KR20190043637A - 스테비올 글리코시드의 재조합 생산 - Google Patents

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KR20190043637A
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마이클 모션
폴라 엠. 힉스
요르겐 한센
옌스 호튼-라르센
에스벤 홀크자에르 한센
마이클 달가드 미켈슨
사비나 타바레스
샤롯데 블룸
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Abstract

스테비올 생합성 효소들과 UDP-글리코실전이효소 (UGTs)을 인코드하는 신규한 재조합 유전자를 발현시키도록 조작된 재조합 미생물, 식물들, 그리고 식물 세포들을 설명한다. 이러한 미생물, 식물들, 또는 식물 세포들은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드, 가령, 루부소시드 또는 리바우디오시드 A를 생산할 수 있고, 이는 식품 산물들 및 식이 보충제에서 천연 감미료들로 이용할 수 있다.

Description

스테비올 글리코시드의 재조합 생산{Recombinant Production of Steviol Glycosides}
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통하여 ASCII에 제출된 서열 목록을 포함하며, 그리고 이에 의해 전문이 참고자료에 통합된다. 2011년 6월 2일에 만들어진 상기 ASCII 사본은 25933WO1.txt으로 명명되며, 크기는 483,406 bytes이다.
본 교시는 스테비올(steviol) 및 스테비올 글리코시드의 재조합 생산에 관한 것이다. 특히, 본 교시는 재조합 미생물, 식물들, 또는 식물 세포들과 같은 재조합 숙주들에 의한 스테비올 및 스테비올 글리코시드 가령, 루부소시드(rubusoside) 및/또는 리바우디오시드(rebaudioside) A의 생산에 관한 것이다. 본 교시는 또한 스테비올 글리코시드를 함유하는 조성물을 제공한다.
감미료는 식품, 음료 또는 과자 산업에서 가장 흔히 이용되는 성분들로 알려져 있다. 감미료는 생산 동안 최종 식품 산물에 통합될 수 있거나 또는 단독 용도로 적절하게 희석시켰을 때, 식탁 감미료 또는 베이킹에서 설탕을 대체하는 대체물로 이용할 수 있다. 감미료들은 예컨데 슈크로즈, 고과당 옥수수 시럽, 당밀, 메이플 시럽, 그리고 꿀과 같은 천연 감미료들, 그리고 인공 감미료들 예컨데 아스파르탐, 사카린 및 슈클로즈와 같은 인공 감미료들을 포함한다. 스테비아(stevia) 추출물은 다년생 관목, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 단리하고 추출할 수 있는 천연 감미료다. 스테비아는 스테비아 추출물의 상업적 생산을 위해 남아메리카 및 아시아에서 흔히 자란다. 다양한 수준으로 정제된 스테비아 추출물은 식품 및 블렌드에서 고감도 조미료로 상업적으로 이용되며, 또는 단독으로 식탁 감미료로 이용된다.
스테비아 식물의 추출물들은 리바우디오시드 및 단맛에 기여하는 기타 스테비올 글리코시드를 함유하지만, 각 글리코시드의 양은 상이한 생산 배취에 따라 흔히 변화한다. 기존의 시판 산물들은 주로 리바우디오시드 A이며, 기타 글리코시드 예컨데 리바우디오시드 C, D, 및 F의 양은 적다. 스테비아 추출물들은 오염물질들, 예컨데 이취(off-flavors)의 원인이 되는 식물에서 유도된 화합물들을 또한 함유할 수 있다. 이들 이취는 선택된 식품 시스템 또는 용도에 따라 대체로 문제가 될 수있다. 잠재적인 오염물질들은 색소, 지질, 단백질, 석탄산(phenolics), 사카라이드, 스파툴에놀(spathulenol) 그리고 기타 세스키테르펜, 라단 디테르펜(labdane diterpene), 모노테르펜(monoterpene), 데카논산, 8,11,14-에이코사트레에논산, 2-메틸옥사데칸, 펜타코산, 옥타코산, 테트라코산, 옥타데카놀, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, α- 및 β-아미린, 루페올, β-아미린 아세테이트, 펜타사이클 트리테르펜, 센타우레딘, 퀘르시틴, 에피-알파-카디놀, 카로필렌 및 유도물질, 베타-피넨, 베타-시토스테롤, 그리고 기베레린(gibberellin)을 포함한다.
요약
재조합 숙주, 예컨데 유전자의 발현에 의해 스테비올의 생산을 야기하는 하나 이상의 생합성 유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 이러한 유전자는 코팔일(copalyl) 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자, 카우렌(kaurene) 합성효소를 인코드하는 유전자, 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; 그리고 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자를 포함한다. 재조합 숙주는 코팔일 디포스페이트 합성효소와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자들을 대신하여, 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자를 포함할 수 있다. 이 유전자들중 최소한 하나는 재조합 유전자이다. 일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자를 더 포함한다. 재조합 숙주는 절두된(truncated) HMG-CoA 환원효소를 인코드하는 유전자 및/또는 CPR를 인코드하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 이들 유전자의 발현은 유도성(inducible)일 수 있다.
한 측면에서, 이 서류는 UGT91D2 폴리펩티드 (가령, UGT91D2e 또는 UGT91D2m 폴리펩티드)를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다. UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5에 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성 (가령, 최소한 95% 또는 99% 동일성)을 보유할 수 있다. UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, 또는 387-473에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, 및 438으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5과 비교하여 잔기 206에서 아르기닌, 잔기 207에서 시스테인, 그리고 잔기 343에서 아르기닌을 포함한다. 한 구체예에서, UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5과 비교하여 잔기 30에서 페닐알라닌, 잔기 93에서 글루타민, 잔기 99에서 발린, 잔기 122에서 페닐알라닌, 잔기 140에서 티로신, 잔기 142에서 시스테인, 잔기 148에서 트레오닌, 잔기 153에서 알라닌, 잔기 156에서 세린, 잔기 195에서 메티오닌, 잔기 196에서 글루타민산, 잔기 199에서 글루타민산, 잔기 211에서 메티오닌, 잔기 221에서 페닐알라닌, 잔기 286에서 알라닌, 잔기 427에서 아스파라진, 또는 잔기 438에서 알라닌을 포함한다. 폴리펩티드는 서열 번호:5 또는 서열 번호:95의 아미노산 서열을 보유할 수 있다.
여기에서 설명된 숙주는 서열 번호:3에 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성을 보유하는 UGT85C 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, UGT85C 폴리펩티드는 서열 번호:3의 잔기 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, 및 471에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
여기에서 설명된 숙주는 서열 번호:7에 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성을 보유하는 UGT76G 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, UGT76G 폴리펩티드는 서열 번호:7의 잔기 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 하나 이상의 아미노산 치환을 보유할 수 있다.
이 문서는 서열 번호:3에 나타낸 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성이며, 그리고 서열 번호:3의 잔기 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, 및 471에서 하나 이상의 아미노산 치환을 보유하는 UGT85C 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 또한 특징으로 한다. 예를 들면, UGT85C 폴리펩티드는 서열 번호:3의 잔기 13, 15, 60, 270, 289, 및 418에서 치환들을 포함할 수 있다. 예를 들면, UGT85C 폴리펩티드는 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호:3의 잔기 13, 60, 및 270에서 치환; b) 서열 번호:3의 잔기 60 및 87에서 치환; c) 서열 번호:3의 잔기 65, 71, 220, 243, 및 270에서 치환; d) 서열 번호:3의 잔기 65, 71, 220, 243, 270, 및 441에서 치환; e) 서열 번호:3의 잔기 65, 71, 220, 389, 및 394에서 치환; f) 서열 번호:3의 잔기 65, 71, 270, 및 289에서 치환; g) 서열 번호:3의 잔기 15 및 65에서 치환; h) 서열 번호:3의 잔기 65 및 270에서 치환; i) 서열 번호:3의 잔기 65 및 440에서 치환; j) 서열 번호:3의 잔기 65 및 441에서 치환; k) 서열 번호:3의 잔기 65 및 418에서 치환; l) 서열 번호:3의 잔기 220, 243, 270, 및 334에서 치환; 또는 m) 서열 번호:3의 잔기 270 및 289에서 치환.
또다른 측면에서, 이 문서는 서열 번호:7에 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성을 보유하고, 그리고 잔기 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 하나 이상의 아미노산 치환을 보유하는 UGT76G 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다. 예를 들면, UGT76G 폴리펩티드는 다음을 보유할 수 있다: a) 아미노산 잔기 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 및 291에서 치환; b) 잔기 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 및 291에서 치환; 또는 c) 잔기 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 치환.
여기에서 설명된 임의의 숙주는 UGT74G1 폴리펩티드를 인코드하는 유전자 (가령, UGT74G1 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자)를 더 포함할 수 있다.
여기에서 설명된 임의의 숙주는 다음중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자; (ii) 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 또는 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자; (iii) 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; (iv) 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자; (v) 절두된 HMG-CoA를 인코드하는 유전자; (vi) CPR를 인코드하는 유전자; (vii) 람노오즈 합성효소를 인코드하는 유전자; (viii) UDP-글루코오즈 탈수소효소를 인코드하는 유전자; 그리고 (ix) UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제를 인코드하는 유전자. (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), 또는 (ix)의 유전자중 최소한 하나의 유전자는 재조합 유전자일 수 있다. 일부 구체예들에서, (i), (ii), (iii), 및 (iv)의 각 유전자는 재조합 유전자이다.
이 문서는 서열 번호:5에 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 서열 동일성 (가령, 최소한 95% 또는 99% 서열 동일성)을 보유하는 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산을 또한 특징으로 한다. 이 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, 또는 387-473에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, 및 438으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 206에서 아르기닌, 잔기 207에서 시스테인, 및 잔기 343에서 아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 30에서 페닐알라닌, 잔기 93에서 글루타민, 잔기 99에서 발린, 잔기 122에서 페닐알라닌, 잔기 140에서 티로신, 잔기 142에서 시스테인, 잔기 148에서 트레오닌, 잔기 153에서 알라닌, 잔기 156에서 세린, 잔기 195에서 메티오닌, 잔기 196에서 글루타민산, 잔기 199에서 글루타민산, 잔기 211에서 메티오닌, 잔기 221에서 페닐알라닌, 잔기 286에서 알라닌, 잔기 427에서 아스파라진, 또는 잔기 438에서 알라닌을 포함한다.
또다른 측면에서, 이 문서는 서열 번호:50에 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 보유하는 단리된 폴리펩티드를 특징으로 한다.
이 문서는 다음을 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다: (i) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자; (ii) 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 또는 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자; (iii) 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; 그리고 (iv) 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자; 여기에서 상기 유전자들중 최소한 하나는. 이 숙주는 각 유전자들이 발현되는 조건하에 배양하였을 때 스테비올을 생산할 수 있고, 그리고 배양 배지에 최소한 1 mg/L까지 축적시킬 수 있다. 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소는 서열 번호: 121-128에 제시된 아미노산 서열중 하나에 90% 이상의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 코팔일 디포스페이트 합성효소는 서열 번호:129-131에 제시된 아미노산 서열중 하나에 90% 이상의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 카우렌 합성효소는 서열 번호:132-135에 제시된 아미노산 서열중 하나에 90% 이상의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 카우렌 산화효소는 서열 번호:138-141에 제시된 아미노산 서열중 하나에 90% 이상의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 스테비올 합성효소는 서열 번호:142-146에 제시된 아미노산 서열중 하나에 90% 이상의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 이 숙주는 절두된 HMG-CoA를 인코드하는 유전자 및/또는 CPR를 인코드하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
임의의 재조합 숙주들은 UGT74G1 폴리펩티드, UGT85C2 폴리펩티드, UGT76G1 폴리펩티드, 또는UGT91D2 폴리펩티드를 인코드하는 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있다.
임의의 재조합 숙주들은 유전자들 각각이 발현되는 조건하에서 배양하였을 때 최소한 하나의 스테비올 글리코시드를 생산할 수 있다. 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 B, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 D, 리바우디오시드 E, 리바우디오시드 F, 그리고 둘코시드 A으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 전술한 조건에서 배양하였을 때 스테비올 글리코시드는 배양 배지의 L당 최소한 1mg까지 축적될 수 있다(가령, 최소한 10 mg/liter 또는 20 mg/liter).
임의의 재조합 숙주들은 다음중 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있다: i) 데옥시크실로즈 5-포스페이트 합성효소 (DXS)를 인코드하는 유전자; ii) D-1-데옥시크실로즈 5-포스페이트 환원이성질화효소(reductoisomerase) (DXR)를 인코드하는 유전자; iii) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 합성효소 (CMS)를 인코드하는 유전자; iv) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 (CMK)를 인코드하는 유전자; v) 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 (MCS)를 인코드하는 유전자; vi) 1-하이드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 합성효소 (HDS)를 인코드하는 유전자를 인코드하는 유전자; 또는 vii) 1-하이드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소 (HDR)를 인코드하는 유전자.
임의의 재조합 숙주들은 다음중 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있다: ix) 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코드하는 유전자; x) 절두된 HMG-CoA 환원효소를 인코드하는 유전자; xi) 메발로네이트 키나제를 인코드하는 유전자; xii) 포스포메발로네이트 키나제를 인코드하는 유전자; 또는 xiii) 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제를 인코드하는 유전자.
여기에서 설명된 임의의 숙주에 있어서, 하나 이상의 유전자의 발현은 유도성일 수 있다.
여기에서 설명된 임의의 숙주는 미생물 (가령, 사카로미세트 예컨데 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli)), 또는 식물 또는 식물 세포 (가령, 스테비아((Stevia), 예컨데 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana), 피스코미트렐라(피스코미트렐라(Physcomitrella)), 또는 담배 식물 또는 식물 세포)일 수 있다.
또다른 측면에서, 이 문서는 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 이 유전자들이 발현되는 조건들하에서 배양배지에 여기에서 설명된 숙주를 성장시키고; 그리고 이 숙주에 의해 생산된 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 회수하는 것을 포함한다. 성장 단계는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함할 수 있다. 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올-19-O-글루코시드, 루부소시드, 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 B, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 D, 리바우디오시드 E, 리바우디오시드 F, 및 둘코시드 A로 구성된 군으로부터 선택된다.
스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 생산하는 방법을 또한 제공한다. 이 방법은 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소, 코팔일 디포스페이트 합성효소, 카우렌 합성효소, 카우렌 산화효소, 카우레논산 13-하이드록시라제 유전자 및 임의선택적으로UGT74G1 및/또는 UGT85C2 유전자가 발현되는 조건들하에서 배양배지에 미생물을 성장시키고; 그리고 이 미생물에 의해 생산된 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 회수하는 것을 포함한다. 이 미생물은 사카로미세스 종(Saccharomyces spp)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 성장 단계는 하나 이상의 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소, 코팔일 디포스페이트 합성효소, 카우렌 합성효소, 카우렌 산화효소, 카우레논산 13-하이드록시라제, UGT74G1 및 UGT85C2 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 회수 단계는 배양 배지로부터 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 HPLC에 의해 순수분리하는 것을 포함한다. 스테비올 또는 스테비올 글리코시드은 스테비올, 루부소시드, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 F, 또는 둘코시드 A일 수 있다.
유전자의 발현으로 ent-카우렌의 생산을 초래하는 하나 이상의 생합성 유전자를 포함하는 재조합 사카로마이세스(Saccharomyces) 균주를 또한 제공한다. 이생합성 유전자은 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 또는 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자를 포함한다. 균주는 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소의 발현시 ent-카우렌을 생산한다.
또다른 측면에서, 이 문서는 서열 번호: 18-25, 34-36, 4-43, 48, 49, 52-55, 60-64, 70-72, 77, 또는 79에 제시된 뉴클레오티드 서열중 하나에 90% 이상의 서열 동일성(가령, 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성)을 가진 단리된 핵산을 특징으로 한다.
이 문서는 다음을 포함하는 재조합 숙주를 특징으로 한다: (i) UGT74G1를 인코드하는 유전자; (ii) UGT85C2를 인코드하는 유전자; (iii) UGT76G1를 인코드하는 유전자; 그리고 (iv) UGT91D2를 인코드하는 유전자, 여기에서 상기 유전자들중 최소한 하나는 재조합 유전자이다. 일부 구체예들에서, 이들 각 유전자는 재조합 유전자이다. 이 숙주는 이들 각 유전자가 발현되는 조건들하에서 배양하였을 때, 최소한 하나 스테비올 글리코시드를 생산할 수 있다. 이 숙주는 다음을 더 포함할 수 있다: (a) 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 또는 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자; (b) 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; (c) 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자; 그리고 (d) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자. 스테비올 글리코시드는 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 D 또는 리바우디오시드 E일 수 있다. 이 문서는 이러한 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물을 또한 특징으로 한다. 이 조성물은 스테비올 글리코시드의 총 중량에서 4% 이상의 리바우디오시드 D와 스테비아 추출물과 비교하여 감소된 수준의 스테비아 식물에서 유도된 오염물질들을 보유할 수 있다. 이 조성물은 스테비올 글리코시드의 총 중량에서 4% 이상의 리바우디오시드 E와 스테비아 추출물과 비교하여 감소된 수준의 스테비아 식물에서 유도된 오염물질들을 보유할 수 있다.
UGT91D2m의 아미노산 서열을 제외하고, UGT91D2e 및 UGT91D2m의 아미노산 서열에 90% 이상의 서열 동일성을 보유하는 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산 뿐만 아니라 UGT91D2m의 아미노산 서열을 제외하고, UGT91D2e 또는 UGT91D2m의 아미노산 서열에 90% 이상의 서열 동일성을 보유하는 단리된 폴리펩티드를 또한 특징으로 한다.
이 문서는 여기에서 설명된 숙주에 의해 생산되는 스테비올 글리코시드 조성물을 또한 특징으로 한다. 이 조성물은 스테비아 추출물과 비교하여 스테비아 식물에서 유도된 오염물질들의 수준이 감소된다.
또다른 측면에서, 이 문서는 재조합 숙주를 특징으로 한다. 이 숙주는 다음을 포함한다: (i) UGT91D2를 인코드하는 재조합 유전자; (ii) UGT74G1를 인코드하는 재조합 유전자; (iii) UGT85C2를 인코드하는 재조합 유전자; (iv) UGT76G1를 인코드하는 재조합 유전자; 그리고 (v) 람노오즈 합성효소를 인코드하는 재조합 유전자, 여기에서 이 숙주는 이들 각 유전자들이 발현되는 조건하에 배양하였을 때, 최소한 하나 스테비올 글리코시드를 생산한다. 이 숙주는 다음을 더 포함할 수 있다: (a) 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 또는 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자; (b) 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; (c) 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자; 그리고 (d) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자. 스테비올 글리코시드는 리바우디오시드 C 또는 둘코시드 A일 수 있다. 이 문서는 이러한 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물을 또한 특징으로 한다. 이 조성물은 스테비올 글리코시드의 총 중량에 대해 15%이상의 리바우디오시드 C를 보유하며, 그리고 스테비아 추출물과 비교하여 스테비아 식물에서 유도된 오염물질들 의 수준이 감소된다. 이러한 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물을 또한 특징으로 한다. 이 조성물은 스테비올 글리코시드의 총 중량에 대해 15%이상의 둘코시드를 보유하며, 그리고 스테비아 추출물과 비교하여 스테비아 식물에서 유도된 오염물질들 의 수준이 감소된다.
이 문서는 재조합 숙주를 또한 특징으로 한다. 이 숙주는 다음을 포함한다 (i) UGT91D2를 인코드하는 재조합 유전자; (ii) UGT74G1를 인코드하는 재조합 유전자; (iii) UGT85C2를 인코드하는 재조합 유전자; (iv) UGT76G1를 인코드하는 재조합 유전자; (v) UDP-글루코오즈 탈수소효소를 인코드하는 재조합 유전자; 그리고 (vi) UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제를 인코드하는 재조합 유전자, 여기에서 이 숙주는 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에 배양하였을 때, 최소한 하나 스테비올 글리코시드를 생산한다. 이 숙주는 다음을 더 포함할 수 있다: (a) 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 또는 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자; (b) 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자; (c) 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자; 그리고 (d) 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자. 스테비올 글리코시드는 리바우디오시드 F일 수 있다. 이 문서는 이러한 숙주들에 의해 생산되는 스테비올 글리코시드 조성물을 또한 특징으로 한다. 이 조성물은 스테비올 글리코시드의 총 중량에서 4% 이상의 리바우디오시드 F와 스테비아 추출물과 비교하여 감소된 수준의 스테비아 식물에서 유도된 오염물질들을 보유할 수 있다.
또다른 측면에서, 이 문서는 스테비올 글리코시드 조성물을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에서 배양 배지안에 여기에서 설명된 숙주를 성장시키고; 그리고 이 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물을 회수하는 것을 포함하며, 여기에서 회수된 조성물에는 야생형 스테비아 식물의 스테비올 글리코시드 조성물과 비교하여 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 D, 리바우디오시드 E, 리바우디오시드 F 또는 둘코시드 A가 풍부하다. 이 숙주(가령, 미생물)에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비아 추출물과 비교하여 스테비아 식물에서 유도된 오염물질이 감소된 수준을 보유할 수 있다.
이 문서는 야생형 스테비아 식물의 스테비올 글리코시드 조성물과 비교하여 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 D, 리바우디오시드 E, 리바우디오시드 F 또는 둘코시드 A가 풍부한 스테비올 글리코시드 조성물을 포함하는 식품을 또한 특징으로 한다.
또다른 측면에서, 이 문서는 형질의 변이와 연관있는지를 확인하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 식물 집단에서 하나 이상의 유전적 다형성이 서열 번호:5에 제시된 폴리펩티드 및 이의 기능적 동사체에 대한 유전자 좌(locus)와 관련있는지를 결정하고; 그리고 식물들 집단의 형질의 변이와 식물들 집단에서 하나 이상의 유전적 다형성의 존재 사이에 상관관계를 측정하고, 이에 의해 하나 이상의 유전적 다형성이 형질에서 변이와 연관있는지를 확인하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 이 문서는 식물 계통을 만드는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 식물 집단에서 하나 이상의 유전적 다형성이 서열 번호:5에 제시된 폴리펩티드 및 이의 기능적 동사체에 대한 유전자 좌(locus)와 관련있는지를 결정하고; 하나 이상의 유전적 다형성의 존재가 형질의 변이와 연관된 집단에서 하나 이상의 식물들을 확인하고; 확인된 식물들중 하나 이상을 자체와 또는 상이한 식물들과 교배하여 종자를 생산하고; 종자로부터 성장한 최소한 하나 후손 식물과 자체 또는 상이한 식물을 교배하고; 그리고 전술한 식물 계통을 만들기 위하여 추가 0-5 세대 동안 교배 단계를 반복하는 것을 포함하고, 여기에서 유전적 다형성중 최소한 하나는 식물 계통에 존재한다.
이 문서는 스테비올 글리코시드에서 글루코오즈의 C-2'로 제 2 슈가 모이어티를 이동시키는 방법을 또한 특징으로 한다. 이 방법은 스테비올 글리코시드로 제 2 슈가 모이어티를 이동시키기 위하여 적합한 반응 조건들 하에서 스테비올 글리코시드에 UGT91D2 폴리펩티드와 UDP-슈가를 접촉시키는 것을 포함한다. UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5에 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 서열 동일성 (가령, 최소한 95% 또는 99%)을 보유할 수 있다. UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, 또는 387-473에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. UGT91D2 폴리펩티드는 서열 번호:5의 잔기 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, 및 438으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드, 루부소시드, 스테비오시드, 및 리바우디오시드 A로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 스테비올 글리코시드는 루부소시드일 수 있으며, 그리고 제 2 슈가 모이어티는 글루코오즈이며, 그리고 스테비오시드는 제 2 글루코오즈 모이어티의 이전시 생산된다. 스테비올 글리코시드는 스테비오시드일 수 있으며, 그리고 제 2 슈가 모이어티는 글루코오즈일 수 있으며, 그리고 리바우디오시드 E는 제 2 글루코오즈 모이어티의 이전시 생산된다. 스테비올 글리코시드는 스테비오시드일 수 있고, 여기에서 리바우디오시드 D를 생산하기 위한 적합한 반응 조건들하에서 스테비오시드는 UGT91D2 폴리펩티드 및 UGT76G1 폴리펩티드와 접촉된다. 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드일 수 있고, 스테비올-1,2 바이오시드는 전술한 제 2 글루코오즈 모이어티의 이전시 생산된다. 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드일 수 있고, 그리고 스테비올-1,2-크실로바이오시드는 제 2 글루코오즈 모이어티의 이전시 생산된다. 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드일 수 있고 그리고 스테비올-1,2-람노바이오시드는 제 2 글루코오즈 모이어티의 이전시 생산될 수 있다. 스테비올 글리코시드는 리바우디오시드 A일 수 있고, 그리고 리바우디오시드 D는 제 2 글루코오즈 모이어티의 이전시 생산된다
또다른 측면에서, 이 문서는 스테비아 식물에서 폴리뉴클레오티드의 존재를 결정하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 최소한 하나 프로브 또는 프라이머 쌍을 스테비아 식물로부터 얻은 핵산과 접촉시키고, 여기에서 이 프로브 또는 프라이머 쌍은 UGT 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 특이적이며, 여기에서 UGT 폴리펩티드 서열 번호: 5, 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호:7에 최소한 90% 서열 동일성을 보유하며, 그리고 전술한 스테비아 식물에 이 폴리뉴클레오티드가 존재하는지를 결정하는 것을 포함한다.
이 문서는 스테비아 생물학적 시료의 유전자형을 결정하기(genotyping) 위한 키트를 또한 특징으로 한다. 이 키트는 서열 번호: 5, 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호:7에 최소한 90% 서열 동일성을 보유하는 UGT 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭시키는 프라이머 쌍, 또는 이 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화되는(hybridizes) 프로브를 포함한다.
유전자의 발현으로 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 생산하게 되는 하나 이상의 생합성 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 또한 여기에서 제공한다. 이 생합성 유전자는 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자, 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자 그리고 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자, 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자, 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자, 그리고 UGT74G1 및/또는 UGT85C2를 인코드하는 유전자를 포함한다. 이 유전자들의 최소한 하나는 재조합 유전자이다. 이 미생물은 코팔일 디포스페이트 합성효소와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자들을 대신하여 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자를 포함할 수 있다.
이 재조합 미생물은 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에 배양하였을 때 최소한 하나 스테비올 글리코시드를 생산한다. 스테비올 글리코시드는 루부소시드, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 F, 둘코시드 B, 또는 둘코시드 A일 수 있다.
이 재조합 미생물은 가령, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있고, 그리고 이러한 유전적 변형이 부족한 대조군 미생물과 비교하여 EXG1 및 EXG2 글리코시드 가수분해효소 활성을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 보유할 수 있고, 그리고 이러한 유전적 변형이 부족한 대조군 미생물과 비교하여 에르고스테롤 생합성을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 보유할 수 있다. 사카로마이세트(Saccharomycete)는 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에 배양하였을 때 루부소시드를 생산한다. 이 루부소시드는 배양 배지 L당 최소한 10mg까지 축적할 수 있다. 이 사카로마이세트(Saccharomycete)는 CEY171, CEY191, 또는 CEY213으로 명명된 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있다.
이 재조합 미생물은 SM12UGT를 인코드하는 유전자와 UGT76G1를 인코드하는 유전자를 더 포함할 수 있고, 그리고 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에 배양하였을 때 스테비올 글리코시드를 생산할 수 있다. 스테비올 글리코시드는 리바우디오시드 A일 수 있다.
하나 이상의 생합성 유전자를 포함하여, 이들 유전자의 발현으로 최소한 하나의 스테비올 글리코시드를 생산하는 재조합 미생물을 또한 여기에서 제공한다. 이 생합성 유전자는 SM12UGT를 인코드하는 유전자, UGT74G1를 인코드하는 유전자, UGT76G1를 인코드하는 유전자와 UGT85C2를 인코드하는 유전자를 포함한다. 이 재조합 미생물은 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에 배양하였을 때 리바우디오시드 A 또는 리바우디오시드 B를 생산한다. 이 리바우디오시드 A 또는 리바우디오시드 B는 배양 배지에서 L 당 최소한 1mg까지 축적할 수 있다.
UGT91D2 폴리펩티드, 가령, 재조합 UGT91D2 유전자를 인코드는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 또한 특징으로 한다.
게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자, 이중기능의 코팔일 디포스페이트 합성효소 및 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자 (또는 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자와 카우렌 합성효소를 인코드하는 유전자), 카우렌 산화효소를 인코드하는 유전자, 스테비올 합성효소를 인코드하는 유전자, UGT74G1를 인코드하는 유전자, UGT85C2를 인코드하는 유전자, UGT76G1를 인코드하는 유전자, 그리고 UGT91D2를 인코드하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 또한 특징으로 한다. 이들 유전자중 최소한 하나는 재조합 유전자이다. 이 재조합 미생물은 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에 배양하였을 때 최소한 하나 스테비올 글리코시드, 가령, 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 B, 및/또는 리바우디오시드 F를 생산할 수 있다. 이 재조합 미생물은 이러한 조건들하에서 배양하였을 때, 배양 배지 L당 최소한 20 mg의 스테비올 글리코시드를 축적할 수 있다. 이 재조합 미생물는 사카로마이세트(Saccharomycete), 가령, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있고, 이러한 유전적 변형이 부족한 대조군 미생물과 비교하여 EXG1 및 EXG2 글리코시드 가수분해효소 활성을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 보유할 수 있고, 그리고 이러한 유전적 변형이 부족한 대조군 미생물과 비교하여 에르고스테롤 생합성을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 보유할 수 있다.
UGT74G1를 인코드하는 유전자, UGT85C2를 인코드하는 유전자, UGT76G1를 인코드하는 유전자, 그리고 UGT91D2를 인코드하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 또한 특징으로 한다. 이들 유전자중 최소한 하나는 재조합 유전자이다. 이 재조합 미생물은 이들 각 유전자가 발현되는 조건하에 배양하였을 때, 스테비올 글리코시드, 가령, 리바우디오시드 A 또는 리바우디오시드 B를 생산할 수 있다. 리바우디오시드 A 또는 리바우디오시드 B는 배양 배지에서 L당 최소한 15mg까지 축적할 수 있다.
상기에서 설명된 재조합 미생물은 데옥시크실로즈 5-포스페이트 합성효소 (DXS)를 인코드하는 유전자, 및/또는 D-1-데옥시크실로즈 5-포스페이트 환원이성질화효소 (DXR)를 인코드하는 유전자, 및/또는 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 합성효소 (CMS)를 인코드하는 유전자, 및/또는 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 (CMK)를 인코드하는 유전자, 및/또는 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 (MCS)를 인코드하는 유전자, 및/또는 1-하이드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 합성효소 (HDS)를 인코드하는 유전자, 및/또는 1-하이드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소 (HDR)를 인코드하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
상기에서 설명된 재조합 미생물은 아세토아세틸-CoA 티올라제를 인코드하는 유전자, 및/또는 절두된 HMG-CoA 환원효소를 인코드하는 유전자, 및/또는 메발로네이트 키나제를 인코드하는 유전자, 및/또는 포스포메발로네이트 키나제를 인코드하는 유전자를 인코드하는 유전자, 및/또는 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제를 인코드하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
다른 정의가 없는 한, 여기에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 해당 기술분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 적합한 방법들 및 재료들을 하기에서 설명하지만 여기에서 설명된 것들에 유사한 또는 등가의 방법들 및 재료들을 이용하여 본 발명을 실행할 수 있다. 여기에서 언급된 모든 공개, 특허 출원 및 기타 자료들은 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 충돌되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조절할 것이다. 또한, 재료, 방법들 및 예시들은 오로지 설명을 위한 것이며, 그리고 이에 제한하는 의도는 아니다. 본 발명의 기타 특징들과 장점들은 다음의 상세한 설명으로부터 자명할 것이다. 출원인은 특허법의 표준 관행에 따라, 통상적인 구절 "포함하는("comprising)", 기본적으로 구성된("consisting essentially of"), 또는 구성된("consisting of")을 이용하여 본 발명에서 임의로 공개된 발명을 대안으로 청구하는 권리를 가진다.
도 1은 게라닐게라닐 디포스페이트로부터 스테비올의 생합성을 설명하는 계획안이다.
도 2A-D는 스테비올로부터 스테비올 글리코시드의 생합성을 위한 대표 경로들을 나타낸다.
도 3은 다양한 스테비올 글리코시드의 화학적 구조들을 나타낸다.
도 4는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서 rebA 생산을 도식으로 나타낸 것이다.
도 5는 eYACs를 형성하기 위하여 유전자의 연쇄(concatenation)를 도식으로 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 배양 조건들 하에서 효모 균주 CEY13에 의한 루부소시드 생산을 보여준다.
도 7은 루부소시드에 대한 문헌의 값과 비교하였을 때, 효모 균주 CEY213에 의해 생산된 화합물의 1H 및 13C NMR 분석으로 얻은 데이터를 보여준다.
도 8은 UGT91D1 및 UGT91D2 아미노산 서열(차례로 서열 번호:14, 16, 12, 5, 및 10)의 배열이다.
도 9는 24시간 및 99 시간 배양 후, 플라스미드 pMUS47를 함유하는 효모 CEY213에 의한 리바우디오시드 A, 스테비오시드, 및 루부소시드 생산을 보여준다.
도 10A는 상청액내 RebA, 루부소시드 및 19-SMG의 농도를 설명하는 그래프다. 도 10B는 효모 세포들에게 100 M 스테비올을 공급하였던 실험들에서 세포 펠렛 안에서 측정된 RebA, 루부소시드 및 19-SMG의 농도를 나타내는 그래프다. 이 두 그래프에서, 첫 번째 막대들은 테그안된(untagged) 대조군 균주들을 나타내고; 두 번째 막대는 UGT74G1, UGT76G1, 및 UGT91D2e 융합 단백질 그리고 UGT85C2 융합 단백질을 함유하는 균주를 나타내는데, 여기에서 MDM2 단백질의 N-말단 158개 아미노산은 각 UGT에 융합되며, UGT85C2 융합 단백질에서 합성 PMI 펩티드의 4개 반복체는 85C2의 N-말단에 인-프레임안에서 융합된다. y-축은 마이크로몰 단위의 농도를 나타낸다.
다양한 도면에서 기준 기호는 유사한 요소들을 가리킨다.
두 가지 글리코시드, 스테비오시드와 리바우디오시드 A는 상업적으로 생산되는 스테비아 추출물들에서 주요 화합물들이다. 스테비오시드는 리바우디오시드 A보다는 더 쓴 맛을 가지고, 단 맛이 덜하며, 따라서 추출물 준비물에서 리바우디오시드 A의 비율이 더 높은 것이 바람직하다고 전하고 있다. 그러나, 스테비아 추출물의 조성물은 식물들이 성장한 토양 및 기후에 따라 로트(lot)마다 다변할 수 있다. 원천이 되는 식물, 기후 조건, 그리고 추출 공정에 따라, 시판되는 조제물에서 리바우디오시드 A의 양은 전체 스테비올 글리코시드 함량의 20 내지 97%까지 다양하며, 일반적으로 >50-80%이며, 일부 경우 전체 스테비올 글리코시드의 >95-97%를 초과하는 많은 양이 포함된다고 전한다. 더욱이, 기타 스테비올 글리코시드는 스테비아 추출물들에서 다양한 양으로 존재하는데, 이는 스테비아 식물들로부터 추출 및 정제에 의해 일관된 맛 프로파일을 가진 감미료를 생산하는 능력을 더 복합시킨다. 예를 들면, 리바우디오시드 B는 일반적으로 1-2% 미만으로 존재하는 반면, 리바우디오시드 C는 7-15%와 같은 높은 수준으로 존재할 수 있다. 리바우디오시드 D는 전형적으로 2% 이하의 수준으로 존재하며, 그리고 리바우디오시드 F는 전형적으로 전체 스테비올 글리코시드의 3.5% 이하에서 조성물에 존재한다. 소수의 스테비올 글리코시드의 미량이라도스테비아 추출물의 풍미 프로파일에 영향을 주는 것으로 전한다. 추가적으로, 스테비아 식물의 오염물질들중 일부는 매우 낮은 농도에서 조차도 상업적으로 이용가능한 식물 추출물들의 일부에 이취를 또한 제공할 수 있는 것으로 본다.
이 문서는 재조합 숙주들 예컨대, 식물 세포들, 식물들, 또는 미생물은 스테비올의 생합성에 유용한 폴리펩티드를 발현시키도록 개발할 수 있다는 발견에 근거한다. 더우기, 이러한 숙주들은 스테비올 글리코시드 예컨대, 루부소시드 및 리바우디오시드 A를 생산하는데 적합한 우리딘 5'-디포스포 (UDP) 글리코실전이효소를 발현시킬 수 있다. 재조합 미생물은 특히 유용한 숙주들이다. 다양한 미생물의 섀시(chassis)에서 이러한 생합성 폴리펩티드들의 발현으로 예컨데 슈가, 글리세롤, CO2, H2, 및 태양광과 같은 에너지 및 탄소원으로부터 일관되고, 재생가능한 방식으로 스테비올 및 이의 글리코시드를 생산할 수 있도록 한다. 일관된 맛 프로파일을 가진 감미료 조성물을 생산하기 위하여, 사전선택된 생합성 효소들을 숙주 안으로 통합시키고 적절한 수준에서 이들을 발현시킴으로써 재조합 숙주에 의해 생산된 각 스테비올 글리코시드의 비율을 맞출 수 있다. 더우기, 재조합 숙주에 의해 생산된 스테비올 글리코시드의 농도는 스테비아 식물에서 생산되는 스테비올 글리코시드의 수분보다 더 놓을 것으로 예상되며 이는 하류 공정의 효율을 개선시킨다. 이러한 감미료 조성물들은 스테비아 추출물들에 존재하는 오염물질들의 양과 비교하여 식물 기반의 오염물질들이 거의 없거나 또는 없다.
이들 유전자중 최소한 하나는 재조합 유전자, 용도에 의해 선택된 종 또는 균주에 따른 특정 재조합 유전자(들)이다. 스테비올 및 글리코시드 수율을 증가시키고, 에너지 및 탄소원이 스테비올 및 이의 글리코시드로 전환되는 효율을 개선시키고, 및/또는 세포 배양물 또는 식물로부터의 생산성을 강화시키기 위하여 추가적인 유전자 또는 생합성 모듈을 포함시킬 수 있다. 이러한 추가적인 생합성 모듈은 테르페노이드 전구물질들, 이소펜테닐 디포스페이트 및 디메틸알릴 디포스페이트의 생합성에 관련된 유전자를 포함한다. 추가적인 생합성 모듈은 테르펜 합성효소 및 테르펜 시클라아제 유전자, 예컨데 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소 및 코팔일 디포스페이트 합성효소를 인코드하는 유전자들을 포함하며; 이들 유전자는 내생성 유전자 또는 재조합 유전자일 수 있다.
I. 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들
A. 스테비올 생합성 폴리펩티드들
스테비아 추출물들에서 볼 수 있는 화합물들중 디테르펜 스테비올 및 다양한 스테비올 글리코시드를 포함하는 몇 가지에 대한 화학 구조들을 도 3에 나타낸다. CAS 번호는 하기 표 A에 나타낸다. Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, prepared by Harriet Wallin, 식품 Agric. Org. (2007) 참고.
표 A.
Figure pat00001
숙주 예컨데 미생물에서 특정 유전자의 발현은 숙주에서 스테비올을 합성하는 능력을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 하기에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 이러한 유전자중 하나 이상은 숙주에 자연적으로 존재할 수 있다. 그러나, 전형적으로, 이러한 유전자중 하나 이상은 자연상태에서 이들을 보유하지 않는 숙주로 형질도입시킨 재조합 유전자들이다.
스테비올을 생산하는 생화학적 경로는 게라닐게라닐 디포스페이트의 형성, (-) 코팔일 디포스페이트로 고리형성, 이어서 산화 및 하이드록실화에 의해 스테비올의 형성을 수반한다. 도 1 참고. 따라서, 재조합 미생물에서 게라닐게라닐 디포스페이트이 스테비올로의 전환은 카우렌 합성효소 (KS)를 인코드하는 유전자, 카우렌 산화효소 (KO)를 인코드하는 유전자, 그리고 스테비올 합성효소 (KAH)를 인코드하는 유전자의 발현과 관련된다. 스테비올 합성효소는 또한 카우레논산 13-하이드록시라제로 공지되어 있다.
적합한 KS 폴리펩티드들은 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 KS 효소들은 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana), 지아 메이즈(Zea mays) 및 포풀루스 트리초카르파(Populus trichocarpa)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 서열 번호: 132-135 참고. 이들 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 하기에서 더 상세하게 설명한다. 예를 들면, 표 3 및 서열 번호: 40-47 참고.
적합한 KO 폴리펩티드들은 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 KO 효소들은 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 기베레라 푸지코로이(Gibberella fujikoroi) 및 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 서열 번호: 138-141 참고. 이들 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 하기에서 더욱 상세하게 설명한다. 예를 들면, 표 5 및 서열 번호: 52-59 참고.
적합한 KAH 폴리펩티드들은 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 KAH 효소들은 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 비티스 비니페라(Vitis vinifera) 그리고 메디카고 투룬쿨라타(Medicago trunculata)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 가령, 서열 번호: 142-146 참고; U.S. 특허 공개 번호 2008-0271205; U.S. 특허 공개 번호 2008-0064063 및 Genbank Accession No. gi 189098312. 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 스테비올 합성효소는 CYP714A2로 분류된다. 이들 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 하기에서 더욱 상세하게 설명한다. 예를 들면, 표 6 및 서열 번호: 60-69 참고.
일부 구체예들에서, 재조합 미생물은 KO 및/또는 KAH 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 함유한다. 이러한 미생물은 사이토크롬 P450 환원효소 (CPR) 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 또한 함유하는데, 그 이유는 KO 및/또는 KAH 폴리펩티드들의 특정 조합은 외생 CPR 폴리펩티드의 발현을 요구하기 때문이다. 특히, 식물 기원의 KO 및/또는 KAH 폴리펩티드의 활성은 외생 CPR 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자의 함입에 의해 상당히 증가될 수 있다. 적합한 CPR 폴리펩티드들은 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 CPR 효소들은 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 그리고 기베레라 푸지코로이(Gibberella fujikoroi)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 가령, 서열 번호: 147-149 참조. 이들 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들 하기에서 더욱 상세하게 설명한다. 예를 들면, 표 7 및 서열 번호: 70-75 참고.
재조합 미생물에서 이들 유전자의 발현으로 게라닐게라닐 디포스페이트가 스테비올로 전환된다.
B. 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들
일부 구체예들에서, 여기에서 설명된 재조합 숙주는 스테비올을 스테비올 글리코시드로 전환시킬 수 있다. 이러한 숙주(가령, 미생물)는 UGTs로도 알려진 하나 이상의 UDP 글리코실전이효소를 인코드하는 유전자를 함유한다. UGTs는 활성화된 뉴클레오티드 슈가로부터 수용체 모이어티, 이 경우, 스테비올 또는 스테비올 유도체에서 -OH 또는 COOH 모이어티로 모노사카라이드 단위를 이전시킨다. UGT는 서열 상동성에 근거하여 족(families) 및 아족(subfamilies)으로 분류된다. Li et al. J. Biol. Chem. 276:4338-4343 (2001).
B. 1 루부소시드 생합성 폴리펩티드들
루부소시드의 생합성은 스테비올의 13-OH 와 19-COOH 의 당화(glycosylation)와 관련있다. 도 2A 참고. 재조합 숙주 예컨대, 미생물에서 스테비올이 루부소시드로 전환은 UGTs 85C2 및 74G1를 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 이루어질 수 있고, 이들은 차례로 스테비올의 13-OH 또는 19-COOH로 글루코오즈 단위를 이전시킨다는 것을 알았다.
따라서, 적합한 UGT85C2는 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올 13-OH 전이효소, 그리고 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올-19-O-글루코시드 13-OH 전이효소로 작용한다. 기능을 하는 UGT85C2 폴리펩티드들은 스테비올 및 스테비올-19-O-글루코시드 이외의 스테비올 글리코시드 기질들을 이용하는 글루코실 전이효소 반응들을 또한 촉매할 수 있다.
