MX2012014016A - Produccion recombinante de esteviol glucosidos. - Google Patents

Produccion recombinante de esteviol glucosidos.

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MX2012014016A
MX2012014016A MX2012014016A MX2012014016A MX2012014016A MX 2012014016 A MX2012014016 A MX 2012014016A MX 2012014016 A MX2012014016 A MX 2012014016A MX 2012014016 A MX2012014016 A MX 2012014016A MX 2012014016 A MX2012014016 A MX 2012014016A
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Jens Houghton-Larsen
Esben Halkjaer Hansen
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Sabina Tavares
Charlotte Blom
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Abstract

Se describen microorganismos, plantas, y células de planta recombinantes que ha sido diseñados por ingeniería para expresar genes recombinantes novedosos que codifican enzimas biosintéticas de esteviol y UDP-glicosiltransferasas (UGTs). Dichos microorganismos, plantas, o células de planta pueden producir esteviol o esteviol glucósidos, por ejemplo, rubusósido o Rebaudiósido A, lo cuales pueden ser utilizados como edulcorantes naturales en productos alimenticios y suplementos dietéticos.

Description

PRODUCCIÓN ECOMBINANTE DE ESTEVIOL GLUCÓSIDOS Lista de Secuencias La presente solicitud contiene un listado de secuencias, el cual ha sido presentado en formato ASCII por medio de EFS-Red Mundial y se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 2 de junio de 2011, con el nombre 25933W01.txt y tiene un tamaño de 483,406 bytes.
Campo de la Invención La presente descripción se refiere a la producción recombinante de esteviol y esteviol glucósidos. En particular, la presente descripción se refiere a la producción de esteviol y esteviol glucósidos, tales como rubusósido y/o rubaudiósido A, mediante huéspedes recombinantes tales como microorganismos recombinantes, plantas o células de plantas. La presente descripción también proporciona composiciones que contienen esteviol glucósidos.
Antecedentes de la Invención Los edulcorantes son bien conocidos como los ingredientes utilizados de manera más común en la industria de alimentos, bebidas o industrias de dulcería. El edulcorante puede ser incorporado, ya sea en el producto alimenticio final durante la producción o para uso independiente, cuando se diluye en forma adecuada, como un edulcorante de mesa, o en un reemplazo en el hogar de azúcares en pastelería. Los edulcorantes incluyen edulcorantes naturales tales como sacarosa, jarabe de maíz alto de fructosa, melaza, jarabe de maple y miel y edulcorantes artificiales tales como aspartame, sacarina y sucralosa. El extracto de estevia es un edulcorante natural que puede aislares y extraerse de un arbusto perene, la Stevia rebaudiana. La estevia crece de manera común en América del Sur y Asia, para la producción comercial de extracto de estevia.
El extracto de estevia, purificado hasta algunos grados, se utiliza comercialmente como un edulcorante de alta intensidad en alimentos y en mezclas o solo como edulcorante de mesa. Los extractos de la planta de Stevia, contienen rebaudiósidos y otros esteviol glucósidos que contribuyen al sabor dulce, aunque la cantidad de cada glucósido con frecuencia varía entre los diferentes lotes de producción. Los productos comerciales existente son de manera predominante rebaudiósido A con cantidades menores de otros glucósidos tales como rebaudiósido C, D y F. Los extractos de estevia también pueden contener contaminantes tales como compuestos derivados de las plantas que contribuyen a un sabor insípido. Estos sabores insípidos pueden ser más o menos problemáticos dependiendo del sistema alimenticio o la aplicación de elección. Los contaminantes potenciales incluyen pigmentos, lipidos, proteínas, fenólicos, sacáridos, spatulenol y otros sesquiterpenos, diterpenos de lábdano, monoterpenos, ácido decanóico, ácido 8, 11 , 14-eicosatrienóico, 2-metiloctadecano, pentacosano, octacosano, tetracosano, octadecanol, stigmasterol, ß-sitosterol, acetato de a- y ß-amirina, lupeol, acetato de ß-amirina, triterpeno pentacíclico, centauredino, quercitino, epi-alfa-cadinol , carofilenos y derivados, beta-pineno, beta-sitosterol, y giberelino.
Breve Descripción de la Invención En la presente descripción se proporciona un huésped recombinante, tal como un microorganismo, que comprende uno o más genes de biosíntesis, cuya expresión tiene como resultado la producción de esteviol. Dichos genes incluyen un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo, un gen que codifica una sintasa de caureno, un gen que codifica una oxidasa de caureno, y un gen que codifica una sintasa de esteviol. El huésped recombinante puede incluir un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, en lugar de los genes que codifican la sintasa de difosfato de copalilo y sintasa de caureno. Por lo menos uno de los genes es un gen recombinante. En algunas modalidades, el huésped recombinante comprende adicionalmente un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil. El huésped recombinante puede comprender adicionalmente un gen que codifica una reductasa de HMG-CoA truncada y/o un gen que codifica un CPR. La expresión de uno o más de los genes puede ser inducida.
En un aspecto, la presente descripción caracteriza un huésped recombinante que incluye un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT91D2 (por ejemplo, un polipéptido UGT91D2e o UGT91D2m). El polipéptido UGT91D2 puede tener por lo menos el 90% de identidad (por ejemplo, por lo menos el 95% o el 99% de identidad) para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5. El polipéptido UGT91D2 puede incluir por lo menos una sustitución de aminoácido en los residuos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, o 387-473 de SEQ ID NO:5. Por ejemplo, el polipéptido UGT91D2 puede incluir una sustitución de aminoácido en uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en los residuos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, y 438 de SEQ ID NO:5. En una modalidad, el polipéptido UGT91D2 incluye una arginina en el residuo 206, una cisteína en el residuo 207 y una arginina en el residuo 342, en relación con la SEQ ID NO:5. En una modalidad, el polipéptido UGT9ID2 incluye una fenilalanina en el residuo 30, una glutamina en el residuo 93, una valina en el residuo 99, una fenilalanina en el residuo 122, una tirosina en el residuo 140, una cisteína en el residuo 142, una treonina en el residuo 148, una alanina en el residuo 153, una serina en el residuo 156, una metionina en el residuo 195, un ácido glutámico en el residuo 196, un ácido glutámico en el residuo 199, una metionina en el residuo 211, una fenilalanina en el residuo 221, una alanina en el residuo 286, una asparagina en el residuo 427, o una alanina en el residuo 438 en relación con la SEQ ID NO:5. El polipéptido puede tener la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:95.
Un huésped descrito en la presente descripción puede incluir adicionalmente un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT85C que tiene por lo menos 90% identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:3. Por ejemplo, el polipéptido UGT85C puede incluir uno o más substituciones de aminoácidos en los residuos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, y 471 de la SEQ IDNO:3.
Un huésped descrito en la presente descripción puede incluir adicionalmente un gen recombinante que codifica a polipéptido UGT76G que tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:7. Por ejemplo, el polipéptido UGT76G puede tener una o más substituciones de aminoácidos en los residuos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, y 346 de la SEQ ID NO:7.
Este documento también caracteriza un huésped recombinante que incluye un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT85C que tiene por lo menos el 90% identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:3, y que tiene una o más substituciones de aminoácidos en los residuos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, y 471 de la SEQ ID NO:3. Por ejemplo, el polipéptido UGT85C puede incluir sustituciones en los residuos 13, 15, 60, 270, 289, y 418 de la SEQ ID NO:3. Por ejemplo, el polipéptido UGT85C puede incluir a) sustituciones en los residuos 13, 60 y 270 de la SEQ ID NO:3; b) sustituciones en los residuos 60 y 87 de la SEQ ID NO:3; c) sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 243, y 270 de la SEQ ID NO:3; d) sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 243, 270, y 441 de la SEQ ID NO:3; e) sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 389, y 394 de la SEQ ID NO:3; f) sustituciones en los residuos 65, 71, 270, y 289 de la SEQ ID NO:3; g) sustituciones en los residuos 15 y 65 de la SEQ ID NO:3; h) sustituciones en los residuos 65 y 270 de la SEQ ID NO:3; i) sustituciones en los residuos 65 y 440 de la SEQ ID NO:3; j) sustituciones en los residuos 65 y 441 de la SEQ ID NO:3; k) sustituciones en los residuos 65 y 418 de la SEQ ID NO:3; 1) sustituciones en los residuos 220, 243, 270, y 334 de la SEQ ID NO:3; o m) sustituciones en los residuos 270 y 289 de la SEQ ID NO:3.
En otro aspecto, este documento caracteriza un huésped recombinante que incluye un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT76G que tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:7, y que tiene uno o más substituciones de aminoácidos en los residuos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, y 346. Por ejemplo, el polipéptido UGT76G puede tener a) sustituciones en los residuos aminoácido 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, y 291; b) sustituciones en los residuos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, y 291; o c) sustituciones en los residuos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, y 346.
Cualquiera de los huéspedes descritos en la presente descripción puede incluir adicionalmente un gen que codifica a polipéptido UGT74GI (por ejemplo, un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT74GI).
Cualquiera de los huéspedes descritos en la presente descripción puede incluir adicionalmente uno o más de: (i) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil; (¡i) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (iii) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (iv) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; (v) un gen que codifica un HMG-CoA truncado; (vi) un gen que codifica a CPR; (vii) un gen que codifica una sintetasa de ramnosa; (viii) un gen que codifica una dehidrogenasa de glucosa UDP; y (ix) un gen que codifica una decarboxilasa de ácido glucorónico-UDP. Por lo menos uno de los genes de (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), o (ix) pueden ser un gen recombinante. En algunas modalidades, cada uno de los genes de (i), (ii), (iii), y (iv) es un gen recombinante.
Este documento también caracteriza un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene por lo menos el 90% de identidad de secuencia (por ejemplo, por lo menos 95% o 99%> identidad de secuencia) para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5. El polipéptido puede incluir por lo menos una sustitución aminoácido en los residuos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, o 387-473 de la SEQ ID NO:5. El polipéptido puede incluir una sustitución aminoácido en uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en los residuos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, y 438 de la SEQ ID NO:5. El polipéptido puede incluir una arginina en el residuo 206, una cisteína en el residuo 207, y una arginina en el residuo 343 de la SEQ ID NO:5. En algunas modalidades, el polipéptido incluye una fenilalanina en el residuo 30, una glutamina en el residuo 93, una valina en el residuo 99, una fenilalanina en el residuo 122, una tirosina en el residuo 140, una cisteína en el residuo 142, una treonina en el residuo 148, una alanina en el residuo 153, una serina en el residuo 156, una metionina en el residuo 195, un ácido glutámico en el residuo 196, un ácido glutámico en el residuo 199, una metionina en el residuo 211, una fenilalanina en el residuo 221, una alanina en el residuo 286, una asparagina en el residuo 427, o una alanina en el residuo 438 de la SEQ ID NO:5.
En otro aspecto, este documento caracteriza un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácido con por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:5.
Este documento también caracteriza un huésped recombinante que incluye (i) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil ; (ii) un gen que codifica a sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica a sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica a sintasa de caureno; (iii) un gen que codifica una oxidasa de caureno; y (iv) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; en donde por lo menos uno de dichos genes. El huésped puede producir esteviol cuando se cultiva bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado y puede acumulares hasta por lo menos 1 mg/L en el medio de cultivo. La sintasa de difosfato de geranilgeranil puede tener más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en la SEQ ID NOs: 121-128. La sintasa de difosfato de copalilo puede tener más del 90%de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en la SEQ ID NOs:129-131. La sintasa de caureno puede tener más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en la 132-135. La oxidasa de caureno puede tener más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en la 138-141. La sintetasa de esteviol puede tener más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en la SEQ ID NOs: 142-146. El huésped puede incluir adicionalmente un gen que codifica un HMG-CoA truncado y/o un gen que codifica un CPR.
Cualquiera de los huéspedes recombinantes puede incluir adicionalmente uno o más de un gen que codifica un polipéptido UGT74G1, un polipéptido UGT85C2, un polipéptido UGT76G1, o un polipéptido UGT91D2.
Cualquiera de los huéspedes recombinantes puede producir por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El esteviol glucósido puede seleccionarse del grupo que consiste en esteviol-13-O-glucósido, esteviol-19-0-glucósido, rubusósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, y dulcósido A. El esteviol glucósido puede acumularse hasta por lo menos 1 mg/litro (por ejemplo, por lo menos 10 mg/litro o 20 mg/litro) de medio de cultivo cuando es cultivado bajo dichas condiciones.
Cualquiera de los huéspedes recombinantes puede incluir adicionalmente uno o más de i) un gen que codifica una sintasa de 5-fosfato de deoxixilulosa (DXS); ii) un gen que codifica una reductoisomerasa de 5-fosfato de deoxixilulosa (DXR); ¡i¡) un gen que codifica una sintasa de 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol (CMS); iv) un gen que codifica a 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol cinasa (CMK); v) un gen que codifica una sintasa de 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol-2,4-ciclodifosfato (MCS); vi) un gen que codifica una sintasa de 1 -hidroxi-2-metil-2(E)-butenil-4-difosfato (HDS); o vii) un gen que codifica una reductasa de 1 -hidroxi-2-met¡l-2(E)-buten¡l 4-difosfato (HDR).
Cualquiera de los huéspedes recombinantes puede incluir adicionalmente uno o más de ix) un gen que codifica a acetoacetil-CoA tiolasa; x) un gen que codifica una reductasa de HMG-CoA truncado; xi) un gen que codifica una cinasa de mevalonato; xii) un gen que codifica una fosfocinasa de mevalonato; o xiii) un gen que codifica una decarboxilasa de pirofosfato de mevalonato.
En cualquiera de los huéspedes descritos en la presente descripción, la expresión de uno o más de los genes puede ser inducida.
Cualquiera de los huéspedes descritos en la presente descripción puede ser un microorganismo (por ejemplo, un Sacaromiceto tal como Saccharomyces cerevisiae , o Escherichia coli), o una planta o célula de planta (por ejemplo, una Stevia tal como una Stevia rebaudiana , Physcomitrella , o planta de tabaco o célula de planta).
En otro aspecto, este documento presenta un método para producir esteviol o un esteviol glucósido. El método incluye el cultivo de un huésped descrito en la presente descripción en un medio de cultivo, bajo condiciones en las cuales los genes son expresados; y la recuperación del esteviol o esteviol glucósido producidos por el huésped. El paso de cultivo puede incluir inducir la expresión de uno o más de los genes. El esteviol o esteviol glucósido se selecciona del grupo que consiste en esteviol-13-O-glucósido, esteviol-19-O-glucósido, rubusósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, y dulcósido A.
La presente descripción también proporciona un método para producir esteviol o a esteviol glucósido. El método incluye el cultivo de un microorganismo en un medió de cultivo, bajo condiciones en las cuales una sintasa de difosfato de geranilgeranil, sintasa de difosfato de copalilo, sintasa de caureno, oxidasa de caureno, gen de ácido 13-hidroxilasa caurenóico y opcionalmente un gen UGT74G1 y/o un gen UGT85C2 son expresados, y la recuperación del esteviol o esteviol glucósido producida por el microorganismo. El microorganismo puede ser un Saccharomyces spp. En algunas modalidades, el paso de cultivo comprende inducir la expresión de uno o más de genes de sintasa de difosfato de geranilgeranil, sintasa de difosfato de copalilo, sintasa de caureno, oxidasa de caureno, ácido 13-hidroxilasa caurenóico, UGT74G1 y UGT85C2. En algunas modalidades, el paso de recuperación comprende la purificación del esteviol o esteviol glucósido desde el medio de cultivo mediante HPLC. El esteviol o esteviol glucósido pueden ser esteviol, rubusósido, rebaudiósido C, rebaudiósido F, o dulcósido A.
En la presente también se proporciona una cepa de Saccharomyces recombinante, que comprende uno o más genes de biosíntesis cuya expresión tiene como resultado la producción de ent-caureno. Los genes de biosíntesis incluyen un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno. La cepa produce ent-caureno a partir de la expresión de la sintasa de difosfato de copalilo y la sintasa de caureno.
En otro aspecto, este documento presenta un ácido nucleico aislado que tiene más del 90% de identidad de secuencia (por ejemplo, más que el 95% o el 99% de identidad de secuencia) para una de las secuencias de nucleótidos establecida en la SEQ ID NOs: 18-25, 34-36, 4-43, 48, 49, 52-55, 60-64, 70-72, 77, o 79.
Este documento también presenta un huésped recombinante que incluye (i) un gen que codifica un UGT74G1; (ii) un gen que codifica un UGT85C2; (iii) un gen que codifica un UGT76G1; y (iv) un gen que codifica un UGT91D2, en donde por lo menos uno de dichos genes es un gen recombinante. En algunas modalidades, cada uno de los genes es un gen recombinante. El huésped puede producir por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El huésped puede incluir adicionalmente (a) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (b) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (c) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; y (d) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil. El esteviol glucósido puede ser rebaudiósido A, rebaudiósido D o rebaudiósido E. Este documento también presenta una composición de esteviol glucósido producida mediante dicho huésped. La composición puede tener más del 4% de rebaudiósido D por peso del total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia. La composición puede tener más del 4% de rebaudiósido E por peso del total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
En la presente también se caracteriza un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene más del 90% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácidos de UGT91D2e y UGT91D2m, excluyendo la secuencia de aminoácido de UGT91D2m, así como también los polipéptidos aislados que tienen más del 90% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido de UGT91D2e o UGT91D2m, excluyendo la secuencia de aminoácido de UGT91D2m.
Este documento también presenta la composición de esteviol glucósido producida por el huésped descrito en la presente descripción. La composición que tiene niveles reducidos de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
En otro aspecto, este documento presenta a huésped recombinante. El huésped incluye (i) un gen recombinante que codifica un UGT91D2; (ii) un gen recombinante que codifica un UGT74G1; (iii) un gen recombinante que codifica un UGT85C2; (iv) un gen recombinante que codifica un UGT76G 1; y (v) un gen que codifica una sintetasa de ramnosa, en donde el huésped produce por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El huésped puede incluir adicionalmente (a) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (b) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (c) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; y (d) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil. El esteviol glucósido puede ser rebaudiósido C o dulcósido A. Este documento también presenta una composición de esteviol glucósido producida por dicho huésped. La composición tiene más del 15% de rebaudiósido C por peso del total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia. Una composición de esteviol glucósido producida por dicho huésped también es presentada. La composición puede tener más del 15% de dulcósido A por peso del total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
Este documento también presenta un huésped recombinante. El huésped incluye (i) un gen recombinante que codifica un UGT91D2; (ii) un gen recombinante que codifica un UGT74G1; (iii) un gen recombinante que codifica un UGT85C2; (iv) un gen recombinante que codifica un UGT76G1; (v) un gen que codifica una dehidrogenasa de glucosa UDP; y (vi) un gen que codifica una decarboxilasa de ácido glucorónico-UDP, en donde el huésped produces por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El huésped puede incluir adicionalmente (a) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (b) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (c) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; y (d) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil. El esteviol glucósido puede ser rebaudiósido F.
Este documento también presenta una composición de esteviol glucósido producida por dichos huéspedes. La composición puede tener más del 4% de rebaudiósido F por peso del total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
En otro aspecto, este documento presenta un método para producir una composición de esteviol glucósido. El método incluye cultivar un huésped descrito en la presente descripción en un medio de cultivo, bajo condiciones en las cuales cada uno de los genes es expresado; y la recuperación de la composición de esteviol glucósido producida por el huésped, en donde la composición recuperada es enriquecida para rebaudiósido A, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F o dulcósido A en relación con la composición de esteviol glucósido de una planta de Stevia de tipo natural. La composición de esteviol glucósido producida por el huésped (por ejemplo, microorganismo) puede tener un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
Este documento también presenta un producto alimenticio que incluye una composición de esteviol glucósido enriquecido para rebaudiósido A, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F o dulcósido A en relación con la composición de esteviol glucósido de una planta de Stevia de tipo natural.
En otro aspecto, este documento presenta un método para identificar si un polimorfismo está asociado con la variación en un atributo. El método incluye determinar si uno o más polimorfismos genéticos en una población de plantas está asociado con el lugar para un polipéptido establecido en la SEQ ID NO:5 y homólogos funcionales del mismo; y medir la correlación entre la variación en el atributo en plantas de la población y la presencia del uno o más polimorfismos genéticos en las plantas de la población, mediante lo cual se identifica si uno o más polimorfismos genéticos están asociados o no con la variación en el atributo.
En todavía otro aspecto, este documento presenta un método para elaborar una línea de planta. El método incluye determinar si uno o más polimorfismos genéticos en una población de plantas está asociado con el sitio para un polipéptido establecido en la SEQ ID NO:5 y homólogos funcionales del mismo; la identificación de una o más plantas en la población en la cual, la presencia de por lo menos uno de los polimorfismos genéticos está asociada con la variación en un atributo; mestizar una o más de las plantas identificadas consigo mismas o una planta diferente para producir semilla; mestizar por lo menos una planta progenie cultivada a partir de la semilla consigo misma o una planta diferente; y repetir los pasos de mestizaje para de 0 a 5 generaciones adicionales para elaborar dicha línea de plantas, en donde por lo menos uno de los polimorfismos genéticos está presente en la línea de plantas.
Este documento también presenta un método para transferir una segunda porción de azúcar al C-2' de una glucosa en un esteviol glucósido. El método incluye poner en contacto el esteviol glucósido con un polipéptido UGT91D2 y una azúcar UDP bajo las condiciones de reacción adecuadas para la transferencia de la segunda porción de azúcar al esteviol glucósido. El polipéptido UGT91D2 puede tener por lo menos el 90% de identidad de secuencia (por ejemplo, por lo menos el 95% o el 99%) para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5. El polipéptido UGT91D2 puede incluir por lo menos una sustitución aminoácido en los residuos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, o 387-473 de la SEQ ID NO:5. El polipéptido UGT91D2 puede incluir una sustitución aminoácido en uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en los residuos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, y 438 de la SEQ ID NO:5. El esteviol glucósido puede seleccionarse del grupo que consiste en esteviol- 13-0-glucósido, rubusósido, esteviósido, y Rebaudiósido A. El esteviol glucósido puede ser rubusósido y la segunda porción de azúcar es glucosa, y el esteviósido es producido a partir de la transferencia de la segunda porción de glucosa. El esteviol glucósido puede ser esteviósido y la segunda porción de azúcar puede ser glucosa, y el Rebaudiósido E es producido a partir de la transferencia de la segunda porción de glucosa. El esteviol glucósido puede ser esteviósido, en donde el esteviósido se pone en contacto con el polipéptido UGT91D2 y un polipéptido UGT76G1 bajo las condiciones de reacción adecuadas para producir el Rebaudiósido D. El esteviol glucósido puede ser esteviol-13-O-glucósido y esteviol-1,2 biósido es producido a partir de la transferencia de dicha segunda porción de glucosa. El esteviol glucósido puede ser esteviol-13-O-glucósido y el estev¡ol- ,2-xilobiosido es producido a partir de la transferencia de la segunda porción de azúcar. El esteviol glucósido puede ser esteviol-13-O-glucósido y el esteviol-1 ,2-ramnobiosido puede ser producido a partir de la transferencia de la segunda porción de azúcar. El esteviol glucósido puede ser ebaudiósido A, y el Rebaudiósido D es producido a partir de la transferencia de una segunda porción de glucosa.
En otro aspecto, este documento presenta un método para determinar la presencia de un polinucleótido en una planta de Stevia. El método incluye poner en contacto por lo menos una sonda o par de cebador con ácido nucleico de la planta de Stevia, en donde la sonda o par de cebador es específico para un polinucleótido que codifica un polipéptido UGT, en donde el polipéptido UGT tiene por lo menos el 90% de identidad de secuencia para la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:7 y determinar si el polinucleótido está presente o no en dicha planta de Stevia.
Este documento también presenta un equipo para la determinación de genotipo de una Muestra biológica de Stevia. El equipo incluye un par de cebador, que amplifica de manera específica, o una sonda que híbrida de forma específica para, un polinucleótido que codifica un polipéptido UGT que tiene por lo menos el 90% de identidad de secuencia para la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:7.
En la presente, también se proporciona un microorganismo recombinante, que comprende uno o más genes de biosíntesis cuyo ion de expresión tiene como resultado la producción de uno o más esteviol glucósidos. Los genes de biosíntesis incluyen un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil, un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno, un gen que codifica una oxidasa de caureno, un gen que codifica una sintetasa de esteviol, y un gen que codifica un UGT74G1 y/o un UGT85C2. Por lo menos uno de los genes es un gen recombinante. El microorganismo puede comprender un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno en lugar de los genes que codifican la sintasa de difosfato de copalilo y sintasa de caureno.
El microorganismo recombinante produce por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El esteviol glucósido puede ser rubusósido, rebaudiósido C, rebaudiósido F, dulcósido B, o dulcósido A.
El microorganismo recombinante puede ser un Sacaromiceto, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, y puede tener una o más modificaciones genéticas que reducen Actividad de hidrolasa de glucósido EXG1 y EXG2 en relación con un microorganismo de control que carece de dichas modificaciones genéticas, y puede tener una o más modificaciones genéticas que reducen biosíntesis de ergosterol en relación con un microorganismo de control que carece de dichas modificaciones genéticas. El Sacaromiceto produces rubusósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El rubusósido puede acumularse hasta por lo menos 10 mg/litro de medio de cultivo. El Sacaromiceto puede ser una cepa Saccharomyces cerevisiae designada como CEY171, CEY191, o CEY213.
El microorganismo recombinante puede comprender adicionalmente un gen que codifica un SM12UGT y un gen que codifica un UGT76G1, y produce un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El esteviol glucósido puede ser rebaudiósido A.
En la presente también se proporciona un microorganismo recombinante, que comprende uno o más genes de biosíntesis cuya expresión tiene como resultado la producción de por lo menos un esteviol glucósido. Los genes de biosíntesis incluyen un gen que codifica un SM12UGT, un gen que codifica un UGT74G1, un gen que codifica un UGT76G1 y un gen que codifica un UGT85C2. El microorganismo recombinante produce rebaudiósido A o rebaudiósido B cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El rebaudiósido A o rebaudiósido B pueden acumularse hasta por lo menos 1 mg/L en el medio de cultivo.
En la presente, también se presenta un microorganismo recombinante, que comprende un gen que codifica un polipéptido UGT91D2, por ejemplo, a gen UGT91D2 recombinante.
En la presente, también se presenta un microorganismo recombinante, que comprende un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil, un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno (o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno), un gen que codifica una oxidasa de caureno, un gen que codifica una sintetasa de esteviol, un gen que codifica un UGT74G1, un gen que codifica a UGT85C2, un gen que codifica a UGT76G1, y un gen que codifica a UGT91D2. Por lo menos uno de los genes es un gen recombinante. El microorganismo recombinante puede producir por lo menos un esteviol glucósido, por ejemplo, rebaudiósido A, rebaudiósido B, y/o rebaudiósido F, cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El microorganismo recombinante puede acumular por lo menos 20 mg de esteviol glucósido por litro de medio de cultivo cuando es cultivado bajo dichas condiciones. El microorganismo recombinante puede ser un Sacaromiceto, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae , y puede tener una o más modificaciones genéticas que reducen la actividad de hidrolasa de glucósido EXG1 y EXG2 en relación con un microorganismo de control que carece de dichas modificaciones genéticas, y puede tener una o más modificaciones genéticas que reducen la biosíntesis de ergosterol en relación con un microorganismo de control que carece de dichas modificaciones genéticas.
En la presente, también se presenta un microorganismo recombinante, que comprende un gen que codifica un UGT74G1, un gen que codifica a UGT85C2, un gen que codifica un UGT76G1, y un gen que codifica un UGT91D2. Por lo menos uno de los genes es un gen recombinante. El microorganismo recombinante puede producir un esteviol glucósido, por ejemplo, rebaudiósido A o rebaudiósido B, cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales, cada uno de los genes es expresado. El rebaudiósido A o rebaudiósido B pueden acumularse hasta por lo menos 15 mg/L en el medio de cultivo.
El microorganismo recombinante descrito anteriormente puede comprender adicionalmente un gen que codifica una sintasa de 5-fosfato de deoxixilulosa (DXS), y/o un gen que codifica una reductoisomerasa de 5-fosfato de D1 -deoxixilulosa (DXR), y/o un gen que codifica una sintasa de 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol (CMS), y/o un gen que codifica una cinasa de 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol (CMK), y/o un gen que codifica una sintasa de 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato (MCS), y/o un gen que codifica una sintasa de 1-hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato (HDS), y/o un gen que codifica una reductasa de 1 -hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato (HDR).
El microorganismo recombinante descrito anteriormente puede comprender adicionalmente un gen que codifica una acetoacetil-CoA tiolasa, y/o un gen que codifica una reductasa de HMG-CoA truncado, y/o un gen que codifica una cinasa de mevalonato, y/o un gen que codifica a fosfocinasa de mevalonato, y/o un gen que codifica una decarboxilasa de pirofosfato de mevalonato.
A menos que sea definido de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que un experto ordinario en la materia a la cual pertenece la presente invención entiende comúnmente. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripción para practicar la misma, los métodos y materiales adecuados se describen más adelante. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente descripción están incorporadas como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, que incluye las definiciones estará en control. Además, los materiales, métodos y ejemplos únicamente son ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Los solicitantes se reservan el derecho para reclamar de forma alternativa cualquier invención descrita utilizando la frase de transición "que comprende", "que consiste esencialmente de" o "que consiste de" de acuerdo con la práctica estándar en la ley de patentes.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1, es un esquema que ilustra la biosíntesis de esteviol de difosfato de geranilgeranil.
Las figuras 2A a 2D, muestran trayectorias representativas para la biosíntesis de esteviol glucósidos a partir de esteviol.
La figura 3, muestra las estructuras químicas para varios de los esteviol glucósidos.
La figura, 4 es una representación esquemática de una producción rebA en Saccharomyces cerevisiae .
La figura 5, es una representación esquemática de la concatenación de genes para formar eYACs.
La figura 6, muestra la producción de rubusósido mediante una cepa de levadura CEY13 bajo diversas condiciones de cultivo.
La figura 7, muestra los datos obtenidos a partir del análisis 1H y 13C RMN del compuesto producido por la cepa de levadura CEY213, en comparación con los valores de la literatura para rubusósido.
La figura 8 es una alineación de secuencia de aminoácidos UGT91D1 y UGT91D2 (SEQ ID NOs:14, 16, 12, 5, y 10, respectivamente).
La figura 9, muestra una producción de Rebaudiósido A, esteviosido, y rubusósido mediante levadura CEY213 que contiene el plásmido pMUS47 después de 24 y 99 horas de cultivo.
La figura 10A, es una gráfica que ilustra las concentraciones de RebA, rubusosido y 19-5MG en sobrenadantes. La figura 10B, es una gráfica de las concentraciones de RebA, rubusosido y 19-SMG medido en los aglomerados celulares, para experimentos en donde las células de levadora fueron alimentadas con 100 µ? de esteviol. En ambas gráficas, el primer juego de barras representa los atributos de control no etiquetados; el Segundo juego de barras representa la cepa que contiene las proteínas de fusión UGT74G1, UGT76G1, y UGT91D2e en las cuales los aminoácidos de la N-terminal 158 de la proteína MDM2 se fusionan con cada UGT, y una proteína de fusión UGT85C2 en la cual cuatro repeticiones del péptido PMI sintético se fusiona en el marco para el término N de 85C2. El eje y es la concentraciones de unidades micromolares.
Los símbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican a los elementos similares.
Descripción Detallada de la Invención Dos glucósidos, esteviosido y rebaudiósido A, son los compuestos primarios en los extractos de estevia producidos comercialmente. El esteviosido se reporta por tener un sabor más amargo y menos dulce que el rebaudiósido A y, por consiguiente, se prefiere una proporción más alta de rebaudiósido A en una preparación del extracto. Sin embargo, la composición de extracto de estevia puede variar de lote en lote dependiendo del suelo y el clima en el cual se cultivan las platas. Dependiendo de la planta fuente, las condiciones de clima, y el procedimiento de extracción, la cantidad de rebaudiósido A en las preparaciones comerciales se reporta por variar desde el 20 hasta el 97% del contenido total de esteviol glucósido, normalmente >50-80% y en algunas ocasiones tan alta como del >95-97% del total de esteviol glucósidos. Además, otros esteviol glucósidos están presentes en cantidades variables en los extractos de estevia, lo cual complica adicionalmente la capacidad para producir un edulcorante con un perfil de sabor consistente por extracción y purificación a partir de plantas de Stevia. Por ejemplo el, Rebaudiósido Bis, normalmente está presente en menos del 1 al 2%, mientras que el Rebaudiósido C puede estar presente en niveles tan altos como del 7 al 15%. El Rebaudiósido D normalmente está presente en niveles del 2% o menores, y el Rebaudiósido F está presente normalmente en composiciones al 3.5% o menos del total de esteviol glucósidos. Incluso las cantidades traza de los esteviol glucósidos menores se reporta que afectan el perfil de sabor de un extracto de estevia. Adicionalmente, se considera que algunos de los contaminantes de la planta de Stevia, incluso en concentraciones muy bajas, también pueden proporcionar falta de sabor a algunos de los extractos de planta disponibles comercialmente.
