JP2017529866A - 事象特異的な検出方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、組換えジャガイモ植物体から作られた食品製品を含む、組換えジャガイモ植物体において遺伝物質を同定するための方法に関する。本開示は、本明細書に記載されている方法において利用される、ヌクレオチドプライマーおよびプローブを含めた材料に関する。さらに、本開示は、遺伝子組換え事象の結果として生じる、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列それ自体、および前記接合部配列を検出する方法を提供する。一局面において、核酸試料における植物形質転換事象の存在を検出するための定量的ＰＣＲ方法が提供される。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０６２，３２４号および２０１５年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／１１８，３２０号（これら各々の全容は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参考として本明細書に援用される：配列表のコンピュータで読み込み可能なフォーマットのコピー（ファイル名：ＪＲＳＩ＿０６２＿０２ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１５年１０月４日、ファイルサイズ：約２６キロバイト）。
本開示は、組換えジャガイモ植物体から作られた食品製品を含む、組換えジャガイモ植物体において遺伝物質を同定するための方法に関する。さらに、本開示は、本明細書に記載されている方法において利用される、ヌクレオチドプライマー、プローブ、および天然には存在しないヌクレオチド接合部配列それ自体を含めた材料に関する。
ジャガイモは、世界で４番目に最も重要な食用作物であり、群を抜いて最も重要な野菜である。ジャガイモは現在、米国のほぼ全ての州で商業的に育てられている。年間のジャガイモ生産は米国では１８００万トン、世界的には３億トンを超える。ジャガイモの人気は、主にその多用性および栄養価に由来する。ジャガイモは、生で、凍結または乾燥させて使用することもでき、穀粉、デンプンまたはアルコールに加工することもできる。ジャガイモは、複合炭水化物を含有し、カルシウム、ナイアシンおよびビタミンＣが豊富である。
食品産業におけるジャガイモの品質は、以下の２つの重大な因子の影響を受ける：（１）ジャガイモは、揚げた時または焼いた時に急速に酸化されて発がん性生成物であるアクリルアミドを形成する非必須遊離アミノ酸であるアスパラギンを大量に含有すること、および（２）ジャガイモは、打撲を受けたジャガイモの損傷した色素体からポリフェノールオキシダーゼが漏出した時に起こる望ましくない事象である、酵素による褐変および変色を高度に受けやすいこと。細胞質では、この酵素によりフェノールが酸化され、次いでこれが急速に重合して濃い色素が生じる。塊茎は、リン酸化されたデンプンを大量に含有し、その一部は貯蔵中に分解されてグルコースおよびフルクトースが生じる。１２０℃を超える温度で加熱すると、これらの還元糖がアミノ酸と反応してアクリルアミドを含めたメイラード生成物を形成する。２種の酵素、水ジキナーゼ（ｗａｔｅｒ ｄｉｋｉｎａｓｅ）Ｒ１およびホスホリラーゼ−Ｌ（Ｒ１およびＰｈＬ）がデンプンリン酸化に関与する。褐変はまた、デンプンのグルコースおよびフルクトースへの部分分解の結果として、非酵素的にも誘発される。
上述の２つの因子に対処するために、アクリルアミド含有量が少なく、打撲黒斑（ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｂｒｕｉｓｅ）耐性が増大しており、還元糖のレベルが低下した塊茎を生じるジャガイモ植物体品種が現在開発されてきている（そのそれぞれが全体として本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第８，７５４，３０３号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｊ３」；米国特許第８，７１０，３１１号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｆ１０」；米国特許第８，８８９，９６３号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｊ５５」；米国特許出願第１４／０７２，４８７号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｅ１２」；および、疫病に対しても抵抗性である、米国特許第８，８８９，９６４号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｗ８」）。これらの改変ジャガイモ植物体は、細菌由来の外来核酸をジャガイモに導入することを伴わずに、遺伝学的事象を導入することによって開発されてきた。
米国特許第８，７５４，３０３号明細書 米国特許第８，７１０，３１１号明細書 米国特許第８，８８９，９６３号明細書
しかし、これらの改変ジャガイモ植物体から作られた食品製品を含む、これらの改変ジャガイモ植物体において、導入された遺伝物質を同定するための方法および材料の重要な必要性が産業において存在する。具体的には、所与のジャガイモ、またはジャガイモ製品が、特定の導入された遺伝子形質転換事象を含有するかどうかを決定するための方法および材料が必要である。
本開示は、植物体における遺伝子形質転換事象を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、植物体は、ジャガイモである。本明細書に記載されている方法は、植物の形質転換の結果として生じた天然には存在しないヌクレオチド接合部を検出するために広範に適用可能である。一部の態様では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性ベクターを通じて起こる植物形質転換事象により、本方法によって検出することができる、独特の天然には存在しないヌクレオチド接合部配列が創出される。これらの形質転換事象は、任意の植物種において検出することができるが、例示されているある特定の実施形態では、本明細書で教示される方法は、８種のジャガイモ栽培品種における、天然には存在しないヌクレオチド接合部の検出を教示するものである。
一部の態様では、本開示は、ジャガイモ植物体のゲノムに対してネイティブである、挿入された核酸配列を含み、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＤＮＡ、ウイルス性マーカー、またはベクター骨格配列を含有しない形質転換されたジャガイモを検出することができる方法および材料を提供する。もっと正確に言えば、ジャガイモ品種（ｖａｒｉｅｔｙ）のゲノムに挿入され、本明細書に記載されている方法の実施形態によって検出されるＤＮＡは、ジャガイモに対してネイティブであるか、または野生ジャガイモに対してネイティブであるか、または有性生殖適合性の（ｓｅｘｕａｌｌｙ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ジャガイモ植物体に対してネイティブである、非コードポリヌクレオチドであり得る。これらの導入されたヌクレオチドは、打撲黒斑の発現、アスパラギンの蓄積、および還元糖の蓄積に関与する遺伝子がサイレンシングされるように機能する。したがって、これらの導入遺伝子により、形質転換されたジャガイモにおけるアクリルアミド含有量が少なくなる。さらに、本明細書で教示される方法により、疫病に対する抵抗性を付与する、ジャガイモに導入される遺伝子、および一部の態様ではコードするポリヌクレオチドを検出することができる。上述の挿入ＤＮＡにより、天然には見出されない、独特の天然には存在しないヌクレオチド接合部が創出される。
したがって、本明細書において教示される形質転換事象により、形質転換されたジャガイモにおける非天然ヌクレオチド「接合部」配列の創出が導かれる。これらの天然には存在しないヌクレオチド接合部は、特定の遺伝子形質転換事象の存在を示す診断薬の一種として使用することができる。上述の通り、本明細書で教示される方法は、ジャガイモに限定されない。もっと正確に言えば、本発明において利用した８種のジャガイモ栽培品種により、任意の植物種における、植物の形質転換の結果として生じた天然には存在しないヌクレオチド接合部配列を検出する本方法の適用性が実証される。
本技法は、一意的に設計されたプライマーおよびプローブを含む特殊化された定量的ＰＣＲ方法を利用することにより、これらの天然には存在しないヌクレオチド接合部を検出することができる。一部の態様では、本開示のプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列に結合する。一部の態様では、従来のＰＣＲを利用する。他の態様では、リアルタイムＰＣＲを利用する。一部の態様では、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用する。
したがって、本開示は、ＰＣＲ産物をリアルタイムで検出するための、２つの一般的な方法の利用を包含する：（１）あらゆる二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素、および（２）プローブとその相補配列がハイブリダイズした後にのみ検出することが可能になる、蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブ。一部の態様では、天然には存在しないヌクレオチド接合部のみが、教示されるプライマーによって増幅され、したがって、非特異的染料によってか、または特異的なハイブリダイゼーションプローブを利用することによって検出することができる。
さらに、開示されている形質転換事象の結果として生じる、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列を創出することにより、天然には見出されない独特のヌクレオチド配列を創出した。これらの配列は、単離することができ、そのような分子を創出するために人間の手が介在しなければ天然には存在しないヌクレオチド分子を含む。さらに、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列に結合する、開示されているプローブ配列もまた、天然には見出されない新規のヌクレオチド分子である。したがって、本開示の態様は、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列分子自体、それと共に、穏やかなハイブリダイゼーション条件からストリンジェントなハイブリダイゼーション条件までの下で前記天然には存在しないヌクレオチド接合部配列に結合することが可能な他のヌクレオチド分子に関する。一部の態様では、穏やかなハイブリダイゼーション条件からストリンジェントなハイブリダイゼーション条件までの下で前記天然には存在しないヌクレオチド接合部配列に結合することが可能なヌクレオチド分子は、「ヌクレオチドプローブ」と称される。
したがって、本開示には、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９遺伝子形質転換事象を検出する代表的な方法が記載されている。本開示は、上述の形質転換事象の結果として生じた天然には存在しないヌクレオチド接合部配列を検出する方法を提供する。これらの８例は、任意の植物種における、形質転換事象の結果として生じた天然には存在しないヌクレオチド接合部配列の検出のより大きな属を可能にする種としての機能を果たす。
一実施形態では、核酸試料における植物形質転換事象の存在を検出するための定量的ＰＣＲ方法であって、ａ）ｉ）フォワードヌクレオチドプライマーとリバースヌクレオチドプライマーの対、ｉｉ）ヌクレオチドプローブ、およびｉｉｉ）検出しようとする天然には存在しないヌクレオチド接合部を含む前記試料由来の標的ヌクレオチド配列を組み合わせるステップであり、ヌクレオチドプローブが、天然には存在しないヌクレオチド接合部、または天然には存在しないヌクレオチド接合部の存在を示す配列に結合するステップと、ｂ）前記試料から標的ヌクレオチド配列を検出するステップとを含む定量的ＰＣＲ方法が提供される。
一態様では、天然には存在しないヌクレオチド接合部は、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９、またはこれらの組合せからなる群より選択される植物形質転換事象の結果として生じる。一部の態様では、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列は、食品製品材料において見出される。特定の態様では、食品製品材料は、ジャガイモ食品製品材料である。
一態様では、標的ヌクレオチド配列は、配列番号１〜４８からなる群より選択される、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
一態様では、フォワードヌクレオチドプライマーとリバースヌクレオチドプライマーの対およびヌクレオチドプローブが、配列番号５２〜９０からなる群より選択される。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号５２を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号５３を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号５４を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、Ｅ１２事象の左側または右側の接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号５５を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号５６を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号５７を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、Ｆ１０事象の左側または右側の接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号５８を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号５９を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号６０を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、Ｊ３事象の左側または右側の接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号６１を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号６２を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号６３を含み、ヌクレオチドプローブは、Ｊ５５事象に存在する、天然には存在しないヌクレオチド接合部の存在を示す配列に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号６４または６７を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号６５または６８を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号６６または６９を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、Ｖ１１事象の左側または右側の接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号７０を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号７１を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号７２を含み、ヌクレオチドプローブは、Ｗ８事象に存在する、天然には存在しないヌクレオチド接合部の存在を示す配列に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号７３を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号７４を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号７５を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、Ｘ１７事象の左側または右側の接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号７６を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号７７を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号７８を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、Ｙ９事象の左側または右側の接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号７９を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号８０を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号８１を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、ｐＳＩＭ１２７８に付随する内側のＡＧＰ／Ａｓｎ１接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号８２を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号８３を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号８４を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、ｐＳＩＭ１２７８に付随する内側の接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号８５を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号８６を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号８７を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、ｐＳＩＭ１６７８に付随する内側の接合部に結合する。特定の態様では、ヌクレオチドプローブは、内側のＶｎｔ１ターミネーター／ｐＡｇｐ接合部に結合する。
一実施形態では、フォワードヌクレオチドプライマーは配列番号８８を含み、リバースヌクレオチドプライマーは配列番号８９を含み、ヌクレオチドプローブは配列番号９０を含み、ヌクレオチドプローブは、天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する。
一実施形態では、ヌクレオチドプローブは、ｐＳＩＭ１６７８に付随する内側の接合部に結合する。
一実施形態では、ｐＳＩＭ１２７８またはｐＳＩＭ１６７８に付随する天然には存在しない構築物特異的接合部配列が検出される。これらの実施形態では、表６「ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８構築物接合部」および図５の両方に例示されている天然には存在しない接合部配列が検出される。
一実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、またはＹ９に関連する、天然には存在しない事象特異的接合部配列が検出される。これらの実施形態では、表６および図６の両方に例示されている天然には存在しない接合部配列が検出される。
一実施形態では、核酸試料は、ジャガイモ植物体、もしくはジャガイモ植物体の一部、またはジャガイモ由来食品製品、または、食品製品に利用される、ジャガイモに基づく成分に由来するものである。
一実施形態では、ジャガイモ植物体の一部は、ジャガイモの花、ジャガイモの花被片、ジャガイモの花弁、ジャガイモの萼片、ジャガイモの葯、ジャガイモの花粉、ジャガイモの種子、ジャガイモの葉、ジャガイモの葉柄、ジャガイモの茎、ジャガイモの根、ジャガイモの根茎、ジャガイモの匍匐枝、ジャガイモの塊茎、ジャガイモの苗条、ジャガイモの細胞、ジャガイモのプロトプラスト、ジャガイモ植物体組織、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つである。
一実施形態では、ジャガイモ由来食品製品は、ジャガイモ加工食品製品、ジャガイモ家畜飼料材料、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、ジャガイモ顆粒、ジャガイモタンパク質、ジャガイモ粉（ｐｏｔａｔｉｏｎ ｆｌｏｕｒ）、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つである。
一実施形態では、核酸試料は、ジャガイモ由来食品製品に由来し、食品製品において、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、Ｙ９、またはこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの植物形質転換事象の存在を検出することが可能である。
一実施形態では、食品製品全体の２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、および０．５％未満のレベルで形質転換事象を検出することが可能である。一実施形態では、食品製品全体の約０．１％から約５％までにわたるレベルで、または食品製品全体の約０．２％から約５．０％までにわたるレベルで、または食品製品全体の約０．１％から約１０％までにわたるレベルで、形質転換事象を検出することが可能である。
一実施形態では、配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸接合部配列が提供される。
別の実施形態では、ジャガイモにｐＳＩＭ１２７８および／またはｐＳＩＭ１６７８を挿入することによって創出される天然には存在しないヌクレオチド接合部配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸接合部配列が提供される。一部の態様では、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列は、図５（構築物に特異的な接合部）および図６（事象特異的接合部）および表６に示されている。
別の実施形態では、配列番号１〜４８からなる群より選択される、単離された天然には存在しない核酸接合部配列が提供される。一実施形態では、非天然ヌクレオチド接合部配列は表６に見出される。表６は、接合部配列が遺伝子挿入断片の「左側」または「右側」に含有されるか否かの表示も包含する。一部の態様では、これらの非天然ヌクレオチド接合部配列は、より長いヌクレオチド配列内に含まれる。例えば、表６中の配列は、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、またはそれ超の長さのヌクレオチドを含むヌクレオチド配列内に含まれる。
一実施形態では、配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と穏やかな条件下でハイブリダイズすることが可能な単離された天然には存在しない核酸配列が提供される。一実施形態では、配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な単離された天然には存在しない核酸配列が提供される。一部の態様では、配列番号１〜４８とハイブリダイズすることが可能な上述の核酸配列は、ヌクレオチドプローブである。一部の態様では、ヌクレオチドプローブは、リアルタイムＰＣＲ用に構成されている。一部の態様では、プローブはレポーター分子で標識されている。
別の実施形態では、配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される核酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸プローブ配列が提供される。別の実施形態では、配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される、単離された天然には存在しない核酸プローブ配列が提供される。表７に記載されている通り、上述のプローブは、以下の、天然には存在しない、均等に特異的（ｅｖｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）かつ構築物特異的ヌクレオチド接合部配列に結合することが可能である：５４（Ｅ１２）、５７（Ｆ１０）、６０（Ｊ３）、６３（Ｊ５５）、６６（Ｖ１１）、６９（Ｖ１１）、７２（Ｗ８）、７５（Ｘ１７）、７８（Ｙ９）、８１（ｐＳＩＭ１２７８）、８４（ｐＳＩＭ１２７８）、８７（ｐＳＩＭ１６７８）、および９０（ｐＳＩＭ１６７８）。
別の実施形態では、配列番号５２〜９０からなる群より選択される核酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸プライマーまたはプローブ配列が提供される。別の実施形態では、配列番号５２〜９０からなる群より選択される、単離された天然には存在しない核酸プライマーまたはプローブ配列が提供される。
上述の開示によるフォワードヌクレオチドプライマーおよびリバースヌクレオチドプライマーおよびヌクレオチドプローブを含むキットを、ＰＣＲおよびｑＰＣＲ反応に利用する標準試薬と共に含むキットも本明細書で教示される。
さらに、一実施形態では、本開示は、アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子（ｆＡｓｎ１）の断片およびポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の３’−非翻訳配列をアンチセンス方向に含むＤＮＡセグメントを２コピー含有する第１のサイレンシングカセットと、ジャガイモホスホリラーゼ−Ｌ（ｐＰｈＬ）遺伝子の断片およびジャガイモＲ１遺伝子の断片をアンチセンス方向に含むＤＮＡセグメントを２コピー含有する第２のサイレンシングカセットとを含む、ｐＳＩＭ１２７８と称される植物ベクターを提供する。
ｐＳＩＭ１２７８ベクターは、植物の形質転換の前の植物ＤＮＡの維持を支持し、植物細胞の形質転換の際に植物細胞に移入されない、９，５１２ｂｐの骨格領域と、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるネイティブなＤＮＡを含む、１０，１４８ｂｐのＤＮＡ挿入断片領域とを含む。
さらに、別の実施形態では、本開示は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１疫病抵抗性遺伝子（Ｖｎｔ１）をセンス方向に含むＤＮＡセグメントを１コピー含有する第１の発現カセットと、液胞酸性インベルターゼ（ＶＩｎｖ）遺伝子の断片をアンチセンス方向に含むＤＮＡセグメントを２コピー含有する第２のサイレンシングカセットを含む、ｐＳＩＭ１６７８と称される植物ベクターを提供する。
ｐＳＩＭ１６７８ベクターは、植物の形質転換の前の植物ＤＮＡの維持を支持し、植物細胞の形質転換の際に植物細胞に移入されない、９，５１２ｂｐの骨格領域と、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるネイティブなＤＮＡを含む、９，０９０ｂｐのＤＮＡ挿入断片領域とを含む。
本開示は、上述のＤＮＡ挿入断片領域が植物体に導入されたか否かを検出する方法を提供する。上述の通り、挿入されたＤＮＡの領域により、独特の非天然ヌクレオチド接合部配列の形成が導かれる。これらの接合部配列は、本開示の他の箇所の中でも、表６、図５、および図６に見出すことができる。
さらに、本開示により、植物体への遺伝物質の導入にｐＳＩＭ１２７８および／またはｐＳＩＭ１６７８ベクターが利用されたか否かを検出することができる。一部の実施形態では、植物体は、ジャガイモである。しかし、本明細書に開示されている本方法および材料は、任意の適切な植物に導入された、教示される遺伝学的事象の存在を検出するために使用することができる。本方法は、植物体への遺伝物質の導入にｐＳＩＭ１２７８ベクターおよび／またはｐＳＩＭ１６７８ベクターが利用されたか否かを検出するために利用することができるので、本方法により、そのようなベクターを利用して植物体にＤＮＡが導入された任意の植物体、または任意のジャガイモ植物体における形質転換を検出することができる。
実施形態では、方法は、バイオテクノロジーによるジャガイモ食品製品の事象特異的検出をもたらすために、ＤＮＡ抽出が最適化されるように開発されたものである。
本明細書のある特定の実施形態では、教示される事象特異的または構築物特異的な検出プロトコールにおいて使用される全ての設備、試薬、および方法に関する詳細な説明が提示される。さらに、ある特定の態様では、教示されるＰＣＲ ＤＮＡ抽出手順と、それと共にＤＮＡの質についてのスクリーニングの再現性を裏付けるために、データが提示される。
ＰＣＲによる事象特異的、または構築物特異的な検出に関する教示される態様の一部では、リアルタイムＰＣＲの全ての手順が、食品製品中の低レベル（０．２〜５．０％）のバイオテクノロジーによるジャガイモを検出可能であることの証拠と共に概説されている。
本開示の一態様では、植物ＤＮＡベクターのサイレンシングカセットのうちの１つまたは複数を発現するジャガイモ植物体品種は、以下の形質転換事象：Ｅ１２（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｊ３（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｊ５５（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｆ１０（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、Ｗ８（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｖ１１（Ｓｎｏｗｄｅｎ）、Ｘ１７（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、およびＹ９（Ａｔｌａｎｔｉｃ）からなる群より選択される。本開示は、上述の遺伝子形質転換事象のいずれかの存在を検出するために有用な方法および材料を教示する。これらの事象は、ジャガイモ植物体の一部を利用して検出することができる。
特定の実施形態では、ジャガイモ植物体の任意の一部分を利用して、本明細書において教示される検出方法に組み入れるための遺伝物質を単離することができる。一部の態様では、教示される方法では、ジャガイモ植物体の胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、雌ずい、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、胚軸、根、根端、花、種子、葉柄、塊茎、芽、または茎を供給源材料として利用する。さらに、本開示は、ジャガイモ植物体から生産される任意の製品を供給源材料として利用する方法を提供する。一部の態様では、食品製品は、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、またはジャガイモ顆粒である。
特定の態様では、４種の異なるジャガイモ品種（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ、Ａｔｌａｎｔｉｃ、およびＳｎｏｗｄｅｎ）をｐＳＩＭ１２７８構築物で形質転換した。一部の実施形態では、これらのジャガイモは、「ＧＥＮ１」または世代１または第１世代と称され、Ｅ１２（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｊ３（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｊ５５（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｆ１０（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、およびＶ１１（Ｓｎｏｗｄｅｎ）を含む。
別の態様では、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ、およびＡｔｌａｎｔｉｃジャガイモ品種をｐＳＩＭ１２７８構築物とｐＳＩＭ１６７８構築物の両方で形質転換した。一部の実施形態では、これらのジャガイモは、「ＧＥＮ２」または世代２または第２世代と称され、Ｗ８（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｘ１７（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、およびＹ９（Ａｔｌａｎｔｉｃ）を含む。