적합한 UGT74G1 폴리펩티드는 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올 19-COOH 전이효소 및 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올-13-O-글루코시드 19-COOH 전이효소로 기능을 한다. 기능을 하는 UGT74G1 폴리펩티드들은 스테비올 및 스테비올-13-O-글루코시드 이외의 스테비올 글리코시드 기질들을 이용하는, 또는 우리딘 디포스페이트 글루코오즈이외의 기증자로부터 슈가 모이어티를 이전시키는 글리코실전이효소 반응을 또한 촉매할 수 있다.
기능을 하는 UGT74G1 및 기능을 하는 UGT85C2를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 스테비올이 제공될 때, 루부소시드 및 두 가지 스테비올 모노시드들 (예컨데, 스테비올 13-O-모노글루코시드과 스테비올 19-O-모노글루코시드)을 만들 수 있다. 이러한 유전자중 하나 이상은 이 숙주안에 자연적으로 존재할 수 있다. 그러나 전형적으로, 이러한 유전자들은 이들을 원래 보유하지 않는 숙주 (가령, 미생물)로 형질도입된 재조합 유전자들이다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 재조합 숙주는 최소한 하나 통합된 DNA 서열에 의해 보강된 게놈을 가진 숙주를 의미한다. 이러한 DNA 서열들은 자연 상태에는 존재하지 않는, 유전자, 정상적으로 RNA로 전사되지 않거나 또는 단백질로 해독되지 않는("발현된") DNA 서열들, 그리고 비-재조합 숙주 안으로 도입되기를 바라는 기타 유전자 또는 DNA 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 설명된 재조합 숙주의 게놈은 하나 이상의 재조합 유전자의 안정적인 도입을 통하여 보강되는 것으로 인지할 것이다. 일반적으로, 도입된 DNA는 이 DNA의 수령인인 숙주에 원래 있는 것이 아니지만, 그러나 주어진 숙주로부터 DNA 분절을 단리시키고, 그리고 후속적으로 동일한 숙주 안으로 이 DNA의 하나이상의 추가 복사본을 도입시켜 유전자 산물의 생산을 강화시키거나 또는 유전자의 발현 패턴을 변경시키는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 일부 경우들에서, 도입된 DNA는 가령, 상동성 재조합 또는 특정 부위 돌연변이생성에 의해 내생성 유전자 또는 DNA 서열을 변경 또는 대체할 수 있다. 적합한 재조합 숙주들은 미생물, 식물 세포들, 및 식물들을 포함한다.
용어 "재조합 유전자"는 동일한 또는 유사한 유전자 또는 DNA 서열이 이미 이러한 숙주에 존재할 수 있건 없건 상관없이, 수령 숙주 안으로 도입되는 유전자 또는 DNA 서열을 말한다. 본 내용에서"도입된(introduced)" 또는 "보강된(augmented)"은 사람의 손에 의해 도입된 또는 보강된다는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 재조합 유전자는 또다른 종으로부터 기인된 DNA 서열일 수도 있고, 또는 동일한 종에 존재하지만, 재조합 숙주를 만들기 위하여 유전공학적 방법들을 통하여 숙주 안으로 통합된 DNA 서열일 수 있다. 숙주 안으로 도입된 재조합 유전자는 형질변환되는 숙주에 정상적으로 존재하는 DNA 서열과 동일할 수 있고, 그리고 도입되어 이 DNA의 하나 이상의 추가적인 복사본을 제공하고, 이로 인하여 이 DNA의 유전자 산물의 과다 발현 또는 변형된 발현을 허용한다는 것을 인지할 것이다.
적합한 UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 스테비아로부터 기인된 기능을 하는 UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들을 인코드하는 유전자는 Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005)에서 보고된다. 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana) UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들의 아미노산 서열들은 차례로 서열 번호: 1 및 3에서 제시한다. 효모에서 발현을 위하여 최적화시킨 UGT74G1 및 UGT85C2를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 차례로 서열 번호: 2 및 4에서 제시한다. 실시예 17 및 18에서 차례로 설명된 UGT85C2 및 UGT74G1 변이체들 참고.
일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 미생물이다. 이 재조합 미생물은 루부소시드를 생산하기 위하여 스테비올을 함유하는 배지에서 성장시킬 수 있다. 그러나, 다른 구체예들에서, 이 재조합 미생물은 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 재조합 유전자 , 가령, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, UGT74G1 및 UGT85C2 유전자에 추가하여 CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 그리고 KAH 유전자를 함유하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 포함시킬 필요없이, 스테비올 모노시드들과 루부소시드를 모두 생산할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 재조합 미생물은 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소 (GGPPS)를 인코드하는 재조합 유전자를 더 발현시킨다. 적합한 GGPPS 폴리펩티드들은 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 GGPPS 효소들은 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana), 기베레라 푸지코로이(Gibberella fujikoroi), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana), 스트렙토미세스 크라불리게루스(Streptomyces clavuligerus), 술푸로부스 아시도칼다리우스(Sulfulobus acidocaldarius), 시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.) 및 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 서열 번호: 121-128 참고. 이들 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열들 하기에서 더욱 상세하게 설명한다. 표 1 및 서열 번호:18-33 참고. 일부 구체예들에서, 이 재조합 미생물은 디테르펜 생합성 또는 테르페노이드 전구물질들의 생산에 관련된 재조합 유전자, 가령, 하기에서 설명하는 메틸에리트리톨 4-포스페이트 (MEP) 경로에 있는 유전자 또는 메발로네이트 (MEV) 경로에 있는 유전자를 더 발현시킨다.
B. 2 리바우디오시드 A 생합성 폴리펩티드들
리바우디오시드 A의 생합성은 아글리콘 스테비올의 당화와 관련된다. 특히, 리바우디오시드 A는 13-O-스테비올모노시드를 형성하는 스테비올의 13-OH의 당화, 스테비올-1,2-바이오시드를 형성하는 스테비올모노시드의 13-O-글루코오즈의 C-2'의 당화, 스테비오시드를 형성하는 스테비올-1,2-바이오시드의 C-19 카르복실의 당화, 그리고 스테비오시드의 C-13-O-글루코오즈의 C-3'의 당화에 의해 형성될 수 있다. 각 당화 반응이 일어나는 순서는 변할 수 있다. 도 2A 참고.
재조합 숙주에서 스테비올을 리바우디오시드 A로 전환시키는 것은 다음의 기능을 하는 UGTs: 74G1, 85C2, 76G1 및 91D2를 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 실현될 수 있다는 것을 알았다. 따라서, 배지에 스테비올을 공급할 때, 이들 4개 UGT를 발현시키는 재조합 미생물은 리바우디오시드 A를 만들 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자의 하나 이상은 원래 자연상태에서 이들을 보유하지 않는 미생물로 형질도입된 재조합 유전자이다. 또한, SM12UGT로 명명된 UGT는 UGT91D2를 대체할 수 있다는 것을 발견하였다.
적합한 UGT74G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 상기에서 논의된 것들을 포함한다. 적합한 UGT76G1은 수용체 분자, 스테비올 1,2 글리코시드의 C-13-O-글루코오즈의 C-3'에 글루코오즈 모이어티를 첨가한다. 따라서, UGT76G1은 예를 들면, 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올 13-O-1,2 글루코시드 C-3' 글루코실 전이효소 및 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올-19-O-글루코오즈, 13-O-1,2 바이오시드 C-3' 글루코실 전이효소로 기능한다. 기능을 하는 UGT76G1 폴리펩티드들은 글루코오즈이외의 슈가를 함유하는 스테비올 글리코시드 기질들, 가령, 스테비올 람노시드와 스테비올 크실로시드를 이용하는 글루코실 전이효소 반응을 또한 촉매할 수 있다. 도 2A, 2B, 2C 및 2D 참고. 적합한 UGT76G1 폴리펩티드들은 스테비아 레바우디아나(S. rebaudiana)에 의해 만들어진 그리고 Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005)에서 보고된 바 있는 것을 포함한다. 스테비아 레바우디아나(S. rebaudiana) UGT76G1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호:7에 제시한다. 서열 번호:7의 UGT76G1 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현하도록 최적화되었으며, 그리고 서열 번호:8로 제시된다. 실시예 18에서 제공하는 UGT76G1 변이체들 또한 참고한다.
적합한 UGT91D2 폴리펩티드는 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 스테비올-13-O-글루코시드 전이효소 (스테비올-13-모노글루코시드 1,2-글루코실라제라고도 부름)로 기능하여, 수용체 분자, 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오즈의 C-2'로 글루코오즈 모이어티를 전달한다. 전형적으로, 적합한 UGT91D2 폴리펩티드는 수용체 분자, 루부소시드의 13-O-글루코오즈의 C-2'로 글루코오즈 모이어티를 전달하는 우리딘 5'-디포스포 글루코실: 루부소시드 전이효소로 또한 기능한다.
기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드들은 스테비올-13-O-글루코시드 및 루부소시드이외의 스테비올 글리코시드 기질들을 이용하는 반응을 또한 촉매할 수 있는데, 가령, 기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드들은 리바우디오시드 E를 만들기 위하여 19-O-글루코오즈 잔기의 C-2'로 글루코오즈 모이어티를 전달하는 기질로써 스테비오시드를 이용할 수 있다. 기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드들은 리바우디오시드 D를 만들기 위하여 19-O-글루코오즈 잔기의 C-2'로 글루코오즈 모이어티를 전달하는 기질로써 리바우디오시드 A를 또한 이용할 수 있다. 그러나, 기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드는 전형적으로 C-13 위치에서 1,3-결합된 글루코오즈를 보유하는 스테비올 화합물들로 글루코오즈 모이어티를 운반하지 않고, 예컨데, 스테비올 1,3-바이오시드와 1,3-스테비오시드로 글루코오즈 모이어티의 운반은 일어나지 않는다.
기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드들은 우리딘 디포스페이트 글루코오즈이외의 제공자로부터 슈가 모이어티를 운반할 수 있다. 예를 들면, 기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드는 우리딘 5'-디포스포 D-크실로실: 스테비올-13-O-글루코시드 전이효소로 작용하여, 수용체 분자, 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오즈의 C-2'로 크실로즈 모이어티를 운반할 수 있다. 또다른 예로써, 기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드는 우리딘 5'-디포스포 L-람노실: 스테비올-13-O-글루코시드 전이효소로 작용하여, 수용체 분자, 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오즈의 C-2'로 람노오즈 모이어티를 운반할 수 있다.
적합한 기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드들은 여기에서 설명된 것들, 가령, UGT91D2e 및UGT91D2m으로 명명된 폴리펩티드들을 포함한다. 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana)의 예시적인 UGT91D2e 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 5에 제시한다. 서열 번호:6은 효모에서 발현하도록 코돈 최적화된 서열 번호:5의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열 번호:5의 폴리펩티드를 인코드하는 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana) 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:9에 제시한다. 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana)의 예시적인 UGT91D2m 폴리펩티드들의 아미노산 서열은 서열 번호: 10 및 12에 제시하고, 그리고 이들은 차례로 서열 번호: 11 및 13에서 제시하는 핵산 서열들에 의해 인코드된다. 실시예 16의 UGT91D2 변이체들, 가령, 아미노산 잔기 206, 207, 및 343에서 치환을 보유하는 변이체 참고.
상기에서 나타낸 것과 같이, 여기에서 SM12UGT로 지정된 UGTs는 UGT91D2를 대체할 수 있다. 적합한 기능을 하는 SM12UGT 폴리펩티드들은 이포모에아 푸르푸레아(Ipomoea purpurea)(Japanese morning glory)에 의해 만들어지고, 그리고 Morita et al. Plant J. 42, 353-363 (2005)에서 설명된 것들을 포함한다. I. purpurea IP3GGT 폴리펩티드를 인코드하는 아미노산 서열은 서열 번호:76에 제시한다. 서열 번호:77은 효모에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화된 서열 번호:76의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이다. 또다른 적합한 SM12UGT 폴리펩티드는 R25S 돌연변이를 보유하는 Bp94B1 폴리펩티드이다. Osmani et al. Plant Phys. 148: 1295-1308 (2008) 및 Sawada et al. J. Biol. Chem. 280:899-906 (2005) 참고. 벨리스 퍼레니스(Bellis perennis)(red daisy) UGT94B1 폴리펩티드를 인코드하는 아미노산 서열은 서열 번호:78에서 제시한다. 서열 번호:79는 효모에서 발현시키기 위하여 코돈 최적화된 서열 번호:78의 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 구체예들에서, 이 재조합 미생물은 리바우디오시드 A를 만들기 위하여 스테비올-13-O-글루코시드 또는 스테비올-19-O-글루코시드를 함유하는 배지에서 성장시킨다. 이러한 구체예들에서, 이 미생물은 기능을 하는 UGT91D2, 기능을 하는 UGT74G1 그리고 기능을 하는 UGT76G1을 인코드하는 유전자를 함유하고, 이를 발현시키고, 그리고 배양 배지에 스테비올, 스테비올모노시드들, 또는 루부소시드중 하나 또는 이 둘 모두가 공급되면, 리바우디오시드 A를 만들 수 있다.
다른 구체예들에서, 이 재조합 미생물은 리바우디오시드 A를 만들기 위하여 루부소시드를 함유하는 배지에서 성장시킨다. 이러한 구체예들에서, 이 미생물은 기능을 하는 UGT91D2와 기능을 하는 UGT76G1을 인코드하는 유전자들을 함유하고, 이들을 발현시키며, 그리고 배양 배지에 루부소시드가 공급되면, 리바우디오시드 A를 생산할 수 있다.
다른 구체예들에서 이 재조합 미생물은 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자, 가령, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, 예를 들면, UGT74G1, UGT85C2, UGT91D2 유전자 및 UGT76G1 유전자에 추가하여, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 그리고 KAH 유전자를 함유하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 함유해야 하는 조건없이 리바우디오시드 A를 생산할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 재조합 미생물은 리바우디오시드 A 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 위하여 디테르펜 전구물질 게라닐게라닐 디포스페이트의 증가된 수준을 제공하기 위하여 재조합 GGPPS 유전자를 더 함유하고 이를 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 이 재조합 미생물은 테르페노이드 전구물질들의 생산에 관련된 재조합 유전자들, 가령, 하기에서 논의되는 MEP 또는 MEV 경로에서 유전자들을 더 함유하고, 발현시킨다.
B. 3 둘코시드 A 와 리바우디오시드 C 생합성 폴리펩티드들
리바우디오시드 C 및/또는 둘코시드 A의 생합성은 아글리콘 스테비올의 당화 및 람노실화와 관계한다. 특히, 둘코시드 A는 스테비올-13-O-글루코시드를 형성하는 스테비올의 13-OH의 당화, 1,2 람노바이오시드를 형성하는 스테비올-13-O-글루코시드의 C-2'의 람노실화, 그리고 1,2 람노바이오시드의 C-19 카르복실의 당화에 의해 형성될 수 있다. 리바우디오시드 C는 둘코시드 A의 C-13-O-글루코오즈의 C-3'의 당화에 의해 형성될 수 있다. 각 당화 반응이 일어나는 순서는 다양할 수 있다. 도 2B 참고.
재조합 숙주에서 스테비올이 둘코시드 A로 전환은 다음의 기능을 하는 UGTs: 85C2, 91D2, 및 74G1을 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 이루어질 수 있음을 알았다. 따라서, 이들 3가지 UGTs 및 람노오즈 합성효소를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 스테비올이 제공될 때 둘코시드 A를 만들 수 있다. 대안으로, 두 가지 UGTs, 91D2 및 74G1과, 그리고 람노오즈 합성효소를 발현시키는 조재합 미생물은 배지에 모노시드, 스테비올-13-O-글루코시드 또는 스테비올-19-O-글루코시드가 제공될 때 둘코시드 A를 만들 수 있다. 유사하게, 재조합 미생물에서 스테비올이 리바우디오시드 C 로 전환은 스테비올이 배지로 공급될 때 UGTs 85C2, 91D2, 74G1, 및 76G1 그리고 람노오즈 합성효소를 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 이루어질 수 있고, 스테비올-13-O-글루코시드가 공급될 때 UGTs 91D2, 74G1 및 76G1 그리고 람노오즈 합성효소를 인코드하는 유전자들의 발현에 의해 이루어질 수 있고, 스테비올-19-O-글루코시드가 공급될 때 UGTs 85C2, 91D2 및 76G1, 그리고 람노오즈 합성효소를 인코드하는 유전자들의 발현에 의해 이루어질 수 있고, 또는 루부소시드가 공급될 때 UGTs 91D2 및 76G1 그리고 람노오즈 합성효소를 인코드하는 유전자들의 발현에 의해 이루어질 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자의 하나 이상은 이들을 원래 자연적으로 보유하지 않은 미생물로 형질도입된 재조합 유전자이다.
적합한 UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 여기에서 논의되는 기능을 하는 UGT 폴리펩티드들을 포함한다. 람노오즈 합성효소는 스테비올 화합물 수용체의 람노실화를 위한 UDP-람노오즈 제공자(donor)의 양을 증가시킨다. 적합한 람노오즈 합성효소들은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들, 예컨데 A. thaliana RHM2 유전자의 산물을 포함한다.
일부 구체예들에서, UGT79B3 폴리펩티드는 UGT91D2 폴리펩티드를 대체한다. 적합한 UGT79B3 폴리펩티드들은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들을 포함하는데, 시험관에서 스테비올 13-O-모노시드의 람노실화를 할 수 있다. A. thalian UGT79B3는 글루코실화된 화합물들을 람노실화시켜 1,2-람노시드를 만들 수 있다. 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) UGT79B3의 아미노산 서열은 서열 번호:150에서 제시한다. 서열 번호:150의 아미노산 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:151에서 제시한다.
일부 구체예들에서, 리바우디오시드 C는 UDP-슈가들의 재생을 위하여 적합한 UDP-슈가 또는 무-세포 시스템을 공급하면서, 시험관 방법들을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들면, "An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology" by Jewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJ and Swartz JR in Molecular Systems Biology, 4, article 220 (2008) 참고. 반응은 함께 실시하거나 또는 단계적으로 실시할 수 있다. 예를 들면, UDP-람노오즈 및 UGT91d2e의 화학량론적인 추가에 이어서 UGT76G1의 첨가와 과량의 또는 화학량론적인 UDP-글루코오즈의 공급에 의해 루부소시드로부터 리바우디오시드 C를 만들 수 있다. 일부 구체예들에서 포스파타아제를 이용하여 2차 산물들을 제거하고, 그리고 반응 수율을 개선시킨다.
다른 구체예들에서, 재조합 숙주는 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자, 가령, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, 예를 들면, UGT85C2, UGT74G1, UGT91D2 유전자 및UGT76G1 유전자에 추가하여, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 그리고 KAH 유전자를 보유하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 포함시킬 필요없이 리바우디오시드 C를 생산할 수 있다. 또한, 재조합 숙주는 전형적으로 람노오즈 합성효소를 인코드하는 내생성 또는 재조합 유전자를 발현시킨다. 이러한 유전자는 스테비올 화합물 수용체의 람노실화를 위한 증가된 양의 UDP-람노오즈 제공자를 제공하는데 유용하다. 적합한 람노오즈 합성효소들은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 의해 만들어진 것들, 예컨데 A. thaliana RHM2 유전자의 산물을 포함한다.
상이한 UGT 유전자의 상대적인 발현 수준의 조절 뿐만 아니라 UDP-람노오즈의 이용성을 조절함으로써, 원하는 비율로 스테비올 및 스테비올 글리코시드 산물들을 특이적으로 생산하도록 재조합 숙주를 맞출 수 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 수 있을 것이다. 스테비올 생합성 유전자, 그리고 스테비올 글리코시드 생합성 유전자의 전사 조절은 당업계에 공지되어 있는 기술을 이용하여 전자 활성화 및 억제 조합을 통하여 달성할 수 있다. in vitro 반응의 경우, 상이한 수준의 UGT 효소들의 추가와 함께 또는 상이한 UGTS의 상대적인 활성에 영향을 주는 조건들하에 상이한 수준의 UGT 효소들의 추가는 원하는 비율의 각 스테비올 글리코시드를 합성하게 할 것이라는 것을 당업자는 인지할 것이다.
일부 구체예들에서, 이 재조합 숙주는 리바우디오시드 A 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 위하여 디테르펜 전구물질 게라닐게라닐 디포스페이트의 증가된 수준을 제공하기 위하여 재조합 GGPPS 유전자를 더 함유하고 이를 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 게라닐게라닐 디포스페이트, ent-카우레논산 또는 파르네실 피로포스페이트를 소모하는 비-스테비올 경로의 발현을 침묵 또는 감소시키는 유전적 구조체를 더 포함하고, 이에 의해 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 제공한다. 예를 들면, 스테롤 생산 경로 예컨데 에르고스테롤로의 유동은 ERG9 유전자의 하향조절에 의해 감소될 수 있다. 지베렐린(gibberellins)을 생산하는 세포들에서, 지베렐린 합성은 ent-카우레논산에서 스테비올로의 유동을 증가시키기 위하여 하향조절될 수 있다. 카로테노이드 생산 유기체들에 있어서, 하나 이상의 카로테노이드 생합성 유전자의 하향조절에 의해 스테비올로의 유동은 증가될 수 있다.
일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 테르페노이드 전구물질들의 생산에 관련된 재조합 유전자들, 가령, 하기에서 논의되는 MEP 또는 MEV 경로에서 유전자들을 더 함유하고, 발현시킨다.
일부 구체예들에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 전체 스테비올 글리코시드에서 최소한 15% 이상의 리바우디오시드 C, 가령, 최소한 20% 리바우디오시드 C, 30-40% 리바우디오시드 C, 40-50% 리바우디오시드 C, 50-60% 리바우디오시드 C, 60-70% 리바우디오시드 C, 70-80% 리바우디오시드 C, 80-90% 리바우디오시드 C를 보유하는 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 일부 구체예들에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 최소한 90% 리바우디오시드 C, 가령, 90-99% 리바우디오시드 C을 보유하는 스테비올 글리코시드 조성물들을 생산한다. 존재하는 기타 스테비올 글리코시드는 도 2 A와 B에 나타낸 것들, 예컨데 스테비올 모노시드들, 스테비올 글루코바이오시드, 스테비올 람노바이오시드, 리바우디오시드 A, 그리고 둘코시드 A를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 숙주에 의해 생산되는 리바우디오시드 C가 풍부한 조성물은 더 정제될 수 있고, 그리고 이렇게 정제된 리바우디오시드 C 또는 둘코시드 A를 그 다음 다른 스테비올 글리코시드, 풍미제, 또는 감미료들과 혼합하여 원하는 풍미체계 또는 감미 조성물을 얻을 수 있다. 예를 들면, 재조합 미생물에 의해 생산된 리바우디오시드 C가 풍부한 조성물은 상이한 재조합 미생물에 의해 생산된 리바우디오시드 A, F, 또는 D가 풍부한 조성물과 복합되거나, 스테비아 추출물로부터 정제된 리바우디오시드 A, F, 또는 D와 복합되거나, 또는 시험관에서 생산한 리바우디오시드 A, F, 또는 D와 복합될 수 있다.
B. 4 리바우디오시드 E 및 리바우디오시드 D 생합성 폴리펩티드들
리바우디오시드 E 및/또는 리바우디오시드 D의 생합성은 아글리콘 스테비올의 당화를 포함한다. 특히, 리바우디오시드 E는 스테비올-13-O-글루코시드를 형성하기 위하여 스테비올의 13-OH의 당화, 스테비올-1,2-바이오시드를 형성하기 위하여 스테비올-13-O-글루코시드의 C-2'의 당화, 1,2-스테비오시드를 형성하기 위하여 1,2-바이오시드의 C-19 카르복실의 당화, 그리고 리바우디오시드 E를 형성하기 위하여 1,2-스테비오시드의 19-O-글루코오즈의 당화에 의해 만들 수 있다. 리바우디오시드 D는 리바우디오시드 E의 C-13-O-글루코오즈의 C-3'의 당화에 의해 만들 수 있다. 각 당화 반응이 일어나는 순서는 바뀔 수 있다. 예를 들면, 19-O-글루코오즈의 C-2'의 당화는 이 경로에서 마지막 단계가 될 수 있으며, 여기에서 리바우디오시드 A는 이 경로에서 중간생성물이다. 도 2C 참고.
재조합 숙주에서 스테비올이 리바우디오시드 D로 전환은다음의 기능을 하는 UGTs: 85C2, 91D2, 74G1 및 76G1을 인코드하는 유전자(들)의 발현에 의해 이루어질 수 있음을 알았다. 따라서, 이들 4가지 UGTs를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 스테비올이 공급될 때 리바우디오시드 D를 만들 수 있다. 대안으로, 기능을 하는 2가지 UGTs, 91D2 및 76G1를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 루부소시드 또는 1,2-스테비오시드가 공급될 때 리바우디오시드 D를 만들 수 있다. 또다른 대안으로, 기능을 하는 3가지 UGTs, 74G1, 91D2 및76G1를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 모노시드, 스테비올-13-O-글루코시드가 공급될 때 리바우디오시드 D를 만들 수 있다. 유사하게, 재조합 미생물에서 스테비올-19-O-글루코시드이 리바우디오시드 D로의 전환은 스테비올-19-O-글루코시드가 공급될 때 UGTs 85C2, 91D2 및 76G1을 인코드하는 유전자의 발현에 의해 이루어질 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자의 하나 이상은 이들을 원래 자연적으로 보유하지 않은 미생물로 형질도입된 재조합 유전자이다.
적합한 UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 여기에서 논의한 기능을 하는 UGT 폴리펩티드들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기에서 논의한 바와 같이, UGT79B3 폴리펩티드는 UGT91을 대체한다.
일부 구체예들에서, 리바우디오시드 D 또는 리바우디오시드 E는 UDP-슈가들의 재생을 위하여 적합한 UDP-슈가 또는 무-세포 시스템을 공급하면서, 시험관 방법들을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들면, Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008) 참고. 다중 반응을 요구하는 전환은 함께 실시하거나 단계별로 실시할 수 있다. 리바우디오시드 D는 상업적으로 이용가능한 농축된 추출물 또는 생합성을 통하여 생산된 리바우디오시드 A로부터 화학량론 또는 과량의 UDP-글루코오즈와 UGT91D2e를 첨가함으로써 생산할 수 있다. 일부 구체예들에서, 포스파타아제를 이용하여 부차 산물을 제거하고, 반응수율을 개선시킨다.
상이한 UGT 유전자의 상대적인 발현 수준의 조절함으로써, 원하는 비율로 스테비올 및 스테비올 글리코시드 산물들을 특이적으로 생산하도록 재조합 숙주를 맞출 수 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 수 있을 것이다. 스테비올 생합성 유전자, 그리고 스테비올 글리코시드 생합성 유전자의 전사 조절은 당업계에 공지되어 있는 기술을 이용하여 전자 활성화 및 억제 조합을 통하여 달성할 수 있다. in vitro 반응의 경우, 상이한 수준의 UGT 효소들의 추가와 함께 또는 상이한 UGTS의 상대적인 활성에 영향을 주는 조건들하에 상이한 수준의 UGT 효소들의 추가는 원하는 비율의 각 스테비올 글리코시드를 합성하게 할 것이라는 것을 당업자는 인지할 것이다.
더 높은 비율의 리바우디오시드 D 또는 E, 또는 리바우디오시드 D 또는 E로의 좀더 효율적인 전환은 13-O-글루코시드 반응 (기질들 리바우디오시드 A 및 스테비오시드)과 비교하였을 때, 19-O-글루코시드 반응에 대해 더 높은 활성을 가진 이당화(diglycosylation) 효소를 이용하여 수득가능하다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
다른 구체예들에서, 재조합 숙주는 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자, 가령, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, 예를 들면, UGT85C2, UGT74G1, UGT91D2 유전자 및 UGT76G1 유전자에 추가하여, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 그리고 KAH 유전자를 보유하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 추가할 필요없이 리바우디오시드 E 및 D를 생산할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 재조합 숙주는 스테비올 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 위하여 디테르펜 전구물질 게라닐게라닐 디포스페이트의 증가된 수준을 제공하기 위하여 재조합 GGPPS 유전자를 더 함유하고 이를 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 게라닐게라닐 디포스페이트, ent-카우레논산 또는 파르네실 피로포스페이트를 소모하는 비-스테비올 경로의 발현을 침묵 또는 감소시키는 유전적 구조체를 더 포함하고, 이에 의해 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 제공한다. 예를 들면, 스테롤 생산 경로 예컨데 에르고스테롤로의 유동은 ERG9 유전자의 하향조절에 의해 감소될 수 있다. 지베렐린(gibberellins)을 생산하는 세포들에서, 지베렐린 합성은 ent-카우레논산에서 스테비올로의 유동을 증가시키기 위하여 하향조절될 수 있다. 카로테노이드 생산 유기체들에 있어서, 하나 이상의 카로테노이드 생합성 유전자의 하향조절에 의해 스테비올로의 유동은 증가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 디테르펜 생합성 또는 테르페노이드 전구물질들의 생산에 관여하는 재조합 유전자, 가령, 하기에서 논의되는 MEP 또는 MEV 경로내 유전자를 더 함유하고 이를 발현시킨다.
일부 구체예들에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 전체 스테비올 글리코시드 중량의 최소한 3% 이상의 리바우디오시드 D, 가령, 최소한 4%의 리바우디오시드 D, 최소한 5%의 리바우디오시드 D, 10-20%의 리바우디오시드 D, 20-30%의 리바우디오시드 D, 30-40%의 리바우디오시드 D, 40-50%의 리바우디오시드 D, 50-60%의 리바우디오시드 D, 60-70%의 리바우디오시드 D, 70-80%의 리바우디오시드 D를 보유하는 리바우디오시드 D가 풍부한 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 일부 구체예들에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 최소한 90%의 리바우디오시드 D, 가령, 90-99%의 리바우디오시드 D를 보유하는 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 존재하는 기타 스테비올 글리코시드는 도 2 C에 나타낸 것들, 예컨데 스테비올 모노시드들, 스테비올 글루코바이오시드, 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 E, 및 스테비오시드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 숙주(가령, 미생물)에 의해 생산된 리바우디오시드 D가 풍부한 조성물은 더 정제할 수 있고, 그리고 이렇게 정제한 리바우디오시드 D 또는 리바우디오시드 E는 다른 스테비올 글리코시드, 풍미제, 또는 감미료들과 혼합하여 원하는 풍미체계 또는 감미 조성물을 얻는다. 예를 들면, 재조합 숙주에 의해 생산된 리바우디오시드 D가 풍부한 조성물은 상이한 재조합 숙주에 의해 생산된 리바우디오시드 A, C, 또는 F가 풍부한 조성물과 복합시킬 수 있고, 스테비아 추출물로부터 정제한 리바우디오시드 A, F, 또는 C와 복합시킬 수 있고, 또는 시험관으로부터 생산된 리바우디오시드 A, F, 또는 C와 복합시킬 수 있다.
B. 5 리바우디오시드 F 생합성 폴리펩티드들
리바우디오시드 F의 생합성은 아글리콘 스테비올의 당화 및 크실로실화를 포함한다. 특히, 리바우디오시드 F는 스테비올-13-O-글루코시드를 형성하는 스테비올의 13-OH의 당화, 스테비올-1,2-크실로바이오시드를 형성하는 스테비올-13-O-글루코시드의 13-O-글루코오즈의 C-2'의 크실로실화, 1,2-스테비오크실로시드를 형성하기 위하여 1,2-크실로바이오시드의 C-19 카르복실의 당화, 그리고 리바우디오시드 F를 형성하기 위하여 1,2-스테비오크실로시드의 C-13-O-글루코오즈의 C-3'의 당화에 의해 만들 수 있다. 각 당화 반응이 일어나는 순서는 변동될 수 있다. 도 2D 참고.
재조합 숙주에서 스테비올이 리바우디오시드 F로의 전환은 내생성 또는 재조합적으로 발현된 UDP-글루코오즈 탈수소효소와 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제와 함께, 다음의 기능을 하는 UGTs: 85C2, 91D2, 74G1 및 76G1을 인코드하는 유전자의 발현에 의해 이루어질 수 있음을 알았다. 따라서, 내생성 또는 재조합 UDP-글루코오즈 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제와 함께 이들 4가지 UGT를 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 스테비올이 공급되면 리바우디오시드 F를 만들 수 있다. 대안으로, 기능을 하는 2가지 UGTs, 91D2 및 76G1을 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 루부소시드가 공급될 때 리바우디오시드 F를 만들 수 있다. 또다른 대안으로써, 기능을 하는 UGT 76G1을 발현시키는 재조합 미생물은 1,2 스테비오람노시드가 공급될 때 리바우디오시드 F를 만들 수 있다. 또다른 대안으로써, 기능을 하는 3가지 UGTs, 74G1, 91D2 및 76G1을 발현시키는 재조합 미생물은 배지에 모노시드, 스테비올-13-O-글루코시드가 공급될 때 리바우디오시드 F를 만들 수 있다. 유사하게, 재조합 미생물에서 스테비올-19-O-글루코시드가 리바우디오시드 F로의 전환은 스테비올-19-O-글루코시드가 공급될 때 UGTs 85C2, 91D2 ? 76G1을 인코드하는 유전자의 발현에 의해 이루어질 수 있다. 전형적으로, 이들 유전자의 하나 이상은 이들을 원래 자연적으로 보유하지 않은 미생물로 형질도입된 재조합 유전자이다.
적합한 UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 및 UGT85C2 폴리펩티드들은 여기에서 논의되는 기능을 하는 UGT 폴리펩티드들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기에서 논의된 것과 같이 UGT79B3 폴리펩티드는 UGT91을 대체한다. UDP-글루코오즈 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제는 스테비올 화합물 수용체의 크실로실화를 위한 증가된 양의 UDP-크실로즈 제공자룰 제공한다. 적합한 UDP-글루코오즈 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제는 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 크립토코커스 네오파르만스(Cryptococcus neoformans)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들면, 적합한 UDP-글루코오즈 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제 폴리펩티드들은 차례로 A. thaliana UGD1 유전자 및 UXS3 유전자에 의해 인코드될 수 있다. Oka and Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006) 참고.
일부 구체예들에서, 리바우디오시드 F는 UDP-슈가들의 재생을 위하여 적합한 UDP-슈가 또는 무-세포 시스템을 공급하면서, 시험관 방법들을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들면, Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008) 참고. 다중 반응을 요구하는 전환은 함께 실시하거나 단계별로 실시할 수 있다. 리바우디오시드 F는 리바우디오시드 F는 루부소시드로부터 화학량론의 UDP-크실로즈 및 UGT91D2e을 추가하고, 이어서 UGT76G1의 첨가와 과량의 또는 화학량론적인 UDP-글루코오즈의 공급에 의해 만들 수 있다. 일부 구체예들에서, 포스파타아제를 이용하여 부차 산물을 제거하고, 반응수율을 개선시킨다.
다른 구체예들에서, 재조합 숙주는 스테비올 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자, 가령, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 및/또는 KAH 유전자를 발현시킨다. 따라서, 예를 들면, UGT85C2, UGT74G1, UGT91D2 유전자 및 UGT76G1 유전자에 추가하여, CDPS 유전자, KS 유전자, KO 유전자 그리고 KAH 유전자를 함유하는 미생물은 배양 배지에 스테비올을 포함시킬 필요없이, 리바우디오시드 F를 생산할 수 있다. 또한, 재조합 숙주는 전형적으로 UDP-글루코오즈 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제를 인코드하는 내생성 또는 재조합 유전자를 발현시킨다. 이러한 유전자는 스테비올 화합물 수용체의 크실로실화를 위하여 증가된 양의 UDP-크실로즈 제공자를 제공하는데 유용하다. 적합한 UDP-글루코오즈 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제는 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 크립토코커스 네오파르만스(Cryptococcus neoformans)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 예를 들면, 적합한 UDP-글루코오즈 탈수소효소 및 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제 폴리펩티드들은 차례로 A. thaliana UGD1 유전자 및 UXS3 유전자에 의해 인코드될 수 있다. Oka and Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006) 참고.
상이한 UGT 유전자들의 상대적인 발현 수준의 조절하고 뿐만 아니라, UDP-크실로즈의 이용성을 조절함으로써, 원하는 비율로 스테비올 및 스테비올 글리코시드 산물들을 특이적으로 생산하도록 재조합 숙주를 맞출 수 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 수 있을 것이다. 스테비올 생합성 유전자들의 전사 조절은 당업계에 공지되어 있는 기술을 이용하여 전자 활성화 및 억제 조합을 통하여 달성할 수 있다. in vitro 반응의 경우, 상이한 수준의 UGT 효소들의 추가와 함께 또는 상이한 UGTS의 상대적인 활성에 영향을 주는 조건들하에 상이한 수준의 UGT 효소들의 추가는 원하는 비율의 각 스테비올 글리코시드를 합성하게 할 것이라는 것을 당업자는 인지할 것이다.
일부 구체예들에서, 이 재조합 숙주는 스테비올 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 위하여 디테르펜 전구물질 게라닐게라닐 디포스페이트의 증가된 수준을 제공하기 위하여 재조합 GGPPS 유전자를 더 함유하고 이를 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 게라닐게라닐 디포스페이트, ent-카우레논산 또는 파르네실 피로포스페이트를 소모하는 비-스테비올 경로의 발현을 침묵 또는 감소시키는 유전적 구조체를 더 포함하고, 이에 의해 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 경로를 통한 증가된 유동을 제공한다. 예를 들면, 스테롤 생산 경로 예컨데 에르고스테롤로의 유동은 ERG9 유전자의 하향조절에 의해 감소될 수 있다. 지베렐린을 생산하는 세포들에서, 지베렐린 합성은 ent-카우레논산에서 스테비올로의 유동을 증가시키기 위하여 하향조절될 수 있다. 카로테노이드 생산 유기체들에 있어서, 하나 이상의 카로테노이드 생합성 유전자의 하향조절에 의해 스테비올로의 유동은 증가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 디테르펜 생합성 또는 테르페노이드 전구물질들의 생산에 관여하는 재조합 유전자들, 가령, 하기에서 논의되는 MEP 경로내 유전자들을 더 함유하고 이를 발현시킨다.
일부 구체예들에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 전체 스테비올 글리코시드 중량의 최소한 4% 이상의 리바우디오시드 F, 가령, 최소한 5%의 리바우디오시드 F, 최소한 6%의 리바우디오시드 F, 10-20%의 리바우디오시드 F, 20-30%의 리바우디오시드 F, 30-40%의 리바우디오시드 D, 40-50%의 리바우디오시드 F, 50-60%의 리바우디오시드 F, 60-70%의 리바우디오시드 F, 70-80%의 리바우디오시드 F를 보유하는 리바우디오시드 F가 풍부한 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 일부 구체예들에서, 미생물과 같은 재조합 숙주는 최소한 90%의 리바우디오시드 F, 가령, 90-99%의 리바우디오시드 F를 보유하는 스테비올 글리코시드 조성물을 생산한다. 존재하는 기타 스테비올 글리코시드는 도 2 A와 D에 나타낸 것들, 예컨데 스테비올 모노시드들, 스테비올 글루코바이오시드, 스테비올 크실로비오시드, 리바우디오시드 A, 스테비오크실로시드, 스테비오시드, 루부소시드 및 스테비오시드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 숙주에 의해 생산된 리바우디오시드 F가 풍부한 조성물은 다른 스테비올 글리코시드, 풍미제, 또는 감미료들과 혼합하여 원하는 풍미체계 또는 감미 조성물을 얻는다. 예를 들면, 재조합 숙주에 의해 생산된 리바우디오시드 F가 풍부한 조성물은 상이한 재조합 숙주에 의해 생산된 리바우디오시드 A, C, 또는 D가 풍부한 조성물과 복합시킬 수 있고, 스테비아 추출물로부터 정제한 리바우디오시드 A, C, 또는 D와 복합시킬 수 있고, 또는 시험관으로부터 생산된 리바우디오시드 A, C, 또는 D와 복합시킬 수 있다.
C. 기타 폴리펩티드들
유전자의 발현으로 좀더 효과적인 또는 더 큰 규모의 스테비올 또는 스테비올 글리코시드의 생산을 실행할 수 있는 추가적인 폴리펩티드들의 유전자는 재조합 숙주 안으로 또한 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포는 게라닐게라닐 디포스페이트 합성효소 (GGPPS, 또한 GGDPS라고도 함)를 인코드하는 하나 이상의 유전자를 또한 포함할 수 있다. 또다른 예로써, 재조합 숙주는 람노오즈 합성효소를 인코드하는 하나 이상의 유전자, 또는 UDP-글루코오즈 탈수소효소 및/또는 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제를 인코드하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 또다른 예로써, 재조합 숙주는 사이토크롬 P450 환원효소 (CPR)를 인코드하는 하나 이상의 유전자를 또한 함유할 수 있다. 재조합 CPR의 발현은 테르페노이드 생합성을 위한 코인자로 이용되는 NADPH를 재생하기 위하여 NADP+ 사이클링을 촉진시킨다. 물론 NADHP 수준을 재생시키는데 다른 방법들을 이용할 수 있다. NADPH가 제한되는 환경에서; 외생 트란스하이드로게나제(transhydrogenase) 유전자를 포함하도록 균주들을 추가 변형시킬 수 있다. 가령, Sauer et al., J. Biol. Chem. 279: 66136619 (2004) 참고. 바람직한 공인자 수준을 증가시키기 위하여 NADH/NADPH 비율을 감소시키거나 또는 그렇지 않으면 변형시키는 다른 방법들은 당업자들에게 공지되어 있다.
또다른 예로써, 재조합 숙주는 MEP 경로 또는 메발로네이트 경로에서 하나 이상의 효소들을 인코드하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 유전자는 이들이 디테르펜 생합성 경로로 탄소 유동을 증가시킬 수 있고, 이 경로에 의해 생성된 이소펜테닐 디포스페이트 및 디메틸알릴 디포스페이트로부터 게라닐게라닐 디포스페이트를 생산하기 때문에 유용하다. 이렇게 생산된 게라닐게라닐 디포스페이트는 스테비올 생합성 폴리펩티드들과 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들의 발현으로 인하여 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성으로 유향시킬 수 있다.
C. 1 MEP 생합성 폴리펩티드들
일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 이소프레노이드 생합성을 위한 메틸에리트리톨 4-포스페이트 (MEP) 경로에 관련된 효소들을 인코드하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. MEP 경로의 효소들은 데옥시크실로즈 5-포스페이트 합성효소 (DXS), D-1-데옥시크실로즈 5-포스페이트 환원이성질화효소 (DXR), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 합성효소 (CMS), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제 (CMK), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소 (MCS), 1-하이드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 합성효소 (HDS) 및 1-하이드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소 (HDR)를 포함한다. 하나 이상의 DXS 유전자, DXR 유전자, CMS 유전자, CMK 유전자, MCS 유전자, HDS 유전자 및/또는 HDR 유전자는 재조합 미생물 안에 통합시킬 수 있다. Rodrguez-Concepcin and Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002) 참고.
DXS, DXR, CMS, CMK, MCS, HDS 및/또는 HDR 폴리펩티드들을 인코드하는 적합한 유전자는 대장균(E. coli), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 그리고 시네초코커스 레오폴리엔시스(Synechococcus leopoliensis)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. DXR 폴리펩티드들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들은 예를 들면, 미국 특허 제7,335,815호에서 설명한다.
C. 2 메발로네이트 생합성 폴리펩티드들
일부 구체예들에서, 재조합 숙주는 이소프레노이드 생합성을 위한 메발로네이트 경로에 관련된 효소들을 인코드하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 숙주안으로 형질도입시키는데 적합한 유전자들은 메발로네이트 경로의 효소들 예컨대, 절두된 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴 (HMG)-CoA 환원효소 (tHMG), 및/또는 메발로네이트 키나제 (MK)를 인코드하는 유전자, 및/또는 포스포메발로네이트 키나제 (PMK)를 인코드하는 유전자, 및/또는 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제 (MPPD)를 인코드하는 유전자이다. 따라서, 하나 이상의 HMG-CoA 환원효소 유전자, MK 유전자, PMK 유전자, 및/또는 MPPD 유전자는 재조합 숙주 예컨대, 미생물로 통합시킬 수 있다.