Este documento se basa en el descubrimiento dé que los huéspedes recombinantes, tales como células de plantas, plantas, o microorganismos pueden ser desarrollados para expresar los polipéptidos útiles para la biosíntesis de esteviol. Adicionalmente, dichos huéspedes pueden expresar glucosil transferasas de 5'-difosfo uridina (UDP) adecuadas para la producción de esteviol glucósidos, tales como rubusósido y rebaudiósido A. Los microorganismos recombinantes son huéspedes particularmente útiles. La expresión de estos polipéptidos biosintéticos en diversos esqueletos microbiales, permiten que el esteviol y sus glucósidos sean producidos en una forma consistente, y que se pueda reproducir a partir de fuentes de energía y carbón tales como azúcares, glicerol, C02, H2 y la luz solar. La proporción de cada esteviol glucósido producida para un huésped recombinante puede ser ajustada a la medida incorporando las enzimas biosintéticas previamente seleccionadas en los huéspedes y que las expresan en niveles adecuados, para produce una composición edulcorante con un perfil de sabor consistente. Adicionalmente, las concentraciones de esteviol glucósidos producidas por huéspedes recombinantes se espera sean superiores que los niveles de esteviol glucósidos producidos en la planta de Stevia, lo cual mejora la eficiencia de la purificación en corriente descendente. Dichas composiciones de edulcorante contienen pocos o ninguno de los contaminantes basados en la planta en relación con la cantidad de contaminantes presentes en los extractos de estevia.
Por lo menos uno de los genes es un gen recombinante, el gen recombinante(s) particular depende de la especie o cepa seleccionada para utilizarse. Los genes adicionales o módulos biosintéticos pueden estar incluidos con el objeto de incrementar la producción de esteviol y glucósido, mejorar la eficiencia con la cual las fuentes de energía y carbón son convertidas en esteviol y sus glucósidos, y/o para mejorar la productividad a partir del cultivo celular o planta. Dichos módulos biosintéticos adicionales incluyen a los genes involucrados en la síntesis de los precursores de terpenoide, difosfato de isopentenilo y difosfato de dimetilalilo. Los módulos biosintéticos adicionales incluyen genes de sintasa de terpeno y ciclasa de terpeno genes, tales como los genes que codifican la sintasa de difosfato de geranilgeranil y la sintasa de difosfato de copalilo; estos genes pueden ser genes endógenos o genes recombinantes.
I. Polipéptidos de Biosíntesis Esteviol y Esteviol Glucósido A. Polipéptidos de Biosíntesis de Esteviol Las estructuras químicas para varios de compuestos que se encuentran en los extractos de estevia se muestran en la figura 3, incluyendo el diterpeno esteviol y varios esteviol glucósidos. Los números CAS se muestran en la Tabla A a continuación. Véase también la publicación "Evaluación química y técnica de esteviol glucósidos 69ava JECFA" (Steviol glycosides Chemical y Technical Assessment 69th JECFA), preparado por Harriet Wallin, Food Agrie. Org. (2007).
Tabla A Se ha descubierto que la expresión de ciertos genes en un huésped tal como un microorganismo confiere la capacidad para sintetizar el esteviol a partir de ese huésped. Como se plantea con mayor detalle más adelante, uno o más de dichos genes pueden estar presentes de manera natural en un huésped. Normalmente, sin embargo, uno o más de dichos genes son genes recombinantes que han sido transformados en un huésped que no los posee de manera natural.
La trayectoria bioquímica para producir esteviol involucre la formación de difosfato de geranilgeranil, la ciclación a (-) difosfato de copalilo, seguido por oxidación e hidroxilación para formar el esteviol. Véase la figura 1. Por lo tanto, conversión de difosfato de geranilgeranil a esteviol en un microorganismo recombinante involucra la expresión de un gen que codifica una sintasa de caureno (KS), un gen que codifica una oxidasa de caureno (KO), y un gen que codifica una sintetasa de esteviol (KAH). La sintetasa de esteviol también es conocida como ácido caurenóico 13-hidroxilasa.
Los polipéptidos KS son conocidos. Por ejemplo, las enzimas KS adecuadas incluyen a aquellas elaboradas mediante Stevia rebaudiana , Zea mays y Populus trichocarpa . Véanse las, SEQ ID NOs: 132-135. Las secuencias de nucleótidos que codifican a estos polipéptidos se describen con mayor detalle más adelante. Véase, por ejemplo, la Tabla 3 y las SEQ ID NOs: 40-47. Los polipéptidos KO adecuados son conocidos. Por ejemplo, las enzimas KO adecuadas incluyen a aquellas elaboradas mediante Stevia rebaudiana , Arabidopsis thaliana, Gibberella fujikoroi y Trametes versicolor. Véanse las SEQ ID NOs: 138-141. Las secuencias de nucleótidos que codifican a estos polipéptidos se describen con mayor detalle más adelante. Véanse, por ejemplo, la Tabla 5 y las SEQ ID NOs: 52-59.
Los polipéptidos KAH adecuados son conocidos. Por ejemplo, las enzimas KAH adecuada incluyen a aquellas elaboradas mediante Stevia rebaudiana , Arabidopsis thaliana, Vitis vinifera y Medicago trunculata . Véanse, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 142-146; Publicación de Patente Norteamericana No. 2008-0271205; Publicación de Patente Norteamericana No. 2008-0064063 y No. de Acceso de banco genético gi 189098312. La sintetasa de esteviol a partir de Arabidopsis thaliana es clasificada como una CYP714A2. Las secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos se describen con mayor detalle más adelante. Véanse, por ejemplo, la Tabla 6 y las SEQ ID NOs: 60-69.
En algunas modalidades, un microorganismo recombinante contiene un gen recombinante que codifica un polipéptido KO y/o un KAH. Dichos microorganismos también normalmente contienen un gen recombinante que codifica un polipéptido de reductasa de citocromo P450 (CPR), debido a que ciertas combinaciones de polipéptidos KO y/o KAH requieren la expresión de un polipéptido exógeno CPR. En particular, la actividad de un polipéptido KO y/o un KAH de la planta de origen pueden ser incrementados de manera significativa por la inclusión de un gen recombinante que codifica un polipéptido CPR exógeno. Los polipéptidos CPR adecuados son conocidos. Por ejemplo, las enzimas CPR adecuadas incluyen a aquellas elaboradas mediante Stevia rebaudiana, Arabidopsis thaliana, y Giberella fujikuroi. Véanse, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 147-149. Las secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos se describen con mayor detalle más adelante. Véanse, por ejemplo, la Tabla 7 y las SEQ ID NOs: 70-75.
La expresión en un microorganismo recombinante de estos genes tiene como resultado la conversión de difosfato de geranilgeranil a esteviol.
B. Polipéptidos de Biosíntesis de Esteviol Glucósido En algunas modalidades, un huésped recombinante descrito en la presente descripción puede convertir el esteviol en un esteviol glucósido. Dicho huésped (por ejemplo, microorganismo) contiene genes que codifican uno o más UDP Glucosil Transferasas, también conocidas como UGTs. Las UGTs transfieren una unidad de monosacárido de un azúcar de nucleótido activada a una porción aceptante, en este caso, una porción -OH o -COOH sobre el esteviol o derivado de esteviol. Las UGTs se han clasificado en familias y sub-familias con base en la homología de secuencia. Li y asociados, J. Biol. Chem. 276:4338-4343 (2001).
B. 1 Polipéptidos de Biosíntesis de Rubusósido La biosíntesis de rubusósido involucre la glucosilación del 13-OH y el 19-COOH de esteviol. Véase, la figura 2A. Se ha descubierto que la conversión de esteviol a rubusósido en un huésped recombinante tal como un microorganismo, puede lograrse mediante la expresión del gene(s) que codifica las UGTs 85C2 y 74G1, el cual transfiere unidad de glucosa al 13-OH o al 19-COOH, respectivamente, de esteviol.
Por lo tanto, un UGT85C2 adecuado funciona como un glucosil de 5'-difosfo uridina: esteviol 13-OH transferasa, y un glucosil de 5'-difosfo uridina: esteviol-19-O-glucósido 13-OH transferasa. El polipéptido UGT85C2s funcional, también puede catalizar las reacciones de glucosil transferasa que utilizan los sustratos de esteviol glucósido diferentes del esteviol y el esteviol-19-O-glucósido.
Un polipéptido UGT74G1 adecuado funciona como un glucosil de 5'-difosfo uridina: esteviol 19-COOH transferasa y un glucosil de 5'-difosfo uridina: esteviol-13-O-gl ucósido 19-COOH transferasa. El polipéptido funcional UGT74G1s también puede catalizar las reacciones de glucosil transferasa que utilizan sustratos de esteviol glucósido sustratos diferentes de esteviol y esteviol-13-O-glucósido, o que transfieren porciones de azúcar de los donantes diferentes de la glucosa de difosfato de uridina.
Un microorganismo recombinante que expresa un UGT74G1 funcional y un UGT85C2 funcional puede elaborar el rubusósido y ambos monósidos de esteviol (es decir, Esteviol 13-O-monoglucósido y Esteviol 19-O-monoglucósido) cuando se utiliza esteviol para alimentar el medio. Uno o más de dichos genes puede estar presente de manera natural en el huésped. Normalmente, sin embargo, dichos genes son genes recombinantes que han sido transformados en un huésped (por ejemplo, un microorganismo) que naturalmente no los posee.
Como se utiliza en la presente descripción, el término huésped recombinante pretende referirse a un huésped, el genoma del cuál ha sido aumentado en por lo menos una secuencia de ADN incorporada. Dichas secuencias de ADN incluyen sin limitación un gens que naturalmente no están presentes, las secuencias de ADN que no son transcritas normalmente en ARN o son traducidos en una proteína ("expresados"), y otros genes o secuencias de ADN las cuales se desea introducir dentro del huésped no recombinante. Se apreciará que normalmente el genoma de un huésped recombinante descrito en la presente descripción se aumentó a través de la introducción estable de uno o más genes recombinantes. Generalmente, el ADN introducido originalmente no es residente en el huésped que es el receptor del ADN, aunque está dentro del alcance de la presente invención para aislar un segmento de ADN de un huésped determinado, y para introducir en forma subsiguiente una o más copias adicionales de ese ADN al mismo huésped, por ejemplo, para mejorar la producción del producto de un gen o alterar el patrón de expresión de un gen. En algunos casos, el ADN introducido modificará o incluso reemplazará un gen endógeno o secuencia de ADN, por ejemplo, mediante la recombinación homologa o mutagénesis dirigida en el sitio. Los huéspedes recombinantes adecuados incluyen microorganismos, células de planta, y plantas.
El término "gen recombinante" se refiere a un gene o secuencia de ADN que se introduce en un huésped receptor, independientemente de si el mismo gen o un gen similar o secuencia de ADN ya pueden estar presentes en dicho huésped. El término "introducido," o "aumentado" en este contexto, se conoce en la material porque significa introducido o aumentado por la mano del hombre. Por lo tanto, un gen recombinante puede ser una secuencia de ADN de otras especies, o puede ser una secuencia de ADN que se originó a partir de o que está presente en la misma especie, aunque ha sido incorporada en un huésped mediante los métodos de ingeniería genética para formar un huésped recombinante. Se apreciará que un gen recombinante que es introducido en un huésped puede ser idéntico a una secuencia de ADN que normalmente está presente en el huésped que está siendo transformado, y se introduce para proporcionar una o más copias adicionales del ADN mediante lo cual permite la sobre expresión o expresión modificada del producto genético de ese ADN.
El polipéptido UGT74G1 y UGT85C2s adecuados, incluyen a aquellos elaborados mediante Stevia rebaudiana. Los genes que codifican el polipéptido UGT74G1 funcional y UGT85C2s a partir de Stevia están reportados en la publicación de Richman y asociados, Plant J . 41: páginas 56 a 67 (2005). La secuencia de aminoácidos de polipéptidos de S. rebaudiana UGT74G1 y EL polipéptido UGT85C2s es establecida en las SEQ ID NOs: 1 y 3, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican UGT74G1 y UGT85C2 que se han optimizado para expresión en levadura son establecidas en las SEQ ID NOs: 2 y 4, respectivamente. Véase también las variantes de UGT85C2 y UGT74G1 descritas en los Ejemplos 17 y 18, respectivamente.
En algunas modalidades, el huésped recombinante es un microorganismo. El microorganismo recombinante puede ser cultivado en un medio que contiene esteviol con el objeto de producir rubusósido. En otras modalidades, sin embargo, el microorganismo recombinante expresa uno o más genes recombinantes involucrados en la biosíntesis de esteviol, por ejemplo, un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y/o un gen KAH. Por lo tanto, un microorganismo que contiene un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y un gen KAH además de un gen UGT74G1 y un gen UGT85C2 tiene la capacidad de producir tanto monósidos de esteviol como rubusósido sin la necesidad de incluir esteviol en el medio de cultivo.
En algunas modalidades, el microorganismo recombinante expresa adicionalmente un gen recombinante que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil (GGPPS). Los polipéptidos GGPPS adecuados son conocidos. Por ejemplo, las enzimas GGPPS adecuadas incluyen a aquellas elaboradas mediante Stevia rebaudiana, Gibberella fujikuroi, Mus musculus, Thalassiosira pseudonana , Streptomyces clavuligerus, Sulfulobus acidocaldarius, Synechococcus sp. y Arabidopsis thaliana. véanse, las SEQ ID NOs: 121 a 128. Las secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos se describen con mayor detalle más adelante. Véanse la Tabla 1 y las SEQ ID NOs: 18-33. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante expresa adicionalmente los genes recombinantes involucrados en la biosíntesis de diterpeno o la producción de precursores de terpenoide, por ejemplo, los genes en la trayectoria de 4-fosfato de metileritritol (MEP) o los genes en la trayectoria de mevalonato (MEV) planteada anteriormente.
B. 2 Polipéptidos de Biosíntesis de Rebaudiósido A La biosíntesis de rebaudiósido A involucre la glucosilacion de aglicona esteviol. de manera específica, el rebaudiósido A puede ser formado mediante la glucosilacion del 13-OH de esteviol el cual forma el 13-O-esteviolmonosido, la glucosilacion del C-2' de la 13-O-glucosa del esteviolmonósido la cual forma el esteviol-1 ,2-biosido, glucosilación del carboxilo C-19 de esteviol-1 ,2-biosido el cual forma el esteviosido, y la glucosilación del C-3' del C-13-O-glucosa de esteviosido. El orden en el cual ocurre cada reacción de glucosilación puede variar. Véase la figura 2A.
Se ha descubierto que la conversión de esteviol a rebaudiósido A en un huésped recombinante puede ser lograda mediante la expresión del gene(s) que codifica los siguientes UGTs: 74G1, 85C2, 76G1 y 91D2 funcionales. Por lo tanto, un microorganismo recombinante que expresa estos cuatro UGTs puede elaborar el rebaudiósido A cuando en el medio es alimentado el esteviol. Normalmente, uno o más de estos genes son genes recombinantes que han sido transformados en un microorganismo que no los posee de manera natural. También se ha descubierto que los UGTs designados en la presente descripción como SM12UGT pueden ser sustituidos por UGT91D2.
El polipéptido UGT74G1 y UGT85C2s adecuados incluyen aquellos planteados anteriormente. Un UGT76G1 adecuado agrega una porción de glucosa al C-3' del C-13-O-glucosa de la molécula aceptante, un esteviol 1,2 glucósido. Por lo tanto, el UGT76G1 funciona, por ejemplo, como un glucósido de 5'-difosfo uridina: glucosil transferasa de esteviol 13-0-1,2 glucósido C-3' y una glucosil de 5'-difosfo uridina: esteviol-19-O-glucosa, glucosil transferasa 13-0-1,2 biósido C-3". El polipéptido funcional UGT76G1s también puede catalizar las reacciones de glucosil transferasa que utilizan los sustratos de esteviol glucósido que contienen azúcares diferentes de glucosa, por ejemplo, ramnósidos de esteviol y xilósidos de esteviol. Véanse, las figuras 2A, 2B, 2C y 2D. Los polipéptidos UGT76G1s adecuados incluyen a aquellos elaborados mediante S. rebaudiana y están reportados en la publicación de Richman y asociados, Plant J . 41: páginas 56 a 67 (2005). La secuencia de aminoácido de un polipéptido de S. rebaudiana UGT76G1 está establecida en la SEQ ID NO:7. La secuencia de nucleótido que codifica al polipéptido UGT76G1 de la SEQ ID NO:7 se ha optimizado para la expresión en levadura y está establecida en la SEQ ID NO:8. Véanse también las variantes de UGT76G1 establecidas en el Ejemplo 18.
Un polipéptido UGT91D2 adecuado funciona como un glucosil de uridina 5'-difosfo: esteviol-13-O-glucósido transferasa (también denominado como un esteviol-13- monoglucósido 1 ,2-glucosilasa), transfiriendo una porción de glucosa al C-2' de la 13-O-glucosa de la molécula aceptante, esteviol-13-O-glucósido. Normalmente, un polipéptido UGT91D2 aceptable también funciona como una glucosil de uridina 5'-difosfo: transferasa de rubusósido que transfiere una porción de glucosa al C-2' de la 13-O-glucosa de la molécula aceptante, rubusósido.
El polipéptido UGT91D2s funcional puede catalizar también las reacciones que utilizan los sustratos de esteviol glucósido diferentes de esteviol-13-O-glucósido y rubusósido, por ejemplo, el polipéptido UGT91D2s funcional puede utilizar esteviosido como un sustrato, que transfiere a porción de glucosa al C-2' del residuo de 19-O-glucosa para producir Rebaudiosido E. Los polipéptidos UGT91D2s funcionales también pueden utilizar Rebaudiosido A como un sustrato, que transfiere una porción de glucosa al C-2' del residuo de 19-O-glucosa para producir Rebaudiosido D. Sin embargo, un polipéptido UGT91D2 funcional, normalmente no transfiere una porción de glucosa a los compuestos de esteviol que tienen un enlace 1,3-glucosa en la posición C-13, es decir, la transferencia de una porción de glucosa al esteviol 1,3-biosido y no ocurre el 1 ,3-steviosido.
El polipéptido funcional UGT91D2s puede transferir porciones de azúcar desde los donantes diferentes de la glucosa de difosfato de uridina. Por ejemplo, un polipéptido funcional UGT91D2 puede actuar como una uridina de 5'-difosfo D-xilosil: esteviol-13-O-glucósido transferasa, que transfiere una porción de xilosa al C-2' de la 13-O-glucosa de la molécula aceptante, esteviol-13-O-glucósido. Como otro ejemplo, un polipéptido funcional UGT91D2 puede actuar como una uridina de 5'-difosfo L-ramnosilo: esteviol-13-O-glucósido transferasa, transfiriendo una porción de ramnosa al C-2' de la 13-O-glucosa de la molécula aceptante, esteviol-13-O-glucósido El polipéptido funcional UGT91D2s adecuado incluye a aquellos descritos en la presente descripción, por ejemplo, los polipéptidos designados como UGT91D2e y UGT91D2m. La secuencia de aminoácido de un polipéptido UGT91D2e de ejemplo de Stevia rebaudiana está establecida en la SEQ ID NO: 5. La SEQ ID NO:6 es una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:5 que ha sido optimizado por un codón para la expresión en levadura. La secuencia de nucleótido de S. rebaudiana que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:5 es establecida en la SEQ ID NO:9. La secuencia de aminoácidos del polipéptido UGT91D2m de ejemplo de S. rebaudiana es establecida en la SEQ ID NOs: 10 y 12, y es codificada por las secuencias de ácido nucleico establecidas en las SEQ ID NOs: 11 y 13, respectivamente. Véanse también las variantes UGT91D2 del ejemplo 16, por ejemplo, una variante que contiene una sustitución en los residuos de aminoácido 206, 207, y 343.
Como se indicó anteriormente, los UGTs designados en la presente descripción como SM12UGT pueden ser sustituidos por UGT91D2. El polipéptido funcional SM12UGTs incluye a aquellos elaborados mediante Ipomoea purpurea ("Gloria matutina japonesa" Japanese morning glory) y se describen en la publicación de Morita y asociados Plant J. 42, páginas 353 a 363 (2005). La secuencia de aminoácido que codifica el polipéptido /. purpurea IP3GGT está establecida en la SEQ ID NO:76. La SEQ ID NO:77 es una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:76 que ha sido optimizada mediante un codón para la expresión en levadura. Otro polipéptido adecuado SM12UGT es un polipéptido Bp94B1 que tiene una mutación R25S. Véase la publicación de Osmani y asociados Plant Phvs. 148: páginas 1295 a 1308 (2008) y la publicación de Sawada y asociados J. Biol. Chem. 280: páginas 899 a 906 (2005). La secuencia de aminoácido que codifica el polipéptido Bellis perennis (red daisy) UGT94B1 está establecida en la SEQ ID NO:78. La SEQ ID NO:79 es la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:78 que ha sido optimizada mediante un codón para la expresión en levadura.
En algunas modalidades, el microorganismo recombinante se cultiva en un medio que contiene esteviol-13-O-glucósido o estev¡ol-19-O-glucósido con el objeto de producir rebaudiósido A. En dichas modalidades, el microorganismo contiene y expresa genes que codifican un UGT91D2 funcional, un UGT74G1 funcional y un UGT76G1 funcional, y tiene la capacidad de producir rebaudiósido A cuando es alimentado con esteviol, uno o ambos del esteviol monósidos, o rubusósido en el medio de cultivo.
En otras modalidades, el microorganismo recombinante se cultiva en un medio que contiene rubusósido con el objeto de producir rebaudiósido A. En dichas modalidades, el microorganismo contiene y expresa genes que codifican un UGT91D2 funcional y un UGT76G1 funcional, y tiene la capacidad de producir rebaudiósido A cuando se alimenta con rubusósido en el medio de cultivo.
En otras modalidades el microorganismo recombinante expresa uno o más genes involucrados en la biosíntesis de esteviol, por ejemplo, un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y/o un gen KAH. Por lo tanto, por ejemplo, un microorganismo que contiene un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y un gen KAH, además de un gen UGT74G1, un gen UGT85C2, un gen UGT91D2 gene y un gen UGT76G1, tiene la capacidad de producir rebaudiósido A sin la necesidad de incluir esteviol en el medio de cultivo.
En algunas modalidades, el microorganismo recombinante contiene adicionalmente y expresa un gen GGPPS recombinante con el objeto de proporcionar niveles incrementados del precursor diterpeno de difosfato de geranilgeranil, para el flujo incrementado a través de la trayectoria biosintética de rebaudiósido A. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante contiene adicionalmente y expresa genes recombinantes involucrados en la biosíntesis de diterpeno o producción de los precursores terpenoides, por ejemplo, genes en la trayectoria MEP o MEV planteados anteriormente.
B. 3 Polipéptidos de Biosíntesis de Dulcósido A y Rebaudiósido C La biosíntesis de rebaudiósido C y/o dulcósido A involucra la glucosilación y ramnosilación del aglicona esteviol. De manera específica, el dulcósido A puede ser formado mediante la glucosilación del 13-OH de esteviol el cual forma el esteviol-13-O-glucósido, ramnosilación del C-2' de la 13-O-glucosa de esteviol-13-O-glucósido la cual forma el 1,2 ramnobiósido, y la glucosilación del carboxilo C-19 del 1,2 ramnobiósido. El rebaudiósido C puede ser formado mediante la glucosilación del C-3' de la C-13-O-glucosa del dulcósido A. El orden en el cual ocurre cada una de las reacciones de glucosilación puede variar. Véase la figura 2B.
Se ha descubierto que la conversión de esteviol a dulcósido A en un huésped recombinante puede lograrse mediante la expresión de gene(s) que codifican los siguientes UGTs funcionales: 85C2, 91D2, y 74G1. Por lo tanto, un microorganismo recombinante que expresa estos tres UGTs y una sintetasa de ramnosa pueden elaborar un dulcósido A cuando son alimentados con esteviol en el medio. De manera alternativa, un microorganismo recombinante que expresa dos UGTs, 91D2 y 74G1, y sintetasa de ramnosa pueden elaborar un dulcósido A cuando se alimentan con monósido, esteviol-13-0-glucósido o esteviol-19-O-glucósido, en el medio. De manera similar, la conversión de esteviol a rebaudiósido C en un microorganismo recombinante puede lograrse mediante la expresión de gene(s) que codifican UGTs 85C2, 91D2, 74G1, y 76G1 y sintetasa de ramnosa cuando son alimentados con esteviol, mediante la expresión de genes que codifican a los UGTs 91D2, 74G1 y 76G1, y sintetasa de ramnosa cuando se alimenta con esteviol-13-O-glucósido, mediante la expresión de genes que codifican a los UGTs 85C2, 91D2 y 76G1, y sintetasa de ramnosa cuando se alimentan con esteviol-19-O-glucósido, o mediante la expresión de genes que codifican a los UGTs 91D2 y 76G1 y sintetasa de ramnosa cuando se alimenta con rubusósido. Normalmente, uno o más de estos genes son los genes recombinantes que han sido transformados en un microorganismo que no los posee de manera natural.
Los polipéptidos UGT91D2, UGT74G1, UGT76G1 y UGT85C2s adecuados, incluyen a los polipéptidos funcionales UGTs planteados en la presente descripción. La sintetasa de ramnosa proporciona cantidades incrementadas del UDP-donarte de ramnosa para la ramnosilación del compuesto de esteviol aceptante. Las sintetasas de ramnosa adecuadas incluyen a aquellas elaboradas mediante Arabidópsis thaliana, tales como el producto del gen RHM2 de A. thaliana.
En algunas modalidades, un polipéptido UGT79B3 es sustituido por un polipéptido UGT91D2. Los polipéptidos UGT79B3 adecuados incluyen a aquellos elaborados mediante Arabidópsis thaliana, los cuales tienen la capacidad de la ramnosilación de esteviol 13-O-monosido in vitro. La A. thaliana UGT79B3 puede ramnosilar compuestos glucosilados para formar 1 ,2-ramnosidos. La secuencia de aminoácido de una Arabidópsis thaliana UGT79B3 está establecida en la SEQ ID NO: 150. La secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:150 está establecida en la SEQ ID NO:151.
En algunas modalidades el rebaudiósido C puede ser producido utilizando métodos in vitro mientras que se suministra el UDP-azúcar adecuado o un sistema libre de células para la regeneración de UDP-azúcares. Véase, por ejemplo, la publicación "Una plataforma metabólica libre de células integrada para producción de proteínas y biología sintética" (An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology) de Jewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJ y Swartz JR en Molecular Systems Biology, 4, artículo 220 (2008). Las reacciones pueden ser llevadas a cabo juntas, o paso a paso. Por ejemplo, el rebaudiósido C puede ser producido a partir de rubusósido con la adición de cantidades estequiométricas de UDP-ramnosa y UGT91d2e, seguido por la adición deUGT76G1 y un exceso o suministro estequiométrico de UDP-glucosa. En algunas modalidades se utilizan las fosfatasas para remover productos secundarios y mejorar las producciones de reacción.
En otras modalidades, el huésped recombinante expresa uno o más genes involucrados en la biosíntesis de esteviol, por ejemplo, un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y/o un gen KAH. Por lo tanto, por ejemplo, un microorganismo que contiene un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y un gen KAH, además de un gen UGT85C2, un gen UGT74G1, un gen UGT91D2 y un gen UGT76G1 gene, tiene la capacidad de producir el rebaudiósido C sin la necesidad de incluir esteviol en el medio de cultivo. Además, el huésped recombinante normalmente expresa un gen endógeno o un gen recombinante que codifica una sintetasa de ramnosa dicho gen es útil con el objeto de proporcionar cantidades incrementadas de la UDP-ramnosa donante para la ramnosilación del compuesto de esteviol aceptante. Las sintetasas de ramnosa adecuadas incluyen a aquellas elaboradas mediante Arabidopsis thaliana, tales como el producto del gen de A. thaliana RHM2.
Un experto en la materia reconocerá que mediante la modulación de los niveles expresión relativos de los genes UGT diferentes, así como también modulando la disponibilidad de la UDP-ramnosa, un huésped recombinante puede ser adaptado a medida para producir de manera específica productos de esteviol y esteviol glucósido en una proporción deseada. La regulación transcripcional de genes de biosíntesis de esteviol, y genes de biosíntesis de esteviol glucósido puede lograrse mediante una combinación de activación transcripcional y represión utilizando las técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Para las reacciones in vitro, un experto en la materia reconocerá que la adición de niveles diferentes de enzimas UGT en combinación o bajo condiciones las cuales impactan las actividades relativas de los diferentes UGTS en combinación dirigirá la síntesis hacia una proporción deseada de cada esteviol glucósido.
En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente y expresa un gen GGPPS recombinante con el objeto de proporcionar niveles incrementados del precursor de diterpeno de difosfato de geranilgeranil, para flujo incrementado a través de la trayectoria biosintética de rebaudiósido A. En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente un término genético para silenciar o reducir el expresión de las trayectorias diferentes a esteviol que consumen difosfato de geranilgeranil, ácido ent-caurenóico o farnesil pirofosfato, mediante lo cual se proporciona un flujo incrementado a través de las trayectorias biosintéticas del esteviol y esteviol glucósido. Por ejemplo, el flujo para las trayectorias de producción de esterol tales como ergosterol pueden ser reducidas por sub-regulación del gen ERG9. En las células que producen giberelinas, la síntesis de giberelina puede ser sub-regulada para incrementar el flujo de ácido ent-caurenóico a esteviol. En los organismos de producción carotenoides, el flujo para esteviol puede ser incrementado mediante la sub-regulación de uno o más genes biosintéticos carotenoides.
En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente y expresa los genes recombinantes involucrados en la biosíntesis de diterpeno o la producción de precursores de terpenoide, por ejemplo, los genes en la trayectoria MEP o MEV planteados más adelante.
En algunas modalidades, a huésped recombinante tal como un microorganismo produce la composición de esteviol glucósidos que tiene más de por lo menos el 15% de rebaudiósido C del total de esteviol glucósidos, por ejemplo, por lo menos el 20% de rebaudiósido C, del 30 al 40% de rebaudiósido C, del 40 al 50% de rebaudiósido C, del 50 al 60% de rebaudiósido C, del 60 al 70% de rebaudiósido C, del 70 al 80% de rebaudiósido C, del 80 al 90% de rebaudiósido C. En algunas modalidades, un huésped recombinante tal como un microorganismo produce la composición de esteviol glucósidos que tiene por lo menos el 90% de rebaudiósido C, por ejemplo, del 90 al 99% de rebaudiósido C. Oros esteviol glucósidos presentes pueden incluir a aquellos representados en las Figures 2A y 2B, tal como esteviol monósidos, esteviol glucobiósidos, esteviol ramnobiósidos, rebaudiósido A, y dulcósido A. En algunas modalidades, la composición enriquecida con rebaudiósido C producida por el huésped puede ser purificada adicionalmente y el rebaudiósido C o dulcósido A, purificados de esta manera pueden mezclarse entonces con otros esteviol glucósidos, sabores, o edulcorantes para obtener un sistema de sabor deseado o composición edulcorante. Por ejemplo, una composición enriquecida con rebaudiósido C producida por un microorganismo recombinante puede ser combinada con una composición enriquecida con rebaudiósido A, F, o D producida para un microorganismo recombinante diferente, con rebaudiósido A, F, o D purificado a partir de un extracto de estevia, o con rebaudiósido A, F, o D producidos in vitro.
B. 4 Polipéptidos de Biosíntesis de Rebaudiósido E y Rebaudiósido D La biosíntesis de rebaudiósido E y/o rebaudiósido D involucra la glucosilación de la aglicona de esteviol. De manera específica, el rebaudiósido E puede ser formada mediante la glucosilación del 13-OH de esteviol la cual forma el esteviol-13-O-glucosido, la glucosilación del C-2' del 13-O-glucosa de estev¡ol-13-O-glucosido la cual forma el esteviol-1 ,2-biosido, la glucosilación del C-19 carboxilo del 1,2-biosido para formar el 1 ,2-esteviosido, y la glucosilación del C-2' de la 19-O-glucosa del 1 ,2-steviosido para formar el rebaudiósido E. El Rebaudiósido D puede ser formado mediante glucosilación del C-3' del C-13-O-glucosa de rebaudiósido E. El orden en el cual ocurre cada reacción de glucosilación puede variar. Por ejemplo, la glucosilación del C-2' de la 19-O-glucosa puede ser el último paso en la trayectoria, en donde el Rebaudiósido A es un intermediario en la trayectoria. Véase la figura 2C.
Se ha descubierto que la conversión de esteviol a rebaudiósido D en un huésped recombinante puede lograrse mediante la expresión de gen(es) que codifican los siguientes UGTs funcionales: 85C2, 91D2, 74G1 y 76G1. Por lo tanto, un microorganismo recombinante que expresa estos cuatro UGTs puede elaborar el rebaudiósido D cuando se alimenta con esteviol en el medio. De manera alternativa, un microorganismo recombinante que expresa dos UGTs funcionales, 91D2 y 76G1, pueden elaborar el rebaudiósido D cuando se alimenta con rubusósido o 1 ,2-steviosido en el medio. Como otra alternativa, un microorganismo recombinante que expresa tres UGTs funcionales, 74G1, 91D2 y 76G1, puede elaborar el rebaudiósido D cuando se alimenta con el monósido, esteviol-13-O-glucosido, en el medio. De manera similar, la conversión de esteviol-19-O-glucosido a rebaudiósido D en un microorganismo recombinante puede lograrse mediante la expresión de genes que codifican UGTs 85C2, 91D2 y 76G1, cuando se alimenta con esteviol-19-O-glucosido. Normalmente, uno o más de estos genes son genes recombinantes que han sido transformados en un huésped que no los posee de manera natural.
Los polipéptidos UGT91D2, UGT74G1 , UGT76G1 y UGT85C2s adecuados incluyen el polipéptido UGTs funcional planteado en la presente descripción. En algunas modalidades, un polipéptido UGT79B3 es sustituido por un UGT91, como se planteó anteriormente.
