CN116615535A - 利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法 - Google Patents
利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法，更具体地，涉及通过将包含靶向马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的单向导RNA(sgRNA)的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)复合物转导至马铃薯原生质体来制备褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的方法。由于本发明的方法没有外来基因的插入，只有与自然变异无法区分的微小变异，因此可与需要消耗巨大的成本及时间来评估安全性及是否具有环境危害性的转基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)作物不同，其有望节省成本及时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法。
背景技术
近来，消费者的食品购买方式转向天然产品偏好及健康导向，同时，随着单人家庭及核心家庭的增加，对具有新鲜度及便利性的轻度加工作物(minimally processedcrops)的需求正在增加。由于这种轻度加工作物在生产阶段中经过清洗、剥皮及切割等过程，因此消费者可在购买后无需经过预处理过程即可直接使用的优点。
马铃薯作为轻度加工作物之一，在加工过程中因剥皮及切割导致的表面暴露于空气中及细胞壁破坏，容易发生酶促褐变现象(enzymatic browning)。
在包括马铃薯在内的植株中发生这种酶促褐变现象的主要原因是多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)蛋白，多酚氧化酶蛋白是一种含有Cu2+的酶，通过氧化细胞中存在的多酚化合物来转化为左旋多巴(L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)，L-DOPA)，左旋多巴转化为多巴醌后，经氧化聚合反应引起形成深褐色黑色素的褐变现象。
众所周知，这种褐变反应不仅使轻度加工作物呈现出令人不快的颜色及气味，而且还会降低营养价值。并且，由于像这样在轻度加工作物的储存及流通过程中发生褐变的产品的商品性降低导致经济损失，因此有必要抑制褐变。
最近的基因组编辑技术显示了使用各种类型的位点特异性核酸酶(nuclease)在所需基因组DNA位置诱导基因突变的可能性。其中，CRISPR/Cas9系统作为与植物及其他许多有机体相关的强大的基因组编辑工具而周知。该系统的优点是精确有效地将突变引入靶位点。并且，表明基因编辑作物与通过现有传统育种技术开发的作物相比没有差异。
另一方面，日本公开专利第2019-507595号中公开了“一种显示减少的损伤诱发性表面变色的植物”，韩国公开专利第2016-0087651号中公开了“一种防止褐变的有色马铃薯及防止有色马铃薯褐变的方法”，但没有记载本发明的“一种利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法”。
发明内容
技术问题
本发明鉴于如上所述的要求而导出，本发明人为了抑制褐变，通过利用CRISPR系统代替普通的杂交育种或基因修饰方法来编辑马铃薯多酚氧化酶2基因，从体外培养的无菌马铃薯幼苗中分离原生质体之后，通过聚乙二醇(PEG)介导的转染(transfection)方法引入核糖核蛋白(RNP)复合物(StPPO2sgRNA+Cas9)后，通过引入的原生质体的细胞再生及分化来最终选择马铃薯多酚氧化酶2基因被编辑的个体，并且从选择的基因编辑植株中选择多酚氧化酶2(PPO2)蛋白活性及褐变现象得到抑制的马铃薯品系，从而完成了本发明。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供一种用于抑制马铃薯植株褐变的基因组编辑用组合物，其包含如下成分作为有效成分：对马铃薯来源的马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA(guide RNA)和核酸内切酶(endonuclease)蛋白的复合物(ribonucleoprotein)；或者重组载体，包含编码对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA的DNA及编码核酸内切酶蛋白的核酸序列。
并且，本发明提供一种向导核酸，其为在构成马铃薯多酚氧化酶2(Solanumtuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的核苷酸序列中对靶区域具有特异性的RNA序列，上述靶区域为序列号5的碱基序列。
并且，本发明提供一种褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的制备方法，其包括：步骤(a)，通过将对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA及核酸内切酶蛋白引入马铃薯植物细胞中来编辑基因组；以及步骤(b)，从上述基因组被编辑的马铃薯植物细胞再生马铃薯植株。
