KR101317730B1

KR101317730B1 - 근접 후향 육종 방법

Info

Publication number: KR101317730B1
Application number: KR1020077022587A
Authority: KR
Inventors: 던 코르넬리스 마리아 페트뤼스 반; 로베르트 헬레너 히슬라인 디르크스
Original assignee: 리즈크 즈완 자드틸트 엔 자드한델 비.브이.
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2013-10-15
Also published as: US20130298272A1; IL185523A; KR20070120121A; IL185523A0; CN104782475A; ES2422215T3; JP2013128484A; WO2006094773A2; EP1853710A2; US9326463B2; JP5238264B2; AU2006222150A1; EP2301326A1; EP1853710B9; NZ560960A; MX2007010566A; HK1208777A1; EP1853710B1; WO2006094773A3; CA2599796A1

Abstract

본 발명은 이형접합형의 비인간계 유기체로부터 동형접합형의 비인간계 유기체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 동형접합형의 유기체는 교배를 통해 잡종을 수득할 수 있으며, 상기 방법은 이형접합형의 출발 유기체를 제공하는 단계; 상기 유기체가에서 2차 분열 복원으로부터 기원되는 SDR-0 세포를 제조하는 단계; 상기 SDR-0 세포로부터 SDR-0 유기체를 재생하는 단계; 및 수득되는 SDR-0 유기체로부터 동형접합형 유기체를 제조하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조되는 제1 동형접합형 유기체를 제2 동형접합형 유기체와 교배시키는 단계를 포함하는 잡종의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득가능한 동형접합형의 비-인간계 유기체 및 비-인간계 잡종 유기체를 제공한다.

Description

근접 후향 육종 방법{NEAR REVERSE BREEDING}

본 발명은 이형접합형의 비-인간계 유기체로부터 동형접합형의 비-인간계 유기체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 동형접합형의 유기체를 교차하여 잡종(hybrid)을 수득할 수 있다. 본 발명은 특히 식물에 관한 것이다.

식물 육종은 전세계적으로 식량으로 사용되는 재배 종을 공급하는데 있어 인류의 가장 중요한 기본 과제중 하나이다. 식물 육종은 오래된 결과이며, 본래 국소 특정 지역에서 우수한 식물을 선별 및 증식시키는 것을 기반으로 한다.

당대 식물 육종은 유전학에 대한 지식에 매우 의존적이며, 복배수체(doubled haploids, DH)(Haploids in Crop Improvement II eds; Palmer C, Keller W, and Kasha K (2005) in: Biotechnology in Agriculture and Forestry 56 Eds; Nagata T, Lorz H, and Widholm J. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, ISBN 3-500-22224-3) 및 분자 마커(De Vienne ed. (2003) Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechnology. Science publishers Inc. Enfield, NH USA. ISBN 1-57808-239-0)와 같은 방법에 의해 기술적으로 뒷받침된다.

유성 생식의 유전적 메카니즘은, 환경 변화에 종의 생존 기회를 증강시키는 유전자 다양성을 증가시키도록 진화되어왔다. 염색체 조합(chromosome assortment) 및 교배 시스템(mating system)과는 독립적인 감수분열에의한 재조합(Meiotic recombination)은, 이러한 점에서 주된 기여 인자이다. 그러나, 식물 육종에서는, 이러한 메카니즘은, 유전적으로 이형접합성 식물이 농경 또는 원예학적으로 매우 가치가 있는 것으로 판명된 경우에, 특히 비생산적으로 작용할 수 있다. 유전적 인자의 재분배(redistribution)는 결과적으로 상업적으로 바람직한 형질이 소실됨으로써, 유전학적으로 동일하지 않은, 즉 이종의 식물 발생을 초래한다.

이에 대처하기 위하여, 다수의 기술들이 식물 육종자(breeder)에게 이용될 수 있다. 한가지 방법은, 증식(mutiplication)은 오직 유사 분열을 통해서만 이루어지므로, 이들의 유전적 구성의 완전한 보존을 유도하도록 식물을 세포적으로(vegetatively) 증식시키는 방법이다. 많은 식물 종들의 경우, 인 비보(in vivo)로 삽목(cutting)을 제조하는 것과 유사한 다른 방법들도 적용가능하지만, 식물의 체세포적인 증식에는 시험관내 조직 배양이 사용되고 있다.

체세포적인 증식을 종자로부터 증식시키는 것과 비교하였을때의 단점은, 노동 집약적이며 따라서 비용이 많이 든다는 점이다. 또한, 이러한 방법은 로지스틱 문제로 장기간 식물을 저장하기 어려우며, 바이러스와 같은 병원체에 의한 식물 감염 위험성이 식물을 종자를 통해 증식시키는 경우에 비해 현저하게 높다.

대안적으로, 체세포적인 증식을 일반적으로 단성 생식(apomixis)이라고 하는 무성 종자의 형성을 통해 달성할 수 있다. 많은 종들에서 자연적으로 이루어지는 단성 생식은 유전자 조작에 의해 유성 증식성 식물 종에서도 유도할 수 있다. 그 러나, 현재에는, 단성 생식의 여러 단계, 즉, 비감수분열 (apomeiosis), 단위 생식(parthenogenesis) 및 자가 배유 발생(autonomous endosperm development)에 관여하는 유전자들은 아직 동정되지 않았으며, 이들은 복잡한 양상으로 상호작용할 수 있다. 그러므로, 식물 육종에서 단성 생식의 가능성이 이미 오랜 시간동안 폭넓게 인지되었음에도 불구하고, 개념 입증은 아직 이루어지지 않은 상태이다.

다른 방법으로서, WO 03017753에 개시된 후향 육종(reverse breeding) 기술을 이용할 수 있다. 후향 육종은 유전자 조작을 통한 감수분열의 재조합 억제와, 이후의 비-재조합된 모체 염색체를 포함하는 포자로부터 파생된 복배수체(DH) 식물의 생산을 근간으로 한다. DH들은 감수분열 동안에 발생되는 모체 염색체의 독립적인 조합(independent parental chromosome assortment)의 결과로서 오직 이들의 유전자 구성 측면에서만 상이하다. 따라서, 초기 출발 식물의 유전자 구성을 재구축하기 위하여, DH 또는 이로부터 계통 중 어느 것을 교차를 통해 조합시켜야 하는지를 결정하는데, 염색체 당 하나의 공통-우성의 다형성 마커를 사용하는 것으로도 충분하다. 이로서, 후향 육종 기술은 그것의 유전자 구성이 알려져 있지 않더라도 종자를 통하여 생식력이 있는 선택된 임의 식물의 유전자 보존을 가능하게 한다.

그러나, 이 기술의 문제점은 감수분열 재조합의 완전한 억제가 키아스마(chiasma)의 부재를 초래하고, 따라서 생식체(gamete)의 이수성(aneuploidy)을 유도할 수 있는 감수분열I 중에 부적절한 염색체 분리(chromosome segregation)를 초래함으로써, 생존성을 감소시킨다는 것이다. 감수분열I 중에 키아스마가 형성되지 않는 경우, 모든 염색체의 양 극(pole) 중 어느 하나로 이동할 독립적인 기회는 50%이다. 이는, 완전한 염색체 상보체를 가진 포자를 만들 이론적인 기회가 (½)^x 임을 의미하며, 여기서 x는 단배체 염색체의 수이다. 따라서, 균형 생식체(balanced gamete)의 빈도는 단배체 염색체의 수 증가에 따라 감소한다.

많은 농작물 종들은 비교적 염색제 수가 적지만(예, 오이는 단배체 게놈당 7개의 염색체를 가지고, 시금치는 단지 6개임), 단배체 게놈 당 12개의 염색체를 가지는 가장 큰 야채 농작물들 중 하나인 토마토처럼 비교적 염색체 수가 높은 상업적으로 중요한 종들도 있다. 이러한 기술적인 제약은 후향 육종 기법의 유효성을 매우 감소시킨다. 따라서, 유성 후대(sexual offspring)에서의 유전자 구성을 보존할 수 있는 대안적인 방법이 당업계에 요구되고 있다.

따라서, 본 발명은 모체 유기체, 특히 모체 식물의 유전자 구성을 보존하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 이르게된 연구에서, 예컨대 이른바 "SDR-0 세포"라고 하는 2차 분열 복원(second division restitution, SDR) 결과로서 수득될 수 있는 비감수분열 포자(unreduced spore)로부터 재생시킨 식물을 이용함으로써, 이러한 방법을 제공할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 또한, 이러한 방법은 진균 또는 어류와 같은 식물 이외의 인간을 제외한 다른 유기체에서도 수행될 수 있으며, 다른 생식 세포, 예컨대 생식체에 대해서도 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명은 이형접합형의 비인간계 유기체로부터 동형접합형의 비인간계 유기체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 동형접합형의 유기체를 교배를 통해 잡종을 수득할 수 있으며, 상기 방법은 a) 이형접합형의 출발 유기체를 제공하는 단계; b) 상기 유기체로부터 2차 분열 복원에 의해 발생되는 SDR-0 세포를 제조하는 단계; c) 상기 SDR-0 세포로부터 SDR-0 유기체를 재생하는 단계; 및 d) 수득되는 SDR-0 유기체로부터 동형접합형 유기체를 제조하는 단계를 포함한다. 이 방법은 본원에서 "근접 후향 육종(Near Reverse Breeding)"이라고 한다.