En algunas modalidades, el rebaudiósido D o el rebaudiósido E pueden ser producidos utilizando métodos in vitro mientras que se suministra el UDP-azúcar adecuado o un sistema libre de células para la regeneración de UDP-azúcares. Véase, por ejemplo, la publicación de Jewett C y asociados Molecular Systems Biology, Vol. 4, artículo 220 (2008). Las conversiones que requieren de reacciones múltiples pueden ser llevadas a cabo juntas o paso a paso. El rebaudiósido D puede ser producido a partir de Rebaudiósido A que es un extracto enriquecido disponible comercial mente o producido por medio de biosíntesis, con la adición de cantidades esteq uiométricas o en cantidades en exceso de UDP-glucosa y UGT91D2e. En algunas modalidades se utilizan las fosfatasas para remover los productos secundarios y mejorar las producciones de reacción.
Un experto en la materia reconocerá que modulando los niveles de expresión relativos de los genes UGT diferentes, un huésped recombinante puede ser ajustado a medida para producir de manera específica productos de esteviol y esteviol glucósido en una proporción deseada. La regulación transcripcional de genes de biosíntesis de esteviol y genes de biosíntesis de esteviol glucósido puede lograrse mediante una combinación de activación transcripcional y represión utilizando las técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Para las reacciones in vitro, un experto en la materia reconocerá que la adición de niveles diferentes de enzimas UGT en combinación o bajo condiciones las cuales ¡mpactan las actividades relativas de los diferentes UGTS en combinación dirigirá la síntesis hacia una proporción deseada de cada esteviol glucósido. Un experto en la materia reconocerá que una proporción más alta de rebaudiósido D o E o la conversión más eficiente a rebaudiósido D o E puede ser obtenida con una enzima de diglucosilacion que tiene una actividad superior para la reacción de 19-O-glucósido en comparación con la reacción 13-O-glucosido (sustratos de rebaudiósido A y esteviosido).
En otras modalidades, el huésped recombinante expresa uno o más genes involucrados en la biosíntesis de esteviol, por ejemplo, un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y/o un gen KAH. por lo tanto, por ejemplo, un microorganismo que contiene un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y un gen KAH, además de un gen UGT85C2, un gen UGT74G1, un gen UGT91D2 y un gen UGT76G1, tiene la capacidad de producir rebaudiósidos E y D sin la necesidad de incluir esteviol en el medio de cultivo.
En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente y expresa un gen GGPPS recombinante con el objeto de proporcionar niveles incrementados del precursor de diterpeno de difosfato de geranilgeranil, para flujo incrementado a través de la trayectoria biosintética de esteviol. En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente un término genético para silenciar la expresión de trayectorias diferentes de esteviol que consumen difosfato de geranilgeranil, ácido ent-caurenóico o farnesil pirofosfato, mediante lo cual se proporciona un flujo incrementado a través de las trayectorias biosintéticas esteviol y esteviol glucósidos. Por ejemplo, el flujo para las trayectorias de producción de esterol, tales como, ergosterol pueden reducirse mediante la sub-regulación del gen ERG9. En las células que producen giberelinas, la síntesis de giberelina puede ser sub-regulada para incrementar el flujo de ácido ent-caurenóico para esteviol. En los organismos de producción de carotenoides, el flujo para esteviol puede ser incrementado mediante la sub-regulación de uno o más genes biosintéticos de carotenoides. En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente y expresa genes recombinantes involucrados en la biosíntesis de diterpeno o la producción de precursores de terpenoide, por ejemplo, genes en las trayectorias MEP o MEV planteadas más adelante.
En algunas modalidades, un huésped recombinante tal como un microorganismo produce la composición enriquecida por rebaudiósido de esteviol glucósidos que tienen más de por lo menos el 3% de rebaudiósido D por peso total de esteviol glucósidos, por ejemplo, por lo menos el 4% de rebaudiósido D por lo menos el 5% de rebaudiósido D, del 10 al 20% de rebaudiósido D , del 20 al 30% de rebaudiósido D, del 30 al 40% de rebaudiósido D, del 40 al 50% de rebaudiósido D, del 50 al 60% de rebaudiósido D, del 60 al 70% de rebaudiósido D, del 70 ai 80% de rebaudiósido D. En algunas modalidades, un huésped recombinante tal como un microorganismo produce la composición de esteviol glucósidos que tiene por lo menos el 90% de rebaudiósido D, por ejemplo, del 90 al 99% de rebaudiósido D. Otros esteviol glucósidos presentes pueden incluir a aquellos representados en la figura 2C, tales como esteviol monósidos, esteviol glucobiósidos, rebaudiósido A, rebaudiósido E y esteviosido. En algunas modalidades, la composición enriquecida por rebaudiósido D producida por el huésped (por ejemplo, un microorganismo) puede ser purificada adicionalmente y el rebaudiósido D o rebaudiósido E, purificados de esta manera pueden ser mezclados con otros esteviol glucósidos, sabores, o edulcorantes para obtener un sistema de sabor deseado o composición edulcorante. Por ejemplo, una composición enriquecida con rebaudiósido D producida por un huésped recombinante puede ser combinada con una composición enriquecida con rebaudiósido A, C, o F producida para un huésped recombinante diferente, con rebaudiósido A, F, o C purificado a partir de un extracto de estevia, o con rebaudiósido A, F, o C producido in vitro.
B. 5 Polipéptidos de Biosíntesis de Rebaudiósido F La biosíntesis de rebaudiósido F involucra la glucosilación y xilosilación de la aglicona de esteviol. De manera específica, el rebaudiósido F puede ser formado mediante la glucosilación del 13-OH de esteviol, el cual forma el esteviol-13-O-glucósido, xilosilación del C-2' de la 13-O-glucosa de esteviol- 13-0-glucósido la cual forma el esteviol-1 ,2-xilobiosido, la glucosilación del C-19 carboxilo del 1 ,2-xilobiosido para formar el 1 ,2-estevioxilosido, y la glucosilación del C-3' de la C- 3-0-glucosa del 1 ,2-estevioxilosido para formar el rebaudiósido F. El orden en el cual ocurre cada reacción de glucosilación puede variar. Véase la figura 2D.
Se ha descubierto que la conversión de esteviol a rebaudiósido F en un huésped recombinante puede lograrse mediante la expresión de genes que codifican a los siguientes UGTs funcionales: 85C2, 91D2, 74G1 y 76G1, junto con la UDP-glucosa dehidrogenasa endógena o expresado en forma recombinante y UDP-decarboxilasa de ácido glucorónico. Por lo tanto, un microorganismo recombinante que expresa estos cuatro UGTs junto con UDP-glucosa dehidrogenasa endógena o recombinante y UDP- decarboxilasa de ácido glucorónico puede elaborar el rebaudiósido F cuando se alimenta con esteviol en el medio. De manera alternativa, un microorganismo recombinante que expresa dos UGTs funcionales, 91D2 y 76G1, puede elaborar el rebaudiósido F cuando se alimenta con rubusósido en el medio.
Como otra alternativa, un microorganismo recombinante que expresa un UGT76G1 funcional puede elaborar el rebaudiósido F cuando se alimenta con 1,2 esteviorhamnosido. Como otra alternativa, un microorganismo recombinante que expresa tres UGTs funcionales, 74G1, 91D2 y 76G1, puede elaborar el rebaudiósido F cuando se alimenta con el monósido, esteviol-13-O-gl ucósido, en el medio. De manera similar, la conversión de esteviol-19-O-glucósido a rebaudiósido F en un microorganismo recombinante puede lograrse mediante la expresión de genes que codifican los UGTs 85C2, 91D2 y 76G1 cuando se alimenta con esteviol-19-O-glucósido. Normalmente, uno o más de estos genes son genes recombinantes que han sido transformados en un huésped que no los posee de manera natural.
Los polipéptidos UGT9ID2, UGT74GI, UGT76GI y UGT85C2s adecuados, incluyen los polipéptidos UGTs funcionales planteados en la presente descripción. En algunas modalidades, un polipéptido UGT79B3 es sustituido por un UGT91, como se planteó anteriormente. El UDP-glucosa dehidrogenasa y UDP- decarboxilasa de ácido glucorónico proporcionan cantidades incrementadas de la UDP-xilosa donante para la xilosilación del compuesto de esteviol aceptante. Los UDP-glucosa dehidrogenasas adecuadas y UDP-decarboxilasas de ácido glucorónico incluyen a aquellas elaboradas mediante Arabidopsis thaliana o Cryptococcus neoformans . Por ejemplo, la UDP-glucosa dehidrogenasa adecuada y los polipéptidos UDP-decarboxilasas de ácido glucorónico pueden ser codificadas mediante el gen A. thaliana UGD1 y el gen UXS3, respectivamente. Véase la publicación de Oka y Jigami, FEBS J. 273: páginas 2645 a 2657 (2006).
En algunas modalidades el rebaudiósido F puede ser producido utilizando los métodos in vitro mientras que suministra el UDP-azúcar apropiado o un sistema libre de células para la regeneración de UDP-azúcares. Véase, por ejemplo, la publicación de Jewett MC y asociados "Molecular Systems Biology", Vol. 4, artículo 220 (2008). Las reacciones pueden ser llevadas a cabo juntas o paso por paso. Por ejemplo, el rebaudiósido F puede ser producido a partir de rubusósido con la adición de cantidades estequiométricas de UDP-xilosa y UGT9ID2e, seguido por la adición de UGT76G1 y un exceso o suministro estequiométrico de UDP-glucosa. En algunas modalidades se utilizan las fosfatasas para remover los productos secundarios y mejorar las producciones de reacción.
En otras modalidades, el huésped recombinante expresa uno o más genes involucrados en la biosíntesis de esteviol, por ejemplo, un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y/o un gen KAH.
Por lo tanto, por ejemplo, un microorganismo que contiene un gen CDPS, un gen KS, un gen KO y un gen KAH, además de un gen UGT85C2, un gen UGT74GI, un gen UGT9ID2 y un gen UGT76GI, tiene la capacidad de producir rebaudiósido F sin la necesidad de incluir esteviol en el medio de cultivo. Además, el huésped recombinante normalmente expresa un gen endógeno o un gen recombinante que codifica una dehidrogenasa de glucosa UDP y una decarboxilasa de ácido glucorónico-U DP. Dichos genes son útiles con el objeto de proporcionar cantidades incrementadas de la UDP-xilosa donante para la xilosilación del compuesto de esteviol aceptante. Las UDP-glucosa dehidrogenasas y UDP-decarboxilasas de ácido glucorónico adecuadas incluyen a aquellas elaboradas mediante Arabidopsis thaliana o Cryptococcus neoformans. Por ejemplo, los polipéptidos de UDP-glucosa dehidrogenasa y UDP-decarboxilasas de ácido glucorónico adecuados puede ser codificadas por el gen de A. thaliana UGD 1 y el gen UXS3, respectivamente. Véase la publicación de Oka y Jigami, FEBS J. 273: páginas 2645 a 2657 (2006).
Un experto en la materia reconocerá que mediante la modulación de los niveles de expresión relativos de los diferentes genes UGT, así como también la modulación de la disponibilidad de UDP-xilosa, un microorganismo recombinante puede ser ajustado de manera específica para producir productos de esteviol y esteviol glucósido en una proporción deseada. La regulación transcripcional de genes de biosíntesis de esteviol puede ser lograda mediante una combinación de activación transcripcional y represión utilizando las técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Para las reacciones in vitro, un experto en la materia reconocerá que la adición de diferentes niveles de enzimas UGT en combinación o bajo condiciones las cuales impactan las actividades relativas de los diferentes UGTS en combinación dirigirá la síntesis hacia una proporción deseada de cada uno de los esteviol glucósidos.
En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente y expresa un gen GGPPS recombinante con el objeto de proporcionar niveles incrementados del precursor de diterpeno de difosfato de geranilgeranil, para el flujo incrementado a través de la trayectoria biosintética del esteviol. En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente un término genético para silenciar la expresión de trayectorias diferentes de esteviol que consumen difosfato de geranilgeranil, ácido ent-caurenóico o farnesil pirofosfato, mediante lo cual se proporciona un flujo incrementado a través de las trayectorias biosintéticas del esteviol y esteviol glucósidos. Por ejemplo, el flujo para las trayectorias de producción de esterol, tales como ergosterol, se puede reducir mediante la sub-regulación del gen ERG9 gene. En las células que producen giberelinas, la síntesis de giberelina puede ser sub-regulada para incrementar el flujo de ácido ent-caurenóico para esteviol. En los organismos que producen carotenoides, el flujo para esteviol puede ser incrementado mediante la sub-regulación de uno o más genes biosintéticos de carotenoides. En algunas modalidades, el huésped recombinante contiene adicionalmente y expresa los genes recombinantes involucrados en la biosíntesis de diterpeno, por ejemplo, los genes en la trayectoria MEP planteados más adelante.
En algunas modalidades, un huésped recombinante tal como un microorganismo produce una composición enriquecida con rebaudiósido F de esteviol glucósidos que tiene más de por lo menos el 4% de rebaudiósido F por peso total de esteviol glucósidos, por ejemplo, por lo menos el 5% de rebaudiósido F, por lo menos el 6% de rebaudiósido F, del 10 al 20% de rebaudiósido F, del 20 al 30% de rebaudiósido F, del 30 al 40% de rebaudiósido F, del 40 al 50% de rebaudiósido F, del 50 al 60% de rebaudiósido F, del 60 al 70% de rebaudiósido F, del 70 al 80% de rebaudiósido F. En algunas modalidades, un huésped recombinante tal como un microorganismo, produce la composición de esteviol glucósidos que tiene por lo menos el 90% de rebaudiósido F, por ejemplo, del 90 al 99% de rebaudiósido F. Otros esteviol glucósidos presentes pueden incluir a aquellos representados en la figura 2A y 2D, tales como esteviol monósidos, esteviol glucobiósidos, esteviol xilobiósidos, rebaudiósido A, estevioxilósido, rubusósido y esteviosido. En algunas modalidades, la composición enriquecida con rebaudiósido F producida por el huésped puede ser mezclada con otros esteviol glucósidos, sabores, o edulcorantes para obtener un sistema de sabor deseado o composición edulcorante. Por ejemplo, una composición enriquecida con rebaudiósido F producida por un microorganismo recombinante puede ser combinada con una composición enriquecida con rebaudiósido A, C, o D producida por un microorganismo recombinante diferente, con rebaudiósido A, C, o D purificada a partir de un extracto de estevia, o con rebaudiósido A, C, o D producido in vitro.
C. Otros Polipéptidos Los genes para polipéptidos adicionales cuya expresión facilita la producción más eficiente o a mayor escala de esteviol o a esteviol glucósido también pueden ser introducidos en un huésped recombinante. Por ejemplo, un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta también puede contener uno o más genes que codifican una sintasa de difosfato de geranilgeranil (GGPPS, también denominada como GGDPS). Como otro ejemplo, el huésped recombinante puede contener uno o más genes que codifican una sintetasa de ramnosa, o uno o más genes que codifican una dehidrogenasa de glucosa UDP y/o una decarboxilasa de ácido glucorónico-UDP. Como otro ejemplo, un huésped recombinante también puede contener uno o más genes que codifican una reductasa de citocromo P450 (CPR). La expresión de un CPR recombinante facilita el ciclado de NADP+ para regenerar el NADPH, el cual es utilizado como un cofactor para la biosíntesis de terpenoide. Se pueden utilizar otros métodos para también regenerar los niveles de NADHP. En circunstancias en las cuales el NADPH se vuelve limitante; las cepas pueden ser modificadas adicionalmente para incluir genes de transhidrogenasa exógena. Véase, por ejemplo, la publicación de Sauer y asociados, J. Biol. Chem. 279: páginas 6613 a 6619 (2004). Aquellos expertos en la material conocen otros métodos para reducir o modificar de otra forma la proporción de NADH/NADPH de manera que se incremente el nivel del cofactor deseado.
Como otro ejemplo, el huésped recombinante puede contener uno o más genes que codifican uno o más enzimas en la trayectoria MEP o la trayectoria de mevalonato. Dichos genes son útiles debido a que pueden incrementar el flujo de carbono dentro de la trayectoria de biosíntesis de diterpeno, produciendo difosfato de geranilgeranil a partir de difosfato isopentenilo y difosfato de dimetilalilo generado por la trayectoria. La difosfato de geranilgeranil producido de esta manera puede ser dirigida hacia la biosíntesis de esteviol y esteviol glucósido debido a la expresión de la biosíntesis de polipéptidos de esteviol y biosíntesis de polipéptidos de esteviol glucósido.
C. 1 Polipéptidos de Biosíntesis de MEP En algunas modalidades, un huésped recombinante contiene uno o más genes que codifican las enzimas involucradas en la trayectoria de 4-fosfato de metileritritol (MEP) para la biosíntesis de isoprenoide. Las enzimas en la trayectoria MEP incluyen sintasa de 5-fosfato de deoxixilulosa (DXS\), reductoisomerasa de D-2-deoxixilulosa de 5-fosfato (DXR), sintasa de 4-difosfocitidil de 1 -2-C-metil-D-eritritol (CMS), cinasa de 4-difosfocitidil de 1 -2-C-metil-D-eritritol (CMK), sintasa de 4-difosfocitidil-2-C-met¡l-D-eritritol de 2,4-ciclodifosfato (MCS), sintasa de 1 -hidroxi-2-metil-2(E)-butenil de 4-difosfato (HDS) y reductasa de -hidroxi-2-metil-2(E)-butenil-4-difosfato (HDR). Uno o más genes de DXS, gens de DXR, genes de CMS, genes de CMK, genes de MCS, genes de HDS y/o genes de HDR pueden ser incorporados dentro de un microorganismo recombinante. Véase, la publicación de Rodríguez-Concepción y Boronat, Planta Phys. 130: páginas 1079 a 1089 (2002).
Los genes adecuados que codifican a los polipéptidos DXS, DXR, CMS, CMK, MCS, HDS y/o HDR incluyen a aquellos elaborados mediante E. coli, Arabidopsis thaliana y Syneehoeoeeus leopoliensis. Las secuencias de nucleótidos que codifican a los polipéptidos DXR se describen, por ejemplo, en Patente Norteamericana No. 7,335,815.
C. 2 Polipéptidos de Biosíntesis de Mevalonato En algunas modalidades, un huésped recombinante contiene uno o más genes que codifican las enzimas involucradas en la trayectoria de mevalonato para la biosíntesis de isoprenoide. Los genes adecuados para la transformación en un huésped codifican la enzimas en la trayectoria de mevalonato tales como una reductasa de 3-hidroxi-3-metil-glutaril (HMG)-CoA truncada (tHMG), y/o un gen que codifica una cinasa de mevalonato (MK), y/o un gen que codifica una fosfocinasa de mevalonato (PMK), y/o un gen que codifica una decarboxilasa de pirofosfato de mevalonato (MPPD). Por lo tanto, uno o más genes de reductasa de HMG-CoA, genes MK, genes PMK, y/o genes MPPD pueden ser incorporados dentro de un huésped recombinante, tal como un microorganismo. Los genes adecuados que codifican los polipéptidos de la trayectoria de mevalonato son conocidos. Por ejemplo, los polipéptidos adecuados incluyen a aquellos elaborados mediante E. coli, Paraeoeeus denitrificans, Saccharomyces cerevisiae , Arabidopsis thaliana, Kitasatospora griseola, Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Gallus gallus, Streptomyces sp. KO-3988, Nicotiana attenuata , Kitasatospora griseola. Hevea brasiliensis, Enterococcus faecium y Haematococcus pluvialis. Véanse, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 7,183,089, 5,460,949, y 5,306,862.
D. Homólogos Funcionales Los homólogos funcionales de los polipéptidos descritos anteriormente, también son adecuados para utilizarse en la producción de esteviol o esteviol glucósidos en un huésped recombinante. Un homólogo funcional es un polipéptido que tiene una similitud de secuencia para un polipéptido de referencia, y que realiza una o más de las funciones bioquímicas o fisiológicas del polipéptido de referencia. Un homólogo funcional y el polipéptido de referencia pueden ser polipéptidos de ocurrencia natural, y la similitud de secuencia puede deberse a los eventos evolutivos convergentes o divergentes. Como tales, los homólogos funcionales son, en algunas ocasiones, designados en la literatura como homólogos, u ortólogos, o parálogos. Las variantes de un homólogo funcional que ocurre de manera natural, tales como los polipéptidos codificados por los mutantes de una secuencia de codificación de tipo natural, pueden por sí mismos ser homólogos funcionales. Los homólogos funcionales también pueden ser creado por medio de la mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia de codificación para un polipéptido, o combinando los dominios de las secuencias de codificación para los polipéptidos diferentes que ocurren de manera natural ("intercambio de dominio"). Las técnicas para modificar los genes que codifican los polipéptidos funcionales UGTs descritas en la presente descripción son conocidas e incluyen, entre otras cosas, las técnicas de evolución dirigidas, las técnicas de mutagénesis dirigidas por el sitio y las técnicas de mutagénesis aleatorias, y pueden ser útiles para incrementar la actividad específica de un polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, alterar los niveles de expresión niveles, alterar la ubicación sub-celular, o modificar las interacciones polipéptido: polipéptido en una forma deseada. Dichos polipéptidos modificados se consideran homólogos funcionales. El término "homólogo funcional" es aplicado en algunas ocasiones al ácido nucleico que codifica una funcionalidad del polipéptido homólogo.
Los homólogos funcionales pueden ser identificados mediante el análisis de las alineaciones de secuencia de nucleótido y polipéptido. Por ejemplo, realizando una búsqueda en una base de datos de secuencias de nucleótido o polipéptido se pueden identificar los homólogos de polipéptidos de biosíntesis de esteviol o esteviol glucósido. El análisis de secuencia puede involucrar al análisis BLAST, BLAST recíproco, o PSI-BLAST de las bases de datos no redundantes que utilizan una secuencia de aminoácidos GGPPS, CDPS, KS, KO o KAH como la secuencia de referencia. La secuencia de aminoácido es, en algunos casos, deducida a partir de la^ secuencia de nucleótido. Aquellos polipéptidos en la base de datos que tienen más del 40% de identidad de secuencia son candidatos para evaluación posterior por su capacidad de adecuación como un polipéptido de biosíntesis de esteviol o esteviol glucósido. La similitud de secuencia de aminoácido permite las sustituciones conservadoras de los aminoácidos, tales como la sustitución de un residuo hidrófobo a otro o la sustitución de un residuo polar por otro. Si se desea, se puede llevar a cabo la inspección manual de dichos candidatos con el objeto de limitar el número de candidatos a ser evaluados posteriormente. La inspección manual puede ser realizada seleccionado aquellos candidatos que parecen tener dominios presentes en los polipéptidos de biosíntesis de esteviol, por ejemplo, dominios funcionales conservados.
Las regiones conservadas pueden ser identificadas localizando una región dentro de secuencia primaria de aminoácido de un polipéptido de biosíntesis de esteviol o un esteviol glucósido que es una secuencia repetida, forma alguna estructura secundaria (por ejemplo, hélices y plantillas beta), establece los dominios cargados en forma positiva o negativa, o representa un motivo o dominio de proteína. Véase, por ejemplo, el sitio de la red mundial Pfam que describe las secuencias de consenso para una variedad de motivos y dominios de proteína En la Red Mundial en sanger.ac.uk/Software/Pfam/ y pfam.janelia.org/. La información incluida en la base de datos Pfam base de datos se describe en las publicaciones de Sonnhammer y asociados, Nucí. Acids Res., 26: páginas 320 a 322 (1998); Sonnhammer y asociados, Proteins, 28: páginas 405 a 420 (1997); y Bateman y asociados, Nucí. Acids Res., 27: páginas 260 a 262 (1999). Las regiones conservadas también pueden ser determinadas mediante las secuencias de alineación de los mismos polipéptidos o los polipéptidos relacionados de las especies cercanamente relacionadas. Las especies cercanamente relacionadas preferentemente son de la misma familia. En algunas modalidades, la alineación de las secuencias de dos especies diferentes es adecuada.
Normalmente, los polipéptidos que exhiben por lo menos aproximadamente el 40% de la identidad de secuencia de aminoácido son útiles para identificar las regiones conservadas. Las regiones conservadas de los polipéptidos relacionados exhiben por lo menos el 45% de identidad de la secuencia de aminoácido (por ejemplo, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, o por lo menos el 90% de identidad de la secuencia de aminoácido). En algunas modalidades, una región conservada exhibe por lo menos el 92%, el 94%, el 96%, el 98%, o el 99% de identidad de la secuencia de aminoácido.
Por ejemplo, los polipéptidos adecuados para la producción de esteviol glucósidos en un huésped recombinante incluyen homólogos funcionales de UGT91D2e, UGT91D2m, UGT85C, y UGT76G. Dichos homólogos tienen más del 90% (por ejemplo, por lo menos el 95% o el 99%) de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido de UGT91D2e (SEQ ID NO:5), UGT91D2m (SEQ ID NO:10), UGT85C (SEQ ID NO:3), o UGT76G (SEQ ID NO:7). Las variantes de los polipéptidos UGT91D2, UGT85C, y UGT76Gs normalmente tienen 10 o menos substituciones de aminoácidos dentro de la secuencia primaria de aminoácido, por ejemplo, 7 o menos substituciones de aminoácidos, 5 o substituciones conservadoras de aminoácidos, o entre 1 y 5 sustituciones. Sin embargo, en algunas modalidades, las variantes de los polipéptidos UGT91D2, UGT85C y UGT76Gs pueden tener 10 o más substituciones de aminoácidos (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, de 10 a 20, de 10 a 35, de 20 a 30, o de 25 a 35 sustituciones de aminoácidos). Las sustituciones pueden ser conservadoras, o en algunas modalidades, no conservadoras. Los ejemplos no limitantes de los cambios no conservadores en los polipéptidos UGT91D2e incluyen glicina a arginina y triptofano a arginina. Ejemplos no limitantes de sustituciones no conservadoras en los polipéptidos UGT76Gs incluyen valina a ácido glutámico, glicina a ácido glutámico, glutamina a alanina, y serina a prolina. Los ejemplos no limitantes de cambios a polipéptidos UGT85Cs incluyen histidina a ácido aspártico, prolina a serina, lisina a treonina, y treonina a arginina.
En algunas modalidades, un homólogo UGT91D2 útil puede tener substituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácidos) en regiones del polipéptido que están fuera de los circuitos pronosticados, por ejemplo, los residuos 20 a 26, 39 a 43, 88 a 95, 121 a 124, 142 a 158, 185 a 198, y 203 a 214 son circuitos pronosticados en el dominio de terminal N y los residuos 381 a 386 son circuitos pronosticados en el dominio de terminal C de la SEQ ID NO:5. Por ejemplo, un homólogo de UGT91D2 útil puede incluir por lo menos un aminoácido de sustitución en los residuos 1 a 19, 27 a 38, 44 a 87, 96 a 120, 125 a 141, 159 a 184, 199 a 202, 215 a 380, o 387 a 473 de la SEQ ID NO:5. En algunas modalidades, un homólogo UGT91D2 puede tener un aminoácido de sustitución en uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en los residuos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, y 438 de la SEQ ID NO:5. Por ejemplo, un homólogo UGT91D2 funcional puede tener un aminoácido de sustitución en uno o más de los residuos 206, 207, y 343, tales como una arginina en el residuo 206, una cisteína en el residuo 207, y una arginina en el residuo 343 de la SEQ ID NO:5. Véase, la SEQ ID NO:95. Otros homólogos funcionales de UGT91D2 pueden tener uno o más de los siguientes: una tirosina o fenilalanina en el residuo 30, una prolina o glutamina en el residuo 93, una serina o valina en el residuo 99, una tirosina o una fenilalanina en el residuo 122, una histidina o tirosina en el residuo 140, una serina o cisteína en el residuo 142, una alanina o treonina en el residuo 148, una metionina en el residuo 152, una alanina en el residuo 153, una alanina o serina en el residuo 156, una glicina en el residuo 162, una leucina o metionina en el residuo 195, un ácido glutámico en el residuo 196, una lisina o ácido glutámico en el residuo 199, una leucina o metionina en el residuo 211, una leucina en el residuo 213, una serina o fenilalanina en el residuo 221, una valina o isoleucina en el residuo 253, una valina o alanina en el residuo 286, una lisina o asparagina en el residuo 427, una alanina en el residuo 438, y ya sea una alanina o una treonina en el residuo 462 de la SEQ IDNO:5. Véanse los ejemplos 11 y 16, y las Tablas 12 y 14. Un polipéptido UGT91D2 variante útil también puede ser construido con base en la alineación establecida en la Figure 8.
En algunas modalidades, un homólogo UGT85C útil puede tener una o más substituciones de aminoácidos en los residuos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, y 471 de la SEQ ID NO:3. Los ejemplos no limitantes de homólogos UGT85C útiles incluyen polipéptidos que tienen sustituciones (con respecto a la SEQ ID NO:3) en el residuo 65; en el residuo 65 en combinación con el residuo 15, 270, 418, 440 o 441; en los residuos 13, 15, 60, 270, 289, y 418; sustituciones en los residuos 13, 60 y 270; sustituciones en los residuos 60 y 87; sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 243, y 270; sustituciones en los residuos 25 65, 71, 220, 243, 270, y 441; sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 389, y 394; sustituciones en los residuos 65, 71, 270, y 289; sustituciones en los residuos 220, 243, 270, y 334; o sustituciones en los residuos 270 y 289. Véanse el Ejemplo 17 y la Tabla 15.
En algunas modalidades, un homólogo UGT76G útil puede tener una o más substituciones de aminoácidos en los residuos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, y 346 de la SEQ ID NO:7. Los ejemplos no limitantes de homólogos UGT76G útiles incluyen polipéptidos que tienen sustituciones (con respecto a la SEQ ID NO:7) en los residuos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, y 291; en los residuos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, y 291; o en los residuos 74, 87,91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, y 346. Véase el Ejemplo 18 y la Tabla 16.
Los métodos para modificar la especificidad del sustrato de, por ejemplo, el UGT91D2e, son conocidos por aquellos expertos en la materia, e incluyen sin limitación, los métodos de mutagénesis dirigida por el sitio/racional, los métodos de evolución dirigida aleatoria y combinaciones en las cuales las técnicas de mutagénesis/saturación se realizan cerca del sitio activo de la enzima. Por ejemplo, véase la publicación de Sarah A. Osmani y asociados Phvtochemistrv 70 (2009) páginas 325 a 347.
Una secuencia candidato normalmente tiene una longitud que es desde el 80 por ciento hasta el 200 por ciento de la longitud de la secuencia de referencia, por ejemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 15 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 por ciento de la longitud de la secuencia de referencia. Un porcentaje de identidad para cualquier ácido nucleico o polipéptido candidato en relación con un ácido nucleico o polipéptido de referencia puede determinarse de la siguiente manera. Una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácido) está alineada con uno o más secuencias candidatas utilizando el programa de cómputo ClustalW (versión 1.83, parámetros por defecto), el cual permite las alineaciones de secuencias de ácido nucleico o polipéptido para ser llevadas a cabo a través de su longitud completa (alineación global). Chenna y asociados, Nucleic Acids Res., 31 (13): páginas 3497 a 500 (2003).
El software ClustalW calcula la mejor coincidencia entre una secuencia de referencia y una o más secuencias candidatas, y las alinea de manera que las identidades, similitudes y diferencias pueden ser determinadas. Las fisuras de uno o más residuos pueden insertarse en una secuencia de referencia, una secuencia candidato, o ambas, para aumentar al máximo las alineaciones de secuencia. Para la alineación en grupos de dos rápida de las secuencias de ácido nucleico, se utilizan los siguientes parámetros por defecto: tamaño de palabra: 2; tamaño de ventana: 4; método de clasificación: porcentaje; número de diagonales superiores: 4; y penalización de fisura: 5. Para la alineación múltiple de secuencias de ácido nucleico, se utilizan los siguientes parámetros: penalización de abertura de fisura: 10.0; penalización de extensión de fisura: 5.0; y transiciones de peso: si. Para alineación en grupos de dos rápida de secuencias de proteína, se utilizan los siguientes parámetros: tamaño de palabra: 1; tamaño de ventana: 5; método de clasificación:porcentaje; número de diagonales superiores: 5; penalización de fisura: 3. Para la alineación múltiple de secuencias de proteína, se utilizan los siguientes parámetros: matriz de peso: blosum; penalización de abertura de fisura: 10.0; penalización de extensión de fisura: 0.05; fisuras hidrófilas: encendido; residuos hidrófilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, y Lys; penalizaciones de fisura específicas de residuo: encendido. La salida del software ClustalW es una alineación de secuencia que refleja la relación entre las secuencias. El software ClustalW puede ser ejecutado, por ejemplo, en el sitio del Lanzador de búsqueda del Colegio Baylor de Medicina en la red mundial (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) y en el sitio del Instituto de bioinformática Europeo en la red mundial (ebi.ac.uk/clustalw).
Para determinar el porcentaje de identidad de un ácido nucleico o secuencia de aminoácido candidato a una secuencia de referencia, las secuencias son alineadas utilizando el software ClustalW, el número de coincidencias idénticas en la alineación se divide entre la longitud de la secuencia de referencia, y el resultado es multiplicado por 100. Se debe observar que el valor porcentual de identidad puede ser redondeado al décimo más cercano. Por ejemplo, 78.11, 78.12, 78.13, y 78.14 son redondeados hacia abajo a 78.1, mientras que 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, y 78.19 son redondeados hacia arriba a 78.2.
Se apreciará que un polipéptido funcional UGT91D2 puede incluir aminoácidos adicionales que no están involucrados en la glucosilación u otras actividades enzimáticas realizadas por UGT91D2, y por consiguiente, dicho polipéptido puede ser más largo de lo que podría ser de otra manera. Por ejemplo, un polipéptido UGT91D2 puede incluir una etiqueta de purificación, un péptido de tránsido de cloroplasto, a péptido de tránsito mitocondrial, un péptido de amiloplasto, péptido de señal, o una etiqueta de secreción agregada al término amino o carboxi. En algunas modalidades, un polipéptido UGT91D2 incluye una secuencia de aminoácido que funciona como un reportero, por ejemplo, una proteína verde fluorescente o una proteína amarrillo fluorescente.
