MX2007010566A - Reproduccion casi inversa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para producir un organismo homocigoto no humano a partir de un organismo heterocigoto no humano cuyo organismo homocigoto puede ser cruzado para obtener un hibrido que comprende la provision de un organismo inicial heterocigoto; permitir que el organismo produzca celulas SDR-0 a traves de la meiosis, cuyas celulas se origina de la restitucion de segunda division, la regeneracion de los organismos SDR-0 a partir de las celulas SDR-0; y la produccion del organismo homocigoto a partir de los organismos SDR-0 obtenidos de este modo. La invencion se refiere ademas a un metodo para producir un hibrido, que comprende el cruzamiento de un primer organismo homocigoto que es producido de acuerdo al metodo anterior, con un segundo organismo homocigoto. Ademas, la invencion proporciona organismos homocigotos no humanos y organismo hibridos no humanos, obtenibles mediante estos metodos. La invencion se refiere en particular a las plantas.

Description

REPRODUCCIÓN CASI INVERSA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para producir un organismo no humano homocigoto a partir de un organismo no humano heterocigoto, cuyo organismo homocigoto puede ser cruzado para obtener un híbrido. La invención se refiere en particular a las plantas. La producción o reproducción de las plantas es una de las ocupaciones fundamentales de la humanidad que es de importancia fundamental para proporcionar especies domesticadas que alimenten al mundo. La producción de plantas es por consecuencia vieja y está originalmente basada en la selección y propagación de aquellas plantas que sobresalían en campos de selección locales. La producción contemporánea de plantas es altamente dependiente del conocimiento de la genética y está tecnológicamente apoyada por métodos tales como los haploides duplicados (DH) (ver fi . Haploides in Crop Improvement II eds; Plamer C, Keller W, y Kasha K (2005) en: Biotechnology in Agriculture and Forestry 56 Eds; Nagata T, Lórz H, y Widholm J. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, ISBN 3-500-22224-3) y marcadores moleculares (ver fi. De Vienne ed. (2003) Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechnology. Science publishers Inc. Enfield, NH Estados Ref.: 185642 Unidos, ISBN 1-57808-239-0) . Los mecanismos genéticos durante la reproducción sexual han evolucionado para incrementar la variación genética que mejora las oportunidades de supervivencia de una especie en un ambiente cambiante. La recombinación meiótica, la clasificación cromosómica independiente y el sistema de copulación son factores contribuyentes principales a este respecto. No obstante, en la producción de plantas estos mecanismos pueden actuar contraproducentemente, especialmente en aquellos casos cuando las plantas genéticamente heterocigotas han sido identificadas con alto valor agronómico u hortícola. La redistribución de los factores genéticos da como resultado la generación de plantas genéticamente no similares y por lo tanto heterogéneas y por consecuencia la pérdida de rasgos comercialmente deseables. Con el fin de contrarrestar este efecto, está disponible un número de tecnologías para los productores de plantas. Una posibilidad es propagar plantas vegetativamente, lo cual conduce a una preservación completa de su composición genética ya que la multiplicación ocurre exclusivamente a través de la mitosis. Para muchas especies de plantas, el cultivo de tejidos in vi tro está siendo utilizado para propagar vegetativamente plantas aunque otros métodos como la producción de cortes o esquejes in vivo puede ser también aplicable.

