CN103667211A - 影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途，影响雄性生育力的蛋白质包括：（a）具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有影响雄性生育力的活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明影响雄性生育力的蛋白质OsAmylase为首次分离自水稻品种日本晴的α-淀粉酶，并且能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中去雄的步骤，减小了劳动力的投入和对产量的影响，具有较大的成本效益。

Description

影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途

技术领域

本发明涉及一种影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种来自水稻的、通过提前降解淀粉以影响植物雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途。

背景技术

植物杂交育种技术的发展使得作物的品质和数量均有相当程度的提高。由于杂交技术的应用，使得产量增加和预期特征（例如疾病抗性、昆虫抗性、耐热性、耐旱性以及植物组成的变化）的各种组合都成为可能。通常情况下，杂交技术的应用依赖于向母本提供花粉的父本，由此获得杂交种。

长期以来，在水稻育种工作和生产上使用的雄性不育系主要通过常规育种的方法筛选获得，或者将不育性状从一个品种通过回交的方法引入另一品种中，这种方法周期长、见效慢，难以满足生产发展的迫切需求；同时雄性不育系的资源非常有限，严重制约水稻制备和生产杂交种。

如果植物已空间隔离雄性和雌性的花或者分离雄性和雌性植株，则可以适用杂交种植物生产的机械方法。例如，在玉米植株的顶端花序中具有生产花粉的雄花，雌花在沿着茎的叶轴部。玉米的异交是通过对母本机械去雄以防止自交来确保的。尽管目前去雄被用于植物的杂交种种子生产中，如玉米，但是依据母本去雄的实际去雄成本和产量损失，上述过程是劳动密集型的且是昂贵的。另外，大部分作物植物的功能性雄性和雌性器官均在同一朵花中，例如，水稻是不严格的自花传粉，约有3%-5%的异花传粉，且水稻的花粉相当细小，会随风力、稻的摇摆落到隔壁雌蕊柱头上，因此去雄不是一个简单的过程。尽管可以在散粉前用手除去花粉形成器官，但上述杂交种生产的方法是极端劳动密集型的和昂贵的。

生产杂交植物的化学方法包括使用化学药品杀死或阻止可育花粉的形成。这些化学药品被称为杀配子剂，被用于给予暂时的雄性不育。由于化学药品的费用和有效性、以及应用的持续时长和可靠性，使用杀配子剂进行的杂交植物的商业化生产是受限制的。杀配子剂的一个严重的局限性在于其具有植物毒性的影响，其严重程度取决于基因型。其它局限性包括这些化学药品对于延长花期中的作物不一定是有效的，因为生长的新花可能没有被影响。因此，需要重复应用上述化学药品。

此外，近年来随着转基因植物种类和种植面积的快速增加，转基因生物的大规模环境释放以及可能带来的环境生物安全问题已经日益成为当前倍受关注的话题之一。而转基因植物中的外源基因可能通过天然杂交的方式整合到环境中的非转基因品种或其野生近缘种中，从而带来环境生物安全问题。在杂交亲和的植物种类之间，花粉介导的基因漂移是不可避免的。

上世纪九十年代，Mariani等人开创了人工制备雄性不育系的新途径，他们利用来自烟草的花药绒毡层的特异启动子(TA29)和核糖核酸酶基因（Barnase）构建表达盒转化烟草和油菜，导致转基因植株的花药绒毡层被破坏，形成雄性不育系，而并未影响转基因植株的其它性状。除利用Barnase构建雄性不育系之外，当前很多研究表明其它的功能基因也可被广泛应用于基因工程方法来构建转基因雄性不育植株。

在花粉发育后期，淀粉的积累为后续的花粉萌发和花粉管的延伸储备能量，当花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解能够使花粉粒能量来源崩溃，从而花粉发育被遏制，导致植物雄性育性丧失。已有报道将玉米α-淀粉酶基因与雄性组织优先型启动子重组，使转基因玉米植株通过表达α-淀粉酶，出现了不同程度的雄性不育现象。为了利用上述技术获得新的雄性不育株系，从而降低花粉介导的基因漂移的风险，需要不同来源的α-淀粉酶基因，例如水稻，而至今未发现有水稻的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途，即新的来自水稻的α-淀粉酶基因，以获得新的雄性不育株系，从而降低花粉介导的基因漂移的风险。

