CN118291517A - 一种利用农杆菌浸染诱导系幼胚遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及分子育种领域，具体涉及一种编辑单倍体诱导系植物基因组中靶基因的方法，以及由所述方法获得的经编辑的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞。本申请还涉及由所述单倍体诱导系植物制备经编辑的单倍体植物的方法，以及由所述经编辑的单倍体植物制备经编辑的二倍体植物的方法。
Description
技术领域
本申请涉及分子育种领域，具体涉及一种编辑单倍体诱导系植物基因组中靶基因的方法，以及由所述方法获得的经编辑的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞。本申请还涉及由所述单倍体诱导系植物制备经编辑的单倍体植物的方法，以及由所述经编辑的单倍体植物制备经编辑的二倍体植物的方法。
技术背景
以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术是近些年发展起来的新兴生物技术，在农业生物育种方面具有广阔的应用前景，被认为是新一代生物育种体系的核心技术之一。在作物育种中应用基因编辑技术涉及到作物的遗传转化，而目前大多数作物，尤其是优良的育种自交系还没有建立起遗传转化体系或者遗传转化效率很低，已获得的优良自然变异或新创造的优良等位基因通常采用回交转育的方式进行遗传改良，这种方式往往需要几年的时间才能完成对育种自交系的改良，因此，严重影响了优良等位基因在商业化品种中使用的效率。
单倍体育种技术同样是现代育种体系中非常重要的技术环节，在获得纯合株系、加快育种进程中发挥了重要的作用。然而，单倍体育种技术通常在快速成系的过程中发挥重要作用，但是在育种的方向和性质较难控制，存在一定的盲目性。
如何能够实现基因编辑技术与单倍体育种技术有效的结合起来，既能突破对遗传转化对遗传背景的以来，实现对现有育种自交系的精准定向改良，同时能够快速实现育种自交系的基因组纯化，缩短育种周期。这对于现代生物育种将是一种新的技术变革。
如果能够将基因编辑技术与单倍体育种技术进行融合，将大大缩短了基因诱导编辑的过程，极大促进优良等位变异在商业化育种自交系中的利用进程。因此，需要提供一种新的育种自交系构建方法。
发明内容
本申请的发明人通过大量实验，提供了一种能够将基因编辑系统转化入单倍体诱导系的方法，并通过该方法在子代中产生经基因编辑的单倍体植物。进一步的，将单倍体植物进行染色体加倍，并进行自交或回交，能够获得稳定遗传的经基因编辑的子代。因此，本申请的方法以及通过该方法获得的植株能够提高植物功能遗传学研究的速度，在许多领域具有显着的意义。特别是适用于改良植物性状，获得质/产量增加、营养品质提高和/或对生物和非生物胁迫的抗性和/或耐受性增加的植物。
因此，在第一方面，本申请提供了一种编辑单倍体诱导系植物基因组中靶基因的方法，所述方法包括：将靶向所述靶基因的基因组编辑系统转入单倍体诱导系植物中。
在某些实施方案中，所述单倍体诱导系植物是天然的单倍体诱导系植物，或者是经改造(例如，基因组编辑)产生的具有单倍体诱导能力的植物。
通常来说，单倍体诱导系可以通过与所选择的植株系杂交，而产生单倍体植物。在某些实施方案中，单倍体植物具有单组染色体。在某些实施方案中，单倍体诱导系通过与二倍体植物(两组染色体)杂交，而产生单倍体植物(单组染色体)。
在本文中，“天然的单倍体诱导系植物”是指天然具有诱导产生单倍体植物的能力的植物，这种诱导产生单倍体植物的能力可以是天然存在的，也可以是经过人工培育或选育的；例如，通过构建诱导系选育群体而选育出的单倍体诱导系植物。在某些实施方案中，所述天然的单倍体诱导系植物包含没有经过基因组编辑，且具有诱导产生单倍体植物的能力的任何植物。
在本文中，“经改造产生的具有单倍体诱导能力的植物”是指这样的植物，其天然不具有诱导产生单倍体植物的能力，通过对其进行改造(例如，基因组编辑)，而具有诱导产生单倍体植物的能力。
通常来说，选取容易转化的植株材料，对其进行基因组编辑，并使其具有单倍体诱导能力，以获得经改造产生的具有单倍体诱导能力的植物。
这种经改造产生的具有单倍体诱导能力的植物和方法，可以参考，例如，玉米的Stock 8(Coe,1959,Am,Nat 93:381-382；Sharkar and Coe,1986,Genetics 54:453-464)；玉米的RWS(Roeber and Geiger 2001,submitted to Crop Science)；玉米的KEMS(Deimling,Roeher,and Geiger,1997,Vortr.Pflsnzenzuchtg 38:203-224)；或者，玉米的KMS and ZfVIS(Chalyk,Bylich&Chebotar,1994,MNL 68:47；Chalyk&Chebotar,2000,Plant Breeding 119:363-364)。这些公开内容通过引用并入本文。
玉米，大麦，小麦，黑小麦，燕麦，高粱，马铃薯等植物中均存在天然的单倍体诱导系植物。例如，大麦单倍体可以通过将栽培常规大麦(Hordeum vulgare)与其野生祖先物种(Hordeum bulbosum)杂交而产生。例如，小麦，黑小麦和燕麦的单倍体可以通过用来自相关物种，例如但不限于，玉米，高粱，大麦(球茎大麦(Hbulbulosum)，和粟)的花粉对去雄小麦和黑小麦穗以及燕麦圆锥花序授粉来产生。
在某些实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
在某些实施方案中，所述单子叶植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜。
在某些实施方案中，所述植物是玉米。
在某些实施方案中，所述天然的单倍体诱导系植物选自Stock6，CAU3，CAU4，CAU5，HI3，HI4，HI5，以及它们的任何组合。
在本文中，所述编辑包括至少一个核苷酸的缺失、置换、插入或其组合。在某些实施方案中，所述靶基因被编辑后，所述靶基因的功能、表达水平、活性或其组合被破坏(例如，敲低或沉默)。
在某些实施方案中，所述靶基因天然存在于所述单倍体诱导系植物的基因组中。
在某些实施方案中，所述单倍体诱导系植物的靶基因被编辑后，不影响其对子代单倍体植物的诱导能力。
在某些实施方案中，所述靶基因被编辑后，能够提高植物产量和/或提高植物品种的质量。
在某些实施方案中，所述提高植物品种的质量包括：提高植物抵抗病原物(例如，昆虫、病原细菌、病毒)的能力，提高植物抵抗逆境(例如，低温、干旱)的能力。
在某些实施方案中，所述提高植物产量包括：提高植物的穗数，提高植物的穗粒数，提高植物的百粒重或千粒重，和/或提高植物的种植密度。
在某些实施方案中，提高植物的种植密度是使种植密度不低于约5500株/亩、不低于约6000株/亩、不低于约6500株/亩、不低于约7000株/亩或不低于约7500株/亩(例如约5000株/亩～12000株/亩，约6000株/亩～12000株/亩，约7000株/亩～12000株/亩；例如约7500株/亩、约8000株/亩、约9000株/亩、约10000株/亩、或约12000株/亩)。
在某些实施方案中，靶基因选自与下述相关的基因：编码农艺性状，昆虫抗性，抗病性，除草剂抗性，不育性，谷物特性和商业产品的基因。
在某些实施方案中，靶基因还包括，涉及调控油，淀粉，碳水化合物或营养代谢的基因，以及那些影响例如籽粒大小，蔗糖负荷等的基因。
在某些实施方案中，所述编辑位于所述靶基因的编码区和/或非编码区，例如启动子、5’UTR、内含子、外显子、3’UTR、终止子及其任何组合。
在某些实施方案中，所述编辑包括缺失、置换、插入、倒位、重复或其任意组合。
在某些实施方案中，所述编辑导致无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变或其任何组合。
在某些实施方案中，所述植物细胞对于所述编辑而言是纯合的。
在某些实施方案中，所述编辑包括第一等位基因中的第一编辑和第二等位基因中的第二编辑，所述第一编辑和所述第二编辑彼此相同或不同。
在本文中，可通过本领域已知的各种合适的基因组编辑技术，对靶基因进行编辑。示例性的靶基因编辑技术包括ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)、CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas以及其他位点特异性核酸酶技术。这些核酸酶能够在基因组中的期望位置处切割并产生特定双链断裂，该断裂随后通过细胞内源工艺(例如，同源重组(HR)、同源介导的修复(HDR)以及非同源末端连接(NHEJ))修复。在双链断裂中NHEJ直接连接DNA末端，而HDR利用同源序列作为模板以在断点处重新产生所缺失的DNA序列。因此，通过将对于靶基因而言特异性的CRISPR、ZFN和/或TALEN以及同源供体DNA引入细胞，可在靶基因中生成至少一处双链断裂，同时同源供体DNA通过同源重组实现基因的敲入。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统包括至少一种位点特异性核酸酶，例如RNA引导的核酸酶(例如Cas核酸酶)、锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、TALE核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统选自CRISPR/Cas、TALEN、ZFN、转座子技术、PASTE技术、PE技术、碱基编辑器、以及它们的任何组合。
