KR20170061159A - 사건-특이적 탐지 방법 - Google Patents

사건-특이적 탐지 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 감자 식물에서 유전 재료를 확인하는 방법에 관한 것으로, 이런 식물로부터 제조된 식품을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명에서 설명한 방법에서 사용된 뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 포함하는 재료에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유전자 재조합 사건으로부터 생성된 그 자체의 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열 및 이 접합부 서열을 탐지하는 방법을 제공한다.

Description

사건-특이적 탐지 방법{Event-Specific Detection Methods}
본 발명은 재조합 감자 식물에서 유전 재료를 확인하는 방법에 관한 것으로, 이런 식물로부터 제조된 식품을 포함한다. 또한, 본 발명은 뉴클레오타이드 프라이머, 프로브 및 본 발명에 기재된 방법에서 사용된 그 자체의 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열을 포함하는 재료에 관한 것이다.
감자는 전세계적으로 네 번째로 가장 중요한 식용 작물이며 현재까지 가장 중요한 채소이다. 감자는 현재 미국의 거의 모든 주에서 상업적으로 재배된다. 매년 감자 생산량은 미국에서만 1800만톤이 넘으며, 전세계적으로 3억톤이 넘는다. 감자의 인기는 주로 이의 다용성 및 영양적 가치로 인한 것이다. 감자는 신선한 상태로, 동결된 상태로 또는 건조된 상태로 사용될 수 있거나, 가루, 전분 또는 알코올로 가공될 수 있다. 이들은 복합 탄수화물을 포함하며, 칼슘, 니아신 및 비타민 C가 풍부하다.
식품 산업에서 감자의 품질은 두 가지 중요한 인자들에 의해 영향을 받는다: (1) 감자는 튀기거나 구울 때 신속하게 산화되어 발암성 생성물인 아크릴아마이드를 형성하는 비필수 유리 아미노산인 아스파라긴을 다량으로 함유하고; (2) 감자는 멍든 감자의 손상된 색소체로부터 폴리페놀 옥시다제가 누출되는 경우 발생하는 부작용인 효소적 갈변 및 변색에 매우 취약하다. 세포질에서, 효소는 페놀을 산화시키고, 그런 다음, 신속하게 중합되어 어두운 색소를 생성한다. 덩이줄기는 인산화된 전분을 다량으로 함유하며, 이 전분 중 일부는 저장 동안에 분해되어 포도당 및 과당을 생성한다. 이들 환원당은 아미노산과 반응하여 120℃를 초과하는 온도에서 가열 시 아크릴아마이드를 포함하는 마이야르 생성물을 형성한다. 전분 인산화에 관여하는 두 가지 효소는 수(water) 다이키나아제 R1 및 포스포릴라제-L (R1 및 PhL)이다. 갈변은 또한 전분이 포도당 및 과당으로 부분적으로 분해된 결과로서 비-효소적으로 유도된다.
두 상기 인자를 해결하기 위해, 낮은 아크릴아마이드 함량, 증가된 흑점 상처 내성 및 환원당의 감소된 수준을 갖는 덩이줄기를 생산하는 감자 식물 품종이 개발되었다(감자역병에 대해 저항성인 미국 특허 제8,754,303호, "Potato Cultivar J3"; "Potato Cultivar F10", 미국 특허 제8,889,963호 "Potato Cultivar J55", 미국 특허 출원 제14/ 072,487호 "Potato Cultivar E12"; 및 미국 특허 제8,889,964호 "Potato Cultivar W8", 이의 각각은 본 발명에서 참조로 포함된다). 이런 변형 감자 식물은 감자에 도입된 박테리아의 외래 핵산 없이 유전적 사건의 도입에 의해 개발되었다.
그러나, 이런 식물로 제조된 식품을 포함하는 이들 변형 감자 식물에 도입된 유전 재료를 확인하기 위한 방법 및 재료를 가질 업계의 중요한 요구가 존재한다. 구체적으로, 주어진 감자 또는 감자 제품이 특정의 도입된 유전적 형질전환 사건을 포함하는지 여부를 결정하기 위한 방법 및 재료를 가질 필요가 있다.
본 발명은 식물에서 유전적 형질전환 사건을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 식물은 감자이다. 본 발명에 기재된 방법은 식물 형질전환으로부터 초래하는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 탐지하는데 광범위하게 적용 가능하다. 일부 양태에서 아그로박테리움 매개 벡터를 통해 일어나는 식물 형질전환 사건은 본 방법에 의해 탐지될 수 있는 독특한 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열을 생성한다. 이런 형질전환 사건은 임의의 식물 종에서 탐지될 수 있고; 그러나, 특정 예시된 실시태양에서, 본 발명에서 교시된 방법은 8개 감자 품종에서 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부의 탐지를 교시한다.
일부 양태에서, 본 발명은 감자 식물 게놈에 고유하고 아그로박테리움 DNA, 바이러스 마커 또는 벡터 백본 서열을 함유하지 않는 삽입된 핵산 서열을 포함하는 형질전환 감자를 탐지할 수 있는 방법 및 재료를 제공한다. 오히려, 감자 품종의 게놈에 삽입되고 본 발명에 기재된 방법의 실시태양에 의해 탐지되는 DNA는 감자에 고유하거나 또는 야생 감자에 고유하거나 타가수정 가능한 감자 식물에 고유한 비 암호화 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 이런 도입된 뉴클레오타이드는 흑점 상처, 아스파라긴 축적 및 환원당 축적의 발현에 관련된 유전자를 침묵시키는 기능을 한다. 결과적으로, 이들 도입된 유전자는 형질전환 감자에서 아크릴아마이드 함량을 낮추게 된다. 또한, 본 발명에 교시된 방법은 감자역병에 대한 내성을 부여하는 감자에 도입된 유전자, 및 일부 양태에서 암호화 폴리뉴클레오타이드를 탐지할 수 있다. 상기 삽입된 DNA는 자연에서 발견되지 않는 독특한 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 생성한다.
따라서, 본 발명에서 교시된 형질전환 사건은 형질전환 감자에서 비-자연 뉴클레오타이드 "접합부" 서열의 생성을 유도한다. 이런 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부는 특정 유전적 형질전환 사건의 존재를 나타내는 일종의 진단으로 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명에서 교시된 방법은 감자에 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명에서 사용된 8개 감자 품종은, 임의의 식물 종에서 식물 형질전환에 기인한 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열을 탐지하는 본 방법의 응용가능성을 입증한다.
본 기술은 고유하게 설계된 프라이머 및 프로브를 포함하는 특수화된 정량적 PCR 방법의 사용을 통해 이런 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 탐지할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열에 결합한다. 일부 양태에서, 전통적인 PCR이 사용된다. 다른 양태에서, 실시간 PCR이 사용된다. 일부 양태에서, 정량적 PCR(qPCR)이 사용된다.
따라서, 본 발명은 실시간 PCR 생성물의 탐지를 위한 두 일반적인 방법의 사용을 다룬다: (1) 임의의 이중 가닥 DNA이 삽입된 비 특이적 형광 염료 및 (2) 프로브 및 이의 상보적 서열과의 혼성화 후에만 탐지를 허용하는 형광 리포터로 표지된 올리고뉴클레오타이드로 구성하는 서열-특이적 DNA 프로브. 일부 양태에서, 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부만이 교시된 프라이머를 통해 증폭될 것이고, 결과적으로 비 특이적 염료를 통해 또는 특이적 혼성화 프로브의 사용을 통해 탐지될 수 있다.
또한, 개시된 형질전환 사건으로부터 생성된 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열을 생성함으로써 본 발명자는 자연계에서 발견되지 않는 독특한 뉴클레오타이드 서열을 생성하였다. 이런 서열은 분리될 수 있으며 이런 분자를 만들기 위해 인간의 손이 개입하지 않으면 자연계에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 또한, 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열에 결합하는 개시된 프로브 서열은 또한 자연계에서 발견되지 않는 신규한 뉴클레오타이드 분자이다. 결과적으로, 본 발명의 양태는 경미한 내지 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열에 결합할 수 있는 다른 뉴클레오타이드 분자와 함께 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열 분자 자체를 포함한다. 일부 양태에서, 경미한 내지 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열에 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 분자는 "뉴클레오타이드 프로브"라고 불린다.
따라서, 본 발명에서, E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및 Y9 유전적 형질전환 사건을 탐지하는 대표적인 방법이 기술되어있다. 상기 방법은 상기 형질전환 사건으로부터 기인한 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열을 탐지하는 방법을 제공한다. 이런 8개 예는 모든 식물 종에서 형질전환 사건으로 인한 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열을 탐지하는 더 큰 속을 가능하게 하는 종으로서 역할을 한다.
한 실시태양에서, a) i) 포워드 및 리버스 뉴클레오타이드 프라이머 한 쌍, ii) 뉴클레오타이드 프로브 및 iii) 탐지될 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 포함하는 상기 샘플로부터의 표적 뉴클레오타이드 서열을 결합하는 단계; 상기 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 또는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부의 존재를 나타내는 서열에 결합하며; 및 b) 상기 샘플로부터 표적 뉴클레오타이드 서열을 탐지하는 단계를 포함하여 핵산 샘플에서 식물 형질전환 사건의 존재를 탐지하기 위한 정량적 PCR 방법이 제공된다.
한 양태에서, 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부는 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및 Y9, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물 형질전환 사건으로부터 유래한다. 일부 양태에서, 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열은 식품 재료에서 발견된다. 특정 양태에서, 식품 제품 재료는 감자 식품 재료이다.
한 양태에서, 표적 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 양태에서, 한 쌍의 포워드 및 리버스 뉴클레오타이드 프라이머 및 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NOs: 52-90로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 52를 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 53을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 54를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 E12 사건의 좌측 또는 우측 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 55를 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 56을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 57을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 F10 사건의 좌측 또는 우측 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 58을 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 59를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 60을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 J3 사건의 좌측 또는 우측 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 61을 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 62를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 63을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 J55 사건에 존재하는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부의 존재를 나타내는 서열과 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 64 또는 67을 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 65 또는 68을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 66 또는 69를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 V11 사건의 좌측 또는 우측 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 70을 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 71을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 72를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 W8 사건에 존재하는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부의 존재를 나타내는 서열과 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 73을 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 74를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 75를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 X17 사건의 좌측 또는 우측 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 76을 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 77을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 78을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 Y9 사건의 좌측 또는 우측 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 79를 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 80을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 81을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 pSIM1278과 연관된 내부 AGP/Asn1 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 82를 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 83을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 84를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 pSIM1278과 연관된 내부 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 85를 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 86을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 87을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 pSIM1678과 연관된 내부 접합부와 결합한다. 한 특정 양태에서, 뉴클레오타이드 프로브는 내부 Vnt1 말단부/pAgp 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 88을 포함하고 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 89를 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 90을 포함하고 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 프로브는 pSIM1678과 연관된 내부 접합부와 결합한다.
한 실시태양에서, pSIM1278 또는 pSIM1678과 관련된 비 자연 발생 구조체- 특이적 접합부 서열이 탐지된다. 이런 실시태양에서, 표 6 "pSIM1278 및 pSIM1678 구조체 접합부" 및 도 5에 예시된 비 자연 발생 접합부 서열이 탐지된다.
한 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17, 또는 Y9와 연관된 비 자연 발생 사건-특이적 접합부 서열이 탐지된다. 이런 실시태양에서, 표 6 및 도 6에 예시된 비 자연 발생 접합부 서열이 탐지된다.
한 실시태양에서, 핵산 샘플은 감자 식물 또는 감자 식물 부분, 또는 감자 유래 식품 또는 식품에 사용된 감자 기반 성분으로부터의 것이다.
한 실시태양에서, 감자 식물 부분은 감자 꽃, 감자 꽃잎 조각, 감자 꽃잎, 감자 꽃받침, 감자 꽃밥, 감자 꽃가루, 감자 종자, 감자 잎, 감자 잎자루, 감자 줄기, 감자 뿌리, 감자 뿌리 줄기, 감자 줄기, 감자 덩이줄기, 감자 싹, 감자 세포, 감자 원형질, 감자 식물 조직 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나이다.
한 실시태양에서, 감자 유래 식품은 감자 가공 식품, 감자 가축 사료, 감자 튀김, 감자 칩, 탈수 감자 재료, 감자 플레이크, 감자 과립, 감자 단백질, 감자 가루 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나이다.
한 실시태양에서, 핵산 샘플은 감자 유래 식품으로부터 유래된 것이며, E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17, Y9 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 식물 형질전환 사건의 존재는 식품에서 탐지될 수 있다.
한 실시태양에서, 형질전환 사건은 전체 식품의 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 및 0.5% 미만의 수준에서 탐지될 수 있다. 한 실시태양에서, 형질전환 사건은 전체 식품의 약 0.1% 내지 약 5% 범위의 수준에서, 또는 전체 식품의 약 0.2% 내지 5.0% 범위의 수준에서, 또는 전체 식품의 약 0.1% 내지 약 10%의 범위의 수준에서 탐지될 수 있다.
한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 접합부 서열이 제공된다.
다른 실시태양에서, pSIM1278 및/또는 pSIM1678을 감자에 삽입함으로써 생성된 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 접합부 서열이 제공된다. 일부 양태에서, 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 서열은 도 5(구조체 특이적 접합부) 및 도 6(사건 특이적 접합부) 및 표 6에 도시된다.
다른 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분리 된 비 자연 발생 핵산 접합부 서열이 제공된다. 한 실시태양에서, 비 자연 뉴클레오타이드 접합부 서열은 표 6에 발견된다. 표 6은 또한 접합부 서열이 유전적 삽입체의 "좌측" 또는 "우측"에 함유되는지 여부의 표시를 포함한다. 일부 양태에서, 이런 비 자연 뉴클레오타이드 접합부 서열은 보다 긴 뉴클레오타이드 서열에 포함된다. 예를 들어, 표 6의 서열은 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 포함될 수 있다.
한 실시태양에서, 온화한 조건하에서 SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산에 혼성화할 수 있는 분리된 비 자연 발생 핵산 서열이 제공된다. 한 실시태양에서, 엄격한 조건하에서 SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산에 혼성화할 수 있는 분리된 비 자연 발생 핵산 서열이 제공된다. 일부 양태에서, SEQ ID NOs: 1-48에 혼성화할 수 있는 상기 핵산 서열은 뉴클레오타이드 프로브이다. 일부 양태에서, 뉴클레오타이드 프로브는 실시간 PCR을 위해 구성된다. 일부 양태에서, 프로브는 리포터 분자로 표지된다.
또 다른 실시태양에서, SEQ ID NOs: 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 프로브 서열이 제공된다. 다른 실시태양에서, SEQ ID NOs: 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분리된 비 자연 발생 핵산 프로브 서열이 제공된다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 상기 프로브는 다음과 같은 비 자연 발생 더욱 특이적 및 구조체 특이적 뉴클레오타이드 접합부 서열에 결합할 수 있다: 54 (E12), 57 (F10), 60 (J3), 63 (J55), 66 (V11), 69 (V11), 72 (W8), 75 (X17), 78 (Y9), 81 (pSIM1278), 84 (pSIM1278), 87 (pSIM1678) 및 90 (pSIM1678).
다른 실시태양에서, SEQ ID NOs: 52-90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 프라이머 또는 프로브 서열이 제공된다. 다른 실시태양에서, SEQ ID NOs: 52-90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분리된 비 자연 발생 핵산 프라이머 또는 프로브 서열이 제공된다.
또한, PCR 및 qPCR 반응에서 사용된 표준 시약과 함께, 상기 발명에 따른 포워드 및 리버스 뉴클레오타이드 프라이머 및 뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 키트가 본 발명에 교시된다.
또한, 한 실시태양에서, 본 발명은, 안티센스 배향으로, 아스파라긴 합성효소-1 유전자(fAsn1)의 단편 및 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 3'-비번역 서열을 포함하는 DNA 절편의 두 복제물을 함유하는 제 1 침묵 카세트 및 안티센스 배향으로, 감자 포스포릴라제-L(pPhL) 유전자의 단편 및 감자 R1 유전자의 단편을 포함하는 DNA 절편의 두 복제물을 함유하는 제 2 침묵 카세트를 포함하는 pSIM1278로 불리는 식물 벡터를 제공한다.
pSIM1278 벡터는 식물 형질전환 전에 식물 DNA의 유지를 지원하고 식물 세포의 형질전환 시 식물 세포로 전이되지 않는 9,512 bp 백본 영역 및 형질전환 시 식물 세포의 게놈 속에 안정적으로 통합되는 자연 DNA를 포함하는 10,148 bp DNA 삽입체 영역을 포함한다.
또한, 다른 실시태양에서, 본 발명은 센스 배향으로 Rpi-vnt1 감자역병 저항성 유전자(Vnt1)를 포함하는 DNA 단편의 하나의 복제물을 함유하는 제 1 발현 카세트; 및 안티센스 배향으로 공포 산 전화효소(VInv) 유전자의 단편을 포함하는 DNA 절편의 두 복제물을 함유하는 제 2 침묵 카세트를 포함하는 pSIM1678로 지칭되는 식물 벡터를 제공한다.
pSIM1278 벡터는 식물 형질전환 전에 식물 DNA의 유지를 지원하고 식물 세포의 형질전환 시 식물 세포로 전이되지 않는 9,512 bp 백본 영역 및 형질전환 시 식물 세포의 게놈 속에 안정적으로 통합되는 자연 DNA를 포함하는 9,090 bp DNA 삽입체 영역을 포함한다.
본 발명은 상기 DNA 삽입체 영역이 식물에 도입되었는지를 탐지하는 방법을 제공한다. 상기한 대로, DNA의 삽입된 영역은 독특한 비 자연 뉴클레오타이드 접합부 서열의 형성을 유도한다. 이런 접합부 서열은 본 발명의 다른 곳 중에서, 표 6, 도 5 및 도 6에서 발견될 수 있다.
또한, 본 발명은 pSIM1278 및/또는 pSIM1678 벡터가 식물에 유전 재료를 도입시키는데 사용되었는지를 탐지할 수 있다. 일부 실시태양에서, 식물은 감자이다. 그러나, 본 발명에 개시된 방법 및 재료는 임의의 적합한 식물에 도입된 교시된 유전적 사건의 존재를 탐지하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 pSIM1278 및/또는 pSIM1678 벡터가 식물에 유전 재료를 도입시키는데 사용되었는지를 탐지하는데 사용될 수 있기 때문에, 상기 방법은 DNA를 식물 속에 도입하기 위해 이러한 벡터를 사용하는 임의의 식물 또는 임의의 감자 식물에서 형질전환을 탐지할 수 있다.
한 실시태양에서, 생물공학 감자 식품의 이벤트 특이적 검출을 제공하기 위한 목적으로 DNA 추출을 최적화하는 방법이 개발되었다.
교시된 사건-특이적 또는 구조체-특이적, 탐지 프로토콜에 사용된 모든 장비, 시약 및 방법의 상세한 설명이 본 발명의 특정 실시태양에 제시된다. 또한, DNA 품질에 대한 스크리닝과 함께 교시된 PCR DNA 추출 과정의 반복성을 뒷받침하기 위한 데이터가 특정 양태에 제시된다.
PCR 사건 특이적 또는 구조체 특이적 탐지의 교시된 양태 중 일부에서, 실시간 PCR에 대한 모든 절차는 식품에서 생물공학 감자의 낮은 수준(0.2-5.0%)을 탐지하는 능력의 증거와 함께 약술된다.
본 발명의 한 양태에서, 식물 DNA 벡터의 하나 이상의 침묵 카세트를 발현하는 감자 식물 품종은 다음 형질전환 사건: E12(러셋 버뱅크), J3(애틀란틱), J55(애틀란틱), F10(레인저 러셋), W8(러셋 버뱅크), V11(스노우덴), X17(레인저 러셋) 및 Y9(애틀란틱)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명은 상기 유전적 형질전환 사건 중 임의의 존재를 검출하는데 유용한 방법 및 재료를 교시한다. 이러한 사건은 감자 식물의 일부를 사용하여 탐지될 수 있다.
특정 실시태양에서, 감자 식물의 임의의 부분은 본 발명에 교시된 탐지 방법에 혼입하기 위해 유전 재료를 분리하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 교시된 방법은 배아, 원형질 세포, 분열 조직 세포, 유합조직, 꽃가루, 잎, 꽃밥, 암술, 자엽, 배축, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃, 씨앗, 잎자루, 덩이줄기, 눈 또는 감자의 줄기 식물을 원료로 사용할 것이다. 또한, 본 발명은 감자 식물로부터 생산된 임의의 제품을 원료로서 사용하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 식품은 감자 튀김, 감자 칩, 탈수 감자 재료, 감자 플레이크 또는 감자 과립이다.
특정 양태에서, 4가지 상이한 감자 품종(러셋 버뱅크, 레인저 러셋, 애틀란틱 및 스노우덴)을 pSIM1278 구조체로 형질전환시켰다. 일부 실시태양에서, 이들 감자는 "GEN1" 또는 세대 1 또는 제 1 세대로 불리며 E12(러셋 버뱅크), J3(애틀란틱), J55(애틀란틱), F10(레인저 러셋) 및 V11(스노우덴)을 포함한다.
다른 양태에서, 러셋 버뱅크, 레인저 러셋 및 애틀란틱 감자 품종은 pSIM1278 및 pSIM1678 구조체로 형질전환되었다. 일부 실시태양에서, 이들 감자는 "GEN2" 또는 세대 2 또는 제 2 세대로 불리며, W8(러셋 버뱅크), X17(레인저 러셋) 및 Y9(애틀란틱)를 포함한다.
낮은 아크릴아마이드 함량 및/또는 증가된 흑점 상처 내성을 나타낸 8개 사건이 식별되었다: E12(러셋 버뱅크), J3(애틀란틱), J55(애틀란틱), F10(레인저 러셋) 및 V11(스노우덴), X17(레인저 러셋), Y9(애틀란틱). W8, X17 및 Y9 사건은 또한 감자역병에 대한 증가된 저항력을 나타낸다. 이들 모든 사건은 본 발명에 개시된 사건 특이적 또는 구조체 특이적 탐지 방법에 의해 탐지될 수 있다.
본 발명의 한 실시 양태는 각 형질전환 사건을 유전적으로 식별하기 위해 구조체 특이적 및 품종/사건 특이적 프라이머 및 프로브 및 qPCR 조건을 교시한다.
한 양태에서, 본 발명은 E12(러셋 버뱅크), J3(애틀란틱), J55(애틀란틱), F10(레인저 러셋), W8(러셋 버뱅크), V11(스노우덴), X17(레인저 러셋) 및 Y9(애틀란틱)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형질전환 사건을 식별하는데 사용된 qPCR 방법을 교시한다.
본 발명의 한 실시양태는 (a) SEQ ID NOs 1-48을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 하나, 하나 초과 또는 전부를 포함하는 핵산의 샘플에서 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계; (b) 샘플에서 상기 SEQ ID NOs의 존재 또는 부존재를 기초로, 샘플이 식물 형질전환 사건으로부터의 유전 재료를 함유하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 형질전환 식물 사건으로부터 유래된 재료의 존재 또는 부존재에 대해 샘플을 검사하는 방법을 교시하는 방법을 교시한다. 이러한 서열은 형질전환 사건으로 인해 발생하는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 나타낸다. 이러한 비 자연 접합부 서열은 특히 접합부 서열이 유전 삽입물의 "좌측" 또는 "우측"에 포함되어 있는지 여부와 함께 표 6에 개략적으로 설명되어있다. 또한, 상기 사건의 시각적인 묘사가 특히 도 5 및 도 6에서 발견될 수 있다.