Una desventaja de la propagación vegetativa cuando se compara a la propagación a través de semillas es el hecho de que su labor es intensiva y por ende costosa. Además, es difícil clasificar plantas por periodos prolongados de tiempo que imponen problemas de logística y los riesgos de infecciones del material vegetal con patógenos como virus, es considerablemente más grande en comparación a una situación en la cual el material vegetal es propagado a través de semillas . Como una alternativa, la propagación vegetativa puede ser lograda a través de la formación de semillas asexuales, la cual es denominada en general como apomixis. Apomixis que ocurre naturalmente en un número de especies puede ser inducida en especies de plantas que se propagan sexualmente, mediante ingeniería genética. Actualmente, no obstante, los genes responsables para los diferentes pasos de la apomixis, por ejemplo, la apomeiosis, la partenogénesis y el desarrollo de endosperma autónomo no ha sido todavía identificado y pueden interactuar de una manera complicada. Por lo tanto, aunque el potencial de la tecnología de apomixis para la producción de plantas es ampliamente reconocida para un periodo de tiempo ya prolongado, la prueba del concepto está todavía esperando. Como otra alternativa más, se puede hacer uso de la tecnología de reproducción o producción inversa como se describe en el documento WO-03017753. La producción inversa está basada en la supresión de la recombinación meiótica a través de la ingeniería genética y la producción subsiguiente de plantas haploides duplicadas (DHs) derivadas de esporas que contienen cromosomas progenitores no recombinados. Estas DHs difieren con respecto a su composición genética solamente como una consecuencia de la clasificación cromosómica progenitora independiente, que ocurrió durante la meiosis. Por lo tanto, es suficiente con hacer uso de un marcador polimórfico, co-dominante por cromosoma, para determinar cuáles de los DHs o las líneas derivadas de éstos, deben ser combinados a través del cruce para reconstruir la composición genética de la planta inicial original. Como tal, la aplicación de tecnología de producción o reproducción inversa permite la preservación genética de cualquier planta fértil seleccionada a través de semillas, incluso si su composición genética es desconocida. No obstante, una ventaja de esta tecnología es el hecho de que la supresión completa de la recombinación meiótica da como resultado la ausencia de quiasmata, y por lo tanto segregación inapropiada del cromosoma durante la meiosis I que podría conducir a la aneuploidia de los gametos y por lo tanto a disponibilidad reducida. Cuando no se forman quiasmatas durante la meiosis I, cada cromosoma tiene una oportunidad independiente del 50% de moverse hacia uno de los polos. Esto significa que la probabilidad teórica para elaborar una espora con un complemento cromosómico completo es ( ) *, en donde x representa el número de cromosomas haploides. La frecuencia de gametos balanceados disminuye por lo tanto conforme se incrementa el número de cromosomas haploides . Aunque muchas especies de cosechas tienen un número de cromosomas relativamente bajo (por ejemplo, el pepino tiene 7 cromosomas por genoma haploide y la espinaca tiene únicamente 6) existen también especies económicamente importantes con números de cromosomas relativamente altos como el tomate, una de las cosechas vegetales más grandes, la cual tiene 12 cromosomas por genoma haploide. Este constreñimiento técnico reduce significativamente la eficiencia de la tecnología de reproducción inversa. Por lo tanto, una necesidad clara en la técnica existe para métodos alternativos que permitan la preservación de la composición genética en la progenie sexual. Un objetivo de la presente invención es por lo tanto, proporcionar un método para preservar la composición genética de un organismo progenitor, en particular una planta progenitora . En la búsqueda que condujo a la presente invención se encontró sorprendentemente que al hacer uso de plantas regeneradas a partir de esporas no reducidas, por ejemplo, como se pueden obtener como resultado de un evento de restitución de segunda división (SDR, por sus siglas en inglés) , las denominadas "células SDR-0", es posible proporcionar tal método. Este método puede también ser realizado en otros organismos no humanos diferentes a las plantas, tales como hongos o peces, o con otras células reproductoras, tales como gametos. La invención se refiere de este modo a un método para producir un organismo homocigoto no humano a partir de un organismo heterocigoto no humano, cuyo organismo homocigoto puede ser cruzado para obtener un híbrido, que comprende : a) la provisión de un organismo inicial heterocigoto; b) permitir que el organismo produzca células SDR-0 que se originan de la restitución de segunda división; c) la regeneración de los organismos SDR-0 a partir de las células SDR-0; y d) la producción del organismo homocigoto a partir de los organismos SDR-0 obtenidos así. Este método será llamado en la presente "reproducción casi inversa". Las esporas no reducidas son formadas preferentemente como consecuencia de la omisión de la segunda división meiótica. Este fenómeno natural es conocido como restitución de segunda división o SDR. La SDR puede ocurrir durante la reproducción sexual en plantas, concomitantemente con los eventos meióticos regulares. La tecnología de reproducción casi inversa de la invención explota los eventos de SDR al seleccionar específicamente las esporas no reducidas que son producidas a través de SDR natural o manipulado por ingeniería, para la regeneración. Las plantas resultantes, llamadas plantas SDR-0, las cuales son principalmente homocigotas, en una modalidad preferida, son utilizadas para producir DHs. No obstante, el nivel de homocigocidad en las plantas SDR-0 puede también ser incrementada a través de los pasos de endogamia o eventos de SDR secundarios o combinaciones de los mismos. Los marcadores moleculares que son polimórficos entre los genomas maternos y paternos de la planta inicial puede ser utilizados para identificar aquellas plantas SDR-0 y los DHs derivados de éstas que son esencialmente complementarios con respecto a su composición genética y que después del cruzamiento dan como resultado la reconstrucción casi completa de la concepción genética de la planta inicial original . La reconstrucción es "casi completa" como consecuencia de la recombinación meiónica durante la formación de los eventos SDR-0 y durante la formación de los DHs derivados de éstos. Los híbridos reconstruidos diferirán genéticamente en cierto grado uno del otro, así como de la planta híbrida inicial, original. No obstante, esta variación es fuertemente reducida en comparación a una situación en la cual los DHs son derivados directamente de un evento meiótico regular. Además, los DHs son genéticamente fijos, lo cual significa que no existe espacio para la selección adicional. La ventaja de integrar un evento SDR en este proceso es que la selección para la complementariedad genética ocurre en un proceso de dos pasos . El primer paso está concentrado en las regiones proximales de los cromosomas, por ejemplo, incluyendo los centrómeros. El segundo paso está dirigido hacia los extremos distales de los cromosomas, por ejemplo, aquellas regiones que fueron intercambiadas durante la recombinación. Esta fijación genética retardada reduce la complejidad e incrementa las probabilidades de encontrar genotipos ampliamente complementarios, especialmente cuando los marcadores moleculares están disponibles para la selección. Una ventaja adicional de este procedimiento es el hecho de que la SDR es un proceso natural que ocurre durante la reproducción sexual que puede ser explotado como tal sin la necesidad adicional de interferir con los procesos de reproducción sexual . Las figuras 1A-1B y la figura 2, fig„ 2-1, fig. 2- 2, 2-3 y 2-4 ilustran esquemáticamente la diferencia entre un evento meiótico normal (seguido por la formación de los DHs) y un evento SDR. En ambas figuras han sido descritos cuatro pares cromosómicos y los homólogos son mostrados en color claro, respectivamente, estructuras similares a varillas oscuras donde los círculos negros sobre las varillas describen los centrómeros . Las figuras tienen meramente para ilustrar el principio de esta invención. Es obvio para aquellos expertos en la técnica que en la práctica, el número de pares cromosómicos involucrados depende de la especie involucrada. Además, los puntos de cruzamiento son variables con respecto a su número/cromosoma y su posición sobre el cromosoma. Las figuras 1A-1B describen una meioisis normal y la duplicación (que puede ser espontánea o inducida) de los cromosomas después de que tuvieron lugar ambas divisiones meióticas. En este caso, el cruzamiento ha conducido a la aparición de dos cromosomas progenitores y dos cromosomas recombinantes por par. Además, debido a la clasificación independiente de los dos cromosomas homólogos de cada par, es obvio que pueden ser formados muchas esporas/gametos genéticamente diferentes. En las figuras 1A-1B, han sido descritos únicamente tres productos arbitrarios de este proceso. Después de regenerar las plantas a partir de tales esporas, los DHs pueden ser obtenidos. La producción de DHs es de la mayor importancia en la reproducción contemporánea de plantas y es aplicada como una tecnología establecida para la mayoría de las cosechas. Las plantas regeneradas a partir de esporas diploides serán además llamadas DH-0 por ejemplo, haploides duplicados como el regenerante primario proveniente de una espora espontánea o diploidizada inducida, que se origina de un evento meiótico normal. El término "SDR-0" es utilizado para el regenerante primario a partir de la célula o espora que careció de la segunda división meiótica. Las plantas DH-0 cuando son auto-polinizadas darán origen a plantas de progenie (DH-1), las cuales son genéticamente 100% idénticas y completamente fijas en todos los alelos. Así pues, aunque las esporas (gametos) que son formados en las plantas DH-0 sufrieron nuevamente meiosis y recombinación, no pueden tener lugar reacomodos genéticos. Esto significa por lo tanto que esta denominada "línea pura" es inmortalizada por el hecho de que no puede tener lugar la segregación. Tal linea puede no obstante mostrar fenotípicamente diferente apariencia cuando se desarrolla en diferentes condiciones, tales como las bajas o las altas temperaturas, o por ejemplo, en diferentes zonas climáticas. Las diferencias que pueden ser observadas son no obstante, válidas para todos los "miembros", de la linea, en otras palabras, no existirá variación "intra-línea" . No obstante, pueden existir diferencias entre lineas puras diferentes (DH-1) , la cual es llamada variación "inter- línea" . La figura 2, 2-1, 2-2, 2-3 y 2-4 describen un evento SDR. En contraste a la figura 1 donde tuvo lugar una duplicación cromosómica espontánea o inducida después de la terminación de la meiosis, la aparición de esporas diploides es provocada por la ausencia de la segunda división meiótica. La diferencia fundamental entre los DHs y las plantas SDR diploides es ilustrada por el hecho de que los segmentos heterocigotos están presentes sobre diferentes cromosomas en la planta SDR, mientras que los DHs son completamente homocigotos . Se debe notar además que en las plantas SDR todos los pares cromosómicos son homocigotos con respecto a sus regiones centroméricas . La heterocigocidad si está presente, radica en los extremos cromosómicos distales. Este contraste a otro evento meiótico aberrante llamado Restitución de Primera División o FDR está caracterizado por la ausencia de la primera división meiótica, y te da como resultado la heterocigocidad en las regiones centroméricas para todos los pares cromosómicos . En el caso teórico mostrado en la figura 2, 2-1, 2- 2, 2-3 y 2-4 , la planta inicial (planta donadora) que fue utilizada para generar los DHs y las SDRs, respectivamente, contiene cromosomas homólogos que son completamente heterocigotos. Esto significa que todos los alelos de los genes llevados por estos cromosomas son polimórficos. En la práctica, no obstante, esto es altamente improbable y por lo tanto este caso identifica la situación heterocigota más extrema. A partir de la figura 2, 2-1, 2-2, 2-3 y 2-4 es también claro que para un evento SDR los puntos de cruzamiento de cada par cromosómico determinan la proporción entre los locus homocigotos y los locus heterocigotos. Esta proporción se incrementa para aquellos eventos de SDR que en promedio tienen sus posiciones de cruzamiento localizadas más hacia el telómero, mientras que disminuye cuando en promedio las posiciones de cruzamiento están localizadas más hacia el centrómero. Con la disponibilidad de suficientes marcadores moleculares, estos puntos de cruzamiento pueden ser fácilmente determinados para cada evento de SDR. El grado de cruzamiento para cada brazo cromosómico está limitado por la posición del centrómero. Se debe notar además que en el caso en que la heterocigocidad residual sea relativamente baja, los eventos de SDR se asemejan a la aparición de RIL's y BIL's pero en formas heterocigotas . SDR es solo una forma de una clase más amplia de fenómenos que conducen a la formación de esporas/gametos no reducidos (Veilleux, Plant Breeding Reviews 3, 253-288 (1985) ) describe los mecanismos mediante los cuales los gametos no reducidos son formados, y proporcionan una lista de la aparición de gametos no reducidos en plantas de cosecha. A ese tiempo, principalmente dos clases diferentes de gametos no reducidos fueron reconocidas, a saber SDR y FDR. Recientemente, ha sido publicada una tercera clase de gametos no reducidos, llamada Restitución Meiótica Indeterminada o IMR (Lim et al. (2001) Theor. Appl. Genet. 103:219-230). Para el propósito de esta invención únicamente es relevante la SDR. La SDR ocurre naturalmente en una amplia variedad de cosechas, como se pone en evidencia por la lista presentada por Veilleux, supra, y otra investigación independiente (Lim K et al. (2004) Breeding Science 54:13-18) . De manera interesante, se encontró que en la pimienta, la frecuencia de gametos SDR 2n (polen) incrementó de menos de 1% hasta 10.5% (promedio) en una exposición de 48 horas de las plantas a 11°C (Zhang X et al. (2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78: (1)84-88). La frecuencia máxima de aparición de SDR fue medida para ser de 81.3%. Es de este modo posible incrementar el número de eventos SDR por estímulos externos. La aparición de esporas o gametos 2n no está restringida al gametofito masculino, sino que existe también evidencia de que ésta ocurre al nivel del gametofito femenino. Por ejemplo, Zagorcheva L (Genetics and Plant Breeding 9(5), 386-399 (1976) reportaron la aparición de desviaciones de la macroesporo- y macrogametogénesis en el pepino.

