BR122021005304B1 - Hospedeiro recombinante que compreende genes recombinantes para produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, ácido nucleico, método para produzir esteviol, glicosídeo de esteviol ou composição de glicosídeo de esteviol e método para sintetizar esteviol ou glicosídeo de esteviol - Google Patents

Hospedeiro recombinante que compreende genes recombinantes para produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, ácido nucleico, método para produzir esteviol, glicosídeo de esteviol ou composição de glicosídeo de esteviol e método para sintetizar esteviol ou glicosídeo de esteviol Download PDF

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Ganesh M. Kishore
Michael Motion
Paula M. Hicks
Jorgen Hansen
Jens Houghton- Larsen
Esben Halkjær Hansen
Michael Dalgaard Mikkelsen
Sabina Tavares
Charlotte Blom
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Abstract

Microrganismos recombinantes, plantas e células vegetais são divulgados, os quais foram concebidos para expressar novos genes recombinantes que codificam enzimas biossintéticas de esteviol e UDP-glicosiltransferases (UGTs). Tais microrganismos, plantas ou células vegetais podem produzir esteviol ou glicosídeos de esteviol, por exemplo, rubusosídeo ou Rebaudiosídeo A, que podem ser utilizados como adoçantes naturais em produtos alimentares e suplementos dietéticos.

Description

[001] Dividido do BR 11 2012 030836 0, depositado em 02/06/2011.
Listagem de Sequência
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi apresentada no formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 2 de Junho de 2011, é nomeada 25933WO1.txt e possui tamanho de 483.406 bytes.
Campo Técnico
[003] Esta divulgação refere-se à produção recombinante de esteviol e glicosídeos de esteviol. Em particular, esta divulgação refere-se à produção de esteviol e glicosídeos de esteviol, tais como rubusosídeo e/ou rebaudiosídeo A por hospedeiros recombinantes, tais como microrganismos recombinantes, plantas, ou células vegetais. Esta divulgação também provê composições contendo glicosídeos de esteviol.
Fundamento
[004] Adoçantes são bem conhecidos como ingredientes mais comumente utilizados em alimentos, bebidas ou indústrias de confeitaria. O adoçante pode ser incorporado em um produto alimentar final durante a produção ou utilizado sozinho, quando apropriadamente diluído, tal como um adoçante de mesa ou uma substituição caseira para açúcares no cozimento. Adoçantes incluem adoçantes naturais, tais como sacarose, xarope de milho rico em frutose, melaço, xarope de bordo, e mel e adoçantes artificiais, tais como aspartame, sacarina e sucralose. O extrato de estévia é um adoçante natural que pode ser isolado e extraído de um arbusto perene, Stevia rebaudiana. A estévia é comumente cultivada na América do Sul e Ásia para produção comercial de extrato de estévia. O extrato de estévia, purificado em vários graus, é utilizado comercialmente como um adoçante de alta intensidade em alimentos e em misturas ou sozinho como um adoçante de mesa.
[005] Extratos da planta de estévia contem rebaudiosídeos e outros glicosídeos de esteviol que contribuem para o sabor doce, embora a quantidade de cada glicosídeo geralmente varie entre diferentes lotes de produção. Produtos comerciais existentes são predominantemente rebaudiosídeo A com menos quantidades de outros glicosídeos, tais como rebaudiosídeo C, D, e F. Extratos de estévia podem também conter contaminantes, tais como compostos derivados de plantas que contribuem para sabores desagradáveis. Estes sabores desagradáveis podem ser mais ou menos problemáticos dependendo da aplicação ou sistema alimentar escolhido. Contaminantes potenciais incluem pigmentos, lipídios, proteínas, fenólicos, sacarídeos, espatulenol e outros sesquiterpenos, labdano diterpenos, monoterpenos, ácido decanóico, ácido 8,11,14-eicosatrienóico, 2-metiloctadecano, pentacosano, octacosano, tetracosano, octadecanol, estigmasterol, β-sitosterol, α- e β-amirina, lupeol, β-amirina acetato, triterpeno pentacíclico, centauredina, quercitina, epi-alfa-cadinol, carofilenos e derivados, beta-pineno, beta-sitosterol, e giberelina.
Sumário
[006] É aqui fornecido um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, compreendendo um ou mais genes de biossíntese, cuja expressão resulta em produção de esteviol. Tais genes incluem um gene que codifica uma copalil difosfato sintase, um gene que codifica uma caureno sintase, um gene que codifica uma caureno oxidase; e um gene que codifica uma esteviol sintetase. O hospedeiro recombinante pode incluir um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase, no lugar dos genes que codificam copalil difosfato sintase e caureno sintase. Pelo menos um dos genes é um gene recombinante. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente compreende um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase. O hospedeiro recombinante pode ainda compreender um gene que codifica uma redutase de HMG-CoA truncado e/ou um gene que codifica um CPR. A expressão de um ou mais dos genes pode ser induzível.
[007] Em um aspecto, este documento apresenta um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT91D2 (por exemplo, um polipeptídeo UGT91D2e ou UGT91D2m). O polipeptídeo UGT91D2 pode ter pelo menos 90% de identidade (por exemplo, pelo menos 95% ou 99% de identidade) à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo UGT91D2 pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido nos resíduos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, ou 387473 da SEQ ID NO: 5. Por exemplo, o polipeptídeo UGT91D2 pode incluir uma substituição em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste nos resíduos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, e 438 da SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o polipeptídeo UGT91D2 inclui uma arginina no resíduo 206, uma cisteína no resíduo 207, e uma arginina no resíduo 343 em relação à SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o polipeptídeo UGT91D2 inclui uma fenilalanina no resíduo 30, uma glutamina no resíduo 93, uma valina no resíduo 99, uma fenilalanina no resíduo 122, uma tirosina no resíduo 140, uma cisteína no resíduo 142, uma treonina no resíduo 148, uma alanina no resíduo 153, uma serina no resíduo 156, uma metionina no resíduo 195, um ácido glutâmico no resíduo 196, um ácido glutâmico no resíduo 199, uma metionina no resíduo 211, uma fenilalanina no resíduo 221, uma alanina no resíduo 286, uma asparagina no resíduo 427, ou uma alanina no resíduo 438 em relação à SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo pode ter a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 95.
[008] Um hospedeiro aqui descrito pode ainda incluir um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT85C tendo pelo menos 90% de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3. Por exemplo, o polipeptídeo UGT85C pode incluir uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, e 471 da SEQ ID NO: 3.
[009] Um hospedeiro aqui descrito pode ainda incluir um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G tendo pelo menos 90% de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 7. Por exemplo, o polipeptídeo UGT76G pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346 da SEQ ID NO: 7.
[0010] Este documento também apresenta um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT85C tendo pelo menos 90% de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3, e tendo uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, e 471 da SEQ ID NO: 3. Por exemplo, o polipeptídeo UGT85C pode incluir substituições nos resíduos 13, 15, 60, 270, 289, e 418 da SEQ ID NO: 3. Por exemplo, o polipeptídeo UGT85C pode incluir a) substituições nos resíduos 13, 60, e 270 da SEQ ID NO: 3; b) substituições nos resíduos 60 e 87 da SEQ ID NO: 3; c) substituições nos resíduos 65, 71, 220, 243, e 270 da SEQ ID NO: 3; d) substituições nos resíduos 65, 71, 220, 243, 270, e 441 da SEQ ID NO: 3; e) substituições nos resíduos 65, 71, 220, 389, e 394 da SEQ ID NO: 3; f) substituições nos resíduos 65, 71, 270, e 289 da SEQ ID NO: 3; g) substituições nos resíduos 15 e 65 da SEQ ID NO: 3; h) substituições nos resíduos 65 e 270 da SEQ ID NO: 3; i) substituições nos resíduos 65 e 440 da SEQ ID NO: 3; j) substituições nos resíduos 65 e 441 da SEQ ID NO: 3; k) substituições nos resíduos 65 e 418 da SEQ ID NO: 3; l) substituições nos resíduos 220, 243, 270, e 334 da SEQ ID NO: 3; ou m) substituições nos resíduos 270 e 289 da SEQ ID NO: 3.
[0011] Em outro aspecto, este documento apresenta um hospedeiro recombinante que inclui um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G tendo pelo menos 90% de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 7, e tendo uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346. Por exemplo, o polipeptídeo UGT76G pode ter a) substituições nos resíduos de aminoácido 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, e 291; b) substituições nos resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, e 291; ou c) substituições nos resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346.
[0012] Qualquer um dos hospedeiros aqui descritos pode ainda incluir um gene que codifica um polipeptídeo UGT74G1 (por exemplo, um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT74G1).
[0013] Qualquer um dos hospedeiros aqui descritos pode ainda incluir um ou mais de: (i) um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase; (ii) um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase; (iii) um gene que codifica uma caureno oxidase; (iv) um gene que codifica uma esteviol sintetase; (v) um gene que codifica um HMG-CoA truncado; (vi) um gene que codifica um CPR; (vii) um gene que codifica uma ramnose sintetase; (viii) um gene que codifica uma UDP-glicose desidrogenase; e (ix) um gene que codifica uma UDP-ácido glucurônico descarboxilase. Pelo menos um dos genes de (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), ou (ix) pode ser um gene recombinante. Em algumas modalidades, cada um dos genes de (i), (ii), (iii), e (iv) é um gene recombinante.
[0014] Este documento também apresenta um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95% ou 99% de identidade de sequência) à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido nos resíduos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, ou 387-473 da SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo pode incluir uma substituição em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste nos resíduos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, e 438 da SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo pode incluir uma arginina no resíduo 206, uma cisteína no resíduo 207, e uma arginina no resíduo 343 da SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo inclui uma fenilalanina no resíduo 30, uma glutamina no resíduo 93, uma valina no resíduo 99, uma fenilalanina no resíduo 122, uma tirosina no resíduo 140, uma cisteína no resíduo 142, uma treonina no resíduo 148, uma alanina no resíduo 153, uma serina no resíduo 156, uma metionina no resíduo 195, um ácido glutâmico no resíduo 196, um ácido glutâmico no resíduo 199, uma metionina no resíduo 211, uma fenilalanina no resíduo 221, uma alanina no resíduo 286, uma asparagina no resíduo 427, ou uma alanina no resíduo 438 da SEQ ID NO: 5.
[0015] Em outro aspecto, este documento apresenta um polipeptídeo isolado tendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 90% de identidade à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5.
[0016] Este documento também apresenta um hospedeiro recombinante que inclui (i) um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase; (ii) um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase; (iii) um gene que codifica uma caureno oxidase; e (iv) um gene que codifica uma esteviol sintetase; em que pelo menos um dos referidos genes. O hospedeiro pode produzir esteviol quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso, e pode se acumular a pelo menos 1 mg/L no meio de cultura. Uma geranilgeranil difosfato sintase pode ter mais de 90 % de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID NOs: 121-128. Uma copalil difosfato sintase pode ter mais de 90 % de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID NOs:129-131. Uma caureno sintase pode ter mais de 90 % de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácido apresentadas na 132-135. A caureno oxidase pode ter mais de 90 % de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácido apresentadas na 138141. A esteviol sintetase pode ter mais de 90 % de identidade de sequência a uma das sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID NOs:142-146. O hospedeiro pode ainda incluir um gene que codifica um HMG-CoA truncado e/ou um gene que codifica um CPR.
[0017] Qualquer um dos hospedeiros recombinantes pode ainda incluir um ou mais de um gene que codifica um polipeptídeo UGT74G1, um polipeptídeo UGT85C2, um polipeptídeo UGT76G1, ou um polipeptídeo UGT91D2.
[0018] Qualquer um dos hospedeiros recombinantes pode produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O glicosídeo de esteviol pode ser selecionado do grupo que consiste em esteviol-13-O-glicosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, rubusosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, e dulcosídeo A. O glicosídeo de esteviol pode se acumular a pelo menos 1 mg/litro (por exemplo, pelo menos 10 mg/litro ou 20 mg/litro) de meio de cultura quando cultivado sob as referidas condições.
[0019] Qualquer um dos hospedeiros recombinantes pode ainda incluir um ou mais de i) um gene que codifica uma desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXS); ii) um gene que codifica uma D-1-desoxixilulose 5-fosfato redutoisomerase (DXR); iii) um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS); iv) um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK); v) um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS); vi) um gene que codifica uma 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS); ou vii) um gene que codifica uma 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR).
[0020] Qualquer um dos hospedeiros recombinantes pode ainda incluir um ou mais de ix) um gene que codifica uma acetoacetil-CoA tiolase; x) um gene que codifica uma redutase de HMG-CoA truncado; xi) um gene que codifica uma mevalonato quinase; xii) um gene que codifica uma fosfomevalonato quinase; ou xiii) um gene que codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase.
[0021] Em qualquer um dos hospedeiros aqui descritos, a expressão de um ou mais dos genes pode ser induzível.
[0022] Qualquer um dos hospedeiros aqui descritos pode ser um microrganismo (por exemplo, um Saccharomycete, tal como Saccharomyces cerevisiae, ou Escherichia coli), ou uma planta ou célula vegetal (por exemplo, uma Stevia, tal como uma Stevia rebaudiana, Physcomitrella, ou planta de tabaco ou célula vegetal).
[0023] Em outro aspecto, este documento apresenta um método de produção de esteviol ou um glicosídeo de esteviol. O método inclui o crescimento de um hospedeiro aqui descrito em um meio de cultura, sob condições em que os genes são expressos; e recuperação do esteviol ou glicosídeo de esteviol produzido pelo hospedeiro. A etapa de crescimento pode incluir induzir a expressão de um ou mais dos genes. O esteviol ou glicosídeo de esteviol é selecionado do grupo que consiste em esteviol-13-O-glicosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, rubusosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, e dulcosídeo A.
[0024] Também é aqui fornecido um método de produção de esteviol ou um glicosídeo de esteviol. O método inclui crescimento de um microrganismo em um meio de cultura, sob condições em que uma geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, gene 13-hidroxilase de ácido caurenóico e, opcionalmente, um gene UGT74G1 e/ou UGT85C2 são expressos, e recuperação do esteviol ou glicosídeo de esteviol produzido pelo microrganismo. O microrganismo pode ser um Saccharomyces spp. Em algumas modalidades, a etapa de crescimento compreende induzir a expressão de um ou mais de uma geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, 13-hidroxilase de ácido caurenóico, genes UGT74G1 e UGT85C2. Em algumas modalidades, a etapa de recuperação compreende purificar o esteviol ou glicosídeo de esteviol do meio de cultura por HPLC. O esteviol ou glicosídeo de esteviol pode ser esteviol , rubusosídeo, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo F, ou dulcosídeo A.
[0025] Também é aqui fornecido uma cepa de Saccharomyces recombinante, compreendendo um ou mais genes de biossíntese cuja expressão resulta na produção de ent-caureno. Os genes de biossíntese incluem um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase. A cepa produz ent- caureno quando da expressão de uma copalil difosfato sintase e uma caureno sintase.
[0026] Em outro aspecto, este documento apresenta um ácido nucleico isolado tendo mais de 90 % de identidade de sequência (por exemplo, mais de 95% ou 99% de identidade de sequência) a uma das sequências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID NOs: 18-25, 34-36, 4-43, 48, 49, 52-55, 60-64, 70-72, 77, ou 79.
[0027] Este documento também apresenta um hospedeiro recombinante que inclui (i) um gene que codifica um UGT74G1; (ii) um gene que codifica um UGT85C2; (iii) um gene que codifica um UGT76G1; e (iv) um gene que codifica um UGT91D2, em que pelo menos um dos referidos genes é um gene recombinante. Em algumas modalidades, cada um dos genes é um gene recombinante. O hospedeiro pode produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O hospedeiro pode ainda incluir (a) um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase; (b) um gene que codifica uma caureno oxidase; (c) um gene que codifica uma esteviol sintetase; e (d) um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase. O glicosídeo de esteviol pode ser rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo E. Este documento também apresenta uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por tal hospedeiro. A composição pode ter mais de 4% de rebaudiosídeo D em peso de glicosídeos de esteviol total e um nível reduzido de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia. A composição pode ter mais de 4% de rebaudiosídeo E em peso de glicosídeos de esteviol total e um nível reduzido de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia.
[0028] Também aqui apresentado é um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo tendo mais de 90 % de identidade de sequência às sequências de aminoácido de UGT91D2e e UGT91D2m, excluindo a sequência de aminoácido de UGT91D2m, bem como os polipeptídeos isolados tendo mais de 90 % de identidade de sequência à sequência de aminoácido de UGT91D2e ou UGT91D2m, excluindo a sequência de aminoácido de UGT91D2m.
[0029] Este documento também apresenta composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo hospedeiro aqui descrito. A composição tendo níveis reduzidos de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia.
[0030] Em outro aspecto, este documento apresenta um hospedeiro recombinante. O hospedeiro inclui (i) um gene recombinante que codifica um UGT91D2; (ii) um gene recombinante que codifica um UGT74G1; (iii) um gene recombinante que codifica um UGT85C2; (iv) um gene recombinante que codifica um UGT76G1; e (v) um gene que codifica uma ramnose sintetase, em que o hospedeiro produz pelo menos um glicosídeo de esteviol quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O hospedeiro pode ainda incluir (a) um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase; (b) um gene que codifica uma caureno oxidase; (c) um gene que codifica uma esteviol sintetase; e (d) um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase. O glicosídeo de esteviol pode ser rebaudiosídeo C ou dulcosídeo A. Este documento também apresenta uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por tal hospedeiro. A composição possui mais de 15% de rebaudiosídeo C em peso de glicosídeos de esteviol total e um nível reduzido de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por tal hospedeiro também é apresentada. A composição pode ter mais de 15% de dulcosídeo A em peso de glicosídeos de esteviol total e um nível reduzido de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia.
[0031] Este documento também apresenta um hospedeiro recombinante. O hospedeiro inclui (i) um gene recombinante que codifica um UGT91D2; (ii) um gene recombinante que codifica um UGT74G1; (iii) um gene recombinante que codifica um UGT85C2; (iv) um gene recombinante que codifica um UGT76G1; (v) um gene que codifica uma UDP-glicose desidrogenase; e (vi) um gene que codifica uma UDP-ácido glucurônico descarboxilase, em que o hospedeiro produz pelo menos um glicosídeo de esteviol quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O hospedeiro pode ainda incluir (a) um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase, ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase; (b) um gene que codifica uma caureno oxidase; (c) um gene que codifica uma esteviol sintetase; e (d) um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase. O glicosídeo de esteviol pode ser rebaudiosídeo F. Este documento também apresenta uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por tais hospedeiros. A composição pode ter mais de 4% de rebaudiosídeo F em peso de glicosídeos de esteviol total e um nível reduzido de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia.
[0032] Em outro aspecto, este documento apresenta um método de produção de uma composição de glicosídeo de esteviol. O método inclui o crescimento de um hospedeiro aqui descrito em um meio de cultura, sob condições em que cada um dos genes é expresso; e recuperação da composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo hospedeiro, em que a composição recuperada é enriquecida por rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A em relação à composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia de tipo selvagem. A composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo hospedeiro (por exemplo, microrganismo) pode ter um nível reduzido de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia.
[0033] Este documento também apresenta um produto alimentar que inclui uma composição de glicosídeo de esteviol enriquecida por rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A em relação à composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de estévia de tipo selvagem.
[0034] Em outro aspecto, este documento apresenta um método de identificar se um polimorfismo está associado à variação em uma característica. O método inclui determinar se um ou mais polimorfismos genéticos em uma população de plantas está associado ao lócus para um polipeptídeo previsto na SEQ ID NO: 5 e homólogos funcionais do mesmo; e medir a correlação entre variação no traço em plantas da população e a presença do um ou mais polimorfismos genéticos em plantas da população, para assim identificar se o um ou mais polimorfismos genéticos está ou não associado à variação no traço.
[0035] Em ainda outro aspecto, este documento apresenta um método de produção de uma linhagem de planta. O método inclui determinar se um ou mais polimorfismos genéticos em uma população de plantas está associado ao lócus para um polipeptídeo previsto na SEQ ID NO: 5 e homólogos funcionais do mesmo; identificar uma ou mais plantas na população em que a presença de pelo menos um dos polimorfismos genéticos está associada à variação em uma característica; cruzar um ou mais das plantas identificadas com ela mesma ou uma planta diferente para produzir semente; cruzar pelo menos uma planta progênie gerada da semente com ela mesma ou uma planta diferente; e repetir as etapas de cruzamento por mais 0-5 gerações para produzir a referida linhagem de planta, em que pelo menos um dos polimorfismos genéticos está presente na linhagem da planta.
[0036] Este documento também apresenta um método de transferência de uma segunda porção de açúcar para o C-2' de uma glicose em um glicosídeo de esteviol. O método inclui contactar o glicosídeo de esteviol com um polipeptídeo UGT91D2 e um UDP-açúcar sob condições de reação adequadas para a transferência da segunda porção de açúcar para o glicosídeo de esteviol. O polipeptídeo UGT91D2 pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95% ou 99%) à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo UGT91D2 pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido nos resíduos 119, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, ou 387-473 da SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo UGT91D2 pode incluir uma substituição em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste nos resíduos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, e 438 da SEQ ID NO: 5. O glicosídeo de esteviol pode ser selecionado do grupo que consiste em esteviol-13-O-glicosídeo, rubusosídeo, esteviosídeo, e rebaudiosídeo A. O glicosídeo de esteviol pode ser rubusosídeo e a segunda porção de açúcar é glicose, e esteviosídeo é produzido quando da transferência da segunda porção de glicose. O glicosídeo de esteviol pode ser esteviosídeo e a segunda porção de açúcar pode ser glicose, e Rebaudiosídeo E é produzido quando da transferência da segunda porção de glicose. O glicosídeo de esteviol pode ser esteviosídeo, em que esteviosídeo é contactado com o polipeptídeo UGT91D2 e um polipeptídeo UGT76G1 sob condições de reação adequadas para produzir Rebaudiosídeo D. O glicosídeo de esteviol pode ser esteviol-13-O-glicosídeo e esteviol-1,2 biosídeo é produzido quando da transferência da referida segunda porção de glicose. O glicosídeo de esteviol pode ser esteviol-13-O-glicosídeo e esteviol-1,2-xilobiosídeo é produzido quando da transferência da segunda porção de açúcar. O glicosídeo de esteviol pode ser esteviol-13-O-glicosídeo e esteviol-1,2-ramnobiosídeo pode ser produzido quando da transferência da segunda porção de açúcar. O glicosídeo de esteviol pode ser Rebaudiosídeo A, e Rebaudiosídeo D é produzido quando da transferência de uma segunda porção de glicose.
[0037] Em outro aspecto, este documento apresenta um método de determinar a presença de um polinucleotídeo em uma planta de estévia. O método inclui contactar pelo menos uma sonda ou par de iniciador com ácido nucleico a partir da planta de estévia, em que a sonda ou par de iniciador é específico para um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo UGT, em que o polipeptídeo UGT tem pelo menos 90% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 e determinar se o polinucleotídeo está ou não presente na referida planta de estévia.
[0038] Este documento também apresenta um kit para genotipagem de uma amostra biológica de estévia. O kit inclui um par de iniciador que especificamente amplifica, ou uma sonda que especificamente se hibridiza a, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo UGT tendo pelo menos 90% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7.
[0039] Também é aqui fornecido um microrganismo recombinante, compreendendo um ou mais genes de biossíntese cuja expressão resulta na produção de um ou mais glicosídeos de esteviol. Os genes de biossíntese incluem um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase, um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase, um gene que codifica uma caureno oxidase, um gene que codifica uma esteviol sintetase, e um gene que codifica um UGT74G1 e/ou um UGT85C2. Pelo menos um dos genes é um gene recombinante. O microrganismo pode compreender um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase em vez dos genes que codificam uma copalil difosfato sintase e caureno sintase.
[0040] O microrganismo recombinante produz pelo menos um glicosídeo de esteviol quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O glicosídeo de esteviol pode ser rubusosídeo, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo F, dulcosídeo B, ou dulcosídeo A.
[0041] O microrganismo recombinante pode ser um Saccharomycete, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, e pode ter uma ou mais modificações genéticas que reduzem atividade de EXG1 e EXG2 glicosídeo hidrolase em relação a um microrganismo de controle que não possui tais modificações genéticas, e pode ter uma ou mais modificações genéticas que reduzem biossíntese de ergosterol em relação a um microrganismo de controle que não possui tais modificações genéticas. O Saccharomycete produz rubusosídeo quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O rubusosídeo pode se acumular a pelo menos 10 mg/litro de meio de cultura. O Saccharomycete pode ser uma cepa de Saccharomyces cerevisiae designada CEY171, CEY191, ou CEY213.
[0042] O microrganismo recombinante pode ainda compreender um gene que codifica um SM12UGT e um gene que codifica um UGT76G1, e produzir um glicosídeo de esteviol quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O glicosídeo de esteviol pode ser rebaudiosídeo A.
[0043] Também é aqui fornecido um microrganismo recombinante, compreendendo um ou mais genes de biossíntese cuja expressão resulta na produção de pelo menos um glicosídeo de esteviol. Os genes de biossíntese incluem um gene que codifica um SM12UGT, um gene que codifica um UGT74G1, um gene que codifica um UGT76G1 e um gene que codifica um UGT85C2. O microrganismo recombinante produz rebaudiosídeo A ou rebaudiosídeo B quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O rebaudiosídeo A ou rebaudiosídeo B pode se acumular a pelo menos 1 mg/L no meio de cultura.
[0044] Também aqui apresentado é um microrganismo recombinante, compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo UGT91D2, por exemplo, um gene UGT91D2 recombinante.
[0045] Também aqui apresentado é um microrganismo recombinante, compreendendo um gene que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase, um gene que codifica uma copalil difosfato sintase bifuncional e caureno sintase (ou um gene que codifica uma copalil difosfato sintase e um gene que codifica uma caureno sintase), um gene que codifica uma caureno oxidase, um gene que codifica uma esteviol sintetase, um gene que codifica um UGT74G1, um gene que codifica um UGT85C2, um gene que codifica um UGT76G1, e um gene que codifica um UGT91D2. Pelo menos um dos genes é um gene recombinante. O microrganismo recombinante pode produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, e/ou rebaudiosídeo F, quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O microrganismo recombinante pode acumular pelo menos 20 mg de glicosídeo de esteviol por litro de meio de cultura quando cultivado sob tais condições. O microrganismo recombinante pode ser um Saccharomycete, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, e pode ter uma ou mais modificações genéticas que reduzem atividade de EXG1 e EXG2 glicosídeo hidrolase em relação a um microrganismo de controle que não possui tais modificações genéticas, e pode ter uma ou mais modificações genéticas que reduzem biossíntese de ergosterol em relação a um microrganismo de controle que não possui tais modificações genéticas.
[0046] Também aqui apresentado é um microrganismo recombinante, compreendendo um gene que codifica um UGT74G1, um gene que codifica um UGT85C2, um gene que codifica um UGT76G1, e um gene que codifica um UGT91D2. Pelo menos um dos genes é um gene recombinante. O microrganismo recombinante pode produzir um glicosídeo de esteviol, por exemplo, rebaudiosídeo A ou rebaudiosídeo B, quando cultivado sob condições em que cada um dos genes é expresso. O rebaudiosídeo A ou rebaudiosídeo B pode se acumular a pelo menos 15 mg/L no meio de cultura.
[0047] Os microrganismos recombinantes descritos acima podem ainda compreender um gene que codifica uma desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXS), e/ou um gene que codifica uma D-1-desoxixilulose 5-fosfato redutoisomerase (DXR), e/ou um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), e/ou um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK), e/ou um gene que codifica uma 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), e/ou um gene que codifica uma 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS), e/ou um gene que codifica uma 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4- difosfato redutase (HDR).
[0048] Os microrganismos recombinantes descritos acima podem ainda compreender um gene que codifica uma acetoacetil-CoA tiolase, e/ou um gene que codifica uma redutase de HMG-CoA truncado, e/ou um gene que codifica uma mevalonato quinase, e/ou um gene que codifica uma fosfomevalonato quinase, e/ou um gene que codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase.
[0049] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por uma pessoa ordinariamente versada na técnica à qual a invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados para praticar a invenção, métodos e materiais adequados encontram-se descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporados por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. Outras vantagens e características da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Os requerentes reservam o direito de alternativamente reivindicar qualquer invenção divulgada utilizando a frase de transição "compreendendo", "consistindo essencialmente em" ou "que consiste em" de acordo com a prática padrão na lei de patentes.
[0050] Descrição dos Desenhos
[0051] A FIGURA 1 é um esquema que ilustra a biossíntese de esteviol a partir de geranilgeranil difosfato.
[0052] As FIGURAS 2A-D mostram caminhos representativos para a biossíntese de glicosídeos de esteviol a partir de esteviol.
[0053] A FIGURA 3 mostra estruturas químicas para vários glicosídeos de esteviol.
[0054] A FIGURA 4 é uma representação esquemática da produção de rebA em Saccharomyces cerevisiae.
[0055] A FIGURA 5 é uma representação esquemática da concatenação de genes para formar eYACs.
[0056] A FIGURA 6 mostra produção de rubusosídeo por cepa de levedura CEY13 sob várias condições de cultura.