在某些实施方案中，所述基因组编辑包含RNA引导的核酸内切酶以及指导RNA(gRNA)。所述RNA引导的核酸内切酶可以选自：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(又称Csn1/Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1(又称Cas12a)、CasX、CasY及其同源物或经修饰形式、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、激烈火球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo))及其同源物或经修饰形式。
在某些实施方案中，所述RNA引导的核酸内切酶是Cas蛋白酶。本文提及的Cas蛋白可以是任何已知的或后来鉴定的Cas效应蛋白，例如但不限于Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas13a(C2c2)、C2c3、Cas13b，它们可源自任何合适的来源，因此可以包括来自多种(原核)生物体的不同直系同源物。在某些实施方案中，Cas蛋白是Cas9，例如金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)或化脓性链球菌Cas9(SpCas9)。在某些实施方案中，Cas蛋白是Cas12a，例如来自氨基酸球菌属物种，例如氨基酸球菌属物种BV3L6 Cpf1(AsCas12a)，或毛螺菌科细菌Cas12a，例如毛螺菌科细菌MA2020或毛螺菌科细菌MD2006(LBCas12a)。
在某些实施方案中，所述基因组编辑为CRISPR/Cas系统，其通过指导RNA(gRNA)将Cas酶蛋白募集到靶标基因座以完成修饰，gRNA包含与靶标基因座中的靶序列具有互补性的指导序列。在某些实施方案中，所述gRNA可以是嵌合指导RNA或单一指导RNA(sgRNA)。在某些实施方案中，gRNA包含指导序列和tracr配对序列(或直接重复序列)。在某些实施方案中，gRNA包含指导序列、tracr配对序列(或直接重复序列)和tracr序列。在某些实施方案中，本文所述的CRISPR-Cas系统不包含和/或不依赖于tracr序列的存在(例如，如果Cas蛋白是Cas12a)。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统是CRISPR/Cas系统，其包括：Cas蛋白酶(例如Cas9蛋白酶)和指导RNA(gRNA)。
在某些实施方案中，所述gRNA能够靶向所述靶核酸。
在某些实施方案中，所述gRNA包含与所述靶核酸或其片段互补的序列。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统存在于一种或多种载体上。
在某些实施方案中，所述Cas蛋白酶和gRNA存在于相同的载体上。
在某些实施方案中，所述RNA引导的核酸内切酶及其引导RNA可以通过重组DNA构建体或载体引入至植物细胞。在某些实施方案中，所述RNA引导的核酸内切酶及其引导RNA通过同一个或不同的重组DNA构建体或载体引入植物细胞。在某些实施方案中，所述重组DNA构建体或载体整合或不整合至植物细胞的基因组中。
在某些实施方案中，构建包含编码所述Cas蛋白酶和gRNA序列的载体，然后通过农杆菌介导将所述载体转化入所述单倍体诱导系植物的细胞中。
在某些实施方案中，所述Cas蛋白酶和gRNA存在于相同或不同的载体上。
在某些实施方案中，所述Cas蛋白酶和gRNA存在于相同的载体上。
制备含有所需遗传组分的质粒或载体的方法是本领域众所周知的。载体通常由许多遗传组分组成，包括但不限于调节元件，如启动子，前导子，内含子和终止子序列。调节元件也被称作顺式或反式调节元件，这取决于该元件与它们所控制的序列或基因的接近程度。
在某些实施方案中，所述载体还包含转化增强序列。
将上述载体引入植物细胞的技术是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于:(1)化学方法；(2)物理方法，如显微注射，电穿孔和基因枪；(3)病毒载体；(4)受体介导的机制；和(5)宿主细胞介导的植物转化方法(例如，农杆菌或根瘤菌)。在文本中，将上述载体引入植物细胞或组织的方法被称为“转入”或“转化”，包括但不限于稳定转化方法和瞬时转化方法。术语“稳定转化”是指导入植物的多核苷酸整合到植物基因组中，并且能够由其后代遗传。术语“瞬时转化”或“瞬时表达”是指将多核苷酸引入植物中，而不整合到植物的基因组中。
农杆菌介导的转化方法是本领域技术人员已知的，包括农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840，和Ishida等，(2007)。农杆菌介导的玉米转化(NAT Protoc 2,161 4-1621)。
在某些实施方案中，所述方法通过下述步骤(a)至步骤(e)实现：
(a)提供植物细胞或组织(例如，幼胚)；
(b)构建包含编码所述Cas蛋白酶和gRNA序列的载体，并将其转入农杆菌细胞中；
(c)将转化完成的农杆菌细胞与所述植物细胞或组织(例如，幼胚)接触，并进行共培养；
(d)筛选培养步骤(c)获得的植物细胞或组织(例如，幼胚)，并获得愈伤组织；
(e)分化培养所述愈伤组织；
任选地，将所述愈伤组织进行生根培养。
在上述步骤(a)至步骤(d)中，可以使用任何合适的植物培养基。合适的例子包括但不限于基于MS的培养基(Murashige和Skoog，Physiol。Plant，15:47 3-497,196 2)或N6培养基(Chu等，Scienia Sinica18:659,199 5)。在某些实施方案中，这些培养基还包含植物生长调节剂，包括但不限于生长素，例如胡黄连(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸)，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和麦草畏(3，6-二氯乙酸)；细胞分裂素如BAP(6-苄氨基嘌呤)和激动素；ABA；和赤霉素。在某些实施方案中，这些培养基还包含添加剂，包括但不限于氨基酸，大量元素，铁，微量元素，肌醇，维生素和有机物，碳水化合物，未定义的介质组分如酪蛋白水解物。在某些实施方案中，这些培养基还包含合适的胶凝剂如琼脂，如低熔点琼脂糖或凝胶。本领域技术人员熟悉各种组织培养基，当适当补充时，其支持植物组织生长和发育，并适合于植物转化和再生。这些组织培养基可以作为商业制剂购买，或者定制制备和修饰。
在上述步骤(c)中，共培养可以选用选择性培养基。本领域技术人员知晓选择性培养基中包含的择性试剂的方案。典型的选择性试剂包括但不限于抗生素如Geneticin(G418)，卡那霉素，帕罗霉素或其它化学物质如草甘膦。可以向选择或延迟介质添加附加的适当介质组分以抑制农杆菌生长。这样的介质组分可包括但不限于抗生素如卡宾西林或头孢噻肟。
在某些实施方案中，在步骤(e)中，提供乳糖亚硫酸盐培养基(LS培养基)分化培养所述愈伤组织。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含CuSO4。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1mmol/L至100mmol/L的CuSO4。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1mmol/L至10mmol/L，10mmol/L至30mmol/L，30mmol/L至50mmol/L，50mmol/L至80mmol/L，80mmol/L至100mmol/L的CuSO4。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含玉米素。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1mg/L至30mg/L玉米素。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1mg/L至5mg/L，5mg/L至10mg/L，10mg/L至15mg/L，15mg/L至20mg/L，20mg/L至25mg/L，25mg/L至30mg/L玉米素。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含：硝酸钾，硝酸铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙，乙二胺四乙酸二钠，硫酸亚铁，硫酸锰，硫酸锌，硼酸，碘化钾，维生素B1(盐酸硫胺素)，维生素B6(盐酸吡哆醇)，甘氨酸，钼酸钠，硫酸铜，肌醇，氯化钴，烟酸，硫酸铜，MES，玉米素，蔗糖，琼脂，特美汀中的任意一项或多项。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含：硝酸钾，硝酸铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙，乙二胺四乙酸二钠，硫酸亚铁，硫酸锰，硫酸锌，硼酸，碘化钾，维生素B1(盐酸硫胺素)，维生素B6(盐酸吡哆醇)，甘氨酸，钼酸钠，硫酸铜，肌醇，氯化钴，烟酸，硫酸铜，MES，玉米素，蔗糖，琼脂和特美汀。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1700-2000mg/L的硝酸钾。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1550-1700mg/L的硝酸铵。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含150-180mg/L的磷酸二氢钾。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含350-380mg/L的硫酸镁。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含430-460mg/L的氯化钙。