并且，本发明提供一种通过上述方法制备的褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株及其基因组被编辑的种薯。
发明的效果
通过本发明的方法制备的褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株，即使在预先切削或捣碎的情况下也可延缓褐变，便于加工或烹饪，减少额外工序，如用于抑制褐变的加热及添加人工添加剂等。并且，由于本发明的方法没有外来基因的插入，只有与自然变异无法区分的微小变异，因此可与需要消耗巨大的成本及时间来评估安全性及是否具有环境危害性的转基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)作物不同，其有望节省成本及时间。
附图说明
图1至图4是为了验证候选单向导RNA而进行的体内试验(In vivo assay)的靶向深度测序(Target deep-sequencing)结果。
图5示出从马铃薯幼植株的叶子中分离原生质体，(A)部分是VCP处理马铃薯幼植株的叶子的状态，(B)部分是示出通过用蔗糖浓度梯度分离经VCP处理的原生质体来确认的完整(intact)的原生质体(红色箭头标记部分)的状态，(C)部分是最终分离的原生质体的显微镜观察照片。
图6是从引入CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物的马铃薯原生质体再生的植株的状态。
图7至图10是从引入CRISPR/Cas核糖核蛋白复合物的原生质体再生的植株中的部分个体的深度测序(deep-seq.)分析结果。
图11是示出本发明的方法的马铃薯原生质体的马铃薯多酚氧化酶2编辑效率(左)及马铃薯原生质体来源的马铃薯多酚氧化酶2编辑物的插入缺失(InDel)模式(右)的结果。
图12是使用马铃薯块茎测定多酚氧化酶2(PPO2)蛋白活性的结果。
图13是使用马铃薯块茎观察褐变现象的结果，(A)部分是将马铃薯的块茎切片后比较对照区(WT)与基因编辑物(GE#14、#25)的状态，(B)部分是将马铃薯块茎仅去除表皮后比较对照区(WT)与基因编辑物(GE#14、#25)的状态。
具体实施方式
为了实现本发明的目的，本发明提供一种用于抑制马铃薯植株褐变的基因组编辑用组合物，其包含如下成分作为有效成分：对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2(Solanumtuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA(guide RNA)和核酸内切酶(endonuclease)蛋白的复合物(ribonucleoprotein)；或者重组载体，包含编码对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA的DNA及编码核酸内切酶蛋白的核酸序列。
在本发明的组合物中，用于抑制马铃薯植株褐变的基因组编辑的靶基因为由序列号1的碱基序列组成的马铃薯多酚氧化酶2基因。
在本说明书中，术语“基因组/基因编辑(genome/gene editing)”是指可在包括人类细胞在内的动植物细胞的基因组碱基序列中引入靶向变异的技术，通过基于DNA切割的一个以上的核酸分子的缺失(deletion)、插入(insertion)及取代(substitutions)等来敲除(knock-out)或敲入(knock-in)特定基因，或者也可在不生成蛋白质的非编码(non-coding)DNA序列中引入变异的技术。根据本发明的目的，上述基因组编辑可以为尤其使用核酸内切酶(endonuclease)，例如，Cas相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)及向导RNA，在植株中引入变异。并且，术语“基因编辑(gene editing)”可与“基因编辑(gene engineering)”混用。
并且，术语“靶基因”是指存在于通过本发明所要编辑的植株的基因组中的部分DNA，不限定于其基因的种类，并且均可包括编码区域及非编码区域。普通技术人员可根据其目的，根据需要产生的变异对所要制备的基因组编辑植株选择上述靶基因。
并且，术语“向导RNA(guide RNA)”是指短的单链RNA，包含在编码靶基因的碱基序列中对靶DNA具有特异性的RNA，并且其全部或部分与靶DNA碱基序列互补结合，起到以相应靶DNA碱基序列引导核酸内切酶蛋白的作用的RNA。上述向导RNA是指双重RNA(dual RNA)或单向导RNA(single guide RNA，sgRNA)形式，上述双重RNA包含crRNA(CRISPR RNA)及反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)这两个RNA作为结构要素；上述单向导RNA包括：包含与靶基因中的碱基序列全部或部分互补的序列的第一位点；以及包含与核酸内切酶(尤其，RNA-向导核酸酶)相互作用的序列的第二位点，但是，若核酸内切酶为可在靶碱基序列中具有活性的形式，则可不受限制地包括在本发明的范围内，并且可考虑一并使用的核酸内切酶的种类或来源于核酸内切酶的微生物等，根据本领域公知的技术制备并使用。