II. Ácidos Nucleicos de Biosíntesis de Esteviol y Esteviol Glucósido Un gen recombinante que codifica un polipéptido descrito en la presente descripción comprende la secuencia de codificación para ese polipéptido, enlazado de manera operativa en sentido de orientación con una o más regiones regulatorias adecuadas para expresar el polipéptido. Debido a que muchos microorganismos tienen la capacidad de expresar productos genéticos múltiples a partir de un mARN policistrónico, los polipéptidos múltiples pueden ser expresados bajo el control de una región regulatoria única para esos microorganismos, si se desea. Una secuencia de codificación y una región regulatoria se consideran estar enlazados en forma operativa cuando la región regulatoria y secuencia de codificación se colocan de manera que la región regulatoria es efectiva para la regulación de transcripción o traducción de la secuencia. Normalmente, el sitio de inicio de traducción del cuadro de lectura de traslación de la secuencia de codificación se coloca entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en corriente descendente de la región regulatoria para un gen monocistrónico.
En muchos casos, la secuencia de codificación para un polipéptido descrito en la presente descripción se identifica en una especie diferente del huésped recombinante, es decir, es un ácido nucleico heterólogo. Por lo tanto, si el huésped recombinante es un microorganismo, la secuencia de codificación puede ser de otros microorganismos procarióticos o eucarióticos, de plantas o de animales. En algunos casos, sin embargo, la secuencia de codificación es una secuencia que es nativa para el huésped y está siendo introducida nuevamente en ese organismo. Una secuencia nativa puede ser distinguida con frecuencia de la secuencia que ocurre de manera natural por la presencia de secuencias no naturales enlazadas al ácido nucleico exógeno, por ejemplo, las secuencias regulatorias no nativas que flanquean una secuencia nativa en un término de ácido nucleico recombinante. Además, ácidos nucleicos exógenos transformados de manera estable, normalmente son integrados en posiciones diferentes de la posición en donde se encuentra la secuencia nativa.
El término "región regulatoria" se refiere a un ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos que influyen en el inicio e índice de transcripción o traducción, y estabilidad y/o movilidad de un producto de transcripción o traducción. Las regiones regulatorias incluyen, sin limitación, secuencias promotoras, secuencias de mejoramiento, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteína, elementos que se pueden inducir, secuencias de enlace de proteína, regiones no traducidas 5' y 3' (UTRs), sitios de inicio de transcripción, secuencias de terminación, secuencias poliadenilación, ¡ntrones, y combinaciones de los mismos. Una región regulatoria, normalmente comprende por lo menos un promotor central (basal). Una región regulatoria también puede incluir por lo menos un elemento de control, tal como una secuencia de mejoramiento, un elemento en corriente ascendente o una región de activación en corriente ascendente (UAR). Una región regulatoria está enlazada en forma operativa a una secuencia de codificación colocando la región regulatoria y la secuencia de codificación de manera que la región regulatoria es efectiva para la regulación de transcripción o traducción de la secuencia. Por ejemplo, para enlazar en forma operativa una secuencia de codificación y una secuencia de promotor, el sitio de inicio de la traducción del cuadro de lectura de traducción de la secuencia de codificación normalmente se coloca entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en corriente descendente del promotor. Una región regulatoria puede, sin embargo, ser posicionada tanto como aproximadamente 5,000 nucleótidos en corriente ascendente del sitio de inicio de la traducción, o aproximadamente 2,000 nucleótidos en corriente ascendente del sitio de inicio de la transcripción.
La elección de las regiones regulatorias que estarán incluidas depende de varios factores, que incluyen, sin limitación, eficiencia, capacidad de selección, capacidad de inducción, nivel de expresión deseada, y expresión diferencial durante ciertas etapas del cultivo. Es una cuestión rutinaria para un experto en la materia modular la expresión de una secuencia de codificación seleccionando en forma adecuada y posicionando las regiones regulatorias en relación con la secuencia de codificación. Se deberá comprender que más de una región regulatoria puede estar presente, por ejemplo, intrones, agentes de mejoramiento, regiones de activación en corriente ascendente, terminadores de transcripción, y elementos que se pueden inducir.
Uno o más genes pueden ser combinados en un término de ácido nucleico recombinante en "módulos" útiles para un aspecto particular de la producción de esteviol y/o esteviol glucósido. La combinación de una pluralidad de genes en un module, particularmente un módulo policistrónico, facilita el use del módulo en una variedad de especies. Por ejemplo, una agrupación de genes de biosíntesis de esteviol, o una agrupación de genes UGT, puede combinarse en un módulo policistrónico de manera que, después de la inserción de una región regulatoria adecuada, el módulo puede ser introducido dentro de una gran variedad de especies. Como otro ejemplo, una agrupación de genes UGT puede combinarse de manera que cada secuencia de codificación UGT está enlazada en forma operativa a una región regulatoria separada, para formar un módulo UGT. Dicho módulo puede ser utilizado en aquellas especies para las cuales la expresión monocistrónica es necesaria o deseable. Además de los genes útiles para la producción de esteviol o esteviol glucósido, un término recombinante normalmente contiene también un origen de replicación, y uno o más marcadores que se pueden seleccionar para el mantenimiento del término en las especies adecuadas.
Se apreciará que debido a la degeneración del código genético, una cantidad de ácidos nucleicos pueden codificar un polipéptido particular; es decir, para muchos aminoácidos, existe más de una tripleta de nucleótido que sirve como el codón para el aminoácido. Por lo tanto, los codones en la secuencia de codificación para un polipéptido determinado pueden ser modificados de manera que se obtiene la expresión óptima en un huésped particular, utilizando las Tablas de desviación de los codones adecuados para ese huésped (por ejemplo, microorganismo). Las secuencias de nucleótidos establecidas SEQ ID NOs: 18-25, 34-36, 40-43, 48-49, 52-55, 60-64, y 70-72 que codifican ciertas enzimas para la biosíntesis de esteviol y esteviol glucósido, modificadas para la expresión incrementada en levadura. Como los ácidos nucleicos aislados, estas secuencias modificadas pueden existir como moléculas purificadas y pueden ser incorporadas en un vector o un virus para utilizarse en la construcción de módulos para términos de ácido nucleico recombinante.
En algunos casos, es deseable inhibir uno o más funciones de un polipéptido endógeno con el objeto de desviar los intermediarios metabólicos hacia la biosíntesis de esteviol o esteviol glucósido. Por ejemplo, puede ser deseable sub-regular la síntesis de esteróles en una cepa de levadura con el objeto de incrementar adicionalmente la producción de esteviol o esteviol glucósido, por ejemplo, sub-regulando epoxidasa de escualeno. Como otro ejemplo, puede ser deseable inhibir la función de degradación de productos genéticos endógenos determinados, por ejemplo, glucohidrolasas que remueven las porciones de glucosa de los metabolitos secundarios. Como otro ejemplo, la expresión de los transportadores de membrana involucrados en el transporte de esteviol glucósidos puede inhibirse, de manera que la secreción de esteviosidos glucosilados se inhibe. Dicha regulación puede ser benéfica porque la secreción de esteviol glucósidos puede ser inhibida durante un período de tiempo deseado durante el cultivo del microorganismo, mediante lo cual se incrementa la producción de productos de glucósido en la cosecha. En dichos casos, un ácido nucleico que inhibe la expresión del polipéptido o producto genético puede estar incluido en un término recombinante que es transformado en la cepa. De manera alternativa, la mutagénesis puede ser utilizada para generar mutantes en genes para los cuales se desea inhibir la función. III. Huéspedes A. Microorganismos Una cantidad de procariotas y eucariotas es adecuada para utilizarse en la construcción de los microorganismos recombinantes descritos en la presente descripción, por ejemplo, la bacteria gram-negativa, levadura y hongos. Una especie y cepa seleccionadas para utilizarse como una cepa de producción de esteviol o esteviol glucósido se analiza primero para determinar cuáles genes de producción genes son endógenas para la cepa y cuales genes no están presentes. Los genes para los cuales no está presente una contraparte endógena en la cepa son ensamblados en uno o más términos recombinantes, los cuales son transformados entonces en la cepa con el objeto de suministrar las funciones faltantes.
Las especies procarióticas y eucarióticas de ejemplo se describen con mayor detalle más adelante. Sin embargo, se apreciará que pueden ser adecuadas otras especies. Por ejemplo, las especies adecuadas pueden ser un género seleccionado a partir del grupo que consiste en Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, Corynebacterium , Escherichia , Fusarium/Gibberella, Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaffia, Phanerochaete, Pichia, Physcomitrella, Rhodoturula , Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sphaceloma, Xanthophyllomyces y Yarrowia. Las especies de ejemplo a partir de dicho género incluyen Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphureus, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Physcomitrella patens, Rhodoturula glutinis 32, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma UBV-AX, Xanthophyllomyces dendrorhous, Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi, Candida utilis y Yarrowia lipolytica . En algunas modalidades, un microorganismo puede ser un ascomiceto tal como Gibberella fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, o Saccharomyces cerevisiae. En algunas modalidades, un microorganismo puede ser una procariota tal como Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides, o Rhodobacter capsulatus. Se apreciará que ciertos microorganismos pueden ser utilizados para un gen de filtración y prueba de interés en una forma de producción total alta, mientras que otros microorganismos con características de productividad o crecimiento deseadas pueden ser utilizados para la producción a gran escala de esteviol glucósidos.
Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae es un organismo de esqueleto altamente utilizado en la biología sintética, y puede ser utilizado como la plataforma de microorganismo recombinante. Existen varias bibliotecas de mutantes, plásmidos, modelos de cómputo detallados de metabolismo y otra información disponible para la S. cerevisiae, que permiten el diseño racional de diversos módulos para mejorar la producción de productos. Los métodos son conocidos para la elaboración de microorganismos recombinantes.
Una biosíntesis de un grupo genético de esteviol puede ser expresada en levadura utilizando cualquiera de una cantidad de promotores conocidos. Las cepas que sobre- producen terpenos son conocidas y pueden ser utilizadas para incrementar la cantidad de difosfato de geranilgeranil disponibles para la producción de esteviol y esteviol glucósido. Aspergillus SDD Las especies Aspergillus tales como A. oryzae, A. niger y A. sojae son utilizadas ampliamente como microorganismos en la producción de alimentos, y también se puede utilizar como la plataforma de microorganismo recombinante. Las secuencias de nucleótidos están disponibles para los genomas de A. nidulans, A.fumigatus, A. oryzae, A. clavatus, A.flavus, A. niger, y A. terreus, que permiten el diseño y modificación racional de trayectorias de endógenos para mejorar el flujo e incrementar la producción de producto. Los modelos metabólicos se han desarrollado para Aspergillus, así como también para estudios transcriptómicos y proteómicos. La A. niger es cultivada para la producción industrial de una serie de ingredientes alimenticios, tales como ácido cítrico y ácido glucónico, y por consiguiente, las especies tales como A. niger generalmente son adecuadas para la producción de ingredientes alimenticios tales como esteviol y esteviol glucósidos. El Ejemplo 23, describe la metodología de clonación para la producción de esteviol glucósidos en Aspergillus nidulans.
Escherichia coli Escherichia coli, otro organismo de plataforma utilizado ampliamente en biología sintética, también se puede utilizar como la plataforma de microorganismo recombinante. Similar al caso de Saccharomyces, existen bibliotecas de mutantes, plásmidos, modelos de cómputo detallados de metabolismo y otra información disponible para E. coli, que permite el diseño racional de varios módulos para mejorar la producción de producto. Los métodos similares a aquellos descritos anteriormente para Saccharomyces pueden ser utilizados para elaborar los microorganismos E. coli recombinantes.
Aparieus, Gibberella. v Phanerochaete spp.
Agarieus, Gibberella, y Phanerochaete spp. pueden ser útiles debido a que son conocidos por producir grandes cantidades de giberelina en el cultivo. Por lo tanto, los precursores de terpeno para producir grandes cantidades de esteviol y esteviol glucósidos ya son producidos por génesendógenos. Por lo tanto, los módulos que contienen genes recombinantes para polipéptidos de biosíntesis de esteviol o esteviol glucósido pueden ser introducidos en especies de dicho género sin la necesidad de introducir genes de trayectoria de mevalonato o MEP.
Rhodobacter spp.
El Rhodobacter puede ser utilizado como la plataforma de microorganismo recombinante. Similar al E. coli, existen librerías de mutantes disponibles así como también vectores de plásmido adecuados, que permiten el diseño racional de varios módulos para mejorar la producción de producto. Las trayectorias de isoprenoide se han diseñado especies bacteriales membranosas de Rhodobacter para la producción incrementada de carotenoides y CoQ10. Véanse, las publicaciones de patentes Norteamericanas Nos. 20050003474 y 20040078846. Los métodos similares a aquellos descritos anteriormente para E. coli pueden ser utilizados para elaborar microorganismos recombinantes de Rhodobacter.
Phvscomitrella spp.
Los musgos de Physcomitrella , cuando se cultivan en cultivo de suspensión, tienen características similares a levadura u otros cultivos fúngicos. Este género se está volviendo un tipo importante de célula para la producción de metabolitos de plantas secundarias, las cuales pueden ser difíciles de producir en otros tipos de células. El Ejemplo 22 describe la producción de enzimas UGT activas en la trayectoria de esteviol glucósido en P. patens.
B. Células de Planta o Plantas En algunas modalidades, los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en la presente descripción son introducidos en plantas o células de planta para incrementar la producción de esteviol glucósido general o enriquecer la producción de los esteviol glucósidos específicos en proporción con los otros. Por lo tanto, un huésped puede ser una planta o una célula de planta que incluye por lo menos un gen recombinante descrito en la presente descripción. Una planta o célula de planta puede ser transformada teniendo un gen recombinante integrado en su genoma, es decir, puede ser transformado de manera estable. Las células transformadas de manera estable normalmente retienen el ácido nucleico introducido en cada división celular. Una planta o célula de planta también puede ser transformada en forma temporal, de tal manera que el gen recombinante no está integrado en su genoma. Las células transformadas en forma temporal, normalmente pierden toda o alguna porción del ácido nucleico introducido con cada división celular, de manera que el ácido nucleico introducido no puede ser detectada en las células hijas después de una cantidad suficiente de divisiones celulares. Las plantas transgénicas y las células de planta transformadas tanto de manera temporal como estable pueden ser útiles en el métodos descritos en la presente descripción.
Células de planta transgénicas utilizadas en los métodos descritos en la presente descripción pueden constituir parte o la totalidad de la planta completa. Dichas plantas puede ser cultivadas en una forma adecuada para las especies bajo consideración, ya sea en una cámara de cultivo, un invernadero o en un campo. Las plantas transgénicas pueden ser reproducidas según se desee para un propósito general, por ejemplo, para introducir un ácido nucleico recombinante en otras líneas, para transferir un ácido nucleico recombinante a otras especies, o para selección adicional de otras cepas deseables. De manera alternativa, las plantas transgénicas pueden ser propagadas en forma vegetativa para aquellas especies sensibles a dichas técnicas. Como se utiliza en la presente descripción, una planta transgénica también se refiere a una progenie de una planta transgénica inicial provista siempre que la progenie herede el transgen. Las semillas producidas por una planta transgénica puede ser cultivadas y producidas en forma vegetativa (o injertada y reproducida en forma vegetativa) para obtener semillas homocigosas para el término de ácido nucleico.
Plantas transgénicas puede ser cultivadas en cultivo de suspensión, o cultivo de tejido u órgano. Para los propósitos de la presente invención, se pueden utilizar las técnicas de cultivo de tejido sólido y/o líquido. Cuando se utiliza un medio sólido, células de planta transgénicas puede ser colocadas directamente en el medio o pueden ser colocadas sobre un filtro que es colocado entonces en contacto con el medio. Cuando se utiliza un medio líquido, las células de planta transgénicas pueden ser colocadas sobre un dispositivo de flotación, por ejemplo, una membrana porosa que hace contacto con el medio líquido.
Cuando se utilizan las células de planta transformadas en forma temporal, una secuencia de reportero que codifica un polipéptido reportero que tiene actividad de reportero puede estar incluido en el procedimiento de transformación y un ensayo para la actividad del reportero o expresión pueden ser realizados en un momento adecuado después de la transformación. Un tiempo adecuado para conducir el ensayo, normalmente es de aproximadamente 1 a 21 días después de la transformación, por ejemplo, aproximadamente de 1 a 14 días, aproximadamente de 1 a 7 días, o aproximadamente de 1 a 3 días. El uso de ensayos temporales es particularmente conveniente para el análisis rápido en diferentes especies, o para confirmar la expresión de un polipéptido heterólogo cuya expresión no se ha confirmado con anterioridad en células receptoras particulares.
Las técnicas para introducir ácidos nucleicos en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas son conocidos en la materia, e incluyen, sin limitación, transformación mediada por Agrobacterium , transformación mediada por vector viral, electroporación y transformación de aceleración de partículas, Patentes Norteamericanas Nos 5,538,880; 5,204,253; 6,329,571; y 6,013,863. Si una célula o tejido cultivado se utiliza como el tejido receptor para la transformación, las plantas pueden ser regeneradas a partir de los cultivos transformados si se desea, mediante las técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia.
Una población de plantas transgénicas puede ser bloqueada y/o seleccionada en búsqueda de aquellos miembros de la población que tienen un atributo o fenotipo conferido por la expresión del transgen. Por ejemplo, una población de progenie de un evento de transformación único puede ser seleccionado en búsqueda de aquellas plantas que tienen un nivel deseado de expresión de un polipéptido de biosíntesis de esteviol o esteviol glucósido o ácido nucleico. Se pueden utilizar los métodos físicos y bioquímicos métodos para identificar los niveles de expresión. Estos incluyen el análisis Southern análisis o amplificación PCR para la detección de un polinucleótido; manchados Northern, protección de S1 ARNs, extensión por cebador, o amplificación RT-PCR para detectar transcripciones de ARN; los ensayo enzimáticos para detectar actividad de enzima o ribozima de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis de gel de proteína, manchados Western, inmunoprecipitación, e inmunoensayos enlazados por enzima para detectar polipéptidos. Otras técnicas tales como la hibridación in situ, teñido de enzima, e inmunoteñido también se pueden utilizar para detectar la presencia o expresión de polipéptidos y/o ácidos nucleicos. Los métodos para realizar todas las técnicas referidas son conocidos. Como una alternativa, una población de plantas que comprende los eventos de transformación independientes puede ser seleccionada para aquellas plantas que tienen un atributo deseado, tal como la producción de un esteviol glucósido o biosíntesis modulada de un esteviol glucósido. La selección y/o detección puede ser llevada a cabo sobre una o más generaciones, y/o en más de una ubicación geográfica. En algunos casos, las plantas transgénicas pueden ser cultivadas y seleccionadas bajo condiciones las cuales inducen un fenotipo deseado o de otra manera son necesarias para producir un fenotipo deseado en una planta transgénica. Además, la selección y/o detección puede ser aplicada durante una etapa particular de desarrollo, en la cual se espera que el fenotipo sea exhibido por la planta. La selección y/o detección pueden ser llevadas a cabo para elegir aquellas plantas transgénicas que tienen una diferencia estadísticamente significativa en un nivel de esteviol glucósido en relación con una planta de control que carece del transgen.
Los ácidos nucleicos, genes recombinantes, y términos descritos en la presente descripción pueden ser utilizados para transformar una cantidad de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas plantas y sistemas celulares de plantas. Los ejemplos no limitantes de monocotiledóneas adecuadas incluyen, por ejemplo, cosechas de cereal tales como arroz, centeno, sorgo, mijo, trigo, maíz, y cebada. La planta puede ser una monocotiledónea que no es cereal, tal como el espárrago, plátano, o cebolla. La planta también puede ser una dicotiledónea tal como la estevia (Stevia rebaudiana), soya, algodón, girasol, guisantes, geranio, espinaca, o tabaco. En algunos casos, la planta puede contener las trayectorias precursoras para la producción de fosfato de fenilo, tal como la trayectoria de mevalonato, normalmente encontradas en el citoplasma y la mitocondria. La no trayectoria de mevalonato se encentra más frecuentemente en plastos de píanta [Dubey y asociados, 2003 J. Biosci. 28 páginas 637 a 646]. Un experto en la materia puede dirigir la expresión de polipéptidos de biosíntesis de esteviol glucósido al organelo adecuado a través del uso de secuencias conductoras, de tal manera que la biosíntesis de esteviol glucósido ocurre en la ubicación deseada de la célula de planta. Un experto en la materia utilizará los promotores adecuados para dirigir la síntesis, por ejemplo, a la hoja de una planta, si así se desea. La expresión también puede ocurrir en cultivos de tejido, tales como un cultivo de callos o cultivo de raíces fibrosas finas, si así se desea.
En una modalidad, uno o más del ácido nucleico o polipéptidos descritos en la presente descripción son introducidos en la Stevia (por ejemplo, Stevia rebaudiana) de tal manera que se incrementa la biosíntesis de esteviol glucósido general o que la composición general de esteviol glucósido es enriquecida en forma selectiva para uno o más esteviol glucósidos específicos. Por ejemplo, uno o más genes recombinantes pueden ser introducidos en la Stevia de manera que uno o más de los siguientes son expresados: una enzima UGT91D tal como UGT91D2e (por ejemplo, SEQ ID NO:5 o un homólogo funcional de la misma), UGT91D2m (por ejemplo, SEQ ID NO:10); una enzima UGT85C tal como una variante establecida en la Tabla 15, o una enzima UGT76G1 tal como una variante establecida en el Ejemplo 18. Los términos de ácido nucleico normalmente incluyen un promotor adecuado (por ejemplo, promotores 35S, e35S, o ssRUBISCO) enlazado en forma operativa a un ácido nucleico que codifica el polipéptido UGT. Los ácidos nucleicos pueden ser introducidos en la Stevia mediante transformación mediada por Agrobacterium; transferencia de gen mediada por electroporación para protoplastos; o mediante bombardeo de partículas. Véase, por ejemplo, la publicación de Singh y asociados, "Compendio de plantas de cosecha transgénica; azúcar transgénica, tubérculo y fibra" (Compendium of Transgenics Crop Plants: Transgenics Sugar, Tuber y Fiber), Editado por Chittaranjan Kole y Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd. (2008), páginas 97 a 115. Para el bombardeo de partículas del callos derivado de hoja de estevia, los parámetros pueden ser de la siguiente manera: 6 cm de distancia, 1100 psi He de presión, partículas de oro, y un bombardeo.
Las plantas de Stevia pueden ser regeneradas mediante embriogénesis somática, como la que se describe en la publicación de Singh y asociados, 2008, supra. En particular, los segmentos de hoja (aproximadamente 1 a 2 cm de largo) pueden ser removidos de plantas cultivadas in vitro de 5 a 6 semanas e incubadas (lado inferior adaxial) en medio MS complementados con vitaminas B5, 30 g de sacarosa y 3 g de Gelrits. ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) se puede utilizar en combinación con adenina de 6-bencilo (BA), cinetina (KN), o ceatina. Las masas Pro-embriónicas aparecen después de 8 semanas de sub-cultivo. Dentro de un período de 2 a 3 semanas de sub-cultivos, aparecerán los embriones somáticos sobre la superficie de los cultivos. Los embriones pueden ser madurados en un medio que contiene BA en combinación con ácido 2,4-D, a-naftalenoacético ácido (NAA), o ácido indobutírico (IBA). Los embriones somáticos maduros que germinan y forman planteletas pueden ser extirpados del callo. Después de que las planteletas alcanzan una edad de 3 a 4 semanas, las planteletas pueden ser transferidas a macetas con vermiculita y se cultivan durante 6 a 8 semanas en cámaras de cultivo para la climatización y son transferidas a invernaderos.
En una modalidad, los esteviol glucósidos son producidos en arroz. El arroz y el maíz se pueden transformar fácilmente utilizando técnicas tales como transformación mediada por Agrobacterium . Los sistemas de vector binario son utilizados comúnmente para la introducción de genes exógenos de Agrobacterium a las monocotiledóneas. Véanse, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,215,051 y 6,329,571. En un sistema de vector binario, un vector contiene la región T-ADN, la cual incluye un gen de interés (por ejemplo, un UGT descrito en la presente descripción) y el otro vector es un plásmido Ti desarmado que contiene la región vir. Los vectores co-integrados y los vectores que se pueden movilizar también pueden ser utilizados. Los tipos y tratamientos previos de tejidos a ser transformados, la cepa de Agrobacterium utilizada, la duración de la inoculación, la prevención de sobre-crecimiento y la necrosis mediante Agrobacterium , pueden ser ajustados por un experto en la materia. Las células de embrión inmaduras del arroz pueden ser preparados para la transformación con Agrobacterium utilizando vectores binarios. El medio de cultivo utilizado es complementado con compuestos fenólicos. De manera alternativa, la transformación puede ser realizada en plantas utilizando infiltración de vacío. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2000037663, WO 2000063400, y WO 2001012828.
IV. Métodos para Producir Esteviol y Esteviol Glucósidos Los huéspedes recombinantes descritos en la presente descripción pueden ser utilizados en métodos para producir esteviol o esteviol glucósidos. Por ejemplo, si el huésped recombinante es un microorganismo, el método puede incluir cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo bajo condiciones en las cuales los genes de biosíntesis de esteviol y/o esteviol glucósido son expresados. El microorganismo recombinante puede ser cultivado en un lote alimentado o procedimiento continuo. Normalmente, el microorganismo recombinante se cultiva en un fermentador a una temperatura definida durante un período de tiempo deseado. Dependiendo del microorganismo particular utilizado en el método, otros genes recombinantes tales como genes de biosíntesis isopentenilo y sintasa de terpeno y genes de ciclasa también pueden estar presentes y ser expresados. Los niveles de sustratos e intermediarios, por ejemplo, difosfato de isopentenilo, difosfato de dimetilalilo, difosfato de geranilgeranil, caureno y ácido caurenóico, pueden ser determinados por la extracción de muestras del medio de cultivo para análisis de acuerdo con los métodos publicados.
Después de que el microorganismo recombinante se ha cultivado en el cultivo durante el período de tiempo deseado, el esteviol y/o uno o más esteviol glucósidos pueden entonces ser recuperados del cultivo utilizando diversas técnicas conocidas en la materia. Si el huésped recombinante es una planta o célula de plantas, el esteviol o esteviol glucósidos pueden ser extraídos del tejido de la planta utilizando diversas técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, un lisato crudo del microorganismo cultivado o tejido de planta puede ser centrifugado para obtener un sobrenadante. El sobrenadante resultante puede entonces ser aplicado a una cromatografía sobre columna, por ejemplo, una columna C-18, y ser lavado con agua para remover los compuestos hidrófilos, seguidos por la elución de los compuesto(s) de interés con un solvente tal como metanol. El compuesto(s) puede entonces ser purificado adicionalmente mediante HPLC preparativo. Véase también la publicación WO 2009/140394.
La cantidad de esteviol o esteviol glucósido producida puede ser desde aproximadamente 1 mg/l hasta aproximadamente 1,500 mg/l, por ejemplo, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mg/l, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 mg/l, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 mg/l, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 mg/l, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 mg/l, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 500 mg/l, desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1,500 mg/l, o desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 1,000 mg/l. En general, los tiempos de cultivo más largos conducirán a cantidades mayores de producto. Por lo tanto, el microorganismo recombinante puede ser cultivado durante un período desde 1 día hasta 7 días, desde 1 día hasta 5 días, desde 3 días hasta 5 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, o aproximadamente 5 días.
Se apreciará que los diversos genes y módulos planteados en la presente descripción pueden estar presentes en dos o más microorganismos recombinantes en lugar de un microorganismo único. Cuando una pluralidad de microorganismos recombinantes se utiliza, estos pueden ser cultivados en un cultivo mezclado para producir esteviol y/o esteviol glucósidos. Por ejemplo, un primer microorganismo puede comprender uno o más genes de biosíntesis para producir esteviol mientras que un segundo microorganismo comprende genes de biosíntesis de esteviol glucósido. De manera alternativa, los dos o más microorganismos pueden ser cultivados cada uno en un medio de cultivo separado y el producto del primer medio de cultivo, por ejemplo, esteviol, puede ser introducido en el segundo medio de cultivo para ser convertido en un intermediario subsiguiente, o en un producto final, tal como rebaudiósido A. El producto producido por el segundo, o el microorganismo final es recuperado entonces. También se apreciará que en algunas modalidades, un microorganismo recombinante es cultivado utilizando fuentes de nutrientes diferentes de un medio de cultivo y utiliza un sistema diferente de un fermentador.
Los esteviol glucósidos no necesariamente tienen un desempeño equivalente en los diferentes sistemas alimenticios. Por consiguiente es deseable tener la capacidad para dirigir la síntesis para la composición de los esteviol glucósidos de elección. Los huéspedes recombinantes descritos en la presente descripción pueden producir composiciones que son enriquecidas en forma selectiva para esteviol glucósidos específicos y tienen un perfil de sabor consistente. Por lo tanto, los microorganismos recombinantes, plantas, y células de planta descritos en la presente descripción pueden facilitar la producción de composiciones que son ajustados a medida para cumplir con el perfil edulcorante deseado para un producto alimenticio deseado y que tienen una proporción de cada esteviol glucósido que es consistente de lote a lote. Los microorganismos descritos en la presente descripción no producen los productos derivados de planta no deseados que se encuentran en los extractos de estevia. Por lo tanto, la composición de esteviol glucósidos producidos por el microorganismo recombinante descrito en la presente descripción se pueden distinguir de las composiciones derivadas de la planta de Estevia.
V. Productos Alimenticios El esteviol y esteviol glucósidos obtenidos mediante los métodos descritos en la presente descripción pueden ser utilizados para elaborar productos alimenticios, suplementos dietéticos y composiciones de edulcorante. Por ejemplo, el esteviol o esteviol glucósido substancialmente puros, tales como rebaudiósido A pueden estar incluidos en productos alimenticios tales como helado, bebidas carbonatadas, jugos de fruta, yogurts, productos horneados, gomas de mascar, caramelos duros y suaves, y salsa. El esteviol o esteviol glucósido substancialmente puro también pueden estar incluidos en productos no alimenticios, tales como productos farmacéuticos, productos medicinales, suplementos dietéticos y suplementos nutricionales. El esteviol o esteviol glucósidos substancialmente puros también pueden estar incluidos en productos alimenticios para animales, tanto para la industria del agrocultivo como la industria de animales de compañía. De manera alternativa, una mezcla de esteviol y/o esteviol glucósidos puede ser elaborada cultivando microorganismos recombinantes por separado o cultivando plantas/células de planta diferentes, cada una produciendo un esteviol o esteviol glucósido específico, recuperando el esteviol o esteviol glucósido en forma substancialmente pura de cada microorganismo o planta/células de planta y combinando entonces los compuestos para obtener una mezcla que contiene cada compuesto en la proporción deseada. Los microorganismos recombinantes, plantas, y células de planta descritos en la presente descripción permiten que se obtengan mezclas más precisas y consistentes en comparación con los productos de Estevia actuales. En otra alternativa, un esteviol o esteviol glucósido substancialmente puro puede ser incorporado en un producto alimenticio junto con otros edulcorantes, por ejemplo, sacarina, dextrosa, sacarosa, fructosa, eritritol, aspartame, sucralosa, monatina, o acesulfame de potasio. La proporción de peso del esteviol o esteviol glucósido en relación con otros edulcorantes puede variarse según se desee para lograr un sabor satisfactorio en el producto alimenticio final. Véase, por ejemplo, Publicación de Patente Norteamericana No. 2007/0128311. En algunas modalidades, el esteviol o esteviol glucósido pueden ser provistos con un sabor (por ejemplo, cítrico) como un modulador de sabor. Por ejemplo, el Rebaudiósido C puede ser utilizado como un agente de mejoramiento de dulzura o modulador de dulzura, en particular para edulcorantes con base en carbohidratos, de manera que se puede reducir la cantidad de azúcar producto alimenticio.
Las composiciones producidas por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta descritas en la presente descripción pueden ser incorporadas en productos alimenticios. Por ejemplo, una composición de esteviol glucósido producida por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta puede ser incorporada en un producto alimenticio en una cantidad que varía desde aproximadamente 20 mg de esteviol glucósido/kg de producto alimenticio hasta aproximadamente 1800 mg de esteviol glucósido/kg de producto alimenticio con una base de peso seco, dependiendo del tipo de esteviol glucósido y producto alimenticio. Por ejemplo, una composición de esteviol glucósido producida por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta puede ser incorporada en un postre, producto de confitería frío (por ejemplo, helado), productos lácteos (por ejemplo, yogurt), o bebidas (por ejemplo, a bebida carbonatada) de manera que el producto alimenticio tenga un máximo de 500 mg de esteviol glucósido/kg de alimento con una base de peso seca. Una composición de esteviol glucósido producida por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta puede ser incorporada en un producto horneado (por ejemplo, a biscocho) de manera que el producto alimenticio tiene un máximo de 300 mg de esteviol glucósido/kg de alimento con una base seca. Una composición de esteviol glucósido producida por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta puede ser incorporada en una salsa (por ejemplo, jarabe de chocolate) o producto vegetal (por ejemplo, conservas) de manera que el producto alimenticio tiene un máximo de 1000 mg de esteviol glucósido/kg de alimento sobre una base de peso seco. Una composición de esteviol glucósido producida por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta puede ser incorporada en un pan de manera que el producto alimenticio tiene un máximo de 160 mg de esteviol glucósido/kg de alimento con una base en peso seco. Una composición de esteviol glucósido producida por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta puede ser incorporada en un caramelo duro o suave de manera que el producto alimenticio tiene un máximo de 1600 mg de esteviol glucósido/kg de alimento con una base en peso seca. Una composición de esteviol glucósido producida por un microorganismo recombinante, planta, o célula de planta puede ser incorporada en un producto de frutas procesadas (por ejemplo, jugos de fruta, rellenos de fruta, compota, y jaleas) de manera que el producto alimenticio tiene un máximo de 1000 mg de esteviol glucósido/kg de alimento con una base en peso seco.