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含36.9-37.5mg/L的乙二胺四乙酸二钠。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含25-29mg/L的硫酸亚铁。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含21.9-22.5mg/L的硫酸锰。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含8.5-8.8mg/L的硫酸锌。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含6.0-6.5mg/L的硼酸。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含0.79-0.85mg/L的碘化钾。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含0.08-0.11mg/L的维生素B1(盐酸硫胺素)。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含0.45-0.55mg/L的维生素B6(盐酸吡哆醇)。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1.6-2.2mg/L的甘氨酸。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含0.22-0.3mg/L的钼酸钠。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含10mmol/L-30mmol/L的硫酸铜。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含91-102mg/L的肌醇。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含0.022-0.03mg/L的氯化钴。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含0.45-0.55mg/L的烟酸。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含1.5-3mg/L的硫酸铜。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含0.3-0.8g/L的MES。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含2mg/L-5mg/L的玉米素。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含15-30g/L的蔗糖。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含4.5-6g/L的琼脂。
在某些实施方案中，所述LS培养基包含180-220mg/L的特美汀。
在某些实施方案中，所述LS培养基的pH值为5.8-6.2。
在第二方面，本申请提供了第一方面所述的方法获得的经编辑的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞。
在某些实施方案中，所述单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞的基因组中所述靶基因被编辑。
在某些实施方案中，所述编辑包括至少一个核苷酸的缺失、置换、插入或其组合。
在某些实施方案中，所述单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞的基因组中所述靶基因被纯合编辑或杂合编辑。
在某些实施方案中，所述靶基因被编辑后，所述靶基因的功能、表达水平、活性或其组合被破坏(例如，敲低或沉默)。
在本文中，“纯合编辑”或“杂合编辑”是指所述靶基因的编辑类型。不同的编辑类型主要取决于靶基因编辑过程中，所述编辑发生的时期。如果在受精卵形成的早期进行编辑，那么可能发生纯合编辑。如果在受精卵发生了分裂后进行编辑，那么不同组织的编辑的类型将不同。在某些实施方案中，在同一个植株中，测序同一个位置的编辑类型，可能会因为混入了不同的组织部位而呈现出多个编辑类型，即为“嵌合体”。
在第三方面，本申请提供了如第二方面所述的经编辑的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞，在制备经编辑的子代植物或其部分、种子、细胞中的用途。
在某些实施方案中，所述子代是经编辑的单倍体植物或其部分、种子、细胞。
在某些实施方案中，所述经编辑的单倍体植物或其部分、种子、细胞不携带基因组编辑系统。
在某些实施方案中，所述子代是经编辑的单倍体植物进行染色体加倍后的植物或其部分、种子、细胞。
在第四方面，本申请提供了一种制备经编辑的单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)从第一方面所述的方法获得的经编辑的单倍体诱导系植物中，选取靶基因被纯合编辑的植物作为第一植物；
(b)提供第二植物；
(c)用第一植物的花粉给所述第二植物授粉，收获由授粉产生的子代，从而获得经编辑的单倍体植物。
在某些实施方案中，其中所述第一植物和所述第二植物是相同或不同的物种。
在某些实施方案中，所述第一植物和第二植物各自独立地选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜。
在某些实施方案中，所述第一植物为玉米。
在某些实施方案中，所述第二植物也为玉米。
在某些实施方案中，当第一植物为玉米时，本领域技术人员可以选择任意的玉米植株作为第二植物，包括但不限于，杂交系(例如，品种间的杂交种，品种与自交系的杂交种，自交系间的杂交种)，以及自交系。
在某些实施方案中，在步骤(a)中，通过核酸检测，或者对所述靶基因调控的性状进行检测，以选取靶基因被纯合编辑的植物。
靶基因的检测
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测(例如，测序，凝胶电泳检测)所述靶基因。
测基因破坏的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于核酸测序、杂交方法、扩增方法等。
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：(a)提供包含所述植物的基因组DNA的样品；(b)对所述样品进行核酸扩增反应；和(c)对扩增子进行测序。在某些实施方案中，步骤(b)包括使用靶向修饰所在区域侧翼的引物对。
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：(a)提供包含植物的基因组DNA的样品；(b)对所述样品进行核酸扩增反应；和(c)通过凝胶电泳检测扩增产物的长度。在某些实施方案中，步骤(b)包括使用靶向修饰所在区域侧翼的引物对。
分子标记的检测
分子标记可以是与所述靶基因连锁的任何核酸序列，分子标记能够衍生自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来自剪接的RNA、cDNA等)，此外还可以指用于检测该标记序列的核酸(例如与标记序列互补或与位于其侧翼的核酸，例如用于扩增和/或杂交该标记序列的探针或引物(例如引物对))。
可以通过本领域中公认的方法检测分子标记，包括但不限于核酸测序、杂交方法、扩增方法(例如基于PCR的序列特异性扩增方法)、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单序列重复检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、和/或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。
在某些实施方案中，所述分子标记选自目前已知的多态性的等位基因，本领域技术人员也可以使用本领域公知的用于发现多态性的任何技术很容易地鉴定其他候选多态性的等位基因。
在某些实施方案中，所述分子标记选自单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(InDel)、单特征多态性(SFP)、简单序列重复(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)。
在某些实施方案中，所述分子标记与内源DWF4基因的遗传距离小于20cM。在某些实施方案中，所述分子标记与内源DWF4基因的遗传距离为1cM、2cM、3cM、4cM、5cM、6cM、7cM、8cM、9cM、10cM、11cM、12cM、13cM、14cM、15cM、16cM、17cM、18cM、19cM、19.5cM或19.9cM。
在某些实施方案中，所述核酸检测是通过检测是否存在与所述靶核酸连锁的分子标记来实现的。
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测与所述靶基因连锁的分子标记。
在某些实施方案中，步骤(2)包括提供针对所述分子标记的特异性引物对，并对所述分子标记进行扩增，检测所述扩增产物。
在某些实施方案中，步骤(2)包括使用特异性探针并检测杂交信号。
在某些实施方案中，步骤(2)包括测序。
在某些实施方案中，步骤(2)包括对所述分子标记进行基因芯片(例如SNP芯片)检测。
在某些实施方案中，所述分子标记是SNP。检测SNP的非限制性实例包括杂交、扩增、测序等。在某些实施方案中，所述检测包括SNP芯片。