La reproducción casi inversa explota la aparición de esporas no reducidas que son el resultado de la SDR, con el fin de reconstruir la composición genética del material vegetal heterocigoto inicial a un alto grado. Básicamente, con el fin de reconstruir la planta híbrida original se comienza a seleccionar aquellas plantas SDR-0 que son complementarias para la región centromérica de cada cromosoma. Esto puede ser logrado mediante la genotipificación de la región centromérica para cada cromosoma, utilizando marcadores moleculares polimórficos . Ya que los regenerantes SDR-0 son homocigotos en la región centromérica para cada cromosoma, las plantas completamente (o parcialmente) complementarias pueden ser fácilmente identificadas de esta manera. La probabilidad de encontrar una planta SDR-0 complementaria (con base en la complementariedad del centrómero y sin tomar en cuenta ninguna heterocigocidad residual) cuando una planta aleatoria SDR-0 ha sido seleccionada es de ( ) x donde x es el número de cromosomas . En el caso en que las líneas progenitoras originales vayan a ser reconstruidas, la probabilidad de encontrar un progenitor es un medio elevado a la (H) '1 y para el otro progenitor la probabilidad es de (^)x. Como se estableció al principio, tales líneas "casi progenitoras" pueden ser también consideradas como "lineas endogámicas retrocruzadas" (BIL's) con lo cual son generados segmentos de introgresión para ambos progenitores. Estas plantas complementarias pueden ser subsecuentemente cruzadas con el fin de reconstruir el genotipo de la planta híbrida original. No obstante, ya que debido a la recombinación meiótica, las regiones distales de los brazos cromosómicos de las plantas SDR-0 serán heterocigotas (en el caso de un cruzamiento simple por brazo cromosómico) la segregación ocurrirá en el híbrido reconstruido, lo cual puede conducir a un cierto nivel de no uniformidad. Cuando la información genética localizada en las regiones distales de los eventos SDR-0 complementarios, no está contribuyendo significativamente hacia la variación fenotípica debido a que la recombinación ha ocurrido en posiciones cromosómicas relativamente distantes, y por lo tanto el contenido del gen es bajo debido a que la variación alélica no contribuyó significativamente a la variación fenotípica, el híbrido reconstruido será relativamente uniforme. En una modalidad preferida de la invención, son generados eventos SDR-0 en los cuales la recombinación meiótica ocurrió exclusivamente en las regiones teloméricas extremas de los cromosomas. En tales eventos, los cromosomas han sido físicamente recombinados pero no genéticamente. Con el fin de obtener plantas híbridas reconstruidas genéticamente completamente homogéneas, los DHs son producidos a partir de cada uno de los eventos SDR-0 complementarios . Este principio que es esquemáticamente ilustrado en las figuras 3A, 3B-1, 3B-2 , 3B-3 , 3B-4 y 3B-5 describen la formación de esporas /gametos que podrían ocurrir para la planta que es regenerada a partir del evento 3 de SDR- 0 de la figura 2 , 2 -1 , 2 -2 , 2 -3 y 2 -4 . Las esporas que son formadas pueden ser regeneradas y después pueden ser producidos DHs de duplicación del cromosoma. Mediante el uso de marcadores moleculares se pueden seleccionar aquellos DHs que son genéticamente muy similares a cualquiera de las líneas progenitoras . Esto es ilustrado en la figura 4 por el grupo de cromosomas que ha sido duplicado. Debido a la segregación, los extremos distales de los cromosomas ( a partir del punto límite de recombinación hacia el telómero ) de estas plantas haploides duplicadas contendrá en promedio 50% de la información genética de cada progenitor . Cuando dos plantas haploides duplicadas aleatoriamente elegidas derivadas de eventos SDR-0 complementarias , son combinadas a través de cruzamiento , las regiones de los brazos proximales serán 100% heterocigotas , mientras que las regiones de los brazos distales serán 50% heterocigotas , en la planta híbrida reconstruida . Ya que se asume que los eventos SDR- 0 son 60% homocigotos en promedio (Carputo , D . et al . ( 2003 ) Genetics 163 , 287-294 ) , la reconstrucción con eventos complementarios dará como resultado 80% de heterocigocidad en promedio (100% x 60% + 50% x 40%) y 20% de homocigocidad. La homocigocidad entre el punto de cruzamiento proximal y distal será sesgado hacia el genotipo del regenerante SDR-0 que era homocigoto para esta región, mientras que distal al punto de cruzamiento distal, la homogocigocidad será igual para ambos genotipos progenitores . Es claro para la persona experta en la técnica que las figuras mencionadas con relación a los porcentajes de heterocigocidad, representan valores extremos, por ejemplo, comenzando a partir de una planta que es 100% heterocigota, lo cual significa que todas los alelos de los genes llevados en los cromosomas son polimórficos . En la práctica, esto es altamente improbable y por lo tanto los porcentajes de heterocigocidad serán en promedio más bajos. La invención se refiere además a un método para producir un híbrido, que comprende el cruzamiento de un primer organismo homocigoto que es producido de acuerdo a la invención, con un segundo organismo homocigoto. De acuerdo a la invención es posible reconstruir la constitución genética del híbrido original, mientras que, además, pueden ser obtenidas variantes que se aproximan a la constitución genética del híbrido original. En una primera modalidad, el segundo organismo homocigoto es al menos parcialmente complementario al primer organismo homocigoto tal que el híbrido resultante se asemeja al organismo inicial heterocigoto. Adecuadamente, la semejanza con el organismo inicial heterocigoto comprende el híbrido que tiene al menos 50% de la heterocigocidad del organismo inicial. Preferentemente, la semejanza en la heterocigocidad es cualquier porcentaje entre 50 y 100%, más específicamente la semejanza en la heterocigocidad es cualquier porcentaje entre 50% y 60%, preferentemente entre 60% y 70%, más preferentemente entre 70% y 80%, aún más preferentemente entre 80% y 90%, y lo más preferentemente entre 90% y 100%. La frase "cualquier porcentaje" está destinada a cubrir todos y cada uno de los porcentajes dentro del intervalo establecido, aún cuando el porcentaje particular no sea explícitamente mencionado. Alternativamente, el segundo organismo homocigoto es seleccionado de tal manera que el híbrido resultante supera en funcionamiento al organismo inicial heterocigoto original. El "organismo inicial heterocigoto original" es el organismo que es utilizado en el paso a) de la reivindicación 1. La variación del nivel relativo de homocigocidad así como su origen progenitor en la planta híbrida reconstruida, depende del punto de cruzamiento dentro de cada brazo cromosómico de cada progenitor. Mediante el uso de marcadores moleculares ambos eventos SDR-0 asi como los DHs derivados de éstos, pueden ser seleccionados, lo cual después de la hibridación da como resultado híbridos Fl con niveles relativamente bajos de homocigocidad. En esta modalidad, para los eventos SDR-0 se deben seleccionar aquellos que tengan en promedio más cruzamiento distal mientras que para los DHs se deben seleccionar aquellos que sean más complementarios. Por otra parte, no obstante, pueden ser deseables seleccionar aquellos eventos que tengan una distancia relativamente grande entre el punto de cruzamiento proximal y distal, para introducir homocigocidad en el híbrido Fl, que puede ser sesgada hacia cualquier progenitor. A partir de lo anterior, es claro que la reproducción casi inversa hace posible que un productor de plantas reconstruya una planta híbrida a un alto grado, pero que la variación significativa debida a los diferentes niveles y orígenes de los alelos que son homocigotos, puede ser también obtenida entre los híbridos Fl experimentales que pueden dar como resultado un mejoramiento del funcionamiento de la planta híbrida original (inicial). Además, es posible producir híbridos que sean complementarios únicamente para un subgrupo dado de cromosomas. Esto puede ser realizado mediante la selección de aquellos eventos SDR-0 que con base en su genotipo centromérico son complementarios para los pares cromosómicos deseados e idénticos para los otros. Tales híbridos producidos a partir de las denominadas líneas de casi sustitución serán principalmente homocigotos para los pares de cromosomas no complementarios, con niveles similares de heterocigocidad en las regiones distales de los cromosomas, en comparación a los pares cromosómicos complementarios. En su forma más extrema, los haploides dobles completamente no complementarios, pueden ser cruzados, lo cual conduce a plantas híbridas con heterocigocidad limitada a las partes dístales de los cromosomas. Con el fin de explotar SDR para la tecnología de reproducción casi inversa, se puede hacer uso de la aparición espontánea de eventos SDR o se pueden inducir eventos SDR por ejemplo, a través de la ingeniería genética. Otra modalidad más de la invención se refiere al retrocruzamiento. El retrocruzamiento es un término de reproducción de plantas que es bien conocido para la persona experta en la técnica y que se refiere a un procedimiento en el cual un rasgo específico es introgresado dentro de una línea vegetal con una constitución genética deseada (el denominado antecedente genético) . El producto deseado de este procedimiento es una linea de plantas que es genéticamente casi idénticamente a la linea de plantas iniciadoras pero a la cual únicamente son agregados factores genéticos subyacentes al rasgo deseado, a través de recombinación. Con el fin de lograr este objetivo, las plantas que poseen el antecedente genético deseado y el rasgo deseado, son cruzadas y la progenie es seleccionada para las plantas que llevan el rasgo asi como, tanto como sea posible del antecedente genético. Ya que con cada ciclo de cruzamiento el incremento del antecedente genético deseado es en promedio disminuido a la mitad, en la práctica, toma 4 a 5 ciclos de reproducción completar el procedimiento de retrocruzamiento . La reproducción casi inversa permite acelerar el retrocruzamiento ya que el procedimiento de alcanzar la homocigocidad tiene lugar únicamente en dos pasos. El primer paso es idéntico al procedimiento de retrocruzamiento tradicional, por ejemplo, el cruzamiento de las plantas que llevan el antecedente genético deseado y el rasgo deseado. El híbrido resultante es utilizado para generar eventos SDR-0 que son seleccionados para el rasgo deseado que puede estar basado en el fenotipo o asistido por marcador, y el antecedente genético deseado basado en los marcadores centroméricos específicos para el antecedente genético. El segundo paso involucra la producción de DHs que son seleccionados para la cantidad máxima de antecedente genético, utilizando marcadores moleculares. La reproducción casi inversa acelera el procedimiento para llegar a la homocigocidad, pero permite dos pasos de selección. Cuando los marcadores genéticos suficientes son disponibles, el producto de retrocruzamiento deseado puede ser obtenido de manera mucho más eficiente, en comparación con el procedimiento tradicional ya que el número de ciclos de reproducción que consumen tiempo pueden ser significativamente reducidos. Con el método de reproducción casi inversa de la invención, CMS puede ser introgresado dentro de un antecedente deseado de una manera muy eficiente. Con el fin de aplicar la reproducción casi inversa para la transferencia CMS, la linea donadora de CMS es preferentemente genéticamente no similar a la linea que tiene que ser convertida a esterilidad masculina para un gran número de marcadores genéticos nucleares, de modo que la diferencia entre los cromosomas del CMS y el donador fértil pueden ser más fácilmente determinados. Con el fin de convertir una línea pura o una línea endogámica deseada (homocigota o casi homocigota) en una linea similar pero con un antecedente CMS, es realizado un primer cruce por polinización del CMS con polen de la linea deseada. La progenie Fl resultante contiene CMS y 50% de los cromosomas de la linea deseada. Las plantas de progenie Fl son inducidas para realizar la meiosis de SDR durante la ginogénesis ya sea mediante tratamiento con productos químicos tales como óxido nitroso o condiciones de tensión o estrés tales como baja temperatura. SDR puede también ocurrir espontáneamente durante la ginogénesis. En el caso en que es aplicada al androgénesis, se tiene que hacer uso de un gen restaurador el cual puede suprimir el efecto del citoplasma inductor de esterilidad masculina. Las plantas SDR-0 resultantes son genéticamente analizadas utilizando marcadores de ADN que son polimórficos para las regiones centroméricas del híbrido Fl . Las plantas SDR-0 que contienen exclusivamente las regiones centroméricas de la línea que tiene que ser convertida a un CMS, son seleccionadas. En el caso en que números grandes de marcadores de discriminación que cubren el genoma son disponibles, se pueden seleccionar aquellos eventos SDR-0 que en promedio tienen las posiciones de cruzamiento más proximales sobre los cromosomas. Esto convierte en gran medida una línea celular seleccionada a un CMS en un paso simple. Si es necesario, este ciclo de retrocruzamiento puede ser reiterado. La aparición espontánea de eventos SDR puede ser aumentada por condiciones de estrés abióticas especificas tales como choques caloríficos o fríos. Tales condiciones de estrés o tensión se sabe que aumentan la formación de esporas diploides no reducidas (Zhang X et al., (2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78: (1)84-88). Además, es posible inducir la formación de polen 2n mediante la aplicación de gas óxido nitroso (N20) (Okazaki, K. et al. (2005) Euphytica, 143, 101-114). Cuando son producidas esporas diploides a través de la meiosis masculina, es también posible enriquecer estas células a través de citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia. Tales tecnologías son por si mismas para la persona experta en la materia, y han sido aplicadas a las microesporas en el pasado (Deslauriers C et al., (1991) Flor cytometric characterization and sorting of cultured Brassica napus microsporas. Biochem. Biophys. Acta: 1091, 165-172) . Además, se sabe que el polen o las esporas diploides son más grandes en tamaño que sus compañeros haploides (Lernmi G y Negri V. (1994) Research on 2n pollen production in Lotus tenuis an I.M.G.V. of Perugia University. Lotus newsletter Vol; 25, pp. 24-27). Sorprendentemente, el mero hecho de que las esporas diploides sean físicamente diferentes de las esporas haploides hace posible enriquecer específicamente las esporas diploides a través de citometría de flujo y la clasificación celular activada por fluorescencia. Además, la optimización de las funciones ambientales que conducen a la formación de esporas diploides puede ser fácilmente realizada utilizando las diferentes tecnologías de clasificación.