Por ejemplo, dicha composición de esteviol glucósido puede tener desde el 90 hasta el 99% de rebaudiósido A y una cantidad indetectable de contaminantes derivados de la planta de estevia, y ser incorporada en un producto alimenticio desde 25 hasta 1600 mg/kg, por ejemplo, desde 100 hasta 500 mg/kg, desde 25 hasta 100 mg/kg, desde 250 hasta 1000 mg/kg, desde 50 hasta 500 mg/kg o desde 500 hasta 1000 mg/kg sobre una base de peso seco.
Dicha composición de esteviol glucósido puede ser una composición enriquecida con rebaudiósido B que tiene más del 3% de rebaudiósido B y ser incorporada en el producto alimenticio de manera que la cantidad de rebaudiósido B en el producto es desde 25 hasta 1600 mg/kg, por ejemplo, desde 100 hasta 500 mg/kg, desde 25 hasta 100 mg/kg, desde 250 hasta 1000 mg/kg, desde 50 hasta 500 mg/kg o desde 500 hasta 1000 mg/kg sobre una base de peso seco. Normalmente, la composición enriquecida con el rebaudiósido B tiene una cantidad que no se puede detectar de contaminantes derivados de la planta de estevia.
Dicha composición de esteviol glucósido puede ser una composición enriquecida con rebaudiósido C que tiene más del 15% de rebaudiósido C y ser incorporada en el producto alimenticio de tal manera que la cantidad de rebaudiósido C en el producto desde 20 hasta 600 mg/kg, por ejemplo, desde 100 hasta 600 mg/kg, desde 20 hasta 100 mg/kg, desde 20 hasta 95 mg/kg desde, 20 hasta 250 mg/kg, desde 50 hasta 75 mg/kg o desde 50 hasta 95 mg/kg sobre una base de peso seco. Normalmente, la composición enriquecida con rebaudiósido C tiene una cantidad que no se puede detectar de contaminantes derivados de la planta de estevia.
Dicha composición de esteviol glucósido puede ser una composición enriquecida con rebaudiósido D que tiene más del 3% de rebaudiósido D y es incorporada en el producto alimenticio de tal manera que la cantidad de rebaudiósido D en el producto es desde 25 hasta 1600 mg/kg, por ejemplo, desde 100 hasta 500 mg/kg, desde 25 hasta 100 mg/kg, desde 250 hasta 1000 mg/kg, desde 50 hasta 500 mg/kg o desde 500 hasta 1000 mg/kg sobre una base de peso seco. Normalmente, la composición enriquecida con el rebaudiósido D tiene una cantidad que no se puede detectar de contaminantes derivados de la planta de estevia.
Dicha composición de esteviol glucósido puede ser una composición enriquecida con rebaudiósido E que tiene más del 3% de rebaudiósido E y es incorporada en el producto alimenticio de tal manera que la cantidad de rebaudiósido E en el producto es desde 25 hasta 1600 mg/kg, por ejemplo, desde 100 hasta 500 mg/kg, desde 25 hasta 100 mg/kg, desde 250 hasta 1000 mg/kg, desde 50 hasta 500 mg/kg o desde 500 hasta 1000 mg/kg sobre una base de peso seco. Normalmente, la composición enriquecida con rebaudiósido E tiene una cantidad que no se puede detectar de contaminantes derivados de la planta de estevia.
Dicha composición de esteviol glucósido puede ser una composición enriquecida con rebaudiósido F que tiene más del 4% de rebaudiósido F y es incorporada en el producto alimenticio de tal manera que la cantidad de rebaudiósido F en el producto es desde 25 hasta 1000 mg/kg, por ejemplo, desde 100 hasta 600 mg/kg, desde 25 hasta 100 mg/kg, desde 25 hasta 95 mg/kg, desde 50 hasta 75 mg/kg o desde 50 hasta 95 mg/kg sobre una base de peso seco. Normalmente, la composición enriquecida con rebaudiósido F tiene una cantidad que no se puede detectar de contaminantes derivados de la planta de estevia.
Dicha composición de esteviol glucósido puede ser una composición enriquecida con dulcósido A que tiene más del 4% de dulcósido A y es incorporada en el producto alimenticio de tal manera que la cantidad de dulcósido A en el producto es desde 25 hasta 1000 mg/kg, por ejemplo, desde 100 hasta 600 mg/kg, desde 25 hasta 100 mg/kg, desde 25 hasta 95 mg/kg, desde 50 hasta 75 mg/kg o desde 50 hasta 95 mg/kg sobre una base de peso seco. Normalmente, la composición enriquecida con dulcósido A tiene una cantidad que no se puede detectar de contaminantes derivados de la planta de estevia.
En algunas modalidades, un esteviol o esteviol glucósido substancialmente puro es incorporado en un edulcorante de mesa o producto "taza por taza". Dichos productos normalmente son diluidos para el nivel de edulcorante apropiado con uno o más agentes de adición de volumen, por ejemplo, maltodextrinas, conocidos por aquellos expertos en la materia. La composición de esteviol glucósidos enriquecida para rebaudiósido A, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, o dulcósido A puede empacada en una bolsita, por ejemplo, desde 10,000 hasta 30,000 mg de esteviol glucósido/kg de producto sobre una base de peso seco, para uso de mesa.
VI. Reproducción de Planta A. Polimorfismos Los polimorfismos entre los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción (por ejemplo, los ácidos nucleicos UGT91D2) pueden ser utilizados como marcadores en el mapeo genético de las plantas y los programas de reproducción de las plantas en Estevia. Véase, por ejemplo, la publicación de Yao y asociados, Genome. 1999,42: páginas 657 a 661. Por lo tanto, los polimorfismos descritos en la presente descripción pueden ser utilizados en un método para identificar si ese polimorfismo está asociado con la variación en un atributo. El método involucra medir la correlación entre variación en el atributo en las plantas de una línea de Estevia o población y la presencia de uno o más polimorfismos genéticos en esas plantas, mediante lo cual se identifica si los polimorfismos genéticos están o no asociados con la variación en el atributo. Normalmente, el atributo es la cantidad total de esteviol glucósidos expresen en las hojas de la planta, aunque el atributo también puede ser la cantidad de un esteviol glucósido particular, por ejemplo, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, o dulcósido A. En algunas modalidades, el atributo es la cantidad de esteviol, o la cantidad de un precursor isoprenoide. Una correlación estadísticamente significativa correlación entre el atributo y la presencia del marcador polimórfico se determina utilizando una estadística paramétrica o no paramétrica, por ejemplo, la prueba de Chi-cuadrada, prueba del Estudiante, prueba de Mann-Whitney, o prueba F. Una correlación estadísticamente significativa entre, por ejemplo, la cantidad de rebaudiósido A en una planta y la presencia de un marcador polimórfico indica que el marcador puede ser útil en un programa de reproducción asistido por marcador para la selección de los niveles de rebaudiósido A alterados.
Los polimorfismos pueden ser detectados por medios conocidos en la materia, incluyendo sin limitación, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), detección de ADN polimórfica amplificada aleatoria (RAPD), polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP), repetición de secuencia simple (SSR) o microsatélites. El descubrimiento, detección, y definición de genotipo de los polimorfismos se han descrito en la literatura. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Henry, ed. (2001) Plant genotyping. "La huella digital de ADN en plantas de Wallingford" (La ADN Fingerprinting de Plants Wallingford): CABI Publishing; y Phillips y Vasil, eds. (2001) "Marcadores en las plantas con base en el AND" (DNA-based markers in plants Dordrecht): Kluwer Academic Publishers. Por ejemplo, un cebador o sonda derivados de las secuencias de ácido nucleico establecidas en las SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO:96, o los complementos de las mismas, pueden ser utilizados para identificar una o más plantas individuales que poseen un alelo polimórfico que está correlacionado con una composición deseada de esteviol glucósido. Esas plantas pueden entonces ser utilizadas en un programa de reproducción para combinar el alelo polimórfico con una pluralidad de otros alelos en otros sitios que están correlacionados con la composición deseada de esteviol glucósido. Como será evidente para un experto en la materia, el número y tipo de marcadores requeridos puede diferir, dependiendo de los atributos) a ser seleccionado para y el grado de correlación para cada marcador. Los métodos, por consiguiente, involucran la detección de una pluralidad de polimorfismos en el genoma de la planta en ciertas modalidades. Se apreciará que el método puede comprender adicionalmente almacenar los resultados del paso de detección de la pluralidad de polimorfismos en un medio legible por computadora.
Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para identificar las líneas de planta de Estevia o poblaciones comprende suministrar una muestra de ácido nucleico para una planta de Estevia, proporcionando cebadores de amplificación para amplificar una región de una planta de Estevia que corresponde a un gen UGT que tiene el 90% o más identidad de secuencia para un ácido nucleico que codifica los polipéptidos establecidos en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, o 7, presentes en la muestra, aplicando los cebadores de amplificación a la muestra de ácido nucleico de manera que la amplificación de la región ocurre, e identificando las plantas que tienen un atributo deseado con base en la presencia de uno o más polimorfismos en la muestra de ácido nucleico amplificada que se correlacionan con el atributo.
En algunas modalidades, un método para determinar la presencia de un polinucleótido en una planta de Estevia involucra poner en contacto por lo menos una sonda o par de cebador con ácido nucleico de la planta. La sonda o par de cebador es específico para un polinucleótido que codifica un polipéptido UGT que tiene por lo menos el 90% de identidad de secuencia para las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, o 7. Entonces se determina la presencia o ausencia del polinucleótido.
Además de los métodos para detectar los polimorfismos y determinar el genotipo de una planta de Estevia, los equipos adecuados para llevar a cabo los métodos también se describen, así como también un medio legible por computadora producido mediante dichos métodos que contiene los datos generados mediante los métodos. Un equipo para definición de genotipo de una muestra biológica de Estevia incluye un par de cebador que amplifica de manera específica, o una sonda que híbrida de manera específica, a un polinucleótido que codifica a polipéptido UGT que tiene por lo menos el 90% de identidad de secuencia para las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, o 7. Dichos equipos normalmente tienen el cebador o sonda contenidos dentro de un material de empaque adecuado.
En algunas modalidades de los métodos y equipos descritos en la presente descripción, se utiliza uno o más grupos de oligonucleótidos, cada uno con la capacidad de reconocer la presencia o ausencia de una posición genómica específica y definida. Para las líneas o poblaciones de Estevia poliploide, son deseables más oligonucleótidos. El límite inferior es un par de oligonucleótidos y el límite superior es establecido por la capacidad de resolución deseada del método y el equipo de prueba. La hibridación de los oligonucleótidos para ADN a partir de la planta de Estevia preferentemente se registra en el sitio mediante cualquier sistema de etiquetado convencional, aplicando, por ejemplo, transferasa terminal y etiquetas que se pueden registrar convencionales. Como una alternativa al etiquetado in situ, la muestra de AND hibridada puede ser liberada del soporte sólido y ser hibridada en forma subsiguiente con polisecuencias de nucleotidos etiquetadas que corresponden a cada una de las oligosecuencias de nucleotidos originales anexas al soporte sólido. La hibridación es opcionalmente reversible y el soporte sólido puede ser devuelto a su estado original para ser utilizado nuevamente. Un dideoxinucleótido etiquetado puede ser incorporado en el extreme del oligonucleótido siempre que el oligonucleótido sea hibridado al ADN genómico como una plantilla. La secuencia de nucleótido en la posición genómica adyacente a la región de coincidencia el oligonucleótido es conocido y por consiguiente, el nucleótido particular el cual será incorporado (A, C, G, T o U) es conocido. La clasificación co-dominante se logra utilizando oligosecuencias de nucleotidos en pares, es decir, dos o paralelos, es decir, tres oligosecuencias de nucleotidos de flanqueo. Los resultados obtenidos son registrados como alelos completos, vacíos, de falla o nulos y pueden ser utilizados para distinguir entre los genotipos heterocigosos y/o homocigosos. Los tratamientos de hibridación posterior opcionales, que incluyen el lavado y digestión, se proporcionan con el objeto de remover la muestra de ADN que no se híbrida por completo para las oligosecuencias anexas de soporte sólido de los nucleotidos, por ejemplo, antes y después del etiquetado. La presencia o ausencia de hibridación es registrada utilizando un método que permite el registro del estado de hibridación, normalmente en un medio legible por computadora.
B. Programas de Reproducción La Estevia normalmente es una especie injertada, aunque se observa de manera ocasional la polinización. Por lo tanto, un programa de reproducción de planta de Estevia, normalmente involucra el uso de uno o más de: selección recurrente, selección de masa, selección de volumen y reproducción cruzada. Estas técnicas pueden ser utilizadas solas o en combinación con uno o más técnicas diferentes en un programa de reproducción. Véase, la publicación de Yadav y asociados, Can. J. Plant Sci. 1: páginas 1 a 27 (2011). Cada planta identificada puede ser cruzada para crear una planta diferente para producir semilla, la cual, entonces es germinada para formar una progenie de plantas. Se semilla de una o más plantas progenie que posee el fenotipo(s) deseado y el polimorfismo(s) deseado se compone y entonces se hace coincidir en forma aleatoria para formar una generación de progenie subsiguiente. El programa de reproducción puede repetir estos pasos para las generaciones adicionales 0 a 5 según sea adecuado, con el objeto de lograr la estabilidad deseada en la población resultante de plantas, las cuales retienen el alelo polimórfico(s). En la mayoría de los programas de reproducción, el análisis del alelo polimórfico de partícula será llevado a cabo en cada generación, aunque el análisis ? puede ser llevado a cabo en generaciones alternativas si se desea. La auto-polinización de las plantas progenie puede ser llevada a cabo para aquellas líneas de estevia y poblaciones en las cuales es factible la auto-polinización.
La selección recurrente es un método utilizado en un programa de reproducción de plantas para mejorar una población de plantas. El método conlleva que las plantas individuales tienen una polinización cruzada unas con las otras para formar una progenie. Las progenies son cultivadas y la progenie superior seleccionada mediante cualquier número de métodos de selección, los cuales incluyen a la planta individual, la progenie sib media, la progenie sib completa y la progenie de auto-polinización. Las progenies seleccionadas son de polinización automática o de polinización cruzada unas con las otras para formar la progenie para otra población. Esta población es plantada y nuevamente se seleccionan las plantas superiores para polinización automática o polinización cruzada unas con las otras. La selección recurrente es un procedimiento cíclico y, por consiguiente, puede ser repetido tantas veces como se desee. El objetivo de la selección recurrente es mejorar los atributos de una población. La población mejorada puede utilizarse como una fuente de material de reproducción para obtener variedades nuevas para uso comercial o de reproducción, incluyendo la producción de un cultivo sintético. Un cultivo sintético es la progenie resultante formada por la reproducción cruzada de las diversas variedades seleccionadas. El número de variedades parentales de plantas, poblaciones, accesos naturales, ecotipos, etc., que son utilizados para generar un sintético puede variar desde tan pequeño como 10 hasta tanto como 500. Normalmente, aproximadamente de 100 a 300 variedades, poblaciones, etc., se utilizan como los padres para la variedad sintética. La semilla de la parcela de semillas de origen de una variedad sintética puede venderse a un agricultor. De manera alternativa, la semilla de la parcela de producción de semilla de origen puede experimentar de manera subsiguiente una o dos generaciones de multiplicación, dependiendo de la cantidad de semillas producidas la parcela parental y la demanda de semilla.
La selección masiva selección es una técnica útil cuando se utiliza en conjunto con la selección asistida por el marcador molecular. En la selección masiva, las semillas de los individuos son seleccionadas con base en un fenotipo o genotipo. Estas semillas seleccionadas son entonces aumentadas y utilizadas para cultivar la siguiente generación. La selección de volumen requiere el cultivo de una población de plantas en una parcela de volumen, lo que permite que las plantas experimenten la polinización automática, cosechando la semilla en volumen y utilizando entonces una muestra de la semilla cosechada en volumen para la planta de siguiente generación. También, en lugar de la polinización automática, la polinización dirigida podría utilizarse como parte del programa de reproducción.
Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para elaborar una línea de plantas de Estevia o población involucra la identificación de una o más plantas en la línea o población en la cual, la presencia de un polimorfismo en un sitio que tiene una secuencia de nucleótido que codifica a polipéptido que es por lo menos el 90% idéntico a las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, o 7 está asociado con la variación en un atributo de interés. Las plantas identificadas son entonces mestizadas consigo mismas o una planta diferente de Estevia para producir semilla, y por lo menos una progenie de plantas que se cultivan a partir de la semilla, nuevamente se cruza consigo misma o una planta de Estevia diferente por las generaciones 0-5 adicionales para elaborar una línea o población que posee el polimorfismo.
En algunos casos, selección de otros atributos útiles también es llevada a cabo, por ejemplo, la selección de resistencia a las enfermedades. La selección de dichos otros atributos puede ser llevada a cabo antes, durante o después de la identificación de las plantas individuales que posee el alelo polimórfico deseado.
Las técnicas de reproducción asistidas por el marcador pueden ser utilizadas además de, o como una alternativa para otras clases de técnicas de identificación.
La presente invención será descrita ad icional mente en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la presente invención descrita en las reivindicaciones.
VI. Ejemplos Ejemplo 1 -- Construcción de Genes de Trayectoria de Biosíntesis de Caureno Una secuencia de nucleótido que codifica una reductasa de levadura HMG CoA de pastelería truncada se clonó en un vector de plásmido episomal de copia alta de levadura de manera que la secuencia de codificación se enlazó en forma operativa para y bajo el control de transcripción de un promotor el cual puede ser reprimido por la metionina de aminoácido. Véanse, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,460,949 y 5,306,862.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas GGPPS mostradas en la Tabla 1 fueron modificadas para la expresión en levadura (Véanse las SEQ ID NOs: 18-25) y son clonadas en un vector E. coli de manera que la secuencia de codificación se enlazó en forma operativa con y bajo el control de transcripción de un promotor de levadura el cual puede ser reprimido por el aminoácido de metionina. El nombre para cada cásete de expresión que contiene el plásmido ("vector de entrada") también se muestra en la Tabla 1. Las secuencias de nucleótidos de los organismos fuente a partir de los cuales fueron identificados originalmente los polipéptidos, están establecidas en las SEQ ID NOs: 26-33. Otros vectores de entrada fueron construidos utilizando enzimas GGPPS expresadas por una secuencia de nucleótido no modificada de Catharanthus roseus designada como EV270, una secuencia de nucleótido no modificada a partir de Aspergillus nidulans designada como C301 y una secuencia de nucleótido no modificada a partir de Xanthophyllomyces dendrorhous designado como C413.
Tabla 1. Clones GGPPS Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas CDPS mostradas en la Tabla 2 fueron modificadas para la expresión en levadura (Véase las SEQ ID NOs: 34-36) y clonadas en vectores de entrada de levadura. Las secuencias de nucleótidos a partir de los organismos fuente desde los cuales fueron identificados originalmente los polipéptidos son establecidas en las SEQ ID NOs: 37-39. Otros vectores de entrada fueron construidos utilizando las enzimas CDPS expresados por una secuencia de nucleótido no modificada a partir de Arabidopsis thaliana designada como EV64, una secuencia de nucleótido no modificada de Zea mays designada como EV65 y una secuencia de nucleótido no modificada de Lycopersicon esculentum designada como EV66.
Tabla 2. Clones CDPS Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas KS enzimas mostradas en la Tabla 3 fueron modificadas para la expresión en levadura (Véanse las SEQ ID NOs: 40 -43) y fueron clonadas en los vectores de entrada de levadura. Las secuencias de nucleótidos de los organismos fuente a partir de los cuales fueron identificados originalmente los polipéptidos son establecidas en las SEQ ID NOs:44-47. Se construyeron otros vectores de entrada utilizando enzimas KS expresadas por una secuencia de nucleótido no modificada de Arabidopsis thaliana designada como EV70, una secuencia de nucleótido no modificada de Cucúrbita máxima designada como EV71 y una secuencia de nucleótido no modificada de Cucumis sativus designada como EV72.
Tabla 3. Clones KS Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas de fusión CDPS-KS mostradas en la Tabla 4 fueron modificadas para la expresión en levadura (véanse las SEQ ID NQs: 48 y 49) y fueron clonadas en vectores de entrada de levadura. Las secuencias de nucleótidos de los organismos fuente a partir de los cuales fueron identificados originalmente los polipéptidos son establecidas en las SEQ ID NOs: 50 y 51.
Tabla 4. Clones CDPS-KS Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas KO mostradas en la Tabla 5 fueron modificadas para la expresión en levadura (véanse las SEQ ID NOs: 52-55) y clonadas en vectores de entrada de levadura. Las secuencias de nucleótidos de los organismos fuente a partir de los cuales fueron identificados originalmente los polipéptidos son establecidas en las SEQ ID NOs: 56-59.
Tabla 5. Clones KO Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas KAH mostradas en la Tabla 6 fueron modificadas para la expresión en levadura (véanse las SEQ ID NOs: 60-64) y clonadas en vectores de entrada de levadura. Las secuencias de nucleótidos de los organismos fuente a partir de los cuales fueron identificados originalmente los polipéptidos son establecidas en las SEQ ID NOs: 65-69.
Tabla 6. Clones KAH * = la secuencia se muestra en la Publicación de Patente Norteamericana No.2008-0064063.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas CPR mostradas en la Tabla 7 fueron modificadas para la expresión en levadura (véanse las SEQ ID NOs: 70-72) y fueron clonadas en vectores de entrada de levadura. Las secuencias de nucleótidos de los organismos fuente a partir de los cuales fueron identificados originalmente los polipéptidos son establecidas en las SEQ ID NOs:73-75.
Tabla 7. Clones CPR Ejemplo 2 -- Construcción de Genes de Trayectoria de Esteviol Glucósido Los vectores de integración que contienen las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas UGT85C2 y UGT74G1 relacionados en la Tabla 8 fueron transformados en levadura. Los transformantes fueron obtenidos con un contenido de UGT85C2, o UGT85C2 y UGT74G1, integrado en el genoma.
Tabla 8. Clones UGT Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas IP3GGT y UGT94B1 R25S fueron modificadas para la expresión en levadura (véanse las SEQ ID NOs: 77 y 79) y se clonaron en los vectores de entrada de levadura. Las secuencias de aminoácidos para IP3GGT y UGT94B1 R25S son establecidas en las SEQ ID NOs: 76 y 78, respectivamente. El vector episomal de copia alta que contiene una secuencia de nucleótido IP3GGT modificada fue designado como pEFI155. El vector episomal de copia alta que contiene una secuencia de nucleótido modificada UGT94B1 R25S fue designado como pEFI156.
Ejemplo 3 -- Construcción de Cepas de Levadura Una cepa de levadura designada como EFSC301 fue modificada reemplazando el promotor endógeno ERG9 con el promotor CUP1 que se puede inducir con cobre. La cepa EFSC301 es un derivado de la cepa de colección de la levadura EUROSCARF BY4742. Véase, la red mundial en la dirección uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/by.html. En el medio de cultivo de levadura estándar, el gen ERG9 es transcrito en niveles muy bajos, debido a que la concentración de cobre en dicho medio es baja. La disminución de una producción de ergosterol en esta cepa tiene como resultado cantidades incrementadas de unidades de isopreno disponibles para la biosíntesis de esteviol. La cepa de levadura también fue modificada por la integración en forma genómica de genes de Estevia UGT85C2 y UGT74G1, cada uno bajo el control de transcripción al promotor GPDI constitutivo fuerte. Véase la Tabla 8. La cepa tiene una copia de cada uno de los genes de Estevia UGT85C2 y UGT74G1 integrados en el genoma de cepa MUS1241.
Ejemplo 4 -- Análisis de Gen de Trayectoria de Esteviol Glucósido Para examinar la biosíntesis de esteviol glucósido en la levadura, los casetes de expresión de los 36 vectores de entrada de las Tablas 1 a 7 y el Ejemplo 1 se concatenaron en forma aleatoria en reacciones de ligación para crear los cromosomas de levadura artificial ("eYACs"). El procedimiento se muestra en forma esquemática en la figura 5.
Se llevaron a cabo dos grupos diferentes de ligaciones. El grupo de ligación A incluyó todos los genes relacionados en las Tablas 1 a 7, excepto que no se incluyeron genes CDPS-KS bi-funcionales (Tabla 4). El grupo de ligación B incluyó todos los genes relacionados en las Tablas 1 a 7 excepto que no se incluyeron los genes CDPS y KS monofuncionales (Tablas 2 a 3).
Se prepararon desde 30 hasta 200 pg de ADN a partir de cada a partir de cada uno de los vectores de entrada que contienen el cásete. Los casetes de expresión genética fueron liberados de cada vector mediante la digestión con la enzima de restricción Asc1. Los casetes fueron concatenados entonces en forma aleatoria en eYACs mediante ligación con T4 la ligasa en una reacción de 3 horas. El éxito de la reacción de concatenación fue evaluada por la viscosidad de la mezcla de reacción, debido a que el ADN concatenado es altamente viscoso. Los fragmentos de ADN ("brazos") que contienen un centrómero, dos telerómeros y los marcadores de selección LEU2 y TRP1 se agregaron al extremo de los casetes de expresión concatenados, mediante lo cual se crean los eYACs funcionales.
Los eYACs fueron transformados en esferoplastos de la cepa competente de levadura MUS1243 mediante la digestión de zimolasa de la pared celular de levadura, seguido por el tratamiento con un regulador CaCh/PEG, que hace a los esferoplastos permeables a moléculas grandes tales como eYACs.
Después de la transformación, los esferoplastos de levadura fueron incrustados en un medio de crecimiento sólido de agar noble, en el cual puede tener lugar la regeneración de la pared celular. Las colonias aparecieron de 4 a 8 días después de la inoculación. El medio de regeneración careció de los aminoácidos de leucina y triptofano, seleccionando de esta manera la presencia de eYACs de dos brazos en las células de levadura.
Se obtuvieron aproximadamente 3,000 transformantes para cada grupo. Cada transformante se cubrió de rayas nuevamente y se probó en la búsqueda de marcadores de cepa de levadura y la presencia genética de ambos brazos del eYAC, es decir, los marcadores LEU2 y TRP1. Más del 97% de los transformantes tuvo el genotipo correcto. Cada transformante recibió un número de designación CEY.
Inicialmente, 24 CEYs de cada grupo fueron cultivados durante 24 horas en 2 mi de medio completo sintético (SC), sin metionina, de manera que inducen la expresión genética a partir de los eYACs. Después de 24 horas, el sobrenadante de cada cultivo se recolectó y se sometió a LC-MS (Cromatografía liquida-espectrometría de masa acoplada (Cuadropolo triple)) análisis para la presencia de rubusosido. Debido a que los genes de UGT74G1 y UGT85C2 son co-expresados en cada transformante CEY, el producto final esperado cuando se produce el esteviol es rubusosido (éster de esteviol-( 13-3-D-glucopiranosiloxi)p-D-glucopiranosil).
Ninguno de los CEYs del grupo B produjo niveles que se pueden detectar de rubusosido, mientras que 7 de los CEYs del grupo A los presentaron. La cepa CEY 19 fue el productor superior. El CEY 19 produjo un compuesto con una masa de 665.2, la cual podría corresponder a un aducto de sodio de rubusosido. Un compuesto con una masa de 643.2 también se observó, y probablemente corresponde a rubusosido protonado. La f raccionación molecular basada en MS-MS de 665.2 de masa del compuesto tuvo como resultado un desajuste de masa de 503.2, el cual corresponde al esteviol monósido como un aducto de sodio. Debido a la masa, el patrón de fraccionación, el espectro HPLC, y el estándar de retención de este compuesto correspondió exactamente a aquel de un rubusosido estándar producido in vitro mediante la glucosilación de esteviol utilizando las enzimas de Estevia 85C2 y 74G1, el compuesto producido por CEY fue determinado por ser rubusosido.
Determinación adicional para la producción de rubusosido Se cultivaron 95 clones adicionales del grupo A y 95 clones del grupo B en bandejas de 96 depósitos profundos en 1 mi SC de medio sin metionina. Los sobrenadantes de cada uno de estos cultivos se combinaron en agrupaciones de dos clones, fueron analizados mediante LC-MS, y se determinó la proporción de señal/ruido MS. La proporción s/n MS s/n es una medida adecuada del contenido de rubusosido relativo. Cuando se descubrió que una agrupación de 2 CEYs produce rubusosido, cada clone en esa agrupación se analizó por separado. Los resultados mostraron que el grupo B de CEYs no produjo rubusosido, mientras que por lo menos 28 CEYs del grupo A produjeron niveles que se pueden detectar de rubusosido.
Identificación de genes presentes en rubusosido que produce clones CEY Para correlacionar el contenido genético de eYACs con la producción de rubusosido, se desarrolló un protocolo PCR en el cual los fragmentos de tamaños similares (0.5 kb) de todos los genes posibles transmitidos por eYAC podrían ser amplificados. Los cebadores internos de 20 a 5 nt se colocaron de manera que pudiera utilizarse una temperatura de recocido similar para amplificar todos los genes. El ADN genómico, el cual incluye eYAC ADN, se preparó a partir de 4 CEYs sin producción de rubusosido, 4 con producción baja de rubusosido y 6 con producción muy alta de rubusósido. Utilizando cantidades equimolares de estas 14 preparaciones de ADN, se realizó el PCR analítico para todos los 37 genes para estos 14 CEYs, así como también los controles positivo y negativo. Todos los genes fueron amplificados excepto uno, aparentemente debido a la falla del cebador.
Los genes presentes en las seis cepas CEY que producen rubusósido muestran en la Tabla 9. Los genes presentes en las ocho cepas CEY que no producen o tienen producción baja de rubusósido se muestran en la Tabla 10.
Tabla 9. Genes Presentes en CEY de Producción Alta de Rubusósido Tabla 10. Genes Presentes en Cepas CEY de Producción Baja o sin Producción de Rubusósido Ejemplo 5 -- Modificación de Condiciones de Cultivo de Levadura Los experimentos fueron llevados a cabo con la cepa CEY213 con el objeto de determinar las condiciones de cultivo que conducen a una producción máxima de rubusósido. El material de partida fue una sustancia de congelador de glicerol (-80°C) de CEY213. Las células congeladas originalmente provienen de una placa de agar que contiene medio SC de levadura sin triptofano, leucina e histidina (SC-TLH), y que contiene 2 mM de metionina. cinco mi de medio SC-TLH líquido que contiene 2 mM de metionina se inoculó con una sustancia de congelación de circuito completo CEY213 de células de levadura. La expresión eYAC en CEY213 es reprimida bajo estas condiciones. Las células fueron cultivadas durante la noche a una temperatura de 30°C con agitación lenta (170 rpm) y se designaron como los "cultivos previos".
Los cultivos previos de CEY 213 se utilizaron para inocular de 25 a 50 mi de SC media sin metionina, en la cual, se variaron los parámetros indicados más adelante. La producción de rubusósido bajo cada una de las condiciones de cultivo se midió mediante el centrifugado de 500 pl de cada medio de cultivo, transfiriendo 250 pl del sobrenadante a un tubo nuevo, agregando 250 µ? de metanol, agitando a conciencia y centrifugando durante 10 minutos a velocidad máxima. Una alícuota del sobrenadante fue analizada para la producción de rubusósido mediante LC-MS.
Niveles de Cobre Los cultivos previos de CEY213 se cultivaron en medio SC al cual se agregaron 50 µ? de ácido batocuproinadisulfónico. El ácido Batocuproinadisulfónico ácido quela el cobre en el medio de cultivo. El gen ERG9 en CEY213 se ha modificado de manera que la expresión es controlada mediante el promotor CUP1. Una disminución en los niveles de cobre en el medio disminuirá adicionalmente la actividad ERG9 actividad y mediante lo cual se incrementará la cantidad de unidades de isopreno disponibles para la biosíntesis de esteviol.
La quelación de iones de cobre en el medio de cultivo tiene un efecto perjudicial en el cultivo de levadura y la producción de rubusósido disminuyó proporcionalmente. Estos resultados sugirieron que incluso sin quelación de cobre, la cepa CEY213 está en su índice mínimo de biosíntesis de ergosterol, y no pueden desviarse más unidades de isopreno de la biosíntesis de ergosterol hacia la producción de esteviol glucósido.
Glucosa Al duplicar la glucosa disponible del 2 al 4% se obtuvo un efecto marginal sobre la producción de rubusósido, aproximadamente un incremento del 5 al 10% en la producción de rubusósido.
Limitación del nitrógeno disponible Los cultivos previos CEY213 fueron cultivados bajo condiciones de nitrógeno disponible limitado. La limitación del nitrógeno durante el crecimiento de la levadura en el cultivo se conoce para incrementar la producción de ergosterol. Cuando la concentración de NH4SO4 se disminuyó de 4g/l a 2, 1 o 0.4 g/l, el índice de crecimiento de CEY213 disminuyó en proporción con la cantidad de nitrógeno. La producción de rubusósido disminuyó proporcionalmente con la disminución en el crecimiento.
Aereación de cultivos El CEY213 se cultivó en matraces Ehrlenmeyer con o sin deflectores. Los resultados indicaron que existió, en el mejor de los casos, un efecto marginal de la aereación incrementada mediante el uso de deflectores. En todo caso, la flata de aereación por medio de la falta de deflectores incrementó la producción.
