CN113365492B - 非整倍体甜菊栽培品种“ap-1” - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种来自秋水仙碱诱导的多倍体的非整倍体甜菊栽培品种，其被命名为“AP‑1”。本公开涉及甜菊栽培品种“AP‑1”的植物部分、甜菊“AP‑1”的植物以及通过将该栽培品种“AP‑1”与其自身或另一种甜菊品种进行杂交而产生甜菊植物的方法，该方法包括使用秋水仙碱处理来产生非整倍体甜菊植物的方法。本公开还涉及通过将该栽培品种“AP‑1”与另一种甜菊栽培品种进行杂交而产生的杂交体甜菊种子和植物。使用十种高度多态性SNP和对应的基因组序列来鉴定“AP‑1”。

Description

非整倍体甜菊栽培品种“AP-1”

提交序列表

与本申请相关联的序列表经由EFS-Web以电子格式提交，并且据此全文以引用方式并入本说明书中。

背景技术

甜菊是用于生产甜味剂、糖替代品和其他可食用成分的重要且有价值的大田作物。因此，甜菊植物育种的持续目标是开发农学上合理的甜菊物种的稳定、高产的甜菊栽培品种。该目标的原因是使甜味剂、糖替代品和其他可食用成分的量和质量最大化。为了实现该目标，甜菊育种者必须选择并开发具有产生优异栽培品种的性状的植物。

新甜菊栽培品种的开发需要亲本的评估和选择以及这些亲本的杂交。给定杂交的可预测成功的缺乏要求育种者在任何给定年份以相同或不同的育种目标进行若干杂交。

甜叶菊(Stevia rebaudiana)是二倍体植物物种(2n＝2x＝22个染色体)。多倍体化是植物界的物种形成、多样性和适应的常见机制。大约50％至70％的被子植物(有花植物)在其进化过程中经历了多倍体。在许多作物中，多倍体植物常常具有生长旺盛且器官尺寸很大的特点。除了传统杂交育种方法之外，多倍体化也一直用作现代甜菊育种中的强效植物育种方法。

发明内容

结合系统、工具和方法描述了以下实施方案及其方面，这些实施方案和方面意在是示例性的和例示性的，而不是限制范围。在各种实施方案中，已经减少或消除了上述问题中的一个或多个问题，而其他实施方案涉及其他改进。

一个或多个实施方案涉及甜菊种子、甜菊植物、甜菊栽培品种以及用于生产甜菊植物的方法。

一个或多个实施方案还涉及通过使本发明的植物与另一种甜菊植物杂交来产生甜菊种子和植物的方法。

一个实施方案涉及活体植物组织，诸如甜菊品种“AP-1”的芽、微芽和种子。另一方面还涉及通过种植甜菊品种“AP-1”的种子而产生的植物，以及此类植物的衍生物。如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生甜菊植物的组织培养物的植物细胞、植物愈伤组织、植物丛、芽、微芽和在植物或植物部分(诸如花粉、花、种子、叶和茎)中完整的植物细胞。

另一个实施方案涉及甜菊品种“AP-1”的可再生细胞的组织培养物以及由其再生的植物，其中再生的甜菊植物表达从甜菊种子或组织培养物生长的命名为“AP-1”的植物的所有生理和形态特性。

又一个实施方案是包含至少第一转基因的甜菊品种“AP-1”的甜菊植物，其中该甜菊植物以其他方式能够表达甜菊品种“AP-1”的所有生理和形态特性。具体地讲，在本发明的实施方案中，提供了包含单基因座转换体的植物。单基因座转换体可包含转基因基因，该转基因基因已通过遗传转化引入甜菊品种“AP-1”或其祖先中。转基因的或非转基因的单基因座转换体也可通过回交引入，如本领域所熟知的。在某些实施方案中，单基因座转换体可包含显性或隐性等位基因。基因座转换体可赋予植物潜在的任何期望性状，如本文所述。

又一个实施方案涉及使用其他新植物育种技术(NPBT)，诸如寡核苷酸定向诱变(ODM)和CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1，来修饰甜菊品种“AP-1”或其祖先。

再一个实施方案涉及通过将甜菊品种“AP-1”的植物与第二甜菊植物进行杂交而产生的第一代(F₁)杂交体甜菊种子。还包括通过将甜菊品种“AP-1”与第二甜菊植物进行杂交而产生的杂交体种子生长的F₁杂交体甜菊植物。本发明还进一步包括以甜菊品种“AP-1”作为一个亲本产生的F₁杂交体植物的种子，从F₁杂交体植物的种子生长的第二代(F₂)杂交体甜菊植物，以及F₂杂交体植物的种子。

再一个实施方案是产生甜菊种子的方法，该方法包括将甜菊品种“AP-1”的植物与任何第二甜菊植物(包括其自身或品种“AP-1”的另一个植物)进行杂交。具体地讲，杂交方法包括以下步骤：种植甜菊品种“AP-1”的种子；培养由所述种子产生的甜菊植物直至所述植物开花；使所述植物的花受精；以及收获由所述植物产生的种子。

再一个实施方案是产生杂交体甜菊种子的方法，该方法包括将甜菊品种“AP-1”与跟甜菊品种“AP-1”非同基因的不同的第二甜菊植物进行杂交。具体地讲，其中杂交包括以下步骤：种植甜菊品种“AP-1”和不同的第二甜菊植物的种子；培养从种子生长的甜菊植物直至植物开花；将两个植物中的一个植物上的花与另一个植物的花粉进行异花授粉；以及收获由异花授粉而产生的种子。

再一个实施方案是用于在甜菊育种程序中开发甜菊植物的方法，该方法包括：获得品种“AP-1”的甜菊植物或其部分；以及使用植物育种技术将所述植物或部分用作育种材料的来源。在该方法中，植物育种技术可选自轮回选择、混合选择、集团选择、回交、谱系育种、标记辅助(或标记增强)选择、秋水仙碱诱导的多倍体、单倍体/双单倍体生产、遗传转化和基因组编辑。在某些实施方案中，品种“AP-1”的甜菊植物被用作雄性或雌性亲本。

再一个实施方案是用于产生来源于甜菊品种“AP-1”的甜菊植物的方法，该方法包括以下步骤：通过将甜菊品种“AP-1”的植物与第二甜菊植物进行杂交来制备来源于甜菊品种“AP-1”的后代植物；以及将后代植物与其自身或第二植物进行杂交，以产生来源于甜菊品种“AP-1”的植物的后一代的后代植物。在一个实施方案中，该方法还包括：将后一代的后代植物与其自身或第二植物进行杂交；以及重复所述与其自身或第二植物的杂交至少2至10个另外的代数，以产生来源于甜菊品种“AP-1”的近交甜菊植物。还提供了由该方法产生的植物。在某些实施方案中，由本文所述的该方法和其他方法产生的植物品种“AP-1”衍生的植物可被进一步定义为包括表1中给出的植物品种“AP-1”的性状。

在另一个实施方案中，一种使本申请的甜菊植物无性繁殖的方法，该方法包括以下步骤：从“AP-1”的植物收集能够繁殖的组织或细胞；培养所述组织或细胞以获得增殖的芽；以及使所述增殖的芽生根以获得生根的小植株；或者培养所述组织或细胞以获得增殖的芽，或获得小植株。此外，提供了通过种植所述小植株或增殖的芽而产生的植物。

在另一个实施方案中，描述了使用单核苷酸多态性(SNP)标记来鉴定甜叶菊(Stevia rebaudiana)品种的方法。使用十种高度多态性SNP和对应的基因组序列来鉴定植物品种“AP-1”衍生的植物材料。带有经标记的十种SNP的基因组序列在图3中列出。

另一个实施方案提供了用于甜菊植物“AP-1”的组织培养物中的可再生细胞。组织培养物可能够使具有前述甜菊植物的生理和形态特性的植物再生，并且使具有与前述甜菊植物基本上相同的基因型的植物再生。在此类组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、雌蕊、根、根尖、花、种子或茎。此外，另一个实施方案提供由本发明的组织培养物再生的甜菊植物。

本发明的一个实施方案包括通过将甜菊栽培品种“AP-1”的植物或植物部分或者其基因座转换体与另一种植物进行杂交而产生的第二甜菊种子、植物、植物部分或细胞，其中所述甜菊栽培品种“AP-1”的代表性活体植物组织已以CGMCC No.16985保藏，并且其中所述甜菊栽培品种“AP-1”种子、植物、植物部分或细胞与甜菊栽培品种“AP-1”的植物或植物部分具有相同的SNP ID NO:1(SEQ ID NO:1)、SNP ID NO:2(SEQ ID NO:2)、SNP ID NO:3(SEQ ID NO:3)、SNP ID NO:4(SEQ ID NO:4)、SNP ID NO:5(SEQ ID NO:5)、SNP ID NO:6(SEQ ID NO:6)、SNP ID NO:7(SEQ ID NO:7)、SNP ID NO:8(SEQ ID NO:8)、SNP ID NO:9(SEQ ID NO:9)和SNP ID NO:10(SEQ ID NO:10)的单核苷酸多态性的多态性。

再一个实施方案包括可用于鉴定所述甜菊栽培品种“AP-1”的十种单核苷酸多态性，包括单核苷酸多态性周围的基因座特异性基因组序列。

从以下详细描述中，其他目的、特征和优点可变得明显。然而，应当理解，虽然示出了具体实施方案，但是详细描述和具体示例仅通过例证给出，因为从该详细描述中，对于本领域技术人员而言，本发明实施方案的精神和范围内的各种变化和修改可变得明显。

序列表简述

SEQ ID NO:1公开了SNP ID NO:1，“stv_snp_77072”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:2公开了SNP ID NO:2，“stv_snp_3459”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:3公开了SNP ID NO:3，“stv_snp_6645712”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:4公开了SNP ID NO:4，“stv_snp_682884”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:5公开了SNP ID NO:5，“stv_snp_9679”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:6公开了SNP ID NO:6，“stv_snp_16174”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:7公开了SNP ID NO:7，“stv_snp_18770”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:8公开了SNP ID NO:8，“stv_snp_35587”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:9公开了SNP ID NO:9，“stv_snp_11367”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

SEQ ID NO:10公开了SNP ID NO:10，“stv_snp_11882”，其在受试甜菊品系中是高度多态性的。

附图说明

并入本文并构成说明书一部分的附图示出了一些但不是唯一或排他的示例性实施方案和/或特征。本文中公开的实施方案和附图旨在被认为是例示性的而不是限制性的。

图1示出了与二倍体“814011”相比较的“AP-1”的流式细胞多倍体分析。

图2A示出了“AP-1”和“814011”之间从移栽后50天到移栽后100天的植物节数比较。

图2B示出了“AP-1”和“814011”之间从移栽后50天到移栽后100天的植物二级枝梗数比较。

图3示出了带有本文所公开的十种SNP的基因组序列，这些基因组序列可用于开发对“AP-1”和二倍体“814011”进行基因分型的分子标记。

定义

在以下的描述和表格中，使用了许多术语。为了对说明书和权利要求书提供清楚和一致的理解(包括此类术语给定的范围)，提供了以下定义：

莱鲍迪苷A：如本文所用，是仅包含葡萄糖作为其单糖部分的甜菊醇糖苷。其总共包含四个葡萄糖分子，其中三联体的中心葡萄糖在其羟基基团处连接到主要的甜菊醇结构，并且其余葡萄糖在其羧基基团处形成酯键。