La regeneración de las esporas no reducidas puede ocurrir a través de la androgénesis, la ginogénesis o la partenogénesis mediante polinización de pinchazo de una manera similar a la regeneración de las esporas reducidas. En el caso en que la partenogénesis mediante polinización de pinchazo sea aplicada, puede ser ventajoso utilizar polen diploide, especialmente para aquellas especies que tienen una baja tolerancia para las modificaciones de la proporción de genomas maternos a paternos en el endosperma. Para la mayoría, sino es que para todas las cosechas, éstos protocolos de regeneración descritos en la literatura y son conocidos para la persona experta en la técnica. Una vez que las plantas son regeneradas a partir de esporas diploides, pueden ser utilizados marcadores moleculares para determinar si las regiones centroméricas de los pares de cromosomas son homocigotas o heterocigotas, lo cual es el diagnóstico para los eventos SDR o FDR, respectivamente. De esta manera, los eventos SDR pueden ser fácilmente seleccionados. Son conocidos diferentes procedimientos genéticos para una persona experta en la técnica, que permiten la interferencia con las funciones génicas involucradas en la segunda división celular de la meiosis. Tal interferencia puede ser ya sea a través de la mutagénesis o de la transgénesis. Los procedimientos transgénicos se dirigen a la introducción estable o transitoria de un fragmento de ácido disoxirribonucleico (ADN, por sus siglas en inglés) que modifica la segunda división de la meiosis, conduciendo a esporas diploides del tipo SDR. Esta modificación puede ocurrir a través de la interferencia con factores genéticos involucrados en los procesos meióticos, especialmente aquellos involucrados en la segunda división celular. La interferencia puede ser establecida a través de la subregulación especifica de la expresión del gen con base en el silenciamiento post-transcripcional del gen (PTGS) . PTGS puede ser logrado a través de la interferencia del ARN (ARNi) o el silenciamiento del gen inducido por virus (VIGS). En otro procedimiento más, la interferencia puede ser establecida a través de la sobre-expresión de las proteínas que ejercen un efecto negativo dominante sobre la segunda división de la meiosis conduciendo a SDR. Independientemente del procedimiento emprendido, el gen objetivo necesita ser conocido al nivel molecular. Un número de mutantes recesivos han sido descritos de la papa (pecp, osos, fcfc) que dan como resultado un tipo SDR de meiosis (Carputo, D. et al (2003) Genetics 163, 287-294) . También para el maiz, la mutación elongatel conduce a la ausencia de meiosis II (Burell, PJ y Grossnikalus, U. (2005) Plant J. 43, 309-320) . Aunque los genes que han sido mutados en estos ejemplos específicos no han sido todavía identificados al nivel molecular, la persona experta en la materia será capaz de hacerlo asi, y por lo tanto, éstos y otros genes todavía desconocidos son excelentes candidatos para lograr la SDR en especies objetivo, utilizando tecnologías de supresión molecular. La presente invención se refiere al principio general de la reproducción casi inversa, y al hecho de que no todas las modalidades posibles de inducir SDR en un organismo inicial han sido descritas, no es relevante para la invención. Las alternativas a los genes descritos anteriormente, pueden ser encontradas en genes como DUET (Venkata Reddy et al. (2003) Development 130, 5975-5987) y CYC1; 2 (Wang et al. (2004) plant Physiology 136, 4127-4135) que han sido descritos para Arabidopsis thaliana y que después de la mutación conducen a una forma aberrante de meiosis . Los productos meióticos diploides en estos mutantes, son similares a SDR, y por lo tanto, DUET y CYC1; 2 asi como sus homólogos funcionales en otras especies vegetales, son genes objetivo candidatos para lograr un tipo SDR de meiosis. Otro gen objetivo candidato es TETRASPORE/STUD (Yang et al (2003) Plant J. 34, 229-240) que después de la supresión de un gen conduce a la ausencia de división celular después de la meiosis. Los regenerantes diploides de las microesporas de un mutante de tetraspore/stud pueden ser similares a SDR. Una vez que una planta SDR-0 ha sido obtenida, ésta puede ser además caracterizada molecularmente. Inicialmente, los haplotipos de las regiones centroméricas pueden ser determinados, lo cual proporciona una introspectiva en el nivel de complementariedad de los cromosomas homólogos entre las plantas SDR-0. Dependiendo de la aplicación se pueden seleccionar plantas SDR-0 completa o parcialmente complementarias. Las plantas SDR-0 pueden ser subsecuentemente utilizadas para generar mapas de haplotipos más densos. Esto puede ser logrado utilizando tecnologías de tipificación molecular bien conocidas para la persona experta en la técnica. Los ejemplos son RFLP (Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (Beckamnn, J.S. y Soller, M. (1983) Theor. and Appl. Genet. 67, 35-43)), RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (Welsh, J. y McClelland, M (1990) Nucleic Acids Res. 19, 961-866)), AFLP (Polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (Vos, P. et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 4407-4414)) o SFR (Polimorfismo de característica simple (Borovitz, J. et al (2003) Genome Research 13, 513-523) . Estas tecnologías pueden ser utilizadas sin conocimiento previo de la naturaleza de los polimorfismos del ADN.