메발로네이트 경로 폴리펩티드들을 인코드하는 적합한 유전자는 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 폴리펩티드들은 대장균(E. coli), 파라코쿠스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 키타사토스포라 그리세올라(Kitasatospora griseola), 호모 사피엔스(Homo sapiens), 드로소필라 메라노가스터(Drosophila melanogaster), 갈루스 갈수스(Gallus gallus), 스트렙토미세스 종(Streptomyces sp.) KO-3988, 니코티아나 아테누아타(Nicotiana attenuata), 키타사토스포라 그리세올라(Kitasatospora griseola), 헤베아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 그리고 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)에 의해 만들어진 것들을 포함한다. 가령, 미국 특허 제7,183,089호, 제5,460,949호, 그리고 제5,306,862호 참고.
D. 기능을 하는 동족체들(Homologs)
상기에서 설명한 폴리펩티드들의 기능을 하는 동족체들은 또한 재조합 숙주에서 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 생산하는데 이용하기에 적합하다. 기능을 하는 동족체는 참고 폴리펩티드에 서열 유사성을 보유하고, 그리고 참고 폴리펩티드의 하나 이상의 생화학 또는 생리학적 기능(들)을 실행하는 폴리펩티드이다. 기능을 하는 동족체와 참고 폴리펩티드는 천연 생성 폴리펩티드들일 수 있고, 그리고 서열 유사성은 수렴성(convergent) 또는 분기성(divergent) 진화 사건들로 인한 것일 수 있다. 이러하여, 기능을 하는 동족체들은 homolog(동족체들), 또는 orthologs(한 조상에서 진화한 같은 기능의 유전자 집단), 또는 paralogs(한 조상 유전자에서 왔지만 서열은 유사해도 기능이 좀 달라진 것)로 때로 명명되기도 한다. 천연적으로 생성되는 기능을 하는 동족체의 변이체들, 예컨데 야생형 코딩 서열의 돌연변이체에 의해 인코드된 폴리펩티드들은 자체가 기능을 하는 동족체들일 수 있다. 기능을 하는 동족체들은 또한 폴리펩티드의 코딩 서열의 특정 부위 돌연변이 생성을 통하여 만들어질 수 있고, 또는 상이한 천연적으로 생성되는 상이한 폴리펩티드들의 코딩 서열들로부터 도메인의 조합 ("도메인 교환(swapping)")에 의해 만들어질 수도 있다. 여기에서 설명된 기능을 하는 UGT 폴리펩티드들을 인코드하는 유전자를 변형시키는 기술들은 공지되어 있으며, 이 기술들은 그중에서도 특히, 지향된 진화 기술(directed evolution techniques), 특정 부위 돌연변이생성 기술 및 무작위 랜덤 돌연변이생성 기술을 포함하며, 그리고 폴리펩티드의 특이적인 활성을 증가시키고, 기질 특이성을 변경하고, 발현 수준들을 변경하고, 세포이하의 위치를 변경하고, 또는 원하는 방식으로 폴리펩티드:폴리펩티드 상호작용들을 변경시키는데 유용하다. 이러한 변형된 폴리펩티드들은 기능을 하는 동족체들로 간주한다. 용어 "기능을 하는 동족체"는 때로는 기능을 하는 상동성 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 적용된다.
기능을 하는 동족체들은 뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열 배열의 분석에 의해 확인할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열들의 데이터베이스에 쿼리(query)를 실행함으로써 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들의 동족체들을 확인할 수 있다. 서열 분석은 GGPPS, CDPS, KS, KO 또는 KAH 아미노산 서열을 참고 서열로 이용하여 비-여분(nonredundant)의 데이터베이스의 BLAST, Reciprocal BLAST, 또는 PSI-BLAST 분석을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열로부터 유추된다. 데이터베이스에서 40%이상의 서열 동일성을 보유하는 이들 폴리펩티드는 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드로의 적합성의 추가 평가에 후보들이다. 아미노산 서열 유사성은 보존성 아미노산 치환들, 예컨데 하나의 소수성 잔기를 또다른 소수성 잔기로 치환 또는 하나의 극성 잔기를 또다른 극성 잔기로 치환을 허용한다. 바람직한 경우, 더 평가할 후보물질의 수를 줄이기 위하여 이러한 후보의 수작업 조사를 실행할 수 있다. 수작업 조사는 스테비올 생합성 폴리펩티드들에 존재하는 도메인, 가령, 보존된 기능을 하는 도메인들을 가지고 있는 것으로 보이는 후보물질을 선택함으로써 실행할 수 있다.
보존된 영역들은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열내에 반복된 서열이며, 일부 2차 구조(가령, 헬릭스 및 베타 쉬트)를 형성하고, 양전하 또는 음전하를 띈 도메인을 확립하고, 또는 단백질 모티프 또는 도메인을 나타내는 영역을 파악함으로써 확인할 수 있다. 가령, 다양한 단백질 모티프와 도메인에 대한 콘센선스 서열들을 설명하는 Pfam 웹 사이트, sanger.ac.uk/Software/Pfam/ 및 pfam.janelia.org/ 참고. Pfam 데이터베이스에 포함된 정보는 Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); 및 Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)에서 설명한다. 보존된 영역들은 밀접하게 관련된 종으로부터 동일한 또는 관련된 폴리펩티드의 서열들을 배열함으로써 또한 결정할 수 있다. 밀접하게 관련된 종은 바람직하게는 동일한 과(family)의 것이다. 일부 구체예들에서, 두 가지 상이한 종의 서열들을 배열하는 것이 적합하다.
전형적으로, 최소한 약 40%의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드들은 보존된 영역들을 확인하는데 유용하다. 보존된 영역들 of 관련된 폴리펩티드들의 보존된 영역들은 최소한 45%의 아미노산 서열 동일성 (가령, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 또는 최소한 90% 아미노산 서열 동일성)을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 보존된 영역은 최소한 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.
예를 들면, 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드를 생한하는데 적합한 폴리펩티드들은 UGT91D2e, UGT91D2m, UGT85C, 및UGT76G의 기능을 하는 동족체들을 포함한다. 이러한 동족체들은 UGT91D2e의 아미노산 서열 (서열 번호:5), UGT91D2m의 아미노산 서열 (서열 번호:10), UGT85C의 아미노산 서열 (서열 번호:3), 또는 UGT76G의 아미노산 서열(서열 번호:7)에 90%이상의 (가령, 최소한 95% 또는 99%) 서열 동일성을 보유한다. UGT91D2, UGT85C, 및 UGT76G 폴리펩티드들의 변이체들은 전형적으로 1차 아미노산 서열 내 10개 또는 이보다 적은, 가령, 7 개 또는 이보다 적은 아미노산 치환, 5개 또는 이보다 적은 보존성 아미노산 치환, 또는 1 내지 5개 치환을 보유한다. 그러나, 일부 구체예들에서, UGT91D2, UGT85C, 및 UGT76G 폴리펩티드들의 변이체들은 10개 이상의 아미노산 치환 (가령, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 10-20개, 10-35개, 20-30개, 또는 25-35개 아미노산 치환)을 보유할 수 있다. 치환들은 보존성일 수 있으며, 또는 일부 구체예들에서, 비-보존성일 수 있다. UGT91D2e 폴리펩티드들에서 비-보존성 변화의 비-제한적인 예는 글리신에서 아르기닌으로 그리고 트립토판에서 아르기닌으로의 변화를 포함한다. UGT76G 폴리펩티드들에서 비-보존성 치환의 비-제한적인 예는 발린에서 글루타민산으로, 글리신에서 글루타민산으로, 글루타민에서 알라닌으로, 그리고 세린에서 프롤린으로의 치환을 포함한다. UGT85C 폴리펩티드에서 변화의 비-제한적인 예는 히스티딘에서 아스파르트산으로, 프롤린에서 세린으로, 리신에서 트레오닌으로, 그리고 트레오닌에서 아르기닌으로의 변화를 포함한다.
일부 구체예들에서, 유용한 UGT91D2 동족체는 이 폴리펩티드의 영역들에서 예측된 루프의 밖에 아미노산 치환(가령, 보존성 아미노산 치환)을 보유할 수 있고, 가령, 잔기 20-26, 39-43, 88-95, 121-124, 142-158, 185-198, 및 203-214는 서열 번호:5의 N-말단 도메인에서 예측된 루프이며 그리고 잔기 381-386은 C-말단 도메인에서 예측된 루프다. 예를 들면, 유용한 UGT91D2 동족체는 서열 번호:5의 잔기 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, 또는 387-473에서 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, UGT91D2 동족체는 서열 번호:5의 잔기 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, 및 438로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 아미노산 치환을 보유할 수 있다. 예를 들면, UGT91D2 기능을 하는 동족체는 하나 이상의 잔기 206, 207, 및 343에서 아미노산 치환을 보유할 수 있는데, 예컨데 서열 번호:5의 잔기 206에서 아르기닌, 잔기 207에서 시스테인, 그리고 잔기 343에서 아르기닌을 보유할 수 있다. 서열 번호:95 참고. UGT91D2의 기타 기능을 하는 동족체들은 서열 번호:5에서 다음중 하나 이상을 보유한다: 잔기 30에서 티로신 또는 페닐알라닌, 잔기 93에서 프롤린 또는 글루타민, 잔기 99에서 세린 또는 발린, 잔기 122에서 티로신 또는 페닐알라닌, 잔기 140에서 히스티딘 또는 티로신, 잔기 142에서 세린 또는 시스테인, 잔기 148에서 알라닌 또는 트레오닌, 잔기 152에서 메티오닌, 잔기 153에서 알라닌, 잔기 156에서 알라닌 또는 세린, 잔기 162에서 글리신, 잔기 195에서 루이신 또는 메티오닌, 잔기 196에서 글루타민산, 잔기 199에서 리신 또는 글루타민산, 잔기 211에서 루이신 또는 메티오닌, 잔기 213에서 루이신, 잔기 221에서 세린 또는 페닐알라닌, 잔기 253에서 발린 또는 이소루이신, 잔기 286에서 발린 또는 알라닌, 잔기 427에서 리신 또는 아스파라진, 잔기 438에서 알라닌, 그리고 잔기 462에서 알라닌 또는 트레오닌. 실시예 11 및 16, 그리고 표 12 및 14 참고. 유용한 변이체 UGT91D2 폴리펩티드는 도 8에서 제시한 배열에 근거하여 또한 작제할 수 있다.
일부 구체예들에서, 유용한 UGT85C 동족체는 서열 번호:3의 잔기 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, 및 471에서 하나 이상의 아미노산 치환을 보유할 수 있다. 유용한 UGT85C 동족체들의 비-제한적인 예는 (서열 번호:3에 대해) 잔기 65에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 65와 잔기 15, 270, 418, 440, 또는 441와의 조합에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 13, 15, 60, 270, 289, 및 418에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 13, 60, 및 270에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 60 및 87에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 65, 71, 220, 243, 및 270에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 65, 71, 220, 243, 270, 및 441에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 65, 71, 220, 389, 및 394에서 치환을 보유하는; 잔기 65, 71, 270, 및 289에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 220, 243, 270, 및 334에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 또는 잔기 270 및 289에서 치환을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 실시예 17 및 표 15 참고.
일부 구체예들에서, 유용한 UGT76G 동족체는 서열 번호:7의 잔기 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 하나 이상의 아미노산 치환을 보유할 수 있다. 유용한 UGT76G 동족체들의 비-제한적인 예는 (서열 번호:7에 대해) 잔기 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 및 291에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 잔기 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 및 291에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들; 또는 잔기 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, 및 346에서 치환을 보유하는 폴리펩티드들을 포함한다. 실시예 18 및 표 16 참고.
예를 들면 UGT91D2e의 기질 특이성을 변경시키는 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 특정 부위/합리적인 돌연변이생성 방법들, 랜덤 지향된 진화 방법들 그리고 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이때 랜덤 돌연변이생성/포화 기술은 효소의 활성 부위 부근에서 실시한다. 예를 들면 Sarah A. Osmani, et al. Phytochemistry 70 (2009) 325347 참고.
후보 서열은 전형적으로 참고 서열 길이의 80% 내지 200%의 길이, 가령, 참고 서열 길이의 82%, 85%, 87%, 89%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%의 길이를 보유한다. 참고 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 임의의 후보 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 동일성 비율은 다음과 같이 결정할 수 있다. 참고 서열 (가령, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)은 컴퓨터 프로그램 ClustalW (version 1.83, default parameters)을 이용하여 하나 이상의 후보서열에 정렬하고, 이로써 이들의 전장에 걸쳐 핵산 또는 폴리펩티드 서열들의 배열이 허용된다(global alignment). Chenna et al., Nucleic Acid Res., 31(13):3497-500 (2003).
ClustalW는 참고 서열과 하나 이상의 후보 서열들 사이에 가장 잘 매치하는 것을 계산하고, 그리고 동일성, 유사성 및 차이를 결정할 수 있도록 이들을 배열한다. 참고 서열, 후보 서열, 또는 이 둘 모두에 하나 이상의 잔기의 갭을 삽입하여 서열 배열을 최대화시킬 수 있다. 핵산 서열들의 신속한 쌍을 이루는(pairwise) 배열을 위하여, 다음의 디폴트 매개변수를 이용한다: 단어 크기: 2; 창 크기: 4; 득점 방법: %; 상부 대각선의 수: 4; 및 갭 패널티: 5. 핵산 서열들의 다중 배열을 위하여 다음의 매개변수를 이용한다: 갭 개방 패널티: 10.0; 갭 연장 패널티: 5.0; 그리고 무게 변이: 있음. 단백질 서열들의 신속한 쌍을 이루는(pairwise) 배열을 위하여, 다음의 매개변수를 이용한다: 단어 크기: 1; 창 크기 5; 득점 방법: %; 상부 대각선의 수: 5; 및 갭 패널티: 3. 단백질 서열들의 다중 배열을 위하여 다음의 매개변수를 이용한다: 무게 매트릭스: blosum; 갭 개방 패널티: 10.0; 갭 연장 패널티: 0.05; 친수성 갭: 온(on);친수성 잔기: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, 및 Lys; 잔기-특이적 갭 패널티: 온(on). ClustalW 아웃풋(output)은 서열들 사이에 상관관계를 반영하는 서열 배열이다. ClustalW는 예를 들면, Baylor College of Medicine Search Launcher site on the World Wide Web (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) 및 the European Bioinformatics Institute site on the World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw)에서 실시할 수 있다.
참고 서열에 대해 후보 핵산 또는 아미노산 서열의 동일성 비율을 측정하기 위하여, 이 서열들은 ClustalW를 이용하여 배열하고, 배열에서 동일한 매치 수를 참고서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱한다. 동일성 값의 비율은 가장 근접은 10/1값으로 돌릴 수 있다. 예를 들면, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 78.1으로 돌리고, 반면 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 돌린다.
기능을 하는 UGT91D2 폴리펩티드는 UGT91D2에 의해 실행되는 당화 또는 기타 효소 활성에 관여하지 않는 추가 아미노산을 포함할 수 있으며, 따라서 이러한 폴리펩티드는 이 경우보다 더 길어질 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, UGT91D2 폴리펩티드는 아미노 또는 카르복시 단부에 추가되는 정제 테그, 엽록체 운반 펩티드, 미토콘드리아 운반 펩티드, 녹말체(amyloplast) 펩티드, 신호 펩티드, 또는 분비 테그를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, UGT91D2 폴리펩티드는 리포터, 가령, 녹색 형광 단백질 또는 황색 형광 단백질로 기능을 하는 아미노산 서열을 포함한다.
II. 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 핵산
여기에서 설명하는 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자는 이 폴리펩티드의 발현에 적합한 하나 이상의 조절 영역들에 대해 센스 방향으로 작용가능하도록 연결된, 상기 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함한다. 많은 미생물이 폴리시스트론 mRNA로부터 다중 유전자 산물을 발현시킬 수 있기 때문에, 바람직한 경우 이들 미생물의 단일 조절 영역의 제어하에 다중 폴리펩티드들을 발현시킬 수 있다. 코딩 서열 및 조절 영역은 조절 영역과 코딩 서열이 이 서열의 전사 또는 해독을 조절하는데 유효하도록 위치되었을 때, 작용가능하도록 연결된 것으로 간주한다. 전형적으로, 코딩 서열의 해독 판독 틀의 해독 개시 부위는 모노시스트론 유전자의 조절 영약의 1 내지 약 15개 뉴클레오티드 하류에 위치한다.
많은 경우에서, 여기에서 설명된 폴리펩티드의 코딩 서열은 재조합 숙주이외의 종에서 확인되며, 예컨데, 이종기원의 핵산이다. 따라서, 재조합 숙주가 미생물인 경우, 이 코딩 서열은 다른 원핵 또는 진핵 미생물, 식물들 또는 동물들로부터 유래될 수 있다. 그러나, 일부 경우에서, 코딩 서열은 이 숙주에 고유한 서열로 해당 유기체로 재도입된다. 고유 서열은 외생 핵산, 가령, 재조합 핵산 구조체(construct)에서 고유 서열의 측면에 비-고유 조절 서열들에 연결된 비-천연 서열들의 존재로 천연적으로 발생하는 서열과 흔히 구별할 수 있다. 또한, 안정적으로 형질전환된 외생 핵산은 고유 서열이 발견되는 위치 이외의 위치에 전형적으로 통합된다.
"조절 영역"은 전사 또는 해독 개시 및 속도, 그리고 전사 또는 해독 산물의 안전성 및/또는 운동성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열들을 보유하는 핵산을 말한다. 조절 영역들은 프로모터 서열들, 인헨서 서열들, 반응 요소들, 단백질 인지 부위들, 유도성 요소들, 단백질 결합 서열들, 5 및 3 해독안된 영역들 (UTRs), 전사 시작 부위들, 종료 서열들, 폴리아데닐화 서열들, 인트론, 및 이의 조합들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 조절 영역은 전형적으로 최소한 하나의 코어(기저) 프로모터를 포함한다. 조절 영역은 최소한 하나의 조절 요소, 예컨데 인헨서서열, 상류 요소 또는 상류 활성화 영역 (UAR)을 또한 포함할 수 있다. 조절 영역은 이 조절 영역이 이 서열의 전사 또는 해독을 조절하는데 유효하도록 조절영역과 코딩 서열을 위치시킴으로써, 코딩 서열에 작용가능하도록 연결된다. 예를 들면, 코딩 서열 및 프로모터 서열이 작용가능하도록 연결되기 위하여, 코딩 서열의 해독 판독 틀의 해독 개시 부위는 프로모터의 1 내지 약 15 뉴클레오티드 하류에 일반적으로 위치한다. 그러나, 조절 영역은 해독 개시 부위의 상류 약 5,000개 뉴클레오티드 만큼의 위치, 또는 전사 시작 부위의 상류 약 2,000개 뉴클레오티드의 만큼의 위치에 있을 수 있다.
포함되는 조절 영역들의 선택은 효율, 유도성, 원하는 발현 수준 그리고 특정 배양 단계에서 선호되는 발현을 포함하는 몇 가지 인자들에 따라 달라진다. 코딩 서열의 대하여 조절 영역들을 적절하게 선택하고 배치함으로써, 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게는 일상적인 것이다. 하나 이상의 조절 영역, 가령, 인트론, 인헨서들, 상류 활성화 영역들, 전사 종료물질들, 그리고 유도성 요소들이 존재할 수 있음을 인지할 것이다.
하나 이상의 유전자는 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드 생산의 불연속 측면(discrete aspect)에 유용한 "모듈"로 재조합 핵산 구조체에 복합될 수 있다. 모듈에서 다수의 유전자의 복합, 특히 폴리시스트론(polycistronic) 모듈은 다양한 종에서 이 모듈의 이용을 촉진시킨다. 예를 들면, 스테비올 생합성 유전자 클러스터, 또는 UGT 유전자 클러스터는 폴리시스트론 모듈에서 복합되어, 적합한 조절 영역의 삽입 후, 이 모듈은 광범위한 다양한 종으로 도입될 수 있다. 또다른 예로써, UGT 유전자 클러스터는 UGT 모듈을 형성하기 위하여 별도 조절 영역에 각 UGT 코딩 서열이 작용가능하게 연결되도록 복합될 수 있다. 이러한 모듈은 모노시스트론 발현이 필수적이거나 또는 바람직한 종들에서 이용할 수 있다. 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생산에 유용한 유전자에 추가적으로, 재조합 구조체는 전형적으로 복제 원점과 적절한 종에서 이 구조체의 유지를 위한 하나 이상의 선택가능한 표식을 또한 포함할 수 있다.
유전자 코드의 축퇴(degeneracy)로 인하여, 특정 폴리펩티드를 다수의 핵산이 인코드할 수 있는데, 예를 들면, 많은 아미노산의 경우, 해당 아미노산의 코돈으로 작용하는 하나 이상의 뉴클레오티드 삼코드(triplet)가 있음을 인지할 것이다. 따라서, 주어진 폴리펩티드에 대한 코딩 서열에서 코돈은 해당 숙주(가령, 미생물)의 적합한 코돈 편향표를 이용하여 특정 숙주에서 최적의 발현을 얻을 수 있도록 변형시킬 수 있다. 서열 번호:18-25, 34-36, 40-43, 48-49, 52-55, 60-64, 및 70-72는 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성을 위하여 특정 효소들을 인코딩하고, 효모에서 발현의 증가를 위하여 변형된 뉴클레오티드 서열들을 제시한다. 단리된 핵산들로써, 이러한 변형된 서열들은 정제된 분자들로 존재할 수 있고, 그리고 재조합 핵산 구조체들을 위한 모듈을 작성하는데 이용하기 위하여 벡터 또는 바이러스로 통합시킬 수 있다.
일부 경우들에서, 대사 중간생성물을 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 쪽으로 돌리기 위하여 내생성 폴리펩티드의 하나 이상의 기능을 억제하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생산을 더 증가시키기 위하여, 스쿠알렌 에폭시다제를 하향조절함으로써, 효모 균주에서 스테롤의 합성을 하향조절하는 것이 바람직할 수 있다. 또다른 예로써, 특정 내생성 유전자 산물들, 가령, 2차 대사물질로부터 글루코오즈 모이어티를 제거하는 당가수분해효소들의 분해 기능을 억제시키는 것이 바람직할 수 있다. 또다른 예로써, 스테비올 글리코시드의 운반에 관여하는 막 운반물질의 발현을 억제시킬 수 있고, 당화된 스테비오시드들의 분비가 억제된다. 이러한 조절은 미생물의 배양동안 원하는 기간에 스테비올 글리코시드의 분비를 억제시키고, 이렇게 함으로써 수득시 글리코시드 산물(들)의 수율을 증가시키는데 유익할 수 있다. 이러한 경우들에서, 폴리펩티드 또는 유전자 산물의 발현을 억제하는 핵산은 균주내로 형질도입된 재조합 구조체에 포함될 수 있다. 대안으로, 기능을 억제하는 것이 바람직한 유전자에서 돌연변이를 만드는데 돌연변이생성을 이용할 수 있다.
III. 숙주
미생물
많은 원핵생물 및 진핵생물이 여기에서 설명하는 재조합 미생물, 가령, 그람-음성 박테리아, 효모 및 곰팡이를 작제의 사용에 적합하다. 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생산 균주로 사용하는데 선택된 종 및 균주는 우선 생산 유전자가 이 균주에 내생성인지, 어떤 유전자가 존재하지 않는지를 판단하기 위하여 분석한다. 균주에 내생성 대응부분에 대한 유전자가 존재하지 않는 경우, 이 유전자를 하나 이상의 재조합 구조체에 어셈블리하고, 그 다음 빠진 기능(들)을 공급하기 위하여 균주안으로 이들 구조체들을 형질전환시킨다.
예시적인 원핵 및 진핵 종들은 하기에서 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 다른 종들이 적합할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 적합한 종들은 속(genus)에서 아가리쿠스(Agaricus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 바실러스(Bacillus), 칸디다(Candida), 코리네박테리움(Corynebacterium), 에쉬리치아(Escherichia), 푸사리움/기베렐라(Fusarium/Gibberella), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 레티포루스(Laetiporus), 렌티누스(Lentinus), 파피아(Phaffia), 파네로차에테(Phanerochaete), 피치아(Pichia), 피스코미트렐라(Physcomitrella), 로도투루라(Rhodoturula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 스파셀로마(Sphaceloma), 산토필로미세스(Xanthophyllomyces) 그리고 야로위아(Yarrowia)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 속으로부터 선택된 예시적인 종은 렌티누스 티그리누스(Lentinus tigrinus), 레티포루스 술푸레우스(Laetiporus sulphureus), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 로도투루라 글루티니스(Rhodoturula glutinis) 32, 로도투루라 무시라기노사(Rhodoturula mucilaginosa), 파피아 로도자야마(Phaffia rhodozyma) UBV-AX, 산토필로미세스 덴드로우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 푸사리움 푸지쿠로이/기베레라 푸지코로이(Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi), 칸디다 우틸리스(Candida utilis) 그리고 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 미생물은 아스코미세츠, 예컨데 기베레라 푸지코로이(Gibberella fujikuroi), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 또는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 미생물은 원핵생물, 예컨데 대장균(Escherichia coli), 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides), 또는 로도박터 캡술라투스(Rhodobacter capsulatus)일 수 있다. 특정 미생물은 관심 미생물을 고처리량(high throughput) 방식으로 스크리닝하고 테스트하는데 이용하는 것이 적합하며, 원하는 생산성 또는 성장 특징을 가진 다른 미생물은 스테비올 글리코시드을 대규모로 생산하는데 이용할 수 있음을 인지할 것이다.
사카로마이세스 세레비시에( Saccharomyces cerevisiae )
사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)는 합성 생물학에서 광범위하게 이용되는 섀시(chassis) 유기체이고, 그리고 재조합 미생물 플랫폼으로 이용할 수 있다. S. cerevisiae에 이용할 수 있는 돌연변이체의 라이브러리, 플라스미드, 대사의 상세한 컴퓨터 모델 및 기타 정보가 있어, 산물 수율을 개선시키는 다양한 모듈의 합리적인 기획이 가능하다. 재조합 미생물을 만드는 방법들은 공지되어 있다.
다수의 공지 프로모터들을 이용하여 스테비올 생합성 유전자 클러스터를 효모에서 발현시킬 수 있다. 테르펜을 과다생산하는 균주들은 공지되어 있으며, 이를 이용하여 스테비올 및 스테비올 글리코시드 생산에 이용할 수 있는 게라닐게라닐 디포스페이트의 양을 증가시킬 수 있다.
아스퍼질러스 (Aspergillus ) spp .
아스퍼질러스(Aspergillus) 종, 예컨대, A. oryzae, A. niger 및 A. sojae 는 식품 생산에 광범위하게 이용되는 미생물이며, 그리고 재조합 미생물 플랫폼으로 또한 이용할 수 있다. 뉴클레오티드 서열들은 A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae, A. clavatus, A. flavus, A. niger, 및 A. terreus의 게놈으로 이용가능하여, 유동을 강화시키고, 그리고 산물 수율을 증가시키기 위하여 내생성 경로의 합리적인 기획 및 변형이 가능하다. 아스퍼질러스(Aspergillus) 뿐만 아니라 전사체적(transcriptomic) 연구와 단백체적(proteomics) 연구를 위하여 대사적 모델을 개발하여왔다. A. niger는 다수의 식품 성분들, 예컨데 구연산 및 글루코닌산의 산업적 생산을 위하여 배양하고, 따라서 종들 예컨대, A. niger는 식품 성분들, 예컨대, 스테비올 및 스테비올 글리코시드의 생산에 일반적으로 적합하다. 실시예 23은 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)에서 스테비올 글리코시드의 생산을 위한 클로닝 방법을 설명한다.
대장균( Escherichia coli )
합성 생물에서 또다른 광범위하게 이용되는 플랫폼 유기제인 대장균(Escherichia coli)은 재조합 미생물 플랫폼으로 또한 이용할 수 있다. 사카로마이세스(Saccharomyces)에 유사하게, 대장균(E. coli)에 이용가능한 돌연변이체 라이브러리, 플라스미드, 대사의 상세한 컴퓨터 모델 및 기타 정보들이 있고, 이는산물 수율을 강화시키기 위하여 다양한 모듈의 합리적인 기획이 가능하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)에 대해 상기에서 설명한 것과 유사한 방법들을 이용하여 재조합 대장균(E. coli) 미생물을 만들 수 있다.
아가리쿠스(Agaricus ), 기베레라(Gibberella ), 및 파네로차에 테(Phanerochaete) spp.
아가리쿠스, 기베레라, 및 파네로차에테 spp.는 이들이 배양물에서 다량의 지베렐린을 생산하는 것으로 공지되어 있기 때문에 유용할 수 있다. 따라서, 다량의 스테비올 및 스테비올 글리코시드를 생산하기 위한 테르펜 전구물질들은 이미 내생성 유전자에 의해 만들어진다. 따라서, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들를 위한 재조합 유전자를 포함하는 모듈은 메발로네이트 또는 MEP 경로 유전자의 도입 필요없이 이러한 속으로부터 종으로 도입시킬 수 있다.
로도박터(Rhodobacter ) spp.
로도박터(Rhodobacter)는 재조합 미생물 플랫폼으로 이용할 수 있다. 대장균(E. coli)과 유사하게, 이용가능한 돌연변이체 라이브러리 뿐만 아니라 적합한 플라스미드 벡터들이 있어, 산물 수율을 강화시키기 위하여 다양한 모듈의 합리적인 기획이 가능하다. 카로테노이드 및 CoQ10의 생산 증가를 위하여 로도박터(Rhodobacter)의 막 세균 종에서 이소프레노이드 경로들이 조작되었다. 미국 특허 공개 번호 20050003474 및 20040078846 참고. 대장균(E. coli)에 대해 상기에서 설명한 것과 유사한 방법을 이용하여 재조합 로도박터(Rhodobacter) 미생물을 만들 수 있다.
피스코미트렐라(Physcomitrella) spp.
현탁 배양물에서 성장시켰을 때 피스코미트렐라(Physcomitrella) 이끼는 효모 또는 기타 곰팡이 배양물과 유사한 특징들을 가진다. 이 속은 식물 2차 대사물의 생산에 중요한 유형의 세포가 되며, 다른 유형의 세포들에서는 생산하기가 곤란하다. 실시예 22는 P. patens에서 스테비올 글리코시드 경로내 활성 UGT 효소들의 생산을 설명한다.
식물 세포들 또는 식물들
일부 구체예들에서, 여기에서 설명된 핵산 및 폴리펩티드들은 식물들 또는 식물 세포들로 도입시켜 다른 것들과 비례하여 특이적 스테비올 글리코시드의 생산을 위하여 전체적인 스테비올 글리코시드 생산을 증가시키거나 또는 풍부하게 한다. 따라서, 숙주는 여기에서 설명된 최소한 하나 재조합 유전자을 포함하는 식물 또는 식물 세포일 수 있다. 식물 또는 식물 세포는 이의 게놈으로 통합된 재조합 유전자를 가지게 함으로써 형질전환시킬 수 있는데, 예를 들면, 안정적으로 형질전환시킬 수 있다. 안정적으로 형질전환된 세포들은 전형적으로 각 세포 분할과 함께 도입된 핵산을 보유한다. 식물 또는 식물 세포는 또한 일과적으로 형질변환시켜, 재조합 유전자가 이의 게놈에 통합되지 않는다. 일과적으로 형질전환된 세포들은 각 세포 분할시 전형적으로 도입된 핵산의 전부 또는 일부분을 상실하여, 도입된 핵산은 충분한 횟수의 세포 분할 후 자녀 세포에서는 탐지할 수 없다. 일과적으로 형질전환된 그리고 안정적으로 형질전환된 이식유전자 식물들과 식물 세포들은 모두 여기에서 설명된 방법에 유용할 것이다.
여기에서 설명된 이식유전자 식물 세포들은 온전한 식물의 일부 또는 전부분을 구성할 수 있다. 이러한 식물들은 성장실, 온실 또는 들판에서 종에 적합한 방식으로 성장시킬 수 있다. 이식유전자 식물들은 특정 목적에 맞게 자라게 할 수 있는데, 예를 들면, 재조합 핵산을 다른 계통으로 도입시키기 위하여, 재조합 핵산을 다른 종으로 이전시키기 위하여, 또는 기타 원하는 형질에 대해 추가 선택하도록 자라게 할 수 있다. 대안으로, 이식유전자 식물들은 이러한 기술에 순응하는 이들 종에 대해 무성 증식시킬 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 이식유전자 식물은 후손이 이식유전자를 물려받는다면 초기 이식유전자 식물의 후손이라고 또한 할 수 있다. 할 것이다. 이식유전자 식물에 의해 생산된 종자는 핵산 구조체에 대해 동종접합자인 종자를 얻기 위하여 성장시키고, 그리고 자가수분시킨다(selfed)(또는 교배 및 자가수준시킨다).
이식유전자 식물들은 현탁 배양 또는 조직 또는 국방부 직할부대 및 기관 배양에서 성장시킬 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 고체 및/또는 액체 조직 배양 기술을 이용할 수 있다. 고체 배지를 이용할 때, 이식유전자 식물 세포들을 배지에 바로 위치시키거나 또는 필터에 위치시킨 후, 다시 배지와 접촉하도록 위치시킨다. 액체 배지를 이용할 때, 이식유전자 식물 세포들은 부유 장치(flotation device), 가령, 액체 배지와 접촉되는 다공성 막 위에 둘 수 있다.
일과적으로 형질전환된 식물 세포들을 이용할 때, 리포터 활성을 보유한 리포터 폴리펩티드를 인코드하는 리포터 서열이 형질변환 과정에 포함될 수 있고, 리포터 활성 또는 발현에 대한 분석은 형질변환 후 적합한 시기에 실행할 수 있다. 분석을 실행하는 적합한 시기는 형질변환 후, 전형적으로 약 1-21 일, 가령, 약 1-14 일, 약 1-7 일, 또는 약 1-3 일에 실행한다. 일시적 분석의 사용은 상이한 종들에서 신속한 분석에 특히 편리하고, 또는 이종기원의 폴리펩티드의 발현이 특히 수령 세포들에서 이전에 확인되지 않은 경우, 이종 기원의 폴리펩티드의 발현을 확인하기 위하여 실행한다.
핵산을 외떡잎식물과 쌍떡잎식물 식물들로 도입시키는 기술들은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 아그로벡테리움(Agrobacterium)-매개된 형질변환, 바이러스-매개된 형질변환, 전기천공 및 입자 총 형질변환(particle gun transformation), 미국 특허 제5,538,880호; 제5,204,253호; 제6,329,571호; 그리고 제6,013,863호를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 세포 또는 배양된 조직을 형질변환의 수령 조직으로 이용할 경우, 당업계에 공지되어 있는 기술을 이용함으로써 식물들을 형질전환된 배양물로부터 재생시킬 수 있다.
이식유전자 식물들의 집단은 이식유전자의 발현에 의해 부여되는 형질 또는 표현형을 보유한 집단의 구성요소에 대해 스크리닝하거나 및/또는 선택할 수 있다. 예를 들면, 단일 형질변환의 후손 집단은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드 또는 핵산의 바람직한 발현 수준을 보유하는 이들 식물들에 대하여 스크리닝할 수 있다. 물리적 그리고 생화학적 방법들을 이용하여 발현 수준들을 확인할 수 있다. 이런 것들로는 서던 분석 또는 폴리뉴클레오티드의 탐지를 위한 PCR 증폭; 노던 블랏, S1 RNase 보호, 프라이머-연장, 또는 RNA 전사체 탐지를 위한 RT-PCR 증폭; 폴리펩티드들과 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임 활성 탐지를 위한 효소 분석; 그리고 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블랏, 면역침전, 그리고 폴리펩티드들을 탐지하기 위하여 효소-연계된 면역분석. 기타 기술, 예컨데 in situ 혼성화, 효소 착색, 그리고 면역착색 또한 폴리펩티드들 및/또는 핵산의 존재 또는 발현을 탐지하는데 이용할 수 있다. 언급된 모든 기술들을 실시하는 방법들은 공지되어 있다. 대안으로, 독립 형질변환 사건들을 포함하는 식물 집단은 원하는 형질, 예컨데 스테비올 글리코시드의 생산, 또는 스테비올 글리코시드의 조절된 생합성을 보유하는 식물들에 대해 스크리닝할 수 있다. 선택 및/또는 스크리닝은 하나 이상의 세대 및/또는 한 군데 이상의 지리적 위치에서 실시할 수 있다. 일부 경우들에서, 이식유전자 식물들은 이식유전자 식물에서 원하는 표현형을 유도하거나 또는 원하는 표현형을 만드는데 필요한 조건들 하에서 성장시키고 선택할 수 있다. 또한, 선택 및/또는 스크리닝은 식물에 의해 기대되는 표현형의 특정 발달 단계 동안에 적용시킬 수 있다. 선택 및/또는 스크리닝은 이식유전자가 없는 대조군 식물과 비교하여 스테비올 글리코시드 수준이 통계학적으로 유의적으로 차이가 있는 이들 이식유전자 식물들을 선택하기 위하여 실시할 수 있다.
여기에서 설명된 핵산, 재조합 유전자, 그리고 구조체들은 다수의 외떡잎식물과 쌍떡잎식물 식물들 그리고 식물 세포계를 형질변환시키는데 이용할 수 있다. 적합한 외떡잎식물의 예는 예를 들면, 곡물 수확물 예컨데 쌀, 호밀, 수수, 기장, 밀, 옥수수, 그리고 보리를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 식물은 비-곡물 외떡잎식물일 수 있는데, 예컨데 아스파라거스, 바나나, 또는 양파일 수 있다. 이 식물은 또한 쌍떡잎식물 예컨대, 스테비아 (스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana)), 대두, 목화, 해바라기, 완두콩, 제라늄, 시금치, 또는 담배일 수 있다. 일부 경우들에서, 이 식물은 페닐 포스페이트 생산의 전구물질 경로들, 예컨대, 세포질 및 미토콘드리아에서 전형적으로 볼 수 있는 메발로네이트 경로를 포함할 수 있다. 비-메발로네이트 경로는 식물 색소페들에서 좀더 흔하게 볼 수 있다 [Dubey, et al., 2003 J. Biosci. 28 637646]. 당업자는 리더 서열들의 사용을 통하여 적절한 국방부 직할부대 및 기관으로 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들의 발현을 표적화시켜, 식물 세포의 원하는 위치에서 스테비올 글리코시드 생합성이 일어나도록 할 수 있다. 당업자는 가령, 바람직한 경우, 식물의 잎으로 합성을 지향시키는 적절한 프로모터를 이용할 것이다. 발현은 바람직한 경우 조직 배양물, 예컨대, 캘러스 배양(callus culture) 또는 모상근 배양(hairy root culture)에서 일어날 수 있다.
한 구체예에서, 여기에서 설명된 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드들은 전체적인 스테비올 글리코시드 생합성이 증가되거나 또는 전체적인 스테비올 글리코시드 조성물이 하나 이상의 특이적 스테비올 글리코시드에 대해 선택적으로 풍부해지도록 스테비아 (가령, 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana))로 도입된다. 예를 들면, 하나 이상의 재조합 유전자는 다음중 하나 이상이 발현되도록 스테비아로 도입시킬 수 있다: UGT91D 효소, 예컨데 UGT91D2e (가령, 서열 번호:5 또는 이의 기능을 하는 동족체), UGT91D2m (가령, 서열 번호:10); UGT85C 효소 예컨대, 표 15에서 제시되는 변이체, 또는 UGT76G1 효소 예컨대, 실시예 18에서 제시된 변이체. 핵산 구조체들은 전형적으로 UGT 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에 작용가능하도록 연결된 적합한 프로모터 (가령, 35S, e35S, 또는 ssRUBISCO 프로모터들)를 포함한다. 핵산들은 아그로벡테리움(Agrobacterium)-매개된 형질변환; 원형질로 전기천동-매개된 유전자 이동; 또는 입자 투하에 의해 스테비아로 도입시킬 수 있다. 가령, Singh, et al., Compendium of Transgenic Crop Plants: Transgenic Sugar, Tuber and Fiber, Edited by Chittaranjan Kole and Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd. (2008), pp. 97-115 참고. 스테비아 잎에서 유도된 캘루스의 과립 투하의 경우, 매개변수들은 다음과 같을 수 있다: 6 cm 거리, 1100 psi He 압력, 금 입자 및 1회 투하.
스테비아 식물들은 Singh et al., 2008, supra에서 설명한 것과 같이 체세포 배형성에 의해 재생될 수 있다. 특히, 잎 분절들 (대략 1-2cm 길이)은 5 내지 6주 시험관에서 성장시킨 식물로부터 제거하고, 그리고 B5 비타민, 30 g 슈크로즈 그리고 3 g Gelrite가 보충된 MS 배지상에서 배양하였다(향축 사이드 다운). 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)은 6-벤질 아데닌(BA), 키네틴(KN), 또는 제틴과 복합하여 사용할 수 있다. 배발생전 물질(Proembryogenic)는 8주의 2차 배양(subculture)후 나타난다. 2-3주의 2차 배양이내에, 체세포 배는 배양물 표면에 나타날 것이다. 배는 2,4-D, a-나프탈렌아세트산(NAA), 또는 인돌부틸산(IBA)과 복합하여 BA를 함유하는 배지에서 성숙될 수 있다. 발아하고 묘목을 이루는 성숙 체세포 배는 칼리(calli)로부터 잘라낼 수 있다. 묘목이 3-4주에 도달 한 후, 묘목은 질석(vermiculite)이 담긴 포트로 옮길 수 있고, 환경 순응을 위하여 성장실에서 6-8주 성장시키고, 온실로 옮길 수 있다.
한 구체예에서, 스테비올 글리코시드는 쌀에서 생산된다. 쌀과 옥수수는 예컨대, 아그로벡테리움(Agrobacterium)-매개된 형질변환과 같은 기술을 이용하여 바로 형질변환시킬 수 있다. 외떡잎식물로 아그로벡테리움(Agrobacterium) 외생 유전자 도입에 흔히 이용되는 것이 이중 벡터 시스템이다. 예를 들면, 미국 특허 제6,215,051호 및 제6,329,571호. 이원체(binary) 벡터 시스템에서, 한 개 벡터는 관심 유전자(가령, 여기에서 설명된 UGT)를 포함하는 T-DNA 영역을 함유하고, 다른 벡터는 vir 영역을 함유하는 무력화된(disarmed) Ti 플라스미드이다. 공동-통합된 벡터들과 이동가능한 벡터들을 도한 이용할 수 있다. 형질전환될 조직의 유형 및 전처리, 이용되는 아그로벡테리움(Agrobacterium) 균주, 접종 기간, 아그로벡테리움(Agrobacterium)에 의한 과다성장 및 괴사 방지는 당업자에 의해 용이하게 조정할 수 있다. 이원체 벡터들을 이용하여 아그로벡테리움(Agrobacterium)으로 형질변환시키기 위하여 쌀의 미성숙 배 세포들을 준비할 수 있다. 이용되는 배양 배지에 페놀 화합물들을 보충한다. 대안으로, 형질변환은 진공 침투를 이용하여 식물에서 실행할 수 있다. 예를 들면, WO 2000037663, WO 2000063400, 및 WO 2001012828 참고.
IV. 스테비올 및 스테비올 글리코시드를 생산하는 방법
여기에서 설명된 재조합 숙주들은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 만드는 방법들에 이용할 수 있다. 예를 들면, 재조합 숙주가 미생물인 경우, 이 방법은 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드 생합성 유전자가 발현되는 조건들하에서 배양 배지에 재조합 미생물을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 재조합 미생물은 유가식배양(fed batch) 또는 연속 공정에서 성장시킬 수 있다. 전형적으로, 재조합 미생물은 원하는 기간 동안 정해진 온도에서 발효기에서 성장한다. 이 방법에 이용되는 특정 미생물에 따라, 다른 재조합 유전자 예컨대, 이소펜테닐 생합성 유전자와 테르펜 합성효소 그리고 시클라아제 유전자가 또한 존재하고, 발현될 수 있다. 기질들 및 중간생성물, 가령, 이소펜테닐 디포스페이트, 디메틸알릴 디포스페이트, 게라닐게라닐 디포스페이트, 카우렌 그리고 카우레논산의 수준들은 공개된 방법들에 따라 분석을 위한 배양 배지로부터 시료를 추출하여 측정할 수 있다.