在某些实施方案中，所述靶基因调控的性状是植株的性状(例如，茎叶夹角，叶片颜色)和/或籽粒的性状(例如，籽粒中胚乳的颜色，籽粒中胚的颜色)。
在某些实施方案中，在步骤(b)中，第二植物选自杂交系(例如，品种间的杂交种，品种与自交系的杂交种，自交系间的杂交种)，和/或自交系。
在某些实施方案中，在步骤(b)中，将自交系植物作为第二植物。
在某些实施方案中，所述自交系植物选自TXB2-3，X1C14A，PH207，OSL476，B104，LY16M，LA306，B113，W22，LH244，CIMBL54，LY16F，RA589，835b，05W002，RA624，Si273，M165，CIMBL60，Z58，NZA004，By843，4F1，CL009，Nan21-3，RA584，CML118，P138，K22，HC，RA263，CF3，CIMBL145，By4944，CT208，R08，Gy386，GEMS48，RA136，B111，C7-2，P178，M97，以及它们的任何组合。
在某些实施方案中，所述第二植物的靶基因未经编辑。
在某些实施方案中，在步骤(c)中，通过子代的籽粒的性状和/或对靶基因进行核酸检测来筛选经编辑的单倍体植物。
在某些实施方案中，所述籽粒的性状选自籽粒中胚乳的颜色，籽粒中胚的颜色，或它们的任何组合。
在某些实施方案中，如果子代的籽粒中胚乳的颜色与第一植物相同，且籽粒中胚的颜色与第二植物相同，则所述子代是经编辑的单倍体植物。
靶基因的检测
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测(例如，测序，凝胶电泳检测)所述靶基因。
测基因破坏的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于核酸测序、杂交方法、扩增方法等。
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：(a)提供包含所述植物的基因组DNA的样品；(b)对所述样品进行核酸扩增反应；和(c)对扩增子进行测序。在某些实施方案中，步骤(b)包括使用靶向修饰所在区域侧翼的引物对。
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：(a)提供包含植物的基因组DNA的样品；(b)对所述样品进行核酸扩增反应；和(c)通过凝胶电泳检测扩增产物的长度。在某些实施方案中，步骤(b)包括使用靶向修饰所在区域侧翼的引物对。
分子标记的检测
分子标记可以是与所述靶基因连锁的任何核酸序列，分子标记能够衍生自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来自剪接的RNA、cDNA等)，此外还可以指用于检测该标记序列的核酸(例如与标记序列互补或与位于其侧翼的核酸，例如用于扩增和/或杂交该标记序列的探针或引物(例如引物对))。
可以通过本领域中公认的方法检测分子标记，包括但不限于核酸测序、杂交方法、扩增方法(例如基于PCR的序列特异性扩增方法)、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单序列重复检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、和/或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。
在某些实施方案中，所述分子标记选自目前已知的多态性的等位基因，本领域技术人员也可以使用本领域公知的用于发现多态性的任何技术很容易地鉴定其他候选多态性的等位基因。
在某些实施方案中，所述分子标记选自单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(InDel)、单特征多态性(SFP)、简单序列重复(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)。
在某些实施方案中，所述分子标记与内源DWF4基因的遗传距离小于20cM。在某些实施方案中，所述分子标记与内源DWF4基因的遗传距离为1cM、2cM、3cM、4cM、5cM、6cM、7cM、8cM、9cM、10cM、11cM、12cM、13cM、14cM、15cM、16cM、17cM、18cM、19cM、19.5cM或19.9cM。
在某些实施方案中，所述核酸检测是通过检测是否存在与所述靶核酸连锁的分子标记来实现的。
在某些实施方案中，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测与所述靶基因连锁的分子标记。
在某些实施方案中，步骤(2)包括提供针对所述分子标记的特异性引物对，并对所述分子标记进行扩增，检测所述扩增产物。
在某些实施方案中，步骤(2)包括使用特异性探针并检测杂交信号。
在某些实施方案中，步骤(2)包括测序。
在某些实施方案中，步骤(2)包括对所述分子标记进行基因芯片(例如SNP芯片)检测。
在某些实施方案中，所述分子标记是SNP。检测SNP的非限制性实例包括杂交、扩增、测序等。在某些实施方案中，所述检测包括SNP芯片。
在某些实施方案中，如果子代的籽粒中胚乳的颜色与第一植物相同，籽粒中胚的颜色与第二植物相同，且则通过核酸检测确认所述靶基因经编辑，则所述子代是经编辑的单倍体植物。
在种子、胚胎或植株阶段，还可以通过对靶基因或分子标记以外的等位基因(例如，RNJ，malt)筛选成熟种子单倍体/二倍体(Nanda和Chase，1966)。因此，在某些实施方案中，可以通过对RNJ或malt基因进行核酸检测，以判断所述植物是否为单倍体植物。在某些实施方案中，如果所述子代含有malt基因，则所述植物为单倍体植物。
在植株发育过程中，还可以通过能够区分单倍体或二倍体植株的性状来进行区分。在某些实施方案中，如果所述靶基因能够调控植株叶片夹角大小(例如，叶片夹角减小)，则可以通过判断植株的叶片夹角大小(例如，判断植株的叶片夹角是否减小)，以判断所述植物是否为单倍体植物。在此类实施方案中，如果子代的植株的叶片夹角减小，则所述植株是单倍体植物。
在第五方面，本申请提供了如第四方面所述的方法制备的单倍体植物或其部分、种子、细胞，其中，所述单倍体植物或其部分、种子、细胞的基因组中的靶基因被编辑。
在某些实施方案中，所述经编辑的单倍体植物或其部分、种子、细胞不携带基因组编辑系统。
在某些实施方案中，所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜。
在第六方面，本申请提供了如第五方面所述的单倍体植物或其部分、种子、细胞在制备玉米自交系中的用途。
在某些实施方案中，所述玉米自交系的基因组中的靶基因被编辑。
在第七方面，本申请提供了一种制备经编辑的二倍体植物的方法，所述方法包括：通过如第四方面所述的方法获得经编辑的单倍体植物，并用染色体加倍剂处理所述经编辑的单倍体植物，获得经编辑的二倍体植物。
在某些实施方案中，所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜。
在某些实施方案中，所述染色体加倍剂选自秋水仙碱、拿草特、滴停平、氟乐灵，以及它们的任何组合。
可以用染色体加倍剂处理体细胞单倍体细胞，单倍体胚胎，单倍体种子或由单倍体种子产生的单倍体幼苗。纯合植物可通过将单倍体细胞与染色体加倍剂接触以产生纯合的加倍单倍体细胞而从单倍体细胞再生。染色体加倍的方法可以参考，例如，S.et al.,Plant cell,tissue organ cult.,Cordrecht,the Netherlands,Kluwer AcademicPublishers,1997,48(3):203-207；或者，Kato,A.,Maize Genetics CooperationNewsletter1997,38-37；或者，Wan,Y.et al.,TAG,1989,77:889-892,Wan,Y.et al.,TAG,1991,81:205-211.The disclosures of which are incorporated herein byreference。
在某些实施方案中，所述经编辑的二倍体植物生长至成熟后，可以与相同的转化株系进行有性杂交(即，自交)，或者与针对性选择的用于获得所需特性的转基因植物的另一种植物进行“回交”。在此类实施方案中，所述经编辑的二倍体植物可用于将靶核酸“渗入”到通过自交或回交获得的子代的遗传系中。
因此，在第八方面，本申请提供了一种制备经编辑的自交系植物的方法，所述方法包括：将如第四方面所述的方法获得的经编辑的二倍体植物进行杂交或自交，以获得经编辑的自交系种子或植物。
在某些实施方案中，将所述经编辑的二倍体植物与另外的植物进行杂交。
在某些实施方案中，所述另外的植物是二倍体植物(例如，天然的二倍体植物，人工培育的二倍体植物)。
在某些实施方案中，所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜。
在第九方面，本申请提供了如第八方面所述的方法制备的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的制品。
在某些实施方案中，所述制品包含所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组DNA。
在某些实施方案中，所述制品选自玉米耳穗、去苞叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、不饱和玉米油、饱和玉米油、玉米片、爆玉米花、由玉米生产的乙醇和/或汁(liquor)、由玉米发酵产生的干酒糟(DDGS)、来自玉米的动物饲料、化妆品和填充剂中的一项或多项。
在第十方面，本申请提供了如前所述的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞，如前所述的单倍体植物或其部分、种子、细胞，或如前所述的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的制品在提高玉米产量和/或提高玉米品种质量中的用途。
