CN114317540A - 一种RcFAH12基因启动子和其缺失突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种2605bp长的RcFAH12启动子及其缺失突变片段，所述RcFAH12启动子及缺失突变片段的获得方法包括以下步骤：将全基因合成的RcFAH12启动子‑2506～+99bp序列，连入pUC57质粒载体中得到质粒pUC57‑RcFAHP2605，并以质粒pUC57‑RcFAHP2605为模板，分别以对应的T/B引物对进行PCR扩增，得到10个启动子缺失突变片段，经PCR扩增、纯化、连接，成功构建含不同RcFAH12基因启动子缺失克隆的表达载体，并通过拟南芥遗传转化，利用农杆菌介导的蘸花法侵染拟南芥，得到T3代转基因拟南芥，对T3代转基因拟南芥组织进行GUS染色分析，得出不同长度的RcFAH12基因启动子表现出不同的启动表达活性，包括具有组成型启动表达、种子相对特异性表达、花粉特异性表达，在植物基因工程育种中具有重要应用价值。

Description

一种RcFAH12基因启动子和其缺失突变体及其应用

技术领域

本发明属于植物生物工程育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种RcFAH12基因启动子和其缺失突变体及其应用。

背景技术

蓖麻(Ricinus communis L.)是一种大戟科二倍体(x＝10，2n＝20)油料植物，其种子中含有39.6％～59.5％的甘油三酯，其中一种特殊的羟化脂肪酸——蓖麻醇酸酯(Ricinoleate)，也称蓖麻油酸(18:1-OH；12-hydroxy-9-cis-octadecenoic acid)约占总脂肪酸的81.44％～90.25％，其比例与种子发育时间正相关。催化蓖麻油酸生物合成的关键酶是油酸-12-羟化酶(oleate 12-hydroxylase,RcFAH12)，属于脂肪酸修饰酶，能将磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)的Sn-2-油酰基转变为Sn-2-蓖麻油酰基。是蓖麻油中产生高蓖麻油酸的重要原因。

基因启动子的研究对于理解基因表达调控至关重要，分离的启动子序列及其元件对基因的精细调节也至关重要。不同的启动子使基因具有不同的表达特性。选择合适的启动子对于外源基因的表达量至关重要。能够使基因在大多数的细胞类型中表达的启动子称为组成型启动子，如对许多双子叶植物转基因工作而言，最常用的一种启动子是来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。它们是植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子，特点是表达具有持续性，表达量基本恒定，也正由于这种特点使得外源基因产物可能对植物的生长发育产生不利影响，甚至导致死亡。此外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。为了使外源基因在植物体内高效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，使人们越发注重特异表达启动子和诱导型启动子的研究和应用，使启动子在特定的组织和一定的发育时期启动基因表达，使基因表达能够对特异条件产生响应，既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。目前，大量的特异性启动子和诱导型启动子已被克隆和功能分析，并已广泛应用于植物基因工程中。

发明内容

本发明利用RACE技术，确定RcFAH12基因转录起点位置，得到启动子及其缺失片段，并进一步的将缺失片段转化到拟南芥中，得到该基因缺失片段启动基因表达的模式，提供了一种来源于蓖麻的RcFAH12基因启动子和其缺失突变片段及应用。

一种RcFAH12启动子，所述RcFAH12启动子是利用RACE技术确定RcFAH12转录起始位点，参照蓖麻基因组序列合成的RcFAH12启动子-2506～+99bp序列。本发明还公开了一种RcFAH12启动子的缺失突变片段，所述RcFAH12启动子及缺失突变片段的获得方法包括以下步骤：将RcFAH12启动子-2506～+99bp序列，连入pUC57质粒载体中得到质粒pUC57-RcFAHP2605，并以质粒pUC57-RcFAHP2605为模板，分别以对应的T/B引物对进行PCR扩增，得到10个启动子缺失突变片段。

进一步的，所述缺失突变片段为RcFAHP2605、RcFAHP2159、RcFAHP1611、RcFAHP1178、RcFAHP677、RcFAHP256、RcFAHP494、RcFAHP584、RcFAHP502、RcFAHP613，大小分别为2605bp、2159bp、1611bp、1178bp、677bp、256bp、494bp、584bp、502bp和613bp。

进一步的，所述RcFAHP2605、RcFAHP2159、RcFAHP1611、RcFAHP1178、RcFAHP677、RcFAHP256、RcFAHP494、RcFAHP584、RcFAHP502、RcFAHP613对应的核苷酸序列为SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10。

进一步的，所述PCR扩增时的扩增体系为质粒pUC57-RcFAHP2605 1μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer(Mg²⁺ plus)10μL；dNTP Mixture(2.5mM each)4μL；PrimeSTAR GXLDNA Polymerase 1μL；补ddH₂O至50μL；T/B引物各1μL。

进一步的，所述PCR扩增时的扩增参数为98℃变性10sec；60℃退火延伸3min，30个循环，4℃保存。

本发明还公开了一种RcFAH12启动子缺失突变片段在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用。

进一步的，将10个启动子缺失克隆片段连入由pCAMBIA 1303经Pst I/Nco I双酶切的载体中，构建由10个缺失突变启动子替换原有35S启动子的表达载体，并利用蘸花法侵染拟南芥进行遗传转化，在浓度为50mg/L潮霉素抗性筛选下，得到T3代转基因拟南芥，并对T3代转基因拟南芥组织进行GUS染色分析，得到不同缺失突变片段在花药中、种子中以及叶片中启动GUS基因表达的特性。

进一步的，所述缺失突变片段在种子中高强度特异性表达的启动子有RcFAHP2605、RcFAHP1611、RcFAHP256、RcFAHP502和RcFAHP613，并且所述RcFAHP2605驱动GUS在种子中表达量高的同时，其在叶片中也呈现高强度表达。