재조합 미생물이 원하는 기간 동안 배양물에서 성장한 후, 스테비올 및/또는 하나 이상의 스테비올 글리코시드는 당업계에 공지되어 있는 다양한 기술을 이용하여 배양물로부터 회수할 수 있다. 재조합 숙주가 식물 또는 식물 세포들인 경우, 당업계에 공지되어 있는 다양한 기술들을 이용하여 식물 조직으로부터 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 추출할 수 있다. 예를 들면, 배양된 미생물 또는 식물 조직의 정제안된 용해물을 원심분리시켜 상청액을 수득할 수 있다. 생성된 상청액을 크로마토그래피 컬럼, 가령, C-18 컬럼에 제공하고, 물로 세척하여 친수성 화합물을 제거하고, 용매예컨대, 메탄올을 이용하여 관심 화합물(들)을 용리시킨다. 그 다음 화합물(들)은 예비 HPLC에 의해 추가 정제시킬 수 있다. WO 2009/140394 또한 참고.
생산된 스테비올 또는 스테비올 글리코시드의 양은 약 1 mg/l 내지 약 1,500 mg/l, 가령, 약 1 내지 약 10 mg/l, 약 3 내지 약 10 mg/l, 약 5 내지 약 20 mg/l, 약 10 내지 약 50 mg/l, 약 10 내지 약 100 mg/l, 약 25 내지 약 500 mg/l, 약 100 내지 약 1,500 mg/l, 또는 약 200 내지 약 1,000 mg/l일 수 있다. 일반적으로, 배양 시간이 길면 더 많은 양의 산물을 얻을 수 있다. 따라서, 재조합 미생물은 1 일 내지 7 일, 1 일 내지 5 일, 3 일 내지 5 일, 약 3 일, 약 4 일, 또는 약 5 일간 배양할 수 있다.
여기에서 설명된 다양한 유전자와 모듈은 단일 미생물보다는 2가지 이상의 재조합 미생물에 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 다수의 재조합 미생물이 이용될 때, 이들은 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드를 생산하기 위하여 혼합 배양에서 성장시킬 수 있다. 예를 들면, 제 1 미생물은 스테비올을 생산하기 위한 하나 이상의 생합성 유전자를 포함하고, 제 2 미생물은 스테비올 글리코시드 생합성 유전자를 포함한다. 대안으로, 2가지 이상의 미생물 각각이 별도의 배양 배지에서 성장할 수 있고, 제 1 배양 배지의 산물, 가령, 스테비올은 제 2 배양 배지로 도입되어, 후속 중간생성물로 전환되거나, 또는 최종 산물 예컨대, 리바우디오시드 A로 전환될 수 있다. 제 2, 또는 최종 미생물에 의해 생산된 산물을 그 다음 회수한다. 일부 구체예들에서, 재조합 미생물은 배양 배지 이외의 영양 원천과 발효기 이외의 시스템을 이용하여 성장시킬 수 있음을 또한 인지할 것이다.
스테비올 글리코시드는 상이한 식품계에서 균등한 성능을 반드시 가질 필요는 없다. 따라서, 선택된 스테비올 글리코시드 조성물로 합성이 지향되는 능력을 보유하는 것이 바람직하다. 여기에서 설명된 재조합 숙주들은 특이적 스테비올 글리코시드에 대해 선택적으로 풍부하고, 일관된 맛 프로파일을 보유하는 조성물을 만들 수 있다. 따라서, 여기에서 설명된 재조합 미생물, 식물들, 그리고 식물 세포들은 주어진 식품 산물에 바람직한 단맛 프로파일에 부합되도록 맞추어진, 그리고 배취마다 일관된 각 스테비올 글리코시드 비율을 보유하는 조성물의 생산을 용이하게 할 수 있다. 여기에서 설명된 미생물은 스테비아 추출물들에서 볼 수 있는 바람직하지 못한 식물 부산물을 만들지 않는다. 따라서, 여기에서 설명된 재조합 미생물에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물들은 스테비아 식물들로부터 유도한 조성물과 구별된다.
V. 식품 산물들
여기에서 설명된 방법들에 의해 수득한 스테비올 및 스테비올 글리코시드는 식품 산물들, 규정식 보충물 그리고 감미료 조성물을 만드는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 예컨대, 리바우디오시드 A는 식품 산물들 예컨대, 아이스크림, 탄산음료, 과일 쥬스, 요거트, 구운 제품들, 츄잉검, 단단한 그리고 부드러운 캔디, 그리고 소스 등에 포함시킬 수 있다. 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 비-식품 산물들 예컨대, 약학 산물들, 의학 산물들, 규정식 보충물들 및 영양 보충물들에 또한 포함될 수 있다. 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 농업 및 반려동물 산업 모두에 이용되는 동물 사료 산물들에 또한 포함시킬 수 있다. 대안으로, 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드의 혼합물은 재조합 미생물을 별도로 배양하거나 또는 상이한 식물들/식물 세포들을 성장시키고, 각각 특이적 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 생산하고, 각 미생물 또는 식물/식물 세포들로부터 실질적으로 순수한 형태의 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 회수하고, 그리고 그 다음 원하는 비율의 각 화합물을 포함하는 혼합물을 수득하기 위하여 이 화합물들을 복합시켜 만들 수 있다. 여기에서 설명된 재조합 미생물, 식물들, 그리고 식물 세포들은 현재 스테비아 산물들과 비교하여 좀더 정확하고 일관된 혼합물의 수득을 허용한다. 또다른 대안에서, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 다른 감미료들, 가령 사카린, 덱스트로즈, 슈크로즈, 푸락토즈, 에리트리톨, 아스파르탐, 슈크랄로즈, 모나틴, 또는 아세술팜 칼륨과 함께 식품 산물에 통합될 수 있다. 기타 감미료들에 대하여 스테비올 또는 스테비올 글리코시드의 중량비는 최종 식품 산물의 만족할만한 맛을 얻기 위하여 바람직하게 변화시킬 수 있다. 가령, U.S. 특허 공개 번호 2007/0128311 참고. 일부 구체예들에서, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 풍미 조절물질로써 풍미(가령, 감귤류)와 함께 제공될 수 있다. 예를 들면, 리바우디오시드 C는 단맛 강화제 또는 단맛 조절물질로 이용할 수 있는데, 특히 탄수화물계 감미료들에서 이용하여 식품 산물에서 슈가의 양을 줄일 수 있다.
여기에서 설명된 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산된 조성물들은 식품 산물들로 통합시킬 수 있다. 예를 들면, 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비올 글리코시드 및 식품 산물의 유형에 따라 건중량에 기초하여 약 20 mg 스테비올 글리코시드/kg 식품 산물 내지 약 1800 mg 스테비올 글리코시드/kg 식품 산물의 양으로 식품 산물에 통합시킬 수 있다. 예를 들면, 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산된 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 기초하여 식품 kg당 최대 500 mg 스테비올 글리코시드를 포함하도록 디저트, 차가운 과자류(가령, 아이스크림), 유제품(가령, 요거트), 또는 음료(가령, 탄산 음료)에 통합시킬 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산되는 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 기초하여 식품 kg당 최대 300 mg 스테비올 글리코시드를 포함하도록 구운 제품(가령, 비스킷)에 통합시킬 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산되는 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 기초하여 식품 kg당 최대 1000 mg 스테비올 글리코시드를 포함하도록 소스(가령, 초코렛 시럽) 또는 식물 제품(가령, 피클)에 통합시킬 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산되는 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 기초하여 식품 kg당 최대 160 mg 스테비올 글리코시드를 포함하도록 빵에 통합시킬 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산되는 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 기초하여 식품 kg당 최대 1600 mg 스테비올 글리코시드를 포함하도록 단단한 또는 부드러운 사탐에 통합시킬 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생산되는 스테비올 글리코시드 조성물은 식품 산물의 건중량에 기초하여 식품 kg당 최대 1000 mg 스테비올 글리코시드를 포함하도록 가공된 과일 산물(가령, 과일 쥬스, 과일 필링, 잼 및 젤리)에 통합시킬 수 있다.
예를 들면, 이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 90-99% 리바우디오시드 A와 탐지불가한 양의 스테비아 식물에서 유도된 오염물질들을 보유할 수 있고, 건중량에 근거하여 25-1600 mg/kg, 가령, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg 양으로 식품 산물에 통합시킬 수 있다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3% 이상의 리바우디오시드 B를 보유하는 리바우디오시드 B가 풍부한 조성물일 수 있고, 산물에서 리바우디오시드 B의 양이 건중량에 근거하여 25-1600 mg/kg, 가령, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품 산물에 통합될 수 있다. 전형적으로, 리바우디오시드 B가 풍부한 조성물은 스테비아 식물에서 유도된 탐지불가능한 양의 오염물질들을 가진다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 15%이상의 리바우디오시드 C를 보유하는 리바우디오시드 C가 풍부한 조성물일 수 있으며, 그리고 산물에서 리바우디오시드 C의 양은 건중량에 근거하여 20-600 mg/kg, 가령, 100-600 mg/kg, 20-100 mg/kg, 20-95 mg/kg, 20-250 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 산물에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 리바우디오시드 C가 풍부한 조성물은 스테비아 식물에서 유도된 탐지불가능한 양의 오염물질들을 보유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3% 이상의 리바우디오시드 D를 보유한 리바우디오시드 D가 풍부한 조성물일 수 있고, 그리고 산물에서 리바우디오시드 D의 양이 건중량에 근거하여 25-1600 mg/kg, 가령, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품 산물에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 리바우디오시드 D가 풍부한 조성물은 스테비아 식물에서 유도된 탐지불가능한 양의 오염물질들을 보유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3% 이상의 리바우디오시드 E를 보유한 리바우디오시드 E가 풍부한 조성물일 수 있고, 그리고 산물에서 리바우디오시드 E의 양이 건중량에 근거하여 25-1600 mg/kg, 가령, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품 산물에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 리바우디오시드 E가 풍부한 조성물은 스테비아 식물에서 유도된 탐지불가능한 양의 오염물질들을 보유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 4% 이상의 리바우디오시드 F를 보유한 리바우디오시드 E가 풍부한 조성물일 수 있고, 그리고 산물에서 리바우디오시드 F의 양이 건중량에 근거하여 25-1000 mg/kg, 가령, 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 산물에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 리바우디오시드 F가 풍부한 조성물은 스테비아 식물에서 유도된 탐지불가능한 양의 오염물질들을 보유한다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 4% 이상의 둘코시드 A를 보유한 둘코시드 A가 풍부한 조성물일 수 있고, 그리고 산물에서 둘코시드 A의 양이 건중량에 근거하여 25-1000 mg/kg, 가령, 100-600 mg/kg, 25-100 mg/kg, 25-95 mg/kg, 50-75 mg/kg 또는 50-95 mg/kg이 되도록 식품 산물에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 둘코시드 A가 풍부한 조성물은 스테비아 식물에서 유도된 탐지불가능한 양의 오염물질들을 보유한다.
일부 구체예들에서, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 탁상용 감미료 또는 "cup-for-cup" 산물에 통합시킨다. 이러한 산물들은 전형적으로 하나 이상의 벌크제, 가령, 당업계에 공지되어 있는 말토덱스트린을 이용하여 적절한 단맛 수준으로 희석시킬 수 있다. 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 D, 리바우디오시드 E, 리바우디오시드 F, 또는 둘코시드 A가 풍부한 스테비올 글리코시드 조성물은 테이블용으로 건중량에 근거하여 사세에 산물 kg 당 예를 들면, 10,000 내지 30,000 mg 스테비올 글리코시드으로 포장할 수 있다.
VI. 식물 육종(Breeding)
다형성
여기에서 설명된 핵산들중 다형성(가령, UGT91D2 핵산들)을 스테비아에서 식물 유전자 매핑 및 식물 육종 프로그램에 표식으로 이용할 수 있다. 가령, Yao et al., Genome, 1999, 42:657-661 참고. 따라서, 여기에서 설명된 다형성은 이 다형성이 형질의 변이와 연관이 있는지를 확인하는 방법에 이용할 수 있다. 이 방법은 스테비아 계 또는 집단의 식물들에서 형질 변이와 이들 식물들에서 하나 이상의 유전적 다형성의 존재 사이에 상관관계를 측정하고, 이에 의해 이 유전적 다형성이 형질 변이와 연관이 있는지를 확인하는 것을 포함한다. 전형적으로, 형질은 식물의 잎에 존재하는 스테비올 글리코시드의 총량이지만, 형질은 또한 특정스테비올 글리코시드, 가령, 리바우디오시드 A, 리바우디오시드 B, 리바우디오시드 C, 리바우디오시드 D, 리바우디오시드 E, 리바우디오시드 F, 또는 둘코시드 A의 양일 수도 있다. 일부 구체예들에서, 형질은 스테비올의 양, 또는 이소프레노이드 전구물질의 양이다. 형질과 다형성 표식의 존재 사이에 통계학적으로 유의적인 상관관계는 적절한 매개변수 또는 비-매개변수 통계, 가령, Chi-square 테스트, Student's t-테스트, Mann-Whitney 테스트, 또는 F-테스트를 이용하여 결정한다. 예를 들면, 식물에서 리바우디오시드 A의 양과 다형성 표식의 존재 사이에서 통계학적으로 유의적인 상관관계는 이 표식이 변경된 리바우디오시드 A 수준들의 선택을 위한 표식-연합된 육종 프로그램에 유용할 수 있음을 나타낸다.
다형성은 당업계에 공지되어 있는 방법들에 의해 탐지될 수 있는데, 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), 랜덤 증폭된 다형성 DNA 탐지 (RAPD), 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP), 단순 서열 반복 (SSR) 또는 초위성체(microsatellites)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다형성의 발견, 탐지 및 유전자형 분석은 문헌들에서 설명하고 있다. 가령, Henry, ed. (2001) Plant Genotyping. The DNA Fingerprinting of Plants Wallingford: CABI Publishing; and Phillips and Vasil, eds. (2001) DNA-based Markers in Plants Dordrecht: Kluwer Academic Publishers 참고. 예를 들면, 서열 번호:6, 서열 번호:9, 또는 서열 번호:96에서 제시한 핵산 서열들로부터 유도된 프라이머 또는 프로브, 또는 이의 보체들을 이용하여 원하는 스테비올 글리코시드 조성물과 관련된 다형성 대립형질을 보유하는 하나 이상의 개별 식물들을 확인할 수 있다. 그 다음 이들 식물들을 breeding 프로그램에 이용하여 이 대립형질을 원하는 스테비올 글리코시드 조성물과 관련된 다른 좌에서 다수의 다른 대립형질과 복합시킬 수 있다. 당업자에게 명백한 것과 같이, 요구되는 표식들의 수와 유형은 선택할 형질들, 그리고 각 표식에 대한 상관관계 정도에 따라 달라질 것이다. 따라서, 이 방법들은 특정 구체예에서 식물의 게놈에 다수의 다형성을 탐지하는 것을 포함한다. 이 방법은 컴퓨터 판독 매체상에서 다수의 다형성을 탐지하는 단계들의 결과를 저장하는 것을 더 포함할 수 있다.
따라서, 일부 구체예들에서, 스테비아 식물 계통 또는 집단을 확인하는 방법은 스테비아 식물을 위한 핵산 시료를 공급하고, 시료 안에 존재하는 서열 번호:1, 3, 5 또는 7에 제시한 폴리펩티드들을 인코드하는 핵산에 90% 이상의 서열 동일성을 보유하는 UGT 유전자에 대응하는 스테비아 식물의 영역을 증폭시키기 위한 증폭 프라이머를 제공하고, 핵산 시료에 증폭 프라이머를 제공하여 이 영역의 증폭이 발생하도록 하고, 그리고 형질과 관련된 증폭된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성에 근거하여 원하는 형질을 보유하는 식물들을 확인하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 스테비아 식물에서 폴리뉴클레오티드의 존재를 판단하는 방법은 최소한 하나 프로브 또는 프라이머 쌍을 식물의 핵산과 접촉시키는 것을 포함한다. 이 프로브 또는 프라이머 쌍은 서열 번호: 1, 3, 5, 또는 7에 최한 90% 서열 동일성을 보유하는 UGT 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 특이적이다. 그 다음 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 판단한다.
다형성을 탐지하고, 그리고 스테비아 식물의 유전자유형을 결정하는 방법들에 추가하여, 이 방법들을 실행하는데 적합한 키트 또한 설명하고, 이 방법에 의해 생성된 데이터를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 또한 설명한다. 스테비아 생물학적 시료의 유전자형을 결정하는 키트는 서열 번호: 1, 3, 5, 또는 7에 최소한 90% 서열 동일성을 보유하는 UGT 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 프라이머 쌍 또는 이에 특별히 혼성화되는 프로브를 포함한다. 이러한 키트는 전형적으로 적합한 포장 재닐내에 포함된 프라이머 또는 프로브를 보유한다.
여기에서 설명된 방법 및 키트의 일부 구체예들에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하는데, 각 세트는 특정 그리고 한정된 게놈 위치의 존재 또는 부재를 인지할 수 있다. 배수체(polyploid) 스테비아 계 또는 집단의 경우, 더 많은 올리고뉴클레오티드들이 바람직하다. 하한은 한 개 올리고뉴클레오티드 쌍이며, 상한은 이 방법과 테스트 키트의 바람직한 해결 능력에 의해 설정된다. 스테비아 식물의 DNA에 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 예를 들면, 말단 전이효소 및 통상적인 기록가능한 라벨에 적용하는 임의의 통상적인 라벨링 시스템에 의해 즉석에서 바람직하게 기록된다. 즉석 라벨링에 대안으로, 혼성화된 시료 DNA는 고형 지지대로부터 방출되고, 그리고 후속적으로 고형 지지대에 부착된 원래 올리고뉴클레오티드 서열들 각각에 대응하는 라벨된 폴리뉴클레오티드 서열들에 혼성화된다. 혼성화는 임의 선택적으로 가역적이며, 고형 지지대는 재사용을 위하여 이의 원래 상태로 복귀될 수 있다. 라벨된 디데옥시뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 주형으로 게놈 DNA에 혼성화된다면 올리고뉴클레오티드의 말단에 통합될 수 있다. 이 올리고뉴클레오티드에 매취되는 영역에 인접한 게놈 위치의 뉴클레오티드 서열은 공지이며, 따라서, 통합될 특정 뉴클레오티드 (A, C, G, T 또는 U)는 공지이다. 쌍을 이룬, 예컨데 두 개의 또는 나란한, 예컨데 세 개의, 측면으로 배치된 올리고뉴클레오티드 서열들을 이용하여 공동-우세 득점(Co-dominant scoring)을 얻는다. 수득한 결과들은 가득(full), 비어있음(empty), 실패(failure) 또는 무효( null) 대립형질로 기록하고, 이를 이용하여 이종접합체 및/또는 동종접합체 유전자형을 구별할 수 있다. 세척 및 절단을 포함하는 선택적인 혼성후 처리를 제공하여, 라벨링 전 그리고 라벨링 후 고형 지지재-부착된 올리고뉴클레오티드 서열들에게 충분히 혼성화안된 시료 DNA를 제거한다. 전형적으로 컴퓨터 판독가능한 매체상에서 혼성화 상태의 기록을 허용하는 방법을 이용하여 혼성화의 존재 또는 부재를 기록한다.
육종(Breeding) 프로그램
스테비아는 기-수분이 가끔 관찰되지만 전형적으로 외부교배(outcrossing) 종이다. 따라서, 스테비아 식물 육종 프로그램은 전형적으로 다음중 하나 이상의 이용을 포함한다: 순환 선발 집단 선발(recurrent selection mass selection), 대량 선발(bulk selection), 그리고 교잡수정. 이러한 기술들을 단독으로 또는 육종 프로그램에서 하나 이상의 다른 기술들과 조합하여 이용할 수 있다. Yadav et al., Can. J. Plant Sci. 91: 1-27 (2011) 참고. 각 확인된 식물은 상이한 식물과 교배하여 씨를 생산하고, 이 씨가 발아하여 후손 식물들을 이룬다. 원하는 표현형 및 바람직한 다형성을 보유하는 하나 이상의 후손 식물들의 씨를 복합하고, 그리고 무작위로 짝을 지어 뒤이은 후손 세대를 만든다. 육종 프로그램은 다형성 대립형질(들)을 보유하는 생성된 식물 집단에서 바람직한 안전성을 획득하기 위하여 적절하게는 추가 0 내지 5 세대 동안 이들 단계들을 반복할 수 있다. 대부분의 육종 프로그램에서, 특정 다형성 대립형질에 대한 분석은 각 세대에서 실시할 수 있지만, 바람직한 경우 대체 세대에서 분석을 실시할 수 있다. 후손 식물들의 자가교배(selfing)는 자가교배가 가능한 이들 스테비아 계통 및 집단에서 실시할 수 있다.
순환 선별(Recurrent selection)은 식물들 집단을 개선시키기 위하여 식물 육종 프로그램에 이용되는 방법이다. 이 방법은 후손을 형성하기 위하여 개별 식물들을 서로 타화수분시키는 것을 수반한다. 이 후손이 자라고 임의의 수의 선별 방법들에 의해 우수한 후손들이 선별되고, 이 후손들은 개별 식물, 반형매(half-sib) 후손, 전형매(full-sib) 후손 그리고 자식(selfed) 후손을 포함한다. 선별된 후손은 자가수분되거나 또는 서로 타화수분되어 또다른 집단에 대한 후손을 만든다. 이 집단을 심고, 그리고 자가수분하거나 또는 서로 타화수분하기 위하여 다시 우수한 식물들을 선별한다. 순환 선별은 순환 과정이며, 따라서 필요한 만큼 반복할 수 있다. 순환 선별의 목적은 집단의 형질들을 개선시키는 것이다. 그 다음 개선된 집단은 합성 재배변종의 생산을 포함하는 상업적 또는 육종 용도를 위한 새로운 종류들을 얻기 위한 육종 재료의 원천으로 이용할 수 있다. 합성 재배변종은 몇 가지 선별된 종류들의 교잡수정에 의해 형성된 결과물인 후손이다. 합성물을 만드는데 이용되는 부모 식물 종류, 집단, 야생 계승(wild accessions), 생태형(ecotypes)의 수는 적게는 10에서 많게는 500까지 다양할 수 있다. 전형적으로, 약 100 내지 300개지 종류, 집단 등을 합성 종류의 부모로 이용한다. 합성 종류의 부모 씨 생산 플롯으로부터 종자를 농부에게 판매할 수 있다. 대안으로, 부모 플롯에서 생산되는 종자의 양과 종자에 대한 수요에 따라 부모 종자 생산 플롯의 종자를 후속적으로 1 내지 2 세대 증식을 거치게할 수 있다.
집단 선별(Mass selection)은 분자-표식 연합된 선별과 병용할 때 유용한 기술이다. 집단 선별에서, 개별 식물로부터의 종자는 표현형 또는 유전자형에 근거하여 선별한다. 이러한 선별된 종자들을 많게 하고, 그리고 다음 세대를 기르기 위하여 이용한다. 집단 선별(Bulk selection)은 대용량 플롯에서 식물 집단을 성장시키고, 식물들의 자가-수분을 허용하고, 대용량으로 종자를 수확하고, 그리고 대용량으로 수확된 종자의 시료를 이용하여 다음 세대를 심는 것을 요구한다. 또한, 자가-수분 대신, 직접 수분(directed pollination)을 육종 프로그램의 일부분으로 이용할 수 있다.
따라서, 일부 구체예들에서, 스테비아 식물 계통 또는 집단을 만드는 방법은 서열 번호: 1, 3, 5, 또는 7에 최소한 90% 동일한 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 유전자 좌에서 다양성의 존재는 관심대상의 형질 변이와 연합된 계 또는 집단에서 하나 이상의 식물을 확인하는 것을 포함한다. 그 다음 확인된 식물(들)은 자가 교배하거나 또는 상이한 스테비아 식물과 교배하여 종자를 생산하고, 그리고 이 종자로부터 성장한 최소한 하나 후손 식물을 추가 0-5 세대를 위하여 다시 자가 교배하거나 또는 상이한 스테비아 식물과 교배하여 다형성을 보유하는 계 또는 집단을 만든다.
일부 경우들에서, 다른 유용한 형질에 대한 선별, 질병 저항성에 대한 선별을 또한 실시한다. 이러한 기타 형질에 대한 선별은 원하는 다형성 대립유전자를 보유하는 개별 식물을 확인하기 전, 확인하는 동안 또는 확인하는 동안 실시할 수 있다.
표식-지원된 육종 기술은 다른 종류의 확인 기술에 추가적으로, 또는 이 기술의 대안으로 이용할 수 있다.
이 발명은 다음의 실시예에서 더 설명되지만, 이들 실시예는 청구범위에서 설명하는 발명의 범위를 제한하지 않는다.
VI. 실시예들
실시예 1 - 카우렌 생합성 경로 유전자의 작제
절두된 제빵 효모 HMG CoA 환원효소를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 효모의 많은 복사체 에피좀 플라스미드 벡터 안으로 클론시켜, 코딩 서열을 아미노산 메티오닌에 의해 억제되는 프로모터에 작용가능하도록 연결시켜, 이의 조절하에 두었다. 미국 특허 제5,460,949호 및 제5,306,862호 참고.
표 1에 나타낸 GGPPS 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 효모에서 발현을 위하여 변형시켰고(서열 번호:18-25 참고) 그리고 대장균(E. coli) 벡터 안으로 클론시켜, 코딩 서열을 아미노산 메티오닌에 의해 억제되는 프로모터에 작용가능하도록 연결시켜, 이의 조절하에 두었다. 각 발현 카세트-함유 플라스미드 ("진입 벡터")의 이름은 표 1에 나타낸다. 이 폴리펩티드들이 최초로 확인된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 26-33에 나타낸다. 카타란투스 로제우스(Catharanthus roseus), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 안토필로미세스 덴드로우스(anthophyllomyces dendrorhous)로부터 변형안된 뉴클레오티드 서열에 의해 발현되는 GGPPS 효소들을 이용하여 다른 진입 벡터(차례로 EV270, C301, C413)를 작제하였다.
GGPPS 클론
효소 원천 유기체 gi 번호 수탁번호 플라스미드 이름 구조체
이름		 길이 (nts) 서열번호
(DNA)		 서열번호
(단백질)
stevia rebaudiana) 90289577 ABD92926 pMUS14 MM-1 1086 18 121
Gibberella fujikuroi 3549881 CAA75568 pMUS15 MM-2 1029 19 122
Mus
musculus 		47124116 AAH69913 pMUS16 MM-3 903 20 123
Thalassiosira
pseudonana 		223997332 XP_002288339 pMUS17 MM-4 1020 21 124
Streptomyces clavuligerus 254389342 ZP_05004570 pMUS18 MM-5 1068 22 125
Sulfulobus acidocaldarius 506371 BAA43200 pMUS19 MM-6 993 23 126
Synechococcus sp. 86553638 ABC98596 pMUS20 MM-7 894 24 127
Arabidopsis thaliana 15234534 NP_195399 pMUS21 MM-8 1113 25 128
표 2에 나타낸 CDPS 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 효모에서 발현시키기 위하여 변형시키고(서열 번호: 34-36), 그리고 효모 진입 벡터 안으로 클론시켰다. 이 폴리펩티드들이 최초로 확인된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 37-39에 나타낸다. 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 지아 메이즈(Zea mays), 리코페리스콘 에스큘렌툼(Lycopersicon esculentum )로부터 변형안된 뉴클레오티드 서열에 의해 발현되는 GGPPS 효소들을 이용하여 다른 진입 벡터(차례로 EV64, EV65, EV66)를 작제하였다.
CDPS 클론
효소 원천 유기체 gi 번호 수탁 번호 플라스미드 이름 구조체
이름		 길이 (nts) 서열
번호: (DNA)		 서열번호 (단백질)
stevia rebaudiana 2642661 AAB87091 pMUS22 MM-9 2364 34 129
Streptomyces clavuligerus 197705855 EDY51667 pMUS23 MM-10 1584 35 130
Bradyrhizobium japonicum 529968 AAC28895.1 pMUS24 MM-11 1551 36 131
표 3에 나타낸 KS 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 효모에서 발현시키기 위하여 변형시키고(서열 번호: 40-43), 그리고 효모 진입 벡터 안으로 클론시켰다. 이 폴리펩티드들이 최초로 확인된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 44-47에 나타낸다. 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 쿠르쿠르비타 막시마(Cucurbita maxima ), 쿠쿠미스 사타부스(Cucumis sativus)로부터 변형안된 뉴클레오티드 서열에 의해 발현되는 KS 효소들을 이용하여 다른 진입 벡터(차례로 EV70, EV71, EV72)를 작제하였다.
KS 클론
효소 원천 유기체 gi 번호 수탁번호 플라스미드
이름		 구조체
이름		 길이
(nts)		 서열
번호
(DNA)		 서열번호 (단백질)
stevia rebaudiana 4959241 AAD34295 pMUS25 MM-12 2355 40 132
stevia rebaudiana 4959239 AAD34294 pMUS26 MM-13 2355 41 133
Zea mays 162458963 NP_001105097 pMUS27 MM-14 1773 42 134
Populus trichocarpa 224098838 XP_002311286 pMUS28 MM-15 2232 43 135
표 4에 나타낸 CDPS-KS 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 효모에서 발현시키기 위하여 변형시키고(서열 번호: 48-49), 그리고 효모 진입 벡터 안으로 클론시켰다. 이 폴리펩티드들이 최초로 확인된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 50과 51에 나타낸다.
CDPS-KS 클론
효소 원천 유기체 gi 번호 수탁 번호 플라스미드 이름 구조체 이름 길이
(nts)		 서열 번호 (DNA) 서열 번호 (단백질)
Phomopsis amygdali 186704306 BAG30962 pMUS29 MM-16 2952 48 136
Physcomitrella patens 146325986 BAF61135 pMUS30 MM-17 2646 49 137
표 5에 나타낸 KO 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 효모에서 발현시키기 위하여 변형시키고(서열 번호: 52-55), 그리고 효모 진입 벡터 안으로 클론시켰다. 이 폴리펩티드들이 최초로 확인된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 56-59에 나타낸다.
KO 클론
효소 원천 유기체 gi 번호 수탁 번호 플라스미드 이름 구조체 이름 길이 (nts) 서열 번호 (DNA) 서열 번호 (단백질)
stevia rebaudiana 76446107 ABA42921 pMUS31 MM-18 1542 52 138
Arabidopsis thaliana 3342249 AAC39505 pMUS32 MM-19 1530 53 139
Gibberella fujikoroi 4127832 CAA76703 pMUS33 MM-20 1578 54 140
Trametes versicolor 14278967 BAB59027 pMUS34 MM-21 1500 55 141
표 6에 나타낸 KAH 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 효모에서 발현시키기 위하여 변형시키고(서열 번호: 60-64), 그리고 효모 진입 벡터 안으로 클론시켰다. 이 폴리펩티드들이 최초로 확인된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 65-69에 나타낸다.
KAH 클론
효소 원천 유기체 gi 번호 수탁 번호 플라스미드 이름 구조체
이름		 길이 (nts) 서열
번호 (DNA)		 서열 번호 (단백질)
stevia rebaudiana --* pMUS35 MM-22 1578 60 142
stevia rebaudiana 189418962 ACD93722 pMUS36 MM-23 1431 61 143
Arabidopsis
thaliana 		15238644 NP_197872 pMUS37 MM-24 1578 62 144
Vitis vinifera 225458454 XP_002282091 pMUS38 MM-25 1590 63 145
Medicago trunculata 84514135 ABC59076 pMUS39 MM-26 1440 64 146
* = 서열은 U.S. 특허 공개 번호 2008-0064063에 나타낸다.
표 7에 나타낸 CPR 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 효모에서 발현시키기 위하여 변형시키고(서열 번호: 70-72), 그리고 효모 진입 벡터 안으로 클론시켰다. 이 폴리펩티드들이 최초로 확인된 원천 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 73-75에 나타낸다.
CPR 클론
효소 원천 유기체 gi 번호 수탁 번호 플라스미드 이름 구조체
이름		 길이 (nts) 서열
번호
(DNA)		 서열번호
(단백질
stevia rebaudiana 93211213 ABB88839 pMUS40 MM-27 2133 70 147
Arabidopsis thaliana 15233853 NP_194183 pMUS41 MM-28 2079 71 148
Giberella fujikuroi 32562989 CAE09055 pMUS42 MM-29 2142 72 149
실시예 2 -스테비올 글리코시드 경로 유전자의 작제 표 8에서 열거한 UGT85C2 및 UGT74G1 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들을 보유하는 통합 벡터(Integration vectors)들을 효모 안으로 형질전환시켰다. 게놈으로 통합된 UGT85C2, 또는UGT85C2 및 UGT74G1을 포함하는 형질변환체를 얻었다.
UGT 클론
원천 유기체 UGT No. gi 번호 수탁 번호 유형 플라스미드 이름 길이 (뉴클레오티드) 서열 번호
stevia rebaudiana UGT85C2 37993660 AY345978.1 통합 벡터 pMUS11 1446 4
stevia rebaudiana UGT74G1 37993668 AY345982 통합 벡터 pMUS12 1383 2
stevia rebaudiana UGT76G1 37993652 AY345974 통합 벡터 pMUS13 1377 8
Ipomoea purpurea IP3GGT 62857205 AB192315.1 많은 복사체 벡터 pMUS10 1380 77
Bellis perennis UGT94B1 R25S mutant 56550538
(야생형)		 AB190262.1
(야생형)		 많은 복사체 벡터 pEF1156 1317
(야생형)		 79
Arabidopsis thaliana UGT79B3 28951020 BT005370.1 많은 복사체 벡터 pEF1153 1362 151
IP3GGT 및 UGT94B1 R25S 효소들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들을 효모에서 발현을 위하여 변형시키고(서열 번호: 77 및79), 그리고 효모 진입 벡터 안으로 클론시켰다. IP3GGT 및 UGT94B1 R25S에 대한 아미노산 서열들을 차례로 서열 번호: 76 및 78에 제시한다. 변형된 IP3GGT 뉴클레오티드 서열을 함유하는 많은 복사체 에피좀 벡터는 pEF1155로 명명하였다. 변형된 UGT94B1 R25S 뉴클레오티드 서열을 포함하는 많은 복사체 에피좀 벡터는 pEF1156로 명명하였다.
실시예 3 -효모 균주의 작제
EFSC301로 명명된 효모 균주는 내생성 ERG9 프로모터를 구리 유도성 CUP1 프로모터로 대체시킴으로써 변형되었다. 균주 EFSC301는 EUROSCARF 채집 효모 균주 BY4742의 유도체다. uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/by.html 참고. 표준 효모 성장 배지에서, ERG9 유전자는 이 배지내 구리 농도가 낮기 때문에 매우 낮은 수준으로 전사된다. 이 균주에서 에르고스테롤 생산의 감소는 스테비올 생합성에 이용할 수 있는 이소프렌 단위량을 증가시키게 한다. 효모 균주는 스테비아 UGT85C2 및 UGT74G1 유전자를 게놈에 통합시켜 또한 변형되는데, 이들 각각은 강력한 구성 GPD1 프로모터의 제어하에 있다. 표 8 참고. 이 균주는 MUS1241 균주 게놈 안에 통합된 스테비아 UGT85C2 및 UGT74G1 각 유전자의 한 개 복사체를 보유한다.
실시예 4 -효모에서 스테비올 글리코시드 경로 유전자 발현의 분석
효모에서 스테비올 글리코시드 생합성을 검사하기 위하여, 표 1-7 및 실시예 1의 36개 진입 벡터들의 발현 카세트를 무작위로 결찰 반응에 연결시켜 인위적인 효모 염색체("eYACs")들을 만들었다. 이 과정은 도 5에 도시한다.
두 가지 상이한 세트의 결찰을 실시하였다. 결찰 세트 A는 이중-기능을 하는 CDPS-KS 유전자 (표 4)가 포함되지 않는 것을 제외하고, 표 1-7에 열거된 모든 유전자들을 포함하였다. 결찰 세트 B는 단일-기능을 하는 CDPS 및 KS 유전자 (표 2-3)가 포함되지 않은 것을 제외하고 표 1-7에 열거한 모든 유전자들을 포함하였다.
카세트-함유 진입 벡터로부터 30 내지 200μg의 DNA를 준비하였다. 유전자 발현 카세트들은 제한 효소 AscI로 절단함으로써 각 벡터로부터 방출되었다. 그 다음 카세트들은 3시간 반응에서 T4 리가아제로 결찰시켜 eYACs에 무작위로 연결시켰다. 연쇄(concatenation) 반응의 성공은 반응 혼합물의 점성으로 평가되는데, 농축된 DNA가 점성이 매우 크기 때문이다. 동원체(centromere), 두개의 말단소립(telomeres) 그리고 LEU2 및 TRP1 선별 표식들을 함유하는 DNA 단편들("arms")을 농축된 발현 카세트들의 단부에 추가하고, 이로 인하여 기능을 하는 eYACs가 만들어진다.
eYACs는 효모 세포 벽의 자이모라제(zymolyase) 절단과, 스페로플라스트(spheroplasts)가 큰 분자 예컨대, eYACs가 투과할 수 있도록 만드는 CaCl2/PEG 완충액으로 처리함으로써 컴피턴트 효모 균주 MUS1243의 스페로플라스트로 형질전환되었다.
형질전환 후, 효모 스페로플라스트는 고형 성장 배지에 기초한 불활성 한천에 박아두었고, 여기에서 세포 벽의 재생이 일어날 수 있다. 접종 후 4-8일 후 콜로니들이 나타났다. 재생 배지는 아미노산 루이신 및 트립토판이 부족하고, 따라서 효모 세포들에서 이중-무장된(double-armed) eYACs의 존재에 대해 선별할 수 있다.
약 3,000개의 형질변환체들을 각 세트로부터 얻었다. 각 형질변환체를 재도말하였고(re-streaked) 그리고 효모 균주 표식들과 이중 무장된 eYAC, 예컨데, LEU2 및 TRP1 표식들에 대한 유전적 존재에 대해 테스트하였다. 97% 이상의 형질변환체들은 정확한 유전자형을 보유하였다. 각 형질변환체에 CEY 지정 번호를 부여하였다.
우선, 각 세트로부터 24개 CEYs를 2 ml의 합성 완전 배지(SC),-(메티오닌 없이)에서 24시간 동안 성장시켜, eYACs로부터 유전자 발현을 유도하였다. 24 시간 후, 각 배양물의 상청액을 수집하고, 루부소시드의 존재에 대해 LC-MS (Liquid Chromatography-coupled Mass Spectrometry (Triple Quadropole)) 분석을 하였다. 스테비아 UGT74G1 및 UGT85C2 유전자는 각 CEY 형질변환체에서 공동-발현되기 때문에, 스테비올이 생산될 때 예상되는 최종 산물은 루부소시드 (스테비올-(13-β-D-글루코피라노실옥시)-β-D-글루코피라노실 에스테르)이다.
세트 B의 CEYs중 어느 것도 탐지가능한 수준의 루부소시드를 생산하지 않았지만, 세트 A의 CEYs중 7개는 생산하였다. 균주 CEY19는 수석 생산자이었다. CEY19는 질량이 665.2인 화합물을 생산하였는데, 이는 루부소시드의 나트륨 첨가물에 대응할 수 있다. 질량이 643.2인 화합물 또한 볼 수 있었는데, 이는 아마도 양성자 추가된 루부소시드에 대응한다. 665.2 질량의 화합물의 MS-MS-기반 분자 분획물은 503.2의 질량으로 분해되고, 이는 나트륨 첨가물로써 스테비올 모노시드에 대응한다. 이 화합물의 질량, 분획 패턴, HPLC 스펙트럼, 그리고 이 화합물의 유지 표준(retention standard)은 스테비아 효소들 85C2 및 74G1을 이용하여 스테비올의 당화에 의해 시험관에서 생산되는 루부소시드 표준과 정확하게 대응하여, CEY에 의해 생산된 화합물은 루부소시드라고 판단하였다.
루부소시드 생산을 위한 추가 스크리닝
세트 A의 추가적인 95개 클론과 세트 B의 95개 클론을 96개 딥-웰 트레이에서 메티오닌 없이 1 ml의 SC 배지에서 성장시켰다. 이들 배양물 각각의 상청액은 두 개의 클론 모음에서 복합시켰고, LC-MS로 분석하였고, 그리고 MS 신호/소음 비율을 결정하였다. MS s/n 비율은 상대적인 루부소시드 함량의 적정한 측도이다. 2가지 CEYs의 모음이 루부소시드를 생산하는 것으로 밝혀질 때, 이들 모음에서 각 클론은 별도로 분석하였다. 결과들에서 세트 B의 CEYs는 루부소시드를 생산하지 않았고, 세트 A의 최소한 28개 CEYs는 탐지가능한 수준들의 루부소시드를 생산하였다는 것을 보여주었다.
루부소시드를 생산하는 CEY 클론에 존재하는 유전자의 확인
루부소시드 생산에 대해 eYACs의 유전자 함량의 상관관계를 위하여, PCR 프로토콜이 개발되었는데, 이 프로토콜에서 모든 가능한 eYAC-운반된 유전자의 유사한 크기의 단편들(0.5 kb)을 증폭시킬 수 있다. 20-25 nt의 내부 프라이머는 모든 유전자를 증폭시키기 위하여 유사한 어닐링 온도를 이용하도록 위치시켰다. eYAC DNA를 포함하는 게놈 DNA는 루부소시드 생산이 없는 4개 CEY, 루부소시드 생산이 낮은 4개 CEY 그리고 루부소시드 생산이 매우 높은 6개 CEY를 준비하였다. 이들 14개의 등몰량의 DNA 준비물을 이용하여, 이들 14개 CEY에 대해 37개 유전자 모두와 양성 및 음성 대조군에 대하여 분석학적 PCR을 실행하였다. 하나를 제외하고 모든 유전자들이 증폭하였는데, 하나는 프라이머 결함으로 인한 것으로 보인다.
많은 루부소시드를 생산하는 6개 CEY 균주에 존재하는 유전자를 표 9에 나타낸다. 루부소시드를 생산하지 않거나 적게 생산하는 8가지 CEY 균주에 존재하는 유전자는 표 10에 나타낸다.