비감수분열 포자는 제2 감수분열이 생략된 결과로서 선호적으로 형성된다. 이러한 자연 현상은 이차 분열 복원 또는 SDR이라고 한다. SDR은 식물에서 정기적인 감수분열 발생을 수반하여 유성 생식하는 동안에 발생할 수 있다. 본 발명의 근접 후향 육종 기법은 재생 단계 동안에 자연적인 또는 조작된 SDR을 통해 생산되는 비감수분열 포자를 특이적으로 선별함으로써 SDR 현상을 조사한다. 제조되는 식물, 즉 SDR-0 식물은 대개 동형접합체이며, 바람직한 예에서는 DH 생산에 사용된다. 그러나, SDR-0 식물에서의 동형접합율(homozygocity) 수준은 또한 근친 교배 단계나 또는 제2 SDR 발생 또는 이들의 조합을 통해 증가시킬 수 있다.

출발 식물의 모계 및 부계 게놈 간에 다형인 분자 마커를 사용하여 SDR-0 식물과 이로부터 파생된 DH를 동정할 수 있으며, 이들은 그 유전자 구성 측면에서 본질적으로 상보적이며, 교배시에 최초 출발 식물의 유전자 구성(make up)과 거의 완벽한 재구축이 발생된다.

재구축은 SDR-0 현상 발생 및 이로부터 파생된 DH가 형성되는 동안에 감수분열 재조합의 결과로서 "거의 완성된다". 재구축된 잡종은 서로 간 그리고 최초 출발 잡종 식물과 어느 정도 유전적으로 상이할 것이다. 그러나, 이러한 차이는 DH가 정기적인 감수분열 현상으로부터 직접적으로 파생되는 경우에 비해 매우 작아진다. 더욱이, DH는 추가적으로 선별할 필요가 없다는 의미에서 유전적으로 고정되어 있다.

이러한 과정에 SDR 현상을 통합하는 경우의 이점은, 유전자 상보성에 대한 선별은 2단계 과정으로 발생된다는 것이다. 제1 단계는, 염색체의 중앙부, 즉 센트로미어를 포함한 부위에 집중된다. 제2 단계는 염색체의 말단 끝, 즉 재조합으로인해 교체되는 부위쪽으로 향해진다. 이러한 지연성 유전자 고정(delayed genetic fixation)은 복잡성을 감소시키고, 분자 마커가 선별에 유용할 경우에 특히 상보적인 유전자형을 찾을 기회를 크게 증가시킨다.

이러한 방법의 다른 이점은, SDR이 유성 생식 동안에 발생되며 유성 생식 과정을 간섭할 다른 필요가 없는 것으로서 조사될 수 있는 자연적인 현상이라는 것이다.

도 1 및 2는 정상적인 감수분열 현상(이후, DH 형성됨) 및 SDR 현상간의 차이를 도식적으로 설명한 것이다. 이들 도에는, 4쌍의 염색체가 도시되어 있으며, 상동체는 각각 연한, 어두운 막대형 구조로 나타내고, 막대의 검은 원은 센트로미어를 표시한다. 도면은 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것이다. 실제 참여 염색체 쌍의 수는 참여 종에 따라 달라진다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 교차점은 이들의 수/염색체 및 염색체상에서의 위치에 따라 가변적이다.

도 1은 정상적인 감수분열 및 제1 및 제2 감수분열 모두가 이루어진 후 염색체의 (자발적으로 또는 유도될 수 있는) 배가를 나타낸 것이다. 이러한 경우에, 교차로 1쌍 당 2개의 모체 염색체 및 2개의 재조합 염색체가 발생된다. 또한, 각 쌍의 2개의 동종 염색체의 독립적인 조합으로 인해, 매우 유전학적으로 상이한 포자/생식체가 형성될 수 있음이 명백하다.

도 1에, 이러한 과정의 단지 3가지 산물만 임의적으로 나타내었다. 이러한 포자로부터 식물을 재생시킨 후, DH를 수득할 수 있다. DH의 제조는 당대의 식물 육종에 가장 중요한 것이며, 대부분의 농작물에 대한 확립된 기법으로서 적용된다. 이배체 포자로부터 재생되는 식물은, 정상적인 감수분열 발생으로부터 유래되는 자발적인 또는 유도성 이배체화된 포자의 제1 재생물로서, 이후 DH-0, 즉 복배수체로 명명된다. 용어 "SDR-0"는 제2 감수분열이 결핍된 세포나 포자의 제1 재생물에 사용된다. 자가 수분한 DH-0 식물은 유전자가 100% 동일하며, 모든 대립 유전자가 완전하게 고정된 후대 식물(DH-1)을 산출할 것이다. 그래서, DH-0 식물에서 형성된 포자(생식체)가 다시 감수분열과 재조합을 겪더라도, 유전자 재정렬은 이루어질 수 없다. 즉, 이는 조합이 발생할 수 없다는 사실로 인해 이른바 "순계(pure line)"가 고정됨을 의미한다. 이러한 식물주는 그러나 저온 또는 고온, 또는 여러가지 기후대와 같은 여러가지 환경에서 생장할때 표현형상 상이한 외양을 보일 수 있다. 관찰될 수 있는 차이점은 그러나, 계통의 모든 "일원"에 대해 유효하며, 즉 "계통내" 차이는 없을 것이다. 그러나, 상이한 순계(DH-1)들간의 차이, "계통간" 차이가 있을 수 있다.

도 2는 SDR 현상을 나타낸 것이다. 감수분열이 완료된 후 자발적인 또는 유도된 염색체 배가가 발생되는 도 1과는 반대로, 이배체 포자의 발생은 제2 감수분열의 부재에 의해 초래된다.

DH와 이수체 SDR 식물간의 근본적인 차이점은, 이형접합성 세그먼트가 SDR 식물의 여러 염색체에 존재하지만, DH는 완전히 동형접합체라는 사실에 의해 설명된다. 또한, SDR 식물에서 모든 염색체 쌍은 그것의 센트로미어 부위에 있어서 동형접합체이라는 것을 유념하여야 한다. 만약 존재한다면 이형접합체는 말단 염색체 끝에 존재한다. 이는, 제1 감수분열이 없고 모든 염색체 쌍에서 센트로미어 부위에 이형접합체를 초래하는, 제1 분열 복원 또는 FDR이라고 하는 비정상적인 다른 감수분열과는 반대된다.

도 2에 나타낸 이론적인 경우에서, DH 및 SDR 각각을 생성하기 위해 사용되는 출발 식물(공여체 식물)은 완전하게 이형접합체인 동종 염색체를 포함한다. 이는 이들 염색체에 있는 유전자의 모든 대립 유전자가 다형성임을 시사한다. 그러나, 실제 이는 매우 가능성이 없으며, 따라서 이 경우는 이형접합체 상태의 매우 극단적인 예이다.

도 2로부터, SDR 발생에서 각 염색체 쌍의 교차점은 동형접합체 유전자 자리와 이형접합체 유전자 자리 간의 비를 결정하는 것이 분명하다. 평균적으로 보다 텔로미어 쪽으로 교차 위치가 위치된 SDR-현상에서 이러한 비가 증가하지만, 평균적으로 교차 위치가 보다 센트로미어 쪽으로 위치한 경우에는 감소한다. 충분한 분자 마커의 이용으로, 이러한 교차점은 각 SDR에서 쉽게 결정할 수 있다.

각 염색체 팔에 있어서의 교차 정도는 센트로미어의 위치에 의해 제한된다. 또한, 잔류 이형접합율이 비교적 낮은 경우에, SDR 현상은 이형접합체 형태에서의 RIL's 및 BIL's의 발생과 비슷함을 유념하여야 한다.

SDR은 생식체 비감수분열 포자/생식체의 형성을 이끄는 보다 폭넓은 현상의 한 형태일 뿐이며(Veilleux, Plant Breeding Reviews 3, 253-288 (1985)), 상기 문헌에는 비감수분열 생식체의 형성 메카니즘이 개시되어 있으며 농작물 식물에서 출현하는 비감수분열 생식체 리스트가 기재되어 있다. 그 시기에 비감수분열 생식체의 주된 상이한 2가지 클래스는 SDR 및 FDR로 인지되었다. 최근, 비감수분열 생식체의 세번째 클래스가 불확정 감수분열 복원(Indeterminate Meiotic Restitution) 또는 IMR로 공개되었다(Lim et al. (2001) Theor. Appl. Genet. 103:219-230).