并且，上述向导RNA可以是从质粒模板转录的、在体外(in vitro)转录(transcribed)的(例如，寡核苷酸双链)或合成的向导RNA等，但并不限定于此。
在本发明的基因组编辑用组合物中，上述向导RNA被设计为对由序列号5的碱基序列组成的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性，其特征在于，相对于被设计为对序列号2至序列号4的靶碱基序列具有特异性的其它马铃薯多酚氧化酶2基因编辑用向导RNA，被设计为对上述序列号5的碱基序列具有特异性的向导RNA的插入缺失(InDel)突变诱导效率更高。尤其，由于马铃薯是一种四倍体作物，因此若通过使用插入缺失(InDel)效率高的向导RNA来适用CRISPR/Cas系统，则提高可获得4个等位基因均被编辑的个体的效率。
并且，在本发明的基因组编辑用组合物中，上述核酸内切酶蛋白可以为选自由Cas9、Cpf1(来自普雷沃氏菌和弗朗西斯氏菌1的CRISPR(CRISPR from Prevotella andFrancisella 1))、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)、锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)或其功能性类似物组成的组中的一种以上，优选地，可以为Cas9蛋白，但并不限定于此。
并且，上述Cas9蛋白可以为选自由酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)来源的Cas9蛋白、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)来源的Cas9蛋白、嗜热链球菌(S.thermophilus)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)来源的Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源的Cas9蛋白、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)来源的Cas9蛋白、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)来源的Cas9蛋白组成的组中的一种以上，但并不限定于此。Cas9蛋白或其基因信息可从公知的数据库中获得，如美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的基因库(GenBank)。
Cas9蛋白是RNA向导的DNA(RNA-guided DNA)核酸内切酶，可诱导双链DNA断裂(double stranded DNA break)。为了使Cas9蛋白准确地与靶碱基序列相结合后使DNA链断裂，被公知为前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)的由3个碱基组成的短碱基序列应存在于靶碱基序列旁边，Cas9蛋白通过假定从PAM序列(NGG)的第3个与第4个碱基对之间进行断裂。
在本发明的基因组编辑用组合物中，上述向导RNA及核酸内切酶蛋白可通过形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein)复合物而起到RNA基因剪刀(RNA向导的工程化核酸酶(RNA-Guided Engineered Nuclease)，RGEN)的作用。
本发明还提供一种向导核酸，其为在构成马铃薯多酚氧化酶2(Solanumtuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的核苷酸序列中对靶区域具有特异性的RNA序列，上述靶区域为序列号5的碱基序列。
本发明的“向导核酸”是指前述的“向导RNA”，除了对靶区域具有特异性的RNA序列以外，包括核酸内切酶结合位点。上述核酸内切酶可优选为RNA向导的核酸酶。但并不限定于此。
本发明的向导核酸可优选为单向导RNA(single guide RNA，sgRNA)形式，但并不限定于此。
在本发明一实例的向导核酸中，当合成对上述靶区域具有特异性的RNA序列时，在相当于从PAM碱基第20个的靶序列的碱基为腺嘌呤(adenine，A)、胸腺嘧啶(thymine，T)或胞嘧啶(cytosine，C)的情况下，可用鸟嘌呤(guanine，G)代替来合成，但并不限定于此。
当本发明的向导核酸在由序列号5的碱基序列组成的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶序列中诱导插入缺失(insertion-deletion，InDel)突变时，与可通过引起几个bp大小(1～10bp)的缺失突变来诱发数百个bp大小的碱基插入或缺失变异体的向导RNA相比，其在基因组变异方面具有安全性较高的特征。