많은 루부소시드를 생산하는 CEY 균주들에 존재하는 유전자
높은 생산 매우 높은 생산
유전자 CEY50 CEY176 CEY19 CEY173 CEY191 CEY213
tHMG1 + + + + - +
MM-1 - + + + + -
MM-2 - + + + + -
MM-3 + + + + + +
MM-4 + + + - + +
MM-5 + + + + + +
MM-6 + + + + + +
MM-7 - + - + + -
MM-8 + + + + - +
EV270 + + - + + +
C301 + + + + + +
C413 + + - + + +
MM-9 + + + + + +
MM-10 + - - + + +
MM-11 + + - + + +
EV64 + + + + + +
EV65 - - + + + +
EV66 + + + + + +
MM-12 + - - + + +
MM-13 + + + + + +
MM-14 + + + + + +
MM-15 - - - - + -
EV70 - + + + - -
EV71 프라이머 결함
EV72 + + + + + +
MM-18 + + + + + -
MM-19 + - + - + +
MM-20 + + + + + +
MM-21 - - + + - +
MM-22 + + + + + +
MM-23 + - + + - +
MM-24 + + + + + +
MM-25 + + + + + +
MM-26 + + + + + +
MM-27 + + + + + +
MM-28 - - - - - -
MM-29 + + + + + +
루부소시드 생산이 적거나 또는 없는 CEY 균주들에 존재하는 유전자
루부소시드 생산이 없음 낮은 생산
유전자 CEY162 CEY169 CEY171 CEY188 CEY75 CEY147 CEY214 CEY87
tHMG1 - - - - - - + +
MM-1 + + + + - + - -
MM-2 + - + + + + + +
MM-3 + + + + + + + +
MM-4 - - + - - + - +
MM-5 + + + + + + + +
MM-6 + + + - + + + +
MM-7 + - + + + + + +
MM-8 + + + + + + + +
EV270 + + + + + + + +
C301 + + + + + + + +
C413 + + + + + + + +
MM-9 + + + + - + + +
MM-10 + + + + - + + +
MM-11 + + + + + + + -
EV64 + + + + - + + +
EV65 + - - - + - + -
EV66 + + + + + + + +
MM-12 + + + + + + + +
MM-13 + + + + + + + +
MM-14 + + + + + + + +
MM-15 + - + - + + - +
EV70 + + + + + + + +
EV71 프라이머 결함
EV72 + + + + + + + +
MM-18 + + + + + + + +
MM-19 + + + + + + + +
MM-20 + + + + + + + +
MM-21 - + - - - + - +
MM-22 + + + + + - + +
MM-23 + - + - + + - +
MM-24 + - + + + + + +
MM-25 + - + + + + + +
MM-26 + + + + + - + +
MM-27 + + + + + + + +
MM-28 - - + - - - - +
MM-29 + + + + - + + +
실시예 5 -효모 배양 조건의 수정 루부소시드 생산을 최대화시키는데 도움이 되는 배양 조건들을 결정하기 위하여 균주 CEY213로 실험들을 실시하였다. 출발 물질은 CEY213의 글리세롤 냉동 저장물(-80℃)이었다. 냉동된 세포들은 트립토판, 루이신 그리고 히스티딘 (SC-TLH)없이, 그리고 2 mM의 메티오닌을 포함하는 SC 효모 배지가 있는 한천 플레이트에서 최초로 유래되었다. 2mM의 메티오닌을 함유하는 5 ml의 액체 SC-TLH 배지에 냉동 저장된 CEY213 효모 세포들의 루프-풀(loop-full)을 접종시켰다. CEY213에서 eYAC 발현은 이들 조건에서 억제된다. 이 세포들은 느린 교반(170rpm)과 함께 하룻밤 동안 30℃에서 성장시켰고, 이를 "사전-배양물(pre-cultures)"로 명명하였다.
CEY 213 사전-배양물을 이용하여 메티오닌이 없는 25-50 ml의 SC 배지에 접종하였고, 이때 하기에 명시된 매개변수는 다변하였다. 각 성장 조건하에 루부소시드 생산은 500 μl의 각 배양 배지를 원심분리하고, 250 μl의 상청액을 새로운 튜브에 첨가하고, 철저하게 흔들고, 그리고 최대 속도에서 10분간 원심분리하여 측정하였다. LC-MS에 의해 루부소시드 생산에 대해 상청액의 분획물을 분석하였다.
구리 수준들
CEY213 사전배양물은 50 M 베토쿠프린이디술폰산(bathocuproinedisulfonic acid)이 추가된 SC 배지에서 성장시켰다. 베토쿠프린이디술폰산은 성장 배지내 구리에 킬레이트 고리를 형성한다. CEY213에서 ERG9 유전자는 CUP1 프로모터에 의해 이의 발현이 조절되도록 변형시킨다. 배지내 구리 수준들의 감소는 ERG9 활성을 더 감소시킬 것이고, 이에 의해 스테비올 생합성에 이용가능한 이소프렌 단위량은 증가할 것이다.
성장 배지에서 구리 이온의 킬레이트화는 효모 배양물의 성장에 해로운 효과를 가지고 있었고, 루부소시드 생산이 비례적으로 감소하였다. 구리 켈레이트화없을 경우 조차도, 균주 CEY213는 에르고스테롤 생합성의 최소 속도에 있었고, 이소프렌 단위가 에르고스테롤 생합성으로부터 스테비올 글리코시드 생산을 지향하여 전향하지 않을 것이라고 이러한 결과들은 암시하였다.
글루코오즈
이용가능한 글루코오즈를 2%에서 4%로 배가시키면 루부소시드 생산에 있어서 루부소시드 생산이 약 5-10% 증가하는 보잘 것 없는 효과가 있었다.
이용가능한 질소 제한
CEY213 사전-배양물은 이용가능한 질소를 제한한 조건들 하에서 성장시켰다. 배양에서 효소 성장 동안 질소의 제한은 에르고스테롤의 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있다. NH4SO4의 농도가 4g/l에서 2g/l, 1g/l 또는 0.4 g/l로 감소되었을 때, CEY213의 성장률은 질소의 양에 비례하여 감소하였다. 루부소시드 생산은 성장의 감소와 비례하여 감소하였다.
배양물의 통기(Aeration)
CEY213은 배플(baffle)이 있는 또는 없는 Ehrlenmeyer 플라스크에서 성장시켰다. 배플의 사용을 통하여 통기의 증가로 인한 효과는 미미하였다(marginal effect)는 것을 결과들로부터 나타났다. 있다면, 배플의 부족으로 인하여 통기의 부족은 생산을 증가시켰다.
개시, 발효 시간 및 성장 온도에서 광학 밀도
배양물은 두 가지 상이한 광학 밀도, 사전-배양된 CEY213의 광학 밀도 OD600=0.1 또는 OD600=1.0에서 시작하였다. 그 다음 발효는 20℃, 25℃ 또는 30℃의 온도에서 24, 48, 72 또는 144 시간 동안 실시하였다.
도 6에 나타낸 것과 같이, 발효 시작시 배취 배양물의 밀도, 배양 온도, 발효 시간의 조합은 CEY21에 의해 생산되는 루부소시드의 양에 유의적인 효과가 있었다. 따라서, OD600=1.0의 시작 광학밀도, 30℃에서 144시간의 배양물을 성장시킴으로써 8.5 mgs/liter에 못지않은 루부소시드를 생산하였다.
실시예 6 - 루부소시드의 대규모 생산
CEY213을 이용한 일련의 발효 실험은 3가지 종류의 효모 배지(풍부한 배지(rich medium)와 두 가지 유형의 합성 배지)를 이용하고, 접종 밀도를 변화시키고, 그리고 eYAC 유전자 카세트 발현의 시간을 변경시키면서 실시하였다.
배취 발효 조건들(Batch Fermentation Conditions)
배취 발효는 CEY213 사전-배양물을 원심분리시키고, 상청액을 버리고, 세포들은 100μM 메티오닌과 4% 글루코오즈를 함유하는 6 L의 SC-TLH 배지에 재현탁시켜 실시하였다. 배플없는 100 ml Ehrlenmeyer 플라스크에서 OD600을 1.0으로 조정하였고, 그리고 세포들은 느린 교반과 함께 30℃에서 144시간 동안 성장시켰다.
루부소시드의 회수
발효후, 배양물을 원심분리시키고, 상청액은 동량의 메탄올과 혼합시키고, 철저하게 흔들고, 침전된 물질을 제거하기 위하여 원심분리시켰다. 생성된 상청액은 용리액으로 메탄올을 이용하여 섬광 C18-실리카 컬럼 크로마토그래피하고, 한 가지 주요 화합물과 탐지되는 한 가지 추가 소수 화합물을 얻기 위하여 예비 HPLC를 실시하였다.
정제된 화합물은 1H 및 13C NMR로 분석하였고, 데이터는 도 7에 나타낸다. 이 화합물은 루부소시드의 1H 및 13C NMR 문헌 값과 비교한 것에 근거하여 루부소시드로 확인되었다. 정량적 분석에서 CEY213 발효는 12.8 mgs/liter의 루부소시드를 생산하였다는 것을 나타낸다.
실시예 7 - IP3GGT 활성
1. 시험관에서 이포모에아 푸르푸레아( Ipomoea purpurea ) 3GGT 글리코실전이효소의 효소 활성
스테비올을 기질로 이용하여 이포모에아 푸르푸레아(Ipomoea purpurea) 3GGT 글리코실전이효소 (IP3GGT)의 시험관에서 효소 활성을 시험관에서 측정하였다. 스테비아 리부아디안(stevia rebaudian) UGT85C2 및 IP3GGT 글리코실전이효소의 유전자들은 각각 대장균에서 발현시켰고, 각 효소를 정제하였다.
효소 반응은 두 단계로 실행하였다. 우선, 0.5 mM 스테비올 (총 9.55 mgs)을 반응 완충액(1 mM UDP-글루코오즈, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2, 1 mM KCl, 0.1 U/ul 송아지 내장 포스파타아제를 포함)에서 30℃에서 16시간 동안 ca. 0.5 g UGT85C2 효소와 함께 항온처리하였다. 그 다음 ca. 0.5 g IP3GGT 효소를 추가하였고, 반응 혼합물은 30℃에서 추가 20시간 동안 항온처리하였다.
반응 산물들의 분석에서 스테비올이 스테비올-13-O-모노시드로 100% 전환되었고, 이중 25%는 스테비오-13-O-1,2-바이오시드로 추가 글리코실화된 것으로 나타났다. 이론상의 스테비올-13-O-1,2-바이오시드 수율은 약 4.8 mg이었다. 반응 혼합물은 예비 HPLC를 거치고, 2.5 mg의 스테비올-13-O-1,2-바이오시드 (52% 정제 수율)을 얻었다. LC-MS를 이용하여, 정제된 화합물의 덩어리는 루부소시드 및 스테비올-13-O-1,3-바이오시드와는 상이한 유지 시간(retention time)을 가졌다. 정제된 화합물은 1H NMR, 이종핵 단일 양자 밀착성(heteronuclear single quantum coherence)(HSQC)-NMR 및 히종핵 다중 결합 상관관계(heteronuclear multiple bond correlation) (HMBC)-NMR 분석을 거치고, 이에 의해 이 화합물이 스테비올-13-O-1,2-바이오시드임을 확인하였다.
2. 스테비올- 또는 스테비올 모노시드-공급한 효모에서 PIP3GGT의 생체내 발현
IP3GGT가 효모에서 활성인 지를 결정하기 위하여, GPD1 강력한 프로모터에 작용가능하도록 연결된 변형안된 IP3GGT 코딩 서열을 함유하는 2μ 많은 복사체(에피좀) 플라스미드, pMUS10을 효모 균주 MUS1245 안으로 형질전환시켰다. MUS1245는 유전적으로 통합된 UGT85C2 발현 카세트를 함유한다. 생성된 효모 균주는 OD600=0.2의 출발 밀도에서 IP3GGT 발현 플라스미드의 지속적인 존재에 대해 선별하기 위하여 히스트딘이 없는 SC 배지에서 성장시켰다. 스테비올 또는 스테비올 모노시드를 3 mM에서 배지로 추가하였다. 30℃에서 72시간 동안 성장시킨 후, HPLC에 의해 스테비올 및 스테비올 글루코시드의 존재에 대해 배양 상청액을 분석하였다.
LC-MS 분석에서 스테비올-13-O-모노시드를 탐지할 수는 있지만, 스테비올이 공급된 후 1,2-글루코실화된 스테비올-13-O-글루코시드가 탐지되지 않았다. 대조적으로, 낮은 그러나 탐지가능한 양의 스테비올 1,2-바이오시드는 스테비올-13-O-모노시드가 공급된 후 pMUS10를 가지고 있는 MUS1245에 의해 만들어졌다. 이러한 결과에서 고유 이포모에아 푸르푸레아(Ipomoea purpurea) 3GGT 코딩 서열은 스테비올 모노시드가 스테비올 1,2-바이오시드로 생체내에서 탐지가능한 전환을 얻는데 충분한 수준으로 효모에서 발현됨을 보여준다.
실시예 8 -효모 균주들의 변형
EXG1 및 EXG2
S. cerevisiae는 스테비올 1,2- 및 스테비올 1,3-바이오시드에서 1,2 또는 1,3 슈가 결합을 분해하는 효소들을 함유할 수 있다. 이 가능성을 테스트하기 위하여, 효모 균주 CEY213은 두 가지 바이오시드 각 0.1 mM를 함유하는 배지에서 30℃에서 3일간 성장시켰다. 배양물의 LC-MS 분석에서 1,2-바이오시드의 수준은 안정적이었지만, 1,3-바이오시드에서 1,3-결합은 분석의 감지 한계 범위내에서 완전하게 가수분해된 것으로 나타났다.
하나의 공지된 또는 추정 글리코시드 가수분해효소 유전자에서 파괴된 각 25가지 S. cerevisiae 돌연변이체들은 스테비올 바이오시드를 분해하는 능력에 대하여 검사하였다. 각 효모 돌연변이체의 배양물은 스테비올 1,3-바이오시드를 함유하는 배지에서 상기에서 설명한 것과 같이 성장시키고, 그리고 LC-MS에 의해 분석하였다. EXG1 (엑소-1,3-β-글루칸소화효소) 유전자에 돌연변이를 가지고 있는 효모 균주는 1,3-바이오시드 가수분해 활성의 대부분을 상실한 것으로 밝혀졌다. 효모 EXG1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 Vazquez de Aldana et al. Gene 97:173-182 (1991)에서 보고되었다. EXG2 유전자 (또다른 엑소-1,3-β-글루칸소화효소)에 돌연변이를 가지고 있는 효모 균주는 가수분해 활성이 조금 감소하였다. Correa, et al., Current Genetics 22:283-288 (1992).
이중 돌연변이체 효모 균주 (exg1 exg2)를 만들었다. 이중 돌연변이체 균주를 스테비올 1,3-바이오시드를 함유하는 배지에서 성장시켰을 때, 바이오시드의 가수분해가 탐지되지 않았다.
실시예 9 - 스테비올 생합성의 증가된 역가
실시예 4 (및 표 11)에서 테스트한 상이한 효소 부류 각각으로부터 개별 효소 클론은 이소펜테닐 피로포스페이트 및 파르네실 피로포스페이트로부터 최대 스테비올을 생산하는 특정 클론을 확인하기 위하여 eYAC 기술을 이용하여 검사하였다. GGPPS, KO 및 KAH 효소들은 스테비올 경로에서 모든 남아있는 효소적 단계들을 발현시키는 S. cerevisiae 균주에서 개별적으로 eYAC에서 테스트하였고, 또는 GGPPS 효소들의 경우 개별적으로 또는 두 개의 모둠(가령, 시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.) + S. acidocaldarius GGPPS 또는 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) GGPPS 단독)에서 테스트하였다. Synechococcus spp. GGPPS 클론 MM-7 (서열 번호:24에 의해 인코드됨)이 가장 효과적이었음을 결과에서 나타났다. 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 와 술푸로부스 아시도칼다리우스(Sulfulobus acidocaldarius)로부터 GGPPS 클론 또한 상당한 활성이 있었다. KO 및 KAH 클론들중에서 스테비아 KO 클론 MM-18 (서열 번호:52에 의해 인코드됨)과 A. thaliana KAH 클론 MM-24 (서열 번호:62에 의해 인코드됨)이 최대로 스테비올을 생산하였다는 것이 결과에서 또한 나타났다.
원천 유기체 효소 gi 번호 수탁 번호 코딩 서열 코딩 서열
길이 (뉴클레오티드)
stevia rebaudiana GGPPS-1 158104429 ABD92926 MM-1 1086
Gibberella
fujikoroi 		GGPPS-2 3549881 CAA75568 MM-2 1029
Mus musculus GGPPS-3 BC069913.1 MM-3 903
Thalassiosira pseudonana GGPPS-4 223997332 XP_002288339 MM-4 1020
Sulfulobus acidocaldarius GGPPS-6 506371 BAA43200 MM-6 993
Synechococcus sp. GGPPS-7 86553638 ABC98596 MM-7 894
Cantharanthus roseus GGPPS-9 1063275 X92893 EV270 1074
Aspergillus nidulans GGPPS-10 29468175 AF479566 C301 1191
Xanthophyllomyces dendrorhous GGPPS11 63145970 DQ016502 C413 1131
stevia rebaudiana CDPS-1 2642661 AAB87091 MM-9 2364
Streptomyces clavuligerus CDPS-2 197705855 EDY51667 MM-10 1584
Bradyrhizobium japonicum CDPS-3 529968 AAC28895.1 MM-11 1551
Arabidopsis thaliana CDPS-4 18412041 NM_116512 EV-64 2409
Zea mays CDPS-5 50082774
 AY562490 EV-65 2484
Lycopersicon esculentum CDPS-6 6009477
 AB015675 EV-66 2403
stevia rebaudiana KS-1 4959241 AAD34295 MM-12 2355
stevia rebaudiana KS-2 4959239 AAD34294 MM-13 2355
Zea mays KS-3 162458963 NP_001105097 MM-14 1773
Populus trichocarpa KS-4 224098838 XP_002311286 MM-15 2232
Arabidopsis thaliana KS-5 3056724
 AF034774
 EV-70 2358
Cucurbita maxima KS-6 1431869
 U43904
 EV-71 2370
Cucumis sativus KS-7 21326756
 AB045310
 EV-72 2358
stevia rebaudiana) KO-1 76446107 ABA42921 MM-18 1542
Arabidopsis thaliana KO-2 3342249 AAC39505 MM-19 1530
Gibberella fujikoroi KO-3 74676162
 O94142 MM-20 1578
Trametes versicolor KO-4 14278966
 AB057426
 MM-21 1500
stevia rebaudiana KAH-1 * MM-22 1578
stevia rebaudiana KAH-2 189418962 ACD93722 MM-23 1431
Arabidopsis thaliana KAH-3 15238644 NM_122399 MM-24 1578
Vitis vinifera KAH4 225458453 XM_002282055 MM-25 1590
Medicago trunculata KAH5 84514134 DQ335781 MM-26 1440
stevia rebaudiana CPR-1 189098311 DQ269454.4 MM-27 2133
Arabidopis thaliana CPR-2 145343899 NM_118585 MM-28 2079
Gibberella fujikoroi CPR-3 32562988 AJ576025.1 MM-29 2142
* U.S. 특허 공개 번호 20080064063
실시예 4에서 설명한 S. cerevisiae 균주 CEY213은 표 11에 나타낸 GPD1 프로모터에 작동가능하도록 연결된 CDPS 또는 KS 유전자중 하나를 운반하는 많은 복사체 플라스미드로 형질전환되었다. 예비 실험에서 CEY213에서 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana) CDPS (CDPS-1, 서열 번호:34에 의해 인코드됨)의 과다 발현은 많은 복사체 CDPS-1 과다발현 플라스미드가 부족한 CEY213과 비교하였을 때 루부소시드 생산을 증가시킨 것으로 나타났다. 이 실험은 또한 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana) KO (KO-1, 서열 번호:52에 의해 인코드됨)는 테스트한 두 가지중 가장 활성있는 KO였다는 것을 나타내었다.
일관성있게 높은 수준의 스테비올 글리코시드를 생산하는 효모 균주를 작제하기 위하여, GGPPS-10 클론을 함유하는 발현 카세트, KO-1 클론(서열 번호:52) 및KAH-3 클론(서열 번호:62)은 S. cerevisiae 균주 CEN.PK 111-61A의 게놈 안으로 안정적으로 통합시켰다. 구성 GPD1 및 TPI1 프로모터들에 의해 이들 카세트들이 발현되었다. 또한, KS-1 (서열 번호:40), CDPS-1 (서열 번호:34) 및 UGT74G1 (서열 번호:2)을 포함하는 발현 카세트들을 게놈안으로 안정적으로 통합시켰다. 그러나, 생성된 효모 균주, EFSC1751는 실시예 6에서 설명한 조건들하에서 실험실 규모로 성장시켰을 때 임의의 스테비올-19-O-모노시드를 생산하지 못하였다.
EFSC1751에서 스테비올 글리코시드 생산의 부족에 대한 근거를 확인하기 위하여, CDPS-3, CDPS-4, CDPS-5 및 CPR-1 유전자 단독 또는 조합으로 균주 EFSC1751에서 발현시켰다. CPR-1은 스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana)에서 유래되었고, 이의 서열은 Genbank Accession DQ269454.4에서 찾아볼 수 있다. 결과들로부터 CDPS-3, CDPS-4 또는 CDPS-5와 함께 발현하였을 때, CPR-1은 EFSC1751에서 스테비올-19-O-모노시드를 생산하였다. 동일한 균주에서 이들 유전자 단독으로는 어떠한 생산도 하지 못하였다. 이들 결과는 CDPS-1, 스테비아 효소의 게놈상에 통합된 복사체는 이 효모 구조체에서 기능을 하지 못하지만, Bradyrhizobium, Arabidopsis 또는 Zea CDPS 클론은 이 구조체에서 기능을 하였다는 것을 알 수 있었다. 또한, 이 구조체의 염색체 안으로 통합된 식물에서 유도된 KAH 및/또는 KO 유전자는 외생 CPR for 활성을 위하여 외생 CPR을 요구하는 것으로 보인다. Giberella fujikuroi (MM-29)의 CPR 또한 식물에서 유도된 KAH 및/또는 KO 폴리펩티드들과 작용할 수 있는 것으로 보인다.
두 가지 선두 GGPPS 후보들, GGPPS-6 (서열 번호:23에 의해 인코드됨)과 GGPPS-7 (서열 번호:24에 의해 인코드됨)은 기능을 하는 스테비올 글리코시드 경로 (UGT74G1를 포함)를 보유하지만 GGPPS 유전자는 없는 S. cerevisiae 균주에서 개별적으로 추가 발현되었다. 그 다음 50% DMSO에 5분간 가열시키고, 16000 상대적 원심력(RCF)에서 5분간 원심분리한 배양물 시료의 LC-MS 분석에 의해 19-SMG의 생산에 대하여 형질변환체들을 분석하였다. GGPPS-6-발현 플라스미드를 함유하는 많은 형질변환체들은 19-SMG를 생산하지 않았다는 것을 알았다.
GGPPS-7을 포함하는 매우 소수의 형질변환체들을 수득하였는데, 이는GGPPS-7 (시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.)은 두 효소들의 더 활성이 있는 두 효소들일 수 있으며, 이 활성은 독성을 부여하는데 충분하도록 높을 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들면, GGPP 생산에서의 급격한 증가는 하류 경로 예컨대, 에르고스테롤 생산으로 배출되게 할 수 있다. 이 가설을 테스트하기 위하여, UPC2-1 유전자는 GGPPS-7과 공동 발현시켰고, 세포들의 에르고스테롤 공급을 시도하여 이것이 세포들의 성장을 탈환할 수 있는지를 보았다. 그러나, 세포 성장은 탈환되지 않았다.
세포 독성은 GGPP의 축적 또는 GGPP의 대사물질로 인한 것일 수도 있다. 이 가설을 테스트하기 위하여, CDPS-5는 GGPPS-7-발현시키는 효모 균주에서 더 발현시켜 독성이 GGPP 사용의 증가에 의해 경감될 수 있는지를 보았다. CDPS5 과다-발현은 어느 정도 성장을 탈환한 것으로 보였는데, 그 이유는 GGPPS-7와 함께 이 효소를 과다발현시키는 플라스미드와의 형질변환이 몇몇 콜로니에서 발생하였기 때문이다. 형질변환체의 수는 여전히 낮았다. 유사한 균주 단, GGPPS-7 대신 GGPPS-10을 가진 유사한 균주에서 CDPS-5의 과다-발현으로 스테비올 글리코시드 생산이 배가되었고, 이들 결과들은 함께 CDPS가 도입된 스테비올 글리코시드 생합성 경로에서 제한적인 병목임을 암시할 수 있다.
요약하면, 효모 배지 + 2% 글루코오즈에서 30℃, for 24-72 시간 동안 시험관 세포 배양물에서 19-SMG 또는 루부소시드의 생산에 근거하여 eYAC 구조체들로 다음과 같은 결론을 얻었다: KS-1 (스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana), 서열 번호:40에 의해 인코드됨), KO-1 (S. rebaudiana, 서열 번호:52에 의해 인코드됨) 및 KAH-1 (S. rebaudiana) 또는 KAH-3 (아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 서열 번호:62에 의해 인코드됨)은 스테비올 경로에서 최고의 조합으로 보인다. GGPPS-7 (시네코코쿠스 종(Synechococcus sp.))은 이 단계에서 최고의 활성을 나타내지만, 하류 병목이 발생한다면, 과다발현은 또한 독성과 전반적으로 더 낮은 수준의 스테비올 글리코시드로 이어질 수 있다. CDPS 및 CPR 유전자 유사체들의 모든 조합을 테스트하였고, 표 11에서 3개 CPR 모두 활성이 있었던 것으로 밝혀졌으며, 그리고 CDPS-5 지아 메이즈(Zea mays) 또는 CDPS-4 (A. thaliana)와 함께 CPR-1 (S. rebaudiana, 서열 번호:70에 의해 인코드됨) 또는 CPR-3 (Gibberekka fujikuroi, 서열 번호:72에 의해 인코드됨)의 조합은 특히 유용하였다. CDPS-5는 이 경로에서 최적의 CDPS인 것으로 보인다. 스테롤 경로들로의 감소된 유동을 가진 리포터 균주에서 조합을 추가 테스트할 수 있다.
지아 메이즈(Zea mays)(CDPS-5)로부터 CDPS의 더 높은 활성에 대한 가능성을 조사하기 위하여, 표적 서열들이 제거될 때 세포질에서 활성이 더 높은지를 판단하기 위하여, 플라스티드 신호 펩티드와 함께 그리고 플라스티드 신호 펩티드 없이 GPD 프로모터를 이용하여 2미크론 다중복사체 플라스미드로부터 이 유전자를 발현시켰다. 지아 메이즈(Zea mays)의 CDPS-5와 엽록체 신호 펩티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 차례로 서열 번호:80 및 81에서 제시한다. 엽록체 신호 펩티드는 서열 번호:80의 뉴클레오티드 1-150에 의해 인코드되며, 그리고 서열 번호:81의 아미노산 1 내지 50에 상응한다. 플라스미드는 게놈에 통합되어, 강력한 구성 GPD 및 TPI 프로모터로부터 발현되는 GGPPS-10, CDPS-5, KS-1, KO-1, KAH-3, CPR-1 및 UGT74G1 (서열 번호:2)을 보유한 안정적인 루부소시드 생산자 균주 (EFSC1859) 안으로 형질전환시켰다. 더우기, 균주 EFSC1859에서 ERG에 의해 인코드되는 스쿠알렌 합성효소의 발현은 내생성 프로모터를 CUP1 유도성 프로모터로 대체함으로써 하향조절하였다. 이들 유전자에 추가하여, 균주 EFSC1859는 GPD1 프로모터를 이용하여 2 미크론 다중복사체 벡터로부터 UGT85C2 (서열 번호:3)를 또한 발현시킨다. 루부소시드 및 19-SMG 생산은 이 생산 수준을 예측하기 위하여 LC-MS에 의해 측정하였다. 플라스티드 리더 서열의 제거가 야생형 서열과 비교하였을 때 스테비올 글리코시드 생산을 증가시키는 것 같지는 않았다. 그러나, 이 작업으로 리더 서열은 스테비올 경로 기능의 상실을 야기하지 않고 제거할 수 있음을 설명한다.
유사하게, 막 고정(anchoring) 서열들 (예컨데, 서열 번호:72의 뉴클레오티드 4-63; 서열 번호:62의 뉴클레오티드 4-87; 그리고 서열 번호:52의 뉴클레오티드 1-117)없이 CPR-3, KAH-3 및 KO-1에 대한 플라스미드를 작제하였고, 그리고 플라스미드 보다는 염색체에 통합된 UGT85C2를 가진 균주 EFSC1859 안으로 형질전환시켰다. 이들 효소들은 고정 서열없이 기능을 할 것으로 예측된다.
실시예 10 - 스테비올-1,3- O -모노글루코시드 1,2-글루코실전이효소 서열들의 확인
스테비아 EST 분석
스테비아 (스테비아 레바우디아나(stevia rebaudiana)) 잎 EST (Expressed Sequence Tags) 데이타베이스(Brandle et al., Plant Mol. Biol. 50:613-622, 2002)의 tBLASTN 연구는 쿼리로(queries) 완전한 Ipomoea (Ipomoea purpurea) UGT79 유형 UGT (IP3GGT), Bellis (Bellis perennis) UGT94B1, 스테비아 UGT79A2, 스테비아 UGT76G1과 스테비아 UGT91D1 아미노산 서열들을 이용하여 실행하였고, 따라서 주로 디글리코실전이효소를 함유하는 것으로 알려진 모든 패밀리 1 글리코실전이효소 하위-패밀리로부터 UGT를 대표한다. 9가지 이전에 설명안된 UGT 유전자의 부분 서열들을 확인하였다. 부분 서열중 하나는 UGT 79 하위-패밀리("79-EV1")의 것이며, UGT 76 하위-패밀리("76-EV1")중 하나와 UGT 91 하위-패밀리중 두 개 ("91-EV-1" 및 "91-EV2"), 뿐만 아니라 UGT 71, 72, 78, 84 및 88 하위-패밀리의 구성요소들이었다. 단리를 위한 PCR 주형으로 스테비아 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 이용하여 부분 서열들을 단리하였다. 또한, UGT 76 하위-패밀리의 2개 스테비아 구성요소들을 단리하였고, GenBank accession ACT33422.1은 76G1 하위-패밀리의 구성요소이며(Mohankumar), 그리고 GenBank accession ACM47734.1은 76G2 (Yang) 하위-패밀리의 구성요소이다.
파이로염기서열분석(Pyrosequencing)
추가적인 UGT 클론들은 다음과 같이 스테비아 cDNA와 함께 파이로염기서열분석을 실시함으로써 확인하고 단리하였다. 스테비아 잎으로부터 Ambion® Micro Poly Purist™ mRNA 준비 키티를 이용하여 스테비아 mRNA를 준비하였다. 품질 대조군으로써, 각 서열의 5'- 및 3'-말단에서 21개 뉴클레오티드와 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 분석 PCR을 이용하여 스테비아 리바우디오시드 A 경로 UGT 유전자 85C2, 74G1 및 76G1의 존재에 대하여 역 전사된 mRNA를 테스트하였다. 그 다음 증폭된 전체 길이 mRNA를 파이로염기서열분석 및 contig 어셈블리(MOgene, St. Louis, MO USA)에 이용하였다. 평균 길이가 393개 뉴클레오티드인 약 340만 판독을 실시하였고, 생성된 원시 서열들을 이용하여 25907개 서열 contigs를 수득하였다. 총 ca. 1,500 UGTs의 공개적으로 이용가능한 아미노산 서열들을 포함하는 데이터베이스를 작제하였다. 약 150개의 서열화된 UGTs는 광범위한 하위-패밀리로부터 완전하게 주석이 달린 UGTs이었다. 남아있는 서열화된 UGTs는 부분적으로 이들의 동족체들로 주석이 달렸다. 쿼리(query)로 25907개 스테비아 EST contigs를 이용하여 조작된 UGT 데이터베이스 (유전적 code = 1, Low complexity = Yes, Expect value = 10.0, Word size = 3, No of processors = 2, Matrix = BLOSUM62, Gap cost (open) = 11, Gap cost (extension)= 1)에 대하여 BLASTX 조사를 실시하였다(CLC Genomics, Muehltal, Germany). 결과에서 스테비아에서 90개 이상의 기존 미지의 UGTs에 대한 서열이 파이로서열분석 데이터베이스에 존재하였다는 것을 암시하였다.
파이로서열분석 데이터베이스에서 UGT 79 하위-패밀리 또는 UGT 94 하위-패밀리의 추가 구성요소들이 확인되지는 않았다. 그러나, 이 분석에서 UGT 76 및 91 하위-패밀리의 새로운 구성요소들을 보여주었다. 어느 정도의 유전자들의 경우, 전장 서열 데이터는 파이로서열분석 EST 데이터로부터 바로 이용가능하였다. 부분 서열 데이터를 수득한 요소들의 전장 서열들을 수득하기 위하여 이미 작제된 스테비아 플라스미드 cDNA 라이브러리를 이용하였다. 각 특이적, 부분적 UGT 서열에 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 라이브러리 플라스미드 벡터 서열에 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 복합시켰다. 이들 프라이머를 PCR 에 이용하여 전체 길이 산물을 수득하였고, 후속적으로 서열화시켰다. 전장 서열에 기초하여, 반응의 주형으로 스테비아 cDNA 라이브러리로부터 전장 UGT 유전자의 증폭을 위하여 푸르프-리딩(proof-reading) PCR 중합효소를 이용하여 제 2 PCR을 실행하였다. 이 전략을 이용하여, UGT 76 하위-패밀리중 5가지 구성요소들, UGT 91 하위-패밀리중 6개 구성요소들, 뿐만 아니라 기타 UGT 하위-패밀리중 10개 구성요소들을 단리하였다.
스테비아 EST 데이터베이스로부터 확인된 7가지 UGT, 2가지 공개적으로 이용가능한 스테비아 UGT 76 서열들, 그리고 파이로서열분석에서 확인된 21개 UGTs 각각을 E. coli 발현 벡터들 pET30A+ 또는 pETDuet (정제 목적으로 HIS-tag를 이용) 안으로 클론시키고, 그리고 자기분해-클론 E. coli 균주 XjA 및 XjB에서 발현시켰다. 이들 대다수의 UGTs 경우, UGT 단백질의 발현으로 함포체(inclusion bodies)가 형성되었다. 이들 함포체의 형성을 극복하기 위하여 이들 UGTs중 일부는 저온 발현 균주 "Arctic Express" (Agilent Technologies)에서 발현시켰다. 이 시스템에서 발현에 실패한 것들의 경우, PCR 산물들의 시험관내 결합된 전사-해독 (TNT®T7 Quick for PCR DNA kit, Promega)을 시도하였고, 이로써 남아있는 UGT의 성공적인 발현이 허용되었다. 35S-메티오닌으로 라벨링하고, SDS-PAGE상에서 단리하고, 그리고 문제의 UGT 단백질에 대한 예상 크기의 단백질 밴드를 인산영상화 탐지함으로써 반응의 효과를 확실하게 하였다.
상기에서 설명한 것과 같이 발현된 각 클론의 UGT 폴리펩티드들은 기질로 스테비올-13-O-모노글루코시드를 이용하여 1,2-당화 활성에 대하여 테스트하였다. 25 L 반응에서 형성된 총 단백질의 약 1/5에 상응하는 시험관내 In vitro 전사된/해독된 단백질을 반응 완충액 (1 mM UDP-글루코오즈, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2, 1 mM KCl, 0.1 U/l 송아지 내장 포스파타제를 함유하는)에서 기질로서 0.5 mM 스테비올-13-O-모노글루코시드 (SMG)를 이용하여 시험관 반응에 이용하였다. 이 반응 혼합물은 30℃에서 20 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음 반응 혼합물은 스테비올-1,2-바이오시드의 존재에 대하여 LC-MS 분석으로 분석하였다. Phenomenex® Synergy Hydro-RP column (250 x 3 mm, 3 m 과립, 80 포어 크기)가 구비된 그리고 전자 분무 이온화와 함께 TSQ Quantum (ThermoFisher Scientific) 삼중 사중극자 질량 분석계에 연결된 Agilent 1100 Series HPLC system (Agilent Technologies)를 이용하여 LC-MS 분석을 실행하였다. 4분간 0.60.4 ml/min, 5% MeCN; 2분간 0.4 ml/min, 540% MeCN; 11분간 0.4 ml/min, 4055% MeCN; 그리고 3분간 0.41.0 ml/min, 55100% MeCN으로 구성된 그라디언트를 적용시킴으로써 MeCN (0.01% 포름산) 및 H2O (0.01% 포름산)을 함유하는 이동상(30℃)을 이용하여 용리를 실행하였다. 스테비올 바이오시드는 Mw 665.2 [M+Na+] 상에서 SIM(Single Ion Monitoring)을 이용하여 탐지하였다. 테스트한 30개 UGT 효소들중 어느것도 탐지가능한 스테비올-13-O-모노글루코시드 당화 활성을 나타내지 않았다.
파이로서열확인분석에 의해 확인된 6개 UGT91 구성요소들의 뉴클레오티드 서열은 Genbank Accession No. AY345980의 스테비아 UGT91D1의 서열과 비교하였다. GenBank 서열은 파이로서열분석에 의해 확인한 6개 서열과 비교하여 N-말단에 12개 추가 아미노산을 인코드하는 것으로 나타났다. 활성에 대하여 UGT91D1 패밀리 구성요소들을 다시-테스트하기 위하여, 스테비아 잎 cDNA의 PCR 증폭에 의해 UGT91D1 서열들을 재-단리하였다. 생성된 PCR 산물들은 플라스미드 벡터 안으로 클론시켰고, 각 산물에 대한 효소 활성은 상기에서 설명한 것과 같이 측정하였다: 대장균(E. coli)에서 GST-테그된 발현, 시험관에서 전사-해독의 결합, 및/또는 효모에서 생체내 발현. 세 가지 모든 방법에 의해 한 개 클론으로부터 스테비올 1,2-당화 활성을 탐지하였다. 이 클론은 UGT91D2e으로 명명하였다. UGT91D2e의 아미노산 서열은 서열 번호:5에서 제시한다. 대조적으로, Accession No. AY345980 (단백질 수탁 번호 AAR06918)에 의해 설명된 동일한 서열을 가지지만, 아미노 말단에 12개 아미노산이 없는 클론으로부터는 1,2-당화 활성이 탐지되지 않았다.
실시예 11 - UGT91D2e 서열들의 분석
UGT91D2e의 서열 변이체들
도 19B에서 증명된 것과 같이, 활성(91D2e) 변이체들과 가장 근접한 비활성 동족체들 (91D1) 사이에는 소수의 아미노산 변형이 존재한다. Ma et al., Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2003 36(2):123-9 (단백질 수탁 번호 AAM53963, GI:21435782 ) 및 Brandle et al., supra (단백질 수탁 번호 AAR06918, GI:37993665) 에 의해 클론된 91D1 유전자는 RebA 생합성에 요구되는 1-2 당화 활성을 나타내지 않았다. 활성을 위하여 어떤 아미노산이 요구되는지를 확인하기 위하여, UGT91D2e (서열 번호:5)의 아미노산이 비활성 동족체내 대응하는 아미노산으로 변경되도록 21개 단일 특정 부위 돌연변이체를 만들었다. 표 12 참고. 또한, 위치 364 (SP) 또한 변화되도록 특정 부위 돌연변이를 만들었다. 제조업자의 프로토콜(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 따라 QuikChange® II 특정 부위 돌연변이생성 키트를 이용하여 돌연변이체를 만들었고, 그리고 pGEX-4TI 벡터들은 XJb Autolysis E. coli 균주 (ZymoResearch, Orange, CA) 안으로 형질전환시켰다. 잔기 162의 글리신이 아스파르트산으로 변화되는 돌연변이체는 만들지 않았다.
돌연변이체 효소들의 활성을 평가하기 위하여, E. coli에서 생산된 단백질을 이용하여 기질-공급 실험을 시험관에서 실시하였다. 처음에, E. coli 세포들을 30℃에서 하룻밤 동안 성장시키고, 3 mM 아라비노즈와 0.1 mM IPTG와 함께 유도하고, 그리고 20℃에서 추가 항온처리하였다. 시험관 분석을 위하여, 세포들을 20℃에서 하룻밤동안 유도하였고, 동결/해동 순환에 의해 용해시키고, 정제안된 세포 추출물을 효소 반응에 이용하였고, 이때 기질들은 0.5 mM 스테비올-13-O-글루코시드와 0.5 mM 루부소시드이었다.
스테비올 모노글루코시드 (SMG) 및 루부소시드 (Rub) 기질들에 대한 결과를 표 12에 나타낸다. "+"는 이당화 활성이 탐지되었음을 나타내고, "-"는 활성이 탐지되지 않았음을 나타내고, 그리고"NA"는 분석이 실행되지 않았음을 나타낸다. 표시된 돌연변이는 91D2e 서열 (서열 번호:5)의 넘버링에 근거한다.
이 유전자의 일부는 E. coli에서 함포체에서 발현되는 경향을 가지고 있기 때문에, 대장균 실험에서 활성을 나타내지 않는 코딩 서열들은 실시예 10에서 설명한 것과 같이 시험관내 PCR 산물들(TNT®T7 Quick for PCR DNA kit, Promega)의 결합된 전사-해독에 의해 생산되었다. 간략하게 설명하자면, 5가지 단일 돌연변이체의 PCR 증폭으로부터 2 μl의 DNA와 야생형 효소를 총 25μl의 반응에서 이 키트 마스터 믹스와 1 μl L-[35S]-메티오닌과 함께 90분 동안 30℃에서 항온처리하였다. 각 시료의 경우, 2 μl 최종 반응물을 SDS-PAGE 겔에서 이동시켰다. All 6가지 단백질 모두 SDS-PAGE 겔의 시각적인 관찰에 의해 판단하였을 때, 유사한 가용성 재조합 단백질 수준들을 보여주었다. 시험관내-해독된 단백질에 대한 결과들은 표 12의 우측에 나타낸다. 이 표에서 백분율은 기질과 산물의 상대적인 피크 면적에 근거하여 기질이 산물로의 전환하는 대략적인 양을 나타낸다.
돌연변이 E. coli
단백질
SMG		 E. coli
단백질
Rub		 in vitro
단백질
SMG		 in vitro
단백질
Rub
Y30F + + NA NA
P93Q + + NA NA
S99V + + NA NA
Y122F + + NA NA
H140Y + + NA NA
S142C + + NA NA
T144I - - 5.9% 0.05%
A148T + + NA NA
M152L - - 25.1% 0.85%
G153A + + NA NA
A156S + + NA NA
L195M + + NA NA
V196E + + NA NA
K199E + + NA NA
L211M + + NA NA
L213F - - 29.4% 1.59%
S221F + + NA NA
V286A + + NA NA
S364P - - 4.1% 0.4%
G384C - - 14.1% 1.28%
K427N + + NA NA
E438A + + NA NA
UGT91D2e (서열 번호:5)와 비교하였을 때 이당화 활성의 대략적인 양은 다음과 같이 나타났다: 기질로 13-SMG을 이용하여, T144S의 경우 6.1%, M152L의 경우 26.2%, L213F의 경우 30.7%, S364P의 경우 4.3%, 그리고 G384C의 경우 14.7% . For 루부소시드의 경우, UGT91D2e와 비교하여 이당화 활성의 대략적인 양은 다음과 같이 나타났다: T144S, M152L, L213F, S364P, 및 G384C의 경우 차례로 1.4%, 23.4%, 43.7%, 10.9% 및 35.2%. 이들 결과에서 22개 아미노산 돌연변이체중 5개는 단리되었을 때 활성에 대해 두드러지게 유해한 것으로 나타났다. 기타 17개 돌연변이의 조합 또한 비활성 또는 활성의 상실을 초래할 수 있는 가능성이 있다.
91D2e 서열들과 상기에서 설명한 변이체들을 At72B1, Mt85H2, VvGT1 and Mt71G1로 명명된 단백질(Osmani et al (2009) Phytochemistry 70, 325-347)과 배열시키고, 그리고 예측된 3차 구조(알파 헬릭스, 베타-쉬트, 그리고 코일 영역들)을 분석함으로써, 이당화 활성의 상실을 초래할 것 같은 돌연변이의 영역들을 확인할 수 있다. 유해한 처음 3가지 돌연변이는 N-말단 도메인에서 발견되었는데, 이 영역들은 루프로 보인다. N-말단 도메인(아미노산 잔기 1-240), 특히 N-말단 도메인(아미노산 20-26, 39-43, 88-95, 121-124, 142-158, 185-198, 및 203-214)의 예측된 루프 영약들은 글루코오즈 수용체 분자 기질의 결합에 주요 역할을 하는 것으로 본다. 활성에 유해한 것으로 보이는 4번째 돌연변이는 C-말단 도메인에서 발견되는데, 이 영역은 C5 루프(아미노산 381-386에 상응)로 본다. 이 루프 또한 글루코오즈 수용체 기질 특이성에 중요한 것으로 본다. 비활성 대 활성 루부소시드 디글리코실라제 효소들을 구분짓는 22개 돌연변이중 19개는 91D2e의 예측된 수용체 기질 결합 영역들의 5개 아미노산 안에 위치한다. 따라서, 공개된 91D1 효소들은 UDP-글루코오즈와 대체 수용체 기질 사이에 글리코실전이효소 반응을 촉매하는 것 같다.