进一步的，所述RcFAHP1611启动子可启动GUS在花萼、花瓣、花丝、柱头中高强度表达；所述RcFAHP2605启动子可启动GUS基因在花萼、柱头及花药中低强度表达。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

1、利用RACE技术，RcFAH12基因启动子及其缺失片段，经PCR扩增、纯化、连接，成功构建含不同RcFAH12基因启动子缺失克隆的表达载体，并通过拟南芥遗传转化，利用农杆菌介导的蘸花法侵染拟南芥，得到该基因缺失片段的特异性表达，得出在种子胚中可启动GUS基因较强表达的启动子是RcFAHP2605、RcFAHP1611、RcFAHP256、RcFAHP502、RcFAHP613；

2、RcFAHP1611启动子可启动GUS在叶片、花萼、花瓣、花丝、柱头中强表达，但在花药中不表达；RcFAHP2605启动子可启动GUS基因在叶片中表达较强，也可在花萼、柱头及部分花药中表达，但表达量均较低；

3、RcFAHP256启动子可启动GUS基因在莲座叶和花药中弱表达；RcFAHP494启动子可启动GUS在莲座叶、茎生叶、花萼、花药中启动GUS基因表达；RcFAHP502启动子可启动GUS在莲座叶、茎生叶、花药中启动GUS基因弱表达，其他缺失启动子(包括RcFAHP2159、RcFAHP1178、RcFAHP677)都只在花药中可启动GUS表达，但从染色结果看，表达量不同，对植物基因工程育种具有重要的应用价值。

附图说明

图1为RcFAH12启动子缺失载体构建示意图。

图2为RcFAH12缺失启动子的克隆电泳图。

图3为缺失启动子表达载体质粒PCR验证电泳图。

图4为缺失启动子表达载体农杆菌菌液PCR验证电泳图。

图5为T2代拟南芥转基因植株鉴定电泳图。

图6为T3代转基因拟南芥GUS染色分析图。

图7为不同启动子缺失突变体转基因拟南芥叶片GUS酶活测定柱形图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1一种RcFAH12启动子及缺失突变片段的获得

1实验材料

1.1植物材料，本实验所用植物材料为实验室保存并种植的通蓖5号蓖麻叶片和野生哥伦比亚拟南芥。通蓖5号直接种植于蛭石和泥炭土(1﹕1)中，待叶片直径约5cm时取干净的0.1g叶片立即置于液氮中速冻，保存于-80℃待用。野生型哥伦比亚型拟南芥首先培养于光照培养箱，播种在MS培养基中，待2叶期至4叶期时，选择根较长的拟南芥转移到含有蛭石和泥炭土(1﹕1)的小盆中，在人工气候室中培养，22℃光照16h黑暗8h，湿度70％。

1.2菌株与载体，感受态菌株DH5α购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；感受态菌株GV3101购自上海唯地生物技术有限公司、pCAMBIA1303购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。RcFAH12启动子序列为北京六合华大基因科技有限公司全基因合成，并构建在pUC57载体中。

1.3实验引物

表1-1 RcFAH12启动子缺失突变体引物设计

1.4蓖麻RcFAH12启动子顺式作用元件分析

依据RACE克隆到的RcFAH125′端序列进行Blast，在蓖麻基因组中找到RcFAH12位置，截取位于-2506～+99bp的序列作为启动子区域，利用在线工具PlantCARE对RcFAH12启动子进行顺式作用元件分析。

1.5 RcFAH12启动子缺失突变片段的获得

由华大六合基因有限责任公司合成RcFAH12启动子-2506～+99bp序列，并连入pUC57质粒载体中，质粒命名为pUC57-RcFAHP2605。参考In-

HD Cloning Kit(Takara)用户手册设计引物见表1-1，由华大六合基因公司合成，使用浓度为10μM。以质粒pUC57-RcFAHP2605为模板扩增，分别以对应的T/B引物对(表1-1)扩增得到启动子缺失突变克隆，分别是RcFAHP2605(-2506～+99bp)、RcFAHP2159(-2060～+99bp)、RcFAHP1611(-1512～+99bp)、RcFAHP1178(-1079～+99bp)、RcFAHP677(-578～+99bp)、RcFAHP256(-157～+99bp)、RcFAHP494(-2504～-2011bp)、RcFAHP584(-2061～-1478bp)、RcFAHP502(-1512～-1011bp)、RcFAHP613(-1079～-467bp)。扩增体系见表1-2，扩增参数见表1-3。

表1-2 RcFAH12基因启动子缺失突变片段PCR扩增体系

表1-3 RcFAH12基因启动子缺失突变片段PCR扩增参数

1.6 RcFAH12启动子缺失突变片段表达载体构建

培养含pCAMBIA1303载体的大肠杆菌，提取质粒，建立限制性内切酶(PstⅠ/NcoⅠ)的双酶切体系切割pCAMBIA1303载体，回收大片段，由RcFAH12基因启动子(-2506～+99bp)获得的启动子缺失片段与pCAMBIA1303的连接使用无缝克隆的方法，参考In-

HDCloning Kit(Takara)用户手册进行操作，将不同的启动子缺失克隆片段连入由pCAMBIA1303 Pst I/Nco I双酶切的载体中，构建由不同缺失突变启动子替换原有35S启动子的表达载体。载体构建如图1。连接体系见表1-4所示，连接反应见1-5所示。连接产物转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确后提取质粒转化农杆菌，农杆菌转化菌鉴定使用菌液PCR检测，以表达载体引物序列1303F和1303R为引物进行菌液PCR验证，PCR反应体系见表1-6，反应程序见表1-7。鉴定正确的菌种保存备用。