并且，本发明提供一种褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的制备方法，其包括：步骤(a)，通过将对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum PolyphenolOxidases 2，StPPO2)基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA(guide RNA)及核酸内切酶(endonuclease)蛋白引入马铃薯植物细胞中来编辑基因组；以及步骤(b)，从上述基因组被编辑的马铃薯植物细胞再生马铃薯植株。
在本发明一实例的制备方法中，对上述马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA及核酸内切酶蛋白如上所述。
本发明中所使用的CRISPR/Cas9系统是一种基于非同源性末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)机制的基因编辑方法，该机制为通过在所要编辑的特定基因的特定位置引入双螺旋断裂来诱导DNA修复过程中诱导的不完全修复引起的插入缺失(insertion-deletion，InDel)突变。
在本发明的制备方法中，可以使用如下成分将上述步骤(a)的向导RNA及核酸内切酶蛋白引入马铃薯植物细胞中：对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA和核酸内切酶蛋白的复合物(ribonucleoprotein)；或者重组载体，包含编码对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA的DNA及编码核酸内切酶蛋白的核酸序列，但并不限定于此。
在本发明的制备方法中，将上述向导RNA和核酸内切酶蛋白的复合物转导至植物细胞中的方法可适当选自原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens et al.,1982,Nature 296:72-74；Negrutiu et al.,1987,Plant Mol.Biol.8:363-373)、原生质体的电穿孔法(Shillito et al.,1985,Bio/Technol.3:1099-1102)、向植物元素的显微注射法(Crossway et al.,1986,Mol.Gen.Genet.202:179-185)、各种植物元素的(DNA或RNA包被)粒子轰击法(Klein et al.,1987,Nature 327:70)、在根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转移中(非完整性)的细菌感染等。
并且，将重组载体引入植物细胞是指一种转化方法，上述重组载体包含编码对上述靶碱基序列具有特异性的向导RNA的DNA及编码核酸内切酶蛋白的核酸序列。植物物种的转化已不仅是双子叶植物，而对包括单子叶植物的植物物种来说是普遍的。原则上，任意转化方法可用于将本发明的重组载体引入到合适的祖细胞。
在本发明的制备方法中，对上述靶碱基序列具有特异性的向导RNA及核酸内切酶蛋白被引入的“植物细胞”为任何植物细胞。植物细胞为培养细胞、培养组织、培养器官或整体植物。“植物组织”是分化或未分化的植物的组织，例如根、茎、叶、花粉、小孢子、卵細胞、种子及用于培养的各种形式的细胞，即包括单细胞、原生质体(protoplast)、芽及愈伤组织，但不并限定于此。植物组织可以为植物原位(in planta)组织或者处于器官培养、组织培养或细胞培养状态的组织。本发明的优选植物细胞为原生质体。
在本发明的制备方法中，上述步骤(b)的基因组被编辑的马铃薯植物细胞可以是在马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列中被诱导产生1～10bp大小的缺失(deletion)变异，但并不限定于此。
在本发明的制备方法中，从基因组被编辑的植物细胞再生基因组被编辑的植物的方法可使用本领域公知的任意方法。基因组被编辑的植物细胞应再生为整体植物。通过愈伤组织或原生质体培养再生成熟植物的技术对于许多不同物种在本领域是周知的。
并且，本发明提供一种通过上述方法制备的褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株及其基因组被编辑的种薯。
本发明的褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株是一种利用CRISPR/Cas9系统编辑参与褐变现象的马铃薯多酚氧化酶2基因的植株，由于马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因被敲除，与未编辑基因组的马铃薯植株相比，该植株为具有褐变得到抑制的形质的基因组编辑马铃薯植株。
尤其，本发明的基因组编辑马铃薯植株可以是在马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列中被诱导产生1～10bp大小的缺失(deletion)变异，与数百bp大小的碱基插入或缺失变异体被诱发的基因组编辑植株相比，其在基因组变异方面具有安全性较高的特征。
在本说明书中，术语“StPPO2”可与“StuPPO2”互换使用。