일부 양태에서, 한 샘플에서 핵산의 존재 또는 부존재는 PCR 증폭을 사용하여 탐지된다. 일부 양태에서, 실시간 PCR 증폭이 사용된다. 일부 양태에서, 교시 된 방법은 SEQ ID NOs: 52-90을 갖는 표 7의 프라이머/프로브 세트 또는 상기 프라이머/프로브 세트의 변이체를 사용한다. 일부 양태에서, SEQ ID NOs: 49-51은 대조군을 탐지하는데 사용된다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 E12에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 E12는 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 F10에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 F10은 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 J3에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 J3는 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 J55에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 J55는 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 V11에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 V11은 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 W8에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역 및 pSIM1678의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 W8은 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다. 다른 실시태양에서, 사건 W8은 감자역병 내성 유전자 Rpi-Vnt1의 발현에 효과적인 감자 DNA에 효과적인 센스 감자에 추가하여, 내인성 공포 산 전화효소 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 X17에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역 및 pSIM1678의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 X17은 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다. 다른 실시태양에서, 사건 X17은 감자역병 내성 유전자 Rpi-Vnt1의 발현에 효과적인 감자 DNA에 효과적인 센스 감자에 추가하여, 내인성 공포 산 전화효소 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 사건 Y9에 존재하는 pSIM1278의 삽입체 영역 및 pSIM1678의 삽입체 영역을 포함한다. 다른 실시태양에서, 사건 Y9는 포스포릴라제-L 및 다이키나아제 R1 유전자에 대한 내인성 감자 프로모터의 역 반복체에 추가하여, 내인성 아스파라긴 합성효소-1 유전자 및 내인성 폴리페놀 옥시다제-5 유전자의 발현의 억제에 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다. 다른 실시태양에서, 사건 Y9은 감자역병 내성 유전자 Rpi-Vnt1의 발현에 효과적인 감자 DNA에 효과적인 센스 감자에 추가하여, 내인성 공포 산 전화효소 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인 감자 DNA의 역 반복체를 함유한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 5' 말단에서 6-카복시플루오레신으로 표지되고 3' 말단에서 블랙 홀 퀸처(Black Hole Quenchers ™)로 표지된 뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 qPCR 프로토콜을 제공한다. 그러나, 임의의 혼성화 프로브 및 임의의 리포터 분자가 구성될 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다.
일부 실시태양에서, PCR 증폭의 효율은 90% 내지 110%이다. 또 다른 실시태양에서, PCR 증폭의 선형성은 R2 값에 의해 측정된다. 일부 실시태양에서, R2 값은 0.98 이상이다. 일부 실시태양에서, PCR 증폭은 60℃의 어닐링/신장 온도를 사용하여 34 내지 35 사이클의 증폭 동안 적어도 24 pg의 감자 잎 DNA를 탐지할 수 있다. 일부 실시태양에서, PCR 증폭은 강력하다. 일부 실시태양에서, PCR 증폭은 (a) 초기 변성을 위해 95℃에서 600초 동안 1회 PCR 사이클; (b) 45회 PCR 사이클: 변성을 위해 95℃에서 15초, 어닐링/신장을 위해 60초 동안 60℃을 포함하는 열 순환 조건을 가진다. 일부 실시태양에서, 열 순환 조건은 (a) 초기 변성을 위해 95℃에서 600초 동안 1회 PCR 사이클; (b) 40회 PCR 사이클: 변성을 위해 95℃에서 15초, 어닐링을 위해 60℃에서 15 초 동안, 연장을 위해 72℃에서 10초를 포함한다.
일부 실시태양에서, 샘플은 꽃, 꽃잎 조각, 꽃잎, 꽃받침, 꽃밥, 꽃가루, 종자, 잎, 잎자루, 줄기, 뿌리, 뿌리줄기, 포복지, 덩이줄기 또는 싹 또는 그 일부를 포함하는 식물 또는 그 부분을 포함하며, 식물 세포, 식물 원형질 및/또는 식물 조직 및/또는 식물 유래 물질, 바람직하게는 가공 식품 또는 사료 재료를 포함하는 식품 또는 사료 재료를 포함한다. 일부 실시태양에서, 가공 식품은 감자 튀김, 감자 칩, 탈수 감자 재료, 감자 플레이크, 감자 단백질, 감자 밀가루 및 감자 과립으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 샘플은 식품을 포함한다. 추가 실시태양에서, 식품은 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 재료의 혼합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 재료는 감자 튀김, 감자 칩, 감자 플레이크 및 감자 덩이줄기를 포함한다.
일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 덩이줄기 및/또는 튀김은 전체 식품의 약 1% 미만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 덩이줄기 및/또는 튀김은 전체 식품 제품의 약 0.5% 미만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 덩이줄기 및/또는 튀김은 전체 식품의 약 0.2%를 포함한다.
일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 칩은 전체 식품의 약 10% 미만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 칩은 총 식품의 약 5%를 포함한다.
일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 플레이크는 전체 식품의 약 15% 미만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 플레이크는 전체 식품의 약 8% 미만을 포함한다. 일부 실시태양에서, 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및/또는 Y9로부터 유래된 감자 플레이크는 전체 식품의 약 2.5%를 포함한다.
SEQ ID NOs 1-90으로부터 선택된 서열을 포함하는 분리된 뉴클레오타이드 서열이 본 발명에 교시된다.
하나 이상의 형질전환 식물 사건으로부터 유래된 재료의 잠재적인 존재 또는 부존재에 대해 샘플을 시험하기 위한 키트가 본 발명에 교시되며, 키트는 하나, 하나 이상의 또는 모든 프라이머/프로브 세트 또는 상기 프라이머/프로브 세트의 변이체를 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 상기 키트의 사용에 대한 지도/지시를 포함할 수 있다.
상기 예시적인 양태 및 실시태양 이외에, 추가적인 양태들 및 실시태양들은 다음의 설명들의 연구에 의해 명백해질 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 pSIM1278 형질전환 벡터를 나타낸다. 좌측의 벡터 백본 영역은 길이가 9,512 bp로서, 10,149 bp 위치에서 시작하여 19,660 bp 위치에서 종결된다. 백본 DNA는 주로 식물 형질전환 전에 DNA 삽입체의 유지를 지지 제공하는 박테리아 DNA로 구성된다. 플랭킹 경계 서열을 포함하는 DNA 삽입체 영역(우측)은 길이가 10,148 bp(1 bp 내지 10,148 bp)이다. DNA 삽입체는 형질전환 시 감자 게놈 내로 안정하게 통합되었다.
도 2는 pSIM1278 형질전환 벡터에 삽입된 DNA 삽입체에서 두 침묵 카세트의 개략도를 제공한다. 각각의 침묵 카세트는 스페이서에 의해 분리된 2개의 유전자 단편의 복사체를 2개씩 함유한다. 4개의 표적화된 유전자인 Asn-1, Ppo-5, Ph1 및 R1의 단편들을 포함하는 DNA 분절의 복사체 2개는 덩이줄기에서 주로 활성이며 Pro로서 표시된 2개의 수렴 프로모터(convergent promoter) 사이에 역반복체(inverted repeat)로서 삽입되었다. 생성되는 침묵 카세트를 함유하는 식물은 의도한 표적 유전자를 동적이며 역동적으로 침묵시키는 다양하고 비폴리아데닐화된(unpolyadenylated) RNA 분자 어레이를 덩이줄기에서 생성한다. RNA 분자의 크기는 일반적으로, 수렴 전사가 충돌 전사(collisional transcription)를 유도하기 때문에 적용되는 2개의 프로모터 간의 거리보다 더 작았다.
도 3은 pSIM1678 형질전환 벡터를 나타낸다. 좌측의 벡터 백본 영역은 길이가 9,512 bp로서, 9,091 bp 위치에서 시작하여 18,602 bp 위치에서 종결된다. 백본 DNA는 주로 식물 형질전환 전에 DNA 삽입체의 유지를 지지 제공하는 박테리아 DNA로 구성된다. 플랭킹 경계 서열을 포함하는 DNA 삽입체 영역(우측)은 길이가 9,090 bp(1 bp 내지 9,090 bp)이다. DNA 삽입체는 형질전환 시 감자 게놈 내로 안정하게 통합되었다.
도 4A-D는 감자 사건 E12, F10, J3 및 J55에서 DNA 삽입체의 구조의 도식을 나타낸다. 약어는 다음과 같다: A. tumefaciens T-DNA 경계와 유사한 LB = 왼쪽 경계(25 염기쌍 서열), AGP = ADP 글루코오스피로포스포릴라제 유전자의 프로모터, GBS = 과립-결합 전분 신타아제 유전자의 프로모터, RB = A. tumefaciens T-DNA 경계와 유사한 오른쪽 경계(25 염기쌍 서열), ASN1 = DNA 겔 블롯 혼성화에 사용되고 아스파라긴 합성효소 제 1 (Asn1) 유전자로부터 유래된 프로브, fASN1 = 아스파라긴 합성효소 1(Asn1) 유전자의 단편, fPPO5 = 폴리페놀 옥시다제 5(Ppo 5) 유전자의 단편, pPHL = 제 2 역 반복체 카세트에 사용된 포스포릴라제-L 유전자의 프로모터 단편, PHL = DNA 겔 블롯 혼성화에 사용되고 포스포릴라제-L 유전자의 프로모터로부터 유래된 프로브, pRL = 제 2 역 반복체 카세트에 사용된 워터 다이키나아제 R1 유전자의 프로모터의 단편, 스페이서 = 각각의 역 반복체의 암 사이의 서열, RV = 제한 효소 EcoRV, Hd = 제한 효소 Hind III, R1 = 제한 효소 EcoRI, Sc = 제한 효소 ScaI. 굵은 검은 선은 DNA 겔 블롯 혼성화에 사용된 DNA 삽입체의 다양한 영역에 대한 프로브를 나타낸다. 굽은 화살표는 각각의 개별 프로모터에 대한 전사 시작 부위를 나타낸다. 흰 화살촉은 각 역 반복체 카세트에서 소정의 유전자 또는 프로모터 단편에 대한 각 가닥의 방향(센스 또는 안티센스)을 나타낸다. 번호는 DNA 삽입체에서 뉴클레오타이드 위치를 나타낸다. 뉴클레오타이드 위치 1은 LB 이후의 AGP 프로모터의 시작이다. 표 2는 DNA 삽입체의 각 요소에 대한 자세한 내용을 제공한다. 재배품종은 다음과 같이 나타내어진다. 도 4A - F10 삽입체; 도 4B - E12 삽입체; 도 4C - J3 삽입체; 도 4D - J55 삽입체.
도 5는 플라스미드 구조체 pSIM1278 및 pSIM1678의 삽입체 영역에서 구조체-특이적 접합부를 나타낸다. 삽입체 영역 아래의 숫자는 구조체 특이적 접합부 나타내며 표 6의 SEQ ID NOs: 3-16 및 SEQ ID NOs: 42-48에 상응한다. 약어는 pSIM1278의 삽입체 영역에 대해 다음과 같다: LB = A. tumefaciens T-DNA 경계와 유사한 왼쪽 경계, pAGP = ADP 글루코오스피로포스포릴라제 유전자의 프로모터, pGbss = 과립-결합 전분 신타아제 유전자의 프로모터, RB = A. tumefaciens T-DNA 경계와 유사한 오른쪽 경계(25-염기 쌍 서열), ASN = 아스파라긴 합성효소 1(Asn1) 유전자의 단편, PPO = 폴리페놀 옥시다제 5(Ppo 5) 유전자의 단편, PHL = 제 2 역 반복체 카세트에 사용된 포스포릴라제-L 유전자의 프로모터의 단편, RL = 제 2 역 반복체 카세트에 사용된 워터 다이키나아제 R1 유전자의 프로모터의 단편, 적색 상자 = 각각의 역 반복체의 암 사이의 스페이서 서열. 약어는 pSIM1678의 삽입체 영역에 대해 다음과 같다: A. tumefaciens T-DNA 경계와 유사한 LB = 왼쪽 경계(25-염기쌍 서열), pAGP = ADP 글루코오스피로포스포릴라제 유전자의 프로모터, pGbss = 과립-결합 전분 신타아제 유전자의 프로모터, RB = A. tumefaciens T-DNA 경계와 유사한 오른쪽 경계(25-염기쌍 서열), pVnt1 = 감자역병 내성 유전자 Rpi - vnt1의 천연 프로모터, Vnt1 = 감자역병 내성을 부여하는 유전자(Phytophthora infestans), tVnt1 = 감자역병 내성 유전자 Rpi - vnt1의 자연 종결자, Inv = 공포 산 전화효소 유전자의 단편. 화살표는 각각의 역 반복체 카세트에서 소정의 유전자 또는 프로모터 단편에 대한 각 가닥(센스 또는 안티센스)의 방향 또는 소정의 프로모터에 대한 전사 방향을 나타낸다. 표 2와 4는 각 삽입체 영역의 각 요소에 대한 추가 세부 내용을 제공한다.
도 6A-I는 Innate™ 1.0 Inserts(pSIM1278) 품종 E12, F10, V11, J3, J55 및 E56 및 Innate ™ 2.0 Inserts(pSIM1278 및 pSIM1678) 품종 W8, X17 및 Y9에 대한 사건 특이적 접합부 및 구조체 특이적 접합부를 보여준다. 삽입체 영역 아래의 숫자는 구조체-특이적 접합부를 나타내며 표 6에서 발견된 SEQ ID NO와 상응한다. 삽입체 영역 위의 숫자는 사건-특이적 접합부를 나타내며 표 6에서 발견된 SEQ ID NO와 상응한다. 약어는 도 5에 기술된 바와 같다. 재배 품종 삽입체는 다음과 같이 나타내어진다: 도 6A - E12 구조; 도 6B - F10 구조; 도 6C - V11 구조; 도 6D - J3 구조; 도 6E - J55 구조; 도 6F - E56 구조; 도 6G - W8 구조; 도 6H - X17 구조; 도 6I - Y9 구조.
도 7은 레인저 러셋 사건 F10 덩이줄기, 튀김 및 플레이크 및 애틀란틱 사건 J3 덩이줄기 및 칩으로부터 식품 믹스에 대해 수행된 모든 DNA 분리가 상업용 변종 식품에 혼합된 가장 낮은 비율의 과립 Innate™ 식품에서 증폭될 수 있음을 예시한다. F10 플레이크에서 2.5%의 하나의 거짓 음성이 존재하였다. 이러한 결과는 개시된 방법이 qPCR 테스트에 사용될 충분한 품질의 DNA를 생성한다는 것을 입증한다. Innate™는 pSIM1278 및/또는 pSIM1678 형질전환 벡터로 형질전환 된 감자 식물 및 상기 식물로 만든 식품을 나타내기 위해 J.R. Simplot에 의해 사용되는 상표이다.
도 8은 표 1 및 표 2에 기술된 DNA 서열을 사용하여 플라스미드 pSIM1278을 제조하는 방법을 예시한다. 출발 벡터, pCAMBIA1301은 최종 pSIM1278 백본에서 복제의 기점을 함유한다.
도 9는 pSIM1278에서 T-DNA 발현 카세트의 제조를 예시한다. 융합 PCR을 사용하여 1A(pAgp - 제 1 복제물), 1B(pAgp - 제 2 복제물), 2(Asn1, Ppo5), 3(Ppo5, Asn1), 4(pGbss - 제 1 복제물) 및 7(스페이서1, Ppo5 , Asn1). 감자 게놈으로부터의 서열에 기초하여 Blue Heron Biotechnology, Inc.(Bothell, WA)에 의해 요소 5(PhL, R1) 및 6(스페이서2, R1, PhL, pGbss)을 합성하였다. 요소 8, 9 및 10은 도면에 도시된 빌딩 블록을 결찰하여 생성되었다. 결국, 3개의 단편, 10, 11 및 6이 원하는 발현 카세트를 연장하도록 생성되었다. 이들 3개의 단편을 결찰하고 도 8에 도시된 KpnI-SacI 제한 위치에 삽입하여 pSIM1278을 생성하였다.
도 10은 표 3 및 표 4에 기술된 바와 같은 DNA 서열을 사용하여 플라스미드 pSIM1678을 제조하는 방법을 예시한다. 출발 벡터, pSIM1278은 최종 pSIM1678 백본을 함유한다. 당업자는 실시예 및 도 9 및 도 10을 사용하여 임의의 감자 식물을 변형시킬 수 있으며, 그런 후에 본 발명에서 교시된 방법에 따라 탐지가능한 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 함유할 수 있을 것이다.
하기의 상세한 설명 및 표에서, 다수의 용어가 사용된다. 이러한 용어에 의해 제공될 범위를 포함하여, 명세서 및 청구항에 대한 명쾌하면서 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기의 정의가 제공된다:
"하나"("a" 또는 "an")란 용어는 해당 실체 중 하나 이상을 의미한다; 예를 들어, "프라이머"는 하나 이상의 프라이머 또는 적어도 하나의 프라이머를 의미한다. 이와 같이, 용어 "하나"("a"(또는 "an")), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 여기서 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 "한 요소"에 대한 언급은 문맥이 하나의 요소 및 하나의 요소만이 존재하는 것을 명확하게 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "대립 유전자"는 하나의 형질 또는 특징에 관한, 하나 이상의 다른 형태의 유전자 중 임의의 유전자이다. 이배체 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자의 2개의 대립 유전자들은 한 쌍의 상동 염색체상에서 상응하는 유전자 좌를 차지한다.
본 발명에서 사용된 용어 "아미노산 서열"은 식물로부터 단리되거나, 식물에 고유하거나, 식물에 자연적으로 존재하거나, 또는 합성에 의해 제조되나 내인성 대응물의 핵산 서열을 포함하는 올리고펩타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 및 이들의 단편을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "인공적으로 조작됨"은 조작되지 않는 자연적으로 발생하는 대응물과 비교해 상이한 생물학적, 생화학적, 형태학적 또는 생리학적 표현형 및/또는 유전자형을 가지는 식물 또는 식물 세포를 생산하기 위해, 식물 또는 식물 세포를, 수동적으로 또는 기계적 수단이나 재조합 수단, 예컨대 유전자 조작 기술에 의해 이동시키거나, 배열하거나, 작동시키거나 또는 조절하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "무성 번식"은 배우자(gamete)의 융합을 수반하지 않는 잎 절단부, 줄기 절단부, 뿌리 절단부, 덩이줄기 눈, 포복지(stolon), 단일 식물 세포 원형질체, 캘러스 등으로부터 전체 식물을 발생시킴으로써 자손을 생산하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "백본"은 전달용으로 의도되는 DNA 삽입체 서열을 배제한 바이너리(binary) 벡터의 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "역교배"는 재배자가 잡종 자손을 부모 중 하나로 다시 반복하여 교배시키는 과정으로서, 예를 들어, 제1세대 잡종 F1을 F1 잡종의 부모 유전자형 중 하나와 교배시키는 과정이다.
본 발명에서 사용된 용어 "흑점 상처"는 상처가 난 덩이줄기 조직에서 확인되는 흑점은 세포 손상 후 생성되며 조직에 갈색, 회색 또는 흑색의 외양을 제공하는 멜라닌이라는 색소의 결과인 상태를 기술한다. 멜라닌은 세포 손상의 결과, 페놀 기질과 적절한 효소가 서로 접촉하게 될 때 형성된다. 손상은 파괴된 세포를 필요로 하지 않는다. 그러나, 통상적으로 조직이 충격을 받을 때, 기질과 효소의 혼합이 발생해야 한다. 흑점은 주로 관다발 둘레 바로 아래에 위치하는 주골수(perimedullary) 조직에서 발생하지만, 피층(cortical) 조직의 일부를 포함하기에 충분할 정도로 클 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "경계-유사 서열(border-like sequence)"은 다음을 의미한다. "경계-유사" 서열은 변형되어야 하는 선별된 식물종으로부터 단리되거나, 변형되어야 하는 식물종과 타가수정 가능한 식물로부터 단리되며, 아그로박테 리움의 경계 서열과 유사하게 작용한다. 즉, 본 발명의 경계-유사 서열은 이것이 연결되는 폴리뉴클레오타이드의 통합을 촉진하고 용이하게 한다. 본 발명의 DNA 삽입체는 바람직하는 경계-유사 서열을 함유한다. 경계-유사 서열은 길이가 5 bp 내지 100 bp, 길이가 10 bp 내지 80 bp, 길이가 15 bp 내지 75 bp, 길이가 15 bp 내지 60 bp, 길이가 15 bp 내지 50 bp, 길이가 15 bp 내지 40 bp, 길이가 15 bp 내지 30 bp, 길이가 16 bp 내지 30 bp, 길이가 20 bp 내지 30 bp, 길이가 21 bp 내지 30 bp, 길이가 22 bp 내지 30 bp, 길이가 23 bp 내지 30 bp, 길이가 24 bp 내지 30 bp, 길이가 25 bp 내지 30 bp, 또는 길이가 26 bp 내지 30 bp이다. DNA 삽입체 좌측 및 우측 경계 서열은 변형되어야 하는 식물의 게놈으로부터 단리될 수 있고/되거나 게놈에 고유할 수 있다. DNA 삽입체 경계-유사 서열은 뉴클레오타이드 서열 면에서, 임의의 공지된 아그로박테리움-유래 T-DNA 경계 서열과 동일하지 않다. 따라서, DNA 삽입체 경계-유사 서열은 아그로박테리움 종, 예컨대 아그로박테리움 투메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens ) 또는 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes ) 유래의 T-DNA 경계 서열과 상이한 뉴클레오타이드를 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상 가질 수 있다. 즉, 본 발명의 DNA 삽입체 경계 서열 또는 경계-유사 서열은 아그로박테리움 종, 예컨대 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스 유래의 T-DNA 경계 서열과 95% 이상, 90% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상의 서열 동일성을 가지나, 100%의 서열 동일성을 가지진 않는다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, 설명적인 용어 "DNA 삽입체 경계" 및 "DNA 삽입체 경계-유사"는 교환할 수 있다. 경계-유사 서열은 식물 게놈으로부터 단리되며, 뉴클레오타이드 서열을 또 다른 뉴클레오타이드 서열 내로 통합시킬 수 있는 효율을 변화시키기 위해 변형 또는 돌연변이될 수 있다. 다른 폴리뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 경계-유사 서열에 첨가되거나 경계-유사 서열 내에 혼입될 수 있다. 따라서, DNA 삽입체 좌측 경계 또는 DNA 삽입체 우측 경계는 5'- 및 3'- 다중 클로닝 부위, 또는 부가적인 제한 부위를 가지도록 변형될 수 있다. DNA 삽입체 경계 서열은 동반(accompanying) 벡터 유래의 백본 DNA가 식물 게놈 내로 통합되지 않는 가능성을 높이기 위해 변형될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "칩"은 바삭바삭할 때까지 바싹 튀기거나 구운 감자의 얇은 조각이다. 감자 칩은 일반적으로 전채, 반찬 또는 간식으로 제공된다. 칩은 또한 파삭파삭한 것으로 알려져 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 본 명세서 및 청구범위 및 이의 변형에 사용된 동사 "포함한다"는 그 단어에 후속하는 항목이 포함되지만 특별히 언급되지 않은 항목은 배제되지 않는다는 것을 의미하는 비 제한적인 의미로 사용된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 특정 요소들"로 본질적으로 구성되는" 조성물은 이들 요소의 포함뿐만 아니라 본 발명의 조성물의 기본적이며 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소들의 포함으로 제한된다. 따라서, 조성물이 본 발명의 기본적이며 신규한 특징에 영향을 미치지 않는 한, 즉, 선별된 식물종 또는 선별된 식물종과 타가수정 가능한 식물로부터 유래되지 않는 외래 DNA를 포함하지 않는 한, 해당 조성물은 "로 본질적으로 구성되는"이란 용어로 특징지어지는 본 발명의 조성물의 성분인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "떡잎"은 자엽(seed leaf)의 한 유형이다. 떡잎은 씨앗의 양분 저장 조직을 함유한다.
본 발명에 사용된 용어 "퇴화 프라이머(degenerate primer)"는 정확하진 않지만 유사한 상동성을 가진 서열에 혼성화되는 경우, 염기 미스매치를 수용할 수 있기에 충분한 뉴클레오타이드 변이를 함유하는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명에 사용된 용어 "쌍떡잎(dicotyledon)" 또는 쌍자엽(dicot)은 배가 2개의 자엽 또는 떡잎을 가지는 꽃식물이다. 쌍자엽의 예는 담배, 토마토, 감자, 고구마, 카사바, 알팔파(alfalfa) 및 대두를 비롯한 콩과식물(legume), 당근, 딸기, 상추, 오크(oak), 단풍나무, 호두나무, 장미, 민트, 호박(squash), 데이지 및 선인장을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 용어 "DNA 삽입체"는 식물의 게놈에 삽입되어야 하는 DNA 삽입체는 해당 식물에 고유한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 해당 식물에 고유한 유전적 요소를 가진다. 일례에서, 예를 들어, 본 발명의 감자품종 J3의 DNA 삽입체는 형질전환 시 식물 세포의 게놈에 안정적으로 통합되며, 흑점 상처의 발현, 아스파라긴 축적 및 노화 감미에 관여하는 유전자를 침묵시키는 감자 또는 야생형 감자에 고유하거나 타가수정 가능한 감자 식물에 고유한 10,147 bp의 비-암호화 폴리뉴클레오타이드이다. DNA 삽입체는 바람직하게는 2개의 발현 카세트를 포함하며, pSIM1278 형질전환 벡터로 지칭되는 형질전환 벡터 내로 삽입된다. 제 1 카세트는 ADP 글루코오스피로포스포릴라제 유전자(Agp)의 Agp 프로모터와 과립-결합 전분 신타아제 유전자(Gbss)의 Gbss 프로모터 사이에서 역반복체로서 배열되는 아스파라긴 신타아제-1 유전자(Asn1) 및 폴리페놀옥시다제-5 유전자(Ppo5)의 단편을 둘 다 포함한다. 이들 프로모터는 덩이줄기에서 주로 활성이다. 제 2 카세트의 기능은 전분-연관 유전자 다이키나아제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL)의 프로모터를 침묵시키는 것이다. 이 카세트는 제 1 카세트와 동일한 Agp 프로모터 및 Gbss 프로모터에 작동가능하게 연결된, 전분-연관 유전자 다이키나아제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL)의 프로모터들의 단편으로 구성된다. 이런 발현 카세트는 외래 DNA를 함유하지 않으며, 선별된 식물종 유래의 DNA 또는 선별된 식물종과 타가수정 가능한 식물 유래의 DNA로만 구성된다.
본 발명에 사용된 용어 "비 자연 뉴클레오타이드 접합부" 또는 "비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부"는 자연계에서 발생하지 않는 뉴클레오타이드의 서열을 의미한다. 오히려, 이러한 서열은 유전적 형질전환 사건을 통해 형성된다. 상기한 바와 같이, 본 발명에 기술된 유전적 형질전환 사건은 비 자연 감자 DNA를 함유하지 않는 발현 카세트로 생성된다. 따라서, 이런 비 자연적 뉴클레오타이드 접합부는 감자 뉴클레오타이드로 구성되지만, 이런 뉴클레오타이드는 감자의 유전적 형질전환 동안 자연적으로 발생하지는 않지만 인간의 조작에 기인한 유전적 배열에 존재한다. 표 6은 이런 접합부 서열의 실시태양을 기술한다. 사건-특이적 접합부 서열의 경우, 표 6은 접합부의 한쪽 면에서 형질전환된 감자의 뉴클레오타이드가 발견되고 접합부의 다른 면에서 형질전환 사건을 통해 삽입된 뉴클레오타이드가 발견된다는 것을 예시한다. 따라서, 사건-특이적 접합부 서열의 경우, 비 자연 뉴클레오타이드 접합부는 삽입된 뉴클레오타이드가 감자 식물의 천연 뉴클레오타이드를 만나는 경계를 나타낸다. 또한 표 6에 구조체 접합부가 예시된다. 이런 고유한 접합부 서열은 모든 형질전환 사건에서 나타나며 특정 사건에 특유한 것이 아니라, 형질전환을 수행하기 위해 pSIM1278 구조체 및/또는 pSIM1678 구조체를 사용하는 어떠한 사건에도 존재할 것이다. 이런 접합부는 구조체 내에 함유된 다양한 유전적 요소의 서열을 나타내며, 예를 들어 접합부는 ASN 및 PPO(ASN/PPO) 요소가 결합된다. 이런 구조체-특이적 접합부는 도 5를 참조하면 쉽게 시각화된다.