본 발명은, SDR만 해당된다. SDR은 전술한 Veilleux에 나타낸 리스트 및 그외 다른 연구(Lim K et al. (2004) Breeding Science 54: 13-18)에 의해 입증된 바와 같이 광의의 농작물에서 자연적으로 발생한다. 흥미롭게도, 페퍼(pepper)에서 SDR 2n 생식체(꽃가루)의 빈도가 식물의 11 ℃에 48시간 노출에 의해 1% 미만에서 최대10.5 %(평균) 증가함을 발견하였다(Zhang X et al. (2002) Journal of HorticulturalScience & Biotechnology 78: (1) 84-88). SDR의 최대 발생 빈도는 81.3%로 측정되었다. 따라서, 외부 자극에 의해 SDR 발생 수를 증가시키는 것이 가능하다.

2n 포자 또는 생식체의 발생은 웅성 배우체(gametophyte)에 제한되지 않지만, 또한 자성 배우체의 수준에서 발생한다는 증거가 있다. 예컨대, Zagorcheva L(Genetics and Plant Breeding 9(5), 386-399 (1976))은 오이에서 마크로포자(macrosporo)- 및 마크로생식체형성(macrogametogenesis)의 이탈이 발생됨을 보고하였다.

근접 후향 육종은 이형접합형 출발 식물의 유전자 구성을 대규모로 재구성하기 위하여 SDR의 결과인 비감수분열 포자의 발생을 이용한다. 기본적으로, 최초 잡종 식물을 재구성하기 위하여, 각 염색체의 센트로미어 부위에 상보적인 SDR-0 식물 선별을 시작한다. 이는, 다형성 분자 마커를 이용하여 각 염색체에 대한 센트로미어 부위의 유전자형을 결정함으로써, 성취할 수 있다. SDR-0 재생물은 각 염색체에 대한 센트로미어 부위에서 동형접합체이므로, 완전히(또는 부분적으로) 상보적인 식물은 이러한 방식으로 쉽게 동정할 수 있다. (센트로미어 상보성을 토대로, 임의의 잔류 이형접합율을 고려하지 않고) 상보성 SDR-0 식물을 찾을 확률은, 1 무작위 SDR-0 식물이 선택되는 경우에, (1/2)^x이며, 여기서 x는 염색체의 수이다.

최초 모체 계통이 재구성된 경우에, 하나의 모체를 찾을 확률은 (1/2)^x-1이며, 다른 모체에 대한 확률은 (1/2)^x이다. 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 "근 모체(near parental)" 식물주는 또한 양쪽 모체에 유전자 이입(introgression) 세그먼트가 형성되는 역-교배 근친 교배주(BIL's)인 것으로 간주될 수 있다. 이들 상보적인 식물은 최초 잡종 식물의 유전자형을 재구성하기 위해 이후에 교배할 수 있다.

그러나, 감수분열 재조합으로 인해, SDR-0 식물의 염색체 팔의 원위부는 이형접합체일 것이므로(염색체 팔 당 교차 1개인 경우), 분리는 임의 수준의 무-정형성을 이끌 수 있는 재구성된 잡종에서 이루어질 것이다. 재조합이 비교적 멀리 떨어진 염색체 위치에서 발생되어 따라서 유전자 함유가 낮거나, 또는 대립 유전자의 차이가 유전자형 차이에 크게 기여하지 않아, 상보적인 SDR-0의 원위부에 위치되어 있는 유전자 정보가 유전자형 차이에 현저하게 기여하지 않는다면, 재구성된 잡종은 비교적 일정할 것이다.

본 발명의 바람직한 예에서, SDR-0는 염색체의 최말단 텔로미어 부위에서만 주로 감수분열 재조합이 발생되는 경우에, 이루어진다. 이러한 현상에서, 염색체는 유전자 재조합이 아닌 물리적으로 재조합된다.

유전적으로 완전하게 동종인 재구성된 잡종 식물을 수득하기 위해, DH를 상보적인 SDR-0 각각으로부터 제조한다. 도 3에 도식적으로 설명된 원리는, 도 2에서 SDR-0으로부터 재생되는 식물에서 발생될 포자/생식체의 형성을 묘사한다.

형성된 포자는 재생될 수 있으며, 염색체 배가시에 DH가 제조될 수 있다. 분자 마커를 이용함으로써, 모체 계통중 어느 하나와 유전자가 매우 유사한 DH를 선별할 수 있다. 이는 배가된 염색체 세트로 도 4에 설명되어 있다.

분리로 인해, 이들 복배수체 식물의 염색체 원위부 말단은 각 모체의 유전자 정보를 평균적으로 50% 포함할 것이다. 상보적인 SDR-0로부터 파생된 무작위로 선택한 복배수체 식물 2종을 교배를 통해 조합하는 경우, 원위부 팔 부위의 이형접합성은 100%일 것이지만, 재구성된 잡종 식물에서의 원위부 팔 부위 이형접합성은 50%일 것이다. SDR-0는 평균적으로 동형접합성이 60%일 것으로 추측됨으로(Carputo, D. et al. (2003) Genetics 163, 287-294), 상보적인 현상을 이용한 재구성은 평균적으로 이형접합율 80%(100% x 60% + 50% x 40%) 및 동형접합율 20%일 것이다. 근위 및 원위 교차점 사이의 동형접합율은 이 부위에 대해 동형접합체인 SDR-0 재생물의 유전자형을 왜곡시킬 것이지만, 원위에서 원위 교차점의 동형접합율은 양쪽 모체 유전자형과 동일할 것이다.

이형접합성 %를 언급한 도면은 극한 값, 즉 염색체상에 포함된 유전자의 모든 대립 유전자가 다형임을 의미하는 100% 이형접합체인 식물로부터 개시됨을 의미함을, 당업자에게 명확해진다. 실제, 이는 거의 가능성이 없으며, 따라서 이형접합율은 평균적으로 보다 낮을 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 생산된 제1 동형접합체 유기체를 제2 동형접합제 유기체와 교배하는 단계를 포함하는, 잡종 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 최초 잡종의 유전자 구성을 재구성 가능하지만, 또한 최초 잡종의 유전자 구성과 비슷한 변이체를 수득할 수 있다.

첫번째 예로, 제2 동형접합체 유기체는 제1 동형접합체 유기체와 적어도 부분적으로 상보적이어서, 제조되는 잡종은 이형접합형의 출발 유기체와 비슷하다. 적절하게는, 이형접합형 출발 유기체의 유사물로는 출발 유기체의 적어도 50%의 이형접합성을 갖는 잡종을 포함한다. 바람직하기로는 이형접합성 유사성은 50 내지 100%의 임의 %이며, 보다 구체적으로는 이형접합성의 유사성은 50% 내지 60%, 바람직하기로는 60% 내지 70%, 더 바람직하기로는 70% 내지 80%, 더더 바람직하기로는 80% 내지 90%, 그리고 가장 바람직하기로는 90% 내지 100%의 임의%이다. 표현 "임의 %"는 구체적인 %가 명확하게 언급되어 있지 않더라도 명시된 범위내 각각 및 모든 %를 포괄하는 것으로 의도된다.

대안적으로, 제2 동형접합형 유기체는 제조되는 잡종이 최초 이형접합형 출발 유기체보다 우수하도록 선별된다. "최초 이형접합형 출발 유기체"는 청구항 1의 a) 단계에 사용되는 유기체이다.

재구성된 잡종 식물에서의 상대적인 동형접합성 수준 차이 및 그것의 모체 기원 차이는, 각 모체의 각 염색체 팔내에서 교차점에 의존적이다. 분자 마커를 이용함으로써, 혼성화될때 상대적으로 동형접합체 수준이 낮은 F1 잡종이 형성되도록, SDR-0 둘다와 그로부터 파생되는 DH를 선별할 수 있다.

이러한 예에서, SDR-0에서, 평균적으로 보다 말단의 교차를 갖는 것을 선택하여야 하며, DH의 경우에는 가장 상보적인 것을 선택하여야 한다.

그러나, 한편으로는, 근위 및 원위 교차점 사이에 비교적 먼 거리를 갖는 경우를 선택하여, 양쪽 모체로 치우칠 수 있는 F1 잡종에 동형접합체를 도입하는 것이 적합할 수 있다.

