KR20150084896A

KR20150084896A - 지브라 칩 및 당 말단에 의한 손실을 최소화하기 위한 감자에서 전화효소 사일런싱의 사용

Info

Publication number: KR20150084896A
Application number: KR1020157014929A
Authority: KR
Inventors: 크레이그 리첼; 징송 예; 카이우스 로멘스
Original assignee: 제이.알.심프롯캄패니
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2015-07-22
Also published as: CN104919047A; EP2917352A4; JP2016503297A; MX2015005843A; EP2917352A1; WO2014074990A1; US20140137295A1; CA2891114A1; AU2013342064A1; BR112015010674A2

Abstract

본 발명은 지브라 칩 병원균으로부터의 감염에 의한 당 말단의 더 낮은 발생 및 더 적은 변색 전개를 가진 칩 및 프렌치 프라이와 같은 감자 제품을 생산하는 편리한 방법을 제공한다.

Description

지브라 칩 및 당 말단에 의한 손실을 최소화하기 위한 감자에서 전화효소 사일런싱의 사용{Use of invertase silencing in potato to minimize losses from zebra chip and sugar ends}

본 발명은 지브라 칩 병원균으로부터의 감염에 의한 당 말단의 더 낮은 발생 및/또는 더 적은 변색 전개를 가진 칩 및 프렌치 프라이를 포함하는 감자 제품을 생산하는 편리한 방법을 제공한다.

감자(Solanum tuberosum)는 세계에서 세 번째로 가장 중요한 식품 농작물이다. 감자는 인간 소비, 동물 사료 및 전분과 알코올의 원료로서 사용된다. 전세계 생산량의 2/3 이상이 인간이 직접 섭취하며 나머지의 대부분은 동물에게 공급되거나 전분을 생산하는데 사용된다. 21세기의 첫 10년 동안 평균 전세계 시민의 1년간 음식은 약 33kg(또는 77lb)의 감자를 포함한다.

매년 재배 시기 동안 감자 식물은 식물 건강, 수확량 및 최종 덩이줄기 품질에 영향을 미치는 다양한 생물적 및 비생물적 스트레스에 영향을 받는다. 지면에서 환경적 및 문화적 관행의 복합 작용에 의한 나쁜 덩이줄기 품질은 프렌치 프라이 또는 포테이토 칩과 같은 최종 제품에서 눈으로 볼 수 있다. 부최적 재배 연도 및 나쁜 문화적 관행은 갈색 점, 알맹이 없는 중앙부, 내부 괴사, 관의 착색, 지브라 칩 및 당 말단과 같은 내부 덩이줄기 질병의 분명한 증가를 초래한다. 이런 질병을 가진 최종 프라이 제품은 폐기되어야 해서, 가공자에게 경제적 손실을 야기한다. 경제적 부담의 일부는 계약 불이익 형태로 재배자에게 또는 더 높은 제품 가격 형태로 소비자에게 전가된다.

따라서, 본 발명이 다루는 감자 덩이줄기 품질의 개선에 대한 지속적인 요구가 존재한다.

본 발명은 감자 덩이줄기 또는 감자 덩이줄기로 제조된 제품에서 당 말단의 빈도를 최소화하는 방법을 제공하며, 감자 덩이줄기에서 당 말단의 빈도는 대조군 감자 덩이줄기와 비교하여 감소한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 감자 덩이줄기에서 공포 전화효소 활성을 파괴하는 단계를 포함한다.

본 발명은 감자 덩이줄기 또는 감자 덩이줄기로 제조된 제품에서 지브라 칩의 증상을 최소화하는 방법을 제공하며, 감자 덩이줄기에서 지브라 칩의 증상은 대조군 감자 덩이줄기와 비교하여 감소한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 감자 덩이줄기에서 공포 전화효소 활성을 파괴하는 단계를 포함한다.

공포 전화효소 활성은 임의의 적절한 방법에 의해 파괴될 수 있다. 일부 실시태양에서, 공포 전화효소 활성은 공포 전화효소를 암호화하는 공포 전화효소 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드 변화를 감자 덩이줄기 속에 주입함으로써 파괴된다. 일부 실시태양에서, 뉴클레오티드 변화는 자연스럽게 일어나며 또는 임의의 적절한 방법에 의해 인공적으로 생성된다. 일부 실시태양에서, 공포 전화효소 활성은 억제성 뉴클레오티드 서열을 주입함으로써 파괴된다. 일부 실시태양에서, 억제성 뉴클레오티드 서열은 안티센스 RNA 서열, dsRNAi 서열 및 역방향 반복체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시태양에서, 억제성 뉴클레오티드는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시태양에서, 식물 프로모터는 구조성 프로모터, 비-구조성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 세포 형태 특이적 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시태양에서, 조직 특이적 프로모터는 덩이줄기-특이적 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 덩이줄기-특이적 프로모터는 ADP 글루코오스 피로포스포릴라제 유전자와 관련된 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 덩이줄기-특이적 프로모터는 핵산 서열 SEQ ID NO: 6 또는 임의의 기능성 변형체 또는 이의 기능성 단편을 포함한다.

일부 실시태양에서, 억제성 뉴클레오티드 서열은 역방향 반복체 서열이다. 일부 실시태양에서, 역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5의 특정 일부 또는 일부들과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 유사성을 공유하는 적어도 하나의 센스 서열 및 안티-센스 서열 또는 이의 역 상보적 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5와 혼성화될 수 있는 적어도 하나의 센스 서열 및 적어도 하나의 안티-센스 서열 또는 이의 역 상보적 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서, 역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5의 +53 내지 +733에 해당하는 센스 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5의 +552 내지 +49에 해당하는 안티-센스 서열을 포함한다.

본 발명은 당 말단의 유도에 일반적으로 도움이 되는 지면에서의 조건하에서 당에 의해 덩이줄기를 생산하지 않는 형질전환 식물을 생산하는 방법, 지브라 칩의 증상을 최소화하거나 당 말단의 빈도를 낮추기 위해 전화효소 사일런싱을 사용하는 방법을 제공한다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 감자 식물에서 유전자 사일런싱 카세트(gene silencing cassette)를 발현하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 카세트는 역방향 반복체로부터 기원된 센스 서열 및 안티센스 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 센스 서열은 SEQ ID NO: 5의 100% 동일성을 가진다. 일부 실시태양에서, 안티센스 서열은 센스 서열의 전장 또는 부분 역 및 상보적 서열이다. 일부 실시태양에서, 센스 서열 및 안티센스 서열은 스페이서에 의해 분리된다. 일부 실시태양에서, 발현 카세트는 덩이줄기-특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 덩이줄기-특이적 프로모터는 센스 및 안티센스 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시태양에서, 카세트의 발현은 적어도 하나의 내인성 전화효소 유전자의 발현을 하향 조절하여 감자 덩이줄기 상기 감자 덩이줄기로 제조된 제품에서 당 말단의 빈도를 최소화 및/또는 감자 덩이줄기 상기 감자 덩이줄기로 제조된 제품에서 지브라 칩의 증상을 최소화한다. 일부 실시태양에서, 센스 서열은 SEQ ID NO: 5의 전장 또는 부분 서열과 100% 동일하다. 일부 실시태양에서, 안티센스 서열은 센스 서열의 역 및 상보 서열과 100% 동일하다. 예를 들어, 센스 서열은 SEQ ID NO: 3일 수 있고 안티센스 서열은 SEQ ID NO: 21일 수 있다. 일부 실시태양에서, 안티센스 서열은 센스 서열의 역 및 상보 서열과 100% 동일하지 않으나, 부분적으로 겹치며, 예를 들어, 센스 서열은 SEQ ID NO: 3일 수 있고 안티센스 서열은 SEQ ID NO: 4일 수 있다.

본 발명의 방법은 예측되지 않는데 이는 유전자 효율이 사전의 차가운 온도 도입과 엄격하게 관련이 있기 때문이다(Klann et al., Plant Physiol 1993; Bethke and Jiang, Plant Physiol 2010; Ye et al. J. Agric Food Chem 2010).

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1. 당 말단(SE)은 '레인저'(A)의 거의 절반 및 빈 벡터(B) 대조군 프라이 상에서 명백하다. 라인 1632-1(C) 및 1632-4(D)는 전화효소에 대해 침묵되며 대조군과 동일한 조건하에서 재배되고 튀겨질 때 SE를 나타내지 않는다.
도 2. 새로운 감자 조각에 대한 심각한(A) 및 온화한(B) 지브라 칩 증상. 덩이줄기 과육 전체에서 조직 괴사의 심각한 증상은 수확 35 및 28일 전(dbh) 감염된 덩이줄기 상에서 명백하다. 21 dbh에서 온화하게 감염된 덩이줄기 조각에서 괴사가 덜 명백하다. 14 및 7 dbh 덩이줄기 상에서 적은 괴사가 보이거나 괴사가 보이지 않는다.
도 3. '레인저' 대조군(왼쪽) 및 수확 35일 전에 전화효소-사일런스드 계통 1632-1(오른쪽); (B) 28 dbh; (C) 21 dbh; (D) 14 dbh; 및 (E) 7 dbh로부터의 칩 샘플. 칩은 6-8 덩이줄기의 조각으로 제조되고 3분 동안 375℉에서 튀겨진다. 최종 2% 수분 함량을 얻었다.
도 4. 폴리페놀 옥시다아제(Ppo)를 사일런싱하면 지브라 칩 감염 덩이줄기의 산화성 흑화를 제거한다. 감염되지 않은 cv. '아틀란틱' 덩이줄기(A)에서 폴리페놀 옥시다아제 작용은 무색 카테콜 기질을 절단된 덩이줄기 표면상의 어두운 침전물로 전환시킨다. 미감염(B) 또는 감염(C) Ppo-사일런스드 덩이줄기는 흑화를 나타내지 않는다. 3개의 다른 덩이줄기가 도시된다. 0.4M 카테콜 용액을 절단된 덩이줄기 표면 상에 도포 15분 후 사진을 찍었다.
도 5. 노던은 전화효소(A) 및 Ppo(B)의 사일런싱을 증명한다. 브롬화에티듐은 로딩 참조를 위해 각 노던 아래에 RNA 겔을 염색하였다. 전체 RNA(20㎍)를 온실 재배 덩이줄기로부터 분리하였다. 유전자 내 사건 및 대조군 및 Inv(A) 및 Ppo(B) 프로브와 혼성화된 덩이줄기 조직.

전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 복사본(파일명: JRSI00202US_ST25.txt, 저장일: 2013, 11월8일, 파일 크기 20 킬로바이트).

정의

본 발명에 사용된 대로, 이런 상세한 설명 및 청구항에서 사용된 동사 "포함하다" 및 이의 활용형은 단어 뒤의 항목이 포함되나, 구체적으로 언급되지 않은 항목이 배제되지 않는다는 것을 의미하는 비 제한적인 의미로 사용된다.

용어 "하나"(a 또는 an)는 하나 이상의 실체를 의미하는데; 예를 들어, "하나의 유전자"는 하나 이상의 유전자 또는 적어도 하나의 유전자를 의미한다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 발명에서 서로 교환해서 사용된다. 또한, 부정관사 "하나"(a 또는 an)에 의한 "하나의 요소"에 대한 언급은 내용이 분명하게 하나의 요소 및 요소들 중 단지 하나가 존재한다는 것을 요구하지 않는 한 요소들의 하나 이상이 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "식물"은 식물계에 속하는 임의의 살아있는 유기체를 의미한다(즉, 식물계에서 임의의 속/종). 이것은 나무, 약초, 관목, 풀, 가지, 고사리, 이끼 및 녹조류와 같은 흔한 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어는 외떡잎식물로도 불리는 단자엽식물 및 쌍떡잎식물로도 불리는 쌍자엽식물 모두를 의미한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 식물은 S. tuberosum S.　 stenotomum, S.　phureja, S.　 goniocalyx, S.　 ajanhuiri. S.　 chaucha, S.　 juzepczukii 및 S.　curtilobum와 같은 감자(solanum) 속의 종들이다. 일부 실시태양에서, 식물은 S. tuberosum 종의 감자 변형이다.

본 발명에 사용된 용어 "식물 일부"는 새싹, 뿌리, 자루, 액아, 씨, 턱잎, 잎, 꽃잎, 꽃, 배주, 포엽, 가지, 잎자루, 마디, 마디 사이, 나무껍질, 죽순대, 어린 나무, 뿌리줄기, 엽상체, 잎, 꽃가루, 수술, 종서 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 식물의 임의의 일부를 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "유전자원"(germplasm)은 유기체의 유전성 품질의 물리적 기초를 포함하는 특이적 분자 및 화학적 구성을 가진 유전 재료를 의미한다.

본 발명에 사용된 문구 "로부터 유래된"은 기원 또는 출처를 의미하며, 자연적으로 발생하고, 재조합, 미정제 또는 정제된 분자를 포함할 수 있다. 기원 또는 출처로부터 유래된 핵산 또는 아미노산은 본 발명의 다른 곳에서 정의된 모든 종류의 뉴클레오티드 변화 또는 단백질 변형을 가질 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "자손"은 하나 이상의 부모 식물 또는 이의 자손으로부터의 무성 또는 유성 번식에 의한 자손으로서 얻은 임의의 식물을 의미한다. 예를 들어 자손 식물은 부모 식물의 클로닝 또는 자가생식에 의해 또는 두 부모 식물을 교배함으로써 얻을 수 있으며 자가생식뿐만 아니라 F1 또는 F2 또는 추가 세대 포함한다. F1은 부모로부터 생산된 제 1 세대 자손이며 이의 적어도 하나는 형질의 제공자로서 첫 번째로 사용되는 반면, 제 2 세대(F2) 또는 후속 세대(F3, F4 등)의 자손은 F1's, F2's 등의 자가생식으로부터 생산된 표본이다. F1은 2개의 실제 순계(true-breeding) 부모(순계는 형질에 대해 동형이다) 사이의 교배로부터의 잡종인 반면, F2는 상기 F1 잡종의 자가-수분 작용으로부터 얻은 자손일 수 있다(주로 자손이다).