본 발명에 사용된 용어 "효율"은 실시간 PCR 분석의 특징을 의미한다. 이상적인 qPCR(정량적 PCR) 반응은 -3.32의 기울기로 100%의 효율을 가지며, 이는 각 사이클 동안 PCR 생성물의 완벽한 배가와 관련이 있다. 그러나, 90 내지 110%의 효율을 가진 3.1 내지 -3.6의 기울기는 일반적으로 허용가능 하다고 생각된다(Commission, C. A. (2009). Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories ( ENGL ), (October 2008), 1-8). 효율은 복제된 표준 곡선에 의해 결정된다. 증폭 효율은 표준 곡선의 로그 선형 부분의 기울기로부터 결정되며 E= (10(-1/slope) -1)*100로 계산된다(Bustin, S. A., et al. (2009). MIQE 지침: 정량 실시간 PCR 실험의 출판을 위한 최소 정보. Clinical Chemistry, 55(4), 1-12. doi:10.1373/clinchem. 2008.112797).
본 발명에 사용된 용어 "배"는 성숙 씨앗 내에 함유된 미성숙 식물이다.
본 발명에 사용된 용어 "사건"은 전체 형질전환 식물을 생성하는데 사용된 하나의 식물 세포에서 일어난 독특한 DNA 재조합 사건을 의미한다. 식물 세포는 관심의 DNA 삽입체를 운반하는 이진 형질전환 벡터로 형질전환된다. 형질전환된 세포는 형질전환 식물로 재생되며, 각각의 생성된 형질전환 식물은 독특한 사건을 나타낸다. 서든 블롯 혼성화 또는 PCR과 같은 분자 기술은 각각의 형질전환된 사건을 확인하는데 사용된다. 각각의 유래된 사건은 약어(예를 들어, J3)로 식별된다. 상이한 사건은 세포 게놈 내의 DNA 삽입물의 수, 게놈 내의 DNA 삽입체 복제물의 배열 및/또는 DNA 삽입 위치의 차이를 갖는다. DNA 삽입체 및 형질의 전시에서 유전자의 최적 발현을 일으키는 사건은 분석되고 더 연구될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 핵산과 관련하여 "외래"는 해당 핵산이 비-식물 유기체로부터 유래되거나, 형질전환되어야 하는 식물과 동일한 종인 아닌 식물로부터 유래되거나, 형질전환되어야 하는 식물과 교배할 수 없는 식물로부터 유래되며, 또는 표적 식물의 종에 속하지 않음을 의미한다. 본 발명에 따르면, 외래 DNA 또는 RNA는 균류, 박테리아, 바이러스, 포유류, 어류 또는 조류의 유전적 구성(genetic makeup)에 자연적으로 존재하나, 형질전환되어야 하는 식물에는 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 나타낸다. 따라서, 외래 핵산은 예를 들어, 형질전환된 식물에 의해 자연적으로 생성되지 않는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이다. 외래 핵산은 단백질 생성물을 암호화해야 할 필요는 없다. 본 발명에 따르면, 원하는 유전자내 식물은 이의 게놈 내에 통합되는 임의의 외래 핵산을 함유하지 않는 식물이다.
본 발명에 사용된 용어 "플레이크"는 뜨거운 물이나 우유를 첨가하여 으깬 감자의 비슷한 유사체를 생산함으로써 재구성될 수 있는 포장된 편의 식품을 만들기 위해 쿠킹, 매싱 및 탈수의 산업 공정을 통해 만들어진 감자 플레이크를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이"는 바싹 튀긴 감자의 막대기이다. 프라이는 부드럽거나 바삭바삭하게 뜨겁게 제공되는 구운 감자의 긴 조각이며 일반적으로 점심 또는 저녁 식사와 함께 먹거나 간식으로 먹는다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자"는 암호화 영역을 지칭하며, 해당 영역에 대해 5'- 또는 3'-인 뉴클레오타이드 서열은 포함하지 않는다. 기능성 유전자는 프로모터 또는 종결자에 작동가능하게 연결되는 암호화 영역이다. 유전자는 상이한 종 유래이든지 또는 동일한 종 유래이든지 간에, 형질전환 또는 다양한 육종 방법을 이용하여, 종의 게놈 내로 도입될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "변환된 유전자" 또는 "변환"은 역교배로 일컬어지는 식물 육종 기술에 의해 개발되는 식물을 지칭하며, 여기서, 역교배 기술, 유전자 조작 또는 돌연변이를 통해 품종 내로 전달되는 하나 이상의 유전자 외에도, 품종의 원하는 형태학적 특징 및 생리학적 특징들은 실질적으로 모두 복귀된다. 하나 이상의 유전자 좌 또한 전달될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자 재배열"은 생체 내에서뿐만 아니라 시험관 내에서 자발적으로 발생할 수 있는 유전적 요소의 재연관(re-association)을 지칭하며, 이는 유전적 물질의 새로운 조직화(organization)를 도입한다. 예를 들어, 상이한 염색체의 유전자 좌에서 폴리뉴클레오타이드를 함께 스플라이싱하는 것은 식물 발달 및 생식적 재조합(sexual recombination) 동안에 생체 내에서 자발적으로 일어날 수 있다. 따라서, 시험관 내에서 비-자연적인 유전적 변형 기술에 의한 유전적 요소의 재조합은 마찬가지로 생체 내에서 생식적 재조합을 통해 일어날 수 있는 재조합 이벤트와 흡사하다.
본 발명에 사용된 용어 "배축"은 떡잎과 뿌리 사이의 배 또는 묘목의 부분이다. 따라서, 배축은 순(shoot)과 뿌리 사이의 전이 구역으로서 간주될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "틀 내에서(in frame)"은 다음을 의미한다. 뉴클레오타이드 트리플릿(triplet)(코돈)은 식물 세포에서 원하는 재조합 단백질의 초기(nascent) 아미노산 서열로 번역된다. 구체적으로, 본 발명은 해독틀 내에서 제 2 핵산에 연결된 제 1 핵산을 고려하며, 여기서, 제 1 뉴클레오타이드 서열은 유전자이며, 제 2 뉴클레오타이드는 프로모터 또는 유사한 조절 요소이다.
본 발명에 사용된 용어 "통합하다"는 선별된 식물종 유래의 핵산 서열, 선별된 식물과 동일한 종 유래의 식물 유래의 핵산 서열, 또는 선별된 식물종과 타가수정 가능한 식물 유래의 핵산 서열의 선별된 식물종의 세포 게놈 내로의 삽입을 의미한다. "통합"은 고유한 유전적 요소만의 식물 세포 게놈 내로의 혼입을 의미한다. 고유한 유전적 요소를 예컨대 상동성 재조합에 의해 통합하기 위해, 본 발명은 이러한 과정에서 하나의 단계로서 고유한 것이 아닌 DNA를 "사용"할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특정한 DNA 분자의 "사용"과 특정한 DNA 분자의 식물 세포 게놈 내로의 "통합"을 구별한다.
본 발명에 사용된 용어 "도입"은 감염, 형질감염, 형질전환 또는 형질도입을 포함하는 방법에 의해, 핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "단리된"은 임의의 핵산 또는 화합물이 이의 정상적이며 고유한 환경으로부터 물리적으로 분리되는 것을 의미한다. 단리된 물질은 예를 들어, 용매, 완충제, 이온 또는 그 외의 성분을 함유하는 적합한 용액에서 유지될 수 있으며, 정제된 형태 또는 비정제된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "감자역병"은 난균성 감자역병균(oomycete Phytophthora infestans)에 의해 유발되고 감자 식물의 잎, 줄기, 과일 및 덩이줄기를 감염시키고 파괴할 수 있는 '감자 마름병'으로도 알려진 감자 병을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "리더"는 유전자의 앞쪽에 있으며(또는 5'까지) 전사는 되지만 번역은 되지 않는 서열을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "탐지 수준" 또는 "LOD"는 GMO 실험실의 유럽 네트워크에 따라, 단일 실험실 검증에 의해 입증된 바와 같이, 신뢰할 수 있게 탐지될 수 있지만 반드시 정량화될 수 없는 한 시료 내의 분석물의 최저량 또는 농도이다.
본 발명에 사용된 용어 "선형성"은 최적화된 실시간 PCR 분석의 특징을 나타내며 ≥0.98이어야 하는 선형 회귀 분석에 의해 얻은 R2 값에 의해 결정된다 (Bustin et al., 2009).
본 발명에 사용된 용어 "유전자 좌"는 하나 이상의 형질, 예를 들어, 웅성 불임, 제초제 저항성, 곤충 저항성, 질병 저항성(disease resistance), 찰녹말(waxy starch), 변형 지방산 대사, 변형 피틴산 대사, 변형 탄수화물 대사 및 변형 단백질 대사를 부여한다. 형질은 예를 들어, 역교배, 자연 돌연변이 또는 유도 돌연변이, 또는 유전적 형질전환 기술을 통해 도입되는 이식유전자에 의해 품종의 게놈 내로 도입되는 자연적으로 존재하는 유전자에 의해 부여될 수 있다. 유전자 좌는 단일 염색체 위치에서 통합되는 하나 이상의 대립 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상품 수율"은 직경이 2인치 내지 4인치인 수확되는 모든 덩이줄기의 중량이다. 상품 수율은 cwt(100웨이트(hundred weight))로 측정되며, 여기서, cwt는 100파운드이다.
본 발명에 사용된 용어 "외떡잎(monocotyledon)" 또는 "단자엽(monocot)"은 배가 떡잎 또는 자엽을 하나 가지는 꽃식물이다. 단자엽의 예는 잔디풀, 옥수수, 쌀, 귀리, 밀, 보리, 수수, 난초, 붓꽃, 백합, 양파 및 야자나무(palm)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "고유한" 유전적 요소는 형질전환되어야 하는 식물의 게놈에 자연적으로 존재하거나, 게놈으로부터 기원하거나, 게놈에 속하는 핵산을 지칭한다. 따라서, 형질전환되어야 하는 식물 또는 식물종의 게놈으로부터 단리되거나, 형질전환되어야 하는 식물종과 타가수정 가능하거나 교배가능한(interfertile) 식물 또는 종으로부터 단리되는 임의의 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA, mRNA 또는 cDNA 분자는 식물종에 "고유한", 즉, 토종(indigenous)이다. 즉, 고유한 유전적 요소는 전형적인 식물 육종을 통한 식물의 개량을 위해 식물 재배자가 접근할 수 있는 모든 유전적 물질을 나타낸다. 고유한 핵산의 임의의 변이체 또한, 본 발명에 따르면 "고유한" 것으로 간주된다. 이러한 면에서, "고유한" 핵산은 또한, 식물 또는 이의 타가수정 가능한 종으로부터 단리되고, 변형 또는 돌연변이화되어, 생성되는 변이체는 식물로부터 단리되는 비변형된 고유한 핵산과 뉴클레오타이드 서열이 99% 이상, 98% 이상, 97% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 94% 이상, 93% 이상, 92% 이상, 91% 이상, 90% 이상, 89% 이상, 88% 이상, 87% 이상, 86% 이상, 85% 이상, 84% 이상, 83% 이상, 82% 이상, 81% 이상, 80% 이상, 79% 이상, 78% 이상, 77% 이상, 76% 이상, 75% 이상, 74% 이상, 73% 이상, 72% 이상, 71% 이상, 70% 이상, 69% 이상, 68% 이상, 67% 이상, 66% 이상, 65% 이상, 64% 이상, 63% 이상, 62% 이상, 61% 이상 또는 60% 이상 유사할 수 있다. 고유한 핵산 변이체는 또한 뉴클레오타이드 서열이 약 60% 미만, 약 55% 미만 또는 약 50% 미만 유사할 수 있다. 식물로부터 단리된 "고유한" 핵산은 또한 해당 핵산으로부터 전사 및 번역되는 자연적으로 존재하는 단백질 생성물의 변이체를 암호화할 수 있다. 따라서, 고유한 핵산은 핵산이 단리되었던 식물에서 발현되는 비변형된 고유한 단백질과 아미노산 서열이 99% 이상, 98% 이상, 97% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 94% 이상, 93% 이상, 92% 이상, 91% 이상, 90% 이상, 89% 이상, 88% 이상, 87% 이상, 86% 이상, 85% 이상, 84% 이상, 83% 이상, 82% 이상, 81% 이상, 80% 이상, 79% 이상, 78% 이상, 77% 이상, 76% 이상, 75% 이상, 74% 이상, 73% 이상, 72% 이상, 71% 이상, 70% 이상, 69% 이상, 68% 이상, 67% 이상, 66% 이상, 65% 이상, 64% 이상, 63% 이상, 62% 이상, 61% 이상 또는 60% 이상 유사한 단백질을 암호화할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "자연적으로 발생하는 핵산"은 선별된 식물종의 게놈 내에서 확인되며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 식물종의 게놈에 통상적으로 존재하는 제한 부위의 서열은 해당 제한 부위가 해당 게놈으로부터 물리적으로 단리되지 않았더라도, 벡터 또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 외인성 DNA 분자 내로 조작될 수 있다. 따라서, 본 발명은 해당 서열이 선별된 식물종, 또는 형질전환되어야 하는 선별된 식물종과 타가수정 가능한 식물의 게놈에 자연적으로 존재하는 한, 제한 효소 인지 서열과 같은 뉴클레오타이드 서열을 합성 제조할 수 있게 한다.
본 발명에 사용된 용어 "작동가능하게 연결됨"은 조합된 상태에서 2개 이상의 분자들이 식물 세포에서 적절하게 작용하는 방식으로, 이들 분자를 조합하는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 구조 유전자의 전사를 조절하는 경우, 구조 유전자에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에서 사용된 용어 "식물"은 속씨식물 및 겉씨식물, 예컨대 감자, 토마토, 담배, 알팔파, 상추, 당근, 딸기, 사탕무, 카사바, 고구마, 대두, 옥수수, 잔디풀, 밀, 쌀, 보리, 수수, 귀리, 오크, 유칼립투스, 호두나무 및 야자나무를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 식물은 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, 단어 "식물"은 또한 유성 생식 또는 무성 생식으로 발생되든지 간에 식물 세포, 씨앗, 식물 자손, 주아(propagule), 및 절단부 또는 씨앗과 같은 이들 중 임의의 자손을 포함한다. 식물 세포는 현탁 배양물, 캘러스, 배, 분열조직 영역, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 순, 배우체(gametophyte), 포자체(sporophyte), 화분, 씨앗 및 소포자(microspore)를 포함한다. 식물은 다양한 성숙 단계들에 있을 수 있으며, 액체 배양물이나 고체 배양물, 또는 포트(pot), 온실 또는 필드 내의 토양 또는 적합한 매질에서 생장할 수 있다. 식물에서 도입된 리더, 트레일러(trailer) 또는 유전자 서열의 발현은 일시적이거나 영구적일 수 있다. "선별된 식물종"은 이들 "식물" 중 임의의 하나의 종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "식물 부분"(또는 감자식물 또는 이의 일부)은 원형질체, 잎, 줄기, 뿌리, 근단, 꽃밥, 암술, 씨앗, 배, 화분, 밑씨(ovule), 떡잎, 배축, 꽃, 덩이줄기, 눈, 조직, 잎꼭지, 세포, 분열조직 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "식물종"은 생식적인 친화성을 적어도 일부 나타내는 공식적으로 명명되는 식물종에 속하는 식물군이다.
본 발명에서 사용된 용어 "식물 형질전환" 및 "세포 배양"은 광범위하게는, 식물 세포가 유전적으로 변형되고, 유지, 추가적인 생장 및/또는 추가적인 발달에 적절한 식물배양 배지로 전달되는 과정을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "정확한 육종(precise breeding)"은 선별된 식물종, 선별된 식물과 동일한 종의 또 다른 식물, 또는 선별된 식물종과 타가수정 가능한 종으로부터 단리된 핵산, 예컨대 고유한 유전자 및 조절 요소를 개별 식물 세포 내로 안정하게 도입한 다음, 이들 유전적으로 변형된 식물 세포를 식물 전초(whole plant) 내로 재생시킴으로써 식물을 개량하는 것을 의미한다. 알려지지 않은 핵산 또는 외래 핵산이 식물 게놈 내로 영구적으로 혼입되기 때문에, 본 기술은 종래의 식물 육종을 통해서도 접근가능한 동일한 유전적 물질을 이용한다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이머"는 관심의 핵산 서열에 어닐링하는 올리고 뉴클레오타이드이다. 프라이머는 핵산 합성을 위한 시작점으로서 역할을 한다. 이 과정을 촉매하는 하나의 효소인 DNA 중합효소는 DNA 프라이머의 3' 말단에 새로운 뉴클레오타이드를 추가하고 반대 가닥을 복제한다. 예를 들어, 관심의 DNA 서열에 상보적인 포워드 및 리버스 프라이머는 관심의 DNA 영역을 증폭하기 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석에 사용된다.
본 발명에 사용된 용어 "프로브"는 방사성 표지, 바이오틴, 다이옥시게닌 또는 플루오레세인과 같은 탐지가능한 분자로 표지되고 관심의 핵산 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 6-FAM(6-카복시플루오레신)으로 5' 말단에 표지되고 BHQ1(Black Hole Quenchers™ 1)로 3' 말단에 표지된 프로브는 관심의 핵산 서열의 탐지를 위해 실시간 PCR에서 사용된다. 그러나, 프로브라는 용어는 프로브가 거기에 부착된 r 표지를 갖는지와 관계없이, 자연 발생 핵산 결합 서열에 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미하기 위해보다 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "자손"은 본 발명에서 사용된 것과 같이, 2개의 감자식물의 교배로부터 생산되는 F1 감자식물을 포함하며 자손은 추가로, 재현성 부모 라인(recurrent parental line)과의 F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9 및 F10 세대간 교배(generational cross)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "양적 형질 유전자 좌(Quantitative Trait Loci"(QTL)는 통상 계속해서 분포되는 수적으로 대표적인 형질을 어느 정도 조절하는 유전자 좌를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합"은 본 발명에서 사용된 바와 같이 유전자가 클로닝될 수 있으며, DNA가 서열화될 수 있고, 단백질 생성물이 생성될 수 있는 다양한 기술들을 광범위하게 의미한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 또한 유전자가 식물 숙주 시스템의 세포 내로 전달된 후 생성된 단백질을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "재생"은 조직 배양으로부터의 식물의 발달을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "조절 서열"은 식물 시스템에서 관심 유전자의 전사 또는 생성되는 RNA의 번역을 증가시키고/거나 최대화하기 위해 발현 벡터에 포함될 수 있는 당해 기술분야에서 표준이며 공지되어 있는 서열을 지칭한다. 이들은 프로모터, 펩타이드 이출(export) 신호 서열, 인트론, 폴리아데닐화 및 전사 종결 부위를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 식물에서 발현 수준을 증가시키기 위해 핵산 구축물을 변형시키는 방법 또한 일반적으로 당해 기술분야에서 공지되어 있다(예를 들어, Rogers et al., 260 J. Biol . Chem . 3731-38, 1985; Cornejo et al., 23 Plant Mol . Biol . 567: 81,1993 참조). 단백질의 전사율에 영향을 미치기 위해 식물 시스템을 조작하는 경우, 양성 작동 서열 또는 음성 작동 서열, 인핸서 및 사일런서와 같은 조절 서열뿐만 아니라 염색질 구조를 비롯하여 당해 기술분야에 공지된 다양한 인자들이 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은 이들 인자 중 적어도 하나가 관심 단백질을 발현시키기 위해 식물을 조작하는 데 이용될 수 있다는 것을 제공한다. 본 발명의 조절 서열은 고유한 유전적 요소로서, 즉, 변형되어야 하는 선별된 식물종으로부터 단리된다.
본 발명에 사용된 용어 "선별성 마커"는 전형적으로, 항생제, 제초제 또는 독성 화합물에 대한 일부 종류의 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 형질전환 이벤트를 확인하는 데 사용된다. 선별성 마커의 예는 스트렙토마이신 저항성을 암호화하는 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제(spt) 유전자, 만노스-6-포스페이트를 프룩토스-6 포스페이트로 변환시키는 포스포만노스 이소머라제(pmi) 유전자, 카나마이신 및 게네티신 내성을 암호화하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(nptII) 유전자, 하이그로마이신에 대한 저항성을 암호화하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt 또는 aphiv) 유전자, 설포닐우레아-유형 제초제에 대한 저항성을 암호화하는 아세토락테이트 신타아제(als) 유전자, 포스피노트리신 또는 바스타(basta)와 같이 글루타민 신타아제의 작용을 저해하는 제초제에 대한 저항성을 암호화하는 유전자(예, 바르(bar) 유전자), 또는 당해 기술분야에 공지되어 있는 다른 유사한 유전자를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "센스 억제"는 유전자이식 식물에서 해당 유전자의 모두 또는 일부의 하나 이상의 부가적인 복사체의 발현에 의해 내인성 유전자의 발현의 감소이다.
본 발명에 사용된 용어 "비중"은 밀도의 표현으로서, 감자 품질의 측정값이다. 덩이줄기의 비중 및 전분 함량 및 건조 물질 또는 총 고체의 백분율 사이에는 높은 상관관계가 있다. 비중이 높을수록, 회수율이 높아지고, 가공 제품의 품질이 양호해진다.
본 발명에서 사용된 용어 "엄격한 조건"은 특정 혼성화가 형성되지만 비특이적 혼성화가 형성되지 않거나 형성되기 어려운 조건을 의미한다. 예를 들어, 엄격한 조건은 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부의 DNA와 높은 상동성(90% 이상, 또는 95% 이상)을 갖는 DNA - 예를 들어, 표 6의 서열과 높은 상동성을 갖는 서열을 갖는 프로브 서열이 상기 서열에 혼성화하는 조건일 수 있다. 엄격한 조건은 혼성화가 완벽한 혼성화의 용융 온도(Tm)보다 약 5℃ 내지 약 30℃(약 10℃ 내지 약 25℃) 낮은 온도에서 일어나는 조건을 의미할 수 있다. 예를 들어, J. Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(특히 §11.45 "Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"에 기술된 조건)에 기술된 조건은 엄격한 조건으로 사용될 수 있다. 따라서, 두 핵산 서열이 실질적으로 상동하다는 표시는 두 분자가 엄격한 조건하에서 서로 혼성화된다는 것이다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 상이한 환경 변수하에서 상이하다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(Tm)보다 약 5℃ 내지 20℃ 낮도록 선택된다. Tm은 주어진 DNA 서열의 모든 분자의 50%가 이중 가닥으로 혼성화되고 50%가 단일 가닥으로 존재하는 섭씨 온도로 정의된다.
본 발명에 사용된 용어 "T-DNA-유사" 서열은 선별된 식물종, 또는 선별된 식물종과 타가수정 가능한 식물로부터 단리되며, 아그로박테리움 종 T-DNA와 100%는 아니지만 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열이다. T-DNA-유사 서열은 각각이 뉴클레오타이드 서열을 또 다른 폴리뉴클레오타이드 내로 통합시킬 수 있는 하나 이상의 경계 서열 또는 경계-유사 서열을 함유할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "총 수율"은 수확된 모든 덩이줄기들의 총 중량을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "트레일러"는 유전자 뒤에 있으면서(또는 3'까지) 전사는 되지만 번역은 되지 않는 서열을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "전사된 DNA"는 유전자, 및 해당 유전자와 연관있는 비번역 리더와 트레일러 서열 둘 다를 포함하는 DNA이다. 이 유전자는 선행 프로모터의 작동에 의해 단일 mRNA로서 전사된다.
본 발명에 사용된 용어 "식물 세포의 형질전환"은 DNA가 식물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 과정이다. "안정하게"란, 세포 게놈에서 세포 게놈에 의한 폴리뉴클레오타이드의 영구적이거나 비-일시적인 체류 및/또는 발현을 지칭한다. 따라서, 안정하게 통합되는 폴리뉴클레오타이드는 형질전환된 세포 게놈 내에서 고정체(fixture)이며, 세포 또는 생성되는 형질전환 식물의 잇따른 자손을 통해 복제 및 번식될 수 있는 것이다. 형질전환은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있는 다양한 방법들을 이용하여 자연적이거나 인공적인 조건하에 이루어질 수 있다. 형질전환은 아그로박테리움-매개 형질전환 프로토콜, 바이러스 감염, 위스커(whisker), 전기천공, 열 쇼크, 리포펙션(lipofection), 폴리에틸렌 글리콜 처리, 미세-주사(micro-injection) 및 입자 충격(particle bombardment)을 포함하는 핵산 서열을 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포 내로 삽입하는 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "이식유전자"은 숙주 게놈 내로 삽입될 유전자이다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자이식 식물"은 적어도 하나의 이식유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 식물이다.
본 발명에 사용된 용어 "덩이줄기"는 영양소를 저장하기 위해 확대된 변형 된 식물 구조의 한 유형을 의미한다. 이것은 식물이 겨울이나 건조한 달에서 생존하고, 다음번 성장기에 재성장을 위한 에너지와 영양소를 제공하고, 무성 생식의 수단으로 사용된다. 이것은 줄기 또는 뿌리에서 유래될 수 있다. 감자는 줄기 덩이줄기이다.
본 발명에 사용된 용어 "변이체"는 특정 유전자 또는 단백질의 표준 또는 주어진 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열로부터 벗어나는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 용어, "이소폼", "이소타입" 및 "유사체" 또한, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 "변이체" 형태를 지칭한다. 하나 이상의 아미노산의 첨가, 제거 또는 치환, 또는 뉴클레오타이드 서열의 변화에 의해 변경되는 아미노산 서열은 "변이체" 서열인 것으로 간주될 수 있다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있으며, 여기서, 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 가지며, 예를 들어, 루신이 아이소루신으로 대체되는 것이다. 변이체는 "비보존적" 변화를 가질 수 있으며, 예를 들어, 글리신이 트립토판으로 대체되는 것이다. 유사한 최소 변이는 또한, 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지 결정하는 가이던스(guidance)는 벡터 NTI Suite(InforMax, MD) 소프트웨어와 같이 당해 기술분야에 잘 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 찾을 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "덩굴식물 성숙도"는 식물이 탄수화물을 이용하여 광합성을 계속하는 능력을 지칭한다. 덩굴식물 성숙도는 1 내지 5의 척도로 점수가 매겨지며, 여기서, 1은 죽은 덩굴식물이고, 5는 여전히 꽃을 피우고 있는 녹색 덩굴식물이다.
Innate TM 기술
감자는 사배체이며, 매우 이형접합성(heterozygous)이고, 근교약세(inbreeding depression)에 민감하기 때문에, 바람직한 형질을 감자식물의 게놈 내로 삽입하는 것은 특유의 어려움을 제공한다. 따라서, 종래의 육종을 이용한 가공 동안에, 아크릴아마이드를 더 적게 생성하고, N-나이트로소-N-(3-케토-1,2-부테인다이올)-3'-나이트로티라민(Wang et al., Arch Toxicol 70: 10-5, 1995), 5-하이드록시메틸-2-푸르푸랄(Janzowski et al., Food Chem Toxicol 38: 801-9, 2000), 및 돌연변이유발 특성을 가진 다른 마이야르 반응 생성물(Shibamoto, Prog Clin Biol Res 304: 359-76, 1989)을 비롯하여 유해한 마이야르 반응 생성물을 더 적게 생성하는 유전자이식 감자식물을 효율적으로 개발하는 것이 매우 어렵다.