表1-4 RcFAH12启动子缺失突变与pCAMBIA1303载体连接体系

表1-5 RcFAH12启动子缺失突变与pCAMBIA1303载体连接反应

表1-6 PCR扩增体系

表1-7 PCR扩增参数

1.7拟南芥遗传转化及转基因植株的鉴定

使用蘸花法侵染拟南芥，收集农杆菌侵染后的拟南芥T0代种子。

将T0代种子经50mg/L的潮霉素筛选后，单株采收种子，晾干后4℃保存。将筛选出的各T1代单株拟南芥种子，再次经50mg/mL潮霉素筛选培养后，取拟南芥叶片，利用擎科生物的T5derect试剂盒，分别以各个植株的基因组DNA为模板以载体上GUS基因为靶基因进行扩增鉴定，引物对为qGUSF1/qGUSR1。PCR反应体系同表2-3，PCR反应程序同表2-4，退火温度为58℃；PCR反应结束后，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。T₃代拟南芥的筛选和鉴定与T₂代的方法相同。

1.8转基因拟南芥GUS染色分析

分别对野生型拟南芥和T3代转基因拟南芥幼苗和发育中的种子进行GUS染色分析，其中发育中的种子染色时，经冷冻切片机暴露胚后进行染色。配制GUS-stainingsolution(0.05M磷酸钠缓冲液；10mM EDTA；0.5mM铁氰化钾；0.5mM亚铁氰化钾；1mM X-Gluc；0.1％Triton X-100)；将待检测的材料用不含X-Gluc的GUS-staining solution冲洗3遍；使待检测材料完全浸泡在含有X-Gluc的GUS-staining solution，放入真空抽气机中抽取真空10min，用锡箔纸将离心管包住，放在37℃的振荡培养箱中150rpm过夜，第二天将染色材料用水洗一遍，然后转移至70％的酒精中进行脱色，每1h换一次脱色液，直至材料背景被完全脱色为止，置于显微镜下观察拍照。

1.9转基因拟南芥叶片蛋白提取及浓度测定

(1)取不同缺失突变启动子的转基因拟南芥叶片，放2mL离心管(预先放入1粒钢珠)液氮中速冻保存，待全部样品采集完成后进行下一步实验；

(2)使用冷冻研磨仪(Cryomill)将每一个样品叶片研磨成粉，加入200μL GUS提取缓冲液置于冰浴中；

(3)采用Bradford蛋白浓度测定法，将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20μL分别加到96孔板中，加GUS提取缓冲液补足到20μL，各孔加入200μL稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟，用酶标仪测定OD₅₉₅。以吸光值为纵坐标，BSA含量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。

(4)分别取提取的蛋白原液20μL加入96孔板，再加入200μL 1×G250染色液，充分震荡混匀后，用酶标仪测定OD₅₉₅的吸光度值，

(5)将吸光值代入BSA标准曲线回归方程中，求得蛋白含量。

1.10 GUS酶活性分析

GUS酶活检测具体操作方法如下：

(1)标准曲线的制作：准备4-MU标准品，用0.2mol/L Na₂CO₃将1mmol/L 4-MU逐级稀释12个梯度，分别为0.50000mmol/L、0.25000mmol/L、0.12500mmol/L、0.06250mmol/L、0.03125mmol/L……，去掉高浓度的7个，用低浓度的5个在365nm激发光，455nm发射光，在黑色酶标板中测定荧光值，制作标准曲线，得到线性回归方程。设置酶标仪Excitation为365nm，Emission为455nm，Mode选择Top，Lag time为0，Gain为手动设置值50。稀释好的4-MU可在4℃短期保存，注意避光。

(2)取20μL总蛋白加入200μL预热的含有1mM 4-MUG的GUS抽提液中，置37℃水浴中反应，当溶液全部加入后，在第5min，15min，25min以及35min时各取出40μL加入含160μL0.2mol/L Na₂CO₃的黑色96孔酶标板中，

(3)测定荧光值，代入标准曲线回归方程，得到4-MU含量，计算酶活性。GUS酶活性定义为：每mg蛋白在每分钟生成4-MU的量(pmol)。

实施例2 RcFAH12启动子缺失突变片段在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用

2.1 RcFAH12基因启动子缺失片段扩增结果

RcFAH12启动子(-2506～+99bp)缺失突变片段的获得，以pUC57-RcFAHP2605重组质粒为模板，使用表1-1的引物序列扩增得到的10个RcFAH12启动子缺失片段，即RcFAHP2605、RcFAHP2159、RcFAHP 1611、RcFAHP 1178、RcFAHP 677、RcFAHP 256、RcFAHP494、RcFAHP 584、RcFAHP 502和RcFAHP 613，大小分别为2605bp、2159bp、1611bp、1178bp、677bp、256bp、494bp、584bp、502bp和613bp，对应的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，扩增条带与预计目的条带大小一致，对扩增得到的单一目的条带进行胶回收，电泳结果见图2所示，并将回收产物冻存于-40℃冰箱中，备用。

2.2 RcFAH12缺失启动子表达载体的构建及鉴定

RcFAH12启动子(-2506～+99bp)缺失突变片段表达载体构建及鉴定，分别将3.1所得到的RcFAH12启动子(-2506～+99bp)缺失片段与pCAMBIA1303载体经Pst I/Nco I双酶切回收的线性大片段通过无缝克隆进行连接、转化、液体培养，提质粒，PCR验证。同样以pCAMBIA1303上插入片段两端载体上的引物1303F和1303R进行扩增，pCAMBIA1303-RcFAHP2605、pCAMBIA1303。RcFAHP 2159、pCAMBIA1303-RcFAHP 1611、pCAMBIA1303-RcFAHP 1178、pCAMBIA1303-RcFAHP 677、pCAMBIA1303-RcFAHP 256、pCAMBIA1303-RcFAHP 613、pCAMBIA1303-RcFAHP 494、pCAMBIA1303-RcFAHP 584、pCAMBIA1303-RcFAHP 502的扩增产物大小分别为2943bp、2497bp、1949bp、1516bp、1015bp、594bp、832bp、922bp、840bp、951bp，结果见图3所示。扩增条带与目的片段大小一致，测序后经序列比对确定成功克隆10个缺失启动子片段并连入表达载体。