전술한 바로부터, 근접 후향 육종은 식물 육종자을 넓은 범위로 잡종 식물을 재구성하는 것을 실현할 수 있으며, 동형접합형인 대립 유전자의 상이한 수준 및 기원으로 인한 현저한 차이는 최초(출발) 잡종 식물의 성능 향상을 초래할 수 있는 F1 실험 잡종들 사이에서 수득할 수 있다는 것이 분명해진다.

또한, 해당 염색체 서브세트에만 상보적인 잡종을 생산하는 것도 가능하다. 이는, 이들의 센트로미어 유전자형의 토대로 원하는 염색체 쌍에 대해 상보적이며 다른 것과 동일한 SDR-0를 선택함으로써, 수행할 수 있다. 이른바 근사-치환(near-substitution) 계통으로부터 제조된 이러한 잡종은 대게 상보적인 염색체 쌍에 비해 염색체의 원위부에 유사한 이형접합성을 갖는 비-상보적인 염색체 쌍에 대해 동형접합체일 것이다. 이의 가장 극단적인 형태로, 완전히 비-상보적인 복배수체를 교배하여, 염색체의 원위부에 제한된 이형접합성을 갖는 잡종 식물을 도출할 수 있다.

근접 후향 육종 기술에 SDR을 이용하기 위하여, 자발적인 발생의 SDR을 이용할 수 있으며, 또는 예컨대 유전자 조작을 통해 SDR를 유도할 수 있다.

본 발명의 다른 예는 역교배에 관한 것이다. 역교배는 당업계에 잘 알려져있는 식물 육종으로, 특정한 형질을 원하는 유전자 구성(이른바 유전적 백그라운드)을 갖는 식물주에 이입되는 과정이다. 이러한 과정의 원하는 결과는, 출발 식물주와 유전적으로 거의 동일한 식물주이지만, 원하는 형질이 내재된 유전자 인자는 재조합을 통해 추가된다. 이러한 목적을 성취하기 위하여, 원하는 유전적 백그라운드 및 원하는 형질을 갖는 식물을 교배시키고, 상기 형질 뿐만 아니라 가능한 많은 유전적 백그라운드를 갖는 식물을 후대로 선택한다. 각 역교배 주기에 따라, 원하는 유전적 백그라운드의 증대는 평균적으로 반씩 나누어지므로, 실제 역교배 과정을 완료하는데 4 내지 5회의 육종 사이클이 소요된다.

근접 후향 육종은 동형접합성에 이르기 위한 과정은 단지 2 단계로 이루어지므로써 역교배의 가속화를 허용한다. 첫번째 단계는 전통적인 역교배 과정, 즉 원하는 유전적 백그라운드 및 원하는 형질을 가지는 식물의 교배이다. 제조되는 잡종을 사용하여, 표현형이나 보조 마커를 기본으로 할 수 있는 원하는 형질과 유전적 백그라운드에 특이적인 센트로미어 마커를 근간으로한 원하는 유전적 백그라운드로, 선택되는 SDR를 제조한다.

두번째 단계는, 분자 마커를 이용하여 최대량의 유전적 백그라운드에 대해 선택된 DH의 제조를 포함한다. 근접 후향 육종은 동형접합을 실현시키기 위한 상기 과정을 고정하며, 2가지 선별 단계를 허용한다. 충분한 유전자 마커가 이용가능한 경우, 원하는 역교배 산물은 시간이 걸리는 육종 사이클의 수가 현저하게 감소될 수 있으므로, 전통적인 과정에 비해 보다 더 효율적으로 많이 수득할 수 있다.

본 발명의 근접 후향 육종 방법으로, CMS를 매우 유효한 방식으로 원하는 백그라운드에 이입할 수 있다. CMS 전이에 근접 후향 육종을 적용하기 위하여, CMS 공여체 계통은 CMS와 변형 능력이 있는 공여체의 염색체간의 차이점을 보다 용이하게 결정할 수 있도록, 다수의 핵 유전자 마커에 있어서 웅성 불임성으로 변환되어야 하는 계통과 유전자가 유사하지 않는 것이 바람직하다.

순계 또는 원하는 근교계(inbred line)(동형접합성 또는 거의 동형접합성)를 유사하고 CMS 백그라운드를 갖는 계통으로 변환시키기 위하여, 1차 교배는 상기 CMS와 원하는 계통의 꽃가루와의 수분에 의해 이루어진다. 제조되는 F1 후대는 CMS와 원하는 계통의 염색체 50%를 포함한다. F1 후대 식물은 아산화질소와 같은 화합물이나 저온과 같은 스트레스 조건 처리 중 어느 한가지에 의해 자성 생식(gynogenesis) 중에 SDR-감수분열을 수행하도록 유도된다. 또한, SDR은 자성 생식중에 자발적으로 발생할 수 있다.

동정 생식(androgenesis)이 적용된 경우에, 웅성 불임성 유도 세포질의 영향을 억제할 수 있는 수복 유전자(restorer gene) 제조에 사용된다.

제조되는 SDR-O 식물은 F1 잡종의 센트로미어 부위가 다형인 DNA 마커를 이용하여 유전자를 분석한다. CMS로 변환되어야 하는 계통의 센트로미어 부위만을 포함하는, SDR-0 식물을 선택한다. 게놈을 포괄하는 다수의 식별 마커를 이용가능한 경우, 평균적으로 염색체상에 가장 근접한 교차 위치를 가지는 SDR-0을 선택할 수 있다. 이는 대개 단일 단계로 선별된 계통을 CMS로 변환시킨다. 필요에 따라, 이러한 역교배 사이클은 반복될 수 있다.

자발적인 SDR 출현은 열 또는 냉 충격과 같은 특이적인 비생물적인 스트레스 조건에 의해 강화될 수 있다. 이러한 스트레스 조건은 비환원, 이배체 포자의 형성을 증강시키는 것으로 알려져 있다(Zhang X et al., (2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78: (1) 84-88). 또한, 아산화질소(N₂O) 가수를 가함으로써, 2n 꽃가루 형성을 유도하는 것이 가능하다(Okazaki, K. et al. (2005) Euphytica, 143, 101-114).

이배체 포자가 웅성 감수분열을 통해 제조되었을때, 유세포기 및 형광 활성화된 세포 분류를 통해 이들 세포를 농화할 수 있다. 이러한 기술들은 그 자체가 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 식물의 미소포자에 적용된다(Deslauriers C et al., (1991) Flow cytometric characterisation and sorting of cultured Brassica napus microspores. Biochem. Biophys. Acta: 1091, 165-172).

또한, 이배체 포자 또는 꽃가루가 그들의 단배체 동등체(peer) 보다 크기가 더 큰 것으로 알려져 있다(Lernmi G and Negri V. (1994) Research on 2n pollen production in Lotus tenuis an I.M. G.V. of Perugia University. Lotus newsletter VoI; 25, pp 24-27). 놀랍게도, 이배체 포자가 단배체 포자와 물리적으로 상이하다는 단순한 사실은, 유세포기 및 형광 활성화된 세포 분류를 통해 이배체 포자를 특히 농화가능하게 한다.

더욱이, 이배체 포자의 형성을 유도하는 환경적인 조건의 최적화는 여러가지 분류 기술을 이용하여 쉽게 실행할 수 있다.

비감수분열 포자의 재생은 감수분열 포자의 재생과 유사한 방식으로 가시 수분(prickle pollination)에 의한 동정 생식, 자성 생식 또는 단성 생식을 통해 형성할 수 있다. 가시 수분에 의한 단성 생식이 적용되는 경우에, 이배체 꽃가루, 특히 내배유(endosperm)에서 부계 대 모계 게놈의 비 변형에 허용성이 낮은 종에 대해 이배체 꽃가루를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 모두는 아니지만 대부분의 농작물에서의, 이러한 재생 프로토콜이 문헌에 개시되어 있으며, 당업자에게 공지되어 있다.

이배체 포자로부터 식물을 재생한 후, 분자 마커를 이용하여 염색체 쌍의 센트로미어 부위가 각각 SDR 또는 FDR 현상을 보이는 동형접합체 또는 이형접합체인지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 방식으로, SDR을 쉽게 선별할 수 있다.

감수분열의 제2 세포 분열에 참여하는 유전자 기능의 간섭할 수 있는 여러가지 유전자 접근 방법이 당업자들에게 알려져 있다. 이러한 간섭은 돌연변이 발생 또는 형질전환을 통해 이루어질 수 있다. 형질전환 방법은 SDR 타입의 이배체 포자를 유도하는 감수분열의 제2 분열을 변형하는 DNA 단편을 안정적으로 또는 일시적으로 도입하는 것을 목표로한다. 이러한 변형은 감수분열 프로세스에 관여하는 유전적 인자, 특히 제2 세포 분열에 관여하는 인자와의 간섭을 통해 발생할 수 있다. 간섭은 전사 후 유전자 침묵(PTGS)로 인해 유전자 발현의 특이적인 하향 조절을 통해 확립될 수 있다. PTGS는 RNA-간섭(RNAi) 또는 바이러스-유도성 유전자 침묵(VIGS)를 통해 달성될 수 있다.