본 발명에 사용된 용어 "교배하다", "교배", "교배 수분작용" 또는 "이종교배"는 한 식물상의 한 꽃의 꽃가루가 다른 식물상의 꽃의 배주(암술머리)에 (인공적으로 또는 자연적으로) 접촉되는 과정을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "재배 변종"은 원예학 또는 농경학 기술에 의해 생산된 식물의 변종, 균주 또는 품종을 의미하며 일반적으로 야생 개체군에서는 발견되지 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "식물 조직"은 식물의 임의의 일부를 의미한다. 식물 기관의 예들은 잎, 자루, 뿌리, 덩이줄기, 씨, 가지, 죽순대, 옹이, 엽액, 꽃, 꽃가루, 수술, 암술, 꽃잎, 꽃자루, 줄기, 암술머리, 암술대, 포엽, 과일, 수간, 심피, 꽃받침, 꽃밥, 배주, 작은 꽃자루, 침상엽, 구과, 뿌리줄기, 포복지, 새싹, 과피, 배젖, 태좌, 액과, 수술, 잎집을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용된 "식물 프로모터"는 기원이 식물 세포이던 아니던 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

본 발명에 사용된 "엄격한 잡종화 조건"은 50% 포름아마이드의 존재하에서 42℃에서 밤새 잡종화(12-24hrs) 후, 세척 또는 약 12 내지 약 24시간 동안 약 65℃에서 5xSSC 후, 약 1시간 동안 65℃에서 0.1xSSC에서 세척을 포함한다.

본 발명에 사용된 "구조성 프로모터"는 대부분의 조건하에서 및/또는 대부분의 발생 단계에서 활성인 프로모터이다. 형질전환 세포 또는 식물을 선택하는데 사용된 높은 수준의 단백질 생산; 쉬운 탐지 및 정량화를 가능하게 하는 리포터 단백질 또는 스코어러블 마커(scorable marker)의 높은 수준의 발현; 조절 전사 시스템의 일부인 전사 인자의 높은 수준의 생산; 식물에서 편재하는 활성을 필요로 하는 화합물의 생산; 및 식물 성장의 모든 단계 동안 필요로 하는 화합물의 생산과 같은 식물 생명공학에서 사용된 발현 벡터에서 구조성 프로모터를 사용하는 여러 이점이 존재한다. 비 제한적인 예시적 구조성 프로모터는 CaMV 35S 프로모터, 오핀(opine) 프로모터, 편재 프로모터, 액틴 프로모터, 알코올 분해효소 프로모터 등을 포함한다.

본 발명에 사용된 "비-구조성 프로모터"는 특정 조건하에서, 특정 형태의 세포에서 및/또는 특정 발생 단계 동안 활성인 프로모터이다. 예를 들어, 조직 특이적, 조직 우선, 세포 특이적 형태, 세포 우선 형태, 유도성 프로모터 및 발생 제어하에서 프로모터는 비-구조성 프로모터이다. 발생 제어하의 프로모터의 예들은 줄기, 잎, 뿌리 또는 씨와 같은 특정 조직에서 우선적으로 전사를 개시하는 프로모터를 포함한다.

본 발명에 사용된 "유도성" 또는 "억제성" 프로모터는 화학적 또는 환경적 인자 제어하에 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 의한 전사를 일으킬 수 있는 환경 조건의 예들은 혐기성 조건 또는 특정 화학물질 또는 빛의 존재를 포함한다.

본 발명에 사용된 "조직 특이적" 프로모터는 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터이다. 유전자의 구조성 발현과 달리, 조직-특이적 발현은 여러 번의 상호작용 수준의 유전자 조절의 결과이다. 이와 같이, 당업계에서 때때로 특정 조직에서 전이유전자의 효과적이고 신뢰할만한 발현의 성취하기 위해 균질한 또는 밀접하게 연관된 식물 종으로부터의 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 이것이 과학 및 특허 문헌에서 발견된 특정 식물 및 조직으로부터 분리된 다량의 조직-특이적 프로모터에 대한 주요 이유들 중 하나이다. 조직 특이적 프로모터의 비 제한적인 예들은 덩이줄기-특이적 프로모터, 잎-특이적 프로모터, 뿌리-특이적 프로모터, 꽃-특이적 프로모터, 씨-특이적 프로모터, 분열 조직-특이적 프로모터 등을 포함한다.

본 발명에 사용된 "세포 형태 특이적" 프로모터는 하나 이상의 기관에서 특정 세포 형태에서 발현을 주로 일으키는 프로모터이다.

본 발명에 사용된 용어 "변형"은 형태 또는 기능이 다른 유사한 배열의 개체와 구별되는 종들 내의 한 그룹의 개체로 이루어진 종들의 세부 분할을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "유전자형"은 개체 세포, 세포 배양액, 조직, 유기체(예를 들어, 식물) 또는 유기체의 그룹을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "클론"은 단일 전구체로부터 유전된 또는 유래되고 유전적으로 동일하거나 실질적으로 동일한 세포, 세포의 그룹, 일부, 조직, 유기체(예를 들어, 식물) 또는 유기체의 그룹을 의미한다. 일부 실시태양에서, 클론은 적어도 하나의 무성 단계를 포함하는 과정에서 생산된다.

본 발명에 사용된 용어 "잡종"은 하나 이상의 유전자가 다른 부모들 사이의 교배로부터 얻은 임의의 개체 세포, 조직 또는 식물을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "근친 교배" 또는 "근교계"는 상대적으로 순종 균주를 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "개체군"은 공통 유전자 기원을 공유하는 식물의 유전적으로 동종 또는 이종 개체군을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "변종" 또는 "재배 변종"은 구조적 특징과 성능에 의해 동일한 종들 내에서 다른 변종과 동일할 수 있는 유사한 식물의 그룹을 의미한다. 본 발명에 사용된 용어 "변종"은 1972년 11월10일, 1978년 10월23일 및 1991년 3월19일 제네바에서 개정된 1961년 12월2일의 식물신품종 보호에 관한 국제협약(International Convention for the Protection of New Varieties of Plants)(UPOV 조약)에서 해당 정의와 동일한 의미를 가진다. 따라서, "변종"은 단일 식물 분류군 내의 식물 그룹화를 의미하며, 번식자의 권리의 동의에 대한 조건이 완전히 충족되는지와 상관없이, 이런 그룹화는 i) 소정의 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 얻은 특징들의 발현에 정의될 수 있고, ii) 상기 특징들 중 적어도 하나의 발현에 의한 임의의 다른 식물 그룹화와 구별될 수 있고 iii) 변하지 않고 전파되기 위한 이의 적합성에 관해 한 개체군으로 고려될 수 있다.

본 발명에 사용된 문구 "당 말단"은 덩이줄기의 한 말단, 주로 포복지 말단에 높은 수준으로 당 축적으로부터 얻은 덩이줄기의 생리학적 질병을 의미한다. 당 말단을 가진 덩이줄기로 만든 프렌치 프라이는 검은 갈색 말단, 바람직하지 않은 처리 결함을 가진다.

본 발명에 사용된 용어 "지브라 칩"은 감자 이(potato psyllid, Bactericera cockerelli)에 의해 전달된 병원균 Candidatus Liberibacter solanacearum에 의해 유발된 감자의 질병을 의미한다. 지브라 칩-감염 감자로 만든 칩 및 프렌치 프라이는 주로 이들을 팔 수 없게 만드는 엇갈려 생기는 갈색 및 연한 갈색의 패턴을 가진다.

감자

전세계 약 5천 개의 감자 변종이 있다. 이들 중 3천 개는 주로 페루, 볼리비아, 에콰도르, 칠레 및 콜롬비아의 안데스 산맥에서만 발견된다. 이들은 분류학파에 따라 8개 또는 9개 종에 속한다. 5천 개의 배양된 변종과 별개로, 약 200개의 야생종 및 아종이 있으며, 이들의 대부분은 배양된 변종과 이종 교배될 수 있고, 이는 특정 페스트와 질병에 대한 저항력을 야생종의 유전자 풀로부터 배양된 감자 종의 유전자 풀에 옮기도록 반복적으로 실행되었다.

전세계에서 재배된 주요 종은 솔라넘 튜버로섬(Solanum tuberosum)(48개 염색체를 가진 4배체)이며 이 종의 현대 변종이 가장 널리 재배된다. 또한 4개의 2배체 종(24개 염색체를 가짐)이 존재한다: 솔라넘 스테노토맘(S.　 stenotomum), 솔라넘 프레어(S.　 phureja), 솔라넘 고니오칼릭스(S.　 goniocalyx) 및 솔라넘 아잔후이리(S.　 ajanhuiri). 2개의 3배체 종(36개 염색체를 가짐)이 존재한다: 솔라넘 차우차(S.　 chaucha) 및 솔라넘 주젭페주키(S.　 juzepczukii). 1개의 5배체 배양종(60개 염색체를 가짐)이 존재한다: 솔라넘 쿠르틸로범(S.　 curtilobum). 솔라넘 튜버로섬의 두 주요 아종이 존재한다: 안디지나 또는 안데스 산맥 및 튜버로섬 또는 칠레. 안데스 산맥 감자는 이것이 비롯된 산악 적도 및 극지방에서 일반적인 낮이 짧은 조건에 적합하다. 칠레 다도해에서 산출되는 칠레 감자는 남부 칠레의 높은 고도 지방에서 일반적인 낮이 긴 조건에 적합하다.

감자는 기후가 선선하고 식물이 토양으로부터 충분한 물을 흡수하여 녹말 덩이줄기를 형성하기에 충분히 습기가 있는 한 풍부하게 생산되고 다양한 기후에 쉽게 적응한다. 감자는 저장 상태로 잘 보존되지 않고 저장된 덩이줄기에 제공되는 곰팡이에 취약하여 빠르게 부패하게 한다. 반대로, 곡식은 부패의 큰 위험 없이 수년 동안 저장될 수 있다.

감자는 비타민과 미네랄뿐만 아니라 카로테노이드와 천연 페놀과 같은 파이토케미컬의 종합체를 함유한다. 클로로겐산은 최대 90%의 감자 덩이줄기 천연 페놀을 구성한다. 감자에서 발견된 다른 것은 4-O-카페오일퀸산(크립토-클로로겐산), 5-O-카페오일퀸산(네오-클로로겐산), 3,4-다이카페오일퀸산 및 3,5-다이카페오일퀸산이다. 껍질을 가진 중간 크기 150g(5.3oz) 감자는 27mg의 비타민 C(일일 권장량(DV)의 45%), 620mg의 칼륨(DV의 18%), 0.2mg 비타민 B6(DV의 10%) 및 소량의 타아민, 리보플라빈, 폴레이트, 니아신, 마그네슘, 인, 철 및 아연을 제공한다. 껍질을 가진 감자의 섬유 함유량(2g)은 많은 통곡물빵, 파스타 및 시리얼의 섬유 함유량과 동일하다.

영양 면에서, 감자는 탄수화물 함유량(중간 감자에서 대략 26그램) 때문에 가장 유명하다. 이런 탄수화물의 주요 형태는 전분이다. 적지만 상당한 비율의 이런 전분은 위와 소장에서 효소에 의한 소화에 대해 저항력이 있어서 대장에 필수적으로 손상 없이 도달한다. 이런 저항 전분은 섬유와 유사한 생리학적 효과 및 건강 유익을 가진 것으로 생각된다: 감자는 벌크(bulk)를 제공하며, 결장암에 대한 보호를 제공하며, 글루코오스 내성 및 인슐린 민감성을 개선하며, 혈장 콜레스테롤 및 트라이글리세라이드 농도를 낮추며, 포만감을 증가시키며 가능하게는 지방 저장도 감소시킨다. 감자에서 저항 전분의 양은 제조 방법에 크게 의존한다. 감자를 조리하고 냉동하면 저항 전분을 현저하게 증가시킨다. 예를 들어, 조리된 감자 전분은 약 7% 저항 전분을 함유하며, 이는 냉동시에 약 13%로 증가한다.

감자는 여러 보통의 또는 주지된 변종으로 번식되었고, 이의 각각은 특정 농업적 또는 요리용 특성을 가진다. 일반적으로, 변종은 공통적인 특성을 기준으로 황갈색, 적색, 백색, 황색(유콘으로도 불림) 및 심홍색과 같은 몇몇 주요 그룹으로 분류된다. 요리 목적을 위해서, 변종은 주로 찰성(waxiness) 면에서 기술된다. 전분이 많은 감자 또는 분질(굽기) 감자는 점질(삶기) 감자(16-18%)보다 많은 전분(20-22%)을 가진다. 차이는 아밀로오스 및 아밀로펙틴의 상대적인 비율의 변화로부터 발생할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 감자 변종은 백색 둥근 감자 변종, 적색 둥근 감자 변종 또는 황갈색 감자 변종이다.