低アクリルアミド含有量および／または打撲黒斑耐性の増大を示した８つの事象を同定した：Ｅ１２（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｊ３（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｊ５５（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｆ１０（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、Ｗ８（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｖ１１（Ｓｎｏｗｄｅｎ）、Ｘ１７（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、およびＹ９（Ａｔｌａｎｔｉｃ）。Ｗ８事象、Ｘ１７事象、およびＹ９事象は、疫病に対する抵抗性の増大も示した。これらの事象は全て、本明細書に開示されている事象特異的または構築物特異的な検出方法によって検出することができる。
本開示の一実施形態は、各形質転換事象を遺伝的に同定するための、構築物特異的および品種／事象特異的なプライマーおよびプローブおよびｑＰＣＲ条件を教示する。
一態様では、本開示は、Ｅ１２（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｊ３（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｊ５５（Ａｔｌａｎｔｉｃ）、Ｆ１０（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、Ｗ８（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、Ｖ１１（Ｓｎｏｗｄｅｎ）、Ｘ１７（Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ）、およびＹ９（Ａｔｌａｎｔｉｃ）からなる群より選択される形質転換事象を同定するために利用するｑＰＣＲ方法を教示する。
本開示の一実施形態は、試料を、１つまたは複数のトランスジェニック植物事象に由来する材料が存在するかしないかについて検査する方法であって、（ａ）試料中に、配列番号１〜４８を有するヌクレオチド配列の１つ、１つ超、または全部を含む核酸が存在するかしないかを検出するステップと、（ｂ）試料中に前記配列番号が存在するかしないかに基づいて、試料が、植物形質転換事象に由来する遺伝物質を含有するか否かを結論付けるステップとを含む方法を教示する。これらの配列は、形質転換事象の結果として生じた天然には存在しないヌクレオチド接合部を示すものである。これらの非天然接合部配列は、とりわけ、表６において、遺伝子挿入断片の「左側」または「右側」に接合部配列が含有されるか否かの表示と共に概説されている。さらに、前記事象の視覚的な描写を、とりわけ、図５および図６に見出すことができる。
一部の態様では、試料中に核酸が存在するかしないかを、ＰＣＲ増幅を使用して検出する。一部の態様では、リアルタイムＰＣＲ増幅を使用する。一部の態様では、教示される方法では、配列番号５２〜９０を有する、表７のプライマー／プローブセット、または前記プライマー／プローブセットのバリアントを利用する。一部の態様では、配列番号４９〜５１を使用して対照を検出する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｅ１２に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｅ１２は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｆ１０に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｆ１０は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｊ３に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｊ３は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｊ５５に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｊ５５は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｖ１１に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｖ１１は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｗ８に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域およびｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｗ８は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。さらなる実施形態では、事象Ｗ８は、内在性液胞酸性インベルターゼ遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−Ｖｎｔ１を発現させるために有効なセンスジャガイモＤＮＡとを含有する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｘ１７に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域およびｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｘ１７は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。さらなる実施形態では、事象Ｘ１７は、内在性液胞酸性インベルターゼ遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−Ｖｎｔ１を発現させるために有効なセンスジャガイモＤＮＡとを含有する。
一部の実施形態では、試料は、事象Ｙ９に存在するｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域およびｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域を含む。さらなる実施形態では、事象Ｙ９は、内在性アスパラギンシンテターゼ−１遺伝子および内在性ポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子およびジキナーゼＲ１遺伝子に対する内在性ジャガイモプロモーターの逆方向反復とを含有する。さらなる実施形態では、事象Ｙ９は、内在性液胞酸性インベルターゼ遺伝子の発現を阻害するために有効なジャガイモＤＮＡの逆方向反復と、それに加えて、疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−Ｖｎｔ１を発現させるために有効なセンスジャガイモＤＮＡとを含有する。
一実施形態では、本開示は、５’末端が６−カルボキシフルオレセインで標識され、３’末端がＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）で標識されたヌクレオチドプローブを利用するｑＰＣＲプロトコールを提供する。しかし、任意のハイブリダイゼーションプローブおよび任意のレポーター分子を構築してよいことが当業者には理解されよう。
一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅の効率は、９０％〜１１０％である。別の実施形態では、ＰＣＲ増幅の直線性を、Ｒ２値によって測定する。一部の実施形態では、Ｒ２値は、０．９８を超えるかまたはそれと等しい。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅により、少なくとも２４ｐｇのジャガイモの葉のＤＮＡを、６０℃のアニーリング／伸長温度を使用して、３４サイクルから３５サイクルの間の増幅で検出することができる。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅は頑強である。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅の熱サイクル条件は、（ａ）最初の変性のために９５℃で６００秒間のＰＣＲサイクルを１回；（ｂ）４５回のＰＣＲサイクル：変性のために９５℃で１５秒間、次いで、アニーリング／伸長のために６０℃で６０秒間を含む。一部の実施形態では、熱サイクル条件は、（ａ）最初の変性のために９５℃で６００秒間のＰＣＲサイクルを１回；（ｂ）４０回のＰＣＲサイクル：変性のために９５℃で１５秒間、次いで、アニーリングのために６０℃で１５秒間、次いで、伸長のために７２℃で１０秒間を含む。
一部の実施形態では、試料は、花、花被片、花弁、萼片、葯、花粉、種子、葉、葉柄、茎、根、根茎、匍匐枝、塊茎もしくは苗条、もしくはその一部を含めた植物体もしくはその一部、植物細胞、植物プロトプラストおよび／または植物組織、および／または植物由来材料、好ましくは、加工食品もしくは飼料材料を含めた食品もしくは飼料材料を含む。一部の実施形態では、加工食品製品は、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、ジャガイモタンパク質、ジャガイモ粉、およびジャガイモ顆粒からなる群より選択される。
一部の実施形態では、試料は食品製品を含む。さらなる実施形態では、食品製品は、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来する材料の混合物を含む。一部の実施形態では、材料は、ポテトフライ、ポテトチップ、ジャガイモフレーク、およびジャガイモの塊茎を含む。
一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するジャガイモの塊茎および／またはポテトフライは、食品製品全体の約１％未満を構成する。一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するジャガイモの塊茎および／またはポテトフライは、食品製品全体の約０．５％未満を構成する。一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するジャガイモの塊茎および／またはポテトフライは、食品製品全体の約０．２％を構成する。
一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するポテトチップは、食品製品全体の約１０％未満を構成する。一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するポテトチップは、食品製品全体の約５％を構成する。
一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するジャガイモフレークは、食品製品全体の約１５％未満を構成する。一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するジャガイモフレークは、食品製品全体の約８％未満を構成する。一部の実施形態では、事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、および／またはＹ９に由来するジャガイモフレークは、食品製品全体の約２．５％を構成する。
本明細書では、配列番号１〜９０から選択される配列を含む単離されたヌクレオチド配列が教示される。
本明細書では、試料を、１つまたは複数の形質転換植物事象に由来する材料が存在するかしないかの潜在性について検査するためのキットであって、１つ、１つ超、または全てのプライマー／プローブセット、または前記プライマー／プローブセットのバリアントを含むキットが教示される。本開示のキットは、前記キットの指示／使用説明書も含んでよい。
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、以下の説明を考察することにより、さらなる態様および実施形態が明らかになろう。
図１は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターを示す。左側のベクター骨格領域は、１０，１４９ｂｐの位置で始まり、１９，６６０ｂｐの位置で終わる、９，５１２ｂｐの長さである。骨格ＤＮＡは、主に、植物の形質転換の前のＤＮＡ挿入断片の維持の支持をもたらす細菌ＤＮＡからなる。隣接境界配列を含めたＤＮＡ挿入断片領域（右側）は、１０，１４８ｂｐの長さである（１ｂｐから１０，１４８ｂｐまで）。ＤＮＡ挿入断片は、形質転換の際にジャガイモゲノムに安定に組み込まれた。
図２は、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターに挿入したＤＮＡ挿入断片内の２つのサイレンシングカセットの略図を提供する。各サイレンシングカセットは、スペーサーによって分離された、２コピーの２つの遺伝子断片を含有する。２コピーの、標的化された４つの遺伝子、すなわち、Ａｓｎ−１、Ｐｐｏ−５、ＰｈｌおよびＲ１の断片を含むＤＮＡセグメントを、Ｐｒｏで示される、主に塊茎において活性である２つの収束プロモーターの間に逆方向反復として挿入した。結果として得られる、サイレンシングカセットを含有する植物体は、塊茎において、意図された標的遺伝子を動的にかつ勢いよくサイレンシングする、ＲＮＡ分子の多様かつポリアデニル化されていないアレイを生じる。収束転写（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により、衝突転写（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）がもたらされるので、ＲＮＡ分子のサイズは、一般に、使用した２つのプロモーター間の距離よりも小さかった。
図３は、本発明のｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターを示す。左側のベクター骨格領域は、９，０９１ｂｐの位置で始まり、１８，６０２ｂｐの位置で終わる、９，５１２ｂｐの長さである。骨格ＤＮＡは、主に植物の形質転換の前のＤＮＡ挿入断片の維持の支持をもたらす細菌ＤＮＡからなる。隣接境界配列を含めたＤＮＡ挿入断片領域（右側）は、９，０９０ｂｐの長さである（１ｂｐから９，０９０ｂｐまで）。ＤＮＡ挿入断片は、形質転換の際にジャガイモゲノムに安定に組み込まれた。
図４Ａ〜Ｄは、ジャガイモ事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、およびＪ５５におけるＤＮＡ挿入断片の構造の図を示す。略語は、以下の通りである：ＬＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した左境界（２５塩基対の配列）、ＡＧＰ＝ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーター、ＧＢＳ＝顆粒結合デンプン合成酵素遺伝子のプロモーター、ＲＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した右境界（２５塩基対の配列）、ＡＳＮ１＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子に由来するプローブ、ｆＡＳＮ１＝アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子の断片、ｆＰＰＯ５＝ポリフェノールオキシダーゼ５（Ｐｐｏ５）遺伝子の断片、ｐＰＨＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターの断片、ＰＨＬ＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターに由来するプローブ、ｐＲＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、水ジキナーゼＲ１遺伝子のプロモーターの断片、スペーサー＝各逆方向反復のアーム間の配列、ＲＶ＝制限酵素ＥｃｏＲＶ、Ｈｄ＝制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｒ１＝制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｓｃ＝制限酵素ＳｃａＩ。太い黒線は、ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用されるＤＮＡ挿入断片の種々の領域に対するプローブを示す。屈曲した矢印は、それぞれのプロモーターの転写開始部位を指す。白い矢じりは、各逆方向反復カセット内の所与の遺伝子またはプロモーター断片についての各鎖の方向（センスまたはアンチセンス）を示す。数字は、ＤＮＡ挿入断片内のヌクレオチド位を示す。ヌクレオチド１位は、ＬＢの後ろのＡＧＰプロモーターの始まりである。表２は、ＤＮＡ挿入断片の各エレメントに関するさらなる詳細を示す。栽培品種を以下の通り示す：図４Ａ−Ｆ１０挿入断片；図４Ｂ−Ｅ１２挿入断片；図４Ｃ−Ｊ３挿入断片；図４Ｄ−Ｊ５５挿入断片。 図４Ａ〜Ｄは、ジャガイモ事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、およびＪ５５におけるＤＮＡ挿入断片の構造の図を示す。略語は、以下の通りである：ＬＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した左境界（２５塩基対の配列）、ＡＧＰ＝ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーター、ＧＢＳ＝顆粒結合デンプン合成酵素遺伝子のプロモーター、ＲＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した右境界（２５塩基対の配列）、ＡＳＮ１＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子に由来するプローブ、ｆＡＳＮ１＝アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子の断片、ｆＰＰＯ５＝ポリフェノールオキシダーゼ５（Ｐｐｏ５）遺伝子の断片、ｐＰＨＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターの断片、ＰＨＬ＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターに由来するプローブ、ｐＲＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、水ジキナーゼＲ１遺伝子のプロモーターの断片、スペーサー＝各逆方向反復のアーム間の配列、ＲＶ＝制限酵素ＥｃｏＲＶ、Ｈｄ＝制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｒ１＝制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｓｃ＝制限酵素ＳｃａＩ。太い黒線は、ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用されるＤＮＡ挿入断片の種々の領域に対するプローブを示す。屈曲した矢印は、それぞれのプロモーターの転写開始部位を指す。白い矢じりは、各逆方向反復カセット内の所与の遺伝子またはプロモーター断片についての各鎖の方向（センスまたはアンチセンス）を示す。数字は、ＤＮＡ挿入断片内のヌクレオチド位を示す。ヌクレオチド１位は、ＬＢの後ろのＡＧＰプロモーターの始まりである。表２は、ＤＮＡ挿入断片の各エレメントに関するさらなる詳細を示す。栽培品種を以下の通り示す：図４Ａ−Ｆ１０挿入断片；図４Ｂ−Ｅ１２挿入断片；図４Ｃ−Ｊ３挿入断片；図４Ｄ−Ｊ５５挿入断片。 図４Ａ〜Ｄは、ジャガイモ事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、およびＪ５５におけるＤＮＡ挿入断片の構造の図を示す。略語は、以下の通りである：ＬＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した左境界（２５塩基対の配列）、ＡＧＰ＝ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーター、ＧＢＳ＝顆粒結合デンプン合成酵素遺伝子のプロモーター、ＲＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した右境界（２５塩基対の配列）、ＡＳＮ１＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子に由来するプローブ、ｆＡＳＮ１＝アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子の断片、ｆＰＰＯ５＝ポリフェノールオキシダーゼ５（Ｐｐｏ５）遺伝子の断片、ｐＰＨＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターの断片、ＰＨＬ＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターに由来するプローブ、ｐＲＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、水ジキナーゼＲ１遺伝子のプロモーターの断片、スペーサー＝各逆方向反復のアーム間の配列、ＲＶ＝制限酵素ＥｃｏＲＶ、Ｈｄ＝制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｒ１＝制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｓｃ＝制限酵素ＳｃａＩ。太い黒線は、ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用されるＤＮＡ挿入断片の種々の領域に対するプローブを示す。屈曲した矢印は、それぞれのプロモーターの転写開始部位を指す。白い矢じりは、各逆方向反復カセット内の所与の遺伝子またはプロモーター断片についての各鎖の方向（センスまたはアンチセンス）を示す。数字は、ＤＮＡ挿入断片内のヌクレオチド位を示す。ヌクレオチド１位は、ＬＢの後ろのＡＧＰプロモーターの始まりである。表２は、ＤＮＡ挿入断片の各エレメントに関するさらなる詳細を示す。栽培品種を以下の通り示す：図４Ａ−Ｆ１０挿入断片；図４Ｂ−Ｅ１２挿入断片；図４Ｃ−Ｊ３挿入断片；図４Ｄ−Ｊ５５挿入断片。 図４Ａ〜Ｄは、ジャガイモ事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、およびＪ５５におけるＤＮＡ挿入断片の構造の図を示す。略語は、以下の通りである：ＬＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した左境界（２５塩基対の配列）、ＡＧＰ＝ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーター、ＧＢＳ＝顆粒結合デンプン合成酵素遺伝子のプロモーター、ＲＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した右境界（２５塩基対の配列）、ＡＳＮ１＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子に由来するプローブ、ｆＡＳＮ１＝アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子の断片、ｆＰＰＯ５＝ポリフェノールオキシダーゼ５（Ｐｐｏ５）遺伝子の断片、ｐＰＨＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターの断片、ＰＨＬ＝ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターに由来するプローブ、ｐＲＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、水ジキナーゼＲ１遺伝子のプロモーターの断片、スペーサー＝各逆方向反復のアーム間の配列、ＲＶ＝制限酵素ＥｃｏＲＶ、Ｈｄ＝制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｒ１＝制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｓｃ＝制限酵素ＳｃａＩ。太い黒線は、ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションに使用されるＤＮＡ挿入断片の種々の領域に対するプローブを示す。屈曲した矢印は、それぞれのプロモーターの転写開始部位を指す。白い矢じりは、各逆方向反復カセット内の所与の遺伝子またはプロモーター断片についての各鎖の方向（センスまたはアンチセンス）を示す。数字は、ＤＮＡ挿入断片内のヌクレオチド位を示す。ヌクレオチド１位は、ＬＢの後ろのＡＧＰプロモーターの始まりである。表２は、ＤＮＡ挿入断片の各エレメントに関するさらなる詳細を示す。栽培品種を以下の通り示す：図４Ａ−Ｆ１０挿入断片；図４Ｂ−Ｅ１２挿入断片；図４Ｃ−Ｊ３挿入断片；図４Ｄ−Ｊ５５挿入断片。
図５は、プラスミド構築物ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域内の構築物特異的接合部を示す。挿入断片領域の下の数字は、構築物特異的接合部を示し、表６の配列番号３〜１６および配列番号４２〜４８に対応する。ｐＳＩＭ１２７８の挿入断片領域についての略語は以下の通りである：ＬＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した左境界（２５塩基対の配列）、ｐＡＧＰ＝ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーター、ｐＧｂｓｓ＝顆粒結合デンプン合成酵素遺伝子のプロモーター、ＲＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した右境界（２５塩基対の配列）、ＡＳＮ＝アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）遺伝子の断片、ＰＰＯ＝ポリフェノールオキシダーゼ５（Ｐｐｏ５）遺伝子の断片、ＰＨＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子のプロモーターの断片、ＲＬ＝第２の逆方向反復カセットに使用される、水ジキナーゼＲ１遺伝子のプロモーターの断片、赤い四角＝各逆方向反復のアーム間のスペーサー配列。ｐＳＩＭ１６７８の挿入断片領域についての略語は以下の通りである：ＬＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した左境界（２５塩基対の配列）、ｐＡＧＰ＝ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーター、ｐＧｂｓｓ＝顆粒結合デンプン合成酵素遺伝子のプロモーター、ＲＢ＝Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡの境界と類似した右境界（２５塩基対の配列）、ｐＶｎｔ１＝疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１のネイティブなプロモーター、Ｖｎｔ１＝疫病（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する抵抗性を付与する遺伝子、ｔＶｎｔ１＝疫病抵抗性遺伝子Ｒｐｉ−ｖｎｔ１のネイティブなターミネーター、Ｉｎｖ＝液胞酸性インベルターゼ遺伝子の断片。矢印は、各逆方向反復カセット内の所与の遺伝子またはプロモーター断片についての各鎖の方向（センスまたはアンチセンス）または所与のプロモーターについての転写の方向を示す。表２および表４は、各挿入断片領域の各エレメントに関するさらなる詳細を示す。
図６Ａ〜Ｉは、Ｉｎｎａｔｅ（商標）１．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８）栽培品種Ｅ１２、Ｆ１０、Ｖ１１、Ｊ３、Ｊ５５、およびＥ５６、ならびにＩｎｎａｔｅ（商標）２．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８）栽培品種Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９についての事象特異的接合部および構築物特異的接合部を示す。挿入断片領域の下の数字は、構築物特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。挿入断片領域の上の数字は、事象特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。略語は、図５に記載の通りである。栽培品種挿入断片を以下の通り示す：図６Ａ−Ｅ１２の構造；図６Ｂ−Ｆ１０の構造；図６Ｃ Ｖ１１の構造；図６Ｄ−Ｊ３の構造；図６Ｅ−Ｊ５５の構造；図６Ｆ−Ｅ５６の構造；図６Ｇ Ｗ８の構造；図６Ｈ−Ｘ１７の構造；図６Ｉ−Ｙ９の構造。 図６Ａ〜Ｉは、Ｉｎｎａｔｅ（商標）１．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８）栽培品種Ｅ１２、Ｆ１０、Ｖ１１、Ｊ３、Ｊ５５、およびＥ５６、ならびにＩｎｎａｔｅ（商標）２．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８）栽培品種Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９についての事象特異的接合部および構築物特異的接合部を示す。挿入断片領域の下の数字は、構築物特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。挿入断片領域の上の数字は、事象特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。略語は、図５に記載の通りである。栽培品種挿入断片を以下の通り示す：図６Ａ−Ｅ１２の構造；図６Ｂ−Ｆ１０の構造；図６Ｃ Ｖ１１の構造；図６Ｄ−Ｊ３の構造；図６Ｅ−Ｊ５５の構造；図６Ｆ−Ｅ５６の構造；図６Ｇ Ｗ８の構造；図６Ｈ−Ｘ１７の構造；図６Ｉ−Ｙ９の構造。 図６Ａ〜Ｉは、Ｉｎｎａｔｅ（商標）１．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８）栽培品種Ｅ１２、Ｆ１０、Ｖ１１、Ｊ３、Ｊ５５、およびＥ５６、ならびにＩｎｎａｔｅ（商標）２．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８）栽培品種Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９についての事象特異的接合部および構築物特異的接合部を示す。挿入断片領域の下の数字は、構築物特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。挿入断片領域の上の数字は、事象特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。略語は、図５に記載の通りである。栽培品種挿入断片を以下の通り示す：図６Ａ−Ｅ１２の構造；図６Ｂ−Ｆ１０の構造；図６Ｃ Ｖ１１の構造；図６Ｄ−Ｊ３の構造；図６Ｅ−Ｊ５５の構造；図６Ｆ−Ｅ５６の構造；図６Ｇ Ｗ８の構造；図６Ｈ−Ｘ１７の構造；図６Ｉ−Ｙ９の構造。 図６Ａ〜Ｉは、Ｉｎｎａｔｅ（商標）１．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８）栽培品種Ｅ１２、Ｆ１０、Ｖ１１、Ｊ３、Ｊ５５、およびＥ５６、ならびにＩｎｎａｔｅ（商標）２．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８）栽培品種Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９についての事象特異的接合部および構築物特異的接合部を示す。挿入断片領域の下の数字は、構築物特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。挿入断片領域の上の数字は、事象特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。略語は、図５に記載の通りである。栽培品種挿入断片を以下の通り示す：図６Ａ−Ｅ１２の構造；図６Ｂ−Ｆ１０の構造；図６Ｃ Ｖ１１の構造；図６Ｄ−Ｊ３の構造；図６Ｅ−Ｊ５５の構造；図６Ｆ−Ｅ５６の構造；図６Ｇ Ｗ８の構造；図６Ｈ−Ｘ１７の構造；図６Ｉ−Ｙ９の構造。 図６Ａ〜Ｉは、Ｉｎｎａｔｅ（商標）１．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８）栽培品種Ｅ１２、Ｆ１０、Ｖ１１、Ｊ３、Ｊ５５、およびＥ５６、ならびにＩｎｎａｔｅ（商標）２．０挿入断片（ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８）栽培品種Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９についての事象特異的接合部および構築物特異的接合部を示す。挿入断片領域の下の数字は、構築物特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。挿入断片領域の上の数字は、事象特異的接合部を示し、表６に見出される配列番号に対応する。略語は、図５に記載の通りである。栽培品種挿入断片を以下の通り示す：図６Ａ−Ｅ１２の構造；図６Ｂ−Ｆ１０の構造；図６Ｃ Ｖ１１の構造；図６Ｄ−Ｊ３の構造；図６Ｅ−Ｊ５５の構造；図６Ｆ−Ｅ５６の構造；図６Ｇ Ｗ８の構造；図６Ｈ−Ｘ１７の構造；図６Ｉ−Ｙ９の構造。