[0057] A FIGURA 7 mostra os dados obtidos a partir de análise de 1H e 13C RMN do composto produzido por cepa de levedura CEY213, em comparação a valores literais para rubusosídeo.
[0058] A FIGURA 8 é um alinhamento das sequências de aminoácido UGT91D1 e UGT91D2 (SEQ ID NOs:14, 16, 12, 5, e 10, respectivamente).
[0059] A FIGURA 9 mostra Rebaudiosídeo A, esteviosídeo, e produção de rubusosídeo por levedura CEY213 contendo plasmídeo pMUS47 após 24 e 99 horas de cultura.
[0060] A FIGURA 10A é um gráfico que ilustra as concentrações de RebA, rubusosídeo e 19-SMG em sobrenadantes. A FIGURA 10B é um gráfico das concentrações de RebA, rubusosídeo e 19-SMG medidas em sedimentos de células, para experimentos onde células de levedura foram alimentadas com 100 μM esteviol. Em ambos os gráficos, o primeiro jogo de barras representa as cepas de controle não- marcadas; o segundo jogo de barras representa a cepa contendo as proteínas de fusão UGT74G1, UGT76G1, e UGT91D2e, em que os aminoácidos N-terminais 158 da proteína MDM2 são fundidos a cada UGT, e uma proteína de fusão UGT85C2, em que quatro repetições do peptídeo PMI sintético são fundidas em quadro ao N-terminal de 85C2. O eixo y é concentração em unidades micromolares.
[0061] Símbolos de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.
[0062] Descrição Detalhada
[0063] Dois glicosídeos, esteviosídeo e rebaudiosídeo A, são os compostos primários em extratos de estévia comercialmente produzidos. Esteviosídeo é relatado como tendo um gosto mais amargo e menos doce do que rebaudiosídeo A e, portanto, uma proporção maior de rebaudiosídeo A em uma preparação de extrato é preferida. No entanto, a composição de extrato de estévia pode variar de lote para lote dependendo do solo e clima em que as plantas são cultivadas. Dependendo da origem da planta, das condições climáticas e do processo de extração, a quantidade de rebaudiosídeo A em preparações comerciais é relatada como variando de 20 a 97% do teor de glicosídeo de esteviol total, tipicamente >50-80% e às vezes tão alta quanto >95-97% dos glicosídeos de esteviol total. Além disso, outros glicosídeos de esteviol estão presentes em quantidades diversas em extratos de estévia, o que adicionalmente complica a capacidade de produzir um adoçante com um perfil de sabor consistente pela extração e purificação a partir de plantas de estévia. Por exemplo, Rebaudiosídeo B está tipicamente presente em menos de 1-2%, enquanto Rebaudiosídeo C pode estar presentes em níveis tão altos quanto 7-15%. Rebaudiosídeo D está tipicamente presente em níveis de 2% ou menos, e Rebaudiosídeo F está tipicamente presente em composições em 3.5% ou menos dos glicosídeos de esteviol total. Mesmo pequenas quantidades dos menores glicosídeos de esteviol são relatadas por afetar o perfil de sabor de um extrato de estévia. Além disso, acredita-se que alguns dos contaminantes da planta de estévia, mesmo em concentrações muito baixas, também podem fornecer sabores desagradáveis a alguns dos extratos de plantas comercialmente disponíveis.
[0064] Este documento está baseado na descoberta de que hospedeiros recombinantes, tais como células vegetais, plantas ou microrganismos podem ser desenvolvidos os quais expressam polipeptídeos úteis para a biossíntese de esteviol. Além disso, tais hospedeiros podem expressar uridina 5'-difosfo (UDP) glicosil transferases adequadas para a produção de glicosídeos de esteviol, tais como rubusosídeo e rebaudiosídeo A. Microrganismos recombinantes são hospedeiros particularmente úteis. A expressão destes polipeptídeos biossintéticos em vários chassis microbianos permite que esteviol e seus glicosídeos sejam produzidos de um modo consistente e reprodutível a partir de energia e fontes de carbono, tais como açúcares, glicerol, CO2, H2 e luz solar. A proporção de cada glicosídeo esteviol produzido por um hospedeiro recombinante pode ser adaptada pela incorporação de enzimas biossintéticas pré-selecionadas nos hospedeiros e expressão destas em níveis adequados para produzir uma composição adoçante com um perfil de sabor consistente. Além disso, as concentrações de glicosídeos de esteviol produzidas por hospedeiros recombinantes deverão ser maiores do que os níveis de glicosídeos de esteviol produzidos na planta de estévia, o que melhora a eficiência de purificação a jusante. Tais composições adoçantes contêm pouco ou nenhum contaminante à base de plantas em relação à quantidade de contaminantes presente em extratos de estévia.
[0065] Pelo menos um dos genes é um gene recombinante, o(s) gene(s) recombinante(s) particular(es) dependendo da espécie ou cepa selecionada para uso. Genes ou módulos biossintéticos adicionais podem ser incluídos a fim de aumentar o rendimento de esteviol e glicosídeo, melhorar a eficiência com que as fontes de energia e carbono são convertidas em esteviol e seus glicosídeos e/ou melhorar a produtividade a partir da cultura celular ou planta. Tais módulos biossintéticos adicionais incluem genes envolvidos na síntese de precursores de terpenóides, isopentenil difosfato e dimetilalil difosfato. Módulos biossintéticos adicionais incluem genes de terpeno sintase e de terpeno ciclase, tais como genes que codificam geranilgeranil difosfato sintase e copalil difosfato sintase; esses genes podem ser genes endógenos ou genes recombinantes.
[0066] I. Polipeptídeos de Biossíntese de Esteviol e Glicosídeo de Esteviol
[0067] A. Polipeptídeos de Biossíntese de Esteviol
[0068] Estruturas químicas para vários dos compostos encontrados em extratos de estévia são mostrados na Figura 3, incluindo o diterpeno esteviol e vários glicosídeos de esteviol. Os números de CAS são mostrados na Tabela A abaixo. Ver também, Steviol Glycosides Chemical e Technical Assessment 69th JECFA, preparado por Harriet Wallin, Food Agric. Org. (2007).
[0069] Tabela A.
Figure img0001
[0070] Foi descoberto que a expressão de determinados genes em um hospedeiro, tal como um microrganismo, confere a capacidade de sintetizar esteviol neste hospedeiro. Como discutido em mais detalhes abaixo, um ou mais de tais genes pode estar presente naturalmente em um hospedeiro. Tipicamente, no entanto, um ou mais de tais genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro que não os possui naturalmente.
[0071] O caminho bioquímico para produzir esteviol envolve a formação de geranilgeranil difosfato, ciclização para (-) copalil difosfato, seguida por oxidação e hidroxilação para formar esteviol. Ver FIGURA 1. Desta forma, a conversão de geranilgeranil difosfato para esteviol em um microrganismo recombinante envolve a expressão de um gene que codifica uma caureno sintase (KS), um gene que codifica uma caureno oxidase (KO), e um gene que codifica uma esteviol sintetase (KAH). Esteviol sintetase é também conhecida como 13-hidroxilase de ácido caurenóico.
[0072] Polipeptídeos KS adequados são conhecidos. Por exemplo, enzimas KS adequadas incluem aquelas produzidas por Stevia rebaudiana, Zea mays e Populus trichocarpa. Ver, SEQ ID NOs: 132-135. Sequências de nucleotídeo que codificam estes polipeptídeos são descritas em mais detalhes abaixo. Ver, por exemplo, Tabela 3 e SEQ ID NOs: 40-47.
[0073] Polipeptídeos KO adequados são conhecidos. Por exemplo, enzimas KO adequadas incluem aquelas produzidas por Stevia rebaudiana, Arabidopsis thaliana, Gibberella fujikoroi e Trametes versicolor. Ver, SEQ ID NOs: 138-141. Sequências de nucleotídeo que codificam estes polipeptídeos são descritas em mais detalhes abaixo. Ver, por exemplo, Tabela 5 e SEQ ID NOs: 52-59.
[0074] Polipeptídeos KAH adequados são conhecidos. Por exemplo, enzimas KAH adequadas incluem aquelas produzidas por Stevia rebaudiana, Arabidopsis thaliana, Vitis vinifera e Medicago trunculata. Ver, por exemplo, SEQ ID NOs: 142146; Publicação de Patente dos Estados Unidos N°. 2008-0271205; Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 2008-0064063 e Genbank Accession No. gi 189098312. A esteviol sintetase a partir de Arabidopsis thaliana é classificada como CYP714A2. Sequências de nucleotídeo que codificam estes polipeptídeos são descritas em mais detalhes abaixo. Ver, por exemplo, Tabela 6 e SEQ ID NOs: 60-69.
[0075] Em algumas modalidades, um microrganismo recombinante contém um gene recombinante que codifica um polipeptídeo KO e/ou KAH. Tais microrganismos também tipicamente contêm um gene recombinante que codifica um polipeptídeo de citocromo P450 redutase (CPR), uma vez que certas combinações de polipeptídeos KO e/ou KAH requerem a expressão de um polipeptídeo CPR exógeno. Em particular, a atividade de um polipeptídeo KO e/ou KAH de origem vegetal pode ser significativamente elevada pela inclusão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo CPR exógeno. Polipeptídeos CPR adequados são conhecidos. Por exemplo, enzimas CPR adequadas incluem aquelas produzidas por Stevia rebaudiana, Arabidopsis thaliana, e Giberella fujikuroi. Ver, por exemplo, SEQ ID NOs: 147-149. Sequências de nucleotídeo que codificam estes polipeptídeos são descritas em mais detalhes abaixo. Ver, por exemplo, Tabela 7 e SEQ ID NOs: 70-75.
[0076] A expressão em um microrganismo recombinante destes genes resulta na conversão de geranilgeranil difosfato em esteviol.
[0077] B. Polipeptídeos de Biossíntese de Glicosídeo de Esteviol
[0078] Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante aqui descrito pode converter esteviol em um glicosídeo de esteviol. Tal hospedeiro (por exemplo, microrganismo) contém genes que codificam um ou mais UDP Glicosil Transferases, também conhecidas como UGTs. UGTs transferem uma unidade de monossacarídeo a partir de um açúcar de nucleotídeo ativado para uma porção de aceptor, neste caso, uma porção de -OH ou -COOH em esteviol ou derivado de esteviol. UGTs foram classificadas em famílias e subfamílias com base na homologia de sequência. Li et al. J. Biol. Chem. 276:4338-4343 (2001).
[0079] B. 1 Polipeptídeos de Biossíntese de Rubusosídeo
[0080] A biossíntese de rubusosídeo envolve glicosilação do 13-OH e 19- COOH de esteviol. Ver FIGURA 2A. Foi descoberto que a conversão de esteviol em rubusosídeo em um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, pode ser acompanhada pela expressão de gene(s) que codifica UGTs 85C2 e 74G1, que transferem uma unidade de glicose para o 13-OH ou 19-COOH, respectivamente, de esteviol.
[0081] Desta forma, um UGT85C2 adequado funciona como uma uridina 5’- difosfo glicosil: esteviol 13-OH transferase, e uma uridina 5’-difosfo glicosil: esteviol- 19-O-glicosídeo 13-OH transferase. Polipeptídeos UGT85C2 funcionais também podem catalisar reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que não esteviol e esteviol-19-O-glicosídeo.
[0082] Um polipeptídeo UGT74G1 adequado funciona como uma uridina 5’- difosfo glicosil: esteviol 19-COOH transferase e uma uridina 5’-difosfo glicosil: esteviol- 13-O-glicosídeo 19-COOH transferase. Polipeptídeos UGT74G1 funcionais também podem catalisar reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que não esteviol e esteviol-13-O-glicosídeo, ou que transferem porções de açúcar a partir de doadores que não uridina difosfato glicose.
[0083] Um microrganismo recombinante que expressa um UGT74G1 funcional e um UGT85C2 funcional pode produzir rubusosídeo e ambos monosídeos de esteviol (isto é, esteviol 13-O-monoglicosídeo e esteviol 19-O-monoglicosídeo) quando alimentado esteviol no meio. Um ou mais de tais genes pode estar presente naturalmente no hospedeiro. Tipicamente, no entanto, tais genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro (por exemplo, microrganismo) que não os possui naturalmente.
[0084] Como usado aqui, o termo hospedeiro recombinante destina-se a se referir a um hospedeiro, o genoma do qual foi aumentado por pelo menos uma sequência de DNA incorporada. Tais sequências de DNA incluem, mas não são limitadas a, genes que não estão naturalmente presentes, sequências de DNA que não estão normalmente transcritas no RNA ou traduzidas em uma proteína (“expressa”), e outros genes ou sequências de DNA que alguém deseja introduzir no hospedeiro não-recombinante. Será apreciado que tipicamente o genoma de um hospedeiro recombinante aqui descrito é aumentado através da introdução estável de um ou mais genes recombinantes. Geralmente, o DNA introduzido não é originalmente residente no hospedeiro que é o receptor do DNA, mas está dentro do escopo da invenção isolar um segmento de DNA a partir de um dado hospedeiro, e posteriormente introduzir uma ou mais de cópias adicionais daquele DNA no mesmo hospedeiro, por exemplo, para aumentar a produção do produto de um gene ou alterar o padrão de expressão de um gene. Em alguns casos, o DNA introduzido irá modificar ou até mesmo substituir um gene endógeno ou uma sequência de DNA por, por exemplo, recombinação homóloga ou mutagênese direcionada a sítio. Hospedeiros recombinantes adequados incluem microrganismos, células vegetais, e plantas.
[0085] O termo “gene recombinante” se refere a um gene ou sequência de DNA que é introduzido em um hospedeiro receptor, independentemente de se o mesmo ou um gene ou sequência de DNA semelhante pode já estar presente em tal hospedeiro. "Introduzido” ou "aumentado", neste contexto, é conhecido na técnica por significar introduzido ou aumentado pela mão de homem. Desta forma, um gene recombinante pode ser uma sequência de DNA de outra espécie, ou pode ser uma sequência de DNA que se originou a partir de ou está presente na mesma espécie, mas foi incorporada em um hospedeiro por métodos de engenharia genética para formar um hospedeiro recombinante. Será apreciado que um gene recombinante que é introduzido em um hospedeiro pode ser idêntico a uma sequência de DNA que está normalmente presente no hospedeiro a ser transformado e é introduzida para fornecer uma ou mais cópias adicionais do DNA para, assim, permitir a superexpressão ou expressão modificada do produto de gene daquele DNA.
[0086] Polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 adequados incluem aqueles produzidos por Stevia rebaudiana. Genes que codificam polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 funcionais a partir de Stevia são reportados em Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005). Sequências de aminoácido de polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 de S. rebaudiana são apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 e 3, respectivamente. Sequências de nucleotídeo que codificam UGT74G1 e UGT85C2 que foram otimizadas para expressão em leveduras são apresentadas nas SEQ ID NOs: 2 e 4, respectivamente. Ver também as variantes UGT85C2 e UGT74G1 descritas nos Exemplos 17 e 18, respectivamente.
[0087] Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante é um microrganismo. O microrganismo recombinante pode ser cultivado em meio contendo esteviol a fim de produzir rubusosídeo. Em outras modalidades, no entanto, o microrganismo recombinante expressa um ou mais genes recombinantes envolvidos na biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Desta forma, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH além de um gene UGT74G1 e UGT85C2 é capaz de produzir ambos monosídeos de esteviol e rubusosídeo sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura.
[0088] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante adicionalmente expressa um gene recombinante que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase (GGPPS). Polipeptídeos GGPPS adequados são conhecidos. Por exemplo, enzimas GGPPS adequadas incluem aquelas produzidas por Stevia rebaudiana, Gibberella fujikuroi, Mus musculus, Thalassiosira pseudonana, Streptomyces clavuligerus, Sulfulobus acidocaldarius, Synechococcus sp. e Arabidopsis thaliana. Ver, SEQ ID NOs:121-128. Sequências de nucleotídeo que codificam estes polipeptídeos são descritas em mais detalhes abaixo. Ver Tabela 1 e SEQ ID NOs:18-33. Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante adicionalmente expressa genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno ou produção de precursores de terpenóide, por exemplo, genes no caminho de metileritritol 4-fosfato (MEP) ou genes no caminho de mevalonato (MEV) discutidos abaixo.
[0089] B. 2 Polipeptídeos de Biossíntese de Rebaudiosídeo A
[0090] A biossíntese de rebaudiosídeo A envolve glicosilação de aglicona esteviol. Especificamente, rebaudiosídeo A pode ser formado por glicosilação do 13- OH de esteviol que forma o 13-O-esteviolmonosídeo, glicosilação do C-2’ do 13-O- glicose de esteviolmonosídeo que forma esteviol-1,2-biosídeo, glicosilação do C-19 carboxil de esteviol-1,2-biosídeo que forma esteviosídeo, e glicosilação do C-3’ do C- 13-O-glicose de esteviosídeo. A ordem em que cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Ver FIGURA 2A.
[0091] Foi descoberto que a conversão de esteviol em rebaudiosídeo A em um hospedeiro recombinante pode ser acompanhada pela expressão do gene(s) que codifica os seguinte UGTs funcionais: 74G1, 85C2, 76G1 e 91D2. Desta forma, um microrganismo recombinante que expressa estes quatro UGTs pode produzir rebaudiosídeo A quando alimentado esteviol no meio. Tipicamente, um ou mais destes genes são genes recombinantes que foram transformados em um microrganismo que não os possui naturalmente. Foi também descoberto que os UGTs aqui designados como SM12UGT podem ser substituídos por UGT91D2.
[0092] Polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 adequados incluem aqueles discutidos acima. Um UGT76G1 adequado adiciona uma porção de glicose ao C-3’ do C-13-O-glicose da molécula de aceptor, um esteviol 1,2 glicosídeo. Desta forma, UGT76G1 funciona, por exemplo, como uma uridina 5’-difosfo glicosil: esteviol 13-O- 1,2 glicosídeo C-3’ glicosil transferase e uma uridina 5’-difosfo glicosil: esteviol-19-O- glicose, 13-O-1,2 biosídeo C-3’ glicosil transferase. Polipeptídeos UGT76G1 funcionais podem também catalisar reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que contêm açúcares que não glicose, por exemplo, esteviol ramnosídeos e esteviol xilosídeos. Ver, FIGURAS 2A, 2B, 2C e 2D. Polipeptídeos UGT76G1 adequados incluem aqueles produzidos por S. rebaudiana e reportados em Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005). A sequência de aminoácido de um polipeptídeo UGT76G1 de S. rebaudiana está apresentada na SEQ ID NO: 7. A sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo UGT76G1 da SEQ ID NO: 7 foi otimizada para expressão em levedura e é apresentada na SEQ ID NO: 8. Ver também as variantes UGT76G1 apresentadas no Exemplo 18.
[0093] Um polipeptídeo UGT91D2 adequado funciona como uma uridina 5’- difosfo glicosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase (também referida como uma esteviol-13-monoglicosídeo 1,2-glicosilase), transferindo uma porção de glicose para o C-2’ do 13-O-glicose da molécula de aceptor, esteviol-13-O-glicosídeo. Tipicamente, um polipeptídeo UGT91D2 adequado também funciona como a uridina 5’-difosfo glicosil: rubusosídeo transferase transferindo uma porção de glicose para o C-2’ do 13-O-glicose da molécula de aceptor, rubusosídeo.
[0094] Polipeptídeos UGT91D2 funcionais podem também catalisar reações que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que não esteviol-13-O-glicosídeo e rubusosídeo, por exemplo, polipeptídeos UGT91D2 funcionais podem utilizar esteviosídeo como um substrato, transferindo uma porção de glicose para o C-2’ do resíduo de 19-O-glicose para produzir Rebaudiosídeo E. Polipeptídeos UGT91D2 funcionais podem também utilizar Rebaudiosídeo A como um substrato, transferindo uma porção de glicose para o C-2’ do resíduo de 19-O-glicose para produzir Rebaudiosídeo D. No entanto, um polipeptídeo UGT91D2 funcional tipicamente não transfere uma porção de glicose para compostos de esteviol tendo uma 1,3-glicose ligada na posição C-13, isto é, a transferência de uma porção de glicose para esteviol 1,3-biosídeo e 1,3-esteviosídeo não ocorre.
[0095] Polipeptídeos UGT91D2 funcionais podem transferir porções de açúcar a partir de doadores que não uridina difosfato glicose. Por exemplo, um polipeptídeo UGT91D2 funcional pode atuar como uma uridina 5’-difosfo D-xilosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção de xilose para o C-2’ do 13-O-glicose da molécula de aceptor, esteviol-13-O-glicosídeo. Como outro exemplo, um polipeptídeo UGT91D2 funcional pode atuar como uma uridina 5’-difosfo L-ramnosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção de ramnose para o C-2’ do 13-O-glicose da molécula de aceptor, esteviol-13-O-glicosídeo.
[0096] Polipeptídeos UGT91D2 funcionais adequados incluem aqueles descritos aqui, por exemplo, os polipeptídeos designados UGT91D2e e UGT91D2m. A sequência de aminoácido de um polipeptídeo UGT91D2e exemplar a partir de Stevia rebaudiana é apresentada na SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 6 é uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5 que foi otimizada para expressão de códon em levedura. A sequência de nucleotídeo de S. rebaudiana que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5 é apresentada na SEQ ID NO: 9. As sequências de aminoácido de polipeptídeos UGT91D2m exemplares a partir de S. rebaudiana são apresentadas nas SEQ ID NOs: 10 e 12, e são codificadas pelas sequências de ácido nucleico apresentadas nas SEQ ID NOs: 11 e 13, respectivamente. Ver também as variantes UGT91D2 do Exemplo 16, por exemplo, uma variante contendo uma substituição nos resíduos de aminoácido 206, 207, e 343.
[0097] Como indicado acima, UGTs aqui designados como SM12UGT podem ser substituídos por UGT91D2. Polipeptídeos SM12UGT funcionais adequados incluem aqueles produzidos por Ipomoea purpurea (Japanese morning glory) e descritos em Morita et al. Plant J. 42, 353-363 (2005). A sequência de aminoácido que codifica o polipeptídeo IP3GGT de I. purpurea é apresentada na SEQ ID NO: 76. SEQ ID NO: 77 é uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 76 que foi otimizada para expressão de códon em levedura. Outro polipeptídeo SM12UGT adequado é um polipeptídeo Bp94B1 tendo uma mutação R25S. Ver Osmani et al. Plant Phys. 148: 1295-1308 (2008) e Sawada et al. J. Biol. Chem. 280:899-906 (2005). A sequência de aminoácido que codifica o polipeptídeo UGT94B1 de Bellis perennis (red daisy) é apresentada na SEQ ID NO: 78. SEQ ID NO: 79 é a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 78 que foi otimizada para expressão de códon em levedura.
[0098] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é cultivado em meio contendo esteviol-13-O-glicosídeo ou esteviol-19-O-glicosídeo a fim de produzir rebaudiosídeo A. Em tais modalidades, o microrganismo contém e expressa genes que codificam um UGT91D2 funcional, um UGT74G1 funcional e um UGT76G1 funcional, e é capaz de produzir rebaudiosídeo A quando é alimentado esteviol, um ou ambos dos monosídeos de esteviol, ou rubusosídeo no meio de cultura.
[0099] Em outras modalidades, o microrganismo recombinante é cultivado em meio contendo rubusosídeo a fim de produzir rebaudiosídeo A. Em tais modalidades, o microrganismo contém e expressa genes que codificam um UGT91D2 funcional e um UGT76G1 funcional, e é capaz de produzir rebaudiosídeo A quando é alimentado rubusosídeo no meio de cultura.
[00100] Em outras modalidades o microrganismo recombinante expressa um ou mais genes envolvidos na biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Desta forma, por exemplo, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, além de um gene UGT74G1, UGT85C2, UGT91D2 e um gene UGT76G1, é capaz de produzir rebaudiosídeo A sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura.
[00101] Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante adicionalmente contém e expressa um gene GGPPS recombinante a fim de prover níveis elevados do diterpeno precursor geranilgeranil difosfato, para fluxo aumentado através do caminho biossintético do rebaudiosídeo A. Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante adicionalmente contém e expressa genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno ou produção de precursores de terpenóide, por exemplo, genes no caminho MEP ou MEV discutido abaixo.
[00102] B. 3 Polipeptídeos de Biossíntese de Dulcosídeo A e Rebaudiosídeo C
[00103] A biossíntese de rebaudiosídeo C e/ou dulcosídeo A envolve glicosilação e ramnosilação do aglicona esteviol. Especificamente, dulcosídeo A pode ser formado por glicosilação do 13-OH de esteviol que forma esteviol-13-O-glicosídeo, ramnosilação do C-2’ do 13-O-glicose de esteviol-13-O-glicosídeo que forma o 1,2 ramnobiosídeo, e glicosilação do C-19 carboxil do 1,2 ramnobiosídeo. Rebaudiosídeo C pode ser formado por glicosilação do C-3’ do C-13-O-glicose de dulcosídeo A. A ordem em que cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Ver FIGURA 2B.
[00104] Foi descoberto que a conversão de esteviol em dulcosídeo A em um hospedeiro recombinante pode ser acompanhada pela expressão de gene(s) que codifica os seguintes UGTs funcionais: 85C2, 91D2, e 74G1. Desta forma, um microrganismo recombinante expressando estes três UGTs e uma ramnose sintetase pode produzir dulcosídeo A quando alimentado esteviol no meio. Alternativamente, um microrganismo recombinante expressando dois UGTs, 91D2 e 74G1, e ramnose sintetase podem produzir dulcosídeo A quando alimentado o monosídeo, esteviol-13- O-glicosídeo ou esteviol-19-O-glicosídeo, no meio. Da mesma forma, a conversão de esteviol em rebaudiosídeo C in um microrganismo recombinante pode ser acompanhada pela expressão de gene(s) que codifica UGTs 85C2, 91D2, 74G1, e 76G1 e ramnose sintetase quando alimentado esteviol, pela expressão de genes que codificam UGTs 91D2, 74G1 e 76G1, e ramnose sintetase quando alimentado esteviol-13-O-glicosídeo, pela expressão de genes que codificam UGTs 85C2, 91D2 e 76G1, e ramnose sintetase quando alimentado esteviol-19-O-glicosídeo, ou pela expressão de genes que codificam UGTs 91D2 e 76G1 e rhamonse sintetase quando alimentado rubusosídeo. Tipicamente, um ou mais destes genes são genes recombinantes que foram transformados em um microrganismo que não os possui naturalmente.
[00105] Polipeptídeos UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 e UGT85C2 adequados incluem os polipeptídeos UGT funcionais discutidos aqui. Ramnose sintetase provê quantidades elevadas do doador de UDP-ramnose para ramnosilação do aceptor de composto de esteviol. Ramnose sintetases adequadas incluem aquelas produzidas por Arabidopsis thaliana, tais como o produto do gene RHM2 de A. thaliana.
[00106] Em algumas modalidades, um polipeptídeo UGT79B3 é substituído por um polipeptídeo UGT91D2. Polipeptídeos UGT79B3 adequados incluem aqueles produzidos por Arabidopsis thaliana, que são capazes de ramnosilação de esteviol 13-O-monosídeo in vitro. UGT79B3 de A. thaliana pode ramnosilar compostos glicosilados para formar 1,2-ramnosídeos. A sequência de aminoácido de um UGT79B3 de Arabidopsis thaliana é apresentada na SEQ ID NO: 150. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 150 é apresentada na SEQ ID NO: 151.
[00107] Em algumas modalidades, rebaudiosídeo C pode ser produzido utilizando métodos in vitro ao fornecer o UDP-açúcar ou um sistema livre de célula apropriado para regeneração de UDP-açúcares. Ver, por exemplo, “An integrated cell- free metabolic platform for protein production e synthetic biology” by Jewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJ e Swartz JR in Molecular Systems Biology, 4, article 220 (2008). As reações podem ser realizadas juntas ou por etapas. Por exemplo, rebaudiosídeo C pode ser produzido a partir de rubusosídeo com a adição de quantidades estequiométricas de UDP-ramnose e UGT91d2e, seguida pela adição de UGT76G1 e um fornecimento estequiométrico ou em excesso de UDP-glicose. Em algumas modalidades, fosfatases são usadas para remover produtos secundários e melhorar os rendimentos das reações.
[00108] Em outras modalidades, o hospedeiro recombinante expressa um ou mais genes envolvidos na biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Desta forma, por exemplo, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, além de um gene UGT85C2, UGT74G1, UGT91D2 e um gene UGT76G1, é capaz de produzir rebaudiosídeo C sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura. Além disso, o hospedeiro recombinante tipicamente expressa um gene recombinante ou endógeno que codifica uma ramnose sintetase. Tal gene é útil para prover quantidades elevadas do doador de UDP-ramnose para ramnosilação do aceptor de composto de esteviol. Ramnose sintetases adequadas incluem aquelas produzidas por Arabidopsis thaliana, tais como o produto do gene RHM2 de A. thaliana.
[00109] Uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que através da modulação dos níveis de expressão relativa de diferentes genes UGT, bem como modulação da disponibilidade de UDP-ramnose, um hospedeiro recombinante pode ser adaptado para especificamente produzir produtos de esteviol e glicosídeo de esteviol em uma proporção desejada. A regulação transcricional de genes de biossíntese de esteviol, e genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol pode ser alcançada por uma combinação de ativação transcricional e repressão utilizando técnicas conhecidas daqueles versados na técnica. Para reações in vitro, uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que a adição de diferentes níveis de enzimas UGT em combinação ou sob condições que impactam as atividades relativas dos diferentes UGTS em combinação irá direcionar a síntese no sentido de uma proporção desejada de cada glicosídeo de esteviol.