일부 실시태양에서, 감자는 감자 유전자원의 ISO-인정 집합을 소유하는 페루, 리파에 있는 국제 감자 센터에 기탁된 변종이다. 국제 감자 지놈 시퀀싱 콘소시엄은 2009년에 감자 지놈의 초안 서열을 완성하였다는 것을 발표하였다. 감자 지놈은 12개 염색체 및 8억6천만 개 염기쌍을 함유하여 중간 크기 식물 지놈을 만든다. 현재 재배된 모든 최신 변종의 99% 이상이 남중앙 칠레의 저지에서 재배된 아종의 직계 후손이다. 일부 다른 실시태양에서, 감자는 European Cultivated Potato Database(ECPD), the Potato Association of America, the Cornell Potato Varieties List, the Canadian Registry of Potato Varieties, the UPOV potato varieties collection, The British Potato Variety Database, International Potato Center, Potato Variety Management Institute, United States Potato GenBank, North Carolina State University Potato Variety Database, Texas A&M Potato Breeding & Variety Development Program, Michigan State University Potato Breeding and Genetics Program, 및 North American Potato Variety Inventory 등에 포함된 변종이다.

본 발명을 위한 예시적 감자 변종은 레인저 러셋(Ranger Russet), 버뱅크(Burbank), 이노베이터(Innovator), 아틀란틱(Atlantic), 우마틸라 러셋(Umatilla Russet), 애디론댁 블루(Adirondack Blue), 애디론택 레드(Adirondack Red), 아가타(Agata), 아몬드(Almond), 아플라인(Apline), 알투라스(Alturas), 아만딘(amandine), 아나벨레(Annabelle), 안야(Anya), 아란 빅토리(Arran Victory), 애벌런치(Avalanche), 밤베르그(Bamberg), 반녹크 러셀(Bannock Russet), 벨레 데 폰테나이(Belle de Fontenay), BF-15, 빌드스타(Bildtstar), 빈트제(Bintje), 블레이저(Blazer), 버셋(Busset), 블루 콩고(Blue Congo), 본노테(Bonnotte), 브리티시 퀸(British Queens), 카브리타스(Cabritas), 카모타(Camota), 카넬라 러셋(Canela Russet), 카라(Cara), 카롤라(Carola), 첼리나(Chelina), 칠레오(Chiloe), 시에로(Cielo), 클라벨라 블란카(Clavela Blanca), 데시레(Desiree), 에스티마(Estima), 피안나(Fianna), 핑거링(Fingerling), 플라바(Flava), 저먼 버터볼(German Butterball), 골든 원더(Golden Wonder), 골드러시(Goldrush), 홈 가드(Home Guard), 아이리쉬 코블러(Irish Cobbler), 저지 로얄(Jersey Royal), 케네베크(Kennebec), 케르 핑크(Kerr's Pink), 케스트렐(Kestrel), 케우카 골드(Keuka Gold), 킹 에드워드(King Edward), 키플리어(Kipfler), 레이디 발포어(Lady Balfour), 랑글라데(Langlade), 린다(Linda), 마르시(Marcy), 마르폰다(Marfona), 마리스 파이퍼(Maris Piper), 마르퀴스(Marquis), 메가칩(Megachip), 모나리자(Monalisa), 니콜라(Nicola), 파차코나(Pachacona), 파이크(Pike), 핑그 아이(Pink Eye), 핑크(Pink), 피르 애플(Fir Apple), 프리무라(Primura), 라테(Ratte), 레코드(Record), 레드 라소다(Red LaSoda), 레드 놀랜드(Red Norland), 레드 폰티액(Red Pontiac), 루스터(Rooster), 러셋 노르코타아(Russet Norkotah), 셀마(Selma), 시포디(Shepody), 시에글린데(Sieglinde), 실베르톤(Silverton), 러셋(Russet), 시르코(Sirco), 스노우덴(Snowden), 스푼타(Spunta), 스토바라와(Stobrawa), 수페리어(Superior), 비발디(Vivaldi), 비텔로테(Vitelotte),, 옐로우 핀(Yellow Finn), 유콘 골드(Yukon Gold), 블루 포테이토 변종(blue potato varieties)(예를 들어, 크림 오브 더 그롭), 아이고로타(Igorota), 솔리바오(Solibao), 간자(Ganza), 엘리안(Eliane), 벨루스(BelRus), 센테니얼 러셋(Centennial Russet), 센츄리 러셋(Century Russet), 프론티어 러셋(Frontier Russet), 힐리테 러셋(Hilite Russet), 크란츠(Krantz), 렘히 러셋(Lemhi Russet), 누크색(Nooksack), 노르골드 러셋(Norgold Russet), 노르킹 러셋(Norking Russet), 러셋 누겟(Russet Nugget), 알레가니(Allegany), 비이콘 칩퍼(Beacon Chipper), 칼화이트(CalWhite), 캐스케이드(Cascade), 캐스타일(Castile), 치페타(Chipeta), 겜칩(Gemchip), 이타스카(Itasca), 아이보리 크리스프(Ivory Crisp), 카노나(Kanona), 카타딘(Katahdin), 케네벡 스토리(Kennebec Story), 라 칩퍼(La Chipper), 라모카(Lamoka), 모노나(Monona), 몬티셀로(Monticello), 노르칩(Norchip), 노르위스(Norwis), 오나웨이(Onaway), 치프테인(Chieftain), 라 루즈(La Rouge), 노르도나(NorDonna), 노르랜드(Norland), 레드 라 소다(Red La Soda), 레드 폰티액(Red Pontiac), 레드 루비(Red Ruby), 산그레(Sangre), 바이킹(Viking), 온타리오(Ontario), 파이크(Pike), 세바고(Sebago), 쉬포디(Shepody), 스노우덴(Snowden), 수페리오러(Superior), 와네타(Waneta), 화이트 펄(White Pearl), 화이트 로즈앤드(White Roseand) 및 모든 유전적으로 변형된 변종을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 더 많은 감자 변종은 Clough et al., Hort Technology, 2010, 20(1):250-256; Potato Variety Handbook, National Institute of Agricultural Botany, 2000; Chase et al., North American Potato Variety Inventory, Potato Association of America, 1988에 기술되며, 이의 각각은 전문이 참조로 포함된다.

전통적인 감자 재배는 5가지 단계로 나뉜다. 제 1 단계 동안, 새싹이 씨 감자로부터 나타나고 뿌리 성장이 시작된다. 제 2 단계 동안, 식물이 잎과 가지를 성장시킴에 따라 광합성은 시작된다. 제 3 단계에서 포복지가 줄기상에서 하부 잎 겨드랑이로부터 자라며 지면으로 아래로 자라며 포복지가 팽창함에 따라 이런 포복지 상에 새로운 덩이줄기가 자란다. 이 단계는 자주(항상은 아님) 개화와 관련이 있다. 덩이줄기 형성은 토양 온도가 80℉(26.7℃)에 도달할 때 중지된다; 따라서, 감자는 호냉성 작물로 생각된다. 덩이줄기 비대는 식물이 이의 자원의 대부분을 새롭게 형성된 덩이줄기에 쏟기 시작할 때인 제 4 단계 동안 일어난다. 이 단계에서, 여러 인자가 생산량에 중요하다: 최적 토양 수분 및 온도, 토양 영양소 이용가능성 및 균형 및 해충 공격에 대한 저항력. 최종 단계는 성숙 분열이다: 식물 캐노피는 다시 말라 죽고, 덩이줄기 껍질은 단단해지고, 이들의 당은 전분으로 전환된다.

감자는 알코올 음료, 사람 및 가축용 식품을 생산하는데 사용될 수 있다. 감자 전분은 식품 산업에서 수프와 소스의 점증제 및 접합제로서, 직물 산업에서 접착제로서, 종이와 보드의 제조용으로 사용될 수 있다. 폐기된 감자는 플라스틱 제품용 폴리락트산을 생산하는데 사용될 수 있거나 생분해성 포장용 기재로서 사용될 수 있다. 꿀과 함께 감자 껍질은 화상에 대한 민간 요법이다. 신선한 감자는 굽고, 삶거나 튀겨지고 엄청난 범위의 요리법에 사용된다: 몇몇을 예로 들면, 으깬 감자, 감자 팬케이크, 감자 만두, 두 번 구운 감자, 감자 스프, 감자 샐러드 및 감자 그라탕. 감자는 또한 전세계 레스토랑 및 패스트 푸드 체인에서 제공되는 프렌치 프라이(영국에서는 "칩") 또는 감자 크리스피(미국에서는 "칩")과 같은 스낵 푸드를 생산하는데 사용될 수 있다. 탈수 감자 플레이크는 소매 으깬 감자 제품에 사용되고, 스낵의 원료로서 사용되고 심지어 식품 보조제로서 사용된다. 다른 탈수 제품인 감자 분말은 고기 혼합물을 결합하고 고기 국물과 수프를 진하게 하도록 식품 산업에서 사용된다. 감자 전분은 밀과 옥수수 전분보다 더 높은 점성을 제공하고 더욱 맛있는 제품을 생산한다. 감자 번분은 소스와 스튜용 점증제로서 사용되고, 케이크 믹스, 반죽, 비스켓 및 아이스 크림에서 결합제로 사용된다. 동유럽과 북유럽에서, 으깬 감자는 가열되어 전분을 발효가능한 당으로 전환되어 보드카와 아쿠아비트와 같은 알코올 음료의 증류에 사용된다.

고구마

고구마(Ipomoea batatas)는 메꽃과에 속하는 쌍떡잎 식물이다. 이의 크고, 전분성이고, 단맛이 나는 덩이줄기 뿌리는 중요한 뿌리 채소이다. 어린 잎과 새싹은 때때로 덜 익은 상태로 먹는다. 대략 50개 속 및 1,000 이상의 종의 메꽃과 중에서, 감자는 제일 중요한 유일한 농작 식물이며 - 일부 다른 것은 어떤 지방에서 사용되나, 다수는 실제로 독성이 있다. 고구마는 감자(Solanum tuberosum)와 단지 먼 친척이다. 비록 부드럽고, 주황색 고구마가 북유럽 일부에서 "얌"으로 종종 잘못 불리나, 고구마는 아프리카와 아시아에서 산출되고 외떡잎 마과에 속하는 진짜 얌과 식물학적으로 전혀 다르다.

전화효소

베타-프룩토푸라노시다제로도 알려진 전화효소(Inv)(EC 3.2.1.26)는 프룩토오스와 글루코오스를 생산하는 수크오로스의 가수분해에 촉매작용을 미치는 효소이다. 전화효소와 관련이 있는 것은 설탕분해효소이다. 전화효소와 설탕분해효소는 수크로오스를 가수분해하여 수크로오스와 프룩토오스의 동일한 혼합물을 제공한다. 전화효소는 O-C(프룩토오스) 결합을 분해하는 반면, 설탕분해효소는 O-C(글루코오스) 결합을 분해한다.

감자 전화효소는 Bhaskar et al., Plant Physiology, October 2010, Vol. 154, pp. 939-948, Draffehn et al., BMC Plant Biology, 2010, 10:271, Ye et al., J. Agric . Food Chem . 2010 58:12162-12167, 및 미국 특허 No. 7094606에 기술되며, 이의 각각은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다. 추가 감자 전화효소는 등록 번호 DQ478950.1, JN661859.1, JN661860.1, AY341425.1, JN661854.1, EU622806.1, L29099.1, JN661857.1, JN661855.1, JN661858.1, JN661856.1, JN661853.1, JN661852.1, EU622807.1, X70368.1, JN661862.1, 및 JN661861.1로 진뱅크에 기탁된다. 감자 전화효소와 높은 동일성을 공유하는 서열은 등록번호 HH772321.1, HH772323.1, HH772324.1, HH772322.1, AR928219.1, BD073570.1, I61429.1, I29071.1, I64641.1, E54105.1, E16293.1, E08976.1, E09853.1, E07108.1, HH977806.1, I64644.1, I64642.1, I29074.1, 및 I29072.1로 진뱅크에 기탁된다. 당업자는 공지된 감자 전화효소 유전자를 기초로 추가 감자 전화효소 유전자를 동정하고 분리할 수 있을 것이다.

당 말단

당 말단은 감자를 가공하는데 주로 관찰된 내부 덩이줄기 질병이며 대부분 '러셋 버뱅크'와 같은 긴 덩이줄기에 영향을 미친다. 당 말단은 주로 덩이줄기의 줄기 말단 상에서, 프렌치 프라이의 한 말단의 튀기기 후 흑화로 나타난다. 당 말단은 저온 저장 감자 덩이줄기에 환원 당의 축적 현상인 저온 당화와 다르다(Dale and Bradshaw, 2003, Progress in improving processing attributes in potato. Trends Plant Sci 8: 310-312; Bhaskar et al., Suppression of the Vacuolar Invertase Gene Prevents Cold-induced Sweetening in Potato, Plant Physiology, October 2010, 154:939-948). 저온 당화는 가공 과정에서 헥소스 당의 축적에 의한 여러 재배 변종의 감자(Solanum tuberosum L.)의 덩이줄기의 저온 저장 후 덩이줄기 품질 문제이다. 이것은 전분의 수크로오스로의 분해에 의해 유발되며, 수크로오스는 액포산 전화효소에 의해 글루코오스와 프룩토오스로 분해된다. 손상된 덩이줄기의 가공 동안, 굽기와 튀기기에 필요한 고온은 환원당과 유리 아미노산 사이에 마이얄 반응을 일으켜서, 아크릴아마이드의 축적을 초래한다. 그러나, 당 말단은 포복지 부착 지역 근처의 한 말단에 축적되는 환원당의 캐러멜화에 의해 유발된 흑화를 의미한다. 당 말단은 덩이줄기 개시와 조기 비대 동안 높은 공기 및 토양 온도의 기간을 견뎌야 하는 식물과 통상적으로 관련이 있다. 임의의 이론에 한정되기를 원치 않으며, 높은 토양 온도는 덩이줄기에서 당의 전분으로의 전환을 억제하여, 손상된 조직에 환원당의 농도를 증가시킨다고 생각된다(Thompson et al. Am. J. Potato Res. 85(5): 375-386 2008). 이런 중요한 시기에 물부족은 또한 조직 사이에 당의 수송을 방해함으로써 당 말단을 악화시킬 수 있다. 재배자가 당 말단과 싸우기 위해 가져야 하는 관리 옵션은 조기 덩이줄기 비대 동안 수분 스트레스가 최소화되는 보장하고 군엽 캐노피를 빠르게 얻고 계절 동안 보존되는 환경을 생성하는 것을 포함한다. 당 말단은 농부가 고품질 작물을 성장할 가능성이 최대인 지방과 산지에서 감자를 재배하도록 강요할 수 있다.