실시예 12 -효모에서 리바우디오시드 A의 생산
스테비올-공급받은 효모에서 리바우디오시드 A의 생산
게놈적으로 통합된 UGT74G1 발현 카세트를 포함하는 효모 균주 EFSC1580은 스테비아 UGTs 91D2e (서열 번호:5), 85C2 (서열 번호:3), 및 76G1 (서열 번호:7)의 공동 발현을 위하여 세가지 상이한 많은 복사체(에피좀성) 플라스미드로 형질전환시켰다. pMUS44, pMUS7 및 pMUS9으로 명명한 3가지 플라스미드는 강력한 GPD1 프로모터에 작용가능하도록 연결된 차례로 UGT91D2e, UGT85C2 and UGT76G1에 대한 코딩 서열을 포함한다. 생성된 효모 균주는 pMUS44, pMUS7 및 pMUS9 발현 플라스미드의 지속적인 존재에 대해 선별하기 위하여 우라실, 히스티딘, 및 루이신없는 SC 배지에서 성장시켰다. 스테비올은 배지에 최종 농도가 250M이 되도록 추가하였고, 그리고 이 균주는 30℃에서 배양하였다. 배양 18시간과 72시간에 LC-MS에 의해 리바우디오시드 A의 존재에 대해여 상청액 분획물과 세포 펠렛을 분석하였다. Phenomenex® Synergy Hydro-RP column (250 x 3 mm, 3 m 과립, 80 포어 크기)가 구비된 그리고 전자 분무 이온화와 함께 TSQ Quantum (ThermoFisher Scientific) 삼중 사중극자 질량 분석계에 연결된 Agilent 1100 Series HPLC system (Agilent Technologies)를 이용하여 LC-MS 분석을 실행하였다. 4분간 0.60.4 ml/min, 5% MeCN; 2분간 0.4 ml/min, 540% MeCN; 11분간 0.4 ml/min, 4055% MeCN; 그리고 3분간 0.41.0 ml/min, 55100% MeCN으로 구성된 그라디언트를 적용시킴으로써 MeCN (0.01% 포름산) 및 H2O (0.01% 포름산)을 함유하는 이동상(30℃)을 이용하여 용리를 실행하였다. 스테비올 바이오시드는 Mw 665.2 [M+Na+] 상에서 SIM(Single Ion Monitoring)을 이용하여 탐지하였다.
LC-MS 결과는 pMUS44, pMUS7 및 pMUS9를 함유하는 균주 EFSC1580을 스테비올 존재하에 성장시켰을 때 배양 18시간과 72시간에 상청액에서 탐지가능한 양의 리바우디오시드 A가 존재하였다는 것을 보여주었다. 이 산물은 리바우디오시드 A 표준과 함께 용리시켰고, 예측된 질량은 [M+Na]+ = 989으로 확인되었다. 10M 리바우디오시드 A 표준의 흡수도에 대해 이 산물의 흡수도를 비교함으로써, 세포 배양물의 상청액내 축적량은 18시간 시점에 6mg/L, 그리고 72시간 시점에 15 mg/L으로 예측되었다.
글루코오즈-공급된 효모에서 리바우디오시드 A와 리바우디오시드 D의 생산
실시예 4에서 설명드린 것과 같이 효모 균주 CEY213는 eYACs으로부터 발현된 스테비올 생합성 경로 유전자 뿐만 아니라 게놈적으로 통합된 UGT74G1 및 UGT85C2 발현 카세트들을 포함한다. 균주 CEY213는 실시예 6에서 설명하는 것과 같은 루부소시드를 생산한다.
균주 CEY213은 UGT91D2e (서열 번호:5) 및 UGT76G1 (서열 번호:7)의 동시 발현을 위하여 2μ 많은 복사체(에피좀) 이중 발현 플라스미드, pMUS47로 형질전환시켰다. 이 pMUS47 플라스미드는 두 개의 발현 카세트들을 포함하는데, 하나는 UGT91D2e의 코딩 서열을 보유하고, 그리고 다른 하나는 UGT76G1의 코딩 서열을 보유한다. 이들 코딩 서열들 모두 강력한 구성 GPD1 프로모터에 작용가능하도록 연결된다. 생성된 효모 균주는 eYACs 존재에 대한 설명을 유지하기 위하여 히스티딘, 루이신 및 트립토판 없이, pMUS47의 존재에 대한 선별을 유지하기 위하여 우라실 없이 그리고 최종적으로 eYACs에 존재하는 프로모터를 억제하기 위하여 메티오닌(2mM)과 함께 SC 배지에서 30℃에서 하룻밤 동안 사전-배양하였다. 다음날, 이 세포들을 세척하였고, eYAC 프로모터의 유도를 위하여 동일한 배지, 단 메티오닌이 없는 배지로 옮겼다. 시료들은 항온처리 24시간과 99시간 시점에 채집하였고, 상청액과 세포 펠렛은 상기에서 설명한 것과 같이 LC-MS를 이용하여 리바우디오시드 A 및 리바우디오시드 D의 존재에 대해여 분석하였다.
24시간 및 99시간 시점 모두의 상청액에서 탐지가능한 양의 리바우디오시드 A가 발견되었음을 결과들에서 보았다. 산물은 리바우디오시드 A 표준과 함께 공동-용리시켰고, 예측된 질량은 [M+Na]+ = 989으로 확인되었다. 10M 리바우디오시드 A 표준에 대한 산물의 흡수도를 비교함으로써, 상청액에서 리바우디오시드 A의 축적은 24시간 시점에서 3mg/L이상이며, 99시간 시점에서 6 mg/L이상으로 예측되었다. 도 9 참고. 또한, 소량의 스테비오시드와 루부소시드가 효모 세포 펠렛에 존재하였고, 그리고 탐지가능한 양의 스테비오시드와 루부소시드가 배양물 상청액에 존재하였다는 것을 결과에서 나타내었다. 도 9 참고.
또한 결과에서 소량이지만 탐지가능한 양의 리바우디오시드 D가 생산되었음을 볼 수 있었는데, 이는 UGT91D2e가 리바우디오시드 E를 생산하는 스테비오시드의 19-O 글루코오즈에 추가 글루코오즈를 콘쥬게이트시키거나 또는 바로 리바우디오시드 A의 19-O 글루코오즈에 콘쥬게이트시킬 수 있음을 암시한다. 이들 결과는 또한 UGT76G1이 리바우디오시드 D를 생산하기 위하여 기질로 리바우디오시드 E를 수용할 수 있음을 암시한다. 도 2C 참고.
실시예 13 - UGT 서열들에 대한 코돈 최적화된 서열들을 가진 리바우디오시드 A의 생산
GeneArt (Regensburg, Germany) 및 DNA 2.0 (Menlo Park, CA)에 의해 공급된 두 가지 방법을 이용하여 효모 발현을 위하여 UGT 91d2e, 74G1, 76G1, 및 85C2에 대한 최적의 코딩 서열들을 기획하였고 합성하였다: (서열 번호: 6, 2, 8, 및 4, 차례로) 또는 DNA 2.0 (Menlo Park, CA) (서열 번호: 84, 83, 85, 및 82, 차례로). UGT 91d2e, 74G1, 76G1, 및 85C2 (서열 번호: 5, 1, 7, 및 3, 차례로)의 아미노산 서열들은 변화되지 않았다.
4가지 최적화된 UGT 모두와 발현 카세트들을 포함하는 많은 수의 복사체 플라스미드를 작제하였고, 발현시켰고, 그리고 이들의 활성은 야생형 서열들을 포함하는 유사한 구조체들의 발현 산물들과 비교하였다. 플라스미드들은 범용 Watchmaker 균주, EFSC301 (실시예 3에서 설명한)로 형질전환시켰다. UGTs는 높은 복사체(2) 벡터 안으로 삽입시키고, 강력한 구성 프로모터 (GPD1) (벡터들 P423-GPD, P424-GPD, P425-GPD, 및 P426-GPD)로부터 발현시켰다. 하룻밤 성장시킨 후, 0.25의 OD600에서 새로운 배지에 재-접종시킨 후, 배양 배지 (SC -leu-trp-ura-his)에 25 M 스테비올 (최종 농도)을 보충하였고, 루부소시드 (Rub), 19-SMG (19SMG) 및 RebA (RebA)의 생산을 24시간 후에 배지에서 측정하였다. 19-SMG가 첫 시료들중 하나에서 탐지할 수 없었다는 일부 사실로 인하여 이 실험을 반복하였다.
하기 표 13에 나타낸 것과 같이 두 가지 별개 연구 결과로부터 코돈 최적화된 8개 UGTs 모두 활성이었다는 것을 나타낸다. 그러나, 각 전략에서 코돈-최적화된 UGT중 최소한 하나에 대한 효소 발현은 구조체를 만드는데 이용된 새로운 코돈 최적화에 의해 감소되었다. 변형된 구조체 (서열 번호: 6, 2, 8, 및 4)에서 병목은 루부소시드 및 RebA 사이에 잠재적으로 만들어진 것으로 보인다. 개별 효소 활성 분석과 효모 균주들에서 발현된 이들 코딩 서열들의 발현 분석으로 이 경로에서 UGT 유전자의 최적의 조합을 허용할 것으로 기대한다.
RebA (M) 19SMG (M) Rub (M)
야생형 3.2
1.7		 17.2
14.0		 4.9
3.2
DNA2.0 4.4
1.7		 12.4
10.8		 4.6
3.1
GeneArt 1.2
0.8		 nd
11.1		 4.6
4.5
nd = 탐지 한계 이하
실시예 14 - 서열 테그를 가진 UGT를 이용하여 리바우디오시드의 생산
작은 펩티드들 또는 단백질 결합과 UGT 단백질 85C2, 91D2e, 74G1, 및 76G1과의 융합은 UGTs사이에 상호작용(channeling)을 촉진시킬 수 있거나 또는 효모 세포들의 특이적 성분들에게 UGT들의 표적화/고정화를 도울 수 있다.
RebA 경로에서 UGT의 스카폴딩이 활성 경로 효소들을 야기하는지를 평가하기 위하여, DNA 2.0 코돈-최적화된 UGTs 85C2 및 74G1은 p53 단백질 모티프를 닮은 4가지 고친화성, 짧은(또는 PMI로 공지된) 펩티드의 스트링에 틀-내(in frame)에 융합시킨다. p53 단백질 모티프는 인간에서 MDM2 단백질과 상호작용한다(Li et al., J Mol Biol. 2010, 398(2):200-13 참고). DNA 2.0 코돈-최적화된 UGTs 85C2, 91D2e, 74G1 및 76G1 (서열 번호: 82, 84, 83, 및 85, 차례로)은 인간 단백질 MDM2 (유전자 수탁 번호 ABT17086)의 처음 158개 아미노산에 틀-내 융합되었다. 작은 GS-풍부한 링커 영역 또한 UGTs의 N-말단 메티오닌 바로 앞에 융합되었다. PMI/MDM2 결합의 융합안된, 친화력은 높은-친화력 결합을 나타내는 낮은 nM 범위내에 있다. 상기 구조체들로 형질전환된 효모 세포들은 85C2 단백질 (85C2_P53으로 지칭됨) 스카폴드에 N-말단에 융합된 4 X PMI (P53-유사) 펩티드 주변 UGT 스카폴드를 생산하는 것으로 기대된다.
TRP1에 대해 결손된 실험실 효모 균주 BY4741은 인간 MDM2 단백질의 처음 158개 아미노산의 N-말단, 틀-내 융합을 가진, 스테비아 레바우디안(Stevia rebaudian) UGTs 74G1,76G1 및 91D2e를 발현시키는, 그리고 합성 PMI 펩티드 (4 X TSFAEYWNLLSP, 서열 번호:86)의 4 반복체의 N-말단 틀-내 융합과 함께 스테비아 레바우디안(Stevia rebaudian) UGT85C2를 발현시키는 발현 플라스미드 p423-426 GPD (Mumberg et al, Gene, 156 (1995), 119-122)들로 형질변환되었다. 85C2, 74G1, 91D2e, 및 76G1 융합 단백질의 아미노산 서열의 경우 차례로 서열 번호: 88, 90, 92, 및 94 참고; 융합 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들의 경우 서열 번호: 89, 92, 93, 및 95 참고. 이 효모 균주 및 대조군 균주 (임의의 융합 없이 4개 UGT를 발현시키는)는 플라스미드 존재에 대하여 선별하는 합성 효모 배지에서 하룻밤 동안 성장시키고, 그 다음날 합성 효모 배지를 담고 있는 96개 딥-웰 트레이로 세포 밀도가 OD600 1이 되도록 옮겼다. 최종 농도 100μM의 스테비올을 추가하였다. 72 시간 후, 시료들을 취하고, 실시예 12에서 설명한 것과 같이 LC-MS를 이용하여 분석하였다. 도 10A 및 10B에 나타낸 것과 같이, UGTs는 다양한 융합 테그와 함께 발현되었을 때 효모에서 활성이다.
실시예 15 UGT91D2e 활성
3가지 상이한 유전적 배경의 스테비아 원천으로부터 만든 cDNA/라이브러리 준비물을 이용하여 추가적으로 하위-패밀리 91개 UGTs를 클론하였다. UGT91D1/91D2e에 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 cDNA 준비물의 PCR 증폭에 이용하였고, 그리고 정확한 크기의 생성된 PCR 산물들을 적절한 플라스미드 벡터 안으로 클론시켰다. 각 실험에서 다수의 클론을 서열화하였고, 서열화 결과에서 서열내 약간의 변이를 가진 UGT91D 핵산들이 증폭할 수 있음을 보여주었다. UGT91D2e와 비교하여 서열내 최대 차이들을 가진 20개 UGT91D 변이체들이 in vitro 전사-해독에 의해 발현되었으며, 이어서 스테비올-13-O-모노글루코시드-1,2-당화 활성에 대하여 효소 테스트를 하였다. 변이체들중 하나는 약한 1,2-바이오시드 당화 활성을 나타내었고, 나머지는 탐지가능한 당화 활성을 보이지 않았다. 따라서, UGT91D2 폴리펩티드들은 스테비아에서 주요 스테비올-13-O-모노글루코시드-1,2-당화 효소들인 것으로 보인다.
UGT91D2e의 효소 활성
in vitro 전사-해독 결합에 의해 만들어진 UGT91D2e (서열 번호:5)는 슈가 제공자로 UDP-글루코오즈보다는 UDP-크실로즈 또는 UDP-람노오즈를 이용하여 시험관내 효소 분석에서 스테비올-13-O-모노글루코시드를 크실로실화 및 람노실화시키는 능력에 대하여 테스트하였다.
크실로실화 분석은 다음과 같이 실시하였다: 3 mM의 UDP-글루쿠로닌산은 ca. 1 g의 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)-인코드된 UDP-글루쿠로닌산 데카르복실라제 UXS3 (E. coli에서 생산되고, 정제된), 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 6 g BSA, 1 mM MgCl2, 및 1% 송아지 내장 포스파타제와 혼합하였다. 이 반응 혼합물은 UDP-글루쿠로닌산을 UDP-크실로즈로 전환시키기 위하여 30℃에서 30분한 항온처리하였다. 그 다음, 실시예 9에서 설명하는 것과 같이 만들어진 1.5 mM의 스테비올-13-O-모노글루코시드 기질과 ca. 0.5 g의 UGT91D2e 효소를 이 혼합물에 첨가하고, 추가 20시간 동안 30℃에서 항온처리되도록 하였다.
람노실화 분석은 다음과 같이 실행하였다: 3 mM의 UDP-글루코오즈를 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)-인코드된 RHM2 람노오즈 합성효소 (E. coli에서 생산되고, 정제된) N-말단 및 C-말단 부분 각각 0.6 g, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 1.5 mM NADPH, 1.5 mM NAD+, 6 g BSA, 1 mM MgCl2, 및 1% 송아지 내장 포스파타제와 혼합하였다. 이 반응 혼합물은 UDP-글루쿠로닌산을 UDP-람노오즈로 전환시키기 위하여 30℃에서 30분간 항온처리하였다. 1.5 mM의 스테비올-13-O-모노글루코시드 기질과 ca. 0.5 g의 UGT91D2e 효소를 이 혼합물에 첨가하고, 추가 20시간 동안 30℃에서 항온처리되도록 하였다.
결과에서 UGT91D2e는 UDP-글루코오즈로 관찰된 속도의 약 1/2 내지 1/3 비율로 스테비올-13-O-모노글루코시드 기질을 크실로실화시킬 수 있는 것으로 나타났는데, 1,2-크실로실화된 스테비올-13-O-모노시드를 형성하고, 이는 리바우디오시드 F의 전구물질이었다 UGT91D2e는 UDP-글루코오즈로 관찰된 비율과 약 동일한 비율로 스테비올-13-O-모노글루코시드 기질의 람노실화를 실행할 수 있었고, 1,2-람노실화된 스테비올-13-O-모노시드를 형성하고, 이는 리바우디오시드 C (둘코시드 B)의 전구물질이다. 이들 결과는 생체내에서 적절한 전구물질 분자와의 합성과 적절한 UGTs의 발현이 생체내에서 리바우디오시드 F 및 C의 합성을 초래한다는 것을 나타낸다. 도 2B 및 2D 참고.
UGT91D2e는 시험관에서 스테비올-13-O-모노글루코시드이외의 기질들, 예컨데, 루부소시드, 스테비올-1,3-바이오시드 및 1,3-스테비오시드를 1,2-글루코실화시키는 능력에 대하여 또한 테스트하였다. 결과에서 UGT 91D2e는 1,3-결합된 글루코오즈가 존재할 때(가령, 스테비올 1,3-바이오시드 및 1,3-스테비오시드) 활성이 아니었지만, UGT 91D2e는 19-O 위치에서 1차 당화와 상관없이 활성이었다는 것을 나타내었다. 이들 결과에서 스테비올 1,3-바이오시드 및 1,3-스테비오시드는 rebA 형성에 대해 생체내 스테비아 경로에 존재하지 않을 가능성을 암시한다. 도 2A 및 도 3 참고.
실시예 16 UGT91D 동족체들
S. rebaudiana 의 상이한 생태형(ecotype)은 유전적으로 다양하다. 상이한 스테비아 RNA 수탁물로부터 91D의 96개 클론의 조사에서 조사한 6가지 생태형 사이에 많은 아미노산 변화들이 나타났다(가령, 서열 번호:9에서 제시한 91D2e의 뉴클레오티드 서열에서 넘버링하였을 때 뉴클레오티드 74 (G에서 D로의 아미노산 변화를 초래), 89 (Y 에서 F로), 131 (V 에서 A로), 137 (F 에서 S로), 278 (P 에서 Q로), 295 (S 에서 V 또는 P로), 331 (E 에서 Q로), 365 (Y 에서 F로), 395 (A 에서 V로), 418 (H 에서 Y로), 425 (S 에서 G로), 431 (T 에서 I로), 442 (A 에서 T로), 454 (M 에서 L로), 458 (G 에서 A로), 466 (A 에서 S로), 485 (G 에서 D로), 583 (L 에서 M으로), 587 (V 에서 E로), 595 (K 에서 E로), 614 (D 에서 G로), 616 (G 에서 R로), 631 (L 에서 M으로), 637 (L 에서 F로), 662 (S 에서 F로), 664 (K 에서 E로), 671 (Y 에서 C로), 857 (V 에서 A로), 867 (S 에서 R로), 919 (F 에서 L로), 989 (V 에서 A로), 1000 (R에서 C로), 1090 (S 에서 P로), 1150 (G 에서 C로), 1232 (L에서 S로), 1281 (K 에서 N으로), 1313 (E 에서 A로), 1354 (Q 에서 R로), 그리고 1369 (V 에서 I로)). 이들 다양성에서 일부 추가 변이들이 현저하였는데, 이는 서열화 또는 PCR 오류로 인한 것으로 보이며, 특히 다형성에서 오직 한번만 발견되는 경우에 그러하다. 추가 분석을 위하여 20개의 코딩 영역들을 선택하였다. 단리된 클론의 설명은 표 14를 참고한다. 표 14에서 아미노산의 넘버링은 서열 번호:5에 제시한 UGT91D2e의 아미노산 서열에 근거한다.
클론 UGT91D2e (서열 번호:5)과 비교하여 돌연변이들
1 뉴클레오티드 서열, G165V, I367V, L388P에서 잔기 119-145 사이에 +1 프레임쉬프트
2 뉴클레오티드 728, K214R에서 시작한 27bp 결손
3 D205G, V286A, Y443C
4 L28P, Y30F, P93Q, S99V, E111Q, I118V, Y122F, H140Y, S142C, T144I, A148T, M152L, G153A, A156S, G162D, L195M, V196E, K199E, L211M, L213F, S221F, L411S, V425A
5 G206R, Y207C, W343R
6 Q13R, F46S, S99P, D395G
7 Y30F, S364P, G384C, K427N, E438A
8 Y94C, A132V, Y224C, G384C, K427N, E438A, Q455R
9 K222E, T341M, G384C
10 Y94C, A132V, Y224C, K313N, R334C, G384C
11 Y30F, K222E, V286A, G384C, K427N, E438A
12 Y30F, P93Q, S99V, Y122F, H140Y, S142C, T144I, T145N, A148T, M152L, G153A, A156S, G162D, L195M, V196E, K199E, L211M, L213F, S221F, V286A S289R, R334C, G384C, K427N, E438A
13 V44A, I136V, G374D, V457I, N463S
14 I60S, K97R, Q103R, F181S, L411S
15 V244A, F307L
16 H140Y, S142C, T144I, A148T, M152L, G153A, A156S
17 L195M, V196E, K199E, L211M, L213F, S221F, V286A, R334C, G384C, K427N, E438A
18 V169A, R334C, G384C, K427N, E438A
19 G25D, Y30F, P93Q, S99V, Y122F, H140Y, S142C, T144I, A148T, M152L, G153A, A156S, G162D, L195M, V196E, K199E, L211M, L213F, S221F, V286A, G384C
20 I64T, V323A, V330A, G384C, K427N, E438A
표 14의 클론 모두 기질로 13-SMG를 이용하여 활성에 대하여 테스트하였다. 클론 5는 약한 1,2-당화 활성을 보유한 반면, 나머지 19개는 테스트한 조건들하에서 활성을 가지는 것으로 보이지 않았다. 클론 5의 서열은 서열 번호:95에 제시하며, 그리고 야생형 UGT92D2e (서열 번호:5)에 대하여 다음의 돌연변이들을 가진다: G206R, Y207C, 및 W343R.
실시예 17 -UGT85C 동족체들
스테비올 글리코시드 생산을 위한 경로에서 동일한 또는 강화된 활성을 보유하는 동족체들을 확인하기 위하여, 6가지 상이한 S. rebaudiana 생태형으로부터 UGT85Cs의 유전적 다양성을 검사하였다. UGT85C 유전자에 특이적인 PCR 프라이머를 기획하였고, 그리고 PCR 반응을 cDNA에서 실시하였다 (일부는 cDNA 라이브러리에서 실시하였고, 일부는 cDNA 준비물에서 실시하였다). 생성된 PCR 산물들을 클론하였고, 96개 클론을 서열화하였다. 아미노산 다형성을 매핑하였고, 그리고 다양한 공통적인 다형성 표시를 가지는 16개 UGT 85C을 선택하였다. 표 15 참고. 일부 클론들의 경우 추가적인 변형이 또한 확인되었지만, PCR 오류로 인한 것일 수 있거나 또는 공통 다형성이 아니었다. 다형성은 수탁 No. AY345978.1에서 제시한 야생형 S. rebaudian UGT85C 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 넘버링에 대해서 설명한다(표 8 참고).
Figure pat00002
Figure pat00003
PCR 산물들 (TNT®T7 Quick for PCR DNA kit, Promega)의 시험관내 전사-해독 결합을 통하여 이들 클론들이 발현되었고, 앞선 실시예들에서 설명된 것과 같이 기질들 스테비올 및 스테비올-19-O-글루코시드 (0.5 mM) 상에서 당화 활성에 대하여 분석하였다. 클론 1, 4, 16, 17, 19, 20, 21, 26, 29, 30, 31, 37, 및 39로부터 생산된 UGT85Cs는 가용성이었고, 90분 분석에서 19-SMG를 루부소시드로 전환시킬 수 있었다. 클론 27로부터 생산된 UGT85C는 불용성으로 간주하였다. 클론 1와 33에서 만들어진 UGT85Cs도 불용성으로 간주되었지만, 단백질 밴드가 보이지 않았음에도 불구하고 미량의 루부소시드가 생산되었다. 이들 실험은 독립성으로 3회 실시하였다. 실험에서 다음의 아미노산 돌연변이들은 활성 상실을 야기하지 않았다: V13F, F15L, H60D, A65S, E71Q, I87F, K220T, R243W, T270M, T270R, Q289H, L334S, A389V, I394V, P397S, E418V, G440D, 및 H441N. 활성 클론에서 볼 수 있었던 추가적인 돌연변이는 클론 37에서 K9E, 클론 26에서 K10R, 클론 2에서 Q21H, 클론 30에서 M27V, 클론 4에서 L91P, 클론 31에서 Y298C, 클론 37에서 K350T, 클론 1에서 H368R, 클론 19에서 G420R, 클론 4에서 L431P, 클론 16에서 R444G, 그리고 클론 30에서 M471T.
테스트하지 않았던 유일한 공통 다형성은 T270A 및 I336T이었고, 이 둘다 상당히 보존성 치환이었다. 클론 17은 UGT85C, 6/480 아미노산과 비교하였을 때, 통합된 최고의 변화를 보유하였다. 변화가능한 것으로 보이는 17-20개 아미노산은 아미노산 수준에서 대략 4% 차이를 나타낸다.
일반적으로, 85Cs 가운데 낮은 유전적 다양성이 있고, 표 15에 제시한 공통의 다형성을 가진 85C 동족체들 모두 활성일 것 같다.
실시예 18 UGT76G 동족체들
스테비올 글리코시드 생산을 위한 경로에서 동일한 또는 강화된 활성을 보유하는 동족체들을 확인하기 위하여, 6가지 상이한 S. rebaudiana 생태형으로부터 UGT76Gs의 유전적 다양성을 검사하였다. UGT76G에 특이적인 PCR 프라이머를 기획하였고, 그리고 PCR 반응을 cDNA에서 실시하였다 (cDNA 라이브러리 또는 cDNA 준비물). 생성된 PCR 단편들을 클론하였고, 96개 클론을 서열화하였다. 공통의 아미노산 다형성을 매핑하였고, 그리고 다양한 다형성 표시를 가지는 다음을 포함하는 16개 UGT76G 클론을 선택하였다(아미노산 넘버링): R10S, I16L, F22V, M29I, K52S, V74K/E, P80S, L85A, V87S/G, L91P, I92F, I93F, H96Y, G97R, L108V, E113D, G116E, A123T, Q125A, I126L, Y128H, T130A, L142I, V145M, S147N, N151T, F152I, H153L, H155Y, V156D, Q160L, E163D, L167F, P169L, K188N, K191Q, C192S/F, S193G/A, F194Y, M196N, K198Q, K199(I, V, Q), Y200(L, A, G), Y203I, F204L, E205G, N206K, I207M, T208I, V217I/F, E226Q, S228P, L230V, V233I, I234T, E236D, I237F, S253P, P266Q, S273P, R274S, G284T/A, T285S, 287-3 bp 결손, R298H, P326A, L330V, G331A, P341L, L346I, S376L, D377A, G379A, L380F, S438P, 및 K441N. 일반적으로, 76Gs가운데 매우 높은 다양성이 있었다.
이 클론들은 시험관 해독을 통하여 발현되었고, 기존 실시예들에서 설명한 것과 같이, 기질로 0.5 mM의 스테비올-13-O-글루코시드 및 0.5 mM의 스테비오시드를 이용하여 당화 활성에 대하여 분석하였다. 반응은 30℃에서 90분간 실시하였다. 고유 76G1 활성은 스테비올-13-O-글루코시드를 기질로 이용하였을 때, 1,3-바이오시드를 형성함으로써 76G_C4, 76G_G7 및 76G_H12로 명명된 새로운 3가지 76G에서 발견되었다. 이 경우에 활성은 포지티브 대조군, 기능을 하는 76G1과 비교하여 판단하였다. 클론 76G_G7 및 76G_H12는 대조군보다 약간 더 높은 수준의 Reb A를 생산하였지만, 76G_C4는 대조군보다 약간 적은 Reb A를 생산하였다. 이들 클론에서 변화 수는 대조군 효소로부터 아미노산 수준에서 약 7% 차이를 나타낸다. 서열 번호: 98, 100, 및 102는 차례로 76G_C4, 76G_G7, 및 76G_H12의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 번호: 97, 99, 및 101은 차례로 76G_C4, 76G_G7, 및 76G_H12를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 제시한다. 서열 번호: 98, 100, 및 102는 차례로 76G_C4, 76G_G7, 및 76G_H12의 아미노산 서열을 제시한다. 서열 번호: 97, 99, 및 101은 차례로 76G_C4, 76G_G7, 및 76G_H12를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
표 16은 야생형 효소와 비교하였을 때, 활성을 보유하였던 76G 클론의 아미노산 변화들을 요약한다. 활성 클론에서 다수의 중첩 다형성이 있었고, 따라서, 이들 다형성은 효소에 대해 활성의 상실을 야기하지 않는 것으로 예측된다. 특정 돌연변이, 예컨데 위치 80에서 PS 돌연변이 또는 위치 22에서 FV 돌연변이는 비활성 클론에서 빈번한 것으로 보인다.
클론 돌연변이들
76G_G7 M29I, V74E, V87G, L91P, G116E, A123T, Q125A, I126L, T130A, V145M, C192S, S193A, F194Y, M196N, K198Q, K199I, Y200L, Y203I, F204L, E205G, N206K, I207M, T208I, P266Q, S273P, R274S, G284T, T285S, 287-3 bp 결손, L330V, G331A, L346I
76G_H12 M29I, V74E, V87G, L91P, G116E, A123T, Q125A, I126L, T130A, V145M, C192S, S193A, F194Y, M196N, K198Q, K199I, Y200L, Y203I, F204L, E205G, N206K, I207M, T208I, P266Q, S273P, R274S, G284T, T285S, 287-3 bp 결손
76G_C4 M29I, V74E, V87G, L91P, G116E, A123T, Q125A, I126L, T130A, V145M, C192S, S193A, F194Y, M196N, K198Q, K199I, Y200L, Y203I, F204L, E205G, N206K, I207M, T208I
실시예 19 - 절두된 효모 HMG-CoA 환원효소 및 기타 HMG-CoA 환원효소들의 발현S. cerevisiae에서, 메발로네이트 경로는 예를 들면, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A (HMG-CoA) 환원효소의 수준에서 엄격하게 제어된다. 절두된 HMG-CoA 환원효소 (tHMG1, 분해로부터 안정화된 효소를 인코드하는)의 발현은 효모 안에서 PPP 생산을 지향하는 유동을 증가시키는 한 가지 방법이다. 예를 들면, 효모에서 tHMG1의 발현은 β-카로틴의 급격한 과다생산으로 이어졌다. Verwaal et al., 2007, Appl. Environ. Microbiol. 73:4342 참고. 흥미로운 것은, 이러한 효모는 예상한 것과 같이 고형 성장 배지상에서 더 짙은 오렌지 색을 나타내지 않았고, 오히려 더 강력한 황생을 나타내었는데, 이는 아마도 중간생성물 피토엔(phytoene)의 더 높은 과다생산인 것으로 보인다.
HMG-CoA 환원효소의 발현을 스테비올 및 스테비올 글리코시드 경로로의 유동을 개선시키는데 이용할 수 있는지를 판단하기 위하여, 프로모터 of the ERG9 유전자의 고유 프로모터를 CUP1 프로모터로 대체함으로써 이소프레노이드 유동을 테스트하기 위한 효모 리포터 균주는 준비하였다. 미국 특허 출원 61/346853, (May 20, 2010 출원) 참고.
이 효모 균주를 생산하는데 이용한 유전자들을 표 17에 나타낸다. 원천 유기체의 유전자는 DNA 2.0 Inc™에 따라 코돈 최적화하였다. 세포의 프레닐 포스페이트 이용성을 모니터하기 위한 목적으로, 프레닐 포스페이트를 β-카로틴으로 전환시키는데 요구되는 3가지 효소들(Xanthophyllomyces dendrorhous로부터 GGPP 합성효소, X. dendrorhous,로부터 피토엔 합성효소와 베타 카로틴 합성효소 그리고 Neurospora crassa로부터 제타 카로틴 합성효소와 델타 카로틴 합성효소)에 대한 유전자와 함께 유전자 발현 카세트들(메티오닌-억제가능한 프로모터들)을 포함하는 많은 복사체 플라스미드를 보유한 구조체를 만들었다. Verwaal et al., 2007 supra; 및 미국 특허 출원 61/346853 참고.
HMG CoA 환원효소 및 기타 메발로네이트 유전자의 원천들
수탁# 유기체 효소 크기 (nt) 유전자 이름 서열 번호
(최적화된
코돈) 		서열 번호
(단백질)
XM_001467423 Leishmania infantum 아세틸-CoA C-아세틸 전이효소 1323 MEV-4 103 104
YML075C Saccharomyces cerevisiae 절두된 HMG (tHMG1) 1584 tHMG1 105 106
EU263989 Ganoderma lucidum 3-HMG-CoA 환원효소 3681 MEV-11 107 108
BC153262 Bos taurus 3-HMG-CoA 환원효소 2667 MEV-12 109 110
AAD47596 Artemisia annua 3-HMG-CoA 환원효소 1704 MEV-13 111 112
AAB62280 Trypanosoma cruzi 3-HMG-CoA 환원효소 1308 MEV-14 113 114
CAG41604 Staph aureus 3-HMG-CoA 환원효소 1281 MEV-15 115 116
DNA2.0 서열 Archaeoglobus fulgidus 3-HMG-CoA 환원효소 1311 HMG 환원효소 117 118
DNA2.0
서열		 Pseudomonas mevalonii 3-HMG-CoA 환원효소 1287 HMG 환원효소 119 120
효모 tHMG1을 β-카로틴을 생산하는 CEN.PK-기반 효모 균주에서 발현시켜, 오렌지색을 밝은 노란색으로 색의 변화를 얻었다. 흥미로운 것은, Artemisia annua, Trypanosoma cruzi 및 Staphylococcus aureus의 전장 HMG 뿐만 아니라 Pseudomonas mevalonii 및 Archeoglobus fulgidus 의 NADH-의존성 HMG의 발현은 유사한 결과를 가져왔고, 이는 이들 유전자가 효모에서 메발로네이트 경로를 통하여 유동을 또한 개선시킨다는 것을 나타낸다(Bos taurus HMG의 유사한 과다발현은 이러한 효과가 없었다). 끝으로, Leishmania infantum 아세틸-CoA C-아세틸전이효소 (메발로네이트 경로의 첫 번째 효소, 표 17에서 설명하고 있음) 또는 고유 S. cerevisiae (CAB1, YDR531W) 또는 B. subtilis, (acc. No. YP004204141) 판토테네이트(pantothenate) 키나제 (아세틸-CoA 생산을 증가시키는 것으로 알려짐)의 과다발현 후 동일한 색의 변화를 볼 수 있었다. 이들 실험에서 색의 변화가 GGPP의 더 높은 이용성때문인지를 테스트하기 위하여, 효모 tHMG1, P. mevalonii 또는 S. aureus HMGs, 또는 B. subtilis 판토테네이트 키나제를 안정적인 19-SMG 생산 균주에서 발현시켰다. 이들 구조체중 어느 것도 테스트한 조건하에서 19-SMG 또는 루부소시드 생산 (UGT85C2 공동-발현됨)을 증가시킨 것으로 나타나지 않았다. 킨 것으로 보이는 것들은 없었다. 효모 리포터 균주에 메발로네이트 공급 또한 루부소시드의 생산을 증가시키지 않았다. 그러나, 루부소시드 리포터 균주는 에르고스테롤 생합성을 지향하는 ERG9-인코드된 유동을 감소시키도록 유전적으로 변형되지 않았다. 에르고스테롤 생산에 대해 유동의 조절은 HMG 환원효소 유전자와 베타-카로틴 생산에 유익한 것으로 밝혀진 기타 메발로네이트 경로 유전자를 이용하여 스테비올 글리코시드 생산을 증가시킬 것으로 예측한다.
실시예 20 생체내에서 RebC의 생산
리바우디오시드 C, 스테비올-13-O-글루코피라노실-1,2-람노시드로의 전구물질 분자 합성은 실시예 15에서 시험관에서 보여주었다. 이 실시예에서, 스테비올-13-O-모노글루코시드는 UDP-글루코오즈와 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) RHM2 효소 (유전자 좌 tag AT1G53500) 및 UGT91D2e와 함께 기질로 이용하였다. 도 2B에 나타낸 경로를 추가 설명하기 위하여, 스테비올로부터 리바우디오시드 C의 생산은 생체내에서 실시하였다.
리바우디오시드 C를 생산할 수 있는 효모 균주를 작제하였고, 그리고 리바우디오시드 C 및 리바우디오시드 A의 생산을 LC-MS로 분석하였다. 변형된 S사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 BY4742를 작제하였고, EYS583-7A로 명명하였다. BY4742의 사용은 Naesby et al., Microb Cell Fact. 8:45 (2009)에서 설명하였다. 4가지 UGTs (91D2d, 76G1, 74G1, 및 85C2) 모두 GPD 프로모터를 가진 플라스미드에서 구조적으로 발현시켰다. 이러한 유형의 균주는 Naesby et. al, Microb Cell Fact. 8:45 (2009)에서 설명하였다. UGT85C2는 플라스미드 P423 GPD (ATCC#87355)에 삽입하였고, UGT74G1은 P424 GPD (ATCC#87357)으로 클론시켰고, 그리고 UGT91D2e 및 UGT76G1은 모두 고유의 다중 클로닝 부위(MCS)에서 91D2e와 추가적인 GPD 프로모터와 CYC 종료물질과 함께 삽입된 76G1을 가진 P425-GPD (ATCC#87359)으로 클로닝시켰다. 생성된 균주는 GPD 프로모터로부터 발현된 RHM2 유전자를 포함하는 플라스미드 P426 GPD (ATCC#87361)로 형질전환시켰다. 이 균주는 히스티딘, 루이신, 트립토판 및 우라실이 부족한 SC 배지에서 24시간 동안 성장시켰다. 배양물은 25 μM 스테비올을 포함하는 새로운 배지에서 0.4의 OD600로 재접족시켰고, 그리고 효모는 72시간 이상동안 성장하도록 둔 후에, 상청액과 세포 펠렛에 리바우디오시드 C가 존재하는지를 탐지하였다. 리바우디오시드 C는 진정한 리바우디오시드 C 표준(Chromadex, Irvine CA)을 이용하여 정량화하였다. 상청액에서 총 1.27 M 0.36 M의 RebC가 탐지되었다. 유사하게, 3.17 M 1.09 M의 RebA가 세포 펠렛에서 탐지되었다. 당업자는 RHM2 효소의 활성을 조정함으로써 및/또는 UDP-람노오즈 반응에 대해 더 높은 활성을 가진 UGT91D2e 또는 UGT76G1-유사 효소들을 이용함으로써 RebC 대 RebA의 상이한 비율을 얻을 수 있음을 인지할 것이다. 대체 UGTs는 야생형 효소들 또는 창시 발견 계획을 통하여 수득된 독특한 효소들의 돌연변이된 형태일 수 있다.
당업자는 글루코오즈로부터 리바우디오시드 A를 생산할 수 있는 효모 균주, 예컨대, 실시예 12에서 UGT91D2e 및UGT76G1을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 균주 CEY213는 벡터를 통하여 또는 염색체에 통합된 RHM2 유전자가 추가와 함께 리바우디오시드 C를 생산할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예 21 - 대장균( Escherichia coli )에서 발현된 UGT를 이용하여 스테비올 글리코시드 생산
그람 음성 세균에서 UGT 효소들의 활성
UGTs 91D2e, 74G1, 76G1, 및 85C2에 대한 야생형 유전자들을 Novagen (EMD4 Biosciences, Madison, WI)의 pET30을 이용하여 E. coli XjB-자가분해 BL21(DE3) 세포들 안으로 클론시켰지만, UGT91D2e의 경우는 pGEX 4T-1 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 벡터 안으로 클론시켰다. 실시예 7 및 10에서 유사한 클로닝을 설명하였다. 모든 벡터들은 IPTG-유도성 프로모터를 이용한다. 판매인이 설명하는 것과 같이, 플라스미드 DNA는 화학적으로 컴피턴트 세포들로 형질전환시켰다.
원하는 항생제 저항성을 나타내는 형질변환제들은 NZCYM-배지 및 항생제를 이용하여 2mL 배양물에서 3℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 생체내 먹이공급(feedings)을 위하여 5가지 배양물을 성장시켰다: UGT 91d2e, 74G1, 76G1, 및 85C2 각각과, 4개 클론 모두의 혼합물. 다음날, 최종농도 0.3 mM의 IPTG 및 3 mM의 아라비노즈로 배양을 유도하였고, 50 M 스테비올 (UGT74G1, UGT85C2 및 4가지 혼합물) 또는 50M 루부소시드 (UGT91D2e 및 UGT76G1) 존재하에서 20℃에서 2일간 성장시켰다. 온도를 30℃로 올리고, 하루 더 세포를 성장시켰다. 그 다음 세포는 5분간 4000 rpm에서 원심분리시켜 수확하였고, 그리고 상청액은 LC-MS 분석을 위하여 제거하였다. 세포들을 50% DMSO에서 재현탁시키고, 5분간 80℃에서 용해시키고, 용해물은 LC-MS로 분석하였다.
시험관 분석을 위하여 원하는 항생제 저항성을 나타내는 형질변환제들은 NZCYM-배지 및 항생제를 이용하여 2mL 배양물에서 3℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 다음날, 최종농도 0.3 mM의 IPTG 및 3 mM의 아라비노즈로 배양을 유도하였고, 20℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 세포는 5분간 4000 rpm에서 원심분리시켜 수확하였고, 200 L GT-완충액(RBC Bioscience)과 3 tablets/100ml의 Complete mini Protease Inhibitor(Roche)에 재현탁시키고, Eppendorf 튜브로 옮기고, 볼텍스하고, 1.5시간 동안 80℃에서 냉동시켰다. 세포들을 얼음위에서 해동시키고, 3분간 실온에 두었다. 대략 절단 정도 해동되었을 때, 15 l의 0.14 mg/ml H2O DNase 용액 + 30 l 0.05M MgCl2를 각 튜브에 추가하였고, 시료들은 실온에서 대략 5분간 항온처리하였다. 세포들은 5분간 최대 속도에서 원심분리하였다. 100 L의 상청액(용해물)을 새로운 마이크로퓨즈 튜브로 옮겼고, 100 L의 글리세롤을 첨가하였다.
15.15 L H2O, 7.5 L 4X 완충액(400mM Tris, 20mM MgCl2, 4mM KCl), 0.3 L FastAPTM (1u/ L)(Fermentas), 0.45 L의 100 mM UDP-글루코오즈 스톡(stock), 0.6 L의 기질 (스테비올 또는 루부소시드) 그리고 6 L의 정제안된 효소 준비물(상기에서 설명)을 추가하여 효소 분석을 실시하였다. UGT74G1, UGT85C2, 뿐만 아니라 4가지 UGTs 모두의 혼합물을 스테비올과 함께 항온처리하였다. UGT 76G1 및 85C2는 루부소시드와 함께 항온처리하였다. 효소 분석은 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 4000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 30 L 시료를 새로운 96웰 플레이트로 옮기고, 30 L의 DMSO를 추가하였다. 그 다음 시료는 LC-MS 분석를 받았다. 스테비올 1,2-바이오시드 (UGT76G1 및UGT74G1의 경우) 또는 리바우디오시드 B (UGT74G1의 경우)를 기질로 사용하여 유사한 시험관 분석을 실시하였다.