공정 변화, 덱스트로스 감소, 및 아스파라기나제, 시트레이트 및 경쟁적 아미노산과 같은 첨가제를 통해 아크릴아마이드를 감소시키는 몇몇 방법들이 시험된 바 있으며, 연구가 계속 진행중이다. 감자 산업 전반에 걸쳐 공정 변화를 시행하는 데 드는 자본 비용은 수백만 달러에 이를 것이다. 비용 외에도, 이들 공정 변화는 아스파라기나제 또는 시트레이트와 같은 첨가제와 관련된 잠재적으로 부정적인 향을 포함하는 상당한 단점들을 가진다. 전형적으로, 후라이 제조업체는 원하는 금갈색을 발색시키기 위해 감자튀김 공정 동안 덱스트로스를 첨가하지만, 덱스트로스 또한 마이야르 반응을 통해 아크릴아마이드의 형성을 증가시킨다. 아크릴아마이드의 현저한 감소는 단지 덱스트로스를 공정에서 생략함으로써 일어난다; 그러나, 시그너처 금갈색은 일부 다른 방식으로(아나토(annatto)와 같은 색상의 첨가를 통해) 발색되어야 한다. 다른 색상을 사용하는 경우, 이들 갈변 반응을 통해 발생되는 전형적인 향이 존재하지 않게 된다. 아스파라긴과 같은 반응물을 감소시키기 위해 첨가제를 사용할 경우의 또 다른 문제점은 동결 저장 동안에 발생하는 수분 이동으로서, 아스파라긴이 표면으로 되돌아가고 아크릴아마이드가 증가된다. 마지막으로, 감자에 상처가 난 후 발생하는 흑화(blackening)는 감자 튀김 및 칩 가공 시 품질 및 회수율에 영향을 미친다. 손상되고 상처가 난 감자는 가공 전에 손질되거나 버려져야 해서, 품질 문제 또는 경제적 손실을 야기한다.
Innate™ 기술의 설명은 함께 작동하여 식물을 생성하는 식물 생물 시스템을 개괄적으로 설명한다. 이 기술은 형질의 확인, 벡터의 디자인, 아크로박테리움 속 벡터 도입, 수용체 감자 품종 선택, 형질전환 식물 및 새로운 감자가 예상되는 DNA 삽입체를 함유하는 것의 확인을 포함한다. InnateTM 방법은 식물 해충이 아닌 원하는 특성을 가진 새로운 감자 사건을 개발하기 위해 감자에 비-코딩 DNA를 삽입할 수 있다.
본 발명의 "고유한 기술" 전략은 흑점 상처에 관여하는 폴리페놀옥시다제-5(Ppo5)의 발현, 아크릴아마이드 형성의 전구체인 아스파라긴 축적에 관여하는 아스파라긴 신타아제-1(Asn1)의 발현, 및/또는 아크릴아마이드와 같은 독성 마이야르 생성물을 형성하고, 아스파라긴과 같은 아미노산과 정상적으로 반응하는 환원당의 축적과 연관된 효소인 포스포릴라제-L 및 다이키나아제-R1의 발현을 감소시킴으로써 감자의 작물 특성 및 영양가를 개선하기 위한 감자 산업의 요구를 해결한다.
덩이줄기에서 이들 유전자의 부분적인 침묵 또는 완전한 침묵은 아크릴아마이드를 생성하는 잠재성을 낮춘다. 본 발명의 InnateTM 기술을 사용하면, 감자를, 식물의 게놈 내로 임의의 외래 유전 재료를 통합시키지 않으면서 오로지 비-코딩 조절 영역만 함유하는 감자식물로부터 수득되는 유전 재료 또는 감자식물과 타가수정 가능한 식물로부터 수득되는 유전 재료인 "고유한" 유전 재료로만 형질전환시킴으로써, 바람직한 형질을 상업적으로 가치있는 감자식물 품종의 게놈 내로 혼입시킬 수 있다.
바람직한 형질은 충격-유도성 흑점 상처에 대한 높은 내성, 아크릴아마이드 전구체인 아스파라긴의 형성 감소, 및 환원당의 축적 감소와 더불어, 결과적으로, 아크릴아마이드를 포함하는 독성 마이야르 생성물의 축적 저하, 개량된 품질 및 식품 색 조절을 포함한다. 감자는 사배체이며, 매우 이형접합성이고, 근교약세에 민감하기 때문에, 이들 바람직한 형질을 기존의 감자 품종 내로 혼입하는 것은 전통적인 육종을 통해서 달성하기란 불가능하다.
본 발명에 사용된 비-코딩 감자식물 DNA 삽입체 서열은 감자식물 게놈에 고유하며, 임의의 아그로박테리움 DNA를 함유하지 않는다. DNA 삽입체는 바람직하게는 2개의 발현 카세트를 포함하며, pSIM1278 형질전환 벡터로 지칭되는 형질전환 벡터 내로 삽입된다(미국특허 제8,754,303호, "Potato Cultivar J3"; 미국특허 제8,710,311호, "Potato Cultivar F10"; 미국특허 제8,889,963호, "Potato Cultivar J55"; 및 미국특허 제14/072,487호, "Potato Cultivar E12"; 및 pSIM1678 벡터를 가지는 미국특허 제8,889,964호, "Potato Cultivar W8," 이런 특허 및 출원의 각각은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다).
제 1 카세트는 ADP 글루코오스피로포스포릴라제 유전자(Agp)의 Agp 프로모터와 과립-결합 전분 신타아제 유전자(Gbss)의 Gbss 프로모터 사이에서 역반복체로서 배열되는 아스파라긴 신타아제-1 유전자(Asn1) 및 폴리페놀옥시다제-5 유전자(Ppo5)의 단편을 둘 다 포함한다. 이들 프로모터는 덩이줄기에서 주로 활성이다.
제 2 카세트의 기능은 전분-연관 유전자 다이키나아제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL)의 프로모터를 침묵시키는 것이다. 이 카세트는 제1 카세트와 동일한 Agp 프로모터 및 Gbss 프로모터에 작동가능하게 연결된, 전분-연관 유전자 다이키나아제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL )의 프로모터들의 단편으로 구성된다. 이들 발현 카세트는 외래 DNA를 함유하지 않으며, 선별된 식물종 유래의 DNA 또는 선별된 식물종과 타가수정 가능한 식물 유래의 DNA로만 구성된다.
제 2 DNA 삽입체는 식물 공포성 전화효소, VInv에 대한 Rpi - vnt1 발현 카세트 및 침묵 카세트를 포함하는 pSIM1678(전문이 참조로 포함된 미국특허 제8,889,964호, "Potato Cultivar W8") 로 불리는 제 2 식물 벡터로부터 유래된다. Rpi-vnt1 유전자 카세트는 역병에 대해 광범위한 저항성을 제공하는 고유 프로모터 및 종결자 서열에 의해 조절된 VNT1 단백질 암호화 영역으로 이루어진 반면 침묵 카세트는 대립 식물 프로모터, pGbss 및 pAgp가 측면에 위치한 감자 VInv 유전자로부터의 서열의 역전 반복체로 이루어진다. 제 1 카세트의 기능은 감자 역병에 저항성을 부여하는 반면 제 2 카세트의 기능은 공포성 전화효소 유전자, 환원 글루코오스 및 프룩토오스를 침묵시키는 것이다.
천연 DNA에 의한 표적화된 유전자 침묵은 감자 사건의 덩이줄기에서 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 수준을 감소시킨다. 일반적으로, 삽입된 DNA는 발현시, 다양한 크기와 처리되지 않은 전사체를 생성하는 침묵 카세트를 함유한다. 이런 전 사체는 아스파라긴 신타아제와 같은 효소를 암호화하는 mRNA의 절단을 유발한다. 이것은 표적화된 "침묵" 효소의 훨씬 감소된 수준을 가져온다.
Asn1 및 Ppo5 유전자 침묵은 전분 관련 유전자 키나아제-R1(R1) 및 포스포 릴라제-L(PhL)을 추가로 억제하지 않으면서 아크릴아마이드 형성을 2 내지 4배로 현저히 감소시키기에 충분하다.
따라서, 감자 사건의 덩이줄기는 프라잉 또는 베이킹시 감소된 아크릴아마이드 형성과 관련 유리 아미노산인 아스파라긴 및 글루타민의 감소된 비율을 포함하는 매우 바람직한 특성을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 감자 품종은 유리 아스파라긴 함량이 2배 내지 4배 이상 감소하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 감자 품종은 저장 중에 환원당인 글루코오스 및 프룩토오스로의 전분 절단을 지연을 나타낸다. 전분 대 당 전환의 손상은 노화 감미 및 아크릴아마이드 형성을 더 감소시키고 열-유도 갈변을 제한한다. 또한, W8, X17 및 Y9 사건은 J3, F10, J55 및 E12 사건에 존재하는 pSIM1278 벡터에 추가하여 pSIM1678 벡터의 추가 사용으로 인한 감자 역병에 대한 내성을 보여준다.
따라서, 본 발명의 감자 품종은 감자 산업 및 식품 시장에서 매우 가치가 있는데 이는 열 처리시 아크릴아마이드의 생성량이 현저히 적고 어떠한 잠재적으로 해로운 외래 유전자를 보유하지 않기 때문이다.
상기 유리한 특징들을 겸비하는 감자 품종을 도출하는 연구는 대체로 경험적이다. 이러한 연구는 시간, 노동 및 자본의 광범위한 투자를 필요로 한다. 감자 종자의 개발은 종종, 온실에서 상업적인 이용까지 최대 8년 이상 걸릴 수 있다. 육종은 가장 중요한 특징들을 자손에게 혼입하기 위해 우수한 부모를 신중하게 선별하는 데에서 시작된다. 원하는 모든 형질들이 통상적으로 단 1회의 교배로는 나타나지 않기 때문에, 육종은 누적되어야 한다.
현재의 육종 기술은 부모 클론의 조절된 수분(pollination)을 계속한다. 전형적으로, 화분은 이후에 암컷 부모를 수분하는 데 사용하기 위해 젤라틴 캡슐에 수집된다. 잡종 씨앗은 온실에서 파종되고, 덩이줄기는 수천 개의 개별 묘목으로부터 수확 및 보유된다. 이듬해에, 각각의 생성되는 묘목으로부터 1개 내지 4개의 덩이줄기를 필드에 심고, 필드는 바이러스 및 질병의 확산을 방지하기 위해 극도의 주의를 기울이도록 한다. 이 첫해 묘목 작물로부터, 선별 과정에서 생존한 각각의 잡종 개체 유래의 몇몇 "씨앗" 덩이줄기를 이듬해의 식재(planting)를 위해 보유한다. 2년째가 지난 후, 상업적인 용도로서의 덩이줄기의 적합성을 결정하기 위해 밀도 측정 및 프라이 시험용으로 검체를 채취하였다. 그런 다음, 이때까지 선별 과정에서 생존한 식물을, 보다 포괄적인 일련의 프라이 시험 및 밀도 측정을 위해 3번째 해에 확장된 부피로 심었다. 4년째의 개발 단계에서, 상이한 생존 조건에 대한 이들의 적응성을 측정하기 위해, 몇몇 주에서 생존 선별을 필드 시험으로 수행하였다. 결국, 우수한 품질을 가진 품종이 다른 농장으로 전달되며, 씨앗은 상업적인 규모로 증가하였다. 일반적으로, 이때까지, 새로운 개량된 감자 종자를 개발하기 위해서는 식재, 수확 및 시험까지 8년 이상이 투자되어 왔다.
특이적인 단백질 생성물을 암호화하는 유전자의 단리 및 특징화를 가능하게 하는 분자 생물학적 기술의 출현으로, 식물 생물학 분야의 과학자들은, 식물의 형질을 특이적인 방식으로 변경시키기 위해, 외래 유전자, 또는 고유한 또는 내인성 유전자의 부가적인 또는 변형된 버전(아마도 상이한 프로모터들에 의해 유도됨)을 포함하고 발현하도록 식물의 게놈을 조작하는데 큰 관심을 나타내었다. 이러한 외래의 부가적인 및/또는 변형된 유전자는 본 발명에서 종합적으로 "이식유전자"로서 지칭된다. 지난 15년 내지 20년 동안, 유전자이식 식물을 생산하는 몇몇 방법들이 개발되어 왔으며, 본 발명, 특히 실시태양은 또한, 청구되는 품종 또는 라인의 형질전환된 버전에 관한 것이다.
식물 형질전환은, 식물 세포에서 작용할 발현 벡터의 구축을 수반한다. 이러한 벡터는 조절 요소(예를 들어, 프로모터)의 조절하의 또는 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 유전자를 포함하는 DNA를 포함한다. 발현 벡터는 이러한 작동가능하게 연결되는 유전자/조절 요소 조합을 하나 이상 함유할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드 형태로 있을 수 있으며, 이식유전자를 감자식물(들)의 유전적 물질 내로 혼입하기 위해 후술되는 바와 같이 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 감자식물을 생산하기 위해, 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합되어 사용될 수 있다.
전통적인 식물 육종은 전형적으로, 새롭고 개량된 특징을 가진 품종을 제조하기 위해, 식물 염색체의 무작위 재조합에 의존한다. 표준의 잘 공지된 기술에 따르면, 유전자 및 조절 요소를 포함하는 유전적 "발현 카세트"는 아그로박테리움-단리된 전달 DNA("T-DNA")의 경계 내에 삽입되고, 식물 게놈 내로 통합된다. T-DNA 물질의 아그로박테리움-매개 전달은 전형적으로 하기의 표준 절차를 포함한다: (1) 적어도 하나는 외래 기원의 것인 유전적 요소의 시험관 내 재조합에 의해, 형질전환 선별용 발현 카세트를 제조하는 단계, (2) 이 발현 카세트를, 종종 외래 DNA를 함유하는 적어도 하나의 다른 발현 카세트와 함께, 통상 T-DNA 경계 서열의 측면에 존재하는 아그로박테리움 DNA의 염기쌍 수백 개로 구성되는 바이너리 벡터의 T-DNA 영역 내로 삽입하는 단계, (3) 종종 아그로박테리움 유래의 부가적인 바이너리 벡터 서열의 일부 또는 모두와 수반되는, T-DNA 경계들 사이에 위치하는 서열을 식물 세포로 전달하는 단계, 및 (4) 수율 증가, 개량된 활력, 질병 및 곤충에 대한 내성 증가, 또는 스트레스 하에서의 생존능 증가와 같은 원하는 형질을 나타내는, 안정하게 형질전환된 식물 세포를 선별하는 단계.
따라서, 유전자 조작 방법은 프로모터 및 종결자와 같은 조절 요소, 및 새로운 형질의 발현에 관여하거나 또는 형질전환체의 확인 및 선별을 위한 마커로서 작용하는 유전자를 포함하는, 바이러스, 박테리아 및 식물로부터의 외래의 비-토종 핵산의 도입에 의존한다. 마커 유전자는 전형적으로, 박테리아 소스로부터 유래되며, 항생제내성 또는 제초제 저항성을 부여한다. 전형적인 육종 방법은 힘들며 시간 소모적이고, 새로운 품종은 전형적으로 단지 상대적으로 중간 정도의 개량을 나타낸다.
"안티센스" 기술에서, 유전자이식 식물에서 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 고유한 유전자의 서열은 도치(invert)된다.
감자 형질전환용 발현 벡터: 마커 유전자
발현 벡터는 마커를 함유하는 형질전환된 세포가 음성 선별, 즉, 선별성 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장을 저해함으로써 회수되거나, 양성 선별, 즉, 유전적 마커에 의해 암호화되는 생성물을 스크리닝함으로써 회수되게 하는 조절 요소(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 유전적 마커를 포함한다. 식물 형질전환에 보편적으로 사용되는 다수의 선별성 마커 유전자는 형질전환 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선별성 화학제를 대사적으로 해독시키는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 저해제에 둔감한 변경된 표적을 암호화하는 유전자를 포함한다. 소수의 양성 선별 방법이 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다.
식물 형질전환에 보편적으로 사용되는 하나의 선별성 마커 유전자는 식물 조절 신호의 조절하에서 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자이다. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). 보편적으로 사용되는 또 다른 선별성 마커 유전자는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자로서, 항생제 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여한다. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299 (1985).
항생제에 대한 저항성을 부여하는, 박테리아 기원의 부가적인 선별성 마커 유전자는 겐타마이신 아세틸 트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 및 아미노글리코사이드-3'-아데닐 트랜스퍼라제, 블레오마이신 내성 결정인자를 포함한다. Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990) Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). 다른 선별성 마커 유전자는 글리포세이트, 글루포시네이트 또는 브로목시닐(bromoxynil)과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여한다. Comai et al., Nature 317:741-744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990) and Stalker et al., Science 242:419-423 (1988).
박테리아 기원은 아니지만 식물 형질전환용의 선별성 마커 유전자는 예를 들어, 마우스 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 식물 5-에놀피루빌쉬키메이트(enolpyruvylshikimate)-3-포스페이트 신타아제 및 식물 아세토락테이트 신타아제를 포함한다. Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987), Shah et al., Science 233:478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990).
식물 형질전환용의 또 다른 부류의 마커 유전자는 형질전환된 세포를 항생제와 같은 독성 성분에 대한 저항성에 대해 직접적으로 유전적 선별을 하기보다는 추정상 형질전환된 식물 세포를 스크리닝하는 것을 필요로 한다. 이들 유전자는 특히, 특이적인 조직에서 유전자 발현의 공간적인 패턴을 정량화하거나 시각화하는 데 유용하며, 유전자 발현의 조사를 위해 유전자 또는 유전자 조절 서열에 융합될 수 있기 때문에 종종 리포터 유전자로 지칭된다. 추정적으로 형질전환된 세포의 스크리닝에 보편적으로 사용되는 유전자는 β-글루쿠로니다제(GUS), β-갈락토시다제, 루시퍼라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 포함한다. Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987), Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989), Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:131 (1987), DeBlock et al., EMBO J. 3:1681 (1984).
식물조직의 파괴를 필요로 하지 않는 GUS 활성을 생체 내에서 시각화하는 방법이 이용가능하다. Molecular Probes publication 2908, IMAGENE GREEN, p. 1-4 (1993) 및 Naleway et al., J. Cell Biol. 115:151a (1991). 그러나, 이들 GUS 활성의 생체 내 시각화 방법은 낮은 민감도, 높은 형광 백그라운드 및 루시퍼라제 유전자를 선별성 마커로서 사용하는 것과 연관된 제한점들로 인해, 형질전환된 세포의 회수에 유용한 것으로 입증되지 않았다.
일부 양태에서, 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 유전자는 원핵 세포 및 진핵 세포에서 유전자 발현용 마커로서 이용되어 왔다. Chalfie et al., Science 263:802 (1994). GFP, 및 GFP의 돌연변이체는 스크리닝가능한 마커(screenable marker)로서 사용될 수 있다.
감자 형질전환용 발현 벡터: 프로모터
발현 벡터에 포함된 유전자는 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 구동되어야 한다. 몇몇 유형의 프로모터들은 단독으로 또는 프로모터와 조합되어 사용될 수 있는 다른 조절 요소들과 마찬가지로, 형질전환 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용된 바과 같이, "프로모터"는, 전사의 시작부로부터 업스트림에 있으면서, 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 및 다른 단백질의 인지 및 결합에 관여하는 DNA 영역에 대한 참조를 포함한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 발달 조절하에서 프로모터의 예는 잎, 뿌리, 씨앗, 섬유, 물관(xylem vessel), 헛물관(tracheid) 또는 후막조직(sclerenchyma)과 같은 소정의 조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-우선적인" 것으로 지칭된다. 소정의 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적인" 것으로 지칭된다. "세포-유형" 특이적인 프로모터는 주로, 하나 이상의 기관에 존재하는 소정의 유형의 세포, 예를 들어, 뿌리 또는 잎의 관다발 세포에서 발현을 유도한다. "유도성" 프로모터는 환경적인 조절하에 존재하는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 의한 전사에 영향을 미칠 수 있는 환경적인 조건의 예로는, 혐기성 조건 또는 광(light)의 존재를 포함한다. 조직-특이적인 프로모터, 조직-우선적인 프로모터, 세포 유형 특이적인 프로모터 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터의 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경적 조건하에 활성인 프로모터이다.
A. 유도성 프로모터
유도성 프로모터는 감자에서 발현될 유전자에 작동가능하게 연결된다. 선택적으로, 유도성 프로모터는, 감자에서 발현될 유전자에 작동가능하게 연결되는 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다. 유도성 프로모터를 이용하여, 전사율은 유도제에 반응하여 증가한다.
임의의 유도성 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. Ward et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993)을 참조한다. 예시적인 유도성 프로모터로는, 구리에 반응하는 ACEI 시스템(Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)); 벤젠설폰아미드 제초제 약해 경감제에 반응하는, 옥수수 유래의 In2 유전자(Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227:229-237 (1991) 및 Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)) 또는 Tn10 유래의 Tet 억제제(Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991))를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 유도성 프로모터는 식물이 정상적으로 반응하지 않는 유도제에 반응하는 프로모터이다. 예시적인 유도성 프로모터는 스테로이드 호르몬 유전자 유래의 유도성 프로모터로서, 이의 전사 활성은 글루코코티코스테로이드 호르몬에 의해 유도된다. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421 (1991).
B. 구성적 프로모터
구성적 프로모터는 감자에서 발현될 유전자에 작동가능하게 연결되거나, 구성적 프로모터는 감자에서 발현될 유전자에 작동가능하게 연결되는 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다.
다수의 상이한 구성적 프로모터들이 본 발명에 이용될 수 있다. 예시적인 구성적 프로모터로는 식물 바이러스 유래의 프로모터, 예컨대 CaMV 유래의 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)) 및 쌀 액틴(McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990)); 유비퀴틴(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) 및 Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU(Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS(Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)) 및 옥수수 H3 히스톤(Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992) 및 Atanassova et al., Plant Journal 2 (3): 291-300 (1992))과 같은 유전자 유래의 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
브라씨카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조 유전자(또는 상기 Xba1/Ncol 단편과의 뉴클레오타이드 서열 유사성)에 대해 5' Xba1/Ncol 단편인 ALS 프로모터는 특히 유용한 구성적 프로모터를 나타낸다. PCT 출원 WO 96/30530을 참조한다.
C. 조직-특이적 또는 조직- 선호적 프로모터
조직-특이적 프로모터는 감자에서 발현용 유전자에 작동가능하게 연결된다. 선택적으로, 조직-특이적인 프로모터는, 감자에서 발현용 유전자에 작동가능하게 연결되는 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다. 조직-특이적인 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자로 형질전환된 식물은 이식유전자의 단백질 생성물을 특이적인 조직에서 배제적으로 또는 우선적으로 생성한다.
임의의 조직-특이적인 프로모터 또는 조직-우선적인 프로모터가 본 발명에 이용될 수 있다. 예시적인 조직-특이적인 프로모터 또는 조직-우선적인 프로모터는 파세올린(phaseolin) 유전자 유래의 것과 같은 뿌리-선호적인 프로모터(Murai et al., Science 23:476-482 (1983) 및 Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-3324 (1985)); cab 또는 루비스코(rubisco) 유래의 것과 같은 잎-특이적인 프로모터 및 광-유도성 프로모터(Simpson et al., EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985) 및 Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)); LAT52 유래의 것과 같은 꽃밥-특이적인 프로모터(Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)); Zm13 유래의 것과 같은 화분-특이적인 프로모터(Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)) 또는 apg 유래의 것과 같은 소포자-선호적인 프로모터 (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993))를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
단백질을 하위세포(subcellular) 구획으로 표적화하기 위한 신호 서열
이식유전자에 의해 생성되는 단백질을 엽록체, 액포, 퍼옥시좀, 글리옥시좀, 세포벽 또는 미토콘드리아와 같은 하위세포 구획으로 수송하거나, 아포플라스트(apoplast) 내로 분비하는 것은 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을, 관심 단백질을 암호화하는 유전자의 5' 및/또는 3' 영역에 작동가능하게 연결함으로써 달성된다. 구조 유전자의 5' 및/또는 3' 말단에 있는 서열을 표적화하는 것은 단백질 합성 및 가공 동안에, 인코딩된 단백질이 궁극적으로 구획화되는 곳을 결정할 수 있다.
신호 서열의 존재는, 폴리펩타이드를 세포내 소기관 또는 하위세포 구획으로 인도하거나 아포플라스트로 분비되게 한다. 다수의 신호 서열들이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:49 (1992); Close, P.S., Master's Thesis, Iowa State University (1993); Knox, C., et al., Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987); Lerner et al., Plant Physiol. 91:124-129 (1989); Frontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991); Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991); Gould et al., J. Cell. Biol. 108:1657 (1989); Creissen et al., Plant J. 2:129 (1991); Kalderon, et al., Cell 39:499-509 (1984); Steifel, et al., Plant Cell 2:785-793 (1990)을 참조한다.
솔라눔( Solanum ) 속의 분류학
솔라나세아(Solanaceae) 계통은 토마토(Lycopersicon esculentum으로도 불리는 Solanum lycopersicum), 가지(Solanum melogena), 담배(Nicotiana tabacum), 고추(Capsicum annuum) 및 감자(Solanum tuberosum)와 같은 잘 알려진 여러 재배 작물을 포함한다. 솔라눔 속 내에, 1,000 종 이상의 종들이 인정되었다. 감자는 상업용 감자 농장에서 일반적으로 볼 수 있는 잡초를 포함하여 덩이줄기를 갖지 않는 솔라눔(토마토, 가지 등) 종과 혼성화하지 않을 것이다(Love 1994).
솔라눔 속은 여러 하위 계층으로 나뉘며, 이의 하위 계층 감자는 모든 덩이줄기를 갖는 감자를 포함한다. 하위 계층 감자는 시리즈로 나뉘며, 이의 투베로사(tuberosa)는 이 문서와 관련이 있다. 일련의 투베로사 내에 약 54종의 야생 및 재배 감자가 발견된다. 이들 중 하나는 에스. 투베로숨(S. tuberosum)이다.
에스. 투베로숨은 두 아종: 투베로숨(tuberosum)과 안디제나(andigena)로 나뉜다. 투베로숨 아종은, 예를 들어, 북아메리카와 유럽의 작물 식물로서 널리 사용되는 재배 감자이다. 아종 안디제나는 또한 재배 종이나 재배는 중남미에만 국한된다(Hanneman 1994).
미국의 야생 감자
미국 국경에서 자라고 유전자 은행에 표본이 존재하는 단지 두 야생 감자 종은 사배체 종 에스. 펜들레리(S. fendleri)(최근에 에스. 스톨로니페룸(S. stoloniferum)으로 재분류되었지만, 인터-진뱅크 포테이토 데이터베이스를 포함하는 일부 소스는 여전히 에스. 펜틀레리라는 명칭을 사용한다) 및 이배체 종 에스. 제임시(S. jamesii)(Bamberg et al., 2003 년 IPD 2011, Bamberg and del Rio 2011a, Bamberg and del Rio 2011b, Spooner et al. Love (1994)는 세 번째 종인 에스. 피나티섹텀(S. pinnatisectum)이 또한 미국의 고유종이라는 것을 보고하였다. 그러나, 스푸너 등(2004)은 이전에 피나티섹텀으로 생각되었던 것이 실제로 에스 제임시이었다고 결정하였다. 10년 이상의 현장 조사와 기존 기록에 대한 평가를 통해 밤베르그 등(2003) 및 스푸너 등(2004)은 미국에서 에스. 펜틀레리 및 에스, 제임시 단 두 종의 존재를 확립했다. 이 연구자들은 또한 이전에 기록된 위치를 확인하려고 시도했고, 이 과정을 통해 이 종의 현재 알려진 위치의 지도를 업데이트하여, 각 기록된 개체군(Bamberg et al. 2003)과 분포도(Spooner et al. 2004)에 대한 위도와 경도 위치를 제공하였다. 이 종들은 주로 대부분의 상업 생산 지역 (Bamberg and del Rio 2011a)으로부터 잘 격리된 5,000 내지 10,000 피트의 고도에서 건조한 숲, 관목 사막 및 모래 지역에 거주한다.
