CN111778250A - 一种蓖麻可低温诱导启动子pdat1-2p5及其克隆和应用 - Google Patents

一种蓖麻可低温诱导启动子pdat1-2p5及其克隆和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程与分子生物学技术领域，具体公开了一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1‑2P5及其克隆和应用。本发明蓖麻可低温诱导启动子PDAT1‑2P5其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。上述蓖麻可低温诱导启动子PDAT1‑2P5可在低温诱导下驱动外源基因在拟南芥中特异表达。本发明获得的新的蓖麻可低温诱导启动子PDAT1‑2P5可以驱动外源基因在低温条件下特异表达，其克隆鉴定将对植物品质改良或以植物作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

Description

一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5及其克隆和应用
技术领域
本发明涉及基因工程与分子生物学技术领域，具体涉及一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5及其克隆和应用。
背景技术
蓖麻为大戟科(Euphorbiaceae)蓖麻属，一年生或多年生草本，子实富含油分和蛋白质，是重要的工业原料。蓖麻籽中三酰甘油含量范围在39.6％～59.5％，其中含有特殊的羟化脂肪酸——蓖麻油酸(Ricinolic acid)，蓖麻油酸是一种羟基脂肪酸(HFA)，是蓖麻油中的主要成分，约占蓖麻三酰甘油的83.65％～90.00％，平均值达到88.30％。蓖麻作为油料作物主要就是利用种子生产蓖麻油，蓖麻油在多个领域被广泛的应用。磷脂：甘油二酯酰基转移酶(Phospholipid:diacylglycerol acyltransferase，PDAT)在TAG合成中发挥的作用是在不依赖于酰基-CoA情况下将磷脂sn-2位点上的酰基转移到DAG sn-3位点，是蓖麻油中产生高蓖麻油酸的重要原因。
自1983年首次获得转基因植物以来，植物基因工程技术在解决人类所面临的粮食、能源和环境危机等方面发挥了很大的作用并显示了良好的前景，外源基因能够在植物组织中实现正常乃至高效的表达，一个重要的条件是构建一个高水平表达异源蛋白质的表达载体，而一个高效表达的载体，启动子则是最重要元件之一。至今在真核生物中已鉴定多种特定的启动子序列，常常在基因转录起始点5′近端的核苷酸序列上游-20～-220bp区域内。
不同的启动子使基因具有不同的表达特性。选择合适的启动子对于外源基因的表达量至关重要。能够使基因在大多数的细胞类型中表达的启动子称为组成型启动子，如对许多双子叶植物转基因工作而言，最常用的一种启动子是来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。它们是植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子，特点是表达具有持续性，表达量基本恒定，也正由于这种特点使得外源基因产物可能对植物的生长发育产生不利影响，甚至导致死亡。此外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。为了使外源基因在植物体内高效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，使人们越发注重特异表达启动子和诱导型启动子的研究和应用，使启动子在特定的组织和一定的发育时期启动基因表达，使基因表达能够对特异条件产生响应，既保证了外源基因在植物体内的有效发挥又减少了对植物的不良影响。目前，大量的特异性启动子和诱导型启动子已被克隆和功能分析，并已广泛应用于植物基因工程中。本发明低温诱导型启动子的克隆鉴定为下一步在植物基因工程改造中具有良好的应用价值。
发明内容
本发明提供了一种来源于蓖麻的启动子PDAT1-2P5及其克隆和应用，本发明在蓖麻中克隆到一个1569bp的启动子片段PDAT1-2P，经生物信息学分析、洋葱转基因瞬时表达验证，确定PDAT1-2P是一个能驱动外源基因表达的启动子，进一步截取其中部分片段在拟南芥中永久表达验证PDAT1-2P5具有低温诱导表达的特性。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5，其核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示的。