지브라 칩

감자 재배자에게 중요한 새로운 생명에 관한 스트레스는 박테리아 Candidatus Liberobacter solanacearum에 의해 유발된 지브라 칩이다. Secor et al. (Association of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' with Zebra Chip Disease of Potato Established by Graft and Psyllid Transmission, Electron Microscopy, and PCR, Plant Diseases, 93(6):574-583), and Liefting et al., ('Candidatus Liberibacter solanacearum', associated with plants in the family Solanaceae, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(9):2274-2276) 참조. 2000년에 남 텍사스에서 처음 발견된 지브라 칩(ZC)은 미시시피 강 서부의 모든 주요 감자 생산 주로 퍼져나갔다. 지브라 칩은 또한 과테말라, 온두라스, 멕시코 및 뉴질랜드에서 주요 문제이며, 감염 식물에서 시작되는 덩이줄기의 생산량 손실과 품질 문제를 일으킨다. 현재, ZC 병원균에 대한 알려진 유전적 저항력은 없다. 재배자는 단지 질병의 매개 곤충, 감자 이(Bactericera cockerelli)를 방해하도록 살충제를 뿌릴 수 있다. ZC 병원균은 얇게 썰고 튀기자마자 감염된 덩이줄기가 어둡고 밟은 탈색의 인상적인 줄무늬 패턴을 나타내게 한다. 특징적인 줄무늬 형성은 진행된 세포 사망을 나타내는 심하게 감염된 덩이줄기 및 어떠한 눈에 보이는 세포 사망도 갖지 않는 약하게 감염된 덩이줄기에 의해 명백하다.

지브라 칩 감염 덩이줄기는 절단된 덩이줄기의 빠른 갈색화 반응에 원인이 될 수 있는 증가된 수준의 페놀 화합물과 티로신을 가진다(Navarre et al., Amer. J. Potato Res. 86:88-95 2009). 지브라 칩이 걸린 감자 덩이줄기는 증가된 수준의 다수의 페놀, 아미노산 및 방어 관련 단백질을 특징으로 한다(Wallis et al. Physiological and Molecular Plant Pathology 78 (2012) 66-72). 폴리페놀 옥시다아제(Ppo)의 사일런싱은 이전에 덩이줄기에서 감소된 증상 발현과 연관이 있기 때문에(Rommens et al. J. Agric. Food Chem. 2006, 55, 9882-9887), Ppo 사일런싱은 감염된 덩이줄기에서 ZC의 증상을 감소시킬 수 있다고 가정될 수 있다. 그러나, Ppo 사일런싱은 증가된 질병 민감성과 관련이 있을 수 있다는 가정이 있기 때문에(Thipyapong et al. Planta 2004, 220, 105-117), Ppo 사일런싱은 ZC의 증상과 심각성을 단지 악화시킬 수 있다. 본 발명은 ZC-감염 덩이줄기에서 증가된 Ppo 반응을 확인하나 ZC에 감염된 프라이드 감자에서 카라멜화 색을 감소시키는 능력을 나타내지 않는다. 또한, Ppo 사일런스드 라인 대 비-Ppo 사일런스드 라인에서 감소된 증상 발현을 나타내는 것이 불가능하였다. 상기한 참조문헌의 각각은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다.

칸디다투스 리베리박터(Candidatus Liberibacter)는 근생균과의 그람-음성 박테리아의 속이다. 용어 칸디다투스는 배양액에 이런 박테리아를 유지하는 것이 가능하다고 입증되지 않은 것을 나타내는데 사용된다. 리베리박터의 탐지는 특정 프라이머를 가진 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭을 기초로 한다. 속의 일원은 대부분 이에 의해 전달되는 식물 병원균이다. 속은 최초에 리베로박터로 불렸다. 칸디다투스 리베리박터의 비 제한적인 종은 리베리박터 아프리카누스, 리베리박터 아메리카누스, 리베리박터 아시아티쿠스, 리베리박터 에로패우스, 리베리박터 피실라우로우스 및 리베리박터 솔라나세아럼을 포함한다.

'칸디다투스 리베리박터 솔라나세아럼'의 완전한 지놈 서열이 개시되었다(Lin et al., The Complete Genome Sequence of 'Candidatus Liberibacter solanacearum', the Bacterium Associated with Potato Zebra Chip Disease, PLOS One, 201, 6(4):e19135). 사전 전달 시험은 B. cokerelli은 'Ca. L. solanacearum'의 벡터라는 것을 강하게 암시하였다. 이는 박테리아를 획득할 수 있으나 전달이 필요한 것으로 확인된다는 것이 입증되었다. 또한, 질병 역학의 여러 다른 양태는 연구되어야 할 상태이다(예를 들어, 씨 또는 가지를 통한 전달). 긴 거리에 걸쳐, 감염된 식물과 이의 무역이 박테리아를 확산시킬 수 있다. 'Ca. L. solanacearum'은 다른 이 종, B. trigonica 및 T. apicalis과 공동으로 발견되었고, 또한 다른 병원균(예를 들어, Aster yellows phytoplasma , Spiroplasma citri)과 혼합된 감염 상태로 발견되었다.

'칸디다투스 리베리박터 솔라나세아럼'의 존재 또는 부존재는, 예를 들어, 감자 덩이줄기에서 지브라 칩 증상을 관찰함으로써 또는 통상적인 또는 실시간 PCR과 같은 뉴클레오티드 잡종화를 기초로 한 방법에 의하는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 탐지될 수 있다(Crosslin et al., "Detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in the Potato Psyllid, Bactericera cockerelli (Sulc), by Conventional and Real-Time PCR, Southwestern Entomologist, 36(2):125-135, 2011). 다른 방법은 침지 및 응집 테스트, 면역황금표지법, 면역전자현미경법, ELISA(예를 들어, 측면 흐름 테스트 또는 DAS-ELISA), 웨스턴 블롯, RIA 및/또는 도트 블롯 테스트 및 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

방법

본 방법은 프렌치 프라이 또는 칩과 같은 감자 제품에서 당 말단이 낮게 발생하는 감자 덩이줄기의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 지브라 칩 병원균에 약하게 감염되었으나 더 적은 증상을 가진, 예를 들어, 낮은 역가의 병원균의 존재에도 불구하고, 튀긴 후 탈색 전개가 적은 감자 제품을 제조하는 방법을 제공한다.

감자 제품에서 당 말단의 발생은 아래 실시예 1에 기술된 방법과 같이, 당업자에게 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시태양에서, 테스트될 감자 덩이줄기로 제조된 감자 제품의 색은 당 말단의 지표로서 사용되며 감자 제품을 위한 USDA 먼셀 컬러 차트와 같은 컬러 차트의 도움으로 대조군 감자 덩이줄기로 제조된 감자 제품에 대해 측정된다. 적절한 대조군 감자 덩이줄기는 붕괴되지 않은 전화효소를 가진 임의의 상응하는 감자 변종일 수 있는 반면 대조군 감자 덩이줄기는 테스트될 감자 덩이줄기와 동일한 조건하에서 재배, 수확 및 처리되었다. 일부 실시태양에서, 당 말단 표현형을 가진 본 발명의 감자 덩이줄기로 제조된 감자 제품의 백분율은 대조군 감자 덩이줄기의 백분율보다 현저하게 낮다. 예를 들어, 당 말단 표현형을 가진 본 발명의 감자 덩이줄기로 제조된 감자 제품의 백분율은 약 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30%이다.

감자 제품에서 지브라 칩(ZC) 병원균의 증상은 아래 실시예 2에 기술된 방법과 같이, 당업자에게 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시태양에서, ZC 심각성의 시각적 판단(즉 덩이줄기 과육의 괴저 병반)은 식물이 병원균으로 처리된 후 덩이줄기에 대해 이루어질 수 있다. 증상 심각성의 평가 동안, 리베리박터의 존재 또는 부존재에 대한 PCR 확인을 위해 덩이줄기 샘플을 채취하였다. 식물이 리베리박터-양성 이에 더 오랫동안 노출되면 ZC의 존재는 크게 더 어두운 칩과 상관이 있다. 일부 실시태양에서, 프라이드 제품의 경우, 제품은 비교 전에 제품에 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 최종 수분을 얻기 위해 약 300F, 350F, 400F 또는 450F에서 약 1, 2, 3, 4, 5분 이상 동안 오일에서 튀겨질 수 있다. 일부 실시태양에서, 제품의 색 전개는 시각 관찰로 검사하며 애그트론 수치(Agtron readings)로 나타난다. 더 높은 애그트론 수치는 더 밝은 빛과 관련이 있다. 붕괴된 전화효소 유전자를 가진 감자 덩이줄기로 제조된 제품은 대조군 감자 덩이줄기로 제조된 제품과 비교하여 더 밝은 색을 가지며, 덜 심각한 증상을 나타낸다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 감자 식물에서 전화효소 유전자/효소 활성을 붕괴하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 전화효소는 액포 전화효소이다. 일부 실시태양에서, 전화효소 유전자/효소 활성은 적어도 감자 덩이줄기에서 붕괴된다. 일부 실시태양에서, 전화효소 유전자/효소 활성은 감자 덩이줄기에서만 붕괴된다. 본 발명에 사용된 용어 "붕괴된", "붕괴하는" 또는 "붕괴"는 감자에서 액포 전화효소 활성이 대조군 식물에서 전화효소 활성과 비교하여 낮아지고, 감소되거나 심지어 완전히 없어진 방식으로 변형되는 것을 의미한다.

효소의 활성을 붕괴하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이런 방법은 돌연변이(예를 들어, 화학적 돌연변이, 복사에너지 돌연변이, 트랜스포존 돌연변이, 삽입 돌연변이, 표식인자 돌연변이, 위치-지정 돌연변이, 및 천연 돌연변이), 낙-아웃/낙-인, 안티센스 및 RNA 간섭을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다양한 형태의 돌연변이가 붕괴된 액포 전화효소 활성을 가진 감자 식물을 생산하고 분리하는데 사용될 수 있다. 이들은 위치-지정, 무작위 지점 돌연변이, 상동 재조합(DNA 셔플링), 주형을 포함하는 우라실을 사용하는 돌연변이, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이, 간격 이중 DNA를 사용하는 돌연변이 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 적절한 방법은 지점 불일치 복구, 복구-결핍 숙주 균주를 사용하는 돌연변이, 제한-선택 및 제한-정화, 결실 돌연변이, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이, 이중가닥 파괴 복구 등을 포함한다. 예를 들어, 키메릭 구조체를 필요로 하는 돌연변이 또한 본 발명에 포함된다. 한 실시태양에서, 돌연변이는 자연 발생 분자 또는 변형 또는 돌연변이 자연 발생 분자의 공지된 정보, 예를 들어, 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 결정 구조 등에 의해 안내될 수 있다. 물질, 프로토콜과 같은 식물의 돌연변이의 더 많은 정보에 대해, (전문이 본 발명에 참조로 포함된 Principles of plant genetics and breeding, Wiley-Blackwell, 2007, ISBN 1405136464, 9781405136464) 참조.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 RNA 간섭을 위한 뉴클레오티드 서열, 안티센스 올리고뉴클레오티드, microRNA 및/또는 입체적-차단 올리고뉴클레오티드와 같은 하나 이상의 억제성 뉴클레오티드를 사용하여 감자 식물에서 내인성 전화효소 유전자의 활성을 붕괴시키는 단계를 포함한다(Kole et al., RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides, Drug Discovery, 2012, 11:125-140; Ossowski et al., Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs, The Plant Journal, 2008, 53(4):674-690; Wang et al., Application of gene silencing in plants, Current Opinion in Plant Biology, 2002, 5(2):146-150; Vaucheret et al., Post-transcriptional gene silencing in plants, Journal of Cell Science, 2001, 114:3083-3091; Stam et al., Review Article: The Silence of Genes in Transgenic Plants, annals of Botany, 79(1):3-12; Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis, The Plant Cell, 2006, 18(5):1121-1133; David Allis et al., Epigenetics, CSHL Press, 2007, ISBN 0879697245, 978087969724; Sohail et al., Gene silencing by RNA interference: technology and application, CRC Press, 2005, ISBN 0849321417, 9780849321412; Engelke et al., RAN Interference, Academic Press, 2005, ISBN 0121827976, 9780121827977; and Doran et al., RNA Interference: Methods for Plants and Animals, CABI, 2009, ISBN 1845934105, 9781845934101 참조, 이의 각각은 실제로는 전문이 참조로 본 발명에 포함된다).