2.3 RcFAH12缺失启动子表达载体转化农杆菌并鉴定

将各重组质粒转化至GV3101农杆菌感受态中，为验证农杆菌转化成功，分别以含不同RcFAH12启动子(-2506～+99bp)缺失突变表达载体的农杆菌菌液为模板进行PCR检测，检测结果见图4所示，扩增片段与目的片段大小一致，证明启动子的缺失表达载体构建成功。

2.4拟南芥遗传转化及转基因植株的鉴定

使用50mg/L潮霉素浓度筛选出含不同RcFAH12启动子缺失克隆的载体、pCAMBIA1303载体的T1代转基因拟南芥，将T1代转基因拟南芥种子收集并晾干，4℃放置，备用。

使用50mg/L潮霉素浓度筛选出含不同RcFAH12启动子缺失克隆的载体、pCAMBIA1303的T2代抗潮霉素拟南芥，分别取多株抗潮霉素拟南芥叶片进行基因组DNA提取，以DNA为模板，RcFAH12启动子(-2506～+99bp)各缺失突变转化的拟南芥使用qGUS F1/qGUS R1分别进行转基因植株PCR验证，验证结果见图5所示，均可扩增出条带，大小与预计一致为156bp，证明拟南芥成功转化。将T2代转基因拟南芥种子收集并晾干，4℃放置，备用。

2.5转基因拟南芥GUS染色分析

图6中显示的是RcFAH12启动子(-2506～+99bp)各缺失片段启动GUS基因表达的染色结果。WT野生型作为对照，GUS染色为阴性。pCAMBIA1303载体中GUS基因在CaMV35S启动子的启动下，大量表达GUS酶，与底物X-Gluc反应后，使整株幼苗均被染上较深的蓝色，并且胚也被染色，且颜色较深。在RcFAHP2605和RcFAHP1611启动子的启动下，两叶期幼苗GUS染色阳性，且颜色较深，但进一步生长后叶片的GUS染色变浅。通过莲座叶叶片染色可以看出，RcFAHP1611启动子启动GUS表达量最多，染色最深，RcFAHP2605启动子次之。RcFAHP2159、RcFAHP1178、RcFAHP677、RcFAHP256、RcFAHP494、RcFAHP584、RcFAHP 502、RcFAHP 613启动子两叶期幼苗染色为阴性，进一步生长后RcFAHP256、RcFAHP494和RcFAHP 502的莲座叶叶脉有非常浅的蓝色，说明在此时期GUS基因有少量表达。茎生叶染色结果显示，RcFAHP1611启动子启动GUS表达量最多，GUS染色颜色最深；RcFAHP2605启动子次之，GUS染色稍浅；RcFAHP494、RcFAHP502两个启动子可微量启动GUS基因表达，肉眼可见茎生叶叶脉有微弱蓝色；其他缺失启动子在茎生叶中均未观察到GUS基因表达。从转基因拟南芥花序染色结果显示，RcFAHP1611启动子可启动GUS在花萼、花瓣、花丝、柱头中大量表达，但在花药中未表达；RcFAHP2605启动子可启动GUS基因在花萼、柱头及部分花药中表达，但表达量均较低；RcFAHP494启动子可在花萼、花药中启动GUS基因表达；其他缺失启动子都只在花药中可启动GUS表达，但从染色结果看，表达量不同。从所有在花药中的染色结果可以观察到，GUS基因主要在花药发育早期表达较高，后期较少或不表达。拟南芥种子及胚的染色结果显示RcFAHP2605、RcFAHP1611、RcFAHP256、RcFAHP502、RcFAHP613启动子可在拟南芥种子中启动GUS基因表达，且颜色均较深，说明表达量较高。总结结果见表2-1。

表2-1 RcFAH12启动子(-2506～+99bp)各缺失片段启动GUS基因表达结果

2.6 RcFAH12启动子GUS活性分析

采集含不同缺失突变启动子的转基因拟南芥莲座叶样品进行GUS酶活分析。以OD595吸光值为横坐标，以BSA的含量为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y＝0.3543x，R2＝0.9986，说明曲线的线性很好，可用于后续计算样本中蛋白的含量。

取10mmol/L 4-MU溶液100μL加入900μL GUS抽提液配制成1mmol/L 4-MU溶液，取300μL 1mmol/L4-MU溶液逐级稀释为源溶液浓度的1/2，得到12个浓度的溶液，用最后5个浓度的溶液测定荧光强度标准曲线，得到线性回归方程：y＝0.6817x，R2＝0.998，可以看出，线性很好，可用于后续的4-MU含量的测定。

不同RcFAH12启动子缺失突变拟南芥莲座叶GUS活性分析，发现RcFAHP2605和RcFAHP1611表达量较高，而RcFAHP502,RcFAH494,RcFAH1178表达量较低，而其他启动子缺失突变体几乎不表达，这与GUS染色一致，见图7。