为实现上述目的，本发明提供了一种影响雄性生育力的蛋白质，包括：

（a）具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有影响雄性生育力的活性的由（a）衍生的蛋白质；或

（c）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

为实现上述目的，本发明还提供了一种影响雄性生育力的基因，包括：

（a）编码所述影响雄性生育力的蛋白质的核苷酸序列；或

（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交且编码具有影响雄性生育力的活性的蛋白质的核苷酸序列；或

（c）如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

所述严格条件可为在6×SSC（柠檬酸钠）、0.5%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述影响雄性生育力的基因。

进一步地，所述调控序列为雄性配子优先型启动子。

优选地，所述雄性配子优先型启动子为PG47或ZM13。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述影响雄性生育力的基因或所述表达盒的DNA构建体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述DNA构建体的重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种降解植物花粉中淀粉的方法，包括通过表达所述影响雄性生育力的基因或所述表达盒以降解植物花粉中的淀粉。

为实现上述目的，本发明还提供了一种扰乱植物花粉发育的方法，包括利用所述降解植物花粉中淀粉的方法以扰乱花粉形成。

为实现上述目的，本发明还提供了一种诱导植物雄性不育的方法，包括利用所述扰乱植物花粉发育的方法以产生部分雄性不育植物。

为实现上述目的，本发明还提供了一种影响植物雄性生育力的方法，包括利用所述诱导植物雄性不育的方法以产生部分雄性不育植物。

为实现上述目的，本发明还提供了一种降低花粉中外源基因扩散的方法，包括将所述表达盒引入植物细胞以产生转基因植株。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，包含：

（a）提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因的纯合隐性等位基因，且所述第一植株是雄性不育的；

（b）向第二植株中引入所述DNA构建体，所述第二植株包含与所述第一植株包含的雄性不育基因的纯合隐性等位基因相同的雄性不育基因的纯合隐性等位基因；所述构建体为半合状态；在所述构建体中还包括育性恢复基因，当所述育性恢复基因在所述第二植株中表达时将恢复其雄性生育力；

（c）用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持所述第一植株纯合隐性状态的后代。

优选地，所述育性恢复基因为Ms26基因、Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。

为实现上述目的，本发明还提供了一种用于从具有雌性配子和雄性配子的植株产生种子的方法，包含：

（a）向包含雄性不育基因的纯合隐性等位基因的第三植株引入所述DNA构建体，所述第三植株是雄性不育的；在所述构建体中还包括育性恢复基因，当所述育性恢复基因在所述第三植株中表达时将恢复其雄性生育力；

（b）使所述第三植株自体受精；

（c）产生含有所述构建体的种子。

优选地，所述育性恢复基因为Ms26基因、Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。

本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。

本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子（密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸），其可作为开放阅读框（ORF）阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA（肽核酸）。

本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明影响雄性生育力的基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明影响雄性生育力的基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠（SSC）处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5%SDS溶液中，在65℃下与SEQ ID NO:1发生特异性杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

因此，具有影响植物雄性生育力活性并在严格条件下与本发明序列1杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40%-50%、大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同源性。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的影响雄性生育力的活性特征的部分和/片段（包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失）、变体、突变体、取代物（有替代氨基酸的蛋白质）、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有影响雄性生育力的活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的影响植物雄性生育力的生物活性的蛋白。

本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列（核苷酸或氨基酸）的一部分或其人工改造形式（例如适合植物表达的序列），包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端的缺失，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保（编码）蛋白质为α-淀粉酶。在一些情况下（特别是植物中的表达），使用编码截短蛋白质的截短基因可能是有利的。优选的截短基因一般编码全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。

由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响调控雄性生育力的活性的序列，亦包括保留影响雄性生育力的活性的片段。

本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、疏水性氨基酸（如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社（Academic Press）出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定（如参见，Cunningham和Wells，1989，Science244：1081-1085）。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的影响雄性生育力活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定（参见，如de Vos等，1992，Science255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters309：59-64）。

因此，与序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60%，优选的大于75%，更优选的大于80%，甚至更优选的大于90%，并且可以大于95%。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性和/或类似性。