莱鲍迪苷D：如本文所用，是从甜叶菊分离的对映-贝壳杉烷型二萜糖苷。

莱鲍迪苷M：如本文所用，是从甜叶菊分离的对映-贝壳杉烷型二萜糖苷。

甜菊苷含量：如本文所用，甜菊苷是来源于甜菊植物的糖苷百分比。

具体实施方式

甜菊栽培品种“AP-1”是甜叶菊(Stevia rebaudiana)植物品种，其显示出均匀性和稳定性，如以下品种描述信息中所述。在仔细关注植物类型均匀性的情况下，已经复制了足够的代数。在持续观察到均匀性的情况下增加了栽培品种。

甜菊栽培品种“AP-1”是使用甜菊品种“814011”(美国专利No.9,668,451)作为其母本植物，通过秋水仙碱诱导的多倍体形成而产生的。

对于秋水仙碱诱导的多倍体形成而言，用1％秋水仙碱处理甜菊品种“814011”的150个外植体3小时。用0.5％秋水仙碱处理甜菊品种“814011”的另一150个外植体16小时。将来自两个分开的处理的外植体组合在一起以进行倍性筛选。

为了检测倍性水平的变化，执行流式细胞分析。二倍体“814011”的细胞核DNA含量用作对照。测试所有推定多倍体品系的细胞核DNA含量，并且相对于二倍体“814011”对照的值来表示这些细胞核DNA含量。根据所产生的多倍体(包括混倍体，这些植物含有具有不同染色体数目的细胞)植物的数目和用秋水仙碱处理的外植体的数目的比率来计算多倍体诱导率。总体上看，在该实验中观察到38.2％多倍体诱导率(数据未示出)。

将推定多倍体外植体移栽到生根培养基上以进行根诱导和繁殖。使可能的嵌合体在无性繁殖过程中溶解。已使用三个无性世代进行嵌合体溶解。首先将生根的小植株移栽到含有高压灭菌的蛭石和土壤的混合物的托盘中以便进一步生长，然后移栽到中华人民共和国江西省赣州的实验田中。使用定义的参数调查该种群的植物形态特性和生长势。使用显微镜观察来测量叶片的上表面上的气孔大小和每单位面积的气孔频率。

在推定多倍体种群之中，一种品系表现出旺盛的植物生长且其干叶样品中的莱鲍迪苷M积累增加。比较该品系在G1期(细胞周期的四个阶段中的第一阶段)中的峰值与二倍体“814011”细胞核的G1峰值表明该品系的倍性水平介于二倍体(2x)与三倍体(3x)之间(图1)。该非整倍体甜菊品系被命名为“AP-1”。

非整倍体是指含有一个或多个特异性染色体向整倍体的染色体总数的添加或扣减的多倍体。“AP-1”表现出超倍性，与二倍体“814011”相比，染色体数目有所增加。根据基因平衡假说，非整倍体基因组不平衡。该状况导致基因剂量不平衡并且可引起植物的表型变异。基因剂量不平衡影响基因表达和表型的机制尚不完全清楚。有可能通过失去平衡的过程，而得以与二倍体甜菊品种相比促进甜菊醇糖苷生物合成和积累的期望等位基因的表达和/或抑制性等位基因的缺失。因此，在与二倍体“814011”的比较中调查“AP-1”的形态和生理特性。根据在中华人民共和国江西省赣州采集的数据，甜菊栽培品种“AP-1”具有以下形态和其他特性。

表1：品种描述信息

繁殖类型：无性扦插、组织培养和种子

类型：多年生

产生生根的幼小植物的时间：从扦插起20至30天

根描述：存在初生根(包括直根和侧根)和次生根(包括肉质根和小根)

生根习性：须根系，深度约20.0cm至30.0cm，宽度30.0cm至40.0cm(在大田条件下)

植物和生长习性：分为3个阶段，植被生长阶段、植被生长和生殖生长共同阶段、生殖生长阶段

植物高度：65.0cm至77.0cm

植物直径：32.0cm至38.0cm

茎：

长度：63.0cm至73.0cm

节间长度：2.1cm至3.3cm

直径：0.81cm至0.92cm

颜色：RHS 145A

质地：在基部木质化

强度：强

花色苷：不存在

主茎上的节数：26至38

每个植物的基础节数：223至289

侧枝：

长度：10.0cm至24.8cm

直径：0.20cm至0.32cm

节间长度：1.0cm至3.5cm

方向：向上；成约20度至30度角

强度：强

质地：在基部木质化

颜色：RHS 142A

叶：

排布：对生

长度：6.6cm至7.5cm

宽度：1.4cm至1.8cm

形状：卵形-披针形

尖端：突然变细

基部：细小

边缘：中等齿

脉序模式：网状脉序

脉序颜色：RHS 144C

质地(上表面和下表面二者)：无毛

颜色，未成熟：

上表面：RHS 146A

下表面：RHS 143A

颜色，成熟：

上表面：RHS 146A

下表面：RHS 143C

芽：

长度：0.6cm至0.7cm

宽度：0.10cm至0.20cm

形状：椭圆体

颜色：轻微RHS 140C

花序：

外观和排布：花头状花序，由五个椭圆形苞片，五个盘状小花组成

开花时间：约57天

开花时间：在中华人民共和国江西省赣州，从八月至九月盘状小花：

长度：0.8cm至1.0cm

宽度：0.2cm至0.3cm

形状：管状

尖端：尖锐

边缘：光滑

基部：在基部的中部变成管状

颜色：

上表面：白色

下表面：白色

脉序颜色：

上表面：白色

下表面：白色

苞片：

长度：0.6cm至0.7cm

宽度：0.1cm至0.2cm

形状：披针形

尖端：突然变细

边缘：光滑

基部：细小

颜色(上表面和下表面两者)：RHS 140C

脉序颜色(上表面和下表面)：RHS 140C

香味：不存在

繁殖器官：

雄蕊：

数量：5

花丝长度：0.15cm

花丝颜色：RHS 141C

花药形状：柱状

花药长度：0.15cm

花药颜色：RHS 154A

花粉量：稀少

花粉颜色：RHS 154A

雌蕊：

花柱长度：0.15cm

花柱颜色：RHS 141B

柱头形状：2分支

柱头颜色：RHS 112D

子房颜色：RHS 145C

座果和结籽：种子是瘦果，长约0.3cm至0.4cm，并且长0.05cm至0.08cm，同时顶部上有浅棕色的冠毛。

病害和昆虫/害虫抗性：良好。

与商业品种的比较

“AP-1”与名称为“814011”的商业甜菊植物(美国专利No.9,668,451)最类似，该商业甜菊植物是“AP-1”来源的母本植物。两个品种之间的差异描述于表2中。

表2

与类似品种的比较

与二倍体“814011”相比，在“AP-1”中观察到莱鲍迪苷M积累的20.54％增加，而“AP-1”中的莱鲍迪苷A积累减少16.21％。“AP-1”中的非整倍体基因组的固有不平衡可能在改变莱鲍迪苷M和莱鲍迪苷A的积累中起到了因果作用。

为了比较植物发育期间“AP-1”与二倍体对照之间的形态差异，作为形态特征调查了三个参数(一级枝梗数、二级枝梗数和总节数)。“AP-1”的株型是多枝的，在植物完全发育之后具有11个一级枝梗。相比之下，二倍体“814011”对照植物具有4个一级枝梗。成熟“AP-1”植物最终有274个茎节；而二倍体“814011”具有155个茎节(图2A)。成熟“AP-1”植物具有36个二级枝梗，相比之下，二倍体“814011”对照植物有27个二级枝梗(图2B)。

还在显微镜下进行气孔形态和数目的比较。与二倍体对照品系“814011”相比，未在“AP-1”中观察到气孔大小和每单位面积的气孔频率的显著差异(数据未示出)。

据估计，与其母本植物“814011”的种植相比，可通过“AP-1”种植实现干叶产量的8.33％增加。在甜菊品种“AP-1”中，非整倍体似乎通过促进植物枝梗和茎节的发育来改善植物株型。因此，与野生型对照相比，非整倍体增强了叶产量。

莱鲍迪苷含量

为了收集下表3的数据，将甜菊叶样品风干/烘干，然后使用研杵和研钵将其研磨成细粉。对于每个样品，将叶粉末(100mg)用15ml的60℃蒸馏水提取18小时。将混合物离心，过滤上清液并收集，用于通过HPLC(Agilent,USA)进行SG组分分析。甜菊醇糖苷的分析使用配备有Poroshell 120SB-C18 2.7μm，4.6×150mm的Agilent Technologies 1200系列(USA)HPLC进行。设置在210nm处的二极管阵列用作检测器。在第一列中，Reb代表莱鲍迪苷，Stev代表甜菊苷，并且Dul代表杜克苷。

表3

“AP-1”的莱鲍迪苷含量

用于检测和测量甜菊醇糖苷的附加方法

除了HPLC之外，还可通过本领域中公知的多种方法检测和测量甜菊醇糖苷。

用于鉴定甜菊栽培品种“AP-1”的单核苷酸多态性(SNP)

单核苷酸多态性(SNP)是发生在基因组中特定位置的特定单核苷酸中的变异，这是甜叶菊(Stevia rebaudiana)基因组中最常见的遗传变异类型。已发现可用于鉴定“AP-1”的十种SNP。十种SNP的基因组序列在图3中示出，并且在下表4中列出。

表4

“AP-1”的SNP基因型

SNP	SEQ NO	“AP-1”基因型
			SNP ID NO:1	SEQ ID NO:1	第61位的纯合CC
SNP ID NO:2	SEQ ID NO:2	第47位的杂合CG
			SNP ID NO:3	SEQ ID NO:3	第49位的纯合TT
SNP ID NO:4	SEQ ID NO:4	第48位的纯合CC
			SNP ID NO:5	SEQ ID NO:5	第69位的纯合GG
SNP ID NO:6	SEQ ID NO:6	第58位的杂合TC
			SNP ID NO:7	SEQ ID NO:7	第65位的杂合TC
SNP ID NO:8	SEQ ID NO:8	第65位的杂合AG
			SNP ID NO:9	SEQ ID NO:9	第81位的杂合AT
SNP ID NO:10	SEQ ID NO:10	第47位的杂合TC

另一个实施方案是来源于通过将甜菊品种“AP-1”的植物或植物部分与另一个植物进行杂交而产生的甜菊品种“AP-1”的甜菊植物或植物部分，其中所述甜菊品种“AP-1”的代表性组织培养物已经保藏。

另一个实施方案是来源于通过将甜菊品种“AP-1”的植物或植物部分与另一个植物进行杂交而产生的甜菊品种“AP-1”的甜菊种子，其中所述甜菊品种“AP-1”的代表性植物部分已经保藏，并且其中来源于甜菊品种“AP-1”的所述甜菊种子在相同的环境条件下生长时，基本上具有与甜菊品种“AP-1”相同的形态特性。相同的环境条件可以是但不限于并列比较。特性可以是表1中列出的那些。该比较可使用许多专业认可的实验设计和统计分析来进行。