생체내 먹이 공급의 경우 활성이 탐지되지 않았다. 표 18은 시험관 분석 결과를 설명한다.
튜브 UGT 클론(들) 공급된 기질 탐지된 산물
1 74G1 스테비올 19-SMG, 낮은 수준의 루부소시드
2 85G1 스테비올 13-SMG, 낮은 수준의 루부소시드
3 76G1 루부소시드 1,3-스테비오시드, 미지의 테트라-글리코시드
4 91D2e 루부소시드 스테비오시드
5 4가지 정제안된UGT
준비물의 혼합물		 스테비올 루부소시드, 1,3-스테비오시드,
잔량 RebA (모노시드 없음)
6 76G1 스테비올 1,2-바이오시드 리바우디오시드 B
7 74G1 스테비올 1,2-바이오시드 스테비오시드
8 74G1 리바우디오시드 B 리바우디오시드 A
이들 결과에서 UGT 효소들은 모두 E. coli 세포들에서 활성이라는 것을 나타낸다. 그러나, 기질들이 세포질로 바로 들어가지 못할 수도 있다. 스테비올이 전구물질 경로로부터 대장균에서 생산된다면, 다양한 스테비올 글리코시드 산물들의 생산은 글루코오즈로부터 가능할 것으로 기대한다. 기질 특이성이 약간 중첩되는 74G1 및 85G1 UGTs는 스테비올 단독으로부터 루부소시드를 생산할 수 있을 것으로 기대하지 않는다. 4가지 정제안된 효소 준비물의 혼합물은 매우 낮은 수준의 모노시드들을 제공하였는데, 이는 디- 및 트리-글리코시드로의 전환이 효과적이었음을 나타낸다. UGT91D2e의 경우, 이용된 준비물은 장기 보관 후 고유 활성의 일부를 상실하였다. 새로 준비한 효소는 더 높은 수준의 리바우디오시드 A 수율을 가질 것으로 예상한다.
실시예 22 - 피스코미트렐라 페텐스( Physcomitrella patens )에서 스테비올 글 리코시드의 생산
이끼 세포들에서 공급(feeding) 실험
UGT 91d2e, 74G1, 76G1, 및 85C2에 대한 유전자를 U.S. 특허 공개 번호 20100297722에서 설명한 pTHUbi:Gateway 벡터 시스템을 이용하여 피스코미트렐라 페텐스(Physcomitrella patens)로 클론시켰다. 이 벡터는 강력한 옥수수 Ubiquitin 프로모터를 이용한다. PCR 프라이머는 시작 코든의 "CACC" 상류 추가와 함께 기존 실시예들에서 코딩 영역들(고유 서열들)을 증폭하도록 기획하였다. 플라스미드 DNA는 SwaI으로 절단하였고, 원형질체로 형질전환시키는데 이용하였다(일반적으로 대략 0.5x106 원형질체). 원하는 저항성을 나타내는 형질전환체는 10 mL 배양물에서 1일간 성장시키고, 그 다음 표 19에 나타낸 것과 같이, 스테비올, 루부소시드, 또는 완충액 + DMSO을 공급하였다. 10 mL 의 배양물당 기질을 포함하는 완충액의 0.5mL을 추가하였고, 그리고 최종 농도 0.1% DMSO, 50 M 스테비올 또는 루부소시드, 그리고 0.125 mM 포스페이트 완충액을 배양물에 추가하였다. 양성 대조군은 YFP (황색 형광 단백질)이 스테비올의 존재시 또는 단지 완충액 및 DMSO에서 발현될 때 실시하였다. 배양물을 2일 더 성장시키고, 세포를 분리하고, 추가 분석할 때까지 액화 질소에서 냉동시켰다. 일부 경우에서 이끼 세포들내에서 다중 단계의 전환을 설명하기 위하여, 다중 UGT-함유 플라스미드들은 동일한 원형질체 세포들로 형질전환시켰다.
튜브 UGT 유전자(들) 공급된 기질
1 YFP (대조군) 없음
2 YFP 스테비올 (50 M)
3 74G1 없음
4 76G1 없음
5 85C2 없음
6 91D2E 없음
7 74G1 스테비올 (50 M)
8 76G1 스테비올 (50 M)
9 85C2 스테비올 (50 M)
10 91D2E 스테비올 (50 M)
11 74G1/85C2 없음
12 74G1/85C2 스테비올 (50 M)
13 74G1/85C2/91D2E 없음
14 74G1/85C2/91D2E 스테비올 (50 M)
15 76G1 루부소시드 (50 M)
16 91D2E 루부소시드 (50 M)
17 76G1/91D2E 없음
18 76G1/91D2E 루부소시드 (50 M)
형광 신호 관찰에 의해 측정하였을 때, 대조군(튜브 1과 2)는 발현이 양성이었다. 실험의 상청액은 LC-MS에 의해 분석하였다; 200 L의 각 시료 상청액은 동량의 50% DMSO와 혼합하였다. 시료를 회전시키고(15,700 상대적 원심력, 10 분) 그리고 생성된 상청액 100 L는 LC-MS에 의해 분석하였다. 원형질 펠렛은 얼음위에서 해동시켰고, 그리고 3 tablets/100 ml Complete Mini Protease Inhibitor (Roche)를 포함하는 10 mM Tris-HCl pH 8를 최종 용적이 150 L이 되도록 첨가하였다. 용액을 둘로 나눈다: 75 L는 새 튜브로 옮기고, 원형질을 펠렛화시켰다(15,700 상대적 원심력, 1분). 펠렛을 75 L Milli-Q 물로 세척하고, 150 L DMSO (50%)에 재현탁시켰다. 그 다음 시료들을 가열시키고(80℃, 10 분), 볼텍스하고, 원심분리하였다(15,700 상대적 원심력, 10분). 생성된 상청액 50L는 LC-MS에 의해 분석하였다.
상청액 또는 펠렛에서 스테비올 글리코시드 생산이 탐지되지 않았다. 스테비올 및 루부소시드가 이끼 세포들로 운반될 수 있는지는 알수 없다.
펠렛 추출물들의 시험관 공급(feeding)
시료 1, 3, 4, 5, 6, 11, 13 및 17)로 시험관 공급 실험을 실시하였다. 나머지 75 L의 원래 재현탁물에 유리 비드(425-600 미크론)를 추가하였고, 원형질은 4℃에서 3회(매회 2분씩, 볼테스 사이에 얼음에 보관) 볼텍스하여 기계적으로 용해시켰다. 시료를 회전시키고(15,700 상대적 원심력, 10분, 4℃) 그리고 생성된 상청액 6 L를 in vitro 효소 반응에 이용하였다. 효소 반응을 위하여 FastAPTM 포스포타제(Fermentas)를 이용하였고(0.3 U/반응) 그리고 UDP-글루코오즈:기질 비율은 5이었다. 표 20에 따라 스테비올 또는 루부소시드를 시료에 공급하였다.
튜브로부터 세포 추출물 UGT 유전자(들) 공급된 기질
1 YFP 없음
1 YFP 0.5 mM 스테비올
1 YFP 0.5 mM 루부소시드
3 74G1 0.5 mM 스테비올
4 76G1 0.5 mM 루부소시드
5 85C2 0.5 mM 스테비올
6 91D2E 0.5 mM 루부소시드
11 74G1/85C2 0.5 mM 스테비올
13 74G1/85C2/91D2E 0.5 mM 스테비올
17 76G1/91D2E 0.5 mM 루부소시드
반응물은 30℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 항온처리후, 동량의 DMSO (100%)를 시료에 추가하였고, 혼합하고, 그 다음 시료를 회전시키고(15,700 상대적 원심력, 10분) 그리고 생성된 상청액 30L는 LC-MS에 의해 분석하였다. LC-MS 분석에서 UGT76G1에 의해 루부소시드가 1,3-스테비오시드로 전환을 보여주었다. 다른 스테비올 글리코시드가 탐지되지 않았다. UGTs의 가용성 발현이 피스코미트렐라(Physcomitrella)에서 발생되었는지는 알수 없다. 하나의 UGT가 이끼 세포들에서 활성이라면 다른 것들도 발현이 일어난다면 또한 활성일 것으로 예상한다. 추가로, 클로닝은 일시적인 방식으로 실시하였다. 테스트하였을 때 UGT 활성에 대하여 활성일 추가 클론을 만들기 위하여 유전자의 안정적인 통합을 기대한다.
재조합 단백질의 가용성 발현을 증가시키는 방법들은 당업자들에게 공지되어 있다. 재조합 단백질의 가용성 발현을 증가시키는 비-제한적인 방법들은 대체 프로모터, 리보좀 결합 부위들, 코돈 사용, 쉬프론(chaperones)과의 공동-발현, 및 온도의 변화이다.
실시예 23 - 아스퍼질러스 니둘란( Aspergillus nidulans) 에서 스테비올 글리 코시드의 생산
곰팡이 세포들에서 UGT 효소들의 활성
UGT 91D2e, 74G1, 76G1, 및 85C2에 대한 고유 유전자는 PCR-조작된 발현 카세트와 USER 벡터 시스템을 이용하여 아스퍼질러스 니둘란(Aspergillus nidulans)으로 클론시켰다. 클로닝 방법들은 Hansen et al., Appl. Environ. Microbiol. 77: 3044-3051 (2011)에서 설명하고 있다. 간략하게 설명하자면, 각 UGT를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 게놈 삽입 및 선택 표식으로 argB 에 대한 추가 두 개의 표적 서열들을 포함하는 벡터 안에서 구성 PgpdA 프로모터와 TtrpC 종료물질 사이에 삽입하였다. 플라스미드 DNA는 Nielsen et al., Fungal Genet. Biol. 43:5464 (2006) and Johnstone et al., EMBO J. 4:1307-1311 (1985)에 따라 A. nidulans 원형질체로 형질전환시켰다. 원하는 저항성을 나타내는 형질변환체는 최소 배지(1% 글루코오즈; 10 mM NaNO3; 미네랄 믹스)를 이용하여 150mL 배양물에서 48시간 동안 성장시켰다.
유리 비드와 함께 미셀리아(mycelia) 파괴에 의해 준비된 세포 용해물을 이용하여 시험관에서 개별 UGTs의 활성을 측정하였다. 74G1 및 85C2를 발현시키는 균주들의 세포 용해물은 0.5 mM 스테비올과 함께, 그리고 76G1 및 91D2e를 발현시키는 균주들은 24시간 동안 0.5 mM 스테비올-13-O-글루코시드와 함께 항온처리하였고, 상청액은 LC/MS를 이용하여 추가 분석하였다. 스테비올 글리코시드는 탐지되지 않았다.
이들 산물들이 SDS-PAGE 상에서 일반적으로 볼 수 없기 때문에 UGT 효소들의 가용성 발현이 이루어졌는지는 알 수 없다. 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 는 모두 곰팡이이기 때문에, 추가 실험이 활성 클론을 야기할 것으로 기대한다. 재조합 단백질의 가용성 발현을 증가시키는 방법들은 당업자에게 공지되어 있다. 재조합 단백질의 가용성 발현을 증가시키는 비-제한적인 방법들은 대체 프로모터, 리보좀 결합 부위들, 코돈 사용, 쉬프론(chaperones)과의 공동-발현, 및 온도의 변화이다.
기타 구체예들
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 설명하고 있지만, 상기 명세서들은 설명을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 첨부된 청구범위에 의해 본 발명의 범위가 정해짐을 인지할 것이다. 다른 측면들, 장점들 그리고 변형들이 다음의 청구범위내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> EVOLVA SA ABUNDA NUTRITION, INC. <120> RECOMBINANT PRODUCTION OF STEVIOL GLYCOSIDES <130> 25903-0003WO1 <140> <141> <150> 61/471,622 <151> 2011-04-04 <150> 61/434,582 <151> 2011-01-20 <150> 61/350,553 <151> 2010-06-02 <160> 151 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 460 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 1 Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile 1 5 10 15 Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys 20 25 30 Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His 35 40 45 Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile 50 55 60 Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser 65 70 75 80 Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser 85 90 95 Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp 100 105 110 Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile 115 120 125 Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val 130 135 140 Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu 145 150 155 160 Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu 165 170 175 Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser 180 185 190 Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val 195 200 205 Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr 210 215 220 Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met 225 230 235 240 Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu 245 250 255 Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro 260 265 270 Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly 275 280 285 Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val 290 295 300 Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu 305 310 315 320 Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp 325 330 335 Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val 340 345 350 Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val 355 360 365 Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys 370 375 380 Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu 385 390 395 400 Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile 405 410 415 Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp 420 425 430 Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn 435 440 445 Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala 450 455 460 <210> 2 <211> 1383 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 2 atggcagagc aacaaaagat caaaaagtca cctcacgtct tacttattcc atttcctctg 60 caaggacata tcaacccatt catacaattt gggaaaagat tgattagtaa gggtgtaaag 120 acaacactgg taaccactat ccacactttg aattctactc tgaaccactc aaatactact 180 actacaagta tagaaattca agctatatca gacggatgcg atgagggtgg ctttatgtct 240 gccggtgaat cttacttgga aacattcaag caagtgggat ccaagtctct ggccgatcta 300 atcaaaaagt tacagagtga aggcaccaca attgacgcca taatctacga ttctatgaca 360 gagtgggttt tagacgttgc tatcgaattt ggtattgatg gaggttcctt tttcacacaa 420 gcatgtgttg tgaattctct atactaccat gtgcataaag ggttaatctc tttaccattg 480 ggtgaaactg tttcagttcc aggttttcca gtgttacaac gttgggaaac cccattgatc 540 ttacaaaatc atgaacaaat acaatcacct tggtcccaga tgttgtttgg tcaattcgct 600 aacatcgatc aagcaagatg ggtctttact aattcattct ataagttaga ggaagaggta 660 attgaatgga ctaggaagat ctggaatttg aaagtcattg gtccaacatt gccatcaatg 720 tatttggaca aaagacttga tgatgataaa gataatggtt tcaatttgta caaggctaat 780 catcacgaat gtatgaattg gctggatgac aaaccaaagg aatcagttgt atatgttgct 840 ttcggctctc ttgttaaaca tggtccagaa caagttgagg agattacaag agcacttata 900 gactctgacg taaacttttt gtgggtcatt aagcacaaag aggaggggaa actgccagaa 960 aacctttctg aagtgataaa gaccggaaaa ggtctaatcg ttgcttggtg taaacaattg 1020 gatgttttag ctcatgaatc tgtaggctgt tttgtaacac attgcggatt caactctaca 1080 ctagaagcca tttccttagg cgtacctgtc gttgcaatgc ctcagttctc cgatcagaca 1140 accaacgcta aacttttgga cgaaatacta ggggtgggtg tcagagttaa agcagacgag 1200 aatggtatcg tcagaagagg gaacctagct tcatgtatca aaatgatcat ggaagaggaa 1260 agaggagtta tcataaggaa aaacgcagtt aagtggaagg atcttgcaaa ggttgccgtc 1320 catgaaggcg gctcttcaga taatgatatt gttgaatttg tgtccgaact aatcaaagcc 1380 taa 1383 <210> 3 <211> 481 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 3 Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile 1 5 10 15 Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln 20 25 30 Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe 35 40 45 Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly 50 55 60 Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser 65 70 75 80 Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu 85 90 95 Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp 100 105 110 Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile 115 120 125 Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu 130 135 140 Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu 145 150 155 160 Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr 165 170 175 Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu 180 185 190 Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu 195 200 205 Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His 210 215 220 Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu 225 230 235 240 Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu 245 250 255 Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu 260 265 270 His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu 275 280 285 Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr 290 295 300 Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala 305 310 315 320 Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile 325 330 335 Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys 340 345 350 Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His 355 360 365 Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile 370 375 380 Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp 385 390 395 400 Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly 405 410 415 Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val 420 425 430 Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys 435 440 445 Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser 450 455 460 Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg 465 470 475 480 Asn <210> 4 <211> 1446 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 4 atggatgcaa tggcaactac tgagaaaaag cctcatgtga tcttcattcc atttcctgca 60 caatctcaca taaaggcaat gctaaagtta gcacaactat tacaccataa gggattacag 120 ataactttcg tgaataccga cttcatccat aatcaatttc tggaatctag tggccctcat 180 tgtttggacg gagccccagg gtttagattc gaaacaattc ctgacggtgt ttcacattcc 240 ccagaggcct ccatcccaat aagagagagt ttactgaggt caatagaaac caactttttg 300 gatcgtttca ttgacttggt cacaaaactt ccagacccac caacttgcat aatctctgat 360 ggctttctgt cagtgtttac tatcgacgct gccaaaaagt tgggtatccc agttatgatg 420 tactggactc ttgctgcatg cggtttcatg ggtttctatc acatccattc tcttatcgaa 480 aagggttttg ctccactgaa agatgcatca tacttaacca acggctacct ggatactgtt 540 attgactggg taccaggtat ggaaggtata agacttaaag attttccttt ggattggtct 600 acagacctta atgataaagt attgatgttt actacagaag ctccacaaag atctcataag 660 gtttcacatc atatctttca cacctttgat gaattggaac catcaatcat caaaaccttg 720 tctctaagat acaatcatat ctacactatt ggtccattac aattacttct agatcaaatt 780 cctgaagaga aaaagcaaac tggtattaca tccttacacg gctactcttt agtgaaagag 840 gaaccagaat gttttcaatg gctacaaagt aaagagccta attctgtggt ctacgtcaac 900 ttcggaagta caacagtcat gtccttggaa gatatgactg aatttggttg gggccttgct 960 aattcaaatc attactttct atggattatc aggtccaatt tggtaatagg ggaaaacgcc 1020 gtattacctc cagaattgga ggaacacatc aaaaagagag gtttcattgc ttcctggtgt 1080 tctcaggaaa aggtattgaa acatccttct gttggtggtt tccttactca ttgcggttgg 1140 ggctctacaa tcgaatcact aagtgcagga gttccaatga tttgttggcc atattcatgg 1200 gaccaactta caaattgtag gtatatctgt aaagagtggg aagttggatt agaaatggga 1260 acaaaggtta aacgtgatga agtgaaaaga ttggttcagg agttgatggg ggaaggtggc 1320 cacaagatga gaaacaaggc caaagattgg aaggaaaaag ccagaattgc tattgctcct 1380 aacgggtcat cctctctaaa cattgataag atggtcaaag agattacagt cttagccaga 1440 aactaa 1446 <210> 5 <211> 473 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 5 Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val 1 5 10 15 Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln 20 25 30 Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser 35 40 45 Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile 50 55 60 Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp 65 70 75 80 Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys 85 90 95 Lys Ala Ser Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln 100 105 110 His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro 115 120 125 Ser Ile Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr 130 135 140 Thr Pro Trp Ala Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile 145 150 155 160 Asn Gly Ser Asp Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Lys Trp Phe Pro Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu 180 185 190 Ala Arg Leu Val Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg 195 200 205 Met Gly Leu Val Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr 210 215 220 His Glu Phe Gly Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln 225 230 235 240 Val Pro Val Val Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Ile Pro Gly Asp 245 250 255 Glu Lys Asp Glu Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys 260 265 270 Gln Lys Gly Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Leu Val 275 280 285 Ser Gln Thr Glu Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly 290 295 300 Leu Pro Phe Val Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser 305 310 315 320 Asp Ser Val Glu Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg 325 330 335 Gly Leu Val Trp Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His 340 345 350 Glu Ser Val Cys Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val 355 360 365 Glu Gly Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly 370 375 380 Asp Gln Pro Leu Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile 385 390 395 400 Glu Ile Pro Arg Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val 405 410 415 Ala Arg Ser Leu Arg Ser Val Val Val Glu Lys Glu Gly Glu Ile Tyr 420 425 430 Lys Ala Asn Ala Arg Glu Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val 435 440 445 Glu Lys Glu Tyr Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala 450 455 460 Arg Ala Val Ala Ile Asp His Glu Ser 465 470 <210> 6 <211> 1422 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 6 atggctacat ctgattctat tgttgatgac aggaagcagt tgcatgtggc tactttccct 60 tggcttgctt tcggtcatat actgccttac ctacaactat caaaactgat agctgaaaaa 120 ggacataaag tgtcattcct ttcaacaact agaaacattc aaagattatc ttcccacata 180 tcaccattga ttaacgtcgt tcaattgaca cttccaagag tacaggaatt accagaagat 240 gctgaagcta caacagatgt gcatcctgaa gatatccctt acttgaaaaa ggcatccgat 300 ggattacagc ctgaggtcac tagattcctt gagcaacaca gtccagattg gatcatatac 360 gactacactc actattggtt gccttcaatt gcagcatcac taggcatttc tagggcacat 420 ttcagtgtaa ccacaccttg ggccattgct tacatgggtc catccgctga tgctatgatt 480 aacggcagtg atggtagaac taccgttgaa gatttgacaa ccccaccaaa gtggtttcca 540 tttccaacta aagtctgttg gagaaaacac gacttagcaa gactggttcc atacaaggca 600 ccaggaatct cagacggcta tagaatgggt ttagtcctta aagggtctga ctgcctattg 660 tctaagtgtt accatgagtt tgggacacaa tggctaccac ttttggaaac attacaccaa 720 gttcctgtcg taccagttgg tctattacct ccagaaatcc ctggtgatga gaaggacgag 780 acttgggttt caatcaaaaa gtggttagac gggaagcaaa aaggctcagt ggtatatgtg 840 gcactgggtt ccgaagtttt agtatctcaa acagaagttg tggaacttgc cttaggtttg 900 gaactatctg gattgccatt tgtctgggcc tacagaaaac caaaaggccc tgcaaagtcc 960 gattcagttg aattgccaga cggctttgtc gagagaacta gagatagagg gttggtatgg 1020 acttcatggg ctccacaatt gagaatcctg agtcacgaat ctgtgtgcgg tttcctaaca 1080 cattgtggtt ctggttctat agttgaagga ctgatgtttg gtcatccact tatcatgttg 1140 ccaatctttg gtgaccagcc tttgaatgca cgtctgttag aagataaaca agttggaatt 1200 gaaatcccac gtaatgagga agatggatgt ttaaccaagg agtctgtggc cagatcatta 1260 cgttccgttg tcgttgaaaa ggaaggcgaa atctacaagg ccaatgcccg tgaactttca 1320 aagatctaca atgacacaaa agtagagaag gaatatgttt ctcaatttgt agattaccta 1380 gagaaaaacg ctagagccgt agctattgat catgaatcct aa 1422 <210> 7 <211> 458 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 7 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile 1 5 10 15 Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu 20 25 30 Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro 65 70 75 80 Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser 100 105 110 Glu Glu Asp Glu Glu Val 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Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455 <210> 8 <211> 1377 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 8 atggaaaaca agaccgaaac aacagttaga cgtaggcgta gaatcattct gtttccagta 60 ccttttcaag ggcacatcaa tccaatacta caactagcca acgttttgta ctctaaaggt 120 ttttctatta caatctttca caccaatttc aacaaaccaa aaacatccaa ttacccacat 180 ttcacattca gattcatact tgataatgat ccacaagatg aacgtatttc aaacttacct 240 acccacggtc ctttagctgg aatgagaatt ccaatcatca atgaacatgg tgccgatgag 300 cttagaagag aattagagtt acttatgttg gcatccgaag aggacgagga agtctcttgt 360 ctgattactg acgctctatg gtactttgcc caatctgtgg ctgatagttt gaatttgagg 420 agattggtac taatgacatc cagtctgttt aactttcacg ctcatgttag tttaccacaa 480 tttgacgaat tgggatactt ggaccctgat gacaagacta ggttagagga acaggcctct 540 ggttttccta tgttgaaagt caaagatatc aagtctgcct attctaattg gcaaatcttg 600 aaagagatct taggaaagat gatcaaacag acaaaggctt catctggagt gatttggaac 660 agtttcaaag agttagaaga gtctgaattg gagactgtaa tcagagaaat tccagcacct 720 tcattcctga taccattacc aaaacatttg actgcttcct cttcctcttt gttggatcat 780 gacagaacag tttttcaatg gttggaccaa caaccaccta gttctgtttt gtacgtgtca 840 tttggtagta cttctgaagt cgatgaaaag gacttccttg aaatcgcaag aggcttagtc 900 gatagtaagc agtcattcct ttgggtcgtg cgtccaggtt tcgtgaaagg ctcaacatgg 960 gtcgaaccac ttccagatgg ttttctaggc gaaagaggta gaatagtcaa atgggttcct 1020 caacaggaag ttttagctca tggcgctatt ggggcattct ggactcattc cggatggaat 1080 tcaactttag aatcagtatg cgaaggggta cctatgatct tttcagattt tggtcttgat 1140 caaccactga acgcaagata catgtctgat gttttgaaag tgggtgtata tctagaaaat 1200 ggctgggaaa ggggtgaaat agctaatgca ataagacgtg ttatggttga tgaagagggg 1260 gagtatatca gacaaaacgc aagagtgctg aagcaaaagg ccgacgtttc tctaatgaag 1320 ggaggctctt catacgaatc cttagaatct cttgtttcct acatttcatc actgtaa 1377 <210> 9 <211> 1422 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 9 atggctacca gtgactccat agttgacgac cgtaagcagc ttcatgttgc gacgttccca 60 tggcttgctt tcggtcacat cctcccttac cttcagcttt cgaaattgat agctgaaaag 120 ggtcacaaag tctcgtttct ttctaccacc agaaacattc aacgtctctc ttctcatatc 180 tcgccactca taaatgttgt tcaactcaca cttccacgtg tccaagagct gccggaggat 240 gcagaggcga ccactgacgt ccaccctgaa gatattccat atctcaagaa ggcttctgat 300 ggtcttcaac cggaggtcac ccggtttcta gaacaacact ctccggactg gattatttat 360 gattatactc actactggtt gccatccatc gcggctagcc tcggtatctc acgagcccac 420 ttctccgtca ccactccatg ggccattgct tatatgggac cctcagctga cgccatgata 480 aatggttcag atggtcgaac cacggttgag gatctcacga caccgcccaa gtggtttccc 540 tttccgacca aagtatgctg gcggaagcat gatcttgccc gactggtgcc ttacaaagct 600 ccggggatat ctgatggata ccgtatgggg ctggttctta agggatctga ttgtttgctt 660 tccaaatgtt accatgagtt tggaactcaa tggctacctc ttttggagac actacaccaa 720 gtaccggtgg ttccggtggg attactgcca ccggaaatac ccggagacga gaaagatgaa 780 acatgggtgt caatcaagaa atggctcgat ggtaaacaaa aaggcagtgt ggtgtacgtt 840 gcattaggaa gcgaggtttt ggtgagccaa accgaggttg ttgagttagc attgggtctc 900 gagctttctg ggttgccatt tgtttgggct tatagaaaac caaaaggtcc cgcgaagtca 960 gactcggtgg agttgccaga cgggttcgtg gaacgaactc gtgaccgtgg gttggtctgg 1020 acgagttggg cacctcagtt acgaatactg agccatgagt cggtttgtgg tttcttgact 1080 cattgtggtt ctggatcaat tgtggaaggg ctaatgtttg gtcaccctct aatcatgcta 1140 ccgatttttg gggaccaacc tctgaatgct cgattactgg aggacaaaca ggtgggaatc 1200 gagataccaa gaaatgagga agatggttgc ttgaccaagg agtcggttgc tagatcactg 1260 aggtccgttg ttgtggaaaa agaaggggag atctacaagg cgaacgcgag ggagctgagt 1320 aaaatctata acgacactaa ggttgaaaaa gaatatgtaa gccaattcgt agactatttg 1380 gaaaagaatg cgcgtgcggt tgccatcgat catgagagtt aa 1422 <210> 10 <211> 473 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 10 Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val 1 5 10 15 Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln 20 25 30 Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser 35 40 45 Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile 50 55 60 Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp 65 70 75 80 Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys 85 90 95 Lys Ala Ser Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln 100 105 110 His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro 115 120 125 Ser Ile Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr 130 135 140 Thr Pro Trp Ala Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile 145 150 155 160 Asn Gly Ser Asp Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Lys Trp Phe Pro Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu 180 185 190 Ala Arg Leu Val Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg 195 200 205 Met Gly Leu Val Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr 210 215 220 His Glu Phe Gly Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln 225 230 235 240 Val Pro Val Val Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Val Pro Gly Asp 245 250 255 Glu Lys Asp Glu Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys 260 265 270 Gln Lys Gly Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Leu Val 275 280 285 Ser Gln Thr Glu Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly 290 295 300 Leu Pro Phe Val Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser 305 310 315 320 Asp Ser Val Glu Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg 325 330 335 Gly Leu Val Trp Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His 340 345 350 Glu Ser Val Cys Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val 355 360 365 Glu Gly Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly 370 375 380 Asp Gln Pro Leu Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly 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atggtcgaac cacggttgag gatctcacga caccgcccaa gtggtttccc 540 tttccgacca aagtatgctg gcggaagcat gatcttgccc gactggtgcc ttacaaagct 600 ccggggatat ctgatggata ccgtatgggg ctggttctta agggatctga ttgtttgctt 660 tccaaatgtt accatgagtt tggaactcaa tggctacctc ttttggagac actacaccaa 720 gtaccggtgg ttccggtggg attactgcca ccggaagtac ccggagacga gaaagatgaa 780 acatgggtgt caatcaagaa atggctcgat ggtaaacaaa aaggcagtgt ggtgtacgtt 840 gcattaggaa gcgaggtttt ggtgagccaa accgaggttg ttgagttagc attgggtctc 900 gagctttctg ggttgccatt tgtttgggct tatagaaaac caaaaggtcc cgcgaagtca 960 gactcggtgg agttgccaga cgggttcgtg gaacgaactc gtgaccgtgg gttggtctgg 1020 acgagttggg cacctcagtt acgaatactg agccatgagt cggtttgtgg tttcttgact 1080 cattgtggtt ctggatcaat tgtggaaggg ctaatgtttg gtcaccctct aatcatgcta 1140 ccgatttttg gggaccaacc tctgaatgct cgattactgg aggacaaaca ggtgggaatc 1200 gagataccaa gaaatgagga agatggttgc ttgaccaagg agtcggttgc tagatcactg 1260 aggtccgttg ttgtggaaaa agaaggggag atctacaagg cgaacgcgag ggagctgagt 1320 aaaatctata acgacactaa ggttgaaaaa gaatatgtaa gccaattcgt agactatttg 1380 gaaaagaata cgcgtgcggt tgccatcgat catgagagtt aa 1422 <210> 12 <211> 473 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 12 Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val 1 5 10 15 Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Phe Leu Gln 20 25 30 Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser 35 40 45 Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile 50 55 60 Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp 65 70 75 80 Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Gln Tyr Leu Lys 85 90 95 Lys Ala Val Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln 100 105 110 His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Phe Thr His Tyr Trp Leu Pro 115 120 125 Ser Ile Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Phe Cys Val Ile 130 135 140 Thr Pro Trp Thr Ile Ala Tyr Leu Ala Pro Ser Ser Asp Ala Met Ile 145 150 155 160 Asn Asp Ser Asp Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Lys Trp Phe 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gatattcaat atctcaagaa ggctgttgat 300 ggtcttcaac cggaggtcac ccggtttcta gaacaacact ctccggactg gattatttat 360 gattttactc actactggtt gccatccatc gcggctagcc tcggtatctc acgagcctac 420 ttctgcgtca tcactccatg gaccattgct tatttggcac cctcatctga cgccatgata 480 aatgattcag atggtcgaac cacggttgag gatctcacga caccgcccaa gtggtttccc 540 tttccgacca aagtatgctg gcggaagcat gatcttgccc gaatggagcc ttacgaagct 600 ccggggatat ctgatggata ccgtatgggg atggttttta agggatctga ttgtttgctt 660 ttcaaatgtt accatgagtt tggaactcaa tggctacctc ttttggagac actacaccaa 720 gtaccggtgg ttccggtggg attactgccg ccggaaatac ccggagacga gaaagatgaa 780 acatgggtgt caatcaagaa atggctcgat ggtaaacaaa aaggcagtgt ggtgtacgtt 840 gcattaggaa gcgaggcttt ggtgagccaa accgaggttg ttgagttagc attgggtctc 900 gagctttctg ggttgccatt tgtttgggct tatagaaaac caaaaggtcc cgcgaagtca 960 gactcggtgg agttgccaga cgggttcgtg gaacgaactc gtgaccgtgg gttggtctgg 1020 acgagttggg cacctcagtt acgaatactg agccacgagt cagtttgtgg tttcttgact 1080 cattgtggtt ctggatcaat tgtggaaggg ctaatgtttg 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180 gctctcgagg catctgtcaa atctcgcatt cctcaaactg acaagatatg cgagtctatg 240 gcatactcac tcatggctgg aggaaagcgt atccgtcccg ttttgtgcat tgctgcttgt 300 gaaatgtttg ggggaagtca agatgtggct atgccgacgg ctgtggcttt ggagatgatt 360 catactatga gtcttattca tgacgatttg ccttcaatgg acaacgatga tctccgacga 420 ggaaagccaa ctaatcatgt tgtctttgga gaggatgttg ctattcttgc tggggattct 480 cttctcagta cgtcttttga acatgttgcc cgtgaaacca aaggagtgtc agctgaaaag 540 attgtagatg ttatcgctcg cctcgggaag tctgtgggtg cagagggtct tgctggtgga 600 caggttatgg atcttgagtg tgaggcgaag ccaggaacta ccctcgacga tctcaagtgg 660 attcacattc acaaaactgc cactcttctt caagtggcag tggcatcagg tgctgttctt 720 ggaggggcca caccagagga ggttgctgct tgtgaactgt tcgcaatgaa tattggactt 780 gccttccagg tcgctgatga tattttggac gtgacggcat cgagtgagga tcttggcaaa 840 actgctggaa aggatgaagc cacagataag acaacttatc ctaagctttt gggattggag 900 gagagtaagg catacgctcg acaactcata gacgaagcaa aggaatcttt ggctcctttc 960 ggtgatcgtg ctgctccatt gttggcaatt gccgacttta tcattgatcg aaagaactag 1020 <210> 30 <211> 1068 <212> DNA <213> Streptomyces clavuligerus <400> 30 atgcacctgg ctccccgccg agtaccgcgc ggccgtcgaa gcccacctga ccgcgttcct 60 gaacgccaag gagcgctcgg ccgccgccgg ggggccggtt ccacaggatg tgcccgcgct 120 gctgcgggag ttcatcggcg ccgggggggg ggggaagcgg atccgtccgc tgctgtgcat 180 cgcggctggc aggccggcgg cggaacagga ctgccggacg aggtggtgtc cacagcggcg 240 gcgctggaga tgttccacgc gttcgcgctg atccacgacg acatcatgga tgactccgcg 300 accaggcgcg gcagcccgac ggtgcaccgg gcactcgccg accggctcgg cgccgctctc 360 gaccccgacc aagccggaca actgggggtg agcacggcga tcctcgtcgg ggacctcgcc 420 ctgacctggt cggacgaact gctgtacgct cccctgaccc cccaccggct ggccgcggta 480 ctgcccctgg tcacggccat gcgcgcggaa acggtccacg gccagtacct ggacatcacc 540 tccgcccgcc ggcccggcac ggacacctca ctggcgctgc gaatcgcgcg ctacaaaacc 600 gctgcttaca ccatggaacg ccccctgcac atcggagcag cgctcgccgg cgcacgaccg 660 gaactcctgg cagggctcag cgcctacgcg ctgccggcgg gcgaggcatt ccagctcgcc 720 gacgacctcc tgggagtgtt cggcgatcca cggagaaccg gcaaacccga cctcgacgac 780 ctccgcggcg gcaagcacac cgtcctcgtg gccctcgccc gggaacacgc cacacctgaa 840 cagcggcaca ccctggacac cctgctcggc acaccaggcc tcgaccggca gggcgcgtcc 900 cggctgcgct gcgtcctcgt cgccaccggg gcccgggcgg aagccgaacg cctgatcacc 960 gaacggcgcg accaggccct caccgcgctc aacgccctga cactgccccc accgctcgcc 1020 gaggcactcg cccgcctcac cctcgggagt accgcacacc cggcctga 1068 <210> 31 <211> 993 <212> DNA <213> Sulfulobus acidicaldarius <400> 31 atgagttact ttgacaacta ttttaatgag attgttaatt ctgtaaacga cattattaag 60 agctatatat ctggagatgt tcctaaacta tatgaagcct catatcattt gtttacatct 120 ggaggtaaga ggttaagacc attaatctta actatatcat cagatttatt cggaggacag 180 agagaaagag cttattatgc aggtgcagct attgaagttc ttcatacttt tacgcttgtg 240 catgatgata ttatggatca agataatatc agaagagggt tacccacagt ccacgtgaaa 300 tacggcttac ccttagcaat attagctggg gatttactac atgcaaaggc ttttcagctc 360 ttaacccagg ctcttagagg tttgccaagt gaaaccataa ttaaggcttt cgatattttc 420 actcgttcaa taataattat atccgaagga caggcagtag atatggaatt tgaggacaga 480 attgatataa aggagcagga ataccttgac atgatctcac gtaagacagc tgcattattc 540 tcggcatcct caagtatagg cgcacttatt gctggtgcta atgataatga tgtaagactg 600 atgtctgatt tcggtacgaa tctaggtatt gcatttcaga ttgttgacga tatcttaggt 660 ctaacagcag acgaaaagga acttggaaag cctgttttta gtgatattag ggagggtaaa 720 aagactatac ttgtaataaa aacactggag ctttgtaaag aggacgagaa gaagattgtc 780 ctaaaggcgt taggtaataa gtcagcctca aaagaagaat taatgagctc agcagatata 840 attaagaaat actctttaga ttatgcatac aatttagcag agaaatatta taaaaatgct 900 atagactctt taaatcaagt ctcctctaag agtgatatac ctggaaaggc tttaaaatat 960 ctagctgaat ttacgataag aaggagaaaa taa 993 <210> 32 <211> 894 <212> DNA <213> Synechococcus sp. <400> 32 ttggttgccc aaaccttcaa cctggacacc tacttgagcc aacgccagca acaggtggaa 60 gaggcgcttt ctgcggcatt ggttcccgcc tatccggagc gcatttacga ggcgatgcgc 120 tacagcctgc tggcgggggg gaaacgcctg aggccgatcc tctgtctggc ggcctgtgag 180 ttggccggcg gctctgtgga gcaggccatg cccaccgcct gcgccctgga gatgatccac 240 accatgtcgc tgatccacga cgatctgccg gcgatggaca acgacgattt tcgccgcggc 300 aagcccacca atcacaaggt attcggcgag gatatcgcca ttttggcagg agatgccctg 360 ttggcctatg cctttgagca tatcgccagc caaacgcggg gggtgccgcc gcagttggtg 420 ctgcaagtca ttgcccgcat tggccatgct gtggcggcaa ccggcttggt agggggccag 480 gtggtggatc tggagtccga aggcaaagcc atttccctag aaactttgga gtacatccac 540 agtcacaaga cgggtgctct gctggaggcc tcggtggttt cgggagggat cctggcaggg 600 gccgatgagg agctgctggc gcggctgagc cactacgctc gggacatcgg cctggctttt 660 cagatcgtgg acgacatttt ggatgttact gccaccagcg agcaactggg caaaacggca 720 ggcaaggatc aagctgccgc caaagccacc taccccagct tgttgggcct agaggcttcc 780 cggcagaaag ctgaggaact gatccaatcg gccaaggagg cgttgcgccc ctacggatcc 840 caggccgagc ccctgttggc tctggccgat ttcatcaccc gccgccagca ttga 894 <210> 33 <211> 1116 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 33 atggcttcag tgactctagg ttcatggatt gttgttcacc accacaatca tcatcatcca 60 tcttcaatcc ttaccaaatc cagatccaga tcttgtccta taactcttac taaacccatc 120 tcctttcgat caaaacgcac cgtttcatca tcttcttcaa tcgtttcttc ttccgttgtt 180 acaaaagaag acaatctacg ccaatctgaa ccatcctctt tcgatttcat gtcgtacatc 240 atcaccaaag ccgaattagt caacaaagct ttagattcag ctgttcctct ccgtgagcca 300 ctcaagatcc acgaagcgat gcgttactct cttctcgccg gtggcaaaag agttagacca 360 gttctctgca tcgctgcttg tgaactcgtc ggaggtgaag aatcaaccgc tatgccagca 420 gcttgcgccg tcgagatgat tcacaccatg tcgttgatcc acgacgatct cccttgtatg 480 gataacgacg atctccgccg tggaaaaccg accaaccaca aagtgtttgg tgaagacgtc 540 gctgttttag ccggagacgc gcttctctct ttcgctttcg agcatttagc ttcggcgacg 600 agttctgatg ttgtttctcc ggtgagagtg gttcgagccg ttggagaatt ggctaaagcg 660 ataggaacag aagggttagt ggcgggtcaa gtcgtggata ttagtagtga agggttagat 720 ttaaacgacg tcggtttaga gcatttggag tttatccatt tgcataaaac ggcggcgttg 780 cttgaagctt ctgctgtttt gggagctatt gttggtggag gaagtgatga tgagattgag 840 aggttaagaa agtttgcgag atgtattggt ttgttgtttc aggtggttga tgatatcttg 900 gatgtgacga aatcgtcgaa agagttaggg aaaactgctg ggaaagattt