図７は、Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ事象Ｆ１０の塊茎、フライ、およびフレークに由来する食品混合物、ならびにＡｔｌａｎｔｉｃ事象Ｊ３の塊茎およびチップに由来する食品混合物に対して実施したＤＮＡ単離の全てで、混合して商業品種食品製品にした、すり砕いたＩｎｎａｔｅ（商標）食品製品を最低の百分率として増幅することができたことを例示する。Ｆ１０フレークにおいて２．５％で１つの偽陰性が存在した。これらの結果から、開示されている方法により、ｑＰＣＲ試験において使用するのに十分な品質のＤＮＡが生成されることが実証される。Ｉｎｎａｔｅ（商標）は、Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔにより利用されている商標であり、ｐＳＩＭ１２７８および／またはｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターを用いて形質転換されたジャガイモ植物体および前記植物体から作られた食品製品を示す。
図８は、表１および表２に記載のＤＮＡ配列を利用する、プラスミドｐＳＩＭ１２７８を構築するためのプロセスを例示する。出発ベクター、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１は、最終的なｐＳＩＭ１２７８骨格における複製起点を含有する。
図９は、ｐＳＩＭ１２７８におけるＴ−ＤＮＡ発現カセットの構築を例示する。融合ＰＣＲを使用して、エレメント１Ａ（ｐＡｇｐ−第１のコピー）、１Ｂ（ｐＡｇｐ−第２のコピー）、２（Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５）、３（Ｐｐｏ５、Ａｓｎ１）、４（ｐＧｂｓｓ−第１のコピー）および７（スペーサー１、Ｐｐｏ５、Ａｓｎ１）を増幅した。エレメント５（ＰｈＬ、Ｒ１）および６（スペーサー２、Ｒ１、ＰｈＬ、ｐＧｂｓｓ）は、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）により、ジャガイモゲノム由来の配列に基づいて合成された。エレメント８、９、および１０は、図に示されている構成要素をライゲーションすることによって作出した。最後に、３つの断片、１０、１１および６を所望の発現カセットにまたがるように創出した。これらの３つの断片をライゲーションし、図８に示されているＫｐｎＩ−ＳａｃＩ制限部位に挿入してｐＳＩＭ１２７８を作出した。
図１０は、表３および表４に記載のＤＮＡ配列を利用する、プラスミドｐＳＩＭ１６７８を構築するためのプロセスを例示する。出発ベクター、ｐＳＩＭ１２７８は、最終的なｐＳＩＭ１６７８骨格を含有する。当業者は、実施例および図９および図１０を利用して、任意のジャガイモ植物体を形質転換することができ、それは、今度は、本明細書で教示される方法に従って検出可能な天然には存在しないヌクレオチド接合部を含有する。
定義
以下の説明および表では、いくつもの用語が使用されている。そのような用語に与えられる範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲の明瞭かつ一貫した理解をもたらすために以下の定義を提供する。
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数のその実体を指す。例えば、「１つの（ａ）プライマー」とは、１つまたは複数のプライマーまたは少なくとも１つのプライマーを指す。そのように、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では互換的に使用される。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」への言及は、文脈により、その要素がただ１つのみ存在することが明らかに必要とされている場合を除き、その要素が１つ超存在する可能性を除去するものではない。
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子」は、１つの形質または特性に関する遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかである。二倍体の細胞または生物では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、相同染色体の対上の対応する遺伝子座を占有する。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸配列」は、植物から単離された、植物に対してネイティブな、もしくは植物において天然に存在する、または、合成により作製されたものであるが内在性対応物の核酸配列を含む、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質およびその断片を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「人工的に操作された（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ）」は、操作されていない天然に存在する対応物と比較して異なる生物学的、生化学的、形態学的、または生理的表現型および／または遺伝子型を有する植物体または植物細胞が生じるように、植物体または植物細胞を、手によって、または機械的手段もしくは組換え手段によって、例えば、遺伝子工学技法によって、移動させる、配置する、操作する（ｏｐｅｒａｔｅ）または制御することを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「無性繁殖」は、配偶子の融合を伴わない、葉挿し、茎挿し、根挿し、塊茎芽、匍匐枝、単一の植物細胞プロトプラスト、カルスなどから植物全体を作出することによって後代を生じさせることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「骨格」は、バイナリーベクターの、移入が意図されたＤＮＡ挿入断片配列以外の核酸配列を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「戻し交配」は、育種家が、雑種後代をまた親の一方と交配すること、例えば、第１世代雑種Ｆ１とＦ１雑種の親遺伝子型の一方との交配を繰り返すプロセスである。
本明細書で使用される場合、用語「打撲黒斑」は、打撲を受けた塊茎組織に見出される黒斑が、細胞が傷害を受けた後に生成され、組織に褐色、灰色または黒色の外観を生じさせるメラニンと称される色素の結果である状態を説明する。メラニンは、細胞損傷の結果としてフェノール基質と適切な酵素が互いと接触すると形成される。損傷は、細胞の破壊である必要はない。しかし、通常、組織が強い衝撃を受けた場合、基質と酵素の混合は必ず起こるはずである。黒斑は、主に導管輪（ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｎｇ）の真下の髄周囲組織（ｐｅｒｉｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｉｓｓｕｅ）において起こるが、皮質組織の一部を含むほど大きい場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「境界様配列」は、以下を意味する。「境界様」配列は、改変しようとする選択された植物種から、または改変しようとする植物種に対して有性生殖適合性の植物から単離され、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの境界配列と同様に機能する。すなわち、本開示の境界様配列は、それが連結したポリヌクレオチドの組み込みを促進し、容易にするものである。本開示のＤＮＡ挿入断片は、境界様配列を含有することが好ましい。ＤＮＡ挿入断片の境界様配列は、５〜１００ｂｐの長さ、１０〜８０ｂｐの長さ、１５〜７５ｂｐの長さ、１５〜６０ｂｐの長さ、１５〜５０ｂｐの長さ、１５〜４０ｂｐの長さ、１５〜３０ｂｐの長さ、１６〜３０ｂｐの長さ、２０〜３０ｂｐの長さ、２１〜３０ｂｐの長さ、２２〜３０ｂｐの長さ、２３〜３０ｂｐの長さ、２４〜３０ｂｐの長さ、２５〜３０ｂｐの長さ、または２６〜３０ｂｐの長さの間である。ＤＮＡ挿入断片の左境界配列および右境界配列は、改変しようとする植物のゲノムから単離されたものであってよく、かつ／または、改変しようとする植物のゲノムに対してネイティブなものであってよい。ＤＮＡ挿入断片の境界様配列は、任意の公知のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＴ−ＤＮＡの境界配列とは、ヌクレオチド配列が同一でない。したがって、ＤＮＡ挿入断片の境界様配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓなどのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来のＴ−ＤＮＡの境界配列とは異なるヌクレオチドを１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ超有し得る。すなわち、ＤＮＡ挿入断片の境界、または本開示の境界様配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓなどのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種由来のＴ−ＤＮＡの境界配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ挿入断片の境界」および「ＤＮＡ挿入断片の境界様」という説明的用語は、交換可能である。境界様配列は、植物のゲノムから単離することができ、ヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列に組み込むことが可能な効率が変化するように改変するかまたは変異させることができる。他のポリヌクレオチド配列を本開示の境界様配列に付加するまたは組み入れることができる。したがって、ＤＮＡ挿入断片の左境界またはＤＮＡ挿入断片の右境界は、５’多重クローニング部位および３’多重クローニング部位、または追加的な制限部位を有するように改変することができる。ＤＮＡ挿入断片の境界配列は、付随的なベクターに由来する骨格ＤＮＡが植物のゲノムに組み込まれない可能性が増大するように改変することができる。
本明細書で使用される場合、「チップ（ｃｈｉｐ）」という用語は、ジャガイモの薄いスライスをカリカリという音をたてるようになるまで、じっくり揚げたかまたは焼いたものである。ポテトチップ（ｐｏｔａｔｏ ｃｈｉｐ）は、一般には、前菜、付け合わせ、または軽食として出される。チップは、ポテトチップ（ｃｒｉｓｐ）としても公知である。
本明細書で使用される場合、本記載および特許請求の範囲において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞およびその活用は、非限定的な意味で使用され、その単語の次に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が除去されるものではないことを意味する。
本明細書で使用される場合、ある特定の要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」組成物は、それらの要素、ならびに、本発明の組成物の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない要素の包含に限定される。したがって、組成物が本開示の基本的かつ新規の特性に影響を及ぼさない、すなわち、選択された植物種にも選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物にも由来するものではない外来ＤＮＡを含有しない限りは、その組成物は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉で特徴付けられる本発明の組成物の構成成分とみなすことができる。
本明細書で使用される場合、用語「子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）」は、子葉（ｓｅｅｄ ｌｅａｆ）の一種である。子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）は、種子の養分貯蔵組織を含有する。
本明細書で使用される場合、用語「縮重プライマー」は、類似しているが厳密な相同ではない配列とハイブリダイズした際の塩基ミスマッチに適応させることができる十分なヌクレオチド変動を含有するオリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、用語「双子葉植物」または「双子葉類」は、胚に子葉（ｓｅｅｄ ｌｅａｆ）または子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）を２つ有する顕花植物である。双子葉類の例としては、これだけに限定されないが、タバコ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、アルファルファおよびダイズを含めたマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ミント、カボチャ、ヒナギク、およびサボテンが挙げられる。
本明細書で使用される場合、本開示による用語「ＤＮＡ挿入断片」は、植物のゲノムに挿入されるＤＮＡ挿入断片が、その植物に対してネイティブなポリヌクレオチド配列を含むか、またはその植物に対してネイティブな遺伝子エレメントを有することを意味する。一実施例では、例えば、本開示のジャガイモ品種Ｊ３のＤＮＡ挿入断片は、ジャガイモもしくは野生ジャガイモ、または有性生殖適合性のジャガイモ植物体に対してネイティブであり、形質転換の際に植物細胞のゲノムに安定に組み込まれ、打撲黒斑の発現、アスパラギンの蓄積、および老化により甘くなることに関与する遺伝子をサイレンシングする、１０，１４７ｂｐの非コードポリヌクレオチドである。ＤＮＡ挿入断片は、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと称される形質転換ベクターに挿入されることが好ましい。第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターの間に逆方向反復として配置された、アスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ１）遺伝子とポリフェノールオキシダーゼ−５（Ｐｐｏ５）遺伝子の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に塊茎において活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１のカセットと同じＡｇｐプロモーターおよびＧｂｓｓプロモーターに作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターの断片で構成される。これらの発現カセットは、選択された植物種に由来するか、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物に由来するＤＮＡのみを含有する。
本明細書で使用される場合、用語「非天然ヌクレオチド接合部」または「天然には存在しないヌクレオチド接合部」は、天然には存在しないヌクレオチドの配列を指す。もっと正確に言えば、これらの配列は、遺伝子形質転換事象により形成される。上述の通り、本明細書に記載されている遺伝子形質転換事象は、ネイティブでないジャガイモＤＮＡを含有しない発現カセットを用いて創出される。したがって、これらの非天然ヌクレオチド接合部は、ジャガイモヌクレオチドで構成されるが、これらのヌクレオチドは、天然には存在しないがジャガイモの遺伝子形質転換の間になされた人間による操作の結果生じた遺伝子配置にある。表６にこれらの接合部配列の実施形態を記載する。事象特異的接合部配列に関して、表６に、接合部の一方の側には形質転換されたジャガイモに由来するヌクレオチドが見出され、接合部の他方の側には形質転換事象を介して挿入されたヌクレオチドが見出されることを例示する。したがって、事象特異的接合部配列に関しては、非天然ヌクレオチド接合部は、挿入されたヌクレオチドとジャガイモ植物体のネイティブなヌクレオチドが合わさる境界を表す。表６には構築物接合部も例示する。これらの独特の接合部配列は、形質転換事象の全てに存在し、特定の事象に特異的なものではなく、ｐＳＩＭ１２７８構築物および／またはｐＳＩＭ１６７８構築物を利用して形質転換を行った事象のいずれにも存在する。これらの接合部は、構築物内に含有される種々の遺伝子エレメントの配列、例えば、ＡＳＮおよびＰＰＯ（ＡＳＮ／ＰＰＯ）エレメントが一緒になる接合部を表す。これらの構築物特異的接合部は、図５を参照して容易に可視化される。
本明細書で使用される場合、用語「効率」は、リアルタイムＰＣＲアッセイの特質を指す。理想的なｑＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）反応の効率は、１００％、傾き−３．３２であり、これは、各サイクル中のＰＣＲ産物の完全な倍加と相関する。しかし、−３．１から−３．６の間の傾き、９０％から１１０％の間の効率が一般に許容されるとみなされる（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ， Ｃ． Ａ．（２００９年）。Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＧＭＯ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ＧＭＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＥＮＧＬ）、（２００８年１０月）、１〜８頁）。効率は、反復検量線によって確立される。増幅効率は、検量線の対数線形部分の傾きから決定し、Ｅ＝（１０（−１／傾き）−１）＊１００として算出する。（Ｂｕｓｔｉｎ， Ｓ． Ａ．ら（２００９年）。Ｔｈｅ ＭＩＱＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５巻（４号）、１〜１２頁、ｄｏｉ： １０．１３７３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ． ２００８．１１２７９７）。
本明細書で使用される場合、用語「胚」は、成熟種子中に含有される未成熟の植物体である。
本明細書で使用される場合、用語「事象」は、１つの植物細胞において起こり、次いでトランスジェニック植物全体を作出するために使用される、独特のＤＮＡ組換え事象を指す。植物細胞を、目的のＤＮＡ挿入断片を有するバイナリー形質転換ベクターを用いて形質転換する。形質転換された細胞はトランスジェニック植物まで再生し、得られたトランスジェニック植物のそれぞれは、独特の事象を表す。サザンブロットハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどの分子技法を使用して、形質転換された事象のそれぞれを確認する。引き出された事象のそれぞれは、略語（例えば、Ｊ３）によって識別される。異なる事象は、細胞ゲノム内のＤＮＡ挿入断片のコピーの数、ＤＮＡ挿入断片コピーの配置および／またはＤＮＡ挿入断片のゲノム内での位置に差異を有する。ＤＮＡ挿入断片内の遺伝子の最適な発現および形質の表示をもたらす事象をさらに分析および試験することができる。
本明細書で使用される場合、核酸に関する用語「外来」は、核酸が、非植物生物に由来する、または形質転換しようとする植物体と同じ種ではない植物体に由来する、または、形質転換しようとする植物体と交配できない植物体に由来する、または標的植物体の種に属さないことを意味する。本開示によると、外来ＤＮＡまたはＲＮＡは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳動物、魚類または鳥類の遺伝子構造には天然に存在するが、形質転換しようとする植物体には天然に存在しない核酸を表す。したがって、外来核酸は、例えば、形質転換された植物によって自然に産生されないポリペプチドをコードする核酸である。外来核酸は、タンパク質産物をコードする必要はない。本開示によると、所望の遺伝子内植物（ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ）は、そのゲノム内にいかなる外来核酸も組み込まれていない植物である。
本明細書で使用される場合、用語「フレーク」は、加熱調理し、すりつぶし、脱水して、熱水または牛乳を添加することによって再構成し、それによりマッシュポテトに非常に近いものを作製することができる、包装されたインスタント食品をもたらす工業プロセスを通じて創出されるジャガイモフレークを指す。
本明細書で使用される場合、用語「フライ」は、じっくり揚げた棒状のジャガイモである。フライは、揚げたジャガイモの細長い小片であり、熱い状態で出され、軟らかいかまたはカリカリであり、一般には昼食または夕食に付随して食されるか、または軽食として食される。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、コード領域を指し、その領域の５’側または３’側のヌクレオチド配列を含まない。機能的な遺伝子は、プロモーターまたはターミネーターに作動可能に連結したコード領域である。遺伝子は、異なる種に由来するか同じ種に由来するかにかかわらず、種のゲノムに、形質転換または種々の育種方法を使用して導入することができる。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子変換された」または「変換」は、戻し交配技法によって、遺伝子工学によって、または変異によって、ある品種の所望の形態学的特性および生理的特性の基本的に全てを、当該品種に移入される１つまたは複数の遺伝子に加えて回復させる、戻し交配と称される植物育種技法によって開発された植物を指す。１つまたは複数の遺伝子座も移入することができる。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子再構成」は、遺伝物質の新しい組織化が導入される、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて自然に起こり得る遺伝子エレメントの再会合を指す。例えば、異なる染色体の遺伝子座にあるポリヌクレオチドの一緒になったスプライシングが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて植物発生および有性組換えのどちらの間にも自然に起こり得る。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける非天然遺伝子改変技法による遺伝子エレメントの組換えは、同じくｉｎ ｖｉｖｏにおける有性組換えを通じて起こり得る組換え事象と類似している。
本明細書で使用される場合、用語「胚軸」は、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）と根の間の胚または実生の部分である。したがって、胚軸は、苗条と根の間の移行部とみなすことができる。
本明細書で使用される場合、用語「インフレーム」は、以下を意味する。ヌクレオチドトリプレット（コドン）が植物細胞において所望の組換えタンパク質の新生アミノ酸配列に翻訳される。具体的には、本開示は、第１の核酸が読み枠内で第２の核酸と連結しており、第１のヌクレオチド配列は遺伝子であり、第２のヌクレオチドはプロモーターまたは同様の調節エレメントであることを意図している。
本明細書で使用される場合、用語「組み込む」は、選択された植物種に由来する、または選択された植物と同じ種由来の植物に由来する、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物に由来する核酸配列を、選択された植物種の細胞のゲノムに挿入することを指す。「組み込み」とは、ネイティブな遺伝子エレメントのみを植物細胞ゲノムに組み入れることを指す。例えば相同組換えによってネイティブな遺伝子エレメントを組み込むために、本開示では、ネイティブでないＤＮＡを、そのようなプロセスにおけるステップとして「使用」することができる。したがって、本開示では、特定のＤＮＡ分子の「使用」と特定のＤＮＡ分子の植物細胞ゲノムへの「組み込み」は区別される。
本明細書で使用される場合、用語「導入」は、感染、トランスフェクション、形質転換または形質導入を含めた方法によって核酸配列を細胞に挿入することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、その通常のネイティブな環境から物理的に分離された任意の核酸または化合物を指す。単離された材料は、例えば溶媒、緩衝液、イオン、または他の構成成分を含有する適切な溶液中で維持することができ、精製された形態であっても精製されていない形態であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「疫病」は、ジャガイモ植物体の葉、茎、果実、および塊茎に感染し、それらを破壊し得る、卵菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって引き起こされる、「ジャガイモの疫病」としても公知のジャガイモの病害を指す。
本明細書で使用される場合、用語「リーダー」は、遺伝子に先行する（または遺伝子の５’側にある）、転写されるが翻訳はされない配列を指す。
本明細書で使用される場合、用語「検出のレベル」または「ＬＯＤ」は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ＧＭＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに従って単一の実験室による検証によって実証される、確実に検出することができるが、必ずしも定量化されない、試料中の分析物の最低の量または濃度である。
本明細書で使用される場合、用語「直線性」は、最適化されたリアルタイムＰＣＲアッセイの特質を指し、線形回帰分析によって得られるＲ２値によって決定され、Ｒ２値は≧０．９８であるべきである（Ｂｕｓｔｉｎら、２００９年）。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座」は、例えば、雄性不稔性、除草剤耐性、昆虫抵抗性、病害抵抗性、蝋様デンプン、脂肪酸代謝の改変、フィチン酸代謝の改変、炭水化物代謝の改変、およびタンパク質代謝の改変などの、１つまたは複数の形質を付与するものである。形質は、例えば、戻し交配、自然変異もしくは誘導された変異によって品種のゲノムに導入された天然に存在する遺伝子、または遺伝子形質転換技法によって導入された導入遺伝子により、付与され得る。遺伝子座は、単一の染色体上の位置に組み込まれた１つまたは複数の対立遺伝子を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「市場性のある収量」は、直径２インチから４インチの間である、収穫される全ての塊茎の重量である。市場性のある収量は、ｃｗｔ（ハンドレッドウェイト）単位で測定され、ｃｗｔ＝１００ポンドである。
本明細書で使用される場合、用語「単子葉植物」または「単子葉類（ｍｏｎｏｃｏｔ）」は、胚に子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）または子葉（ｓｅｅｄ ｌｅａｆ）を１つ有する顕花植物である。単子葉類の例としては、これだけに限定されないが、芝草、トウモロコシ、イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、およびヤシが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ネイティブ」な遺伝子エレメントとは、形質転換しようとする植物のゲノムに天然に存在する、それを起源とする、またはそれに属する核酸を指す。したがって、形質転換しようとする植物体もしくは植物種のゲノムから単離されたか、または、形質転換しようとする植物種に対して有性生殖適合性または交配可能である植物体もしくは種から単離された核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ分子はいずれも、その植物種に対して「ネイティブ」である、すなわち、その植物種に固有である。言い換えれば、ネイティブな遺伝子エレメントとは、古典的な植物育種を通じて植物を改善するために植物育種家が利用可能な全ての遺伝物質を表す。本開示によると、ネイティブな核酸の任意のバリアントも「ネイティブ」とみなされる。この点において、「ネイティブ」な核酸は、植物またはその有性生殖適合性の種から単離し、得られるバリアントが、植物から単離された改変されていないネイティブな核酸と、ヌクレオチド配列が、９９％またはそれ超、９８％またはそれ超、９７％またはそれ超、９６％またはそれ超、９５％またはそれ超、９４％またはそれ超、９３％またはそれ超、９２％またはそれ超、９１％またはそれ超、９０％またはそれ超、８９％またはそれ超、８８％またはそれ超、８７％またはそれ超、８６％またはそれ超、８５％またはそれ超、８４％またはそれ超、８３％またはそれ超、８２％またはそれ超、８１％またはそれ超、８０％またはそれ超、７９％またはそれ超、７８％またはそれ超、７７％またはそれ超、７６％またはそれ超、７５％またはそれ超、７４％またはそれ超、７３％またはそれ超、７２％またはそれ超、７１％またはそれ超、７０％またはそれ超、６９％またはそれ超、６８％またはそれ超、６７％またはそれ超、６６％またはそれ超、６５％またはそれ超、６４％またはそれ超、６３％またはそれ超、６２％またはそれ超、６１％またはそれ超、または６０％またはそれ超、同様になるように、改変するかまたは変異させることもできる。ネイティブな核酸バリアントは、ヌクレオチド配列が、約６０％未満、約５５％未満、または約５０％未満、同様であってもよい。植物から単離された「ネイティブ」な核酸は、その核酸から転写および翻訳される天然に存在するタンパク質産物のバリアントをコードしてもよい。したがって、ネイティブな核酸は、核酸を単離した植物において発現される改変されていないネイティブなタンパク質と、アミノ酸配列が、９９％またはそれ超、９８％またはそれ超、９７％またはそれ超、９６％またはそれ超、９５％またはそれ超、９４％またはそれ超、９３％またはそれ超、９２％またはそれ超、９１％またはそれ超、９０％またはそれ超、８９％またはそれ超、８８％またはそれ超、８７％またはそれ超、８６％またはそれ超、８５％またはそれ超、８４％またはそれ超、８３％またはそれ超、８２％またはそれ超、８１％またはそれ超、８０％またはそれ超、７９％またはそれ超、７８％またはそれ超、７７％またはそれ超、７６％またはそれ超、７５％またはそれ超、７４％またはそれ超、７３％またはそれ超、７２％またはそれ超、７１％またはそれ超、７０％またはそれ超、６９％またはそれ超、６８％またはそれ超、６７％またはそれ超、６６％またはそれ超、６５％またはそれ超、６４％またはそれ超、６３％またはそれ超、６２％またはそれ超、６１％またはそれ超、または６０％またはそれ超、同様であるタンパク質をコードしてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する核酸」は、選択された植物種のゲノム内に見出され、ＤＮＡ分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。植物種のゲノム内に通常存在する制限部位の配列は、ベクターまたはオリゴヌクレオチドなどの外因性ＤＮＡ分子に、その制限部位がそのゲノムから物理的に単離されていないにもかかわらず、工学的に操作して入れることができる。したがって、本開示では、制限酵素認識配列などのヌクレオチド配列を、その配列が選択された植物種のゲノムまたは形質転換しようとする選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物体において天然に存在する限りは、合成により創出することが可能になる。
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、２つまたはそれ超の分子を、植物細胞においてそれらが組み合わさって適正に機能するように組み合わせることを意味する。例えば、プロモーターにより構造遺伝子の転写が制御される場合、そのプロモーターは、構造遺伝子に作動可能に連結している。
本明細書で使用される場合、用語「植物」は、これだけに限定されないが、被子植物および裸子植物、例えば、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、サトウダイコン、キャッサバ、サツマイモ、ダイズ、トウモロコシ、芝草、コムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、エンバク、オーク、ユーカリ、クルミ、およびヤシなどを含む。したがって、植物は、単子葉類であっても双子葉類であってもよい。単語「植物」は、本明細書で使用される場合、有性生殖によって生じたか無性生殖によって生じたかにかかわらず、植物細胞、種子、植物後代、むかご、および、これらのいずれかの後裔、例えば、挿し木または種子なども包含する。植物細胞は、懸濁培養物、カルス、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子を含む。植物は、成熟度が種々の段階であってよく、液体または固体培養物中で生育させることもでき、鉢、温室または圃場において土壌または適切な培地で生育させることもできる。植物における導入されたリーダー、トレーラーまたは遺伝子配列の発現は一過性であっても恒久的であってもよい。「選択された植物種」は、これだけに限定されないが、これらの「植物」の任意の１つの種であってよい。