3、总结

本发明以全基因合成的pUC57-RcFAHP2605重组质粒为模板，经PCR扩增、纯化、连接，成功构建含不同RcFAH12基因启动子缺失克隆的表达载体，并通过拟南芥遗传转化，利用农杆菌介导的蘸花法侵染拟南芥，在浓度为50mg/L潮霉素抗性筛选下，得到T3代转基因拟南芥。对T3代转基因拟南芥组织进行GUS染色分析，分析结果表明：不同长度的RcFAH12基因启动子表现出不同的启动表达活性，包括具有组成型启动表达、种子相对特异性表达、花粉特异性表达。进一步测定莲座叶GUS酶活性，其结果与莲座叶GUS染色一致。不同RcFAH12基因启动子缺失片段驱动的GUS基因表达存在种子相对特异性、花药特异性表达，还存在多转录起点的现象。RcFAHP1611除不能驱动GUS在花药中表达外，其他组织中均能表达且表达量较高；在种子中表达量较高的缺失启动子片段有RcFAHP2605、RcFAHP1611、RcFAHP256、RcFAHP502和RcFAHP613，RcFAHP2605驱动GUS在种子中表达量高的同时，其在叶片中表达量也较高；RcFAHP256、RcFAHP502和RcFAHP613驱动GUS在种子中表达量较高而在其他组织中表达量较低，具有种子相对特异性表达；而RcFAHP2159、RcFAHP1178RcFAHP677和RcFAHP584表现出在花药中特异性表达。

以上所述，仅是本发明的实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书保护的范围。

序列表

<110> 内蒙古民族大学

<120> 一种RcFAH12基因启动子和其缺失突变体及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtttgttg gtgacgctag cattaaaagt agtaatcaag ttctaccttt aaaagatgcc 60

ttacatgtac caaatctaaa tagagattta ttatcggtta gtcaccttac agactattat 120

cctgtaaata atgaatttcc taataagaat tttatatcaa gaaaatagag agaggtcaca 180

aaatgatgat aagacaatcc aatggtggtc tctatgttat ttcaagtcca catgagttac 240

atttctttta taggttcaac caaagaacct cacttggtag ggactgcaat taatctattg 300

ctaaatcatt cagtctttct ttctccttcc cccaattttt ccctatcatt attaattatt 360

cccaatctga agcaccattt ttactcatca ggcaatcgct aatttttcca ccatatggtg 420

gggccaaact taatgatggt ttcaaacctc tgttaaaatc tgttactatt ccattacatc 480

tcctttgcca ttatcttaca gatattcgct attattattc gtcattattc cctttgaaat 540

tcatcgcaat tagcgataga tcctattcgt cgctatacaa tcatattcta gtagtgttat 600

agacatccat aacttgaaga ctgtattgtg catatctcta cttcttggct tgttcgtcaa 660

tcaacttcgc actttgtaaa tacgtacttg atcactttca cattttgtac atgtagatta 720

aatgtaactt ctatattcca cttctttagt tttctcaacc tcctttccat ttgaaaaaaa 780

agtattttat tcttccagga tattgtttaa catccacact tcttttttat tcccgacctt 840

tattgctacc tccccacttc ataagaatgt cttacaacct tttaaaagac tttataactt 900

ccctttcaca ttcttgcatc cttaattttt tacatgttaa taatgaatta ttaatcaatt 960

tttggccagt aagctgagaa tttaataatg atttagaaat ccaacaataa cgggcttcaa 1020

aatttggata aaaaatatat aggccttctt aataggcttg gtctaattac tagtcgtagg 1080

ataatgctaa atttggatat aaacaatttc aaatttggtt aaaattaaaa atttatttga 1140

tttacaaaat agattctaaa tagaatttat ttgctgataa gtttatatat ttaatctttt 1200

aagtataagt ttggggcaca aattgaccaa ttgtccataa aaatagtatc caacttttat 1260

catttcaacc aaacattcca tagtattttc agaagagata ttgagaggtg gcaatggaaa 1320

tggaggccgc tgaagagaga ttaggaggtg gcaagggaat tcgaggcagc agaagagata 1380

tttcgaggtg gcaccgaaat tcgaggcagc aggtgcgagt catgtccaca gctcactttt 1440

cactttttgg agaaaccaag aaattttgac aggtttatgc taattttgac aagcgtttgg 1500

ctaattcctg ttacaaacaa aagtcattta ttgtcaattt cgtctttatg ttaaatttat 1560

ttgacctcgt gattttaatt ttagtctaat ctatttttta ttattgttat ataaaattaa 1620

taaatattta ttaattttga ataattaaat atatatatat atatatatta tttttataca 1680

atacaataaa tatatcaata taaataaatt tctctttttt aatataaaat tacagaaata 1740

tttattaaaa tttattaacc tcagcttata ttttattatt gaaatttaat agatgtatat 1800

ttatttaata tttaaattca taattgaata aaatattttt attagtcaaa ttaaaattta 1860

tatatacata ttattattaa aatgcttaat ttaattataa attttaagaa taattaaaga 1920

cattataaga gtttctagtt caacttctaa ttttataatt taattatttt gattataaat 1980

aaaattaatt tgtgattaat ttttaaatat ttttatttta gttaatatat aatggtctcg 2040

tcgaatatgc cgatattaat aaataaattt aaatttaaaa tttaaaatta gttattttat 2100

agtaaatata aaaaattaaa aattaccata caatttatta aatgttgtgc agttcattga 2160

gtattggatg aaacgaaaag gaaaagaaaa gcaaaaagat gaaagttgaa gggtaaatgc 2220

atattagagt ggtattatgc cttacttacc attgatcccc tgtagttaag tgaagagtga 2280

tgactgagag taaagggtga gtgaggcgat gacattgttg cgatgttttg aatgttaaaa 2340

acattaattg gacagctgtt taagaagaaa acatatgaaa tggacacgtt ttaagcaaat 2400

ggggatcctt tagttccatg cgtacagcct caggcacttg ggggtccagc ccaaccctcc 2460

ctgccttgcc tatatacaca ccttcttcac tgcaaaacac cacctcaaat caaacaccac 2520

accttataac tcagccttaa gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagagg 2580

agacatttct cttctctgag ataag 2605

<210> 2

<211> 2159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctctgttaa aatctgttac tattccatta catctccttt gccattatct tacagatatt 60