En el caso en que los polimorfismos de ADN sean caracterizados, por ejemplo, como SNPs, se puede hacer uso de una plétora de tecnologías de detección de SNP (Kwok, P.Y. y Chen, X. (2003) Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60). Los mapas de haplotipo pueden ser utilizados para seleccionar plantas para la producción de DH. Los DHs obtenidos pueden ser haplotipificados para las regiones que eran heterocigotas en la planta inicial SDR-0. Tal análisis proporciona la información genética que puede ser utilizada para dirigir la proporción de heterocigocidad/homocigocidad en el híbrido Fl y proporciona la posibilidad de seleccionar cualquiera de los orígenes progenitores de las regiones homocigotas del genoma de híbrido Fl . La probabilidad de encontrar al menos una combinación complementaria de dos organismos homocigotos (una combinación que después del cruzamiento puede "resintetizar" el organismo inicial) es una función del número cromosómico haploide x de una especie dada, y el número k de los organismos homocigotos producidos a partir de un organismo inicial heterocigoto en el cual ha tenido lugar la SDR. Cuando el número cromosómico haploide de una especie de cosecha dada es expresado como x, el número máximo de genotipos de SDR-0 considerando únicamente la regiones cromosómicas proximales de los puntos de cruzamiento y de este modo incluyendo la región centromérica, que son obtenidos a partir de una planta de esa especie de cosecha, es 2X. La probabilidad de que un par aleatoriamente elegido de las plantas SDR-0 o una planta DH derivada de éstas, a partir de esta población, después del cruzamiento, dará como resultado un híbrido Fl que tiene un genotipo casi idéntico al genotipo que produjo los eventos SDR-0 (genotipo original) es (2X - 1)/2X. En el caso en que es producido un número total de k plantas SDR-0, existe un número de l/2k(k-l) combinaciones de 2 plantas SDR-0 genéticamente distintas o plantas DH derivadas de éstas que pueden ser cruzadas. La probabilidad de que cualquier combinación aleatoriamente elegida de dos plantas SDR-0 o plantas DH derivadas de éstas sean complementarias, es de 1/2X. De este modo, la probabilidad para que cualquier combinación aleatoriamente elegida de 2 plantas SDR-0 o DHs provenientes de ésta que no son complementarias, es 1 - 1/2X = (2X - 1)/2X. En el caso de k SDR-Os o de DHs derivadas de éstas, l/2k (k - 1) combinaciones pueden ser realizadas y por lo tanto la probabilidad de que dentro de esta población de SDR-0 o DHs derivadas de éstas no pueden ser encontradas plantas complementarias de ( (2X - l)/2x)(1/2k (k ~ ?n y por lo tanto la probabilidad de que al menos una combinación complementaria de dos plantas SDR-0 o DHs derivadas de éstas pueda ser encontrada es de 1-((2X - l)/2x)(1 2k <k " ?n. El resultado de este análisis es mostrado en la tabla 1 siguiente.

Tabla 1 : La probabilidad al menos de encon trar una combina ción de dos SDR-0 complemen tarias o DHs derivadas de éstas , utili zando tecnología de reproducción casi inversa como una función del número X de cromosomas haploides y el número k de plantas SDR-0 alea toriamen te producidas , disponibles .

Este análisis muestra que el genotipo original puede ser ampliamente resintetizado como un híbrido Fl de acuerdo a la presente invención con alta probabilidad utilizando 48 plantas SDR-0 o los DHs derivados de éstas, para las especies vegetales con un número de cromosomas haploides de 7 como el pepino, 128 para una especie vegetal con un número de cromosomas haploides de 9 como la coliflor, y 256 para una especie vegetal con un número de cromosomas haploides de 12 como el tomate, melón y el pimiento dulce. Estas cifras ilustran el hecho de que el número de plantas SDR-0 requeridas para aplicar la reproducción casi inversa para especies de cosecha es relativamente baja y por lo tanto la generación de tales números es altamente factible, especialmente en un ambiente industrial. Es obvio para la persona experta en la técnica que tales cálculos pueden ser realizados para cualquier especie vegetal para la cual se conozca el número de cromosomas haploides. "Plantas o células de SDR-0" como se utilizan en esta solicitud está destinado a relacionarse a las plantas y a las células que resulten de los gametos no reducidos. Tales gametos no reducidos pueden a su vez ser el resultado de un evento de Restitución de Segunda División (SDR) , pero puede ser también ser el producto de una forma aberrante de meiosis que conduce a diploides. La invención proporciona de este modo los medios para utilizar organismos, en particular plantas, y sus progenies, regeneradas a partir de SDR o gametos no reducidos similares a SDR, por ejemplo, para el propósito de construcción del genotipo, para producir lineas progenitoras casi complementarias para elaborar líneas de sustitución cromosómica cercana y para optimizar híbridos Fl mediante introducción de segmentos genómicos homo- y heterocigotos. La presente invención será además ilustrada en los ejemplos no limitantes siguientes y que se refieren a las siguientes figuras. La figura 5 muestra los patrones de AFLP de las plantas F2 típicas de pepino. Cada linea horizontal representa una planta individual. Cada columna vertical representa un grupo de vinculación. Los segmentos gris claro representan las áreas heterocigotas, las áreas negras y oscuras que representan las áreas homocigotas respectivas . La figura 6 muestra el análisis de AFLP de las lineas DH típicas del pepino . Cada línea hori zontal representa una planta individual . Cada columna vertical representa un grupo de vinculación . Únicamente las áreas negras y oscuras están presentes , como se espera en los DHs y los segmentos gris claro están ausentes . La figura 7 muestra el análisis de AFLP de las plantas SDR- 0 típicas en pepino. Cada linea horizontal representa una planta individual . Cada columna vertical representa un grupo de vinculación.