所述蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5含有RNA聚合酶结合位点TATAbox、CAATbox、LTR(低温响应元件)、ABRE(脱落酸应答元件)、ARE(厌氧诱导调控元件)、CGTCA-motif(茉莉酸甲酯应答元件)等顺式作用元件。
本发明的优点和技术效果是：本发明首先提取蓖麻叶片总DNA，用启动子特异引物PDAT1-2-1-T和PDAT1-2-3-B进行PCR扩增，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pMDTM-18T中。生物信息学分析，PDAT1-2P启动子区含有常见的TATA-box、CAAT-box外，还有参与光响应、低温响应(LTR)、干旱诱导反应(MBS)、茉莉酸甲酯响应元件(TGACG-motifh和CGTCA-motif)以及MYB结合位点等多种顺式作用元件。用PstⅠ和NcoⅠ从pMDTM-18T载体切下该片段，替换掉植物表达载体pCAMBIA1303中的35S。将构建好的植物表达载体转入农杆菌GV3101。在洋葱中瞬时表达分析，发现其可启动绿色荧光蛋白GFP基因的表达，说明该启动子具有启动基因表达的功能。
用引物PDAT1-2-5-T和PDAT1-2-3-B从表达载体上扩增PDAT1-2P5启动子序列，先连入克隆载体pMDTM-18T，再用PstⅠ和NcoⅠ从pMDTM-18T载体切下该片段连入表达载体pCAMBIA1303中替换35S启动子，GUS组织化学染色发现转基因拟南芥不显示蓝色，经干旱12h、24、32、48小时处理后，GUS酶活测定明显比对照增强，这说明，PDAT1-2P5能在低温诱导条件下驱动GUS报告基因在植物中表达，它是一个低温诱导启动子。
附图说明
图1是荧光定量PCR检测PDAT1-2P驱动的下游基因在蓖麻根(root)、茎(stem)、叶(leaf)、雄花(flower)和不同发育时期(5DAP、10DAP、15DAP、20DAP、25DAP、30DAP、35DAP、40DAP、50DAP、60DAP)种子中的表达情况。
图2是PDAT1-2P启动子的PCR扩增示意图。
其中，A：启动子PDAT1-2P PCR扩增片段示意图，扩增PDAT1-2P片段长为1569bp；B：pMD18T-PDAT1-2P质粒PCR鉴定，扩增PDAT1-2P片段长为1569bp；C：pCAMBIA1303-PDAT1-2P质粒PCR鉴定，扩增含PDAT1-2P片段长为1906bp；扩增含35S的对照片段长1107bp。
图3是PDAT1-2P启动子构建时植物表达载体pCAMBIA1303和pCAMBIA1303-PDAT1-2P结构示意图。
图4是PDAT1-2P5启动子序列扩增图。
其中，A：启动子PDAT1-2P5 PCR扩增片段示意图，扩增PDAT1-2P5片段长为447bp，图中4泳道；B：pMD18T-PDAT1-2P5质粒PCR鉴定，扩增PDAT1-2P片段长为447bp，图中4泳道；C：pCAMBIA1303-PDAT1-2P5质粒PCR鉴定，扩增含PDAT1-2P片段长为447bp，图中4泳道。
图5是PDAT1-2P5启动子构建时植物表达载体pCAMBIA1303和pCAMBIA1303-PDAT1-2P5结构示意图。
图6是PDAT1-2P5启动子序列及作用元件分析。
图7是GUS组织化学染色，其中转基因拟南芥叶片、茎、花萼和果荚能够被染上蓝色但颜色很浅。
图8是低温处理前和低温处理后不同时间含PDAT1-2P5启动子转基因拟南芥叶片的GUS酶活性测定。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例具体包括以下试验过程：
1.1植物材料
本实验采用通蓖5号蓖麻品种的4叶期叶片，使用液氮速冻并放置-80℃保存备用。
1.2菌株与载体
菌株：大肠杆菌DH5α感受态细胞，购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。农杆菌GV3101感受态细胞，购买于上海士锋生物科技有限公司。
载体：克隆载体pMDTM18-TVector，购买于宝生物工程(大连)有限公司。植物表达载体pCAMBIA1303为本实验室保存。
Bradford蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，
1.3PDAT1-2P所驱动基因内源表达分析
设计基因特异引物PDAT1-2(F)和PDAT1-2(R)(如表1所示)，提取“通蓖5号”根、茎、叶片、雄花、和不同发育时期的蓖麻种子的RNA，反转录成cDNA。利用RT-PCR方法检测其在根、茎、叶片和不同发育时期种子中的表达情况，以蓖麻基因18s rRNA作为内参基因(表1)。
图1实验结果显示：该基因在种子中有很强的表达信号，在根、茎、叶片、雄花表达量很少。这表明该基因在种子中有强表达。
1.4蓖麻幼嫩叶片DNA提取及PDAT1-2P启动子片段的克隆