억제성 뉴클레오티드 서열은 구조성 프로모터, 비-구조성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 세포 형태 특이적 프로모터와 같은 식물 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

RNA 간섭(RANi)은 사일런스드 유전자에 대해 서열이 상동인 이중-가닥 RNA(dsRNA)에 의해 개시된, 동물과 식물에서 서열-특이적, 전사-후 유전자 사일런싱 또는 전사 유전자 사일런싱의 과정이다. 본 발명에서 유용한 바람직한 RNA 효과기 분자는 임의의 숙주 폴리뉴클레오티드 서열과 서열이 충분히 구별되어야 하며 이를 위해 기능은 본 발명의 방법 중 임의의 것이 실행된 후 방해되지 않는다. 컴퓨터 알고리즘은 RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열 및 숙주, 필수, 정상 서열 사이에 상동성의 필수적 결여를 정의하는데 사용될 수 있다.

용어 "dsRNA" 또는 "dsRNA 분자" 또는 "이중-가닥 RNA 효과기 분자"는 이중-가닥 형상인 적어도 약 19개 이상 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 리보핵산 분자를 의미한다. 이중-가닥 RNA 효과기 분자는 2개의 개별 RNA 가닥으로 형성된 듀플렉스 이중-가닥 RNA일 수 있거나 적어도 부분적으로 이중-가닥 헤어핀 형상(즉, 헤어핀 dsRNA 또는 스템-루프 dsRNA)을 가질 수 있는 자가-상보성의 영역을 가진 단일 RNA 가닥일 수 있다. 다양한 실시태양에서, dsRNA는 전적으로 리보뉴클레오티드로 구성되거나 RNA/DNA 잡종과 같은 리보뉴클레오티드 및 디옥시뉴클레오티드의 혼합물로 구성된다. dsRNA는 자가-상보성의 영역들을 가진 단일 분자일 수 있어서 분자의 한 단편에 있는 뉴클레오티드는 분자의 다른 단편에 있는 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룬다. 한 양태에서, 자가-상보성의 영역들은 분자의 다른 부분에 대한 상보성이 없어서 단일 가닥으로 존재하는 적어도 약 3-4 뉴클레오티드 또는 약 5, 6, 7, 9 내지 15개 뉴클레오티드 이상의 영역(즉, "루프 영역")에 의해 연결된다. 이런 분자는 부분적으로 이중-가닥 스템-루프 구조와 선택적으로 짧은 단일 가닥 5' 및/또는 3' 말단을 가질 것이다. 헤어핀 dsRNA의 자가-상보성의 영역 또는 듀플렉스 dsRNA의 이중-가닥 영역은 효과기 서열과 효과기 보체를 포함할 것이다(예를 들어, 헤어핀 dsRNA에서 단일-가닥 루프 영역으로 연결). 효과기 서열 또는 효과기 가닥은 RISC에 포함되거나 RISC와 결합된 이중-가닥 영역 또는 듀플렉스의 가닥이다. 한 양태에서, 이중-가닥 RNA 효과기 분자는 전화효소 유전자의 RNA에 대한 역보체 또는 반대 가닥 복제 중간체인 적어도 19개 연속 뉴클레오티드 효과기 서열, 바람직하게는 19 내지 29, 19 내지 27 또는 19 내지 21개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 것이다.

한 실시태양에서, 상기 이중-가닥 RNA 효과기 분자는 하나 이상의 이중-가닥 RNA 효과기 분자를 포함하는 발현 구조체에 감자 식물, 식물 조직 또는 식물 세포를 제공함으로써 제공된다. 한 실시태양에서, 발현 구조체는 감자의 전화효소 유전자로부터 유래된 이중-가닥 RNA를 포함한다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 dsRNA 효과기 분자는 "헤어핀 dsRNA", "dsRNA 헤어핀", "짧은-헤어핀 RNA" 또는 "shRNA", 즉, 대략 400 내지 500개 미만의 뉴클레오티드(nt) 또는 100 내지 200개 미만의 nt의 RNA 분자이며, 적어도 15 내지 100개 뉴클레오티드(예를 들어, 17 내지 50nt, 19 내지 29nt)의 적어도 하나의 직선은 동일한 RNA 분자(단일 RNA 가닥) 상에 위치한 상보적 서열과 염기쌍을 이루며 상기 서열 및 상보성 서열은 염기 상보성의 2개 영역에 의해 형성된 스템 구조 위에 단일-가닥 루프를 형성하는 적어도 약 4 내지 7개 뉴클레오티드(또는 약 9 내지 약 15개 nt, 약 15 내지 약 100개 nt, 약 100 내지 약 1000개 nt)의 쌍을 이루지 않은 영역에 의해 분리된다. shRNA 분자는 억제될 표적 서열에 상동성이며 상보적인 약 17 내지 약 500개 bp; 약 17 내지 약 50개 bp, 약 40 내지 약 100개 bp; 약 18 내지 약 40개 bp; 또는 약 19 내지 약 29개 bp의 이중-가닥 스템 영역; 및 염기 상보성의 2개 영역에 의해 형성된 스템 구조 위에 단일-가닥 루프를 형성하는 적어도 약 4 내지 7개 뉴클레오티드, 또는 약 9 내지 약 15개 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 100개 nt, 약 250-500bp, 약 100 내지 약 1000개 nt의 쌍을 이루지 않은 루프 영역을 포함하는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함한다. 그러나, "루프 영역" 또는 "루프 서열"을 포함하는 것은 엄격하게 필수적인 것으로 인식되지 않을 것인데 이는 역보체가 바로 이어지는 서열을 포함하는 RNA 분자는 관련 없는 "스터퍼(stuffer)" 서열에 의해 분리되지 않을 때에도 스템-루프 형상을 갖게 될 것이기 때문이다.

하나 이상의 이중-가닥 RAN 효과기 분자로 전사될 수 있는 DNA 서열을 포함하는 본 발명의 발현 구조체는 감자 식물로 변형될 수 있고, 변형된 식물은 붕괴된 전화효소 활성을 가진다. dsRNA 효과기 분자에 의해 억제될 표적 서열은 암호화 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 RNAi 구조체는 하나 이상의 역방향 반복체를 포함한다. 역방향 반복체는 감자 식물에서 간섭 RNA 분자로 전사될 수 있다. 일부 실시태양에서, 전사된 간섭 RNA 분자는 프로모터 영역, 암호화 영역, 인트론, 감자에서 전화효소 유전자의 5' UTR 영역 및/또는 3' UTR 영역을 표적화할 수 있다.

일부 실시태양에서, 역방향 반복체는 센스 가닥 및 안티-센스 가닥을 포함한다. 일부 실시태양에서, 센스 가닥 및 안티-센스 가닥은 서로 완전히 상보적이다. 일부 실시태양에서, 센스 가닥 및 안티-센스 가닥은 전장에 대해 서로 완전히 상보적이지 않으나, 적어도 부분적으로 상보적이다. 일부 실시태양에서, 센스 가닥은 감자에서 전화효소 유전자에 대해 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 이상을 공유한다. 일부 실시태양에서, 센스 가닥은 전화효소 유전자의 +53 내지 +733에 상응하는 단편(프라이머 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 19에 의해 증폭될 수 있다)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 안티-센스 가닥은 전화효소 유전자의 +552 내지 +49에 상응하는 단편(프라이머 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 20에 의해 증폭될 수 있다)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 센스 가닥 및/또는 안티-센스 가닥은 전화효소 유전자의 673-1168, 1310-1818 또는 1845-2351에 상응하는 단편을 포함한다.

일부 실시태양에서, 전화효소 활성은 감자 덩이줄기에서 적어도 방해된다. 일부 실시태양에서, 전화효소 활성은 단지 감자 덩이줄기에서 또는 주로 감자 덩이줄기에서 방해된다. 덩이줄기-특이적 방해를 얻기 위해서, 본 발명의 전화효소 사일런싱 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 덩이줄기-특이적 프로모터에 의해 운반될 수 있다. 덩이줄기-특이적 프로모터의 비-제한적인 예들은 Ye et al., 2010(예를 들어, SEQ ID NO: 6과 같은 ADP 글루코오스 피로포스포릴라제(AGP) 유전자 또는 이의 기능성 변형체, 단편과 결합된 프로모터), Twell et al.,(Plant Molecular Biology, 9:365-375 (1987), S. Rosahl et al., ("The 5' Flanking DNA of a patatin gene directs tuber specific expression of a chimaeric gene potato", "Organ-Specific Gene Expression in Potato: Isolation and Characterization of Tuber-Specific cDNA Sequences", Molecular Gen Genet, (1986) 202: pp. 368-373), 및 미국특허 Nos. 5436393(예를 들어, 솔라넘 튜버로섬 또는 이의 기능성 변형체, 단편으로부터 유래된 파타틴 유전자의 B33 프로모터 서열), 6184443(예를 들어, 감자 α-아밀라제 유전자 또는 이의 기능성 변형체, 단편의 프로모터 서열)에 기술된 것들을 포함하며, 이의 각각은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 자연 돌연변이 전화효소 유전자를 가진 감자 식물을 스크리닝함으로써 전화효소 활성을 붕괴시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 감자 식물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 돌연변이될 수 있고 돌연변이된 전화효소 유전자를 가진 감자 식물은 확인되고 분리될 수 있다.

일부 실시태양에서, 전화효소가 붕괴된 감자 식물은 하나 이상의 농업적으로 중요한 형질을 가진다. 본 발명에 사용된 대로, "농경학적으로 중요한 형질"은 인간 사용에 유용하거나 유리한 식물 또는 식물 부분에 임의의 표현형을 포함한다. 농경학적으로 중요한 형질의 예들은 증가된 바이오매스 생산, 특정 바이오연료의 생산, 증가된 식품 생산, 개선된 식품 품질, 증가된 씨 오일 함유량 등을 초래하는 형질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 농경학적으로 중요한 형질의 추가 예들은 페스트 저항력, 왕성한 생장력, 성장 시간(수확 시간), 증가된 영양소 함유량, 새로운 성장 패턴, 향료 또는 색, 염분, 열, 가뭄 및 추위 내성 등을 포함한다. 일부 실시태양에서, 감자 식물의 농업적으로 중요한 형질은 적응성, 요리 후 흑색화, 액과, 요리 형태, 요리된 질감, 파삭함 적절성, 휴면 기간, 가뭄 저항력, 건물 함유량, 조기 수확율 가능성, 효소 갈색화, 사마귀 종에 대한 산지 면역성, 꽃 색, 꽃 주기, 군잎 덮개, 프렌치 프라이 적합성, 서리 저항력, 튀김 색, 성장 갈라짐, 성장 습관, 속 빈 응어리 경향, 내부 녹균 지점, 밝은 새싹 색, 성숙도, 꽃가루 번식력, 역병 R 유전자, 주요 덩이줄기 과육 색, 단백질 함량, 비대화 속도, 진딧물에 대한 저항력, 세균성 무름병(Erwinia spp.)에 대한 저항력, 세균성 입고병(Ralstonia solanacearum)에 대한 저항력, 탄저병(Erwinia spp.)에 대한 저항력, 더뎅이병(Streptomyces scabies)에 대한 저항력, 건식(Fusarium coeruleum)에 대한 저항력, 겹무늬병(Alternaria solani)에 대한 저항력, 외부 손상에 대한 저항력, 시들음병(Fusarium oxysporum)에 대한 저항력, 괴저(Phoma foveata)에 대한 저항력, 감자씨스트선충(Globodera pallid)에 대한 저항력, 감자씨스트선충(Globodera rostochiensis)에 대한 저항력, 내부 상처에 대한 저항력, 군잎 역병에 대한 저항력, 덩이줄기 역병에 대한 저항력, 감자 잎말림병 바이러스에 대한 저항력, 감자 자루걸레머리 바이러스에 대한 저항력, 감자 바이러스(예를 들어, A, B, C, MS, X, Y, YN)에 대한 저항력, 가루더뎅이병(Spongospora subterranea)에 대한 저항력, 둘레썩음병(Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus)에 대한 저항력, 민달팽이에 대한 저항력, 줄기마름병(Rhizoctonia solani)에 대한 저항력, 담배얼룩바이러스에 대한 저항력, 덩이줄기 나방에 대한 저항력, 샘플 상태, 2차 성장, 2차 덩이줄기 과육 색, 전분 함유량, 포복지 부착, 포복지 길이, 저장 능력, 사마귀 종에 대한 민감성, 맛, 테스트 조건, 덩이줄기 눈 색, 덩이줄기 눈 깊이, 덩이줄기 글리코알카로이드, 수확 이전 덩이줄기 녹색화, 덩이줄기 모양, 덩이줄기 모양 균일성, 덩이줄기 크기, 덩이줄기 껍질 색, 덩이줄기 껍질, 직감, 식물당 덩이줄기, 사마귀(Synchytrium endobioticum) 및 수율 가능성과 관련된 형질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 당 말단의 낮은 발생 및/또는 지브라 칩 병원균에 의해 온화하게 감염될 때 적은 변색 전개를 가진 감자 덩이줄기를 생산하는 감자 식물을 번식시키는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (i) 제공자로서 붕괴된 전화효소 유전자를 포함하는 본 발명의 식물들 중 하나를 수여자 식물 계통과 교배하여 F1 개체군을 생성하는 단계; (ii) 상기 F1 개체군으로부터 유래된 자손에서 당 말단 및/또는 지브라 칩 표현형을 평가하는 단계; 및 (iii) 당 말단의 낮은 발생 및/또는 지브라 칩 병원균에 의해 온화하게 감염될 때 적은 변색 전개를 가진 감자 덩이줄기를 생산하는 자손을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 수여자 식물은 하나 이상의 특정한 농경학적으로 중요한 형질을 가진 정예 계통이다.