[00110] Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém e expressa um gene GGPPS recombinante a fim de prover níveis elevados do precursor de diterpeno geranilgeranil difosfato, para fluxo aumentado através do caminho biossintético do rebaudiosídeo A. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém um constructo genético para silenciar ou reduzir a expressão de caminhos não-esteviol consumindo geranilgeranil difosfato, ácido ent-caurenóico ou farnesil pirofosfato, proporcionando assim fluxo aumentado através dos caminhos biossintéticos de esteviol e glicosídeos de esteviol. Por exemplo, o fluxo para caminhos de produção de esterol, tais como ergosterol, podem ser reduzidos por sub-regulação do Gene ERG9. Em células que produzem giberelinas, síntese de giberelina pode ser sub-regulada para aumentar o fluxo de ácido ent-caurenóico para esteviol. Em organismos produtores de carotenóides, o fluxo para esteviol pode ser aumentado por sub-regulação de um ou mais genes biossintéticos de carotenóides.
[00111] Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém e expressa genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno ou produção de precursores de terpenóide, por exemplo, genes no caminho MEP ou MEV discutidos abaixo.
[00112] Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol que possuem mais de pelo menos 15% de rebaudiosídeo C dos glicosídeos de esteviol total, por exemplo, pelo menos 20% de rebaudiosídeo C, 30-40% de rebaudiosídeo C, 40-50% de rebaudiosídeo C, 50-60% de rebaudiosídeo C, 60-70% de rebaudiosídeo C, 70-80% de rebaudiosídeo C, 80-90% de rebaudiosídeo C. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol que possuem pelo menos 90% de rebaudiosídeo C, por exemplo, 90-99% de rebaudiosídeo C. Outros glicosídeos de esteviol presentes podem incluir aqueles descritos nas Figuras 2 A e B, tais como monosídeos de esteviol, glucobiosídeos de esteviol, ramnobiosídeos de esteviol, rebaudiosídeo A, e Dulcosídeo A. Em algumas modalidades, a composição enriquecida com rebaudiosídeo C produzida pelo hospedeiro pode ser adicionalmente purificada e o rebaudiosídeo C ou Dulcosídeo A assim purificado pode então ser misturado com outros glicosídeos de esteviol, sabores ou adoçantes para obter uma composição adoçante ou sistema de sabor desejado. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo C produzida por um microrganismo recombinante pode ser combinada com uma composição enriquecida com rebaudiosídeo A, F ou D produzida por um microrganismo recombinante diferente, com rebaudiosídeo A, F ou D purificado a partir de um extrato de estévia, ou com rebaudiosídeo A, F ou D produzido in vitro.
[00113] B. 4 Polipeptídeos de Biossíntese de Rebaudiosídeo E e Rebaudiosídeo D
[00114] A biossíntese de rebaudiosídeo E e/ou rebaudiosídeo D envolve glicosilação do aglicona esteviol. Especificamente, rebaudiosídeo E pode ser formado por glicosilação do 13-OH de esteviol que forma esteviol-13-O-glicosídeo, glicosilação do C-2’ do 13-O-glicose de esteviol-13-O-glicosídeo que forma o esteviol-1,2-biosídeo, glicosilação do C-19 carboxil do 1,2-biosídeo para formar 1,2-esteviosídeo, e glicosilação do C-2’ do 19-O-glicose do 1,2-esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E. Rebaudiosídeo D pode ser formado por glicosilação do C-3’ do C-13-O-glicose de rebaudiosídeo E. A ordem em que cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Por exemplo, a glicosilação do C-2’ do 19-O-glicose pode ser a última etapa no caminho, em que Rebaudiosídeo A é um intermediário no caminho. Ver FIGURA 2C.
[00115] Foi descoberto que a conversão de esteviol em rebaudiosídeo D em um hospedeiro recombinante pode ser acompanhada pela expressão de gene(s) que codifica os seguintes UGTs funcionais: 85C2, 91D2, 74G1 e 76G1. Desta forma, um microrganismo recombinante que expressa estes quatro UGTs pode produzir rebaudiosídeo D quando alimentado esteviol no meio. Alternativamente, um microrganismo recombinante expressando dois UGTs funcionais, 91D2 e 76G1, pode produzir rebaudiosídeo D quando alimentado rubusosídeo ou 1,2-esteviosídeo no meio. Como outra alternativa, um microrganismo recombinante expressando três UGTs funcionais, 74G1, 91D2 e 76G1, pode produzir rebaudiosídeo D quando alimentado o monosídeo, esteviol-13-O-glicosídeo, no meio. Da mesma forma, a conversão de esteviol-19-O-glicosídeo em rebaudiosídeo D em um microrganismo recombinante pode ser acompanhada pela expressão de genes que codificam UGTs 85C2, 91D2 e 76G1 quando alimentado esteviol-19-O-glicosídeo. Tipicamente, um ou mais destes genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro que não os possui naturalmente.
[00116] Polipeptídeos UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 e UGT85C2 adequados incluem os polipeptídeos UGT funcionais discutidos aqui. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UGT79B3 é substituído por um UGT91, como discutido acima.
[00117] Em algumas modalidades, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo E pode ser produzido utilizando métodos in vitro ao fornecer o UDP-açúcar ou um sistema livre de célula apropriado para regeneração de UDP-açúcares. Ver, por exemplo, Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008). As conversões que requerem múltiplas reações podem ser realizadas juntas ou por etapas. Rebaudiosídeo D pode ser produzido a partir de Rebaudiosídeo A que é extrato enriquecido comercialmente disponível ou produzido através de biossíntese, com a adição de quantidades estequiométricas ou em excesso de UDP-glicose e UGT91D2e. Em algumas modalidades, fosfatases são usadas para remover produtos secundários e melhorar os rendimentos das reações.
[00118] Uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que através da modulação dos níveis de expressão relativa de diferentes genes UGT, um hospedeiro recombinante pode ser adaptado para especificamente produzir produtos de esteviol e glicosídeo de esteviol em uma proporção desejada. A regulação transcricional de genes de biossíntese de esteviol e genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol pode ser alcançada por uma combinação de ativação transcricional e repressão utilizando técnicas conhecidas daqueles versados na técnica. Para reações in vitro, uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que a adição de diferentes níveis de enzimas UGT em combinação ou sob condições que impactam as atividades relativas dos diferentes UGTS em combinação irá direcionar a síntese no sentido de uma proporção desejada de cada glicosídeo de esteviol. Uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que uma proporção maior de rebaudiosídeo D ou E ou conversão mais eficiente em rebaudiosídeo D ou E pode ser obtida com uma enzima de diglicosilação que possui uma atividade superior para a reação de 19-O-glicosídeo em comparação com a reação de 13-O-glicosídeo (substratos rebaudiosídeo A e esteviosídeo).
[00119] Em outras modalidades, o hospedeiro recombinante expressa um ou mais genes envolvidos na biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Desta forma, por exemplo, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, além de um gene UGT85C2, UGT74G1, UGT91D2 e um gene UGT76G1, é capaz de produzir rebaudiosídeos E e D sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura.
[00120] Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém e expressa um gene GGPPS recombinante a fim de prover níveis elevados do precursor de diterpeno geranilgeranil difosfato, para fluxo aumentado através do caminho biossintético de esteviol. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém um constructo genético para silenciar a expressão de caminhos não-esteviol consumindo geranilgeranil difosfato, ácido ent-caurenóico ou farnesil pirofosfato, proporcionando assim fluxo aumentado através dos caminhos biossintéticos de esteviol e glicosídeos de esteviol. Por exemplo, o fluxo para caminhos de produção de esterol, tal como ergosterol, pode ser reduzido por sub-regulação do gene ERG9. Em células que produzem giberelinas, síntese de giberelina pode ser sub-regulada para aumentar o fluxo de ácido ent- caurenóico para esteviol. Em organismos produtores de carotenóides, o fluxo para esteviol pode ser aumentado por sub-regulação de um ou mais genes biossintéticos de carotenóides. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém e expressa genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno ou produção de precursores de terpenóide, por exemplo, genes nos caminhos MEP ou MEV discutidos abaixo.
[00121] Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas com rebaudiosídeo D que possuem mais de pelo menos 3% de rebaudiosídeo D em peso de glicosídeos de esteviol total, por exemplo, pelo menos 4% de rebaudiosídeo D, pelo menos 5% de rebaudiosídeo D, 10-20% de rebaudiosídeo D, 20-30% de rebaudiosídeo D, 30-40% de rebaudiosídeo D, 40-50% de rebaudiosídeo D, 50-60% de rebaudiosídeo D, 60-70% de rebaudiosídeo D, 70-80% de rebaudiosídeo D. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol que possuem pelo menos 90% de rebaudiosídeo D, por exemplo, 90-99% de rebaudiosídeo D. Outros glicosídeos de esteviol presentes podem incluir aqueles descritos na Figura 2C, tais como monosídeos de esteviol, glucobiosídeos de esteviol, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo E e esteviosídeo. Em algumas modalidades, a composição enriquecida com rebaudiosídeo D produzida pelo hospedeiro (por exemplo, microrganismo) pode ser adicionalmente purificada e o rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo E assim purificado pode ser, então, misturado com outros glicosídeos de esteviol, sabores, ou adoçantes para obter uma composição adoçante ou sistema de sabor desejado. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo D produzida por um hospedeiro recombinante pode ser combinada com uma composição enriquecida com rebaudiosídeo A, C, ou F produzida por um hospedeiro recombinante diferente, com rebaudiosídeo A, F, ou C purificado a partir de um extrato de estévia, ou com rebaudiosídeo A, F, ou C produzido in vitro.
[00122] B. 5 Polipeptídeos de Biossíntese de Rebaudiosídeo F
[00123] A biossíntese de rebaudiosídeo F envolve glicosilação e xilosilação do aglicona esteviol. Especificamente, rebaudiosídeo F pode ser formado por glicosilação do 13-OH de esteviol que forma esteviol-13-O-glicosídeo, xilosilação do C-2’ do 13-O-glicose de esteviol-13-O-glicosídeo que forma esteviol-1,2-xilobiosídeo, glicosilação do C-19 carboxil do 1,2-xilobiosídeo para formar 1,2-estevioxilosídeo, e glicosilação do C-3’ do C-13-O-glicose de 1,2-estevioxilosídeo para formar rebaudiosídeo F. A ordem em que cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Ver FIGURA 2D.
[00124] Foi descoberto que a conversão de esteviol em rebaudiosídeo F em um hospedeiro recombinante pode ser acompanhada pela expressão de genes que codificam os seguinte UGTs funcionais: 85C2, 91D2, 74G1 e 76G1, junto com UDP- glicose desidrogenase e UDP-ácido glucurônico descarboxilase endógena ou recombinantemente expressa. Desta forma, um microrganismo recombinante que expressa estes quatro UGTs junto com UDP-glicose desidrogenase e UDP-ácido glucurônico descarboxilase endógena ou recombinantemente expressa pode produzir rebaudiosídeo F quando alimentado esteviol no meio. Alternativamente, um microrganismo recombinante expressando dois UGTs funcionais, 91D2 e 76G1, pode produzir rebaudiosídeo F quando alimentado rubusosídeo no meio. Como outra alternativa, um microrganismo recombinante expressando um UGT funcional 76G1 pode produzir rebaudiosídeo F quando alimentado 1,2 estevioramnosídeo. Como outra alternativa, um microrganismo recombinante expressando três UGTs funcionais, 74G1, 91D2 e 76G1, pode produzir rebaudiosídeo F quando alimentado o monosídeo, esteviol-13-O-glicosídeo, no meio. Da mesma forma, a conversão de esteviol-19-O- glicosídeo em rebaudiosídeo F em um microrganismo recombinante pode ser acompanhada pela expressão de genes que codificam UGTs 85C2, 91D2 e 76G1 quando alimentado esteviol-19-O-glicosídeo. Tipicamente, um ou mais destes genes são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro que não os possui naturalmente.
[00125] Polipeptídeos UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 e UGT85C2 adequados incluem os polipeptídeos UGT funcionais discutidos aqui. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UGT79B3 é substituído por um UGT91, como discutido acima. UDP-glicose desidrogenase e UDP-ácido glucurônico descarboxilase provêem quantidades elevadas do doador de UDP-xilose para xilosilação do aceptor de composto de esteviol. UDP-glicose desidrogenases e UDP-ácido glucurônico descarboxilases adequadas incluem aquelas produzidas por Arabidopsis thaliana ou Cryptococcus neoformans. Por exemplo, polipeptídeos de UDP-glicose desidrogenase e UDP-ácido glucurônico descarboxilases adequados podem ser codificados pelos gene UGD1 e gene UXS3 de A. thaliana, respectivamente. Ver, Oka e Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006).
[00126] Em algumas modalidades, rebaudiosídeo F pode ser produzido utilizando métodos in vitro ao fornecer o UDP-açúcar ou um sistema livre de célula apropriado para regeneração de UDP-açúcares. Ver, por exemplo, Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008). As reações podem ser realizadas juntas ou por etapas. Por exemplo, rebaudiosídeo F pode ser produzido a partir de rubusosídeo com a adição de quantidades estequiométricas de UDP-xilose e UGT91D2e, seguida pela adição de UGT76G1 e um fornecimento estequiométrico ou em excesso de UDP-glicose. Em algumas modalidades, fosfatases são usadas para remover produtos secundários e melhorar os rendimentos das reações.
[00127] Em outras modalidades, o hospedeiro recombinante expressa um ou mais genes envolvidos na biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Desta forma, por exemplo, um microrganismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, além de um gene UGT85C2, UGT74G1, UGT91D2 e um gene UGT76G1, é capaz de produzir rebaudiosídeo F sem a necessidade de incluir esteviol no meio de cultura. Além disso, o hospedeiro recombinante tipicamente expressa um gene recombinante ou endógeno que codifica uma UDP-glicose desidrogenase e uma UDP-ácido glucurônico descarboxilase. Tais genes são úteis para prover quantidades elevadas do doador de UDP-xilose para xilosilação do aceptor de composto de esteviol. UDP- glicose desidrogenases e UDP-ácido glucurônico descarboxilases adequadas incluem aquelas produzidas por Arabidopsis thaliana ou Cryptococcus neoformans. Por exemplo, polipeptídeos de UDP-glicose desidrogenase e UDP-ácido glucurônico descarboxilases adequados podem ser codificados pelos genes UGD1 e gene UXS3 de A. thaliana, respectivamente. Ver, Oka e Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006).
[00128] Uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que, através da modulação dos níveis de expressão relativa de diferentes genes UGT, bem como modulação da disponibilidade de UDP-xilose, um microrganismo recombinante pode ser adaptado para especificamente produzir produtos de esteviol e glicosídeo de esteviol em uma proporção desejada. A regulação transcricional de genes de biossíntese de esteviol pode ser alcançada por uma combinação de ativação transcricional e repressão utilizando técnicas conhecidas daqueles versados na técnica. Para reações in vitro, uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que a adição de diferentes níveis de enzimas UGT em combinação ou sob condições que impactam as atividades relativas dos diferentes UGTS em combinação irá direcionar a síntese no sentido de uma proporção desejada de cada glicosídeo de esteviol.
[00129] Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém e expressa um gene GGPPS recombinante a fim de prover níveis elevados do precursor de diterpeno geranilgeranil difosfato, para fluxo aumentado através do caminho biossintético de esteviol. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém um constructo genético para silenciar a expressão de caminhos não-esteviol consumindo geranilgeranil difosfato, ácido ent-caurenóico ou farnesil pirofosfato, proporcionando assim fluxo aumentado através dos caminhos biossintéticos de esteviol e glicosídeos de esteviol. Por exemplo, o fluxo para caminhos de produção de esterol, tal como ergosterol, pode ser reduzidos por sub-regulação do gene ERG9. Em células que produzem giberelinas, a síntese de giberelina pode ser sub-regulada para aumentar o fluxo de ácido ent- caurenóico para esteviol. Em organismos produtores de carotenóides, o fluxo para esteviol pode ser aumentado por sub-regulação de um ou mais genes biossintéticos de carotenóides. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante adicionalmente contém e expressa genes recombinantes envolvidos na biossíntese de diterpeno, por exemplo, genes no caminho MEP discutido abaixo.
[00130] Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas com rebaudiosídeo F que possuem mais de pelo menos 4% de rebaudiosídeo F em peso de glicosídeos de esteviol total, por exemplo, pelo menos 5% de rebaudiosídeo F, pelo menos 6% de rebaudiosídeo F, 10-20% de rebaudiosídeo F, 20-30% de rebaudiosídeo F, 30-40% de rebaudiosídeo F, 40-50% de rebaudiosídeo F, 50-60% de rebaudiosídeo F, 60-70% de rebaudiosídeo F, 70-80% de rebaudiosídeo F. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo, produz composições de glicosídeo de esteviol que possuem pelo menos 90% de rebaudiosídeo F, por exemplo, 90-99% de rebaudiosídeo F. Outros glicosídeos de esteviol presentes podem incluir aqueles descritos nas Figuras 2A e D, tais como monosídeos de esteviol, glucobiosídeos de esteviol, xilobiosídeos de esteviol, rebaudiosídeo A, estevioxilosídeo, rubusosídeo e esteviosídeo. Em algumas modalidades, a composição enriquecida com rebaudiosídeo F produzida pelo hospedeiro pode ser misturada com outros glicosídeos de esteviol, sabores, ou adoçantes para obter uma composição adoçante ou sistema de sabor desejado. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo F produzida por um microrganismo recombinante pode ser combinada com uma composição enriquecida com rebaudiosídeo A, C, ou D produzida por um microrganismo recombinante diferente, com rebaudiosídeo A, C, ou D purificado a partir de um extrato de estévia, ou com rebaudiosídeo A, C, ou D produzido in vitro.
[00131] C. Outros Polipeptídeos
[00132] Genes para polipeptídeos adicionais cuja expressão facilita a produção mais eficiente ou em larga escala de esteviol ou glicosídeo de esteviol podem também ser introduzidos em um hospedeiro recombinante. Por exemplo, um microrganismo recombinante, planta ou célula vegetal pode também conter um ou mais genes que codificam uma geranilgeranil difosfato sintase (GGPPS, também referida como GGDPS). Como outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma ramnose sintetase, ou um ou mais genes que codificam uma UDP-glicose desidrogenase e/ou uma UDP-ácido glucurônico descarboxilase. Como outro exemplo, um hospedeiro recombinante pode também conter um ou mais genes que codificam uma citocromo P450 redutase (CPR). A expressão de um CPR recombinante facilita a ciclagem de NADP+ para regenerar NADPH, que é utilizado como co-fator para biossíntese de terpenóide. Outros métodos podem ser usados para regenerar os níveis de NADHP. Em circunstâncias onde NADPH se torna limitante; cepas podem ser adicionalmente modificadas para incluir genes de transhidrogenase exógenos. Ver, por exemplo, Sauer et al., J. Biol. Chem. 279: 6613-6619 (2004). Outros métodos são conhecidos daqueles versados na técnica para reduzir ou de outra forma modificar a razão de NADH/NADPH, tal que o nível de co-fator desejado seja aumentado.
[00133] Como outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma ou mais enzimas no caminho MEP ou caminho de mevalonato Tais genes são úteis porque podem aumentar o fluxo de carbono no caminho da biossíntese de diterpeno, produzindo geranilgeranil difosfato a partir de isopentenil difosfato e dimetilalil difosfato gerado pelo caminho. O geranilgeranil difosfato assim produzido pode ser direcionado à biossíntese de esteviol e glicosídeo de esteviol devido à expressão de polipeptídeos de biossíntese de esteviol e polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol.
[00134] C. 1 Polipeptídeos de Biossíntese de MEP
[00135] Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante contém um ou mais genes que codificam enzimas envolvidas no caminho metileritritol 4-fosfato (MEP) para biossíntese de isoprenóide. Enzimas no caminho MEP incluem desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXS), D-1-desoxixilulose 5-fosfato redutoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D- eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS) e 1-hidróxi-2-metil- 2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR). Um ou mais genes DXS, genes DXR, genes CMS, genes CMK, genes MCS, genes HDS e/ou genes HDR podem ser incorporados em um microrganismo recombinante. Ver, Rodríguez-Concepción e Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002).
[00136] Genes adequados que codificam polipeptídeos DXS, DXR, CMS, CMK, MCS, HDS e/ou HDR incluem aqueles produzidos por E. coli, Arabidopsis thaliana e Synechococcus leopoliensis. Sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos DXR são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 7.335.815.
[00137] C. 2 Polipeptídeos de Biossíntese de Mevalonato
[00138] Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante contém um ou mais genes que codificam enzimas envolvidos no caminho de mevalonato para biossíntese de isoprenóide. Genes adequados para transformação em um hospedeiro codificam enzimas no caminho de mevalonato, tal como uma 3-hidróxi-3-metil-glutaril (HMG)-CoA redutase truncada (tHMG), e/ou um gene que codifica uma mevalonato quinase (MK), e/ou um gene que codifica uma fosfomevalonato quinase (PMK), e/ou um gene que codifica uma mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPPD). Desta forma, um ou mais genes de HMG-CoA redutase, genes MK, genes PMK, e/ou genes MPPD pode ser incorporado em um hospedeiro recombinante, tal como um microrganismo.
[00139] Genes adequados que codificam polipeptídeos de caminho de mevalonato são conhecidos. Por exemplo, polipeptídeos adequados incluem aqueles produzidos por E. coli, Paracoccus denitrificans, Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Kitasatospora griseola, Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Gallus gallus, Streptomyces sp. KO-3988, Nicotiana attenuata, Kitasatospora griseola, Hevea brasiliensis, Enterococcus faecium e Haematococcus pluvialis. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N°s. 7.183.089, 5.460.949, e 5.306.862.
[00140] D. Homólogos funcionais
[00141] Homólogos funcionais dos polipeptídeos descritos acima são também adequados para uso na produção de esteviol ou glicosídeos de esteviol em um hospedeiro recombinante. Um homólogo funcional é um polipeptídeo que possui similaridade de sequência a um polipeptídeo de referência, e que realiza uma ou mais da(s) função(ões) bioquímica(s) ou fisiológica(s) do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeos de ocorrência natural, e a similaridade de sequência pode ser devido a eventos de evolução convergente ou divergente. Como tal, homólogos funcionais são às vezes designados na literatura como homólogos, ou ortólogos, ou parálogos. Variantes de um homólogo funcional de ocorrência natural, tal como polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência de codificação de tipo selvagem, podem ser sozinhos homólogos funcionais. Homólogos funcionais podem também ser criados através de mutagênese direcionada a sítio da sequência de codificação para a sequência de codificação para um polipeptídeo, ou por combinação de domínios a partir das sequências de codificação para diferentes polipeptídeos de ocorrência natural (“troca de domínio”). Técnicas para modificar genes que codificam polipeptídeos UGT funcionais aqui descritas são conhecidas e incluem, inter alia, técnicas de evolução direcionada, técnicas de mutagênese direcionada a sítio e técnicas de mutagênese aleatória, e podem ser úteis para aumentar a atividade específica de um polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, alterar níveis de expressão, alterar a localização subcelular, ou modificar interações polipeptídeo:polipeptídeo de uma maneira desejada. Tais polipeptídeos modificados são considerados homólogos funcionais. O termo “homólogo funcional” é, às vezes, aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo perfeitamente homólogo.
[00142] Homólogos funcionais podem ser identificados por análise de alinhamentos de sequência de nucleotídeo e polipeptídeo. Por exemplo, a realização de uma consulta em um banco de dados de sequências de nucleotídeo ou polipeptídeo pode identificar homólogos de polipeptídeos de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. A análise da sequência pode envolver análise BLAST, BLAST recíproco, ou PSI-BLAST de bases de dados não-redundantes utilizando uma sequência de aminoácido GGPPS, CDPs, KS, KO ou KAH como a sequência de referência. A sequência de aminoácidos é, em alguns casos, deduzida da sequência de nucleotídeo. Esses polipeptídeos na base de dados que possuem mais de 40% de identidade de sequência são candidatos para avaliação adicional da adequação como um polipeptídeo de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. A similaridade da sequência de aminoácidos permite substituições de aminoácidos conservadoras, tais como substituição de um resíduo hidrófobo por outro ou substituição de um resíduo polar por outro. Se desejado, inspeção manual de tais candidatos pode ser realizada com o objetivo de reduzir o número de candidatos a ser adicionalmente avaliados. A inspeção manual pode ser realizada selecionando os candidatos que parecem ter domínios presentes em polipeptídeos de biossíntese de esteviol, por exemplo, domínios funcionais conservados.
[00143] Regiões conservadas podem ser identificadas localizando uma região dentro da sequência aminoácidos primária de um polipeptídeo de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol que seja uma sequência repetida, forme uma estrutura secundária (por exemplo, folhas de beta e hélices), estabeleça domínios positivamente ou negativamente carregados, ou represente um domínio ou motivo de proteína. Ver, por exemplo, o site Pfam que descreve sequências de consenso para uma variedade de domínios e motivos de proteína no World Wide Web e sanger.ac.uk/Software/Pfam/ e pfam.janelia.org/. A informação incluída na base e dados Pfam é descrita em Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteínas, 28:405-420 (1997); e Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999). Regiões conservadas também podem ser determinadas por alinhamento das sequências dos mesmos ou polipeptídeos relacionados a partir de espécies estreitamente relacionadas. Espécies estreitamente relacionadas, preferivelmente, são da mesma família. Em algumas modalidades, o alinhamento de sequências de duas espécies diferentes é adequado.
[00144] Tipicamente, os polipeptídeos que apresentam pelo menos cerca de 40% de identidade de sequência a aminoácido são úteis para identificar regiões conservadas. Regiões conservadas de polipeptídeos relacionados apresentam pelo menos 45% de identidade de sequência a aminoácido (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de identidade de sequência a aminoácido). Em algumas modalidades, uma região conservada apresenta pelo menos 92%, 94%, 96%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a aminoácido.
[00145] Por exemplo, polipeptídeos adequados para produção de glicosídeos de esteviol em um hospedeiro recombinante incluem homólogos funcionais de UGT91D2e, UGT91D2m, UGT85C, e UGT76G. Tais homólogos possuem mais de 90% (por exemplo, pelo menos 95% ou 99%) de identidade de sequência à sequência de aminoácido de UGT91D2e (SEQ ID NO: 5), UGT91D2m (SEQ ID NO: 10), UGT85C (SEQ ID NO: 3), ou UGT76G (SEQ ID NO: 7). Variantes de polipeptídeos UGT91D2, UGT85C e UGT76Gs tipicamente têm 10 ou menos substituições de aminoácido na sequência de aminoácido primária, por exemplo, 7 ou menos substituições de aminoácido, 5 ou substituições de aminoácido conservadoras, ou entre 1 e 5 substituições. No entanto, em algumas modalidades, variantes de polipeptídeos UGT91D2, UGT85C e UGT76G podem ter 10 ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 10-20, 10-35, 20-30, ou 25-35 substituições de aminoácido). As substituições podem ser conservadoras, ou em algumas modalidades, não-conservadoras. Exemplos não-limitantes de alterações não- conservadoras nos polipeptídeos UGT91D2e incluem glicina por arginina e triptofano por arginina. Exemplos não-limitantes de substituições não-conservadoras nos polipeptídeos UGT76G incluem valina por ácido glutâmico, glicina por ácido glutâmico, glutamina por alanina, e serina por prolina. Exemplos não-limitantes de alterações para polipeptídeos UGT85C incluem histidina por ácido aspártico, prolina por serina, lisina por treonina, e treonina por arginina.
[00146] Em algumas modalidades, um homólogo UGT91D2 útil pode ter substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservadoras) nas regiões do polipeptídeo que são externas de ciclos previstos, por exemplo, resíduos 20-26, 39-43, 88-95, 121-124, 142-158, 185-198, e 203-214 são ciclos previstos no domínio N-terminal e resíduos 381-386 são ciclos previstos no domínio C-terminal da SEQ ID NO: 5. Por exemplo, um homólogo UGT91D2 útil pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido nos resíduos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, ou 387-473 da SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, um homólogo UGT91D2 pode ter uma substituição em um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste nos resíduos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, e 438 da SEQ ID NO: 5. Por exemplo, um homólogo funcional de UGT91D2 pode ter uma substituição em um ou mais de resíduos 206, 207, e 343, tal como uma arginina no resíduo 206, uma cisteína no resíduo 207, e uma arginina no resíduo 343 da SEQ ID NO: 5. Ver, SEQ ID NO: 95. Outros homólogos funcionais de UGT91D2 podem ter um ou mais dos seguintes: uma tirosina ou fenilalanina no resíduo 30, uma prolina ou glutamina no resíduo 93, uma serina ou valina no resíduo 99, uma tirosina ou uma fenilalanina no resíduo 122, uma histidina ou tirosina no resíduo 140, uma serina ou cisteína no resíduo 142, uma alanina ou treonina no resíduo 148, uma metionina no resíduo 152, uma alanina no resíduo 153, uma alanina ou serina no resíduo 156, uma glicina no resíduo 162, uma leucina ou metionina no resíduo 195, um ácido glutâmico no resíduo 196, uma lisina ou ácido glutâmico no resíduo 199, uma leucina ou metionina no resíduo 211, uma leucina no resíduo 213, uma serina ou fenilalanina no resíduo 221, uma valina ou isoleucina no resíduo 253, uma valina ou alanina no resíduo 286, uma lisina ou asparagina no resíduo 427, uma alanina no resíduo 438, e tanto uma alanina ou treonina no resíduo 462 da SEQ ID NO: 5. Ver, Exemplos 11 e 16, e Tabelas 12 e 14. Um polipeptídeo UGT91D2 variante útil também pode ser construído com base no alinhamento previsto na Figura 8.