一个实施方案还涉及通过将第一亲本甜菊植物与第二亲本甜菊植物进行杂交而产生甜菊植物的方法，其中第一甜菊植物或第二甜菊植物是来自栽培品种“AP-1”的甜菊植物。此外，第一亲本甜菊植物和第二亲本甜菊植物二者可以是栽培品种“AP-1”(例如，自花授粉)。因此，使用栽培品种“AP-1”的任何方法都是本发明的一部分：自交、回交、杂交体育种以及与种群杂交。使用栽培品种“AP-1”作为亲本产生的任何植物都在本发明的范围内。如本文所用，术语“植物”包括植物细胞和部分、植物原生质体、从中可再生甜菊植物的组织培养物的植物细胞、植物愈伤组织、植物丛和在植物或植物部分(诸如花粉、花、胚、胚珠、种子、叶、茎、根、花药、雌蕊、芽和微芽)中完整的植物细胞。因此，另一个方面是提供在生长和分化时产生基本上具有“AP-1”的所有的生理和形态特性的栽培品种的细胞。

另一个实施方案设想了由“AP-1”的组织培养物再生的甜菊植物。如本领域中公知的，甜菊的组织培养物可用于甜菊植物的体外再生。甜菊的多种组织的组织培养物和由此产生的植物的再生是公知的，并且已经广泛公布。

用于检测标记辅助育种用的SNP的附加方法

除了直接或间接测序之外，还可通过本领域中公知的多种有效方法来检测本文所公开的SNP，该多种有效方法包括美国专利No.5,468,613和5,217,863、5,210,015、5,876,930、6,030,787、6,004,744、6,013,431、5,595,890、5,762,876、5,945,283、5,468,613、6,090,558、5,800,944和5,616,464中公开的那些。具体地讲，可通过与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针的杂交来检测DNA序列中的多态性，如美国专利No.5,468,613和5,217,863中所公开。ASO探针的核苷酸序列被设计为形成完全匹配的杂交体或在可变核苷酸残基的位点处含有错配的碱基对。匹配的杂交体和错配的杂交体之间的区分是基于杂交体在杂交或洗涤期间使用的条件中的热稳定性的差异、通过变性梯度电泳分析的杂交体的稳定性的差异或错配位点处的化学裂解。

如果SNP形成或破坏限制性核酸内切酶裂解位点，则其将改变该限制性核酸内切酶消化所生成的DNA片段的大小或谱。因此，可通过限制性片段分析来将具有变体序列的植物与具有初始序列的植物区分开。可以以这种方式鉴定的SNP被称为“限制性片段长度多态性”(“RFLP”)。RFLP已广泛用于人和植物遗传分析中(Glassberg，英国专利申请2135774；Skolnick等人，Cytogen.Cell Genet.，第32卷，第58-67页(1982年)；Botstein等人，Ann.J.Hum.Genet.，第32卷，第314-331页(1980年)；Fischer等人，PCT申请WO 90/13668；Uhlen，PCT申请WO 90/11369。

确定SNP的另选方法是基于酶切扩增多态性序列(CAPS)(Konieczny,A.和F.M.Ausubel，Plant J.，第4卷，第403-410页(1993年)；Lyamichev等人，Science，第260卷，第778-783页(1993年)。被称为dCAPS的CAPS的改良版本是用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。dCAPS技术通过使用含有与模板DNA有一个或多个错配的引物来引入或破坏限制性酶识别位点。然后对以这种方式修饰的PCR产物进行限制性酶消化，并通过所得限制性模式确定SNP的存在或不存在。该技术可用于已知突变的基因分型和分离的DNA的遗传作图(Neff MM、Neff JD、Chory J、Pepper AE，dCAPS——一种用于单核苷酸多态性的遗传分析的简单技术：拟南芥遗传学中的实验应用(dCAPS,a simple technique for the geneticanalysis of single nucleotide polymorphisms:experimental applications inArabidopsis thaliana genetics)，Plant J.，1998年5月；第14卷，第3期，第387-392页)。

SNP也可以通过单链构象多态性(SSCP)分析来鉴定。SSCP技术是能够鉴定长度通常在150至250个核苷酸之间的DNA单链中的大多数序列变异的方法(Elles，分子医学方法：遗传疾病的分子诊断(Methods in Molecular Medicine:Molecular Diagnosis ofGenetic Diseases)，Humana Press(1996年)；Orita等人，Genomics，第5卷，第874-879页(1989年)。在变性条件下，DNA的单链将采用独特地依赖于其序列的构象。即使仅一个碱基改变，这种构象通常也将不同。据报道大多数构象充分改变物理构型或大小而可通过电泳检测。已经描述了许多用于SSCP的方案，包括但不限于Lee等人，Anal.Biochem.，第205卷，第289-293页(1992年)；Suzuki等人，Anal.Biochem.，第192卷，第82-84页(1991年)；Lo等人，Nucleic Acids Research，第20卷，第1005-1009页(1992年)；Sarkar等人，Genomics，第13卷，第441-443页(1992年)。

还可以使用称为扩增片段长度多态性(AFLP)的DNA指纹技术来检测SNP，该技术基于来自基因组DNA的总消化物的限制性片段的选择性PCR扩增以对该DNA进行图谱分析。Vos等人，Nucleic Acids Res.，第23卷，第4407-4414页(1995年)。该方法允许许多限制性片段的特异性共扩增，其可以在不知道核酸序列的情况下进行分析。AFLP基本上采用三个步骤。最初，用限制性酶切割基因组DNA的样品，并将寡核苷酸接头连接到DNA的限制性片段。然后通过使用接头和限制性序列作为引物退火的靶位点，使用PCR来扩增限制性片段。通过使用延伸到限制性片段中的引物来实现选择性扩增，仅扩增其中引物延伸与限制性位点侧翼的核苷酸匹配的那些片段。然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上显现这些扩增的片段(Beismann等人，Mol.Ecol.，第6卷，第989-993页(1997年)；Janssen等人，Int.J.Syst.Bacteriol，第47卷，第1179-1187页(1997年)；Huys等人，Int.J.Syst.Bacteriol.，第47卷，第1165-1171页(1997年)；McCouch等人，Plant Mol.Biol.第35卷，第89-99页(1997年)；Nandi等人，Mol.Gen.Genet.，第255卷，第1-8页(1997年)；Cho等人，Genome，第39卷，第373-378页(1996年)；Simons等人，Genomics，第44卷，第61-70页(1997年)；Cnops等人，Mol.Gen.Genet.，第253卷，第32-41页(1996年)；Thomas等人，Plant J.，第8卷，第785-794页(1995年)。

也可以使用随机扩增多态性DNA(RAPD)来检测SNP(Williams等人，Nucl.AcidsRes.，第18卷，第6531-6535页(1990年)。

可以通过如美国专利No.5,210,015、5,876,930和6,030,787中公开的方法来检测SNP，其中具有报告分子和淬灭剂分子的寡核苷酸探针与靶多核苷酸杂交。探针被核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性降解。

也可以通过如美国专利No.6,004,744、6,013,431、5,595,890、5,762,876和5,945,283中所公开的标记碱基延伸方法来检测SNP。这些方法基于引物延伸和可检测的核苷三磷酸的掺入。引物被设计成退火到与可变核苷酸紧邻的序列，可以在掺入少至一个标记核苷三磷酸后检测到该可变核苷酸。美国专利No.5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中核酸序列中的单个或多个核苷酸变异可以通过以下过程在核酸中检测，在该过程中扩增含有核苷酸变异的序列，将该序列印在膜上并用标记序列特异性寡核苷酸探针处理。

除了上述的那些方法之外，用于鉴定和检测SNP的其他方法包括使用限制性酶(Botstein等人，Am.J.Hum.Genet.，第32卷，第314-331页(1980年)；以及Konieczny和Ausubel，Plant J.，第4卷，第403-410页(1993年))、酶和化学错配测定法(Myers等人，Nature，第313卷，第495-498页(1985年))、等位基因特异性PCR(Newton等人，Nucl.AcidsRes.，第17卷，第2503-2516页(1989年)；以及Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷，第2757-2760页(1989年))、连接酶链式反应(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第88卷，第189-193页(1991年))、单链构象多态性分析(Labrune等人，Am.J.Hum.Genet.，第48卷，第1115-1120页(1991年))、单碱基引物延伸(Kuppuswamy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第88卷，第1143-1147页(1991年)；以及Goelet，美国专利No.6,004,744和5,888,819)、基于固相ELISA的寡核苷酸连接测定法(Nikiforov等人，Nucl.Acids Res.，第22卷，第4167-4175页(1994年))、双脱氧指纹印迹法(Sarkar等人，Genomics，第13卷，第441-443页(1992年))、寡核苷酸荧光淬灭测定法(Livak等人，PCR Methods Appl.，第4卷，第357-362页(1995年))、5′-核酸酶等位基因特异性杂交TaqMan^TM测定法(Livak等人，Nature Genet.，第9卷，第341-342页(1995年))、模板指导的染料终止物掺入(TDI)测定法(Chen和Kwok，Nucl.Acids Res.，第25卷，第347-353页(1997年))、等位基因特异性分子信标测定法(Tyagi等人，Nature Biotech.，第16卷，第49-53页(1998年))、精确定点(PinPoint)测定法(Haff和Smirnov，Genome Res.，第7卷，第378-388页(1997年))、dCAPS分析(Neffetal.，Plant J.，第14卷，第387-392页(1998年))、焦磷酸测序(Ronaghi等人，AnalyticalBiochemistry，第267卷，第65-71页(1999年)；Ronaghi等人，PCT申请WO 98/13523；以及Nyren等人，PCT申请WO 98/28440)，使用质谱例如Masscode^TM系统(Howbert等人，WO 99/05319；Howber等人，WO 97/27331)、质谱(美国专利No.5,965,363)、寡核苷酸探针的侵入性裂解(Lyamichev等人，Nature Biotechnology，第17卷，第292-296页)以及使用高密度寡核苷酸阵列(Hacia等人，Nature Genetics，第22卷，第164-167页)。

虽然本文描述了用于检测SNP的某些方法，但可以利用其他检测方法。例如，附加方法是已知的并且在以下文献中阐述：Birren等人，Genome Analysis，第4卷，第135-186页，A Laboratory Manual.Mapping Genomes，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1999年)；Maliga等人，Methods in Plant MolecularBiology.A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1995年)；Paterson，Biotechnology Intelligence Unit:GenomeMapping in Plants，R.G.Landes Co.、Georgetown、Tex.和Academic Press，San Diego,Calif.(1996年)；The Maize Handbook，Freeling和Walbot编辑，Springer-Verlag,NewYork,N.Y.(1994年)；Methods in Molecular Medicine:Molecular Diagnosis ofGenetic Diseases，Elles编辑，Humana Press,Totowa,N.J.(1996年)；Clark编辑，PlantMolecular Biology:A Laboratory Manual，Clark编辑，Springer-Verlag,Berlin,Germany(1997年)。