주 수준에서 상업 생산에 사용된 면적과 야생종의 발생 사이에 약간의 중복이 있지만, 미국에서 감자 생산의 대부분은 야생 감자 지역에 있지 않다. 그러나,몇몇 야생 감자 식물이 감자 농장 근처에서 자라날 가능성이 있다(Love 1994). 스푸너 등(2004)은 미국의 에스. 제임시 서식지를 산허리의 큰 자갈, 모래 충적층 바닥, 산책로 또는 도로를 따라 자갈, 충적 골짜기의 풍부한 유기 토양, 모래 휴면지, 초원, 주니퍼-핀욘 관목 사막, 오크 덤불, 침엽수림 및 낙엽수림으로 기술한다. 이들은 유사하게 에스. 펜틀레리 서식지를 4700 내지 11,200 피트 사이의 고도로 기술한다.
감자의 유전학
솔라눔 속의 기본 염색체 번호는 12이다. 에스. 투베로숨 서브에스피. 투베로숨(S. tuberosum subsp. tuberosum)은 이배체(2n = 2x = 24) 또는 사배체(2n = 4x = 48)가 될 수 있다. 이배체는 남아메리카의 일부 지역에서 제한된 범위를 가지며, 사배체는 전 세계적으로 가장 많이 재배된다. 어떻게 사배체가 감자에서 기인하는지는 불분명하다. 재배된 에스. 투베로숨 서브에스피. 투베로숨은 자가사배체(이배체 종의 염색체의 배가) 또는 이질사배체(2개의 관련 종 사이의 이배체 잡종의 염색체의 배가)일 수 있다.
거의 모든 이배체 종은 자체적으로 양립할 수 없지만, 재배된 사배체 에스. 투베로숨 서브에스피. 투베로숨은 자가 수분(자식(selfing))이 가능하다. 플레이스테드(1980)는 현장 조건에서 자식은 사배체 에스. 투베로숨에 대해 가장 가능성이 높으며, 씨앗의 80-100%가 자식에 의해 형성되는 것을 입증하였다. 코너 및 데일(1996)은 뉴질랜드, 영국 및 스웨덴에서 실행된 유전적으로 변형된 감자를 이용한 여러 가지 현장 실험에서 이종 교배 데이터를 수집하였다. 각 연구에서, 식물을 유전자 변형된 식물에서 20미터 이상 분리되었을 때 이종교배율은 0이었다. 비록 많은 솔라눔 종들이 수정능력이 있을지라도, 많은 수의 사배체 재배된 에스. 투베로숨 서브에스피. 투베로숨 품종은 수정능력이 감소하였다는 것을 나타낸다.
감자 품종
감자 품종은 개발하는데 수년이 걸린다. 새로운 품종을 확립하기 위한 결정은 시장에서의 필요성, 잠재적 소비자 수용성, 해충 저항성 또는 내성과 같은 많은 요인에 기초한다. 감자 품종은 옥수수 또는 대두와 같은 일부 다른 작물에 비해 도입 및 중단의 빈도가 높지 않다. 감자는 무성 번식하므로, 교차 수분으로 인한 품종 희석(varietal dilution)의 위험이 줄어든다.
본 발명에 사용된 감자 사건은 4개 감자 품종에서 유래된다.
러셋 버뱅크는 사건 E12 및 W8의 부모 품종이다. 식물은 활력적이며 사철 내내 덩굴 성장을 지속한다. 줄기는 두껍고, 주로 각이 져 있으며, 미세하게 얼룩이 져 있다. 잎은 폭이 중간 내지 길며, 색상은 옅은 녹색 내지 중간 녹색이다. 꽃은 몇 개 되지 않으며, 백색이고, 수정능력이 없다. 종자는 더뎅이병(common scab)에는 내성이 있지만, 위조병(Fusarium)과 청고병(Verticillium wilts), 잎말이병(leafroll)과 망형 괴사(net necrosis), 감자 바이러스 Y 및 감자 역병에 취약하다. 식물은 혹(knob), 뾰족단(pointed end) 및 덤벨(dumbbell)이 없는 덩이줄기를 생산하기 위해서 높고 균일한 토양 수분 및 조절된 질소 비옥도(nitrogen fertility)의 조건을 필요로 한다. 식물이 스트레스를 받을 경우, 덩이줄기에서 젤리-말단(jelly-end) 및 당-말단(sugar-end)이 발달한다. 생산된 덩이줄기는 큰 갈색 표면과 백색의 엽육을 가지며, 양호한 장기 저장 특징을 나타내고, 우수한 베이킹 및 가공 품질에 대한 표준을 나타낸다. 이 품종은 열매가 열리지 않으며, 특히 감자 튀김 생산용으로 북서부 및 중서부에서 광범위하게 재배된다.
레인저 러셋은 사건 F10과 X17의 부모 품종이다. 이런 사계절 품종은 1991에 판매되었다. 레인저 레셋은 레셋 버뱅크보다 청고병, 바이러스 X와 Y, 잎마름병과 망형 괴사, 마른썩음병(Fusarium dry rot)에 저항성이 있다. 이것은 중심 공동병에 매우 내성이 있다. 식물은 크고 곧게 퍼진다. 줄기는 두껍고 한낮에 연한 갈색 내지 연한 자주색일 수 있는 녹색이다. 잎은 크고 넓으며 중간이 녹색이다. 꽃은 풍부하고 생존 가능한 꽃가루를 생산한다. 꽃봉오리는 녹색이며 붉은 자주색 기부와 육경 및 적당량의 짧은 솜털이 있다. 화관은 중간 크기로 붉은 자주색이며 꽃밥은 밝은 황색이다. 이것은 길고 약간 평평하고 베이킹과 감자 튀킴으로의 가공에 매우 적합한 높은 수율의 양질이며, 고 비중의 덩이줄기를 생산한다. 덩이줄기는 더뎅이병과 흑점 상처에 감염되기 쉽다. 레인저 러셋은 러셋 버뱅크보다 먼저 성숙하며 중간 길이의 저장 품종으로 간주된다. 이 품종은 결실 능력이 있고 특히 감자 튀김의 생산을 위해 주로 북서쪽에서 재배된다.
애틀란틱은 사건 J3 및 J55 및 Y9의 부모 품종이다. 식물은 적당히 크고 두껍고 곧은 줄기와 약간 부어 오르며 드물게 솜털이 있는 옹이를 가진다. 잎은 밝고, 중간 녹색이며, 매끄럽고 적당히 솜털이 있으며 눈에 띄는 날개, 큰 비대칭 기본 엽상부 및 여러 2차 및 3차 엽상부가 있다. 꽃은 녹색, 송곳 모양, 솜털이 있는 꽃받침 통, 창백한 라벤더 화관, 오렌지 꽃밥 및 풍부하고, 생육가능한 꽃가루가 풍부하다. 재배 품종은 붉은 곰팡이병과 청고병에 내성을 나타내며, 핑크아이(pinkeye)에 저항성이 있고, 황금빛 선충인 품종 A, 바이러스 X, 덩이줄기 망형 괴사에 고 저항성이며 흑점 상처에 약간의 저항성을 보인다. 덩이줄기는 특히 따뜻하고 건조한 계절에 모래 토양에서 내부의 열 괴사에 감염되기 쉽다. 더 큰 직경의 덩이줄기(직경> 4 인치)의 중심 공동병은 일부 재배 지역에서 심각할 수 있다. 덩이줄기는 타원형 내지 원형이며 연한 내지 진한 비늘 모양 그물 가죽, 적당히 얕은 눈 및 백색 엽육을 가진다. 높은 수확량 잠재력, 높은 비중 및 균일한 덩이줄기 크기 및 모양에 의해, 애틀란틱은 현장 또는 매우 단기간의 저장 후에 얇고 길게 썰기 위한 표준 품종이다(Webb et al., 1978). 이 품종은 결실 능력이 있고 특히 칩의 생산을 위해 주로 북동부 및 남동부에서 재배된다.
스노우덴은 사건 V11의 부모 품종이다. 스노우덴(W 855)은 위스칩(Wischip)과 B5141-6 사이의 교배에 의해 위스콘신 주에서 선택되고 1970년대 후반에 선정되고 1990년에 명명되었다. 선정 및 초기 테스트는 위스콘신, 라인란더, UW-Lelah Starks Potato Breeding Farm에서 스탄 펠로퀸 박사와 도널드 키체프스키 박사에 의해 수행되었다. 덩굴은 크고 곧으며 중간이다. 잎은 연한 녹색이며 닫힌 상태이다. 꽃은 황색의 꽃밥이 달린 백색이며 불완전 발육하는 경향이 있다. 수컷 불임은 흔하며 과일은 드물게 발생한다. 눈은 중간이고 심근 끝에서 더 깊고 균일하게 분포된다. 덩이줄기는 백색 엽육을 가지는 반면, 피부는 연한 황갈색이며 약간 그물로 짜여진다. 덩이줄기는 균일하며 둥글며 약간 평평하며 일정하게 2.5 내지 3.5 인치 지름을 갖는다. 이것은 초기 및 후기 역병 및 더뎅이병에 감염되기 쉽고 콜로라도 감자 딱정벌레를 끌어당긴다. 이 품종은 중심 공동병과 갈색 중심에 저항성이 있다. 스노우덴은 애틀란틱과 거의 비슷하게 산출된다. 스노우덴은 이제 북중부 지역 시험에서 표준이다. 스노우덴은 재조절하지 않고 45℉ 저장으로부터 얇고 길게 잘리는 것을 제외하고 애틀란틱과 매우 유사하다. 스노우덴은 칩 생산에 사용된다.
감자 형질전환 방법
생물학적 및 물리적 식물 형질전환 프로토콜을 비롯하여 수많은 식물 형질전환 방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc. Boca Raton, 1993) 페이지 67-88을 참조한다. 또한, 식물 세포 또는 조직의 형질전환 및 식물의 재생을 위한 발현 벡터 및 시험관 내 배양 방법이 이용가능하다. 예를 들어, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) 페이지 89-119를 참조한다.
A. 아그로박테리움 -매개 형질전환
발현 벡터를 식물 내로 도입하는 한가지 방법은 아그로박테리움의 자연적인 형질전환 시스템을 토대로 한다. 예를 들어, Horsch et al., Science 227:1229 (1985)를 참조한다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스는 식물 세포를 유전적으로 형질전환하는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스의 Ti 플라스미드 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적인 형질전환에 관여하는 유전자를 운반한다. 예를 들어, Kado, C.I., Crit. Rev. Plant Sci . 10:1 (1991)을 참조한다. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개의 유전자 전달 방법에 관한 설명은 상기 Gruber 등, 상기 Miki 등 및 Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)에 의해 제공된다. 또한, 1996년 10월 8일에 발행된 미국 특허 5,563,055(Townsend 및 Thomas)를 참조한다. 아그로박테리움 매개 형질전환 및 아그로박테리움과 함께 사용하도록 특별히 고안된 특정 DNA 전달 플라스미드를 관장하는 여러 특허가 있다 - 예를 들어, US4536475, EP0265556, EP0270822, WO8504899, WO8603516, US5591616, EP0604662, EP0672752, WO8603776, WO9209696, WO9419930, WO9967357, US4399216, WO8303259, US5731179, EP068730, WO9516031, US5693512, US6051757 및 EP904362A1, 이의 전문이 참조로 본 발명에 포함된다.
아그로박테리움 매개 식물의 형질전환은 플라스미드 상에 복제된 DNA 단편을 살아있는 아그로박테리움 세포에 위치시킨 다음 개별 식물 세포로 형질전환시키는데 사용되는 것을 제 1 단계로서 필요로 한다. 따라서 아그로박테리움 매개 식물 형질전환은 간접 식물 형질전환 방법이다.
아그로박테리움 매개 형질전환은 아그로박테리움 속에 속하는 유전적으로 조작된 토양 박테리아의 사용을 통해 이루어진다. 몇몇 아그로박테리움 종은 DNA의 원하는 조각을 많은 식물 종으로 옮길 수있는 유전자 조작이 가능한 "T-DNA"로 알려진 특정 DNA의 전달을 매개한다. T-DNA 매개 된 병인의 과정을 나타내는 주요 사건은 병독성 유전자의 유도, T-DNA의 가공 및 전달이다. 이 과정은 많은 논평의 대상이다 (Ream, 1989; Howard and Citovsky, 1990; Kado, 1991; Hooykaas and Schilperoort, 1992, Winnans, 1992; Zambryski, 1992; Gelvin, 1993; Binns and Howitz, 1994; Hooykaas and Beijersbergen 1994; Lessl and Lanka, 1994; Zupan and Zambryski, 1995).
식물의 아그로박테리움 매개 형질 전환에는 몇 단계가 필요하다. 아그로박테리움과 식물 세포가 처음으로 서로 접촉하게 되는 첫 번째 단계는 일반적으로 "접종"이라고 부른다. 접종 단계 후에, 아그로박테리움 및 식물 세포/조직은 일반적으로 성장 및 T-DNA 전달에 적합한 조건하에 수 시간 내지 수일 또는 그 이상의 기간 동안 함께 성장된다. 이 단계를 "공동 배양"이라고 한다. 공동 배양 및 T-DNA 전달 후, 식물 세포는 종종 살균항생제 및/또는 정균항생제로 처리되어 아그로박테리움을 죽인다. 이것이 유전자이식 식물 세포 대 비-유전자이식 식물 세포의 특이적 성장을 촉진시키는 임의의 선택제의 부재하에 수행되는 경우, 이는 전형적으로 "지연" 단계로 불린다. 유전자이식 식물 세포를 선호하는 선택적 압력의 존재하에서 수행되면, 이는 "선택" 단계라고 불린다. "지연"이 사용될 때, 하나 이상의 "선택"단계가 뒤따른다. "지연"과 "선택" 단계 둘 다는 전형적으로 아그로박테리움 세포의 성장이 감염(접종 및 공동 배양) 과정 후에 바람직하지 않기 때문에 임의의 남아있는 아그로박테리움 세포를 죽이기 위한 살균항생제 및/또는 정균항상제를 포함한다.
아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 생산된 유전자이식 식물은 일반적으로 미립자 매개 유전자 형질전환과 비교하여 단순한 통합 패턴을 포함하지만, 복제물 수 및 삽입 패턴의 큰 변화가 존재한다(Jones et al, 1987; Jorgensen et al., 1987 ). 더욱이, 단일 식물 유전자형 내에서도, 사용된 체외 이식편 및 형질전환 시스템의 유형에 기초하여 상이한 패턴의 T-DNA 통합이 가능하다(Grevelding et al., 1993). T-DNA 복제품 수를 조절하는 요소는 잘 알려져 있지 않다.
형질전환의 특정 Innate™ 방법론은 첨부된 실시예에서 설명될 것이다. 그러나, 식물의 아그로박테리움 매개 식물 형질전환의 상기 "일반적인" 방법은 또한 교시된 방법에 의해 탐지될 수 있는 비 자연 발생적 뉴클레오타이드 접합 서열을 생성한다.
B. 직접적인 유전자 전달
DNA를 이용한 직접 식물 형질전환 방법도 보고되었다. 역사적으로 보고될 이들 중 첫 번째는 식물 세포를 함유하는 용액에 인가된 전류를 사용하는 전기 천공 법이다(M. E. Fromm et al., Nature, 319, 791 (1986), H. Jones et al., Plant Mol. Biol ., 13, 501 (1989) 및 H. Yang 등, Plant Cell Reports, 7, 421 (1988)에 기재되어있다.
"생물학적 폭격(biolistic bombardment)"으로 불리는 다른 직접적인 방법은 DNA로 코팅되어 입자가 두꺼운 세포벽, 막 및 핵 외피를 포함하는 식물 세포를 침투하나 이들의 적어도 일부를 죽이지 않는 충분한 힘으로 식물 조직의 표면에 도포되는 초미립자, 보통 텅스텐 또는 금을 사용한다(US 5,204,253, US 5,015,580).
세 번째 직접적인 방법은 문자 그대로 세포 및 세포의 핵 외피를 부식시키는 날카롭고, 다공성이거나 중공의 바늘형 돌기로 이루어진 금속 또는 세라믹의 섬유 형태를 사용한다. 탄화규소 및 붕산 알루미늄 위스커는 식물 형질전환(Mizuno et al., 2004; Petolino et al., 2000; US5302523 US Application 20040197909) 및 박테리아와 동물 형질전환(Kaepler et al., 1992; Raloff, 1990, Wang, 1995)에 사용되었다. 보고된 다른 방법이 있으며, 의심할 여지없이 추가 방법이 개발될 것이다. 본 발명에서 교시된 방법은 임의의 식물 형질전환 방법으로부터 기인한 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 탐지할 수 있다.
감자 육종
상기 형질전환 방법은 전형적으로 유전자이식 품종을 생산하는 데 사용될 것이다. 그런 다음, 새로운 유전자이식 품종을 생산하기 위해, 유전자이식 품종은 또 다른(비-형질전환 또는 형질전환) 품종과 교배될 수 있다. 선택적으로, 상기 형질전환 기술을 사용하여 특정한 감자 계통으로 조작된 유전적 형질은 식물 육종 분야에 주지되어있는 전통적인 역교배 기술을 사용하여 또 다른 계통으로 이동될 수 있다. 예를 들어, 역교배 접근법은 공개적인 비-엘리트 품종 유래의 조작된 형질을 엘리트 품종으로 이동시키거나, 이의 게놈에 외래 유전자를 함유하는 품종 유래의 조작된 형질을 해당 유전자를 함유하지 않는 품종 또는 품종들 내로 이동시키는 데 사용될 수 있었다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, "교배"는 문맥에 따라 단순한 X × Y 교배 또는 역교배 과정을 의미할 수 있다.
당업자는, 용어 감자식물이 본 발명의 맥락에서 사용되는 경우, 이는 또한 당해 사건의 필수적인 구별 특징을 보유하는 유도체 품종, 예컨대 해당 품종의 유전자 변환된 식물, 또는 하나 이상의 부가 가치 유전자(예, 제초제 저항성 또는 곤충 저항성)가 혼입된 유전자이식 유도체를 포함함을 인지할 것이다. 역교배 방법은 특징을 품종 내로 개량하거나 도입하기 위해 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "역교배"는 잡종 자손을 재현성(recurrent) 부모로 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 이상 반복해서 교배하는 것을 의미한다. 하나 이상의 원하는 특징에 대한 유전자(들)에 기여하는 부모 감자식물은 비재현성 부모 또는 공여자 부모로 불린다. 이 용어는, 비재현성 부모는 역교배 프로토콜에서 1회 사용되며, 따라서, 반복되지 않는다는 사실을 의미한다. 비재현성 부모 유래의 유전자 또는 유전자들이 전달되는 부모 감자식물은 역교배 프로토콜에서 수차례 사용되므로, 재현성 부모로서 공지되어 있다. 전형적인 역교배 프로토콜에서, 본래의 관심 품종(재현성 부모)은 전달되어야 하는 관심 유전자(들)를 운반하는 제2 품종(비재현성 부모)에 교배된다. 그런 다음, 이 교배로 인해 생성되는 자손은 재현성 부모에 다시 교배되고, 이 과정은 감자식물이 수득될 때까지 반복되며, 여기서, 비재현성 부모로부터 전달되는 하나 이상의 유전자 외에도, 재현성 부모의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 특징 및 생리학적 특징들은 변환된 식물에서 회수된다.
적합한 재현성 부모의 선택은 성공적인 역교배 절차의 중요한 단계이다. 역교배 프로토콜의 목적은 하나 이상의 형질 또는 특징을 본래의 품종에서 변경 또는 치환하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 재현성 품종의 하나 이상의 유전자는 비재현성 부모 유래의 원하는 유전자(들)를 사용하여 변형, 치환 또는 보충되는 한편, 원하는 유전자 중 본질적으로 모두 또는 나머지를 보유하며, 따라서, 본래의 품종의 원하는 생리학적 및 형태학적 구성을 보유한다. 특정한 비재현성 부모의 선택은 역교배의 목적에 따라 다를 것이다. 주요한 목적들 중 하나는 일부 상업적으로 바람직하며 작물적으로 중요한 형질을 식물에 부가하는 것이다. 정확한 역교배 프로토콜은, 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위해 변경 또는 첨가되는 특징 또는 형질에 따라 다를 것이다. 전달되는 특징이 우성 대립 유전자인 경우 역교배 방법이 간략화되긴 하지만, 열성 대립 유전자 또한, 전달될 수 있다. 이 경우, 원하는 특징이 성공적으로 전달되었는지 결정하기 위해, 자손의 시험을 도입하는 것이 필요할 수 있다.
마찬가지로, 이식유전자는 당업자에게 주지되어 있는 구축된 재조합 방법의 품종들 중 임의의 품종을 사용하여 식물 내로 도입될 수 있다. 예컨대: Gressel, 1985, Biotechnologically Conferring Herbicide Resistance in Crops: The Present Realities, In Molecular Form and Function of the Plant Genome, L. van Vloten-Doting, (ed.), Plenum Press, New York; Huttner, S.L., et al., 1992, Revising Oversight of Genetically Modified Plants, Bio/Technology; Klee, H., et al., 1989, Plant Gene Vectors and Genetic Transformation: Plant Transformation Systems Based on the use of Agrobacterium tumefaciens , Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants; Koncz, C., et al., 1986, The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-Specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary Vector; Molecular and General Genetics; Lawson, C., et al., 1990, Engineering Resistance to Mixed Virus Infection in a Commercial Potato Cultivar: Resistance to Potato Virus X and Potato Virus Y in Transgenic Russet Burbank, Bio/Technology; Mitsky, T.A., et al., 1996, Plants Resistant to Infection by PLRV. 미국 특허 5,510,253; Newell, C.A., et al., 1991, Agrobacterium-Mediated Transformation of Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank, Plant Cell Reports; Perlak, F.J., et al., 1993, Genetically Improved Potatoes: Protection from Damage by Colorado Potato Beetles, Plant Molecular Biology이며, 이들 모두는 이 목적을 위해 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
새로운 품종의 개발에서 규칙적으로 선별되지 않으나 역교배 및 유전자 조작 기술에 의해 개량될 수 있는 다수의 형질들이 확인되었다. 이들 형질은 유전자이식 식물일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있으며; 이들 형질의 예로는, 제초제저항성; 박테리아, 균류 또는 바이러스 질병에 대한 저항성; 곤충 저항성; 전분 및 다른 탄수화물 농도의 균일성 또는 증가; 증강된 영양 품질; 덩이줄기에 상처가 생길 가능성의 감소; 및 전분의 당으로의 변환율의 감소를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이들 유전자는 일반적으로 핵을 통해 유전된다.
기탁 정보
하기 기탁 정보는 단지 실시예 및 청구된 방법에서 사용된 대표적인 식물 재료를 제공하기 위해서 포함된다.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR J3의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2013년 5월 23일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-120371이다. 본 발명에 참고로 포함된 미국특허 제8,754,303호 "Potato Cultivar J3" 참조.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR F10의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2013년 5월 23일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-120373이다. 본 발명에 참고로 포함된 미국특허 제8,710,311호 "Potato Cultivar F10" 참조.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR W8의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2014년 3월 11일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-121079이다. 본 발명에 참고로 포함된 미국특허 제8,889,964호 "Potato Cultivar W8" 참조.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR J55의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2013년 9월 25일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-120601이다. 본 발명에 참고로 포함된 미국특허 제8,889,963호 "Potato Cultivar J55" 참조.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR E12의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2013년 5월 23일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-120372이다. 본 발명에 참고로 포함된 미국특허출원 제14/072,487호 "Potato Cultivar E12" 참조.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR X17의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2015년 6월 17일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-122248이다.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR Y9의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2015년 6월 17일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-122247이다.
상기 J.R. Simplot Company 소유 POTATO CULTIVAR V11의 덩이줄기 기탁은 the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 이루어졌다. 기탁일은 2015년 6월 17일이었다. ATCC 등록 번호는 PTA-122248이다.
실시예
실시예 1: pSIM1278 형질전환 벡터 백본
플라스미드 pSIM1278은 감자를 형질전환하는데 사용된 19.7kb의 이진 형질전환 벡터이다. 이 실시예는 유전자 요소의 근원, 백본의 클로닝 단계, T-DNA 서열, 및 플라스미드의 요소의 순서를 보여준다.
플라스미드 백본(도 1 및 표 1)은 복제의 두 잘 특징화된 박테리아 기원을 함유한다. pVS1(pVS1 Sta 및 Rep)은 아그로박테리움에서 플라스미드의 유지를 가능하게 하고, pBR322(pBR322 bom 및 ori)는 대장균에서 플라스미드의 유지를 가능하게 한다. 아그로박테리움 DNA 오버드라이브 서열은 RB에서 절단을 향상시키며 대장균 nptII 유전자는 박테리아 카나마이신 선택가능한 마커이다. 백본은 레인저 러셋 감자 폴리유비퀴틴(Ubi7) 프로모터 및 레인저 러셋 감자 폴리유비퀴틴(Ubi3) 종결자가 측면에 있는 아그로박테리움 아이소펜텐일 트렌스페라제(ipt) 유전자를 포함하는 발현 카세트를 함유한다. ipt 카세트는 숙주 식물에서 플라스미드 백본 DNA 통합에 대해 선택하는데 사용된 선택 가능한 표현형입니다. 형질전환된 식물 조직에 존재할 때, ipt의 과다발현은 식물 호르몬 사이토키닌의 과잉생산을 초래하여 발현이 저해된 표현형, 비정상적인 잎 및 뿌리 정착 불능을 가진 식물을 생성한다.
백본 부분은 식물 세포 내로 전이되지 않는다. 백본의 다양한 요소는 표 1에 기술되어 있다.
pSIM1278 백본의 유전자 요소
유전자 요소 기원 등록 번호 1 위치 크기
(bp) 		기능
1. 개재 서열 합성 DNA 10,149-10,154 6 복제에 사용된 서열
2. 오버드라이브 아그로박테리움 투메파 시엔스 Ti-플라스미드 NC_002377 10,155-10,187
33		 아그로박테리움 투메파시엔스 오른쪽 경계 위치의 절단을 향상시킨다 1
3. 개재 서열 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 10,188-11,266
1,079		 pVS1 백본1
4. pVS1 분배 단백질 StaA (PVS1 Sta) 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 11,267-12,267
1,001		 pVS1 안정성 1
5. 개재 서열 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 12,268-12,860
593		 pVS1 백본1
6. pVS1 레플리콘 (pVS1Rep) 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 12,861-13,861
1,001		 아그로박테리움에서 pVS1 복제 영역 1
7. 개재 서열 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 13,862-14,099
238		 pVS1 백본1
8. 개재 서열 pBR322 J01749 14,100-14,180
81		 pBR322 백본1
9. pBR322 bom pBR322 J01749 14,181-14,531
351		 대장균에서 복제를 위한 pBR322 영역 1
10. 개재 서열 pBR322 J01749 14,532-14,670
139		 pBR322 백본1
11. pBR322에 대한 복제 기원 (pBR322 ori) pBR322 J01749 14,671-14,951
281		 복제의 박테리아 기원 1
12. 개재 서열 pBR322 J01749 14,952-15,241
290		 pBR322 백본1
13. 네오마이신 포스포트랜스페라제 II (nptII) 유전자 Tn5 트랜스포존 FJ362602 15,242-16,036 795 아미노글리코시드 포스포트렌스페라제1(Simpson et al. 1985)
14. 개재 서열 벡터 DNA FJ362602 16,037-16,231 195 pCAMBIA 벡터 백본1
15. 유비퀴틴-3 유전자(tUbi3)의 종결자 에스 투베로숨 GP755544 16,232-16,586
355		 ipt 유전자 전사를 위한 종결자(Garbarino and Belknap, 1994)
16. 개재 서열 아그로박테리움 투메파시엔스
Ti-플라스미드		 NC_002377 16,587-16,937
351		 DNA 복제에 사용된 서열
17.아이소펜텐일 트렌스페라제(ipt) 유전자 아그로박테리움 투메파시엔스
Ti-플라스미드		 NC_002377 16,938-17,660
723		 식물에서 아이소펜텐일-AMP, 사이토키닌을 형성하기 위한 AMP 및 아이소펜텐일-피로포스페이트의 축합. 식물에서 비정상적 성장 표현형을 초래한다(Smigocki and Owens, 1988)