Los segmentos gris claro representan áreas heterocigotas, las áreas negras y oscuras representan áreas homocigotas respectivas . Las figuras 8A-8B muestran el polen recolectado de plantas de pimiento tratadas con baj a temperatura . El panel A representa el polen de las plantas tratadas con frío , mientras que el panel B representa el polen de la planta control como se observa a través del microscopio de luz .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Demostración de la aparición de un nivel relativamente baj o de heterocigocidad en plantas de pepino ( Cucumis sa tivus L . ) , obtenidas a través de ginogénesis Mediante la elaboración de haploides y haploides duplicados en el pepino de acuerdo a la Patente Europea EP- 374755 se encontró, mediante el uso de análisis AFLP (llevado a cabo de acuerdo a la Patente Europea EP-534858) que entre los haploides duplicados esperados, un cierto porcentaje probó no ser originado de las megaesporas haploides, sino más bien que es derivado de una megaespora no reducida (2n) . Esto es bien demostrado en las figuras 5, 6 y 7 que mostraron que los haploides duplicados originalmente presumidos (figura 6) contienen todavía sectores heterocigotos, lo cual por definición no es posible en los haploides duplicados verdaderos . Este ejemplo muestra que a través de la ginogénesis en el pepino, los DHs pueden ser obtenidos, pero que además son obtenidas plantas que muestran algunas regiones que son heterocigotas. Este nivel de heterocigocidad es fuertemente reducido en comparación a la generación F2 y es por lo tanto más probablemente provocado por un mecanismo similar a SDR.

EJEMPLO 2 Aumento de la formación de esporas/gametos no reducidos en pimiento dulce (Capsicum annuum L.) Con el fin de incrementar la frecuencia de la formación de esporas/gametos no reducidos, se aplicó estrés frío como un inducidor. Para este propósito, las plantas en floración del pimiento dulce que contenían botones florales pre-meiot icos y que desarrollaban a 23°C fueron expuestas por 5 dias a 11°C de acuerdo a Zhang et al. (2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78, 84-88. Después de este choque frío, los botones fueron cosechados y el polen fue extraído mediante apertura de las anteras utilizando fórceps de disección y escarpelo. El polen fue subsecuentemente transferido a un portaobjeto para microscopio y teñido para la viabilidad utilizando una gota de aceto-carmín. Fueron colocados cubre-objetos sobre la parte superior de la suspensión que fue investigada utilizando microscopía de luz. Como un control, se recolectó polen de plantas de pimiento dulce que fueron desarrolladas a 23°C. Las figuras 8A-8B muestran ejemplos representativos de las morfologías del polen recolectado de las plantas tratadas por frió (8A) versus las plantas control (8B). Como se puede observar, el número de polen con un tamaño incrementado indicativo para ser derivado de las esporas no reducidas, es fuertemente incrementado para la planta tratada con frío. En este ejemplo particular, se estimó que el porcentaje de esporas no reducidas se remontó hasta 25 debido al tratamiento con frío. Como tal el aumento de la formación de esporas no reducidas por la tensión de temperatura, es mostrado como altamente factible.

EJEMPLO 3 Enriquecimiento de esporas diploides de origen natural en brócoli ( Brassica olerá cea L . ) a través de citometría de fluJ° Para la brócoli (y otras especies de plantas) se espera que las esporas diploides son más grandes que las esporas haploides. Con el fin de determinar si es factible enriquecer esporas diploides utilizando citometria de flujo, fueron realizadas diferentes mezclas de las esporas obtenidas de las plantas diploides y tetraploides . Las esporas fueron aisladas mediante molienda de los botones florales (3-4 mm de tamaño) en una solución amortiguadora (8.2 g/l de NaCl, 1.9 g/l de Na2HP04«2H20, 0.3 g/l de NaH2P04« 2H20, pH = 7.4 ) y la filtración subsiguiente a través de un filtro de 110 µm. Las células fueron lavadas dos veces con el amortiguador de extracción y fueron contadas. Se realizaron las siguientes mezclas de células haploides versus diploides: 1:1, 10:1 y 100:1. La clasificación fue llevada a cabo con base en los parámetros de granularidad, vitalidad y tamaño. El enriquecimiento de las células diploides fue obtenido para todas las proporciones y basado en cada uno de los tres parámetros. En un siguiente experimento, fue clasificada una población natural de microesporas haploides con base en los parámetros anteriormente mencionados. Se encontró que las microesporas diploides podrían ser clasificadas, las cuales se estimó que estaban en una frecuencia de 0.7% en la población de microesporas. La figura 9 muestra las microesporas diploides purificadas (hilera inferior) obtenidas en este experimento en comparación a las microesporas haploides normales como se observan a través del microscopio de luz. Fueron obtenidas imágenes por cortesía del Ing. M. Vennik; TNO Leiden (Holanda) .

EJEMPLO 4 Construcción de vectores de interferencia de ARN que pueden ser utilizados para subregular el gen objetivo candidato de Tetraspore Con el fin de subregular la actividad de un gen objetivo candidato en una especie de planta particular, se puede hacer uso de la interferencia de ARN. Para ese propósito, fragmentos de ADN de Tetraspora de la Arabidopsis thaliana se insertaron dentro de pKANNIBAL (Wesley et al. (2001) The Plant Journal 21, 581-590) tal que después de la expresión en plantas una molécula de ARN es formada, la cual puede plegarse hacia atrás sobre si misma formando de este modo una estructura de horquilla que dispara la degradación específica al ARN homólogo. El vector pKANNIBAL contiene un intrón colocado con dirección 3' del promotor CaMV 35S y con dirección 5' de una señal de poliadenilación de octopina-sintasa. En cualquier lado del intrón es colocado un sitio de clonación múltiple que permite la inserción conveniente del brazo izquierdo y derecho del ADN correspondiente al objetivo de interferencia del ADN en una orientación invertida uno con relación al otro. Después de la transcripción, el intrón es retirado mediante el empalme y el brazo izquierdo y derecho se pliegan hacia atrás uno sobre el otro formando el ARN de doble hebra. Los dos fragmentos de cADN fueron aislados correspondiendo al extremo 5' del gen (588 pares de bases, cebador delantero: 5' -ACC TCC GAG AAC TCC GTT AAG-3' ) , cebador inverso: 5' -TGC CTG CTT TCT ACC ACT TC-3' ) y la parte intermedia del gen (679 pares de bases, cebador delantero: 5' -TTC TCA AGT GGC AAG GTG TC-3'; cebador inverso: 5' -ATC CCT CTT TGG TGG AGT AG-3' ) . Los sitios de reconocimiento de enzima de restricción fueron generados en ambos extremos de cada fragmento, los cuales permitieron la inserción de los fragmentos de cADN como una repetición invertida en pKANNIBAL. El brazo izquierdo para ambos fragmentos es manipulado por ingeniería como un fragmento Xhol-Kpnl mientras que el brazo derecho para ambos fragmentos es manipulado por ingeniería como un fragmento HindII-Xbal. Como un paso final los casetes de horquilla completos, que contienen ambas secuencias Tetraspore como repeticiones invertidas, son insertados separadamente dentro de un T-ADN de un vector binario llamado pART27 que contiene el gen de la neomcina-fosfotransferasa II como marcador seleccionable para la transformación vegetal. La integridad del T-ADN fue confirmada por análisis de secuencia. Los vectores binarios resultantes, denominados como pRZ226 para el fragmento 5' y pRZ219 para el fragmento 3' son transferidos dentro de Agroba cterium tumefaciens utilizando un procedimiento de acoplamiento de tres progenitores. En el caso en que la similitud secuencial entre un fragmento de un gen objetivo candidato, clonado, y el gen especifico que necesita ser sub-regulado por la interferencia de ARN, sea demasiado bajo, el método descrito anteriormente puede ser utilizado para elaborar una construcción similar que contenga fragmentos de ADN que son suficientemente homólogos al gen que necesita ser subregulado.

