染色を行うことで確認できる。

【００６８】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明を説明す
る。本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものでは
ない。実施例で使用される制限酵素、プラスミドなど
は、商業的な供給源から入手可能である。

【００６９】（実施例１：ＺＰＴ転写因子群をコードす
るポリヌクレオチドを含む植物発現ベクターの構築）以
前に報告した葯特異的ＺＦ遺伝子（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ
ら、前出）のうち、ＰＥＴｈｙＺＰＴ２−５（ＺＰＴ２
−５）、ＰＥＴｈｙＺＰＴ３−１（ＺＰＴ３−１）、お
よびＰＥＴｈｙＺＰＴ４−１（ＺＰＴ４−１）のｃＤＮ
Ａを、それぞれ、カリフラワーモザイクウイルスの３５
Ｓプロモーターの下流につないで、植物発現ベクターを
作成した。具体的には、下記の通りである。

【００７０】（実施例１−１）プラスミドｐＢＩ２２１
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．から購入）中のカリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーターを含むＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ
ｂａＩ断片）およびＮＯＳターミネーターを含むＤＮＡ
断片（ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を順次プラスミドｐ
ＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｆ．Ａ．ら、Ｔｒ
ａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，４：２８８，１９９５）
のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＵＣＡＰ３５
Ｓを作製した。一方、ＺＰＴ２−５のｃＤＮＡを含むｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ベクターをＫｐｎＩサイトおよ
びＳａｃＩサイト（いずれもベクター中のサイト）で切
断し、上記ｐＵＣＡＰ３５ＳのＫｐｎＩおよびＳａｃＩ
サイトの間に挿入した。さらにこの組み替えプラスミド
をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＺＰＴ２
−５をコードするＤＮＡ断片をバイナリーベクターｐＢ
ＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ， Ｆ．Ａ．
ら、前出）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに
導入した。構築されたＺＰＴ２−５遺伝子は、図４
（ａ）から明らかなように、カリフラワーモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター領域（Ｐ３５
Ｓ；０．９ ｋｂ）、本発明のＺＰＴ２−５をコードす
るポリヌクレオチド（ＺＰＴ２−５；約０．８ｋｂ）、
およびノパリン合成酵素のターミネーター領域（Ｔｎｏ
ｓ；０．３ｋｂ）から構成されている。図４中のＰｎｏ
ｓは、ノパリン合成酵素のプロモーター領域、ＮＰＴＩ
ＩはネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子
を示す。

【００７１】（実施例１−２）ＺＰＴ３−１のｃＤＮＡ
を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ベクターをＫｐｎＩサ
イトおよびＳａｃＩサイト（いずれもベクター中のサイ
ト）で切断し、ｐＵＣＡＰ３５ＳのＫｐｎＩおよびＳａ
ｃＩサイトの間に挿入した。さらにこの組み換えプラス
ミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＺＰ
Ｔ３−１をコードするＤＮＡ断片をバイナリーベクター
ｐＢＩＮＰＬＵＳのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサ
イトに導入した。構築されたＺＰＴ３−１遺伝子は、図
４（ｂ）から明らかなように、カリフラワーモザイクウ
イルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター領域（Ｐ３５
Ｓ；０．９ｋｂ）、本発明のＺＰＴ３−１をコードする
ポリヌクレオチド（ＺＰＴ３−１；約１．７ｋｂ）、お
よびノパリン合成酵素のターミネーター領域（Ｔｎｏ
ｓ；０．３ｋｂ）から構成されている。

【００７２】（実施例１−３）ＺＰＴ４−１のｃＤＮＡ
を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ベクターをＫｐｎＩサ
イトおよびＳａｃＩサイト（いずれもベクター中のサイ
ト）で切断し、上記ｐＵＣＡＰ３５ＳのＫｐｎＩおよび
ＳａｃＩサイトの間に挿入した。さらにこの組み換えプ
ラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
ＺＰＴ４−１をコードするＤＮＡ断片をバイナリーベク
ターｐＢＩＮＰＬＵＳのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉサイトに導入した。構築されたＺＰＴ４−１遺伝子
は、図４（ｃ）から明らかなように、カリフラワーモザ
イクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター領域
（Ｐ３５Ｓ；０．９ｋｂ）、本発明のＺＰＴ４−１をコ
ードするポリヌクレオチド（ＺＰＴ４−１；約２．０ｋ
ｂ），およびノパリン合成酵素のターミネーター領域
（Ｔｎｏｓ；０．３ｋｂ）から構成されている。

【００７３】（実施例２：ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４
−１プロモーター領域の単離ならびにＧＵＳレポーター
遺伝子との連結）ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１のｃ
ＤＮＡをプローブにして、ペチュニアのゲノムＤＮＡラ
イブラリーから、対応するゲノミック・クローンを単離
し、転写開始点上流のＤＮＡ断片（プロモーター領域；
約２．７ｋｂおよび約３．６ｋｂ）をサブクローニング
した。それぞれのＤＮＡ断片をＧＵＳレポーター遺伝子
の上流につないでバイナリー・ベクターにクローニング
した。具体的には、以下の通りである。

【００７４】（実施例２−１）ＺＰＴ３−１のｃＤＮＡ
を、通常のランダムプライム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
前出）を用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識して放射性
標識プローブを作製し、これを用いてＥＭＢＬ３ベクタ
ー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）中に作製したペチュニア
（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ｖａｒ． Ｍｉｔ
ｃｈｅｌｌ）のゲノミックライブラリーをスクリーニン
グした。得られたクローンから遺伝子上流領域を含む約
２．７ｋｂのゲノムＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ）
をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクターのＰｓｔＩ−Ｓ
ａｃＩサイトにサブクローニングし（ｐＢＳ−ＺＰＴ３
−１−ＰＳ）、塩基配列を決定した（図５Ａ〜５Ｂ）。
次に、このプラスミドを鋳型とし、ＳａｌＩ認識配列を
含むプライマー（３’−ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧ
ＡＣＡＧ ＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＴＧＧ
ＣＴＡＴＴＧＴＣ−５’；配列番号１１）および市販の
Ｍ１３−２０プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＺＰＴ
３−１タンパク質翻訳開始点のすぐ下流（塩基番号２６
６１）にＳａｌＩサイトを導入した。そして、ＰｓｔＩ
およびＳａｌＩで切断して得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ
ＡＰＧＵＳＮＴのＧＵＳコード領域の上流に挿入した
（ｐＵＣＡＰ−ＺＰＴ３−１−ＧＵＳＮＴ）。これによ
ってＺＰＴ３−１遺伝子コード領域のＮ末端近傍の領域
でｉｎ ｆｒａｍｅでＧＵＳコード領域と接続された。
さらにｐＵＣＡＰ−ＺＰＴ３−１−ＧＵＳＮＴをＡｓｃ
ＩおよびＰａｃＩで切断して得られるＤＮＡ断片（ＺＰ
Ｔ３−１プロモーター、ＧＵＳコード領域およびＮＯＳ
ターミネーターを含む）をｐＢＩＮＰＬＵＳベクターに
挿入し、ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−１−ＧＵＳを得た（図７
（ａ））。

【００７５】（実施例２−２）ＺＰＴ４−１についても
同様にゲノムＤＮＡを単離し、ＺＰＴ４−１遺伝子上流
領域を含む約３．６ｋｂのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクターのＥ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングし（ｐ
ＢＳ−ＺＰＴ４−１−ＥＥ）、塩基配列を決定した（図
６Ａ〜６Ｂ）。このプラスミドを鋳型にし、ＢａｍＨＩ
認識配列（３’−ＣＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴ
ＡＴＡＴＣ−５’；配列番号１２）を含むプライマーお
よびＭ１３−２０プライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｚ
ＰＴ４−１タンパク質翻訳開始点のすぐ下流（塩基番号
３６４１）にＢａｍＨＩサイトを導入した。そして、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して得られたＤＮＡ断
片をｐＵＣＡＰＧＵＳＮＴのＧＵＳコード領域の上流に
挿入した（ｐＵＣＡＰ−ＺＰＴ４−１−ＧＵＳＮＴ）。
これによってＺＰＴ４−１遺伝子コード領域のＮ末端近
傍の領域でｉｎ ｆｒａｍｅでＧＵＳコード領域と接続
された。さらに、上記と同様にしてＤＮＡ断片（Ａｓｃ
Ｉ−ＰａｃＩ）をｐＢＩＮＰＬＵＳベクターに挿入し、
ｐＢＩＮ−ＺＰＴ４−１−ＧＵＳを作製した（図７
（ｂ））。

【００７６】（実施例３：各融合遺伝子のペチュニア細
胞への導入）上記の各発現ベクターを、以下の手順で、
アグロバクテリウムを介して、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎ
ｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ｖａｒ． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）
に導入した。

【００７７】（１）アグロバクテリウム・チュメファシ
エンスＬＢＡ４４０４株（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入）を２５０ｍｇ／
ｍｌのストレプトマイシンと５０ｍｇ／ｍｌのリファン
ピシンを含むＬ培地中、２８℃で培養した。Ｎａｇｅｌ
ら（１９９０）（前出）の方法に従って、細胞懸濁液を
調製し、実施例１および２で構築したプラスミドベクタ
ーをエレクトロポレーションにより、上記菌株に導入し
た。