本发明中，所述核苷酸序列在花粉发育期大部分表达于花药中，这种核苷酸序列可被认定为“花药特异性”。

本发明花药组织是指植物中雄性生殖器官的组织，它完全发育或局部发育，包括构成花药的所有结构，如表皮、药室内壁、胞间层和绒毡层。

在谷物种子最初的发芽期，糊粉层细胞将合成本发明所述α-淀粉酶（α-Amylase），其参与水解淀粉形成葡萄糖和麦芽糖的过程，由此为后续的花粉萌发和花粉管的延伸储备能量。在花粉发育后期，当花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解能够使花粉粒能量来源崩溃，从而花粉发育被遏制，导致植物雄性育性丧失。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述影响雄性生育力的基因的调节序列。

本发明的启动子可以从其5’非翻译区域（5’UTR）的天然编码区域的5’区来分离。类似地，终止子可以从侧翼于其各终止密码子的3’区来分离。

本领域技术人员可以很容易地鉴定出启动子区域。鉴定出含有ATG基元的推定起始密码子，该起始密码子的上游就是推定的启动子。“启动子”是一段DNA调控区域，其通常包含能知道RNA聚合酶Ⅱ在对于特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子可以额外包含其它识别序列，这些序列通常位于TATA盒的上游或5’端，它们被称为上游启动子元件，影响转录起始速率，例如作用于编码序列的组织表达和时间表达的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织（例如雄性组织）中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子是指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。

核心启动子可以使任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子、泛素启动子、IN2启动子或玄参花叶病毒启动子。

还可以对启动子序列加以修饰，以提供异源核苷酸序列表达水平的范围。可以利用比整条启动子更少的区域，而驱动绒毡层优先表达的能力仍能保留。但是，mRNA的表达水平可能随着启动子序列一部分的缺失而减少。因此，可将启动子修饰为弱或强启动子。通常，“弱启动子”是指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”是指大约1/10000转录本至大约1/100000转录本至大约1/500000转录本的水平。相反，强启动子驱动编码序列以高水平（或者大约1/10转录本至大约1/100转录本至大约1/1000转录本）表达。通常，启动子序列的至少大约30个核苷酸将被用于驱动核苷酸序列的表达。为增加转录水平，可以将增强子与启动子区域组合使用。增强子是发挥增加启动子区域表达作用的核苷酸序列，例如SV40增强子区域、35S增强子元件等。

本发明中，所述构建体中的启动子可以使天然启动子或被取代的启动子。所述构建体中的启动子可以是诱导型启动子，使得可通过暴露给诱导剂来控制构建体中正义或反义分子的表达。任何植物相容性启动子元件都可用于所述构建体，可以是植物基因启动子，例如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基的启动子；或者根癌农杆菌的肿瘤诱导质粒的启动子，例如胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子；或者病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒（CaMV）19S和35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子；大麦脂转移蛋白启动子LTP2；泛素启动子；END2启动子和聚半乳糖醛酸酶PG47启动子。

可获得的植物相容性启动子的范围包括组织特异性启动子和诱导型启动子。诱导型调控元件是能应答于诱导剂直接或间接激活一条或多条DNA序列或基因的转录的元件。不存在诱导剂时，DNA序列或基因将不能被转录。典型地，与诱导型调控元件特异结合以激活转录的蛋白质因子以无活性形式存在，其再通过诱导剂直接或间接转化为活性形式。诱导剂可以是化学试剂，例如蛋白质、代谢产物、生长调控因子、除草剂或酚类化合物或直接通过热、冷、盐或毒性元素施加或通过病原体肌动蛋白或疾病剂（例如病毒）间接施加的生理胁迫。含有诱导型调控元件的植物细胞可暴露于诱导剂，通过喷雾、浇水、加热或类似方法将诱导剂应用到细胞或植物上。

任何诱导型启动子均可用于本发明。示例性的诱导型启动子包括蜕皮素受体启动子；来自ACE1系统的应答于铜的启动子；来自玉米的In2-1和In2-2基因，其应答于苯磺酰胺除草剂安全剂；玉米GST启动子，其由用作为前紧急除草剂的疏水亲电化合物激活；和烟草PR-1a启动子，其由水杨酸激活。其它受化学调控的启动子包括甾醇应答型启动子以及四环素诱导型和四环素遏制型启动子。