cgctattatt attcgtcatt attccctttg aaattcatcg caattagcga tagatcctat 120

tcgtcgctat acaatcatat tctagtagtg ttatagacat ccataacttg aagactgtat 180

tgtgcatatc tctacttctt ggcttgttcg tcaatcaact tcgcactttg taaatacgta 240

cttgatcact ttcacatttt gtacatgtag attaaatgta acttctatat tccacttctt 300

tagttttctc aacctccttt ccatttgaaa aaaaagtatt ttattcttcc aggatattgt 360

ttaacatcca cacttctttt ttattcccga cctttattgc tacctcccca cttcataaga 420

atgtcttaca accttttaaa agactttata acttcccttt cacattcttg catccttaat 480

tttttacatg ttaataatga attattaatc aatttttggc cagtaagctg agaatttaat 540

aatgatttag aaatccaaca ataacgggct tcaaaatttg gataaaaaat atataggcct 600

tcttaatagg cttggtctaa ttactagtcg taggataatg ctaaatttgg atataaacaa 660

tttcaaattt ggttaaaatt aaaaatttat ttgatttaca aaatagattc taaatagaat 720

ttatttgctg ataagtttat atatttaatc ttttaagtat aagtttgggg cacaaattga 780

ccaattgtcc ataaaaatag tatccaactt ttatcatttc aaccaaacat tccatagtat 840

tttcagaaga gatattgaga ggtggcaatg gaaatggagg ccgctgaaga gagattagga 900

ggtggcaagg gaattcgagg cagcagaaga gatatttcga ggtggcaccg aaattcgagg 960

cagcaggtgc gagtcatgtc cacagctcac ttttcacttt ttggagaaac caagaaattt 1020

tgacaggttt atgctaattt tgacaagcgt ttggctaatt cctgttacaa acaaaagtca 1080

tttattgtca atttcgtctt tatgttaaat ttatttgacc tcgtgatttt aattttagtc 1140

taatctattt tttattattg ttatataaaa ttaataaata tttattaatt ttgaataatt 1200

aaatatatat atatatatat attattttta tacaatacaa taaatatatc aatataaata 1260

aatttctctt ttttaatata aaattacaga aatatttatt aaaatttatt aacctcagct 1320

tatattttat tattgaaatt taatagatgt atatttattt aatatttaaa ttcataattg 1380

aataaaatat ttttattagt caaattaaaa tttatatata catattatta ttaaaatgct 1440

taatttaatt ataaatttta agaataatta aagacattat aagagtttct agttcaactt 1500

ctaattttat aatttaatta ttttgattat aaataaaatt aatttgtgat taatttttaa 1560

atatttttat tttagttaat atataatggt ctcgtcgaat atgccgatat taataaataa 1620

atttaaattt aaaatttaaa attagttatt ttatagtaaa tataaaaaat taaaaattac 1680

catacaattt attaaatgtt gtgcagttca ttgagtattg gatgaaacga aaaggaaaag 1740

aaaagcaaaa agatgaaagt tgaagggtaa atgcatatta gagtggtatt atgccttact 1800

taccattgat cccctgtagt taagtgaaga gtgatgactg agagtaaagg gtgagtgagg 1860

cgatgacatt gttgcgatgt tttgaatgtt aaaaacatta attggacagc tgtttaagaa 1920

gaaaacatat gaaatggaca cgttttaagc aaatggggat cctttagttc catgcgtaca 1980

gcctcaggca cttgggggtc cagcccaacc ctccctgcct tgcctatata cacaccttct 2040

tcactgcaaa acaccacctc aaatcaaaca ccacacctta taactcagcc ttaagagaga 2100

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaggagacat ttctcttctc tgagataag 2159

<210> 3

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaaatccaa caataacggg cttcaaaatt tggataaaaa atatataggc cttcttaata 60