18. 개재 서열 합성 DNA 17,661-17,672
12		 DNA 복제에 사용된 서열
19. 폴리유비퀴틴 프로모터(Ubi7) 에스 . 투베 로숨 품종레인저 러셋 U26831 17,673-19,410
1,738		 ipt 백본 마커 유전자의 발현을 구동하는 프로모터(Garbarino et al., 1995)
20. 개재 서열 벡터 DNA U10460
 19,411-19,660
250		 pZP200 벡터 백본1
1 http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html - (pCAMBIA 벡터의 일반적인 구조 지도)
실시예 2: pSIM1278 형질전환 벡터 T-DNA
pSIM1278에 사용된 플랭킹 경계 서열(flanking border sequence)를 포함하는 pSIM1278 DNA 삽입체 영역은 1 bp에서 10,148 bp로, 길이가 10,148 bp이다. pSIM1278 DNA 삽입체는 고유한 DNA로만 구성되며 감자 게놈 내로 안정하게 통합된다. pSIM1278 DNA 삽입체 또는 이의 기능성 부분은 본 발명의 감자식물 품종에서 통합되는 벡터 pSIM1278의 유일한 유전 물질이다.
pSIM1278 DNA 삽입체는 아래 도 1(벡터 백본 영역과 함께), 도 2, 도 5 및 표 2에 기술된다. LB 및 RB 서열 (각각 25 bp)은 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 T-DNA 경계와 유사하고 기능하도록 합성적으로 설계되었다. 진뱅크 등록번호 AY566555는 경계 영역에 대한 DNA 소스를 명확히 하기 위해 수정되었다. 유전 요소 5와 10으로 기술된 ASN1은 Chawla et al., 2012에서 StAst1이라 지칭된다.
플라스미드 pSIM1278 T-DNA는 두 발현 카세트를 함유한다:
제 1 카세트(요소 4 내지 12, 표 2)는 형질전환 된 감자 품종에서 Asn1 및 Ppo5의 하향 조절을 초래한다. 이것은 Asn1의 2개의 동일한 405bp 단편과 Ppo5의 2개의 동일한 144bp 단편으로 구성된다. Asn1 및 Ppo5의 단편은 비 코딩 157bp 레인저 러셋 감자 뉴클레오타이드 스페이서 요소에 의해 분리된 역 반복으로서 배열된다. Asn1 및 Ppo5 단편은 2개의 수렴 감자 프로모터 사이에 배열된다; 주로 덩이줄기에서 활성인 ADP 글루코스 피로포스포릴라제 유전자(Agp)의 Agp 프로모터 및 과립-결합 전분 신타아제 유전자(Gbss)의 Gbss 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터는 역 반복체의 발현을 유도하여 이중 가닥 RNA를 생성하고 Asn1 및 Ppo5를 하향 조절한다.
제 2 카세트(요소 14 내지 21, 표 2)는 형질전환 된 감자 품종에서 PhL 및 R1의 하향조절을 초래한다. 이것은 PhL 프로모터 영역(pPhL)의 2개의 동일한 509 bp 단편과 R1 프로모터 영역(pR1)의 2개의 동일한 532 bp 단편으로 구성된다. pPhL 및 pR1 단편은 레인저 러셋 감자 폴리유비퀴틴 유전자의 비 암호화 258 bp 단편에 의해 분리된 역 반복체로 배열된다. 첫 번째 카세트와 마찬가지로, pPhL 및 pR1 단편은 감자 Agp 및 Gbss 프로모터 사이에 배열되고 전사된다.
왼쪽 경계 위치로부터 오른쪽 경계까지, pSIM1278 T-DNA의 유전자 요소
유전자 요소 기원 등록 번호 위치( pSIM1278 ) 크기(bp) 의도된 기능
1. 왼쪽 경계(LB) 부위 1 합성 AY5665555
(염기 1-25)		 1-25 25 pSIM1278로부터 단일-가닥 DNA 삽입체를 방출하는 2차 절단 부위 (van Haaren et al. 1989)
2. LB를 포함하는 왼쪽 경계 영역 서열 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 AY5665555
(염기26-187)		 26-187 162 LB에서 2차 절단을 지원한다
3. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 AF393847 188-193 6 DNA 복제에 사용된 서열
4. ADP 글루코오스 피로포스포릴라제 유전자에 대한 프로모터(pAgp), 1st 복제물 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363752 194-2,453 2260 특히 덩이줄기에서 Asn1과 Ppo5의 단편을 포함하는 역 반복체의 발현을 유도하는 두 개의 수렴 프로모터 중 하나
5. 아스파라긴 신서타제-1(Asn1) 유전자의 단편(1st 복제물 안티센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363759 2,454-2,858 405 Asn1 전사체의 절단을 유발하여 아스파라긴 생성을 손상시키는(11) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
(Chawla et al. 20122)
6. 폴리페놀 옥시다제-5 유전자(Ppo5)의 3'-비번역된 서열(1st 복제물, 안티센스 배향) 솔라눔 투베로숨 HM363754 2,859-3,002 144 po5 전사체의 절단을 유발하여 흑점 발달을 차단하는(9) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
7. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 DQ478950 3,003-3,008 6 DNA 복제에 사용된 서열
8. 스페이서-1 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363753 3,009-3,165 157 1st 역 반복체들 사이의 서열
9. 폴리페놀 옥시다제-5 유전자(Ppo5)의 3'-비번역된 서열(2nd 복제물, 센스 배향) 솔라눔 투베로숨 HM363754 3,166-3,309 144 Ppo5 전사체의 절단을 유발하여 흑점 발달을 차단하는(6) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
10. 아스파라긴 신서타제-1(Asn1) 유전자의 단편(2nd 복제물, 센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363759 3,310-3,715 406 Asn1 전사체의 절단을 유발하여 아스파라긴 생성을 손상시키는(5) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
(Chawla et al. 20122)
11. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 X73477 3,716-3,721 6 DNA 복제에 사용된 서열
12. 과립-결합 전분 신타아제(pGbss) 유전자에 대한 프로모터(1st 복제물, pAgp의 1st 복제물에 대한 수렴 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363755 3,722-4,407 686 특히 덩이줄기에서 Asn1과 Ppo5의 단편을 포함하는 역 반복체의 발현을 유도하는 두 개의 수렴 프로모터 중 하나
13. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 X95996/ AF393847 4,408-4,423 16 DNA 복제에 사용된 서열
14. pAgp, 2nd 복제물 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363752 4,424-6,683 2260 특히 덩이줄기에서 PhL과 R1의 단편을 포함하는 역 반복체의 발현을 유도하는 두 개의 수렴 프로모터 중 하나
15. 감자 포스포릴라제-L(pPhL) 유전자에 대한 유전자의 단편(1st 복제물, 안티센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363758 6,684-7,192 509 PhL 전사체의 절단을 유발하여 전분 절단을 통한 환원당의 형성을 제한하는 (21) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
16. 감자 R1 유전자(pR1)에 대한 프로모터의 단편(1st 복제물, 안티센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363757 7,193-7,724 532 R1 전사체의 절단을 유발하여 전분 절단을 통한 환원당의 형성을 제한하는 (20) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
17. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 DQ478950 7,725-7,730 6 DNA 복제에 사용된 서열
18. 스페이서-2 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 U268313 7,731-7,988 258 2nd 역 반복체들 사이의 서열
19. 감자 R1 유전자(pR1)에 대한 프로모터의 단편(2nd 복제물, 센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363757 7,989-8,520 532 R1 전사체의 절단을 유발하여 전분 절단을 통한 환원당의 형성을 제한하는 (20) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
20. 감자 포스포릴라제-L(pPhL) 유전자에 대한 유전자의 단편(2nd 복제물, 센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363758 8,521-9,029 509 PhL 전사체의 절단을 유발하여 전분 절단을 통한 환원당의 형성을 제한하는 (16) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
21. pGbss (2nd 복제물, pAgp의 2nd 복제물에 대한 수렴 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 X832204 9,030-9,953 924 특히 덩이줄기에서 PhL과 R1의 단편을 포함하는 역 반복체의 발현을 유도하는 두 개의 수렴 프로모터 중 하나
22. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 AF143202 9,954-9,962 9 DNA 복제에 사용된 서열
23. RB를 포함하는 오른쪽 경계 영역 서열 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 AY5665555
(염기 231-391)		 9,963-10,123 161 RB-유사 부위에서 1차 절단을 지원한다
24. 오른쪽 경계 (RB) 서열1 합성 AY5665555
(염기 392-416)		 10,124-10,148 25 SIM1278로부터 단일-가닥 DNA 삽입체를 방출하는 1차 절단 부위 (van Haaren et al. 1989)
1 LB 및 RB 염기 서열 (각각 25-bp)은 아그로박테리움 투메파시엔스의 T-DNA 경계와 유사하고 기능적으로 합성되도록 설계되었다.
2 유전 요소 5와 11로 기술된 ASN1은 Chawla et al.2012에서 StAst1이라 불린다.
3 진뱅크 등록번호 HM36756H는 pSIM1278 구조의 pGbss DNA 요소에 존재하는 4개의 3' 말단 뉴클레오타이드를 적절하게 포함하기 위해 진뱅크 등록번호에 대한 인용 부호로 대체된다.
4 진뱅크 등록번호 HM363755는 진뱅크 등록번호 X83220에 대한 인용문으로 대체되어 pSIM1278 구조체에 존재하는 전체 pGbss (2차 사본) DNA 삽입체 서열을 적절하게 포함한다.
5 진뱅크 등록번호 AY566555는 경계 지역의 DNA 기원을 명확히 하기 위해 개정되었다.
따라서, 표 1 및 표 2에서 볼 수 있듯이, pSIM1278 플라스미드는 감자 식물 형질전환을 위해 고안된 이원 벡터이다. 벡터 백본은 벡터 백본 DNA를 갖는 식물을 제거하기 위한 스크리닝용 ipt 마커와 함께 대장균 및 아그로박테리움에서 복제를 위한 서열을 함유한다. T-DNA 영역은 LB 및 RB 서열에 의해 측면으로 둘러싸인 2개의 발현 카세트로 구성된다. pSIM1278 벡터를 함유하는 아그로박테리움을 숙주 식물 조직에 접종하면, pSIM1278의 T-DNA 영역이 숙주 게놈으로 전사된다.
본 발명의 감자 라인을 제조하는데 사용된 표 2에 기재된 DNA 삽입체는 인접 유전자를 활성화시키지 않고 감자 식물 품종의 표현형에 악영향을 미치지 않는다.
실시예 3 : pSIM1678 형질전환 벡터 백본
플라스미드 pSIM1678은 감자를 형질전환하는데 사용되는 18.6kb의 이원 형질전환 벡터이다. 이 실시예는 유전자 요소의 기원, 백본의 클로닝 단계, T-DNA 서열, 및 플라스미드의 요소의 순서를 보여준다.
플라스미드 백본(도 3; 표 3)은 복제의 두 잘 특징 지워진 박테리아 기원을 함유한다. pVS1(pVS1 Sta 및 Rep)은 아그로박테리움에서 플라스미드의 유지를 가능하게 하고, pBR322(pBR322 bom 및 ori)는 대장균에서 플라스미드의 유지를 가능하게 한다. 아그로박테리움 DNA 오버드라이브 서열은 RB에서 절단을 촉진시키며 대장균 nptII 유전자는 박테리아 카나마이신 선별 마커이다. 백본은 레인저 러셋 감자 폴리유비퀴틴(Ubi7) 프로모터 및 레인저 러셋 감자 폴리유비퀴틴(Ubi3) 종결자에 의해 측면으로 둘러싸인 아그로박테리움 아이소펜텐일 트렌스페라제(ipt) 유전자를 포함하는 발현 카세트를 함유한다(Garbarino and Belknap, 1994). ipt 카세트는 숙주 식물에서 플라스미드 백본 DNA 통합에 대해 선택하는데 사용되는 선별 가능한 표현형이다. 형질전환된 식물 조직에 존재할 때, ipt의 과다발현은 식물 호르몬 사이토키닌의 과잉생산을 초래하여 발현이 저해된 표현형, 비정상적인 잎 및 뿌리 정착 불능을 가진 식물을 생성한다.
백본 부분은 식물 세포 내로 전이되지 않는다. 백본의 다양한 요소는 표 3에 기술된다.
pSIM1678 백본의 유전자 요소
유전자 요소 기원 등록 번호 1 위치 크기
(bp) 		기능
1 http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html - (pCAMBIA 벡터의 일반적인 구조 지도)
1. 개재 서열 합성 DNA 9,091-9,096 6 복제에 사용된 서열
2. 오버드라이브 아그로박테리움 투메파시엔스 Ti-플라스미드 NC_002377 9,097-9,126
30		 아그로박테리움 투메파시엔스 오른쪽 경계 위치의 절단을 향상시킨다 1
3. 개재 서열 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 9,127-10,208
1,082		 pVS1 백본1
4. pVS1 분배 단백질 StaA (PVS1 Sta) 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 10,209-11,209
1,001		 pVS1 안정성 1
5. 개재 서열 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 11,210-11,802
593		 pVS1 백본1
6. pVS1 레플리콘 (pVS1Rep) 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 11,803-12,803
1,001		 아그로박테리움에서 pVS1 복제 영역 1
7. 개재 서열 슈도모나스 플루오레센스 pVS1 AJ537514 12,804-13,040
237		 pVS1 백본1
8. 개재 서열 pBR322 J01749 13,041-13,212 172 pBR322 백본1
9. pBR322 bom pBR322 J01749 13,213-13,473
261		 대장균에서 복제를 위한 pBR322 영역 1
10. 개재 서열 pBR322 J01749 13,474-13,612
139		 pBR322 백본1
11. pBR322에 대한 복제 기원 (pBR322 ori) pBR322 J01749 13,613-13,893
281		 복제의 박테리아 기원 1
12. 개재 서열 pBR322 J01749 13,894-14,183
290		 pBR322 백본1
13. 네오마이신 포스포트랜스페라제 II (nptII) 유전자 Tn5 트랜스포존 FJ362602 14,184-14,978 795 아미노글리코시드 포스포트렌스페라제1(Simpson et al. 1985)
14. 개재 서열 벡터 DNA FJ362602 14,979-15,173 195 pCAMBIA 벡터 백본1
15. 유비퀴틴-3 유전자(tUbi3)의 종결자 에스 투베로숨 GP755544 15,174-15,528
355		 ipt 유전자 전사를 위한 종결자(Garbarino and Belknap, 1994)
16. 개재 서열 아그로박테리움 투메파시엔스
Ti-플라스미드		 NC_002377 15,529-15,879
351		 DNA 복제에 사용된 서열
17.아이소펜텐일 트렌스페라제(ipt) 유전자 아그로박테리움 투메파시엔스
Ti-플라스미드		 NC_002377 15,880-16,602
723		 식물에서 아이소펜텐일-AMP, 사이토키닌을 형성하기 위한 AMP 및 아이소펜텐일-피로포스페이트의 축합. 식물에서 비정상적 성장 표현형을 초래한다(Smigocki and Owens, 1988)
18. 개재 서열 합성 DNA 16,603-16,614
12		 DNA 복제에 사용된 서열
19. 폴리유비퀴틴 프로모터(Ubi7) 에스 . 투베 로숨 품종 레인저 러셋 (A)U26831 16,615-18,352
1,738		 ipt 백본 마커 유전자의 발현을 구동하는 프로모터(Garbarino et al., 1995)
20. 개재 서열 벡터 DNA (B)U10460
 18,353-18,602
250		 pZP200 벡터 백본
실시예 4: pSIM1678 형질전환 벡터 T-DNA
pSIM1278에 사용된 플랭킹 경계 서열(flanking border sequence)를 포함하는 pSIM1278 DNA 삽입 영역은 길이가 9,090 bp(1 bp에서 9,090 bp)이다. pSIM1678 DNA 삽입체는 고유한 DNA로만 구성되며 감자 게놈 내로 안정하게 통합된다. pSIM1678 DNA 삽입체 또는 이의 기능성 부분은 본 발명의 감자식물 품종에서 통합되는 벡터 pSIM1678의 유일한 유전 물질이다.
pSIM1678 DNA 삽입체는 아래 도 3(벡터 백본 영역과 함께), 도 5 및 표 4에 기술된다. 표 4에서, LB 및 RB 서열(각각 25-bp)은 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 T-DNA 경계와 유사하고 기능적으로 합성되도록 설계되었다. 진뱅크 등록번호 AY566555는 경계 지역의 DNA 기원을 명확히하기 위해 개정되었다.
플라스미드 pSIM1678 T-DNA는 1-bp 내지 9,090-bp이며, 2개의 발현 카세트를 포함한다(도 3):
제 1 카세트(요소 4 내지 6, 표 4)는 솔리눔 벤투리(Solanum venturii)로부터 유래하는 2,626 bp Rpi - vnt1(Vnt1) 유전자를 함유한다. 유전자 생성물인 VNT1은 피 토프토라 인페스탄(Phytophthora infestans)의 감자역병 감염으로부터 감자를 보호하는 식물 면역 반응에 관여하는 R 단백질이다. 이 유전자는 천연 Vnt1 프로모터, pVnt1 및 종결자, tVnt1하에서 발현된다.
제 2 카세트(요소 8 내지 14, 표 4)는 형질전환된 감자 품종에서 액포 전화효소(VInv)의 하향조절을 초래한다. 이것은 역 반복체로 분리되게 배열된 VInv(요소 10 및 12, 표 4)의 두 단편으로 이루어진다. VInv 단편은 두 개의 융합 감자 프로모터: 주로 덩이줄기에서 활성인 ADP 글루코스 피로포스포릴라제 유전자(Agp)의 Agp 프로모터 및 과립-결합 전분 신타아제 유전자(Gbss)의 Gbss 프로모터 사이에 배열된다: 이런 프로모터는 역 반복체의 발현을 유도하여 이중 가닥 RNA를 생성하고 VInv를 하향 조절한다.
왼쪽 경계 위치로부터 오른쪽 경계까지, pSIM1678 T-DNA의 유전자 요소
유전자 요소 기원 등록 번호 위치( pSIM1678 ) 크기(bp) 의도된 기능
1. 왼쪽 경계(LB) 부위 1 합성 AY5665553
(염기 1-25)		 1-25 25 pSIM1678로부터 단일-가닥 DNA 삽입체를 방출하는 2차 절단 부위
2. LB를 포함하는 왼쪽 경계 영역 서열 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 AY5665553
(염기1-187)		 26-187 162 LB에서 2차 절단을 지원한다
3. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 AF393847 188-193 6 DNA 복제에 사용된 서열
4. 감자역병 저항성 유전자(Vnt1)에 대한 천연 프로모터 솔라눔 벤투리 FJ423044 194-902 709 감자역병 저항성 유전자 vnt1의 발현을 유도한다
5. 감자역병 저항성 유전자 VNt1(Rpi-vnt1)
 솔라눔 벤투리 FJ423044 903-3,578 2676 솔라눔 벤투리 감자역병 저항성 단백질 유전자
6. Vnt1 유전자에 대한 천연 종결자 솔라눔 벤투리 FJ423044 3,579-4,503 925 감자역병 저항성 유전자 vnt1의 전사를 종료한다
7. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 HM363755 4,504-4,510 7 DNA 복제에 사용된 서열
8. ADP 글루코오스 피로포스포릴라제 유전자에 대한 프로모터(pAgp) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 HM363753 4,511-6,770 2260 산 전화효소 유전자의 단편을 포함하는 역 반복체의 발현을 유도하는 두 개의 수렴 프로모터 중 하나
9. 개재 서열 솔라눔 투베로숨
품종 레인저 러셋		 DQ206630 6,771-6,776 6 DNA 복제에 사용된 서열
10. 산 전화효소(Inv)의 단편(센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 DQ478950 6,777-7,455 679 전화효소 전사체의 열화를 일으키는 (12) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
11. 개재 서열 솔라눔 투베로숨
품종 레인저 러셋
 X73477 7,456-7,461 6 DNA 복제에 사용된 서열
12. 산 전화효소(Inv)의 단편(항-센스 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 DQ478950 7,462-7,965 504 전화효소 전사체의 열화를 일으키는 (10) 이중 가닥 RNA와 함께 생성한다
13. 개재 서열 솔라눔 투베로숨
품종 레인저 러셋
 X95996 7,966-7,971 6 DNA 복제에 사용된 서열
14. 과립-결합 전분 신타아제(pGbss) 유전자에 대한 프로모터(pAgp에 대한 수렴 배향) 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 X832202 7,972-8,895 924 특히 덩이줄기에서 전화효소 유전자의 단편을 포함하는 역 반복체의 발현을 유도하는 두 개의 수렴 프로모터 중 하나
15. 개재 서열 솔라눔 투베로숨 AF143202 8,896-8,904 9 DNA 복제에 사용된 서열
16. RB를 포함하는 오른쪽 경계 영역 서열 솔라눔 투베로숨 품종 레인저 러셋 AY5665553
(염기 231-416)		 8,905-9,065 161 RB-유사 위치에서 1차 절단을 지원한다
17. 오른쪽 경계(RB) 서열1 합성 AY5665553
(염기 392-416)		 9,066-9,090 25 pSIM1678로부터 단일 가닥 DNA 삽입체를 방출하는 1차 절단을 위한 위치(van Haaren et al., 1989)
1 LB 및 RB 염기 서열 (각각 25-bp)은 아그로박테리움 투메파시엔스의 T-DNA 경계와 유사하고 기능적으로 합성되도록 설계되었다.
2 진뱅크 등록번호 HM363755는 진뱅크 등록번호 X83220에 대한 인용문으로 대체되어 pSIM1278 구조체에 존재하는 전체 pGbss (2차 사본) DNA 삽입체 서열을 적절하게 포함한다.
3 진뱅크 등록번호 AY566555는 경계 지역의 DNA 기원을 명확히 하기 위해 개정되었다.
따라서, 표 3 및 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, pSIM1278 플라스미드는 감자 식물 형질전환을 위해 고안된 이원 벡터이다. 벡터 백본은 벡터 백본 DNA를 갖는 식물을 제거하기 위한 스크리닝용 ipt 마커와 함께 대장균 및 아그로박테리움에서 복제를 위한 서열을 함유한다. T-DNA 영역은 LB 및 RB 서열에 의해 측면으로 둘러싸인 2개의 발현 카세트로 구성된다. pSIM1678 벡터를 함유하는 아그로박테리움을 숙주 식물 조직에 접종하면, pSIM1678의 T-DNA 영역이 숙주 게놈으로 전사된다.
실시예 5: 아그로박테리움 균주 및 형질감염
C58 유래 아그로박테리움 균주 AGL1은 고독성 플라스미드 pTiBo542의 전이 DNA를 정확하게 결실시킴으로써 개발되었다(Lazo et al., 1991). 일반적인 재조합 유전자(recA) 내의 트랜스포존 삽입은 pSIM1278(도 1)과 같은 재조합 플라스미드 벡터를 안정화시킨다. AGL1은 카베니실린(carbenicillin) 및 리팜피신(rifampicin)에 대한 저항성을 나타내며 티멘틴(timentin)을 사용하여 형질전환된 감자 조직으로부터 제거된다. 선택 후, 식물은 항생제와 아그로박테리움을 포함하지 않으며, 식물의 게놈에 감자 유래 발현 카세트가 삽입된다.
원료 식물을 3% 수크로오스 및 2g/l 젤라이트(증식 배지)를 함유하는 40ml 절반 강도 M516(Phytotechnology) 배지로 마젠타 박스에서 유지시켰다. 4 내지 6 mm의 감자 마디 사이 절편을 pSIM1278을 가지고 있는 아그로박테리움 AGL1 균주에 감염된 4주된 식물에서 잘라내어 3% 수크로오스와 6g/l 한천(공동 배양 배지)을 함유하는 조직 배양 배지로 옮겼다. 감염된 체외 이식편을, 이틀 후에 3% 수크오로스, 6g/l 한천 및 150mg/l 티멘틴을 함유하는 M404(Phytotechnology) 배지로 옮겨서 아그로박테리움(호르몬 없는 배지)을 제거하였다. 방법의 세부 사항은 Richael et al.(2008)에 기술된다.
한 달 후, 감염된 체외 이식편을 어떠한 합성 호르몬도 없는 새로운 배지에 옮기고 퍼시벌 성장 챔버에서 이들이 싹을 형성하기 시작한 24℃에서 동안 16시간의 광주기 하에서 배양하였다. 많은 싹이 ipt 유전자를 발현하고 사이토키닌 과잉생산 표현형을 나타내었다; 이 싹은 더 이상의 분석을 위해 고려되지 않았다. PCR 지노타이핑(genotyping)은 남아있는 싹의 약 0.3 내지 1.5%가 P-DNA의 적어도 일부를 포함하면서 ipt 유전자가 결핍되었다는 것을 입증하였다. 따라서, 형질전환된 식물을 선택하기 위해 어떠한 마커도 사용되지 않았다. ipt 기반 마커 제거 식물 형질전환에 대한 자세한 내용은 Richael et al. (2008)에 의해 발행되었다.
아그로박테리움을 제거하는 과정은 체외 이식편 감염 2일 후에 시작되었다. 이 목적을 위해, 조직은 살아있는 아그로박테리움이 없는 것으로 입증될 때까지 항생제 티멘틴(150 mg/L)을 투여받았다. 28℃에서 2주 동안 영양소 브로스-효모 추출물(NBY 배지)에서 형질전환 사건의 줄기 단편을 배양함으로써 증명하였다(2회 반복). 97 CFR 파트 340에 따라, 형질전환 된 식물은 살아있는 아그로박테리움이 없는 경우에만 농장으로 옮겨 심었다.
러셋 버뱅크 W8 사건은 상이한 플라스미드로 두 개의 분리된 형질전환으로부터 유래된 삽입체를 함유한다. 제 1 삽입체인 플라스미드 pSIM1278은 덩이줄기에서 최대 4개의 감자 유전자인 Asn1, Ppo5, R1 및 PhL을 침묵시키도록 설계된 역 반복체로 이루어진 2개의 카세트를 함유한다. 유사하게, 제 2 플라스미드인 pSIM1678은 덩이줄기에서 Vlnv 유전자를 침묵시키는 역 반복체(inverted repeat)로 이루어진 카세트를 함유하면서 천연 감자 프로모터하에서 Rpi-vnt1 유전자의 복제물을 함유하는 카세트를 함유한다.
감자 식물 품종은 DNA 겔 블롯 분석에 의해 분석하여 통합된 DNA 삽입체 서열의 구조 및 복제물 수를 결정하고 벡터 백본 서열의 부재를 확인하였다.
또한, 분자 특성화는 DNA 삽입체에 의해 측면으로 둘러싸인 접합부의 서열을 결정하고 삽입된 DNA의 안정성을 보이기 위해 사용하였다.
접합부의 시퀀싱 정보는 유전자 내 감자 식물 품종에 대한 특이 PCR 테스트를 개발하기 위한 기초를 제공하였다. 따라서, 개시된 방법은 다른 식물 종과 다른 감자 품종에 넓게 응용될 수 있는데, 이는 형질전환 사건을 겪은 식물 종의 DNA를 서열화하고 이로부터 얻은 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 확인하는 것은 당업자의 기술 수준 내에 있기 때문이다. 그런 후에 상기 당업자는 상기 비 자연 발생 접합부 서열에 결합하는 적절한 프로브 및 이런 서열을 증폭하도록 최적화된 프라이머를 개발할 수 있을 것이다.
실시예 6: 벡터 백본 DNA의 부존재에 대한 증거
많은 상용 유전자이식 작물과는 달리, 본 발명의 감자 품종은 벡터 백본 DNA와 같은 형질전환에 사용되는 아그로박테리움 유래 DNA 서열이 3가지 상이한 방법에 의해 결여된 것으로 확인되었다: 1) 먼저, 벡터 백본에서 음성 선택성 이소펜텐일 아이소머라제(ipt) 마커 유전자의 존재 또는 부존재가 결정되었는데, 이는 아그로박테리움에서 식물 세포로의 ipt 유전자 발현 카셋트를 포함하는 백본 DNA의 의도하지 않은 전이가 ipt 유전자 발현을 유발하고, 결과적으로 사이토킨닌 형태 호르몬 아이소펜텐일아데노신의 형성을 유발할 수 있기 때문이다, 2) 그런 후에 백본 DNA의 부존재를 확인하기 위해 제 1 스크리닝 방법을 통과한 형질전환된 감자 식물에 서던 블롯 혼성화를 사용하였고, 3) 그런 후에 DNA 삽입체 경계 영역 및 플랭킹 백본 DNA 또는 DNA 삽입체에 의해 측면으로 둘러싸인 백본 DNA 내의 영역 사이의 접합부를 나타내는 단편을 증폭하도록 PCR을 설계하였다. 이 방법의 효능은 pSIM1278 DNA를 양성 대조군으로 사용함으로써 확인하였다. 본 발명의 감자 품종은 벡터 백본 DNA의 존재를 나타내는 PCR 밴드를 생성하지 않았다.
실시예 7: 삽입 DNA의 안정성
DNA 삽입체의 안정성은 원래 형질전환체에서 평가되었고, DNA 겔 블롯 혼성화 및 형질 평가 모두를 사용하여 증식된 식물 재료에서 다시 평가되었다. 이 연구는 유전자 내 사건이 일관되고 신뢰할 수 있는 방식으로 통합된 형질을 나타낼 수 있도록 수행되었다. 불안정성은 드문 재조합 사건에 의해 유발되거나 메틸화에 의해 야기될 수 있다. 감자는 일반적으로 무성적으로 번식하기 때문에, 유성적으로 번식된 작물에 대한 표준 평가는 직접적으로 응용될 수 없으며 씨앗보다는 덩이줄기가 후속 세대를 정의하는데 사용되었다. DNA 블롯 혼성화의 결과는 일관된 밴드가 여러 세대에서 존재함을 보여 주며, 따라서 안정성을 나타낸다. 안정성에 대한 추가 증거는 1세대와 2세대의 덩이줄기 씨앗에서 형질 효능을 확인함으로써 얻어졌다.