다른 방법으로, 간섭은 SDR을 유도하는 감수분열의 제2 분열에 우세적으로 부정적인 효과를 보이는 단백질의 과다 발현을 통해 확립될 수 있다.

실시되는 방법과는 상관없이, 타겟 유전자는 분자 수준에서 알아야 한다. 열성 돌연변이 다수가 SDR 형의 감수분열을 형성하는 감자(pcpc, osos, fcfc)에서 확인되었다(Carputo, D. et al (2003) Genetics 163, 287-294). 또한, 옥수수에서, elongate1 돌연변이는 감수분열II의 생략을 도출한다(Barell, PJ and Grossniklaus, U. (2005) Plant J. 43, 309-320).

이들 구체적인 예에서 돌연변이된 유전자는 아직 분자 수준으로는 동정되지는 않았지만, 당업자는 그렇게 할 수 있을 것이며, 따라서 이들 및 아직 미확인된 다른 유전자는 분자 억제 기술을 이용하여 타겟 종에서 SDR을 이루기 위한 우수한 후보물질이다. 본 발명은 근접 후향 육종의 일반적인 원칙에 관한 것이며, 출발 유기체에 SDR을 유도하는 모든 가능한 구현예가 언급된 것은 아니라는 사실은 본 발명과 관련이 없다.

전술한 유전자에 대한 대안책은 아라비돕시스 탈리아나에서 개시되어 있으며 돌연변이시에 비정상적인 형태의 감수분열을 도출하는, DUET와 같은 유전자에서 확인할 수 있다(Venkata Reddy et al. (2003) Development 130, 5975-5987) and CYCl; 2 (Wang et al. (2004) Plant Physiology 136, 4127-4135).

이들 돌연변이에서 이배체 감수분열 산물은 SDR형이며, 따라서 DUET 및 CYC1; 2 뿐만 아니라 다른 식물 종에서의 이들의 기능적인 동종체는 감수분열의 SDR 타입을 수득하기 위한 타겟 유전자 후보이다.

또다른 후보 타겟 유전자는 낫 아웃시 감수분열 이후의 세포 분열이 생략되는 TETRASPORE/STUD(Yang et al (2003) Plant J. 34, 229-240)이다. tetraspore/stud 돌연변이 미세포자의 이배체 재생은 SDR형일 수 있다.

SDR-O 식물이 수득되면, 이들을 분자적으로 추가적으로 특정화할 수 있다. 먼저, SDR-0 식물들간에 동종적인 염색체의 상보 수준에 대한 식견을 부여하는 센트로미어 부위의 일배체형(haplotype)을 결정할 수 있다. 적용에 따라, 완전하게 또는 부분적으로 상보적인 SDR-0 식물을 선택할 수 있다. SDR-0 식물은 보다 빽빽한 일배체형 맵을 제조하기 위해 이후에 사용될 수 있다. 이는 당업자에게 잘 알려져 있는 분자 타이핑 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 예로는, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism(Beckmann, J. S. and Soller, M (1983) Theor. and Appl. Genet. 67, 35-43)), RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA(Welsh, J. and McClelland, M. (1990) Nucleic Acids Res. 19, 961-866)), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism(Vos, P. et al (1995) Nucleic Acids Res. 23, 4407-4414)) 또는 SFP(Single Feature Polymorphism (Borovitz, J. et al (2003) Genome Research 13, 513-523))가 있다. 이러한 기술은 DNA 다형성 특성에 대한 기존 지식없이 사용할 수 있다.

DNA 다형성이 예컨대 SNP로서 특정화되는 경우에, 많은 SNP 검출 기술에 사용할 수 있다(Kwok, P. Y. and Chen, X (2003) Curr. Issues MoI. Biol. 5, 43-60). 일배체형 맵을 사용하여 DH 제조용 식물을 선택할 수 있다. 수득되는 DH는 SDR-0 출발 식물에서 이형접합체인 부위에 일배체형일 수 있다. 이러한 분석으로, F1 잡종에서 이형접합율/동형접합율 비를 조정하기 위해 사용할 수 있는 유전자 정보를 제공하며, F1 잡종 게놈의 동형접합체 부위의 모체 기원 중 어느 하나를 선택할 가능성을 제공한다. 2종의 동형접합체 유기체의 적어도 하나의 상보적인 조합(교배이후에 출발 유기체를 "재합성"할 수 있는 조합)에서 찾을 가능성은, 해당 종의 단배체 염색체 갯수 x 및 SDR이 발생된 이형접합성 출발 유기체로부터 제조된 동형접합성 유기체의 갯수 k의 함수이다.

해당 농작물 종의 단배체 염색체 수를 x로 표시하는 경우, 교차점에 근접한 염색체 부위만을 고려하는 따라서 센트로미어 부위를 포함하는 SDR-0의 최고값은 농작물 종이 2^x인 식물로부터 수득된다. 이 개체로부터 무작위로 선별한 SDR-0 식물 한 쌍 또는 이로부터 파생된 DH 식물은 교배하면, SDR-0(최최 유전자형)을 만드는 유전자형과 거의 동일한 유전자형을 갖는 F1 잡종을 만들 확률은 (2^x - 1)/2^x이다. 총 수가 k인 SDR-0 식물이 제조되는 경우, 교배할 수 있는 유전자가 상이한 2종의 SDR-0 식물이나 이로부터 파생된 DH 식물의 조합 수는 1/2k(k-1)이다. 상보적인, 2종의 SDR-0 식물 또는 이로부터 파생된 DH 식물의 임의 무작위 선별 조합 확률은 ½^x이다. 그러므로, 상보적이지 않은 1종의 SDR-0 식물 또는 이의 DH의 임의 무작위 선별 조합 확률은 1-½^x = (2^x - 1)/2^x이다. k SDR-0 또는 이로부터 파생된 DH의 경우, ½k(k-1) 조합을 제조할 수 있으며, 따라서 이러한 SDR-0-개체 또는 이로부터 파생된 DH에서 상보적이지 않는 식물이 발견된 확률은 ((2^x - 1)/2^x)^(½k(k-1))이며, 2종의 SDR-0 식물 또는 이로부터 파생된 DH의 적어도 한가지 상보적인 조합이 발견될 확률은 1-((2^x - 1)/2^x)^(½k(k-1))이다. 이러한 분석 결과는 하기 표 1에 나타낸다.

표 1: 단배체 염색체 갯수 x 및 이용가능한 무작위적으로 제조된 SDR-0 식물의 수 k의 함수로서, 근접 후향 육종 기술을 이용하여, 2종의 상보적인 SDR-0 또는 이로부터 파생된 DH의 적어도 한가지 조합을 찾을 확률

이러한 분석에서는, 최초 유전자형은 대체적으로 본 발명에 따라 높은 확률로 오이처럼 단배체 염색체 수가 7인 식물종에서 48종의 SDR-0 식물 또는 이로부터 파생된 DH, 콜리플라워처럼 단배체 염색체 수가 9인 식물 종 128, 및 토마토, 멜론 및 피망처럼 단배체 염색체 수가 12인 식물 종 256을 이용하여, F1 잡종으로서 재합성할 수 있음을 보인다. 이들 농작물 종에 있어 근접 후향 육종을 적용하는데 필요한 SDR-0 식물의 수는 비교적 적으며, 따라서 이러한 수의 재생은 특히 산업적인 조건에서 매우 실현가능하다는 것을 나타낸다. 이러한 계산은 단배체 염색체 수를 알고 있는 임의 식물 종에서 이루어질 수 있는 것으로, 당업자에게 자명하다.

"SDR-O 식물 또는 세포"는 본원에서 비감수분열 생식체로부터 발생되는 식물 또는 세포를 일컫는 것으로 의도된다. 이러한 비감수분열 생식체는 SDR(Second Division Restitution)의 결과일 수 있지만, 또한 이배체를 유도하는 비정상적인 형태의 감수분열의 산물일 수 있다.

따라서, 본 발명은 예컨대 유전자형 재구성, 유사 상보적인 모체 계통의 제조, 유사 염색체 교환 계통 제조, 및 동형접합형 및 이형접합형 게놈 세그먼트의 도입에 의한 F1 잡종 최적화를 위하여, 유기체, 특히 SDR 또는 SDR형 비감수분열 생식체로부터 재생된 이들의 후대을 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 하기 및 하기 도면에 언급된 비제한적인 예에서 추가적으로 설명된다:

도 5는 전형적인 F2 오이 식물의 AFLP 패턴을 나타낸다. 각각의 수평선은 하나의 개별 식물을 나타낸다. 모든 수직 컬럼은 연결 그룹(linkage group)을 나타낸다. 연회색 세그먼트는 이형접합체 부위를 나타내며, 검정 및 어두운 부분은 각각의 동형접합체 부위를 나타낸다.