育种方法

在任何期望的植物种质的开发中存在许多步骤。植物育种始于对当前种质问题和劣势的分析和定义、计划目标的制定以及对特定育种目标的定义。下一步是选择具有满足计划目标的性状的种质。目标是在单个栽培品种中组合来自亲本种质的期望性状的改进组合。在甜菊中，重要性状为叶产率、早熟、改善的叶品质、莱鲍迪苷含量、甜菊苷含量、对病虫害的抗性、对旱热的抗性和改善的农学性状。育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改善性状的遗传力，以及商业上使用的栽培品种类型(例如，F1杂交体栽培品种、纯系栽培品种等)。对于高度可遗传的性状，在单个位置处评价优质个体植物的选择将是有效的，而对于具有低遗传力的性状，选择应基于从相关植物家族的重复评价获得的平均值。流行的选择方法通常包括谱系选择、改进的谱系选择、重量选择和轮回选择。

遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种用于将高度可遗传性状的一个或几个有利基因转移到期望的栽培品种中。该方法已广泛用于对于抗病性栽培品种进行育种。多种轮回选择技术用于改善由许多基因控制的定量遗传性状。在自花授粉作物中轮回选择的使用取决于授粉的容易程度、每次授粉成功杂交的频率、以及每个成功杂交的杂交后代的数目。

每个育种计划应包括对育种程序的效率的定期、客观评价。评价标准根据目标和目的而变化，但应包括基于与适当标准的比较、先进育种品系的总体价值、以及每单位投入(例如，每年、每花费的美元数等)产生的成功栽培品种的数目的每年来自选择的收益。

有前途的先进育种品系经过全面测试，并与代表商业目标区域的环境中的流行栽培品种进行了三年或更多年的比较。比流行的栽培品种优良的品系是成为新的商业栽培品种的候选者。那些仍然缺乏一些性状的品系被丢弃或用作亲本以产生新的种群用于进一步选择。

导致营销和分销的最后步骤的这些过程通常需要从进行第一次杂交开始起七年至十二年。因此，开发新栽培品种是一个耗时的过程，需要精确的前瞻性规划、资源的高效利用以及方向的最小变化。

最困难的任务是鉴定遗传上优良的个体，因为对于大多数性状，真实的基因型值被其他混杂的植物性状或环境因素所掩盖。鉴定优良植物的一种方法是观察其相对于其他实验品系和广泛培养的标准栽培品种的性能。对于许多性状，单个观察结果是不确定的，并且需要在时间和空间上重复观察以提供对品系的遗传价值的良好估计。

商业甜菊育种计划的目标是开发新的、独特的和优良的甜菊栽培品种。育种者最初选择两个或更多个亲本品系并使其杂交，然后进行世代进化和选择，从而产生许多新的遗传组合。通过该程序，育种者理论上可产生数十亿种不同的遗传组合。育种者无法直接控制在其培养的有限种群规模中将会出现哪种遗传组合。因此，两个育种者将永远不会开发出具有相同性状的相同品系。

每年，植物育种者选择种质以推进至下一代。该种质在独特且不同的地理、气候和土壤条件下生长，并随后在生长季节期间和结束时进行进一步选择。开发的品系是不可预测的。这种不可预测性是因为育种者的选择发生在独特的环境中，在DNA水平上没有控制(使用常规育种程序)，并且产生了数百万种不同的可能的遗传组合。本领域普通技术育种人员不能预测其开发的最终所得品系，除非可能以非常粗略和一般的方式。通过使用完全相同的原始亲本和相同的选择技术，同一育种者不能以任何合理的可能性产生相同的栽培品种两次。这种不可预测性导致大量研究资金的开支用于开发优良的新的甜菊栽培品种。

甜菊的纯系栽培品种通常通过使两个或更多个亲本杂交然后进行选择来育种。遗传的复杂性、育种目标和可利用的资源均影响育种方法。谱系育种、轮回选择育种和回交育种是通常用于自花授粉作物(诸如甜菊)的育种方法。这些方法涉及其中制备育种池或种群以组合来自两个或更多个栽培品种或多种广泛来源的期望性状的方式。通常用于选择期望个体或个体种群的程序被称为混合选择、株行选择和单粒传法或改进的单粒传法。这些选择方法中的一种或其组合可用于从育种种群开发栽培品种。

谱系育种主要用于将有利基因组合成全新栽培品种，其在许多性状上与用于原始杂交的任一亲本不同。其通常用于改善自花授粉作物。将具有有利的互补性状的两个亲本杂交以产生F1(子一代)。F2种群通过使F2植物自交产生。期望个体植物的选择可早在其中发生最大基因分离的F2代开始。单独植物选择可进行一代或多代。接下来，来自每个所选植物的种子可栽培在被称为后代行或后代山的单独的、识别的行或山中以评价品系并增加种子数量，或进一步选择单独植物。一旦选择具有期望性状的后代行或后代山，其就变成所谓的育种品系，该品系可从源自相同原始种群的其他育种品系中特异性地鉴定。在高世代(即，F5或更高)中，在重复测试中评价单独品系的种子。在高级阶段，测试来自相同原始杂交的最佳品系或表型相似品系的混合物作为新栽培品种的潜在释放。

严格意义上的单粒传法程序是指栽培分离种群，从每个植物中收获一粒种子，并将这些种子组合成批，其作为下一代栽培。当群体已经进展至期望的近交水平时，从其来源的品系的植物将分别追踪至不同的F2个体。单粒传法程序的主要优点是延迟选择，直至在单个植物中实现高水平的纯合性(例如，缺乏基因分离)，并且通常通过使用冬季小植株圃快速通过这些早期世代。

改进的单粒传法程序涉及从种群中的每个植物收获多个种子(即，单个锁或简单铃)并将它们组合以形成批。该批的一部分用于栽培下一代，且一部分用于储备。该程序已被用于在收获时节省劳动力并保持足够的种群种子数量。

期望性状的选择可在任何分离的世代(F2及更高代)发生。通过在最大程度地表达期望性状的环境中培养种群并且可鉴定具有该性状的个体或品系而对种群施加选择压力。例如，当植物或品系在天然或人工诱导的病害环境中培养时，可进行对抗病性的选择，并且育种者仅选择几乎没有或没有病害并因此被认为具有抗性的那些个体。

除表型观察之外，还可检测植物的基因型。存在许多基于实验室的技术可用于植物基因型的分析、比较和表征。其中包括同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特征扩增区(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR，也被称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。

用分子技术育种

靶向基因组编辑可以通过使用工程核酸酶来实现。在细菌中，CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是包含碱基序列的短重复的原核DNA的片段。每个重复之后是来自之前暴露于细菌病毒或质粒的“间隔DNA”的短片段。其发音为“crisper”。随后暴露于病毒时，细菌能够识别、靶向并破坏外来DNA。CRISPR系统可用于通过使用Cas9核酸酶进行基因编辑，所述核酸酶使用引导性RNA分子导向到其靶DNA上，然后在DNA中诱导双链断裂以破坏基因或所需序列。然后通过非同源修复系统或同源依赖性修复系统来修复DNA。在后一种情况下，可以使用人工寡核苷酸将新序列插入切割位点。还可参见US20100076057A1、WO2010075424A2、WO2013126794A1、WO2013142578、WO2013169398、WO2013176772A1、US2013181440A1、US20140017214A1、WO2014011237A1、WO2014022702A2、WO2014071219A1、US8697359B1和WO2014018423A2。

同工酶电泳和RFLP已广泛用于确定遗传组成。Shoemaker和Olsen(MolecularLinkage Map of Soybean(Glycine max L.Merr.)，第6.131-6.138页，S.J.O'Brien编辑，Genetic Maps:Locus Maps of Complex Genomes，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1993年))开发了分子遗传连锁图谱，其由25个具有约365个RFLP、11个RAPD、三个经典标记和四个同工酶基因座的连锁群组成。还可参见Shoemaker，R.C.，RFLP Map of Soybean，第299-309页，Phillips,R.L.和Vasil,I.K.编辑，DNA-Based Markers in Plants,Kluwer Academic Press,Dordrecht,the Netherlands(1994年)。

SSR技术是目前最高效且实用的标记技术；与RFLP相比，可常规使用更多的标记基因座，并且可使用SSR找到每个标记基因座的更多等位基因。例如，Diwan和Cregan描述了在大豆中具有多达26个等位基因的高度多态微卫星基因座。Diwan,N.和Cregan,P.B.，Theor.Appl.Genet.，第95卷，第22-225页(1997年)。除本文所述的那些之外的附加SNP也可用于鉴定本发明的独特遗传组成和保留该独特遗传组成的后代品种。可组合使用多种分子标记技术以增强总体分辨率。

包括通过使用诸如同工酶电泳、RFLP、RAPD、AP-PCR、DAF、SCAR、AFLP、SSR和SNP之类的技术鉴定的标记的分子标记可用于植物育种。分子标记的一种用途是数量性状基因座(QTL)映射。QTL映射是使用已知与对于数量性状具有可测量的影响的等位基因密切相关的标记。育种过程中的选择基于与正效应等位基因相关的标记的积累和/或与来自植物基因组的负效应等位基因相关的标记的消除。

在育种过程期间也可使用分子标记来选择定性性状。例如，与包含实际感兴趣等位基因内的序列的等位基因或标记密切相关的标记可用于在回交育种程序期间选择包含感兴趣的等位基因的植物。例如，分子标记用于大豆育种以选择对大豆胞囊线虫具有抗性的性状，参见美国专利No.6,162,967。标记也可用于选择轮回亲本的基因组和针对供体亲本的标记进行选择。使用该程序可使来自保留在所选植物中的供体亲本的基因组的量最小化。其还可用于降低回交程序中所需杂交回轮回亲本的次数。在选择过程中使用分子标记通常被称为遗传标记增强选择。通过提供通过杂交追踪遗传谱的手段，分子标记也可用于鉴定和排除作为植物的亲本品种或祖先的某些种质来源，如下文中更全面地讨论的。

突变育种

突变育种是将新性状引入甜菊品种中的另一种方法。自发发生或人工诱导的突变可能是植物育种者的有用的变异性来源。人工诱变的目标是提高期望特性的突变率。突变率可通过许多不同手段来提高，该手段包括温度，长期种子储存，组织培养条件，辐射(诸如X射线、γ射线、中子、β辐射或紫外辐射)，化学诱变剂(诸如碱基类似物如5-溴尿嘧啶)、抗生素；烷化剂(诸如硫芥、氮芥、环氧化物、乙胺、硫酸酯、磺酸酯、砜或内酯)，叠氮化物，羟胺，亚硝酸或者吖啶。一旦通过诱变观察到期望性状，然后便可通过传统育种技术将性状并入现有种质中。突变育种的细节可见于Fehr,Macmillan Publishing Company的Principles of Cultivar Development(1993年)。染色体突变是诸如TILLING(定向诱导基因组局部突变)的现代育种技术中期望的，因为它们提供了新的变异来源。多倍体的多等位基因性质具有在突变育种中有用的许多优点。已发现同源四倍体具有为对应二倍体栽培品种20-40倍的突变频率，这是由于其具有大基因组。其在多倍体中的主导形式对可因诱导突变引起的有害等位基因进行遮盖，能够缓解植物受到通常与近交二倍体作物相关联的致死条件的影响。

双单倍体的生产

双单倍体生产也可以在育种计划中用于纯合品种的开发。双单倍体通过使来自杂合植物的染色体集合加倍以产生完全纯合的个体来产生。例如，参见Wan等人，Theor.Appl.Genet.，第77卷，第889-892页(1989年)。