【００７８】（２）各融合遺伝子をコードするポリヌク
レオチドを、以下の方法によって、ペチュニア細胞へ導
入した：上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスＬＢＡ４４０４株をＹＥＢ培地（ＤＮ
Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ第２巻、７８頁、Ｇｌｏｖｅｒ
Ｄ．Ｍ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８５）で振とう
培養（２８℃、２００ｒｐｍ）した。得られた培養液
を、滅菌水で２０倍に希釈し、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎ
ｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ｖａｒ． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）
の葉片と共存培養した。２〜３日後、抗生物質を含む培
地で上記細菌を除去し、２週間ごとに選択培地で継代
し、上記５種類の融合遺伝子と共に導入された、ｐＢＩ
ＮＰＬＵＳ由来のＮＰＴＩＩ遺伝子発現によるカナマイ
シン抵抗性の有無に基づいて、形質転換されたペチュニ
ア細胞を選抜した。選抜した細胞を、常法によりカルス
を誘導した後、植物体に再分化した（Ｊｏｒｇｅｎｓｅ
ｎ Ｒ．Ａ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，
３１：９５７，１９９６）。

【００７９】（実施例４：ＺＰＴ遺伝子群を導入した形
質転換ペチュニアの表現型）実施例１のベクターを導入
して得られた形質転換体を用い、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ
３−１およびＺＰＴ４−１の発現の制御に伴う花粉の形
態変化を観察することによって、これらＺＰＴ遺伝子群
のｃＤＮＡ導入による植物への影響を検討した。具体的
には、以下の通りである。

【００８０】（実施例４−１）ＺＰＴ２−５のｃＤＮＡ
を３５Ｓプロモーターの制御下に導入した形質転換体
（１４個体）から、ノーザンブロット解析によって、コ
サプレッションによる遺伝子発現の抑制が起こった個体
（３個体）を選抜した。（なお、１４個体のうち他の４
個体では、導入したＺＰＴ２−５遺伝子の過剰発現が観
察された。）ノーザンブロット解析の条件は、次の通
り：７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、２
％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ製）、５０ｍＭリン酸ナトリウム・バッファー
（ｐＨ７．０）、０．１％ラウリルサルコシン・ナトリ
ウム、５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、および³²Ｐ標識プ
ローブＤＮＡ（１ｘ１０⁷ｃｐｍ）を含む溶液中で、６
８℃で１６時間ハイブリダイズさせた後、２ｘＳＳＣ／
０．１％ＳＤＳで６８℃、３０分間の洗浄。

【００８１】上記のコサプレッション形質転換体３個体
において、以下のような表現型が観察された（図８）。

【００８２】四分子期の直前に起こる減数分裂の過程に
おいて、正常な（野生型の）ペチュニアでは、クロマチ
ンの凝縮による細糸状構造の形成に続き（前期Ｉの細糸
期）、相同染色体が対合する（前期Ｉの接合糸期）。次
に、中期Ｉ（ｍｅｔａｐｈａｓｅＩ）に入ると、４分染
色体が細胞赤道面にならび、その後、紡錘装置によって
相同染色体が均等に細胞の両極に分離する。他方、ＺＰ
Ｔ２−５遺伝子のコサプレッションを起こした形質転換
体では、中期Ｉにおいて４分染色体が細胞赤道面に正し
く並ぶことのないまま、染色体の極分離が進行した。こ
のとき、染色体の両極への分配が著しく不均等であっ
た。

【００８３】正常な減数分裂の過程では、上記１回目の
染色体分離の後、２回目の染色体分離によって、４つの
ハプロイドのグループが形成され、その後に細胞質分離
が起こる。他方、上記のコサプレッションを起こした形
質転換体では、一回目の染色体分離の直後に細胞質分離
および細胞分裂が起こった。また、この不均等な細胞分
裂は一回でとどまらず、少なくともさらに二回繰り返さ
れて、最高８個の小胞子細胞が形成された。不均等な染
色体分離のために、これらの小胞子細胞に含まれる染色
体数は不均一であり、それに伴って、細胞の大きさも著
しく不均等であった。結果として、正常なペチュニアに
おいて四分子期にあたる時期に、これらの形質転換体で
は、正常より多い数の小胞子（最高８個）が形成されて
いた（図８（ｆ）；つぼみのサイズ６ｍｍにおけるＺＰ
Ｔ２−５コサプレッション形質転換体の花粉細胞の写
真。また、図９（ｂ）；四分子期における形質転換体の
花粉細胞の写真も参照）。

【００８４】コサプレッション形質転換体において、小
胞子の一部（１０−２０％）はその後も発達を続けた
が、大部分の小胞子細胞は、これらを包むカロース層が
分解される前に、破裂した。この段階で破裂せずに生き
残った小胞子は、六面体に近い異常形態を示し、正常な
小胞子の４面体形態とは明らかに異なっていた。異常形
態の小胞子は、その後、一見正常な有糸分裂によって二
核となって、花粉粒を形成した。しかし、これらの花粉
粒は稔性をほとんど失っていた。すなわち、正常なペチ
ュニアの雌ずいにこれらの形質転換体の花粉粒をかける
と、コサプレッションを示した３系統からの花粉では、
種子形成が全く無いか、または、わずかに種子が形成さ
れるのみ（最高でも１０％、つまり、ペチュニア１株あ
たりで産生される種子の数が、約１０個の花の平均とし
て、コントロールの１割）であった。コサプレッション
を示さない形質転換体３系統からの花粉では、野生型の
コントロール植物の場合と同様の、正常な種子形成が確
認された。

【００８５】上記のコサプレッション形質転換体はま
た、雌性配偶体形成にも異常を示し、雌性稔性が正常個
体の２５−３５％に低下していた。すなわち、胚珠（雌
性配偶体）の発達は外観上正常であったものの、野生型
の花粉で受粉したとき過半数の胚珠が受精できず、受精
したものも以後の発達に異常を示し、多くが死滅（ａｂ
ｏｒｔ）した。この場合も、コサプレッションを示さな
い形質転換体では、野生型のコントロール植物の場合と
同様の、正常な雌性配偶体形成が観察された。

【００８６】（実施例４−２）ＺＰＴ３−１のｃＤＮＡ
を３５Ｓプロモーターの支配下に導入すると、ＺＰＴ２
−５遺伝子を導入した場合と同様の形質変化が、１５個
体中、３個体に表れた（図９）。すなわち、これらの形
質転換体では、減数分裂の過程でＺＰＴ２−５の場合と
全く同様の異常が見られた。そして、小胞子期まで発達
する細胞数は非常に少なく、生き残った小胞子は形態異
常（６面体）を示した。さらに、成熟した花粉粒は稔性
を失っていた。しかし、ＺＰＴ２−５の場合とは異な
り、これらの個体では雌性稔性には影響がなかった。

【００８７】実施例４−１と同じ条件でのノーザンブロ
ット法による遺伝子発現解析の結果、ＺＰＴ３−１遺伝
子を導入した個体においては、ＺＰＴ３−１とＺＰＴ４
−１との両方の遺伝子の発現抑制が観察された。両遺伝
子は、構造的類似性が高い。すなわち、コード領域全体
の塩基配列の相同性は３７％であり、ＺＰＴ３−１の２
番目のＺＦ領域とＺＰＴ４−１の３番目のＺＦ領域、お
よびＺＰＴ３−１の３番目のＺＦ領域とＺＰＴ４−１の
４番目のＺＦ領域とを、相同性値が最大化されるように
近傍の配列を含めて、塩基配列レベルで、それぞれ比較
したときの相同性の平均値は８６％である（配列比較は
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムによる）。従って、上記
の発現抑制事象は、一つの遺伝子の導入によって二つの
遺伝子の発現抑制（コサプレッション）が起こったこと
による可能性が高い。このことは、これら二つの遺伝子
の機能が重複していることを示唆し、両遺伝子の各々の
導入によって共通した表現型の変化が見られることとも
符合する。

【００８８】（実施例４−３）ＺＰＴ４−１のｃＤＮＡ
を３５Ｓプロモーターの支配下に導入すると、ＺＰＴ２
−５遺伝子を導入した場合と同様の形質変化が、１３個
体中、２個体に表れた。すなわち、これらの形質転換体
では、減数分裂の過程でＺＰＴ２−５の場合と全く同様
の異常が見られた。そして、小胞子期まで発達する細胞
数は非常に少なく、生き残った小胞子は形態異常（６面
体）を示した。さらに、成熟した花粉粒は稔性をほとん
ど失っていた。しかし、ＺＰＴ３−１の場合と同様に、
これらの個体では雌性稔性には影響がなかった。上述し
た理由から、本実施例においても、ＺＰＴ３−１とＺＰ
Ｔ４−１との両方の遺伝子の発現抑制（コサプレッショ
ン）が起こった可能性が高い。