ggcttggtct aattactagt cgtaggataa tgctaaattt ggatataaac aatttcaaat 120

ttggttaaaa ttaaaaattt atttgattta caaaatagat tctaaataga atttatttgc 180

tgataagttt atatatttaa tcttttaagt ataagtttgg ggcacaaatt gaccaattgt 240

ccataaaaat agtatccaac ttttatcatt tcaaccaaac attccatagt attttcagaa 300

gagatattga gaggtggcaa tggaaatgga ggccgctgaa gagagattag gaggtggcaa 360

gggaattcga ggcagcagaa gagatatttc gaggtggcac cgaaattcga ggcagcaggt 420

gcgagtcatg tccacagctc acttttcact ttttggagaa accaagaaat tttgacaggt 480

ttatgctaat tttgacaagc gtttggctaa ttcctgttac aaacaaaagt catttattgt 540

caatttcgtc tttatgttaa atttatttga cctcgtgatt ttaattttag tctaatctat 600

tttttattat tgttatataa aattaataaa tatttattaa ttttgaataa ttaaatatat 660

atatatatat atattatttt tatacaatac aataaatata tcaatataaa taaatttctc 720

ttttttaata taaaattaca gaaatattta ttaaaattta ttaacctcag cttatatttt 780

attattgaaa tttaatagat gtatatttat ttaatattta aattcataat tgaataaaat 840

atttttatta gtcaaattaa aatttatata tacatattat tattaaaatg cttaatttaa 900

ttataaattt taagaataat taaagacatt ataagagttt ctagttcaac ttctaatttt 960

ataatttaat tattttgatt ataaataaaa ttaatttgtg attaattttt aaatattttt 1020

attttagtta atatataatg gtctcgtcga atatgccgat attaataaat aaatttaaat 1080

ttaaaattta aaattagtta ttttatagta aatataaaaa attaaaaatt accatacaat 1140

ttattaaatg ttgtgcagtt cattgagtat tggatgaaac gaaaaggaaa agaaaagcaa 1200

aaagatgaaa gttgaagggt aaatgcatat tagagtggta ttatgcctta cttaccattg 1260

atcccctgta gttaagtgaa gagtgatgac tgagagtaaa gggtgagtga ggcgatgaca 1320

ttgttgcgat gttttgaatg ttaaaaacat taattggaca gctgtttaag aagaaaacat 1380

atgaaatgga cacgttttaa gcaaatgggg atcctttagt tccatgcgta cagcctcagg 1440

cacttggggg tccagcccaa ccctccctgc cttgcctata tacacacctt cttcactgca 1500

aaacaccacc tcaaatcaaa caccacacct tataactcag ccttaagaga gagagagaga 1560

gagagagaga gagagagaga gagaggagac atttctcttc tctgagataa g 1611

<210> 4

<211> 1178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acagctcact tttcactttt tggagaaacc aagaaatttt gacaggttta tgctaatttt 60

gacaagcgtt tggctaattc ctgttacaaa caaaagtcat ttattgtcaa tttcgtcttt 120

atgttaaatt tatttgacct cgtgatttta attttagtct aatctatttt ttattattgt 180

tatataaaat taataaatat ttattaattt tgaataatta aatatatata tatatatata 240

ttatttttat acaatacaat aaatatatca atataaataa atttctcttt tttaatataa 300

aattacagaa atatttatta aaatttatta acctcagctt atattttatt attgaaattt 360

aatagatgta tatttattta atatttaaat tcataattga ataaaatatt tttattagtc 420

aaattaaaat ttatatatac atattattat taaaatgctt aatttaatta taaattttaa 480

gaataattaa agacattata agagtttcta gttcaacttc taattttata atttaattat 540

tttgattata aataaaatta atttgtgatt aatttttaaa tatttttatt ttagttaata 600

tataatggtc tcgtcgaata tgccgatatt aataaataaa tttaaattta aaatttaaaa 660

ttagttattt tatagtaaat ataaaaaatt aaaaattacc atacaattta ttaaatgttg 720

tgcagttcat tgagtattgg atgaaacgaa aaggaaaaga aaagcaaaaa gatgaaagtt 780

gaagggtaaa tgcatattag agtggtatta tgccttactt accattgatc ccctgtagtt 840

aagtgaagag tgatgactga gagtaaaggg tgagtgaggc gatgacattg ttgcgatgtt 900

ttgaatgtta aaaacattaa ttggacagct gtttaagaag aaaacatatg aaatggacac 960

gttttaagca aatggggatc ctttagttcc atgcgtacag cctcaggcac ttgggggtcc 1020

agcccaaccc tccctgcctt gcctatatac acaccttctt cactgcaaaa caccacctca 1080

aatcaaacac cacaccttat aactcagcct taagagagag agagagagag agagagagag 1140

agagagagag aggagacatt tctcttctct gagataag 1178

<210> 5

<211> 677

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagtttctag ttcaacttct aattttataa tttaattatt ttgattataa ataaaattaa 60

tttgtgatta atttttaaat atttttattt tagttaatat ataatggtct cgtcgaatat 120

gccgatatta ataaataaat ttaaatttaa aatttaaaat tagttatttt atagtaaata 180

taaaaaatta aaaattacca tacaatttat taaatgttgt gcagttcatt gagtattgga 240

tgaaacgaaa aggaaaagaa aagcaaaaag atgaaagttg aagggtaaat gcatattaga 300

gtggtattat gccttactta ccattgatcc cctgtagtta agtgaagagt gatgactgag 360

agtaaagggt gagtgaggcg atgacattgt tgcgatgttt tgaatgttaa aaacattaat 420

tggacagctg tttaagaaga aaacatatga aatggacacg ttttaagcaa atggggatcc 480

tttagttcca tgcgtacagc ctcaggcact tgggggtcca gcccaaccct ccctgccttg 540

cctatataca caccttcttc actgcaaaac accacctcaa atcaaacacc acaccttata 600

actcagcctt aagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga ggagacattt 660

ctcttctctg agataag 677

<210> 6

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggacagctgt ttaagaagaa aacatatgaa atggacacgt tttaagcaaa tggggatcct 60

ttagttccat gcgtacagcc tcaggcactt gggggtccag cccaaccctc cctgccttgc 120

ctatatacac accttcttca ctgcaaaaca ccacctcaaa tcaaacacca caccttataa 180

ctcagcctta agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag gagacatttc 240

tcttctctga gataag 256

<210> 7

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtttgttggt gacgctagca ttaaaagtag taatcaagtt ctacctttaa aagatgcctt 60

acatgtacca aatctaaata gagatttatt atcggttagt caccttacag actattatcc 120

tgtaaataat gaatttccta ataagaattt tatatcaaga aaatagagag aggtcacaaa 180

atgatgataa gacaatccaa tggtggtctc tatgttattt caagtccaca tgagttacat 240

ttcttttata ggttcaacca aagaacctca cttggtaggg actgcaatta atctattgct 300

aaatcattca gtctttcttt ctccttcccc caatttttcc ctatcattat taattattcc 360

caatctgaag caccattttt actcatcagg caatcgctaa tttttccacc atatggtggg 420

gccaaactta atgatggttt caaacctctg ttaaaatctg ttactattcc attacatctc 480

ctttgccatt atct 494

<210> 8

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acctctgtta aaatctgtta ctattccatt acatctcctt tgccattatc ttacagatat 60