组织优先型启动子可用于靶向特定的植物组织中增强的转录和/或表达。启动子可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。本发明中，启动子是偏好于在植物的雄性或雌性组织中表达。本领域技术人员已知的很多此类启动子都可以使用。例如MAC2启动子，其偏好于指导其连接的基因在植物雄性组织中表达，特别是绒毡层。雄性配子优先型启动子还包括PG47启动子以及ZM13启动子；肌动蛋白解聚因子启动子；玉米果胶甲基酯酶类似基因的启动子ZmC5；钙调素结合蛋白Mpcbp的启动子。

本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列（即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子）、提供DNA转移和/或整合功能的序列（即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点）、提供选择性功能的序列（即抗生素抗性标记物、生物合成基因）、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列（即多接头序列、位点特异性重组序列）和提供复制功能的序列（即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列）。

基于基因的目的用途，本发明中所述构建体还可以包括其它组分，例如选择标记、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。所述构建体还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止区域。终止区域可以从根癌农杆菌的Ti质粒获得，例如胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶的终止区域。

所述构建体可额外的含有5’前导序列，所述前导序列可发挥增强翻译的作用，其包含但不限于，小RNA病毒前导序列，EMCV前导序列（脑心肌炎病毒5’非编码区）；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV（烟草蚀纹病毒）前导序列；MDMV（玉米矮缩花叶病毒）前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质（BiP）；来自紫花苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列（AMVRNA4）；烟草花叶病毒（TMV）前导序列；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列（MCMV）。所述构建体还可含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，特别是质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，所述构建体还可包含转运肽（又称分泌信号序列或导向序列）的编码序列，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，其包含但不限于，酰基运载蛋白的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽等。用于向特定细胞器表达产物有很多选择，例如，大麦α淀粉酶序列通常被用于指导向内质网的表达。

本发明提供了能表达所述构建体的载体。一般而言，所述载体应当在植物细胞中具有功能。有时，载体在大肠杆菌中具有功能是优选的（例如，生产蛋白质用于产生抗体、DNA序列分析、构建插入、获得核酸的量时）。

本发明中所述构建体可另外含有对除草剂形成抑制或中和作用的基因，优选为除草剂抗性基因，其包括但不限于，对磺酰脲类的抗性基因、对溴苯腈的抗性基因、对草甘膦的抗性基因、对草胺膦的抗性基因、对草丁膦的抗性基因、对咪唑啉酮类的抗性基因和对2，4-二氯苯氧乙酸酯（2，4-D）的抗性基因。

将本发明中所述构建体或所述重组载体导入植物，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

本发明中所述的将核苷酸序列“引入”植株时，其表示可通过直接转化的方法发生，所述方法例如对植物组织的农杆菌介导的转化、微粒发射轰击、电穿孔等；或者可通过将具有异源核苷酸序列的植株与另一植株杂交来进行，使得后代具有并入它们基因组的核苷酸序列。此类育种技术是本领域技术人员公知的。

本发明提供了一种影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途，具有以下优点：

1、首次分离。本发明影响雄性生育力的蛋白质OsAmylase为首次分离自水稻品种日本晴的α-淀粉酶。

2、杜绝基因漂移。本发明影响雄性生育力的基因OsAmylase来源于水稻，在花粉发育后期，当花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解能够使花粉粒能量来源崩溃，从而花粉发育被遏制，导致转基因花粉不育，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种。

3、效益好，准确性高。利用本发明影响雄性生育力的基因OsAmylase干扰了花粉形成和/或功能，准确性高，可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，减小了劳动力的投入和对产量的影响，具有较大的成本效益。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途的含有OsAmylase核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；

图2为本发明影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途的含有OsAmylase核苷酸序列的重组表达载体DBN100259构建流程图；

图3为本发明影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途的转基因水稻植株T0代的花粉发育图；

图4为本发明影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途的转基因水稻植株T1代的花粉发育图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途的技术方案。

第一实施例、获得OsAmylase序列

用玉米α-淀粉酶（α-Amylase）的已知序列（如序列表中SEQ ID NO:3所示），获得水稻品种日本晴的α-淀粉酶（OsAmylase）的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。所述OsAmylase核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有OsAmylase核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T

将合成的OsAmylase核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；OsAmylase为OsAmylase核苷酸序列（SEQ ID NO:1）；MCS为多克隆位点）。