【００８９】以上のように、ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−
１またはＺＰＴ４−１をコードする遺伝子の導入によっ
て、きわめて高い効率で、花粉の発達を阻害し、稔性を
喪失させることができる（ＺＰＴ３−１で９９％以上、
ＺＰＴ２−５およびＺＰＴ４−１で９０％以上）。ま
た、これらの遺伝子群の導入は、その効果が花粉（ＺＰ
Ｔ２−５の場合、花粉および雌性配偶体）に特異的であ
り、植物の他の形質に影響を与えない点で、選択的な形
質改変技術として有用であり得る。

【００９０】（実施例５：ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４
−１プロモーター活性の組織特異性）実施例２のベクタ
ーを導入して得られた形質転換体を用い、ＧＵＳ活性に
よる組織化学的染色を行うことによって、上記ＤＮＡ断
片が有する組織特異的プロモーター活性を検出した。具
体的には、以下の通りである。

【００９１】（実施例５−１）ＺＰＴ３−１遺伝子の上
流領域とＧＵＳとの融合遺伝子を導入して得られた形質
転換体の花を用い、Ｘ−ＧＵＳを基質にしてＧＵＳ活性
の分布を調べた（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｓ．Ｒ．編、Ｇ
ＵＳ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＧＵ
Ｓ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｏｆ ｇ
ｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．１０３−１１４，１９９
２）。その結果、ＧＵＳ活性は１核期の小胞子において
特異的に検出された（図１０（ａ）〜（ｃ））。

【００９２】（実施例５−２）ＺＰＴ４−１遺伝子の上
流領域とＧＵＳとの融合遺伝子を導入して得られた形質
転換体の花を用い、上記と同様にＧＵＳ活性の分布を調
べた。その結果、ＧＵＳ活性は、一核期から二核期にか
けての小胞子および葯の開裂組織において特異的に観察
された（図１０（ｄ）〜（ｆ）；葯の開裂組織を図１０
（ｅ）および（ｆ）に矢印で示す）。

【００９３】以上のように、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ
４−１遺伝子のプロモーターは、一核期の小胞子（ＺＰ
Ｔ３−１）および一核期から二核期にかけての小胞子
（ＺＰＴ４−１）にそれぞれ特異的な活性を示す。ＺＰ
Ｔ４−１遺伝子のプロモーターは、一核期から二核期に
かけての葯の開裂組織にも特異的な活性を示す。

【００９４】小胞子は、のちに成熟して花粉粒を生成す
る前駆細胞である。従って、これらのプロモーターは、
花粉の発達に関連する詳細な研究のためのツールとして
有用である。さらに、これらのプロモーターまたはその
活性断片を用いて、細胞毒性のある遺伝子などを小胞子
に特異的に発現させ、花粉細胞を死滅させまたは機能を
失わせることによって、花粉の発達を直接的かつ効率的
に制御し得る。

【００９５】

【発明の効果】ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−１およびＺＰ
Ｔ４−１遺伝子由来の転写因子をコードするＤＮＡ、な
らびに、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１遺伝子由来の
プロモーターを利用する本件発明の方法は、遺伝子工学
的に植物の形質を選択的に改変する技術、特に、雄性不
稔形質を付与する技術として有用である。