식물 변형

새로운 유전자 재료를 식물 지놈 속에 도입하기 위한 가장 일반적인 방법은 트랜스퍼 또는 T-DNA로 불리는 한 조각의 DNA를 염색체 통합을 위해 개별 식물 세포 속에 글자 뜻대로 주입하기 위해(주로 조직의 상처를 동반) 박테리아 병원균 Agrobacterium tumefaciens의 살아있는 세포의 사용을 포함하며 상기 개별 식물 세포에서 한 조각의 DNA는 식물 핵으로 표적화된다. 아그로박테리움 매개 변형 및 아그로박테리움과 사용하기 위해 특수하게 설계된 특정 DNA 전달 플라스미드를 관리하는 여러 특허가 있다 --- 예를 들어, US4536475, EP0265556, EP0270822, WO8504899, WO8603516, US5591616, EP0604662, EP0672752, WO8603776, WO9209696, WO9419930, WO9967357, US4399216, WO8303259, US5731179, EP068730, WO9516031, US5693512, US6051757 및 EP904362A1. 아그로박테리움-매개 식물 변형은 제 1 단계로서 살아있는 아그로박테리움 세포 속에 플라스미드 상에 복제된 DNA 단편의 위치시키는 단계를 필요로 하며, 살아있는 아그로박테리움 세포는 개별 식물 세포로의 변형을 위해 뒤이어 사용된다. 아그로박테리움-매개 식물 변형은 따라서 간접 식물 변형 방법이다. P-DNA를 가진 벡터를 사용하는 것을 필요로 하는 아그로박테리움-매개 식물 변형은 또한 당업자에게 주지되어 있고 본 발명에서 응용가능성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전문이 참조로 본 발명에 포함된 미국 특허 No. 7,250,554 참조.

감자 변형 방법의 비-제한적인 예는 미국 특허 Nos. 7534934, 8273949, 7855319, 7619138, 7947868, 8193412, 7880057, 8252974, 7250554, 8143477, 8137961, 7601536, 7923600, 7449335, 7928292, 7713735, 8158414, 7598430, 5185253, Beaujean et al., (Agrobacterium-mediated transformation of three economically important potato cultivars using slice intermodal explants: an efficient protocol of transformation, Journal of Experimental Botan, 49(326):1589-1595), Chakravarty et al., (Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influencing Agrobacterium-mediated transformation, Advances in Bioscience and Biotechnology, 2010, 1:409-416), Barrell et al., (Alternative selectable markers for potato transformation using minimal T-DNA vectors, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Volume 70, Number 1 (2002), 61-68), Andersson et al., (A novel selection system for potato transformation using a mutated AHAS gene, Plant Cell Rep., 2003, 22(4):261-267), Valkov et al., (High efficiency plastid transformation in potato and regulation of transgene expression in leaves and tubers by alternative 50 and 30 regulatory sequences, Transgenic Res (2011) 20:137-151), and Tavazza et al (Genetic transformation of potato (Solanum tuberosum): An efficient method to obtain transgenic plants, Plant Science, Volume 59, Issue 2, 1989, Pages 175-181)에 기술되며, 이의 각각은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다.

번식 방법

감자에 대한 일반적인 번식 방법은 Hybridization of crop plants (American Society of Agronomy and Crop Science Society of America, 1980, Chapter 34), Bradshaw et al., (Genetic Resources and Progress in Their Utilization in Potato Breeding, Potato Research, 2006, 49:49-65), Barone (Molecular Marker-assisted Selection for Potato Breeding, Amer . J. of Potato Res. 2004, 81:111-117), Douches et al., (Assessment of Potato Breeding Progress in the USA over the Last Century, Crop Science, 36(6):1544-1552), Advances in Potato chemistry and Technology (Academic Press, 2009, ISBN 0123743494, 9780123743497, Chapter 8, Potato Breeding Strategy, Bradshaaw), and Janick et al. (Potato Breeding via Ploidy Manipulations, Plant Breeding Reviews, 2010)에 기술되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Chahal and Gosal (Principles and procedures of plant breeding: biotechnological and conventional approaches, CRC Press, 2002, ISBN 084931321X, 9780849313219), Taji et al. (In vitro plant breeding, Routledge, 2002, ISBN 156022908X, 9781560229087), Richards (Plant breeding systems, Taylor & Francis US, 1997, ISBN 0412574500, 9780412574504), Hayes (Methods of Plant Breeding, Publisher: READ BOOKS, 2007, ISBN1406737062, 9781406737066)에서 논의된 방법과 같은 다른 번식 방법은 당업자에게 공지되었고, 이의 각각은 전문이 참조로 포함된다.

전통적인 번식 방법은 본 발명의 하나 이상의 재조합 발현 카셋트를 본 발명의 형질전환 식물과 교배되기에 적합한 다른 식물 변종 또는 다른 밀접 관계 종 속에 주입하기 위해 본 발명에 포함될 수 있다.

개방 수분 개체군. 호밀, 여러 옥수수 및 사탕무, 목초 풀, 자주개자리 및 클로버와 같은 콩과 식물과 같은 작물 및 카카오, 코코넛, 오일팜 및 일부 고무와 같은 열대 나무 작물의 개방 수분 개체군의 개선은 필수적으로 유리한 대립 유전자의 고정에 대한 유전자-빈도에 의존하는 반면 (최대가 아닌) 높은 정도의 이형 접합을 유지하는 것에 의존한다. 이런 개체군에서 균일성은 불가능하며 개방 수분 변종에서 유전적 순도(trueness-to-type)는 개별 식물의 특성이 아닌 전체로서 개체군의 통계적인 특징이다. 따라서, 개방 수분 개체군의 이종성은 근친 번식 계통, 클론 및 잡종의 동종성과 반대이다(또는 거의 반대이다).

개체군 개선 방법은 자연적으로 집단 선택(mass selection)으로 불리는 순수한 표현형 선택을 기초로 한 그룹 및 자손 테스팅에 의한 선택을 기초로 한 그룹인 두 그룹으로 나뉜다. 개체군간 개선은 개방 번식 개체군의 개념을 사용한다: 유전자가 한 개체군에서 다른 개체군으로 흘러가게 한다. 한 개체군에서 식물(재배 변종, 균주, 생태형, 또는 임의의 유전자원)은 다른 개체군으로부터의 식물과 자연적으로(예를 들어, 바람에 의해) 또는 손으로 또는 벌(통상적으로, Apis mellifera L. 또는 Megachile rotundata F.)에 의해 교배된다. 선택은 두 소스로부터 바람직한 형질을 가진 식물을 분리함으로써 하나의 (또는 때때로 둘 다) 개체군을 개선하도록 사용된다.

개방-수분 개체군 개선의 기본적으로 2개의 주요 방법이 존재한다. 첫째, 개체군이 결정된 선택 절차에 의해 함께 변화되는 상황이 존재한다. 결과는 분리시에 자체 내에서 무작위-교배에 의해 무한으로 번식할 수 있는 개선된 개체군이다. 둘째, 합성 변종은 개체군 개선과 동일한 최종 결과를 얻으나 자체는 이와 같이 번식가능하지 않다; 이것은 부모 계통 또는 클론으로부터 재구성되어야 한다. 개방-수분 개체군을 개선하기 위한 이런 식물 교배 절차는 당업자에게 주지되어 있고 교차-수분 식물을 개선하기 위해 통상적으로 사용된 교배 절차의 포괄적인 개론은 다음을 포함하는 여러 교과서 및 논문에 제공된다: Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, Inc. (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman Group Limited (1979); Hallauer and Miranda, Quantitative Genetics in Maize Breeding, Iowa State University Press (1981); and, Jensen, Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc. (1988).

집단 선택. 집단 선택에서, 원하는 개별 식물이 선택되고, 수확되고 씨는 자손 테스팅 없이 복합화되어 다음 세대를 생산한다. 선택은 단지 모계 부모를 기초로 하며 수분에 대한 제한이 없기 때문에, 집단 선택은 선택에 의한 무작위 교배 형태에 해당한다. 상기한 대로, 집단 선택의 목적은 개체군에서 뛰어난 표현형의 개체군을 증가시키는 것이다.

합성.

합성 변종은 모든 가능한 잡종 조합에서 좋은 결합 능력에 대해 선택된 여러 표현형을 내부끼리 교배하고, 개방 수분에 의한 변종의 후속 유지에 의해 생산된다. 일부 사탕무 및 콩(Vicia) 또는 클론에서, 목초 풀, 클로버 및 자주개자리에서 부모가 (거의 근친 교배) 씨-전파 계통인지는 원칙적으로 큰 차이가 없다. 부모는 때때로 테스트 크로스(test crosses) 또는 탑 크로스(topcrosses), 더욱 일반적으로 폴리크로스(polycrosses)에 의해 일반적인 결합 능력을 기반으로 선택된다. 부모 씨 계통은 (예를 들어, 자가수정 또는 친척 교배) 의도적으로 근친 교배될 수 있다. 그러나, 부모가 의도적으로 근친 교배되지 않은 경우에도, 계통 유지 동안 계통 내의 선택은 일부 근친 교배가 일어나는 것을 보장할 것이다. 물론, 클론 부모는 변하지 않고 매우 이형 접합 상태일 것이다.

합성은 부모 씨 생산 지면으로부터 농부로 직접 갈 수 있거나 씨 생산 및 씨에 대한 수요 등급에 따라 1회 또는 2회 사이클의 증식을 먼저 진행해야 한다. 실제로, 풀과 클로버는 일반적으로 1회 또는 2회 증식되고 따라서 최초 합성으로부터 상당히 제거된다.

집단 선택이 때때로 사용되는 반면, 자손 테스팅은 일반적으로 폴리크로스에 대해 바람직한데, 이는 이들의 작업 단순성과 목적, 합성에서 일반적인 결합 능력의 사용에 대한 분명한 관련성 때문이다.

합성에 들어가는 부모 계통 또는 클론의 수는 크게 변한다. 실제로, 부모 계통의 수는 10 내지 수백의 범위이며, 100-200이 평균이다. 100 이상의 클론으로 형성된 넓은 기반의 합성은 씨 증식 동안 좁은 기반 합성보다 더욱 안정한 것으로 예상될 수 있다.

순종 변종. 순종 변종은 분리된 개체군으로부터 개별 식물의 선택 및 자가 수분 자손의 전파 및 씨 증가 및 여러 세대에 걸친 표현형의 조심스런 테스팅으로부터 발생된 뛰어난 표현형이다. 이것은 자연적으로 자가 수분하는 종들과 잘 어울리는 개방 수분 방법이다. 이 방법은 변종 개발에서 집단 선택과 조합으로 사용될 수 있다. 조합된 순종과 집단 선택의 변화는 자가 수분 작물에서 변종을 발생시키기 위한 가장 일반적인 방법이다.

잡종. 잡종은 다른 표현형의 부모들 사이의 교배로부터 얻은 개별 식물이다. 상업용 잡종은 옥수수(maize), 사탕무, 해바라기 및 브로콜리를 포함하는 여러 작물에서 현재 광범위하게 사용된다. 잡종은 두 부모 직접 교배하는 것(단일 교배 잡종), 다른 부모와 단일 교배 잡종을 교배하는 것(3가지 또는 3중 교배 잡종) 또는 두 다른 잡종을 교배하는 것(4가지 또는 이중 교배 잡종)을 포함하는 여러 다른 방식으로 형성될 수 있다.

엄격하게 말해서, 이계 교배(즉, 개방-수분) 개체군에서 대부분의 개체는 잡종이나 용어는 주로 부모가 지놈이 다른 종 또는 아종으로 인식되도록 충분하게 구별되는 개체인 경우를 위해 남겨둔다. 잡종은 두 부모의 지놈에서 정성적 및/또는 정량적 차이에 따라 수정 능력이 있거나 없을 수 있다. 잡종 강세(Heterosis 또는 hybrid vigor)는 주로 잡종을 생산하는데 사용된 부모 계통과 비교하여 잡종의 성장, 생존 및 생식의 증가된 강세를 초래하는 증가된 이형 접합과 주로 관련이 있다. 최대 잡종 강세는 주로 두 유전적으로 다르고, 높은 근친 교배 계통을 교배함으로써 성취된다.

잡종의 생산은 이런 계통을 교배하여 얻은 부모 계통 및 잡종 모두의 분리된 생산을 포함하는 잘 개발된 산업이다. 잡종 생산 방법의 상세한 내용에 대해, 예를 들어, Wright, Commercial Hybrid Seed Production 8:161-176, In Hybridization of Crop Plants 참조.

본 발명은 제한적으로 해석되지 않아야 하는 다음 실시예에 의해 추가로 설명된다. 본 명세서 전체에서 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허 출원뿐만 아니라 도면 및 염기 서열의 내용은 참조로 본 발명에 포함된다.