在某些实施方案中，提高玉米品种质量包括：提高玉米抵抗病原物(例如，昆虫、病原细菌、病毒)的能力，和/或提高玉米抵抗逆境(例如，低温、干旱)的能力。
术语定义
如本文所使用的，术语“单倍体”是指具有一组(n)染色体的植物细胞，植物组织或植物。
如本文所使用的，术语“二单倍体”、“双单倍体”或“加倍单倍体”是指植物细胞，植物组织或植物具有两组(2n)染色体，并且通常是纯合的。在某些实施方案中，由于DNA的突变，缺失，插入或其它类似修饰，也可能导致在一些双单倍体中观察到非纯合的情况存在。
如本文所使用的，术语“染色体加倍剂”是指能够使细胞中染色体数目加倍的化学物质(例如，从单倍体到二倍体，或从二倍体到四倍体等)。这样的化学物质可以是抗微管试剂，例如秋水仙碱，丙酰胺或APM(酰胺磷-甲基)。本领域技术人员可以根据现有技术来选择合适的使染色体加倍(例如，通过阻断正常细胞周期分裂等)的化合物。
如本文所用，术语“基因”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，其是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语包括双链和单链DNA和RNA。还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸。优选地，基因包含编码多肽的编码序列。“编码序列”是一种核苷酸序列，当将其置于或处于适当调节序列的控制之下时，该核苷酸序列被转录成mRNA和/或翻译成多肽。所述编码序列的边界由5’-末端的翻译起始密码子和3’-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核酸序列或基因组DNA，而在某些情况下也可以存在内含子。
如本文所用，术语“基因座”是指基因(如DWF4基因)或遗传标记物存在于染色体上的一个或多个具体位置或位点。
如本文所用，术语“内源/内源性”是指存在于其天然基因组位置的基因或等位基因。术语“内源/内源性”可以与“天然”互换使用。在某些实施方案中，所述内源性基因或等位基因是野生型基因或等位基因。在某些实施方案中，所述内源性基因被诱变。在某些实施方案中，所述内源性基因的表达、活性和/或稳定性被修饰。
如本文所用，术语“植物基因组”是指植物细胞的核基因组、线粒体基因组或质体(例如叶绿体)基因组。
如本文所用，术语“基因编辑”是指通过基因编辑技术在生物体基因组中的特定位点进行修饰，包括一个或多个碱基的置换、缺失或添加，导致功能的增加或缺失，从而改变生物体的遗传信息和表型特征。术语“基因编辑技术”是指通过合成的核苷酸片段在生物体基因组中的特定位点进行修饰的技术，常见的基因编辑技术包括基因敲除、基因插入、基因突变和基因重组等。
如本文所用，术语“核酸”能够为任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别的限制。对于用于构建重组构建体的核酸，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
如本文所使用的，术语“愈伤组织”是指去分化的细胞或组织增生块。
如本文所使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指植物或植物细胞的一个或多个性状。这种性状可以通过裸眼或通过本领域已知的任何手段(例如，显微术、生物化学分析、或电子机械测定)观察到。
在某些实施方案中，表型直接由单一基因或遗传基因座控制(即，对应于“单基因性状”)。在单倍体诱导的情况下，使用颜色标记(例如，RNavajo)和/或其他标记证明种子是否是诱导的单倍体种子。使用R Navajo作为颜色标记和使用转基因作为检测雌株上单倍体种子诱导的手段在本领域是熟知的。在其他情况下，表型是几个基因之间相互作用的结果，在某些实施方案中，其也由植物和/或植物细胞与其环境相互作用引起。
如本文所使用的，术语“植物”可以是指全株植物、其任何部分、或从植物衍生的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以是指全株植物、植物组分或器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子和/或植物细胞中的任何一种。
植物细胞是从植物取得的细胞，或者是通过培养从取自植物的细胞衍生的植物细胞。因此，术语“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生区、愈伤组织、叶、嫩枝、配子体、孢子体、花粉和小孢子内的细胞。术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下各项的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、嫩枝和种子；以及接穗、根茎、原生质体、愈伤组织等。
如本文所使用的，术语“子代”或“后代”是指从一个或多个亲本植物通过无性或有性繁殖产生的植物。子代植物可以通过克隆单一亲本植物或使单一亲本植物自交、或者通过使两个或更多个亲本植物杂交来获得。子代植物包括自交体以及F1或F2或甚至更远的世代。F1是产生自亲本的第一代子代，而第二代(F2)或后续代(F3、F4等)的子代是从F1、F2等的自交、互交、回交和/或其他杂交产生的。
如本文所使用的，术语“自交系”是指基因纯合或接近纯合的群体。在某些实施方案中，自交系可以通过几个周期的兄弟/姐妹繁殖或自交来产生。
如本文所使用的，术语“单子叶植物”是指具有单一子叶的植物。例如，谷物如玉米，大米，小麦，燕麦和大麦。
如本文所使用的，术语“转化”或“转入”是指将外源核酸序列(例如，感兴趣的靶基因)导入细胞或组织的方法，包括但不限于稳定转化方法和瞬时转化方法。术语“稳定转化”是指导入植物的多核苷酸整合到植物基因组中，并且能够由其后代遗传。术语“瞬时转化”或“瞬时表达”是指将多核苷酸引入植物中，而不整合到植物的基因组中。
将多核苷酸导入植物细胞的合适方法是本领域技术人员已知的，包括农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840，和Ishida等，(2007)。农杆菌介导的玉米转化(NAT Protoc 2,161 4-1621)，粒子轰击(Gordon-Kamm等，1990，Plant Cell 2:60 3-618)和原生质体的电穿孔(Rhodes等，1986，Science 240:204-207)。
如本文所用，术语“CRISPR”是指含有存在于约40％的已测序细菌和90％的已测序古细菌的基因组中的多个短的同向重复序列的基因座。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割特异性的非编码RNA元件的组合。CRISPR系统共分成3类，其中I类和III类需要多种CRISPR相关(Cas)蛋白共同发挥作用，而II类系统只需要一种Cas蛋白(例如Cas9)即可发挥核酸内切酶活性。因此，II型CRISPR/Cas系统(例如Cas9)在很多情况下应用最为广泛。术语“指导RNA(gRNA)”是指用于在CRISPR/Cas系统中指导Cas蛋白在基因组中靶向编辑的RNA分子，以通过碱基配对或杂交将核酸内切酶导向至植物的基因组中的靶标位点以在所述靶标位点处或附近导致双链DNA断裂或切口。gRNA能够以gRNA分子形式，或以包含可操作地连接于植物可表达启动子的编码gRNA的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体形式转化或引入至植物细胞或组织中。gRNA可以包括例如CRISPR RNA(crRNA)、单链引导RNA(sgRNA)、或可将核酸内切酶引导或导向至基因组中特定靶标位点的任何其他RNA分子。术语“单链引导RNA(sgRNA)”是指包含由接头序列共价连接于tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可表达为单一RNA转录物或分子。术语“Cas9”蛋白是切割核酸的核酸内切酶，在CRISPR/Cas9系统中，sgRNA识别并结合靶DNA，Cas9介导靶DNA的切割。切割的必要条件是在DNA靶标位点的下游存在保守原间隔体邻近基序(PAM)，其通常具有序列5’-NGG-3’，不常见地具有序列5’-NAG-3’。
如本文所用，术语“TALEN”(同“TALE-核酸酶”)是指转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like(TAL)effector nuclease)，是通过使转录激活因子样效应物(TAL effector，即TALE)DNA结合结构域融合于核酸酶结构域来产生的人工限制酶。TALEN的羧基末端含有核酸酶结构域(例如：PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051或Pept071)，它借助TALE(来源于植物致病性黄单胞菌属细菌)来识别特异性DNA碱基对并在特异位点对DNA链进行切割。
如本文所用，术语“ZFN”是指锌指核酸酶(Zinc finger nuclease)是最较早用于基因组编辑的人工合成的限制性内切酶，该酶是异源二聚体，包含DNA结合锌指蛋白(ZFP)结构域和非特异性FokI核酸酶结构域。DNA切割域的FokI核酸酶必须二聚化以切割DNA。如果两个锌指结合位点是回文的，那么锌指核酸酶单体可切割靶标位点。术语“锌指核酸酶”是广泛的，并且包括可在没有来自另一锌指核酸酶的辅助下裂解双链DNA的单体锌指核酸酶。术语“锌指核酸酶”也用于指代被工程改造来一起在相同位点处起裂解DNA的作用的一对锌指核酸酶中的一个或两个成员。ZFN技术已被用于修饰各种生物体内的内源性基因。