EJEMPLO 5 Transformación de Arabidopsis thaliana con pRZ226 y pRZ219 Agrobacteri um tumefaciens cepa C58 que contiene vectores de transformación vegetal pRZ226 y pRZ219 fueron desarrolladas toda la noche en medio LB que contenía estreptomicina (100 mg/l) y espectomicina (300 mg/l) para seleccionar los vectores y rifampicina (40 mg/l) y gentamicina (25 mg/l) para seleccionar el antecedente de Agroba cteri um tumefa ciens C58 a 29°C.

Con el fin de producir plantas transgénicas, el método de inmersión floral de Arabidopsis fue utilizado ampliamente como se describe por Desfeux et al (2000) Plan t Physiology 123, 895-904. Las células bacterianas fueron resuspendidas en la solución de inmersión floral (50 g de sucrosa + 500 µl de surfactante silweett L-77 por litro de milliQ) . Las plantas fijadas, que contenían múltiples botones florales, fueron sumergidas dentro de la solución de inmersión que contenía las células de Agrobacterium a una densidad óptica entre 1.0 y 1.5, durante 5-10 segundos con agitación suave. Después de la inoculación, las plantas fueron contenidas en un recipiente de plástico para mantener la alta humedad bajo condiciones de baja luz por un día y subsecuentemente, las semillas fueron desarrolladas sobre las plantas. Los transformantes fueron seleccionados al hacer germinar la semillas esterilizadas superficialmente, en agarosa al 0.1% colocada en capas sobre placas MS de fuerza media que contenía 50 mg/l de kanamicina. Las plántulas resistentes a la kanamicina fueron transferidas al suelo en un invernadero.

EJEMPLO 6 Evento SDR de origen natural en Brassica olerácea Los híbridos producidos sobre col roja ( Brassica olerácea ) que llevan esterilidad masculina citoplásmica de Ogura (CMS) a través de una cruza amplia, fueron seleccionadas para la aparición de plantas diploides que fueron fenotípicamente casi idénticas a la planta de color roja CMS original y que por lo tanto son el resultado de la ginogénesis in vivo . Estas plantas, que pueden ser fácilmente distinguidas de las plantas híbridas verdaderas con base en su fenotipo fueron por supuesto identificadas con baja frecuencia. Tales plantas se originan a través de la partenogénesis de gametos reducidos, los cuales se duplicaron espontáneamente o a partir de gametos no reducidos. Con el fin de discriminar entre estas posibilidades, el ADN derivado de tal planta fue analizada utilizando AFLP (llevado a cabo de acuerdo a la patente Europea EP-534 858) . El análisis demostró la presencia en una frecuencia relativamente baja de locus heterocigotos, indicando que esa planta se originó de un gameto no reducido. Este ejemplo muestra que a través de la ginogénesis in vivo en Brassica olerácea , pueden ser obtenidas plantas con un nivel relativamente bajo de heterocigocidad que es probablemente provocado por un mecanismo similar a SDR. La figura 10 muestra la huella digital de AFLP de una planta de Brassica olerá cea derivada de un gameto no reducido. Las líneas grises indican una célula marcadora homocigota proveniente de un progenitor, gris oscuro del otro. Gris claro indica un locus de marcador híbrido.

EJEMPLO 7 Reproducción casi inversa en el maíz La incorporación de ácidos nucleicos en el genoma del maíz son procedimientos rutinarios conocidos en la técnica y los métodos de cómo lograr esto han sido descritos (Patente Europea EP-801134; Patente de los Estados Unidos US-5,489,520; Patente Europea EP-97.114654.3) . Utilizando cualquiera de los métodos de transformación descritos en estas solicitudes de patente, fueron introducidas secuencias de ácido nucleico que confieren un efecto inhibidor específico sobre un gen o genes que están involucrados en la segunda división meiótica, en particular elongatel (Barell, PJ y Grossniklaus, U. (2005) Plan t J. 43, 309-320) y los cuales como consecuencia conducen a la aparición de eventos meióticos aberrantes del tipo SDR. La frecuencia de eventos SDR obtenidos algunas veces difiere entre los transformantes independientes como consecuencia de los diferentes sitios genómicos de integración de las secuencias de ácido nucleico transgénico . En otro experimento más, la frecuencia de las esporas SDR fue incrementada por el tratamiento de las plantas de maíz con bajas temperaturas o mediante la aplicación de gas óxido nitroso como se describe por Kato, A y Birchler, JA (2006) J. Hered. 1, 39-44. Como consecuencia de la actividad de los ácidos nucleicos inhibitorios o la aplicación de bajas temperaturas o tratamientos con óxido nitroso, numerosas microesporas, respectivamente, macroesporas, fueron producidas, las cuales son del tipo SDR. La población celular producida de este modo fue enriquecida para la presencia de microesporas SDR-0, mediante el uso de citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia, basada en el hecho de que las microesporas de SDR son más grandes en tamaño en comparación a las microesporas haploides normales. Las microesporas y las macroesporas que fueron producidas como consecuencia de un evento SDR contienen un grupo diploide de cromosomas. Estas microesporas o macroesporas diploides fueron el material inicial para la producción de regenerantes SDR-0. Las plantas de maiz haploides han sido también obtenidas después de la polinización natural y artificial con un inductor haploide. En este caso, son obtenidas semillas que contienen embriones haploides, ver fi. Rotarenco V. (2002) Production of matroclinous maize haploides following nautral and artificial pollination with a haploid inducer. Maize Genetics Cooperation News Letter 76:16. Los protocolos mencionados para producir plantas de maiz DH han sido también aplicados para producir embriones de maíz SDR-0 a partir de células SDR-0 de las cuales la formación es inducida por los tratamientos especificados en este ejemplo. Con el fin de obtener el balance adecuado entre los genomas materno y paterno en el endosperma de los granos SDR-0, se ha hecho uso también de una línea inductora tetraploide. En el experimento específico en el cual la transgénesis es aplicada para inducir SDR, los transformantes que contenían una copia simple del transgen fueron preferidos. Después de obtener una linea transgénica que contiene una construcción de ácido nucleico que inhibe en gran medida la segunda división meiótica, esta línea fue utilizada en cruzas con el fin de evitar eventos de transformación repetitivos. En ese caso, la frecuencia del polen normal que contiene gametos haploides fue baja, pero todavía suficiente para ser utilizada para la cruza. En un experimento adicional, se utilizó una construcción de ácido nucleico inhibitorio que es controlada por un promotor que es químicamente inducible por, dexametasona (Bohner, S. et al (1999) Plant J. 19, 87-95). Los haploides en maiz fueron luego rutinariamente obtenidos de microesporas (Pescitelli S y Petolino J (1988) Plant Cell Reports 1 : 441-444; Coumnas M et al., (1989) Plant Cell Reports 1 : 618-621; Pescitelli S et al., (1989) Plan t Cell Reports 1 : 673-676; Buter B (1997) In vi tro haploid production in mai ze . En: In Vi tro Haploid Production in Higher plants, vol. 4, 37-41. Kluwer Academic Publishers, Eds.; S Jain, S Sopory & R. Veilleux). Plantas de maíz haploides fueron también obtenidas después de la polinización natural y artificial con un inductor haploide (Rotarenco V (2002) Maize Genetics Coopera tion News Let ter 76: 16). En este caso, fueron obtenidas semillas que contenían embriones haploides. Los protocolos anteriormente mencionados para producir plantas de maíz DH fueron aplicados para producir plantas de maíz SDR-0 a partir de células SDR-0 de las cuales la formación es inducida transgénicamente o por otros tratamientos especificados en este ejemplo. Las plantas de maiz SDR-0 fueron genéticamente caracterizadas con respecto a las regiones centroméricas de cada cromosoma utilizando un marcador molecular que es polimórfico para estas regiones en la planta inicial original. Para la detección del polimorfismo, fueron utilizadas diferentes tecnologías, seleccionadas de CAPS, dCAPS, Invader, pirosecuenciamiento, taqman. De este modo, los pares de plantas de maíz SDR-0 fueron identificados, los cuales son complementarios para todos los pares cromosómicos con respecto a las calificaciones del marcador de las regiones centroméricas. Tales pares de plantes de maíz SDR-0 fueron luego utilizados para producir plantas haploides duplicadas para cada planta complementaria de SDR-0. Los DHs individuales obtenidos de cada planta SDR-0 complementaria fueron cruzados por pares, por ejemplo, los DHs que son utilizados para producir un híbrido Fl de maíz se originan de cualquiera de los eventos SDR-0 complementarios. Estas cruzas fueron realizadas recíprocamente. Los híbridos Fl producidos de este modo fueron evaluados en pruebas de campo para el funcionamiento agronómico en el cual el híbrido Fl inicial fue utilizado como un control. Se encontró que el funcionamiento agronómico del híbrido obtenido a través de reproducción casi inversa de la invención es similar al funcionamiento del híbrido original.