以下，将通过实施例详细说明本发明。但是，以下实施例仅用于例示本发明，本发明的内容并不限定于以下实施例。
实施例1.马铃薯多酚氧化酶2基因单向导RNA选择
通过使用CRISPR RGEN工具网站(www.rgenome.net/Cas-designer)上的马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因序列来选择4种不同的单向导RNA(表1)。在以下表1中示出的单向导RNA是通过反映各种条件(鸟嘌呤及胞嘧啶含量(GC content)、帧外分数(out offrame score)及基因组序列中的错配数(mismatch number)等)来进行选择。在本发明中，序列号2至序列号5的碱基序列是指从以下表1中的RGEN靶序列中除去PAM碱基(下划线标记)的序列。
表1
用于马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因编辑的单向导RNA靶序列
在分别合成所选的4个靶序列的单向导RNA后，为了验证进行体外切割试验(Invitro cleavage assay)及体内试验(In vivo assay)。体外切割试验(In vitro cleavageassay)为如下的方法：在包含靶DNA PCR片段的试管中不加入Cas9及单向导RNA(试样1)、以1∶1比例加入Cas9及单向导RNA(试样2)、以1∶3比例加入Cas9及单向导RNA(试样3)后，发生反应，将这些反应产物进行电泳分析来调查是否对相应单向导RNA的靶DNA起作用。在此情况下，当分析中使用的单向导RNA对靶DNA起作用时，通过靶DNA切割来确认出2个以上条带，当单向导RNA对靶DNA不起作用时，切割的产物不被确认。
并且，体内试验(In vivo assay)为如下的方法：将选择的各个单向导RNA通过如Cas9的聚乙二醇(PEG)介导的转导方法来引入原生质体细胞(5×105)中，经过约3天(在细胞核中的核糖核蛋白[Cas9+单向导RNA]复合物与靶基因的反应时间)后，从原生质体中分离基因组DNA，并通过PCR方法进行靶向深度测序(Target deep-sequencing)分析，从而分析插入缺失(InDel)效率。
通过体内试验(In vivo assay)选择的4种单向导RNA的插入缺失(InDel)效率确认为StPPO2-1至StPPO2-3为0％、StPPO2-4为1.9％(图1至图4)。基于上述验证实验结果，本发明人最终选择了StPPO2-4(序列号5)作为用于编辑马铃薯多酚氧化酶2基因的单向导RNA的靶序列。
实施例2.马铃薯原生质体分离及培养方法
在培养皿中放入10ml的VCP(复合多糖酶(Viscozyme)、纤维素酶(Celluclast)、果胶酶(PectinEX))酶溶液，切下体外培养的底西瑞(Desiree)品种(马铃薯(Solanumtuberosum L.cv.)底西瑞(Desiree))幼植株的叶子(约5～7片)，以叶子背面朝上的方式放入上述培养皿后，在25℃的温度及暗条件下，以45rpm的搅拌速度反应约5小时。接着，在观察酶解程度后，当观察到叶组织变得透明时，进行原生质体分离。当VCP酶促反应完成时，用一次性筛网(disposable mesh，Falcon公司，40μm)过滤后，移到14ml圆管中，以800rpm离心5分钟。在离心后弃上清液，加入W5溶液(Menczel L.et al.(1981)Theor.Appl.Genet.59；191-195)1ml后，小心地溶解原生质体，然后缓慢加入W5溶液9ml后，以800rpm离心5分钟，进行第一次清洗。重复相同的过程进行第二次清洗，在第二次清洗后弃上清液，然后缓慢加入W5溶液5ml，小心地移到含有20％的蔗糖5ml的15ml圆管中，然后以800rpm离心5分钟。在离心后，可在管的中心部确认到原生质体层(绿色条带)，并确认到破碎的原生质体或组织的一部分沉入管底。用钝头移液管吸头小心地提取原生质体层，移到含有W5溶液10ml的新15ml圆管中，以800rpm离心5分钟。在离心且弃上清液后，加入1ml的W5溶液并溶解，然后用显微镜观察原生质体状态(图5)。
当分离的原生质体的状态良好时，在6孔板中加入3ml的原生质体诱导培养基(Protoplast Inducing Media，PIM)后，按周观察原生质体及细胞分裂模式。通常，经过约5天后观察到细胞分裂，并且在约2周后细胞开始聚集，约3周后观察到微愈伤组织(microcalli)(可肉眼识别，小于1mm)，经过约4周后，在1.2％的低熔点琼脂(low meltingagar)中培养时，用肉眼可观察到白色斑点。
表2
原生质体分离中使用的溶液的组成
实施例3.使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物的马铃薯原生质体的基因编辑
在显微镜下使用血细胞计数器(hemocytometer)对通过实施例2中描述的方法分离的原生质体进行计数，在CRISPR/Cas9基因编辑实验中使用了约10万个原生质体。