DNA 삽입체 안정성은 생체 외에서 증식되고 결코 토양에 심어지지 않은 식물의 잎으로부터 DNA를 추출하고 평가함으로써 원래 형질변형된 재료(G0)에서 입증되었다. 1세대(G1) 분석을 위해, 각 유전자 내 품종의 두 가지 증식 식물과 각 대조군의 한 식물을 온실에 심었다; 각 식물에서 수확된 덩이줄기 중 하나를 심어 DNA를 분리하고 G1 세대를 평가하는데 사용된 G1 식물로부터 잎을 얻었다. 이 세대로부터의 덩이줄기는 다시 심겨졌고, 결과로 얻은 G2 식물의 잎은 그 세대의 특성화를 허용하였다.
삽입체의 구조는 W8 감자의 3세대 (G0-G3)에 걸쳐 분리된 게놈 DNA의 서던 블롯 분석을 사용하여 안정한 것으로 나타났으나, 표현형 안정성은 필드-성장 덩이줄기의 2세대에서, 폴리페놀 옥시다제 활성을 측정하여 평가되었다. 이 방법은 감자 절단면에 카테콜을 도포한 후 PPO 침묵의 시각적 증거를 나타낸다. 이런 연구는 형질을 유지하면서 W8의 원하는 유전적 변화가 여러 클론 주기 동안 안정적으로 유지되도록 하기 위해 수행되었다.
DNA 삽입체의 안정성은 서던 블롯을 사용하여 3개의 연속적인 클론 세대(G1, G2 및 G3)를 원래의 형질전환체(G0)와 비교함으로써 평가하였다. 안정한 DNA 삽입체는 동일한 구조를 유지하고 식물의 여러 세대에 걸쳐 동일한 소화 패턴을 생성 할 것으로 예상된다. W8 이벤트에서 삽입체의 안정성을 시험하기 위해, pSIM1278 및 pSIM1678 둘 다에서 삽입체의 영역에 혼성화하는 두 개의 프로브(GBS1 및 AGP) 및 pSIM1678 삽입체에 특이적인 두 프로브(INV 및 VNT1)를 사용하여 분해 패턴을 비교하였다. 이들 프로브가 DNA 게놈뿐만 아니라 DNA 삽입체(들)과 혼성화하는 DNA 서열은 감자 게놈에 함유되기 때문에, 내인성 및 삽입체- 특이적 밴드 모두가 서든 블롯에서 예상된다.
모든 게놈 DNA 샘플을 제한 효소, EcoRV로 분해하였고, AGP 또는 GBS1에 특이적인 프로브와 혼성화시켰다. EcoRV는 이들 연구를 위해 선택되었는데 이는 pSIM1278 삽입체(예를 들어, 2.3kb)에서 예측된 크기의 내부 밴드를 갖는 독특한 밴딩 패턴을 제공하기 위해 두 삽입체 내에서 소화되기 때문이다. W8의 모든 샘플 사이의 밴딩 패턴은 두 프로브에 대해 서로 동일하였다. 러셋 버뱅크 대조군에 있는 여러 밴드는 W8에서도 발견되지만 W8은 pSIM1278 및 pSIM1678 삽입체에 해당하는 밴드도 함유한다. 이런 밴드는 분석된 W8의 모든 세대 사이에 유사하게 일치하여 두 삽입체의 유전적 안정성을 나타낸다.
pSIM1678 삽입체에 특이적인 두 개의 프로브를 사용하여 두 번째 분석을 실행하였다. 이 분석을 위해 게놈 DNA 샘플을 제한 효소 XbaI로 분해하고 VNT1 및 INV 프로브와 혼성화하였다. XbaI는 pSIM1678을 내부적으로 분해하고 공지된 크기의 밴드(예를 들어, INV 프로브에 대해 4.6 kb)를 생성함에 따라 이들 연구에 대한 제한 효소로 선택되었다. 다시, 내인성 및 삽입-특이적 밴드 모두를 분석된 3세대 간의 일치하는 밴딩 패턴으로 검출하였다. 유전적 및 표현형 분석 결과는 pSIM1278 및 pSIM1678의 형질전환으로 인해 발생하는 삽입은 3세대에 걸쳐 안정적이라는 것을 나타내었다. 3세대에 걸쳐 입증된 안정성을 감안할 때, 이후의 식물 번식주기 동안 안정성이 유지될 가능성이 있다.
실시예 8: 접합부 분석 및 품종-특이적 탐지
DNA 삽입체/플랭킹 식물 DNA 접합부를 어댑터 리게이션-매개 PCR 또는 열 비대칭 인터레이스 PCR을 사용하여 서열 분석하였다.
접합부 서열을 사용하여 본 발명의 감자 품종에 대한 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 품종-특이적 PCR-기반 탐지 방법에 적용하였다.
프라이머는 품종-특이적 DNA 단편을 증폭시키는데 사용될 수 있어, 상기 품종에 대한 계통 특이적 시험 방법이 얻어진다. 개발된 방법은 농장과 저장소에서 식물과 덩이줄기를 관찰하여 덩이줄기 또는 가공 식품에서 유전자 내 물질의 부존재를 확인하고 유기 씨앗의 순도를 보장하하였다.
실시예 9 : 유전자 침묵의 효능 및 조직 특이성
Asn1, Ppo5, PhL, R1 및 VInv 천연 단백질의 활성을 낮추기 위해 유전자 침묵 방법을 사용하였으며, 단백질 양보다는 전사체 수준을 평가하여 새로운 표현형 형질을 분자 수준의 변화와 연결시켰다.
잎 및 줄기에서 ASN(아스파라긴) 형성에 관여하는 Asn1 유전자의 강한 침묵이 성장에 악영향을 미칠 수 있기 때문에, 덩이줄기 및 포복지 특이적 프로모터이며 광합성적으로 활성인 조직과 뿌리에서 훨씬 덜 활성인 Agp 프로모터 및 Gbss 프로모터는 덩이줄기와 포복지에서 유전자 침묵을 유도하는 데 사용되었다. 그들의 형질전환되지 않은 대조물과 함께 식물 품종의 다양한 조직에서 5개 표적 유전자의 전사체 수준은 노던 블롯 분석에 의해 결정하였다.
W8 사건을 일으키기 위해 러셋 버뱅크에 도입된 3개의 유전자 침묵 카세트 중 2개는 RNAi-매개 침묵을 위한 이들의 표적 전사체를 침묵시키는데 매우 효과적이었다. 이 두 구조체는 효과적으로 W8의 덩이줄기에서 Asn1, Ppo5 및 VInv를 침묵시킨다. 덩이줄기에 대한 침묵의 특이성은 있는 경우, RNAi 기계에 의해 생성된 siRNA의 소수가 다른 조직으로 퍼지거나 이들의 수준은 이런 조직에서 RNAi 반응을 일으키기에 불충분하다는 것을 나타낸다. 덩이줄기 밖에서 침묵에 대한 유일한 증거는 낮은 수준의 Asn1이 관찰되는 꽃에 있었으나, 변화의 정도는 덩이줄기에서보다 훨씬 낮았다. PhL과 R1에 의한 프로모터 침묵 전략은 최소의 효과를 나타내었으며, 이는 동일한 pSIM1278 구조체를 함유하는 다른 사건과 일치한다(Collinge and Clark 2013).
여러 유전자 내 감자 품종의 특이적 조직에서 하향조절된 전사체 수준의 요약이 표 5에 도시된다. 침묵의 양은 유전자와 조직에 따라 변할 수 있었지만, 표 5의 각 문자(A, P, L, R)는 침묵이 확인되었음을 나타낸다.
상이한 조직에서 하향조절된 유전자의 요약
사건 덩이줄기1 포복지1 뿌리1 줄기1 잎1 꽃1 ,2
F10 AP R A LR A P R P A A
E12 AP L R A LR A P P A
J3 AP L R A R A A P A
J55 AP L R A LR A P A
1 A = Asn1, P = Ppo5, L = PhL, R = R1. 표의 문자는 조직에 의한 유전자 발현의 감소를 나타낸다.
2 부분적으로 하향조절된 Asn1 유전자 발현은 꽃의 아미노산 조성을 변화시킬 수 있다. 이러한 효과는 ASN의 감소와 GLN의 증가로 제한될 것이다. ASN과 GLN은 유사한 비 필수 아미노산이기 때문에, 이들 화합물의 수준 변화는 곤충이나 다른 유기체를 위한 사료로서 꽃잎, 꿀 및 꽃가루의 품질에 영향을 줄 것으로 예상되지 않는다.
실시예 10: 감자 식물 잎 조직으로부터의 DNA 분리
DNA를 3g의 감자 식물 잎 조직으로부터 추출하고, 액체 질소에서 분쇄하고 20 ml의 추출 버퍼(0.35 M 소르비톨, 0.1 M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.5 M EDTA, pH 8.0)과 혼합하였다. 샘플을 3,000 rpm에서 5분 동안 펠렛화하고 2ml 추출 버퍼로 헹궜다. 펠렛을 4ml의 추출 버퍼 및 4㎕의 100 mg/ml RNase A에 재현탁하였다. 4 밀리리터의 핵 용해 버퍼(1M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.5 M EDTA, pH 8.0, 5 M NaCl, 20mg/ml CTAB) 및 1.6 ml의 5% 사르코실(Sarcosyl)을 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 혼합하고 교반하면서 20분 동안 65℃에서 배양하였다. 샘플을 같은 부피의 클로로포름:아이소아밀 알코올(24:1)로 흔들고 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 수성 상을 유지시키고 클로로포름 추출 단계를 2-3회 반복하였다. DNA를 같은 부피의 아이소프로필 알코올에 침전시키고 3,000 rpm에서 10분 동안 펠렛화하였다. 펠릿을 70% 에탄올로 헹구고, 건조시키고 TE에 재현탁시켰다.
실시예 11: 고수율 CTAB -기반 DNA 추출법
감자 및 감자 제품은 PCR, 특히 qPCR을 간섭할 수 있는 고 수준의 다당류를 함유한다. 따라서, DNA 분리는 고품질 DNA를 생산하는 방법으로 수행하고 qPCR은 폴리사카라이드와 같은 PCR 저해제에 의한 간섭을 방지하도록 고안된 마스터 믹스(master mixes)를 사용하여 실행하는 것이 권장된다. 이러한 요구 사항을 충족시키기 위해, 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 분리 방법과 Quanta에서 구입할 수 있는 PerfeCTa® qPCR ToughMix®(실시예 16)를 사용한다. 감자 잎 재료에서 추출한 DNA에 대해 검사한 사건-특이적 프라이머를 사용하는 이러한 PCR 방법은 높은 PCR 효율, 우수한 선형성, 표적 특이성 및 견고성을 가져왔다.
추출 방법 프로토콜
1. CTAB 버퍼(1M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.5M EDTA pH 8.0, 5M NaCl 및 20mg/ml CTAB)를 매일 새로 제조하고 65℃로 예열한다.
2. 칩 및 덩이줄기에 10mL CTAB/플레이크 및 프라이에 30mL CTAB 버퍼를 첨가한다.
CTAB 1 mL를 잎에 첨가하였다.
3. 다음의 양의 출발 재료를 적절한 튜브에 첨가한다:
플레이크: 3g
동결 건조 프라이: 3g(신선한 튀김 사용시 6g 사용)
칩(매끄러운 페이스트에 칩을 분쇄): 1 g
동결 건조 덩이줄기: 1g
동결 건조 잎(미세 분말로 분쇄): 0.5 g
4. 각 튜브에 3㎕의 프로테이나제 K를 첨가하고 혼합하여 덩어리를 제거한다.
5. 2-3시간 동안 210 rpm으로 배양기에서 흔들어 주면서 65℃에서 배양한다(45'는 덩이줄기과 잎에 대해 충분하다).
6. 샘플을 14,000 rpm으로 40분 동안 원심분리한다(덩이줄기의 경우 20′, 잎의 경우 10′이 충분하다).
7. 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 얼음 위에서 20분 동안 배양한다.
8. 같은 부피의 얼음 냉각 클로로포름을 첨가한다.
9. 선택사항: 1g의 출발 재료에 대해 200μL의 PhytoPure DNA 추출 수지(GE Healthcare Life Sciences)를 첨가한다. 균질성을 확보하기 위해 사용하기 전에 수지를 와류한다.
10. 샘플을 실온에서 격렬하게 혼합한다.
11. 14,000 rpm에서 40′동안 샘플을 원심분리한다(덩이줄기의 경우 20′및 잎의 경우 10′이 좋다).
12. 상부 수성 상을 깨끗한 튜브로 옮긴다.
13. 깨끗한 계면이 될 때까지 클로로포름 추출을 반복한다(추가 수지가 필요 없음).
14. 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨(pH 5.3)을 첨가한다.
15. 같은 부피의 이소프로판올을 첨가한다.
16. DNA가 침전될 때까지 튜브를 뒤집는다(4℃에서 밤새가 최적이다).
17. DNA를 펠릿화하기 위해 14,000 rpm에서 20′동안 원심분리한다(5′는 잎의 경우 충분하다). 이 시점에서 일부 샘플은 명백한 펠릿을 갖지 없을 수 있다. 이런 경우에, 조심스럽게 상부 투명 층을 피펫으로 옮기고 더 어두운 층을 남겨두고, 이것은 단계 19에서 펠렛이 될 것이다.
18. 얼음 냉각 70% 에탄올로 펠렛을 세척한다.
19. 펠렛을 14,000 rpm으로 5 내지 10분 동안 원심분리한다.
20. 10′동안 또는 펠렛 모서리가 깨끗해질 때까지 펠렛을 공기 건조한다.
21. 200-400 μL TE 버퍼에 DNA를 재현탁한다.
22. 20 ㎍/ml의 농도로 RNase를 첨가한다. 37℃에서 30분 동안 배양한다.
23. 5 부피의 퀴아겐(Qiagen) 버퍼 PB를 DNA에 첨가한다. 컬럼 당 10μg의 DNA를 초과하지 않는다.
24. 칼럼을 통해 DNA/PB 용액을 회전시킨다.
25. 버퍼 AW2 또는 PE로 2회 세척한다.
26. 컬럼을 14,000 rpm에서 2분간 회전시켜 컬럼을 건조시킨다.
27. 적절한 양의 TE(50μL)를 컬럼에 가하고 용출 전에 65℃에서 5′동안 방치한다.
28. DNA 농도는 형광성 삽입 염료(예를 들어, Qubit High-sensitivity)를 사용하여 측정되어야 하고, 샘플은 특히 정량 분석을 실행하는 경우, 연속 희석 분석을 통해 샘플을 PCR 저해제에 대해 시험되어야 한다.
실시예 12: 퀴아엠프 패스트 DNA 스툴 미니 키트 ( QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)를 사용하여 덩이줄기, 플레이크 , 칩 및 프라이에서 DNA 분리
하기의 프로토콜을 수행하여 DNA를 분리하였다. 이 기술을 사용하여 분리된 DNA 샘플은 이전 섹션에서 기술된 CTAB 기반 방법보다 순도가 낮고 수율이 떨어지는 경향이 있다. DNA는 PCR 억제제의 존재로 인한 임의의 정량적 분석을 위한 충분한 품질을 갖도록 주의를 기울여야 한다. 임의의 기질-특이적 지시는 굵게 표시된다.
약 300mg의 플레이크, 칩 또는 프라이 조직을 계량하고, 1.7 ml의 Qiagen InhibitEX 버퍼(임의의 침전물을 재용해하는 예열된 버퍼)를 함유하는 2.0 ml 미세 원심분리 튜브에 놓는다. 동결 건조 덩이줄기의 경우, 1.2 ml InhibitEX 버퍼에 150 mg 조직을 사용한다. 프라이 및 플레이크 재료는 두 개의 300mg 샘플을 개별적으로 용해시켜 단일 컬럼 하류 위에 결합될 것이 필요할 것이다. 칩 샘플의 경우, 선택적으로 2개의 샘플이 용해되고 결합되어 수율을 증가시킬 수 있다.
30 내지 60 초 동안 와류하여 철저히 혼합한다.
95℃± 5℃의 가열된 블록(바람직한) 또는 수조에서 플레이크, 칩 및 덩이줄기 시료를 30분 동안 배양한다. 프라이 샘플의 경우, 30분 동안 70℃에서 대신 배양한다.
14,000 rpm에서 5분 동안 미세 원심 분리기에서 튜브를 원심분리한다.
각 튜브로부터 600-650μl의 상청액을 각각의 2.0 ml 미세원심분리 튜브로 옮기고, 퀴아겐 키트에 제공된 25μl 프로테이나제 K를 첨가한다.
와류로 철저히 혼합한다.
각 튜브에 600-650 μl의 버퍼 AL을 첨가하고 와류로 혼합한다.
샘플을 70℃에서 10분 동안 배양한다.
600-650μl 95 내지 100%의 에탄올(키트에 제공되지 않음)을 첨가하고 와류로 혼합한다.
21,000 x g에서 진공 매니폴드 또는 펄스 원심분리를 사용하여 퀴아앰프 스핀 컬럼(QiaAmp Spin Column)을 통해 한 번에 650μl 용액을 통과시킨다. 프라이 및 플레이크 재료의 경우, 하나의 칼럼에 2개의 튜브 상당 용액을 통과시켜 농축한다. 최종 스핀은 모든 버퍼를 제거하기 위해 14,000 rpm에서 1분이어야 한다.
컬럼을 500㎕ 버퍼 AW1로 1회, 500㎕ 완충액 AW2로 1회 진공 매니폴드 또는 14,000rpm에서 1분간 원심분리하여 세척한다.
컬럼을 2ml 수집 튜브로 옮기고 14,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고 플로우-스루(flow-through)를 폐기한다.
컬럼을 새로운 1.7 ml 미세 원심분리 튜브에 옮기고 덩어리 및 칩을 위해 50 μl TE 또는 막 바로 위의 프라이 및 플레이크 샘플을 위해 30μl TI를 피펫으로 옮긴다
실온에서 3분 동안 배양하였다.
DNA를 용리시키기 위해 14,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다.
DNA를 정량하고 QA(-20 ℃에서 저장). (OD260/OD280) 및 (OD230/OD260) 비는 모든 샘플에 대해 문서화되어야 한다. DNA 농도는 형광 삽입 염료(예를 들어, Life Technologies의 Qubit dsDNA HS Assay Kit)를 사용하여 측정해야 하며, 샘플은 특히 정량 분석을 수행할 경우, 일련의 희석 분석을 통해 PCR 저해제를 시험해야 한다.
실시예 13: 감자 사건에서 DNA 삽입체 및 비 자연 발생 접합부 서열의 분자 특성화
모든 감자 사건을 DNA 겔 블롯 분석에 의해 분석하여 통합된 DNA 삽입체 서열의 구조 및 복제물 수를 결정하고 벡터 백본 서열의 부존재를 확인하였다. 이 연구는 사건의 특성화 및 생물 안전성 평가의 일부로 수행되었다. 분자 특성화는 DNA 삽입물에 의해 측면으로 둘러싸인 접합부의 서열을 결정하고 삽입된 DNA의 안정성을 나타내기 위해 사용되었다. 접합부의 서열 정보는 모든 사건에 대한 사건 특이 PCR 검사를 개발하기 위한 기초를 제공했다(표 6).
도 5는 각각의 구조체-특이적 비 자연 발생 접합부가 pSIM1278 및 pSIM1678의 DNA 삽입체 영역에 대해 발생하는 표 6의 SEQ ID NO를 나타내고, 도 6A-I는 각각의 구조체-특이적 비 자연 발생 접합부가 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및 Y9 사건에 대해 발생하는 표 6의 SEQ ID NO를 나타낸다.
표 6과 관련하여, 제 1 두 서열(SEQ ID NOs: 1 및 2)은 감자 게놈의 일부가 아닌 합성 서열의 25개 뉴클레오타이드인 삽입체의 최외측 모서리에 존재하는 접합부를 나타낸다. 이들은 왼쪽 경계와 오른쪽 경계 모두에 존재한다. 이들은 LB 합성/LB 감자 및 RB 합성/RB 감자로서 표 6에 포함된다
또한, 표 6은 굵게 강조 형태로 다음을 제공한다: 1) 서열이 두 염색체 DNA 및 삽입체에 대한 경계 서열에 공통적인 서열인 염색체 DNA에 대한 서열의 미세상동체. 이들은 존재하는 서열 내에서 굵게 강조 표시된 형태로 나열된다. 표 6은 또한 다음을 제공한다: 2) 접합부 위치 사이에 존재하는 개재 서열. 이 서열은 밑줄이 그어져 있으며 접합부의 어느 한쪽에 15 bp의 서열이 남겨져 있다.
구조체-특이적 및 사건-특이적 비 자연 발생 접합부 서열
접합부 서열 SEQ ID NO.
pSIM1278 구조체 접합부
LB 합성/LB 감자 5' - TGGCAGGATATATACCGGTGTAAAC/GAAGTGTGTGTGGTT - 3' 1
LB 합성/ RB 감자 5' - GTTTACAGTACCATATATCCTGTCA/GAGGTATAGAGGCAT - 3' 2
LB/ AGP 5'- TTGTGGAGGAGTAAG/GGTACC/AAGTGTCTGAGACAA - 3' 3
AGP / ASN 5'- AACAAGCTTGTTAAC/GAACTCTTTATCCAG - 3' 4
ASN / PPO 5'- TGGTGAGCCCTCGAG/ATAATTGTAACTGAT - 3' 5
PPO / 스페이서1 5'- ATTCAATAGAGACTA/TCTAGA/GTGTATGGGTGATCC - 3' 6
스페이서1 / PPO 5'- TTATGGAGGAATCAG/TAGTCTCTATTGAAT - 3' 7
PPO / ASN 5'- ATCAGTTACAATTAT/TCTCGAGGGCTCACC - 3' 8
ASN / GBSS 5'- CTGGATAAAGAGTTC/GAATTC/GTGATGTGTGGTCTA - 3' 9
GBSS / AGP 5'- TGAGATGCATGGTTC/ACTAGTGATTGGTACC/AAGTGTCTGAGACAA - 3' 10
AGP / PHL 5'- AACAAGCTTGTTAAC/GTGCTCTCTATGCAA - 3' 11
PHL /R1 5'- TTTTGCTAAAACATC/GGACACGTATATTTT - 3' 12
R1/ 스페이서2 5'- ATATTTATTATATAA/CTGCAG/CGTTGTTTTGATGAA - 3' 13
스페이서2 /R1 5'- TTTTGATGAAAAAGC/TTATATAATAAATAT - 3' 14
PHL / GBSS 5'- TTGCATAGAGAGCAC/CGTGATGTGTGGTCT - 3' 15
GBSS / RB 5'- AAATCATAATATCTG/GAGCTCATC/GTTATGCTATAAATT - 3' 16
E12 특이적 접합부
( LJ -식물/ 삽입체 ) 5'- TATTGGTGAGAATAA/TAAACGAAGTGTGTG - 3' 17
( RJ - 삽입체 /식물) 5'- ACGGTCAGTCACTTT/GTACTAGTAAAGATC - 3' 18
F10 특이적 접합부
( LJ -식물/ 삽입체 ) 5'- CAGCAGCCATCAACT/GGTCCA/GCAGGATATATACCG - 3' 19
( RJ - 삽입체 /식물) 5'- GTGGGCATCAATTTA/GTCCACCAGCCAAAA - 3' 20
J3 특이적 접합부
( LJ -식물/ 삽입체 ) 5'- AACAGGACAACCACA/AGCTA/GGAAACTCACATGCT - 3' 21
( RJ - 삽입체 /식물) 5'- AAAAAGCCCTAGAAT/TAATTTTTTTTGGAA - 3' 22
(내부) 5'- GAACTGAAACCGATA/TACAAAATGGTATAA - 3' 23
(내부) 5'- CCTCTATACCTCTGA/CAGAGGTATAGAGGC - 3' 24
J55 특이적 접합부
( LJ -식물/ 삽입체 ) 5'- AAATCAACAAGCAAT/TGAAGAACTACCTAT - 3' 25
( RJ - 삽입체 /식물) 5'- CATAAGTGAGACTAT/GCGTGAAACTTTCAG - 3' 26
(내부) 5'- CCTCTATACCTCTGA/TAAATTAAACTGACT - 3' 27
(내부) 5'- ACTAAAAATCTCAGC/TAAAACAATAAAAAT - 3' 28
V11 특이적 접합부
( LJ -식물/ 삽입체 ) 5'- TCATCTTTCATTCCG/GTGTAAACGAAGTGT- 3' 29
( RJ - 삽입체 /식물) 5'- ATGCCTCTATACCTC/TGATAATAAAGAACT- 3' 30
W8 특이적 접합부
( LJ -식물/ pSIM1 678 삽입체) 5'- CAACAATTAAAAAAA/GCCTAATTTTCATGG - 3' 31
( RJ - pSIM1678 삽입체/식물) 5'- ACGGTCAGTCACTTT/CAAGCCCTAGGAGCC - 3' 32
( LJ -식물/ pSIM1278 삽입체) 5'- AGCCCTACAAAAGGC/CCAAACTCTAAGTCA - 3' 33
( RJ -식물/ pSIM1278 삽입체) 5'- AGTCCTAGAACTACG/AAAATTATATTCGGT - 3' 34
(내부) 5'- ATGCCTCTATACCTC/AGAGGTATAGAGGCA - 3' 35
(내부) 5'- TGCCTCTATACCTCT/GACGCAACACAACAC- 3' 36
X17 특이적 접합부
( LJ -식물/ 삽입체 ) 5'- GTATTCGCTGCAGGA/TATATACCGGTGTAA - 3' 37
( RJ - 삽입체 /식물) 5'- GCCTCTATACCTCTG/ACTGGAAAATTGACG - 3' 38
Y9 특이적 접합부
( LJ -식물/ 삽입체 ) 5'- CAAAATGTGCACCAA/TGATGTCTCACGACC - 3' 39
( RJ - 삽입체 /식물) 5'- CTCAACAACCAGTCA/CCGGAAGTCCCTTAA - 3' 40
(내부) 5'-ATGCCTCTATACCTC/TGAAAGTGACTGACC - 3' 41
pSIM1678 구조체 접합부
LB/ pVnt1 5'- TTGTGGAGGAGTAAG/GGTACC/AGTTATACACCCTAC - 3' 42
pVNT1 / Vnt1 5'- ACCAGCTAACAAAAG/ATGAATTATTGTGTT - 3' 43
Vnt1 / tVnt1 5'- TCACAGGTACTATAA/ATAATTATTTACGTT - 3' 44
tVnt1 / pAGP 5'- AGCCTCTTTTCAAAG/GGGCCC/CAAGTGTCTGAGACA - 3' 45
pAGP / Inv 5'- AACAAGCTTGTTAAC/GGATCC/ACATTCCTCCCGGAT - 3' 46
Inv / Inv 5'- TCAAGGACTTTAGAG/GAATTC/AGCGGACCCAGTCCA - 3' 47
Inv / pGbss 5'- GAGGAATGTGTAATG/ACTAGT/CGTGATGTGTGGTCT - 3' 48
감자 사건 E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및 Y9에서 DNA 삽입체의 구조의 다이어그램이 도 4 및 도 6에 도시된다.
사건 E12 및 F10은 1 복제물을 함유한다("복제물"은 적어도 하나의 Asn1/ Ppo5 유전자 침묵 카세트의 존재를 의미한다). 사건 J3 및 J55는 2개의 복제물이 함유된다. 더 많은 복제물 사건 및 단지 하나의 복제물을 가진 사건 사이의 사건 사이의 침묵 활동의 범위와 지속성에 차이가 없었다.
사건 J55는 역 반복체로서 위치된 2개의 연결된 DNA 삽입체를 함유하였다 (도 4 및 도 6). 레첸베르그 등(2003)은 세균성 T-DNA에 대해 두 번째 유전자 사본이 탠덤 또는 역전 배열로 존재하는 것이 침묵을 초래하지 않는다는 것을 보여 주었다. 따라서, J55에서 역전된 연결된 DNA 삽입체 복제물은 침묵에 기여하지 않을 것이고, 따라서 표적화된 유전자의 침묵은 수렴 프로모터 사이에 위치된 역 반복체에 기초하여 의도된대로 기능한다.
사건 W8을 생성하기 위한 pSIM1278 및 pSIM1678에 의한 러셋 버뱅크의 형질전환과 관련된 삽입체의 유전적 및 구조적 특성화는 두 형질전환 모두가 각 플라스미드에 대한 단일 통합 부위를 생성한다는 것을 보여주었다. pSIM1278의 형질전환으로부터 유래된 DNA의 구조는 최초 삽입체의 구조에 비해 복잡했다. 삽입된 DNA는 Asn1/Ppo5 침묵 카세트의 탠덤 반복체, 거의 완전한 pSIM1278 구조체, 및 pR1/ pPh1 침묵 카세트의 복제를 함유하는 역 반복체 및 개재 Ph1 서열을 가진 Gbss 프로모터의 탠덤 복제물로 이루어진 구조를 생성하는 형질전환 동안 재배열을 거친 것으로 보인다(도 6).
이 구조는 예상보다 복잡하지만, 복제된 침묵 카세트는 손상되지 않고 조직 특이적 프로모터의 제어하에 남아있다. 이 구조는 생성물의 안전성 또는 형질 효능에 부정적인 영향을 미치지 않는다.
W8은 또한 통합의 단일 유전자 자리에 존재하는 pSIM1678로부터의 단일 DNA 복제물을 함유한다(도 6). pSIM1678의 DNA 삽입체는 전체 T-DNA 왼쪽 경계와 137bp의 Rpi-vnt1 프로모터를 제거하는 330bp의 결실이 있는 거의 손상되지 않은 DNA 삽입체를 함유한다. 프로모터에서 이 작은 결실은 감자역병 저항성을 부여하는 유전자의 능력에 영향을 미치지 않는다. 또한, Rpi-vnt1 유전자와 관련된 RNA 발현은 RT-PCR을 사용하여 증명되었다.
삽입체는 종종 식물 게놈 또는 DNA 삽입체로부터 유래된 짧은 DNA 서열에 의해 측면으로 둘러싸인다. 이런 삽입은 통합 과정의 일부로 보이며 다소 높은 빈도로 발생한다(Windels et al. 2003). 이런 서열을 갖는 사건의 한 예는 J55의 두 DNA 삽입체 사이의 49-bp 서열을 포함한다. 진뱅크를 사용하여 이 짧은 DNA 서열의 폭발적인 검색은 에스 . 투베로숨으로부터 공지된 서열과 부분적으로 일치하여서, 기원은 식물 게놈 또는 DNA 삽입체로부터 가장 가능성이 높은 것으로 확인하였다.
이동된 DNA 삽입체의 대부분은 경계 근처의 짧은 결실에 의해 도시된 바와 같이, 좌측 및 우측 경계 서열 사이의 전체 거리보다 짧다. 이런 결실은 또한 T-DNA 통합과 관련이 있으며 이중 가닥 절단 수리에 기인한 것으로 가정된다(Gheysen et al. 1991). 2개의 침묵 카세트의 기능적 활성을 손상시키지 않는 짧은 결실은, 예를 들어, 사건 F10(오른쪽 경계에서 38-bp 결실)에서 발견되었다.
실시예 14: qPCR 프라이머 및 프로브 개발
사건 특이적 프라이머는 관심 사건(감자 게놈 플랭킹 영역) 또는 pSIM1278 구조체 또는 pSIM1678 구조체 자체에서 접합부에 특이적인 게놈의 영역을 증폭하도록 설계되었다. 이들 프라이머는 70 내지 200 염기 쌍의 영역을 증폭시키며 이 영역 내에서 특이적 형광 프로브의 결합이 생성물의 실시간 탐지 및 정량화를 허용한다.
각각의 형광 프로브는 6-FAM(6-카복시플루오레신) 모이어티를 가진 5′말단 및 BHQ1(Black Hole Quenchers™ 1) 모이어티를 가진 3′말단으로 표지화된다. 6-FAM에 의한 형광은 동일한 올리고뉴클레오타이드 상의 BHQ1의 존재에 의해 급랭된다. PCR 동안, 증폭되는 표적 가닥에 어닐링된 프로브는 Taq DNA 폴리머라제의 5'-to- 3' 뉴클레아제 활성에 의해 절단되어, 6-FAM 및 BHQ1 모이어티의 분리를 초래할 것이다. 따라서 BHQ1에 의한 6-FAM의 급랭(quenching)은 폐지되어, 6-FAM 형광의 방출을 유도한다. 이 프로브는 열적 안정성과 특이성을 높이기 위해 잠금 핵산(LNA) 프로브로 설계되어 있다(Petersen, M., & Wengel, J. (2003). LNA: A versatile tool for therapeutics and genomics. Trends in Biotechnology. doi:10.1016/S0167-7799(02)00038-0).
솔라눔 투베로숨으로부터의 아데닌 포스포리노실 트랜스페라제(APRT)에 특이적인 프라이머 및 이중 표지된(FAM 및 TAM 또는 BHQ1) 프로브는 내인성 대조군으로서 APRT를 증폭시키는데 사용된다. APRT는 실시간 PCR을 사용하여 감자의 다양한 생물학적 및 비 생물학적 스트레스 연구 동안 이의 안정성을 기반으로 선정되었다(Nicot, N., Hausman, J.-F., Hoffmann, L., Evers, D. (2005). Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress. Journal of Experimental Botany, 56(421), 2907-14. doi:10.1093/jxb/eri285). 그러나, 임의의 적절한 제어 유전자가 사용될 수 있다.
APRT 대조군 또는 각 사건에 특이적인 이중 표지화된 프로브와 함께, 포워드 및 리버스 프라이머가 표 7에 열거되어있다.
qPCR 분석법에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열
분석법 명칭 올리고뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO.
아테닌 포스포리 보실 트렌스페라제 (APRT) 포워드 프라이머 5'- GAACCGGAGCAGGTGAAGAA -3' 49
리버스 프라이머 5'- GAAGCAATCCCAGCGATACG -3' 50
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-'
6FAM-cgc[+C]tc[+A]tg[+A]tc[+C]gatt-BHQ1-3'
프로브 서열 5-cgcctcatgatccgatt-3'		 51