本发明用植物基因组DNA提取试剂盒提取“通蓖5号”幼嫩叶片基因组。使用SnapGene3.2.1设计含PstⅠ和NcoⅠ酶切位点的PDAT1-2P启动子的引物序列，上游引物序列为PDAT1-2-1-T：5'-AACTGCAGGAGGATGAACAGTCTCAGAT-3'，下游引物序列为PDAT1-2-3-B：5'-CATGCCATGGCGTTTTAGTGATTTTGTTG-3'，以蓖麻四叶期叶片DNA为模板，扩增出RcPDAT1-2启动子。
PCR反应体系：ddH2O 33.5μL，10x LAPCRbuffer(Mg2+Plus)5μL；dNTP Mixture8μL；PDAT1-2-1-T/PDAT1-2-3-B(10μM)各1μL；TaKaRa LATaq 0.5μL；基因组模板2μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45sec，59℃退火45sec，72℃2min，30个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)回收PCR产物。将其回收产物与载体pMDTM18-T Vector连接、热激法转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送中国农业科学院测序，经测序正确后，命名为pMD18T-PDAT1-2P。
1.5构建启动子PDAT1-2P表达载体
提取pCAMBIA1303和pMD18T-PDAT1-2 P质粒，分别用限制性内切酶NcoⅠ和PstⅠ双酶切并回收pCAMBIA1303大片段和pMD18T-PDAT1-2P小片段，经T4DNA Ligase连接并转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确连接的质粒命名为pCAMBIA1303-PDAT1-2P。培养含pCAMBIA1303-PDAT1-2P的大肠杆菌，提取质粒，转化农杆菌GV3101感受态，经培养后鉴定，鉴定用PCR引物为pC1303F和pC1303R，鉴定正确后保存。
1.6PDAT1-2 P启动子在洋葱表皮瞬时表达活性验证
分别将含pCAMBIA1303-PDAT1-2P和pCAMBIA1303质粒的农杆菌接种至含有250μLKan和500μLRif的液体YEB培养基中，28℃振荡培养箱中180rpm振荡培养24h。培养好的农杆菌菌液12000rpm离心5min收集菌体，弃上清，并用含10mmol/L MgCl2和20mg/LAS的MS液体培养基重新悬浮菌体沉淀，当重悬液OD600的值为1.5左右时即可用于侵染洋葱表皮细胞20min。用滤纸吸干洋葱表皮表面的菌液，洋葱表皮平铺于MS固体培养基中，以16h光照8h黑暗的光周期、25℃条件下共培养48h。从固体MS培养基上小心取下共培养的洋葱表皮细胞，用无菌水轻轻洗涤上述表皮细胞数次，制作临时切片，在荧光显微镜观察荧光现象并拍照。
1.7PDAT1-2P5启动子序列扩增及载体构建
以pCAMBIA1303-PDAT1-2P质粒为模板，使用表1的引物PDAT1-2-5-T和PDAT1-2-3-B进行扩增，PCR反应体系除引物选择差别外同1.4，扩增参数除退火温度为53℃外，其他同1.4，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
检测正确的PCR产物经琼脂糖凝胶回收，与克隆载体pMDTM18-T在16℃过夜进行连接，命名为pMD18T-PDAT1-2P5，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过PCR鉴定。检测正确的质粒进行PstI和NcoI双酶切并回收小片段，与表达载体经PstI和NcoI双酶切并回收大片段的pCAMBIA1303进行连接、转化、验证，验证成功后进行农杆菌转化并鉴定。
该PDAT1-2P5启动子DNA序列(SEQ IN NO：1)如下：
GAATAGATCACCGTTCACATTCGACGCCGCATCACTGAAACAGTAGCCAAGTAGCAAATGCGCTCCTAGATTTCTCTTCATCACGCCACGTGTATATTTTCTCAGCACGGGGTCCACACACCTCGAGGGTATCTTTCAACTTTGAAACTTCCACTCACCCTCCAAAACTTCAAAAGCTCGCCACGAGTAAACCAATCAGATAATCCCACGTCACCTTTCCCGGCGCTTTTCGGGACACCTCTGTTCTCTCCTTCCGACGCTTGGTGCTTCCAAACAAACAAAAATATAATTTCTAAGTTTTAACCAGATAAGAAAAAAACATATTCAGGTTGAGGGCTTCACTGTCTGCTAACTCTAGCTTCAAAGCCGAACCAGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATTTATTTATTAAATTCTTTGAGCCTTATCAACAAAATCACTAAAACG