对通常用于不同性状和作物的另一些育种方法的描述可见于若干参考书之一(例如Allard(1960年)；Simmonds(1979年)；Sneep等人(1979年)；Fehr(1987年))。

合适的测试应检测到任何重大缺陷，并确定相对于当前栽培品种的优越性或改进水平。除表现出优良的性能之外，还必须需要与工业标准相容或创造新市场的新栽培品种。新栽培品种的引入将为种子生产者、以及种植者、加工者和消费者带来另外的成本用于特殊的广告、市场营销和商业生产实践以及新产品利用。在发布新栽培品种之前进行的测试应考虑研究和开发成本以及最终栽培品种的技术优越性。对于经种子繁殖的栽培品种，容易且经济地产生种子必须是可行的。

甜菊花是雌雄同株的，因为雄性和雌性结构在同一花中。杂交种子或杂交体种子通过选择的亲本之间的人工杂交来产生。通过人工去除雄性花药，在开花之前将待成为雌性的亲本的花芽去雄。在开花时，将来自称为雄性的亲本植物的花的花粉人工置于先前经去雄的花的柱头上。由杂交开发的种子称为第一代(F₁)杂交体种子。栽培这种种子会产生F₁杂交体植物，其遗传组分的一半来自雌性亲本，并且一半来自雄性亲本。基因的分离始于减数分裂，从而产生第二代(F₂)种子。假设原始亲本之间存在多个遗传差异，则每个F₂种子均具有独特的基因组合。

另外的实施方案

随着允许分离和表征编码特定蛋白质产物的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家们对设计植物基因组以包含和表达外源基因或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因(可能由不同的启动子驱动)以便以特定方式改变植物的性状产生了浓厚的兴趣。这样的外源的另外的和/或经修饰的基因在本文中被统称为“转基因”。在过去的十五至二十年中，已经开发了数种用于产生转基因植物的方法，在特定的实施方案中，还涉及要求保护的栽培品种的转化形式。

植物转化涉及构建将在植物细胞中起作用的表达载体。这样的载体包含含有受调节元件(例如，启动子)控制或与其可操作地连接的基因的DNA。表达载体可包含一个或更多个这样的可操作地连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒的形式，并且可单独使用或与其他质粒组合使用，以提供经转化的甜菊植物，使用如下所述的转化方法将转基因并入到甜菊植物的遗传物质中。

用于甜菊转化的表达载体：标记基因

表达载体包含至少一个可操作地连接至调节元件(例如，启动子)的遗传标记，该调节元件允许通过阴性选择(即，抑制不包含选择性标记基因的细胞的生长)或通过阳性选择(即，筛选由遗传标记编码的产物)来回收包含标记的转化细胞。用于植物转化的许多常用的选择性标记基因在转化领域中是公知的，并且包括例如编码代谢解毒选择性化学试剂的酶的基因，该选择性化学试剂可以是抗生素或除草剂，或者编码对抑制剂不敏感的经改变靶标的基因。一些阳性选择方法也是本领域中已知的。

用于植物转化的一种常用的选择性标记基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)，其在植物调节信号的控制下赋予对卡那霉素的抗性。Fraley等人，PNAS，第80卷，第4803页(1983年)。另一种常用的选择性标记基因是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。Vanden Elzen等人，Plant Mol.Biol.，第5卷，第299页(1985年)。

赋予对抗生素的抗性的细菌来源的另外的选择性标记基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶和氨基糖苷-3”-腺苷转移酶(博来霉素抗性决定子)。Hayford等人，Plant Physiol.，第86卷，第1216页(1988年)；Jones等人，Mol.Gen.Genet.，第210卷，第86页(1987年)；Svab等人，Plant Mol.Biol.，第14卷，第197页(1990年)；Hille等人，PlantMol.Biol.，第7卷，第171页(1986年)。其他选择性标记基因赋予对除草剂(诸如草甘膦、草铵膦或溴苯腈类)的抗性。Comai等人，Nature，第317卷，第741-744页(1985年)；Gordon-Kamm等人，Plant Cell，第2卷，第603-618页(1990年)；以及Stalker等人，Science，第242卷，第419-423页(1988年)。

用于非细菌来源的植物转化的其他选择性标记基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。Eichholtz等人，Somatic Cell Mol.Genet.，第13卷，第67页(1987年)；Shah等人，Science，第233卷，第478页(1986年)；Charest等人，Plant Cell Rep.，第8卷，第643页(1990)。

用于植物转化的另一类标记基因需要筛选推定转化的植物细胞，而不是直接遗传选择经转化细胞对毒性物质(诸如抗生素)的抗性。这些基因特别可用于对特定组织中基因表达的空间模式进行定量或使其可视化，并且通常被称为报道基因，因为其可与基因或基因调节序列融合以研究基因表达。用于筛选推定转化细胞的常用基因包括β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶。Jefferson,R.A.，PlantMol.Biol.Rep.，第5卷，第387页(1987年)；Teeri等人，EMBO J.，第8卷，第343页(1989年)；Koncz等人，PNAS，第84卷，第131页(1987年)；DeBlock等人，EMBO J.，第3卷，第1681页(1984年)。

用于可视化不需要破坏植物组织的GUS活性的体内方法是可用的。MolecularProbes Publication 2908，IMAGENE GREEN，第1-4页(1993年)以及Naleway等人，J.CellBiol.，第115卷，第151a页(1991年)。然而，由于低灵敏度、高荧光背景和与使用萤光素酶基因作为选择性标记相关的限制，这些用于可视化GUS活性的体内方法未被证明可用于回收经转化细胞。

最近，编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因在原核和真核细胞中已被用作用于基因表达的标记。Chalfie等人，Science，第263卷，第802页(1994年)。GFP和GFP突变体可用作可筛选标记。

用于甜菊转化的表达载体：启动子

包含在表达载体中的基因必须由包含调节元件(例如，启动子)的核苷酸序列驱动。数种类型的启动子在转化领域中是公知的，可单独使用或与启动子组合使用的其他调节元件也是如此。

如本文所用，“启动子”包括提及来自转录起始上游的RNA区域，并参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录。“植物启动子”是能够在植物细胞中起始转录的启动子。发育控制下的启动子的示例包括在某些组织(诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)中优先启动转录的启动子。此类启动子被称为“组织优选的”。仅在某些组织中起始转录的启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动一个或更多个器官中某些细胞类型，例如，根或叶中的维管细胞的表达。“诱导型”启动子是处于环境控制下的启动子。可能通过诱导型启动子影响转录的环境条件的示例包括厌氧条件或光的存在。组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下具有活性的启动子。

A.诱导型启动子：

诱导型启动子可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。任选地，诱导型启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，该信号序列可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。对于诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而提高。

可使用任何诱导型启动子。参见Ward等人，Plant Mol.Biol.，第22卷，第361-366页(1993年)。示例性诱导型启动子包括但不限于来自响应于铜的ACEI系统的启动子(Mett等人，PNAS，第90卷，第4567-4571页(1993年))；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因(Hershey等人，Mol.Gen.Genet.，第227卷，第229-237页(1991年)以及Gatz等人，Mol.Gen.Genet.，第243卷，第32-38页(1994年))；或来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz等人，Mol.Gen.Genet.，第227卷，第229-237页(1991年))。示例性诱导型启动子是响应于植物通常不响应的诱导剂的启动子。示例性诱导型启动子是来自甾体激素基因的诱导型启动子，其转录活性由糖皮质激素诱导(Schena等人，PNAS，第88卷，第0421页(1991年))。

B.组成型启动子：

组成型启动子可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因，或者组成型启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，该信号序列可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。

可利用许多不同的组成型启动子。示例性的组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的启动子，诸如来自CaMV的35S启动子(Odell等人，Nature，第313卷，第810-812页(1985年))和来自诸如稻肌动蛋白的基因的启动子(McElroy等人，Plant Cell，第2卷，第163-171页(1990年))；泛素(Christensen等人，Plant Mol.Biol.，第12卷，第619-632页(1989年)以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.，第18卷，第675-689页(1992年))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.，第81卷，第581-588页(1991年))；MAS(Velten等人，EMBOJ.，第3卷，第2723-2730页(1984年))；以及玉米H3组蛋白(Lepet等人，Mol.Gen.Genet.，第231卷，第276-285页(1992年)以及Atanassova等人，Plant Journal，第2卷，第3期，第291-300页(1992年))。

ALS启动子，即甘蓝型油菜(Brassica napus)ALS3结构基因的Xbal/Ncol片段5”(或与所述Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)代表特别地可用的组成型启动子。参见PCT申请No.WO 96/30530。

C.组织特异性或组织优选的启动子：

组织特异性启动子可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。任选地，组织特异性启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，该信号序列可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。用可操作地连接至组织特异性启动子的感兴趣基因转化的植物仅在或优先在特定组织中产生转基因的蛋白质产物。

可利用任何组织特异性或组织优选的启动子。示例性的组织特异性或组织优选的启动子包括但不限于：根优选的启动子，诸如来自菜豆蛋白基因的启动子(Murai等人，Science，第23卷，第476-482页(1983年)以及Sengupta-Gopalan等人，PNAS，第82卷，第3320-3324页(1985年))；叶特异性和光诱导的启动子，例如来自cab或二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Simpson等人，EMBO J.，第4卷，第11期，第2723-2729页(1985年)以及Timko等人，Nature，第318卷，第579-582页(1985年))；花药特异性启动子，诸如来自LAT52的启动子(Twell等人，Mol.Gen.Genet.，第217卷，第240-245页(1989年))；花粉特异性启动子，诸如来自Zm13的启动子(Guerrero等人，Mol.Gen.Genet.，第244卷，第161-168页(1993年))；或小孢子优选的启动子，诸如来自apg的启动子(Twell等人，Sex.Plant Reprod.，第6卷，第217-224页(1993年))。

用于将蛋白质靶向到亚细胞区室的信号序列

通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接至编码感兴趣蛋白的基因的5"和/或3"区来实现将转基因产生的蛋白质转运至亚细胞区室，诸如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体，或用于分泌到质外体中。在蛋白质合成和加工期间，结构基因的5"和/或3"末端处的靶向序列可确定所编码蛋白质最终被区室化的位置。

信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室或用于分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等人，Plant Mol.Biol.，第20卷，第49页(1992年)；Close,P.S.，Master's Thesis，Iowa State University(1993年)；Knox,C.等人，Plant Mol.Biol.，第9卷，第3-17页(1987年)；Lerner等人，Plant Physiol.，第91卷，第124-129页(1989年)；Fontes等人，Plant Cell，第3卷，第483-496页(1991年)；Matsuoka等人，PNAS，第88卷，第834页(1991年)；Gould等人，J.Cell.Biol.，第108卷，第1657页(1989年)；Creissen等人，Plant J.，第2卷，第129页(1991年)；Kalderon等人，Cell，第39卷，第499-509页(1984年)；Steifel等人，Plant Cell，第2卷，第785-793页(1990年)。

外源蛋白质基因和农学基因

针对转基因植物，可以以商业数量生产外源蛋白质。因此，本领域中公知的用于选择和繁殖经转化植物的技术产生了以常规方式收获的许多转基因植物，并且然后可从感兴趣的组织或从总生物质中提取外源蛋白质。从植物生物质中提取蛋白质可通过例如由Heney和Orr，Anal.Biochem.，第114卷，第92-96页(1981年)所讨论的已知方法来完成。