【００９６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DIRECTOR GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES , MINISTRY OF AGRICULTURE, FORESTRY AND FISHERIES <120> METHOD OF DECREASING POLLEN FERTILITY BY USE OF GENE OF TRANSCRIPTION FACTOR SPECIFIC TO POLLEN <130> J199412586 <140> <141> <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 777 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> CDS <222> (58)..(588) <400> 1 atcaaaacca aaattccttt ttcacaccga agaacagcct tagtatttca agaaaac 57 atg gtg gct cta tca acg aag aga gaa aga gaa gaa gat aac ttt tac 105 Met Val Ala Leu Ser Thr Lys Arg Glu Arg Glu Glu Asp Asn Phe Tyr 1 5 10 15 agc ata aca acc atg gca aat tac ttg atg tta ctc tcg cgc caa gca 153 Ser Ile Thr Thr Met Ala Asn Tyr Leu Met Leu Leu Ser Arg Gln Ala 20 25 30 aat gaa cat ttt gac aag aaa atg aac aac tca agt act agt cga gtt 201 Asn Glu His Phe Asp Lys Lys Met Asn Asn Ser Ser Thr Ser Arg Val 35 40 45 ttc gag tgc aag act tgt aat cgc cag ttt tca tct ttt caa gca cta 249 Phe Glu Cys Lys Thr Cys Asn Arg Gln Phe Ser Ser Phe Gln Ala Leu 50 55 60 ggt ggc cat aga gca agt cac aag aag cca aga tta atg gga gaa ttg 297 Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys Pro Arg Leu Met Gly Glu Leu 65 70 75 80 cat aac ttg caa tta ttt cat gaa ttg cct aaa cgt aaa act cac gag 345 His Asn Leu Gln Leu Phe His Glu Leu Pro Lys Arg Lys Thr His Glu 85 90 95 tgc tcc att tgt ggg ctt gag ttc gcc att ggg caa gct tta gga gga 393 Cys Ser Ile Cys Gly Leu Glu Phe Ala Ile Gly Gln Ala Leu Gly Gly 100 105 110 cat atg aga agg cat aga gct gtg ata aat gat aaa aat ctt caa gct 441 His Met Arg Arg His Arg Ala Val Ile Asn Asp Lys Asn Leu Gln Ala 115 120 125 cct gat gat caa cat gct cct gtc gtc aaa aaa gca aat ggt cgg aga 489 Pro Asp Asp Gln His Ala Pro Val Val Lys Lys Ala Asn Gly Arg Arg 130 135 140 att ttg tcc ttg gat ttg aac ttg acg cca ttg gaa aat gac tta gag 537 Ile Leu Ser Leu Asp Leu Asn Leu Thr Pro Leu Glu Asn Asp Leu Glu 145 150 155 160 ttt gat ttg cga aag agt aat act gct cct atg gtc gat tgc ttt tta 585 Phe Asp Leu Arg Lys Ser Asn Thr Ala Pro Met Val Asp Cys Phe Leu 165 170 175 tga ttgaactttc cgtttcctta ttcttttctc ttcttctttt ggatattgta 638 tttattcatt aattgtagga gggataggaa gtcttatctt gtgtattagt actacatttt 698 gcagattgta gaacgattag tttgtaactt atcatgatac ccgaaataca atactattta 758 tatgattatt atactacac 777 <210> 2 <211> 176 <212> PRT <213> Petunia hybrida <400> 2 Met Val Ala Leu Ser Thr Lys Arg Glu Arg Glu Glu Asp Asn Phe Tyr 1 5 10 15 Ser Ile Thr Thr Met Ala Asn Tyr Leu Met Leu Leu Ser Arg Gln Ala 20 25 30 Asn Glu His Phe Asp Lys Lys Met Asn Asn Ser Ser Thr Ser Arg Val 35 40 45 Phe Glu Cys Lys Thr Cys Asn Arg Gln Phe Ser Ser Phe Gln Ala Leu 50 55 60 Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys Pro Arg Leu Met Gly Glu Leu 65 70 75 80 His Asn Leu Gln Leu Phe His Glu Leu Pro Lys Arg Lys Thr His Glu 85 90 95 Cys Ser Ile Cys Gly Leu Glu Phe Ala Ile Gly Gln Ala Leu Gly Gly 100 105 110 His Met Arg Arg His Arg Ala Val Ile Asn Asp Lys Asn Leu Gln Ala 115 120 125 Pro Asp Asp Gln His Ala Pro Val Val Lys Lys Ala Asn Gly Arg Arg 130 135 140 Ile Leu Ser Leu Asp Leu Asn Leu Thr Pro Leu Glu Asn Asp Leu Glu 145 150 155 160 Phe Asp Leu Arg Lys Ser Asn Thr Ala Pro Met Val Asp Cys Phe Leu 165 170 175 <210> 3 <211> 1640 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> CDS <222> (95)..(1408) <400> 3 accggtccgg aattcccggg tcgacccacg cgtccggaaa ctttccttgt tgcactttaa 60 tttatgttct agtgagtata ttagagagtg agaa atg gtg gac aat agc cag aaa 115 Met Val Asp Asn Ser Gln Lys 1 5 aat gaa cca tca act gtt ata cac tat tgt aga gta tgt aaa agg gga 163 Asn Glu Pro Ser Thr Val Ile His Tyr Cys Arg Val Cys Lys Arg Gly 10 15 20 ttt aat agt gct gga gct ctt ggt ggg cac atg aga tct cat gga gtg 211 Phe Asn Ser Ala Gly Ala Leu Gly Gly His Met Arg Ser His Gly Val 25 30 35 gga gat cat aat aaa aac tat ggt gaa gat att aat gaa caa aga tat 259 Gly Asp His Asn Lys Asn Tyr Gly Glu Asp Ile Asn Glu Gln Arg Tyr 40 45 50 55 atg atc aac aac ttt aga aga gat aaa cca gag ggt caa aag cac tca 307 Met Ile Asn Asn Phe Arg Arg Asp Lys Pro Glu Gly Gln Lys His Ser 60 65 70 tat aat ctt cgt gct aat act aat aga tta tta ggc aat cga gca agt 355 Tyr Asn Leu Arg Ala Asn Thr Asn Arg Leu Leu Gly Asn Arg Ala Ser 75 80 85 gaa gat cgt gac aag aag tcc tcg atg tgg cct ccc aat gat cgt ggg 403 Glu Asp Arg Asp Lys Lys Ser Ser Met Trp Pro Pro Asn Asp Arg Gly 90 95 100 aaa tat gcc cta gac gag act cta acc cta tca tca atg tcg tca cca 451 Lys Tyr Ala Leu Asp Glu Thr Leu Thr Leu Ser Ser Met Ser Ser Pro 105 110 115 gga tca tca gat ctt gaa aga agt act aag cca tat gat gca aaa gaa 499 Gly Ser Ser Asp Leu Glu Arg Ser Thr Lys Pro Tyr Asp Ala Lys Glu 120 125 130 135 gtg tat aat gga aat gat aag gac aaa tac gct tca aga gaa gaa gaa 547 Val Tyr Asn Gly Asn Asp Lys Asp Lys Tyr Ala Ser Arg Glu Glu Glu 140 145 150 gaa gat cta gcg aat tgt ttg gtc atg ttg tcg aac aaa tct tat gtt 595 Glu Asp Leu Ala Asn Cys Leu Val Met Leu Ser Asn Lys Ser Tyr Val 155 160 165 ttg tcc gat aac aat gag gca aca tac aag gct gaa gaa gtg gaa aag 643 Leu Ser Asp Asn Asn Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Glu Val Glu Lys 170 175 180 ggc atg ttc caa tgt aaa gca tgc aag aaa gtt ttt agc tcc cac caa 691 Gly Met Phe Gln Cys Lys Ala Cys Lys Lys Val Phe Ser Ser His Gln 185 190 195 gct tta ggg gga cat aga gcg agt cat aag aaa gtt aaa ggg tgt tat 739 Ala Leu Gly Gly His Arg Ala Ser His Lys Lys Val Lys Gly Cys Tyr 200 205 210 215 gct gcc aag ata aaa gat gac aac gac ggc aac aac gac aac aac gac 787 Ala Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asn Asp Gly Asn Asn Asp Asn Asn Asp 220 225 230 aac aac aat aat gat aat gac atc gat gaa gac tcg atc tct cct agt 835 Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asp Ile Asp Glu Asp Ser Ile Ser Pro Ser 235 240 245 gat tta att ttc cat caa gaa tct aac tcg ttt cag tct caa tct cca 883 Asp Leu Ile Phe His Gln Glu Ser Asn Ser Phe Gln Ser Gln Ser Pro 250 255 260 tca tca tcg agc tcg ttt tca agg aag aga tca agg gtt cat caa tgc 931 Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Arg Lys Arg Ser Arg Val His Gln Cys 265 270 275 tcg att tgt cat cga gtt ttt tca tca gga caa gcc ttg ggt ggg cac 979 Ser Ile Cys His Arg Val Phe Ser Ser Gly Gln Ala Leu Gly Gly His 280 285 290 295 aaa agg tgt cac tgg cta tca tca agt ttg cca gag aat act ttt ata 1027 Lys Arg Cys His Trp Leu Ser Ser Ser Leu Pro Glu Asn Thr Phe Ile 300 305 310 cca act ttt caa gaa atc caa tac cac acc caa gaa caa gga tta ttc 1075 Pro Thr Phe Gln Glu Ile Gln Tyr His Thr Gln Glu Gln Gly Leu Phe 315 320 325 aac aag cca atg ttt acc aac ttt gat caa cca tta gat cta aac ttc 1123 Asn Lys Pro Met Phe Thr Asn Phe Asp Gln Pro Leu Asp Leu Asn Phe 330 335 340 cca gca caa cta ggc aat cca gct gaa ttt gag ttg aaa cta cac aat 1171 Pro Ala Gln Leu Gly Asn Pro Ala Glu Phe Glu Leu Lys Leu His Asn 345 350 355 cca ttt gaa cat gaa ggc cca aga agc tat ctc cag cta tgg aca gac 1219 Pro Phe Glu His Glu Gly Pro Arg Ser Tyr Leu Gln Leu Trp Thr Asp 360 365 370 375 caa caa atc aat act aat tta cat caa aat gag aag tgc aaa gat tca 1267 Gln Gln Ile Asn Thr Asn Leu His Gln Asn Glu Lys Cys Lys Asp Ser 380 385 390 acg gag gat ttg aga agg gaa gaa aat tac aag gac aag gaa gca aaa 1315 Thr Glu Asp Leu Arg Arg Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Lys Glu Ala Lys 395 400 405 ttg agt aac ctt aaa gat gtg aac ttg gat gga ggc tct tct tgg tta 1363 Leu Ser Asn Leu Lys Asp Val Asn Leu Asp Gly Gly Ser Ser Trp Leu 410 415 420 caa gta ggg att ggt cca acc cca gat ata gta gca act ctg taa 1408 Gln Val Gly Ile Gly Pro Thr Pro Asp Ile Val Ala Thr Leu 425 430 435 ggttagtaac acagtgatcg ttatgtcagc tacaagtata gtaatatata taccaatgtc 1468 ccaacttata cataaactgt ttaacatatt tatactttcg tattattgtt gtatcgaact 1528 ttcactagtt acaatttgtg attcgtccaa tccctaatat agtagcaaca gacctgtaag 1588 attagtatta tgcgattgtt ttgtcattct acaaaataaa atcgtataat at 1640 <210> 4 <211> 437 <212> PRT <213> Petunia hybrida <400> 4 Met Val Asp Asn Ser Gln Lys Asn Glu Pro Ser Thr Val Ile His Tyr 1 5 10 15 Cys Arg Val Cys Lys Arg Gly Phe Asn Ser Ala Gly Ala Leu Gly Gly 20 25 30 His Met Arg Ser His Gly Val Gly Asp His Asn Lys Asn Tyr Gly Glu 35 40 45 Asp Ile Asn Glu Gln Arg Tyr Met Ile Asn Asn Phe Arg Arg Asp Lys 50 55 60 Pro Glu Gly Gln Lys His Ser Tyr Asn Leu Arg Ala Asn Thr Asn Arg 65 70 75 80 Leu Leu Gly Asn Arg Ala Ser Glu Asp Arg Asp Lys