当原生质体分离完成后，通过如下的方式制备CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物。首先，2ml的管中加入15μg的StPPO2-4单向导RNA(使用3μl的5μg/μl浓度的单向导RNA)及30μg的Cas9(使用6μl的5μg/μl浓度的Cas9蛋白)，通过混合1μl的NEB缓冲液(NEB buffer)(#3)来在常温条件下反应10分钟。接着，用聚乙二醇介导的转染(transfection)方法，在准备的原生质体中引入CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物。即，将200μl的原生质体(1×105)及10μl的CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物混合，加入等量(210μl)的40％的聚乙二醇溶液并混合后，在常温条件下反应10分钟。当经过10分钟反应结束时，加入等量(420μl)的W5溶液并进行第一次清洗后，以600rpm离心5分钟。在离心后，弃上清液，为了去除残留的聚乙二醇，再次加入1ml的W5溶液并进行第二次清洗后，以相同的条件进行离心。在清洗过程中，预先将PIM以3ml/孔分到6孔板中。在离心后，在弃上清液的原生质体中加入1ml的PIM溶液并混匀后以500μl/孔分到上述6孔板中并密封后，在25℃的温度及暗条件下培养并观察原生质体的状态。
在约2周后，当原生质体稳定分裂到一定程度时，加入最终浓度为1.2％的低熔点琼脂(low melting agar)并凝固后，在相同条件下培养并观察。在引入CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物后，当经过约3周时，开始观察到微愈伤组织，将在低熔点琼脂/PIM中培养的微愈伤组织移到愈伤组织形成培养基(Callus Forming Media，CFM)中培养。将在愈伤组织形成培养基中培养的愈伤组织(直径为约0.5cm)移到芽诱导培养基(Shoot Inducing Media，SIM)中培养，为了从芽(shoot)诱导的个体诱导生根，移到生根诱导培养基(Root InducingMedia，RIM)中培养。从CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物引入原生质体经过约16周左右成长为一个完整的植株(图6)。用于上述原生质体培养的PIM、CFM、SIM、RIM培养基的组成参见Ehsanpour及Jones(J.Sci.I.R.Iran.(2001),12(2):103-110)的报告。
表3
用于转导的聚乙二醇溶液的组成
实施例4.马铃薯原生质体来源的马铃薯多酚氧化酶2编辑物选择对于通过实施例3获得的共640个个体中的590个个体，用深度测序(deep-seq.)分析并确认马铃薯多酚氧化酶2基因是否被编辑，并且最终确认在110个个体中的至少一个等位基因(allele)中诱导了基因编辑，确认3个个体被编辑为4个等位基因均不同的插入缺失(InDel)模式。图7至图10是显示其中部分个体的深度测序分析结果。最终确认马铃薯多酚氧化酶2基因被编辑的共110个个体的深度测序分析结果，如表4所示。
表4
马铃薯多酚氧化酶2基因的编辑得到确认的个体的深度测序分析结果
/>
尤其，可通过上述110个个体的深度测序分析结果确认，通过本发明的方法制备的马铃薯多酚氧化酶2基因编辑植株在所有4个等位基因(alleles)中确认到-2bp或-4bp缺失模式的突变在整体110个编辑物的插入缺失模式中占57％(63/110)(表5及图11)。
表5
马铃薯多酚氧化酶2基因编辑110个植株的插入缺失变异模式
最后，为了获得马铃薯多酚氧化酶2基因被编辑的品系的块茎(tuber：块茎)，将确认了基因编辑的马铃薯幼植株转移到种薯栽培温室中培养，约3个月后在部分品系中获得块茎，并观察其多酚氧化酶2蛋白活性及褐变现象抑制现象。
实施例5.马铃薯多酚氧化酶2编辑植株的多酚氧化酶2蛋白活性测定
多酚氧化酶2活性测定通过如下方法从马铃薯多酚氧化酶2基因编辑得到确认的马铃薯植株(#14、16、25及30)及非编辑对照区(WT)马铃薯的组织中实施。首先，在1.5ml试管中切碎并放入0.5g的马铃薯块茎。加入1ml的冷磷酸钠溶液(pH 6.5)，使用移液管吸头压碎组织。接着，在13000rpm及4℃温度条件下离心20分钟，在进行离心的同时，在96孔板中混合磷酸钠溶液(pH5.5)和0.2M的邻苯二酚(pyrocatechol)预培养10分钟。在上述离心后，将上清液放入预培养10分钟的含有磷酸钠和邻苯二酚的混合溶液的96孔板中，立即在410nm处测定吸光度。从0秒开始，每30秒测定一次吸光度，测定时间最长2分钟。
使用剩余的上清液，通过布拉德福德定量法(Bradford assay)测定蛋白质浓度，通过测定的蛋白质浓度及410nm吸光度测定值来计算多酚氧化酶2的单元(Unit)。
为了防止实验偏向的盲测(blind test)，在基因编辑植株的样品上贴上编号后，并通过上述方法进行了实验，可通过如图12所示的多酚氧化酶2蛋白活性测定结果确认，与非编辑对照区(WT)相比，在基因编辑植株品系中多酚氧化酶2活性被抑制为从最低28.6％至最高57.8％。
实施例6.马铃薯多酚氧化酶2编辑植株的褐变现象调查
马铃薯褐变现象观察通过2种方法进行。