E12
포워드 프라이머 5'- GGGAGTAGGCTTTATACC-3' 52
리버스 프라이머 5'- CCTTGAATGATTTGATATAAGAAG-3' 53
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-tcag[+T]ca[+C]tt[+T]gt[+A]ctag-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-tcagtcactttgtactag-3'		 54

F10
포워드 프라이머 5'- AAGGCAATCTTTCATAAGC -3' 55
리버스 프라이머 5'- CACACACTTCGTTTACAC -3' 56
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-tat[+A]tc[+C]tg[+C]tg[+G]acca-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-tatatcctgctggacca-3'		 57

J3
포워드 프라이머 5'- CCGGTACTCAAATTTGCAA -3' 58
리버스 프라이머 5'- GGTGTTCTTAATATCGAGTGTTC -3' 59
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-cca[+C]aa[+G]ct[+A]gg[+A]aactca-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-ccacaagctaggaaactca-3'		 60

J55
포워드 프라이머 5'- CATGGAATTATTTAGAAACAAAA -3' 61
리버스 프라이머 5'- GACGATCAAGAATCTCAATA -3' 62
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-tca[+T]ag[+T]ca[+A]ac[+A]gtcagc-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-tcatagtcaaacagtcagc-3'		 63




V11


포워드 프라이머 5'- GTGGGCATCAATTTAGTG -3' 64
리버스 프라이머 5'- GGAGAGTAATAGCCTTAGTA -3' 65
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-cctcta[+T]ac[+C]tc[+T]ga[+T]aat-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-cctctatacctctgataat-3'		 66
포워드 프라이머 5'- TAGCCAAGCATGACTTAC -3' 67
리버스 프라이머 5'- CACACACTTCGTTTACAC -3' 68
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-atg[+T]at[+G]aa[+T]gg[+C]agaag-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-atgtatgaatggcagaag-3'		 69

W8
포워드 프라이머 5'- AGGCTTTATACCGAGTTG -3' 70
리버스 프라이머 5'- TCAGCTTAATCGAATAAGAAAC -3' 71
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-ACT[+A]CG[+G]TC[+A]GT[+C]ACTT-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-actacggtcagtcactt-3'		 72

X17
포워드 프라이머 5'- GTCCGAAGGTTGAGAAAA -3' 73
리버스 프라이머 5'- CGTGAGACATCATCATAATG-3' 74
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-cgc[+T]tc[+A]gt[+T]ac[+G]gctt-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-cgcttcagttacggctt-3'		 75

Y9
포워드 프라이머 5'- GACAGCTATCAATATACTTTAGTAA -3' 76
리버스 프라이머 5'- TTGCCATACTCATACAGAG-3' 77
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-aat[+G]at[+G]tc[+T]ca[+C]gaccaa-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-aatgatgtctcacgaccaa-3'		 78






pSIM1278





포워드 프라이머 5'- TCACCAGTATGACTGTTTA -3' 79
리버스 프라이머 5'- CTACCACACACTCTCTAG -3' 80
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-aag[+C]tt[+G]tt[+A]ac[+G]aactct-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-aagcttgttaacgaactct-3'		 81
포워드 프라이머 5'- GCATCATCCATCAAAGTG - 3' 82
리버스 프라이머 5'- GTCGGTATAATAAGAGAAGGA - 3' 83
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-tag[+A]ga[+C]ta[+T]ct[+A]gagtgt-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-tagagactatctagagtgt-3'		 84


pSIM1678


포워드 프라이머 5'- GAACGGAGGGAGTATGAA -3' 85
리버스 프라이머 5'- CCACTTTCAGTTTTGGTTG -3' 86
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-tctt[+T]tc[+A]aa[+G]gg[+G]ccc-BHQ1-3'
프로브 서열 5'- tcttttcaaaggggccc-3'		 87
포워드 프라이머 5'- GAAGCCTCTTTTCAAAGG - 3' 88
리버스 프라이머 5'- ACGGGTTAATCGATAACC- 3' 89
표지를 가진 프로브 및 LNAs 5-' 6FAM-ccc[+C]aa[+G]tg[+T]ct[+G]aga-BHQ1-3'
프로브 서열 5'-ccccaagtgtctgaga-3'		 90
실시예 15: 분석의 효율 및 선형성
최적화된 qPCR 분석의 두 가지 특징은 높은 PCR 효율(E) 및 상관 계수 R2에 의해 측정된 선형 표준 곡선이다. 이상적인 qPCR 반응은 각 사이클 동안 PCR 생성물의 완벽한 배가와 상관이 있는 -3.32의 기울기를 가진 100%의 효율을 가진다. 그러나, 90 내지 110%의 효율을 가진 -3.1 내지 -3.6의 기울기는 일반적으로 허용가능한 것으로 생각된다(Commission, C. A. (2009). Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories(ENGL), (October 2008), 1-8). 효율은 복제된 표준 곡선에 의해 결정된다. 증폭 효율은 표준 곡선의 log-선형 부분의 기울기로부터 결정되며 E=(10(-1/slope)-1)*100으로 계산되며(Bustin, S. A., et al. (2009). The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 1-12. doi:10.1373/clinchem. 2008.112797) R2 값은 ≥0.98이어야 하는 선형 회귀 분석에 의해 결정된다(Bustin et al., 2009).
표 8은 각 사건-특이적 및 구조체-특이적 qPCR 분석의 효율 및 선형성을 나타낸다.
각각의 분석은 90 내지 110%의 권장 범위와 0.98 이상의 R2 값 사이의 고효율을 입증한다.
데이터는 60℃의 결합 어닐링/신장 온도를 사용하여 잎 DNA에 대해 실행된 분석으로부터 제시된다.
사건-특이적 qPCR 분석법의 효율 및 선형성
감자 품종 분석법 효율 선형성
러셋 버뱅크 E12 98.4% 0.996
레인저 러셋 F10 98.0% 0.998
애틀란틱 J3 103.1% 0.998
애틀란틱 J55 101.2% 0.992
러셋 버뱅크 W8 98.4% 0.994
스노우덴 V11 104.5% 0.998
레인저 러셋 X17 96.3 0.997
애틀란틱 Y9 93.3 0.994
pSIM1278 구조체 * 104.2% 0.983
pSIM1278 구조체 ^ 94.8% 0.995
pSIM1678 구조체 1 95.7 0.996
*SEQ ID NOs 79-81을 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
^SEQ ID NOs 82-84를 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
1SEQ ID NOs 85-87을 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정(Vnt1 종결자 및 Agp 프로모터 사이의 접합부를 탐지한다)
실시예 16: 감자 잎 DNA에서 분석법의 탐지 수준( LOD )
GMO 연구소의 유럽 네트워크(European Network of GMO Laboratories)에 따라, "탐지 한계는 단일 실험실 검증에 의해 입증된 것처럼 신뢰성 있게 탐지될 수 있지만 반드시 정량화될 수 없는 시료에서 분석 물질의 최저량 또는 농도이다" (Commission, 2009). LOD는 ≤ 5% 위음성 결과를 초래하는 시간의 적어도 95% 동안 분석물을 검출해야 한다. 보고된 각각의 분석법은 시간의 95% 초과 동안 총 표적 DNA의 적어도 24pg를 안정적으로 탐지할 수 있었다. 감자 기반 식품에서 분리된 DNA에서 자주 볼 수 있듯이 DNA가 파편화되거나 억제제, 특히 다당류를 포함할 수 있기 때문에 LOD는 사용된 DNA의 원천에 따라 달라질 것이다. 정성 분석 및 정량 분석은 PCR 반응에 충분한 DNA가 사용된다면 <0.1% GMO에 도달할 수 있다.
표 9는 각 사건- 특이적 및 구조체-특이적 qPCR 분석법의 탐지 수준을 나타낸다. 각 분석법은 34 내지 35 사이클 동안 감자 잎 DNA의 적어도 24pg를 안정적으로 증폭시켰다. 데이터는 60℃의 어닐링/신장 온도를 사용하여 실행된 분석법으로부터 제공된다.
사건-특이적 qPCR 분석법의 탐지 수준
분석법 Mean Cq at LOD
E12 35.29
F10 35.21
J3 34.62
J55 35.32
W8 35.99
V11 35.04
X17 35.96
Y9 32.85
pSIM1278 구조체* 34.42
pSIM1278 구조체^ 34.78
pSIM1678 구조체 1 34.17
*SEQ ID NOs 79-81을 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
^SEQ ID NOs 82-84를 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
1SEQ ID NOs 85-87을 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
실시예 17: 사건 특이적 qPCR 분석의 견고성
방법의 견고성은 분석법의 실험 조건에서의 작은 변화에 의해 영향을 받지 않는 능력의 척도이다. 예를 들어, PCR 분석은 상이한 사용자에 의해, 그리고 온도 프로파일 또는 DNA 폴리머라제에서 작은 편차로 상이한 열 순환기 모델에서 실 될 수 있어야 한다. 일반적으로 분석법은 이러한 조건하에서 ±30% 이상 벗어나면 안 된다(Commission, 2009). 본 발명자는 58℃ 내지 61℃의 결합된 어닐링/신장 온도의 4℃ 범위에 걸쳐 각 분석법의 효율과 선형성을 측정하였다(표 10). 분석법의 견고성은 다른 사용자, 열 순환기 및 폴리머라제를 사용하는 외부 실험실에 의한 분석법 성능의 외부 검증에 의해 측정된다.
표 10은 4℃ 결합 어닐링/신장 온도 범위에 걸쳐 각 분석법의 효율 및 선형성을 나타낸다. 58℃에서 F10을 제외하고, 모든 분석법은 전체 범위에서 90-110%와 R2 값≥0.98의 효율로 잘 실행되었다.
4℃ 온도 범위에 걸친 사건-특이적 qPCR 분석법의 효율성과 선형성
분석법
 효율성(%)/선형성
58℃ 59℃ 60℃ 61℃
E12 101.9/0.988 101.2/0.991 98.4/0.996 104.1/0.991
F10 84.8/0.985 95.3/0.980 98.0/0.998 99.3/0.988
J3 99.1/0.994 100.6/0.994 103.1/0.998 101.7/0.997
J55 101.1/0.995 99.9/0.988 101.2/0.992 100.9/0.991
W8 99.1/0.994 100.6/0.994 98.4/0.994 104.7/0.993
V11 93.6/0.997 100.0/0.992 104.5/0.998 95.8/0.994
X17 93.1/0.991 98.9/0.998 103.9/0.974 95.3/0.997
Y9 97.4/0.991 95.2/0.996 95.1/0.996 101/0.981
pSIM1278 구조체 * 104.8/0.992 104.0/0.996 104.2/0.983 95.8/0.994
pSIM1278
구조체 ^ 		97.6/0.997 100.9/0.994 94.8/0.995 95.8/0.994
pSIM1278
구조체 1 		88.3/0.978 95.7/0.994 93.3/0.996 104.4/0.986
*SEQ ID NOs 79-81을 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
^SEQ ID NOs 82-84를 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
1SEQ ID NOs 85-87을 가진 프라이머/프로브 세트를 사용함으로써 결정
실시예 18: 계통-특이적 프라이머 및 프로브의 특이성
각 프라이머 및 프로브 세트의 특이성은 DNA(25ng, 250pg, 및 50pg)의 3가지 농도에서 각 사건(E12, F10, J3, J55, W8, V11, X17 및 Y9) 및 25ng의 DNA를 사용하는 각 상업용 품종(애틀란틱, 레인저 러셋, 버뱅크 및 스노우덴)으로부터의 DNA로 qPCR을 실행함으로써 평가하였다.
E12, J3, J55, W8, V11, X17 및 Y9를 탐지하기 위해 사용된 프라이머는 시험 된 농도에서 위 양성 또는 음성을 나타내지 않았다.
F10에 사용된 프라이머는 5% 허용 가능한 범위 내에 있는 2.3%의 위 양성 비율을 나타내는 39 사이클 후 25ng E12 샘플의 단일 기술적 전형을 증폭하였다.
pSIM1278 구조체에 사용된 프라이머는 41 사이클 후에 두 상이한 야생형 품종으로부터 단일 기술적 전형 증폭하였다. 이 분석법을 향상시키기 위해, PCR 사이클링 파라미터는 조정되고 샘플은 재시험되었다. 새로운 매개변수는 pSIM1278 또는 pSIM1678에 대한 위 양성을 초래하지 않았다.
사건(E12, F10, J3, J55, W8, V11, X17 및 Y9) 및 구조체(pSIM1278 및 pSIM1678)에 대한 qPCR 반응 설정 및 qPCR 사이클링 조건은 표 11-13에 도시된다.
PCR 반응 설정 및 조건( 20μL 총 부피)
시약 최종 농도 1X 샘플(μL)
2X PerfeCTa® qPCR ToughMix® (Quanta)* 1X 10
포워드 프라이머 (10 μM) 0.5 μM 1
리버스 프라이머 (10 μM) 0.5 μM 1
프로브 (10 μM) 0.2 μM 0.4
H2O q.s. 20 μL
주형 DNA 변한다 2 μL
* 마스터 믹스는 PCR 억제를 감소시키는 성분을 함유해야 한다.
PCR 열 사이클링 조건 E12, F10, J3, J55, W8, V11, X17 및 Y9
사이클 온도(°C) 시간(초)
1 95 600
45 95 15
60 60
PCR 열 사이클링 조건 pSIM1278 및 pSIM1678
사이클 온도(°C) 시간(초)
1 95 600
40 95 15
60 15
72 10
기술된 방법은 동결건조된 InnateTM 표준 재료로부터 유래된 표준 곡선을 사용하여 모든 InnateTM 사건(GEN1 및 GEN2 포함)에 공통적인 pSIM1278 구조체를 탐지하기 위해 qPCR을 사용하여 감자 및 감자 제품에서 InnateTM 제품의 탐지를 허용한다. 또한 각 사건을 탐지 한계 <0.1% GMO로 정성적으로 고유하게 탐지하는 프라이머 및 프로브의 한 세트가 제공되었다.
또한, 기술된 방법은 동결건조된 InnateTM 표준 재료로부터 유래된 표준 곡선을 사용하여 모든 GEN2 InnateTM 사건(즉, W8, X17 및 Y9)에 공통적인 pSIM1678 구조체를 탐지하기 위해 qPCR을 사용하여 감자 및 감자 제품에서 Innate™ 제품의 탐지를 허용한다.
실시예 19: 식품 믹스에서 방법의 내부 검증
다수의 식품 믹스를 제조하여 개발된 DNA 분리 방법을 시험하였다. 본 발명자의 내부 테스트는 애틀란틱 J3(칩 품종) 또는 레인저 러셋 F10(프라이 품종)의 모든 식품 기질로부터 DNA를 분리하는 데 중점을 두었다. 종합적으로, 이 두 사건은 고려중인 모든 기질(덩이줄기, 프라이, 칩 및 플레이크)를 포함한다. 분쇄 Innate™ 식품은 표 14에 기술된 바와 같이 상업용 품종 식품에 혼합되었다. 모든 사건에 대해 유사한 결과가 예상된다.
생산된 식품 믹스
계통 식품 Innate™ 식품 퍼센트
J3 동결건조 덩이줄기 0.2/0.5/1.0
F10 동결건조 덩이줄기 0.2/0.5/1.0
F10 동결건조 파 프라이 0.2/0.5/1.0
J3 칩 5.0/10.0
F10 플레이크 2.5/8.0/15.0
실시예 12에 기재된 퀴아겐의 퀴아엠프 패스트 DNA 스툴 미니 키트를 사용하여 2개 내지 3개의 독립적인 DNA 분리를 각각의 식품 믹스에서 실행하였다. 표 15는 600mg 프라이, 플레이크 또는 칩 믹스 또는 300mg의 덩이줄기로부터의 전체 DNA 농도 및 수율을 나타낸다.
DNA가 qPCR에서 사용하기에 충분한 품질인 것을 보장하도록, 각 DNA 분리는 프라이머 및 프로브의 적절한 세트를 사용하여 3번 반복하였다. 2㎕의 각 DNA 분리를 각 반응에 사용하였고 내인성 기준 유전자, APRT를 양성 대조군으로 사용하였다.
각 식품 형태에 대해 얻은 평균 DNA 농도 및 수율
샘플 평균 DNA 농도
(ng/μL)		 평균 총
DNA 수율
(ng)
F10 덩이줄기 3.2 648
J3 덩이줄기 6.1 610
F10 프라이 2.5 75
J3 칩 3.2 158
F10 플레이크 5.3 160
DNA 분리 방법은 상기 각 식품에서 후속 qPCR 분석에 사용하기에 충분한 농도 및 수율의 DNA를 제조하였다. 후속 qPCR 분석으로부터의 결과는 도 7에서 발견될 수 있다.
본 발명에 인용된 모든 참고 문헌, 논문, 출판물, 특허, 특허 공보 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 그러나 본 발명에 언급된 모든 참고 문헌, 기사, 출판물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 전세계 어느 나라에서 유효한 선행 기술을 구성하거나 공통된 상식의 일부를 구성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안으로 간주되어서는 안 된다.
상기 설명은 단지 예시적인 실시태양 및 실시예를 나타내는 것임을 이해해야 한다. 독자의 편의를 위해, 상기 설명은 모든 가능한 실시태양의 한정된 수의 대표적인 실시예인 본 발명의 원리를 교시하는 모든 가능한 실시예에 집중되었다. 설명은 가능한 모든 변형 또는 기술된 변형의 조합을 철저히 열거하려고 시도하지 않았다. 대안적인 실시예가 본 발명의 특정 부분에 대해 제공되지 않았거나, 추가로 설명되지 않은 대체 실시예가 일부분에 대해 이용 가능할 수 있으며, 이들 대안적인 실시예의 면책으로 간주되지 않는다. 기술되지 않은 실시태양 중 다수는 본 발명의 원리의 적용에서의 차이보다는 기술 및 재료의 차이를 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 이하의 특허 청구범위 및 등가물에 기재된 범위보다 적은 것으로 제한되지 않는다.
참조문헌
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SEQUENCE LISTING <110> J.R. Simplot Company Ye, Jingsong Habig, Jeffrey W. Layne, Janet Hein, Jeffrey W. Pence, Matthew G. Hudon, Stephanie <120> EVENT-SPECIFIC DETECTION METHODS <130> JRSI-062/02US 317577-2415 <150> US 62/118,320 <151> 2015-02-19 <150> US 62/062,324 <151> 2014-10-10 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction LB Synthetic-LB Potato <400> 1 tggcaggata tataccggtg taaacgaagt gtgtgtggtt 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction RB Synthetic-RB Potato <400> 2 gtttacagta ccatatatcc tgtcagaggt atagaggcat 40 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction LB-AGP <400> 3 ttgtggagga gtaagggtac caagtgtctg agacaa 36 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction AGP-ASN <400> 4 aacaagcttg ttaacgaact ctttatccag 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction ASN-PPO <400> 5 tggtgagccc tcgagataat tgtaactgat 30 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction PPO-Spacer1 <400> 6 attcaataga gactatctag agtgtatggg tgatcc 36 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction Spacer1-PPO <400> 7 ttatggagga atcagtagtc tctattgaat 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction PPO-ASN <400> 8 atcagttaca attattctcg agggctcacc 30 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction ASN-GBSS <400> 9 ctggataaag agttcgaatt cgtgatgtgt ggtcta 36 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction GBSS-AGP <400> 10 tgagatgcat ggttcactag tgattggtac caagtgtctg agacaa 46 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction AGP-PHL <400> 11 aacaagcttg ttaacgtgct ctctatgcaa 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction PHL-R1 <400> 12 ttttgctaaa acatcggaca cgtatatttt 30 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction R1-Spacer2 <400> 13 atatttatta tataactgca gcgttgtttt gatgaa 36 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction Spacer2-R1 <400> 14 ttttgatgaa aaagcttata taataaatat 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction PHL-GBSS <400> 15 ttgcatagag agcaccgtga tgtgtggtct 30 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 construct junction GBSS-RB <400> 16 aaatcataat atctggagct catcgttatg ctataaatt 39 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E12 specific junction LJ-plant-insert <400> 17 tattggtgag aataataaac gaagtgtgtg 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E12 specific junction RJ insert-plant <400> 18 acggtcagtc actttgtact agtaaagatc 30 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F10 specific junction LJ-plant-insert <400> 19 cagcagccat caactggtcc agcaggatat ataccg 36 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F10 specific junction RJ insert-plant <400> 20 gtgggcatca atttagtcca ccagccaaaa 30 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J3 specific junction LJ-plant-insert <400> 21 aacaggacaa ccacaagcta ggaaactcac atgct 35 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J3 specific junction RJ insert-plant <400> 22 aaaaagccct agaattaatt ttttttggaa 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J3 specific junction internal <400> 23 gaactgaaac cgatatacaa aatggtataa 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J3 specific junction internal <400> 24 cctctatacc tctgacagag gtatagaggc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J55 specific junction LJ-plant-insert <400> 25 aaatcaacaa gcaattgaag aactacctat 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J55 specific junction RJ insert-plant <400> 26 cataagtgag actatgcgtg aaactttcag 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J55 specific junction internal <400> 27 cctctatacc tctgataaat taaactgact 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J55 specific junction internal <400> 28 actaaaaatc tcagctaaaa caataaaaat 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V11 specific junction LJ plant-insert <400> 29 tcatctttca ttccggtgta aacgaagtgt 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V11 specific junction RJ insert-plant <400> 30 atgcctctat acctctgata ataaagaact 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 specific junction LJ plant-pSIM1678 insert <400> 31 caacaattaa aaaaagccta attttcatgg 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 specific junction RJ pSIM1678 insert-plant <400> 32 acggtcagtc actttcaagc cctaggagcc 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 specific junction LJ plant-pSIM1278 insert <400> 33 agccctacaa aaggcccaaa ctctaagtca 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 specific junction RJ plant-pSIM1278 insert <400> 34 agtcctagaa ctacgaaaat tatattcggt 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 specific junction internal <400> 35 atgcctctat acctcagagg tatagaggca 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 specific junction internal <400> 36 tgcctctata cctctgacgc aacacaacac 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X17 specific junction LJ plant-insert <400> 37 gtattcgctg caggatatat accggtgtaa 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X17 specific junction RJ insert-plant <400> 38 gcctctatac ctctgactgg aaaattgacg 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y9 specific junction LJ plant-insert <400> 39 caaaatgtgc accaatgatg tctcacgacc 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y9 specific junction RJ insert-plant <400> 40 ctcaacaacc agtcaccgga agtcccttaa 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y9 specific junction internal <400> 41 atgcctctat acctctgaaa gtgactgacc 30 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 construct junction LB-pVnt1 <400> 42 ttgtggagga gtaagggtac cagttataca ccctac 36 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 construct junction pVNT1-Vnt1 <400> 43 accagctaac aaaagatgaa ttattgtgtt 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 construct junction Vnt1-tVnt1 <400> 44 tcacaggtac tataaataat tatttacgtt 30 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 construct junction tVnt1-pAGP <400> 45 agcctctttt caaaggggcc ccaagtgtct gagaca 36 <210> 46 <211> 36 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<222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 51 cgcctcatga tccgatt 17 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E12 forward primer <400> 52 gggagtaggc tttatacc 18 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E12 reverse primer <400> 53 ccttgaatga tttgatataa gaag 24 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E12 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 54 tcagtcactt tgtactag 18 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F10 forward primer <400> 55 aaggcaatct ttcataagc 19 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F10 reverse primer <400> 56 cacacacttc gtttacac 18 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F10 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 57 tatatcctgc tggacca 17 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J3 forward primer <400> 58 ccggtactca aatttgcaa 19 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J3 reverse primer <400> 59 ggtgttctta atatcgagtg ttc 23 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J3 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 60 ccacaagcta ggaaactca 19 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J55 forward primer <400> 61 catggaatta tttagaaaca aaa 23 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J55 reverse primer <400> 62 gacgatcaag aatctcaata 20 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J55 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 63 tcatagtcaa acagtcagc 19 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V11 forward primer <400> 64 gtgggcatca atttagtg 18 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 69 atgtatgaat ggcagaag 18 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 forward primer <400> 70 aggctttata ccgagttg 18 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 reverse primer <400> 71 tcagcttaat cgaataagaa ac 22 <210> 72 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 72 actacggtca gtcactt 17 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X17 forward primer <400> 73 gtccgaaggt tgagaaaa 18 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X17 reverse primer <400> 74 cgtgagacat catcataatg 20 <210> 75 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X17 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 75 cgcttcagtt acggctt 17 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y9 forward primer <400> 76 gacagctatc aatatacttt agtaa 25 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y9 reverse primer <400> 77 ttgccatact catacagag 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y9 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 78 aatgatgtct cacgaccaa 19 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 forward primer <400> 79 tcaccagtat gactgttta 19 <210> 80 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 reverse primer <400> 80 ctaccacaca ctctctag 18 <210> 81 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 81 aagcttgtta acgaactct 19 <210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 forward primer <400> 82 gcatcatcca tcaaagtg 18 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 reverse primer <400> 83 gtcggtataa taagagaagg a 21 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1278 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 84 tagagactat ctagagtgt 19 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 forward primer <400> 85 gaacggaggg agtatgaa 18 <210> 86 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 reverse primer <400> 86 ccactttcag ttttggttg 19 <210> 87 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 87 tcttttcaaa ggggccc 17 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 forward primer <400> 88 gaagcctctt ttcaaagg 18 <210> 89 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 reverse primer <400> 89 acgggttaat cgataacc 18 <210> 90 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSIM1678 probe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> May be labeled with a 6-FAM 6-carboxyfluorescein moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> May be labeled with a a BHQ1 Black Hole Quenchers 1 moiety <400> 90 ccccaagtgt ctgaga 16

Claims (39)

  1. a) i) 한 쌍의 포워드 및 리버스 뉴클레오타이드 프라이머, ii) 뉴클레오타이드 프로브 및 iii) 탐지될 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부를 포함하는 상기 샘플로부터의 표적 뉴클레오타이드 서열을 혼합하는 단계;
    여기서 뉴클레오타이드 프로브는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부 또는 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부의 존재를 나타내는 서열과 결합한다; 및
    b) 상기 샘플로부터 표적 뉴클레오타이드 서열을 탐지하는 단계를 포함하는 핵산 샘플에서 식물 형질전환 사건의 존재를 탐지하는 정량적 PCR 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부는 : E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17, Y9 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 식물 형질전환 사건으로부터 생성되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    표적 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    포워드 및 리버스 뉴클레오타이드 프라이머 및 뉴클레오타이드 프로브의 쌍은 SEQ ID NOs: 52-90으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 52를 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 53을 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 54를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 E12 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 55를 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 56을 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 57을 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 F10 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 58을 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 59를 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 60을 포함하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 J3 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 61을 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 62를 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 63을 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 J55 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 64 또는 67을 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 65 또는 68를 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 66 또는 69를 포함하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 V11 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 70을 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 71을 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 72를 포함하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 W8 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 73을 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 74를 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 75를 포함하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 X17 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 76을 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 77을 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 78을 포함하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 Y9 사건의 왼쪽 또는 오른쪽 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 79 또는 82를 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 80 또는 83을 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 81 또는 84를 포함하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 pSIM1278과 연관된 내부 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서,
    포워드 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 85 또는 88을 포함하며 리버스 뉴클레오타이드 프라이머는 SEQ ID NO: 86 또는 89를 포함하며 뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 87 또는 90을 포함하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드 프로브는 pSIM1678과 연관된 내부 비 자연 발생 뉴클레오타이드 접합부와 결합하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서,
    핵산 샘플은 감자 식물, 또는 감자 식물 부분 또는 감자 유래 식품으로부터 유래되는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서,
    핵산 샘플은 감자 꽃, 감자 꽃잎 조각, 감자 꽃잎, 감자 꽃받침, 감자 꽃밥, 감자 꽃가루, 감자 종자, 감자 잎, 감자 잎자루, 감자 줄기, 감자 뿌리, 감자 뿌리 줄기, 감자 줄기, 감자 덩이줄기, 감자 싹, 감자 세포, 감자 원형질, 감자 식물 조직 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 감자 식물 부분으로부터 유래된 방법.
  27. 제 1 항에 있어서,
    핵산 샘플은 감자 가공 식품, 감자 가축 사료, 감자 튀김, 감자 칩, 탈수 감자 재료, 감자 플레이크, 감자 과립, 감자 단백질 분말, 감자 전분, 감자 가루, 즉석 감자 제품 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 감자 유래 식품으로부터 유래되는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서,
    핵산 샘플은 감자 유래 식품으로부터 유래되며, E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및 Y9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 식물 형질전환 사건의 존재는 식품에서 탐지될 수 있는 방법.
  29. 제 1 항에 있어서,
    핵산 샘플은 감자 유래 식품으로부터 유래되며, E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및 Y9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 식물 형질전환 사건의 존재는 전체 식품의 1% 미만의 수준으로 식품에서 탐지될 수 있는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    핵산 샘플은 감자 유래 식품으로부터 유래되며, E12, F10, J3, J55, V11, W8, X17 및 Y9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 식물 형질전환 사건의 존재는 전체 식품의 약 0.1% 내지 약 5% 범위의 수준으로 식품에서 탐지될 수 있는 방법.
  31. SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 85% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 접합부 서열.
  32. 제 31 항에 있어서,
    SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 95% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 접합부 서열.
  33. 제 31 항에 있어서,
    SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 100% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 접합부 서열.
  34. 엄격한 조건하에서 SEQ ID NOs: 1-48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 혼성화할 수 있는 분리된 비 자연 발생 핵산 프로브 서열.
  35. SEQ ID NOs: 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 85% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 프로브 서열.
  36. 제 35 항에 있어서,
    SEQ ID NOs: 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 95% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 프로브 서열.
  37. 제 35 항에 있어서,
    SEQ ID NOs: 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 100% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 프로브 서열.
  38. SEQ ID NOs: 52-90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 95% 서열 상동성을 공유하는 분리된 비 자연 발생 핵산 프라이머 또는 프로브 서열.
  39. 제 38 항에 따른 핵산 프라이머 또는 프로브 서열을 포함하는 키트.
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