Lys Ser Ser Met 85 90 95 Trp Pro Pro Asn Asp Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Asp Glu Thr Leu Thr 100 105 110 Leu Ser Ser Met Ser Ser Pro Gly Ser Ser Asp Leu Glu Arg Ser Thr 115 120 125 Lys Pro Tyr Asp Ala Lys Glu Val Tyr Asn Gly Asn Asp Lys Asp Lys 130 135 140 Tyr Ala Ser Arg Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ala Asn Cys Leu Val Met 145 150 155 160 Leu Ser Asn Lys Ser Tyr Val Leu Ser Asp Asn Asn Glu Ala Thr Tyr 165 170 175 Lys Ala Glu Glu Val Glu Lys Gly Met Phe Gln Cys Lys Ala Cys Lys 180 185 190 Lys Val Phe Ser Ser His Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Ala Ser His 195 200 205 Lys Lys Val Lys Gly Cys Tyr Ala Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asn Asp 210 215 220 Gly Asn Asn Asp Asn Asn Asp Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asp Ile Asp 225 230 235 240 Glu Asp Ser Ile Ser Pro Ser Asp Leu Ile Phe His Gln Glu Ser Asn 245 250 255 Ser Phe Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Arg Lys 260 265 270 Arg Ser Arg Val His Gln Cys Ser Ile Cys His Arg Val Phe Ser Ser 275 280 285 Gly Gln Ala Leu Gly Gly His Lys Arg Cys His Trp Leu Ser Ser Ser 290 295 300 Leu Pro Glu Asn Thr Phe Ile Pro Thr Phe Gln Glu Ile Gln Tyr His 305 310 315 320 Thr Gln Glu Gln Gly Leu Phe Asn Lys Pro Met Phe Thr Asn Phe Asp 325 330 335 Gln Pro Leu Asp Leu Asn Phe Pro Ala Gln Leu Gly Asn Pro Ala Glu 340 345 350 Phe Glu Leu Lys Leu His Asn Pro Phe Glu His Glu Gly Pro Arg Ser 355 360 365 Tyr Leu Gln Leu Trp Thr Asp Gln Gln Ile Asn Thr Asn Leu His Gln 370 375 380 Asn Glu Lys Cys Lys Asp Ser Thr Glu Asp Leu Arg Arg Glu Glu Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ser Asn Leu Lys Asp Val Asn Leu 405 410 415 Asp Gly Gly Ser Ser Trp Leu Gln Val Gly Ile Gly Pro Thr Pro Asp 420 425 430 Ile Val Ala Thr Leu 435 <210> 5 <211> 1948 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> CDS <222> (130)..(1554) <400> 5 cccccatgca atttttttag tctcttcatt ctctcaacta aaactagatt tgcttcttat 60 agtttcttgt ccatgtctct tctcattcat acttgaagta gtacaataac aagaaaataa 120 catttagcc atg gat tgt ata gat caa gaa caa caa caa caa caa cca gtt 171 Met Asp Cys Ile Asp Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Pro Val 1 5 10 ttt aag cat tat tgt aga gtt tgc aag aaa ggt ttt gtg tgt ggg aga 219 Phe Lys His Tyr Cys Arg Val Cys Lys Lys Gly Phe Val Cys Gly Arg 15 20 25 30 gct cta ggt ggg cat atg aga gct cat gga att ggg gat gaa gtt gta 267 Ala Leu Gly Gly His Met Arg Ala His Gly Ile Gly Asp Glu Val Val 35 40 45 act atg gat gat gat gat caa gca agt gat tgg gaa gat aag ttt gga 315 Thr Met Asp Asp Asp Asp Gln Ala Ser Asp Trp Glu Asp Lys Phe Gly 50 55 60 ggg agt gtt aag gaa ggt aat aaa agg atg tac caa tta aga aca aac 363 Gly Ser Val Lys Glu Gly Asn Lys Arg Met Tyr Gln Leu Arg Thr Asn 65 70 75 cct aat agg caa aaa agc aat aga gtt tgt gag aat tgt ggg aaa gaa 411 Pro Asn Arg Gln Lys Ser Asn Arg Val Cys Glu Asn Cys Gly Lys Glu 80 85 90 ttc tct tct tgg aaa tct ttt ctt gaa cat gga aaa tgt agc tca gaa 459 Phe Ser Ser Trp Lys Ser Phe Leu Glu His Gly Lys Cys Ser Ser Glu 95 100 105 110 gat gca gaa gag tct tta gta tcc tcg ccc ggt tca gag ggc gag gat 507 Asp Ala Glu Glu Ser Leu Val Ser Ser Pro Gly Ser Glu Gly Glu Asp 115 120 125 tac att tat gat gga aga aaa gaa aaa gga tac gga tgg tct aaa aga 555 Tyr Ile Tyr Asp Gly Arg Lys Glu Lys Gly Tyr Gly Trp Ser Lys Arg 130 135 140 aag agg tca tta aga aca aaa gta gga ggc ctt agt act tca act tat 603 Lys Arg Ser Leu Arg Thr Lys Val Gly Gly Leu Ser Thr Ser Thr Tyr 145 150 155 caa tca agt gag gaa gaa gat ctt ctc ctt gca aaa tgc ctt ata gat 651 Gln Ser Ser Glu Glu Glu Asp Leu Leu Leu Ala Lys Cys Leu Ile Asp 160 165 170 tta gcc aat gca agg gtt gat aca tca ttg gtt gag cca gaa gag tct 699 Leu Ala Asn Ala Arg Val Asp Thr Ser Leu Val Glu Pro Glu Glu Ser 175 180 185 190 tgt gcc tca gcc agt agg gag gag gaa cgg gcg gca cgg aac tcg atg 747 Cys Ala Ser Ala Ser Arg Glu Glu Glu Arg Ala Ala Arg Asn Ser Met 195 200 205 gcc tac ggc ttc acc cca tta gtg agt act cgt gta ccc ttt gac aac 795 Ala Tyr Gly Phe Thr Pro Leu Val Ser Thr Arg Val Pro Phe Asp Asn 210 215 220 aag gct aaa ggg gcg tct agt aaa ggg ttg ttt gaa tgt aaa gct tgc 843 Lys Ala Lys Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Phe Glu Cys Lys Ala Cys 225 230 235 aag aaa gtc ttc aat tcc cac caa gcc cta ggt gga cat agg gca agt 891 Lys Lys Val Phe Asn Ser His Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Ala Ser 240 245 250 cac aag aaa gtt aag ggg tgt tat gca gcg aag caa gat caa ctc gat 939 His Lys Lys Val Lys Gly Cys Tyr Ala Ala Lys Gln Asp Gln Leu Asp 255 260 265 270 gat atc tta att gat gat caa gat gtg aat atc aca cat gat caa gaa 987 Asp Ile Leu Ile Asp Asp Gln Asp Val Asn Ile Thr His Asp Gln Glu 275 280 285 ttc ctg caa agt tca aaa tcc atg agg aag tca aaa atc cat gaa tgc 1035 Phe Leu Gln Ser Ser Lys Ser Met Arg Lys Ser Lys Ile His Glu Cys 290 295 300 tca ata tgc cat aga gtt ttc tcg aca gga caa gct tta ggt ggt cac 1083 Ser Ile Cys His Arg Val Phe Ser Thr Gly Gln Ala Leu Gly Gly His 305 310 315 aag agg tgc cac tgg atc acc tcc aat tcc ccc gat tct tcg aaa ttt 1131 Lys Arg Cys His Trp Ile Thr Ser Asn Ser Pro Asp Ser Ser Lys Phe 320 325 330 cat ttc aat ggt cat gtg gag caa att aat cta aga tca aac atg cat 1179 His Phe Asn Gly His Val Glu Gln Ile Asn Leu Arg Ser Asn Met His 335 340 345 350 aaa tca gat gca tta gat ctt aat aac ctt ccg aca cat gaa gac atg 1227 Lys Ser Asp Ala Leu Asp Leu Asn Asn Leu Pro Thr His Glu Asp Met 355 360 365 tcg cga att aga cga gac ccc ttt aat cca tta agc ttc gag gtg tca 1275 Ser Arg Ile Arg Arg Asp Pro Phe Asn Pro Leu Ser Phe Glu Val Ser 370 375 380 aca gat ata cac ttg caa tat cca tgg agt tgt gct cca aaa aat gat 1323 Thr Asp Ile His Leu Gln Tyr Pro Trp Ser Cys Ala Pro Lys Asn Asp 385 390 395 gat aat gac aat tac tac ctt gaa gaa att aaa atc gat agt aat gcc 1371 Asp Asn Asp Asn Tyr Tyr Leu Glu Glu Ile Lys Ile Asp Ser Asn Ala 400 405 410 aac aac ggt aag tac aat att aat aat ggt gca aca caa aat gta gaa 1419 Asn Asn Gly Lys Tyr Asn Ile Asn Asn Gly Ala Thr Gln Asn Val Glu 415 420 425 430 gat gat gaa gca gat agt aaa ttg aag tta gct aag cta agt gac cta 1467 Asp Asp Glu Ala Asp Ser Lys Leu Lys Leu Ala Lys Leu Ser Asp Leu 435 440 445 aag gat atg aat acc aac tct gat aat ccc gcc cat tgg tta caa gtt 1515 Lys Asp Met Asn Thr Asn Ser Asp Asn Pro Ala His Trp Leu Gln Val 450 455 460 ggg att ggt tca act aca gaa gta ggg gct gat tca taa gtaactatat 1564 Gly Ile Gly Ser Thr Thr Glu Val Gly Ala Asp Ser 465 470 475 gcagttattc ctttgcttaa tttctttttt ttctgtcacc cgagtatata tttatatgca 1624 aatattgtaa ttataacttc accaaacaga tagtaactgt ttggtgatgc aaatactgtt 1684 aatatttgta ctcccttttt ttttgtcctt ttcttgtaat tgatacacaa tcttgtaatt 1744 ttttgtactt tcaatttctt gagctgtaat tttcagtgta atacagaact cagaatatgt 1804 tattcttgca atatgaagtt tagtatgcaa cagtcaaaca cgattagtag aagtggtctg 1864 taatccctcc cactagttac aagttgggat tgattcaccc acagtagttg gggctgactt 1924 tgaagtaaac atatgcagtt attc 1948 <210> 6 <211> 474 <212> PRT <213> Petunia hybrida <400> 6 Met Asp Cys Ile Asp Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Pro Val Phe Lys 1 5 10 15 His Tyr Cys Arg Val Cys Lys Lys Gly Phe Val Cys Gly Arg Ala Leu 20 25 30 Gly Gly His Met Arg Ala His Gly Ile Gly Asp Glu Val Val Thr Met 35 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tctgtatttc gtgttatggg ctaaaaggaa cgaaggattt 780 ctaaataata ccaactcctc agaaagtgag tacgatgttg agaagcctct tttgcattaa 840 atttcttttt attctcaatt gtaatatgta gttagtttgt atatacaact agaatccaac 900 atagagaaga gagagggaga gcttgtttgt accaaataga taacatgtat gttgatttaa 960 gtatcccata ttggtactgg aagtanactg ttaatgttgc ctgcgattca attgtccagt 1020 ccttggtgta gtgagacagt gttaaatatc ccacatggta taaaaaatgg attgctgtct 1080 ccttatatgg tatttgacaa tcctcacatt ttgagctaaa atttgggttg agttaatgca 1140 attgtccatt tcttatcaat gtatttaatc taggcttgga gctaaaaata caaagcaaaa 1200 gagaagagag aaaaagaaca aagaaagact attatgatag ttgatatttg aaaaaatgca 1260 agttccaatc ctagtaatat cttttatttt gcagtagcat gacggaatat gggaatcaac 1320 atgtagctgc ttttctggct ctatctaagc ccctcttctt ttaccatagt tttgtttttc 1380 attcactttt ggaagcagca agggtagatt tagaccacaa atatgcaaat gttttttttt 1440 tttttttttt tgtaaagtct tagacctata tggagtataa cctttgggaa aggggattga 1500 atcaatgatc ataatgtcac aatcatgtag tactacattt tttgttcttc aatttgagct 1560 actagtttga catttcccaa gtaaattatg 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cacttatgct acaaaaatcc ttataactac 2460 accacaacct ttagtactgt tcactaacta attctttatt tataccaacc ctggcttgga 2520 gtgtagcaaa aaaatgtaca ctactccaaa gtaaacacta ttctttgaaa ctttccttgt 2580 tgcactttaa tttatgttct agtgagtata ttagagagtg agaaatggtg gacaatagcc 2640 agaaaaatga accatcaact gttatacact attgtagagt atgtaaaagg ggatttaata 2700 ngtntggagc tc 2712 <210> 8 <211> 4002 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> promoter <222> (1)..