如本文所用，基因的“连锁”是指在同一染色体上的不同基因互相连锁成群，在遗传时一起分离进入同一配子。互相连锁的基因之间的“物理距离”为实际物理距离，其用碱基对(bp)、千碱基对(kb)或者兆碱基对(Mb)表示。通过交换频率或重组频率(RF)测量在同一染色体上的基因之间的“遗传距离”，并且用厘摩(cM)表示。1cM相当于约1％的重组频率。如果没有发现重组体，则RF为零并且所述基因在物理上非常紧密地在一起或它们是相同的。两个基因的相距越远，RF越高。
如本文所用，术语“分子标记”是显示同一物种的两个或多个植物之间的多态性的DNA序列(例如基因或其部分片段)，其存在于接近目的基因的染色体上。表述“分子标记与目的等位基因连锁”是指，所述分子标记与目的等位基因在遗传时一起分离进入同一配子，从而该分子标记的存在指明该目的等位基因存在于包含该分子标记的植物中。有用的多态性包括单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(InDel)、单特征多态性(SFP)、简单序列重复(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)等。分子标记可用于鉴定特定的DNA序列，或基因组或染色体上的某一位置，或鉴定基因渗入片段。“基因渗入片段”是指已通过杂交或传统育种技术(例如回交)引入到相同或近缘物种的另一植物中的染色体片段(或染色体部分或区域)，即基因渗入片段是用动词“基因渗入”表示的育种方法(例如回交)的结果。
如本文所用，术语“SNP(单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism)”是指基因组水平上，两个亲本中存在的单个核苷酸(碱基)的差异位点。
附图说明
图1为玉米单倍体诱导系的遗传转化过程。
图2为pBUE411载体图谱。
图3为lac1基因被编辑的3种单倍体诱导系(HI3-KO#1、HI3-KO#2和HI3-KO#3)的测序结果和表型测量结果。
图4为lac1基因被编辑的5种DH系(DH-B104#KO、DH-PH207#KO、DH-OSL476#KO、DH-TXB2-3#KO和DH-X1C14A#KO)的测序结果和表型测量结果。
有益效果
本申请的发明人通过大量实验，提供了一种能够将基因编辑系统转化入单倍体诱导系的方法，并通过该方法在子代中产生经基因编辑的单倍体植物。进一步的，将单倍体植物进行染色体加倍，并进行自交或回交，能够获得稳定遗传的经基因编辑的子代。因此，本申请的方法以及通过该方法获得的植株能够提高植物功能遗传学研究的速度，在许多领域具有显着的意义。特别是适用于改良植物性状，获得质/产量增加、营养品质提高和/或对生物和非生物胁迫的抗性和/或耐受性增加的植物。
序列信息
表1：本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中：
具体实施方式
现在于以下非限制性实施例中描述本发明。
本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：转化方法
为了成功建立以玉米诱导系为受体材料的高效遗传转化体系，选取了6种单倍体诱导系CAU3、CAU4、CAU5、HI3、HI4和HI5。尝试利用多个玉米遗传转化方法对该6个诱导系进行愈伤组织脱分化和再生能力测试。结果发现，HI3能够获得具有再生能力的II型愈伤组织。因此，我们以HI3为受体材料，通过不断优化遗传转化流程及培养基配方，成功建立了以HI3诱导系为受体材料的遗传转化体系。
1.具体的转化方法如下：
(1)幼胚的获取
取人单倍体诱导系(CAU3、CAU4、CAU5、HI3、HI4或HI5)工授粉12到15天的玉米果穗。剥去苞叶，75％酒精表面消毒1分钟，手术刀削去玉米籽粒约2/3，获取幼胚，大小为1.5mm为宜(图1中的A)。
(2)准备农杆菌菌液
将菌株均匀涂在添加有合适抗生素的LB培养基上，28℃黑暗培养24h。用接种环收集农杆菌，用浸染培养基悬浮，调整OD600到0.2-0.3。
(3)农杆菌浸染
将农杆菌悬浮液与收集好的幼胚混合放置约10分钟(图1中的B)。
(4)幼胚的共培养
浸染完成后，将幼胚盾片朝上放置到共培养培养基上，22℃，暗培养2-3天(图1中的C和1中的D)。
(5)筛选培养
共培养3天后，将幼胚转接到筛选培养基上，并进行第一次筛选培养，28℃黑暗条件下进行培养10-12天(图1中的E)。第一次筛选培养结束后，挑选颜色鲜黄且生长旺盛的愈伤组织转接到新鲜的筛选培养基上，继续培养12-16天(图1中的F和1中的G)。
(6)分化培养
针对HI3诱导系愈伤组织分化再生困难的问题，将常规使用的培养基更换成分化培养基，并且，将分化培养基中添加CuSO4浓度调整至10mmol/L到30mmol/L，同时将激素6-BA更换成更有利于促进愈伤组织分化的玉米素，其适合浓度为2mg/L到5mg/L，结果发现HI3诱导系愈伤组织分化再生率达到80％以上。
具体来说，筛二培养结束以后，将有分化能力的愈伤组织切成直径2-3cm大小转接到分化培养基上，25℃光照条件下，继续培养20天(图1中的H)。
(7)生根培养
将分化获得的再生植株切分成若干单株，移栽到生根培养基中进行生根培养，25℃光照条件下，继续培养14天(图1中的I)。
(8)T0代植株的移栽种植
生根培养结束以后，将T0代再生植株移栽到营养钵中，炼苗10天待长出新叶后直接移栽到温室进行生长结实(图1中的J-图1中的L)。
2.上述方法中提到的培养基，配方如下：
(1)浸染培养基：硝酸钾2200-3000mg/L，硝酸铵450-480mg/L，磷酸二氢钾380-410mg/L，硫酸镁170-190mg/L，氯化钙150-170mg/L，乙二胺四乙酸二钠30-40mg/L，硫酸亚铁25-29mg/L，硫酸锰3.9-5.0mg/L，硫酸锌1.1-1.6mg/L，硼酸1.2-1.6mg/L，碘化钾0.6-0.9mg/L，维生素B1(盐酸硫胺素)0.8-1.1mg/L，维生素B6(盐酸吡哆醇)0.4-0.8mg/L，甘氨酸1.8-2.1mg/L。2,4-二氯苯氧乙酸I.2-I.8mg/L，脯氨酸0.5-0.9g/L，蔗糖65-75g/L，葡萄糖33-38g/L，乙酰丁香酮100-150mg/L，pH值为5.1-5.5。
(2)LB培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 15g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，利福平50mg/L，壮观霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L，pH值为5.6-5.9。
(3)共培养培养基：硝酸钾1700-2000mg/L，硝酸铵1550-1700mg/L，磷酸二氢钾150-180mg/L，硫酸镁350-380mg/L，氯化钙430-460mg/L，乙二胺四乙酸二钠36.9-37.5mg/L，硫酸亚铁25-29mg/L，硫酸锰21.9-22.5mg/L，硫酸锌8.5-8.8mg/L，硼酸6.0-6.5mg/L，碘化钾0.79-0.85mg/L，维生素B1(盐酸硫胺素)0.08-0.11mg/L，维生素B6(盐酸吡哆醇)0.45-0.55mg/L，甘氨酸1.6-2.2mg/L，钼酸钠0.22-0.3mg/L，硫酸铜0.02-0.03mg/L，肌醇91-102mg/L，氯化钴0.022-0.03mg/L，烟酸0.45-0.55mg/L。2,4-二氯苯氧乙酸I.2-I.8mg/L，脯氨酸0.5-0.9g/L，蔗糖32-37g/L，植物凝胶3-4g/L，乙酰丁香酮100-150mg/L，硝酸银5-7mg/L，半胱氨酸盐酸盐300-400mg/L，pH值为5.6-5.9。
(4)筛选培养基：硝酸钾2200-3000mg/L，硝酸铵450-480mg/L，磷酸二氢钾380-410mg/L，硫酸镁170-190mg/L，氯化钙150-170mg/L，乙二胺四乙酸二钠30-40mg/L，硫酸亚铁25-29mg/L，硫酸锰3.9-5.0mg/L，硫酸锌1.1-1.6mg/L，硼酸1.2-1.6mg/L，碘化钾0.6-0.9mg/L，维生素B1(盐酸硫胺素)0.8-1.1mg/L，维生素B6(盐酸吡哆醇)0.4-0.8mg/L，甘氨酸1.8-2.1mg/L，脯氨酸0.5-0.9g/L,水解酪蛋白0.4-0.7g/L,2,4-二氯苯氧乙酸1.2-1.8mg/L，蔗糖32-37g/L，植物凝胶1.5-3g/L，特美汀180-220mg/L,双丙氨膦1-2mg/L。pH值为5.6-5.9。
(5)分化培养基：硝酸钾1700-2000mg/L，硝酸铵1550-1700mg/L，磷酸二氢钾150-180mg/L，硫酸镁350-380mg/L，氯化钙430-460mg/L，乙二胺四乙酸二钠36.9-37.5mg/L，硫酸亚铁25-29mg/L，硫酸锰21.9-22.5mg/L，硫酸锌8.5-8.8mg/L，硼酸6.0-6.5mg/L，碘化钾0.79-0.85mg/L，维生素B1(盐酸硫胺素)0.08-0.11mg/L，维生素B6(盐酸吡哆醇)0.45-0.55mg/L，甘氨酸1.6-2.2mg/L，钼酸钠0.22-0.3mg/L，硫酸铜10mmol/L-30mmol/L，肌醇91-102mg/L，氯化钴0.022-0.03mg/L，烟酸0.45-0.55mg/L，硫酸铜1.5-3mg/L，MES 0.3-0.8g/L,玉米素2mg/L-5mg/L，蔗糖15-30g/L，琼脂4.5-6g/L，特美汀180-220mg/L。pH值为5.8-6.2。