本明細書で使用される場合、用語「植物体の一部」（またはジャガイモ植物体、またはその一部）は、これだけに限定されないが、プロトプラスト、葉、茎、根、根端、葯、雌ずい、種子、胚、花粉、胚珠、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、胚軸、花、塊茎、芽、組織、葉柄、細胞、分裂組織細胞などを含む。
本明細書で使用される場合、用語「植物種」は、少なくともいくらかの有性生殖適合性を示す、種々の公式に名付けられた植物種に属する植物の群である。
本明細書で使用される場合、用語「植物の形質転換」および「細胞培養」は、植物細胞を遺伝子改変し、維持、さらなる生育、および／またはさらなる発達のために適切な植物培養培地に移すプロセスを広範に指す。
本明細書で使用される場合、用語「的確な育種」は、選択された植物種から、または選択された植物と同じ種の別の植物から、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の種から単離されたネイティブな遺伝子および調節エレメントなどの核酸を、個々の植物細胞に安定に導入し、その後、これらの遺伝子改変された植物細胞を植物全体に再生させることによって植物を改善することを指す。未知または外来の核酸は植物のゲノムに恒久的には組み入れられないので、本発明の技術では、従来の植物育種によっても利用可能である同じ遺伝物質を使用する。
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」は、目的の核酸配列とアニーリングするオリゴヌクレオチドである。プライマーは、核酸合成の開始点としての機能を果たす。このプロセスを触媒する酵素であるＤＮＡポリメラーゼにより、新しいヌクレオチドがＤＮＡプライマーの３’末端に付加され、逆の鎖がコピーされる。例えば、目的のＤＮＡ配列と相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて使用して、目的のＤＮＡ領域を増幅する。
本明細書で使用される場合、用語「プローブ」は、放射性標識、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはフルオレセインなどの検出可能な分子で標識されたオリゴヌクレオチドであり、目的の核酸配列と相補的である。例えば、５’末端が６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で標識され、３’末端がＢＨＱ１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）１）で標識されたプローブをリアルタイムＰＣＲにおいて使用して目的の核酸配列を検出する。しかし、プローブという用語は、より一般的に、プローブにｒ標識が付着しているかどうかに関係なく、天然には存在しないヌクレオチド接合部配列に結合することが可能なヌクレオチド配列を指すためにも使用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「後代」は、２つのジャガイモ植物体の交配から生じたＦ１ジャガイモ植物体を含み、後代は、これだけに限定されないが、その後の、反復親系統とのＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、およびＦ１０世代の交配をさらに含む。
本明細書で使用される場合、用語「定量的形質遺伝子座」（ＱＴＬ）とは、通常は継続的に分布する、数値で表すことが可能な形質をいくらかの程度まで制御する遺伝子座を指す。
本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、遺伝子をクローニングすることができ、ＤＮＡについて配列決定することができ、タンパク質産物を産生させることができる種々の技術を広範に説明する。本明細書で使用される場合、この用語はまた、植物宿主系の細胞に遺伝子を移入した後に産生されたタンパク質も説明する。
本明細書で使用される場合、用語「再生」は、組織培養物からの植物の発達を指す。
本明細書で使用される場合、用語「調節配列」は、植物系における目的の遺伝子の転写または結果として得られるＲＮＡの翻訳を増大させ、かつ／または最大にするために発現ベクターに含めることができる、当業者には標準であり公知の配列を指す。それらとしては、これだけに限定されないが、プロモーター、ペプチド移出シグナル配列、イントロン、ポリアデニル化、および転写終結部位が挙げられる。植物における発現レベルが上昇するように核酸構築物を改変する方法も当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｇｅｒｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０巻、３７３１〜３８頁、１９８５年；Ｃｏｒｎｅｊｏら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３巻：５６７：８１、１９９３年を参照されたい）。タンパク質の転写の速度に影響を及ぼすための植物系の工学的操作では、正または負に作用する配列、エンハンサーおよびサイレンサーなどの調節配列、ならびにクロマチン構造を含めた、当技術分野で公知の様々な因子が影響を及ぼし得る。本開示は、目的のタンパク質を発現させるために植物を工学的操作するのに利用することができる、これらの因子の少なくとも１つを提供する。本開示の調節配列は、ネイティブな遺伝子エレメントである、すなわち、選択された改変しようとする植物種から単離されたものである。
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー」は、一般には、抗生物質、除草剤または毒性化合物に対するある種の抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、形質転換事象を同定するために使用される。選択マーカーの例としては、ストレプトマイシン抵抗性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｓｐｔ）遺伝子、マンノース−６−リン酸をフルクトース−６リン酸に変換するホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子；カナマイシンおよびジェネテシン抵抗性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する抵抗性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔまたはａｐｈｉｖ）遺伝子、スルホニル尿素型除草剤に対する抵抗性をコードするアセト乳酸合成酵素（ａｌｓ）遺伝子、ホスフィノトリシンまたはバスタ（ｂａｓｔａ）などの、グルタミン合成酵素の作用が阻害されるように作用する除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子（例えば、ｂａｒ遺伝子）、または当技術分野で公知の他の同様の遺伝子が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「センス抑制」は、トランスジェニック植物において、内在性遺伝子の発現を、その遺伝子の全部または一部の１つまたは複数の追加的なコピーを発現させることによって低減させることである。
本明細書で使用される場合、用語「比重」は、密度の表現であり、ジャガイモ品質の尺度である。塊茎の比重およびデンプン含有量および乾物または総固形物の百分率の間には高い相関がある。比重が高いほど、加工製品の回収率が高くなり、かつ、品質がより良好になる。
用語「ストリンジェントな条件」は、本明細書で使用される場合、特異的なハイブリッドが形成されるが、非特異的なハイブリッドは形成されないか、または形成される可能性がはるかに低くなる条件を指す。例えば、ストリンジェントな条件は、天然には存在しないヌクレオチド接合部のＤＮＡに対する相同性が高い（９０％もしくはそれ超、または９５％もしくはそれ超）ＤＮＡ（例えば、プローブ）−例えば、表６の配列に対する相同性が高い配列を有するプローブ配列−が前記配列とハイブリダイズするような条件であり得る。ストリンジェントな条件とは、完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃〜約３０℃（複数の態様では、約１０℃〜約２５℃）低い温度でハイブリダイゼーションが起こるような条件を指し得る。例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）（特に、§１１．４５、「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件）に記載されている条件を、ストリンジェントな条件として使用することができる。したがって、２つの核酸配列が実質的に相同であるという指標は、その２つの分子がストリンジェントな条件下で互いとハイブリダイズすることである。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境パラメータの下では異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、所与のＤＮＡ配列の全ての分子の５０％がハイブリダイズして２本鎖になり、５０％が１本鎖として存在する、摂氏での温度と定義される。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ−ＤＮＡ様」配列は、選択された植物種から、または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物から単離された核酸配列であり、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｔ−ＤＮＡと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％であるが１００％ではない配列同一性を共有する。Ｔ−ＤＮＡ様配列は、それぞれが、ヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチドに組み込むことが可能な１つまたは複数の境界または境界様配列を含有してよい。
本明細書で使用される場合、用語「総収量」は、収穫された塊茎全ての総重量を指す。
本明細書で使用される場合、用語「トレーラー」は、遺伝子の後に続く（または遺伝子の３’側にある）、転写されるが翻訳はされない配列を指す。
本明細書で使用される場合、用語「転写されたＤＮＡ」は、遺伝子と、その遺伝子に付随する非翻訳リーダー配列およびトレーラー配列の両方を含むＤＮＡである。遺伝子は、前述のプロモーターの作用により、単一のｍＲＮＡとして転写される。
本明細書で使用される場合、用語「植物細胞の形質転換」は、ＤＮＡが植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるプロセスである。「安定に」とは、細胞ゲノムにおける、および細胞ゲノムによるポリヌクレオチドの恒久的な、または一過性ではない保持および／または発現を指す。したがって、安定に組み込まれたポリヌクレオチドは、形質転換された細胞ゲノム内の定着物（ｆｉｘｔｕｒｅ）であり、細胞または得られた形質転換された植物の連続的な後代を通じて複製および繁殖させることができるポリヌクレオチドである。形質転換は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して、天然の条件下で行うこともでき、人工的な条件下で行うこともできる。形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換プロトコール、ウイルス感染、ウィスカー、電気穿孔、熱ショック、リポフェクション、ポリエチレングリコール処理、微量注入、および微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を含めた、原核生物または真核生物宿主細胞に核酸配列を挿入するための任意の公知の方法に依拠するものであってよい。
本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、宿主ゲノムに挿入される遺伝子である。
本明細書で使用される場合、用語「トランスジェニック植物」は、少なくとも１つの導入遺伝子を含有する、遺伝子改変された植物である。
本明細書で使用される場合、用語「塊茎」は、栄養分を貯蔵するために大きくなる、改変された植物構造の一種を指す。塊茎は、植物が、冬または乾燥した数カ月に生き残るため、次の生育時期中の再生育のためのエネルギーおよび栄養分をもたらすため、および無性生殖の手段として、使用される。塊茎は、茎または根に由来し得る。ジャガイモは、茎の塊茎である。
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、特定の遺伝子またはタンパク質の標準または所与のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から逸脱したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を意味するものと理解される。用語「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「類似体」も、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「バリアント」形態を指す。１つまたは複数のアミノ酸の付加、除去もしくは置換、またはヌクレオチド配列の変化により変更されたアミノ酸配列は、「バリアント」配列とみなすことができる。バリアントは、置換アミノ酸が同様の構造的または化学的性質を有する「保存的」変化、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置き換えを有してよい。バリアントは、「非保存的」変化、例えば、グリシンのトリプトファンでの置き換えを有してよい。類似の軽微な変動は、アミノ酸の欠失または挿入、またはその両方を含んでもよい。どのアミノ酸残基を置換する、挿入する、または欠失させることができるかの決定の手引きは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ、ＭＤ）ソフトウェアなどの、当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。
本明細書で使用される場合、用語「つるの成熟度」は、植物の、炭水化物の利用および光合成を続ける能力を指す。つるの成熟度は、１〜５のスケールにスコア化され、ここで、１＝枯れたつるであり、５＝まだ開花する緑色のつるである。
Ｉｎｎａｔｅ（商標）技術
ジャガイモは、四倍体であり、高度にヘテロ接合性であり、かつ近交弱勢に対して感受性であるので、ジャガイモ植物体のゲノムへの望ましい形質の挿入には特定の難しさがある。したがって、従来の育種を使用すると、加工中のアクリルアミドの生成が少なく、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−（３−ケト−１，２−ブタンジオール）−３’−ニトロチラミン（Ｗａｎｇら、Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ、７０巻：１０〜５頁、１９９５年）、５−ヒドロキシメチル−２−フルフラール（Ｊａｎｚｏｗｓｋｉら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ、３８巻：８０１〜９頁、２０００年）、および変異原性を有する他のメイラード反応生成物（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ、Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ、３０４巻：３５９〜７６頁、１９８９年）を含めた有害なメイラード反応生成物が少ないトランスジェニックジャガイモ植物体を効率的に開発することが非常に難しい。
加工の変化、デキストロースの低減、ならびにアスパラギナーゼ、クエン酸塩、および競合アミノ酸などの添加物を通じてアクリルアミドを低減するためのいくつかの方法が試験されており、研究が進行中である。ジャガイモ産業全体を通して加工の変化を実行するために必要な資本支出は、数百万ドルかかる。支出に加えて、これらの加工の変化には、アスパラギナーゼまたはクエン酸塩などの添加物に付随する潜在的に負のフレーバーを含めた重大な欠点がある。一般には、フライ製造者は、フレンチフライの加工中、所望の黄金色を発生させるためにデキストロースを添加するが、デキストロースはまた、メイラード反応によるアクリルアミドの形成も増加させる。ただ単に加工からデキストロースを取り除くことによってアクリルアミドの有意な減少が起こるが、そうすると、特徴的な黄金色をいくつかの他のやり方（例えば、アナトーのような着色料を添加することによってなど）で発生させなければならない。代替の着色料を使用することにより、これらの褐色化反応によって発生する典型的なフレーバーが存在しなくなる。アスパラギンのような反応物を減少させるために添加物を使用することに伴う別の難題は、凍結貯蔵中に水分移行が起こり、その結果、アスパラギンが表面に戻ってアクリルアミドが増加することである。最後に、ジャガイモが打撲を受けた後に起こる黒変が、フレンチフライおよびチップの加工における品質および回収率に影響を及ぼす。損傷し、打撲を受けたジャガイモは、不要な部分を切り取らなければならないか、または加工前に拒絶され、その結果、品質の問題または経済的損失が生じる。
Ｉｎｎａｔｅ（商標）技術についての記載では、植物体を創出するために全てが共に機能する植物生物システムが概略されている。これらは、形質同定、ベクターの設計、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへのベクターの組み入れ、レシピエントジャガイモ品種の選択、植物の形質転換、および新しいジャガイモが予測ＤＮＡ挿入断片を含有することの確認を含む。Ｉｎｎａｔｅ（商標）法により、非コードＤＮＡをジャガイモに挿入して、植物に対して厄介なものではない所望の形質を伴う新しいジャガイモ事象を生じさせることが可能になる。
本開示の「ネイティブな技術」戦略は、ジャガイモの農業特性および栄養価を改善するというジャガイモ産業の必要性に、打撲黒斑の原因であるポリフェノールオキシダーゼ−５（Ｐｐｏ５）の発現、アクリルアミド形成における前駆物質であるアスパラギンの蓄積の原因であるアスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ１）の発現、ならびに／または、通常はアスパラギンなどのアミノ酸と反応し、アクリルアミドを含めた毒性メイラード生成物を形成する還元糖の蓄積に関連する酵素であるホスホリラーゼ−Ｌおよびジキナーゼ−Ｒ１の発現を低減させることによって対処するものである。
塊茎におけるこれらの遺伝子の部分的なまたは完全なサイレンシングにより、アクリルアミドが生成する潜在性が低下する。本開示のＩｎｎａｔｅ（商標）技術の使用により、商業的に有益なジャガイモ植物体品種のゲノムに、ジャガイモを、ジャガイモ植物体またはジャガイモ植物体に対して有性生殖適合性である植物体から得られた、非コード調節領域を含む遺伝物質である「ネイティブな」遺伝物質のみを用いて形質転換することにより、いかなる外来遺伝物質も植物のゲノムに組み込むことなく望ましい形質を組み入れることが可能になる。
望ましい形質としては、衝撃に誘導される打撲黒斑に対する高い耐性、アクリルアミドを含めた毒性メイラード生成物の蓄積の減少を結果として伴う、アクリルアミド前駆物質アスパラギンの形成の減少および還元糖の蓄積の減少、品質の改善、ならびに食品の色の制御が挙げられる。これらの望ましい形質を既存のジャガイモ品種に組み入れることは従来の育種によっては実現不可能である。なぜなら、ジャガイモは、四倍体であり、高度にヘテロ接合性であり、かつ近交弱勢に対して感受性であるからである。
本開示において使用する非コードジャガイモ植物体ＤＮＡ挿入断片配列は、ジャガイモ植物体ゲノムに対してネイティブであり、いかなるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＤＮＡも含有しない。ＤＮＡ挿入断片は、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと称される形質転換ベクターに挿入されることが好ましい（米国特許第８，７５４，３０３号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｊ３」；米国特許第８，７１０，３１１号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｆ１０」；米国特許第８，８８９，９６３号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｊ５５」；および米国特許出願第１４／０７２，４８７号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｅ１２」；および、ｐＳＩＭ１６７８ベクターも有する、米国特許第８，８８９，９６４号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｗ８」に記載されている。これらの特許および出願のそれぞれが、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。
第１のカセットは、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターの間に逆方向反復として配置された、アスパラギンシンテターゼ−１（Ａｓｎ１）遺伝子とポリフェノールオキシダーゼ−５（Ｐｐｏ５）遺伝子の両方の断片を含む。これらのプロモーターは、主に塊茎において活性である。
第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１のカセットと同じＡｇｐプロモーターおよびＧｂｓｓプロモーターに作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）遺伝子のプロモーターの断片で構成される。これらの発現カセットは外来ＤＮＡを含有せず、選択された植物種または選択された植物種に対して有性生殖適合性の植物に由来するＤＮＡのみからなる。
第２のＤＮＡ挿入断片は、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１発現カセットおよび植物液胞インベルターゼ遺伝子、ＶＩｎｖに対するサイレンシングカセットを含む、ｐＳＩＭ１６７８と称される形質転換ベクター（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８８９，９６４号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｗ８」に記載されている）によってもたらされる。Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子カセットは、疫病に対する広範な抵抗性を付与する、そのネイティブなプロモーター配列およびターミネーター配列によって調節されるＶＮＴ１タンパク質コード領域からなり、一方、サイレンシングカセットは、対向する植物プロモーター、ｐＧｂｓｓおよびｐＡｇｐで挟まれた、ジャガイモＶＩｎｖ遺伝子由来の配列の逆方向反復からなる。第１のカセットの機能は、疫病に対する抵抗性を付与することであり、一方、第２のカセットの機能は、液胞インベルターゼ遺伝子をサイレンシングし、それにより、グルコースおよびフルクトースを減少させることである。
ネイティブなＤＮＡを用いた標的化された遺伝子サイレンシングにより、ジャガイモ事象の塊茎における標的化された遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが低下する。一般に、挿入ＤＮＡは、発現させると、サイズが一様でなく、プロセシングされていない転写物が生じるサイレンシングカセットを含有する。これらの転写物により、通常アスパラギンシンテターゼのような酵素をコードするｍＲＮＡの分解が誘発される。この結果、標的化された「サイレンシングされる」酵素のレベルがはるかに低下する。
Ａｓｎ１およびＰｐｏ５遺伝子サイレンシングは、さらにデンプン関連遺伝子であるキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）およびホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）を阻害せずに、アクリルアミド形成を２分の１〜４分の１有意に低減させるのに十分である。
したがって、ジャガイモ事象の塊茎には、揚げた時または焼いた時のアクリルアミド形成の低減に関連する、遊離のアミドアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンの比率の低下を含めた、高度に望ましい形質が組み入れられる。具体的には、本開示のジャガイモ品種は、遊離のアスパラギン含有量が２分の１〜４分の１よりも大きく減少することを特徴とする。さらに、本開示のジャガイモ品種は、貯蔵中の、デンプンの還元糖グルコースおよびフルクトースへの分解の遅延を示す。デンプンから糖への変換を損なうことにより、さらに、老化により甘くなることおよびアクリルアミド形成が低減され、熱により誘導される褐変が限定される。さらに、事象Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９はまた、事象Ｊ３、Ｆ１０、Ｊ５５、およびＥ１２に存在するｐＳＩＭ１２７８ベクターに加えたｐＳＩＭ１６７８ベクターの追加的な利用の結果として生じる、疫病に対する抵抗性も示す。
したがって、本開示のジャガイモ品種は、熱による加工の際にそれらの塊茎で生成されるアクリルアミドが有意に少なく、いかなる潜在的に有害な外来遺伝子も保有しないので、ジャガイモ産業および食品市場において非常に価値がある。
上記の有利な特性を組み合わせたジャガイモ品種をもたらす研究は、大部分は経験的なものである。この研究には、時間、労働、および資金の大きな投資が必要である。ジャガイモ栽培品種の開発は、多くの場合、温室から商業的使用までに、８年またはそれ超に至るまでかかり得る。育種は、最も重要な特性を後代に組み入れるために優れた親を慎重に選択することから始まる。通常、ただ１回の交配では所望の形質の全ては出現しないので、育種は累積的でなければならない。
現在の育種技法では、親クローンの制御された受粉が続けられている。一般には、後に雌親を受粉させるのに使用するために花粉をゼラチンカプセル中に収集する。雑種種子を温室内で播種し、何千もの個々の実生から塊茎を収穫し、保持する。翌年、得られた実生のそれぞれから１つ〜４つの塊茎を、ウイルスおよび病害の蔓延を回避するための細心の注意が払われている圃場に植える。この１年目の実生作物から、選択プロセスを生き延びた各雑種個体に由来するいくつかの「種子」塊茎を翌年の植え付けのために保持する。２年目の後、塊茎の商業的使用への適合性を決定するための密度測定およびフライ試験用に試料を取得する。次いで、この点に関して選択プロセスを生き延びた植物を、より包括的な一連のフライ試験および密度決定のために、３年目に体積を拡大して植える。開発の４年目の段階で、残存している選択物を、いくつかの州における圃場試験に供して、異なる生育条件に対するそれらの順応性を決定する。最終的に、優れた品質を有する品種を他の農場に移し、種子を商業規模まで増加させる。一般に、この時までに、新しい改善されたジャガイモ栽培品種を開発するための試みにおいて、植え付け、収穫および試験で８年またはそれ超が投じられている。
特定のタンパク質産物をコードする遺伝子の単離および特徴付けを可能にする分子生物学的技法の出現に伴い、植物生物学の分野の科学者は、植物の形質を特異的に変更するために、植物のゲノムを工学的操作して、外来遺伝子、または追加的なもしくは改変されたバージョンのネイティブなもしくは内在性の遺伝子（おそらく異なるプロモーターによって駆動される）を含有させ、発現させることに強い関心を寄せた。そのような外来の追加的なおよび／または改変された遺伝子は、本明細書では、「導入遺伝子」と総称する。ここ１５〜２０年にわたって、トランスジェニック植物を作製するための方法がいくつか開発されており、本開示は、特定の実施形態では、特許請求された品種または系統の形質転換されたバージョンにも関する。
植物の形質転換には、植物細胞において機能する発現ベクターの構築が伴う。そのようなベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター）の制御下にある、またはそれに作動可能に連結した遺伝子を含むＤＮＡを含む。発現ベクターは、１つまたは複数のそのような作動可能に連結した遺伝子／調節エレメントの組合せを含有してよい。ベクター（複数可）は、プラスミドの形態であってよく、ジャガイモ植物体の遺伝物質（複数可）に導入遺伝子を組み入れるための下記の形質転換方法を使用して形質転換されたジャガイモ植物体をもたらすために、単独で、または他のプラスミドと組み合わせて使用することができる。
従来の植物育種は、一般には、新しい改善された特性を有する品種を創出するために、植物染色体のランダムな組換えに依拠する。標準的な周知の技法によると、遺伝子および調節エレメントを含む遺伝子「発現カセット」を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから単離されたトランスファーＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」）の境界の内側に挿入し、植物のゲノムに組み込む。Ｔ−ＤＮＡ材料のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性移入は、一般には、以下の標準の手順を含む：（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、そのうちの少なくとも１つは、形質転換を選択するための発現カセットを生成するための外来起源のものである、遺伝子エレメントを組換えること（２）この発現カセットを、多くの場合、外来ＤＮＡを含有する少なくとも１つの他の発現カセットと共に、通常はＴ−ＤＮＡの境界配列で挟まれたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＤＮＡの数百の塩基対からなるバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入すること、（３）Ｔ−ＤＮＡの境界の間に位置する配列を、多くの場合、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の追加的なバイナリーベクター配列の一部または全部と共に植物細胞に移入すること、ならびに、（４）収量の増加、生育力（ｖｉｇｏｒ）の改善、病害および昆虫に対する抵抗性の増強、またはストレス下で生存する能力の増大などの所望の形質を示す、安定に形質転換された植物細胞を選択すること。
したがって、遺伝子工学の方法は、ウイルス、細菌および植物に由来する、プロモーターおよびターミネーターなどの調節エレメント、ならびに新規形質の発現に関与する遺伝子または形質転換体を同定および選択するためのマーカーとして機能する遺伝子を含めた外来の非内在性核酸の導入に依拠し得る。マーカー遺伝子は、一般には、細菌性供給源に由来し、抗生物質または除草剤抵抗性を付与するものである。古典的な育種方法は労力を要し、時間がかかるものであり、一般には、新品種の示す改善は比較的わずかである。
「アンチセンス」技術では、ネイティブな遺伝子の配列を逆にして、トランスジェニック植物における遺伝子の発現をサイレンシングする。
ジャガイモ形質転換のための発現ベクター：マーカー遺伝子
発現ベクターは、調節エレメント（例えばプロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つの遺伝子マーカーを含み、それにより、マーカーを含有する形質転換された細胞を、負の選択、すなわち、選択マーカー遺伝子を含有しない細胞の成長を阻害することによって、または、正の選択、すなわち、遺伝子マーカーによりコードされる産物をスクリーニングすることによってのいずれかで回収することが可能になる。植物の形質転換のために一般に使用される多くの選択マーカー遺伝子が形質転換の技術分野で周知であり、それらとして、例えば、抗生物質もしくは除草剤であり得る選択的な化学薬剤を代謝により解毒する酵素をコードする遺伝子、または、阻害剤に対して非感受性の変更された標的をコードする遺伝子が挙げられる。正の選択方法もいくつか当技術分野で公知である。
植物の形質転換のために一般に使用される選択マーカー遺伝子の１つは、植物調節シグナルの制御下にあると、カナマイシンに対する抵抗性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子である。Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０巻：４８０３頁（１９８３年）。別の一般に使用される選択マーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。Ｖａｎｄｅｎ Ｅｌｚｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５巻：２９９頁（１９８５年）。