(3631) <400> 8 gaattcacca ccacgagtac ttattttgat gagcatggca ttatttttca aacttcttgt 60 gctggaacac cacagcagaa cgggaaagtt gagcgaaaac ataaacatat tttgaatgtt 120 gctcgagcac ttaggtttca agcgcatttc ccaattgagt tttggggtga gtgtgttttg 180 atggcgtgct atttgatcaa gcgaaccctc tcatcggtct tacacagaaa aaaatgccat 240 atgatgtctt ttttggtgta acaccgaact acgagcattt gaaagtgttt ggatctctat 300 gctatggtca caagcatggg tgcttgggag ataagtttga aagtaggagt cgtctgtgtg 360 tttttattgg atacccatat gggaagaaat catggaagtt atatgatttg gacaccaaaa 420 aatattttgt gtcgcgggca cctagcaccg aagcactaag catccgaacc caacgttatt 480 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taatgtgtgt cgcctatgaa agtttttgta tggtttgaag caggcgtcga 1380 gatgttggtt cacgaagtta ttggccgatt tgaaaactta tgcttttana caatcttatt 1440 cggattattg cctttttaca cttcgtaaag ggtccgtcac cttaagtgtg ttggtgtacg 1500 tggatgattt gattattggg gcaataattc ggaagctatt cgtctcttta agttgtatct 1560 ctccacttgc tttcttatga aagatttggg catactaaat tttttgggag atgaagtggc 1620 tagaggacct aaaggtattt tcctatgtca atggaaatat gccttggata taattggatt 1680 attaggagct cgactggttg gaacttctat ggagcagaat catcgtttgg ctttggcaag 1740 tggccgatat attgatgatc tacatagata tatttgattg atgattctag tgcttaatta 1800 aagactgatc aattgtactg ttattaatta atctttgttt aggaggagca tgtgggctgg 1860 aaaatgatgt agcaaacttt ccatacaatg ccatgattac tgcaggaaat gaagtcctat 1920 ttaaacatgg ctttggctgt ggtgcatgct accaggtgca cttgaaattt gttttataaa 1980 aagagaaaca catgcatgaa ttttgagttt cacttcgcaa aataaatgaa atctttattt 2040 atattaatgc aatcgatttt caggtgttgt gcttacagaa tcaaaatcaa tactgctcag 2100 gaaatccaat aatagtaact nttacagatg agtgcccagg ggcatgcaat aatgatcctg 2160 ttcattttga 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Cys Glu Val 40 45 50 tgt aac aaa ggg ttt agc tca ggt aaa gca ctt ggg ggt cac atg aga 486 Cys Asn Lys Gly Phe Ser Ser Gly Lys Ala Leu Gly Gly His Met Arg 55 60 65 att cac gtt cag gct gcc aaa aag ctc tta tct gtt ggt aaa aag tgc 534 Ile His Val Gln Ala Ala Lys Lys Leu Leu Ser Val Gly Lys Lys Cys 70 75 80 aaa aag ctg aac cca ttc ggt tcc agg tat tac aag aaa cga ata tta 582 Lys Lys Leu Asn Pro Phe Gly Ser Arg Tyr Tyr Lys Lys Arg Ile Leu 85 90 95 100 tta caa caa gat gat cat caa gat aat tac aac aat gac atc aag aat 630 Leu Gln Gln Asp Asp His Gln Asp Asn Tyr Asn Asn Asp Ile Lys Asn 105 110 115 cag ttg gca cca att tgt tca gtt tgt ggt aag aat ttt cca tca atg 678 Gln Leu Ala Pro Ile Cys Ser Val Cys Gly Lys Asn Phe Pro Ser Met 120 125 130 aaa tca ttg ttt ggg cat atg aga tct cat cct gaa agg gcc tgg aga 726 Lys Ser Leu Phe Gly His Met Arg Ser His Pro Glu Arg Ala Trp Arg 135 140 145 gga att caa cct cca gct cct aat aaa aac agt tgt ttg tca tca gct 774 Gly Ile Gln Pro Pro Ala Pro Asn Lys Asn Ser Cys Leu Ser Ser Ala 150 155 160 tcc aat gaa att gct gct act act aag tcg ggg gat tta tcg gtg cct 822 Ser Asn Glu Ile Ala Ala Thr Thr Lys Ser Gly Asp Leu Ser Val Pro 165 170 175 180 ggt tgg tct gtt aag gct aag cga ggc cga aag ggt act att gct gaa 870 Gly Trp Ser Val Lys Ala Lys Arg Gly Arg Lys Gly Thr Ile Ala Glu 185 190 195 gca tca tct aac tcg agt ctt ggt tct aga agt ttc tct ttt gat caa 918 Ala Ser Ser Asn Ser Ser Leu Gly Ser Arg Ser Phe Ser Phe Asp Gln 200 205 210 gaa aag gat gac gag gag cac gaa tta cac gat gct gtt ggt cat ctt 966 Glu Lys Asp Asp Glu Glu His Glu Leu His Asp Ala Val Gly His Leu 215 220 225 atg ttg tta gcc aat gga aat aag act agt gca gat caa gaa ttg gaa 1014 Met Leu Leu Ala Asn Gly Asn Lys Thr Ser Ala Asp Gln Glu Leu Glu 230 235 240 ata acc aac agt aat tcg ctt act tcc aaa gct gaa act gaa caa gtc 1062 Ile Thr Asn Ser Asn Ser Leu Thr Ser Lys Ala Glu Thr Glu Gln Val 245 250 255 260 gat gag aac aag aag aaa aag aag aag ata aag tta agg cgt ttg ggt 1110 Asp Glu Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu Arg Arg Leu Gly 265 270 275 tct gta caa gac ctt gtt agt cca gtt tca gtt cat cat gac caa aaa 1158 Ser Val Gln Asp Leu Val Ser Pro Val Ser Val His His Asp Gln Lys 280 285 290 cta gtc atg gat acg cct gaa aaa tac aaa tgt aac act tgt gaa aag 1206 Leu Val Met Asp Thr Pro Glu Lys Tyr Lys Cys Asn Thr Cys Glu Lys 295 300 305 agc ttt gca act cat caa gca ctg gga gga cat agg tca agc cac aac 1254 Ser Phe Ala Thr His Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Ser Ser His Asn 310 315 320 aag ttt aga atg gtc att caa aat tca gtt gaa gat gat gta gtt act 1302 Lys Phe Arg Met Val Ile Gln Asn Ser Val Glu Asp Asp Val Val Thr 325 330 335 340 aat gta gca act agt agc ata att ggc cca gtg gaa gaa cgt gaa gaa 1350 Asn Val Ala Thr Ser Ser Ile Ile Gly Pro Val Glu Glu Arg Glu Glu 345 350 355 gca gct gct agc acc tca aaa ttg ttg gtg gac cat aac aag aat gcc 1398 Ala Ala Ala Ser Thr Ser Lys Leu Leu Val Asp His Asn Lys Asn Ala 360 365 370 tca gca agt cag gta ctt ggg gtt cag aat agg tgc caa tgg gga agt 1446 Ser Ala Ser Gln Val Leu Gly Val Gln Asn Arg Cys Gln Trp Gly Ser 375 380 385 cca att gat cat caa gct ggt cca tca aca agt caa ttg act tca cca 1494 Pro Ile Asp His Gln Ala Gly Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Ser Pro 390 395 400 ggt gaa gtt agc cat tca att ggt cga caa att ctg gat ttt gat ctc 1542 Gly Glu Val Ser His Ser Ile Gly Arg Gln Ile Leu Asp Phe Asp Leu 405 410 415 420 aat gaa tta ccc cct caa gaa gat gaa att gct ggt ggc cgt gat cat 1590 Asn Glu Leu Pro Pro Gln Glu Asp Glu Ile Ala Gly Gly Arg Asp His 425 430 435 cag tat ttt aca ttt ttt cca att taa ctactcctag gtagtgtttg 1637 Gln Tyr Phe Thr Phe Phe Pro Ile 440 445 tttagtctac agcttttaac tcttagctgg ttaggaatta acagctacta cttcatcatc 1697 agtgagaaag gccagtcatg taagttttgg catgttaatg atccatttac tagtagtgca 1757 aattgtggat aatagcgaac catcttggtt atttccattt ttttgctagt tttccataac 1817 aatgtggcat tttgaagaaa gggctgttga actttttttt cttatatctt catggaaagt 1877 acgatgttt 1886 <210> 14 <211> 444 <212> PRT <213> Petunia hybrida <400> 14 Met Val Asp Tyr Gln Asp Leu Gln Val Gly Met Ser Gly Thr Leu Trp 1 5 10 15 Ile Gln Leu Lys Ile Glu Asp Lys Gln Val Gln Glu Leu Asp His Ser 20 25 30 Gln Asp Ile Met Asp Tyr Glu Val Pro Lys Asn Asn Asp His Thr Arg 35 40 45 Ile Cys Glu Val Cys Asn Lys Gly Phe Ser Ser Gly Lys Ala Leu Gly 50 55 60 Gly His Met Arg Ile His Val Gln Ala Ala Lys Lys Leu Leu Ser Val 65 70 75 80 Gly Lys Lys Cys Lys Lys Leu Asn Pro Phe Gly Ser Arg Tyr Tyr Lys 85 90 95 Lys Arg Ile Leu Leu Gln Gln Asp Asp His Gln Asp Asn Tyr Asn Asn 100 105 110 Asp Ile Lys Asn Gln Leu Ala Pro Ile Cys Ser Val Cys Gly Lys Asn 115 120 125 Phe Pro Ser Met Lys Ser Leu Phe Gly His Met Arg Ser His Pro Glu 130 135 140 Arg Ala Trp Arg Gly Ile Gln Pro Pro Ala Pro Asn Lys Asn Ser Cys 145 150 155 160 Leu Ser Ser Ala Ser Asn Glu Ile Ala Ala Thr Thr Lys Ser Gly Asp 165 170 175 Leu Ser Val Pro Gly Trp Ser Val Lys Ala Lys Arg Gly Arg Lys Gly 180 185 190 Thr Ile Ala Glu Ala Ser Ser Asn Ser Ser Leu Gly Ser Arg Ser Phe 195 200 205 Ser Phe Asp Gln Glu Lys Asp Asp Glu Glu His Glu Leu His Asp Ala 210 215 220 Val Gly His Leu Met Leu Leu Ala Asn Gly Asn Lys Thr Ser Ala Asp 225 230 235 240 Gln Glu Leu Glu Ile Thr Asn Ser Asn Ser Leu Thr Ser Lys Ala Glu 245 250 255 Thr Glu Gln Val Asp Glu Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu 260 265 270 Arg Arg Leu Gly Ser Val Gln Asp Leu Val Ser Pro Val Ser Val His 275 280 285 His Asp Gln Lys Leu Val Met Asp Thr Pro Glu Lys Tyr Lys Cys Asn 290 295 300 Thr Cys Glu Lys Ser Phe Ala Thr His Gln Ala Leu Gly Gly His Arg 305 310 315 320 Ser Ser His Asn Lys Phe Arg Met Val Ile Gln Asn Ser Val Glu Asp 325 330 335 Asp Val Val Thr Asn Val Ala Thr Ser Ser Ile Ile Gly Pro Val Glu 340 345 350 Glu Arg Glu Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ser Lys Leu Leu Val Asp His 355 360 365 Asn Lys Asn Ala Ser Ala Ser Gln Val Leu Gly Val Gln Asn Arg Cys 370 375 380 Gln Trp Gly Ser Pro Ile Asp His Gln Ala Gly Pro Ser Thr Ser Gln 385 390 395 400 Leu Thr Ser Pro Gly Glu Val Ser His Ser Ile Gly Arg Gln Ile Leu 405 410 415 Asp Phe Asp Leu Asn Glu Leu Pro Pro Gln Glu Asp Glu Ile Ala Gly 420 425 430 Gly Arg Asp His Gln Tyr Phe Thr Phe Phe Pro Ile 435 440