EJEMPLO 8 Reproducción casi inversa en pepino La ginogénesis es una tecnología bien establecida para el pepino y es llevada a cabo de acuerdo al método descrito en la Patente Europea EP 0 374 755. Los eventos de SDR espontáneos que ocurren durante la ginogénesis cuando son aplicados de acuerdo a la Patente Europea EP 0 374 755 condujeron a la formación de regenerantes diploides que tienen alguna heterocigocidad residual. Estas plantas de pepino SDR-0 fueron identificadas utilizando el análisis de AFLP llevado de acuerdo al método proporcionado en la Patente Europea EP 534858.

Las plantas de pepino SDR-0 obtenidas de este modo fueron genéticamente caracterizadas con respecto a las regiones centroméricas de cada cromosoma utilizando marcadores moleculares que son polimórficos para estas regiones en la planta inicial original. Para la detección de los polimorfismos, fueron utilizadas tecnologías conocidas seleccionadas de CAPS, dCAPS, Invader, pirosecuenciamiento, taqman. Esto dio como resultado la identificación de pares de plantas de pepino SDR-0 que fueron complementarias para todos los pares cromosómicos con respecto a las calificaciones del marcador de las regiones centroméricas. Tales pares de plantas de pepino SDR-0 fueron subsecuentemente utilizadas para producir plantas DH para cada planta complementaria de SDR-0 de acuerdo al método descrito en la Patente Europea EP 0 374 755. Eventos SDR que ocurren espontáneamente fueron descartados y únicamente fueron utilizadas las plantas haploides duplicadas verdaderas, en pasos posteriores. En el caso en que fueron obtenidas las plantas haploides, el número de cromosomas es duplicado, por ejemplo, mediante aplicación de colchicina. La duplicación del cromosoma puede también ocurrir espontáneamente. Las plantas DH individuales obtenidas de cada planta SDR-0 complementaria fueron subsecuentemente cruzadas por pares, por ejemplo, las dos DHs que fueron utilizadas para producir un híbrido de pepino Fl originadas ya sea de cualquiera de los eventos SDR-0 complementarios. Estas cruzas fueron realizadas recíprocamente. Los híbridos Fl producidos de este modo fueron evaluados en pruebas para el funcionamiento agronómico en el cual se utiliza el híbrido inicial Fl como un control. Se encontró que el funcionamiento agronómico del híbrido obtenido a través de la reproducción casi inversa de la invención, es similar al funcionamiento del híbrido Fl original .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para producir un organismo homocigoto no humano a partir de un organismo heterocigoto no humano, cuyo organismo homocigoto puede ser cruzado para obtener un híbrido, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un organismo inicial heterocigoto; b) permitir que el organismo produzca células SDR-0 que se originan de la restitución de segunda división; c) la regeneración de los organismos SDR-0 a partir de las células SDR-0; y d) la producción del organismo homocigoto a partir de los organismos SDR-0 obtenidos de este modo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células SDR-0 son producidas sin interferencia con el organismo inicial.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo que produce las células SDR-0 se selecciona para mostrar una restitución de segunda división, por arriba del promedio.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo que produce las células SDR-0 es genéticamente modificado para mostrar una restitución de segunda división por arriba del promedio.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la modificación genética es transitoria .

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modificación genética es mediante incorporación estable dentro del genoma de un elemento genético, incrementando el número de eventos de restitución de segunda división en el organismo.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo que produce las células SDR-0 es sometido a estrés ambiental para mostrar una restitución de segunda división por arriba del promedio.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el estrés ambiental se selecciona de estrés de temperatura, N02, óxido nitroso N20 o combinaciones de los mismos.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los organismos homocigotos son preparados mediante técnicas haploides duplicadas, cruza endogámica, restitución de segunda división o combinaciones de las mismas.

10. Un método para producir un híbrido, caracterizado porque comprende el cruzamiento de un primer organismo homocigoto que es producido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-9 con un segundo organismo homocigoto .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el segundo organismo homocigoto es al menos parcialmente complementario al primer organismo homocigoto tal que el híbrido resultante se asemeja al organismo inicial heterocigoto.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la semejanza con el organismo inicial heterocigoto comprende el híbrido que tiene al menos 50% de la heterocigocidad del organismo inicial.

13. El método de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque la semejanza en la heterocigocidad es cualquier porcentaje entre 50 y 100%.

14. El método de conformidad con las reivindicaciones 11, 12 ó 13, caracterizado porque la semejanza en la heterocigocidad es cualquier porcentaje entre 50% y 60%, preferentemente entre 60% y 70%, más preferentemente entre 70% y 80%, aún más preferentemente entre 80% y 90% y lo más preferentemente entre 90% y 100%.

15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el segundo organismo homocigoto se selecciona de tal manera que el híbrido resultante supera el funcionamiento del organismo inicial heterocigoto.

16. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el segundo organismo homocigoto se selecciona de tal manera que únicamente un subgrupo de sus cromosomas es complementario a los cromosomas correspondientes del primer organismo homocigoto.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el resto de los cromosomas es idéntico entre el primero y segundo organismos homocigotos.

18. Un método para introgresar un rasgo en un organismo con un antecedente genético deseado, caracterizado porque comprende los pasos de: a) cruzar un primer organismo que tiene el antecedente genético deseado, con un segundo organismo que tiene el rasgo deseado, para obtener un organismo inicial heterocigoto; b) permitir que el organismo produzca células SDR-0 que se originan de la restitución de segunda división; c) regenerar los organismos SDR-0 a partir de las células SDR-0 d) seleccionar los organismos SDR-0 que tienen el rasgo deseado y el antecedente deseado; y e) producir organismos homocigotos a partir de los organismos SDR-0 seleccionados.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las células SDR-0 son obtenidas como se definen en las reivindicaciones 2-8.

20. El método de conformidad con las reivindicaciones 18 ó 19, caracterizado porque los organismos homocigotos son preparados mediante técnicas haploides duplicadas, cruza endogámica, restitución de segunda división o combinaciones de las mismas.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque la selección es realizada con base en la inspección visual o por medio de marcadores moleculares.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque el organismo es una planta.

23. Un organismo homocigoto no humano, caracterizado porque es obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

24. El organismo híbrido no humano, caracterizado porque es obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-21.

25. El organismo híbrido no humano de conformidad con las reivindicaciones 23 ó 24, caracterizado porque el organismo es una planta.

26. La progenie, caracterizada porque es proveniente de un organismo de conformidad con las reivindicaciones 23, 24 ó 25.

27. Las células, caracterizadas porque son provenientes de un organismo de conformidad con las reivindicaciones 23, 24 ó 25, o la progenie de conformidad con la reivindicación 26.

28. El tejido, caracterizado porque es proveniente de un organismo de conformidad con las reivindicaciones 23, 24 ó 25, o la progenie de conformidad con la reivindicación 26.