실시예

실시예 1: 산지-스트레스 덩이줄기에서 당 말단의 발생을 최소화하기 위한 전화효소 사일런싱

Inv 유전자(진뱅크 등록번호 DQ478950)의 cDNA의 센스 및 안티센스 단편을 2개의 프라이머 쌍(SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 20)을 사용하는 감자 변종 '레인저' 러셋의 덩이줄기 폴리(A) + mRNA-유래 라이브러리로부터 증폭하였다. 증폭된 단편은 각각 Inv 유전자의 위치 +53 내지 +733 (센스) 및 +552 내지 +49 (안티센스)에 해당하였다. 전화효소 cDNA의 21-23 염기쌍으로의 임의의 단편 감소는 Inv 유전자(SEQ ID NO: 5)를 침묵시키는데 사용될 수 있다. 복제된 단편은 감자 변종 '레인저' 러셋으로부터 조절 요소들 사이의 역방향 반복체(SEQ ID NOs: 3 및 4)로서 위치되었다: ADP 글루코오스 피로포스포릴라제(Agp) 유전자(등록번호 HM363752, SEQ ID NO: 6)의 2.2kb 덩이줄기-특이적 프로모터 및 유비퀴틴-3 유전자(등록번호 GP755544, SEQ ID NO: 7)의 0.3kb 종결자. 선택가능한 마커 네오마이신 포스포트랜스페라제(npt) 유전자를 운반하는 pSIM401-유래 T-DNA 영역 속에 최종 사일런싱 카셋트의 삽입(Rommens et al., Plant Physiol. 139: 1338-1349 2005)은 또한 벡터 pSIM1632를 생산하였다.

pSIM1632 Inv 사일런싱 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 박테리아와 벡터를 선택하기 위해 항생제를 함유하는 LB 배지(20g/L LB Broth, Sigma)에서 28℃로 밤새 성장시켰다. 밤새 배양의 10배 희석은 5-6시간 동안 로그 단계로 성장시켰고 3000rpm에서 침전시켰다. 펠렛을 3% 수크로오스가 보충된 M404 액체 배지(PhytoTechnology, Shawnee, KS)에서 세척하였고 동일한 액체 배지에서 재현탁하여 0.2의 OD₆₀₀의 세포 밀도를 얻었다.

이식편 재료를 위한 원료 식물을 3% 수크로오스 및 2g/L 겔라이트를 함유하는 40ml의 절반 강도 M516 배지(PhytoTechnology, Shawnee, KS), pH 5.7을 가진 마젠타 박스에 유지하였다. 4-6mm의 감자 마디 사이 단편을 4주된 식물로부터 절단하고, 아그로박테리움으로 감염시키고 3% 수크로오스 및 6g/L 한천으로 보충된 M404 배지, pH 5.7에 옮겼다. 2일 연속 배양 후, 이식편을 M404 배지 + 3% 수크로오스, 2.5mg/L 제아틴 리보사이드, 0.1mg/L NAA, 6g/L 한천, pH 5.7 및 150mg/L 티멘틴인 캘러스 유도 배지에 놓아 선택제로서 아그로박테리움과 100mg/L 카나마이신을 제거하였다. 캘러스 유도 배지 상에서 한 달 후, 새싹이 얻어질 때까지 이식편을 새싹 유도 배지(M404 배지 + 3% 수크로오스, 2.5mg/L 제아틴 리보사이드, 0.1mg/L NAA, 6g/L 한천, pH 5.7 150mg/L 티멘틴 및 100mg/L 카나마이신)에 옮겼다. 새싹을 M404 배지 + 3% 수크로오스, 겔화제 및 100mg/L 카나마이신에서 뿌리내리게 했다. 카나마이신의 존재하에서 뿌리내린 새싹을 전이유전자의 존재에 대해 PCR을 통해 스크린한다. 노던 분석은 ZC 실험에 대해 선택된 계통에서 Inv 유전자의 사일런싱을 확인한다(도 5a). 관심 유전자에 대해 침묵된 계통은 인비트로로 전파되고 씨 생산을 위해 온실에서 성장된다.

변형되지 않은 대조군, 빈 벡터 대조군 및 전화효소-사일런스드 계통을 사용하는 산지 테스트를 아이다호, 파르마, University of Idaho Parma Research and Extension Center에서 연도 1 및 2에 실행하였다. 거대 및 미세영양소의 사용은 University of Idaho에 의해 제안된 관리 권고에 따랐다. 작은 지면을 솔리스 세트 시스템(Solid set system)을 사용하여 뿌려서 물을 대면서 수분을 재배 기간 동안 65% 이상으로 유지하였다. 연도 1에, 각 대조군과 형질전환 계통은 5개 작은 산의 1개 작은 지면을 차지하였다. 연도 2에, 각 대조군과 형질전환 계통은 20개 작은 산의 5개 작은 지면을 차지하였다. 두 연도에서, 줄 내부 공간은 10인치이며 줄 사이는 36인치이다. 덩이줄기는 씨를 뿌린 후 130-140일에 수확하며 튀기기까지 55℃에서 저장하였다(약 2주).

연도 1에서, 프라이 샘플은 5개 작은 산의 합쳐진 샘플로부터 채취한 최소 12파운드의 덩이줄기로 이루어졌다. 연도 2에서, 합쳐진 집합으로부터 20개 덩이줄기, 20개 작은 산의 각각의 복제품을 사용하였고 전부 5개 복제품을 측정하였다. 2년에서, 계통 당 덩이줄기의 평균 수는 5 x 20 또는 100 덩이줄기이었다. 모든 덩이줄기를 3/8-인치 x 3/8-인치 격자 프라이 나이프로 길이방향으로 절단하고 4개의 중앙 긴 조각을 3분 동안 375도로 튀겼다. 튀겨진 긴 조각을 흰색 트레이에 놓고 프렌치 프라이 포테이토에 대한 USDA 먼셀 컬러 차트와 비교하였다. SE 프라이는 긴 조각의 가장 어두운 두 면상에서 ¼ 인치 길이 이상의 말단을 가지며, 긴 조각의 전체 폭의 경우, USDA 먼셀 컬러 차트와 비교할 때 번호 3 또는 더 어두웠다.

표 1에 도시된 대로, 당 말단의 유도에 적절한 조건은 두 년에 ID 필드, 파르마에 제공되었다. 1년에서, 제한된 씨 공급 때문에 작은 샘플 크기가 감소된 당 말단을 가진 모든 계통에 대한 경향을 나타내었다. 비록 변형되지 않은 대조군(레인저 대조군)의 중앙 긴 조각 프라이의 거의 절반 및 빈 벡터 대조군이 당 말단을 나타내지만, 전화효소-사일런스드 계통은 모두 급격한 감소를 나타낸다. 이 사실은 또한 각 샘플에 대한 중앙 긴 조각 프라이의 전부를 나타내는 도 1의 설명으로부터 명백하다. 현저하게 적은 전화효소-사일런스드 계통이 도 1에 설명된 것과 같이 당 말단을 가진 임의의 프라이를 나타내었다. 계통 1과 4는 샘플 프라이에서 당 말단이 없는 것으로 표시되었다. 다른 전화효소 계통은 당 말단을 가진 프라이의 14% 미만 대 튀긴 후 당 말단을 나타내는 대조군 프라이의 42%를 나타내었다. 전화효소 사일런스드 계통이 당 말단에 상당한 감소를 나타낸 동일한 패턴이 더 많은 복제가 가능할 때 2년에서 관찰되었다. 계통 1632-1은 임의의 정도의 당 말단을 나타내는 프렌치 프라이 4±2.3(±표준 편차)의 평균으로 두 년에 뛰어났다. 2개의 복제품은 당 말단을 가진 긴 조각을 갖지 않았다. 다른 계통은 2년에 적은 감소를 나타내어서, 당 말단을 연구할 때 더 큰 샘플 크기의 중요성을 입증하였다.

전화효소-사일런스드 러셋 레인저(1632-x), 빈 벡터 대조군 및 변형되지 않은(레인저 대조군) 덩이줄기로부터의 당 말단(SE)을 가진 중앙이 절단된 프렌치 프라이의 빈도. SE 프라이는 긴 조각의 가장 어두운 두 면상에서 ¼ 인치 길이 이상의 말단을 가지며(측정을 위해 프라이 산업에서 사용된 가장 어두운 지역의 길이), 긴 조각의 전체 폭의 경우, USDA 먼셀 컬러 차트와 비교할 때 번호 3 또는 더 어두웠다. ^* 씨의 제한된 양 때문에 복제는 없다. ^** 각 계통 및 대조군은 5회 복제하였다. ^§ 당 말단을 가진 프렌치 프라이의 평균 수 ± std 편차

	연도 1 ^*		연도 2 ^**
계통 ID	No. 점수 매긴 프라이	No. SE를 가진 프라이	평균 % 프렌치 프라이/SE를 가진 rep^§
1632-1	60	0	4.0 + 2.3
1632-3	60	4	28.4 + 2.4
1632-4	60	0	36.1 + 2.8
1632-5	60	8	20.1 + 7.9
1632-21	60	4	30.5 + 5.0
빈 벡터	51	24	38.6 + 8.0
레인저 대조군	60	25	50.0 + 7.3

실시예 2: 칩과 프렌치 프라이와 같은 프라이드 감자 제품의 지브라 칩-유도 흑화의 심각성을 최소화하기 위한 전화효소 사일런싱

지브라 칩(ZC) 실험에 사용된 전화효소-사일런스드 계통의 발생은 상기하였다. 당 말단의 감소된 빈도를 나타내는 동일한 계통을 지브라 칩의 원인 물질에 의해 감염된 칩에서 색 발생을 최소화하는 능력에 대해 테스트하였다. 변형되지 않은 대조군, 빈 벡터 대조군 및 전화효소-사일런스드 계통을 위한 온실-재배 씨를 사용하는 산지 테스트를 TX, 부시랜드, Texas A&M University Bushland Research and Extension Center에서 실행하였다. 씨를 4월11에 심었다. 처리 당 4개의 식물을 한 블럭에 심었고 출현 후 텐트로 덮었다. 텐트는 원치않는 파우나를 식물로부터 제거하고 감염된 이 - ZC 원인 유기체의 벡터 - 를 식물에 고정하는 역할을 하였다. 텐트에 포함된 각 계통의 4개 식물을 수확 35, 28, 21, 14 및 7일 전 리베리박터를 운반하는 30마리 이로 감염시켰다. 이런 방식으로, 덩이줄기를 지브라 칩으로 다소 점진적으로 감염된 각 계통과 대조군으로부터 생성하였다. 수확 35일 전에 감염된 식물은 전체적으로 감염될 수 있고 매우 어둡게 튀겨진 최종 칩에 의해 ZC의 매우 강한 증상을 나타낸다(도 3b 및 4). 수확 21일 전 감염된 식물은 덩이줄기에서 단지 매우 약한 감염 증상을 나타내며(도 3a) 적당한 양의 흑화와 함께 튀겨질 것이다. 수확 단지 7일 전 감염된 식물은 적은 감염 또는 감염의 나타내지 않을 것으로 예상되며 적은 흑화 또는 흑화가 없이 튀겨질 덩이줄기를 가질 것이다.

수확시에, 각 계통과 처리에 의한 덩이줄기를 ZC 증상에 대해 분석하였다. ZC 심각성의 시각적 평가(즉, 덩이줄기 과육의 괴사 얼룩)를 각 처리에 의한 8개 덩이줄기에 대해 실시하였다. 포복지 말단을 절단하고 0 내지 3등급을 증상에 대한 덩이줄기에 제공하였고 3은 최대량의 덩이줄기 괴사를 나타내고 0은 괴사가 없음을 나타낸다. 표 2는 각 감염 시간에서 각 계통에 대한 질병 심각성 점수를 요약한다. 예상한 대로, 대조군 덩이줄기는 수확 전(dbh) 35 및 28일 심각한 감염의 징후를 나타내었고 덩이줄기 과육 전체에 뚜렷한 얼룩 및 괴사 조직의 줄을 가진다(도 2a 참조). 21dbh에 감염된 덩이줄기는 도 2b에 도시된 대로 덩이줄기의 피질에 연한 괴사 얼룩의 징후를 때때로 나타낼 수 있다. 적은 괴사 또는 괴사 없음으로 표시된 감염의 점진적으로 적은 징후는 수확 직전에 뚜렷하였다. 전화효소-사일런스드 계통은 변형되지 않은 '레인저' 레셋 대조군보다 좋은 점수를 나타내지 않았고, 과육 증상은 전화효소의 사일런싱에 의해 완화되지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 증상 심각성의 평가 동안, 덩이줄기 샘플을 채취하여 리베리박테리아의 존재 또는 부존재에 대해 PCR 확인하였다.

ZC-감염 및 비감염 덩이줄기의 평균 질병 심각성 등급. 폴리페놀 옥시다아제 사일런스드 계통 및 전화효소 사일런스드 계통은 적절한 변형되지 않은 대조군으로 표시된다. 각 처리에 의한 8개 덩이줄기를 포복지 말단에서 절단하고 0 내지 3의 단계로 등급을 매겼고, 3은 최대량의 덩이줄기 괴사를 나타내고 0은 괴사가 없음을 나타낸다. 나타낸 값은 모두 8개 덩이줄기의 평균이다. DBH = 수확 전 일. J3, E12 및 F10은 각각 '아틀란틱'(Atl), 레셋 버뱅크(RB) 및 '레인저' 러셋(RR) 백그라운드에서 Ppo-사일런스드 계통이다. 모든 1632 계통은 러셋 '레인저" 백그라운드에서 Inv에 대해 침묵된다.