首先，按照与之前报告(Gonzalez MN et al.,Front Plant Sci.(2020)10:1649)中进行的方法相同方法对马铃薯块茎进行切片，进行实验，其结果如图13的(A)部分所示。通过切片马铃薯块茎来观察褐变抑制现象的结果，观察到与对照区(WT)相比褐变现象得到抑制的状态。然而，由于水分蒸发而在是否抑制褐变现象方面没有显著的进展，因此在仅去除相同大小的马铃薯块茎的表皮后观察褐变现象。通过结果观察到，与非编辑对照区(WT)相比，马铃薯多酚氧化酶2编辑马铃薯植株(GE#14及#25)的块茎的褐变现象得到显著抑制。(图13的(B)部分)。最终，可确认到马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因编辑植株品系的褐变现象与多酚氧化酶2蛋白活性有关。
序列表
<110> 株式会社图尔金
<120> 利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法
<130> KHP232110757.8
<141> 2021-11-22
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1958
<212> DNA
<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)
<400> 1
tcttttgcgt tttgagcaat aatggcaagc ttgtgcaata gtagtagtac atctctcaaa 60
actcctttta cttcttcctc cacttcttta tcttccactc ctaagccctc tcaacttttc 120
atccatggaa aacgtaacca aatgttcaaa gtttcatgca aggttaccaa taataacggt 180
gaccaaaacc aaaacgttga aacaaattct gttgatcgaa gaaatgttct tcttggctta 240
ggtggtcttt atggtgttgc taatgctata ccattagctg catccgctgc tccagctcca 300
cctcctgatc tctcgtcttg tagtatagcc aggattaacg aaaatcaggt ggtgccgtac 360
agttgttgcg cgcctaagcc tgatgatatg gagaaagttc cgtattacaa gttcccttct 420
atgactaagc tccgtgttcg tcagcctgct catgaagcta atgaggagta tattgccaag 480
tacaatctgg cgattagtcg aatgaaagat cttgataaga cacaaccttt aaaccctatt 540
ggttttaagc aacaagctaa tatacattgt gcttattgta acggtgctta tagaattggt 600
ggcaaagagt tacaagttca taattcttgg cttttcttcc cgttccatag atggtacttg 660
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tcccttttcg atgtaacacg tgaccaaagt caccgaaatg gagcagtaat cgatcttggt 840
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gatctcgggg ttaacactga actcccggga actatagaaa acatccctca cggtcctgtc 1020
cacatctggt ctggtacagt gagaggttca actttgccca atggtgcaat atcaaacggt 1080
gagaatatgg gtcattttta ctcagctggt ttggacccgg ttttcttttg ccatcacagc 1140
aatgtggatc ggatgtggag cgaatggaaa gcgacaggag ggaaaagaac ggatatcaca 1200
cataaagatt ggttgaactc cgagttcttt ttctatgatg aaaatgaaaa cccttaccgt 1260
gtgaaagtca gagactgttt ggacacgaag aagatgggat acgattacaa accaattgcc 1320
acaccatggc gtaacttcaa gcccttaaca aaggcttcag ctggaaaagt gaatacagct 1380
tcacttccgc cagctagcaa tgtattccca ttggctaaac tcgacaaagc aatttcgttt 1440
tccatcaata ggccgacttc gtcaaggact caacaagaga aaaatgcaca agaggagatg 1500
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aacgtggaca ataatgtgaa tgcgaatgag cttgacaagg cggagtttgc ggggagttat 1620