抗生物質に対する抵抗性を付与する、細菌起源の追加的な選択マーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼおよびアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、ブレオマイシン抵抗性決定因子が挙げられる。Ｈａｙｆｏｒｄら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８６巻：１２１６頁（１９８８年）、Ｊｏｎｅｓら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．、２１０巻：８６頁（１９８７年）、Ｓｖａｂら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４巻：１９７頁（１９９０年）Ｈｉｌｌｅら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７巻：１７１頁（１９８６年）。他の選択マーカー遺伝子は、グリホサート、グルホシネートまたはブロモキシニルなどの除草剤に対する抵抗性を付与するものである。Ｃｏｍａｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７巻：７４１〜７４４頁（１９８５年）、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２巻：６０３〜６１８頁（１９９０年）およびＳｔａｌｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４１９〜４２３頁（１９８８年）。
植物の形質転換のための、細菌起源ではない選択マーカー遺伝子としては、例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼおよび植物アセト乳酸シンターゼが挙げられる。Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． １３巻：６７頁（１９８７年）、Ｓｈａｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３巻：４７８頁（１９８６年）、Ｃｈａｒｅｓｔら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ８巻：６４３頁（１９９０年）。
植物の形質転換のための別のクラスのマーカー遺伝子は、形質転換された細胞を、抗生物質などの毒性物質に対する抵抗性について直接遺伝子選択するのではなく、形質転換されたと推定される植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、遺伝子発現を調査するために遺伝子または遺伝子調節配列と融合することができるので、特定の組織における遺伝子の空間的な発現パターンを定量化または可視化するために特に有用であり、しばしばレポーター遺伝子と称される。形質転換されたと推定される細胞をスクリーニングするために一般に使用される遺伝子としては、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ． Ａ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． ５巻：３８７頁（１９８７年）、Ｔｅｅｒｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． ８巻：３４３頁（１９８９年）、Ｋｏｎｃｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４巻：１３１頁（１９８７年）、ＤｅＢｌｏｃｋら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３巻：１６８１頁（１９８４年）。
植物組織の破壊を必要としない、ＧＵＳ活性を可視化するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２９０８、ＩＭＡＧＥＮＥ ＧＲＥＥＮ、１〜４頁（１９９３年）およびＮａｌｅｗａｙら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１５巻：１５１ａ頁（１９９１年）。しかし、これらのＧＵＳ活性を可視化するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法は、低感度、高蛍光バックグラウンドおよび選択マーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に付随する限定が原因で、形質転換された細胞の回収に有用であることは証明されていない。
一部の態様では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現についてのマーカーとして利用されている。Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３巻：８０２頁（１９９４年）。ＧＦＰおよびＧＦＰの変異体を、スクリーニング可能なマーカーとして使用することができる。
ジャガイモ形質転換のための発現ベクター：プロモーター
発現ベクターに含まれる遺伝子は、調節エレメント、例えば、プロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。他の調節エレメントと同様に、単独で、またはプロモーターと組み合わせて使用することができるいくつかの型のプロモーターが形質転換の技術分野において周知である。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、転写の開始の上流にあり、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡの領域への言及を含む。「植物プロモーター」は、植物細胞における転写を開始することが可能なプロモーターである。発生制御下にあるプロモーターの例としては、葉、根、種子、繊維、木部道管、仮道管、または厚膜組織などのある特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターを「組織優先的（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」と称する。ある特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターを「組織特異的」と称する。「細胞型」特異的プロモーターは、１つまたは複数の器官におけるある特定の細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ）における発現を主に駆動する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼす可能性がある環境条件の例としては、嫌気条件または光の存在が挙げられる。組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導性プロモーターは、「非構成的な」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、大抵の環境条件下で活性なプロモーターである。
Ａ．誘導性プロモーター
誘導性プロモーターは、ジャガイモにおいて発現させる遺伝子に作動可能に連結する。任意選択で、誘導性プロモーターは、ジャガイモにおいて発現させる遺伝子に作動可能に連結しているシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する。誘導性プロモーターを用いると、誘導剤に応答して転写の速度が上昇する。
任意の誘導性プロモーターを本開示において使用することができる。Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２巻：３６１〜３６６頁（１９９３年）を参照されたい。例示的な誘導性プロモーターとしては、これだけに限定されないが、銅に応答する、ＡＣＥＩ系由来のもの（Ｍｅｔｔら、ＰＮＡＳ ９０巻：４５６７〜４５７１頁（１９９３年））；ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｓａｆｅｎｅｒ）に応答する、トウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子（Ｈｅｒｓｈｅｙら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２７巻：２２９〜２３７頁（１９９１年）およびＧａｔｚら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４３巻：３２〜３８頁（１９９４年））、または、Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー（Ｇａｔｚら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２７巻：２２９〜２３７頁（１９９１年））が挙げられる。特に好ましい誘導性プロモーターは、植物が通常応答しない誘導剤に応答するプロモーターである。例示的な誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導性プロモーターであり、その転写活性は糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導される。Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８巻：０４２１頁（１９９１年）。
Ｂ．構成的プロモーター
構成的プロモーターは、ジャガイモにおいて発現させる遺伝子に作動可能に連結するか、または構成的プロモーターは、ジャガイモにおいて発現させる遺伝子に作動可能に連結しているシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している。
多くの異なる構成的プロモーターを本開示において利用することができる。例示的な構成的プロモーターとしては、これだけに限定されないが、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターなどの、植物ウイルスに由来するプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３巻：８１０〜８１２頁（１９８５年））ならびに、イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２巻：１６３〜１７１頁（１９９０年））；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２巻：６１９〜６３２頁（１９８９年）およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８巻：６７５〜６８９頁（１９９２年））；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら、Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８１巻：５８１〜５８８頁（１９９１年））；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３巻：２７２３〜２７３０頁（１９８４年））およびトウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３１巻：２７６〜２８５頁（１９９２年）およびＡｔａｎａｓｓｏｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２巻（３号）：２９１〜３００頁（１９９２年））のような遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＡＬＳ３構造遺伝子に対して５’側にある、ＡＬＳプロモーター、Ｘｂａｌ／Ｎｃｏｌ断片（または前記Ｘｂａｌ／Ｎｃｏｌ断片に対するヌクレオチド配列類似性）は、特に有用な構成的プロモーターである。ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／３０５３０号。
Ｃ．組織特異的または組織優先的プロモーター
組織特異的プロモーターは、ジャガイモにおいて発現させる遺伝子に作動可能に連結する。任意選択で、組織特異的プロモーターは、ジャガイモにおいて発現させる遺伝子に作動可能に連結しているシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した目的の遺伝子を用いて形質転換した植物は、特定の組織において排他的にまたは優先的に、導入遺伝子のタンパク質産物を産生する。
任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを本開示において利用することができる。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターとしては、これだけに限定されないが、ファゼオリン遺伝子に由来するものなどの根優先的プロモーター（Ｍｕｒａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３巻：４７６〜４８２頁（１９８３年）およびＳｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２巻：３３２０〜３３２４頁（１９８５年））；ｃａｂまたはルビスコに由来するものなどの葉特異的かつ光誘導性プロモーター（Ｓｉｍｐｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ． ４巻（１１号）：２７２３〜２７２９頁（１９８５年）およびＴｉｍｋｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８巻：５７９〜５８２頁（１９８５年））；ＬＡＴ５２に由来するものなどの葯特異的プロモーター（Ｔｗｅｌｌら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１７巻：２４０〜２４５頁（１９８９年））；Ｚｍ１３に由来するものなどの花粉特異的プロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４４巻：１６１〜１６８頁（１９９３年））、または、ａｐｇに由来するものなどの小胞子優先的プロモーター（Ｔｗｅｌｌら、Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． ６巻：２１７〜２２４頁（１９９３年））が挙げられる。
タンパク質を細胞内区画に標的化するためのシグナル配列
導入遺伝子によって産生されるタンパク質の、葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁もしくはミトコンドリアなどの細胞内区画への輸送またはアポプラスト内への分泌は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’領域および／または３’領域にシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結することによって達成される。構造遺伝子の５’末端および／または３’末端の標的化配列により、タンパク質合成およびプロセシングの間に、コードされるタンパク質がどこに最終的に区画化されるかを決定することができる。
シグナル配列が存在することにより、ポリペプチドが、細胞内細胞小器官もしくは細胞内区画に、またはアポプラストへの分泌に導かれる。多くのシグナル配列が当技術分野で公知である。例えば、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０巻：４９頁（１９９２年）；Ｃｌｏｓｅ， Ｐ． Ｓ．、Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９３年）；Ｋｎｏｘ， Ｃ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９巻：３〜１７頁（１９８７年）；Ｌｅｒｎｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１巻：１２４〜１２９頁（１９８９年）；Ｆｒｏｎｔｅｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３巻：４８３〜４９６頁（１９９１年）；Ｍａｔｓｕｏｋａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８巻：８３４頁（１９９１年）；Ｇｏｕｌｄら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０８巻：１６５７頁（１９８９年）；Ｃｒｅｉｓｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２巻：１２９頁（１９９１年）；Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ ３９巻：４９９〜５０９頁（１９８４年）；Ｓｔｅｉｆｅｌら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２巻：７８５〜７９３頁（１９９０年）を参照されたい。
Ｓｏｌａｎｕｍ属の分類学
Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ科は、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍとも称される）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｇｅｎａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、コショウ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）およびジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）などの、いくつかの周知の栽培作物を含有する。Ｓｏｌａｎｕｍ属の中で、１，０００種超が認識されている。ジャガイモは、商業用ジャガイモ圃場とその周辺に一般に見出される雑草を含めた、塊茎を持たないＳｏｌａｎｕｍ（トマト、ナスなど）種とは交雑しない（Ｌｏｖｅ、１９９４年）。
Ｓｏｌａｎｕｍ属は、いくつかの下位区分（ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ）に分けられ、そのうち下位区分ｐｏｔａｔｏｅは、塊茎を持つ全てのジャガイモを含有する。下位区分ｐｏｔａｔｏｅは、系（ｓｅｒｉｅｓ）に分けられ、そのうちｔｕｂｅｒｏｓａが本文書に関連する。系ｔｕｂｅｒｏｓａの中では、野生ジャガイモおよび栽培ジャガイモがおよそ５４種見出される。これらのうちの１つがＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。
Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍは、２つの亜種：ｔｕｂｅｒｏｓｕｍおよびａｎｄｉｇｅｎａに分けられる。亜種ｔｕｂｅｒｏｓｕｍは、例えば北アメリカおよびヨーロッパにおいて作物として広範に使用されている栽培ジャガイモである。亜種ａｎｄｉｇｅｎａも栽培種であるが、栽培は中南米に限られている（Ｈａｎｎｅｍａｎ、１９９４年）。
米国における野生ジャガイモ
米国の領土内で生育しており、その標本が遺伝子バンク内に存在する野生ジャガイモ種は２つのみであり、それらは、四倍体種Ｓ．ｆｅｎｄｌｅｒｉ（最近、Ｓ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒｕｍとして再分類されたが、Ｉｎｔｅｒ−ｇｅｎｅｂａｎｋ Ｐｏｔａｔｏ Ｄａｔａｂａｓｅを含めた一部の供給源では、今でもＳ．ｆｅｎｄｌｅｒｉの名称が使用されている）および二倍体種Ｓ．ｊａｍｅｓｉｉである（Ｂａｍｂｅｒｇら、２００３年；ＩＰＤ、２０１１年Ｂａｍｂｅｒｇおよびｄｅｌ Ｒｉｏ、２０１１年ａ；Ｂａｍｂｅｒｇおよびｄｅｌ Ｒｉｏ、２０１１年ｂ；Ｓｐｏｏｎｅｒら、２００４年）。Ｌｏｖｅ（１９９４年）により、第３の種、Ｓ．ｐｉｎｎａｔｉｓｅｃｔｕｍも米国におけるネイティブな種であることが報告された。しかし、Ｓｐｏｏｎｅｒら（２００４年）により、以前Ｓ．ｐｉｎｎａｔｉｓｅｃｔｕｍだと思われていたものが実際にはＳ．ｊａｍｅｓｉｉであったということが決定された。１０年を超える圃場での研究および既存の記録の評価を通じて、Ｂａｍｂｅｒｇら（２００３年）およびＳｐｏｏｎｅｒら（２００４年）により、米国には、これらの２つの種、Ｓ．ｆｅｎｄｌｅｒｉおよびＳ．ｊａｍｅｓｉｉのみが存在することが確立された。これらの研究者はまた、以前に記録された位置を検証することも試み、このプロセスを通じて、現在分かっているこれらの種の位置の地図が更新され、記録された各個体群についての緯経度位置（Ｂａｍｂｅｒｇら、２００３年）および分布地図（Ｓｐｏｏｎｅｒら、２００４年）がもたらされた。これらの種は、大部分が、大多数の商業生産領域とは十分に隔離された高度５，０００〜１０，０００フィートの乾燥林、低木林砂漠、および砂地に存在する（Ｂａｍｂｅｒｇおよびｄｅｌ Ｒｉｏ、２０１１年ａ）。
郡レベルでは、商業生産のために使用されるエーカー数と野生種の存在はいくらか重複するが、米国における大多数のジャガイモ生産は、野生ジャガイモ帯域におけるものではない。しかし、少数の野生ジャガイモ植物体がジャガイモ圃場の近くで生育し得る可能性がある（Ｌｏｖｅ、１９９４年）。Ｓｐｏｏｎｅｒら（２００４年）は、米国におけるＳ．ｊａｍｅｓｉｉの生息地として、標高４，５００〜９，４００フィートの、山腹の巨礫の間、砂質の沖積河川の底部、踏み分け道または道路に沿った砂利、沖積谷の肥沃有機質土壌、砂質の休閑地、草地、ビャクシン−低木松の低木林砂漠、オーク雑木林、針葉樹および落葉性の森林を記載している。Ｓｐｏｏｎｅｒらは、Ｓ．ｆｅｎｄｌｅｒｉの生息地も同様であり、標高４７００〜１１，２００フィートであることを記載している。
ジャガイモの遺伝学
Ｓｏｌａｎｕｍ属における基本的な染色体数は、１２である。Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍは二倍体（２ｎ＝２×＝２４）または四倍体（２ｎ＝４×＝４８）であり得る。二倍体の範囲は南米の一部に限られているが、四倍体は、世界中で最も一般的に栽培されている。ジャガイモにおける四倍性がどのように生じたかは不明である。栽培されているＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍは、同質四倍体（二倍体種の染色体の倍加）または異質四倍体（２つの関連する種間の二倍体雑種の染色体の倍加）のいずれかであり得る。
二倍体種はほぼ全てが自家不和合性であるが、栽培されている四倍体Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍは自家受粉（自殖）可能である。Ｐｌａｉｓｔｅｄ（１９８０年）により、圃場条件下では、四倍体Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍについては自殖の可能性が最も高く、種子の８０〜１００パーセントが自殖によって形成されることが示された。ＣｏｎｎｅｒおよびＤａｌｅ（１９９６年）は、ニュージーランド、英国およびスウェーデンにおいて実施された、遺伝子改変されたジャガイモを用いたいくつかの圃場実験から、外交配データを収集した。各試験において、受容植物を遺伝子改変された植物から２０メートル超離した場合には、外交配率はゼロであった。Ｓｏｌａｎｕｍ種の多くは稔性であるが、多数の四倍体の栽培されているＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ栽培品種では稔性が低下していると思われる。
ジャガイモ品種
ジャガイモ品種の開発には何年もかかる。新品種の樹立の決定は、市場におけるニーズ、潜在的な消費者の許容性、および害虫耐性または抵抗性などの多くの因子に基づく。ジャガイモ品種は、トウモロコシ（ｆｉｅｌｄ ｃｏｒｎ）またはダイズなどのいくつかの他の作物と比較して導入および中止の頻度が高くない。ジャガイモはクローン的に繁殖するので、他家受粉に起因する品種間希釈（ｖａｒｉｅｔａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）のリスクが低下する。
本開示において使用するジャガイモ事象は、４つのジャガイモ品種を起源とする。
Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋは、事象Ｅ１２およびＷ８の親品種である。この品種は、１８７０年代の初めにＬｕｔｈｅｒ Ｂｕｒｂａｎｋにより開発された。植物体は生育が良く、季節全体を通してつるが生育し続ける。茎は厚く、顕著に曲がっており、細かい斑点がある。小葉は、幅は長い〜中程度であり、色は薄い〜中程度の緑色である。花はわずかであり、白色であり、稔性ではない。栽培品種は、そうか病（ｃｏｍｍｏｎ ｓｃａｂ）に対して耐性であるが、ＦｕｓａｒｉｕｍおよびＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍによる立ち枯れ病、葉巻病ならびに網状壊死（ｎｅｔ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）ならびにＹウイルスにかかりやすい。植物が、こぶ、尖った先端および亜鈴状を有さない塊茎を生成するためには、土壌水分が高く均一であり、窒素肥沃度が制御された条件が必要である。植物がストレスにさらされると塊茎にゼリーエンド（Ｊｅｌｌｙ−ｅｎｄ）およびシュガーエンド（ｓｕｇａｒ−ｅｎｄ）が発生する。生成する塊茎は大きく、皮は褐色であり、果肉は白色であり、良好な長期間貯蔵特性を示し、優れたベーキングおよび加工品質の標準的なものである。この品種は、不稔性であり、北西部および中西部において、特にフレンチフライの生産用として広範に育てられている。
Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔは、事象Ｆ１０およびＸ１７の親品種である。この完全な季節品種は、１９９１年に公開された。Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔは、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋよりも、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍによる立ち枯れ病、ＸウイルスおよびＹウイルス、葉巻病ならびに網状壊死、ならびにＦｕｓａｒｉｕｍによる乾腐病に対する抵抗性が高い。Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔは、空胴病に対する抵抗性が高い。植物体は、大きく、立性〜開帳性である。茎は、厚く、緑色であり、たくさんの日光の下では薄茶色がかった〜薄紫色になる。葉は、大きく、広く、中程度に緑色である。花は、豊富であり、生育可能な花粉を生じる。芽は、緑色で基部および小花柄が赤みがかった紫色であり、短い軟毛の量は中程度である。花冠は、中程度の大きさであり、赤紫色であり、葯は鮮やかな黄色である。Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔは、長く、わずかに平らであり、フレンチフライへのベーキングおよび加工によく適した、品質が良好で比重の高い塊茎を高収量で生成する。塊茎は、そうか病および打撲黒斑にかかりやすい。Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔは、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋよりも早く成熟し、中期貯蔵用品種であるとみなされる。この品種は稔性であり、主に北西部において、特にフレンチフライの生産用として育てられている。
Ａｔｌａｎｔｉｃは、事象Ｊ３およびＪ５５およびＹ９の親品種である。植物体は、中程度の大きさであり、厚く立性の茎、および、わずかに膨らんだ低密度に軟毛に覆われた節を有する。葉は、鮮やかな中程度の緑色であり、平滑であり、中程度に軟毛に覆われており、顕著な翼（ｗｉｎｇ）、大きな非対称的な初生小葉ならびに多数の二次小葉および三次小葉を伴う。花は、大量であり、緑色の、突き錐状の軟毛に覆われたがく裂片（ｃａｌｙｘ ｌｏｂｅ）、淡いラベンダー色の花冠、オレンジ色の葯、および豊富な生育可能な花粉を伴う。栽培品種は、そうか病およびＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍによる立ち枯れ病に対して耐性であり、ピンクアイ（ｐｉｎｋｅｙｅ）に対して抵抗性であり、ジャガイモシストセンチュウのＲａｃｅ Ａ、Ｘウイルス、塊茎の網状壊死に対して高度に抵抗性であり、打撲黒斑に対していくらかの抵抗性を示す。塊茎は、特に温暖な、乾燥した季節の砂土においては、内部熱壊死（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｈｅａｔ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）にかかりやすい。一部の生育地域では、直径が大きな塊茎（直径＞４インチ）の空胴病は重篤になり得る。塊茎は、卵形〜円形であり、軽い〜重い鱗片状の網状の皮、中程度に浅い芽、および白色の果肉を伴う。塊茎休眠は中程度の長さである。Ａｔｌａｎｔｉｃは、高収量の潜在性、高比重および均一な塊茎のサイズおよび形状を有し、圃場からまたは非常に短期の貯蔵からのチップ生成用の標準品種である（Ｗｅｂｂら、１９７８年）。この品種は、稔性であり、主に北東部および南東部において、特にチップの生産用として育てられている。
Ｓｎｏｗｄｅｎは、事象Ｖ１１の親品種である。Ｓｎｏｗｄｅｎ（Ｗ ８５５）は、１９７０年代の後期に、ウィスコンシンにおいてＷｉｓｃｈｉｐとＢ５１４１−６の交配から選択され、１９９０年に名付けられた。ＵＷ−Ｌｅｌａｈ Ｓｔａｒｋｓ Ｐｏｔａｔｏ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｒｍ、Ｒｈｉｎｅｌａｎｄｅｒ、ＷＩにおいてＤｒ．Ｓｔａｎ ＰｅｌｏｑｕｉｎおよびＭｒ．Ｄｏｎａｌｄ Ｋｉｃｈｅｆｓｋｉにより選択および初期試験が行われた。つるは大きな立性であり、中程度である。葉は、淡緑色であり、閉じている。花は、白色であり、黄色の葯を伴い、生育が止まる傾向がある。雄性不稔性が一般的であり、果実はめったに発達しない。芽は中程度であり、頂端で深く、均一に分布している。塊茎は白色の果肉を有するが、皮は淡褐色であり、わずかに網状である。塊茎は、均一で、丸く、わずかに平らであり、一貫して直径２．５〜３．５インチである。Ｓｎｏｗｄｅｎは、夏疫病（ｅａｒｌｙ ｂｌｉｇｈｔ）および疫病ならびにそうか病にかかりやすく、コロラドハムシを誘引する。この品種は、空胴病および中心部の褐変（ｂｒｏｗｎ ｃｅｎｔｅｒ）に対して耐性である。Ｓｎｏｗｄｅｎの収量はＡｔｌａｎｔｉｃよりもわずかに少ないかそれと同等である。Ｓｎｏｗｄｅｎは現在Ｎｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｔｒｉａｌｓにおける標準物である。Ｓｎｏｗｄｅｎは、華氏４５度での貯蔵から出してリコンディショニングせずにチップ生成される以外は、Ａｔｌａｎｔｉｃと非常によく似ている。Ｓｎｏｗｄｅｎは、チップの生産のために使用される。
ジャガイモ形質転換の方法
生物学的な植物形質転換プロトコールおよび物理的な植物形質転換プロトコールを含めた、植物を形質転換するための多数の方法が開発されてきた。例えば、Ｍｉｋｉら、「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌｉｃｋ， Ｂ． Ｒ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． Ｅ．編（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３年）、６７〜８８頁を参照されたい。さらに、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のための発現ベクターおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法が利用可能である。例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、「Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌｉｃｋ， Ｂ． Ｒ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． Ｅ．編（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３年）、８９〜１１９頁を参照されたい。
Ａ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換