(6)生根培养基：硝酸钾1700-2000mg/L，硝酸铵1550-1700mg/L，磷酸二氢钾150-180mg/L，硫酸镁350-380mg/L，氯化钙430-460mg/L，乙二胺四乙酸二钠36.9-37.5mg/L，硫酸亚铁25-29mg/L，硫酸锰21.9-22.5mg/L，硫酸锌8.5-8.8mg/L，硼酸6.0-6.5mg/L，碘化钾0.79-0.85mg/L，维生素B1(盐酸硫胺素)0.08-0.11mg/L，维生素B6(盐酸吡哆醇)0.45-0.55mg/L，甘氨酸1.6-2.2mg/L，钼酸钠0.22-0.3mg/L，硫酸铜0.02-0.03mg/L，肌醇91-102mg/L，氯化钴0.022-0.03mg/L，烟酸0.45-0.55mg/L，蔗糖18-23g/L，琼脂4.5-6.0g/L，pH值为5.8-6.2。
3.实施遗传转化的载体信息
(1)筛选靶点。登陆到网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)进行dpa1基因靶位点的筛选，筛选原则主要包括靶位点位于基因CDS上且尽量靠近起始密码子ATG、靶位点特异性高、脱靶率低、靶位点结合目标序列评估效率高和靶位点GC含量为55％-60％。最终选择SEQ ID NO：1为lac1基因的敲除靶点；
(2)引物退火合成双链。合成靶点时，在正向引物(SEQ ID NO：2)5’端添加序列GGCG和反向互补序列5’端添加序列AAAC，正向引物和反向互补引物各5μl，共10μl体系，退火条件如下：95℃10min；(N19的Tm值减去3-5℃)℃10min，斜率(R)为3-5％；16℃。
(3)酶切载体pBUE411酶切体系如下：
在37℃水浴条件下，酶切4个小时以上；
(4)靶点序列与载体连接。使用Takara的T4连接酶将靶点引入酶切后的pBUE411载体(图2)上，连接体系如下：
在16℃控温条件下，过夜连接；
(5)将连接产物转化大肠杆菌DH5α。挑选单克隆，使用引物OsU3-FD3(SEQ ID NO：3)和靶点反向互补序列鉴定菌落PCR，使用OsU3-FD3测序验证靶点序列。扩繁阳性单克隆，提取质粒，以备转化农杆菌。
实施例2：诱导系中编辑载体系统的鉴定
对转化成功的受体进行编辑系统和靶点编辑类型的检测，首先利用引物cas9-JC-1F(SEQ ID NO：4)和cas9-JC-1R(SEQ ID NO：5)对T1代(实施例1中获得的T0代的子代)DNA进行扩增，对扩增片段进行测序。
实验结果如图所示(图3)，转化成功的阳性单株中包含编辑载体系统和gRNA片段，表明携带编辑基因lac1的载体成功转化到单倍体诱导系中并获得阳性植株(lac1基因能够调控玉米叶片夹角，如果其表达量提高，则能够增大玉米叶片夹角)。通过对获得阳性植株进行编辑位点的检测，发现3个事件发生了纯合编辑(将它们命名为HI3-KO#1、HI3-KO#2和HI3-KO#3)，编辑类型如图3所示；同时，对纯合编辑系HI3-KO#1、HI3-KO#2和HI3-KO#3进行后代的表型测量。结果显示：相对于野生型，纯合敲除系的3个叶位叶夹角均显著减小，尤其上部叶夹角减小幅度更大(图3)。
实施例3：诱导编辑单倍体的检测
为了快速定向编辑不同遗传背景下lac1基因，实现高通量对不同育种自交系的遗传改良，利用携带lac1靶标片段的cas9载体的阳性株系HI3-KO#1的花粉与43个育种自交系进行杂交(测序显示编辑位点特异)。然后，在果穗中筛选单倍体(胚乳表现为诱导系的颜色，而籽粒中的胚表现为正常的颜色)。之后，将筛选的单倍体种子进行播种，出苗后进行秋水仙素处理，以获得染色体组加倍的DH系(双单倍体株系)。对加倍完成后的单倍体植株进行取样，接着提取样品DNA。
利用扩增效率良好的分子标记cas9-JC-1F(SEQ ID NO：4)和cas9-JC-1R(SEQ IDNO：5)对选择的DH系利用诱导系与被诱导自交系之间存在多态性的引物(引物序列参见Zhong Y,Liu C,Qi X,Jiao Y,Wang D,Wang Y,Liu Z,Chen C,Chen B,Tian X,Li J,ChenM,Dong X,Xu X,Li L,Li W,Liu W,Jin W,Lai J,Chen S.Mutation of ZmDMP enhanceshaploid induction in maize.Nat Plants.2019Jun；5(6):575-580中的补充表1)进行分子标记检测，筛选出不含有载体和诱导系HI3基因组上malt位点的单倍体植株，并对筛选后的单倍体植株进行自交留种，获得lac1位点定向编辑的DH系种子。
统计结果显示，共获得了1175个单倍体植株，进行编辑位点的测序发现，共有19个系发生了纯合编辑事件，得到80个lac1基因纯合编辑的单倍体植株，编辑效率为6.8％；同时正在36个系中发现了328个lac1基因杂合或嵌合编辑体，占总单倍体植株的27.9％(表2)。
以上结果表明，利用诱导系介导的基因编辑系统可以快速、高通量的实现对不同遗传背景的育种自交系进行定向编辑，实现育种自交系的精准改良。这一技术的实现不仅大大缩短了育种周期，同时实现了基因编辑和单倍体育种两大技术体系的无缝融合；不仅成功实现了诱导系的成功转化，增加了遗传转化受体的多样性，同时实现了基因功能快速、高效在不同遗传背景下验证基因的功能和利用价值；不仅实现了单基因功能在不同自交系中的定向精准编辑，同时为多基因、多位点的“一键编辑、快速成系”提供了新技术、新手段。
表2.lac1位点在单倍体中的编辑效率
实施例4：双单倍体后代表型的检测
挑选lac1位点被编辑、种子量较多的DH系进行种植，测量后代的叶夹角表型。如图4所示，从实施例3中获得的DH系中挑选了5个，分别命名为DH-B104#KO、DH-PH207#KO、DH-OSL476#KO、DH-TXB2-3#KO和DH-X1C14A#KO。开花授粉后15天，待叶夹角大小基本固定之后，测量野生型和敲除系的上部、中部和下部叶夹角的大小。统计分析发现，定向编辑的5个DH系，其3个叶位(上、中、下)叶夹角显著减小，尤其是上部叶夹角减小的程度更大，与lac1基因的突变体和敲除系表现出一致的表型。以上表型结果说明，通过诱导系介导的基因编辑技术能够实现对玉米自交系的定向精准编辑，具有重大的理论和实践价值。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (20)
1.一种编辑单倍体诱导系植物基因组中靶基因的方法，所述方法包括：将靶向所述靶基因的基因组编辑系统转入单倍体诱导系植物中；
优选地，所述单倍体诱导系植物是天然的单倍体诱导系植物，或者是经改造(例如，基因组编辑)产生的具有单倍体诱导能力的植物。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述靶基因天然存在于所述单倍体诱导系植物的基因组中；
优选地，所述单倍体诱导系植物的靶基因被编辑后，不影响其对子代单倍体植物的诱导能力；
优选地，所述靶基因被编辑后，能够提高植物产量和/或提高植物品种的质量；
优选地，所述提高植物品种的质量包括：提高植物抵抗病原物(例如，昆虫、病原细菌、病毒)的能力，提高植物抵抗逆境(例如，低温、干旱)的能力；
优选地，所述提高植物产量包括：提高植物的穗数，提高植物的穗粒数，提高植物的百粒重或千粒重，和/或提高植物的种植密度；
优选地，提高植物的种植密度是使种植密度不低于约5500株/亩、不低于约6000株/亩、不低于约6500株/亩、不低于约7000株/亩或不低于约7500株/亩(例如约5000株/亩～12000株/亩，约6000株/亩～12000株/亩，约7000株/亩～12000株/亩；例如约7500株/亩、约8000株/亩、约9000株/亩、约10000株/亩、或约12000株/亩)；
优选地，所述编辑位于所述靶基因的编码区和/或非编码区，例如启动子、5’UTR、内含子、外显子、3’UTR、终止子及其任何组合；
优选地，所述编辑包括缺失、置换、插入、倒位、重复或其任意组合；
优选地，所述编辑导致无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变或其任何组合；
优选地，所述植物细胞对于所述编辑而言是纯合的；
优选地，所述编辑包括第一等位基因中的第一编辑和第二等位基因中的第二编辑，所述第一编辑和所述第二编辑彼此相同或不同。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述基因组编辑系统包括至少一种位点特异性核酸酶，例如RNA引导的核酸酶(例如Cas核酸酶)、锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、TALE核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合；
优选地，所述基因组编辑系统选自CRISPR/Cas、TALEN、ZFN、转座子技术、PASTE技术、PE技术、碱基编辑器、以及它们的任何组合；
优选地，所述基因组编辑系统是CRISPR/Cas系统，其包括：Cas蛋白酶(例如Cas9蛋白酶)和指导RNA(gRNA)；
优选地，所述gRNA能够靶向所述靶核酸；
优选地，所述gRNA包含与所述靶核酸或其片段互补的序列；
优选地，所述基因组编辑系统存在于一种或多种载体上；
优选地，所述Cas蛋白酶和gRNA存在于相同的载体上。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，构建包含编码所述Cas蛋白酶和gRNA序列的载体，然后通过农杆菌介导将所述载体转化入所述单倍体诱导系植物的细胞中；
优选地，所述Cas蛋白酶和gRNA存在于相同或不同的载体上；
优选地，所述Cas蛋白酶和gRNA存在于相同的载体上；
优选地，所述载体还包含转化增强序列。
5.权利要求4所述的方法，其中，所述方法通过下述步骤(a)至步骤(e)实现：
(a)提供植物细胞或组织(例如，幼胚)；
(b)构建包含编码所述Cas蛋白酶和gRNA序列的载体，并将其转入农杆菌细胞中；
(c)将转化完成的农杆菌细胞与所述植物细胞或组织(例如，幼胚)接触，并进行共培养；
(d)筛选培养步骤(c)获得的植物细胞或组织(例如，幼胚)，并获得愈伤组织；
(e)分化培养所述愈伤组织；
任选地，将所述愈伤组织进行生根培养；
