CN117778403A - 一种自交亲和系青花菜的创制方法和相关应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自交亲和系青花菜的创制方法和相关应用，涉及植物育种技术领域。本发明通过对青花菜基因组的SP11基因进行敲除，获得的突变体植株的自交亲和指数有了较大提高，显著减少了不育系和保持系繁育的工作量和成本，为创制青花菜自交亲和系提供技术路线。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，具体而言，涉及一种自交亲和系青花菜的创制方法和相关应用。
背景技术
青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)又名西兰花，属于十字花科芸薹属甘蓝种蔬菜变种之一。青花菜具有很高的营养和保健价值被誉为“蔬菜皇冠”，是国内外消费者非常喜爱的蔬菜品类。青花菜也是我国重要的大宗蔬菜种类之一，在全国各地均有种植，为我国蔬菜周年性供应发挥重要作用。
随着生物技术的发展控制芸苔属作物自交不亲和性基因的遗传机理不断明确。SSI受单一位点的复等位基因控制，命名为S位点，此位点通常包含三个紧密连锁、高度多态性的基因：S位点受体激酶(S locus receptor kinase，SRK)、S位点半胱氨酸富集蛋白/S位点蛋白11(S locus cysteine rich protein/S locus protein 11，SCR/SP11)和S位点糖蛋白(S locus glycoproteins，SLG)。SRK基因编码一个跨膜的丝氨酸/苏氨酸受体激酶，在柱头乳突细胞中特异性表达，是柱头SI决定因子；SCR/SP11基因编码一个定位在花粉粒表面的半胱氨酸富集蛋白，是花粉SI的决定因子；SLG基因编码的是一个能够被分泌到柱头乳突细胞的糖蛋白，在SI识别反应中没有主要作用，只是起到了增强SRK活性和稳定性的功能。SRK和SP11作为SI特异性的决定因素，使柱头区分SI反应中的“自我”和“非自我”花粉，从而抑制花粉的萌发与花粉管穿透乳突细胞细胞壁并伸长等过程，导致自交不亲和的发生。
青花菜是孢子体自交不亲和型(Sporophytic SI，SSI)作物，传统的遗传育种主要根据青花菜的自交不亲和的特性实现杂种优势的利用，因此在育种材料选择过程中自交不亲和性强的材料被保留下来，而自交亲和性好的材料舍弃。现在育种家为了保护育种成果、种质资源流失和保证生产的种子100％为杂交一代种子，细胞质雄性不育已经逐渐取代自交不亲和性广泛在青花菜新品种培育中应用。
青花菜育种技术的更新，育种目标从自交不亲和系的选育转为自交亲和系选育，然而育种家经过数年至十年分离固定获得的高世代优良材料基本上为自交不亲和系，尤其母本材料基本上表现为强自交不亲和性。不育系和保持系等育种材料的选育、繁殖都需通过人工剥蕾授粉，费时费工，成本高，极大限制雄性不育系在育种中的应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自交亲和系青花菜的创制方法和相关应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种自交亲和系青花菜的创制方法，其包括：沉默或下调青花菜基因组中的SP11基因的表达，使得SP11基因的功能缺失，得到转基因青花菜。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的自交亲和系青花菜的创制方法在培育新型转基因青花菜中的应用。
第三方面，本发明实施例提供了沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失的试剂在培育自交亲和系青花菜中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失的试剂在培育转基因青花菜中的应用。
本发明具有以下有益效果：
通过对青花菜基因组的SP11基因进行敲除，获得的突变体植株的交亲和指数有了较大提高，为青花菜创造了自交亲和系的制备路线，显著减少了不育系和保持系繁育的工作量和成本，为创制青花菜自交亲和系提供技术路线。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为青花菜转基因检测示意图；其中字母“M”为DNA marker；数字“1-29”为抗草丁膦除草剂植株；“+”为表达载体质粒作阳性对照；“—”为未转化；
图2为青花菜BoSP11基因靶位点T2序列PCR产物直接测序峰图和单克隆测序结果分析；
图3为BoSP11基因突变青花菜授粉结籽情况；其中FP为花期授粉；BP为蕾期授粉；
图4为BoSP11基因突变青花菜植株田间蜜蜂授粉结籽情况；
图5为BoSP11基因的脱靶效应检测。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种自交亲和系青花菜的创制方法，其包括：沉默或下调青花菜基因组中的SP11基因(SEQ ID No.7)的表达，使得SP11基因的功能缺失，得到转基因青花菜。
在一些实施例中，所述沉默或下调青花菜基因组中的SP11基因的表达的步骤包括：使青花菜基因组SP11基因的第二个外显子发生突变。