植物に発現ベクターを導入するための１つの方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然の形質転換系に基づく。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７巻：１２２９頁（１９８５年）を参照されたい。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓは、植物細胞を遺伝的に形質転換する、植物病原性土壌細菌である。それぞれＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドは、植物体の遺伝子形質転換に関与する遺伝子を保有する。例えば、Ｋａｄｏ， Ｃ． Ｉ．、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １０巻：１頁（１９９１年）を参照されたい。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター系およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性遺伝子移入の方法の説明は、Ｇｒｕｂｅｒら、上記、Ｍｉｋｉら、上記およびＭｏｌｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８巻：２３８頁（１９８９年）によりもたらされる。１９９６年１０月８日に発行された米国特許第５，５６３，０５５号（ＴｏｗｎｓｅｎｄおよびＴｈｏｍａｓ）も参照されたい。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に使用する目的で設計された特定のＤＮＡ送達プラスミドを管理する多数の特許、例えば、全てその全体が本明細書に参照により組み込まれる、ＵＳ４５３６４７５、ＥＰ０２６５５５６、ＥＰ０２７０８２２、ＷＯ８５０４８９９、ＷＯ８６０３５１６、ＵＳ５５９１６１６、ＥＰ０６０４６６２、ＥＰ０６７２７５２、ＷＯ８６０３７７６、ＷＯ９２０９６９６、ＷＯ９４１９９３０、ＷＯ９９６７３５７、ＵＳ４３９９２１６、ＷＯ８３０３２５９、ＵＳ５７３１１７９、ＥＰ０６８７３０、ＷＯ９５１６０３１、ＵＳ５６９３５１２、ＵＳ６０５１７５７およびＥＰ９０４３６２Ａ１が存在する。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換には、第１のステップとして、プラスミドにクローニングされたＤＮＡ断片を生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞内に入れ、次いで、それらを、その後、個々の植物細胞の形質転換に使用することを伴う。したがって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換は、間接的な植物の形質転換方法である。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、遺伝子操作された、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する土壌細菌の使用によって達成される。いくつかのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、任意の所望のＤＮＡ片を多くの植物種内に運搬するように遺伝子操作することができる、「Ｔ−ＤＮＡ」として公知の特定のＤＮＡの移入を媒介する。Ｔ−ＤＮＡ媒介性病因のプロセスを特徴付ける主要な事象は、ビルレンス遺伝子の誘導、Ｔ−ＤＮＡのプロセシングおよび移入である。このプロセスは、多くの総説の主題である（Ｒｅａｍ、１９８９年；ＨｏｗａｒｄおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ、１９９０年；Ｋａｄｏ、１９９１年；ＨｏｏｙｋａａｓおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、１９９２年；Ｗｉｎｎａｎｓ、１９９２年；Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、１９９２年；Ｇｅｌｖｉｎ、１９９３年；ＢｉｎｎｓおよびＨｏｗｉｔｚ、１９９４年；ＨｏｏｙｋａａｓおよびＢｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ、１９９４年；ＬｅｓｓｌおよびＬａｎｋａ、１９９４年；ＺｕｐａｎおよびＺａｍｂｒｙｓｋｉ、１９９５年）。
植物のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性遺伝子形質転換には、いくつかのステップが伴う。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよび植物細胞をまず互いと接触させる第１のステップは、一般に、「接種」と称される。接種ステップの後、通常、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよび植物細胞／組織を、成長およびＴ−ＤＮＡ移入に適した条件下で数時間〜数日またはそれ超の期間にわたって一緒に成長させる。このステップは、「共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）」と称される。共培養およびＴ−ＤＮＡ送達の後、多くの場合、植物細胞を殺菌剤および／または静菌剤で処理してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを死滅させる。これを非トランスジェニック植物細胞に対してトランスジェニック植物細胞の優先的な成長を促進する任意の選択的薬剤の非存在下で行う場合には、一般には、「遅延」ステップと称される。トランスジェニック植物細胞に有利な選択圧力の存在下で行う場合には、これは、「選択」ステップと称される。「遅延」を使用する場合には、その後に１つまたは複数の「選択」ステップを行う。感染（接種および共培養）プロセス後のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞の成長は望ましくないので、「遅延」ステップおよび「選択」ステップはどちらも、一般に、残りのあらゆるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を死滅させるための殺菌剤および／または静菌剤を含む。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって作製されたトランスジェニック植物は、一般に、微小粒子媒介性遺伝子形質転換と比較して単純な組み込みパターンを含有するが、コピー数および挿入パターンは広範に変動する（Ｊｏｎｅｓら、１９８７年；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、１９８７年）。さらに、単一の植物遺伝子型内でさえ、使用される外植片および形質転換系の型に基づいて、異なるパターンのＴ−ＤＮＡ組み込みが可能である（Ｇｒｅｖｅｌｄｉｎｇら、１９９３年）。Ｔ−ＤＮＡコピー数を調節する因子は十分には理解されていない。
付随する実施例には形質転換の特定のＩｎｎａｔｅ（商標）方法論が記載されている。しかし、植物体のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換の上述の「一般的な」方法によっても、教示される方法によって検出することができる天然には存在しないヌクレオチド接合部配列を作製する。
Ｂ．直接遺伝子移入
ＤＮＡを使用する直接的な植物形質転換方法も報告されている。これらのうち歴史的に最初に報告されたものは、植物細胞を含有する溶液に印加される電流を利用する電気穿孔である（Ｍ． Ｅ． Ｆｒｏｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３１９巻、７９１頁（１９８６年）；Ｈ． Ｊｏｎｅｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１３巻、５０１頁（１９８９年）およびＨ． Ｙａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻、４２１頁（１９８８年）。
「微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」と称される、別の直接的な方法では、通常はタングステンまたは金の超微細粒子を使用し、それにＤＮＡをコーティングし、次いで、粒子が、厚い細胞壁、膜および核エンベロープを含めた植物細胞を貫通するのに十分であるが、それらの少なくとも一部は死滅させない力で植物組織の表面に噴霧する（ＵＳ５，２０４，２５３、ＵＳ５，０１５，５８０）。
第３の直接的な方法では、文字通り細胞および細胞の核エンベロープをも突き刺す、鋭い、多孔質または中空の針様突起からなる金属またはセラミックの繊維状の形態を使用する。炭化ケイ素ウィスカーおよびホウ酸アルミニウムウィスカーの両方が、植物の形質転換のため（Ｍｉｚｕｎｏら、２００４年；Ｐｅｔｏｌｉｎｏら、２０００年；ＵＳ５３０２５２３、米国特許出願第２００４０１９７９０９号）ならびに細菌および動物の形質転換のためにも（Ｋａｅｐｌｅｒら、１９９２年；Ｒａｌｏｆｆ、１９９０年；Ｗａｎｇ、１９９５年）使用されている。他の方法が報告されており、追加的な方法が確実に開発されるであろう。本明細書において教示される方法により、任意の植物の形質転換方法の結果として生じた天然には存在しないヌクレオチド接合部を検出することができる。
ジャガイモ育種
前述の形質転換の方法は、一般には、トランスジェニック品種を作製するために使用される。次いで、新しいトランスジェニック品種を作製するために、トランスジェニック品種を別の（形質転換されていないまたは形質転換された）品種と交配することができる。あるいは、前述の形質転換技法を使用して特定のジャガイモ系統に工学的操作により導入された遺伝形質を、植物体育種の技術分野で周知である従来の戻し交配技法を使用して、別の系統に移動させることができる。例えば、戻し交配手法を使用して、工学的に操作された形質を、公共の非優良品種から優良品種に、または、ゲノム内に外来遺伝子を含有する品種からその遺伝子を含有しない品種（複数可）に、移動させることができる。本明細書で使用される場合、「交配」とは、文脈に応じて、単純なＸとＹの交配または戻し交配のプロセスを指し得る。
ジャガイモ植物体という用語が本開示に関して使用される場合、この用語は、その品種の遺伝子変換された植物体、または１つもしくは複数の付加価値遺伝子（例えば、除草剤抵抗性もしくは害虫抵抗性など）が組み入れられたトランスジェニック派生物などの、問題の事象の本質的な際立った特性を保持する派生品種も包含することが当業者には理解されよう。戻し交配方法を本開示と共に使用して、特性を改善するまたは当該品種に導入することができる。用語「戻し交配」とは、本明細書で使用される場合、雑種後代をまた反復親と交配することを１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回またはそれ超、繰り返すことを指す。１つまたは複数の所望の特性について遺伝子（複数可）を寄与する親ジャガイモ植物体は、一回親（ｎｏｎｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐａｒｅｎｔ）またはドナー親と称される。この用語法は、一回親は戻し交配プロトコールにおいて１回使用され、したがって、反復しないという事実を指す。一回親由来の遺伝子（複数可）が移入される親ジャガイモ植物体は、戻し交配プロトコールにおいて数ラウンド使用されるので、反復親として公知である。典型的な戻し交配プロトコールでは、目的の元の品種（反復親）を、移入させる目的の遺伝子（複数可）を有する第２の品種（一回親）と交配する。次いで、この交配から得られた後代を再度反復親と交配し、一回親から移入された１つまたは複数の遺伝子に加えて、反復親の所望の形態学的特性および生理的特性の基本的に全てが、変換された植物において回復するジャガイモ植物体が得られるまでこのプロセスを繰り返す。
適切な反復親の選択は、戻し交配手順を成功させるための重要なステップである。戻し交配プロトコールの目的は、元の品種の１つまたは複数の形質または特性を変更または置換することである。これを達成するために、反復品種の１つまたは複数の遺伝子を、一回親に由来する所望の遺伝子（複数可）を用いて改変するか、置換するか、またはそれを補充すると同時に、残りの所望の遺伝子の基本的に全て、したがって、元の品種の所望の生理的および形態学的な構成を保持する。特定の一回親の選択は、戻し交配の目的に左右される。主要な目的のうちの１つは、いくつかの商業的に望ましい、農業的に重要な形質を植物体に付加することである。正確な戻し交配プロトコールは、適切な試験プロトコールを決定するために変更または付加される特性または形質に左右される。戻し交配方法は、移入される特性が優性対立遺伝子である場合には簡易化されるが、劣性対立遺伝子も移入することができる。この場合、所望の特性が首尾よく移入されたか否かを決定するために、後代の試験を導入することが必要な場合がある。
同様に、導入遺伝子は、以下のものなどの当業者に周知の種々の確立された組換え方法のいずれかを用いて植物体に導入することができる：Ｇｒｅｓｓｅｌ、１９８５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｃｒｏｐｓ： Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｒｅａｌｉｔｉｅｓ、Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｏｒｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ、Ｌ． ｖａｎ Ｖｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ、（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｕｔｔｎｅｒ， Ｓ． Ｌ．ら、１９９２年、Ｒｅｖｉｓｉｎｇ Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｌａｎｔｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｋｌｅｅ， Ｈ．ら、１９８９年、Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ： Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ；Ｋｏｎｃｚ， Ｃ．ら、１９８６年、Ｔｈｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ Ｔ．ｓｕｂ．Ｌ−ＤＮＡ Ｇｅｎｅ ５ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ Ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｌａｗｓｏｎ， Ｃ．ら、１９９０年、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｍｉｘｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ： Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｖｉｒｕｓ Ｘ ａｎｄ Ｐｏｔａｔｏ Ｖｉｒｕｓ Ｙ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｉｔｓｋｙ， Ｔ． Ａ．ら、１９９６年、Ｐｌａｎｔｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＬＲＶ． 米国特許第５，５１０，２５３号；Ｎｅｗｅｌｌ， Ｃ． Ａ．ら、１９９１年、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ． Ｃｖ． Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ；Ｐｅｒｌａｋ， Ｆ． Ｊ．ら、１９９３年、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｐｏｔａｔｏｅｓ： Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｄａｍａｇｅ ｂｙ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｂｅｅｔｌｅｓ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、これらの全てがこの目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。
新品種の開発において決まっては選択されないが、戻し交配および遺伝子工学技法によって改善することができる多くの形質が同定されている。これらの形質は、トランスジェニックであってもトランスジェニックでなくてもよく、これらの形質の例としては、これだけに限定されないが、除草剤抵抗性；細菌、真菌またはウイルスによる病害に対する抵抗性；昆虫抵抗性；デンプンおよび他の炭水化物の濃度の均一性または上昇；栄養品質の増強；塊茎が打撲を受ける傾向の減少；およびデンプンが糖に変換される速度の低下が挙げられる。これらの遺伝子は、一般に、核を通じて遺伝する。
寄託情報
以下の寄託情報は、ただ単に、実施例および特許請求された方法において使用される代表的な植物材料を提示するために含まれる。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｊ３の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は、２０１３年５月２３日であった。ＡＴＣＣ受託番号は、ＰＴＡ−１２０３７１である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７５４，３０３号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｊ３」を参照されたい。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｆ１０の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は、２０１３年５月２３日であった。ＡＴＣＣ受託番号は、ＰＴＡ−１２０３７３である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７１０，３１１号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｆ１０」を参照されたい。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｗ８の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は、２０１４年３月１１日であった。ＡＴＣＣ受託番号は、ＰＴＡ−１２１０７９である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８８９，９６４号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｗ８」を参照されたい。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｊ５５の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は、２０１３年９月２５日であった。ＡＴＣＣ受託番号は、ＰＴＡ−１２０６０１である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８８９，９６３号、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｊ５５」を参照されたい。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｅ１２の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は２０１３年５月２３日であった。ＡＴＣＣ受託番号は、ＰＴＡ−１２０３７２である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／０７２，４８７、「Ｐｏｔａｔｏ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｅ１２」号を参照されたい。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｘ１７の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は２０１５年６月１７日であった。ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ−１２２２４８である。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｙ９の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は２０１５年６月１７日であった。ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ−１２２２４７である。
上に開示されているＪ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙの独自のジャガイモ栽培品種Ｖ１１の塊茎は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０への寄託がなされた。寄託日は、であった。ＡＴＣＣ受託番号は、である。
（実施例１）
ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター骨格
プラスミドｐＳＩＭ１２７８は、ジャガイモを形質転換するために使用される、１９．７ｋｂのバイナリー形質転換ベクターである。この実施例では、遺伝子エレメントの供給源、骨格およびＴ−ＤＮＡ配列のクローニングステップ、ならびにプラスミド内のエレメントの順序を示す。
プラスミド骨格（図１および表１）は、２つのよく特徴付けられた細菌の複製起点を含有する。ｐＶＳ１（ｐＶＳ１ ＳｔａおよびＲｅｐ）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるプラスミドの維持を可能にし、ｐＢＲ３２２（ｐＢＲ３２２ ｂｏｍおよびｏｒｉ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるプラスミドの維持を可能にするものである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＤＮＡオーバードライブ配列により、ＲＢにおける切断が増強され、そしてＥ．ｃｏｌｉ ｎｐｔＩＩ遺伝子は、細菌性カナマイシン選択マーカーである。骨格は、Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ７）プロモーターとＲａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ３）ターミネーターで挟まれたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子を含む発現カセットを含有する。ｉｐｔカセットは、宿主植物へのプラスミド骨格ＤＮＡの組み込みに対する選択に使用するためのスクリーニング可能な表現型である。形質転換された植物組織において存在する場合、ｉｐｔの過剰発現により植物ホルモンであるサイトカイニンが過剰産生され、その結果、生育が妨げられる表現型を有し、葉が異常であり、根付くことができない植物が生じる。
骨格部分は植物細胞に移入されない。骨格の種々のエレメントを表１に記載する。
（実施例２）
ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターＴ−ＤＮＡ
ｐＳＩＭ１２７８に使用する、隣接境界配列を含めたｐＳＩＭ１２７８ ＤＮＡ挿入断片領域は、長さが１ｂｐから１０，１４８ｂｐまでの１０，１４８ｂｐである。ｐＳＩＭ１２７８ ＤＮＡ挿入断片は、ネイティブなＤＮＡのみからなり、ジャガイモゲノム内に安定に組み込まれる。ｐＳＩＭ１２７８ ＤＮＡ挿入断片またはその機能性部分は、ベクターｐＳＩＭ１２７８の、本発明のジャガイモ植物体品種に組み込まれる唯一の遺伝物質である。
ｐＳＩＭ１２７８ ＤＮＡ挿入断片は、図１（ベクター骨格領域と共に）、図２、図５、および以下の表２に記載されている。ＬＢ配列およびＲＢ配列（各２５ｂｐ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴ−ＤＮＡの境界と類似し、同様に機能するように、合成により設計した。ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＹ５６６５５５を、境界領域についてのＤＮＡの供給源が明白になるように修正した。遺伝子エレメント５および１０と記載されているＡＳＮ１は、Ｃｈａｗｌａら、２０１２年ではＳｔＡｓｔ１と称されている。
プラスミドｐＳＩＭ１２７８ Ｔ−ＤＮＡは、２つの発現カセットを含有する：
第１のカセット（エレメント４〜１２、表２）は、形質転換されたジャガイモ品種におけるＡｓｎ１およびＰｐｏ５を下方制御するものである。第１のカセットは、２つの同一の４０５ｂｐのＡｓｎ１の断片および２つの同一の１４４ｂｐのＰｐｏ５の断片で構成される。Ａｓｎ１の断片およびＰｐｏ５の断片は、非コード１５７ｂｐ Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔジャガイモヌクレオチドスペーサーエレメントによって分離された逆方向反復として配置する。Ａｓｎ１断片およびＰｐｏ５断片は、主に塊茎において活性である２つのジャガイモ収束プロモーター；ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターの間に配置する。これらのプロモーターにより、逆方向反復の発現が駆動されて二本鎖ＲＮＡが生成し、Ａｓｎ１およびＰｐｏ５が下方制御される。
第２のカセット（エレメント１４〜２１、表２）は、形質転換されたジャガイモ品種におけるＰｈＬおよびＲ１を下方制御するものである。第２のカセットは、２つの同一の５０９ｂｐのＰｈＬプロモーター領域（ｐＰｈＬ）の断片および２つの同一の５３２ｂｐのＲ１プロモーター領域（ｐＲ１）の断片で構成される。ｐＰｈＬ断片およびｐＲ１断片は、Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン遺伝子の非コード２５８ｂｐ断片によって分離された逆方向反復として配置する。第１のカセットと同様に、ｐＰｈＬ断片およびｐＲ１断片は、ジャガイモＡｇｐプロモーターとＧｂｓｓプロモーターの間に配置され、それらによって転写される。
したがって、表１および表２から見ることができるように、ｐＳＩＭ１２７８プラスミドは、ジャガイモ植物体を形質転換するために設計されたバイナリーベクターである。ベクター骨格は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの両方における複製のための配列を、ベクター骨格ＤＮＡを有する植物を除去するためのスクリーニング用のｉｐｔマーカーと共に含有する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ＬＢ配列とＲＢ配列で挟まれた２つの発現カセットからなる。宿主植物組織にｐＳＩＭ１２７８ベクターを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種すると、ｐＳＩＭ１２７８のＴ−ＤＮＡ領域が宿主ゲノム内に移入される。
本開示のジャガイモ系統を創出するために使用した、表２に記載されているＤＮＡ挿入断片は、隣接する遺伝子を活性化せず、ジャガイモ植物体品種の表現型に悪影響を及ぼさない。
（実施例３）
ｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクター骨格
プラスミドｐＳＩＭ１６７８は、ジャガイモを形質転換するために使用される、１８．６ｋｂのバイナリー形質転換ベクターである。この実施例では、遺伝子エレメントの供給源、骨格およびＴ−ＤＮＡ配列のクローニングステップ、ならびにプラスミド内のエレメントの順序を示す。
プラスミド骨格（図３；表３）は、２つのよく特徴付けられた細菌の複製起点を含有する。ｐＶＳ１（ｐＶＳ１ ＳｔａおよびＲｅｐ）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるプラスミドの維持を可能にし、ｐＢＲ３２２（ｐＢＲ３２２ ｂｏｍおよびｏｒｉ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるプラスミドの維持を可能にするものである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＤＮＡオーバードライブ配列により、ＲＢにおける切断が増強され、そしてＥ．ｃｏｌｉ ｎｐｔＩＩ遺伝子は、細菌性カナマイシン選択マーカーである。骨格は、Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ７）プロモーターとＲａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔジャガイモポリユビキチン（Ｕｂｉ３）ターミネーターで挟まれたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子を含む発現カセットを含有する（ＧａｒｂａｒｉｎｏおよびＢｅｌｋｎａｐ、１９９４年）。ｉｐｔカセットは、宿主植物へのプラスミド骨格ＤＮＡの組み込みに対する選択に使用するためのスクリーニング可能な表現型である。形質転換された植物組織において存在する場合、ｉｐｔの過剰発現により植物ホルモンであるサイトカイニンが過剰産生され、その結果、生育が妨げられる表現型を有し、葉が異常であり、根付くことができない植物が生じる。
骨格部分は植物細胞に移入されない。骨格の種々のエレメントは、表３に記載されている。
（実施例４）
ｐＳＩＭ１６７８形質転換ベクターＴ−ＤＮＡ
ｐＳＩＭ１６７８において使用する、隣接境界配列を含めたｐＳＩＭ１６７８ ＤＮＡ挿入断片領域は、９，０９０ｂｐの長さである（１ｂｐから９，０９０ｂｐまで）。ｐＳＩＭ１６７８ ＤＮＡ挿入断片は、ネイティブなＤＮＡのみからなり、ジャガイモゲノム内に安定に組み込まれる。ｐＳＩＭ１６７８ ＤＮＡ挿入断片またはその機能性部分は、本発明のジャガイモ植物体品種に組み込まれるベクターｐＳＩＭ１６７８の唯一の遺伝物質である。
ｐＳＩＭ１６７８ ＤＮＡ挿入断片は、図３（ベクター骨格領域と共に）、図５、および以下の表４に記載されている。表４では、ＬＢ配列およびＲＢ配列（各２５−ｂｐ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴ−ＤＮＡの境界と類似し、同様に機能するように、合成により設計した。ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＹ５６６５５５を、境界領域についてのＤＮＡの供給源が明白になるように修正した。
プラスミドｐＳＩＭ１６７８ Ｔ−ＤＮＡは、１−ｂｐから９，０９０−ｂｐまでであり、２つの発現カセットを含有する（図３）：
第１のカセット（エレメント４〜６、表４）は、Ｓｏｌａｎｕｍ ｖｅｎｔｕｒｉｉに由来する２，６２６ｂｐのＲｐｉ−ｖｎｔ１（Ｖｎｔ１）遺伝子を含有する。遺伝子産物ＶＮＴ１は、ジャガイモをＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓによる疫病感染から保護する植物免疫応答に関与するＲ−タンパク質である。この遺伝子は、ネイティブなＶｎｔ１プロモーターｐＶｎｔ１、およびターミネーターｔＶｎｔ１の下で発現する。
第２のカセット（エレメント８〜１４、表４）は、形質転換されたジャガイモ品種における液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）の下方制御を結果としてもたらす。第２のカセットは、分離された逆方向反復として配置された２つのＶＩｎｖの断片（エレメント１０および１２、表４）で構成される。ＶＩｎｖ断片は、主に塊茎において活性である２つのジャガイモ収束プロモーター；ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）遺伝子のＡｇｐプロモーターと顆粒結合デンプン合成酵素（Ｇｂｓｓ）遺伝子のＧｂｓｓプロモーターの間に配置する。これらのプロモーターにより、逆方向反復の発現が駆動されて二本鎖ＲＮＡが生成し、ＶＩｎｖが下方制御される。
したがって、表３および表４から見ることができるように、ｐＳＩＭ１６７８プラスミドは、ジャガイモ植物体を形質転換するために設計されたバイナリーベクターである。ベクター骨格は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの両方における複製のための配列を、ベクター骨格ＤＮＡを有する植物を除去するためのスクリーニング用のｉｐｔマーカーと共に含有する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ＬＢ配列とＲＢ配列で挟まれた２つの発現カセットからなる。宿主植物組織にｐＳＩＭ１６７８ベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種すると、ｐＳＩＭ１６７８のＴ−ＤＮＡ領域が宿主ゲノム内に移入される。
（実施例５）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびトランスフェクション
Ｃ５８由来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＡＧＬ１は、強毒性プラスミドｐＴｉＢｏ５４２のトランスファーＤＮＡを正確に欠失させることによって開発された（Ｌａｚｏら、１９９１年）。一般的な組換え遺伝子（ｒｅｃＡ）にトランスポゾンを挿入することにより、ｐＳＩＭ１２７８などの組換えプラスミドベクターが安定化する（図１）。ＡＧＬ１は、カルベニシリンおよびリファンピシンに対する抵抗性を示し、チメンチンを使用する形質転換されたジャガイモ組織から除去される。選択後、植物は、抗生物質およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのどちらも含まず、ジャガイモ由来の発現カセットが植物のゲノム内に挿入されている。