Densidad óptica al inicio, tiempo de fermentación v temperatura de cultivo Los cultivos fueron iniciados en dos densidades ópticas diferentes, OD6oo=0.1 u OD60o=1 0 de cultivo previo de CEY213. La fermentación entonces fue llevada a cabo durante 24, 48, 72 o 144 horas a una temperatura de 20, 25 o 30°C.
Como se muestra en la figura 6, la densidad del cultivo de lote al inicio de la fermentación, la temperatura de cultivo y la longitud del tiempo en fermentación, en combinación, tuvieron un efecto significativo sobre la cantidad de rubusósido producida por CEY213. Por lo tanto, 144 horas de crecimiento de un cultivo con una densidad de partida de OD6oo= 1.0, a una temperatura de 30° C, tuvo como resultado la producción de no menos de 8.5 mgs/litros de rubusósido.
Ejemplo 6 -- Producción a gran escala de rubusósido Se realizó una serie de experimentos de fermentación con CEY213 utilizando 3 clases de medio de levadura (medio rico y dos tipos de medio sintético), variando la densidad de inoculación, y cambiando el cronometraje de la expresión de cásete de gen eYAC.
Condiciones de fermentación de lote La fermentación de lote fue llevada a cabo centrifugando un cultivo previo de CEY213, descartando el sobrenadante y suspendiendo de nuevo las células en 6 litros de medio SC-TLH que contiene 100µ? de metionina y 4% de glucosa. La OD6oo se ajustó a 1.0 en un matraz Ehrlenmeyer de 100 mi sin deflectores y se dejó crecer a las células durante 144 horas a una temperatura de 30°C con agitación lenta.
Recuperación de Rubusósido Después de la fermentación, el cultivo fue centrifugado y el sobrenadante se mezcló con un volumen igual de metanol, fue agitado de manera exhaustiva, y fue centrifugado para remover el material precipitado. El sobrenadante resultante se purificó mediante cromatografía instantánea sobre sílice C18 con metanol como el eluyente, seguido por HPLC preparativo para obtener un compuesto principal, con un compuesto menor adicional detectado.
El compuesto purificado fue analizado mediante 1H y 13C RMN, y los datos se muestran en la figura 7. Se confirmó que el compuesto era rubusósido con base en la comparación con los valores en la literatura para 1H y 13C RMN para el rubusósido. El análisis cuantitativo indicó que la fermentación de CEY213 produjo 12.8 mgs/litro de rubusósido.
Ejemplo 7 - Actividad IP3GGT Actividad 1. Actividad enzimática de qlucosiltransferasa de Ipomoea purpurea 3GGT in vitro La actividad enzimática de la glucosiltransferasa de Ipomoea purpurea 3GGT (IP3GGT) utilizando esteviol como un sustrato se determinó in vitro. Los genes para Stevia rebaudiana UGT85C2 y glucosiltransferasa de IP3GGT fueron expresados, cada uno, en E. coli y cada enzima se purificó.
La reacción enzimática se realizó en dos pasos. En primer lugar, se incubaron 0.5 mM de esteviol (9.55 mgs en total) con ca. 0.5 pg de enzima UGT85C2 durante 16 horas a una temperatura de 30°C en un regulador de reacción (que contiene 1 mM de UDP-glucosa, 100 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 5 mM de MgCI2, 1 mM de KCi, 0.1 U/ul de fosfatasa de intestino de becerro). Entonces el ca. 0.5 pg de Enzima IP3GGT se agregó y la mezcla de reacción fue incubada durante un periodo adicional de 20 horas a una temperatura de 30°C.
El análisis de los productos de reacción indicó aproximadamente el 100% de conversión de esteviol a esteviol-13-O-monosido, 25% del cual se glucosiló adicionalmente en stevio-13-0-1 ,2-biosido. La producción teórica de esteviol-13-0-1,2-biosido fue de aproximadamente 4.8 mg. La mezcla de reacción se sometió entonces a HPLC preparativo, el cual produjo 2.5 mg esteviol-13-0-1 ,2-biosido (52% de producción de purificación). Con el uso del LC-MS, la masa del compuesto purificado tuvo un tiempo de retención diferente que el rubusósido y el esteviol-13-0-1 ,3-biosido. El compuesto purificado se sometió a 1H RMN, coherencia de quantum único heteronuclear (HSQC)-RMN y análisis de correlación de enlace múltiple heteronuclear (HMBC)-RMN, la cual confirmó que el compuesto era esteviol-13-0-1 ,2-biosido. 2. Expresión in vivo de IP3GGT en esteviol- o esteviol monósido-alimentado en levadura Para determinar si el IP3GGT era activo en levadura, el plásmido de copia alta 211 (episomal), pMUSIO, que contiene una secuencia de codificación IP3GGT no modificada enlazada en forma operativa a un promotor GPDI fuerte se transformó en la cepa de levadura MUS1245. El MUS1245 contiene un cásete de expresión integrado en forma genómica UGT85C2. La cepa de levadura resultante se cultivó en Medio SC sin histidina para selección por la presencia continuada del plásmido de expresión IP3GGT, a una densidad de partida OD6oo = 0.2. El esteviol o esteviol monósido se agregó al medio en 3 mM. Después del cultivo durante 72 horas a una temperatura de 30°C, se ensayó el cultivo de sobrenadantes en búsqueda de la presencia de esteviol y esteviol glucósidos mediante HPLC.
Los análisis LC-MS indicaron que no se detectó esteviol-13-O-glucósido 1 ,2-glucosilado después de la alimentación con esteviol, aunque pudiera detectarse el esteviol-13-O-monosido. En contraste, se produjeron cantidades bajas aunque detectables del esteviol 1,2-biosido mediante el MUS1245 que porta el pMUSIO después de la alimentación con esteviol- 13-O-monosido. Estos resultados muestran que la secuencia de codificación de Ipomoea purpurea 3GGT nativa es expresada en levadura a niveles suficientes para obtener conversión de esteviol monósido para esteviol 1,2-biosido ¡n vivo detectable.
Ejemplo 8 -- Modificación de cepas de levadura EXG 1 y EXG2 La S. cerevisiae puede contener enzimas que degradan los enlaces de azúcar 1,2 o 1,3 azúcar en esteviol 1,2- y esteviol 1 ,3-biosidos. Para demostrar esta posibilidad, la cepa de levadura CEY213 se cultivó durante 3 días a una temperatura de 30°C sobre un medio que contiene 0.1 mM de cada uno de los dos biósidos. El análisis LC-MS del cultivo mostró que el nivel de 1,2-biosido era estable, mientras que el 1,3-enlace en el 1,3-biosido pareció hidrolizarse por completo dentro de los límites de detección del ensayo.
Veinticinco mutantes S. cerevisiae , cada uno desestabilizado en un gen de hidrolasa de glucósido conocido o putativo, se examinaron en búsqueda de su capacidad para degradar los esteviol biósidos. Un cultivo de cada mutante de levadura se cultivó como se describió anteriormente sobre un medio que contiene esteviol 1,3-biosido y fue analizado mediante LC-MS. La cepa de levadura que porta una mutación en el gen EXGI (exo-1 ,3-3-glucanasa) se descubrió tenía más pérdida de la actividad de hidrolización de 1,3-biosido. La secuencia de nucleótido del gen de levadura EXG 1 se reportó en la publicación de Vázquez de Aldana y asociados Gene 97: páginas 173 a 182 (1991). La cepa de levadura que porta una mutación en el gen EXG2 (otra exo-1 ,3- -glucanasa) mostró una disminución pequeña en la actividad de hidrolización. Correa y asociados, Current Genetics 22: páginas 283 a 288 (1992).
Se elaboró una cepa de levadura mutante doble (exgl exg2). Cuando la cepa mutante doble se cultivó sobre el medio que contiene esteviol 1,3-biosido, no se detectó hidrólisis del biósido.
Ejemplo 9 - Titulación incrementada de biosíntesis de esteviol Los clones de enzimas individuales de cada una de las diferentes clases de enzima probada en el Ejemplo 4 (y la Tabla 11) se examinaron utilizando una tecnología eYAC para identificar los clones particulares que exhibieron la producción más alta de esteviol a partir de pirofosfato de isopentenilo y farnesil pirofosfato. Las enzimas GGPPS, KO y KAH se han probado en eYACs, en forma individual o en el caso de las enzimas GGPPS en forma Individual o en agrupaciones de dos (por ejemplo, Synechococcus sp. + S. acidocaldarius GGPPS o Aspergillus nidulans GGPPS solo), en una cepa de S. cerevisiae que expresa todos los pasos enzimáticos restantes en la trayectoria de esteviol. Los resultados indicaron que el clon MM-7 de Synechococcus spp. GGPPS (codificado mediante la SEQ ID NO:24) fue el más eficiente. Los clones GGPPS de Aspergillus nidulans y Sulfulobus acidocaldarius también fueron muy activos. Los resultados también indicaron que entre los clones KO y KAH, el clon MM-18 de Stevia KO (codificado mediante la SEQ ID NO:52) y el clon MM-24 de A. thaliana KAH (codificado mediante la SEQ ID NO:62) tuvieron como resultado una mayor producción de esteviol.
Tabla 11 La cepa S. cerevisiae CEY213, descrita en el Ejemplo 4, se transformó con plásmidos de copia alta que portan uno de los genes CDPS o KS mostrados en la Tabla 11, enlazados en forma operativa al promotor GPD1 fuerte. Los experimentos preliminares indicaron que la sobre-expresión de la Stevia rebaudiana CDPS (CDPS-1, codificado mediante la SEQ ID NO:34) en CEY213 produjo un incremento en la producción de rubusósido en relación con CEY213 que careció del plásmido que sobre-expresa CDPS-1 de copia alta. Los experimentos también indicaron que la Stevia rebaudiana KO (KO-1, codificado mediante la SEQ ID NO:52) fue el KO más activo de los dos probados.
Para construir una cepa de levadura con niveles consistentemente altos de producción de esteviol glucósido, los casetes de expresión que contienen el clon GGPPS-10, el clon KO-1 (SEQ ID NO:52) y el clon KAH-3 (SEQ ID NO:62) fueron integrados de manera estable en el genoma de la cepa S. cerevisiae CEN PK 111-61 A. La expresión de estos casetes fue conducida mediante los promotores constitutivos GPDI y TPII. Además, los casetes de expresión que contiene KS-1 (SEQ ID NO:40), CDPS-1 (SEQ ID NO:34) y UGT74G1 (SEQ ID NO:2) fueron integrados de manera estable en el genoma. La cepa de levadura resultante, EFSC1751, sin embargo, no produjo esteviol-19-O-monosido alguno cuando se cultivó a escala de laboratorio bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6.
Para determinar la base para la falta de producción de esteviol glucósido en los genes EFSC1751, CDPS-3, CDPS -4, CDPS -5 y CPR-1, solos o en combinación, fueron expresados en la cepa EFSC 1751. CPR-1 es de Stevia rebaudiana y su secuencia se puede encontrar con el Número de Acceso de Genbank DQ269454.4. Los resultados mostraron que CPR-1, cuando es expresado con cualquiera de CDPS-3, CDPS-4 o CDPS-5, tuvo como resultado la producción de esteviol-19-O-monosido en EFSC1751. Ninguno de estos genes solos en la misma cepa dio como resultado producción alguna. Estos resultados indican que la copia de CDPS-1 integrada en forma genómica, la enzima de Estevia, no es funcional en este término de levadura, mientras que los clones de Bradyrhizobium, Arabidopsis o Zea CDPS fueron funcionales en este término. Además, los genes de KAH y/o KO derivados de la planta integrados en el cromosoma para este término parecen requerir un CPR exógeno para la actividad. El CPR de Giberella fujikuroi (MM-29) también parece tener la capacidad de trabajar con polipéptidos KAH y/o KO derivados de la planta.
Los dos candidatos GGPPS líderes, GGPPS-6 (codificado mediante la SEQ ID NO: 23) y GGPPS-7 (codificado mediante la SEQ ID NO:24), fueron expresados adicionalmente en forma individual en una cepa S. cerevisiae que tiene una trayectoria funcional de esteviol glucósido (que incluye UGT74G1) aunque sin genes GGPPS. Los transformantes fueron entonces analizados para la producción de 19-SMG mediante análisis de cultivo de muestra LC-MS que se hicieron hervir en 50% de DMSO durante 5 minutos y centrifugado a 16000 de fuerza centrífuga relativa (RCF) durante 5 minutos. Se descubrió que muchos transformantes que contienen el plásmido que expresa GGPPS-6 no producen 19-SMG.
Se obtuvieron muy pocos transformantes que contienen GGPPS-7, lo que indica que el GGPPS-7 {Synechococcus sp.) puede ser la más activa de las dos enzimas, y que la actividad podría ser lo suficientemente alta para conferir una toxicidad. Por ejemplo, un incremento dramático en la producción GGPP podría dar como resultado un gasto innecesario en la trayectoria de corriente descendente tal como la producción de ergosterol. Para probar esta hipótesis, un gen UPC2-1 fue coexpresado con GGPPS-7, y la alimentación de ergosterol a las células se intentó para ver si esto podría rescatar el cultivo de células. Sin embargo, no se rescató el cultivo celular.
La toxicidad celular también puede deberse a la acumulación de GGPP o un metabolito de GGPP. Para probar esta hipótesis, el CDPS-5 fue sobre-expresado adicionalmente en la cepa de levadura que expresa el GGPPS-7 para ver si la toxicidad podría ser aliviada incrementando el uso de GGPP. La sobre-expresión de CDPS5 pareció rescatar el cultivo hasta cierto alcance debido a que los transformantes con un plásmido que sobre-expresa esta enzima junto con el GGPPS-7 produjo un crecimiento de pocas colonias. El número de transformantes todavía fue bajo. La sobre-expresión de CDPS-5 en una cepa similar pero con GGPPS-10 en lugar de GGPPS-7 tuvo como resultado el doble de la producción de esteviol glucósido, y estos resultados juntos podrían sugerir que el CDPS es una limitación de cuello de botella en la trayectoria de biosíntesis de esteviol glucósido biosíntesis introducida.
En resumen, con base en la producción de 19-5MG o rubusósido en cultivos celulares en tubo de prueba a una temperatura de 30°C sobre el medio de levadura + 2% de glucosa, durante 24 a 72 horas, se llegó a las siguientes conclusiones con los términos de eYAC: KS-1 (Stevia rebaudiana, codificado mediante la SEQ ID NO:40), KO-1 (S. rebaudiana, codificado mediante la SEQ ID NO:52) y KAH-1 (S. rebaudiana) o KAH-3 (Arabidopsis thaliana, codificado mediante la SEQ ID NO:62) parecen ser las mejores combinaciones para la trayectoria de esteviol. El GGPPS-7 (Synechococcus sp.) parece mostrar la cantidad más alta de actividad para este paso, aunque si ocurren cuellos de botella en corriente descendente la sobre-expresión también podría conducir a una toxicidad y en general a niveles inferiores de esteviol glucósidos. Todas combinaciones de genes análogos CDPS y CPR se probaron y se descubrió que los tres CPRs en la Tabla 11 estaban activos, y que las combinaciones de CPR-1 (S. rebaudiana, codificado mediante la SEQ ID NO:70) o CPR-3 (Gibberella fujikuroi, codificado mediante la SEQ ID NO:72) con cualquiera de CDPS-5 (Zea mays) o CDPS-4 (A. thaliana) fueron particularmente útiles. La CDPS-5 parece ser el CDPS óptimo en la trayectoria. Las combinaciones pueden ser probadas adicionalmente en una cepa de reportero con flujo reducido para las trayectorias de esterol.
Para investigar el potencial para actividad incluso superior del CDPS a partir de Zea mays (CDPS-5), este gen fue expresado a partir de un plásmido de copias múltiples de 2 mieras utilizando al promotor GPD, con y sin un péptido de señal de plástido, para determinar si la actividad mayor en el citoplasma cuando las secuencias objetivo son removidas. La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido del CDPS-5 a partir de Zea mays y que contiene el péptido de señal de cloroplasto se establecen en las SEQ ID NOs:80 y 81, respectivamente. El péptido de señal de cloroplasto es codificado mediante los nucleótidos 1 a 150 de la SEQ ID NO:80, y corresponde a los aminoácidos 1 a 50 de la SEQ ID NO:81. La plásmido fue transformado en una cepa productora de rubusósido estable (EFSC1859) que tiene GGPPS-10, CDPS-5, KS-1, KO-1, KAH-3 , CPR-1 y UGT74G1 (SEQ ID NO:2) integrados en el genoma y expresados a partir de los promotores constitutivos fuertes GPD y TPI. Adicionalmente, en la cepa EFSC 1859, la expresión de sintasa de escualeno, la cual es codificada mediante la ERG9, ésta fue sub-regulada mediante el desplazamiento del promotor endógeno con el promotor que se puede inducir CUP1. Además de estos genes, la cepa EFSC1859 también expresa UGT85C2 (SEQ ID NO:3) desde un vector de copias múltiples de 2 mieras utilizando un promotor GPD 1. La producción de rubusósido y 19-5MG fue medida mediante LC-MS para estimar el nivel de producción. La remoción de la secuencia conductor de plástido no pareció incrementar la producción de esteviol glucósido producción en comparación con la secuencia de tipo natural. Sin embargo, este trabajo demuestra que las secuencias conductoras pueden ser removidas sin provocar una pérdida de función de la trayectoria de esteviol.
De manera similar, los plásmidos fueron construidos para CPR-3, KAH-3 y KO-1 sin secuencias de anclaje de membrana (es decir, los nucleótidos 4 a 63 de la SEQ ID NO:72; los nucleótidos 4 a 87 de la SEQ ID NO:62; y los nucleótidos 1 a 117 de la SEQ ID NO:52) y se transformaron en la cepa EFSC1859 con el UGT85C2 integrado en el cromosoma en lugar de hacerse en un plásmido. Se esperaba que estas enzimas fueran funcionales sin la secuencia de anclaje.
Ejemplo 10 - Identificación de Secuencias de Esteviol-1 ,3-Q- Monoglucósido 1.2-glucosiltransferasa Análisis EST de Estevia Una búsqueda tBLASTN de la base de datos de hoja EST (etiquetas de secuencia expresadas de Estevia {Stevia rebaudiana) (Brandle y asociados, Plant Mol. Biol. 50: páginas 613 a 622, 2002) se llevó a cabo utilizando Ipomoea (Ipomoea purpurea) completa tipo UGT79 UGT (IP3GGT), Bellis (Bellis perennis) UGT94B 1, las secuencias de aminoácidos de Estevia UGT79A2, Estevia UGT76G1 y Estevia UGT91D1 como las búsquedas, representando de esta manera a los UGTs de toda la familia 1 de sub-familias de glucosiltransferasa conocidas principalmente por contener diglicosiltransferasas. Se identificaron las secuencias parciales para 9 genes UGT no descritos anteriormente. Una de las secuencias parciales fue de la sub-familia UGT 79 ("79-EV1"), una de la sub-familia UGT 76 familia ("76-EV1") y dos de la sub familia UGT 91 ("91-EV-l" y "91-EV2"), así como también los miembros de las sub-familias UGT 71, 72, 78, 84 y 88. Siete de las secuencias parciales fueron aisladas utilizando cADN o las librerías cADN de Stevia como la plantilla PCR plantilla para el aislamiento. Además, se aislaron dos miembros de Estevia miembros de la sub-familia UGT 76, número de acceso GenBank ACT33422.1 la cual es un miembro de la sub-familia 76G1 (Mohankumar), y número de acceso GenBank ACM47734.1 la cual es un miembro de la subfamilia 76G2 (Yang).
Pirosecuenciación Se identificaron y aislaron los clones UGT adicionales realizando la pirosecuenciación con cADN de Estevia de la siguiente manera. Se preparó el mARN de Estevia a partir de hojas de Estevia, utilizando el equipo de preparación de mARN Ambion® Micro Poly Purist™. Como un control de calidad, el mARN transcrito inverso se probó en búsqueda de la presencia de los genes UGT de trayectoria de Estevia Rebaudiósido A 85C2, 74G1 y 76G1, empleando un PCR analítico con cebadores de oligonucleótidos idénticos a 21 nucleótidos en los términos 5' - y 3' -de cada secuencia. El mARN de longitud complete se utiliza entonces para la pirosecuenciación y el ensamble contiguo (MOgene, St. Louis, MO E.U.A.). Se realizaron aproximadamente 3.4 millones de lecturas de una longitud promedio de 393 nucleótidos, y las secuencias crudas resultantes se utilizaron para obtener las 25907 secuencias contiguas. Se construyó una base de datos, que contiene la secuencia de aminoácidos públicamente disponible de un total de ca. De 1,500 UGTs. Aproximadamente 150 de los UGTs secuenciados fueron UGTs completamente anotados de una variedad amplia de sub-familias. Los UGTs secuenciados restantes fueron homólogos parcialmente anotados de estos. Se realizó una búsqueda BLASTX (CLC Genomics, Muehltal, Alemania), utilizando los 25907 EST de Estevia contiguos como la búsqueda, para la base de datos GT fabricada (Código genético = 1, Complejidad baja = Si, Valor esperado = 10.0, Tamaño de palabra = 3, Número de procesadores = 2, Matriz = BLOSUM62, Costo de abertura (abierto) = 11, Costo de abertura (extensión)= 1). Los resultados sugieren que las secuencias de más de 90 UGTs conocidos con anterioridad a partir de la Estevia estuvieron presentes en la base de datos de pirosecuenciación.
No se identificaron miembros adicionales de la sub-familia UGT 79 o la sub-familia UGT 94 en la base de datos de pirosecuenciación. Sin embargo, el análisis mostró nuevos miembros de las sub-familias UGT 76 y 91. Para unos cuantos de los genes, los datos de secuencia de longitud completa estuvieron disponibles en forma inmediata de los datos EST de pirosecuenciación. Se utilizó una librería de cADN de plásmido de Stevia A construida previamente para obtener las secuencias de longitud completa para aquellos miembros para los cuales se obtuvieron los datos de secuencia parcial. Un cebador de oligonucleótido idéntico a cada secuencia UGT específica, parcial se combinó con un cebador de oligonucleótido idéntico a la secuencia de vector de plásmido de la librería. Estos cebadores se emplearon en PCR para obtener el producto de longitud completa, el cual fue secuenciado en forma subsiguiente. Con base en la secuencia de longitud completa, se realizó un segundo PCR utilizando una enzima de polimerasa PCR a prueba de lectura para la amplificación del gen UGT de longitud completa de una librería de cADN de Estevia como la plantilla para la reacción. Utilizando esta estrategia, cinco miembros de la sub-familia UGT 76, seis miembros de la subfamilia UGT 91, así como también diez miembros de las otras sub-familias UGT se aislaron.
Cada uno de los 7 UGTs identificados a partir de la base de datos EST de Estevia, las dos secuencias UGT 76 de Estevia disponibles públicamente, y los 21 UGTs identificados a partir de la pirosecuenciación se clonaron en los vectores de expresión E. coli pET30A+ o pETDuet (haciendo uso de la etiqueta HIS para propósitos de purificación) y expresados en las cepas de E. coli propensas a autolisis XjA y XjB. Para un gran número de estos UGTs, la expresión de la proteína UGT tuvo como resultado la formación de cuerpos de inclusión. Con el objeto de superar la formación de esos cuerpos de inclusión, algunos de estos UGTs fueron expresados en la cepa de expresión a temperatura baja "Arctic Express" (Agilent Technologies). Para aquellos que fallaron en expresarse en este sistema, se intentó la transcripción-traducción acopladas in vitro de los productos PCR (TNT®T7 Quick para el equipo PCR DNA, Promega), permitiendo la expresión exitosa del resto de UGTs. La eficiencia de la reacción se aseguró mediante el etiquetado con 35S-metionina, la separación en SDS-PAGE y la detección de imágenes de fosforo de una banda de proteina del tamaño esperado para la proteína UGT proteína en cuestión.
Los polipéptidos UGTs de cada clon, expresados como se describió anteriormente, se probaron en busca de actividad de 1 ,2-glucosilación , utilizando esteviol-13-O-monoglucósido como el sustrato. La proteína transcrita/traducida in vitro, que corresponde aproximadamente a un quinto del total de proteína formada en una de 25 pL reacción, se utilizó en una reacción in vitro, utilizando 0.5 mM de esteviol-13-O-monoglucósido (S G) como el sustrato, en un regulador de reacción (que contiene 1 mM de UDP-glucosa, 100 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 5 mM de MgCI2, 1 mM de KCI, 0.1 U/µ? de fosfatasa de intestino de becerro). La mezcla de reacción fue incubada a una temperatura de 30°C durante 20 horas. La mezcla de reacción se analizó entonces mediante Análisis LC-MS en búsqueda de la presencia esteviol-1 ,2-biosido. Los análisis LC-MS se realizaron utilizando un sistema Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies) ajustado con una columna hidro-RP de sinergia Phenomenex® (250 x 3 mm, 3 pm de partículas, 80 tamaño de poro A) y es unido mediante un guión a un espectrómetro de masa triple de cuatro polos TSQ Quantum (ThermoFisher Scientific) con ionización de electro-rocío. La elución fue llevada a cabo utilizando una fase móvil (30°C) que contiene MeCN (0.01% de ácido fórmico) y H20 (0.01% de ácido fórmico) aplicando un gradiente compuesto de 0.6 ? 0.4 ml/min, 5% de MeCN durante 4 minutos; 0.4 ml/min, 5 ? 40% de MeCN durante 2 minutos; 0.4 ml/min, 40 ? 55% de MeCN durante 11 minutos; 0.4 ? 1.0 ml/min, 55 ?100% de MeCN durante 3 minutos. Los esteviol biósidos fueron detectados utilizando SIM (monitoreo de ión único) en Mw 665.2 [M + Na+]. Ninguna de las 30 enzimas UGT probadas exhibieron actividad de glucosilación de esteviol-13-O-monoglucósido detectable.
Las secuencias de nucleótidos de los seis miembros UGT91 identificados mediante pirosecuenciación se compararon con la secuencia de Estevia UGT91D1 con Número de acceso GenBank No. AY345980. Parece que esa secuencia de GenBank codificó 12 aminoácidos adicionales en el término N, en relación con las seis secuencias identificadas mediante pirosecuenciación. Para volver a probar a los miembros de la familia UGT91D1 en la búsqueda de actividad, las secuencias UGT91D1 fueron aisladas nuevamente mediante amplificación PCR de cADN de hoja de Estevia. Los productos PCR resultantes fueron clonados en un vector de plásmido y actividad enzimática para cada producto se midió como se describió anteriormente mediante: expresión etiquetada por GST en E. coli, transcripción-traducción acoplada in vitro, y/o expresión in vivo en levadura. La actividad de Esteviol de 1,2-glucosilación se detectó a partir de un clon mediante los tres métodos. Este clon fue designado como UGT91D2e. La secuencia de aminoácido de UGT91D2e es establecida en la SEQ ID NO:5. En contraste, no se detectó actividad de 1,2-glucosilación de un clon que tiene la misma secuencia que se describió mediante el número de acceso AY345980 (número de acceso de proteína AAR06918), pero con la falta de los 12 aminoácidos del término amino.
Ejemplo 11 - Análisis de Secuencias UGT91D2e Variantes de secuencia de UGT91D2e Como se evidencia en la figura 19B, existe un número pequeño de modificaciones de aminoácido entre las variantes activas (91D2e) y los homólogos inactivos más cercanos (91D1). Los genes 91D1 genes clonados por Ma y asociados, Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2003 36(2): páginas 123 a 129 (Número de acceso de proteína AAM53963, Gl:21435782) y Brandle y asociados, supra (Número de acceso de proteína AAR06918, Gl:37993665) no exhibieron la actividad de 1,2-glucosilación para la biosíntesis RebA. Para averiguar cuál de los aminoácidos se requieren para la actividad, se crearon 21 mutantes dirigidos al sitio únicos de manera que el aminoácido en UGT91D2e (SEQ ID NO:5) fue cambiado al aminoácido correspondiente en un homólogo inactivo. Véase la Tabla 12. Además, se realizó una mutación dirigida al sitio de manera que la posición 364 (S?P) también se cambió. Los mutantes fueron elaborados utilizando el equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® II de acuerdo con los protocolos del fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), y los vectores pGEX-4TI fueron transformados en una cepa E. coli de autolisis XJb (ZymoResearch, Orange, CA). Uno de los mutantes no se elaboró para cambiar el residuo 162 de una glicina a un ácido aspártico.
Con el objeto de evaluar la actividad de las enzimas mutantes, se realizó un experimento de alimentación de sustrato in vitro utilizando la proteína producida en E. coli. Inicialmente, las células de E. coli se cultivaron durante la noche a una temperatura de 30°C, seguido por la inducción con 3 m de arabinosa y 0.1 mM de IPTG, y con incubación adicional a una temperatura de 20°C. Para el ensayo in vitro, las células fueron inducidas durante la noche a una temperatura de 20°C, fueron lisadas mediante un ciclo de congelación/deshielo, y el extracto de célula cruda se utilizó para una reacción enzimática en la cual, los sustratos fueron 0.5 mM de esteviol-13-O-glucósido y 0.5 mM de rubusósido.
Los resultados se muestran en la Tabla 12 para los sustratos de esteviol monoglucósido (SMG) y sustratos de Rubusósido (Rub). Un signo " + " indica que la actividad de diglucosilación fue detectada, un signo "-" indica que no se detectó actividad, y "NA" indica que no se realizó el ensayo. Las mutaciones observadas se basan en la numeración de la secuencia 91D2e (SEQ ID NO:5).
Debido a que algunos de los genes tienen una tendencia a expresarse en cuerpos de inclusión en E. coli, la secuencia de codificaciones que no muestran actividad en los experimentos de E. coli también fueron producidas por transcripción-traducción acoplada in vitro de productos PCR productos (TNT®T7 Quick para equipo de ADN PCR, Promega) como anteriormente en el Ejemplo 10. En resumen, 2 pL de ADN de la amplificación PCR los cinco mutantes únicos y la enzima tipo natural se incubaron durante 90 minutos a una temperatura de 30°C con el equipo master mix y 1 pL de L-[35S]-Metionina, en un total de 25 pL de reacción. Para cada muestra, se corrió un volumen de 2 pL de reacción final en un gel SDS-PAGE. Las seis proteínas mostraron niveles similares de proteína recombinante soluble como fue evaluado mediante observación visual del gel SDS-PAGE. Los resultados para las proteínas traducidas in vitro se muestran del lado derecho de la Tabla 12. Los porcentajes en esta tabla indican la cantidad aproximada de conversión de sustrato a producto con base en áreas pico relativas del sustrato y producto.
Tabla 12 La cantidad aproximada de actividad de diglucosilación en comparación con UGT91D2e (SEQ ID NO:5) se descubrió ser: 6.1% para T144S, 26.2% para M152L, 30.7% para L213F, 4.3% para S364P, y 14.7% para G384C utilizando 13-SMG como el sustrato. Para rubusósido, la cantidad aproximada de actividad de diglucosilación en comparación con UGT91D2e fue del 1.4%, 23.4%, 43.7%, 10.9% y 35.2% para T144S, M152L, L213F, S364P, y G384C, respectivamente.
Estos resultados indican que 5 de las 22 mutaciones de aminoácido fueron notoriamente dañinas para la actividad cuando se realizó en aislamiento. También es posible que las combinaciones de 10 de las otras 17 mutaciones también pudieran tener como resultado la inactividad o pérdida de actividad.
Al alinear las secuencias 91D2e y las variantes descritas anteriormente con proteínas denominadas At72B1, Mt85H2, VvGT1 y Mt71G1 (Osmani y asociados (2009) Phvtochemistrv 70, páginas 325 a 347), y analizando las estructuras terciarias pronosticadas (hélices alfa, placas beta, y regiones de bobina), las regiones pueden ser identificadas en donde es probable que las mutaciones tengan como resultado la pérdida de actividad de diglucosilación. Las primeras tres mutaciones que son dañinas se encuentran en el dominio de la terminal N, en regiones que son consideradas circuitos. El dominio de terminal N (residuos de aminoácido 1-240), en particular las regiones de circuito pronosticadas del dominio de terminal N (aminoácidos 20 a 26, 39 a 43, 88 a 95, 121 a 124, 142 a 158, 185 a 198 y 203 a 214), se consideran ser responsables principalmente de enlazar el sustrato aceptante de la molécula de glucosa. La cuarta mutación que parece ser dañina para la actividad se encuentra en el dominio de terminal C, en una región que se considera ser el circuito C5 (que corresponde a los aminoácidos 381 a 386). Este circuito, también se considera importante para la especificidad del sustrato aceptante de glucosa. Diecinueve de las veintidós mutaciones que separan a las enzimas de diglucosilasa rubusósido inactivas contra activas están localizadas dentro de los cinco aminoácidos de las regiones de enlace de sustrato aceptante pronosticado de 91D2e. Por consiguiente, es probable que las enzimas 91D1 publicadas catalicen una reacción de glucosil transferasa entre UDP-glucosa y un sustrato aceptante alternativo.