在一些实施例中，所述使青花菜基因组SP11基因的第二个外显子发生突变的步骤包括：利用基因编辑技术对青花菜基因组中的SP11基因的第二个外显子进行编辑。
在一些实施例中，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、锌指酶系统和RNA干扰技术中的至少一种。
在一些实施例中，当利用CRISPR/Cas9系统对SP11基因的第二个外显子进行编辑时，sgRNA的靶位点序列如SEQ ID No.2所示。相比其他基因和靶位点而言，本发明敲除青花菜SP11基因特定靶位点具有很高的编辑效率，很容易筛选获得纯合突变和较大目的片段缺失的突变体，获得的突变体植株的花期自交亲和指数有明显的提升。
利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的步骤包括将含目标sgRNA表达框插入表达载体后，转化到宿主菌感受态细胞中，侵染目的植物，筛选获得转基因植物。可以理解的是，在靶位点明确的情况下，CRISPR/Cas9的其他步骤均可通过常规技术知识获得并进行实施。
在一些实施例中，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥2。
在一些实施例中，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥4.84。
在一些实施例中，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥5.48。
在一些实施例中，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥6.82。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的创制方法在培育转基因青花菜中的应用。
本发明实施例还提供了沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失的试剂在培育自交亲和系青花菜中的应用。
优选地，所述自交亲和系青花菜的花期自交亲和指数≥4.84；
优选地，所述自交亲和系青花菜的花期自交亲和指数≥5.48；
优选地，所述自交亲和系青花菜的花期自交亲和指数≥6.82。
本发明实施例还提供了沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失的试剂在培育转基因青花菜中的应用。
在一些实施例中，所述沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失是指通过CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、锌指酶系统和RNA干扰技术中的至少一种实现。
在一些实施例中，所述沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失是指通过CRISPR/Cas9系统实现。
在一些实施例中，所述试剂包括：sgRNA、sgRNA表达框、含所述sgRNA表达框的表达载体和含所述表达载体的宿主菌中的至少一种。
在一些实施例中，设计所述sgRNA表达框的靶位点序列如SEQ ID No.2所示。
在一些实施例中，所述sgRNA表达框包括启动子序列、tRNA序列、酶切位点和sgRNA序列。
在一些实施例中，所述表达载体可以包括：pBluescript SK-sgRNA和pCA-Cas9中的任意一种。
在一些实施例中，所述宿主菌可以为农杆菌。
SEQ ID No.7：
5’-ATGAAATCTGCTGTTTATGCTTTATTATGTTTCATATTCATCGTTTCAGGTCATATTCAAGGTACTACTACTACATACCCTCAGCTGCCACTGGAGCTACAATTACTTGAGAAAATTTAAACTCCTCTTCAAGTCTTTTCCGACTAATAAACTTTTCTCTCTTTTTTTGGGCTAAACGTTAGATTGATAAATAAAATTATGAAGTGTTAGACATATTCTTTCAATATGTTCTGAACTTCTAGCAATAGACATAGGCCTCGACGTATTGCTTAATGACTTTTATTGGCTCTAAGGCCAACTCCATTGGTAGGTTCTTAATGGGTATCGAACTGATTAAAAGAATCAAAAGAATTAAGACAGAAGAAAAAGAATCAGAAGAGTTTTACGCAAGAATTAAGAAACAAGAAAAAGATTCAAAAACAATATATATATATATATATATATATATCTTGTAATGCTAGCTTTGTATTCGGTAACCTGTACCGCTTCCAATATCACTATTTCTGTTTATCAGTAAAAAGTAACCAATCGGATGAACTATGTTAAATCTTCATACTATCCATCGGTTTTTGCATCTATTCTTTTTCACATCAGTTCTTGAGGTTTGCAAGAAAGTGATTCTAAACTATTTTTTCCGGCATCAAAATTTAGATAGCATTTGGCAAAAAAAATTTAGATAGCAAAACTCACTACTAATAATCAGGAAAACTATATTTGCGAAAAGTGGTTGTAGAGCCTCGTTTAGTTTTAAACTTATTTTATTACCAGTTCATCCTTTTTATCAACTAACATTTTGATAATTGATATACTTTAATAGAGGTGGAAGCTAATCTGATGATGCCTTGTGGCTCTTTTATGTTTGGAAACTGTCGCAATATAGGAGCCAGGGAATGCGAAAAATTAAATTCGCCGGGTAAGCGCAAGAAGCCTTCACATTGCAAATGTACAGATACTCAAATGGGTACTTATTCTTGCGATTGTAAATAG-3’。