[00147] Em algumas modalidades, um homólogo de UGT85C útil pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, e 471 da SEQ ID NO: 3. Exemplos não-limitantes de homólogos de UGT85C úteis incluem polipeptídeos tendo substituições (em relação a SEQ ID NO: 3) no resíduo 65; no resíduo 65 em combinação com o resíduo 15, 270, 418, 440, ou 441; resíduos 13, 15, 60, 270, 289, e 418; substituições nos resíduos 13, 60, e 270; substituições nos resíduos 60 e 87; substituições nos resíduos 65, 71, 220, 243, e 270; substituições nos resíduos 65, 71, 220, 243, 270, e 441; substituições nos resíduos 65, 71, 220, 389, e 394; substituições nos resíduos 65, 71, 270, e 289; substituições nos resíduos 220, 243, 270, e 334; ou substituições nos resíduos 270 e 289. Ver, Exemplo 17 e Tabela 15.
[00148] Em algumas modalidades, um homólogo UGT76G útil pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346 da SEQ ID NO: 7. Exemplos não-limitantes de homólogos UGT76G úteis incluem polipeptídeos tendo substituições (em relação a SEQ ID NO: 7) nos resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, e 291; resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, e 291; ou resíduos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346. Ver Exemplo 18 e Tabela 16.
[00149] Métodos para modificar a especificidade de substrato de, por exemplo, UGT91D2e, são conhecidos dos versados na técnica e incluem, sem limitação, abordagens de mutagênese direcionada a sítio/racional, abordagens de evolução direcionada aleatória e combinações em que técnicas de mutagênese/saturação aleatórias são realizadas perto do sítio ativo da enzima. Por exemplo, ver Sarah A. Osmani, et al. Phytochemistry 70 (2009) 325-347.
[00150] Uma sequência candidata tipicamente possui um comprimento que é a partir de 80 por cento a 200 por cento do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 por cento do comprimento da sequência de referência. Um percentual de identidade para cada ácido nucleico ou polipeptídeo candidato em relação ao ácido nucleico ou polipeptídeo de referência pode ser determinado como segue. Uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácido) é alinhada com uma ou mais sequências candidatas utilizando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros padrão), que permite que alinhamentos de sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo sejam realizados em todo o seu comprimento (alinhamento global). Chenna et al., Acid Nucleics Res., 31(13):3497-500 (2003).
[00151] ClustalW calcula a melhor correspondência entre uma referência e uma ou mais sequências candidatas, e as alinha de modo que as identidades, semelhanças e diferenças possam ser determinadas. Lacunas de um ou mais resíduos podem ser inseridas em uma sequência de referência, uma sequência candidata, ou ambas, para maximizar alinhamentos de sequência. Para o alinhamento emparelhado rápido de sequências de ácido nucleico, os seguintes parâmetros padrão são utilizados: tamanho da palavra: 2; tamanho da janela: 4; método de pontuação: percentagem; número de diagonais de topo: 4; e penalidade de lacuna: 5. Para o alinhamento múltiplo de sequências de ácido nucleico, os seguintes parâmetros são utilizados: penalidade de abertura de lacuna: 10,0; penalidade de extensão de lacuna: 5,0; e transições de peso: sim. Para o alinhamento emparelhado rápido de sequências de proteína, os seguintes parâmetros são utilizados: tamanho da palavra: 1; tamanho da janela: 5; método de pontuação: porcentagem; número de diagonais de topo: 5; penalidade de lacuna: 3. Para o alinhamento múltiplo de sequências de proteínas, os seguintes parâmetros são utilizados: matriz de peso: blosum; penalidade de abertura de lacuna: 10,0; penalização de extensão de lacuna: 0,05; lacunas hidrófilas: ativas; resíduos hidrófilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, e Lis; penalidades de lacuna específicas de resíduo: ativas. A saída de ClustalW é um alinhamento de sequência que reflete a relação entre sequências. ClustalW pode ser rodado, por exemplo, no site do Baylor College de Medicine Search Launcher no World Wide Web (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) e no site do European Bioinformatics Institute no World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw).
[00152] Para determinar a porcentagem de identidade de uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido candidata para uma sequência de referência, as sequências são alinhadas utilizando ClustalW, o número de correspondências idênticas no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência de referência, e o resultado é multiplicado por 100. Observa-se que o valor percentual de identidade pode ser arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, 78,14 e são arredondados para 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 são arredondado para 78,2.
[00153] Será apreciado que um polipeptídeo UGT91D2 funcional pode incluir aminoácidos adicionais que não estão envolvidos na glicosilação ou outras atividades enzimáticas realizadas por UGT91D2, e, portanto, tal polipeptídeo pode ser mais longo do que seria o caso. Por exemplo, um polipeptídeo UGT91D2 pode incluir uma etiqueta de purificação, um peptídeo de trânsito do cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptídeo de sinal, ou uma etiqueta de secreção adicionada ao terminal amino ou carbóxi. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UGT91D2 inclui uma sequência de aminoácido que funciona como repórter, por exemplo, uma proteína verde fluorescente ou proteína amarelo fluorescente.
[00154] II. Ácidos Nucleicos de Biossíntese de Esteviol e Glicosídeo de Esteviol
[00155] Um gene recombinante que codifica um polipeptídeo aqui descrito compreende a sequência de codificação para aquele polipeptídeo, operacionalmente ligada em orientação sentido a uma ou mais regiões reguladoras adequadas para expressar o polipeptídeo. Porque microrganismos são capazes de expressar vários produtos genéticos a partir de um mRNA policistrônico, vários polipeptídeos podem ser expressos sob o controle de uma região reguladora simples para aqueles microrganismos, se desejado. Uma sequência de codificação e uma região reguladora são consideradas operacionalmente ligadas quando a região reguladora e sequência de codificação são posicionadas de tal forma que a região reguladora é eficaz para tradução ou transcrição reguladora da sequência. Tipicamente, o sítio de iniciação da tradução do quadro de leitura translacional da sequência de codificação é posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da região reguladora para um gene monocistrônico.
[00156] Em muitos casos, a sequência de codificação para um polipeptídeo aqui descrito é identificada em uma espécie que não o hospedeiro recombinante, isto é, é um ácido nucleico heterólogo. Desta forma, se o hospedeiro recombinante for um microrganismo, a sequência de codificação pode ser de outros microrganismos procarióticos ou eucarióticas, de plantas ou de animais. Em alguns casos, no entanto, a sequência de codificação é uma sequência que é nativa para o hospedeiro e que está sendo reintroduzida no organismo. Uma sequência nativa muitas vezes pode ser distinguida da sequência de ocorrência natural pela presença de sequências não- naturais ligadas ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não-nativas flanqueando uma sequência nativa em um constructo de ácido nucleico recombinante. Além disso, ácidos nucleicos exógenos estavelmente transformados são tipicamente integrados em posições que não a posição onde a sequência nativa é encontrada.
[00157] "Região reguladora" se refere a um ácido nucleico tendo sequências de nucleotídeo que influenciam a iniciação de transcrição ou tradução e taxa, e estabilidade e/ou mobilidade de um produto de tradução ou transcrição. Regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências potenciadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteínas, elementos induzíveis, sequências de ligação a proteína, regiões 5' e 3' não-traduzidas (regiões UTRs), sítios de início de transcrição, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, íntrons, e combinações destes. Uma região reguladora tipicamente compreende pelo menos um promotor de núcleo (basal). Uma região reguladora também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência promotora, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). Uma região reguladora é operacionalmente ligada a uma sequência de codificação através do posicionamento da região reguladora e a sequência de codificação, de forma que a região reguladora seja eficaz para regular a transcrição ou tradução da sequência. Por exemplo, para operacionalmente ligar uma sequência de codificação e uma sequência promotora, o sítio de iniciação da tradução do quadro de leitura translacional da sequência de codificação é tipicamente posicionado entre um e cerca de 50 nucleotídeos a jusante do promotor. Uma região reguladora pode, no entanto, ser posicionada tanto quanto cerca de 5000 nucleotídeos a montante do sítio de iniciação de tradução, ou cerca de 2000 nucleotídeos a montante de sítio de início da transcrição.
[00158] A escolha de regiões reguladoras a serem incluídas depende de vários fatores, incluindo, mas não limitados a, eficiência, seletividade, indutibilidade, nível de expressão desejado, e expressão preferencial durante determinados estágios de cultura. É uma questão de rotina para uma pessoa versada na técnica modular a expressão de um uma sequência através da adequada seleção e posicionamento de regiões reguladoras em relação à sequência de codificação. Deve ser entendido que mais do que uma região reguladora pode estar presente, por exemplo, íntrons, promotores, regiões de ativação a montante, terminadores da transcrição, e elementos induzíveis.
[00159] Um ou mais genes podem ser combinados em um constructo de ácido nucleico recombinante em "módulos" úteis para um aspecto discreto de produção de esteviol e/ou glicosídeo de esteviol. A combinação de uma pluralidade de genes em um módulo, em particular, um módulo policistrônico, facilita a utilização do módulo em uma variedade de espécies. Por exemplo, um agrupamento de genes de biossíntese esteviol ou um agrupamento de genes UGT pode ser combinado em um módulo policistrônico de tal forma que, após a inserção de uma região reguladora adequada, o módulo pode ser introduzido em uma grande variedade de espécies. Como outro exemplo, um agrupamento de gene UGT pode ser combinado tal que cada sequência de codificação de UGT seja operacionalmente ligada a uma região reguladora separada, para formar um módulo UGT. Tal módulo pode ser usado naquelas espécies para quais a expressão monocistrônica seja necessária ou desejável. Além de genes úteis para a produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, um constructo recombinante tipicamente também contém uma origem de replicação, e um ou mais marcadores selecionáveis para a manutenção do constructo em espécies apropriadas.
[00160] Será apreciado que devido à degeneração do código genético, uma variedade de ácidos nucleicos pode codificar um polipeptídeo particular; isto é, para muitos aminoácidos, há mais do que um tripleto de nucleótidos que serve como o códon para o aminoácido. Desta forma, códons em uma sequência de codificação para um determinado polipeptídeo podem ser modificados, tal que a expressão ideal em um determinado hospedeiro pode ser obtida utilizando tabelas de tendência de códon apropriadas para aquele hospedeiro (por exemplo, microrganismo). SEQ ID NOs: 18-25, 34-36, 40-43, 48-49, 52-55, 60-64, e 70-72 estabelecem sequências de nucleotídeo que codificam certas enzimas para biossíntese de esteviol e glicosídeo de esteviol, modificadas para aumento da expressão em levedura. Como ácidos nucleicos isolados, estas sequências modificadas podem existir como moléculas purificadas e podem ser incorporadas em um vetor ou vírus para uso em módulos de construção para constructos de ácido nucleico recombinante.
[00161] Em alguns casos, é desejável inibir uma ou mais funções de um polipeptídeo endógeno a fim de desviar intermediários metabólicos para biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. Por exemplo, pode ser desejável sub-regular a síntese de esteróis em uma cepa de levedura, a fim de aumentar ainda mais a produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, por exemplo, sub-regulando esqualeno epoxidase. Como outro exemplo, pode ser desejável inibir as funções degradantes de certos produtos de genes endógenos, por exemplo, glicohidrolases que removem porções de glicose de metabólitos secundários. Como outro exemplo, a expressão de transportadores de membrana envolvidos no transporte de glicosídeos de esteviol pode ser inibida, tal que a secreção de esteviosídeos glicosilados é inibida. Tal regulação pode ser benéfica em que a secreção de glicosídeos de esteviol pode ser inibida durante um período de tempo desejado durante a cultura dos microrganismos, aumentando assim o rendimento de produto(s) de glicosídeo no momento da colheita. Em tais casos, um ácido nucleico que inibe a expressão do polipeptídeo produto de gene pode ser incluído em um constructo recombinante que é transformado na cepa. Alternativamente, mutagênese pode ser usada para gerar mutantes em genes para os quais é desejado inibir a função.
[00162] III. Hospedeiros
[00163] Microrganismos
[00164] Uma variedade de procariontes e eucariontes é adequada para utilização na construção dos microrganismos recombinantes aqui descritos, por exemplo, bactérias gram-negativas, fungos e leveduras. Uma espécie e cepa selecionada para uso como uma cepa de produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol é primeiro analisada para determinar quais genes de produção são endógenos para uma cepa e quais genes não estão presentes. Os genes para os quais uma contraparte endógena não está presente em uma cepa são montados em um ou mais constructos recombinantes, que depois de são transformados em uma cepa, a fim de fornecer a(s) função(ões) ausente(s).
[00165] Espécies de procariontes e eucariontes exemplares são descritas em mais detalhes abaixo. No entanto, será apreciado que outras espécies podem ser adequadas. Por exemplo, espécies adequadas podem estar em uma classe selecionada do grupo que consiste em Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, Corynebacterium, Escherichia, Fusarium/Gibberella, Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaffia, Phanerochaete, Pichia, Physcomitrella, Rhodoturula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sphaceloma, Xanthophyllomyces e Yarrowia. Espécies exemplares de tais gêneros incluem Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphureus, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Physcomitrella patens, Rhodoturula glutinis 32, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma UBV-AX, Xanthophyllomyces dendrorhous, Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi, Candida utilis e Yarrowia lipolytica. Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser um Ascomycete, tal como Gibberella fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, ou Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, um microrganismo pode ser um procarionte, tal como Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides, ou Rhodobacter capsulatus. Será apreciado que certos microrganismos podem ser usados para selecionar e testar genes de interesse em uma forma de alto rendimento, enquanto outros microrganismos com características de produtividade ou crescimento desejadas podem ser utilizados para produção em grande escala de glicosídeos de esteviol.
[00166] Saccharomyces cerevisiae
[00167] Saccharomyces cerevisiae é um organismo de chassis amplamente usado em biologia sintética e pode ser usado como a plataforma de microrganismo recombinante. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados de metabolismo e outras informações disponíveis para S. cerevisiae, permitindo o projeto racional de vários módulos para aumentar o rendimento do produto. Métodos são conhecidos para produção de microrganismos recombinantes.
[00168] Um agrupamento de genes de biossíntese de esteviol pode ser expresso em levedura utilizando qualquer um de uma variedade de promotores conhecidos. Cepas que super-produzem terpenos são conhecidas e podem ser usadas para aumentar a quantidade de geranilgeranil difosfato disponível para a produção de esteviol e glicosídeo de esteviol.
[00169] Aspergillus spp.
[00170] Espécies de Aspergillus, tais como A. oryzae, A. niger e A. sojae são microrganismos amplamente utilizados na produção de alimentos, e podem ser também ser utilizadas como plataforma de microrganismo recombinante. Sequências de nucleotídeo estão disponíveis para genomas de A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae, A. clavatus, A. flavus, A. niger, e A. terreus, permitindo projeto racional e modificação de caminhos endógenos para melhorar o fluxo e aumentar o rendimento do produto. Modelos metabólicos foram desenvolvidos para Aspergillus, bem como estudos transcriptômicos e estudos proteômicos. A. niger é cultivado para produção industrial de uma variedade de ingredientes alimentares, tais como ácido cítrico e ácido glucônico e, portanto, espécies tais como A. niger são geralmente adequadas para a produção de ingredientes alimentares, tais como esteviol e glicosídeos de esteviol. O Exemplo 23 descreve a metodologia de clonagem para a produção de glicosídeos de esteviol em Aspergillus nidulans.
[00171] Escherichia coli
[00172] Escherichia coli, outro organismo de plataforma amplamente utilizado em biologia sintética, pode também ser usado como plataforma de microrganismo recombinante. Semelhante a Saccharomyces, existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados de metabolismo e outras informações disponíveis para E. coli, permitindo um projeto racional de vários módulos para melhorar o rendimento do produto. Métodos semelhantes aos descritos acima para Saccharomyces podem ser usados para produção de microrganismos recombinantes de E. coli.
[00173] Agaricus, Gibberella, e Phanerochaete spp.
[00174] Agaricus, Gibberella, e Phanerochaete spp. podem ser úteis porque são conhecidos por produzirem grandes quantidades de giberelina em cultura. Desta forma, os precursores de terpeno para produção de grandes quantidades de esteviol e glicosídeos de esteviol já são produzidos por genes endógenos. Desta forma, módulos contendo genes recombinantes para polipeptídeos de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol podem ser introduzidos em espécies de tais gêneros, sem a necessidade de introdução de genes do caminho de mevalonato ou MEP.
[00175] Rhodobacter spp.
[00176] Rhodobacter pode ser usado como plataforma de microrganismo recombinante. Semelhante a E. coli, existem bibliotecas de mutantes disponíveis, bem como vetores de plasmídeos, permitindo o projeto racional de vários módulos para aumentar o rendimento do produto. Caminhos de isoprenóides foram desenvolvidos em espécies de bactérias membranosas de Rhodobacter para aumento da produção de carotenóide e CoQ10. Ver, Publicação de Patente dos Estados Unidos N°s. 20050003474 e 20040078846. Métodos similares àqueles descritos acima para E. coli podem ser usados para produção de microrganismos de Rhodobacter recombinantes.
[00177] Physcomitrella spp.
[00178] Musgos de Physcomitrella, quando cultivados em cultura de suspensão, têm características semelhantes à levedura ou outras culturas fúngicas. Este gênero está se tornando um importante tipo de célula para produção de metabólitos de plantas secundários, que pode ser de difícil produção em outros tipos de células. O Exemplo 22 descreve a produção de enzimas UGT ativas no caminho de glicosídeo esteviol em P. patens.
[00179] Células Vegetais ou Plantas
[00180] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos e polipeptídeos aqui descritos são introduzidos em plantas ou células vegetais para aumentar a produção global de glicosídeo de esteviol ou enriquecer a produção de glicosídeos de esteviol específico em relação a outros. Desta forma, um hospedeiro pode ser uma planta ou uma célula vegetal que inclui pelo menos um gene recombinante aqui descrito. Uma planta ou célula vegetal pode ser transformada tendo um gene recombinante integrado em seu genoma, isto é, pode ser transformada de forma estável. As células transformadas de forma estável tipicamente retém o ácido nucleico introduzido em cada divisão celular. Uma planta ou célula vegetal pode também ser transitoriamente transformada de tal modo que o gene recombinante não seja integrado no seu genoma. As células transitoriamente transformadas tipicamente perdem toda ou alguma porção do ácido nucleico introduzido em cada divisão celular, tal que o ácido nucleico introduzido não seja detectado em células descendentes após um número suficiente de divisões celulares. Ambas plantas e células vegetais transitoriamente transformadas e estavelmente transformadas podem ser úteis nos métodos aqui descritos.
[00181] Células vegetais transgênicas usadas nos métodos aqui descritos podem constituir o todo ou parte de uma planta inteira. Tais plantas podem ser cultivadas de uma maneira adequada para a espécie em questão, seja em uma câmara de crescimento, uma estufa ou em um campo. Plantas transgênicas podem ser germinadas como desejado para uma determinada finalidade, por exemplo, para introduzir um ácido nucleico recombinante em outras linhagens, para transferir um ácido nucleico recombinante para outras espécies, ou para seleção adicional de outras características desejáveis. Alternativamente, plantas transgênicas podem ser propagadas vegetativamente para as espécies passíveis de tais técnicas. Como aqui usado, uma planta transgênica também se refere a uma progênie de uma planta transgênica inicial desde que a progênie herde o transgene. Sementes produzidas por uma planta transgênica podem ser cultivadas e, em seguida, autofecundadas (ou autocruzadas e autofecundadas) para obter homozigotos de sementes para o constructo de ácido nucleico.
[00182] Plantas transgênicas podem ser cultivadas em cultura de suspensão, ou tecido ou cultura de órgão. Para as finalidades da presente invenção, técnicas de cultura de tecido sólido e/ou líquido podem ser utilizadas. Quando da utilização de meio sólido, células vegetais transgênicas podem ser colocadas diretamente sobre o meio ou podem ser colocadas diretamente em um filtro que é, então, colocado em contato com o meio. Quando utilizando meio líquido, células vegetais transgênicas podem ser colocadas em um dispositivo de flutuação, por exemplo, uma membrana porosa que contacta o meio líquido.
[00183] Quando células vegetais transitoriamente transformadas são utilizadas, uma sequência repórter que codifica um polipeptídeo repórter tendo uma atividade repórter pode ser incluída no processo de transformação e um ensaio para expressão ou atividade repórter pode ser realizado em um tempo adequado após a transformação. Um tempo adequado para a realização do ensaio é tipicamente cerca de 1-21 dias após a transformação, por exemplo, cerca de 1-14 dias, cerca de 1-7 dias, ou cerca de 1-3 dias. O uso de ensaios transientes é particularmente conveniente para análise rápida em diferentes espécies, ou para confirmar a expressão de um polipeptídeo heterólogo cuja expressão não tenha sido anteriormente confirmada em células receptoras particulares.
[00184] Técnicas para a introdução de ácidos nucleicos em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas são conhecidas na técnica, e incluem, sem limitação, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vetor viral, eletroporação e transformação de projetor de partículas, Patente dos Estados Unidos N°s 5.538.880; 5.204.253; 6.329.571; e 6.013.863. Se uma célula ou tecido cultivado for usado como o tecido receptor para transformação, as plantas podem ser regeneradas a partir de culturas transformadas, se desejado, por técnicas conhecidas dos versados na técnica.
[00185] Uma população de plantas transgênicas pode ser triada e/ou selecionada quanto aos membros da população que possuem um traço ou fenótipo conferido por expressão do transgene. Por exemplo, uma população de progênie de um evento de transformação único pode ser selecionado para aquelas plantas tendo um nível desejado de expressão de um polipeptídeo de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol ou ácido nucleico. Métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar níveis de expressão. Estes incluem análise Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção de S1 RNase, extensão de iniciadores ou amplificação por RT-PCR para a detecção de transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para a detecção de enzima ou atividade de ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese de gel de proteínas, Western blot, imunoprecipitação, imunoensaios ligados a enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração enzimática, e imunocoloração também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos. Métodos para a realização de todas as técnicas referidas são conhecidos. Como uma alternativa, uma população de plantas compreendendo eventos de transformação independentes pode ser selecionada para aquelas plantas tendo um traço desejado, tal como produção de um glicosídeo de esteviol ou biossíntese modulada de um glicosídeo de esteviol. Seleção e/ou triagem pode ser realizada durante uma ou mais gerações e/ou em mais de uma localização geográfica. Em alguns casos, plantas transgênicas podem ser cultivadas e selecionadas sob condições que induzem um fenótipo desejado ou são de outro modo necessárias para produzir um fenótipo desejado em uma planta transgênica. Além disso, a seleção e/ou triagem pode ser aplicada durante um estágio específico de desenvolvimento em que o fenótipo deverá ser exibido pela planta. A seleção e/ou triagem pode ser realizada para escolher aquelas plantas transgênicas tendo uma diferença estatisticamente significativa em um nível de glicosídeo de esteviol em relação a uma planta de controle que não tem o transgene.
[00186] Os ácidos nucleicos, genes recombinantes, e constructos aqui descritos podem ser usados para transformar uma variedade de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de célula vegetal. Exemplos não- limitantes de monocotiledôneas adequadas incluem, por exemplo, culturas de cereais como arroz, centeio, sorgo, milheto, trigo, milho e cevada. A planta pode ser uma monocotiledônea não-cereal, tal como aspargo, banana ou cebola. A planta também pode ser uma dicotiledônea, tal como estévia (Stevia rebaudiana), soja, algodão, girassol, ervilhas, gerânio, espinafre ou tabaco. Em alguns casos, a planta pode conter os caminhos precursores para a produção de fenil fosfato, tal como o caminho de mevalonato, tipicamente encontrado no citoplasma e mitocôndrias. O caminho não- mevalonato é mais frequentemente encontrado em plastídeos vegetais [Dubey, et al., 2003 J. Biosci. 28 637-646]. Uma pessoa versada na técnica pode ter como alvo expressão de polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol para a organela adequada através da utilização de sequências líder, tal que a biossíntese de glicosídeo de esteviol ocorre no local desejado da célula vegetal. Uma Pessoa versada na técnica irá utilizar promotores apropriados para direcionar a síntese, por exemplo, para a folha de uma planta, se desejado. A expressão pode também ocorrer em culturas de tecido, tais como cultura de calo ou cultura de raiz hirsuta, se desejado.
[00187] Em uma modalidade, um ou mais ácidos nucleicos ou polipeptídeos aqui descritos são introduzidos em estévia (por exemplo, Stevia rebaudiana) tal que a de biossíntese global de glicosídeo de esteviol é aumentada ou composição de glicosídeo de esteviol global é seletivamente enriquecida por um ou mais glicosídeos de esteviol específicos. Por exemplo, um ou mais genes recombinantes podem ser introduzidos em estévia, tal que um ou mais dos seguintes são expressos: uma enzima UGT91D, tal como UGT91D2e (por exemplo, SEQ ID NO: 5 ou um homólogo funcional da mesma), UGT91D2m (por exemplo, SEQ ID NO: 10); uma enzima UGT85C, tal como uma variante apresentada na Tabela 15, ou uma enzima UGT76G1, tal como uma variante apresentada no Exemplo 18. Constructos de ácido nucleico tipicamente incluem um promotor adequado (por exemplo, promotores 35S, e35S, ou ssRUBISCO) operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo UGT. Ácidos nucleicos podem ser introduzidos em estévia por transformação mediada por Agrobacterium; transferência de gene mediada por eletroporação a protoplastos; ou por bombardeamento de partícula. Ver, por exemplo, Singh, et al., Compendium de Transgenic Crop Plantas: Transgenic Sugar, Tuber e Fiber, Edited by Chittaranjan Kole e Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd. (2008), pp. 97-115. Para bombardeamento de partículas de calo derivado de folha de estévia, os parâmetros podem ser como segue: 6 cm de distância, 1100 psi de pressão He, partículas de ouro, e um bombardeamento.
[00188] Plantas de estévia podem ser regeneradas por embriogênese somática conforme descrito por Singh et al., 2008, supra. Em particular, segmentos de folha (aproximadamente 1-2cm de comprimento) podem ser removidos de plantas cultivadas in vitro a partir de 5 a 6-semanas de idade e incubados (lado de baixo adaxial) em meio MS suplementado com vitaminas B5, 30 g de sacarose e 3 g de Gelrite. Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) pode ser usado em combinação com 6- benzil adenina (BA), cinetina (KN), ou zeatina. Massas pró-embriogênicas aparecem após 8 semanas de subcultura. Em 2-3 semanas de subculturas, embriões somáticos aparecerão na superfície de culturas. Embriões podem ser maturados no meio contendo BA em combinação com 2,4-D, ácido a-naftalenoacético (NAA), ou ácido indolbutírico (IBA). Embriões somáticos maduros que germinam e formam mudas podem ser excisados a partir de calos. Após as mudas atingirem 3-4 semanas, as mudas podem ser transferidas para vasos com vermiculita e cultivadas por 6-8 semanas em câmaras de crescimento para aclimatação e transferidas para estufas.
[00189] Em uma modalidade, glicosídeos de esteviol são produzidos em arroz. Arroz e milho são prontamente transformáveis utilizando técnicas, tais como transformação mediada por Agrobacterium. Sistemas de vetor binário são comumente utilizados para introdução de gene exógeno de Agrobacterium a monocotiledônias. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n°s.. 6.215.051 e 6.329.571. Em um sistema de vetor binário, um vetor contém a região de T-DNA, que inclui um gene de interesse (por exemplo, um UGT aqui descrito) e o outro vetor é um plasmídeo Ti desarmado contendo a região vir. Vetores co-integrados e vetores mobilizáveis também podem ser usados. Os tipos e pré-tratamento de tecidos a serem transformados, a cepa de Agrobacterium usada, a duração da inoculação, a prevenção de sobrecrescimento e necrose por Agrobacterium podem ser prontamente ajustados por uma pessoa versada na técnica. Células embrionárias prematuras de arroz podem ser preparadas para transformação com Agrobacterium utilizando vetores binários. O meio de cultura usado é suplementado com compostos fenólicos. Alternativamente, a transformação pode ser feita pode ser in planta utilizando infiltração a vácuo. Ver, por exemplo, WO 2000037663, WO 2000063400, e WO 2001012828.
[00190] IV. Métodos de produção de esteviol e glicosídeos de esteviol
[00191] Hospedeiros recombinantes aqui descritos podem ser usados em métodos para produzir esteviol ou glicosídeos de esteviol. Por exemplo, se o hospedeiro recombinante for um microrganismo, o método pode incluir cultura do microrganismo recombinante em um meio de cultura sob condições em que esteviol e/ou genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol são expressos. O microrganismo recombinante pode ser cultivado em uma batelada alimentada ou processo contínuo. Tipicamente, o microrganismo recombinante é cultivado em um fermentador em uma temperatura(s) definida por um período de tempo desejado. Dependendo do microrganismo particular usado no método, outros genes recombinantes, tais como genes de biossíntese de isopentenil e genes de terpene sintase e ciclase podem também estar presentes e serem expressos. Os níveis de substratos e intermediários, por exemplo, isopentenil difosfato, dimetilalil difosfato, geranilgeranil difosfato, caureno e ácido caurenóico, podem ser determinados por extração de amostras a partir do meio de cultura para análise de acordo com os métodos publicados.