gattgctgat 960 aagttgacgt atcctaagat tatgggtttg gagaaatcga gagagtttgc tgagaaattg 1020 aatagagagg ctcgtgatca gcttttaggg tttgattctg ataaggttgc tcctttgttg 1080 gctttggcta attacattgc ctatagacag aactga 1116 <210> 34 <211> 2364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 atgaaaaccg ggtttatctc accagcaaca gtatttcatc acagaatctc accagcgacc 60 actttcagac atcacttatc acctgctact acaaactcta caggcattgt cgccttaaga 120 gacatcaact tcagatgtaa agcagtttct aaagagtact ctgatctgtt gcagaaagat 180 gaggcttctt tcacaaaatg ggacgatgac aaggtgaaag atcatcttga taccaacaaa 240 aacttatacc caaatgatga gattaaggaa tttgttgaat cagtaaaggc tatgttcggt 300 agtatgaatg acggggagat aaacgtctct gcatacgata ctgcatgggt tgctttggtt 360 caagatgtcg atggatcagg tagtcctcag ttcccttctt ctttagaatg gattgccaac 420 aatcaattgt cagatggatc atggggagat catttgctgt tctcagctca cgatagaatc 480 atcaacacat tagcatgcgt tattgcactt acaagttgga atgttcatcc ttctaagtgt 540 gaaaaaggtt tgaattttct gagagaaaac atttgcaaat tagaagatga aaacgcagaa 600 catatgccaa ttggttttga agtaacattc ccatcactaa ttgatatcgc gaaaaagttg 660 aacattgaag tacctgagga tactccagca cttaaagaga tctacgcacg tagagatatc 720 aagttaacta agatcccaat ggaagttctt cacaaggtac ctactacttt gttacattct 780 ttggaaggaa tgcctgattt ggagtgggaa aaactgttaa agctacaatg taaagatggt 840 agtttcttgt tttccccatc tagtaccgca ttcgccctaa tgcaaacaaa agatgagaaa 900 tgcttacagt atctaacaaa tatcgtcact aagttcaacg gtggcgtgcc taatgtgtac 960 ccagtcgatt tgtttgaaca tatttgggtt gttgatagac tgcagagatt ggggattgcc 1020 agatacttca aatcagagat aaaagattgt gtagagtata tcaataagta ctggaccaaa 1080 aatggaattt gttgggctag aaatactcac gttcaagata tcgatgatac agccatggga 1140 ttcagagtgt tgagagcgca cggttatgac gtcactccag atgtttttag acaatttgaa 1200 aaagatggta aattcgtttg ctttgcaggg caatcaacac aagccgtgac aggaatgttt 1260 aacgtttaca gagcctctca aatgttgttc ccaggggaga gaattttgga agatgccaaa 1320 aagttctctt acaattactt aaaggaaaag caaagtacca acgaattgct ggataaatgg 1380 ataatcgcta aagatctacc tggtgaagtt ggttatgctc tggatatccc atggtatgct 1440 tccttaccaa gattggaaac tcgttattac cttgaacaat acggcggtga agatgatgtc 1500 tggataggca agacattata cagaatgggt tacgtgtcca ataacacata tctagaaatg 1560 gcaaagctgg attacaataa ctatgttgca gtccttcaat tagaatggta cacaatacaa 1620 caatggtacg tcgatattgg tatagagaag ttcgaatctg acaacatcaa gtcagtcctg 1680 gtttcttact acttggctgc ggcttcaata ttcgaacctg agagatctaa ggagagaatc 1740 gcttgggcaa agacaacaat cttagtcgat aagatcacat caattttcga ttcctctcag 1800 tcaagtaagg aagatattac tgcctttatt gacaagtttc gtaacaagtc ctcctctaaa 1860 aagcactcta tcaacggtga accatggcat gaagttatgg tagctttgaa aaagacctta 1920 cacggctttg ctctggatgc tcttatgact cattctcaag atatacatcc acagttacat 1980 caagcctggg aaatgtggtt gactaaacta caagacggcg tagatgttac tgctgagcta 2040 atggtccaaa tgatcaacat gactgctggc agatgggtat caaaggaatt acttactcat 2100 ccacaatatc aaagattgtc tactgtgaca aattctgtgt gtcacgatat taccaaactt 2160 cacaatttca aggagaattc caccacagtg gattcaaagg ttcaggaact agtccagttg 2220 gtttttagtg acacaccaga tgatttggat caagatatga aacaaacatt cctgacagtg 2280 atgaagacat tctactacaa ggcgtggtgt gatccaaaca ctataaacga tcatatatct 2340 aaagttttcg aaatcgtaat ttga 2364 <210> 35 <211> 1584 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 35 atgcctgatg cacacgatgc tccacctcca caaataagac agagaacact agtagatgag 60 gctacccaac tgctaactga gtccgcagaa gatgcatggg gtgaagtcag tgtgtcagaa 120 tacgaaacag caaggctagt tgcccatgct acatggttag gtggacacgc cacaagagtg 180 gccttccttc tggagagaca acacgaagac gggtcatggg gtccaccagg tggatatagg 240 ttagtcccta cattatctgc tgttcacgca ttattgacat gtcttgcctc tcctgctcag 300 gatcatggcg ttccacatga tagactttta agagctgttg acgcaggctt gactgccttg 360 agaagattgg ggacatctga ctccccacct gatactatag cagttgagct ggttatccca 420 tctttgctag agggcattca acacttactg gaccctgctc atcctcatag tagaccagcc 480 ttctctcaac atagaggctc tcttgtttgt cctggtggac tagatgggag aactctagga 540 gctttgagat cacacgccgc agcaggtaca ccagtaccag gaaaagtctg gcacgcttcc 600 gagactttgg gcttgagtac cgaagctgct tctcacttgc aaccagccca aggtataatc 660 ggtggctctg ctgctgccac agcaacatgg ctaaccaggg ttgcaccatc tcaacagtca 720 gattctgcca gaagatacct tgaggaatta caacacagat actctggccc agttccttcc 780 attaccccta tcacatactt cgaaagagca tggttattga acaattttgc agcagccggt 840 gttccttgtg aggctccagc tgctttgttg gattccttag aagcagcact tacaccacaa 900 ggtgctcctg ctggagcagg attgcctcca gatgctgatg atacagccgc tgtgttgctt 960 gcattggcaa cacatgggag aggtagaaga ccagaagtac tgatggatta caggactgac 1020 gggtatttcc aatgctttat tggggaaagg actccatcaa tttcaacaaa cgctcacgta 1080 ttggaaacat tagggcatca tgtggcccaa catccacaag atagagccag atacggatca 1140 gccatggata ccgcatcagc ttggctgctg gcagctcaaa agcaagatgg ctcttggtta 1200 gataaatggc atgcctcacc atactacgct actgtttgtt gcacacaagc cctagccgct 1260 catgcaagtc ctgcaactgc accagctaga cagagagctg tcagatgggt tttagccaca 1320 caaagatccg atggcggttg gggtctatgg cattcaactg ttgaagagac tgcttatgcc 1380 ttacagatct tggccccacc ttctggtggt ggcaatatcc cagtccaaca agcacttact 1440 agaggcagag caagattgtg tggagccttg ccactgactc ctttatggca tgataaggat 1500 ttgtatactc cagtaagagt agtcagagct gccagagctg ctgctctgta cactaccaga 1560 gatctattgt taccaccatt gtaa 1584 <210> 36 <211> 1551 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 atgaacgccc tatccgaaca cattttgtct gaattgagaa gattattgtc tgaaatgagt 60 gatggcggat ctgttggtcc atctgtgtat gatacggccc aggccctaag attccacggt 120 aacgtaacag gtagacaaga tgcatatgct tggttgatcg cccagcaaca agcagatgga 180 ggttggggct ctgccgactt tccactcttt agacatgctc caacatgggc tgcacttctc 240 gcattacaaa gagctgatcc acttcctggc gcagcagacg cagttcagac cgcaacaaga 300 ttcttgcaaa gacaaccaga tccatacgct catgccgttc ctgaggatgc ccctattggt 360 gctgaactga tcttgcctca gttttgtgga gaggctgctt ggttgttggg aggtgtggcc 420 ttccctagac acccagccct attaccatta agacaggctt gtttagtcaa actgggtgca 480 gtcgccatgt tgccttcagg acacccattg ctccactcct gggaggcatg gggtacttct 540 ccaacaacag cctgtccaga cgatgatggt tctataggta tctcaccagc agctacagcc 600 gcctggagag cccaggctgt gaccagaggc tcaactcctc aagtgggcag agctgacgca 660 tacttacaaa tggcttcaag agcaacgaga tcaggcatag aaggagtctt ccctaatgtt 720 tggcctataa acgtattcga accatgctgg tcactgtaca ctctccatct tgccggtctg 780 ttcgcccatc cagcactggc tgaggctgta agagttatcg ttgctcaact tgaagcaaga 840 ttgggagtgc atggcctcgg accagcttta cattttgctg ccgacgctga tgatactgca 900 gttgccttat gcgttctgca tttggctggc agagatcctg cagttgacgc attgagacat 960 tttgaaattg gtgagctctt tgttacattc ccaggagaga gaaatgctag tgtctctacg 1020 aacattcacg ctcttcatgc tttgagattg ttaggtaaac cagctgccgg agcaagtgca 1080 tacgtcgaag caaatagaaa tccacatggt ttgtgggaca acgaaaaatg gcacgtttca 1140 tggctttatc caactgcaca cgccgttgca gctctagctc aaggcaagcc tcaatggaga 1200 gatgaaagag cactagccgc tctactacaa gctcaaagag atgatggtgg ttggggagct 1260 ggtagaggat ccactttcga ggaaaccgcc tacgctcttt tcgctttaca cgttatggac 1320 ggatctgagg aagccacagg cagaagaaga atcgctcaag tcgtcgcaag agccttagaa 1380 tggatgctag ctagacatgc cgcacatgga ttaccacaaa caccactctg gattggtaag 1440 gaattgtact gtcctactag agtcgtaaga gtagctgagc tagctggcct gtggttagca 1500 ttaagatggg gtagaagagt attagctgaa ggtgctggtg ctgcacctta a 1551 <210> 37 <211> 2364 <212> DNA <213> Stevia rebaudiana <400> 37 atgaagaccg gcttcatctc tcccgccacc gtcttccacc accgtatttc tccggcaacc 60 accttccgcc accacctttc tccggcgacc accaactcca ctggaattgt agctcttaga 120 gacatcaact tccggtgtaa agcggtatcc aaagagtact ctgatttact acaaaaagat 180 gaggcttcat ttaccaagtg ggacgatgac aaagtgaagg accatttgga cacaaataag 240 aatttgtatc caaacgatga gatcaaggag tttgttgaga gcgtgaaagc aatgtttggt 300 tctatgaatg acggagaaat aaatgtgtca gcgtatgata cggcttgggt tgcactcgtg 360 caagatgttg atggaagtgg ttcccctcaa tttccatcaa gtttggagtg gatcgcgaac 420 aatcaactct cagatgggtc ttggggcgat catttgttat tttcggctca tgataggatc 480 attaacacgt tggcatgtgt tatagcgctt acttcttgga acgtccatcc aagtaaatgt 540 gaaaaaggac tgaattttct tagagaaaac atatgtaaac tcgaagacga gaacgcggaa 600 catatgccaa ttggttttga agtcacgttc ccgtcgctaa tagatatcgc aaagaagcta 660 aatattgaag ttcctgagga tactcctgcc ttaaaagaaa tttatgcaag aagagacata 720 aaactcacaa agataccaat ggaagtattg cacaaagtgc ccacaacttt acttcatagt 780 ttggaaggaa tgccagattt ggaatgggaa aaacttctga aattgcaatg caaagatgga 840 tcatttctgt tttctccatc atctactgct tttgcactca tgcaaacaaa agatgaaaag 900 tgtcttcagt atttgacaaa tattgttacc aaattcaatg gtggagttcc gaatgtgtac 960 ccggtggatc tattcgaaca tatttgggta gttgatcgac ttcaacgact tgggattgct 1020 cgttatttca aatcagagat caaagattgc gttgaatata ttaacaagta ttggacaaag 1080 aatgggattt gttgggcaag aaacacgcac gtacaagata ttgatgatac cgcaatggga 1140 tttagggttt taagagcaca tggttatgat gttactccag atgtatttcg acaatttgag 1200 aaggatggta aattcgtatg tttcgctgga cagtcaacac aagccgtcac cggaatgttc 1260 aatgtgtata gagcgtcaca aatgctcttt cccggagaaa gaattcttga agatgcaaag 1320 aaattttcat ataattattt gaaagaaaaa caatcgacaa atgagcttct tgataaatgg 1380 atcatcgcca aagacttacc tggagaggtt ggatatgcgc tagacatacc atggtatgca 1440 agcttaccgc gactcgagac aagatattac ttagagcaat acgggggcga ggatgatgtt 1500 tggattggaa aaactctata caggatggga tatgtgagca ataatacgta ccttgaaatg 1560 gccaaattgg actacaataa ctatgtggcc gtgcttcaac tcgaatggta cactatccag 1620 caatggtatg ttgatatcgg tatcgaaaag tttgaaagtg acaatatcaa aagcgtatta 1680 gtgtcgtatt acttggctgc agccagcata ttcgagccgg aaaggtccaa ggaacgaatc 1740 gcgtgggcta aaaccaccat attagttgac aagatcacct caatttttga ttcatcacaa 1800 tcctcaaaag aggacataac agcctttata gacaaattta ggaacaaatc gtcttctaag 1860 aagcattcaa taaatggaga accatggcac gaggtgatgg ttgcactgaa aaagacccta 1920 cacggcttcg ctttggatgc actcatgact catagtcaag acatccaccc gcaactccat 1980 caagcttggg agatgtggtt gacgaaattg caagatggag tagatgtgac agcggaatta 2040 atggtacaaa tgataaatat gacagctggt cgttgggtat ccaaagaact tttaactcat 2100 cctcaatacc aacgcctctc aaccgtcaca aatagtgtgt gtcacgatat aactaagctc 2160 cataacttca aggagaattc cacgacggta gactcgaaag ttcaagaact agtgcaactt 2220 gtgtttagcg acacgcccga tgatcttgat caggatatga aacagacgtt tctaaccgtc 2280 atgaaaacct tctactacaa ggcgtggtgt gatccgaaca cgataaatga ccatatctcc 2340 aaggtgttcg agattgtaat atga 2364 <210> 38 <211> 1584 <212> DNA <213> Streptomyces clavuligerus <400> 38 ttgcccgacg cgcatgatgc ccctccgcct cagatacgac agcggaccct tgtcgatgag 60 gcgacgcaac tcctcacgga gtcggccgag gacgcctggg gtgaggtgtc cgtgtccgag 120 tacgaaacgg cgcggctggt ggcccacgcc acctggctcg gcggtcacgc cacacgggtg 180 gccttcctgc tggagcggca gcatgaggac ggctcgtggg gcccgcccgg cgggtaccgt 240 ctcgtaccca cgctgagtgc cgtacacgcc ctgctcacct gtctggcgtc tcccgcgcag 300 gaccacggag tgcctcatga ccggctcctg cgcgcagttg acgcgggcct gacggcactg 360 cgtcgtcttg ggacgagcga cagcccgccg gacaccattg cggtcgaact ggtcataccc 420 tcgctccttg agggcatcca gcacctcctg gacccggcgc acccgcattc ccgacccgct 480 ttttcgcaac accgcggcag cctcgtctgc cccgggggcc tcgacggccg cacgctgggg 540 gccttgcgct cccacgccgc agccggcaca cctgtcccgg gcaaggtgtg gcacgcctcg 600 gaaaccttgg ggctatcgac cgaggcagcc tcccaccttc aacccgccca gggcatcatc 660 ggtggctccg ccgccgcgac agcaacatgg ctcaccaggg tcgccccgtc gcaacagagc 720 gacagcgcac ggcgctacct ggaagaactc cagcaccgat acagcggccc ggtgccctcc 780 atcaccccga tcacctattt cgaacgggcc tggctgctca acaacttcgc tgccgcgggg 840 gttccatgcg aggctccggc agcccttctc gacagcctgg aggcagcgct cacaccacag 900 ggcgctccag cgggtgcggg actgccgccg gacgcggatg acaccgccgc cgttctgctg 960 gcgcttgcca cgcacggccg cgggcgccgt cccgaggtcc tcatggacta ccgcacggac 1020 ggctacttcc agtgcttcat cggcgaacgc accccttcca tcagcaccaa tgcccatgtc 1080 ctggagacgc tcggtcacca cgtcgcccaa caccctcagg acagggcccg atacggctca 1140 gccatggaca ccgcatcagc gtggctcctc gcggctcaga agcaggatgg cagctggctc 1200 gacaagtggc acgcctcccc ctactacgcc accgtctgct gcacccaggc actggcagcc 1260 cacgcttccc ctgccaccgc ccccgcacgg cagcgtgctg tgcggtgggt gctggcaaca 1320 caacgctcgg acggcggctg gggcctgtgg cactccacgg tcgaggagac cgcctacgcc 1380 ctgcagatcc tcgccccacc ttccggcggc gggaacatcc ccgtgcaaca ggcgctcacc 1440 agggggcgcg cccgcctctg cggcgctttg ccgctgactc ccctatggca tgacaaggac 1500 ctgtacacgc cggtacgtgt cgtccgcgcc gcccgtgccg ccgccctgta caccacccgt 1560 gacctgcttc tgccgcccct gtga 1584 <210> 39 <211> 1551 <212> DNA <213> Bradyrhizobium japonicum <400> 39 gtgaacgcgc tgtccgaaca tatcctttcc gaattgcgcc gcctgctgag cgaaatgagc 60 gatggcggca gcgtcggtcc gtccgtctac gacacggcgc aggcgctgcg cttccacggc 120 aacgtcaccg gtcggcagga cgcatacgcg tggctcatcg cgcagcaaca ggccgacggc 180 ggatggggaa 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600 gtcaggctca tatcacgcat ctcagccaga gtgtttctcg gtccagagca ctgccgcaac 660 caagaatggt tgacgaccac tgcagagtac agcgagagcc tgttcataac tggctttatt 720 ctccgcgttg tcccccatat tctaagacca ttcatagccc cgctgctacc ctcctacaga 780 acactacttc gcaacgtctc gtcaggtcga agagttattg gagacatcat tcgctcccag 840 caaggtgatg gcaacgagga catcctgtca tggatgaggg atgctgcgac aggggaagaa 900 aagcaaattg acaacattgc ccagcggatg cttatcctga gtctcgcgtc tattcacact 960 acggcaatga cgatgacgca tgctatgtat gacttatgtg cttgccctga gtacatagag 1020 cctcttagag atgaggtcaa aagtgtcgtt ggcgctagtg gttgggacaa gacggcgttg 1080 aatcgattcc acaaactcga cagctttctc aaagagtcac aacgcttcaa ccccgtgttc 1140 ctcttaacgt tcaatcgcat ttatcaccaa tccatgacac tctcagatgg caccaacatc 1200 ccatcaggca ctcgcatcgc ggttccctct cacgcgatgc ttcaggactc agcgcatgtc 1260 ccaggcccga cgccaccaac cgagtttgat ggatttagat actcaaagat tcgctcagac 1320 tcaaactatg cacagaaata tctcttctcc atgactgatt ctagtaacat ggcgtttggg 1380 tatgggaaat acgcctgccc agggcggttc tatgcatcta atgagatgaa gctgactttg 1440 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600 aggatggtgg cagggaagcg ttatttcagt gcttcagatg caagtgaaaa taaacaggcg 660 cagaggtgcc ggagagtgtt cagggaattc tttcatttgt cagggctctt tgtggtggcg 720 gacgctattc catttcttgg atggctcgac tgggggagac atgagaaaac cctaaagaag 780 acagcaatag aaatggacag tattgctcaa gaatggttag aggagcaccg tcggaggaaa 840 gactccggtg atgataatag tacgcaagac ttcatggatg tgatgcagtc agttcttgat 900 ggcaaaaacc ttggtggtta cgacgctgat accatcaata aagccacatg cctgactcta 960 atctccggag gtagcgacac aactgttgtc tctctaacat gggcactctc tcttgtacta 1020 aacaaccgtg acaccttaaa aaaagctcaa gaagaattag acatccaagt tggtaaggaa 1080 agattagtga atgaacaaga tataagtaag ttggtctatc tccaagccat tgttaaagag 1140 acattacggt tatatccacc aggaccactt ggaggactac gccaatttac cgaggattgc 1200 accttgggtg gataccatgt ctctaaaggc acccgtttaa taatgaacct ttcgaagatc 1260 caaaaggatc caagaatttg gtcagatccg acagaattcc aaccagagag gtttctcacc 1320 acccataaag atgttgatcc tcggggaaaa cattttgagt ttataccatt tggagctggt 1380 cgaagagcat gtccaggaat aacttttggt cttcaagtat tacatttaac attggctagt 1440 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 atgcaatcag attcagtcaa agtctctcca tttgatttgg tttccgctgc tatgaatggc 60 aaggcaatgg aaaagttgaa cgctagtgaa tctgaagatc caacaacatt gcctgcacta 120 aagatgctag ttgaaaatag agaattgttg acactgttca caacttcctt cgcagttctt 180 attgggtgtc ttgtatttct aatgtggaga cgttcatcct ctaaaaagct ggtacaagat 240 ccagttccac aagttatcgt tgtaaagaag aaagagaagg agtcagaggt tgatgacggg 300 aaaaagaaag tttctatttt ctacggcaca caaacaggaa ctgccgaagg ttttgctaaa 360 gcattagtcg aggaagcaaa agtgagatat gaaaagacct ctttcaaggt tatcgatcta 420 gatgactacg ctgcagatga tgatgaatat gaggaaaaac tgaaaaagga atccttagcc 480 ttcttcttct tggccacata cggtgatggt gaacctactg ataatgctgc taacttctac 540 aagtggttca cagaaggcga cgataaaggt gaatggctga aaaagttaca atacggagta 600 tttggtttag gtaacagaca atatgaacat ttcaacaaga tcgctattgt agttgatgat 660 aaacttactg aaatgggagc caaaagatta gtaccagtag gattagggga tgatgatcag 720 tgtatagaag atgacttcac cgcctggaag gaattggtat ggccagaatt ggatcaactt 780 ttaagggacg aagatgatac ttctgtgact accccataca ctgcagccgt attggagtac 840 agagtggttt accatgataa accagcagac tcatatgctg aagatcaaac ccatacaaac 900 ggtcatgttg ttcatgatgc acagcatcct tcaagatcta atgtggcttt caaaaaggaa 960 ctacacacct ctcaatcaga taggtcttgt actcacttag aattcgatat ttctcacaca 1020 ggactgtctt acgaaactgg cgatcacgtt ggcgtttatt ccgagaactt gtccgaagtt 1080 gtcgatgaag cactaaaact gttagggtta tcaccagaca catacttctc agtccatgct 1140 gataaggagg atgggacacc tatcggtggt gcttcactac caccaccttt tcctccttgc 1200 acattgagag acgctctaac cagatacgca gatgtcttat cctcacctaa aaaggtagct 1260 ttgctggcat tggctgctca tgctagtgat cctagtgaag ccgataggtt aaagttcctg 1320 gcttcaccag ccggaaaaga tgaatatgca caatggatcg tcgccaacca acgttctttg 1380 ctagaagtga tgcaaagttt tccatctgcc aagcctccat taggtgtgtt cttcgcagca 1440 gtagctccac gtttacaacc aagatactac tctatcagtt catctcctaa gatgtctcct 1500 aacagaatac atgttacatg tgctttggtg tacgagacta ctccagcagg cagaattcac 1560 agaggattgt gttcaacctg gatgaaaaat gctgtccctt taacagagtc acctgattgc 1620 tctcaagcat ccattttcgt tagaacatca aatttcagac ttccagtgga tccaaaagtt 1680 ccagtcatta tgataggacc aggcactggt cttgccccat tcaggggctt tcttcaagag 1740 agattggcct tgaaggaatc tggtacagaa ttgggttctt ctatcttttt ctttggttgc 1800 cgtaatagaa aagttgactt tatctacgag gacgagctta acaattttgt tgagacagga 1860 gcattgtcag aattgatcgt cgcattttca agagaaggga ctgccaaaga gtacgttcag 1920 cacaagatga gtcaaaaagc ctccgatata tggaaacttc taagtgaagg tgcctatctt 1980 tatgtctgtg gcgatgcaaa gggcatggcc aaggatgtcc atagaactct gcatacaatt 2040 gttcaggaac aagggagtct ggattcttcc aaggctgaat tgtacgtcaa aaacttacag 2100 atgtctggaa gatacttaag agatgtttgg taa 2133 <210> 71 <211> 2079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 atgacttctg cactttatgc ctccgatctt ttcaaacaat tgaaaagtat catgggaacg 60 gattctttgt ccgatgatgt tgtattagtt attgctacaa cttctctggc actggttgct 120 ggtttcgttg tcttattgtg gaaaaagacc acggcagatc gttccggcga gctaaagcca 180 ctaatgatcc ctaagtctct gatggcgaaa gatgaggatg atgacttaga tctaggttct 240 ggaaaaacga gagtctctat cttcttcggc acacaaaccg gaacagccga aggattcgct 300 aaagcacttt cagaagagat caaagcaaga tacgaaaagg cggctgtaaa agtaatcgat 360 ttggatgatt acgctgccga tgatgaccaa tatgaggaaa agttgaaaaa ggaaacattg 420 gctttctttt gtgtagccac gtatggtgat ggtgaaccaa ccgataacgc cgcaagattc 480 tacaagtggt ttactgaaga gaacgaaaga gatatcaagt tgcagcaact tgcttacggc 540 gtttttgcct taggtaacag acaatacgag cactttaaca agataggtat tgtcttagat 600 gaagagttat gcaaaaaggg tgcgaagaga ttgattgaag tcggtttagg agatgatgat 660 caatctatcg aggatgactt taatgcatgg aaggaatctt tgtggtctga attagataag 720 ttacttaagg acgaagatga taaatccgtt gccactccat acacagccgt cattccagaa 780 tatagagtag ttactcatga tccaagattc acaacacaga aatcaatgga aagtaatgtg 840 gctaatggta atactaccat cgatattcat catccatgta gagtagacgt tgcagttcaa 900 aaggaattgc acactcatga atcagacaga tcttgcatac atcttgaatt tgatatatca 960 cgtactggta tcacttacga aacaggtgat cacgtgggtg tctacgctga aaaccatgtt 1020 gaaattgtag aggaagctgg aaagttgttg ggccatagtt tagatcttgt tttctcaatt 1080 catgccgata 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cgcatcggaa tcggaagatc cgacgacgct accggcgttg 120 aagatgctgg tggagaatcg cgagctgctg acactgttta cgacgtcgtt tgctgtattg 180 atcggatgtc tcgtgttttt gatgtggcgg agatcgtcct cgaagaaact ggttcaggat 240 ccggtgccgc aggtaatcgt tgttaagaag aaagagaagg agtctgaggt tgatgatggc 300 aagaagaaag tttcgatatt ctacggaact caaacaggaa ccgctgaagg ttttgccaag 360 gcacttgtag aggaagctaa agttcgatat gaaaagacat cctttaaagt tattgatctg 420 gatgattatg ctgctgatga cgatgagtat gaggagaagc ttaagaaaga atctttggcg 480 tttttctttt tggcaacgta tggagatggt gaaccaacag ataatgcagc caatttttac 540 aaatggttta cagagggaga tgacaaaggc gaatggctga agaaacttca atatggcgtg 600 tttggcctcg gtaacagaca atatgagcat ttcaataaga ttgcaatagt ggttgatgac 660 aaactcacag aaatgggcgc aaaacgcctt gttcctgtgg gtcttggaga tgacgatcaa 720 tgtatagaag atgactttac agcatggaaa gagttagtgt ggcccgagtt ggatcaattg 780 ttgcgtgatg aggatgacac gagtgttacg actccttaca ctgctgcggt tttggaatac 840 cgagttgtat atcatgataa acctgcagac tcgtatgcag aagatcaaac tcatacaaat 900 ggtcatgttg ttcatgatgc tcaacatcca 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fujikuroi <400> 75 atggctgaac tcgacactct ggacatcgtc gtcctcggcg ttatcttcct cggaacggtt 60 gcatacttta caaagggcaa gctatggggt gttaccaagg atccctacgc gaatggcttc 120 gctgccggcg gcgcttctaa gccgggtcgc acgaggaaca tcgtcgaggc aatggaagaa 180 tccggcaaga actgtgttgt cttctatggt tctcagaccg gtactgctga agattatgct 240 tctcgcctcg ccaaggaggg taagagtcga ttcggactaa acaccatgat tgccgatctt 300 gaggactacg atttcgacaa cctggatacc gttcccagtg acaacattgt catgttcgtt 360 ctcgcaactt atggtgaagg tgagcctacc gataacgcgg tcgacttcta tgaattcatt 420 accggcgagg atgccagctt caatgagggc aatgatcctc cgctgggcaa cctcaactac 480 gttgctttcg gtctcggaaa caacacgtac gagcactaca actctatggt ccgcaatgtt 540 aacaaggctc tcgagaagct tggcgctcac cgcatcggtg aagctggtga gggtgatgat 600 ggtgctggta ccatggaaga ggacttcttg gcctggaagg atcccatgtg ggaagccctc 660 gctaagaaaa tgggactgga agagcgtgaa gcagtctacg agcctatttt tgccattaac 720 gaacgcgacg acctgactcc tgaagccaat gaagtgtatc tcggtgagcc caacaagctg 780 catctcgaag gcaccgccaa gggaccattc aactctcaca acccctacat tgcccctatc 840 gctgaatctt atgagttgtt ctccgccaag gacagaaact gcctccacat ggaaattgac 900 atcagcggtt ctaacctcaa gtacgaaact ggagaccata ttgctatctg gcctaccaac 960 cctggtgagg aggtcaacaa attcctggat attctcgacc tctctggaaa gcagcacagc 1020 gttgtcactg tcaaggctct cgagcctacc gccaaggttc ctttccccaa ccctacaacc 1080 tacgatgcca ttctgcgata ccacctcgag atctgcgctc ctgtttcacg tcaattcgtc 1140 tctactctcg ccgcatttgc tcccaacgat gatatcaagg ctgagatgaa ccgccttggc 1200 agcgataagg attatttcca cgagaagact ggcccgcatt actacaacat tgcccgtttc 1260 cttgccagcg tcagcaaggg cgagaagtgg accaaaatcc cgttctctgc cttcatcgag 1320 ggtctcacca agctccagcc ccgttactac tccatttctt cctcgtctct ggttcagccc 1380 aagaaaatct cgatcactgc cgtcgttgaa tcccagcaga ttcctggccg ggatgatcct 1440 ttccgtggtg ttgctacaaa ctatcttttt gccctaaagc aaaagcagaa cggtgacccc 1500 aaccctgcac cttttggtca gagctacgag cttacaggcc cccgcaataa gtatgatggc 1560 atccacgttc ctgtccatgt tcgtcactcc aacttcaagc tcccctcgga ccccggtaag 1620 cccatcatca tgattggtcc tggtactggt gtcgctccct tccgcggttt cgtgcaggag 1680 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gaggattaga gagttcgttc aatatttgct tagactaggt 2340 gaaaaaaaga ctggatctag cgaaaccagg caaacatttt taagtatagt gaaatcatgt 2400 tactatgctg ctcattgccc acctcatgtc gttgatagac acattagtag agtgattttc 2460 gagccagtaa gtgccgcaaa gtaaccgcgg 2490 <210> 81 <211> 827 <212> PRT <213> Zea mays <400> 81 Met Val Leu Ser Ser Ser Cys Thr Thr Val Pro His Leu Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ala Val Val Gln Leu Gly Pro Trp Ser Ser Arg Ile Lys Lys Lys Thr 20 25 30 Asp Thr Val Ala Val Pro Ala Ala Ala Gly Arg Trp Arg Arg Ala Leu 35 40 45 Ala Arg Ala Gln His Thr Ser Glu Ser Ala Ala Val Ala Lys Gly Ser 50 55 60 Ser Leu Thr Pro Ile Val Arg Thr Asp Ala Glu Ser Arg Arg Thr Arg 65 70 75 80 Trp Pro Thr Asp Asp Asp Asp Ala Glu Pro Leu Val Asp Glu Ile Arg 85 90 95 Ala Met Leu Thr Ser Met Ser Asp Gly Asp Ile Ser Val Ser Ala Tyr 100 105 110 Asp Thr Ala Trp Val Gly Leu Val Pro Arg Leu Asp Gly Gly Glu Gly 115 120 125 Pro Gln Phe Pro Ala Ala Val Arg Trp Ile Arg Asn Asn Gln Leu Pro 130 135 140 Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Ala Leu Phe Ser Ala 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gatactgtta ttgactgggt accaggtatg gaaggtataa gacttaaaga ttttcctttg 600 gattggtcta cagaccttaa tgataaagta ttgatgttta ctacagaagc tccacaaaga 660 tctcataagg tttcacatca tatctttcac acctttgatg aattggaacc atcaatcatc 720 aaaaccttgt ctctaagata caatcatatc tacactattg gtccattaca attacttcta 780 gatcaaattc ctgaagagaa aaagcaaact ggtattacat ccttacacgg ctactcttta 840 gtgaaagagg aaccagaatg ttttcaatgg ctacaaagta aagagcctaa ttctgtggtc 900 tacgtcaact tcggaagtac aacagtcatg tccttggaag atatgactga atttggttgg 960 ggccttgcta attcaaatca ttactttcta tggattatca ggtccaattt ggtaataggg 1020 gaaaacgccg tattacctcc agaattggag gaacacatca aaaagagagg tttcattgct 1080 tcctggtgtt ctcaggaaaa ggtattgaaa catccttctg ttggtggttt ccttactcat 1140 tgcggttggg gctctacaat cgaatcacta agtgcaggag ttccaatgat ttgttggcca 1200 tattcatggg accaacttac aaattgtagg tatatctgta aagagtggga agttggatta 1260 gaaatgggaa caaaggttaa acgtgatgaa gtgaaaagat tggttcagga gttgatgggg 1320 gaaggtggcc acaagatgag aaacaaggcc aaagattgga aggaaaaagc cagaattgct 1380 attgctccta acgggtcatc ctctctaaac attgataaga tggtcaaaga gattacagtc 1440 ttagccagaa actaagtcga c 1461 <210> 83 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 actagtaaaa tggcagagca acaaaagatc aaaaagtcac ctcacgtctt acttattcca 60 tttcctctgc aaggacatat caacccattc atacaatttg ggaaaagatt gattagtaag 120 ggtgtaaaga caacactggt aaccactatc cacactttga attctactct gaaccactca 180 aatactacta ctacaagtat agaaattcaa gctatatcag acggatgcga tgagggtggc 240 tttatgtctg ccggtgaatc ttacttggaa acattcaagc aagtgggatc caagtctctg 300 gccgatctaa tcaaaaagtt acagagtgaa ggcaccacaa ttgacgccat aatctacgat 360 tctatgacag agtgggtttt agacgttgct atcgaatttg gtattgatgg aggttccttt 420 ttcacacaag catgtgttgt gaattctcta tactaccatg tgcataaagg gttaatctct 480 ttaccattgg gtgaaactgt ttcagttcca ggttttccag tgttacaacg ttgggaaacc 540 ccattgatct tacaaaatca tgaacaaata caatcacctt ggtcccagat gttgtttggt 600 caattcgcta acatcgatca agcaagatgg gtctttacta attcattcta taagttagag 660 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<400> 84 actagtaaaa tggctacatc tgattctatt gttgatgaca ggaagcagtt gcatgtggct 60 actttccctt ggcttgcttt cggtcatata ctgccttacc tacaactatc aaaactgata 120 gctgaaaaag gacataaagt gtcattcctt tcaacaacta gaaacattca aagattatct 180 tcccacatat caccattgat taacgtcgtt caattgacac ttccaagagt acaggaatta 240 ccagaagatg ctgaagctac aacagatgtg catcctgaag atatccctta cttgaaaaag 300 gcatccgatg gattacagcc tgaggtcact agattccttg agcaacacag tccagattgg 360 atcatatacg actacactca ctattggttg ccttcaattg cagcatcact aggcatttct 420 agggcacatt tcagtgtaac cacaccttgg gccattgctt acatgggtcc atccgctgat 480 gctatgatta acggcagtga tggtagaact accgttgaag atttgacaac cccaccaaag 540 tggtttccat ttccaactaa agtctgttgg agaaaacacg acttagcaag actggttcca 600 tacaaggcac caggaatctc agacggctat agaatgggtt tagtccttaa agggtctgac 660 tgcctattgt ctaagtgtta ccatgagttt gggacacaat ggctaccact tttggaaaca 720 ttacaccaag ttcctgtcgt accagttggt ctattacctc cagaaatccc tggtgatgag 780 aaggacgaga cttgggtttc aatcaaaaag tggttagacg ggaagcaaaa aggctcagtg 840 gtatatgtgg cactgggttc cgaagtttta gtatctcaaa cagaagttgt ggaacttgcc 900 ttaggtttgg aactatctgg attgccattt gtctgggcct acagaaaacc aaaaggccct 960 gcaaagtccg attcagttga attgccagac ggctttgtcg agagaactag agatagaggg 1020 ttggtatgga cttcatgggc tccacaattg agaatcctga gtcacgaatc tgtgtgcggt 1080 ttcctaacac attgtggttc tggttctata gttgaaggac tgatgtttgg tcatccactt 1140 atcatgttgc caatctttgg tgaccagcct ttgaatgcac gtctgttaga agataaacaa 1200 gttggaattg aaatcccacg taatgaggaa gatggatgtt taaccaagga gtctgtggcc 1260 agatcattac gttccgttgt cgttgaaaag gaaggcgaaa tctacaaggc caatgcccgt 1320 gaactttcaa agatctacaa tgacacaaaa gtagagaagg aatatgtttc tcaatttgta 1380 gattacctag agaaaaacgc tagagccgta gctattgatc atgaatccta agtcgac 1437 <210> 85 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 actagtaaaa tggaaaacaa gaccgaaaca acagttagac gtaggcgtag aatcattctg 60 tttccagtac cttttcaagg gcacatcaat ccaatactac aactagccaa cgttttgtac 120 tctaaaggtt tttctattac aatctttcac accaatttca acaaaccaaa aacatccaat 180 tacccacatt tcacattcag attcatactt gataatgatc cacaagatga acgtatttca 240 aacttaccta cccacggtcc tttagctgga atgagaattc caatcatcaa tgaacatggt 300 gccgatgagc ttagaagaga attagagtta cttatgttgg catccgaaga ggacgaggaa 360 gtctcttgtc tgattactga cgctctatgg tactttgccc aatctgtggc tgatagtttg 420 aatttgagga gattggtact aatgacatcc agtctgttta actttcacgc tcatgttagt 480 ttaccacaat ttgacgaatt gggatacttg gaccctgatg acaagactag gttagaggaa 540 caggcctctg gttttcctat gttgaaagtc aaagatatca agtctgccta ttctaattgg 600 caaatcttga aagagatctt aggaaagatg atcaaacaga caaaggcttc atctggagtg 660 atttggaaca gtttcaaaga gttagaagag tctgaattgg agactgtaat cagagaaatt 720 ccagcacctt cattcctgat accattacca aaacatttga ctgcttcctc ttcctctttg 780 ttggatcatg acagaacagt ttttcaatgg ttggaccaac aaccacctag ttctgttttg 840 tacgtgtcat ttggtagtac ttctgaagtc gatgaaaagg acttccttga aatcgcaaga 900 ggcttagtcg atagtaagca gtcattcctt tgggtcgtgc gtccaggttt cgtgaaaggc 960 tcaacatggg tcgaaccact tccagatggt tttctaggcg aaagaggtag aatagtcaaa 1020 tgggttcctc aacaggaagt tttagctcat ggcgctattg gggcattctg gactcattcc 1080 ggatggaatt caactttaga atcagtatgc gaaggggtac ctatgatctt ttcagatttt 1140 ggtcttgatc aaccactgaa cgcaagatac atgtctgatg ttttgaaagt gggtgtatat 1200 ctagaaaatg gctgggaaag gggtgaaata gctaatgcaa taagacgtgt tatggttgat 1260 gaagaggggg agtatatcag acaaaacgca agagtgctga agcaaaaggc cgacgtttct 1320 ctaatgaagg gaggctcttc atacgaatcc ttagaatctc ttgtttccta catttcatca 1380 ctgtaagtcg ac 1392 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Thr Ser Phe Ala Glu Tyr Trp Asn Leu Leu Ser Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 1602 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 87 atgaccagct ttgccgagta ttggaatctg ttaagtccca cttcttttgc agaatattgg 60 aaccttctat caccgacgag tttcgcggag tactggaatt tgttttctcc aacatcgttc 120 gctgaatact ggaacttact cagccctgct agtaaaatgg atgcaatggc aactactgag 180 aaaaagcctc atgtgatctt cattccattt cctgcacaat ctcacataaa ggcaatgcta 240 aagttagcac aactattaca ccataaggga ttacagataa ctttcgtgaa taccgacttc 300 atccataatc aatttctgga atctagtggc cctcattgtt tggacggagc cccagggttt 360 agattcgaaa caattcctga cggtgtttca cattccccag aggcctccat cccaataaga 420 gagagtttac tgaggtcaat agaaaccaac tttttggatc gtttcattga cttggtcaca 480 aaacttccag acccaccaac ttgcataatc tctgatggct ttctgtcagt gtttactatc 540 gacgctgcca aaaagttggg tatcccagtt atgatgtact ggactcttgc tgcatgcggt 600 ttcatgggtt tctatcacat ccattctctt atcgaaaagg gttttgctcc actgaaagat 660 gcatcatact taaccaacgg ctacctggat actgttattg actgggtacc aggtatggaa 720 ggtataagac ttaaagattt tcctttggat tggtctacag accttaatga taaagtattg 780 atgtttacta cagaagctcc acaaagatct cataaggttt cacatcatat ctttcacacc 840 tttgatgaat tggaaccatc aatcatcaaa accttgtctc taagatacaa tcatatctac 900 actattggtc cattacaatt acttctagat caaattcctg aagagaaaaa gcaaactggt 960 attacatcct tacacggcta ctctttagtg aaagaggaac cagaatgttt tcaatggcta 1020 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tacctgcctt atagagatta caattactcc 1560 ttggtaatgg gagcttgttg tgaaaatgtc attgggtaca tgccaattcc agtgggtgtc 1620 gccggtccac tatgtttgga cggtaaggaa tttcaagtac ctatggcaac gactgaaggc 1680 tgcttagttg catctacaaa cagaggttgt agagccattg gattaggtgg cggtgcttct 1740 tcaagagtct tggctgacgg tatgactaga ggtcctgttg tgagatttcc tagggcctgt 1800 gactctgcag aagttaaggc ttggttggaa actccagaag gtttcaccgt aatcaaagag 1860 gcctttgatt ccacatcaag ggtggccaga ttacaaaaac tacacatgtc tgtcgctggg 1920 agaaatctgt atatcagatt tcaatccaga tccggcgacg caatgggtat gaatatgatt 1980 tcaaaaggga cagaaaaggc tttgtcaaag ctgcaggagt atttcccaga gatgcaaatc 2040 ttggccgtat ctggcaacta ttgcacagac aaaaagcctg ccgccatcaa ctggattgaa 2100 ggaagaggca aatctgtggt ttgtgaagct gtaattccag ccaaagttgt tagagaagtg 2160 ttaaagacca caacagaagc tatgattgaa gtaaacataa acaaaaactt agtagggtct 2220 gccatggctg gttcaattgg aggatacaac gctcatgctg ccaatattgt aaccgctatc 2280 tacatcgcat gtggacaaga tgctgcccaa aatgtcggtt cctcaaattg catcacattg 2340 atggaagcat ctggccctac aaacgaggat ttgtatatca gttgcacaat gccatctata 2400 gaaataggga ctgtgggagg aggaactaac ttacttccac agcaagcctg cttacaaatg 2460 ctgggtgtac aaggagcctg tagagataat ccaggggaga acgctagaca acttgccaga 2520 attgtttgtg ggacagttat ggctggtgaa cttagtctaa tggcagcttt ggctgctggg 2580 cacctggtga gatctcatat gattcataat agaagtaaga ttaaccttca agatttgcaa 2640 ggtacgtgta cgaaaaaggc tgcctaa 2667 <210> 110 <211> 888 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 110 Met Leu Ser Arg Leu Phe Arg Met His Gly Leu Phe Val Ala Ser His 1 5 10 15 Pro Trp Glu Val Ile Val Gly Thr Val Thr Leu Thr Ile Cys Met Met 20 25 30 Ser Met Asn Met Phe Thr Gly Asn Asn Lys Ile Cys Gly Trp Asn Tyr 35 40 45 Glu Cys Pro Lys Leu Glu Glu Asp Val Leu Ser Ser Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Thr Ile Thr Arg Cys Ile Ala Ile Leu Tyr Ile Tyr Phe Gln Phe 65 70 75 80 Gln Asn Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Tyr Ile Leu Gly Ile Ala Gly 85 90 95 Leu Phe Thr Ile Phe Ser Ser Phe Val Phe Ser Thr Val Val Ile His 100 105 110 Phe Leu Asp Lys Glu Leu Thr Gly Leu Asn Glu Ala Leu Pro Phe Phe 115 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 119 atgtccttag attcaagact gccagctttc agaaatctgt ctccagctgc aagactagat 60 cacattggcc aacttttggg actaagtcat gacgacgttt cccttttagc aaacgccggt 120 gctttaccaa tggatatcgc taatggtatg attgaaaatg taatcgggac ctttgaactg 180 ccatatgcag tggccagtaa ctttcagatc aatggccgtg acgtcttagt accattagtt 240 gtggaggaac ctagtatcgt tgctgcagcc tcttacatgg caaagttagc tagagccaat 300 ggtgggttca ctacatcttc atctgctcca ctaatgcatg cacaagtaca aattgtcggc 360 attcaggatc cactaaacgc aagattgtct ttactgcgta gaaaggatga gatcatagaa 420 ttagccaata ggaaggacca acttctgaat tcattgggcg gtggttgcag agacatagag 480 gtgcatacat ttgccgatac tccaagagga ccaatgcttg tagcacacct tattgtcgat 540 gtgcgtgatg ccatgggagc taatactgtt aacactatgg ctgaagcagt agcacctctg 600 atggaagcca taacaggtgg ccaggtaaga ttgagaatcc tttccaattt ggctgatctt 660 agattggcca gagcccaagt gagaatcact cctcagcaat tggaaactgc cgaattctca 720 ggtgaggcag taattgaggg tatcttggac gcatatgctt ttgccgctgt ggacccttac 780 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  1. UGT91D2 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 숙주.
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