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种自交亲和系青花菜的创制方法，其包括以下步骤。
(1)sgRNA表达框构建：
SP11基因是青花菜自交不亲和反应的主要决定因子，通过测序克隆获得987bp的基因序列，其中包含两个外显子；第一个外显子只有61bp的长度，第二个外显子的长度为170bp。利用CRISPR设计软件(CRISPR-GE(Genome Editing)-Liu YG Lab(scau.edu.cn))进行靶位点筛选，第一个外显子序列中选择为靶位点T1，SP11-T1：5’-TGTTTCATATTCATCGTTTC-3’(SEQ ID No.1)；在第二个外显子中选取靶位点T2，SP11-T2：5’-GGTAAGCGCAAGAAGCCTTC-3’(SEQ ID No.2)。
根据靶位点序列分别合成各个靶位点的互补引物对，其中，所述靶位点sgT1对应互补引物对包括。
SP11-T1 F：5’-TGCATGTTTCATATTCATCGTTTC-3’(SEQ ID No.3)、SP11-T1 R：5’-AAACGAAACGATGAATATGAAACA-3’(SEQ ID No.4)；
所述靶位点sgT2对应互补引物对包括：
SP11-T2 F：5’-TGCAGGTAAGCGCAAGAAGCCTTC-3’(SEQ ID No.5)、SP11-T2 R：5’-AAACGAAGGCTTCTTGCGCTTACC-3’(SEQ ID No.6)。
按表1所示，将靶位点互补引物对加ddH2O配制成总体积为10μL的反应体系，利用PCR扩增仪进行95℃变性5min，然后室温放置1h，再4℃冰箱放置1h以上；反应产物用ddH2O稀释250倍。
表1.靶位点互补引物反应体系
| 成分 | 体积 |
| 引物F | 1μL(100μM) |
| 引物R | 1μL(100μM) |
| ddH2O | 8μL |
| 总体积 | 10μL |
将青花菜SP11基因的两个靶位点序列分别连接sgRNA表达框中，构建含有两个靶位点的sgRNA表达框序列。
上述的sgRNA表达框序列是由拟南芥U3-b启动子序列、tRNA序列、type II内切酶位点序列、sgRNA序列依次排列构成。首先利用type II内切酶BsaⅠ位点将靶位点sgT1插入sgRNA表达框序列中，再利用type II内切酶BbsⅠ位点将靶位点sgT2插入sgRNA表达框序列中。
上述靶位点插入sgRNA表达框的具体步骤为：按表2所示，将sgRNA表达框质粒用内切酶BsaⅠ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化的质粒；再按表3所示，将sgT1互补片段和酶切后线性化的sgRNA表达框质粒在T4连接酶的作用下4℃连接过夜；再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取质粒。
再利用内切酶BbsⅠ酶切将sgT2互补片段连接到上一步获得的含有sgT1片段的sgRNA表达框质粒。
表2.sgRNA表达框酶切反应体系
| 成分 | 体积 |
| 10×NEB Buffer 2.1 | 3μL |
| sgRNA表达框质粒 | 4μL |
| 内切酶BsaI/BbsI | 1μL |
| ddH2O | 22μL |
| 总体积 | 30μL |
表3.靶位点组装连接反应体系
| 成分 | 体积 |
| 酶切sgRNA表达框质粒 | 15μL |
| 靶位点DNA片段 | 2μL |
| T4 DNA ligase Buffer | 2μL |
| T4 DNA ligase | 1μL |
| 总体积 | 20μL |
(2)植物表达载体构建：
将上述获得的含有BoSP11基因两个靶位点的sgRNA表达框利用BamHI和EcoRI酶切位点切下插入pCA-Cas9植物二元表达载体。
上述插入sgRNA表达框的步骤具体为：参照表4酶切反应体系用BamHI和EcoRI内切酶同时对pCA-Cas9载体质粒和sgRNA表达框载体质粒进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化的pCA-Cas9质粒和sgRNA表达框片段；参照表5所示，将pCA-Cas9线性化载体质粒20μL和sgRNA表达框片段6μL在T4连接酶的作用下4℃连接过夜；再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养16小时，筛选阳性克隆，获得用于青花菜BoSP11基因编辑的表达载体质粒。