根据一个实施方案，提供用于商业生产外源蛋白质的转基因植物是甜菊植物。在另一个实施方案中，感兴趣的生物质是种子。对于显示出较高表达水平的相对较少数目的转基因植物，可主要通过常规的RFLP、PCR和SSR分析生成遗传图谱，该图谱鉴定整合的DNA分子的大致染色体位置。对于这方面的示例性方法，参见Glick和Thompson，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，CRC Press,Boca Raton，第269卷，第284页(1993年)。关于染色体位置的图谱信息可用于主题转基因植物的专有保护。如果进行未经授权的繁殖并与其他种质进行杂交，则可将整合区的图谱与可疑植物的相似图谱进行比较，以确定后者是否与主题植物具有共同的系谱。图谱比较将涉及杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，所有这些均是常规技术。

同样，农学基因可在经转化的植物中表达。更具体地，可对植物进行遗传改造以表达农学上感兴趣的各种表型。在这方面涉及的示例性基因包括但不限于以下分类的那些：

A.赋予对害虫或病害的抗性并编码以下的基因：

1.植物抗病性基因。植物防御通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应无毒力(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活。可用克隆的抗性基因转化植物品种，以使对特定病原体株具有抗性的植物工程化。参见例如Jones等人，Science，第266卷，第789页(1994年)(对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)具有抗性的番茄Cf-9基因的克隆)；Martin等人，Science，第262卷，第1432页(1993年)(对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)具有抗性的番茄Pto基因编码蛋白激酶)；Mindrinos等人，Cell，第78卷，第1089页(1994年)(对丁香假单胞菌具有抗性的拟南芥(Arabidopsis)RSP2基因)。

2.赋予对害虫诸如线虫的抗性的基因。参见例如PCT申请No.WO 96/30517，PCT申请No.WO 93/19181。

3.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白，其衍生物或在它们之上模仿的合成多肽。参见例如Geiser等人，Gene，第48卷，第109页(1986年)，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以例如以ATCC登录号40098、67136、31995和31998购自美国模式培养物保藏中心(Manassas,Va.)。

4.凝集素。参见例如Van Damme等人，Plant Molec.Biol.，第24卷，第25页(1994年)的公开内容，其公开了若干种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。

5.维生素结合蛋白，诸如抗生物素蛋白。参见PCT申请No.US 93/06487。该申请教导了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对昆虫害虫的杀幼虫剂的用途。

6.酶抑制剂，例如蛋白酶(protease)或蛋白酶(proteinase)抑制剂或者淀粉酶抑制剂。参见例如Abe等人，J.Biol.Chem.，第262卷，第16793页(1987年)(稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列)；Huub等人，Plant Molec.Biol.，第21卷，第985页(1993年)(编码烟草蛋白酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等人，Biosci.Biotech.Biochem.，第57卷，第1243页(1993年)(硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)；以及美国专利No.5,494,813(Hepher和Atkinson，1996年2月27日发布)。

7.昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮甾体和保幼激素，其变体，基于它们的模拟物，或它们的拮抗剂或激动剂。参见例如Hammock等人，Nature，第344卷，第458页(1990年)，杆状病毒表达克隆的保幼激素酯酶，即保幼激素灭活剂的公开内容。

8.在表达时破坏所感染害虫的生理的昆虫特异性肽或神经肽。例如，参见Regan，J.Biol.Chem.，第269卷，第9页(1994年)(表达克隆产生编码昆虫利尿激激素受体的DNA)以及Pratt等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，第163卷，第1243页(1989年)(在太平洋折翅爐(iploptera puntata)中鉴定出咽侧体抑制素的公开内容。还参见授予Tomalski等人的美国专利No.5,266,317，其公开了编码昆虫特异性麻痹性神经毒素的基因。

9.由蛇、蜂等在自然界中产生的昆虫特异性毒液。例如，参见Pang等人，Gene，第116卷，第165页(1992年)，在植物中异源表达编码蝎昆虫毒性肽的基因的公开内容。

10.负责单萜、倍半萜、甾体、异羟肟酸、苯丙素衍生物或者具有杀虫活性的另外非蛋白质分子的过度积累的酶。

11.参与生物活性分子的修饰，包括翻译后修饰的酶。例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳多糖酶和葡聚糖水解酶，无论是天然的或是合成的。参见以Scott等人的名义的PCT申请No.WO 93/02197，其公开了愈创葡聚糖酶基因的核苷酸序列。包含编码壳多糖酶的序列的DNA分子可例如从ATCC以登录号39637和67152获得。还参见Kramer等人，InsectBiochem.Molec.Biol.，第23卷，第691页(1993年)，其教导了编码烟草天蛾壳多糖酶的cDNA的核苷酸序列，以及Kawalleck等人，Plant Molec.Biol.，第21卷，第673页(1993年)，其提供了欧芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列。

12.刺激信号转导的分子。例如，参见Botella等人，Plant Molec.Biol.，第24卷，第757页(1994年)关于绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列的公开内容，以及Griess等人，Plant Physiol.，第104卷，第1467页(1994年)，其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。

13.疏水矩肽。参见PCT申请No.WO 95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽的肽衍生物的公开内容)和PCT申请No.WO 95/18855(教导赋予抗病性的合成抗微生物肽)。

14.膜通透酶，通道形成剂或通道阻滞剂。例如，参见Jaynes等人，Plant Sci.，第89卷，第43页(1993年)，天蚕素-β-裂解肽类似物的异源表达使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)具有抗性的公开内容。

15.病毒侵入性蛋白或由来源于此的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化的植物细胞中的积累赋予对由外壳蛋白基因来源的病毒以及相关病毒影响的病毒感染和/或病害发展的抗性。参见Beachy等人，Ann.Rev.Phytopathol.，第28卷，第451页(1990年)。外壳蛋白介导的抗性已赋予针对以下的经转化植物：苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯病毒X、马铃薯病毒Y、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒Id。

16.昆虫特异性抗体或来源于此的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。参见Taylor等人，摘要号497，分子植物-微生物相互作用的第七次国际研讨会(Edinburgh,Scotland)(1994年)(通过产生单链抗体片段在转基因烟草中的酶失活)。

17.病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等人，Nature，第366卷，第469页(1993年)，其表明表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免受病毒攻击。

18.由病原体或寄生物在自然界中产生的发育阻滞蛋白。因此，真菌内源-α-1,4-D-多半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同源-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物养分释放。参见Lamb等人，Bio/technology，第10卷，第1436页(1992年)。Toubart等人，Plant J.，第2卷，第367页(1992年)描述了编码豆内源多半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。

19.由植物在自然界中产生的发育阻滞蛋白。例如，Logemann等人，Bio/technology，第10卷，第305页(1992年)已表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌性病害的抗性提高。

B.赋予对除草剂抗性的基因：

1.抑制生长点或分生组织的除草剂，诸如咪唑啉酮或磺酰脲。该类别中的示例性基因编码突变的ALS和AHAS酶，如例如由Lee等人，EMBO J.，第7卷，第1241页(1988年)以及Miki等人，Theor.Appl.Genet.，第80卷，第449页(1990年)分别所描述的。其他除草剂(诸如麦草畏)提高植物生长。

2.草甘膦(分别由突变的5-烯醇式丙酮基莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPS)和aroA基因赋予抗性)和其他膦酰基化合物，诸如草铵膦(膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)PAT bar基因)，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸类和环己酮类(编码ACCase抑制剂的基因)。参见例如授予Shah等人的美国专利No.4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变的aroA基因的DNA分子可以以ATCC登录号39256获得，并且该突变基因的核苷酸序列公开于授予Comai的美国专利No.4,769,061中。授予Kumada等人的欧洲专利申请No.0 333 033和授予Goodman等人的美国专利No.4,975,374，公开了赋予对除草剂(诸如L-草铵膦或环己二酮)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列提供于授予Leemans等人的欧洲申请No.0 242246中。DeGreef等人，Bio/technology，第7卷，第61页(1989年)描述了表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予对苯氧基丙酸类和环己酮，诸如烯禾啶和氟吡甲禾灵的抗性的示例性基因是由Marshall等人，Theor.Appl.Genet.，第83卷，第435页(1992年)描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。

3.抑制光合作用的除草剂，诸如三嗪(psbA和gs+基因)、溴苯腈类或苄腈(腈水解酶基因)。Przibila等人，Plant Cell，第3卷，第169页(1991年)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。用于腈水解酶基因的核苷酸序列公开于授予Stalker的美国专利No.4,810,648，并且包含这些基因的DNA分子可以以ATCC登录号53435、67441和67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等人，Biochem.J.，第285卷，第173页(1992年)描述。

C.赋予或有助于增值性状的基因，诸如：

1.改进的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂基-ACP脱饱和酶的反义基因转化植物以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等人，PNAS，第89卷，第2624页(1992年)。

2.降低的肌醇六磷酸含量：(a)肌醇六磷酸酶编码基因的引入将增强肌醇六磷酸的分解，向经转化的植物中添加更多的游离磷酸盐。参见例如Van Hartingsveldt等人，Gene，第127卷，第87页(1993年)，对于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开内容；以及(b)可引入降低肌醇六磷酸含量的基因。例如，在玉米中，这可通过克隆并且然后再引入与单个等位基因相关的DNA来完成，该等位基因负责以低植酸水平为特征的玉米突变体。参见Raboy等人，Maydica，第35卷，第383页(1990年)。

3.改进的碳水化合物组成，其例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物来实现。参见Shiroza等人，J.Bacteol.，第170卷，第810页(1988年)(链球菌(streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等人，Mol.Gen.Genet.，第20卷，第220页(1985年)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen等人，Bio/technology，第10卷，第292页(1992年)(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的产生)；Elliot等人，PlantMolec.Biol.，第21卷，第515页(1993年)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sorgaard等人，J.Biol.Chem.，第268卷，第22480页(1993年)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)；以及Fisher等人，Plant Physiol.，第102卷，第1045页(1993年)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。

4.改进的纤维特性，例如代表可在甜菊品种中改进的性状的另一个示例的纤维品质。例如，美国专利No.6,472,588描述了用改变纤维特性，诸如强度、长度、纤维细度、纤维成熟度比、未成熟纤维含量、纤维均匀度和马克隆值的蔗糖磷酸合酶核酸转化的转基因植物。包含用于改善纤维特性的编码选自内木葡聚糖转移酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的酶的一种或更多种基因的甜菊植物还描述于美国专利No.6,563,022中。使用优先指导子房组织中基因表达的子房组织转录因子对甜菊纤维进行改进，特别地在非常早的果实发育中，用于在甜菊胚珠组织中表达编码异戊烯基转移酶的基因，以及改进植物中铃集合的特性并改变纤维品质特性，包括纤维的尺寸和强度在美国专利No.6,329,570中讨论。控制植物中纤维形成机制的基因描述于美国专利No.6,169,174中。参与木质素生物合成的基因描述于美国专利No.5,451,514中。

用于甜菊转化的方法

已开发了许多用于植物转化的方法，其包括生物和物理植物转化方案。参见例如Mild等人，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编辑，CRC Press,Inc.,Boca Raton，第67-88页(1993年)。另外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法是可用的。参见例如Gruber等人，“Vectors for Plant Transformation”，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编辑，CRCPress,Inc.,Boca Raton，第89-119页(1993年)。