tcgctattat tattcgtcat tattcccttt gaaattcatc gcaattagcg atagatccta 120

ttcgtcgcta tacaatcata ttctagtagt gttatagaca tccataactt gaagactgta 180

ttgtgcatat ctctacttct tggcttgttc gtcaatcaac ttcgcacttt gtaaatacgt 240

acttgatcac tttcacattt tgtacatgta gattaaatgt aacttctata ttccacttct 300

ttagttttct caacctcctt tccatttgaa aaaaaagtat tttattcttc caggatattg 360

tttaacatcc acacttcttt tttattcccg acctttattg ctacctcccc acttcataag 420

aatgtcttac aaccttttaa aagactttat aacttccctt tcacattctt gcatccttaa 480

ttttttacat gttaataatg aattattaat caatttttgg ccagtaagct gagaatttaa 540

taatgattta gaaatccaac aataacgggc ttcaaaattt ggat 584

<210> 9

<211> 502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaatccaa caataacggg cttcaaaatt tggataaaaa atatataggc cttcttaata 60

ggcttggtct aattactagt cgtaggataa tgctaaattt ggatataaac aatttcaaat 120

ttggttaaaa ttaaaaattt atttgattta caaaatagat tctaaataga atttatttgc 180

tgataagttt atatatttaa tcttttaagt ataagtttgg ggcacaaatt gaccaattgt 240

ccataaaaat agtatccaac ttttatcatt tcaaccaaac attccatagt attttcagaa 300

gagatattga gaggtggcaa tggaaatgga ggccgctgaa gagagattag gaggtggcaa 360

gggaattcga ggcagcagaa gagatatttc gaggtggcac cgaaattcga ggcagcaggt 420

gcgagtcatg tccacagctc acttttcact ttttggagaa accaagaaat tttgacaggt 480

ttatgctaat tttgacaagc gt 502

<210> 10

<211> 613

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acagctcact tttcactttt tggagaaacc aagaaatttt gacaggttta tgctaatttt 60

gacaagcgtt tggctaattc ctgttacaaa caaaagtcat ttattgtcaa tttcgtcttt 120

atgttaaatt tatttgacct cgtgatttta attttagtct aatctatttt ttattattgt 180

tatataaaat taataaatat ttattaattt tgaataatta aatatatata tatatatata 240

ttatttttat acaatacaat aaatatatca atataaataa atttctcttt tttaatataa 300

aattacagaa atatttatta aaatttatta acctcagctt atattttatt attgaaattt 360

aatagatgta tatttattta atatttaaat tcataattga ataaaatatt tttattagtc 420

aaattaaaat ttatatatac atattattat taaaatgctt aatttaatta taaattttaa 480

gaataattaa agacattata agagtttcta gttcaacttc taattttata atttaattat 540

tttgattata aataaaatta atttgtgatt aatttttaaa tatttttatt ttagttaata 600

tataatggtc tcg 613

Claims (10)

1.一种RcFAH12启动子，其特征在于，所述RcFAH12启动子是利用RACE技术确定RcFAH12转录起始位点，参照蓖麻基因组序列合成的RcFAH12启动子-2506～+99bp序列。

2.一种RcFAH12启动子的缺失突变片段，其特征在于，所述RcFAH12启动子缺失突变片段的获得方法包括以下步骤：将RcFAH12启动子-2506～+99bp序列，连入pUC57质粒载体中得到质粒pUC57-RcFAHP2605，并以质粒pUC57-RcFAHP2605为模板，分别以对应的T/B引物对进行PCR扩增，得到10个启动子缺失突变片段。

3.根据权利要求2所述的RcFAH12启动子缺失突变片段，其特征在于，所述缺失突变片段为RcFAHP2605、RcFAHP2159、RcFAHP1611、RcFAHP1178、RcFAHP677、RcFAHP256、RcFAHP494、RcFAHP584、RcFAHP502、RcFAHP613，大小分别为2605bp、2159bp、1611bp、1178bp、677bp、256bp、494bp、584bp、502bp和613bp。

4.根据权利要求3所述的RcFAH12启动子缺失突变片段，其特征在于，所述RcFAHP2605、RcFAHP2159、RcFAHP1611、RcFAHP1178、RcFAHP677、RcFAHP256、RcFAHP494、RcFAHP584、RcFAHP502、RcFAHP613对应的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10。

5.根据权利要求2所述的RcFAH12启动子缺失突变片段，其特征在于，所述PCR扩增时的扩增体系为质粒pUC57-RcFAHP2605 1μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer(Mg²⁺plus)10μL；dNTPMixture(2.5mM each)4μL；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL；补ddH₂O至50μL；T/B引物各1μL。

6.根据权利要求2所述的RcFAH12启动子缺失突变片段，其特征在于，所述PCR扩增时的扩增参数为98℃变性10sec；60℃退火延伸3min，30个循环，4℃保存。

7.如权利要求2所述的一种RcFAH12启动子缺失突变片段在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的RcFAH12启动子缺失突变片段在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用，其特征在于：将10个启动子缺失克隆片段连入由pCAMBIA1303 PstI/Nco I双酶切的载体中，构建由10个缺失突变启动子替换原有35S启动子的表达载体，并利用蘸花法侵染拟南芥进行遗传转化，在浓度为50mg/L潮霉素抗性筛选下，得到T3代转基因拟南芥，并对T3代转基因拟南芥组织进行GUS染色分析，得到不同基因缺失突变片段在花药中、种子中以及叶片中的高强度特异性表达。

9.根据权利要求8所述的RcFAH12启动子缺失突变片段在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用，其特征在于：所述缺失突变片段在种子中高强度特异性表达的启动子有RcFAHP2605、RcFAHP1611、RcFAHP256、RcFAHP502和RcFAHP613，并且所述RcFAHP2605在叶片中也呈现高强度表达。

10.根据权利要求9所述的RcFAH12启动子缺失突变片段在植物功能基因研究或在植物基因工程育种中的应用，所述RcFAHP1611启动子可启动GUS在花萼、花瓣、花丝、柱头中高强度表达；所述RcFAHP2605启动子可启动GUS基因在花萼、柱头及花药中低强度表达。

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