表4.载体线性化酶切反应体系
表5.表达载体连接反应体系
| 成分 | 体积 |
| sgRNA表达框片段 | 6μL |
| pCA-Cas9线性化质粒 | 20μL |
| T4 DNA ligase Buffer | 3μL |
| T4 DNA ligase | 1μL |
| 总体积 | 30μL |
(3)利用冻融法将获得的BoSP11基因编辑表达载体质粒转化到EHA105农杆菌感受态细胞中。
(4)转基因青花菜植株的获得
青花菜无菌下胚轴准备：挑选籽粒饱满、均匀一致的青花菜自交系2M种子先用75％酒精消毒1min，再用10％次氯酸钠消毒15min，之后无菌水漂洗5-6次；将消毒完毕的种子均匀的播种在1/2MS固体培养基中(每瓶30粒为宜)；25℃、16h光照条件下培养7d，将无菌苗的下胚轴剪成长约1cm的小段，置于青花菜分化培养基(MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA pH5.8)上预培养2d。
农杆菌培养与侵染：用接种针挑取上述转化的阳性农杆菌菌株在含有Kan(50mg/L)和Rif(50mg/L)的YEB固体培养基平板上划线，并置于28℃烘箱培养2d；挑取阳性克隆单菌落于5ml含有Kan(50mg/L)和Rif(50mg/L)液体培养基中，225rpm摇床上28℃培养2d；侵染当天取600-700μL菌液加到50mL无抗生素的YEB液体中，28℃、225rpm摇床振荡培养4h至OD600值约为0.6～0.8，4℃、4000rpm离心10min，倒掉上清液，将菌体在20ml冰冷的MS液体培养基(MS+20g/L蔗糖pH5.8)悬浮；将预培养的下胚轴移至无菌瓶中，加入悬浮液侵染15min；将下胚轴移至无菌滤纸上吸干下胚轴上的多余菌液，然后移至分化培养中暗培养2d。
筛选培养与愈伤诱导：把侵染后的下胚轴移至青花菜筛选培养基(MS+3.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+400mg/L Cb+4mg/L PPT)中培养，之后每隔14d更换一次培养基；经过4-6月的筛选培养，将在筛选培养基中正常生长的不定芽，剪下插入生根培养基(MS+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+400mg/L Cb+4mg/L PPT)中进行生根；待根系长至1-2cm即可移栽到土壤中，获得29株抗草丁膦除草剂的植株。
转基因植株检测：
利用CTAB法提取抗草丁膦除草剂植株的基因组DNA，用引物Cas9-F和Cas9-R(Cas9-F：5’-CGCAAGAACCGCATCTGCTACCTC-3’、Cas9-R：5’-TTCTCGAGACGCCTGGACTTGGAG-3’)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明获得的29株抗草丁膦除草剂的植株全部为转基因植株(图1)。
BoSP11基因突变情况检测：
为了检测获得的转基因植株的BoSP11基因是否发生突变，分别在靶位点T1、T2的上下游设计合成引物对BoSP11-F1+BoSP11-R1、BoSP11-F2+BoSP11-R2(BoSP11-F1：5’-ATGGACGGTGGTGAAGAGACGTC-3’、BoSP11-R1：5’-GAATAAAGGCAAACCAGCTCG-3’、BoSP11-F2：5’-CGTCGAATGAGTTATGTAATCCCGACC-3’、BoSP11-R2：5’-GATTGATGAGAAGAGCTTAGATG-3’)PCR扩增。
将29株转基因材料的PCR产物进行测序，与对应的野生型植株PCR产物序列比对，靶位点序列发生改变或测序峰图出现重峰现象判断为基因发生突变。对测序结果进行比对分析，发现BoSP11基因靶位点T1未发生编辑，突变效率为0；但在靶位点T2有23株出现错峰现象，突变效率为79.3％。其中，4株在靶位点PAM结构上游3-4bp出现≤2bp的Indel变化，经进一步克隆测序确定为纯合突变。另外，有2株在靶位点上游28bp处开始出现错峰，克隆测序结果表明发生37bp的较大片段缺失。其余突变植株都在PAM结构上游3-4bp处发生≤2bp的杂合突变(图2)。
将获得SP11基因发生突变的植株置于人工气候室进行培养使其开花，经过3个月左右的15-25℃、16h光照8h黑暗的处理植株抽薹开花，对突变植株进行人工剥蕾和花期授粉，经过1.5个月的培养种子成熟，根据突变的不同类型对3株植株进行蕾期和花期的自交不亲和指数统计。
7#植株144个蕾期授粉种荚获得1172粒种子，蕾期自交亲和指数为1172/144＝8.14，187个花期授粉种荚获得1276粒种子，花期自交亲和指数为1276/187＝6.82；
16#植株156蕾期授粉种荚获得1284粒种子，蕾期自交亲和性指数为1284/156＝8.23，378个花期授粉种荚获得2071粒种子，花期自交亲和指数为2071/378＝5.48；