ストックの植物体を、３％スクロースおよび２ｇ／ｌのゲルライトを含有する、半分の強度のＭ５１６（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）培地（繁殖培地）４０ｍｌを伴うマゼンタボックス（ｍａｇｅｎｔａ ｂｏｘ）中で維持した。４週齢の植物体から４〜６ｍｍのジャガイモ節間セグメントを切り取り、ｐＳＩＭ１２７８を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＧＬ１株を感染させ、３％スクロースおよび６ｇ／ｌの寒天を含有する組織培養培地（共栽培培地）に移した。２日後、感染外植片を、３％スクロース、６ｇ／ｌの寒天および１５０ｍｇ／ｌのチメンチンを含有するＭ４０４（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）培地に移してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを除去した（ホルモンを含まない培地）。この方法の詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌら（２００８年）に記載されている。
１カ月後、感染外植片を、いかなる合成ホルモンも欠く新鮮な培地に移し、Ｐｅｒｃｉｖａｌ生育チャンバー中、２４℃、１６時間の光周期の下でインキュベートし、そこで感染外植片の苗条形成を開始させた。多くの苗条がｉｐｔ遺伝子を発現し、サイトカイニン過剰産生表現型を示した。これらの苗条は、さらなる分析については検討されなかった。ＰＣＲ遺伝子型決定により、残りの苗条の約０．３〜１．５％が、Ｐ−ＤＮＡの少なくとも一部を含有するがｉｐｔ遺伝子を欠くことが実証された。したがって、形質転換された植物を選択するためにマーカーは使用しなかった。ｉｐｔに基づく、マーカーを用いない植物の形質転換に関する詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌら（２００８年）により公開されている。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを除去するプロセスは外植片への感染後２日目に開始した。この目的のために、組織を、生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含まないことが証明されるまで、抗生物質チメンチン（１５０ｍｇ／Ｌ）に供した。証明は、形質転換された事象の茎断片を栄養ブロス−酵母抽出物（ＮＢＹ培地）上、２８℃で２週間インキュベートすることによって得た（２回繰り返した）。９７ ＣＦＲ Ｐａｒｔ ３４０に従って、生きているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含まない場合にのみ、形質転換された植物を圃場に移し、植えた。
Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ Ｗ８事象は、異なるプラスミドを用いた２つの別々の形質転換に由来する挿入断片を含有する。第１の挿入断片、プラスミドｐＳＩＭ１２７８は、塊茎における最大４つのジャガイモ遺伝子、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、Ｒ１、およびＰｈＬをサイレンシングするために設計された逆方向反復からなる２つのカセットを含有する。同様に、第２のプラスミド、ｐＳＩＭ１６７８は、塊茎におけるＶＩｎｖ遺伝子をサイレンシングするための逆方向反復からなるカセットを含有するが、同時に、ネイティブなジャガイモプロモーター下にあるＲｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子のコピーも含有する。
ジャガイモ植物体品種を、組み込まれたＤＮＡ挿入断片配列の構造およびコピー数を決定するため、およびベクター骨格配列が存在しないことを確認するために、ＤＮＡゲルブロット分析によって分析した。
さらに、分子特徴付けを使用してＤＮＡ挿入断片を挟む接合部の配列を決定し、挿入ＤＮＡの安定性を示した。
接合部の配列決定情報により、遺伝子内ジャガイモ植物体品種についての特異的ＰＣＲ試験を開発するための基礎がもたらされた。したがって、形質転換事象を受けた植物種のＤＮＡの配列決定を行い、形質転換事象の結果として生じた天然には存在しないヌクレオチド接合部を同定することは当業者の技術レベルの範囲内であるので、開示されている方法は、他の植物種、および他のジャガイモ栽培品種に対して広範に適用可能である。そこで、前記当業者は、前記天然には存在しない接合部配列に結合する適切なプローブおよびそのような配列を増幅するために最適化されたプライマーを開発することが可能である。
（実施例６）
ベクター骨格ＤＮＡが存在しないことの証拠
多くの市販のトランスジェニック作物とは異なり、本開示のジャガイモ栽培品種は、ベクター骨格ＤＮＡなどの、形質転換のために使用されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＤＮＡ配列を含まないことが以下の３つの異なる方法によって確認された：１）第１に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物細胞へのｉｐｔ遺伝子発現カセットを含む骨格ＤＮＡの偶発的移入により、ｉｐｔ遺伝子発現、したがって、サイトカイニン型ホルモンであるイソペンテニルアデノシンの形成が誘発されるので、負の選択が可能なイソペンテニルイソメラーゼ（ｉｐｔ）マーカー遺伝子がベクター骨格内に存在するかしないかを決定した。２）次いで、第１のスクリーニング方法を通過した形質転換されたジャガイモ植物体に対して、サザンブロットハイブリダイゼーションを使用して骨格ＤＮＡが存在しないことを確認した。そして、３）次いで、ＰＣＲを設計して、ＤＮＡ挿入断片境界領域とＤＮＡ挿入断片を挟む隣接骨格ＤＮＡまたは骨格ＤＮＡ内の領域との間の接合部を示す断片を増幅した。この方法の有効性を、ｐＳＩＭ１２７８ ＤＮＡを陽性対照として使用することによって確認した。本開示のジャガイモ栽培品種は、ベクター骨格ＤＮＡの存在を示すＰＣＲバンドを生じなかった。
（実施例７）
挿入ＤＮＡの安定性
ＤＮＡ挿入断片の安定性を、元の形質転換体において、および繁殖させた植物材料において再度、ＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションおよび形質評価の両方を使用して評価した。これらの試験は、遺伝子内事象が、組み入れられた形質を一貫した信頼できる様式で発現することを確実にするために行った。不安定性は、希少な組換え事象によって誘発される可能性もあり、メチル化によって引き起こされる可能性もある。ジャガイモは、通常クローン的に繁殖するので、有性繁殖する作物に対する標準的な評価は直接適用可能でなく、後の世代を定義するために種子ではなく塊茎を使用した。ＤＮＡブロットハイブリダイゼーションの結果から、多世代において一貫したバンドが存在することが実証され、したがって、安定性が示された。世代１および世代２の塊茎種子における形質の有効性を確認することにより、安定性についてのさらなる証拠を得た。
元の形質転換された材料（Ｇ０）では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて繁殖させ、土壌に植えられたことのない植物体の葉からＤＮＡを抽出し、評価することにより、ＤＮＡ挿入断片安定性が実証された。世代１（Ｇ１）の分析については、各遺伝子内品種から繁殖させた植物体２つと、各対照由来の植物体１つを温室内に植え、各植物体から収穫された塊茎のうちの１つを植えて、Ｇ１植物体からの葉を得、ＤＮＡを単離し、Ｇ１世代を評価するために使用した。この世代からの塊茎を再度植え、生じたＧ２植物体の葉によりその世代の特徴付けを可能にした。
挿入断片の構造は、Ｗ８ジャガイモの３世代にわたって（Ｇ０〜Ｇ３）単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を使用して安定であることが示され、一方、表現型の安定性は、第２世代の圃場で生育させた塊茎におけるポリフェノールオキシダーゼ活性を測定することによって評価した。この方法では、ジャガイモの切断面にカテコールを塗布した後、ＰＰＯサイレンシングの視覚的な証拠が示される。これらの試験は、Ｗ８における所望の遺伝子変化が多数のクローンサイクルにわたって安定なままであり、同時に形質が維持されることを確実にするために行った。
ＤＮＡ挿入断片の安定性を、サザンブロットを使用して３つの連続的なクローン世代（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）を元の形質転換体（Ｇ０）と比較することによって評価した。安定なＤＮＡ挿入断片は、同じ構造を維持し、したがって、多世代の植物体にわたって同じ消化パターンを生じることが予測される。Ｗ８事象における挿入断片の安定性を試験するために、ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８の両方に由来する挿入断片の領域にハイブリダイズする２種のプローブ（ＧＢＳ１およびＡＧＰ）、ならびにｐＳＩＭ１６７８挿入断片に特異的な２種のプローブ（ＩＮＶおよびＶＮＴ１）を使用して、その消化パターンを比較した。これらのプローブがハイブリダイズするＤＮＡ配列は、ジャガイモゲノム内およびＤＮＡ挿入断片（複数可）内に含有されるので、サザンブロットでは内在性バンドおよび挿入断片特異的バンドの両方が予測される。
全てのゲノムＤＮＡ試料を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、ＡＧＰまたはＧＢＳ１のいずれかに特異的なプローブとハイブリダイズさせた。ＥｃｏＲＶは、両方の挿入断片の内部を消化して、ｐＳＩＭ１２７８挿入断片において予測サイズ（例えば、２．３ｋｂ）の内側のバンドを伴う独特のバンディングのパターンをもたらすので、これらの試験に選択した。Ｗ８の全ての試料の間で、バンディングのパターンは、どちらのプローブについても互いに同一であった。Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ対照に存在する複数のバンドはＷ８でも見られるが、Ｗ８は、ｐＳＩＭ１２７８挿入断片およびｐＳＩＭ１６７８挿入断片に対応するバンドも含有する。これらのバンドは、同様に、分析したＷ８の全ての世代の間で一貫しており、これにより、両方の挿入断片の遺伝学的安定性が示される。
第２の分析は、ｐＳＩＭ１６７８挿入断片に特異的な２種のプローブを使用して実施した。この分析のために、ゲノムＤＮＡ試料を制限酵素ＸｂａＩで消化し、ＶＮＴ１プローブおよびＩＮＶプローブとハイブリダイズした。ＸｂａＩは、ｐＳＩＭ１６７８を内部で消化し、既知サイズ（例えば、ＩＮＶプローブについては４．６ｋｂ）のバンドを生じるので、これらの試験の制限酵素として選択した。再度、内在性バンドおよび挿入断片特異的バンドの両方が検出され、分析した３世代の間で一貫したバンディングのパターンが伴った。遺伝学的および表現型解析により、ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８の両方の形質転換によって生じる挿入が３世代にわたって安定であることが示された。３世代にわたって実証された安定性を考慮すると、安定性は、その後の栄養繁殖のサイクルの間、維持される可能性がある。
（実施例８）
接合部の分析および品種特異的検出
ＤＮＡ挿入断片／隣接植物ＤＮＡ接合部について、アダプターライゲーション媒介性ＰＣＲ（Ａｄａｐｔｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ）または熱非対称インターレースＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ）のいずれかを使用して配列決定した。
接合部配列を使用して、本開示のジャガイモ栽培品種に対するプライマーを設計し、これらのプライマーを品種特異的なＰＣＲに基づく検出方法に適用した。
プライマーを使用して、品種特異的ＤＮＡ断片を増幅することができ、それにより、前記品種に対する系統特異的な試験方法がもたらされる。開発した方法を、圃場において植物体および塊茎をモニターし、貯蔵して塊茎または加工食品製品中に遺伝子内材料が存在しないことを確認するため、および有機種子の純度を確実にするために使用した。
（実施例９）
遺伝子サイレンシングの有効性および組織特異性
遺伝子サイレンシング法を使用して、ネイティブなＡｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ、Ｒ１およびＶＩｎｖタンパク質の活性を低下させ、タンパク質量ではなく転写レベルを評価して、新表現型の形質を分子レベルでの変化と関連付けた。
葉および茎におけるＡＳＮ（アスパラギン）形成に関与するＡｓｎ１遺伝子の強力なサイレンシングは生育に悪影響を及ぼす可能性があるので、塊茎および匍匐枝において、塊茎特異的および匍匐枝特異的プロモーターであり、光合成的に活性な組織および根における活性ははるかに低いＡｇｐプロモーターおよびＧｂｓｓプロモーターを使用して遺伝子サイレンシングを駆動した。植物体品種と、それと共にそれらの形質転換されていない対応物の、様々な組織において標的化された５つの遺伝子の転写レベルをノーザンブロット分析によって決定した。
Ｗ８事象を作出するためにＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋに導入した３つの遺伝子サイレンシングカセットのうちの２つは、ＲＮＡｉ媒介性サイレンシングに関してそれらの標的転写物のサイレンシングにおいて非常に有効であった。これらの２つの構築物により、Ｗ８の塊茎におけるＡｓｎ１、Ｐｐｏ５、およびＶＩｎｖが有効にサイレンシングされた。塊茎に対するサイレンシングの特異性により、ＲＮＡｉ機構によって生じたｓｉＲＮＡの他の組織への拡散はあったとしてもわずかである、または、それらのレベルがそれらの組織においてＲＮＡｉ応答を引き起こすには不十分であることが示される。塊茎の外側でのサイレンシングの唯一の証拠は、花において低レベルのＡｓｎ１が観察されたが、それでも、変化の大きさは塊茎におけるものよりもはるかに低いことであった。ＰｈＬおよびＲ１を用いたプロモーターサイレンシング戦略の影響は最低限のものであり、これは、同じｐＳＩＭ１２７８構築物を含有する他の事象と一致した（ＣｏｌｌｉｎｇｅおよびＣｌａｒｋ、２０１３年）。
いくつかの遺伝子内ジャガイモ栽培品種の特定の組織において下方制御された転写物レベルの要約を表５に示す。表５中の各文字（Ａ、Ｐ、Ｌ、Ｒ）は、サイレンシングが確認されたが、サイレンシングの量は遺伝子および組織に応じて変動したことを示す。
（実施例１０）
ジャガイモ植物体葉組織からのＤＮＡ単離
ジャガイモ植物体葉組織３ｇからＤＮＡを抽出し、液体窒素中ですり砕き、抽出緩衝液（０．３５Ｍのソルビトール、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２０ｍｌと混合した。試料を、３，０００ｒｐｍで５分にわたってペレット化し、抽出緩衝液２ｍｌですすいだ。ペレットを抽出緩衝液４ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ、４μｌ中に再懸濁させた。核溶解緩衝液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５ＭのＮａＣｌ、２０ｍｇ／ｍｌのＣＴＡＢ）４ミリリットルおよび５％サルコシル１．６ｍｌを各試料に添加した。試料を混合し、６５℃で２０分間、撹拌しながらインキュベートした。試料を、等体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）と共に振とうし、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。水相を保持し、クロロホルム抽出ステップを２〜３回繰り返した。ＤＮＡを等体積のイソプロピルアルコール中に沈殿させ、３，０００ｒｐｍで１０分にわたってペレット化した。ペレットを７０％エタノールですすぎ、乾燥させ、ＴＥに再懸濁させた。
（実施例１１）
高収量の、ＣＴＡＢに基づくＤＮＡ抽出方法
ジャガイモおよびジャガイモ製品は、ＰＣＲ、特にｑＰＣＲに干渉する可能性がある多糖を高レベルで含有する。したがって、高品質のＤＮＡをもたらす方法を用いてＤＮＡ単離を実施すること、およびｑＰＣＲを、多糖などのＰＣＲ阻害物質による干渉が妨げられるように設計されたマスターミックスを使用して実施することが推奨される。これらの要件を満たすために、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）単離法およびＱｕａｎｔａから入手可能なＰｅｒｆｅＣＴａ（登録商標）ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）（実施例１６）を使用する。ジャガイモの葉材料から抽出したＤＮＡに関して試験した、事象特異的プライマーを使用したこれらのＰＣＲ方法では、高いＰＣＲ効率、良好な直線性、標的特異性、および頑強性がもたらされた。
抽出方法のプロトコール
１．ＣＴＡＢ緩衝液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５ＭのＮａＣｌおよび２０ｍｇ／ｍｌのＣＴＡＢ）を日ごとに新しく作製し、６５℃まで予め加熱する。
２．チップおよび塊茎に１０ｍＬのＣＴＡＢを添加する／フレークおよびフライに３０ｍＬのＣＴＡＢ緩衝液を添加する。
葉に１ｍＬのＣＴＡＢを添加する。
３．出発材料を以下の量で適切なチューブに添加する：
フレーク：３ｇ
凍結乾燥したフライ：３ｇ（新鮮なフライを使用する場合は６ｇ）
チップ（チップをすり砕いて滑らかなペーストにする）：１ｇ
凍結乾燥した塊茎：１ｇ
凍結乾燥した葉（すり砕いて微細な粉末にする）：０．５ｇ
４．１ｍｌ当たり３μＬのプロテイナーゼＫを各チューブに添加し、混合して凝集塊を除去する。
５．インキュベーター中、６５℃、２１０ｒｐｍで振とうしながら２〜３時間インキュベートする（塊茎および葉については４５分間で十分である）
６．試料を１４，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する（塊茎については２０分間、葉については１０分間で十分である）
７．上清をきれいなチューブに移し、氷上で２０分間インキュベートする
８．等体積の氷冷クロロホルムを添加する
９．任意選択：ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ ＤＮＡ抽出樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）２００μＬを出発材料１ｇごとに添加する。樹脂は、均一性を確実にするために使用する前にボルテックスする。
１０．試料を室温で勢いよく混合する。
１１．試料を１４，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する（塊茎については２０分間、葉については１０分間で申し分ない）
１２．上部の水相をきれいなチューブに移す。
１３．界面がきれいになるまでクロロホルム抽出を繰り返す（追加的な樹脂は必要ない）。
１４．３Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ５．３）を１／１０体積で添加する
１５．等体積のイソプロパノールを添加する。
１６．ＤＮＡが沈殿するまでチューブを反転させる（４℃で一晩が最適である）
１７．１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してＤＮＡをペレット化する（葉については５分間で十分である）。この時点で、いくつかの試料では明白なペレットができない可能性がある。この場合、上部の透明な層を慎重にピペットで取り除き、下部の濃い層を残し、これを、ステップ１９の間にペレット化する。
１８．氷冷７０％エタノールでペレットを洗浄する。
１９．ペレットを１４，０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離する。
２０．ペレットを、１０分間またはペレットの端が透明に見えるまで風乾する。
２１．ＤＮＡをＴＥ緩衝液２００〜４００μＬ中に再懸濁させる。
２２．ＲＮａｓｅを２０μｇ／ｍｌの濃度まで添加する。３７℃で３０分間インキュベートする。
２３．５体積のＱｉａｇｅｎ緩衝液ＰＢをＤＮＡに添加する。カラム当たりのＤＮＡは１０μｇを超えないようにする。
２４．ＤＮＡ／ＰＢ溶液を、カラムを通してスピンさせる。
２５．緩衝液ＡＷ２またはＰＥで２回洗浄する
２６．カラムを１４，０００ｒｐｍで２分間スピンさせてカラムを乾燥する。
２７．適量のＴＥ（５０μＬ）をカラムに適用し、６５℃で５分間静置した後、溶出させる。
２８．特に定量的分析を実施する場合には、ＤＮＡ濃度を蛍光インターカレート色素（例えば、Ｑｕｂｉｔ Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を使用して測定するべきであり、試料を段階希釈分析によってＰＣＲ阻害物質について試験するべきである。
（実施例１２）
ＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用した、塊茎、フレーク、チップ、およびフライからのＤＮＡ単離
以下のプロトコールを行ってＤＮＡを単離した。この技法を使用して単離したＤＮＡ試料は、前の節に記載のＣＴＡＢに基づく方法よりも純度が低く、収量が少ない傾向がある。ＰＣＲ阻害物質が存在するので、ＤＮＡの品質が任意の定量的分析に関して十分であることを確実にするために注意を払わなければならない。任意のマトリクスに特異的な指示を太字にする。
およそ３００ｍｇのフレーク、チップ、またはフライ組織を秤量し、１．７ｍｌのＱｉａｇｅｎ ＩｎｈｉｂｉｔＥＸ Ｂｕｆｆｅｒ（緩衝液は予め加熱していかなる沈殿物も再溶解させる）を含有する２．０ｍｌの微量遠心チューブに入れる。凍結乾燥した塊茎については、１．２ｍｌのＩｎｈｉｂｉｔＥＸ Ｂｕｆｆｅｒ中１５０ｍｇの組織を使用する。フライ材料およびフレーク材料については、別々に溶解させ、単一のカラムの下流で合わせる、２つの３００ｍｇ試料が必要である。チップ試料については、任意選択で、２つの試料を溶解させ、合わせて収量を増加させることができる。
３０〜６０秒間ボルテックスすることによって徹底的に混合する。
フレーク試料、チップ試料、および塊茎試料を加熱ブロック（好ましい）またはウォーターバス中、９５℃±５℃で３０分間インキュベートする。フライ試料については、その代わりに７０℃で３０分間インキュベートする。
チューブを、微量遠心機中、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
各チューブから上清６００〜６５０μｌを個々の２．０ｍｌの微量遠心チューブに移し、Ｑｉａｇｅｎ Ｋｉｔで提供されるプロテイナーゼＫを２５μｌ添加する。
ボルテックスすることによって徹底的に混合する。
緩衝液ＡＬを６００〜６５０μｌ各チューブに添加し、ボルテックスすることによって混合する。
試料を７０℃で１０分間インキュベートする。
９５〜１００％エタノール（キットでは提供されない）６００〜６５０μｌを添加し、ボルテックスすることによって混合する。
真空マニホールドまたは２１，０００×ｇでのパルス遠心分離を使用して、溶液６５０μｌを一度にＱｉａＡｍｐ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを通過させる。フライ材料およびフレーク材料については、単一のカラムに対して溶液に値する２本のチューブを通過させて濃縮する。最終的に１４，０００ｒｐｍで１分間スピンさせて全ての緩衝液を除去するべきである。
真空マニホールドまたは１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を使用して、カラムを５００μｌの緩衝液ＡＷ１で１回、５００μｌの緩衝液ＡＷ２で１回洗浄する。
カラムを２ｍｌの採取チューブに移動し、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、フロースルーを廃棄する。
カラムを新しい１．７ｍｌの微量遠心チューブに移し、塊茎およびチップについては５０μｌのＴＥ、またはフライおよびフレーク試料については３０μｌのＴＩをピペットで直接膜の上にのせる。
室温で３分間インキュベートする。
１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離してＤＮＡを溶出する。
ＤＮＡ（−２０℃で貯蔵する）を定量化およびＱＡする。全ての試料について（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０）および（ＯＤ２３０／ＯＤ２６０）比を記録すべきである。蛍光インターカレート色素（例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）を使用してＤＮＡ濃度を測定するべきであり、特に定量的分析を実施する場合には試料を段階希釈分析によってＰＣＲ阻害物質について試験するべきである。
（実施例１３）
ジャガイモ事象におけるＤＮＡ挿入断片および天然には存在しない接合部配列の分子特徴付け
全てのジャガイモ事象を、組み込まれたＤＮＡ挿入断片配列の構造およびコピー数を決定するため、およびベクター骨格配列が存在しないことを確認するために、ＤＮＡゲルブロット分析によって分析した。これらの試験は、事象の特徴付けおよびバイオセーフティ評価の一部として行った。分子特徴付けを使用してＤＮＡ挿入断片を挟む接合部の配列を決定し、挿入ＤＮＡの安定性を示した。接合部の配列決定情報により、全ての事象についての事象特異的ＰＣＲ試験を開発するための基礎がもたらされた（表６）。
図５には、ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８のＤＮＡ挿入断片領域について、構築物特異的な天然には存在しない接合部のそれぞれが存在するところに表６の配列番号が示されており、図６Ａ〜Ｉには、Ｅ１２事象、Ｆ１０事象、Ｊ３事象、Ｊ５５事象、Ｖ１１事象、Ｗ８事象、Ｘ１７事象、およびＹ９事象について、それぞれ構築物特異的および事象特異的な天然には存在しない接合部が存在するところに表６の配列番号が示されている。
表６に関して、最初の２つの配列（配列番号１および２）は、ジャガイモゲノムの一部ではない２５ヌクレオチドの合成配列である、挿入断片のはるか外側の端に存在する接合部を表す。これらは左境界と右境界の両方に存在する。これらは表６にＬＢ合成／ＬＢジャガイモおよびＲＢ合成／ＲＢジャガイモとして含まれる。
さらに、表６は、ボールド体および強調表示された字体で、１）染色体ＤＮＡと挿入断片の境界配列の両方に配列が共通する、染色体ＤＮＡに対する配列マイクロホモロジーも提供する。これらは、配列内のそれらが存在する場所に太字および強調表示された字体で列挙されている。表６は、２）接合部位間に存在する介在配列も提供する。これらの配列には下線が引かれており、接合部の各側面に１５ｂｐの配列が残されている。
ジャガイモ事象Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９におけるＤＮＡ挿入断片の構造の図を図４および図６に示す。
事象Ｅ１２およびＦ１０は、１コピーを含有する（「コピー」は、少なくともＡｓｎ１／Ｐｐｏ５遺伝子サイレンシングカセットが存在することを意味する）。事象Ｊ３およびＪ５５は２コピーを含有する。コピー数の多い事象と１コピーしか有さない事象との間で、サイレンシング活性の程度および持続性に差異はなかった。
事象Ｊ５５は、逆方向反復として位置づけられた２つの連結したＤＮＡ挿入断片を含有した（図４および図６）。Ｌｅｃｈｔｅｎｂｅｒｇら（２００３年）は、細菌Ｔ−ＤＮＡを用いて、第２の遺伝子コピーが縦列配置または逆方向配置のいずれで存在しても、サイレンシングはもたらされないことを示した。したがって、Ｊ５５における逆方向の連結したＤＮＡ挿入断片コピーはサイレンシングには寄与しない可能性があり、したがって、標的化された遺伝子のサイレンシングは、収束プロモーターの間に位置づけられた逆方向反復に基づいて意図された通りに機能する。
事象Ｗ８を作製するためのｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８によるＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋの形質転換に付随する挿入断片の遺伝学的および構造的特徴付けから、どちらの形質転換によっても各プラスミドに対して単一の組み込み部位がもたらされることが示された。ｐＳＩＭ１２７８の形質転換に由来するＤＮＡの構造は、元の挿入断片の構造と比較して複雑であった。挿入ＤＮＡは、形質転換の間に再構成を受けたと思われ、その結果、Ａｓｎ１／Ｐｐｏ５サイレンシングカセットの縦列反復、その後に、ほぼ完全なｐＳＩＭ１２７８構築物、ならびに、ｐＲ１／ｐＰｈｌサイレンシングカセットの重複およびＰｈｌ配列が介在するＧｂｓｓプロモーターの縦列重複を含有する逆方向反復からなる構造がもたらされた（図６）。
この構造は、予測よりも複雑であるが、重複したサイレンシングカセットは、インタクトであり、組織特異的プロモーターの制御下に残る。この構造は、産物の安全性または形質の有効性に負の影響を及ぼさない。
Ｗ８は、組み込みの単一の遺伝子座に存在する、単一コピーのｐＳＩＭ１６７８由来のＤＮＡも含有する（図６）。ｐＳＩＭ１６７８のＤＮＡ挿入断片は、ほぼインタクトなＤＮＡ挿入断片を含有し、Ｔ−ＤＮＡ左境界全体およびＲｐｉ−ｖｎｔ１プロモーターの１３７−ｂｐが除去される３３０−ｂｐの欠失を伴う。この、プロモーターの小さな欠失は、遺伝子の疫病抵抗性を付与する能力には影響を及ぼさない。また、Ｒｐｉ−ｖｎｔ１遺伝子に関連するＲＮＡ発現はＲＴ−ＰＣＲを使用して実証されている。
挿入断片は、時々、植物のゲノムまたはＤＮＡ挿入断片に由来する短いＤＮＡ配列で挟まれる。これらの挿入は、組み込みプロセスの一部であると思われ、ある程度高い頻度で生じる（Ｗｉｎｄｅｌｓら、２００３年）。そのような配列を有する事象の例としては、Ｊ５５の２つのＤＮＡ挿入断片間の４９−ｂｐの配列が挙げられる。ＧｅｎＢａｎｋを使用したこの短いＤＮＡ配列のｂｌａｓｔ検索では、Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに由来する公知の配列と部分的にマッチし、これにより、植物のゲノムまたはＤＮＡ挿入断片のいずれを起源とする可能性が最も高いことが確認される。
移入されるＤＮＡ挿入断片の大多数は、境界付近の短い欠失によって示される通り、左境界配列と右境界配列の間の完全な距離よりも短い。そのような欠失はまた、Ｔ−ＤＮＡ組み込みにも関連し二本鎖切断修復に起因するという仮説が立てられた（Ｇｈｅｙｓｅｎら、１９９１年）。２つのサイレンシングカセットの機能活性を損なわない短い欠失は、例えば、事象Ｆ１０において見出された（右境界における３８−ｂｐの欠失）。
（実施例１４）
ｑＰＣＲプライマーおよびプローブの開発
目的の事象（ジャガイモゲノム隣接領域）またはｐＳＩＭ１２７８構築物もしくはｐＳＩＭ１６７８構築物自体の接合部のいずれかに特異的であるゲノムの領域を増幅するために、事象特異的なプライマーを設計した。これらのプライマーにより、標的特異的な蛍光プローブが結合するとリアルタイム検出および産物の定量化が可能になる領域内の７０〜２００塩基対の領域が増幅される。
各蛍光プローブの５’末端を６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）部分で標識し、３’末端をＢＨＱ１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）１）部分で標識する。６−ＦＡＭによる蛍光は、同じオリゴヌクレオチド上にＢＨＱ１が存在することによってクエンチされる。ＰＣＲの間、増幅される標的鎖とアニーリングしたプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断され、その結果、６−ＦＡＭ部分とＢＨＱ１部分が分離する。したがって、ＢＨＱ１による６−ＦＡＭのクエンチは消失し、それにより、６−ＦＡＭ蛍光が放出される。プローブは、熱安定性および特異性を増大させるためにロックド核酸（ＬＮＡ）プローブとして設計される（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｍ．およびＷｅｎｇｅｌ， Ｊ．（２００３年）、ＬＮＡ： Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ｄｏｉ： １０．１０１６／Ｓ０１６７−７７９９ （０２） ０００３８−０）。
内在性対照として、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）に特異的なプライマーおよび二重標識した（ＦＡＭおよびＴＡＭまたはＢＨＱ１）プローブを使用してＡＰＲＴを増幅する。ＡＰＲＴは、リアルタイムＰＣＲを使用した、ジャガイモにおける種々の生物的および非生物的ストレス試験の間の安定性に基づいて選択した（Ｎｉｃｏｔ， Ｎ．、Ｈａｕｓｍａｎ， Ｊ．−Ｆ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｌ．およびＥｖｅｒｓ， Ｄ．（２００５年）、Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｄｕｒｉｎｇ ｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、５６巻（４２１号）、２９０７〜１４頁、ｄｏｉ： １０．１０９３／ｊｘｂ／ｅｒｉ２８５）。しかし、任意の適切な対照遺伝子を利用することができる。
ＡＰＲＴ対照または各事象に特異的な二重標識したプローブとフォワードプライマーおよびリバースプライマーが共に表７に列挙されている。
（実施例１５）
アッセイの効率および直線性