Ejemplo 12 -- Producción de rebaudiósido A en levadura Producción de rebaudiósido A levadura alimentada por esteviol La cepa de levadura EFSCI580, la cual contiene un cásete de expresión integrado en forma genómica UGT74G1, se transformó con tres diferentes plásmidos de copia alta 2µ (episomal) para la co-expresión de Estevia UGTs 91D2e (SEQ ID NO:5), 85C2 (SEQ ID NO:3), y 76G1 (SEQ ID NO:7). Los tres plásmidos, designados como p US44, pMUS7 y pMUS9, contienen la secuencia de codificaciones para UGT91D2e, UGT85C2 y UGT76G 1, respectivamente, enlazado en forma operativa con el promotor GPDI fuerte. La cepa de levadura resultante se cultivó en Medio SC sin uracilo, histidina, y leucina para la selección de la presencia continuada de los plásmidos de expresión pMUS44, pMUS7 y pMUS9. El esteviol se agregó al medio a una concentración final de 250µ?, y la cepa se cultivó a una temperatura de 30°C. A las 18 horas y 72 horas de cultivo, alícuotas del sobrenadante y los aglomerados de célula se analizaron en búsqueda de la presencia de Rebaudiósido A mediante LC-MS. Los análisis LC-MS fueron realizados utilizando un sistema Agilent 1100 Serie HPLC (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) adaptado con una hidro-RP de sinergia Phenomenex® (250 x 3 mm, 3 µ?t? de partículas, tamaño de poro 80 A) y se unieron con un guión a un espectrómetro de masa triple de cuatro polos TSQ Quantum (ThermoFisher Scientific) con ionización de electro-rocío. La elusión fue llevada a cabo utilizando una fase móvil (30°C) que contiene MeCN (0.01% de ácido fórmico) y H20 (0.01% de ácido fórmico) aplicando un gradiente compuesto de 0.6 ? 0.4 ml/min, 5% de MeCN durante 4 minutos; 0.4 ml/min, 5?40% de MeCN durante 2 minutos; 0.4 ml/min, 40 ? 55% de MeCN durante 11 minutos; 0.4 ? 1.0 ml/min, 55?100% de MeCN durante 3 minutos. Se detectaron los esteviol biósidos utilizando SIM (monitoreo de ión único).
Los resultados LC-MS mostraron que las cantidades que se pueden detectar de Rebaudiósido A se encontraron en el sobrenadante a las 18 y 72 horas de cultivo cuando la cepa EFSC1580 que contiene pMUS44, pMUS7 y pMUS9 se cultivó en la presencia de esteviol. El producto co-eludido con un rebaudiósido A estándar y la masa esperada se confirmó como [M + Na]+ = 989. En comparación con la adsorbencia del producto a la adsorbencia de 10µ? de Rebaudiósido A estándar, la acumulación del sobrenadante del cultivo celular se estimó para ser más de 6mg/L a las 18 horas, y más de 15 mg/L a las 72 horas.
Producción de Rebaudiósido A v Rebaudiósido D en levadura alimentada por glucosa La cepa de levadura CEY213, descrita en el Ejemplo 4, contiene genes de trayectoria biosintética de esteviol expresados a partir de eYACs así como también casetes de expresión integrados en forma genómica UGT74G1 y UGT85C2. La cepa CEY213 produce rubusósido, como el que se describió en el Ejemplo 6.
La cepa CEY213 se transformó con un plásmido de expresión dual de copia alta 211 (episomal), pMUS47, para la expresión simultánea de UGT91D2e (SEQ ID NO:5) y UGT76G 1 (SEQ ID NO:7). El plásmido pMUS47 contiene dos casetes de expresión, uno que tiene la secuencia de codificación de UGT91D2e y el otro que tiene la secuencia de codificación de UGT76G 1. Ambas codificaciones de secuencia están enlazadas en forma operativa al promotor constitutivo fuerte GPDI. La cepa de levadura resultante fue cultivada previamente durante la noche a una temperatura de 30°C en medio SC sin histidina, leucina y triptofano con el objeto de mantener la selección para la presencia de eYACs, sin uracilo con el objeto de mantener la selección para la presencia de pMUS47, y finalmente con metionina (2mM) con el objeto de suprimir a los promotores presentes en los eYACs. El día siguiente, las células fueron lavadas y transferidas a un medio idéntico, pero sin metionina, para la inducción de los promotores eYAC. Las muestras fueron recolectadas después de 24 horas y 99 horas de incubación, y los sobrenadantes y aglomerados de células fueron analizados en búsqueda de la presencia de Rebaudiosido A y Rebaudiosido D, utilizando LC-MS como se describió anteriormente.
Los resultados mostraron que se encontraron cantidades detectables de Rebaudiosido A en los sobrenadantes tanto a las 24 como a las 99 horas. El producto co-eludido con un Rebaudiosido A estándar y se confirmó a la masa esperada como [M + Na]+ = 989. Comparando la absorbancia del producto con un Rebaudiosido A estándar de 10µ?, la acumulación de Rebaudiosido A en el sobrenadante se estimó ser de más de 3mg/L a las 24 horas y más de 6 mg/L a las 99 horas. Véase la figura 9. Los resultados también indicaron que estaban presentes cantidades pequeñas de esteviosido y rubusosido en el aglomerado celular de levadura y que estaban presentes cantidades detectables de esteviosido y rubusosido en el cultivo de sobrenadante. Véase la figura 9.
Los resultados también mostraron que se produjeron cantidades pequeñas aunque detectables de Rebaudiosido D, sugiriendo que UGT91D2e tiene la capacidad de conjugar una glucosa adicional glucosa a la 19-0 glucosa de cualquier esteviosido que produce Rebaudiosido E o directamente a la 19-O glucosa de Rebaudiosido A. Estos resultados también sugieren que UGT76G1 puede tener la capacidad de aceptar el Rebaudiósido E como un sustrato para producir Rebaudiósido D. Véase la figura 2C.
Ejemplo 13 -- Producción de Rebaudiósido A con secuencias optimizadas de codón para las secuencias UGT Las secuencias óptimas de codificaciones para UGT 91d2e, 74G1, 76G1, y 85C2 fueron diseñadas y sintetizadas para la expresión de levadura utilizando dos metodologías, suministradas por GeneArt (Regensburg, Alemania) (SEQ ID NOs: 6, 2, 8, y 4, respectivamente) o ADN 2.0 (Menlo Park, CA) (SEQ ID NOs: 84, 83, 85, y 82, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos de UGT 91d2e, 74G1, 76G1, y 85C2 (SEQ ID NOs: 5, 1, 7 y 3, respectivamente) no cambiaron.
Los plásmidos de número alto de copias que contienen casetes de expresión con los cuatro UGTs optimizados fueron construidos y expresados, y su actividad se comparó con los productos de expresión de constructos similares que contienen secuencias de tipo natural. Los plásmidos fueron transformados en la cepa Watchmaker universal, EFSC301 (descrita en el Ejemplo 3). Los UGTs se insertaron en vectores de copia alta (2µ) y fueron expresados a partir de un promotor constitutivo fuerte (GPDI) (vectores P423-GPD, P424-GPD, P425-GPD, y P426-GPD). Después del cultivo durante la noche y la nueva inoculación en medio fresco a un OD6oo de 0.25, el medio de cultivo (SC -leu-trp-ura-his) se complementó con 25 µ de esteviol (concentración final), y la producción de Rubusósido (Rub), 19-5MG (19SMG) y RebA (RebA) se midió en el medio después de 24h. El experimento se repitió, en parte debido al hecho de que 19-5MG no se podía detectar en una de las primeras muestras.
Los resultados de los dos estudios separados, mostrados en Tabla 13 a continuación, indican que los ochos UGT optimizados por codón estuvieron activos. Sin embargo, la expresión de enzima por lo menos para uno de los UGTs optimizados por codón en cada estrategia se redujo por el algoritmo de optimización de codón nuevo utilizado para elaborar los términos (SEQ ID NOs: 6, 2, 8, y 4), se creó potencialmente un cuello de botella entre el rubusósido y RebA. Se espera que los ensayos de actividad de enzima individual y los análisis de expresión de estás secuencias de codificación expresadas en la cepa de levaduras permitirán la combinación óptima de los genes UGT en la trayectoria.
Tabla 13 Ejemplo 14 - Producción de rebaudiósido A utilizando UGTs con etiquetas de secuencia Las fusiones de péptidos pequeños o dominios de enlace de proteína con las Proteínas UGT 85C2, 91D2e, 74G1, y 76G1 pueden promover las interacciones entre los UGTs (canalizar) o ayudar a dirigir/anclar los UGTs con componentes específicos de las células de levadura.
Para evaluar si el andamiaje de los UGTs en la trayectoria RebA podría tener como resultado enzimas de trayectoria activa, se fusionaron los UGTs 85C2 y 74G1 optimizados por codón de ADN 2.0 en el marco de péptidos cortos (también conocidos como PMI) a una agitación de alta afinidad 4, que se parece a la proteína motivo p53. La proteína motivo p53 interactúa con la proteína MDM2 en humanos (véanse Li y asociados, J Mol Biol. 2010, 398(2): páginas 200 a 213). UGTs 85C2, 91D2e, 74GI y 76GI (SEQ ID NOs: 82, 84, 83, y 85, respectivamente) optimizados por codón de ADN 2.0, se fusionaron en el marco con los primeros 158 aminoácidos de la proteína humana MDM2 (número de acceso genético ABTI7086). Una región enlazadora rica en GS pequeña fue fusionada justo antes de la metionina de termina N de los UGTs. Sin fusionar, la afinidad de enlace PMI/MDM2 está en el intervalo nM bajo que representa un enlace de afinidad alta. Las células de levadura transformadas con las construcciones anteriores se espera que produzcan un andamiaje UGT de aproximadamente 4 X PMI (similar a P53) péptido de repetición fusionado con la terminal N para el andamiaje de la proteína 85C2 proteína (designada como 85C2_P53).
La cepa de laboratorio de BY4741, borrada para TRP1, se transformó con los plásmidos de expresión p423-426 GPD (Mumberg y asociados, Gene. 156 (1995), páginas 119 a 122) que expresa los UGTs de Estevia rebaudiana 74G1, 76G1 y 91D2e con fusiones en el marco de terminal N, de los primeros 158 aminoácidos de la proteína humana MDM2, y que expresa Stevia rebaudiana UGT85C2 con una terminal N en el marco de fusión de 4 repeticiones del péptido PMI sintético (4 X TSFAEYWNLLSP, SEQ ID NO:86). Véanse las SEQ ID NOs: 88, 90, 92, y 94 para la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión 85C2, 74GI, 91D2e, y 76GI, respectivamente; Véanse las SEQ ID NOs: 89, 92, 93, y 95 para las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión. Esta cepa de levadura y una cepa de control (que expresan los cuatro UGTs sin fusiones algunas) se cultivaron durante la noche en medio sintético de levadura seleccionando presencia de plásmidos y transferida entonces el día siguiente a una bandeja de 96 depósitos profundos que contiene medio sintético de levadura para una densidad celular que proporciona un OD6oo de 1. Una concentración final de 100µ? de esteviol se agregó. Después de 72 horas, las muestras fueron tomadas y analizadas mediante LC-MS, como se describió en el Ejemplo 12. Como se indicó en las figuras 10A y 10B, los UGTs están activos en levadura cuando son expresados con las diversas etiquetas de fusión.
Ejemplo 15 - Actividad UGT91D2e La sub-familia 91 de UGTs adicional se clonó utilizando cADN/preparaciones de librería elaboradas a partir de 3 fuentes de Estevia de diferentes procedencias genéticas. Los cebadores de oligonucleótido idénticos a UGT91 DI/91 D2e se utilizaron para la amplificación PCR de las preparaciones de cADN, y los productos PCR resultantes del tamaño correcto fueron clonados en los vectores de plásmido adecuados. Los numerosos clones de cada experimento fueron secuenciados, y los resultados de secuenciación mostraron que los ácidos nucleicos UGT91D con ligeras variaciones en la secuencia podrían se amplificados. Las veinte variantes UGT91D con las mayores diferencias en secuencia en relación con el UGT91D2e fueron expresados mediante la transcripción-traducción in vitro seguida por las pruebas enzimáticas para la actividad de glucosilación de esteviol-13-0-monoglucósido-1 ,2. Una de las variantes mostró actividad de glucosilación 1,2-biosido débil, mientras que el resto no mostraron actividad de glucosilación detectable. Por consiguiente parece que los polipéptidos UGT91D2s son las enzimas de glucosilización de esteviol-13-O-monoglucósido-l ,2 principales en Estevia.
Actividad enzimática de UGT91 D2e La UGT91D2e (SEQ ID NO:5), elaborada mediante transcripción/traducción acoplada in vitro, se probó en búsqueda de la capacidad para xilosilar y ramnosilar el esteviol-13-O-monoglucósido en un ensayo de enzima in vitro, utilizando UDP-xilosa o UDP-ramnosa como los donantes de azúcar en lugar de UDP-glucosa.
El ensayo de xilosilación se realizó de la siguiente manera: 3 mM de UDP-ácido glucorónico se mezclaron con ca. 1 pg de UDP-ácido glucorónico decarboxilasa UXS3 codificado por Arabidopsis thaliana (producido en E. coli y purificado posteriormente), 100 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM de DTT, 6 pg de BSA, 1 mM de MgCI2, y 1% fosfatasa de intestino de becerro. La mezcla de reacción fue incubada durante 30 minutos a una temperatura de 30°C, con el objeto de que el UDP-ácido glucorónico sea convertido en UDP-xilosa. Entonces, se agregaron a la mezcla 1.5 mM de sustrato de esteviol-13-0-monoglucósido y ca. 0.5 pg de enzima UGT91D2e elaborada como se describió en el Ejemplo 9, lo cual se dejó incubar a una temperatura de 30°C durante un periodo adicional de 20 horas.
El ensayo de ramnosilación se realizó en la siguiente forma: 3 mM de UDP-glucosa se mezclaron con 0.6 pg de cada una de las partes de terminal N y terminal C sintetasa de ramnosa RHM2 codificada por Arabidopsis thaliana (producida en E. coli y purificada posteriormente), 100 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM de DTT, 1.5 mM de NADPH , 1.5 mM de NAD + , 6 pg de BSA, 1 mM de MgCI2, y 1% de fosfatasa de intestino de becerro. La mezcla de reacción se incubó durante 30 minutos a una temperatura de 30°C, con el objeto de que la UDP-glucosa se convertida en UDP-ramnosa. Entonces los 1.5 mM de sustrato de esteviol-13-O-monoglucósido y ca. 0.5 pg de enzima UGT91 D2e se agregaron a la mezcla, la cual se dejó incubar a una temperatura de 30°C durante un periodo adicional de 20 horas.
Los resultados indicaron que UGT91 D2e tuvo la capacidad de llevar a cabo la xilosilación del sustrato esteviol-13-0-monoglucosido aproximadamente a la mitad de un tercio del índice observado con UDP-glucosa, que forma el esteviol- 13-0-monosido 1 ,2-xilosilated, el cual es un precursor para el Rebaudiósido F. el UGT91D2e tuvo la capacidad de llevar a cabo la ramnosilación del sustrato de esteviol-13-0-monoglucosido aproximadamente al mismo índice que el índice observado con UDP-glucosa, formando el esteviol-13-0-monosidol ,2-ramnosiloated, el cual es un precursor para el Rebaudiósido G (Dulcósido B). Estos resultados indica que la síntesis de moléculas precursoras adecuadas y la expresión de los UGTs adecuados in vivo debe tener como resultado la producción de Rebaudiósido F y C in vivo. Véanse las figuras 2B y 2D.
El UGT91 D2e también se probó por su capacidad para 1 ,2-glucosilar sustratos diferentes de esteviol-13-O-monoglucósido in vitro, es decir, rubusósido, esteviol-1 ,3-biosido y 1 ,3- steviosido. Los resultados indicaron que UGT91D2e no estuvo activo cuando un 1,3-enlace de glucosa estaba presente (por ejemplo, esteviol 1,3-biosido y 1 ,3-steviosido), mientras que UGT91D2e estaba activo independientemente de la glucosilación primaria en la posición 19-0. Estos resultados sugieren que el esteviol 1,3-biosido y 1 ,3-steviosido probablemente no están presentes en la trayectoria in vivo de Estevia para la formación rebA. Véanse la figura 2A y la figura 3.
Ejemplo 16 - Homólogos de UGT91D Los ecotipos diferentes de S. rebaudiana son genéticamente diversos. La investigación de 96 clones de 91Ds de diferentes accesos ARN de Estevia revelaron muchos cambios de aminoácido entre seis ecotipos investigados (por ejemplo, en el nucleotido 74 (dando como resultado un cambio de aminoácido de G a D), 89 (Y a F), 131 (V a A), 137 (F a S), 278 (P a Q), 295 (S a V o P), 331 (E a Q), 365 (Y a F), 395 (A a V), 418 (H a Y), 425 (S a G), 431 (T a I), 442 (A a T), 454 (M a L), 458 (G a A), 466 (A a S), 485 (G a D), 583 (L a M), 587 (V a E), 595 (K a E), 614 (D a G), 616 (G a R), 631 (L a M), 637 (L a F), 662 (S a F), 664 (K a E), 671 (Y a C), 857 (V a A), 867 (S a R), 919 (F a L), 989 (V a A), 1000 (R a C), 1090 (S a P), 1150 (G a C), 1232 (L a S), 1281 (K a N), 1313 (E a A), 1354 (Q a R), y 1369 (V a I)), como son numerados con respecto a la secuencia de nucleotido de 91D2e establecida en la SEQ ID NO:9. Se observe alguna variación adicional de estos polimorfismos, la cual probablemente se debe a la secuenciación o a errores PCR, particularmente si los polimorfismos fueron encontrados únicamente una vez. Se eligieron veinte regiones de codificación para análisis adicional. Véase la Tabla 14 para las descripciones de los clones que fueron aislados. La numeración de los aminoácidos en la Tabla 14 se basa en la secuencia de aminoácidos de UGT91D2e establecida en la SEQ ID NO:5.
TABLA 14 Todos los clones en la Tabla 14 fueron probados para su actividad utilizando 13-SMG como un sustrato. El clon 5 tuvo actividad de 1 ,2-glucosilación débil mientras que los restantes diecinueve no parecieron tener actividad bajo las condiciones probadas. La secuencia del clon 5 es establecida en la SEQ ID NO:95 y tiene las siguientes mutaciones con respecto al UGT92D2e de tipo natural (SEQ ID NO:5): G206R, Y207C, y W343R.
Ejemplo 17 - Homólogos de UGT85C La diversidad genética de UGT85Cs de seis ecotipos diferentes de S. rebaudiana se examinó para identificar a los homólogos que tienen la misma actividad o actividad mejorada en trayectorias para la producción de esteviol glucósido. Los cebadores PCR fueron diseñados para ser específicos para los genes UGT85C, y las reacciones PCR fueron llevadas a cabo sobre cADN (algunas fueron realizadas sobre las librerías cADN, algunas fueron realizadas en preparaciones cADN). Los productos PCR resultantes fueron clonados y se secuenciaron 96 clones. Los polimorfismos de aminoácido fueron mapeados y se eligieron 16 clones UGT85C con una representación de polimorfismo común variable. Véase la Tabla 15. También se observaron las modificaciones adicionales para algunos clones, aunque podrían deberse a los errores PCR o no fueron polimorfismos comunes. Los polimorfismos se describen con respecto a la numeración de nucleótido y aminoácido de la secuencia de nucleótido UGT85C de S. rebaudiana de tipo natural establecida en el No. de acceso AY345978.1 (Véase la Tabla 8).
Los clones fueron expresados a través de la transcripción-traducción acoplada in vitro de productos PCR (equipo ADN PCR para TNT® T7 Quick, Promega) y ensayados para actividad de glucosilación sobre los sustratos de esteviol y esteviol-19-0-glucósido (0.5 m ), como se describió en los ejemplos anteriores. Los UGT85Cs producidos a partir de clones 1 , 4, 16, 17, 19, 20, 21 , 26, 29, 30, 31 , 37, y 39 fueron solubles y tuvieron la capacidad de convertir 19-5MG en rubusósido en un ensayo de 90 minutos. El UGT85C producido a partir del clon 27 se consideró insoluble. Aunque los UGT85Cs producidos a partir de los clones 2 y 33 fueron considerados insolubles, las cantidades traza de rubusósido fueron producidas independientemente de que la banda de proteína no era visible. Estos experimentos fueron realizados en forma independiente tres veces. Los experimentos mostraron que las siguientes mutaciones de aminoácido no tuvieron como resultado la pérdida de actividad: V13F, F15L, H60D, A65S, E71Q, 187F, K220T, R243W, T270M, T270R, Q289H, L334S, A389V, I394V, P397S, E418V, G440D, y H441N. las mutaciones adicionales que se observaron en los clones activos incluyen K9E en el clon 37, K10R en el clon 26, Q21H en el clon 2, M27V en el clon 30, L91 P en el clon 4, Y298C en el clon 31 , K350T en el clon 37, H368R en el clon 1 , G420R en el clon 19, L431 P en el clon 4, R444G en el clon 16, y M471T en el clon 30.
Los únicos polimorfismos comunes que no fueron probados fueron T270A y I336T, los cuales son sustituciones medianamente conservadoras. El clon 17 tuvo la mayoría de los cambios en comparación con UGT85C, 6/480 aminoácidos. Los aminoácidos 17-20 que aparecen para cambiarse representan aproximadamente una diferencia del 4% en el nivel de aminoácido.
Generalmente, existe poca diversidad genética entre los 85Cs y es probable que estén activos todos los homólogos 85C con los polimorfismos comunes establecidos en la Tabla 15.
Ejemplo 18 - homólogos UGT76G La diversidad genética de UGT76Gs de seis ecotipos diferentes de S. rebaudiana se examinó para identificar los homólogos que tienen la misma actividad o actividad mejorada en trayectorias para la producción de esteviol glucósido. Los cebadores PCR fueron diseñados para ser específicos para reacciones UGT76G, y PCR que fueron llevadas a cabo en preparaciones de cADN (librerías de cADN o preparaciones de cADN). Los fragmentos PCR resultantes fueron clonados y los 96 clones fueron secuenciados. Los polimorfismos de aminoácido comunes fueron mapeados y se eligieron dieciséis clones UGT76G, con representación de polimorfismo variable, incluyendo (numeración de aminoácido): R10S, II6L, F22V, M29I, K52S, V74K/E, P80S, L85A, V87S/G, L91P, I92F, I93F, H96Y, G97R, L108V, E113D, G116E, A123T, Q125A, I126L, Y128H, T130A, L142I, V145M, S147N, N15IT, F152I, H153L, H155Y, V156D, Q160L, E163D, L167F, P169L, K188N, K191Q, C192S/F, S193G/A, F194Y, M196N, K198Q, K199(l, V, Q), Y200(L, A, G), Y203I, F204L, E205G, N206K, I207M, T208I, V217I/F, E226Q, S228P, L230V, V233I, I234T, E236D, I237F, S253P, P266Q, S273P, R274S, G284T/A, T285S, 287-3 bp de borrado, R298H, P326A, L330V, G331A, P341L, L346I, S376L, D377A, G379A, L380F, S438P, y K441N. Generalmente, se presentó una gran diversidad entre los 76Gs.
Los clones fueron expresados a través de la traducción in vitro y ensayados para actividad de glucosilación utilizando 0.5 mM de esteviol-13-O-glucósido y 0.5 mM de esteviosido en la forma de sustratos, como se describió en los ejemplos previos. Las reacciones fueron llevadas a cabo durante 90 minutos a una temperatura de 30°C. La actividad del 76G1 natural se encontró en tres 76Gs nuevos designados como 76G_C4, 76G_G7 y 76G_H12, mediante la formación de 1,3-biosido cuando se utilizó como sustrato el esteviol-13-O-glucósido. La actividad en este caso fue determinada en forma comparativa para el control positivo, el 76G1 funcional. Los clones 76G_G7 y 76G_H12 produjeron niveles ligeramente superiores de Reb A que el control aunque 76G_C4 tuvo ligeramente menos Reb A que el control. El número de cambios en estos clones representa una diferencia de aproximadamente el 7% en el nivel de aminoácido, a partir de la enzima de control. Las SEQ ID NOs: 98, 100, y 102 establecen la secuencia de aminoácido de 76G_C4, 76G_G7, y 76G_H12, respectivamente. Las SEQ ID NOs: 97, 99, y 101 establecen las secuencias de nucleótidos que codifican a 76G_C4, 76G_G7, y 76G_H12, respectivamente. Las SEQ ID NOs: 98, 100, y 102 establecen la secuencia de aminoácido de 76G_C4, 76G_G7, y 76G_H12, respectivamente. Las SEQ ID NOs: 97, 99, y 101 establecen las secuencias de nucleótidos que codifican a 76G_C4, 76G_G7, y 76G_H12, respectivamente.
La Tabla 16, resume los cambios de aminoácido de los clones 76G clones que tuvieron actividad, en comparación con la enzima de tipo natural. Estos son un número grande de polimorfismos que se traslapan en los clones activos, por consiguiente se espera que estos polimorfismos no provoquen una pérdida de actividad para la enzima. Parece que ciertas mutaciones son frecuentes en clones inactivos, tales como la mutación P-7S en la posición 80 o la mutación F-7V en la posición 22.
TABLA 16 Ejemplo 19 - Expresión de reductasa HMG-CoA de levadura truncada v otras reductasas HMG-CoA En S. cerevisiae, la trayectoria de mevalonato es regulada de modo pesado, por ejemplo, en el nivel de la enzima 3-Hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa. Expresando una reductasa HMG-CoA truncada (tHMGI, que codifica una enzima estabilizada a partir de degradación) es un método en el cual, el flujo hacia la producción PPP puede ser incrementado en levadura. Por ejemplo, la expresión de tHMGI en levadura ha conducido a la sobre-producción dramática de ß-caroteno. Véase la publicación de Verwaal y asociados, 2007, Appl. Environ. Microbiol. 73: página 4342. De manera interesante, dicha levadura no mostró una coloración anaranjada más oscura sobre medio de cultivo sólido de la que se esperaba, sino en su lugar un color amarillo más fuerte, probablemente debido a la sobre-producción superior del fitoeno intermediario.
Para determinar si la expresión de reductasa HMG-CoA podría utilizarse para mejorar el flujo de las trayectorias de esteviol y esteviol glucósido, se preparó una cepa de reportero de levadura para probar el flujo isoprenoide de prueba, sustituyendo el promotor inherente del gen ER09 con un promotor CUP1 promotor. Véase, la solicitud de Patente Norteamericana No. 61/346853, presentada el 20 de mayo de 2010.
Los genes utilizados para producir la cepa de levadura se muestran en la Tabla 17. Los genes de los organismos fuente fueron optimizados por codón de acuerdo con ADN 2.0 Inc™. Para el propósito de monitoreo de la disponibilidad de fosfato de prenilo celular, se produjo un término el cual tenía un plásmido de número de copias alto que contiene casetes de gene de expresión (promotores que pueden ser reprimidos por metionina) con los genes para las tres enzimas necesarias para convertir los fosfatos de prenilo en ß-caroteno (sintasa de GGPP Xanthophyllomyces dendrorhous, sintasa de fitoeno sintasa y sintasa de beta caroteno de X dendrorhous, y sintasa de zeta caroteno y sintasa de delta caroteno de Neurospora crassa). Véase la publicación de Verwaal y asociados, 2007 supra; y la solicitud de Patente Norteamericana No. 61/346853.
Tabla 17 Fuentes de reductasas HMG CoA y otros genes de Mevalonato La levadura tHMG1 fue expresada en la cepa de levadura basada en CEN.PK que produce ß-caroteno, dando como resultado un cambio de color de anaranjado a amarillo claro. De manera interesante, la expresión de la longitud completa de HMGs a partir de Artemisia annua, Trypanosoma cruzi y Staphylococcus aureus, así como también los HMG dependientes de NADH de Pseudomonas mevalonii y Archeoglobus fulgidus produjo un resultado similar, lo que indica que estos genes también mejoran el flujo a través de la trayectoria de mevalonato en levadura (la sobre-expresión similar de Bos taurus HMG no tuvo dicho efecto). Finalmente, se observó el mismo cambio de color después de la sobre-expresión de C-acetiltransferasa de acetil-CoA de Leishmania infantum (primera enzima de trayectoria de mevalonato, descrita en la tabla 17) o S. cerevisiae nativa (CAB1, YDR531W) o B. subtilis, (No. de acceso YP00420-4141 ) cinasas de pantotenato (conocidas por dar como resultado una producción incrementada de acetil-CoA).
Para probar si el cambio de color en estos experimentos de hecho se debía a una disponibilidad GGPP superior, la levadura tHMG1, los HMGs de P. mevalonii o S. aureus, o la cinasa de pantotenato B. subtilis fueron expresados en una cepa productora de 19-SMG estable. Ninguno de estos términos pareció producir un incremento en 19-SMG o la producción de rubusósido (UGT85C2 co-expresado) bajo las condiciones probadas. La alimentación de mevalonato a la cepa de reportero de levadura tampoco tuvo como resultado en una producción incrementada de rubusósido. La cepa de reportero de rubusósido, sin embargo, no ha sido modificada genéticamente para reducir el flujo codificado por ERG9 hacia la biosíntesis de ergosterol. Se esperó que el control de flujo para la producción de ergosterol podría tener como resultado la producción incrementada de esteviol glucósido utilizando los genes de HMG reductasa y otra trayectoria de genes de mevalonato se encontraron benéfico para la producción de beta-caroteno.
Ejemplo 20 - Producción de RebC in vivo La síntesis de una molécula precursora para Rebaudiósido C, esteviol-13-0-glucopiranosil-1 ,2-ramnosido, se mostró in vitro en el Ejemplo 15. En ese Ejemplo se utilizó esteviol-13-0-monoglucósido como un sustrato, junto con UDP-glucosa y la enzima RHM2 de Arabidopsis thaliana (etiqueta de sitio AT1G53500) y UGT91D2e. Para demostrar adicionalmente la trayectoria mostrada en la figura 2B, se logró in vivo la producción de Rebaudiósido C a partir de esteviol.
Se construyó una cepa de levadura con la capacidad de producir Rebaudiósido C, y la producción de rebaudiósido C y rebaudiósido A fue ensayada mediante LC-MS. Se construyó una cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae modificada y designada como EYS583-A. El uso de BY4742 ha sido descrito por Naesby y asociados, Microb Cell Fact. 8: página 45 (2009). Los cuatro UGTs (91D2d, 76G1, 74G1, y 85C2) fueron expresados en forma constitutiva en plásmidos con promotores GPD. Este tipo de cepa ha sido descrita por Naesby y asociados, Microb Cell Fact. 8: página 45 (2009). La UGT85C2 se insertó en el plásmido P423 GPD (ATCC#87355), la UGT74G1 se clonó en P424 GPD (ATCC#87357) y ambos UGT91D2e y UGT76G1 se clonaron en P425-GPD (ATCC#87359) con 91D2e en el sitio de clonación múltiple original (MCS), y 76G1 se insertó con un promotor adicional GPD y un terminador CYC. La cepa resultante se transformó con plásmido P426 GPD (ATCC#87361 ) que contiene el gen RHM2 expresado a partir del promotor GPD. La cepa se cultivó sobre el medio SC que carece de histidina, leucina, triptofano y uracilo durante 24 horas. El cultivo fue inoculado nuevamente para un OD60o de 0.4 en medio fresco que contiene 25 µ? de esteviol, y la levadura se dejó crecer durante 72 horas más antes de detectar si estaba presente el Rebaudiósido C en el sobrenadante y los aglomerados celulares. El Rebaudiósido C fue cuantificado utilizando un estándar de Rebaudiósido C auténtico (Chromadex, Irvine CA). Se detectó un total de 1.27 µ? ± 0.36 µ? de RebC en el sobrenadante. De manera similar, 3.17 µ? ± 1.09 µ? de RebA se detectó en el aglomerado celular. Un experto en la materia reconocerá que se pueden obtener proporciones diferentes de RebC para RebA mediante la modulación de la actividad de la enzima RHM2 y/o mediante el uso de UGT91D2e o enzimas parecidas a UGT76G1 con actividad superior para las reacciones de UDP-ramnosa. Las UGTs alternativas pueden ser versiones mutagenizadas de las enzimas de tipo natural o enzimas únicas que son obtenidas a través de iniciativas de descubrimiento.
Un experto en la materia reconocerá que una cepa de levadura con la capacidad de producción de Rebaudiósido A a partir de glucosa, tal como la cepa CEY213 transformada con un plásmido que contiene UGT91D2e y UGT76G1 en el Ejemplo 12 podría producir Rebaudiósido C con la adición del gen RHM2 ya sea, por medio de un vector o integrado en el cromosoma.
Ejemplo 21 -- Producción de esteviol glucósidos utilizando UGTs expresados en Escherichia coli Actividad de enzimas UGT de bacteria gram negativa Los genes de tipo natural para los UGTs 91D2e, 74G1, 76G1, y 85C2 fueron clonados en forma individual en células BL21(DE3) de autolisis por XjB de E. coli utilizando el sistema de vector pET30 de Novagen (EMD4 Biosciences, Madison, Wl), excepto que el UGT91D2e, el cual fue clonado en un vector pGEX 4T-1 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). En los Ejemplos 7 y 10 se describió una clonación similar. Todos los vectores utilizan un promotor que se puede inducir mediante IPTG. El plásmido de ADN se transforma en células químicamente competentes, todas descritas por el distribuidor.
Los transformantes que despliegan la resistencia antibiótica deseada se cultivaron durante la noche a una temperatura de 30°C en 2 mL de cultivos utilizando medio NZCYM y antibiótico. Para las alimentaciones in vivo, se cultivaron 5 cultivos: UGT 91d2e, 74G1, 76G1, y 85C2 en forma individual, y una mezcla de los cuatro clones. El día siguiente, los cultivos fueron inducidos a una concentración final de 0.3 mM de IPTG y 3 mM de arabinosa, y se cultivaron durante 2 días a una temperatura de 20°C en la presencia de 50 µ? de esteviol (UGT74G1, UGT85C2 y la mezcla de los cuatro) o 50µ de rubusósido (UGT91D2e y UGT76G1). La temperatura se elevó a 30°C y las células fueron cultivadas durante un día más. Las células fueron cosechadas después mediante centrifugación a dina velocidad de 4000 rpm durante 5 minutos y los sobrenadantes fueron removidos para el análisis LC-MS. Las células fueron suspendidas nuevamente en 50% de DIVISO, fueron lisadas a una temperatura de 80°C durante 5 minutos y los Usados fueron analizados mediante LC-MS.