A.农杆菌(Agrobacterium)介导的转化：

用于将表达载体引入到植物中的一种方法基于农杆菌的天然转化系统。参见例如Horsch等人，Science，第227卷，第1229页(1985年)。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其遗传地转化植物细胞。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见例如Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant Sci.，第10卷，第1页(1991年)。农杆菌载体系统的描述和用于农杆菌介导的基因转移方法由Gruber等人，同上；Miki等人，同上；以及Moloney等人，Plant CellRep.，第8卷，第238页(1989年)提供。还参见1996年10月8日发布的美国专利No.5,563,055(Townend和Thomas)。

B.直接基因转移：

已开发了被统称为直接基因转移的若干种植物转化方法作为农杆菌介导的转化的替代方法。通常可应用的植物转化方法是微粒介导的转化，其中DNA被携带在1μm至4μm的微粒表面上。使用生物射弹装置将表达载体引入到植物组织中，该生物射弹装置将微粒加速至300m/s至600m/s的速度，其足以穿透植物细胞壁和膜。Sanford等人，Part.Sci.Technol.，第5卷，第27页(1987年)；Sanford,J.C.，Trends Biotech.，第6卷，第299页(1988年)；Klein等人，Bio/technology，第6卷，第559-563页(1988年)；Sanford,J.C.，Physiol Plant，第7卷，第206页(1990年)；Klein等人，Bio/technology，第10卷，第268页(1992年)。还参见1991年5月14日发布的美国专利No.5,015,580(Christou等人)；1994年6月21日发布的美国专利No.5,322,783(Tomes等人)。

用于将DNA物理递送至植物的另一种方法是靶细胞的超声处理。Zhang等人，Bio/technology，第9卷，第996页(1991年)。作为另外一种选择，脂质体和原生质球融合已用于将表达载体引入到植物中。Deshayes等人，EMBO J.，第4卷，第2731页(1985年)；Christou等人，PNAS，第84卷，第3962页(1987年)。还报道了使用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA吸收到原生质体中。Hain等人，Mol.Gen.Genet.，第199卷，第161页(1985年)以及Draper等人，Plant Cell Physiol.第23卷，第451页(1982年)。原生质体和全细胞和组织的电穿孔已有所描述。Donn等人，In Abstracts of VIIth International Congress onPlant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，第53页(1990年)；D'Halluin等人，PlantCell，第4卷，第1495-1505页(1992年)；以及Spencer等人，Plant Mol.Biol.，第24卷，第51-61页(1994年)。

转化甜菊靶组织之后，上述选择标记基因的表达允许使用本领域中目前公知的再生和选择方法优先选择转化的细胞、组织和/或植物。

用于转化的前述方法将通常用于产生转基因品种。然后可将转基因品种与另一种(未经转化的或经转化的)品种杂交，以产生新的转基因品种。作为另外一种选择，可使用在植物育种领域中公知的传统回交技术将使用前述转化技术已工程化到特定甜菊栽培品种中的遗传性状转移到另一个栽培品种中。例如，回交方法可用于将工程化性状从公共、非优良品种转变为优良品种，或从其基因组中包含外源基因的品种转变为不含该基因的一种或多种品种。如本文所用，“杂交”可指简单的X×Y杂交，或回交的过程，这取决于上下文。

C.单基因座转换体

当本文使用术语“甜菊植物”时，这也包括该品种的任何单基因座转换体。如本文所用，术语“单基因座转化植物”是指除了转移到品种中的单个基因座之外，还存在该品种的基本上所有期望形态和生理特性的那些甜菊植物。可用于生成单基因座转化植物的一种此类方法是回交方法。如本文所用，术语“回交”是指将杂交后代重复杂交回轮回亲本，即回交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次至轮回亲本。为期望特性贡献基因的亲本甜菊植物被称为“非轮回”或“供体亲本”。该术语是指非轮回亲本在回交方案中使用一次并因此不再出现的事实。转移来自非轮回亲本的基因的亲本甜菊植物被称为轮回亲本，因为其被用于数轮回交方案中(Poehlman和Sleper(1994年)；Fehr(1987年))。在典型的回交方案中，将感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带待转移的单个感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后将来自该杂交的所得后代再次杂交至轮回亲本，并重复该过程，直至获得这样的甜菊植物，其中除了来自非轮回亲本的单个转移基因之外，在经转换植物中基本上恢复了轮回亲本的所有所期望形态和生理特性，如在相同环境条件下培养时在5％显著性水平下确定的。

合适的轮回亲本的选择是成功回交程序的重要步骤。回交方案的目标是改变或替代原始品种中的单个性状或特性。为了实现这一点，轮回品种的单个基因被来自非轮回亲本的期望基因修饰或替代，同时基本保留所有剩余的期望遗传基因，并因此保留原始品种的期望生理和形态构成。特定非轮回亲本的选择将取决于回交的目的。主要目的之一是为植物添加一些商业上期望的、农学上重要的性状。确切的回交方案将取决于被改变的特性或性状以确定适当的测试方案。虽然当被转移的特性是显性等位基因时简化了回交方法，但也可转移隐性等位基因。在这种情况下，可必需引入后代测试以确定是否已成功转移所期望特性。

已鉴定了许多单基因性状，其在新品种的开发中没有被定期选择，但是可通过回交技术来改善。单基因性状可以是转基因的。这些性状的示例包括但不限于雄性不育，蜡质淀粉，除草剂抗性，对细菌、真菌或病毒性病害的抗性，昆虫抗性，雄性能育性，增强的营养品质，工业用途，产率稳定性和产率提高。这些基因通常通过胞核遗传。这些单基因性状中的若干单基因性状描述于美国专利No.5,959,185，No.5,973,234，和No.5,977,445中，这些专利的公开内容特此以引用方式并入。

也可以通过使用下面讨论的各种基因组编辑技术来生成单基因座转化植物。

D.基因组编辑

基因组编辑技术诸如成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(CRISPR-Cas)允许几乎任何作物基因组序列的靶向修饰以产生新变异，这在植物中促进了靶向的性状改良。最近，来自普氏菌属和弗朗西斯氏菌属1(Cpf1)的CRISPR已经成为用于高效进行基因组编辑，包括植物中游离DNA基因组编辑的新工具。与CRISPR-Cas9系统相比，CRISPR-Cpf1系统显示出更高的效率、更高的特异性和更广泛的应用的潜力。

通过组织培养和再生可进一步繁殖该品种。甜菊的多种组织的组织培养物和由此产生的植物的再生是公知的，并且已经广泛公布。例如，可参考Komatsuda,T.等人，CropSci.，第31卷，第333-337页(1991年)；Stephens,P.A.等人，Theor.Appl.Genet.，第82卷，第633-635页(1991年)；Komatsuda,T.等人，Plant Cell,Tissue and Organ Culture，第28卷，第103-113页(1992年)；Dhir,S.等人。Plant Cell Rep.，第11卷，第285-289页(1992年)；Pandey,P.等人，Japan J.Breed.，第42卷，第1-5页(1992年)；以及Shetty,K.等人，Plant Science，第81卷，第245-251页(1992年)；以及1991年1月18日授予Collins等人的美国专利No.5,024,944和1991年4月16日授予Ranch等人的美国专利No.5,008,200。因此，本发明的另一个方面是提供在生长和分化时产生具有甜菊栽培品种“AP-1”的生理和形态特性的甜菊植物的细胞。

如本文所用，术语“组织培养物”指示包含相同或不同类型的分离细胞的组合物或组织成植物部分的此类细胞的集合。示例性类型的组织培养物是原生质体、愈伤组织、植物丛和植物细胞，其可产生在植物或植物部分(诸如胚、花粉、花、种子、叶、茎、根、根尖、花药和雌蕊)中完整的组织培养物。用于制备和维持植物组织培养物的方法是本领域中公知的。以举例的方式，包含器官的组织培养物已用于产生再生植物。美国专利No.5,959,185，No.5,973,234，和No.5,977,445描述了某些技术。

本发明还涉及通过将第一亲本甜菊植物与第二亲本甜菊植物进行杂交而用于产生甜菊植物的方法，其中第一亲本甜菊植物或第二亲本甜菊植物是栽培品种“AP-1”的甜菊植物。此外，第一亲本甜菊植物和第二亲本甜菊植物两者均可来自甜菊栽培品种“AP-1”。因此，使用甜菊栽培品种“AP-1”的任何此类方法都是本公开的一部分：自交、回交、杂交体产生、与种群杂交等。使用甜菊栽培品种“AP-1”作为亲本产生的所有植物都在本发明的范围内，包括从来源于甜菊栽培品种“AP-1”的品种中开发的那些。甜菊栽培品种“AP-1”可用于与其他不同的甜菊植物杂交，以产生具有优良特性的第一代(F₁)甜菊杂交体种子和植物。甜菊栽培品种“AP-1”也可用于转化，其中引入并表达外源基因。通过使用栽培品种“AP-1”的传统育种方法或者通过本领域技术人员已知的多种方案中的任一种方案通过对“AP-1”的转化而产生的遗传变体均旨在处于本公开的范围内。

以下描述了在另外的甜菊植物的开发中可与栽培品种“AP-1”一起使用的育种方法。一个这样的实施方案是用于在甜菊植物育种程序中开发“AP-1”后代甜菊植物的方法，该方法包括：获得栽培品种“AP-1”的甜菊植物或其部分，利用所述植物或植物部分作为育种材料的来源，以及选择具有与“AP-1”共同的分子标记和/或具有选自本文所述特性的形态和/或生理特性的“AP-1”后代植物。可用于甜菊植物育种程序中的育种步骤包括谱系育种、回交、突变育种和轮回选择。结合这些步骤，可利用诸如标记增强选择、遗传标记增强选择(例如，SSR标记)和双单倍体制备之类的技术。

另一种方法涉及产生栽培品种“AP-1”后代甜菊植物的种群，包括将栽培品种“AP-1”与另一种甜菊植物进行杂交，从而产生甜菊植物的种群，该种群平均从栽培品种“AP-1”中获得其等位基因的50％。可选择该种群的植物，并用从这些连续的子代产生的甜菊栽培品种反复自交或同胞杂交。本文所公开的一个实施方案是由该方法产生的甜菊栽培品种。

植物育种领域的普通技术人员将知晓如何评价两个植物品种的性状以确定由那些品种所表达的两个性状之间是否没有显著差异。例如，参见Fehr和Walt，Principles ofCultivar Development，第261-286页(1987年)。因此，本发明包括甜菊栽培品种“AP-1”后代甜菊植物，其包含选自表1中所列出那些的至少两种“AP-1”性状的组合或者发明内容中所列出的“AP-1”性状组合，使得所述后代甜菊植物的所述性状与甜菊栽培品种“AP-1”相比无显著差异，如在相同环境下培养时以5％显著性水平确定的。使用本文中所述的技术，可使用分子标记以将所述后代植物鉴定为“AP-1”后代植物。可使用平均性状值来确定性状差异是否显著，并且在相同环境条件下培养的植物上测量性状。一旦开发出这样的品种，其价值是实质性的，由于重要的是总体上提高种质基础，以便在极端环境条件下维持或改善性状，诸如产率、抗病性、害虫抗性和植物性能。