도 6은 전형적인 DH 오이 주의 AFLP 분석을 나타낸다. 각각의 수평선은 하나의 개별 식물을 나타낸다. 모든 수직 컬럼은 연결 그룹(linkage group)을 나타낸다. DH에서 예상되는 바와 같이 검정 및 어두운 부분만 존재하며, 연회식 세그먼트는 없다.

도 7은 전형적인 SDR-O 오이 주의 AFLP 분석을 나타낸다. 각각의 수평선은 하나의 개별 식물을 나타낸다. 모든 수직 컬럼은 연결 그룹(linkage group)을 나타낸다. 연회색 세그먼트는 이형접합체 부위를 나타내며, 검정 및 어두운 부분은 각각의 동형접합체 부위를 나타낸다.

도 8은 저온으로 처리한 페퍼 식물에서 수집한 꽃가루이다. 패널 A는 광 현미경을 통해 관찰한 냉 처리한 식물의 꽃가루이고, 패널 B는 광 현미경을 통해 관찰한 대조군 식물의 꽃가루이다.

도 1은 정상적인 감수분열 및 제1 및 제2 감수분열 모두가 이루어진 후 염색체의 (자발적으로 또는 유도될 수 있는) 배가를 나타낸 것이다.

도 2는 SDR 현상을 나타낸 것이다.

도 3은 도 2의 SDR-0으로부터 재생시킨 식물에서 발생되는 포자/생식체의 형성을 묘사한다.

도 4는 복배수체(좌측) 및 최초 모계 계통(우측)의 배가된 염색체 세트를 나타낸 것이다.

도 5는 전형적인 F2 오이 식물의 AFLP 패턴을 나타낸다.

도 6은 전형적인 DH 오이 주의 AFLP 분석을 나타낸다.

도 7은 전형적인 SDR-O 오이 주의 AFLP 분석을 나타낸다.

도 8은 저온으로 처리한 페퍼 식물에서 수집한 꽃가루이다.

실시예 1

자성 생식을 통해 수득한 오이(Cucumis sativus L.)에서 비교적 낮은 수준의 이형접합체 출현 입증

EP-374755에 따라 오이에서 단배체 및 복배수체를 제조하고, AFLP 분석을 이용함으로써(EP-534858에 따라 수행), 임의 백분율이 예상되는 복배수체에서 비감수분열 대포자(megaspore)(2n)으로부터 유래되기 보다는 단배체 대포자로부터 생기지 않는다는 것을 확인하였다. 이는 시발된 것으로 추정되는 복배수체(도 6)가 정의에 따르면 진 복배수체(true doubled haploid)에서 불가능한 이형접합성 섹터를 여전히 포함함을 나타낸 도 5, 6 및 7에서 잘 입증된다.

본 실시예는, 오이 DH에서의 자성 발생을 통해 수득할 수 있지만 이형접합체인 일부 부위를 보이는 다른 식물에서도 수득할 수 있음을 보인다. 이러한 이형접합성 정도는 F2 세개에 배해 매우 감소하므로, 이는 틀림없이 SDR형 메카니즘에 의해 초래된다.

실시예 2

피망(Capsicum annuum L.)에서 비감수분열 포자/생식체 형성 강화

비감수분열 포자/생식체 출현 빈도를 증가시키기 위해, 유발원으로서 냉 스트레스를 적용하였다. 이를 위해, 미-감수분열 화아를 포함하며 23 ℃에서 생장시킨 현화 식물 피망을 Zhang et al. (2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78, 84-88에 따라, 5일간 11 ℃에 노출시켰다. 이러한 냉 충격을 가한 후, 싹을 띄우고 부검 포셉 및 외과용 메스를 이용하여 약(anther)을 열어 꽃가루를 추출하였다. 꽃가루를 현미경 글라스 슬라이드에 이동시키고, 아세토-카르민 한 방울을 사용하여 생육력 분석을 위해 염색하였다. 광-현미경을 이용하여 조사되는 현탁물 위에 커버 슬라이드를 놓았다. 대조군으로서, 23 ℃에서 생장시킨 피망 식물로부터 꽃가루를 채집하였다.

도 8은 냉 처리한 식물(8A) 대 대조군 식물(8B)로부터 채집한 꽃가루의 대표적인 형태를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 비감수분열 포자로부터 유래되는 것으로 표시되는 크기 증가가 있는 꽃가루의 수는 냉처리 식물에서 크게 증가하였다. 이러한 특정 예에서, 냉처리로 인한 비감수분열 포자%는 최대 25%인 것으로 추정되었다. 이와 같이, 온도 스트레스에 의한 비감수분열 포자의 형성 강화는 매우 실현가능한 것으로 확인된다.

실시예 3

유세포측정을 통한 브로콜리(Brassica oleracea L.)에서의 자연적으로 형성되는 이배체 포자의 농화

브로콜리(및 그외 식물 종)에서, 이배체 포자는 단배체 포자 보다 큰 것으로 알려져 있다. 유세포측정기를 이용하여 이배체 포자 강화를 실행가능한지를 결정 하기 위하여, 이배체 및 사배체 식물로부터 수득되는 포자로 여러가지 혼합물을 제조하였다. 완충액(8.2 g/L NaCl, 1.9 g/L Na₂HPO₄·2H₂O, 0.3 g/L NaH₂PO₄·2H₂O, pH=7.4) 중에 화아(크기 3-4 mm)를 제분하고, 110 ㎛ 필터로 여과하여 포자를 분리하였다. 세포를 추출 완충액으로 2번 세정한 다음 계수하였다.

단배체 대 이배체 세포: 1:1, 10:1 및 100:1의 혼합물을 만들었다. 이를 파라미터, 입도, 생명력 및 크기에 따라 분류하였다. 여러가지 비율 및 3가지 파라미터 각각에 따라 이배체 세포의 농화가 이루어졌다. 다음 실험으로, 단배체 미세포자의 천연 개체를 상기 파라미터에 따라 분류하였다. 미세포자 개체군에서 0.7%의 빈도로 존재되는 것으로 추정된 이배체 미세포자를 분류할 수 있는 것으로 확인되었다. 도 9는 광 현미경을 통해 관찰되는 바와 같이 정상적인 단배체 미세포자에 비교되는본 실험에서 수득되는 정제한 이배체 미세포자(아래 열)를 나타낸다. 사진은 Ing. M. Vennik; TNO Leiden (The Netherlands)의 courtesy에 의해 수득하였다.

실시예 4

후보 타겟 유전자 사분포자를 하향조절하기 위해 사용할 수 있는 RNA 간섭 벡터의 구축

특정 식물 종에서 후보 타겟 유전자의 활성을 하향 조절하기 위하여, RNA 간섭을 이용할 수 있다. 아라비돕시스 탈리아나의 4분 포자의 DNA 단편을 pKANNIBAL (Wesley et al. (2001) The Plant Journal 27, 581-590)에 삽입하여, 식물에서 발 현되었을때 그 자체가 꺽여져 동종 RNA의 특이적인 분해를 촉발시키는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 RNA 분자를 만든다.

벡터 pKANNIBAL은 CaMV 35S 프로모터의 하류에 위치한 인트론과 상류, 옥토핀 합성효소 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다. 인트론 양 쪽에 다중 클로닝 부위를 위치시켜, 서로간에 반대 방향으로 RNA 간섭 타겟에 상응하는 DNA 좌측 및 우측 팔의 편리한 삽입을 허용한다. 전사되면, 인트론은 스플라이싱에 의해 제거되며, 좌측 및 우측 팔은 서로 꺽여 이중 가닥 RNA를 형성한다.

유전자의 5'-말단(588 bp, 정방향 프라이머: 5'-ACC TCC GAG AAC TCC GTT AAG-3', 역방향 프라이머: 5'-TGC CTG CTT TCT ACC ACT TC-3'), 유전자의 중간 부분(679 bp, 정방향 프라이머: 5'-TTC TCA AGT GGC AAG GTG TC-3'; 역방향 프라이머: 5'-ATC CCT CTT TGG TGG AGT AG-3')에 해당되는 2개의 cDNA 단편이 분리되었다. 제한 효소 인지부를 각 단편의 양쪽에 만들어, pKANNIBAL에서 역위 반복(inverted repeat)으로서 cDNA 단편 삽입이 가능하다. 2개의 단편의 좌측 팔을 XhoI-KpnI 단편으로 조작하였고, 2개의 단편의 우측 팔은 HindII-XbaI 절편으로 조작하였다. 최종 단계로, 역위 반복으로서 4분 포자 서열들 양쪽을(both) 포함하는 완전한 헤어핀 카세트를 T-DNA 바이너리 벡터, pART27에 개별적으로 삽입하였으며, 상기 벡터는 식물 형질전환의 선별 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 유전자를 가지고 있다.