1.8PDAT1-2P5启动子序列及顺式作用元件分析
将扩增到的启动子序列经PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html在线分析，PDAT1-2P5启动子含有重要的RNA聚合酶结合位点TATAbox、CAATbox(图6)，以及低温应答元件LTR(图6)。此外，还包含激素响应元件(如脱落酸和茉莉酸甲酯等)，以及响应光信号、及厌氧诱导的元件序列(表2)。
1.9拟南芥遗传转化及转基因植株的鉴定
利用蘸花法转化拟南芥，收集农杆菌侵染后的拟南芥T0代种子，放置在10mL灭菌的离心管中，使用无菌水进行清洗种子1次，75％的酒精处理6min，再用无菌水继续清洗4遍；播种在含50mg/L的潮霉素的培养皿中，用石腊膜将培养皿封好，放置21℃恒温培养箱中培养3周左右。3周后将活着的且生长状态良好的植株移栽到小花盆中，其土壤成分和培养条件同T0代培养条件相同。提取各个植株的基因组DNA，以载体上的1303F/1303R为引物进行PCR检测，鉴定正确的经T2代培养并收取T2代种子。
1.10转基因拟南芥GUS染色分析
配制GUS-staining solution(0.05M磷酸钠缓冲液；10mM EDTA；0.5mM铁氰化钾；0.5mM亚铁氰化钾；1mM X-Gluc；0.1％Triton X-100)；将待检测的材料用不含X-Gluc的GUS-staining solution冲洗3遍；使待检测材料完全浸泡在含有X-Gluc的GUS-stainingsolution，放入真空抽气机中抽取真空10min，用锡箔纸将离心管包住，放在37℃的振荡培养箱中150rpm过夜，第二天将染色材料用水洗一遍，然后转移至70％的酒精中进行脱色，每1h换一次脱色液，直至材料背景被完全脱色为止，置于显微镜下观察拍照。
GUS组织化学染色结果发现(图7)：转基因拟南芥叶片、茎、花、果荚均能够被染上蓝色，但颜色很浅。
1.11 RcPDAT1-2P5启动子低温响应元件功能验证
为探究低温对PDAT1-2P5启动子活性的影响。将含有LTR低温响应元件的RcPDAT1-2P5启动子的T3代转基因拟南芥种子，放4℃冰箱进行春化，再次使用50mg/L潮霉素处理。培养3周左右将生长状态一致的的植株移栽到小花盆中，继续培养两周，对野生型和转基因拟南芥进行低温胁迫，放置4℃恒温培养箱进行低温处理，16小时光照、8小时黑暗处理48h，处理前取样作为对照，处理后每12h取样一次，样品用液氮速冻，三株拟南芥为一个重复，共三个重复，进行GUS酶活检测：
将不同处理时期的转基因拟南芥叶片，放液氮中速冻保存，待全部样品采集完成后进行下一步实验。提取转基因拟南芥叶片总蛋白并测定蛋白含量测定，蛋白质含量测定参考Bradford蛋白浓度测定说明书进行操作，通过BSA标准曲线回归方程，求得蛋白液中蛋白的含量。
取10-100μg总蛋白，加入1mL含有1mM 4-MUG的GUS抽提液中(反应液应提前预热)，于37℃反应，在第5min，15min，25min以及35min时各取出200μL加入800uL 0.2M Na2CO3。
准备4-MU标准品，用0.2mol Na2CO3将10mmol 4-MU稀释12个梯度，分别为1mmol、0.5mmol、0.25mmol、……去掉高浓度的5个，用低浓度的7个做标准曲线。稀释好的4-MU可在4℃短期保存，注意避光。
将反应产物吸出200μL加入到黑色酶标板中，每板都要加4-MU标准品，即7个浓度梯度稀释液各取出40μL，加入160μL 0.2M Na2CO3，在365nm激发光，455nm发射光，测定荧光值。然后以荧光值为纵坐标，4-MU的含量(pmol)为横坐标绘制标准曲线。得出线性回归方程和相关系数。计算处理前及处理后不同时间GUS酶活性。GUS酶活定义为：每mg蛋白在每分钟生成pmol 4-MU的量。结果如图8。从结果可以看出，在低温诱导后GUS酶活性随时间延长，GUS酶活性不断增大，说明该启动子有低温诱导下游基因表达的特性。
表1本发明用到的引物
Figure BDA0002583845610000091
划线部分是PstI和NcoI识别位点
表2 PDAT1-2P5序列中的顺式作用元件
Figure BDA0002583845610000101
表3制作BSA标准曲线
Figure BDA0002583845610000102
Figure BDA0002583845610000111
Figure BDA0002583845610000121
Figure BDA0002583845610000131
序列表
<110> 内蒙古民族大学
<120> 一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5及其克隆和应用