栽培品种“AP-1”的后代还可通过其与甜菊栽培品种“AP-1”的亲缘关系来表征，如例如在甜菊栽培品种“AP-1”的一定数目的育种杂交内。育种杂交是将新的遗传学引入后代中而进行的杂交，并且区别于在现有遗传等位基因中用于选择而进行的杂交，例如自交或同胞杂交。谱系中育种杂交的数目越少，甜菊栽培品种“AP-1”与其后代之间的关系越接近。例如，通过本文所述中方法产生的后代可在甜菊栽培品种“AP-1”的1、2、3、4或5次育种杂交内。

糖苷的提取和纯化方法

使用水或有机溶剂从甜叶菊植物中提取和纯化甜性糖苷的方法描述于例如美国专利No.4,361,697、4,082,858、4,892,938、5,972,120、5,962,678、7,838,044和7,862,845中。用于提取RebD的方法描述于美国专利No.9,029,426中，并且RebM的提取在美国申请No.14/254,653中提供。

所述组合物可用作各种食物和饮料产品中的甜味增强剂、风味增强剂和甜味剂。食物和饮料产品的示例包括但不限于碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料、零热量饮料、运动饮料、茶、水果和蔬菜汁、果汁饮料、乳饮料、酸奶饮料、酒精饮料、粉状饮料、烘焙产品、曲奇、小面包、烘焙混合物、谷类食品、蜜饯、糖果、太妃糖、口香糖、乳制品、调味乳、酸奶、调味酸奶、发酵乳、酱油和其他豆制品、沙拉酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉制品、鱼肉制品、瓶装和罐头食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜。另外，所述组合物可用于药物或药物制剂和化妆品中，包括但不限于牙膏、漱口水、止咳糖浆、咀嚼片、锭剂、维生素制剂等。所述组合物可以“按原样”使用或与其他甜味剂、调味剂和食物成分组合使用。

尽管以上已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换、添加和子组合。因此，以下所附权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改、置换、添加和子组合。

在不脱离其精神或基本特性的情况下，可以以其他特定形式来体现一个或多个方面。所描述的实施方案在所有方面都应被认为仅是说明性的而非限制性的。因此，实施方案的范围由所附权利要求书而非前述描述指示。落入权利要求的等效含义和范围内的全部改变都应包括在其范围内。

已经出于说明和描述的目的给出了实施方案的前述讨论。前述内容并不旨在将实施方案限制于本文所公开的一种或多种形式。在例如以上具体实施方式中，出于简化本公开的目的，将实施方案的各种特征在一个或多个实施方案中组合在一起。本公开的该方法不应被解释为反映所要求保护的实施方案需要比在每个权利要求中明确记载的特征更多的特征的意图。相反，如以下权利要求所反映的，发明性方面在于少于单个前述公开的实施方案的所有特征。因此，以下权利要求由此并入该具体实施方式中，其中每个权利要求独立地作为单独的优选实施方案。

此外，尽管实施方案的描述已经包括一个或多个实施方案以及某些变型和修改的描述，但是其他变型和修改也在实施方案的范围内(例如，如在理解本公开之后，可能在本领域技术人员的技能和知识范围内)。意图获得如下权利：其在所允许的程度上包括另选实施方案，包括对于所要求保护的那些而言的另选的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或动作，无论这样的另选的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或动作是否在本文中公开；而不是意图公开地奉献任何可取得专利的主题。

除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述实施方案的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”和“所述”以及类似的指代将被理解为涵盖单数和复数两者。除非另有说明，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文的值范围的表述仅旨在用作单个地提及落在该范围内的每个单独的值的速记方法，并且将每个单独的值掺入到说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。例如，如果公开了范围10-15，则也公开了11、12、13和14。除非本文另外指明或以其他方式与上下文明确矛盾，本文所述的所有方法均可按任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明实施方案，并且不对实施方案的范围构成限制。本说明书中的任何语言不应理解为指示任何非权利要求书保护的要素对于实践一个或多个实施方案是必要的。

尽管以上已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换、添加和子组合。因此，所附权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改、置换、添加和子组合。

保藏信息

以上公开的并在所附权利要求书中记载的，名称为“AP-1”的甜菊品种的植物组织的保藏已在中国朝阳区大屯路100101，中国科学院微生物研究所，中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)进行。保藏日期为2018年12月12日。CGMCC登录号是CGMCC No.16985。在授予专利时将不可撤销地去除对保藏对于公众的可用性的所有限制，并且该保藏旨在满足37C.F.R.§§.1.801-1.809的所有要求。

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序列表

<110> 谱赛科美国股份有限公司（PureCircle USA Inc.）

<120> 非整倍体甜菊栽培品种‘AP-1’

<130> PURC.12WOU1

<160> 10

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 102

<212> DNA

<213> 甜叶菊（Stevia rebaudiana）

<400> 1

ggtaataaca accttagttg cctaattata tatgcttctt gtgatgaatt tccaatctaa 60

ytgtacttga gctaatatag aaaacctagt tgctgccaca tt 102

<210> 2

<211> 125

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 2

taacttgcac acatcatcat aaccacgaga cttaccttga aacaatstaa ggttcctctc 60

ttgccatatg taataaacaa cacttccaat taccaatctt tgaataacac tccaaatgga 120

tttat 125

<210> 3

<211> 103

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 3

atggaagatg aacctgatgt tcctgaacaa ctcgttcgcc gatcggttwg tctcgaaatc 60

cattcacaag ttcttttata ttgcactgat ttgatactta ggg 103

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 4

agaagaacag tgccagaata atctgtggcg ctaaagtgat ccaaccayac ccttgttctc 60

ccagttatat aaaagattaa aaattgctag ttgtccttcg c 101

<210> 5

<211> 127

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 5

caatagtgaa agatttctta tatttctttt caattacttt gtatggatta atctaactat 60

tcaatgttkt aaaaagcggg attaatcact gaccaatcgg cgattaatcg ttaattggta 120

acccacc 127

<210> 6

<211> 117

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 6

aattttcttc ttaacatcat gtcatgatta aacattctag cacctgaaaa gaagaaayaa 60

ttggagatta aactaaaaaa ttgcataatt ttggaataat tttcgaaact aaaattt 117

<210> 7

<211> 124

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 7

aatacccaaa ctcattagaa aaactgaaag cacacttgtt actatgtttt cttagtacat 60

ttacygaaac ttgtatgtaa ataactccaa acttacgaaa aacaaacctt attttttgca 120

agaa 124

<210> 8

<211> 124

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 8

ttgtgccaaa ccattaagaa gtctgactta ttaagaggta agttctgaat gattcagcta 60

gttcrtgaaa cttaaccatt tagaatttta gatgcttcag gaaccattaa gaggtgtaaa 120

caaa 124

<210> 9

<211> 134

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 9

tcactttatt aacatttttc ttctctcttt cggcattttt tgcctctaaa tccgctcgtt 60

ttttctcatt ttctaaacac wctttaagcc gacctatttc cgtttccaaa ttctgattct 120

cagattttaa taaa 134

<210> 10

<211> 90

<212> DNA

<213> 甜叶菊

<400> 10

gcaaccatga caagaagttg gctcatgaga agaaacaata acgcacygac acccaatccg 60

gttgctatat cagattcata aacacagtat 90

Claims (14)

1.一种包含甜菊栽培品种“AP-1”的植物或其部分的不能生长为完整甜菊植物的食物或饲料产品，其中所述栽培品种的活体植物组织的愈伤组织样品以CGMCC No. 16985保藏。

2.一种包含权利要求1中所限定的甜菊栽培品种的植物或其部分的不能生长为完整甜菊植物的食物或饲料产品，其中所述植物部分是种子、叶、花粉、茎、根、胚珠或细胞。

3.一种使权利要求2中的植物无性繁殖的方法，包括以下步骤：

从所述植物收集能够繁殖的组织或细胞；

培养所述组织或细胞以获得增殖的芽；以及

使所述增殖的芽生根以获得生根的小植株；或者

培养所述组织或细胞以获得增殖的芽，或获得小植株；或者通过种植所述小植株或增殖的芽而产生的甜菊植物。

4.一种用于产生F₁种子或胚的方法，其中所述方法包括将甜菊栽培品种“AP-1”的植物与不同的甜菊植物或其自身进行杂交，以及收获所得F₁种子或胚，其中所述栽培品种的活体植物组织的愈伤组织样品以CGMCC No. 16985保藏。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法包括收获通过所述方法产生的甜菊种子或胚。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法包括收获通过种植所述种子或胚而产生的甜菊植物或其部分。

7.一种确定甜菊栽培品种“AP-1”的植物的基因型的方法，其中所述栽培品种的活体植物组织的愈伤组织样品以CGMCC No. 16985保藏，其中所述方法包括从所述植物获得核酸样品并在所述核酸中检测多种多态性。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多种多态性对应于SEQ ID NO: 1-10中鉴定的单核苷酸多态性。

9.一种产生（a）除草剂抗性、（b）昆虫抗性或者（c）抗病性甜菊植物的方法，其中所述方法包括用转基因转化甜菊栽培品种“AP-1”的植物，其中所述栽培品种的活体植物组织的愈伤组织样品以CGMCC No. 16985保藏，其中：（a）所述转基因赋予对选自以下的除草剂的抗性：草甘膦、磺酰脲、咪唑啉酮、麦草畏、草铵磷、苯氧基丙酸、环己二酮、三嗪、苄腈和溴苯腈；（b）所述转基因赋予昆虫抗性；或者（c）所述转基因赋予抗病性。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述转基因编码苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）内毒素。

11.一种将期望性状引入甜菊栽培品种“AP-1”的方法，其中所述方法包括：

将“AP-1”植物与包含期望性状的另一种甜菊栽培品种的植物进行杂交以产生后代植物，其中所述“AP-1”植物的植物组织的愈伤组织样品以CGMCC No. 16985保藏；

选择具有所述期望性状的一个或多个后代植物；

将所述选择的后代植物与“AP-1”进行回交以产生回交后代植物；

选择具有所述期望性状的回交后代植物；

连续重复所述回交方法两次或更多次，以产生包含所述期望性状的所选择的第四代或更高代回交后代植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述期望性状选自雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、改进的碳水化合物代谢、改进的甜菊苷含量、改进的莱鲍迪苷含量、改进的甜菊纤维特性以及对细菌性病害、真菌性病害或病毒性病害的抗性。

13.一种用于在甜菊植物育种程序中开发甜菊植物的方法，包括将植物育种技术应用于甜菊栽培品种“AP-1”的植物或其部分，其中所述栽培品种的活体植物组织的愈伤组织样品以CGMCC No. 16985保藏，所述植物育种技术包括秋水仙碱诱导的多倍体；杂交；轮回选择；突变育种，其中所述突变育种选择自发或人为诱导的突变；回交；谱系育种；标记增强选择；单倍体/双单倍体生产；或转化，其中所述技术的应用导致甜菊植物的开发，其中所述植物具有一种或多种多态性，其中所述一种或多种多态性选自以SEQ ID NO: 1-10描绘的SNP。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标记增强选择包括检测一种或多种多态性，其中所述一种或多种多态性选自以SEQ ID NO: 1-10描绘的SNP。