T-DNA의 완전성(integrity)은, 서열 분석으로 검증하였다. 5' 단편은 pRZ226이고 3' 단편은 pRZ219로 표시되는 제조된 바이너리 벡터를, 삼친 교배 과 정(triparental mating procedure)을 이용하여 아그로박테리움 투메팩시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 전이하였다. 클로닝된 후보 타겟 유전자의 단편과 RNA 간섭에 의해 하향 조절될 필요가 있는 특정 유전자 사이의 서열 유사성이 매우 낮은 경우, 전술한 방법을 사용하여 하향 조절될 필요가 있는 유전자와 매우 상동한 DNA 단편을 포함하는 유사한 구조체를 만들 수 있다.

실시예 5

pRZ226 및 pRZ219를 이용한 아라비돕시스 탈리아나 형질전환

식물 형질전환 벡터 pRZ226 및 pRZ219를 포함하고 있는 아그로박테리움 뉴메팩시엔스 균주 C58을 스트렙티노마이(100 mg/L)신 및 스펙티노마이신(300 mg/L)이 함유된 LB 배지에서 철야 배양하여, 벡터를 선별하였고, 리팜피신(40 mg/L) 및 젠타마이신(25 mg/L)이 함유된 LB 배지에서 29 ℃로 배양하여 아그로박테리움 튜메팩시엔스 C58 백그라운드를 선별하였다.

형질전환 식물을 제조하기 위해, Desfeux et al (2000) Plant Physiology 123, 895-904에 개시된 바에 따라 아라비돕시스 꽃 침지 방법(Arabidopsis floral dip method)을 대개 이용하였다. 박테리아 세포를 꽃 침지 용액(50 g 슈크로스 + 500 μl silwett L-77 계면활성제/L milliQ)에 재현탁하였다. 복수개의 화안을 포함하고 있는 볼팅 식물(Bolting plant)을 5-10초간 부드럽게 교반하면서 OD 1.0 내지 1.5fh 아그로박테리움 세포를 포함하고 있는 침지 용액에 넣었다. 접종한 후, 식물을 플라스틱 컨테이너에 넣어, 하루동안 빛이 약한 조건하에서 고습윤한 상태를 유지시킨 다음, 종자를 식물로 생장시켰다.

표면을 멸균한 종자를 0.1% 아가로스가 적층된 50 mg/L의 카나마이신이 포함되어 있는 절반 농도의 MS 플레이트에서 발아시켜, 형질전환체를 선별하였다. 카나마이신 저항성 묘목을 온실의 토양에 옮겨 심었다.

실시예 6

브라시카 올레라시아( Brassica oleracea )에서의 자연적으로 생기는 SDR

광범위한 교배를 통해 Ogura CMS(cytoplasmic male sterility)를 가지고 있는 적양배추(Brassica oleracea)에서 제조된 잡종을, 최초 적양배추 CMS 식물과 표현형상으로 거의 동일하여 따라서 생체내 자성 발생의 결과인 이배체 식물 발생에 대해 스크리닝하였다. 이들의 표현형에 따라 진 잡종 식물과 쉽게 구별할 수 있는 식물은 정말로 빈도가 낮은 것으로 파악되었다.

이러한 식물은 자발적으로 배가된 감수분열 생식체 또는 비감수분열 생식체로부터의 단성 생식을 통해 발생된다. 이러한 가능성을 차별화하기 위해, 이들 식물 유래 DNA를 AFLP(EP-534 858)로 분석하였다. 분석 결과, 비교적 이형접합체 빈도가 낮은 것으로 확인되었으며, 이는 이 식물이 비감수분열 생식체로부터 발생됨을 의미한다. 본 실시예에서는, 브라시카 올레라시아의 생체내 자성 발생을 통해, SDR 유사 메카니즘에 의해 틀림없이 초래되는 비교적 이형접합성이 낮은 식물을 수득할 수 있음을 보인다. 도 10은 비감수분열 생식체로부터 유래된 브라시카 올레라시아의 AFLP 핑거프린트를 나타낸 것이다. 회색 라인은 하나의 모체로부터의 동형접합체 마커 위치이며, 진회색 라인은 다른 모체로부터의 동형접합체 마커 위치이다. 연회색 라인은 잡종 마커 위치를 나타낸다.

실시예 7

옥수수에서의 근접 후향 육종

옥수수 게놈에 핵산 병합은 당업계에 공지된 일반적인 공정이며, 이를 수행하는 방법이 개시되어 있다(EP-801134; US-5,489,520; EP-97.114654.3). 이들 특허 출원에 개시된 형질전환 방법들 중 어느 하나를 이용하여, 제2 감수분열에 관여하며, 결과적으로 비정상적인 SDR 타입의 감수분열 발생을 도출하는 유전자 또는 유전자들, 특히 elongate1(Barell, PJ and Grossniklaus, U. (2005) Plant J. 43, 309-320)에 특이적인 저해 효과를 부여하는 핵산 서열을 도입하였다. 수득되는 SDR 발생 빈도는 형질전환 핵산 서열의 여러가지 게놈 부위의 병합 결과로서 독립적인 형질전환체마다 상이하다.

다른 실험으로, SDR 포자 빈도는 옥수수 식물을 저온 처리하거나 또는 Kato, A and Birchler, JA (2006) J. Hered. 1, 39-44에 개시된 바와 같이 아산화질소 가스를 적용함으로써 증가시켰다.

상기 저해성 핵산의 활성의 결과로서 또는 저온이나 아산화질소 처리의 결과로서, SDR 타입의 다수의 미세포자, 마크로포자를 제조하였다.

따라서 제조되는 세포 개체는 유세포측정기 및 SDR 미세포자가 정상적인 단배체 미세포자에 비해 크기가 더 크다는 사실을 토대로 형광 활성화된 세포 분류를 이용함으로써 SDR-0 미세포자를 농화시켰다.

SDR 발생 결과로서 제조되는 미세포자 또는 마크로포자는 염색체의 이배체 세트를 포함한다. 이러한 이배체 미세포자 또는 마크로포자는 SDR-0 재생물을 제 조하기 위한 출발 물질이었다.

또한, 단배체 옥수수 식물은 단배체 유발원과의 자연적인 및 인공적인 수분화에 의해 수득하였다. 이 경우, 단배체 배야를 포함하는 종자가 수득된다. fi. Rotarenco V (2002) Production of matroclinous maize haploids following natural and artificial pollination with a haploid inducer, Maize Genetics Cooperation News Letter 76: 16을 참조한다. DH 옥수수 식물을 제조하기 위한 언급된 프로토콜을 적용하여, SDR-0 세포로부터 이의 형성이 본 실시예에서 명시된 처리에 의해 유도되는 SDR-0 옥수수 배아를 제조하였다. SDR-0 낟알(kernel)의 내배유에서 부계 및 모체 게놈 사이의 적절한 균형을 구하기 위해, 4배체 유도 주가 사용된다.

SDR을 유도하기 위해 형질전환을 적용하는 특정 실험에서, 트랜스유전자 1 카피가 포함된 형질전환체가 바람직하다. 대체적으로 제2 감수분열을 저해하는 핵산 구조체를 포함하고 있는 형질전환주를 수득한 후, 반복적인 형질전환 발생을 방지하기 위해 교배에 이 형질전환주를 사용하였다. 이 경우에, 단배체 생식체를 포함하고 있는 정상적인 꽃가루의 빈도는 낮았지만 교배에 사용하기에는 충분하였다.

다른 실험으로, 예컨대 덱사메타손(Bohner, S. et al (1999) Plant J. 19, 87-95)에 의해 화학적으로 유도가능한 프로모터에 의해 조절되는 저해성 핵산 구조체를 사용하였다.

다음으로, 미세포자로부터 통상적으로 옥수수 단배체를 수득하였다(Pescitelli S and Petolino J (1988) Plant Cell Reports 7: 441-444; Coumans M et al., (1989) Plant Cell Reports 7: 618-621; Pescitelli S et al., (1989) Plant Cell Reports 7: 673-676; Buter B (1997) In vitro haploid production in maize. In: In Vitro Haploid Production in Higher plants, vol 4, 37-71. Kluwer Academic Publishers. Eds.; S Jain, S Sopory & R Veilleux).