<130> 2020
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaatagatca ccgttcacat tcgacgccgc atcactgaaa cagtagccaa gtagcaaatg 60
cgctcctaga tttctcttca tcacgccacg tgtatatttt ctcagcacgg ggtccacaca 120
cctcgagggt atctttcaac tttgaaactt ccactcaccc tccaaaactt caaaagctcg 180
ccacgagtaa accaatcaga taatcccacg tcacctttcc cggcgctttt cgggacacct 240
ctgttctctc cttccgacgc ttggtgcttc caaacaaaca aaaatataat ttctaagttt 300
taaccagata agaaaaaaac atattcaggt tgagggcttc actgtctgct aactctagct 360
tcaaagccga accagctcag tttttttttt tttttttaaa tttatttatt aaattctttg 420
agccttatca acaaaatcac taaaacg 447
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgacaggtgg aagcgagaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggggataac caccccatga atcca 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgcatggtct cctgatacgg ccaag 25
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aactgcagga ggatgaacag tctcagat 28
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catgccatgg cgttttagtg attttgttg 29
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aactgcagga atagatcacc gttcacat 28
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcgcgttgg ccgattcatt a 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcgatccag actgaatgcc cac 23

Claims (6)

1.一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5，其特征在于：扩增所述PDAT1-2P5的引物PDAT1-2-5-T和PDAT1-2-3-B序列为：
PDAT1-2-5-T：5’-AACTGCAGGAATAGATCACCGTTCACAT-3’；
PDAT1-2-3-B：5’-CATGCCATGGCGTTTTAGTGATTTTGTTG-3’。
3.根据权利要求2所述的一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5，其特征在于：扩增所述蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5的PCR反应体系为：ddH2O 33.5μL；含Mg2+Plus的10x LAPCR buffer 5μL；dNTP Mixture 8μL；浓度为10μM的PDAT1-2-5-T/PDAT1-2-3-B各1μL；TaKaRa LATaq 0.5μL；基因组模板2μL。
4.根据权利要求2所述的一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5，其特征在于：扩增所述蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，53℃退火45sec，72℃2min，30个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5在低温诱导下驱动外源基因在拟南芥中特异表达的应用。
6.根据权利要求5所述的一种蓖麻可低温诱导启动子PDAT1-2P5在低温诱导下驱动外源基因在拟南芥中特异表达的应用，其特征在于：所述外源基因为GUS基因。
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