[00192] Após o microrganismo recombinante ser cultivado em cultura pelo período de tempo desejado, esteviol e/ou um ou mais glicosídeos de esteviol pode, então, ser recuperado da cultura utilizando as várias diferentes conhecidas na arte. Se o hospedeiro recombinante for uma planta ou células vegetais, esteviol ou glicosídeos de esteviol pode ser extraído do tecido da planta utilizando várias técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, um lisado bruto do microrganismo cultivado ou tecido vegetal pode ser centrifugado para obtenção de um sobrenadante. O sobrenadante resultante pode então ser aplicado a uma coluna de cromatografia, por exemplo, uma coluna C-18, e lavado com água para remover compostos hidrofílicos, seguido por eluição do(s) composto(s) de interesse de um solvente, tal como metanol. O(s) composto(s) pode(m), então, ser adicionalmente purificado(s) por HPLC preparativa. Ver também WO 2009/140394.
[00193] A quantidade de esteviol ou glicosídeo de esteviol produzido pode ser a partir de cerca de 1 mg/l a cerca de 1.500 mg/l, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 mg/l, cerca de 3 a cerca de 10 mg/l, cerca de 5 a cerca de 20 mg/l, cerca de 10 a cerca de 50 mg/l, cerca de 10 a cerca de 100 mg/l, cerca de 25 a cerca de 500 mg/l, cerca de 100 a cerca de 1.500 mg/l, ou cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/l. Em geral, tempos de cultura mais longos irão levar a quantidades maiores de produto. Desta forma, o microrganismo recombinante pode ser cultivado por 1 dia a 7 dias, de 1 dia a 5 dias, de 3 dias a 5 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, ou cerca de 5 dias.
[00194] Será apreciado que os vários genes e módulos aqui discutidos podem estar presentes em dois ou mais microrganismos recombinantes, em vez de um único microrganismo. Quando uma pluralidade de microrganismos recombinantes é utilizada, eles podem ser cultivados em uma cultura mista para produzir esteviol e/ou glicosídeos de esteviol. Por exemplo, um primeiro microrganismo pode compreender um ou mais genes de biossíntese para a produção de esteviol, enquanto um segundo microrganismo compreende genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol. Alternativamente, os dois ou mais microrganismos, cada um, podem ser cultivados em um meio de cultura separado e o produto do primeiro meio de cultura, por exemplo, esteviol, pode ser introduzido no segundo meio de cultura para ser convertido em um intermediário posterior ou em um produto final, tal como rebaudiosídeo A. O produto produzido pelo segundo ou microrganismo final é, então, recuperado. Será também apreciado que, em algumas modalidades, um microrganismo recombinante é cultivado utilizando fontes de nutrientes que não um meio de cultura e utilizando um sistema que não um fermentador.
[00195] Glicosídeos de esteviol não necessariamente têm desempenho equivalente em diferentes sistemas alimentares. É, portanto, desejável ter a capacidade de direcionar a síntese a composições de glicosídeo de esteviol de escolha. Os hospedeiros recombinantes aqui descritos podem produzir composições que são seletivamente enriquecidas por glicosídeos de esteviol específicos e têm um perfil de sabor consistente. Desta forma, os microrganismos recombinantes, plantas, e células vegetais aqui descritos podem facilitar a produção de composições que são adaptadas para atender o perfil adoçante desejado para um determinado produto alimentar e que possuem uma proporção de cada glicosídeo de esteviol que é consistente de lote para lote. Os microrganismos aqui descritos não produzem os subprodutos de planta indesejáveis encontrados em extratos de estévia. Desta forma, as composições de glicosídeo de esteviol produzidas pelos microrganismos recombinantes aqui descritos são distinguíveis a partir de composições derivadas de plantas de estévia.
[00196] V. Produtos Alimentares
[00197] O esteviol e glicosídeos de esteviol obtidos pelos métodos aqui descritos podem ser usados para fazer produtos alimentares, suplementos dietéticos e composições adoçantes. Por exemplo, esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro, tal como rebaudiosídeo A pode ser incluído em produtos alimentares, tais como sorvete, bebidas carbonadas, sucos de fruta, iogurtes, bolos, gomas de mascar, balas duras e macias, e molhos. Esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro também pode ser incluído em produtos não-alimentares, tais como produtos farmacêuticos, medicamentos, suplementos dietéticos e suplementos nutricionais. Esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro também pode ser incluído em produtos para alimentação animal tanto para a indústria de agricultura e a indústria de animais de companhia. Alternativamente, uma mistura de esteviol e/ou glicosídeos de esteviol pode ser feita por cultura de microrganismos recombinantes separadamente ou crescimento de diferentes plantas/células vegetais, cada uma produzindo um esteviol específico ou glicosídeo de esteviol, recuperação de esteviol ou glicosídeo de esteviol em forma substancialmente pura a partir de cada microrganismo ou planta/células vegetais e, depois combinando os compostos para se obter uma mistura contendo cada composto na proporção desejada. Os microrganismos recombinantes, plantas, e células vegetais aqui descritas permitem misturas mais precisas e consistentes a serem obtidas em comparação com os produtos Stevia atuais. Em outra alternativa, um esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro pode ser incorporado em um produto alimentar, juntamente com outros adoçantes, por exemplo sacarina, dextrose, sacarose, frutose, eritritol, aspartame, sucralose, monatina, ou acessulfame de potássio. A razão em peso de esteviol ou glicosídeo de esteviol em relação a outros adoçantes pode ser variada como desejado para atingir um sabor satisfatório no produto alimentar final. Ver, por exemplo, Publicação da Patente U.S. No. 2007/0128311. Em algumas modalidades, o esteviol ou glicosídeo de esteviol pode ser fornecido com um sabor (por exemplo, cítrico) como um modulador de sabor. Por exemplo, Rebaudiosídeo C pode ser usado como um intensificador de doçura ou modulador de doçura, em particular para adoçantes à base de carbohidrato, de tal modo que a quantidade de açúcar pode ser reduzida no produto alimentar.
[00198] Composições produzidas por um microrganismo recombinante, planta ou célula vegetal aqui descritas podem ser incorporadas nos produtos alimentares. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto alimentar em uma quantidade que varia de cerca de 20 mg de produto alimentar de glicosídeo de esteviol/kg a cerca de 1800 mg de produto alimentar de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco, dependendo do tipo de glicosídeo de esteviol e produto alimentar. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta ou célula vegetal pode ser incorporada em uma sobremesa, confeitaria fria (por exemplo, sorvete), produtos lácteos (por exemplo, iogurte), ou bebida (por exemplo, uma bebida carbonada) de tal modo que o produto alimentar tem um máximo de 500 mg de alimento de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta ou célula vegetal pode ser incorporada em um bolo (por exemplo, um biscoito) de tal modo que o produto alimentar tem um máximo de 300 mg de alimento de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco. Composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta ou célula vegetal pode ser incorporada em um molho (por exemplo, xarope de chocolate) ou produto vegetal (por exemplo, picles) de tal modo que o produto alimentar tem um máximo de 1000 mg de alimento de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um pão de modo que o produto alimentar tem um máximo de 160 mg de alimento de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em uma bala dura ou macia de modo que o produto alimentar tem um máximo de 1600 mg de alimento de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microrganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto de fruta processada (por exemplo, sucos de fruta, polpa de fruta, compotas, e geléias) de tal modo que o produto alimentar tem um máximo de 1000 mg de alimento de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco.
[00199] Por exemplo, tal composição de glicosídeo de esteviol pode ter de 90- 99% de rebaudiosídeo A e uma quantidade não-detectável de contaminantes derivados de planta de estévia, e ser incorporada em um produto alimentar a cerca de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em uma base de peso seco.
[00200] Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo B tendo maior do que 3% de rebaudiosídeo B e ser incorporada no produto alimentar tal que a quantidade de rebaudiosídeo B no produto é de cerca de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo B possui uma quantidade não-detectável de contaminantes derivados de planta de estévia.
[00201] Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo C tendo maior do que 15% de rebaudiosídeo C e ser incorporada no produto alimentar tal que a quantidade de rebaudiosídeo C no produto é de cerca de 20-600 mg/kg, por exemplo, 100-600 mg/kg, 20-100 mg/kg, 20-95 mg/kg, 20-250 mg/kg, 50-75 mg/kg ou 50-95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo C possui uma quantidade não-detectável de contaminantes derivados de planta de estévia.
[00202] Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo D tendo maior do que 3% de rebaudiosídeo D e ser incorporada no produto alimentar tal que a quantidade rebaudiosídeo D no produto é de cerca de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo D possui uma quantidade não-detectável de contaminantes derivados de planta de estévia.
[00203] Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo E tendo maior do que 3% de rebaudiosídeo E e ser incorporada no produto alimentar tal que a quantidade de rebaudiosídeo E no produto é de cerca de 25-1600 mg/kg, por exemplo, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg ou 500-1000 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo E possui uma quantidade não-detectável de contaminantes derivados de planta de estévia.
[00204] Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com rebaudiosídeo F tendo maior do que 4% de rebaudiosídeo F e ser incorporada no produto alimentar tal que a quantidade de rebaudiosídeo F no produto é de cerca de 25-1000 mg/kg, por exemplo, 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg ou 50-95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com rebaudiosídeo F possui uma quantidade não-detectável de contaminantes derivados de planta de estévia.
[00205] Tal composição de glicosídeo de esteviol pode ser uma composição enriquecida com dulcosídeo A tendo maior do que 4% de dulcosídeo A e ser incorporada no produto alimentar tal que a quantidade de dulcosídeo A no produto é de cerca de 25-1000 mg/kg, por exemplo, 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg ou 50-95 mg/kg em uma base de peso seco. Tipicamente, a composição enriquecida com dulcosídeo A possui uma quantidade não-detectável de contaminantes derivados de planta de estévia.
[00206] Em algumas modalidades, um esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro é incorporado em um adoçante de mesa ou produto "copo- para-copo". Tais produtos são tipicamente diluídos para os níveis de doçura adequados com um ou mais agentes de volume, por exemplo, maltodextrinas, conhecidos por aqueles versados na técnica. Composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas com rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, ou dulcosídeo A podem ser embaladas em um sachê, por exemplo, a cerca de 10.000 a 30.000 mg do produto de glicosídeo de esteviol/kg em uma base de peso seco, para uso de mesa.
[00207] VI. Criação de Planta
[00208] A. Polimorfismos
[00209] Polimorfismos entre os ácidos nucleicos aqui descritos (por exemplo, ácidos nucleicos UGT91D2) podem ser usados como marcadores em mapeamento de planta genética e programas de criação em Stevia. Ver, por exemplo, Yao et al., Genome, 1999, 42:657-661. Assim, os polimorfismos aqui descritos podem ser usados em um método de identificar se o polimorfismo está associado com variação em uma característica. O método envolve medir a correlação entre variação na característica em plantas de uma linhagem de Stevia ou população e a presença de um ou mais polimorfismos mais genéticos naqueles plantas, assim, identificando se ou não os polimorfismos genéticos estão associados com variação na característica. Tipicamente, a característica é a quantidade total de glicosídeos de esteviol presente nas folhas de plantas, ainda que a característica também possa ser a quantidade de um glicosídeo de esteviol particular, por exemplo, rebaudiosídeo A, ou rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, ou dulcosídeo A. Em algumas modalidades, a característica é a quantidade de esteviol, ou a quantidade de um precursor isoprenóide. Uma correlação estatisticamente significativa entre a característica e a presença do marcador polimórfico é determinada usando um teste paramétrico adequado ou estatístico não-paramétrico, por exemplo, teste Chi-square, teste de Student, teste Mann-Whitney, ou teste F. Uma correlação estatisticamente significativa entre, por exemplo, a quantidade de rebaudiosídeo A em uma planta e presença de um marcador polimórfico indica que o marcador pode ser útil em um programa de criação assistido pelo marcador para a seleção de níveis de rebaudiosídeo A alterados.
[00210] Polimorfismos podem ser detectados por meios conhecidos na técnica, incluindo sem limitação, polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de DNA polimórfico amplificado aleatória (RAPD), polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), repetição de sequência simples (SSR) ou microssatélites. Descoberta, detecção, e genotipagem de polimorfismos têm sido descritas na literatura. Ver, por exemplo, Henry, ed. (2001) Plant Genotyping. The DNA Fingerprinting of Plants Wallingford: CABI Publishing; and Phillips and Vasil, eds. (2001) DNA-based Markers in Plants Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. Por exemplo, um iniciador ou sonda derivada das sequências de ácido nucleico apresentadas em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, ou SEQ ID NO: 96, ou os complementos dos mesmos, podem ser usados para identificar uma ou mais plantas individuais que possuem o alelo polimórfico, que está correlacionado com uma composição de glicosídeo de esteviol desejada. Aquelas plantas então podem ser usadas em um programa de criação para combinar o alelo polimórfico com uma pluralidade de outros alelos em outros locais que são correlacionados com a composição de glicosídeo de esteviol desejada. Como será evidente para uma pessoa versada na técnica, o número e o tipo de marcadores necessários podem diferir, dependendo das características a serem selecionadas para e o grau de correlação para cada marcador. Os métodos, portanto, envolve a detecção de uma pluralidade de polimorfismos no genoma da planta em certas modalidades. Será apreciado que o método pode ainda compreender armazenar os resultados da etapa de detecção da pluralidade de polimorfismos em um meio legível por computador.
[00211] Assim, em algumas modalidades, um método para identificar linhagens de planta Stevia ou populações compreende fornecer uma amostra de ácido nucleico para uma planta Stevia, proporcionando iniciadores de amplificação para amplificar uma região de uma planta Stevia correspondente a um gene UGT tendo 90% ou identidade de sequência maior para um ácido nucleico que codifica os polipeptídeos previstos nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 7, presentes na amostra, aplicando os iniciadores de amplificação para a amostra de ácido nucleico de tal modo que a amplificação da região ocorra, e identifique as plantas tendo uma característica desejada baseada na presença de um ou mais polimorfismos na amostra de ácido nucleico amplificada que se correlaciona com a característica.
[00212] Em algumas modalidades, um método de determinar a presença de um polinucleótido em uma planta Stevia envolve colocar em contato pelo menos um par de sonda ou iniciador com ácido nucleico a partir da planta. O par de sonda ou iniciador é específico para um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo UGT tendo pelo menos 90% da identidade da sequência para SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 7. A presença ou ausência do polinucleótido é então determinada.
[00213] Para além dos métodos para detectar os polimorfismos e determinar o genótipo de uma planta Stevia, kits adequados para a realização dos métodos são também descritos, bem como um meio legível por computador produzido por tais métodos que contêm os dados gerados pelos métodos. Um kit para genotipagem de uma amostra biológica Stevia inclui um par de iniciador que especificamente amplifica, ou uma sonda que especificamente hibridiza com, um polinucleótido que codifica um polipeptídeo UGT tendo pelo menos 90% da identidade da sequência para SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 7. Tais kits tipicamente possuem o iniciador ou sonda contida dentro do material de embalagem adequado.
[00214] Em algumas modalidades dos métodos e kits aqui descritos, um ou mais conjuntos de oligonucleotídeos, cada um capaz de reconhecer a presença ou ausência de uma posição genômica específica e definida, serão utilizados. Para linhagens Stevia poliplóides ou populações, mais oligonucleotídeos são desejáveis. O limite inferior é de um par de oligonucleotídeo e o limite superior é definido pela capacidade de resolução desejada do método e o kit de teste. A hibridação dos oligonucleotídeos para o DNA da planta Stevia é preferivelmente gravada in situ por qualquer sistema de rotulagem convencional, aplicando por exemplo transferase terminal e rótulos graváveis convencionais. Como uma alternativa à rotulagem in situ, a amostra de DNA hibridizada pode ser liberada do suporte sólido e subsequentemente hibridizada com sequências de polinucleotídeos rotuladas correspondentes a cada uma das sequências de oligonucleotídeo originais ligadas ao suporte sólido. A hibridação é opcionalmente reversível e, o suporte sólido pode ser retornado ao seu estado original para reutilização. Um dideoxinucleotídeo rotulado pode ser incorporado no final do oligonucleotídeo fornecido, desde que o oligonucleotídeo seja hibridizado ao DNA genômico como amostra. A sequência de nucleotídeo na posição genômica adjacente à região correspondente ao oligonucleotídeo é conhecida e, portanto, o nucleotídeo particular que será incorporado (A, C, G, T ou U) é conhecido. Pontuação co-dominante é alcançada usando pareamento, isto é, dois ou paralelos, isto é, três, flanqueiam as sequências de oligonucleotídeo. Os resultados obtidos são registrados como alelos cheios, vazios, falhos ou nulos e podem ser usados para distinguir entre genótipos heterozigotos e/ou homozigotos. Tratamentos de pós-hibridização opcionais, incluindo lavagem e digestão, são fornecidos a fim de remover a amostra de DNA não totalmente hibridizada para as sequências de oligonucleotídeo ligadas ao suporte sólido, por exemplo, antes e após a rotulação. A presença ou ausência de hibridização é registada usando um método que permite a gravação do estado de hibridização, tipicamente em um meio legível por computador.
[00215] B. Programas de Criação
[00216] Stevia é tipicamente uma espécie de cruzamento, apesar da autopolinização ser ocasionalmente observada. Assim, um programa de criação de planta Stevia tipicamente envolve o uso de um ou mais de: seleção recorrente, seleção de massa, seleção de volume, e intercruzamento. Estas técnicas podem ser usadas sozinhas ou em combinação com uma ou mais outras técnicas em um programa de criação. Ver, Yadav et al., Can. J. Plant Sci. 91: 1-27 (2011). Cada planta identificada pode ser cruzada com uma planta diferente para produzir semente, que é então germinada para formar plantas descendentes. Semente de uma ou mais plantas descendentes possuindo o fenótipo desejado e o polimorfismo desejado é composta, e em seguida, acasalada aleatoriamente para formar uma geração de descendência subsequente. O programa de criação pode repetir estas etapas durante um adicional de 0 a 5 gerações, conforme apropriado, a fim de obter a estabilidade desejada na população de plantas resultante, a qual retém os alelos polimórficos. Na maioria dos programas de criação, análises para o alelo polimórfico particular serão realizadas em cada geração, embora a análise possa ser realizada em gerações alternadas, se desejado. Autofecundação de plantas descendentes pode ser realizada para aquelas linhagens de estévia e populações em que a autofecundação é viável.
[00217] Seleção recorrente é um método usado em um programa de criação de planta para melhorar uma população de plantas. O método implica em plantas individuais cruzando polinização umas com as outras para formar a descendência. A descendência é cultivada e a descendência superior selecionada por qualquer número de métodos de seleção, que incluem planta individual, descendência de meios-irmãos, descendência de irmãos completos e descendência de autofecundação. A descendência selecionada é autopolinizada ou polinizada cruzada uma com a outra para formar descendência de outra população. Esta população é plantada e novamente plantas superiores são selecionadas para se autopolinizarem ou polinizarem de forma cruzada uma com a outra. Seleção recorrente é um processo cíclico e, portanto, pode ser repetido como tantas vezes quantas forem desejadas. O objetivo de seleção recorrente é melhorar as características de uma população. A população melhorada pode então ser usada como uma fonte de material de criação para obter novas variedades para uso comercial ou de criação, incluindo a produção de um cultivar sintético. Um cultivar sintético é a descendência resultante formada pelos intercruzamentos de diversas variedades selecionadas. O número de variedades de plantas parentais, populações, adesões selvagens, ecotipos, etc., que é usado para gerar um sintético pode variar de tão pouco como 10 a tanto quanto 500. Tipicamente, cerca de 100 a 300 variedades, populações, etc., são utilizadas um dos progenitores, para a variedade sintética. Semente do gráfico produção de semente parental de uma variedade sintética pode ser vendida para o agricultor. Alternativamente, as sementes a partir do gráfico da produção de semente parental podem, posteriormente, ser submetidas a uma ou duas gerações de multiplicação, dependendo da quantidade de sementes produzidas no gráfico parental e a procura para sementes.
[00218] Seleção de massa é uma técnica útil quando usada em conjunto com a seleção assistida por marcadores moleculares. Na seleção de massa, sementes de indivíduos são selecionadas com base no genótipo ou fenótipo. Essas sementes são selecionadas e, em seguida, texturizadas e utilizadas para cultivar a próxima geração. Seleção de massa requer crescimento de uma população de plantas em um gráfico de volume, permitindo que as plantas se autopolinizam, colhendo a semente em volume e, em seguida, utilizando uma amostra de semente colhida em volume para plantar a próxima geração. Também, em vez de autopolinização, a polinização direcionada pode ser usada como parte do programa de criação.
[00219] Assim, em algumas modalidades, um método de fazer uma linhagem de planta de Stevia ou população envolve identificar uma ou mais plantas na linhagem ou população em que a presença de um polimorfismo em um local tendo sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 90% idêntico às SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 7 está associada com variação em uma característica de interesse. As plantas identificadas são, em seguida, cruzadas com si próprias ou uma planta estévia diferente para produzir semente, e pelo menos um crescimento de planta de descendência a partir da semente é novamente cruzado com si próprio ou uma planta estévia diferente durante um adicional de 0-5 gerações para fazer uma linhagem ou população que possui o polimorfismo.
[00220] Em alguns casos, a seleção para outras características úteis é também realizada, por exemplo, seleção para resistência a doenças. A seleção para tais características pode ser realizada antes, durante ou após identificação das plantas individuais que possuem o alelo polimórfico desejado.
[00221] Técnicas de criação assistidas por marcadores podem ser utilizadas para além de, ou como uma alternativa para, outros tipos de técnicas de identificação.
[00222] A invenção será ainda descrita nos seguintes exemplos, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.
[00223] VI. Exemplos
[00224] Exemplo 1 - Construção de Genes de Caminho de Biossínteses de Caureno
[00225] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma levedura de panificação truncada HMG CoA redutase foi clonada em um vetor de plasmídeo epissomal de cópia elevada de levedura de tal modo que a sequência de codificação foi ligada operativamente a e sob o controle transcricional de um promotor que pode ser reprimido pelo aminoácido de metionina. Ver, Patentes U.S. Nos 5.460.949 e 5.306.862.
[00226] As sequências de nucleotídeos que codificam as enzimas GGPPS mostradas na Tabela 1 foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID NOs :18-25) e clonadas em um vetor E. coli de modo que a sequência de codificação foi ligada operativamente a e sob o controle transcricional de um promotor de levedura que pode ser reprimido pelo aminoácido de metionina. O nome de cada plasmídeo contendo o cassete de expressão ("vetor de entrada") é também mostrado na Tabela 1. As sequências de nucleotídeos dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas nas SEQ ID NOs: 26-33. Outros vetores de entrada foram construídos utilizando enzimas GGPPS expressas por uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Catharanthus roseus designado EV270, uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Aspergillus nidulans designado C301 e uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Xanthophyllomyces dendrorhous designado C413.
[00227] Tabela 1. Clones GGPPS
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[00228] As sequências de nucleotídeos que codificam as enzimas CDPS mostradas na Tabela 2 foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID NOs: 34-36) e clonadas em vetores de entrada de levedura. As sequências de nucleotídeos dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas nas SEQ ID NOs: 37-39. Outros vetores de entrada foram construídos utilizando enzimas CDPS expressas por uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Arabidopsis thaliana designado EV64, uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Zea mays designado EV65 e uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Lycopersicon esculentum designado EV66.
[00229] Tabela 2. Clones CDPS
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[00230] As sequências de nucleotídeos que codificam as enzimas KS mostradas na Tabela 3 foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID NOs: 40-43) e clonadas em vetores de entrada de levedura. As sequências de nucleotídeos dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas nas SEQ ID NOs: 44-47. Outros vetores de entrada foram construídos utilizando enzimas KS expressas por uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Arabidopsis thaliana designado EV70, uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Cucurbita maxima designado EV71 e uma sequência de nucleotídeo não-modificada a partir de Cucumis sativus designado EV72.
[00231] Tabela 3. Clones KS
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[00232] As sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas de fusão CDPS-KS mostradas na Tabela 4 foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID Nos: 48 e 49) e clonadas em vetores de entrada de levedura. As sequências de nucleotídeo dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas nas SEQ ID NOs: 50 e 51.
[00233] Tabela 4. Clones CDPS-KS
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[00234] As sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas KO mostradas na Tabela 5 foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID NOs: 52-55) e clonadas em vetores de entrada de levedura. As sequências de nucleotídeo dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas nas SEQ ID NOs: 56-59.
[00235] Tabela 5. Clones KO
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[00236] As sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas KAH mostradas na Tabela 6 foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID NOs: 60-64) e clonadas em vetores de entrada de levedura. As sequências de nucleotídeo dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas nas SEQ ID NOs: 65-69.
[00237] Tabela 6. Clones KAH
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* = Sequência é mostrada na Publicação de Patente U.S. No. 2008-0064063.
[00238] As sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas CPR mostradas na Tabela 7 foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID NOs: 70-72) e clonadas em vetores de entrada de levedura. As sequências de nucleotídeo dos organismos de origem a partir dos quais os polipeptídeos foram originalmente identificados são apresentadas nas SEQ ID NOs:73-75.
[00239] Tabela 7. Clones CPR
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[00240] Exemplo 2 - Construção de Genes de Caminho de Glicosídeo de Esteviol
[00241] Os vetores de integração que contêm sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas UGT85C2 e UGT74G1 listadas na Tabela 8 foram transformados em levedura. Transformantes foram obtidos contendo UGT85C2, ou UGT85C2 e UGT74G1, integrados no genoma.
[00242] Tabela 8. Clones UGT
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[00243] As sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas IP3GGT e UGT94B1 R25S foram modificadas para a expressão em levedura (ver SEQ ID NOs: 77 e 79) e clonadas em vetores de entrada de levedura. As sequências de aminoácido para IP3GGT e UGT94B1 R35S são apresentadas nas SEQ ID NOs:76 e 78, respectivamente. O vetor epissomal de alta cópia contendo uma sequência de nucleotídeo IP3GGT modificada foi designado pEF1155. O vetor epissomal de alta cópia contendo uma sequência de nucleotídeo UGT94B1 R25S modificada foi designado pEF1156.
[00244] Exemplo 3 - Construção de Cepas de Levedura
[00245] Uma cepa de levedura designada EFSC301 foi modificada substituindo o promotor ERG9endógeno com o promotor CUP1 induzível por cobre. Cepa EFSC301 é um derivado da coleção EUROSCARF de cepa de levedura BY4742. Ver, a página da web em uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/by.html. Em meio de crescimento de levedura padrão, o gene ERG9 é transcrito em níveis muitos baixos, uma vez que a concentração de cobre em tal meio era baixa. A diminuição na produção de ergosterol nesta cepa resulta em quantidades aumentadas de unidades de isopreno disponíveis para biossínteses de esteviol. A cepa de levedura foi também modificada genomicamente integrando os genes Stevia UGT85C2 e UGT74G1, cada um sob o controle transcricional de promotor GPD1 constitutivo forte. Ver Tabela 8. A cepa possui uma cópia de cada um dos genes Stevia UGT85C2 e UGT74G1 integrados no genoma de cepa MUS1241.
[00246] Exemplo 4 - Análises de Expressão de Gene de Caminho de Glicosídeo de Esteviol em Levedura
[00247] Para examinar as biossínteses de glicosídeo de esteviol em levedura, os cassetes de expressão dos vetores de entrada 36 das Tabelas 1-7 e Exemplo 1 foram aleatoriamente concatenados em reações de ligação para criar cromossomos de levedura artificial (“eYACs”). O processo é mostrado esquematicamente na FIG 5.
[00248] Dois conjuntos diferentes de ligações foram realizados. Conjunto de ligação A incluiu todos os genes listados nas Tabelas 1-7, exceto que nenhum gene CDPS-KS bifunctional (Tabela 4) foi incluído. Conjunto de ligação B incluiu todos os genes listados nas Tabelas 1-7, exceto que nenhum dos genes CDPS e KS monofuncionais (Tabelas 2-3) foi incluído.
[00249] A cerca de 30 a 200 μg de DNA foram preparados a partir de cada um dos vetores de entrada contendo cassete. Os cassetes de expressão de gene foram liberados a partir de cada vetor por digestão com a enzima de restrição AscI. Os cassetes foram, em seguida, aleatoriamente concatenados em eYACs por ligação com T4 ligase em uma reação de 3 horas. O sucesso da reação de concatenação foi avaliado pela viscosidade da mistura de reação, uma vez que o DNA concatenado é altamente viscoso. Fragmentos de DNA (“braços”) contendo um centrômero, dois telômeros e os marcadores de seleção LEU2 e TRP1 foram adicionados à extremidade dos cassetes de expressão concatenados, desse modo criando eYACs funcional.
[00250] Os eYACs foram transformados em esferoplastos da cepa de levedura competente MUS1243 por digestão zimoliase da parede de célula de levedura, seguidos pelo tratamento com um tampão CaCl2/PEG, tornando os esferoplastos permeáveis a grandes moléculas, tal como eYACs.