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＺＰＴ２−５をコードする遺伝子（本明細
書中、単に「ＺＰＴ２−５遺伝子」ともいう）のｃＤＮ
Ａ配列、および対応するアミノ酸配列を示す図である。
２つのジンクフィンガーモチーフ、およびＤＬＮＬ配列
（アミノ酸１４５位〜１５５位）を下線で示す。

【図１Ｂ】 図１Ａの続きである。

【図２Ａ】 ＺＰＴ３−１をコードする遺伝子（本明細
書中、単に「ＺＰＴ３−１遺伝子」ともいう）のｃＤＮ
Ａ配列、および対応するアミノ酸配列を示す図である。
３つのジンクフィンガーモチーフ、およびＤＬＮＬ配列
（アミノ酸４０８位〜４１７位）を下線で示す。

【図２Ｂ】 図２Ａの続きである。

【図２Ｃ】 図２Ｂの続きである。

【図３Ａ】 ＺＰＴ４−１をコードする遺伝子（本明細
書中、単に「ＺＰＴ４−１遺伝子」ともいう）のｃＤＮ
Ａ配列、および対応するアミノ酸配列を示す図である。
４つのジンクフィンガーモチーフ、およびＤＬＮＬ配列
（アミノ酸４３８位〜４４９位）を下線で示す。

【図３Ｂ】 図３Ａの続きである。

【図３Ｃ】 図３Ｂの続きである。

【図３Ｄ】 図３Ｃの続きである。

【図４】 ＺＰＴ２−５、ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４
−１の各ｃＤＮＡ配列を発現するための植物発現ベクタ
ー（ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＺＰＴ２−５、ｐＢＩＮ−３５
Ｓ−ＺＰＴ３−１およびｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＺＰＴ４−
１）の構成を示す概略図である。

【図５Ａ】 ＺＰＴ３−１遺伝子のコード領域の上流配
列を示す図である。転写開始点（２５６７位）を太矢印
で、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を下線太字で示す。

【図５Ｂ】 図５Ａの続きである。

【図６Ａ】 ＺＰＴ４−１遺伝子のコード領域の上流配
列を示す図である。転写開始点（３５０３位）を太矢印
で、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を下線太字で示す。

【図６Ｂ】 図６Ａの続きである。

【図７】 ＺＰＴ３−１およびＺＰＴ４−１遺伝子のプ
ロモーターを解析するための植物発現ベクター（ｐＢＩ
Ｎ−ＺＰＴ３−１−ＧＵＳおよびｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−
１−ＧＵＳ）の構成を示す概略図である。

【図８】 野生型のペチュニアの花粉と、ｐＢＩＮ−３
５Ｓ−ＺＰＴ２−５を導入したペチュニア（コサプレッ
ションを起こした形質転換体）の花粉とを撮影した、生
物の形態を示す写真である（倍率は４００倍）。図８
（ａ）〜（ｄ）は野生型ペチュニア、そして図８（ｅ）
〜（ｈ）はコサプレッション形質転換ペチュニアについ
ての、それぞれつぼみの異なる成長段階における花粉を
示す。花粉はいずれも、常法によりＤＡＰＩ（４’，６
−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ
ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｎ−ｈｙｄｒａｔ
ｅ）で染色した。

【図９】 野生型のペチュニアの花粉と、ｐＢＩＮ−３
５Ｓ−ＺＰＴ３−１を導入したペチュニアの花粉とを撮
影した、生物の形態を示す写真である（倍率は７００
倍）。図９（ａ）および（ｃ）は野生型ペチュニア、図
９（ｂ）および（ｄ）は形質転換ペチュニアについて
の、それぞれ四分子期および小胞子期における花粉を示
す。四分子期の花粉はＤＡＰＩで、小胞子期の花粉はサ
フラニンで、それぞれ常法により染色した。なお、ｐＢ
ＩＮ−３５Ｓ−ＺＰＴ４−１を導入したペチュニアの花
粉でも、図９（ｂ）および（ｄ）と全く同様の形態が観
察された。

【図１０】 ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−１−ＧＵＳおよびｐ
ＢＩＮ−ＺＰＴ４−１−ＧＵＳを導入したペチュニアの
ＧＵＳ染色した花の器官を撮影した、生物の形態を示す
写真である。いずれも、葯が一核期にある花（つぼみ）
を撮影対象とした。図１０（ａ）および（ｄ）は、つぼ
みの外観を実寸大で、図１０（ｂ）および（ｅ）は、葯
の低倍率（４０倍）での断面図を、図６（ｃ）および
（ｆ）は、小胞子（図６（ｃ）；倍率は７００倍）また
は葯の開裂組織周辺（図６（ｆ）；倍率は２００倍）の
高倍率での断面図を、それぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 晃 北海道河西郡芽室町東２条南５丁目１番地 農業試験場宿舎Ｄ棟204号 (72)発明者 高辻 博志 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農林水 産省農業生物資源研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AD20 CA14 CA17 CA19 4B024 AA08 CA04 CA12 DA01 EA04 FA01 FA02 FA07 FA10 GA11 GA14 4B065 AA88X AA88Y AA89X AA95Y AB01 AC20 BA03 BA25 CA53