Para los ensayos ¡n vitro, los transformantes que despliegan la resistencia a antibióticos deseada se cultivaron durante la noche a una temperatura de 30°C en 2 mL de cultivos utilizando medio NZCYM y antibiótico. El día siguiente, los cultivos fueron inducidos a una concentración final de 0.3 mM de IPTG y 3 mM de arabinosa, y se cultivaron durante 24 horas a una temperatura de 20°C. Las células fueron entonces cosechadas mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos y fue suspendida nuevamente en 200 pL de regulador GT (RBC Bioscience) y 3 tabletas/100 mi de inhibidor de proteasa, Complete mini (Roche), transferido a tubos Eppendorf, sometido a vórtice y congelado a una temperatura de 80°C durante 1.5 horas. Las células fueron desheladas en hielo, y se dejaron a temperatura ambiente durante 3 minutos. Cuando se descongeló hasta aproximadamente la mitad, se agregaron 15 µ? de 0.14 mg/ml de solución de H20 DNasa + 30 µ? 0.05M de MgCI2 a cada tubo y las muestras fueron incubadas durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente.
Las células fueron centrifugadas a velocidad máxima durante 5 minutos. Cien pL de sobrenadante (lisato) se transfirieron a tubos de micro-fuga frescos, y se agregaron 100 µ? de glicerol.
Los ensayos de enzimas fueron realizados agregando 15.15 pL de H20, 7.5pL 4 veces de regulador (400 mM de Tris, 20mM de MgCI2, 4mM de KCI), 0.3 pL de FastAp™ (1u/pL) de Fermentas, 0.45pL de un surtido de 100 mM de UDP-glucosa, 0.6pL de sustrato (esteviol o rubusósido) y 6 pL las preparaciones de enzima crudas descritas anteriormente. El UGT74G1 , UGT85C2, así como también los cuatro UGTs mezclados fueron incubados con esteviol. Los UGT 76G1 y 85C2 fueron incubados con rubusósido. Los ensayos de enzima incubados durante la noche a una temperatura de 37°C. Después de la centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos, 30pL de muestras fueron transferidas a 10 placas de 96 depósitos y se agregaron 30 pL de DMSO. Las muestras fueron entonces sometidas a análisis LC-MS. Los experimentos in vitro similares también se realizaron utilizando esteviol 1 ,2-biosido (para UGT76G1 y UGT74G1) o Rebaudiósido B (para UGT74G1) como los sustratos.
No se detectó actividad en las alimentaciones in vivo. La Tabla 18 ilustra los resultados para los ensayos in vitro.
Tabla 18 Estos resultados indican que las enzimas UGT enzimas están todas activas en las células E. coli. Sin embargo, los sustratos pueden no ser fácilmente importados en el citoplasma. Se espera que si el esteviol fuera producido en E. coli de las trayectorias de precursor, la producción de los diversos productos de esteviol glucósido podría ser factible a partir de glucosa. Es inesperado que los UGTs 74G1 y 85G1, los cuales tienen especificidades de sustrato ligeramente traslapados, pueden producir rubusósido a partir únicamente de esteviol. La mezcla de las cuatro preparaciones de enzima cruda produjeron niveles muy bajos de los monósidos, lo cual indica que la conversión a di- y triglucósidos fue eficiente. Con respecto a UGT91D2e, la preparación se utilizó teniendo perdida parte de su actividad original después de almacenamiento de largo plazo. Se espera que una preparación fresca de la enzima podría haber producido niveles más altos de Rebaudiósido A.
Ejemplo 22 -- Producción de esteviol glucósidos en Physcomitrella patens Experimentos de alimentación en células moss Los genes para UGT 91d2e, 74G1, 76G1, y 85C2 se clonaron en Physcomitrella patens utilizando el sistema de vector pTH Ubi: Portal descrito en la Publicación de Patente Norteamericana No. 20100297722. Este vector utiliza un promotor de ubiquitina de maíz fuerte. Los cebadores PCR fueron diseñados para amplificar las regiones de codificación en los ejemplos anteriores (secuencias nativas) con la adición de "CACC" en corriente ascendente del codón de partida. El plásmido de ADN fue digerido con Swal y se utilizó para la transformación en protoplastos (generalmente aproximadamente 0.5 x 106 protoplastos). Los transformantes que despliegan la resistencia deseada fueron cultivados durante 1 día en 10 mL de cultivos y entonces se alimentaron ya sea con esteviol, rubusósido, o regulador + DMSO como está indicado en la Tabla 19. Medio mL de regulador que contiene sustrato se agregó por 10 mL de cultivo, y concentraciones finales de 0.1% de DMSO, 50 µ? de esteviol o rubusósido, y 0.125 mM de regulador de fosfato se agregaron a los cultivos. Se realizó un control positivo, en donde YFP (proteína fluorescente amarilla) fue expresado en la presencia de esteviol o solo de regulador y DMSO. Los cultivos fueron cultivados durante 2 días más antes de la separación de las células y se congelaron en nitrógeno líquido hasta realizar los análisis adicionales. En algunos casos, los plásmidos que contienen UGT múltiples fueron transformados en células de protoplasto, para ilustrar la conversión de pasos múltiples dentro de las células moss.
Tabla 19 La expresión fue positiva en los controles (tubos 1 y 2) como se midió mediante la observación de la señal fluorescente. Los sobrenadantes de los experimentos fueron analizados mediante LC-MS; 200 pL de cada muestra de sobrenadante se mezcló con un volumen igual del 50 por ciento de DMSO. Las muestras se hicieron girar (fuerza centrífuga relativa de 15,700, 10 minutos) y se analizaron 100 microlitros del sobrenadante resultante mediante LC-MS.
Los aglomerados de protoplasto se deshelaron en hielo y se agregaron 10 mM de Tris-RCI pH 8 que contiene 3 tabletas/100 mi de inhibidor de proteasa Complete Mini (Roche) para alcanzar un volumen final de 150 µ?_. Las soluciones fueron divididas en dos: 75 pL fueron transferidos a un tubo nuevo y los protoplastos fueron aglomerados (fuerza centrífuga relativa de 15,700, 1 minuto). Los aglomerados fueron lavados con 75 pL de agua Milli-Q antes de ser suspendidos nuevamente en 150 pL de DMSO (50 por ciento). Las muestras fueron calentadas entonces (80 grados Celsius, 10 minutos), sometieron a vórtice y fueron centrifugadas (fuerza centrífuga relativa 15,700, 10 minutos). Cincuenta pL del sobrenadante resultante fue analizado mediante LC-MS.
No se pudo detectar producción de esteviol glucósido en los sobrenadantes o aglomerados. Se desconoce si el esteviol y rubusósido puede ser transportado en las células moss.
Alimentación in vitro de extractos de aglomerados Los experimentos de alimentación in vitro fueron conducidos con las muestras 1, 3, 4, 5, 6, 11, 13 y 17). Las muestras de vidrio (425-600 mieras) a los 75 pL restantes de las resuspensiones y los protoplastos originales fueron Usados mecánicamente al someterlos a vórtice 3 veces, 2 minutos cada vez, a una temperatura de 4 grados Celsius y fueron almacenados en hielo entre cada proceso de vórtice. Las muestras se hicieron girar (fuerza centrífuga relativa de 15,700, 10 minutos, 4 grados Celsius) y se utilizaron 6 µ?_ de los sobrenadantes resultantes en las reacciones de enzima in vitro. Se utilizó fosfatasa FastAp™ (Fermentas) para las reacciones de enzima (0.3 U/reacción) y la proporción UDP-15 glucosa:sustrato fue de 5. Las muestras fueron alimentadas, ya sea en esteviol o rubusósido de acuerdo con la Tabla 20.
Tabla 20 Las reacciones fueron incubadas a una temperatura de 30°C durante la noche. Después de la incubación, se agregó una cantidad igual de DMSO (100 por ciento) a las muestras y las mezcló, entonces la muestra se hizo girar (fuerza centrífuga relativa 15,700, 10 minutos) y se analizaron 30 pL del sobrenadante mediante LC-MS.
El análisis LC-MS mostró la conversión de rubusósido a ,3-steviosido mediante UGT76G1. Ninguno de los otros esteviol glucósidos se pudieron detectar. Se sabe si la expresión soluble de los UGTs ocurrió en Physcomitrella. Se espera que un UGT esté activen las células moss, los otros podrían también estar activos si ocurrió la expresión. Además, se realiza la clonación en una forma transitoria. La integración estable de los genes se espera que produzca clones adicionales que son activos para la actividad UGT cuando es probada.
Aquellos expertos en la materia conocen los métodos para incrementar la expresión soluble de proteínas recombinantes. Los promotores alternativos, sitios de enlace de ribosoma, uso de codón, la co-expresión con chaperones, y el cambio en la temperatura son ejemplos no limitantes de los métodos para incrementar la expresión soluble de proteínas recombinantes.
Ejemplo 23 -- Producción de esteviol glucósidos en Aspergillus nidulans Actividad de enzimas UGT en células de fúngicas Los genes nativos para UGT 91D2e, 74G1, 76G1, y 85C2 se clonaros en Aspergillus nidulans utilizando un cásete de expresión fabricado por PCR y el sistema de vector USER. Los métodos de clonación se describen en la publicación de Hansen y asociados, Appl. Environ. Microbiol. 77: páginas 3044 a 3051 (2011). Brevemente, un secuencia de nucleótido que codifica cada UGT se insertó entre el promotor constitutivo PgpdA y el terminador TtrpC, en un vector que contiene adicionalmente dos secuencias de dirección para la integración genómica y argB como el marcador de selección. El plásmido de ADN fue transformado en protoplastos A. nidulans de acuerdo con la publicación de Nielsen y asociados, Funqal Genet. Biol. 43: páginas 54 a 64 (2006) y la publicación de Johnstone y asociados, EMBO J. 4: páginas 1307 a 1311 (1985). Los transformantes que despliegan la resistencia deseada fueron cultivados durante 48 horas en 150 mL de cultivos utilizando un medio mínimo (1% de Glucosa; 10 mM de NaN03; mezcla mineral).
Los lisatos celulares preparados mediante la alteración del micelio con cuentas de vidrio se utilizaron para determinar las actividades de los UGTs individuales in vitro. Los lisatos celulares de las cepas que expresan 74G1 y 85C2 fueron incubados con 0.5 mM de esteviol y la cepas que expresan 76G1 y 91D2e fueron incubadas con 0.5 mM de esteviol-13-0-glucósido durante 24 horas, y los sobrenadantes fueron analizados adicionalmente utilizando LC/MS. No se detectaron esteviol glucósidos.
Se sabe que si se logra la expresión soluble de las enzimas UGT ya que estos productos normalmente no son visibles en SDS-PAGE. Debido a que tanto Aspergillus como Saccharomyces son hongos, se espera que la experimentación adicional pudiera dar como resultado clones activos. Aquellos expertos en la material conocen los métodos para incrementar la expresión soluble de proteínas recombinantes. Los promotores alternativos, niveles de inductor, sitios de enlace de ribosomas, uso de codón, co-expresión con chaperones, y cambios en la temperatura son ejemplos no limitantes de los métodos para incrementar la expresión soluble de las proteínas recombinantes.
OTRAS MODALIDADES Se deberá comprender que aunque la presente invención ha sido descrita en conjunto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la presente invención, la cual es definida por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (120)

REIVINDICACIONES
1. Un huésped recombinante que comprende un gen recombinante que codifica polipéptido a UGT91D2.
2. El huésped recombinante tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT91D2 es UGT91D2e o UGT91D2m.
3. El huésped recombinante tal y como se describe en las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT91D2 tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
4. El huésped recombinante tal y como se describe en la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT91D2 tiene por lo menos el 95% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
5. El huésped recombinante tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT91D2 tiene por lo menos el 99% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
6. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dicho huésped es un microorganismo.
7. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho microorganismo es un Sacaromiceto.
8. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho Sacaromiceto es Saccharomyces.
9. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho microorganismo es Escherichia cotí.
10. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dicho huésped es un planta o célula de planta.
11. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha planta o célula de planta es una planta o célula de planta de Stevia, Physcomitrella , o tabaco.
12. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 11, caracterizado además porque dicha planta de Stevia o célula de planta es una planta o célula de planta de Stevia rebaudiana .
13. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende por lo menos un aminoácido de sustitución en los residuos 1 a 19, 27 a 38, 44 a 87, 96 a 120, 125 a 141, 159 a 184, 199 a 202, 215 a 380, o 387 a 473 de la SEQ ID NO:5.
14. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende un aminoácido de sustitución en uno o más residuos seleccionados a partir del grupo que consiste de 40 residuos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343,427, y 438 de la SEQ ID NO:5.
15. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende una arginina en el residuo 206, una cisteína en el residuo 207, y una arginina en el residuo 343 en relación con la SEQ ID NO:5.
16. El huésped tal y como se describe en la rei indicación 14, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende una fenilalanina en el residuo 30, una glutamina en el residuo 93, una valina en el residuo 99, una fenilalanina en el residuo 122, una tirosina en el residuo 140, una cisteína en el residuo 142, una treonina en el residuo 148, una alanina en el residuo 153, una serina en el residuo 156, una metionina en el residuo 195, un ácido glutámico en el residuo 196, un ácido glutámico en el residuo 199, una metionina en el residuo 211, una fenilalanina en el residuo 221, una alanina en el residuo 286, una asparagina en el residuo 427, o una alanina en el residuo 438 en relación con la SEQ ID NO:5.
17. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 s 15, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95.
18. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5.
19. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT85C que tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:3.
20. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT85C comprende uno o más aminoácidos de sustitución en los residuos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 67 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444 y 471 de la SEQ ID NO:3.
21. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT76G que por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:7.
22. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 21, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT76G tiene uno o más aminoácidos de sustitución en los residuos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 76 193, †94, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, y 346 de la SEQ ID NO:7.
23. Un huésped recombinante, dicho huésped comprende un gen recombinante que codifica un polipéptido UGT85C que tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:3, y que tiene uno o más aminoácidos de sustitución en los residuos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, y 471 de la SEQ ID NO:3.
24. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende sustituciones en los residuos 13, 15, 60, 270, 289, y 418 de la SEQ ID NO:3.
25. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende a) sustituciones en los residuos 13, 60, y 270 de la SEQ ID NO:3; b) sustituciones en los residuos 60 y 87 de la SEQ ID NO:3; c) sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 243, y 270 de la SEQ ID NO:3; d) sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 243, 270, y 441 de la SEQ ID NO:3; e) sustituciones en los residuos 65, 71, 220, 389, y 394 de la SEQ ID NO:3; f) sustituciones en los residuos 65, 71, 270, y 289 de la SEQ ID NO:3; g) sustituciones en los residuos 15 y 65 de la SEQ ID NO:3; h) sustituciones en los residuos 65 y 270 de la SEQ ID NO:3; i) sustituciones en los residuos 65 y 440 de la SEQ ID NO:3; j) sustituciones en los residuos 65 y 441 de la SEQ ID NO:3; k) sustituciones en los residuos 65 y 418 de la SEQ ID NO:3; 1) sustituciones en los residuos 220, 243, 270, y 334 de la SEQ ID NO:3; o m) sustituciones en los residuos 270 y 289 de la SEQ IDNO:3.
26. Un huésped recombinante que comprende un gen recombinante que codifica a polipéptido UGT76G que tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:7, y que tiene uno o más aminoácidos de sustitución en los residuos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331 , y 346.
27. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho polipéptido tiene a) sustituciones en los residuos de aminoácido 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199 , 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, y 291; b) sustituciones en los residuos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, y 291; o c) sustituciones en los residuos 74 , 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291 , 330, 331 y 346.
28. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado además porque dicho huésped es un microorganismo.
29. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho microorganismo es un Sacaromiceto.
30. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho Sacaromiceto es Saccharomyces cerevisiae.
31. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho microorganismo es Escherichia coli.
32. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado además porque dicho huésped es una planta o célula de planta.
33. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 32, caracterizado además porque dicha planta o célula de planta es una planta o célula de planta Stevia, Physcomitrella , o tabaco.
34. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha planta de Stevia o célula de planta es una planta o célula de planta de Stevia rebaudiana.
35. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente un gene que codifica un Polipéptido UGT74G1.
36. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho gen que codifica dicho Polipéptido UGT74G1 es un gen recombinante.
37. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente uno o más de: (i) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil; (ii) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (iii) un gen que codifica una oxidasa de caureno; y (iv) un gen que codifica una sintetasa de esteviol.
38. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente uno o más de (v) un gen que codifica un HMG-CoA truncando; (vi) un gen que codifica un CPR; (vii) un gen que codifica una sintetasa de ramnosa; (viii) un gen que codifica una dehidrogenasa de UDP-glucosa; y (ix) un gen que codifica una decarboxilasa de UDP-ácido glucorónico.
39. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 38, caracterizado además porque por lo menos uno de los genes de (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), o (ix) es un gen recombinante.
40. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 37, caracterizado además porque cada uno de los genes de (i), (ü). (iü). y (iv) es un 9en recombinante.
41. Un ácido nucleico aislado que codifica a polipéptido que tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
42. El ácido nucleico tal y. como se describe en la reivindicación 41, caracterizado además porque dicho polipéptido tiene por lo menos el 95% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
43. El ácido nucleico tal y como se describe en la reivindicación 41 o la reivindicación 42, caracterizado además porque dicho polipéptido tiene por lo menos el 99% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
44. El ácido nucleico tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende por lo menos un aminoácido de sustitución en los residuos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, o 387-473 de la SEQ ID NO:5.
45. El ácido nucleico tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende un aminoácido de sustitución en uno o más residuos seleccionados a partir del grupo que consiste en los residuos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 175 211, 221, 286, 343, 427 y 438 de la SEQ ID NO:5.
46. El ácido nucleico tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende una arginina en el residuo 206, una cisteína en el residuo 207, y una arginina en el residuo 343 de la SEQ ID NO:5.
47. El ácido nucleico tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende una fenilalanina en el residuo 30, una glutamina en el residuo 93, una valina en el residuo 99, una fenilalanina en el residuo 122, una tirosina en el residuo 140, una cisteína en el residuo 142, una treonina en el residuo 148, una alanina en el residuo 153, una serina en el residuo 156, una metionina en el residuo 195, un ácido glutámico en el residuo 196, un ácido glutámico en el residuo 199, una metionina en el residuo 211, una fenilalanina en el residuo 221, una alanina en el residuo 286, una asparagina en el residuo 427, o una alanina en el residuo 438 de la SEQ ID NO:5.
48. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácido con por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:5.
49. Un huésped recombinante, dicho huésped comprende: (i) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil; (ii) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (iii) un gen que codifica una oxidase de caureno; y (iv) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; caracterizado además porque por lo menos uno de dichos genes es un gen recombinante.
50. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 49, caracterizado además porque dicho huésped produce esteviol cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales cada uno de dichos genes es expresado.
51. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 50, caracterizado además porque dicho esteviol se acumula hasta por lo menos 1 mg/L de medio de cultivo cuando es cultivado bajo dichas condiciones.
52. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, caracterizado además porque dicha sintasa de difosfato de geranilgeranil tiene más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en las SEQ ID NOs: 121-128.
53. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, caracterizado además porque dicha sintasa de difosfato de copalilo tiene más del 90% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido establecida en las SEQ ID NOs: 129-131.
54. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 53, caracterizado además porque dicha sintasa de caureno tienen más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en las SEQ ID NOs: 132-135.
55. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 54, caracterizado además porque dicha oxidasa de caureno tienen más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en las SEQ ID NOs: 138-141.
56. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 55, caracterizado además porque dicha sintetasa de esteviol tiene más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de aminoácidos establecida en las SEQ ID NOs: 142-146.
57. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 56, caracterizado además porque comprende adicionalmente un gen que codifica un H G-CoA truncado.
58. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 57, caracterizado además porque comprende adicionalmente un gen que codifica un CPR.
59. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 58, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente un gen que codifica un polipéptido UGT74G1.
60. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 59, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente un gen que codifica a Polipéptido UGT85C2.
61. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 60, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente un gen que codifica un polipéptido UGT76G1.
62. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 61, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente un gen que codifica un polipéptido UGT91 D2.
63. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 59 a 62, caracterizado además porque dicho huésped produce por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales cada de dicho genes es expresado.
64. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 63, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es seleccionado a partir del grupo que consiste de esteviol- 13-0-glucosido, esteviol-19-O-glucosido, rubusosido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, y dulcósido A.
65. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 64, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido se acumula hasta por lo menos 1 mg/litro de medio de cultivo cuando es cultivado bajo dichas condiciones.
66. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 65, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido se acumula hasta por lo menos 10 mg/litro de medio de cultivo medio cuando es cultivado bajo dichas condiciones.
67. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 66, caracterizado además porque esteviol glucósido se acumula hasta por lo menos 20 mg/litro de medio de cultivo cuando es cultivado bajo dichas condiciones.
68. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 67, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente uno o más de i) un gen que codifica una sintasa de 5-fosfato deoxixilulosa (DXS); ¡i) un gen que codifica una reductoisomerasa de 5-fosfato D-1 -deoxixilulosa (DXR); iii) un gen que codifica una sintasa 4-difosfocitidill-2-C-metil-D-eritritol (CMS); iv) un gen que codifica una cinasa 4-difosfocitidill-2-C-metii-D-eritritol (CMK); v) un gen que codifica una sintasa 4-difosfocitidill-2-C-metil-D-eritritol2,4-ciclofosfato (MCS); vi) un gen que codifica una sintasa 1 -hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato (HDS); vii) un gen que codifica una reductasa 1 -hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato (HDR).
69. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 68, caracterizado además porque dicho huésped comprende adicionalmente uno o más de: ¡x) un gen que codifica una acetoacetil-CoA tiolasa; x) un gen que codifica una reductasa de HMG-CoA truncado; xi) un gen que codifica una de mevalonato; xii) un gen que codifica una cinasa de fosfomevalonato; xiii) un gen que codifica una decarboxilasa de pirofosfato mevalonato.
70. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 69, caracterizado además porque se puede inducir la expresión de uno o más de dichos genes.
71. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 49 a 70, caracterizado además porque dicho huésped es un microorganismo, una planta, o una célula de planta.
72. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 71, caracterizado además porque dicho huésped es Saccharomyces cerevisiae.
73. Un método para producir esteviol o a esteviol glucósido, que comprende: a) cultivar el huésped tal y como se describe en la reivindicación 71 o la reivindicación 72 en un medio de cultivo, bajo condiciones en las cuales dichos genes son expresados; y b) recuperar el esteviol o esteviol glucósido producidos mediante dicho huésped.
74. El método tal y como se describe en la reivindicación 73, caracterizado además porque dicho paso de cultivo comprende inducir la expresión de uno o más de dicho genes.
75. El método tal y como se describe en la reivindicación 73 o 74, caracterizado además porque dicho esteviol o esteviol glucósido es seleccionado a partir del grupo que consiste de estev¡ol-13-O-glucosido, esteviol-19-O-glucosido, rubusósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, y dulcósido A.
76. Una cepa recombinante de Saccharomyces que comprende: (i) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o (ii) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; caracterizado además porque dicha cepa produce ent-caureno a partir de la expresión de dicha sintasa de difosfato de copalilo y dicha sintasa de caureno.
77. Un ácido nucleico aislado que tiene más del 90% de identidad de secuencia para una de las secuencias de nucleótidos establecida en las SEQ ID NOs: 18-25, 34-36, 4-43, 48, 49, 52-55, 60-64, 70-72, 77, o 79.
78. Un huésped recombinante, dicho huésped comprende: (i) un gen que codifica un UGT74G1; (ii) un gen que codifica un UGT85C2; (iii) un gen que codifica un UGT76G1; y (iv) un gen que codifica un UGT91D2, caracterizado además porque por lo menos uno de dicho genes es un gen recombinante.
79. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 78, caracterizado además porque cada uno de dichos genes es un gen recombinante.
80. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 78 o 79, caracterizado además porque dicho huésped produce por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales cada uno de dichos genes es expresado.
81. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 78 a 80, caracterizado además porque comprende adicionalmente (a) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (b) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (c) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; (d) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil.
82. El huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 78 a 81, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es rebaudiósido A.
83. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene más del 90% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido de UGT91D2e o de UGT91D2m, que excluye a la secuencia de aminoácido de UGT91D2m.
84. Un polipéptido aislado que tiene más del 90% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido de UGT91D2e o UGT91D2m, que excluye la secuencia de aminoácido de UGT91D2m.
85. Una composición de esteviol glucósido producida mediante el huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 78 a 81, dicha composición teniendo niveles reducidos de contaminantes derivados de estevia en relación con un extracto de estevia.
86. Un huésped recombinante, dicho huésped comprende: (i) un gen recombinante que codifica un UGT91D2; (ii) un gen recombinante que codifica un UGT74G1; (iii) un gen recombinante que codifica un UGT85C2; y (iv) un gen recombinante que codifica un UGT76G1; y (v) un gen que codifica una ramnosa sintetasa, caracterizado además porque dicho huésped produce por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales es expresado cada de dicho genes.
87. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 86, caracterizado además porque comprende adicionalmente (a) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y una sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (b) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (c) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; y (d) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil.
88. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 86 o 87, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es rebaudiósido C o dulcósido A.
89. Un composición de esteviol glucósido producida por el huésped tal y como se describe en la reivindicación 86 o 87, caracterizado además porque dicho composición que tiene más del 15% de rebaudiósido C por peso total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
90. La composición de esteviol glucósido producida por el huésped tal y como se describe en la reivindicación 86 o 87, caracterizada además porque dicha composición tiene más del 15% de dulcósido A por peso total esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
91. Un huésped recombinante, dicho huésped comprende: (i) un gen recombinante que codifica un UGT91D2; (ii) un gen recombinante que codifica un UGT74G1; iii) un gen recombinante que codifica un UGT85C2; y (iv) un gen recombinante que codifica un UGT76G1; caracterizado además porque dicho huésped produce por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales cada uno de dicho genes es expresado.
92. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 91, caracterizado además porque comprende adicionalmente (a) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y una sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (b) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (c) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; y (d) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil.
93. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 91 o 92, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es rebaudiósido D o rebaudiósido E.
94. Una composición de esteviol glucósido producida por el huésped tal y como se describe en la reivindicación 91 o 92, caracterizada además porque dicha composición tiene más del 4% de rebaudiósido D por peso total de esteviol glucósidos y aun nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
95. Una composición de esteviol glucósido producida por el huésped tal y como se describe en la reivindicación 91 o 92, caracterizada además porque dicha composición tiene más del 4% de rebaudiósido E por peso total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
96. Un huésped recombinante, dicho huésped comprende: (i) un gen recombinante que codifica un UGT91D2; (ii) un gen recombinante que codifica un UGT74G1; (iii) un gen recombinante que codifica un UGT85C2; (iv) un gen recombinante que codifica un UGT76G1; (V) un gen que codifica una dehidrogenasa de UDP- glucosa; y (vi) un gen que codifica una decarboxilasa de UDP-ácido glucorónico, caracterizado además porque dicho huésped produce por lo menos un esteviol glucósido cuando es cultivado bajo condiciones en las cuales cada uno de dicho genes es expresado.
97. El huésped tal y como se describe en la reivindicación 96, caracterizado además porque comprende adicionalmente (a) un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo bifuncional y una sintasa de caureno, o un gen que codifica una sintasa de difosfato de copalilo y un gen que codifica una sintasa de caureno; (b) un gen que codifica una oxidasa de caureno; (c) un gen que codifica una sintetasa de esteviol; y (d) un gen que codifica una sintasa de difosfato de geranilgeranil.
98. La microorganismo tal y como se describe en la reivindicación 96 o 97, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es rebaudiósido F.
99. Una composición de esteviol glucósido producida por el huésped tal y como se describe en la reivindicación 96 o 97, caracterizada además porque dicha composición tiene más del 4% de rebaudiósido F por peso total de esteviol glucósidos y un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
100. Un método para producir una composición de esteviol glucósido, que comprende: a) cultivar el huésped tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 86 a 88, 91 a 93, o 96 a 98 en un medio de cultivo, bajo condiciones en las cuales cada uno de dicho genes es expresado; y b) recuperar la composición de esteviol glucósido producida por dicho huésped, en donde dicha composición es enriquecida para rebaudiósido A, rebaudiósido e, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F o dulcósido A en relación con la composición de esteviol glucósido de una planta de estevia tipo natural.
101. El método tal y como se describe en la reivindicación 100, caracterizado además porque dicha composición de esteviol glucósido producida mediante dicho microorganismo tiene un nivel reducido de contaminantes derivados de la planta de estevia en relación con un extracto de estevia.
102. Un producto alimenticio que comprende una composición de esteviol glucósido enriquecida para rebaudiósido A, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F o dulcósido A en relación con la composición de esteviol glucósido de una planta de estevia tipo natural.
103. Un método para identificar si un polimorfismo está asociado con una variación en un atributo, dicho método comprende: a) determinar si uno o más polimorfismos genéticos en una población de plantas está asociado con el sitio para un polipéptido establecido en la SEQ ID NO:5 y los homólogos funcionales de los mismos; y b) medir la correlación entre la variación dicho atributo en plantas de dicha población y la presencia de dicho uno o más polimorfismos genéticos en plantas de dicha población, identificando de esta manera si dicho uno o más polimorfismos genéticos están asociados con la variación en dicho atributo.
104. Un método para elaborar una línea de plantas, dicho método comprende: a) determinar si uno o más polimorfismos genéticos en una población de plantas está asociado con el sitio para un polipéptido establecido en la SEQ ID NO:5 y los homólogos funcionales de los mismos; b) identificar una o más plantas en dicha población en la cual, la presencia de por lo menos uno de dichos polimorfismos genéticos está asociado con la variación en un atributo; c) mestizar una o más de dichas plantas identificadas consigo mismas o una planta diferente para producir semilla; d) mestizar por lo menos una progenie de planta cultivada a partir de dicha semilla consigo misma o con una planta diferente; y e) repetir los pasos c) y d) durante un periodo adicional de O a 5 generaciones para elaborar dicha línea de plantas, en donde por lo menos uno de dichos polimorfismos genéticos está presente en dicha línea de plantas.
105. Un método para transferir una segunda porción de azúcar al C-2' de una glucosa en un esteviol glucósido, dicho método comprende poner en contacto dicho esteviol glucósido con un polipéptido UGT91D2 y un UDP-azúcar bajo las condiciones de reacción adecuadas para la transferencia de dicha segunda porción de azúcar a dicho esteviol glucósido.
106. El método tal y como se describe en la reivindicación 105, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT91D2 tiene por lo menos el 90% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
107. El método tal y como se describe en la reivindicación 106, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT91D2 tiene por lo menos el 95% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
108. El método tal y como se describe en la reivindicación 107, caracterizado además porque dicho polipéptido UGT91D2 tiene por lo menos el 99% de identidad para la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:5.
109. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 105 a 108, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende por lo menos un aminoácido de sustitución en los residuos 1-19, 27-38, 44-87, 96-120, 125-141, 159-184, 199-202, 215-380, o 387-473 de la SEQ ID NO:5.
110. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 105 a 109, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende un aminoácido de sustitución en uno o más residuos seleccionados a partir del grupo que consiste de los residuos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, y 438 de la SEQ ID NO:5.
111. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 105 a 110, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es seleccionado a partir del grupo que consiste en esteviol-13-O-glucosido, rubusósido, esteviosido, y Rebaudiósido A.
112. El método tal y como se describe en la reivindicación 111, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es rubusósido, en donde dicha segunda porción de azúcar es glucosa, y el esteviosido es producido a partir de la transferencia de dicha segunda porción de glucosa.
113. El método tal y como se describe en la reivindicación 111, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es esteviosido, en donde dicha segunda porción de azúcar es glucosa, y el Rebaudiósido E es producido a partir de la transferencia de dicha segunda porción de glucosa.
114. El método tal y como se describe en la reivindicación 111, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es esteviosido, en donde el esteviosido se pone en contacto con dicho polipéptido UGT91D2 y un polipéptido UGT76G1 bajo dichas condiciones de reacción adecuadas para producir Rebaudiósido D.
115. El método tal y como se describe en la reivindicación 111, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es esteviol-13-O-glucosido y el esteviol-1,2 biósido es producido a partir de la transferencia de dicha segunda porción de glucosa.
116. El método tal y como se describe en la reivindicación 111, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es esteviol-13-O-glucosido y el esteviol-1 ,2-xilobiosido es producido a partir de la transferencia de dicha segunda porción de azúcar.
117. El método tal y como se describe en la reivindicación 111, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es esteviol-13-O-glucosido y el esteviol-1 ,2-ramnobiosido es producido a partir de la transferencia de dicha segunda porción de azúcar.
118. El método tal y como se describe en la reivindicación 111, caracterizado además porque dicho esteviol glucósido es Rebaudiósido A, y el Rebaudiósido D es producido a partir de la transferencia de dicha segunda porción de glucosa.
119. Un método para determinar la presencia de un polinucleótido en una planta de estevia, que comprende: a) poner en contacto por lo menos una sonda o par de cebador con ácido nucleico de dicha planta de estevia, en donde dicha sonda o par de cebador es específica de un polinucleótido que codifica un polipéptido UGT, en donde dicho polipéptido UGT tiene por lo menos el 90% de identidad de secuencia para las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:7 y, b) determinar si dicho , polinucleótido está presente o no en dicha planta de Stevia.
120. Un equipo para la definición de genotipo de una muestra biológica de estevia, dicho equipo comprende un par de cebador que amplifica de manera específica, o una sonda que híbrida de manera específica, un polinucleótido que codifica un polipéptido UGT que tiene por lo menos el 90% de identidad de secuencia para las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:7.
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