最適化されたｑＰＣＲアッセイの特質のうち２つは、ＰＣＲ効率が高いこと（Ｅ）および相関係数Ｒ２によって測定される検量線が直線的であることである。理想的なｑＰＣＲ反応の効率は、１００％、傾き−３．３２であり、これは、各サイクル中のＰＣＲ産物の完全な倍加と相関する。しかし、−３．１から−３．６の間の傾き、９０％から１１０％の間の効率が一般に許容されるとみなされる（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ， Ｃ． Ａ．（２００９年）、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＧＭＯ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ＧＭＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＥＮＧＬ）、（２００８年１０月）、１〜８頁）。効率は、反復検量線によって確立される。増幅効率は、検量線の対数線形部分の傾きから決定し、Ｅ＝（１０（−１／傾き）−１）＊１００として算出し（Ｂｕｓｔｉｎ， Ｓ． Ａ．ら、（２００９年）。Ｔｈｅ ＭＩＱＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５巻（４号）、１〜１２頁、ｄｏｉ： １０．１３７３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ． ２００８．１１２７９７）、Ｒ２値は、線形回帰分析によって決定し、≧０．９８であるべきである（Ｂｕｓｔｉｎら、２００９年）。
表８は、各事象特異的および構築物特異的ｑＰＣＲアッセイの効率および直線性を示す。
各アッセイで、推奨される範囲である９０〜１１０％の間の高い効率、および０．９８を超えるかまたはそれと等しいＲ２値が実証される。
６０℃の複合アニーリング／伸長温度を使用して葉のＤＮＡに対して実施したアッセイからのデータを示す。
（実施例１６）
ジャガイモの葉のＤＮＡにおけるアッセイの検出のレベル（ＬＯＤ）
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ＧＭＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに従って、「検出の限界とは、単一の実験室による検証によって実証される、確実に検出することができるが、必ずしも定量化されない、試料中の分析物の最低の量または濃度である（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ａｍｏｕｎｔ ｏｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｅ ｉｎ ａ ｓａｍｐｌｅ， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｌｉａｂｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｎｅｃｅｓｓａｒｉｌｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ， ａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ、２００９年）。ＬＯＤは、分析物を少なくとも９５％の確率で検出し、生じる偽陰性結果は≦５％であるべきである。報告された各アッセイでは、全標的ＤＮＡの少なくとも２４ｐｇを９５％超の確率で確実に検出することができた。ＬＯＤは、使用するＤＮＡの供給源に応じて変動する。なぜなら、ジャガイモに基づく食品製品から単離されたＤＮＡにおいて頻繁に見られる通り、ＤＮＡは、断片化されるかまたは阻害物質、特に多糖を含有する可能性があるからである。ＰＣＲ反応に十分なＤＮＡが使用されれば、定性的分析および定量的分析は＜０．１％のＧＭＯに達し得る。
表９は、各事象特異的および構築物特異的ｑＰＣＲアッセイの検出のレベルを示す。各アッセイでは、３４サイクルから３５サイクルの間に、少なくとも２４ｐｇのジャガイモの葉のＤＮＡが確実に増幅された。６０℃のアニーリング／伸長温度を使用して実施したアッセイからのデータを示す。
（実施例１７）
事象特異的ｑＰＣＲアッセイの頑強性
方法の頑強性とは、その方法の、アッセイの実験条件の小さな変化による影響を受けないままである能力の尺度である。例えば、ＰＣＲアッセイは、異なるサーマルサイクラーモデルで、異なる使用者によって、および温度プロファイルまたはＤＮＡポリメラーゼに小さな偏差を伴って、実行できるものであるべきである。アッセイは、これらの条件下で±３０％を超えて逸脱すべきではないことが一般に認められている（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ、２００９年）。５８℃から６１℃までの４度の複合アニーリング／伸長温度範囲にわたって各アッセイの効率および直線性を決定した（表１０）。アッセイのさらなる頑強性は、異なる使用者、サーマルサイクラーおよびポリメラーゼを使用して外の研究室で実施されるアッセイを外部で検証することによって決定される。
表１０は、４度の複合アニーリング／伸長温度範囲にわたる各アッセイの効率および直線性を示す。５８℃でのＦ１０を例外として、アッセイの全てが、範囲全体にわたって、９０〜１１０％の効率および≧０．９８のＲ２値で良好に実施された。
（実施例１８）
系統特異的なプライマーおよびプローブの特異性
各プライマーおよびプローブセットの特異性を、各事象（Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｗ８、Ｖ１１、Ｘ１７、およびＹ９）に由来するＤＮＡを３つのＤＮＡ濃度（２５ｎｇ、２５０ｐｇ、および５０ｐｇ）で用い、各商業品種（Ａｔｌａｎｔｉｃ、Ｒａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ、ＢｕｒｂａｎｋおよびＳｎｏｗｄｅｎ）のＤＮＡを２５ｎｇで使用して、ｑＰＣＲを実施することによって評価した。
Ｅ１２、Ｊ３、Ｊ５５、Ｗ８、Ｖ１１、Ｘ１７、およびＹ９を検出するために使用したプライマーでは、試験した濃度のいずれにおいても偽陽性または陰性は示されなかった。
Ｆ１０のために使用したプライマーでは、３９サイクル後に単一の技術的代表２５ｎｇのＥ１２試料が増幅され、偽陽性率は２．３％であり、これは、５％許容範囲内である。
ｐＳＩＭ１２７８構築物のために使用したプライマーでは、４１サイクル後に２つの異なる野生型品種から単一の技術的な代表が増幅された。このアッセイを改善するために、ＰＣＲサイクルパラメータを調整し、試料を再度試験した。新しいパラメータでは、ｐＳＩＭ１２７８またはｐＳＩＭ１６７８について偽陽性は生じなかった。
事象（Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｗ８、Ｖ１１、Ｘ１７、およびＹ９）および構築物（ｐＳＩＭ１２７８およびｐＳＩＭ１６７８）についてのｑＰＣＲ反応の設定およびｑＰＣＲサイクル条件を表１１〜１３に示す。
記載されている方法により、全てのＩｎｎａｔｅ（商標）事象（ＧＥＮ１およびＧＥＮ２を含める）に共通するｐＳＩＭ１２７８構築物を検出するためのｑＰＣＲを使用し、凍結乾燥したＩｎｎａｔｅ（商標）参照材料から導かれた検量線を使用して、ジャガイモおよびジャガイモ製品中のＩｎｎａｔｅ（商標）製品を検出することが可能になる。さらに、各事象を、定性的に、＜０．１％ＧＭＯの検出限界で一意的に検出するプライマーおよびプローブのセットがもたらされた。
さらに、記載されている方法により、全てのＧＥＮ２ Ｉｎｎａｔｅ（商標）事象（すなわち、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９）に共通するｐＳＩＭ１６７８構築物を検出するためのｑＰＣＲを使用し、凍結乾燥したＩｎｎａｔｅ（商標）参照材料から導かれた検量線を使用して、ジャガイモおよびジャガイモ製品中のＩｎｎａｔｅ（商標）製品を検出することが可能になる。
（実施例１９）
食品混合物における方法の内部検証
開発したＤＮＡ単離方法を検査するために、いくつかの食品混合物を調製した。本発明者らの内部検査は、Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｊ３（チップ品種）またはＲａｎｇｅｒ Ｒｕｓｓｅｔ Ｆ１０（フライ品種）のいずれかの食品マトリクス全てからのＤＮＡの単離に焦点を合わせた。集合的に、これらの２つの事象は、考察される全てのマトリクス（塊茎、フライ、チップ、およびフレーク）を包含する。表１４に記載されている通り、すり砕いたＩｎｎａｔｅ（商標）の食品製品を、商業品種の食品製品中に混合した。全ての事象に同様の結果が予測される。
各食品混合物に対して、実施例１２に記載の通りＱｉａｇｅｎのＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して、２〜３回の独立したＤＮＡ単離を実施した。表１５は、６００ｍｇのフライ、フレークまたはチップ混合物、または３００ｍｇの塊茎からの全体的なＤＮＡ濃度および収量を示す。
ｑＰＣＲに使用するＤＮＡの品質が十分なものであることを確実にするために、各ＤＮＡ単離を、適切なセットのプライマーおよびプローブを用いて３連で行った。各ＤＮＡ単離物２μｌを各反応に使用し、内在性参照遺伝子であるＡＰＲＴを陽性対照として使用した。
ＤＮＡ単離方法により、その後の上記の食品製品のそれぞれにおけるｑＰＣＲ分析に使用するのに十分な濃度および収量のＤＮＡが生じた。その後のｑＰＣＲ分析からの結果は、図７に見出すことができる。
参照による組み込み
本明細書において引用されている全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、あらゆる目的に関してそれらの全体が参照により組み込まれる。しかし、本明細書において引用されている参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願のいずれに対する言及も、それらが有効な先行技術を構成するまたは世界の任意の国における共通の一般知識の一部を形成することの承認またはいかなる形態の示唆でもなく、そのように取られるべきではない。
上記の説明は、単に例示的な実施形態および実施例を表すものであることが理解されるべきである。読者の利便性のために、上記の説明は、本開示の原理を教示する全ての可能性のある実施形態、実施例のうちの限られた数の代表的な例に焦点を合わせている。説明は、全ての可能性のある変形またはさらには記載されるそれらの変形の組合せを徹底的に列挙しようとはしていない。本開示の特定の部分に関しては代替実施形態が示されていない場合があること、または別の記載されていない代替実施形態が一部に関して利用可能であり得ることは、それらの代替実施形態の権利放棄とみなされるべきではない。それらの記載されていない実施形態の多くは、本開示の原理の適用の差異ではなく、技術および材料の差異を伴うことが当業者には理解されよう。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲に記載されている範囲および等価物未満に限定されるものではない。
（項目１）
核酸試料における植物形質転換事象の存在を検出するための定量的ＰＣＲ方法であって、
ａ）ｉ）フォワードヌクレオチドプライマーとリバースヌクレオチドプライマーの対、ｉｉ）ヌクレオチドプローブ、およびｉｉｉ）検出しようとする天然には存在しないヌクレオチド接合部を含む上記試料由来の標的ヌクレオチド配列を組み合わせるステップであって、ここで
上記ヌクレオチドプローブは、上記天然には存在しないヌクレオチド接合部、または上記天然には存在しないヌクレオチド接合部の存在を示す配列に結合する、ステップと、
ｂ）上記試料から上記標的ヌクレオチド配列を検出するステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記天然には存在しないヌクレオチド接合部が、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、Ｙ９、またはこれらの組合せからなる群より選択される植物形質転換事象の結果として生じたものである、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記標的ヌクレオチド配列が、配列番号１〜４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
フォワードヌクレオチドプライマーとリバースヌクレオチドプライマーの上記対および上記ヌクレオチドプローブが、配列番号５２〜９０からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号５２を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号５３を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号５４を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｅ１２事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号５５を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号５６を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号５７を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｆ１０事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号５８を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号５９を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号６０を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｊ３事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号６１を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号６２を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号６３を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｊ５５事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号６４または６７を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号６５または６８を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号６６または６９を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｖ１１事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７０を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号７１を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号７２を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｗ８事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７３を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号７４を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号７５を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｘ１７事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７６を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号７７を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号７８を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
上記ヌクレオチドプローブが、Ｙ９事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目２１）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７９または８２を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号８０または８３を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号８１または８４を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記ヌクレオチドプローブが、ｐＳＩＭ１２７８に付随する、内側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目２３）
上記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号８５または８８を含み、上記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号８６または８９を含み、上記ヌクレオチドプローブが配列番号８７または９０を含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
上記ヌクレオチドプローブが、ｐＳＩＭ１６７８に付随する、内側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、項目１に記載の方法。
（項目２５）
上記核酸試料が、ジャガイモ植物体、もしくはジャガイモ植物体の一部、またはジャガイモ由来食品製品に由来するものである、項目１に記載の方法。
（項目２６）
上記核酸試料が、ジャガイモの花、ジャガイモの花被片、ジャガイモの花弁、ジャガイモの萼片、ジャガイモの葯、ジャガイモの花粉、ジャガイモの種子、ジャガイモの葉、ジャガイモの葉柄、ジャガイモの茎、ジャガイモの根、ジャガイモの根茎、ジャガイモの匍匐枝、ジャガイモの塊茎、ジャガイモの苗条、ジャガイモの細胞、ジャガイモのプロトプラスト、ジャガイモ植物体組織、およびこれらの組合せからなる群より選択されるジャガイモ植物体の一部に由来するものである、項目１に記載の方法。
（項目２７）
上記核酸試料が、ジャガイモ加工食品製品、ジャガイモ家畜飼料材料、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、ジャガイモ顆粒、ジャガイモタンパク質粉末、ジャガイモデンプン、ジャガイモ粉、インスタントジャガイモ製品、およびこれらの組合せからなる群より選択されるジャガイモ由来食品製品に由来するものである、項目１に記載の方法。
（項目２８）
上記核酸試料が、ジャガイモ由来食品製品に由来し、上記食品製品において、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９からなる群より選択される少なくとも１つの植物形質転換事象の存在を検出することが可能である、項目１に記載の方法。
（項目２９）
上記核酸試料が、ジャガイモ由来食品製品に由来し、上記食品製品において、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９からなる群より選択される少なくとも１つの植物形質転換事象の存在を上記食品製品全体の１％未満のレベルで検出することが可能である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
上記核酸試料が、ジャガイモ由来食品製品に由来し、上記食品製品において、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９からなる群より選択される少なくとも１つの植物形質転換事象の存在を上記食品製品全体の約０．１％〜約５％にわたるレベルで検出することが可能である、項目１に記載の方法。
（項目３１）
配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と少なくとも８５％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸接合部配列。
（項目３２）
配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と少なくとも９５％の配列相同性を共有する、項目３１に記載の単離された天然には存在しない核酸接合部配列。
（項目３３）
配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と１００％の配列相同性を共有する、項目３１に記載の単離された天然には存在しない核酸接合部配列。
（項目３４）
配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
（項目３５）
配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される核酸と少なくとも８５％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
（項目３６）
配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される核酸と少なくとも９５％の配列相同性を共有する、項目３５に記載の単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
（項目３７）
配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される核酸と１００％の配列相同性を共有する、項目３５に記載の単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
（項目３８）
配列番号５２〜９０からなる群より選択される核酸と少なくとも９５％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸プライマーまたはプローブ配列。
（項目３９）
項目３８に記載の核酸プライマーまたはプローブ配列を含むキット。

Claims (38)

  1. 核酸試料における植物形質転換事象の存在を検出するための定量的ＰＣＲ方法であって、
    ａ）配列番号５２〜９０からなる群より選択される、ｉ）フォワードヌクレオチドプライマーとリバースヌクレオチドプライマーの対およびｉｉ）ヌクレオチドプローブ、ならびにｉｉｉ）検出しようとする天然には存在しないヌクレオチド接合部を含む前記試料由来の標的ヌクレオチド配列を組み合わせるステップであって、ここで
    前記ヌクレオチドプローブは、前記天然には存在しないヌクレオチド接合部、または前記天然には存在しないヌクレオチド接合部の存在を示す配列に結合する、ステップと、
    ｂ）前記試料から前記標的ヌクレオチド配列を検出するステップと
    を含む、方法。
  2. 前記天然には存在しないヌクレオチド接合部が、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、Ｙ９、またはこれらの組合せからなる群より選択される植物形質転換事象の結果として生じたものである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的ヌクレオチド配列が、配列番号１〜４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号５２を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号５３を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号５４を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｅ１２事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号５５を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号５６を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号５７を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｆ１０事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号５８を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号５９を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号６０を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｊ３事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号６１を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号６２を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号６３を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｊ５５事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号６４または６７を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号６５または６８を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号６６または６９を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｖ１１事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７０を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号７１を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号７２を含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｗ８事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７３を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号７４を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号７５を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｘ１７事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７６を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号７７を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号７８を含む、請求項１に記載の方法。
  19. 前記ヌクレオチドプローブが、Ｙ９事象の、左側または右側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  20. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号７９または８２を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号８０または８３を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号８１または８４を含む、請求項１に記載の方法。
  21. 前記ヌクレオチドプローブが、ｐＳＩＭ１２７８に付随する、内側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  22. 前記フォワードヌクレオチドプライマーが配列番号８５または８８を含み、前記リバースヌクレオチドプライマーが配列番号８６または８９を含み、前記ヌクレオチドプローブが配列番号８７または９０を含む、請求項１に記載の方法。
  23. 前記ヌクレオチドプローブが、ｐＳＩＭ１６７８に付随する、内側の天然には存在しないヌクレオチド接合部に結合する、請求項１に記載の方法。
  24. 前記核酸試料が、ジャガイモ植物体、もしくはジャガイモ植物体の一部、またはジャガイモ由来食品製品に由来するものである、請求項１に記載の方法。
  25. 前記核酸試料が、ジャガイモの花、ジャガイモの花被片、ジャガイモの花弁、ジャガイモの萼片、ジャガイモの葯、ジャガイモの花粉、ジャガイモの種子、ジャガイモの葉、ジャガイモの葉柄、ジャガイモの茎、ジャガイモの根、ジャガイモの根茎、ジャガイモの匍匐枝、ジャガイモの塊茎、ジャガイモの苗条、ジャガイモの細胞、ジャガイモのプロトプラスト、ジャガイモ植物体組織、およびこれらの組合せからなる群より選択されるジャガイモ植物体の一部に由来するものである、請求項１に記載の方法。
  26. 前記核酸試料が、ジャガイモ加工食品製品、ジャガイモ家畜飼料材料、フレンチフライ、ポテトチップ、乾燥ジャガイモ材料、ジャガイモフレーク、ジャガイモ顆粒、ジャガイモタンパク質粉末、ジャガイモデンプン、ジャガイモ粉、インスタントジャガイモ製品、およびこれらの組合せからなる群より選択されるジャガイモ由来食品製品に由来するものである、請求項１に記載の方法。
  27. 前記核酸試料が、ジャガイモ由来食品製品に由来し、前記食品製品において、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９からなる群より選択される少なくとも１つの植物形質転換事象の存在を検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
  28. 前記核酸試料が、ジャガイモ由来食品製品に由来し、前記食品製品において、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９からなる群より選択される少なくとも１つの植物形質転換事象の存在を前記食品製品全体の１％未満のレベルで検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
  29. 前記核酸試料が、ジャガイモ由来食品製品に由来し、前記食品製品において、Ｅ１２、Ｆ１０、Ｊ３、Ｊ５５、Ｖ１１、Ｗ８、Ｘ１７、およびＹ９からなる群より選択される少なくとも１つの植物形質転換事象の存在を前記食品製品全体の約０．１％〜約５％にわたるレベルで検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
  30. 配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と少なくとも８５％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸接合部配列。
  31. 配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と少なくとも９５％の配列相同性を共有する、請求項３０に記載の単離された天然には存在しない核酸接合部配列。
  32. 配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸と１００％の配列相同性を共有する、請求項３０に記載の単離された天然には存在しない核酸接合部配列。
  33. 配列番号１〜４８からなる群より選択される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
  34. 配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される核酸と少なくとも８５％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
  35. 配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される核酸と少なくとも９５％の配列相同性を共有する、請求項３４に記載の単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
  36. 配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、および９０からなる群より選択される核酸と１００％の配列相同性を共有する、請求項３４に記載の単離された天然には存在しない核酸プローブ配列。
  37. 配列番号５２〜９０からなる群より選択される核酸と少なくとも９５％の配列相同性を共有する、単離された天然には存在しない核酸プライマーまたはプローブ配列。
  38. 請求項３７に記載の核酸プライマーまたはプローブ配列を含むキット。
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