然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体DBN01-T），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉素（100毫克/升）的LB平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I（25mM Tris-HCl，10mM EDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮；加入200μl新配制的溶液II（0.2M NaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（3M醋酸钾，5M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述OsAmylase核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即OsAmylase核苷酸序列正确插入。

2、构建含有OsAmylase核苷酸序列的重组表达载体DBN100259

分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体DBNBC-01（载体骨架：pCAMBIA2301（CAMBIA机构可以提供）），将切下的OsAmylase核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01中，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100259，其示意图如图2所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；gDPW：水稻雄性生育力基因组序列（SEQ ID NO:4）；PG47：玉米花粉特异性启动子（SEQ ID NO:5）；bt1：玉米Brittle-1叶绿体转运肽（SEQ ID NO:6）；OsAmylase：水稻α-淀粉酶的核苷酸序列（SEQ ID NO:1）；In2：玉米In2-1基因的终止子（SEQ ID NO:7）；Ubi：玉米Ubiquitin（泛素）基因的启动子（SEQ ID NO:8）；PAT：链霉菌的草丁膦乙酰转移酶的核苷酸序列（SEQ ID NO:9）；Nos：胭脂碱合成酶的终止子（SEQ ID NO:10）；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因（SEQ ID NO:11）；LB：左边界）。

将重组表达载体DBN100259用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体DBN100259），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SphI和SpeI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100259包含序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即OsAmylase核苷酸序列。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN100259用液氮法转化到农杆菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，酶切验证结果表明重组表达载体DBN100259结构完全正确。

第三实施例、转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株的获得及验证

1、获得转基因水稻植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的具有纯合隐性等位基因dpw的粳稻9522品种突变体（上海交通大学合作项目获得）的愈伤组织与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100259中的T-DNA（包括gdpw片段、PG47:OsAmylase:In2片段、Ubi:PAT:Nos片段、Ubi:PMI:Nos片段）转入到水稻染色体组中，获得了转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株。

对于农杆菌介导的水稻转化，简要地，把水稻种子接种在诱导培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、麦芽糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，从水稻成熟胚诱导出愈伤组织（步骤1：愈伤诱导步骤），之后，优选愈伤组织，用农杆菌悬浮液接触愈伤组织，其中农杆菌能够将所述OsAmylase核苷酸序列传递至愈伤组织上的至少一个细胞（步骤2：侵染步骤）。在此步骤中，愈伤组织优选地浸入农杆菌悬浮液（OD₆₆₀=0.3，侵染培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、pH5.4））中以启动接种。愈伤组织与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤3：共培养步骤）。优选地，愈伤组织在侵染步骤后在固体培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，有一个“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤4：恢复步骤）。优选地，愈伤组织在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的愈伤组织在含选择剂（甘露糖）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织（步骤5：选择步骤）。优选地，愈伤组织在有选择剂的筛选固体培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物（步骤6：再生步骤），优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基（N6分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述N6分化培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、甘露糖5g/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养。

2、用TaqMan验证转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株

取转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测DPW-PG47基因和PMI基因的拷贝数。同时以野生型水稻植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测DPW-PG47基因和PMI基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株和野生型水稻植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop2000（Thermo Scientific）测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型水稻植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测DPW-PG47基因序列：

引物1（DF）：TCCTCCGTGTCACGTCAGG如序列表中SEQ ID NO:12所示；

引物2（DR）：ATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGG如序列表中SEQ IDNO:13所示；

探针1（DP）：TCACCTCTCCTAGGAGCTGGTTCGAACTG如序列表中SEQ ID NO:14所示；

以下引物和探针用来检测PMI基因序列：

引物3（PF）：GTATGGAAAATCCGTCCAGCC如序列表中SEQ ID NO:15所示；

引物4（PR）：TGAACTGCTTTTCGGATGTGC如序列表中SEQ ID NO:16所示；

探针2（PP）：CGATGGCCGAGCTGTGGATGG如序列表中SEQ ID NO:17所示；

PCR反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件（Applied Biosystems）分析数据。

实验结果表明，gDPW片段、PG47:OsAmylase:In2片段、Ubi:PAT:Nos片段、Ubi:PMI:Nos片段均己整合到所检测的水稻植株的染色体组中，而且转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株获得了具有单拷贝的转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株。