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 雄性不稔性の植物を作出する方法であっ
   て： （ｉ）配列番号１によって示される塩基配列の第１位か
   ら第７７７位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）
   （ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写
   因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もし
   くは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれかである核酸
   と、該核酸に作動可能に連結されたプロモーターとを含
   む、植物発現カセットを提供する工程、 花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
   細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
   因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズする、工程、 該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、 該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
   る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
   発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
   抑制された植物体を選択する工程を包含し、 ただし、上記（ｉｉ）のＤＮＡは、（ｉｖ）配列番号１
   ３によって示される塩基配列の第１位から第１８８６位
   までの配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子を
   コードするＤＮＡを含まない、方法。
2. 【請求項２】 雄性不稔性の植物を作出する方法であっ
   て： （ｉ’）配列番号３によって示される塩基配列の第１位
   から第１６４０位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉ
   ｉ’）（ｉ’）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御
   する転写因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ’）
   （ｉ’）もしくは（ｉｉ’）の断片であるＤＮＡのいず
   れかである核酸と、該核酸に作動可能に連結されたプロ
   モーターとを含む、植物発現カセットを提供する工程、 花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
   細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
   因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズする、工程、 該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、 該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
   る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
   発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
   抑制された植物体を選択する工程を包含し、 ただし、上記（ｉｉ’）のＤＮＡは、（ｉｖ）配列番号
   １３によって示される塩基配列の第１位から第１８８６
   位までの配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件
   下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子
   をコードするＤＮＡを含まない、方法。
3. 【請求項３】 雄性不稔性の植物を作出する方法であっ
   て： （ｉ”）配列番号５によって示される塩基配列の第１位
   から第１９４８位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉ
   ｉ”）（ｉ”）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御
   する転写因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ”）
   （ｉ”）もしくは（ｉｉ”）の断片であるＤＮＡのいず
   れかである核酸と、該核酸に作動可能に連結されたプロ
   モーターとを含む、植物発現カセットを提供する工程、 花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
   細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
   因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズする、工程、 該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、 該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
   る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
   発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
   抑制された植物体を選択する工程を包含し、 ただし、上記（ｉｉ”）のＤＮＡは、（ｉｖ）配列番号
   １３によって示される塩基配列の第１位から第１８８６
   位までの配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件
   下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子
   をコードするＤＮＡを含まない、方法。
4. 【請求項４】 前記核酸が前記プロモーターに対して順
   方向で連結され、前記植物体の細胞内でセンス方向に転
   写され得る、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 前記核酸が前記プロモーターに対して逆
   方向で連結され、前記植物体の細胞内でアンチセンス方
   向に転写され得る、請求項１から３のいずれかに記載の
   方法。
6. 【請求項６】 前記植物が双子葉植物である、請求項１
   から３のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】 前記植物がナス科植物である、請求項６
   に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記植物がペチュニア属植物である、請
   求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記発現カセットが植物発現ベクターに
   組み込まれている、請求項１から３のいずれかに記載の
   方法。
10. 【請求項１０】 請求項１から９のいずれかに記載の方
    法により作出された、雄性不稔植物。
11. 【請求項１１】 植物に雄性不稔性を付与する方法であ
    って： （ｉ）配列番号１によって示される塩基配列の第１位か
    ら第７７７位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）
    （ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな
    条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写
    因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もし
    くは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれかである核酸
    と、該核酸に作動可能に連結されたプロモーターとを含
    む、植物発現カセットを提供する工程、 花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
    細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
    因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
    な条件下でハイブリダイズする、工程、 該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、 該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
    る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
    発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
    抑制された植物体を選択する工程を包含し、 ただし、上記（ｉｉ）のＤＮＡは、（ｉｖ）配列番号１
    ３によって示される塩基配列の第１位から第１８８６位
    までの配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下
    でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子を
    コードするＤＮＡを含まない、方法。
12. 【請求項１２】 植物に雄性不稔性を付与する方法であ
    って： （ｉ’）配列番号３によって示される塩基配列の第１位
    から第１６４０位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉ
    ｉ’）（ｉ’）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
    ェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御
    する転写因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ’）
    （ｉ’）もしくは（ｉｉ’）の断片であるＤＮＡのいず
    れかである核酸と、該核酸に作動可能に連結されたプロ
    モーターとを含む、植物発現カセットを提供する工程、 花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
    細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
    因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
    な条件下でハイブリダイズする、工程、 該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、 該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
    る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
    発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
    抑制された植物体を選択する工程を包含し、 ただし、上記（ｉｉ’）のＤＮＡは、（ｉｖ）配列番号
    １３によって示される塩基配列の第１位から第１８８６
    位までの配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件
    下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子
    をコードするＤＮＡを含まない、方法。
13. 【請求項１３】 植物に雄性不稔性を付与する方法であ
    って： （ｉ”）配列番号５によって示される塩基配列の第１位
    から第１９４８位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉ
    ｉ”）（ｉ”）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
    ェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御
    する転写因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ”）
    （ｉ”）もしくは（ｉｉ”）の断片であるＤＮＡのいず
    れかである核酸と、該核酸に作動可能に連結されたプロ
    モーターとを含む、植物発現カセットを提供する工程、 花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
    細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
    因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
    な条件下でハイブリダイズする、工程、 該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、 該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
    る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
    発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
    抑制された植物体を選択する工程を包含し、 ただし、上記（ｉｉ”）のＤＮＡは、（ｉｖ）配列番号
    １３によって示される塩基配列の第１位から第１８８６
    位までの配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件
    下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子
    をコードするＤＮＡを含まない、方法。
14. 【請求項１４】 形質が改変された植物を作出する方法
    であって： （ａ’）配列番号７によって示される塩基配列の第１位
    から第２６２４位までの配列を有するＤＮＡ、または
    （ｂ’）（ａ’）の一部の配列を有し、小胞子に特異的
    なプロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含むプロ
    モーターと、該プロモーターに作動可能に連結された異
    種遺伝子とを含む、植物発現カセットを提供する工程、 該発現カセットを植物細胞に導入する工程、および該発
    現カセットが導入された植物細胞を、植物体に再生する
    工程を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 形質が改変された植物を作出する方法
    であって： （ａ”）配列番号８によって示される塩基配列の第１位
    から第３６３１位までの配列を有するＤＮＡ、または
    （ｂ”）（ａ”）の一部の配列を有し、小胞子に、およ
    び任意に葯の開裂組織に、特異的なプロモーター活性を
    示すＤＮＡのいずれかを含むプロモーターと、該プロモ
    ーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、植
    物発現カセットを提供する工程、 該発現カセットを植物細胞に導入する工程、および該発
    現カセットが導入された植物細胞を、植物体に再生する
    工程を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 前記形質は稔性であり、形質が改変さ
    れた植物は、雄性不稔植物である、請求項１４または１
    ５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記形質は和合性であり、形質が改変
    された植物は自家不和合性植物である、請求項１４また
    は１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記植物が双子葉植物である、請求項
    １４または１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記植物がナス科植物である、請求項
    １８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記植物がペチュニア属植物である、
    請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記発現カセットが植物発現ベクター
    に組み込まれている、請求項１４または１５に記載の方
    法。
22. 【請求項２２】 請求項１４から２１のいずれかに記載
    の方法により作出された、形質が改変された植物。
23. 【請求項２３】 植物に雄性不稔性を付与する方法であ
    って： （ａ’）配列番号７によって示される塩基配列の第１位
    から第２６２４位までの配列を有するＤＮＡ、または
    （ｂ’）（ａ’）の一部の配列を有し、小胞子に特異的
    なプロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含むプロ
    モーターと、該プロモーターに作動可能に連結された異
    種遺伝子とを含む、植物発現カセットを提供する工程、 該発現カセットを植物細胞に導入する工程、および該発
    現カセットが導入された植物細胞を、植物体に再生する
    工程を包含する、方法。
24. 【請求項２４】 植物に雄性不稔性を付与する方法であ
    って： （ａ”）配列番号８によって示される塩基配列の第１位
    から第３６３１位までの配列を有するＤＮＡ、または
    （ｂ”）（ａ”）の一部の配列を有し、小胞子に、およ
    び任意に葯の開裂組織に、特異的なプロモーター活性を
    示すＤＮＡのいずれかを含むプロモーターと、該プロモ
    ーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、植
    物発現カセットを提供する工程、 該発現カセットを植物細胞に導入する工程、および該発
    現カセットが導入された植物細胞を、植物体に再生する
    工程を包含する、方法。
25. 【請求項２５】 以下の（Ｉ’）または（ＩＩ’）のＤ
    ＮＡを含むプロモーター： （Ｉ’）配列番号７によって示される塩基配列の第１位
    から第２６２４位までの配列を有するＤＮＡ、または
    （ＩＩ’）（Ｉ’）の一部の配列を有し、小胞子に特異
    的なプロモーター活性を示すＤＮＡ。
26. 【請求項２６】 以下の（Ｉ”）または（ＩＩ”）のＤ
    ＮＡを含むプロモーター： （Ｉ”）配列番号８によって示される塩基配列の第１位
    から第３６３１位までの配列を有するＤＮＡ、または
    （ＩＩ”）（Ｉ”）の一部の配列を有し、小胞子に、お
    よび任意に葯の開裂組織に、特異的なプロモーター活性
    を示すＤＮＡ。
27. 【請求項２７】 請求項２５または２６に記載のプロモ
    ーターと、該プロモーターに作動可能に連結された異種
    遺伝子とを含む、植物に雄性不稔性を付与するために有
    用な植物発現カセット。