[00251] Após transformação, os esferoplastos de levedura foram embebidos em um ágar nobre com base em meio de crescimento sólido, em que regeneração da parede celular pode ocorrer. Colônias apareceram a partir de 4-8 dias após inoculação. No meio de regeneração faltou os aminoácidos de leucina e triptofano, assim selecionando para a presença de eYACs armados duplamente nas células de levedura.
[00252] Cerca de 3.000 transformantes foram obtidos para cada conjunto. Cada transformante foi relistado e testado para marcadores de cepa de levedura e a presença genética de ambos os braços de eYAC, isto é, os marcadores LEU2 e TRP1. Mais do que 97% dos transformantes tinham o genótipo correto. A cada transformante foi dado um número de designação acCEY.
[00253] Inicialmente, 24 CEYs a partir de cada conjunto foram crescidos durante 24 horas em 2 ml de Meio Completo Sintético (SC), sem metionina, assim como para induzir a expressão do gene a partir de eYACs. Após 24 horas, o sobrenadante de cada cultura foi coletado e submetido a LC-MS (Análises de Espectrometria de Massa acopladas à Cromatografia Líquida (Triplo Quádroplo)) durante a presença de rubusosídeo. Uma vez que os genes Stevia UGT74G1 e UGT85C2 são co-expressados em cada transformante CEY, o produto de extremidade esperado quando esteviol é produzido é rubusosídeo (esteviol-(13-β-D- glucopiranossil0xi)-β-D-glucopiranosil éster).
[00254] Nenhum dos CEYs a partir do conjunto B produziu níveis detectáveis de rubusosídeo, enquanto 7 de CEYs a partir do conjunto A não produziu. Cepa CEY19 foi o produtor superior. CEY19 produziu um composto com uma massa de 665.2, que poderia corresponder a um aducto de sódio de rubusosídeo. Um composto com uma massa de 643.2 também foi visto, e provavelmente corresponde ao rubusosídeo protonado. O fracionamento molecular com base em MS-MS do composto de massa 665.2 resultou em uma quebra de massa de 503.2, que corresponde ao monosídeo de esteviol como um aducto de sódio. Uma vez que a massa, o padrão de fracionamento, o espectro de HPLC, e o padrão de retenção deste composto corresponderam exatamente aquele padrão de rubusosídeo produzido in vitro pela glicosilação de esteviol usando enzimas Stevia 85C2 e 74G1, o composto produzido por CEY foi determinado para ser rubusosídeo.
[00255] Avaliação adicional para produção de rubusosídeo
[00256] Um adicional de 95 clones a partir do conjunto A e 95 clones a partir do conjunto B foram crescidos em 96 bandejas de cavidade profunda em 1 ml de meio SC sem metionina. Sobrenadantes de cada uma dessas culturas foram combinados em poços de dois clones, analisados por LC-MS, e a relação do sinal/barulho de MS foi determinada. A relação MS s/n é uma medida aproximada do conteúdo relativo de rubusosídeo. Quando um poço de 2 CEYs foi encontrado para produzir rubusosídeo, cada clone naquele poço foi analisado separadamente. Os resultados mostraram que nenhum conjunto B CEYs produziu rubusosídeo, enquanto pelo menos 28 CEYs a partir do conjunto A produziram níveis detectáveis de rubusosídeo.
[00257] Identificação de genes presentes em rubusosídeo produzindo clones CEY
[00258] Para correlacionar o conteúdo de gene de eYACs para produção de rubusosídeo, um protocolo de PCR foi desenvolvido em que fragmentos de tamanhos similares (0,5 kb) de todos os genes nascidos eYAC possíveis poderiam ser amplificados. Iniciadores internos de 20-25 nt foram colocados de modo que uma temperatura de anelação similar poderia ser usada para amplificar todos os genes. DNA genômico, que inclui eYAC DNA, foi preparado a partir de 4 CEYs com nenhuma produção de rubusosídeo, 4 com baixa produção de rubusosídeo e 6 com alta a cada produção de rubusosídeo alta. Usando quantidades equimolares dessas preparações de 14 DNA, PCR analítica foi realizada durante todos os 37 genes para esses 14 CEYs, bem como controles positivos e negativos. Todos os genes foram amplificados exceto um, aparentemente devido à falha do iniciador.
[00259] Os genes presentes nas seis cepas CEY produzindo alto rubusosídeo são mostrados na Tabela 9. Os genes presentes nas oito cepas CEY produzindo baixo ou nenhum rubusosídeo são mostrados na Tabela 10.
[00260] Tabela 9. Genes Presentes nas Cepas CEY produzindo Alto Rubusosídeo
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[00261] Tabela 10. Genes Presentes em Cepas CEY produzindo Baixo ou Nenhum Rubusosídeo
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[00262] Exemplo 5 - Modificação de Condições de Cultura de Levedura
[00263] Experimentos foram realizados com cepa CEY213 a fim de determinar as condições de cultura úteis para máxima produção de rubusosídeo. O material de partida foi um estoque de congelador de glicerol (-80°C) de CEY213. Células congeladas originalmente se originam de uma placa de ágar contendo meio de levedura SC sem triptofano, leucina e histidina (SC-TLH), e contendo 2 mM de metionina. Cinco ml de meio SC-TLH líquido contendo 2 mM de metionina foram inoculados com um loop completo de células de levedura CEY213 de estoque congelado. Expressão eYAC em CEY213 é reprimida sob essas condições. As células foram crescidas durante a noite a 30° C com baixa agitação (170 rpm) e foram designadas como “preculturas”.
[00264] As preculturas CEY 213 foram utilizadas para inocular 25-50 ml de meio SC sem metionina, em que os parâmetros indicados abaixo foram variados. Produção de rubusosídeo sob cada uma das condições de crescimento foi medida por centrifugação de 500 μl de cada meio de cultura, transferindo 250 μl do sobrenadante para um novo tubo, adicionando 250 μl de metanol, agitando através e centrifugando durante 10 minutos à velocidade máxima. Uma alíquota do sobrenadante foi analisada durante produção de rubusosídeo por LC-MS.
[00265] Níveis de Cobre
[00266] Preculturas CEY213 foram crescidas em meio SC ao qual 50 μM de ácido batocuproinadissulfônico foram adicionados. Ácido de batocuproinodissulfônico sofreu quelação de cobre no meio de crescimento. O gene ERG9 em CEY213 foi mofificado de modo que a expressão é controlada pelo promotor CUP1. Uma diminuição nos níveis de cobre no meio irá ainda diminuir a atividade ERG9 e, desse modo aumentar a quantidade de unidades de isopreno disponíveis para biossínteses de esteviol.
[00267] Quelação de íons de cobre no meio de crescimento tinha um efeito danoso sobre o crescimento da cultura de célula e produção de rubusosídeo foi proporcionalmente diminuída. Esses resultados sugeriram que mesmo sem quelação de cobre, cepa CEY213 está na sua taxa mínima de biossíntese de ergosterol, e mais nenhuma unidade de isopreno pode ser divergida das biossínteses de ergosterol através da produção de glicosídeo de esteviol.
[00268] Glicose
[00269] Duplicar a glicose disponível a partir de 2 a 4% tinha um efeito marginal sobre a produção de rubusosídeo, um aumento de cerca de 5-10% na produção de rubusosídeo.
[00270] Limitação do nitrogênio disponível
[00271] Preculturas de CEY213 foram crescidas sob condições de nitrogênio disponível limitado. Limitação do nitrogênio durante crescimento de levedura em cultura é conhecida para aumentar a produção de ergosterol. Quando a concentração de NH4SO4 foi diminuída a partir de 4g/l para 2, 1 ou 0,4 g/l, a taxa de crescimento de CEY213 diminuiu na proporção para a quantidade de nitrogênio. Produção de rubusosídeo proporcionalmente diminuiu com a diminuição no crescimento.
[00272] Aeração de culturas
[00273] CEY213 foi crescido em frascos de Ehrlenmeyer com ou sem paredes defletoras. Os resultados indicaram que houve um melhor efeito marginal de aeração aumentada através do uso de paredes defletoras. Se em algum lugar, a falta de aeração através da falta de paredes defletoras pode aumentar a produção.
[00274] Densidade Óptica na Iniciação, Tempo de Fermentação e Temperatura de Crescimento
[00275] Culturas foram iniciadas em duas diferentes densidades ópticas, OD600=0,1 ou OD600=1,0 de CEY213 preculturada. Fermentação foi, em seguida, realizada durante 24, 48, 72 ou 144 horas a uma temperatura de 20, 25 ou 30° C.
[00276] Como mostrado na FIG 6, a densidade da cultura de batelada no início da fermentação, a temperatura de cultura e o comprimento do tempo na fermentação, em combinação, tinha um efeito significante na quantidade de rubusosídeo produzida por CEY213. Assim, 144 horas de crescimento de uma cultura com uma densidade de partida de OD6oo=1,0, a 30° C, resultaram na produção de menos do que cerca de 8,5 mgs/litro de rubusosídeo.
[00277] Exemplo 6 - Produção em Larga Escala de Rubusosídeo
[00278] Uma série de experimentos de fermentação com CEY213 foi realizada usando 3 tipos de meio de levedura (meio rico e dois tipos de meio sintético), variando densidade de inoculação, e alterando tempo da expressão do cassete de gene eYAC.
[00279] Condições de Fermentação de Batelada
[00280] Fermentação de batelada foi realizada por centrifugação de uma precultura CEY213, descartando o sobrenadante e ressuspendendo as células em 6 litros de meio SC-TLH contendo 100 μM de metionina e 4% de glicose. O OD600 foi ajustado para 1,0 em um frasco de Ehrlenmeyer de 100 ml sem baffles e as células foram deixadas crescer durante 144 horas a 30° C com baixa agitação.
[00281] Recuperação de Rubusosídeo
[00282] Após fermentação, a cultura foi centrifugada e o sobrenadante foi misturado com um volume igual de metanol, agitado através, e centrifugado para remover o material precipitado. O sobrenadante resultante foi purificado por cromatografia de coluna flash C18-sílica com metanol como o eluente, seguido por HPLC preparativa para obter um composto principal, com um composto menor adicional detectado.
[00283] O composto purificado foi analisado por 1H e 13C NMR, e os dados são mostrados na FIG. 7. O composto foi confirmado para ser rubusosídeo com base na comparação para valores de literatura 1H e 13C NMR para rubusosídeo. Análises quantitativas indicaram que fermentação CEY213 produziu 12,8 mgs/litro de rubusosídeo.
[00284] Exemplo 7 - Atividade IP3GGT
[00285] 1. Atividade Enzimática de Ipomoea purpurea 3GGT glicosiltransferase in vitro
[00286] A atividade enzimática de Ipomoea purpurea 3GGT glicosiltransferase (IP3GGT) usando esteviol como um substrato foi determinada in vitro. Genes para Stevia rebaudiana UGT85C2 e IP3GGT glicosiltransferase foram, cada um, expressos em E. coli e cada enzima foi purificada.
[00287] A reação enzimática foi realizada em duas etapas. Primeira, 0,5 mM de esteviol (total de 9,55 mgs) foi incubado com cerca de 0,5 μg de enzima UGT85C2 durante 16 horas a 30°C em um tampão de reação (contendo 1 mM de UDP-glicose, 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de MgCl2, 1 mM de KCl, 0,1 de U/ul fosfatase de intestino de bezerro). Em seguida, cerca de 0,5 μg de enzima IP3GGT foi adicionado e a mistura de reação incubada durante 20 horas adicionais a 30°C.
[00288] Análises dos produtos de reação indicaram cerca de 100% da conversão de esteviol para esteviol-13-O-monosídeo, 25% das quais foram ainda glicosiladas em estevio-13-O-1,2-biosídeo. O esteviol-13-O-1,2-biosídeo teórico rendeu cerca de 4,8 mg. A mistura de reação foi, em seguida, submetida à HPLC preparativa, que rendeu 2,5 mg de esteviol-13-O-1,2-biosídeo (rendimento de purificação de 52%). Usando LC-MS, a massa do composto purificado tinha um tempo de retenção diferente do que rubusosídeo e esteviol-13-O-1,3-biosídeo. O composto purificado foi submetido a 1H NMR, coerência quântica única heteronuclear (HSQC)- NMR e análises (HMBC)-NMR de correlação de ligação múltipla heteronuclear, que confirmaram que o composto era esteviol-13-O-1,2-biosídeo.
[00289] 2. Expressão in vivo de IP3GGT em esteviol - ou monosídeo de esteviol -levedura alimentada
[00290] Para determinar se o IP3GGT foi ativo em levedura, os 2 μ de alto plasmídeo de cópia (epissomal), pMUS10, contendo uma sequência de codificação IP3GGT não-modificada operavelmente ligada a um promotor GPD1 forte que foi transformado na cepa de levedura MUS1245. MUS1245 contém um cassete de expressão UGT85C2 genomicamente integrado. A cepa de levedura resultante foi crescida em meio SC sem histidina para selecionar para a presença continuada do plasmídeo de expressão IP3GGT, a uma densidade de partida de OD600=0,2. Esteviol ou monosídeo de esteviol foi adicionado ao meio a 3 mM. Após crescimento durante 72 horas a 30°C, sobrenadantes de cultura foram ensaiados durante a presença de esteviol e glicosídeos de esteviol por HPLC.
[00291] Análises de LC-MS indicaram que nenhum esteviol-13-O-glicosídeo 1,2-glucosilado foi detectado após alimentação com esteviol, embora esteviol-13-O- monosídeo pudesse ser detectado. Em contraste, baixas, mas quantidades detectáveis do 1,2-biosídeo de esteviol foram produzidas por MUS1245 realizando pMUS10 após alimentação com esteviol-13-O-monosídeo. Esses resultados mostraram que a sequência de codificação Ipomoea purpurea 3GGT nativa é expressada em levedura a níveis suficientes para obter conversão in vivo detectável de monosídeo de esteviol para 1,2-biosídeo de esteviol.
[00292] Exemplo 8 - Modificação de Cepas de Levedura
[00293] EXG1 e EXG2
[00294] S. cerevisiae pode conter enzimas que degradam as ligações de açúcar 1,2 ou 1,3 em esteviol 1,2- e esteviol 1,3-biosídeos. Para testar esta possibilidade, cepa de levedura CEY213 foi crescida durante 3 dias a 30°C sobre meio contendo 0,1 mM de cada um dos dois biosídeos. Análises de LC-MS da cultura mostraram o nível de 1,2-biosídeo para ser estável, se a 1,3-ligação no 1,3-biosídeo apareceu para completamente hidrolisar dentro dos limites de detecção do ensaio.
[00295] Vinte e cinco mutantes S. cerevisiae, cada um, interrompido em um gene hidrolase de glicosídeo conhecido ou putativo, foram examinados durante sua capacidade de degradar os biosídeos de esteviol. Uma cultura de cada mutante de levedura foi crescida como descrito acima em meio contendo 1,3-biosídeo de esteviol e analisada por LC-MS. A cepa de levedura realizou uma mutação no gene EXG1 (exo-1,3-β-glucanase) que foi encontrado ter mais perda da atividade de hidrolisação de 1,3-biosídeo. A sequência de nucleotídeo do gene EXG1 de levedura é relatada em Vazquez de Aldana et al. Gene 97:173-182 (1991). A cepa de levedura realizou uma mutação no gene EXG2 (outra exo-1,3-β-glucanase) mostrou uma pequena diminuição na atividade de hidrolisação. Correa, et al., Current Genetics 22:283-288 (1992).
[00296] Uma dupla cepa de levedura mutante (exg1 exg2) foi realizada. Quando a dupla cepa de levedura foi crescida em meio contendo 1,3-biosídeo de esteviol, nenhuma hidrólise de biosídeo foi detectada.
[00297] Exemplo 9 - Titulação Aumentada de Biossíntese de Esteviol
[00298] Clones individuais de enzimas cada uma das diferentes classes de enzima testadas no Exemplo 4 (e Tabela 11) foram examinados utilizando tecnologia eYAC para identificar clones específicos que apresentaram a maior produção de esteviol a partir de isopentenil pirofosfato e farnesil pirofosfato. As enzimas GGPPS, KO e KAH foram testadas em eYACs, individualmente ou no caso de enzimas GGPPS individualmente ou em conjuntos de dois (por exemplo, GGPPS Synechococcus sp. + S. acidocaldarius ou GGPPS Aspergillus nidulans sozinho), em uma cepa de S. cerevisiae expressando todas as etapas enzimáticas restantes no caminho de esteviol. Os resultados indicaram que o clone de GGPPS Synechococcus spp. MM-7 (codificado pela SEQ ID NO: 24) foi o mais eficiente. Clones de GGPPS de Aspergillus nidulans e Sulfulobus acidocaldarius também foram muito ativos. Os resultados também indicaram que entre os clones KO e KAH, o clone KO de estévia MM-18 (codificado pela SEQ ID NO: 52) e o clone KAH de A. thaliana MM-24 (codificado pela SEQ ID NO: 62) resultaram na maior produção de esteviol.
[00299] Tabela 11.
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* Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 20080064063
[00300] A cepa de S. cerevisiae CEY213, descrita no Exemplo 4, foi transformada com plasmídeo de alta cópia portando um dos genes CDPS ou KS mostrados na Tabela 11, operacionalmente ligados ao promotor GPD1 forte. Experimentos preliminares indicaram que sobre-espressão do CDPS de Stevia rebaudiana (CDPS-1, codificado pela SEQ ID NO: 34) em CEY213 gerou um aumento na produção rubusosídeo em relação a CEY213 que não tinha CDPS-1 e alta cópia sobre-expressando plasmídeo. Os experimentos também indicaram que KO de Stevia rebaudiana (KO-1, codificado pela SEQ ID NO: 52) foi o KO mais ativo KO dos dois testados.
[00301] Para construir uma cepa de levedura com níveis consistentemente altos de produção de glicosídeo de esteviol, cassetes de expressão contendo o clone GGPPS-10, o clone KO-1 (SEQ ID NO: 52) e o clone KAH-3 (SEQ ID NO: 62) foram estavelmente integrados no genoma da cepa de S. cerevisiae CEN.PK 111-61A. A expressão destes cassetes foi conduzida pelos promotores GPD1 e TPI1 constitutivos. Além disso, cassetes de expressão contendo KS-1 (SEQ ID NO: 40), CDPS-1 (SEQ ID NO: 34) e UGT74G1 (SEQ ID NO: 2) foram estavelmente integrados no genoma. A cepa de levedura resultante, EFSC1751, no entanto, não produziu qualquer esteviol-19-O-monosídeo quando cultivada em escala de laboratório sob as condições descritas no Exemplo 6.
[00302] Para determinar a base para ausência de produção de glicosídeo de esteviol em EFSC1751, os genes CDPS-3, CDPS -4, CDPS -5 e CPR-1, sozinhos ou em combinação, foram expressos na cepa EFSC1751. CPR-1 é de Stevia rebaudiana e sua sequência pode ser encontrada em Genbank Accession DQ269454.4. Os resultados mostraram que CPR-1, quando expressos com CDPS-3, CDPS-4 ou CDPS-5, resultou na produção de esteviol-19-O-monosídeo em EFSC1751. Nenhum destes genes sozinho na mesma cepa resultou em produção. Estes resultados indicam que a cópia genomicamente integrada de CDPS-1, enzima de Stevia, é não- funcional neste constructo de levedura, enquanto os clones CDPS de Bradyrhizobium, Arabidopsis ou Zea eram funcionais neste constructo. Além disso, os genes KAH e/ou KO derivados de plantas integrados no cromossomo para este constructo parecem requerer um CPR exógeno para atividade. O CPR de Giberella fujikuroi (MM-29) também parece ser capaz de trabalhar com polipeptídeos KAH e/ou KO derivados de planta.
[00303] Os dois candidatos de GGPPS principais, GGPPS-6 (codificado pela SEQ ID NO: 23) e GGPPS-7 (codificado pela SEQ ID NO: 24), foram adicionalmente expressos individualmente em uma cepa de S. cerevisiae que possui um caminho de glicosídeo de esteviol funcional (incluindo UGT74G1) mas nenhum gene GGPPS. Os transformantes foram então analisados quanto à produção de 19-SMG por análise de LC-MS de amostras de cultura que foram fervidas em 50% de DMSO por 5 minutos e centrifugadas em força centrífuga relativa de 16000 (RCF) por 5 minutos. Foi descoberto que muitos transformantes contendo o GGPPS-6-expressando plasmídeo não produziram 19-SMG.
[00304] Muito poucos transformantes foram obtidos contendo GGPPS-7, indicando que GGPPS-7 (Synechococcus sp.) pode ser mais ativo do que as duas enzimas, e que a atividade poderia ser alta o suficiente para conferir toxicidade. Por exemplo, um aumento dramático na produção de GGPP poderia resultar em um dreno no caminho a jusante, tal como produção de ergosterol. Para testar esta hipótese, um gene UPC2-1 foi co-expresso com GGPPS-7, e alimentação de ergosterol das células foi tentada para verificar se iria resgatar o crescimento das células. No entanto, o crescimento celular não foi resgatado.
[00305] Toxicidade celular também pode ser devido a uma acumulação de GGPP ou um metabólito de GGPP. Para testar esta hipótese, CDPS-5 foi adicionalmente sobre-expresso no GGPPS-7-expressando cepa de levedura para verificar se a toxicidade pode ser aliviada por aumento no uso de GGPP. Sobre- expressão de CDPS5 pareceu resgatar o crescimento até certo ponto, uma vez que os transformantes com um plasmídeo sobre-expressando esta enzima junto com o GGPPS-7 deu origem a algumas colônias. A variedade de transformantes ainda foi baixa. Sobre-expressão de CDPS-5 em uma cepa similar, mas com GGPPS-10 em vez de GGPPS-7, resultou em uma produção dobrada de glicosídeo de esteviol, e estes resultados juntos podem sugerir que CDPS é um gargalo limitante no caminho de biossíntese de glicosídeo de esteviol introduzido.
[00306] Em resumo, com base na produção de 19-SMG ou rubusosídeo em culturas celulares de tubo de teste a 30°C com meio de levedura + 2% de glicose, por 24-72 horas, as seguintes conclusões foram feitas com os constructos de eYAC: KS- 1 (Stevia rebaudiana, codificado pela SEQ ID NO: 40), KO-1 (S. rebaudiana, codificado pela SEQ ID NO: 52) e KAH-1 (S. rebaudiana) ou KAH-3 (Arabidopsis thaliana, codificado pela SEQ ID NO: 62) parecem ser as melhores combinações para o caminho de esteviol. GGPPS-7 (Synechococcus sp.) parece apresentar a quantidade mais alta de atividade para esta etapa, mas se gargalos a jusante ocorrem, sobre-expressão também pode levar à toxicidade e níveis globais mais baixos de glicosídeos de esteviol. Todas as combinações de análogos de gene CDPS e CPR foram testadas e foi descoberto que todos os 3 CPRs na Tabela 11 eram ativos, e que combinações de CPR-1 (S. rebaudiana, codificado pela SEQ ID NO: 70) ou CPR-3 (Gibberella fujikuroi, codificado pela SEQ ID NO: 72) com CDPS-5 (Zea mays) ou CDPS-4 (A. thaliana) foram particularmente úteis. CDPS-5 parece ser o CDPS ideal no caminho. Combinações podem ser adicionalmente testadas em uma cepa repórter com fluxo reduzido para caminhos de esterol.
[00307] Para investigar o potencial para atividade de CDPS ainda mais alta do Zea mays (CDPS-5), este gene foi expresso a partir de um plasmídeo multicópia de 2micra utilizando o promotor GPD, com e sem um peptídeo de sinal de plastídeo, para determinar se a atividade é mais alta no citoplasma quando sequências de direcionamento são removidas. A sequência de nucleotídeo e sequência de aminoácido do CDPS-5 a partir de Zea mays e contendo o peptídeo de sinal de cloroplasto são apresentadas nas SEQ ID NOs:80 e 81, respectivamente. O peptídeo de sinal de cloroplasto é codificado pelos nucleotídeos 1-150 da SEQ ID NO: 80, e corresponde aos aminoácidos 1 a 50 da SEQ ID NO: 81. O plasmídeo foi transformado na cepa produtora de rubusosídeo estável (EFSC1859) que possui GGPPS-10, CDPS-5, KS-1, KO-1, KAH-3, CPR-1 e UGT74G1 (SEQ ID NO: 2) integrados no genoma e expressos a partir dos promotores GPD e TPI constitutivos fortes. Além disso, na cepa EFSC1859, a expressão de esqualeno sintase, que é codificada por ERG9, foi sub-regulada através de deslocamento do promotor endógeno com o promotor CUP1 induzível. Além destes genes, a cepa EFSC1859 também expressa UGT85C2 (SEQ ID NO: 3) a partir de um vetor multicópia de 2micra utilizando um promotor GPD1. Produção de rubusosídeo e 19-SMG foi medida por LC-MS para estimar o nível de produção. A remoção da sequência líder de plastídeo não pareceu aumentar a produção de glicosídeo de esteviol em comparação à sequência de tipo selvagem. No entanto, este trabalho demonstra que as sequências líder podem ser removidas sem gerar perda da função do caminho de esteviol.
[00308] Da mesma forma, os plasmídeos foram construídos para CPR-3, KAH-3 e KO-1 sem sequências de ancoragem de membrana (isto é, nucleotídeos 463 da SEQ ID NO: 72; nucleotídeos 4-87 da SEQ ID NO: 62; e nucleotídeos 1-117 da SEQ ID NO: 52) e foram transformados na cepa EFSC1859 com o UGT85C2 integrado no cromossomo em vez de em um plasmídeo. Espera-se que estas enzimas sejam funcionais sem a sequência de ancoragem.
[00309] Exemplo 10 - Identificação de Sequências de esteviol-1,3-O- Monoglicosídeo 1,2-Glicosiltransferase
[00310] Análise de Stevia EST
[00311] Uma pesquisa de tBLASTN de uma folha de estévia (Stevia rebaudiana) de base de dados EST (Expressed Sequências Tags - Etiquetas de Sequência Expressa) (Brandle et al., Plant Mol. Biol. 50:613-622, 2002) foi realizada utilizando Ipomoea completa (Ipomoea purpurea) UGT79 tipo UGT (IP3GGT), Bellis (Bellis perennis) UGT94B1, Stevia UGT79A2, Stevia UGT76G1 e Stevia UGT91D1 sequências de aminoácido como consulta, assim representando UGTs a partir de toda família de subfamílias de 1 glicosiltransferase conhecidas por conter diglicosiltransferases. Sequências parciais para 9 genes UGT previamente descritos foram identificadas. Uma das sequências parciais foi a partir da subfamília UGT 79 (“79-EV1”), uma a partir da subfamília UGT 76 (“76-EV1”) e duas a partir da subfamília UGT 91 (“91-EV-1” e “91-EV2”), bem como os membros das subfamílias UGT 71, 72, 78, 84 e 88. Sete das sequências parciais foram isoladas utilizando cDNA de estévia ou bibliotecas cDNA como o modelo PCR para isolamento. Além disso, dois membros de Stevia da subfamília UGT 76 foram isolados, acesso GenBank ACT33422.1 que é um membro da subfamília 76G1 (Mohankumar), e acesso GenBank ACM47734.1 que é um membro da subfamília 76G2 (Yang).
[00312] Pirossequenciamento
[00313] Clones UGT adicionais foram identificados e isolados através do desempenho de pirossequenciamento com cDNA de estévia como segue. mRNA de estévia foi preparado a partir de folhas de estévia, utilizando o kit de preparação de mRNA Ambion® Micro Poly Purist™. Como um controle de qualidade, mRNA reverso transcrito foi testado para uma presença dos genes UGT de caminho de Rebaudiosídeo A de estévia 85C2, 74G1 e 76G1, empregando PCR analítico com iniciadores de oligonucleotídeo idênticos aos nucleotídeos 21 na terminação 5’- e 3’- de cada sequência. O mRNA de comprimento total amplificado foi então utilizado para pirossequenciamento e montagem contig (MOgene, St. Louis, MO USA). Cerca de 3,4 milhões de leituras de um comprimento médio de 393 nucleotídeos foram desempenhadas, e as sequências brutas resultantes utilizadas para se obter sequências contigs 25907. Uma base de dados foi construída, contendo sequências publicamente disponíveis de aminoácido de um total de cerca de 1.500 UGTs. Cerca de 150 dos UGTs sequenciados foram UGTs totalmente anotados a partir de uma ampla variedade de sub-famílias. Os UGTs sequenciados restantes foram parcialmente homólogos anotados destes. Uma pesquisa BLASTX foi desempenhada (CLC Genomics, Muehltal, Germany), utilizando as contigs 25907 Stevia EST como consulta, à base de dados de UGT fabricada (Código genético = 1, baixa complexidade = Sim, Valor esperado = 10.0, Tamanho da palavra = 3, No. de processadores = 2, Matrix = BLOSUM62, Custo de intervalo (abrir) = 11, custo de intervalo (extensão = 1). Os resultados sugerem que as sequências para mais de 90 UGTs previamente conhecidas de estévia foram apresentadas na base de dados de pirossequenciamento.