	J3	Atl	E12	RB	F10	RR	1632-1	1632-3	1632-4	1632-5	1632-21
35일 dbh	1.88	1.00	2.69	1.88	1.75	2.00	1.94	2.56	1.63	1.56	1.63
28일 dbh	2.13	1.06	1.75	1.31	1.75	1.42	1.25	2.19	2.50	0.75	2.13
21일 dbh	0.0	0.50	0.08	0.0	0.25	0.38	0.13	0.31	0.81	0.25	0.69
14일 dbh	0.0	0.19	0.0	0.0	0.56	0.31	0.13	0.25	0.06	0.31	0.13
7일 dbh	0.0	0.0	0.0	0.19	0.25	0.13	0.13	0.13	0.14	0.19	0.31
감염 없음	0.0	0.06	0.0	0.58	0.06	0.00	0.06	0.06	0.13	0.25	0.06

감염일 당 6-8개 대조군 덩이줄기의 얇게 썰기를 실행하여 최종 칩의 색에 대해 ZC 감염의 영향을 확인하였다. 1파운드 샘플의 조각을 칩에서 2% 최종 수분을 얻도록 350F에서 3분 동안 오일에서 튀겼다. 도 3에서 볼 수 있듯이, ZC의 존재는 식물이 리베리박터-양성 이에 더 오래 노출될수록 더 어두운 칩과 관련이 있다. 아그트론 리딩에 의해 측정된 칩 색은 ZC 압력이 수확에 근접한 날에 감소함에 따라 '레인저' 대조군 칩에서 덜 어두워진다(표 3). 감염일 당 6-8개 전화효소 사일런스드 덩이줄기의 얇게 썰기를 실행하여 프라이드 칩에서 ZC-영향 색 발생의 징후에 대한 전화효소 사일런싱의 영향을 확인하였다. 아그트론 리딩에서 반영되고 칩 색의 시각 검사에 의해, 전화효소 사일런싱은 매 감염 시점에 더 낮은 칩 색을 초래하였다. 비록 35 및 28dbh의 칩은 여전히 팔 수 없지만, 더 심각하게 감염된 덩이줄기는 '레인저' 대조군 덩이줄기와 비교하여 더 연했다. 약하게 감염된 덩이줄기로부터의 칩(≤21dbh)은 이 실험의 결과에 따라 전부 판매가능할 것이다.

전화효소 사일런싱된 및 되지 않은 ZC-감염 및 비감염 덩이줄기로 제조한 칩의 아그트론 리딩. 각 값은 동일한 샘플에 대한 3회 리딩의 평균이다. 특정 데이터 점수는 작물 실패로 생략된다. 더 높은 숫자는 더 연한 프라이 색에 해당한다. DBH = 수확전 일.

	'레인저'	1632-1	1632-3	1632-4	1632-5	1632-21
35일 dbh	12.7	24.5	19.5	33.1		25.3
28일 dbh	12.6	30.6	19.8	21.2		17.9
21일 dbh	26.5			29.9	33.6	35.0
14일 dbh	22.7	46.1	44.8		38.4
7일 dbh	22.7	47.3	45.2	42.0	36.7	46.7
감염 없음	32.6	49.2	42.3	37.9	39.9	44.0

실시예 3: 폴리페놀 옥시다아제 사일런싱은 지브라 칩과 관련된 증상을 최소화하지 않는다

폴리페놀 옥시다아제-5 5'-UTR(Ppo5 , SEQ ID NOs: 8 및 9)의 센스 및 안티센스 단편을 2개의 상사 프로모터(convergent promoters) -- Ppo5 유전저의 사일런싱을 유도하는 ADP 글루코오스 피로포스포릴라제 유전자(Agp, SEQ ID NO: 6) 및 과립-결합 합성효소 유전자(Gbss, SEQ ID NO: 11)의 프로모터 사이에 역방향 반복제로서 배열하였다. Ppo 5'UTR의 센스 및 안티센스 단편을 비-암호화 스페이서 DNA(SEQ ID NO: 12)로 분리하였다. 상기한 유전자 사일런싱의 이런 방법(Yan et al. Plant Physiol. 141:1508-1518, 200)은 Ppo 유전자의 사일런싱을 보장하나 Ppo cDNA 서열의 21-23개 염기쌍 아래의 Ppo 유전자의 임의의 단편이 사일런싱에 사용될 수 있다. 유전자 내 계통 F10, E12 및 J3를 생산하기 위해 사용된 P-DNA 벡터 및 마커-제거 방법은 이미 기술되었다(Rommens et al. Plant Biotechnol. J., 6:843-853, 2008).

폴리페놀 옥시다아제 사일런싱 카셋트를 포함하는 아그로박테리움의 LBA4044 균주의 제조 및 성장은 상기 실시예에서 기술한 대로 진행하였다. Ppo 사일런스드 계통을 생성하기 위한 감자 변형은 이전 실시예 1에서 전화효소 사일런스드 계통의 생성에 대해 기술된 대로 진행하였다. 변형되지 않은 식물 및 이들의 유전자 내 복사물의 덩이줄기에서 Ppo5 유전자의 전사 수준은 노던 블럿 분석에 의해 측정하였다(도 5b). 온실-재배 덩이줄기에서, Ppo5 유전자의 전사 수준은 이들의 변형되지 않은 대조군과 비교하여 F10, E12 및 J3 유전자 내 사건에서 강하게 감소하였고, Ppo5 유전자는 변형된 덩이줄기에서 침묵되었다. 본 발명자는 '아틀란틱', 러셋 버뱅크 및 '레인저' 러셋 변종 백그라운드에서 Ppo를 침묵시키기로 선택하였다. 모든 3개의 변종은 검은 점 상처에 취약하나 Ppo 사일런싱 카셋트으로 변형될 때, 검은 점 상처에 취약성을 나타내지 않는다. 이 사실은 '아틀란틱' 야생형 및 Ppo-사일런스드 등가물에 대해 도 4a 및 4b에서 설명된다.

상기 전화효소-사일런스드 계통에 대해 기술한 대로 변형되지 않은 대조군, 빈 벡터 대조군 및 전화효소-사일런스드 계통을 위한 온실-재배 씨를 사용하는 산지 테스트를 TX, 부시랜드, Texas A&M University Bushland Research and Extension Center에서 실행하였다. Ppo-사일런스드 계통 및 이들의 개별 대조군의 새로운 ZC 증상에 점수를 매기는 방법은 위에 기술되며 표 2에 요약된다. 이런 점수로부터, Ppo 사일런싱은 3개의 변종 백그라운드에서 ZC-감염 덩이줄기에서 새로운 증상 발생을 최소화하지 않는다는 것이 분명하다. 폴리페놀 옥시다아제-사일런스드 계통은 변형되지 않은 대조군보다 좋은 점수를 받지 않았는데, 이는 새로운 증상은 Ppo의 사일런싱에 의해 완화될 수 없다는 것을 나타낸다. 더욱 중요한 것은, 실시예 2에 기술된 방법에 따른 이용가능한 계통을 튀긴 후, Ppo 사일런싱은 ZC 감염된 칩을 더 연하게 만들 수 없다는 것이 분명하다. 표 4에서 아그트론 리딩은 Ppo-사일런스드 J3는 변형되지 않은 '아틀란틱' 대조군보다 연하지 않다는 것을 나타낸다. 이것은 E12 계통을 러셋 버뱅크 대조군과 비교할 때 또는 F10 계통을 '레인저' 러셋 대조군과 비교할 때에도 사실이다.

폴리페놀 옥시다아제 사일런싱된 및 되지 않은 ZC-감염 및 비감염 덩이줄기로 제조한 칩의 아그트론 리딩. 각 값은 동일한 샘플에 대한 3회 리딩의 평균이다. 특정 데이터 점수는 작물 실패로 생략된다. 더 높은 숫자는 더 연한 프라이 색에 해당한다. DBH = 수확전 일.

	J3	' 아틀란틱 '	E12	버뱅크	F10	'레인저'
35일 dbh	38.9	44.1	13.5	13.5	12.1	12.7
28일 dbh	38.4	37.5	15.6	14.4		12.6
21일 dbh	37.2	36.8	28.3	28.5	26.7	26.5
14일 dbh	45.3	45		25.5	22.4	22.7
7일 dbh	45.8	47.1		27.9	22.9	22.7
감염 없음	48.3	49.2		27.9	32.7	32.6

절단되거나 벗겨진 ZC-감염 덩이줄기의 빠른 갈색화 반응을 확인하였다(Navarre et al., Amer. J. Potato Res. 86:88-95 2009). 폴리페놀 옥시다아제 사일런싱은 도 4에서 볼 수 있듯이 이런 반응을 억제한다. 비감염된(4B) 또는 감염된(4C) Ppo-사일런스드 덩이줄기는 흑화를 나타내지 않는다.

달리 정의하지 않는 한, 본 발명의 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본 발명에 기술된 것과 유사한 또는 동일한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본 발명에 기술된다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공개공보는 모든 목적이 전문이 참조로 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 논의된 간행물은 특허 출원의 출원일 전에 이들의 공개를 위해서만 제공된다. 본 발명의 어떤 것도 본 발명이 종래 발명에 의해 이런 간행물보다 앞서지 않는다는 것의 인정으로 해석되지 않는다.

본 발명은 이의 특정 실시태양과 함께 기술되었으나, 본 발명은 추가로 변형될 수 있고 본 출원은 본 발명의 원리를 따르며 본 발명이 속하는 기술분야 내의 공지된 또는 통상적인 관행 내에 해당되며 본 발명에 설명된 필수 특징에 적용될 수 있고 첨부된 청구항의 범위에 따르는 것과 같은 본 발명으로부터의 발전을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 적용을 포함한다.

Claims

감자 덩이줄기에서 공포 전화효소 활성을 파괴하는 단계를 포함하여 감자 덩이줄기 또는 감자 덩이줄기로 제조된 제품에서 당 말단의 빈도를 최소화하는 방법으로서, 감자 덩이줄기에서 당 말단의 빈도는 대조군 감자 덩이줄기와 비교하여 감소하는 것인 방법.
감자 덩이줄기에서 공포 전화효소 활성을 파괴하는 단계를 포함하여 감자 덩이줄기 또는 감자 덩이줄기로 제조된 제품에서 지브라 칩의 증상을 최소화하는 방법으로서, 감자 덩이줄기에서 지브라 칩의 증상은 대조군 감자 덩이줄기와 비교하여 감소하는 것인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
공포 전화효소 활성은 공포 전화효소를 암호화하는 공포 전화효소 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드 변화를 감자 덩이줄기 속에 주입함으로써 파괴되는 것인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
공포 전화효소 활성은 억제성 뉴클레오티드 서열을 주입함으로써 파괴되는 것인 방법.
제 4 항에 있어서,
억제성 뉴클레오티드 서열은 안티센스 RNA 서열, dsRNAi 서열 및 역방향 반복체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제 4 항에 있어서,
억제성 뉴클레오티드는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
제 6 항에 있어서,
식물 프로모터는 구조성 프로모터, 비-구조성 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 세포 형태 특이적 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제 7 항에 있어서,
조직 특이적 프로모터는 덩이줄기-특이적 프로모터인 방법.
제 8 항에 있어서,
덩이줄기-특이적 프로모터는 ADP 글루코오스 피로포스포릴라제 유전자와 관련된 프로모터인 방법.
제 9 항에 있어서,
덩이줄기-특이적 프로모터는 핵산 서열 SEQ ID NO: 6 또는 임의의 기능성 변형체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 5 항에 있어서,
억제성 뉴클레오티드 서열은 역방향 반복체 서열인 방법.
제 11 항에 있어서,
역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5로부터 유래되는 것인 방법.
제 12 항에 있어서,
역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5의 +53 내지 +733에 해당하는 센스 서열을 포함하는 것인 방법.
제 13 항에 있어서,
역방향 반복체는 SEQ ID NO: 5의 +552 내지 +49에 해당하는 안티-센스 서열을 포함하는 것인 방법.
제 12 항에 있어서,
역방향 반복체는 SEQ ID NOs: 3, 15, 16 및 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 서열을 포함하는 것인 방법.
제 15 항에 있어서,
역방향 반복체는 SEQ ID NOs: 4, 13, 14, 17 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티-센스 서열을 포함하는 것인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
방법은 감자 식물에 유전자 사일런싱 카셋트를 발현하는 단계를 포함하며, 카셋트는 역방향 반복체로서 배향된 센스 서열 및 안티센스 서열을 포함하며, 센스 서열은 엄격한 잡종화 조건하에서 SEQ ID NO: 5에 잡종화될 수 있고 안티센스 서열은 센스 서열의 전장 또는 부분 역 및 보체 서열인 방법.
제 17 항에 있어서,
센스 서열 및 안티센스 서열은 스페이서에 의해 분리되는 것인 방법.
제 17 항에 있어서,
발현 카셋트는 덩이줄기-특이적 프로모터를 포함하는 것인 방법.
제 19 항에 있어서,
덩이줄기-특이적 프로모터는 센스 및 안티센스 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
제 17 항에 있어서,
카셋트의 발현은 적어도 하나의 내인성 전화효소 유전자의 발현을 하향조절하여 감자 덩이줄기 또는 감자 덩이줄기로 제조한 제품에서 당 말단의 빈도를 최소화 및/또는 감자 덩이줄기 또는 감자 덩이줄기로 제조한 제품에서 지브라 칩의 증상을 최소화하는 것인 방법.
제 17 항에 있어서,
센스 서열은 전장 또는 부분 SEQ ID NO: 5와 100% 동일한 것인 방법.
제 17 항에 있어서,
안티센스 서열은 센스 서열의 역 및 보체 서열과 100% 동일한 것인 방법.
제 17 항에 있어서,
안티센스 서열은 센스 서열의 역 및 보체 서열과 100% 동일하나, 부분적으로 겹쳐지는 것인 방법.