또한, 단배체 옥수수 식물을 단배체 유발원과의 자연적인 및 인공적인 수분화 이후에 수득하였다(Rotarenco V (2002) Maize Genetics Cooperation News Letter 76: 16). 이 경우, 단배체 배아를 포함하는 종자가 수득되었다.

DH 옥수수 식물을 제조하기 위한 전술한 프로토콜을 적용하여, 형질전환으로 또는 본 실시예에 명시된 다른 처리법에 의해 그 형성이 유도되는, SDR-0 세포로부터 SDR-0 옥수수 식물을 제조하였다.

최초 출발 식물에서 이들 부위가 다형인 분자 마커를 이용하여 각 염색체의 센트로미어 부위에 대하여, SDR-0 옥수수 식물을 유전자로 특정화하였다. 여러가지 다형성 검출 기법으로, CAPS, dCAPS, Invader, 피로시퀀싱(pyrosequencing), taqman을 사용하였다.

따라서, 센트로미어 부위의 마커 스코어에 있어 모든 염색체 쌍에 상보적인 SDR-0 옥수수 식물 커플들이 동정되었다. 이후, 이러한 SDR-0 옥수수 식물 커플을 사용하여, 각 SDR-0 상보적인 식물에 대한 복배수체 식물을 제조하였다. 각각의 상보적인 SDR-0 식물로부터 수득되는 개별 DH를 즉, 상보적인 SDR-0 현상 중 어느 하나로부터 발생되는 옥수수 F1 잡종을 사용하기 위해 사용되는 DH 2개를 쌍(pairwise)으로 교배하였다. 이러한 교배는 상호적으로 행해졌다. 출발 F1 잡 종이 대조군으로서 사용되는 야외 실지 농경에 있어, 제조되는 F1 잡종을 조사하였다.

본 발명의 근접 후향 육종을 통해 수득되는 잡종의 농작력은 최초 잡종의 성능과 유사한 것으로 확인되었다.

실시예 8

오이에서의 근접 후향 육종

자성 발생은 오이에 대해 잘 확립되어 있는 기술이며, EP 0 374 755에 언급된 방법에 따라 수행된다. EP 0 374 755에 따라 적용하였을때 자성 발생 동안에 이루어지는 자발적인 SDR 현상은, 일부 잔류 이형접합성을 갖는 이배체 재생물의 형성을 유도한다. 이러한 SDR-0 오이 식물은 EP 534858에 기재된 방법에 다라 AFLP 분석으로 동정하였다.

이로서 수득되는 SDR-0 오이 식물을, 최초 출발 물질에서 이들 부위에 대해 다형인 분자 마커를 이용하여, 각 염색체의 센트로미어 부위에 대해, 유전자로 특정화하였다. 다형성을 검출하기 위해, CAPS, dCAPS, Invader, 피로시퀀싱, taqman로부터 선택되는 공지 기술을 사용하였다. 그 결과, 상기 센트로미어 부위의 마커 스코어에 있어 모든 염색체 쌍에 대해 상보적인 SDR-0 오이 식물 커플이 동정되었다. 이러한 SDR-0 오이 식물 커플을 사용하여, EP 0 374 755에 개시된 방법에 따라 각각의 SDR-0 상보적인 식물에 대한 DH 식물을 제조하였다.

자발적으로 발생되는 SDR 현상은 포기하였고, 이후 단계에는 오직 진 복배수체 식물만을 사용하였다. 단배체 식물이 수득되는 경우에, 염색체 수는 콜치신을 가함으로써 배가된다. 또한, 염색체 배가는 자발적으로 발생할 수 있다. 각각의 상보적인 SDR-0 식물로부터 수득되는 개별적인 DH 식물을 이후, 쌍으로 즉 어느 하나의 상보적인 SDR-0로부터 발생되는 오이 F1 잡종을 제조하기 위해 사용되는 2개의 DH는 쌍으로 교배하였다. 이러한 교배는 상호적으로 이루어졌다. 이로써 제조되는 F1 잡종은 농작력 시험으로 조사하였고, 출발 F1 잡종은 대조군으로서 사용하였다.

본 발명의 근접 후향 육종을 통해 수득되는 잡종의 농작력은 최초 Fl 잡종의 성능과 유사한 것으로 확인되었다.

Claims

이형접합형의 비인간계 유기체로부터 동형접합형의 비인간계 유기체를 제조하는 방법으로서,

상기 동형접합형의 유기체는 교배를 통해 잡종을 수득할 수 있으며;

상기 방법은

a) 이형접합형의 출발 유기체를 제공하는 단계;

b) 상기 유기체로부터 2차 분열 복원(second division restitution)에 의해 발생되는 SDR-0 세포를 제조하는 단계;

c) 상기 SDR-0 세포로부터 SDR-0 유기체를 재생하는 단계; 및

d) 수득되는 SDR-0 유기체로부터 동형접합형 유기체를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 출발 유기체의 간섭없이 SDR-0 세포가 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 SDR-0 세포를 제조하는 유기체는 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이는 것으로 선별되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 SDR-0 세포를 제조하는 유기체는 평균 이상의 제2 분 열 복원을 보이도록 유전자가 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 유전자 변형은 일시적인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 유전자 변형은 유기체에서의 제2 분열 복원 횟수를 증가시키는 유전적 요소의 게놈내로의 안정적인 병합에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 SDR-0 세포를 제조하는 유기체는 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이도록 환경적인 스트레스를 받는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 환경적인 스트레스는 온도 스트레스, NO₂, 일산화질소(N₂O) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 동형접합형 유기체는 복배수체 기법(doubled haploid), 근친 교배(inbreeding), 제2 분열 복원 또는 이들의 조합에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 따라 제조되는 제1 동형접합형 유기체를 제2 동형접합형 유기체와 교배시키는 단계를 포함하는 잡종의 제조 방법.
제 10항에 있어서, 상기 제2 동형접합형 유기체는, 제조되는 잡종이 상기 이형접합형 출발 유기체와 유사하도록, 제1 동형접합형 유기체와 적어도 부분적으로 상보적인 것을 특징으로 하는 잡종의 제조 방법.
제 11항에 있어서, 상기 이형접합형 출발 유기체와의 유사성은 상기 출발 유기체와 적어도 50%의 이형접합성을 갖는 잡종을 포함하는 것을 특징으로 하는 잡종의 제조 방법.
제 11항에 있어서, 상기 이형접합성의 유사성은 50 내지 100%인 것을 특징으로 하는 잡종의 제조 방법.
제 11항에 있어서, 상기 이형접합성의 유사성은 90% 내지 100%인 것을 특징으로 하는 잡종의 제조 방법.
제 10항에 있어서, 상기 제2 동형접합형 유기체는, 제조되는 잡종이 상기 이형접합형 출발 유기체보다 우수하도록, 선택되는 것을 특징으로 하는 잡종의 제조 방법.
제 10항에 있어서, 상기 제2 동형접합형 유기체는, 그 염색체의 서브세트가 오직 상기 제1 동형접합형 유기체의 해당 염색체와 상보적이도록, 선택되는 것을 특징으로 하는 잡종의 제조 방법.
제 16항에 있어서, 나머지 염색체는 제1 또는 제2 동형접합형 유기체와 동일한 것을 특징으로 하는 잡종의 제조 방법.
원하는 유전적 백그라운드를 갖는 유기체에 형질을 이입(introgressing)하는 방법으로서,

상기 방법은

a) 원하는 유전적 백그라운드를 갖는 제1 유기체를, 원하는 형질을 갖는 제2 유기체와 교배하여, 이형접합형의 출발 유기체를 수득하는 단계;

b) 상기 유기체로부터 2차 분열 복원에 의해 발생되는 SDR-0 세포를 제조하는 단계;

c) 상기 SDR-0 세포로부터 SDR-0 유기체를 재생하는 단계;

d) 원하는 형질 및 원하는 백그라운드를 가지고 있는 SDR-0 유기체를 선별하는 단계; 및

e) 선별한 SDR-0 유기체로부터 동형접합형 유기체를 제조하는 단계를 포함하 는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 SDR-0 세포는 제 2항 내지 제 8항중 어느 한항에 따라 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 동형접합형 유기체는 복배수체 기법, 근친 교배, 제2 분열 복원 또는 이들의 조합에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 선별은 육안 검사 또는 분자 마커에 의한 방법을 토대로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 유기체는 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 따른 방법에 의해 수득가능한 동형접합형의 비-인간계 유기체.
제 10항에 따른 방법에 의해 수득가능한 비-인간계 잡종 유기체.
제 23항에 있어서, 상기 유기체는 식물인 것을 특징으로 하는 비-인간계 유기체.
제 23항에 따른 유기체의 후대.
제 23항에 따른 유기체로부터 유래된 세포.
제 23항에 따른 유기체로부터 유래된 조직.