24#植株96个蕾期授粉种荚获得645粒种子，蕾期自交亲和指数为645/96＝6.72，132个花期授粉种荚获得638粒种子，花期自交亲和指数为638/132＝4.84。
野生型植物83个蕾期授粉种荚获得387粒种子，蕾期自交亲和指数为387/83＝4.66，122个花期授粉种荚获得21粒种子，花期自交不亲和指数为21/122＝0.17。
结果表明突变SP11基因能够显著提高青花菜花期授粉的结实率，实现青花菜花期自交亲和的目的。
由于载体整合到植株基因组的位点和SP11基因的位点不同，根据自交分离原则含转基因成分和不含转基因成分的植株按3：1进行分离，因此T1代植株通过筛选可获得无转基因成分的植株。并将筛选获得的无转基因成分植株定植于隔离大棚中，春季利用蜜蜂进行密闭花期授粉，230株材料获得4760g种子，平均每株花期自交获得20.7g种子(图4)，完全达到青花菜田间生产的产量，不需要任何的人工辅助授粉。
由于PAM序列5’端碱基序列决定了sgRNA的特异性，因此将BoSP11基因的两个sgRNA靶序列利用软件(CRISPR-GE(Genome Editing)-Liu G Lab(scau.edu.cn))和数据库(Brassica oleracea var.oleracea(NCBI))进行比对，结果发现和BoSP11-T1同源性相对较高的有2个(LOC106292528、LOC106292533)，和BoSP11-T2同源性相对较高的有4个(LOC106340273、LOC106293065、LOC106319029、LOC106318330)。为了进一步分析靶位点的特异性，是否会发生脱靶的可能，通过PCR扩增这些具有潜在脱靶风险的片段进行序列测序。测序结果表明，BoSP11基因选取的两个靶位点没有发生脱靶现象，具有较高的特异性(图5)。
结果证明利用CRISPR/Cas9技术可以对青花菜SP11基因进行高效的定点敲除，为获得自交亲和系材料提供新的技术路线。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种自交亲和系青花菜的创制方法，其特征在于，其包括：沉默或下调青花菜基因组中的SP11基因的表达，使得SP11基因的功能缺失，得到转基因青花菜。
2.根据权利要求1所述的自交亲和系青花菜的创制方法，其特征在于，所述沉默或下调青花菜基因组中的SP11基因的表达的步骤包括：使青花菜基因组SP11基因的第二个外显子发生突变；
优选地，所述使青花菜基因组SP11基因的第二个外显子发生突变的步骤包括：利用基因编辑技术对青花菜基因组中的SP11基因的第二个外显子进行编辑。
3.根据权利要求2所述的自交亲和系青花菜的创制方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、锌指酶系统和RNA干扰技术中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的自交亲和系青花菜的创制方法，其特征在于，当利用CRISPR/Cas9系统对SP11基因的第二个外显子进行编辑时，sgRNA的靶位点序列如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的自交亲和系青花菜的创制方法，其特征在于，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥2；
优选地，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥4.84；
优选地，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥5.48；
优选地，所述自交亲和系青花菜是指花期自交亲和指数≥6.82。
6.如权利要求1～5任一项所述的创制方法在培育转基因青花菜中的应用。
7.沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失的试剂在培育自交亲和系青花菜中的应用；
优选地，所述自交亲和系青花菜的花期自交亲和指数≥4.84；
优选地，所述自交亲和系青花菜的花期自交亲和指数≥5.48；
优选地，所述自交亲和系青花菜的花期自交亲和指数≥6.82。
8.沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失的试剂在培育转基因青花菜中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失是指通过CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、锌指酶系统和RNA干扰技术中的至少一种实现；
优选地，所述沉默或下调SP11基因表达水平和/或使SP11基因功能缺失是指通过CRISPR/Cas9系统实现。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂包括sgRNA表达框、含所述sgRNA表达框的表达载体和含所述表达载体的宿主菌中的至少一种；
优选地，设计所述sgRNA表达框的靶位点序列如SEQ ID No.2所示。
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