[00314] Nenhum membro adicional da subfamília UGT 79 ou da subfamília UGT 94 foi identificado na base de dados de pirossequenciamento. No entanto, a análise mostrou novos membros das sub-famílias UGT 76 e 91. Para alguns dos genes, todos os dados de sequências de comprimento total foram imediatamente disponíveis a partir dos dados EST de pirossequenciamento EST. Uma biblioteca cDNA de plasmídeo de estévia previamente construída foi utilizada para obter as sequências de comprimento para aqueles membros para os quais os dados de sequências parciais foram obtidos. Um iniciador de oligonucleotídeo idêntico para cada sequência parcial UGT específica foi combinado com um iniciador de oligonucleotídeo idêntico das sequências vetores de plasmídeo da biblioteca. Estes iniciadores foram empregados em PCR para obter o produto de comprimento total, que foi subsequentemente sequenciado. Com base nas sequências de comprimento total, uma segunda PCR foi desempenhada utilizando uma enzima de polimerase à prova de leitura de PCR para amplificação do gente UGT de comprimento total a partir de uma biblioteca de cDNA de estévia como o modelo para a reação. Utilizando esta estratégia, cinco membros da subfamília UGT 76, seis membros da subfamília UGT 91, bem como dez membros de outras sub-famílias UGT foram isolados.
[00315] Cada uma das 7 UGTs identificadas a partir da base de dados de Stevia EST, as 2 sequências Stevia UGT 76 publicamente disponíveis, e as 21 UGTs identificadas a partir de pirossequenciamento foram clonadas em vetores de expressão E. coli pET30A+ ou pETDuet (fazendo uso de HIS-tag para propósitos de purificação) e expressas nas cadeias de autólise propensa de E. coli XjA e XjB. Para um grande número destas UGTs, a expressão da proteína UGT resultou na formação de corpos de inclusão. A fim de sobrepor a formação destes corpos de inclusão, alguns destes IGTs foram expressos na cadeia de expressão de baixa temperatura “Arctic Express” (Agilent Technologies). Para aqueles que falharam para expressar neste sistema, a transcrição por translação in vitro acoplada de produtos PCR (TNT®T7 Quick para kit PCR DNA, Promega) foi tentada, permitindo a expressão bem- sucedida dos UGTs restantes. A eficácia da reação foi garantida rotulando com 35S- metionina, separação em SDS-PAGE e detecção de fosfo imagem de uma banda da proteína do tamanho esperado para a proteína UGT em questão.
[00316] Os polipeptídeos de UGT a partir de cada clone, expressos como descritos acima, foram testados para atividade de 1,2-glicosilação, utilizando esteviol- 13-O-monoglicosídeo como substrato. Proteína in vitro transladada / transcrita, correspondendo a aproximadamente um quinto da proteína total formada em uma reação de 25 μL, foi utilizada em uma reação in vitro, utilizando 0,5 mM esteviol-13- O-monoglicosídeo (SMG) como substrato, em um tampão de reação (contendo 1 mM de UDP-glicose, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2, 1 mM KCl, 0,1 U/μl de fosfatase intestinal de vitela). A mistura de reação foi incubada em 30 °C por 20 horas. A mistura de reação foi a seguir analisada por análise de LC-MS para uma presença de esteviol-1,2-biosídeo. A análise de LC-MS foi desempenhada utilizando um sistema HPLC Agilent Série 1100 (Agilent Technologies) adaptada com a coluna de Sinergia Phenomenex® Hidro-RP (250 x 3 mm, partículas de 3 μm, tamanho de poro de 80 A) e hifenizada a um espectrômetro de massa quadropole triplo TSQ Quantum (ThermoFisher Scientific) com ionização por electrospray. A eluição foi realizada utilizando uma fase móvel (30 °C) contendo MeCN (0.01% ácido fórmico) e H2O (0,01% ácido fórmico) aplicando um gradiente composto de 0,6 ^ 0,4 ml/min, 5 % MeCN por 4 min; 0.4 ml/ min, 5 ^ 40 % MeCN por 2 min; 0,4 ml/min, 40 ^ 55 % MeCN por 11 min; 0,4 ^ 1,0 ml/min, 55 ^ 100 % MeCN por 3 min. Biosídeos de esteviol foram detectados utilizando SIM (Monitoramento de Íon único) em Mw 665,2 [M+Na+]. Nenhuma das 30 enzimas UGT testadas exibiram atividade de glicosilação de esteviol-13-O-monoglicosídeo detectáveis.
[00317] As sequências de nucleotídeo dos seis membros UGT91 identificados por pirossequenciamento foram comparadas às sequências de Stevia UGT91D1 no Acesso Genbank No. AY345980. Apareceu que as sequências GenBank de aminoácidos adicionais 12 codificadas na terminação N, em relação às seis sequências identificadas por pirossequenciamento. Para testar novamente os membros da família UGT91D1 para atividade, as sequências UGT91D1 foram isoladas novamente por amplificação de PCR de cDNA de folha de estévia. Os produtos PCR resultantes foram clonados para um vetor de plasmídeo e a atividade enzimática para cada produto foi medida como descrito acima por: expressão rotulada de GST em E. coli, transcrição - translação acoplada in vitro, e/ou expressão in vivo em levedura. A atividade de glicosilação de esteviol 1,2 foi detectada a partir de um clone por três métodos. Este clone foi designado UGT91D2e. A sequência de aminoácido de UGT91D2e é apresentada na SEQ ID NO: 5. Em contraste, nenhuma atividade de glicosilação 1,2 foi detectada a partir de um clone tendo as mesmas sequências conforme descrito pelo acesso No. AY345980 (Número de acesso da proteína AAR06918), porém faltando os 12 aminoácidos de terminação amino.
[00318] Exemplo 11 - Análise de Sequências UGT91D2e
[00319] Sequências variantes de UGT91D2e
[00320] Conforme evidenciado pela figura 19B, um pequeno número de modificações de aminoácidos existe entre as variantes ativas e os homólogos inativos mais próximos (91D1). Os genes clonados 91D1 por Ma et al., Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2003 36(2):123-9 (Número de Acesso da Proteína AAM53963, GI:21435782 ) e Brandle et al., supra (Número de Acesso da Proteína AAR06918, GI:37993665) não exibiram a atividade de glicosilação 1,2 requerida pela biossíntese de RebA. Para verificar quais aminoácidos são requeridos para atividade, 21 mutantes de local único direcionado tais que o aminoácido em UGT91D2e (SEQ ID NO: 5) foi alterado para o aminoácido correspondente em um homólogo inativo. Vide Tabela 12. Além disso, uma mutação de local direcionado foi feita de tal modo que a posição 364 (S^P) também foi alterada. As mutações foram feitas utilizando o kit Metagênese QuikChange® II de local direcionado aos protocolos do fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e os vetores pGEX-4TI foram transformados em uma autólise XJb de cadeia de E. coli (ZymoResearch, Orange, CA). Um mutante foi feito para alterar o resíduo 162 a partir de uma glicina para um ácido aspártico.
[00321] A fim de acessar a atividade das enzimas mutantes, um experimento de alimentação de substrato foi desempenhado in vitro utilizando a proteína produzida em E. coli. Inicialmente, as células de E. coli foram crescidas durante a noite a 30°C, seguido por indução com 3 mM arabinose e 0,1 mM IPTG, e incubação adicional a 20°C. Para o ensaio in vitro, as células foram induzidas durante a noite a 20°C, lisadas por um congelamento / descongelamento, e o extrato bruto da célula usado para uma reação enzimática em que os substratos foram 0,5 mM esteviol-13-O-glicosídeo e 0,5 mM rubusosídeo.
[00322] Os resultados foram mostrados na Tabela 12 para os substratos de esteviol monoglicosídeo (SMG) e Rubusosídeo (Rub). Um “+” indica que a atividade de desglicosilação foi detectada, um “-“ indica que a atividade não foi detectada, e “NA” indica que o ensaio não foi realizado. As mutações notadas são baseadas na numeração das sequências 91D2e (SEQ ID NO: 5).
[00323] Como alguns dos genes possuem uma tendência para expressar em corpos de inclusão em E. coli, as sequências de codificação que não mostraram atividade nos experimentos de E. coli também foram produzidos por transcrição - translação in vitro de produtos PCR (TNT®T7 Quick para PCR DNA kit, Promega) como acima no Exemplo 10. Resumidamente, 2 μL de DNA proveniente da amplificação de PCR dos cinco mutantes únicos e a enzima tipo selvagem foi incubada durante 90 minutes a 30°C com o kit mestre de mistura e 1 μL L-[35S]-Metionina, in a total de reação de 25μL. Para cada amostra, um volume de reação final de 2 μL ocorreu em um gel a SDS-PAGE. Todas as seis proteínas mostraram níveis similares de proteínas recombinantes solúveis conforme julgado por uma observação visual do gel SDS-PAGE gel. Os resultados para as proteínas in vitro-translatadas são mostrados no lado direito da Tabela 12. As porcentagens nesta tabela indicam a quantidade aproximada de uma conversão de substrato para o produto com base nas áreas de pico relativas de substrato e produto.
[00324] Tabela 12
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[00325] A quantidade aproximada de atividade de desglicosilação quando comparado a UGT91D2e (SEQ ID NO: 5) foi encontrada ser: 6,1 % para T144S, 26,2 % para M152 L, 30,7 % para L213 F, 4,3 % para S364 P, e 14,7 % para G384 C utilizando 13-SMG como substrato. Para rubusosídeo, a quantidade aproximada de atividade de desglicosilação quando comparado a UGT91D2e foi de 1,4 %, 23,4 %, 43,7 %, 10,9 % e 35,2 % for T144S, M152L, L213F, S364P, e G384C, respectivamente.
[00326] Estes resultados indicam que 5 de 22 mutações de aminoácido foram visivelmente prejudiciais para atividade quando feitas em isolamento. É também possível que as combinações das outras 17 mutações também resultariam em inatividade ou perda de atividade.
[00327] Alinhando as sequências 91D2e e as variantes descritas acima com proteínas denominadas At72B1, Mt85H2, VvGT1 e Mt71G1 (Osmani et al (2009) Phytochemistry 70, 325-347), e analisando as estruturas terciárias previstas (alfa hélices, beta-folhas, e regiões de bobina), as regiões podem ser identificadas onde as mutações são comumente para resultar na perda da atividade de desglicosilação. As três primeiras mutações que são prejudiciais são encontradas no domínio N-terminal, em regiões que são pensadas serem circuitos. O domínio N-terminal (resíduos de aminoácido 1 a 240), em particular as regiões de circuito previsto do domínio N- terminal (aminoácidos 20 a 26, 39 a 43, 88 a 95, 121 a 124, 142 a 158, 185 a 198, e 203 a 214), são conhecidas ser primariamente responsáveis pela ligação do substrato aceptor da molécula de glicose. A quarta mutação que aparece para ser prejudicial para atividade é encontrada no domínio C-terminal, em uma região que é acreditada ser o circuito C5 (correspondendo aos aminoácidos 381 a 386). Este circuito é também conhecido ser importante para especificidade do substrato aceptor de glicose. Dezenove das vinte e duas mutações que separam as enzimas desglicosilase rubusosídeo ativas versus inativas são localizadas com cinco aminoácidos das regiões de ligação do substrato aceptor previsto 91D2e. Portanto, é provável que as enzimas 91D1 publicadas catalisem uma reação de glicosil transferase entre UDP- glicose e um substrato aceptor alternativo.
[00328] Exemplo 12 -- Produção de Rebaudiosídeo A em levedura
[00329] Produção de Rebaudiosídeo A em levedura alimentada de esteviol
[00330] A cepa de levedura EFSC1580, que contém um cassete de expressão genomicamente integrado UGT74G1, foi transformado com três plasmídeos de alta cópia de 2μ (episomal) for co-expressão de Stevia UGTs 91D2e (SEQ ID NO: 5), 85C2 (SEQ ID NO: 3), e 76G1 (SEQ ID NO: 7). Os três plasmídeos, designados pMUS44, pMUS7 e pMUS9, contêm sequências de codificação para UGT91D2e, UGT85C2 e UGT76G1, respectivamente, ligado de forma operável ao promotor GPD1. As cepas de levedura restantes cresceram em meio SC sem uracil, histidina, e leucina para selecionar a presença continuada dos plasmídeos de expressão pMUS44, pMUS7 e pMUS9. Esteviol foi adicionado ao meio a uma concentração final de 250μM, e a cepa foi cultivada a 30°C. Às 18 horas e 72 horas de cultura, alíquotas do sobrenadante e sedimentos de células foram analisados para a presença de Rebaudiosídeo A por LC- MS. As análises de LC-MS foram desempenhadas utilizando um sistema Agilent 1100 série HPLC (Agilent Technologies, Wilmington, DE, US) ajustado com uma coluna de Sinergia Phenomenex® Hydro-RP (250 x 3 mm, partículas de 3 μm, tamanho do poro de 80 A) e hifenizado a um espectrômetro de massa quadropole triplo com ionização de eletrospray a um Quantum TSQ (ThermoFisher Scientific). A eluição foi realizada utilizando uma fase móvel (30 °C) contendo MeCN (0,01 % Ácido fórmico) e H2O (0,01 % Ácido fórmico) aplicando um gradiente composto de 0,6 ^ 0,4 ml/min, 5 % MeCN por 4 min; 0,4 ml/min, 5 ^ 40 % MeCN por 2 min; 0,4 ml / min, 40 ^55 % MeCN por 11 min; 0,4 ^ 1,0 ml/min, 55 ^100 % MeCN por 3 min. Biosídeos de esteviol foram detectados utilizando SIM (Monitoramento de Ion único).
[00331] Resultados de LC-MS mostraram que quantidades detectáveis de Rebaudiosídeo A foram encontradas no sobrenadante a 18 e 72 horas de cultura quando a cepa EFSC1580 contendo pMUS44, pMUS7 e pMUS9 cresceu em uma presença de esteviol. O produto co-eluído com um padrão Rebaudiosídeo A e a massa esperada foi confirmada como a [M+Na]+ = 989. Comparando a absorção do produto à absorção de um padrão de 10μM Rebaudiosídeo A, o acúmulo no sobrenadante da cultura da célula foi estimado ser mais que 6mg/L em 18 horas, e mais que 15 mg/L a 72 horas.
[00332] Produção de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D em levedura alimentada de Glicose
[00333] A cepa de levedura CEY213, descrita no exemplo 4, contém caminho biossintético de genes esteviol expressos a partir de eYACs bem como genomicamente integrados UGT74G1 e cassetes de expressão de UGT85C2. A cepa CEY213 produz rubusosídeo, conforme descrito no exemplo 6.
[00334] A cepa CEY213 foi transformada com a 2μ de plasmídeo de expressão duplo com cópia alta (episomal), pMUS47, para a expressão simultânea de UGT91D2e (SEQ ID NO: 5) e UGT76G1 (SEQ ID NO: 7). O pMUS47 plasmídeo contém dois cassetes de expressão, um tendo as sequências de codificação de UGT91D2e e o outro tendo as sequências de codificação de UGT76G1. Amas as sequências de codificação são ligadas de forma operacional ao promotor GPD1 constitutivo. A cepa de levedura resultante foi pré cultivada durante a noite a 30°C em meio SC sem histidina, leucina e triptofano a fim de manter a pré-seleção para uma presença da presença de eYACs, sem uracil a fim de manter a pré-seleção para uma presença de pMUS47, e finalmente com metionina (2mM) a fim de suprimir os promotores apresentados no eYACs. No próximo dia, as células foram lavadas e transferidas para um meio idêntico, mas sem metionina, para indução dos promotores eYAC. As amostras foram coletadas após 24 horas e 99 horas de incubação, e sobrenadantes e sedimentos de células analisados para a presença de Rebaudiosídeo A e Rebaudiosídeo D, utilizando LC-MS os descritos acima.
[00335] Os resultados mostraram que quantidades detectáveis de Rebaudiosídeo A foram encontradas nos sobrenadantes em ambas 24 e 99 horas. O produto co-eluído com o padrão Rebaudiosídeo A e a massa esperada foi confirmada como [M+Na]+ = 989. Comparando a absorção do produto a um padrão Rebaudiosídeo A de 10μM, o acúmulo de Rebaudiosídeo A no sobrenadante foi estimado ser mais que 3mg/L em 24 horas e mais que 6 mg/L em 99 horas. Vide figura 9. Os resultados também indicaram que pequenas quantidades de esteviosídeo e rubusosídeo foram apresentadas no pélete da célula de levedura e que quantidades detectáveis de esteviosídeo e rubusosídeo foram apresentadas na cultura do sobrenadante. Vide a figura 9.
[00336] Os resultados também mostraram que quantidades pequenas porém detectáveis de Rebaudiosídeo D foram produzidas, sugerindo que UGT91D2e é capaz de conjugar uma glicose adicional à glicose 19-O do esteviosídeo produzindo Rebaudiosídeo E ou diretamente à 19-O glicose de Rebaudiosídeo A. Esses resultados também sugerem que UGT76G1 pode ser capaz de aceitar Rebaudiosídeo E como um substrato para produzir Rebaudiosídeo D. Vide figura 2C.
[00337] Exemplo 13 -- Produção de Rebaudiosídeo A com sequências otimizadas de códon para sequências UGT
[00338] Sequências de codificação ideal para UGT 91d2e, 74G1, 76G1, e 85C2 foram designadas e sintetizadas para expressão de levedura utilizando duas metodologias, fornecidas por GeneArt (Regensburg, Germany) (SEQ ID NOs: 6, 2, 8, e 4, respectivamente) ou DNA 2,0 (Menlo Park, CA) (SEQ ID NOs: 84, 83, 85, e 82, respectivamente). A sequência de aminoácidos de UGT 91d2e, 74G1, 76G1, e 85C2 (SEQ ID NOs: 5, 1, 7, e 3, respectivamente) não foram alteradas.
[00339] Os plasmídeos de alto número de cópias contendo cassetes de expressão com todos os quatro UGTs otimizados foram construídos e expressos, e sua atividade comparada aos construtos similares contendo sequências tipo selvagem. Os plasmídeos foram transformados na cepa universal Watchmaker, EFSC301 (descrita no Exemplo 3). UGTs foram inseridas em vetores de altas cópias (2μ) e expressas a partir de um forte promotor construtivo (GPD1) (vetores P423-GPD, P424-GPD, P425-GPD, e P426-GPD). Após o crescimento durante a noite e re- inoculação em meio fresco em um OD600 de 0,25, o meio de cultura (SC -leu-trp-ura- his) foi suplementado com 25 μM de esteviol (concentração final), e a produção de Rubusosídeo (Rub), 19-SMG (19SMG) e RebA (RebA) foi medida no meio após 24h. o experimento foi repetido, em parte devido ao fato de que 19-SMG não foi detectável em uma das primeiras amostras.
[00340] Os resultados a partir dos dois estudos separados, mostrado a Tabela 13 abaixo, indicaram que todos os oito dos UGTs otimizados por códon foram ativados. No entanto, a expressão da enzima por pelo menos um dos UGTs otimizados por códons em cada estratégia foi reduzida pelo novo algoritmo de otimização por códon utilizado para fazer os constructos. Parece que nos constructos modificados de GeneArt (SEQ ID NOs: 6, 2, 8, e 4), um gargalo foi potencialmente criado entre o rubusosídeo e RebA. É esperado que o ensaio da atividade de enzima individual e as análises de expressão destas sequências de codificação expressas nas cepas de leveduras irão permitir a combinação ideal de genes UGT no caminho.
[00341] Tabela 13
Figure img0024
nd = limite de detecção abaixo
[00342] Exemplo 14 - Produção de Rebaudiosídeo A utilizando UGTs com etiquetas de sequências
[00343] Fusão de pequenos peptídeos ou domínios de ligação de proteína com as proteínas UGT 85C2, 91D2e, 74G1, e 76G1 pode promover interações entre as UGTs (canalização) ou auxílio na etiquetagem / ancoramento dos UGTs para os componentes específicos das células de levedura.
[00344] Para acesso se o andaime das UGTs no caminho RebA poderia resultar em enzimas de caminho ativo, as UGTs otimizadas por códon DNA 2,0 85C2 e 74G1 foram fundidas em quadro a uma cadeia de peptídeos de alta afinidade 4, curta (também conhecida como PMI) que remontam os motivos de proteínas p53. Os motives de proteínas p53 interage com a proteína MDM2 em humanos (vide Li et al., J Mol Biol. 2010, 398 (2) :200 -13). UGTs otimizadas por códon de DNA 2,0 85C2, 91D2e, 74G1 e 76G1 (SEQ ID NOs: 82, 84, 83, e 85, respectivamente) foram fundidas em quadro para os primeiros 158 aminoácidos da proteína humana MDM2 (número de acesso do gene ABT17086). Uma pequena região do ligante rica em GS também foi fundida exatamente antes da metionina do N-terminal das UGTs. Não fundida, a afinidade da ligação de PMI/MDM2 é na faixa baixa de nM representando uma ligação de alta afinidade. Células de levedura transformadas com os constructos acima são esperadas produzir um andaime UGT em torno de 4 X PMI (P53-similar) peptídeo fundiu o N-terminal para o andaime da proteína 85C2 (designada 85C2_P53).
[00345] A cepa de levedura de laboratório BY4741, deletada para TRP1, foi transformada com plasmídeos de expressão p423-426 GPD (Mumberg et al, Gene, 156 (1995), 119-122) expressando Stevia rebaudiana UGTs 74G1,76G1 e 91D2e com N-terminal, fusões em quadro dos primeiros 158 aminoácidos de proteína humana MDM2, e expressando Stevia rebaudiana UGT85C2 com uma fusão do N-terminal em quadro de 4 repetições do peptídeo PMI sintético PMI (4 X TSFAEYWNLLSP, SEQ ID NO: 86). Vide SEQ ID NOs: 88, 90, 92, e 94 para uma sequência de aminoácidos das 85C2, 74G1, 91D2e, e 76G1 proteínas de fusão, respectivamente; vide SEQ ID NOs: 89, 92, 93, e 95 para as sequências de nucleotídeo que codificam as proteínas de fusão. Esta cepa de levedura e uma cepa de controle (expressando as quatro UGTs sem qualquer fusão) cresceram durante a noite em meio de levedura sintético selecionando para a presença de plasmídeos e então transferidos para o próximo dia uma bandeja de cavidade de profundidade 96 contendo meio de levedura sintético para uma densidade de célula dando um OD600 de 1. Uma concentração final de 100 μM esteviol foi adicionada. Após 72 horas, as amostras foram levadas e analisadas por LC-MS, como descrito no exemplo 12. Como indicado nas figuras 10A e 10B, as UGTs são ativas em levedura quando expressas com várias etiquetas de fusão.
[00346] Exemplo 15 - Atividade de UGT91D2e
[00347] Sub-família adicional 91 UGTs foi clonada utilizando preparações de cDNA/biblioteca feitas a partir de fontes de estévia de diferentes fundamentos genéticos. Os iniciadores de oligonucleotídeo idênticos ao UGT91D1/91D2e foram utilizados para amplificação de PCR das preparações de cDNA, e os produtos de PCR resultantes do tamanho correto foram clonados em vetores de plasmídeo apropriados. Numerosos clones provenientes de cada experimento foram sequenciados a partir, e os resultados do sequenciamento mostraram que o ácido nucleico UGT91D com leves variações nas sequências poderiam ser amplificadas in sequências. As vinte variantes UGT91D com as maiores diferenças, as diferenças nas sequências em relação a um UGT91D2e foram clonadas por transcrição - translação in vitro seguida por testagem enzimática para atividade de glicosilação de esteviol-13-O-monoglicosídeo-1,2. Um dos variantes mostrou fraca atividade de glicosilação de 1,2-biosídeo, enquanto o lembrete não mostrou nenhuma atividade detectável de glicosilação. Parece, portanto que polipeptídeos UGT91D2 são glicosilação de enzimas primárias de esteviol-13-O- monoglicosídeo-1 ,2 em estévia.
[00348] Atividade enzimática de UGT91D2e
[00349] UGT91D2e (SEQ ID NO: 5), feita por transcrição - translação in vitro, foi testada para a capacidade de xilosilato e ramnosilato de esteviol-13-O- monoglicosídeo em um ensaio de enzima in vitro, utilizando UDP-xilose ou UDP- ramnose como os doadores de açúcar ao invés de UDP-glicose.
[00350] O ensaio de xilosilação foi desempenhado como segue: 3 mM ácido UDP- glucurônico foi misturado com ca. 1 μg Arabidopsis thaliana-codificada UDP- ácido glucurônico descarboxilase UXS3 (produzida in E. coli e então purificada), 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 6 μg BSA, 1 mM MgCl2, e 1 % fosfatase do intestino. A mistura de reação foi incubada por 30 minutos a 30 °C, a fim de que o ácido glucurônico UDP seja vertido em UDP-xilose. A seguir 1,5 mM de substrato de esteviol-13-O-monoglicosídeo e ca. 0.5 μg de enzima UGT91D2e feita como descrito no exemplo 9 foi adicionado à mistura, a qual foi permitida incubar a 30 °C por um adicional de 20 horas.
[00351] O ensaio de ramnosilação foi desempenhado da seguinte forma: 3 mM UDP-glicose foi misturado com 0,6 μg de cada parte do N-terminal e C-terminal de sintetase ramnose Arabidopsis thaliana-codificada RHM2 (produzida em E. coli e a seguir purificada), 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 1.5 mM NADPH, 1.5 mM NAD+, 6 μg BSA, 1 mM MgCl2, e 1 % fosfatase do intestino de vitela. A mistura de reação foi incubada por 30 minutos a 30 °C, a fim de que UDP-glicose seja vertida em UDP-ramnose. A seguir 1,5 mM de substrato de esteviol-13-O-monoglicosídeo e ca. 0.5 μg de enzima UGT91D2e foi adicionada à mistura, que foi permitida incubar a, 30 °C por um adicional de 20 horas.
[00352] Os resultados indicaram que UGT91D2e foi capaz de realizar xilosilação de substrato de esteviol-13-O-monoglicosídeo em cerca de metade de um terço a um terço da taxa observada com UDP-glicose, formando 1,2-esteviol xilosilado-13-O-monosídeo, que é o precursor para Rebaudiosídeo F. UGT91D2e foi capaz de realizar ramnosilação do substrato de esteviol-13-O-monoglicosídeo a cerca da mesma taxa como a taxa observada com UDP-glicose, formando 1,2-ramnosilado de esteviol-13-O-monosídeo, que é a precursor para Rebaudiosídeo C (Dulcosídeo B). Estes resultados indicam que a síntese que sintetiza o precursor de moléculas e a expressão das UGTs apropriadas in vivo deve resultar na produção de Rebaudiosídeo F e C in vivo. Vide as figuras 2B e 2D.
[00353] UGT91D2e também foi testado quanto à sua capacidade de substratos 1,2-glucosilato que não esteviol-13-O-monoglicosídeo in vitro, isto é, rubusosídeo, esteviol-1 ,3-biosídeo e 1,3-esteviosídeo. Os resultados indicaram que a UGT 91D2e não estava ativa quando a ligação de glicose 1,3 estava presente (por exemplo, 1,3-esteviol biosídeo e 1,3-esteviosídeo), enquanto UGT 91D2e foi ativo independentemente de glicosilação na posição primária 19 - O. Estes resultados sugerem que 1,3-esteviol biosídeo e 1,3-esteviosídeo provavelmente não estão presentes no caminho de estévia in vivo para formação de rebA. Vide figura 2A e figura 3.
[00354] Exemplo 16 - Homólogos de UGT91D
[00355] Ecótipos diferentes de S. rebaudiana são geneticamente diversificados. Investigação de 96 clones de uma 91Ds Partir de diferentes acessos de RNA de estévia revelou muitas mudanças de aminoácido entre seis ecótipos investigados (por exemplo, a 74 nucleotídeos (resultando em uma mudança de aminoácido de G a D), 89 (Y para F), 131 (V para a), 137 (F para S), 278 (P a Q), 295 (S V a UO P), 331 (E a Q), 365 (Y a F), 395 (A a V), 418 (H para Y), 425 (S a G), 431 (T a I), 442 (A para T), 454 (M para L), 458 (G para a), 466 (a a S), 485 (G a D), 583 (L a M), 587 (V E), 595 (K para E), 614 (D a G), 616 (G para R), 631 (L a M), 637 (L para F), 662 (S para F), 664 (K para E), 671 (Y a C), 857 (V a), 867 (S R), 919 (F a L), 989 (V a A ), 1000 (R a C), 1090 (S a P), 1150 (G para C), 1232 (L a S), 1281 (K a N), 1313 (E para a), 1354 (Q para R) , e 1369 (V I)), tal como numerados com relação a uma sequência de nucleotídeo de 91D2e Apresentada nd SEQ ID N °: 9. Alguma variação adicional a partir desses polimorfismos foi observada, o que é provavelmente devido a erros de sequenciamento ou PCR, particularmente se os polimorfismos foram encontrados apenas uma vez. Vinte regiões codificantes foram escolhidas para análise adicional. Vide tabela 14 para descrições de clones que foram isoladas. A numeração de aminoácidos na tabela 14 e com base em uma sequência de aminoácido de UGT91D2e apresentada nd SEQ ID N °: 5.
[00356] Tabela 14
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[00357] Todos os clones de na tabela 14 foram testados para a atividade utilizando 13-SMG como um substrato. Clone 5 apresentou atividade de glicosilação 1,2 fraca enquanto o remanescente 19 não pareceu ter atividade sob as condições testadas. A sequências de clone 5 e Apresentada nd SEQ ID N °: 95 e possui o respeito com a seguinte mutações do tipo selvagem UGT92D2e (SEQ ID N °: 5): G206R, Y207C, e W343R.