acaagtttgc cacatgttca tagagctggt gagactaatc atatcgcgac tgttgatttc 1680
cagctggcga taacggaact gttggaggat attggtttgg aagatgaaga tactattgcg 1740
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cttgcagatt gttaattagt ctctattgaa tctgctgaga ttacactttg atggatgatg 1860
ctctgttttt gttttcttgt tctgtttttt cctctgttga aatcagcttt gttgcttgat 1920
ttcattgaag ttgttattca agaataaatc agttacaa 2022
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> StPPO2-1
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> StPPO2-2
<400> 3
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> StPPO2-3
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<210> 5
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<220>
<223> StPPO2-4
<400> 5
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Claims (10)
1.一种用于抑制马铃薯植株褐变的基因组编辑用组合物，其特征在于，包含如下成分作为有效成分：
对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA和核酸内切酶蛋白的复合物；或者
重组载体，包含编码对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA的DNA及编码核酸内切酶蛋白的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的用于抑制马铃薯植株褐变的基因组编辑用组合物，其特征在于，上述马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列由序列号5的碱基序列组成。
3.一种向导核酸，其特征在于，
上述向导核酸为在构成马铃薯多酚氧化酶2基因的核苷酸序列中对靶区域具有特异性的RNA序列，
上述靶区域为序列号5的碱基序列。
4.一种褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，通过将对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA及核酸内切酶蛋白引入马铃薯植物细胞中来编辑基因组；以及
步骤(b)，从上述基因组被编辑的马铃薯植物细胞再生马铃薯植株。
5.根据权利要求4所述的褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的制备方法，其特征在于，使用如下成分将上述步骤(a)的向导RNA及核酸内切酶蛋白引入马铃薯植物细胞中：
对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA和核酸内切酶蛋白的复合物；或者
重组载体，包含编码对马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列具有特异性的向导RNA的DNA及编码核酸内切酶蛋白的核酸序列。
6.根据权利要求4所述的褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的制备方法，其特征在于，上述马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列由序列号5的碱基序列组成。
7.根据权利要求4所述的褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的制备方法，其特征在于，上述步骤(b)的基因组被编辑的马铃薯植物细胞在马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列中被诱导产生1～10bp大小的缺失变异。
8.一种褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株，其特征在于，通过权利要求4至7中任一项所述的方法制备。
9.根据权利要求8所述的基因组编辑马铃薯植株，其特征在于，上述褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株在马铃薯多酚氧化酶2基因的靶碱基序列中被诱导产生1～10bp大小的缺失变异。
10.一种种薯，其特征在于，权利要求8所述的马铃薯植株的基因组被编辑。
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