优选地，在步骤(e)中，提供乳糖亚硫酸盐培养基(LS培养基)分化培养所述愈伤组织；
优选地，所述LS培养基包含CuSO4；
优选地，所述LS培养基包含1mmol/L至100mmol/L的CuSO4(例如，1mmol/L至10mmol/L，10mmol/L至30mmol/L，30mmol/L至50mmol/L，50mmol/L至80mmol/L，80mmol/L至100mmol/L)；
优选地，所述LS培养基包含玉米素；
优选地，所述LS培养基包含1mg/L至30mg/L玉米素(例如，1mg/L至5mg/L，5mg/L至10mg/L，10mg/L至15mg/L，15mg/L至20mg/L，20mg/L至25mg/L，25mg/L至30mg/L)。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物；
优选地，所述单子叶植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜；
优选地，所述植物是玉米；
更优选地，所述天然的单倍体诱导系植物选自Stock6，CAU3，CAU4，CAU5，HI3，HI4，HI5，以及它们的任何组合。
7.权利要求1-6任一项所述的方法获得的经编辑的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞。
8.权利要求7所述的经编辑的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞，其中，所述单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞的基因组中所述靶基因被编辑；
优选地，所述编辑包括至少一个核苷酸的缺失、置换、插入或其组合；
优选地，所述单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞的基因组中所述靶基因被纯合编辑或杂合编辑；
优选地，所述靶基因被编辑后，所述靶基因的功能、表达水平、活性或其组合被破坏(例如，敲低或沉默)。
9.权利要求7或8所述的经编辑的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞，在制备经编辑的子代植物或其部分、种子、细胞中的用途；
优选地，所述子代是经编辑的单倍体植物或其部分、种子、细胞；
优选地，所述经编辑的单倍体植物或其部分、种子、细胞不携带基因组编辑系统；
优选地，所述子代是经编辑的单倍体植物进行染色体加倍后的植物或其部分、种子、细胞。
10.一种制备经编辑的单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)从权利要求1-6任一项所述的方法获得的经编辑的单倍体诱导系植物中，选取靶基因被纯合编辑的植物作为第一植物；
(b)提供第二植物；
(c)用第一植物的花粉给所述第二植物授粉，收获由授粉产生的子代，从而获得经编辑的单倍体植物。
11.权利要求10所述的方法，其中所述第一植物和所述第二植物是相同或不同的物种；
优选地，所述第一植物和第二植物各自独立地选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜；
优选地，所述第一植物为玉米；
优选地，所述第二植物也为玉米。
12.权利要求10或11所述的方法，其中，在步骤(a)中，通过核酸检测，或者对所述靶基因调控的性状进行检测，以选取靶基因被纯合编辑的植物；
优选地，所述核酸检测是通过检测是否存在所述靶核酸来实现的；
更优选地，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测(例如，测序，凝胶电泳检测)所述靶核酸；
优选地，所述核酸检测是通过检测是否存在与所述靶核酸连锁的分子标记来实现的；
更优选地，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测(例如，测序，凝胶电泳检测)与所述靶基因连锁的分子标记；
优选地，所述分子标记选自单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(InDel)、单特征多态性(SFP)、简单序列重复(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)；
优选地，所述靶基因调控的性状是植株的性状(例如，茎叶夹角，叶片颜色)和/或籽粒的性状(例如，籽粒中胚乳的颜色，籽粒中胚的颜色)。
13.权利要求10-12任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中，第二植物选自杂交系(例如，品种间的杂交种，品种与自交系的杂交种，自交系间的杂交种)，和/或自交系；
优选地，将自交系植物作为第二植物；
优选地，所述自交系植物选自TXB2-3，X1C14A，PH207，OSL476，B104，LY16M，LA306，B113，W22，LH244，CIMBL54，LY16F，RA589，835b，05W002，RA624，Si273，M165，CIMBL60，Z58，NZA004，By843，4F1，CL009，Nan21-3，RA584，CML118，P138，K22，HC，RA263，CF3，CIMBL145，By4944，CT208，R08，Gy386，GEMS48，RA136，B111，C7-2，P178，M97，以及它们的任何组合；
优选地，所述第二植物的靶基因未经编辑。
14.权利要求10-13任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，通过子代的籽粒的性状和/或对靶基因进行核酸检测来筛选经编辑的单倍体植物；
优选地，所述籽粒的性状选自籽粒中胚乳的颜色，籽粒中胚的颜色，或它们的任何组合；
优选地，如果子代的籽粒中胚乳的颜色与第一植物相同，且籽粒中胚的颜色与第二植物相同，则所述子代是经编辑的单倍体植物；
优选地，所述核酸检测是通过检测是否存在所述靶核酸来实现的；
优选地，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测(例如，测序，凝胶电泳检测)所述靶核酸；
优选地，所述核酸检测是通过检测是否存在与所述靶核酸连锁的分子标记来实现的；
优选地，所述核酸检测包含下述步骤：
(1)提供包含所述植物或其部分、种子、细胞的基因组DNA的样品；
(2)检测(例如，测序，凝胶电泳检测)与所述靶基因连锁的分子标记；
优选地，所述分子标记选自单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(InDel)、单特征多态性(SFP)、简单序列重复(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)；
优选地，如果子代的籽粒中胚乳的颜色与第一植物相同，籽粒中胚的颜色与第二植物相同，且则通过核酸检测确认所述靶基因经编辑，则所述子代是经编辑的单倍体植物。
15.由权利要求10-14任一项所述的方法制备的单倍体植物或其部分、种子、细胞，其中，所述单倍体植物或其部分、种子、细胞的基因组中的靶基因被编辑；
优选地，所述经编辑的单倍体植物或其部分、种子、细胞不携带基因组编辑系统；
优选地，所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜。
16.权利要求15所述的单倍体植物或其部分、种子、细胞在制备玉米自交系中的用途；
优选地，所述玉米自交系的基因组中的靶基因被编辑。
17.一种制备经编辑的二倍体植物的方法，所述方法包括：通过权利要求10-14任一项所述的方法获得经编辑的单倍体植物，并用染色体加倍剂处理所述经编辑的单倍体植物，获得经编辑的二倍体植物；
优选地，所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜；
优选地，所述染色体加倍剂选自秋水仙碱、拿草特、滴停平、氟乐灵，以及它们的任何组合。
18.一种制备经编辑的自交系植物的方法，所述方法包括：将权利要求10-16任一项所述的方法获得的经编辑的二倍体植物进行杂交或自交，以获得经编辑的自交系种子或植物；
优选地，将所述经编辑的二倍体植物与另外的植物进行杂交；
优选地，所述另外的植物是二倍体植物(例如，天然的二倍体植物，人工培育的二倍体植物)；
优选地，所述植物选自玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、小黑麦、高梁、珍珠粟、类蜀黍、竹、甘蔗、芦笋、洋葱、和大蒜。
19.权利要求18所述的方法制备的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的制品；
优选地，所述制品包含所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组DNA；
优选地，所述制品选自玉米耳穗、去苞叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、不饱和玉米油、饱和玉米油、玉米片、爆玉米花、由玉米生产的乙醇和/或汁(liquor)、由玉米发酵产生的干酒糟(DDGS)、来自玉米的动物饲料、化妆品和填充剂中的一项或多项。
20.权利要求9所述的单倍体诱导系植物或其部分、种子、细胞，权利要求15所述的单倍体植物或其部分、种子、细胞，或权利要求19所述的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的制品在提高玉米产量和/或提高玉米品种质量中的用途；
优选地，提高玉米品种质量包括：提高玉米抵抗病原物(例如，昆虫、病原细菌、病毒)的能力，和/或提高玉米抵抗逆境(例如，低温、干旱)的能力。
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