第四实施例、分析转基因水稻植株

针对植株整体形态对第三实施例中的具有单拷贝的所述转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株（T₀）28株加以评估，针对花药和花粉进行分析。除了雄性生育力的程度之外，在所述转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株和野生型水稻对照植株之间没有观察到其它形态不同。结果表明：具有单拷贝的所述转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株（T₀）均为部分雄性不育（50%），所有植株（100%）的花粉均有一半（50%）不能被染成蓝黑色（图3，50%正常的花粉染色）。而野生型玉米对照植株则是完全雄性可育的（图3，正常花粉染色）。由部分雄性不育（50%）的所述转入OsAmylase核苷酸序列的水稻植株获得T₁代种子，播种后长成T₁代植株，所有部分雄性不育（50%）的所述转入OsAmylase核苷酸序列的T₁代水稻植株的花粉仍有一半花粉没有育性（图4）。

由此证明OsAmylase基因能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种。

综上所述，本发明影响雄性生育力的蛋白质OsAmylase为首次分离自中国水稻品种日本晴的α-淀粉酶，并且能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他野生作物品种；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中去雄的步骤，减小了劳动力的投入和对产量的影响，具有较大的成本效益。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (16)

1.一种影响雄性生育力的蛋白质，其特征在于，包括：

（a）具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有影响雄性生育力的活性的由（a）衍生的蛋白质；或

（c）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种影响雄性生育力的基因，其特征在于，包括：

（a）编码权利要求1所述影响雄性生育力的蛋白质的核苷酸序列；或

（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交且编码具有影响雄性生育力的活性的蛋白质的核苷酸序列；或

（c）如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求2所述影响雄性生育力的基因。

4.根据权利要求3所述表达盒，其特征在于，所述调控序列为雄性配子优先型启动子。

5.根据权利要求4所述表达盒，其特征在于，所述雄性配子优先型启动子为PG47或ZM13。

6.一种包含权利要求2所述影响雄性生育力的基因或权利要求3-5任一项所述表达盒的DNA构建体。

7.一种包含权利要求6所述DNA构建体的重组载体。

8.一种降解植物花粉中淀粉的方法，其特征在于，包括通过表达权利要求2所述影响雄性生育力的基因或权利要求3-5任一项所述表达盒以降解植物花粉中的淀粉。

9.一种扰乱植物花粉发育的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述降解植物花粉中淀粉的方法以扰乱花粉形成。

10.一种诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，包括利用权利要求9所述扰乱植物花粉发育的方法以产生部分雄性不育植物。

11.一种影响植物雄性生育力的方法，其特征在于，包括利用权利要求10所述诱导植物雄性不育的方法以产生部分雄性不育植物。

12.一种降低花粉中外源基因扩散的方法，其特征在于，包括将权利要求3-5任一项所述表达盒引入植物细胞以产生转基因植株。

13.一种用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，其特征在于，包含：

（a）提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因的纯合隐性等位基因，且所述第一植株是雄性不育的；

（b）向第二植株中引入权利要求6所述DNA构建体，所述第二植株包含与所述第一植株包含的雄性不育基因的纯合隐性等位基因相同的雄性不育基因的纯合隐性等位基因；所述构建体为半合状态；在所述构建体中还包括育性恢复基因，当所述育性恢复基因在所述第二植株中表达时将恢复其雄性生育力；

（c）用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持所述第一植株纯合隐性状态的后代。

14.根据权利要求13所述用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，其特征在于，所述育性恢复基因为Ms26基因、Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。

15.一种用于从具有雌性配子和雄性配子的植株产生种子的方法，其特征在于，包含：

（a）向包含雄性不育基因的纯合隐性等位基因的第三植株引入权利要求6所述DNA构建体，所述第三植株是雄性不育的；在所述构建体中还包括育性恢复基因，当所述育性恢复基因在所述第三植株中表达时将恢复其雄性生育力；

（b）使所述第三植株自体受精；

（c）产生含有所述构建体的种子。

16.根据权利要求15用于从具有雌性配子和雄性配子的植株产生种子的方法，其特征在于，所述育性恢复基因为Ms26基因、Ms45基因、DPW基因、Ms3基因或Ms22基因。

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