[00358] Exemplo 17 - homólogos de UGT85C
[00359] A diversidade genética de uma UGT85Cs a partir de seis diferentes ecótipos S. rebaudiana foi examinada para identificar homólogos que possuem a mesma atividade ou reforçada em vias produção de glicosídeo esteviol. Iniciadores de PCR foram concebidos de forma que fossem específicos para genes UGT85C, reações eletrônicas de PCR foram realizadas em cDNA (algumas foram feitas em bibliotecas de cDNA, algumas foram feitas em preparações de cDNA). Os produtos de PCR resultantes foram clonados e 96 clones foram sequenciados. Polimorfismos de aminoácido foram mapeados e 16 clones UGT 85C foram escolhidos com variação de representação de polimorfismo comum. Vide tabela 15. Modificações adicionais foram também notadas por alguns clones, mas podem ser devido a erros de PCR ou não eram polimorfismos comuns. São descritos polimorfismos com relação ao nucleotídeo e aminoácido de numeração do tipo selvagem de S. rebaudiana UGT85C sequências de nucleotídeos apresentada nd No. de Acesso AY345978.1 (vide Tabela 8).
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[00360] Os clones foram expressos através de acoplado transcrição in vitro - translação de produtos PCR (TNT T7 ® rápida para PCR de DNA kit, Promega) e ensaiadas quanto à atividade de glicosilação nos substratos de esteviol e esteviol-19- O-glicosídeo (0,5 mM), como descrito em exemplos anteriores. A UGT85Cs produzida a partir de clones 1, 4, 16, 17, 19, 20, 21, 26, 29, 30, 31, 37, e 39 eram solúveis e foram capazes de converter a 19-SMG rubusosídeo em um ensaio de 90 min . A UGT85C produzida a partir de um clone 27 foi considerada insolúvel. Embora a UGT85Cs produzida a partir de clones 2 e 33 tenha sido considerada insolúvel, quantidades vestigiais de rubusosídeo foram produzidas apesar da banda de proteína não ser visível. Estes experimentos foram realizados de forma independente por três vezes. Os experimentos mostraram que as seguintes mutações de aminoácido não resultam em uma perda de atividade: V13F, F15L, H60D, A65S, E71Q, I87F, K220T, R243W, T270M, T270R, Q289H, L334S, A389V, I394V, P397S, E418V, G440D, e H441N. Mutações adicionais, que foram observadas em clones ativos incluem K9E no clone 37, K10R no clone 26, Q21H no clone 2, M27V no clone 30, L91P no clone 4, Y298C no clone 31, K350T no clone 37, H368R no clone 1, G420R no clone 19, L431P no clone 4, R444G no clone 16, e M471T no clone 30.
[00361] Os polimorfismos apenas comuns que não foram testados foram T270A e I336T, que são ambas substituições bastante conservadoras. Clone 17 com as maiores alterações incorporadas em comparação com UGT85C, Aminoácidos 6/480. Os 17 a 20 aminoácidos que parecem ser mutáveis representam cerca de uma diferença de 4 % no nível de aminoácido.
[00362] Geralmente, há baixa diversidade genética entre os 85Cs e é provável que todos os homólogos de 85C com polimorfismos comuns previstos na tabela 15 estarão ativos.
[00363] Exemplo 18 - homólogos de UGT76G
[00364] A diversidade genética de uma UGT76Gs a partir de seis diferentes ecótipos S. rebaudiana foi examinada para identificar homólogos que possuem a mesma atividade ou reforçada em vias de produção de glicosídeo esteviol. Iniciadores de PCR foram concebidos de forma que fossem específicos para UGT76G, reações eletrônicas de PCR foram realizadas em preparações de cDNA (bibliotecas de cDNA ou preparações de cDNA). Os fragmentos de PCR resultantes foram clonados e 96 clones foram sequenciados. Polimorfismos de aminoácido comuns foram mapeados e 16 clones UGT76G escolhidos, com representação de polimorfismo variando, incluindo (numeração de aminoácido): R10s, I16L, F22V, M29I, K52S, V74K / E, P80S, L85A, V87S / G, L91P, I92F, I93F, H96Y, G97R, L108V, E113D, G116E, A123T, Q125A, I126L, Y128H, T130A, L142I, V145M, S147N, N151T, F152I, H153L, H155Y, V156D, Q160L, E163D, L167F, P169L, K188N, K191Q, C192S / F, S193G / A, F194Y, M196N, K198Q, K199 (I, V, Q), Y200 (L, A, G), Y203I, F204L, E205G, N206K, I207M, T208I, V217I / F, E226Q, S228P, L230V, V233I, I234T, E236D, I237F, S253P, P266Q, S273P, R274S, G284T / A T285S, 287-3 deleção, R298H, P326A, L330V, G331A, P341L, L346I, S376L, D377A, G379A, L380F, S438P, e K441N. Geralmente, há uma diversidade muito grande entre o 76Gs.
[00365] Os clones foram expressos por meio de translação in vitro e testados para atividade de glicosilação utilizando 0,5 mM esteviol-13-O-glicosídeo e 0,5 mM esteviosídeo como substratos, tal como descrito nos exemplos anteriores. Reações foram realizadas durante 90 minutos a 30° C. A atividade nativa 76G1 foi encontrada em três novos 76Gs designados 76G_C4, 76G_G7 76G_H12 e, por meio da formação de 1,3-biosídeo quando esteviol-13-O-glicosídeo foi utilizado como substrato. Atividade neste caso foi determinada comparativamente com o controle positivo, o 76G1 funcional. Clones 76G_G7 e 76G_H12 produziram níveis ligeiramente mais elevados de Reb A do que o controle, mas 76G_C4 tinha Reb A pouco menos do que o controle. O número de mudanças nestes clones representa uma diferença de Cerca de 7 % no nível de aminoácido, a partir da enzima de controle. SEQ ID N ° s: 98, 100, 102 e estabeleceu uma sequência de aminoácido de 76G_C4, 76G_G7, e 76G_H12, respectivamente. SEQ ID N ° s: 97, 99, 101 e estabeleceu as Sequências de nucleotídeo que codificam 76G_C4, 76G_G7, e 76G_H12, respectivamente. SEQ ID N ° s: 98, 100, 102 e estabeleceu uma sequência de aminoácido de 76G_C4, 76G_G7, e 76G_H12, respectivamente. SEQ ID N ° s: 97, 99, 101 e estabeleceu as sequências de nucleotídeo que codificam 76G_C4, 76G_G7, e 76G_H12, respectivamente.
[00366] A tabela 16 resume as alterações de aminoácido dos clones que tinham atividade 76g, em comparação com a enzima de tipo selvagem. Há um grande número de são de sobreposição de polimorfismos nos clones ativos, assim é esperado que estes polimorfismos não causem uma perda de atividade da enzima. Parece que certas mutações são frequentes em clones inativos, tais como tal mutação P ^ S na posição 80 ou mutação F ^ V na posição 22. TABELA 16
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[00367] Exemplo 19 - Expressão de uma levedura truncada da HMG-CoA redutase de outros inibidores da HMG-CoA redutase
[00368] Em S. cerevisiae, a via de mevalonato é fortemente regulada, por exemplo, ao nível da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase. Expressando uma redutase de HMG-CoA truncado (tHMG1, que codifica uma enzima estabilizada a partir de degradação) é um método no qual o fluxo em direção à produção PPP pode ser aumentada em levedura. Por exemplo, uma expressão de tHMG1 em levedura foi deixada à dramática superprodução de β- caroteno. Vide, Verwaal et al., 2007, Appl. Environ. Microbiol. 73:4342. Curiosamente, tal levedura não apresentou coloração laranja mais escura em meio de crescimento sólido, como era esperado, mas em vez de uma cor amarela forte, provavelmente devido a ainda mais elevado o excesso de produção de fitoeno intermediário.
[00369] Para determinar se uma expressão de HMG-CoA redutase poderia ser utilizada para melhorar o fluxo para o caminho esteviol e glicosídeo de esteviol, uma estirpe repórter de levedura para testar o fluxo isoprenóide foi preparada substituindo o promotor inerente do gene com um promotor ERG9 CUP1. Vide, pedido de patente US n ° 61/346853, depositado em 20 maio de 2010.
[00370] Os genes utilizados para produzir a estirpe de levedura são mostrados na tabela 17. Os genes provenientes de organismos de origem foram códon otimizados de acordo com DNA 2.0 Inc™. Para a finalidade de monitorar a disponibilidade celular de fosfato de prenil, foi produzida uma construção que tinha um elevado número de cópias de plasmídeo contendo os cassetes de expressão de gene (promotores de metionina-reprimível) genes para as três enzimas necessárias para transformar fosfatos prenil em β-caroteno (sintase GGPP a partir de Xanthophyllomyces dendrorhous, sintase de fitoeno e sintase β-caroteno a partir de X. Dendrorhous, e sintase de zeta caroteno e sintase de delta caroteno a partir de Neurospora crassa). Vide, Verwaal et al, 2007 supra;. e Pedido de Patente US 61/346853. Tabela 17 Fontes de HMG CoA Redutase e outros genes Mevalonato
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[00371] A levedura tHMG1 foi expressa na estirpe de levedura baseada em CEN.PK- que produz β-caroteno, o que resulta em numa cor que muda a partir de laranja para amarelo claro. Curiosamente, uma Expressão de todo o comprimento HMGS a partir de Artemisia annua, Trypanosoma cruzi e Staphylococcus aureus, bem como a HMG dependente de NADH é a partir de Pseudomonas mevalonii e Archeoglobus fulgidus produzida um resultado semelhante, indicando estes também genes que melhoram o fluxo através do caminho de mevalonato em levedura (semelhante a superexpressão de Bos taurus HMG não teve efeito semelhante). Finalmente, a mudança de cor foi observada mesmo após a sobre-expressão de Leishmania infantum acetil-CoA-acetiltransferase C (primeira enzima da via de mevalonato, descrita na Tabela 17) ou cerevisiae nativa (CAB1, YDR531W) UO B. subtilis, (acc. No. YP004204141) pantotenato quinases (conhecidas por resultar na produção de acetil-CoA aumentada).
[00372] Para testar se a mudança de cor nestas experiências eram de fato, devido à maior disponibilidade de GGPP, a levedura tHMG1, P. mevalonii UO HMGS de S. aureus, Bacillus subtilis ou B. pantotenato quinase foram expressas em uma estirpe produtora estável 19-SMG. Nenhum destes construtos pareceu produzir um aumento de 19 SMG ou produção de rubusosídeo (UGT85C2 co-expressas) sob as condições testadas. A alimentação de mevalonato também à estirpe repórter de levedura não resultou em aumento da produção de rubusosídeo. A estirpe repórter de rubusosídeo, não entanto, não tem sido geneticamente modificada para reduzir o fluxo ERG9 codificado para biossíntese de ergosterol. É esperado que o fluxo e controle de produção de ergosterol resultaria em aumento de produção de glicosídeo esteviol utilizando os genes redutase HMG e outros genes da via mevalonato encontrado para ser benéfico para a produção de beta-caroteno.
[00373] Exemplo 20 - Produção de RebC in vivo
[00374] A síntese de uma molécula precursora de Rebaudiosídeo C, esteviol- 13-O-glucopiranosil-1 ,2-ramnosídeo, foi demonstrada in vitro no exemplo 15. Nesse exemplo o esteviol-13-O-monoglicosídeo foi usado como um substrato, em conjunto com UDP-glicose e a enzima Arabidopsis thaliana RHM2 (etiqueta locus AT1G53500) e UGT91D2e. Para demonstrar ainda mais a via mostrada na figura 2B, produção de Rebaudiosídeo C a partir de esteviol foi realizado in vivo.
[00375] Uma estirpe de levedura capaz de produzir Rebaudiosídeo C foi construída, e a produção de rebaudiosídeo C e rebaudiosídeo A foi determinada por LC-MS. A modificação da estirpe Saccharomyces cerevisiae BY4742 foi construída e designada EYS583-7A. O uso de BY4742 tem sido descrito por Naesby et al., Microb Fato Cell. 08:45 (2009) Todas as quatro UGTs (91D2d, 76G1, 74G1, e 85C2) foram constitutivamente expressas em plasmídeos promotores com GPD. Este tipo de estirpe possui foi descrito por Naesby et. al, Microb Fato Cell. 08: 45 (2009). UGT85C2 foi inserido no plasmídeo P423 GPD (ATCC No 87355), foi clonado em UGT74G1 GPD P424 (ATCC No. 87357) e ambos UGT91D2e e UGT76G1 foram clonados em P425-GPD (ATCC No. 87359) com 91D2e no local de clonagem múltipla inicial (MCS), e 76G1 inserido com um promotor adicional de GPD e a terminação CYC. A estirpe resultante foi transformada com plasmídeo P426 GPD (ATCC No. 87361) contendo o gene expresso RHM2 proveniente de um promotor GPD. A estirpe foi cultivada em meio sem histidina SC, leucina, triptofano e uracila por 24 Horas. A Cultura foi, em seguida, reinoculada para um OD600 de 0,4 em meio fresco contendo 25 μ M esteviol, e a levedura foi deixada a crescer durante 72 horas mais antes de detectar se Rebaudiosídeo C estava presente no sobrenadante e nas células de sedimentos de. Rebaudiosídeo C foi quantificada utilizando um autêntico Rebaudiosídeo C padrão (ChromaDex, Irvine CA). Um total de 1,27 μM ± 0,36 μM de RebC foi detectado no sobrenadante. Da mesma forma, 3,17 μM ± 1,09 μM rebA foi detectada no sedimento de células um versado na técnica irá reconhecer que diferentes proporções de rebC a rebA podem ser obtidos por modulação de uma atividade de a enzima RHM2 e ou / por utilização de UGT91D2e UO UGT76G1-como atividade de enzimas com maior para as reações UDP-ramnose. As versões alternativas UGTs podem ser mutagenizados se as Enzimas tipo selvagem ou Enzimas únicas forem obtidos através de iniciativas de descoberta.
[00376] Um versado na técnica irá reconhecer uma cepa de levedura capaz de produção de Rebaudiosídeo A a partir de glicose, tal Como tensão CEY213 transformada com um plasmídeo contendo UGT91D2e e UGT76G1 no Exemplo 12 produziria Rebaudiosídeo C com uma adição de gene ou RHM2 através de um cromossoma vetorizado ou integrado no mesmo.
[00377] Exemplo 21 - Produção de glicosídeos de esteviol utilizando UGTs expressa em Escherichia coli
[00378] Atividade de Enzimas UGT em bactérias gram-negativas
[00379] Os genes de tipo selvagem para UGTs 91D2e, 74G1, 76G1, e 85C2 foram clonados individualmente em células de E. coli xjb autólise-BL21 (DE3) utilizando o sistema de pET30 vetorizados a partir de Novagen (EMD4 Biosciences, Madison, WI), excepto para UGT91D2e, o qual foi clonado em um pGEX 4T-1 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) Vetor. Clonagem semelhante foi descrito em exemplos 7 e 10. Todos os vetores utilizam um promotor induzível por IPTG-. Plasmídeo de ADN foi transformado em células quimicamente competentes como descrito pelo vendedor.
[00380] Transformantes mostrando a resistência de antibiótico desejada foram cultivadas durante a noite a 30 °C em culturas 2 mL utilizando meio NZCYM e antibiótico. Na alimentação in vivo, 5 Culturas foram cultivadas: UGT 91d2e, 74G1, 76G1, e 85C2 individualmente, e a mistura de todos os quatro clones. O dia seguinte, as culturas foram induzidas a uma concentração final de 0,3 mM IPTG e 3 mM de arabinose, e cresceu 2 dias em 20 °C em uma presença de 50 mM esteviol (UGT74G1, UGT85C2 e mistura quádruplo) ou 50 uM de rubusosídeo (UGT91D2e e UGT76G1 ). A temperatura foi elevada a 30 °C e as células foram cultivadas por mais um dia. As células foram então colhidas por centrifugação a 4000 rpm durante 5 min, e os sobrenadantes foram removidos para análise LC-MS. As células foram ressuspensas em DMSO a 50 %, lisadas a 80 °C durante 5 min e os lisados foram analisados por LC-MS.
[00381] Para os ensaios in vitro, os transformantes que apresentem a resistência desejada a antibióticos foram cultivados durante a noite a 30 °C em culturas 2 mL utilizando meio NZCYM e antibiótico. O dia seguinte, as culturas foram induzidas para uma concentração final de 0,3 mM de IPTG e 3 mM de arabinose, e cultivadas durante 24 horas a 20 C. As células foram então colhidas por centrifugação a 4000 rpm durante 5 min e ressuspensas em 200 ul de tampão GT-(RBC Bioscience) 3 e comprimidos/100ml de mini inibidor de protease completo (Roche), transferido para tubos Eppendorf, centrifugados e congelados a - 80 °C durante 1,5 hora. As células foram descongeladas em gelo, e deixadas à temperatura ambiente durante 3 minutos. Quando aproximadamente a meio caminho descongelado, 15 uL de 0,14 mg / ml solução H2O + 30 ul de DNase 0,05 M MgCl2 foi adicionado a cada tubo e as amostras foram incubadas durante cerca de 5 minutos à temperatura ambiente. As células foram centrifugadas à velocidade máxima durante 5 minutos. Cem uL de sobrenadante (lisado), foi transferido para tubos de microcentrífuga fresco, e 100 ul de glicerol foi adicionado.
[00382] Ensaios de enzima foram desempenhados adicionando 15,15 mL de H2O, 7,5 ul de tampão 4X (Tris 400 mM, 20 mM de MgCl2, 4 mM de KCl), 0,3 uL FastAPTM (1u / uL) a Partir de Fermentas, 0,45 mL de um estoque de 100 mM de UDP-glicose, 0,6 ul de substrato (UO rubusosídeo esteviol) e 6 uL de enzima bruto na preparação descrita acima. UGT74G1, UGT85C2, bem como todos os quatro UGTs misturados foram incubadas com esteviol. UGT 76G1 e 85C2 foram incubadas com rubusosídeo. Os ensaios de enzima foram incubados durante a noite a 37 °C. Após a centrifugação a 4000 rpm durante 5 minutos, 30 uL de amostras foram transferidas para uma nova placa de 96 cavidades e 30 uL de DMSO foi adicionada. As amostras foram então sujeitas a análise LC-MS. Experimentos similares in vitro foram também feitos utilizando esteviol 1,2-biosídeo (para UGT76G1 e UGT74G1) ou Rebaudiosídeo B (para UGT74G1) como substratos.
[00383] Nenhuma atividade foi detectada nas alimentações in vivo. A tabela 18 ilustra os resultados para o ensaio in vitro. Tabela 18
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[00384] Estes resultados indicam que as enzimas UGT são todas ativas in células de E. Coli. No entanto, os substratos podem ser prontamente importados para o citoplasma. É esperado que se o esteviol tenha sido produzido em E. coli a partir de caminhos precursores, a produção de vários produtos de glicosídeo de esteviol seria viável a partir de glicose. É inesperado que as 74G1 e 85G1 UGTs, que têm especificidades de substrato de um pouco de sobreposição, possam produzir rubusosídeo a partir de esteviol isoladamente. A mistura de quatro preparações brutas de enzima deu níveis muito baixos de monosídeos, o que indica que uma Conversão de di- e tri- glicosídeos foi eficiente. Com relação ao UGT91D2e, a preparação que foi utilizada tinha perdido algumas de suas atividade originais de armazenamento a longo prazo. É esperado que uma preparação fresca da enzima teria rendido níveis mais elevados de Rebaudiosídeo A.
[00385] Exemplo 22 - Produção de glicosídeos de esteviol em Physcomitrella patens
[00386] Experimentos de alimentação em células de musgo
[00387] Genes mínimos para 91d2e UGT, 74G1, 76G1, e 85C2 foram clonados em Physcomitrella patens utilizando o pTHUbi: sistema de vetor de gateway descrito na Publicação de Patente US N °. 20100297722. Estes vetorizados utilizam um promotor forte Ubiquitina de milho. Iniciadores de PCR foram concebidos para amplificar as regiões de codificação de sequências exemplares anteriores (nativo) com adição de uma "CACC" a montante do códon de partida. Plasmídeo de ADN foi digerido com Swai e utilizado para a transformação em protoplastos (geralmente cerca de 0,5 x 106 protoplastos). Os transformantes que apresentem a resistência desejada foram cultivados em 1 dia em culturas de 10 mL então alimentados quer esteviol, rubusosídeo, ou tampão + DMSO como indicado pela Tabela 19. Meio mL de tampão contendo substrato foi adicionado por 10 mL de cultura, as concentrações finais de 0,1 % de DMSO, 50 uM esteviol ou rubusosídeo, e 0,125 mM de tampão de fosfato foram adicionadas às Culturas. Um controle positivo foi feito onde a YFP (proteína fluorescente amarela) foi expressa em uma presença de esteviol ou apenas tampão e DMSO. Culturas foram cultivadas 2 dias adicionais antes da separação de células e congelamento em nitrogênio líquido até posterior análise. Em alguns casos, vários plasmídeos contendo UGT foram transformados em células de protoplastos mesmos, para ilustrar a conversão com etapas múltiplas nas células de musgo. Tabela 19
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[00388] A expressão foi positiva nos controles (os tubos 1 e 2) tal como medido por observação do sinal de fluorescência. Os sobrenadantes a partir das experiências foram analisados por LC-MS, 200 uL de cada amostra e o sobrenadante foi misturado com um volume igual de 50 por cento de DMSO. As amostras foram centrifugadas (15.700 força centrífuga relativa, 10 minutos) e 100 microlitros do sobrenadante resultante foi analisado por LC-MS.
[00389] Péletes de protoplastos foram descongelados em gelo e 10 mM Tris- HCl pH 8 contendo 3 comprimidos / 100 ml de Mini Inibidor de Protease Completo (Roche) foi adicionado para alcançar um volume final de 150 uL. As soluções foram divididas em duas partes: 75 uL foi transferido para um novo tubo e protoplastos foram sedimentados (15700 força centrífuga relativa de 1 minuto). O péletes foram lavados com 75 uL de água Milli-Q antes de ressuspensos em 150 uL de DMSO (50 por cento). As amostras foram, em seguida, aquecidas (80 graus Celsius, 10 minutos), agitadas em vórtex e centrifugadas (15.700 força centrífuga relativa, 10 minutos). Cinquenta ul de sobrenadante resultante foram analisados por LC-MS.
[00390] Nenhuma produção de glicosídeo de esteviol foi detectável em péletes ou sobrenadantes. É desconhecido se o esteviol e rubusosídeo podem ser transportados para as células musgo.
[00391] Alimentação in vitro de extratos de péletes
[00392] Experimentos de alimentação in vitro foram realizadas amostras com 1, 3, 4, 5, 6, 11, 13 e 17. Pérolas de vidro (425-600 mícron) foram adicionadas aos 75 uL restantes de ressuspensos originais e protoplastos eletrônicos foram mecanicamente lisados por agitação em vórtex 3 vezes, 2 minutos cada vez, a 4 graus Celsius e armazenamento em gelo no meio de vórtice. As amostras foram centrifugadas (15.700 força centrífuga relativa, 10 minutos, 4 ° C) e 6 uL de sobrenadantes resultantes foram usados em reações de enzima in vitro. Para as reações de enzima FastAPTM fosfatase (Fermentas) foi utilizado (0,3 U de reação /) e o UDP-glicose: razão de substrato foi de 5. As amostras foram alimentadas de esteviol ou rubusosídeo de acordo com a Tabela 20. Tabela 20
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[00393] As reações foram incubadas a 30 °C durante a noite. Após a incubação, uma quantidade igual de DMSO (100 por cento) foi adicionada às amostras e misturada, em seguida a amostra foi centrifugada (força centrífuga relativa de 15,700, 10 minutos) e 30 μL do sobrenadante resultante foi analisado por LC-MS.
[00394] A análise LC-MS mostrou uma conversão de rubusosídeo para 1,3- esteviosídeo por UGT76G1. Nenhum dos outros glicosídeos de esteviol foi detectável. É conhecido se a expressão solúvel das UGTs ocorreu em Physcomitrella. É esperado se um UGT for ativo na maioria das células, as outras também seriam ativas se a expressão tiver ocorrido.. Além disso, a clonagem foi feita de uma maneira transiente. A integração estável dos genes é esperada para produzir clones adicionais que são ativos para atividade de UGT quanto testado.
[00395] Métodos são conhecidos àqueles versados na técnica para aumento da solubilidade da expressão de proteínas recombinantes. Promotores alternativos, sítios de ligação de ribossomo, uso de códon, coexpressão com acompanhantes, e mudanças de temperatura em são exemplos não limitantes de métodos de para aumentar a solubilidade de expressão de proteínas recombinantes.
[00396] Exemplo 23 -- Produção de glicosídeos de esteviol in Aspergillus nidulans
[00397] Atividade de Enzimas UGTem células fúngicas
[00398] Os genes nativos para UGT 91D2e, 74G1, 76G1, e 85C2 foram clonados para Aspergillus nidulans utilizando um cassete de expressão fabricado por PCR e o sistema de vetor USER. Os métodos de clonagem são descritos em Hansen et al., Appl. Environ. Microbiol. 77: 3044 - 3051 (2011). Resumidamente, uma sequência de nucleotídeo que codifica cada UGT foi inserida entre o promotor PgpdA constitutivo e o terminal TtrpC, em um vetor contendo adicionalmente duas sequências de etiquetagem para integração genômica e argB como marcador de seleção. Plasmídeo DNA foi transformado em protoplastos A. nidulans de acordo com Nielsen et al., Fungal Genet. Biol. 43 : 54 - 64 (2006) e Johnstone et al., EMBO J. 4 : 1307 - 1311 (1985). A exibição da transformação da resistência desejada cresceu por 48 horas em 150 mL culturas utilizando meios mínimos (1 % Glicose; 10 mM NaNO3; mistura de mineral).
[00399] Lisados celulares preparados por ruptura das pérolas de vidro com micélios foram usados para determinar as atividades de UGTs individuais in vitro. Os lisados celulares de estirpes expressando 74G1 e 85C2 foram incubados com 0,5 mM e as estirpes de esteviol expressando 76G1 e 91D2e foram incubadas com 0,5 mM esteviol-13-O-glicosídeo, durante 24 Horas, e os sobrenadantes adicionalmente analisados utilizando LC / MS. Nenhum glicosídeo de esteviol foi detectado.
[00400] É desconhecido se expressão solúvel das enzimas UGT foi alcançada uma vez que estes produtos não são tipicamente visíveis em SDS-PAGE. Uma vez que Aspergillus e Saccharomyces são ambos fungos, é esperado que a experimentação adicional resultaria em clones ativos. Métodos são conhecidos para aqueles versados na técnica, para aumentar a expressão solúvel de proteínas recombinantes. Promotores alternativos, níveis de indutor, sítios de ligação de ribossomo, uso de códon, co-expressão com acompanhantes, e mudanças de temperatura são exemplos não limitantes de métodos de expressão solúvel para aumentar as proteínas recombinantes.
[00401] Outras Modalidades
[00402] Deve ser entendido que, embora a invenção tenha sido descrita aqui em conjunção com a descrição detalhada da mesma, a descrição anterior se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, o qual é definido pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens e modificações estão no escopo das reivindicações a seguir.

Claims (7)

1. Hospedeiro recombinante CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um gene tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 6, 9, 11 ou 13 que codifica um polipeptídeo UGT91D2 tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5, 10 ou 12; e (b) um gene tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2, que codifica um polipeptídeo UGT74G1 tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; em que pelo menos um dos referidos genes é um gene recombinante, em que o hospedeiro recombinante é um microrganismo transgênico, tal como uma bactéria ou levedura recombinante.
2. Hospedeiro recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o hospedeiro é um microrganismo consistindo em Saccharomyces cerevisiae ou Escherichia coli.
3. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO pelo fato de que tem a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 6 ou 9, que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5.
4. Método para produzir esteviol, glicosídeo de esteviol, ou composição de glicosídeo de esteviol CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) cultivar o hospedeiro, como definido na reivindicação 1 ou 2, em um meio de cultura, sob condições em que os referidos genes são expressos, em que o cultivo pode incluir induzir a expressão de um ou mais dos referidos genes; e (b) (i) recuperar o esteviol ou o glicosídeo de esteviol produzido pelo referido hospedeiro, em que o glicosídeo de esteviol compreende esteviol-13-O-glicosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, rubusosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A; ou (c) (ii) recuperar a composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo referido hospedeiro, em que a referida composição é enriquecida por rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F ou dulcosídeo A em relação à composição de glicosídeo de esteviol de uma planta de Stevia de tipo selvagem e tem um nível reduzido de contaminantes derivados de planta de estévia em relação ao extrato de estévia derivado de planta.
5. Método para sintetizar esteviol ou glicosídeo de esteviol, em que um nível reduzido de contaminantes derivados de Stevia em relação a um extrato de estévia derivado de planta está presente CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) cultivar o hospedeiro recombinante, como definido na reivindicação 1 ou 2, em um meio de cultura, sob condições em que um ou mais dos referidos genes são expressos, compreendendo a expressão induzida de um ou mais dos referidos genes ou a expressão constitutivamente de um ou mais dos referidos genes, tal que um composto compreendendo o esteviol ou glicosídeo de esteviol de interesse é sintetizado pelo referido microrganismo; e (b) recuperar um ou mais do referido composto.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o hospedeiro recombinante é cultivado usando um processo de fermentação.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o esteviol ou glicosídeo de esteviol compreende esteviol-13-O-glicosídeo, esteviol-19-O-glicosídeo, rubusosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F e dulcosídeo A.
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