CN110536960B - 用于稳健动态代谢控制的组合物和方法 - Google Patents

用于稳健动态代谢控制的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于在基因工程微生物中大规模快速生产化学品的组合物和方法。还提供了能够快速优化微生物生产菌株的高通量代谢工程平台。该平台弥合了目前体内与体外生物生产方法之间的差距，依赖于活性代谢网络的动态最小化。

Description

用于稳健动态代谢控制的组合物和方法
交叉引用
本申请要求于2017年2月21日提交的申请号为62/461,436的美国临时申请的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府支持下完成的，联邦资助号为HR0011-14-C-0075，12043956和1445726，由DOD/DARPA、NAVY/ONR和NSF分别授予。政府对本发明享有一定的权利。
序列表的引用
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝是在2018年2月21日创建的，命名为52240_702_601_SL.txt，大小为81，697字节。
背景技术
已经成功开发了基于生物技术的发酵工艺以生产各种物质，从生物制剂和小分子疗法到特种、大宗和商业化学品，甚至下一代生物燃料。近年来，由于发酵科学和合成生物学以及代谢和酶工程领域的技术发展，这些工艺取得了快速进展。尽管取得了这些重大进展，但合理和定向工程方法的大多数成功示例也极大地依赖于许多且通常很长的试错循环。本公开提供了一种策略，其同时降低了问题的复杂性(以及相关设计空间的大小)，同时还最小化了对环境条件的代谢响应，增加了工程株的稳健性和可扩展性。
发明内容
本发明部分地提供了一种能够快速开发微生物生产菌株的高通量工程平台。
一方面，本发明提供一种产生产物的细胞，其中所述细胞包括：
异源多核苷酸，用于受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述受控降低所述酶的表达诱导所述细胞的稳定期；和
异源生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；
其中，与缺乏所述酶的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期所述产物的产生速率被降低地更少。
在一些实施方案中，所述异源多核苷酸通过所述代谢途径降低通量。在一些实施方案中，所述酶选自下组：烯酰-ACP/CoA还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶、柠檬酸合酶、可溶性转氢酶和NADH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述生产酶选自下组：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶、丙氨酸输出物和NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述环境条件的改变包括增加或降低接触所述细胞的培养基中糖的浓度。在一些实施方案中，所述糖是葡萄糖。在一些实施方案中，所述环境条件的改变包括增加或降低接触所述细胞的培养基的氧合作用。在一些实施方案中，所述产物包含3-羟基丙酸。
在一些实施方案中，所述产物包含氨基酸。在某些方面，所述氨基酸包含丙氨酸。在某些方面，所述细胞在培养物中生长，并且所述培养物的所述丙氨酸的产生速率为至少0.5g/L/小时。在某些方面，所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.0g/L/小时。在某些方面，所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.5g/L/小时。在某些方面，所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.6g/L/小时。在某些方面，所述培养物产生至少80g/L的所述丙氨酸。在某些方面，所述培养物产生至少100g/L的所述丙氨酸。在某些方面，所述培养物产生至少120g/L的所述丙氨酸。在某些方面，所述培养物产生至少140g/L的所述丙氨酸。在某些方面，所述生产多核苷酸编码丙氨酸输出物。在某些方面，所述丙氨酸输出物是alaE。
在一些实施方案中，所述产物包含甲羟戊酸。在一些实施方案中，所述细胞在培养物中生长，并且所述培养物的所述甲羟戊酸的产生速率为至少0.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述甲羟戊酸的所述产生速率为至少1.0g/L/小时。在一些实施方案中，所述甲羟戊酸的所述产生速率为至少1.2g/L/小时。在一些实施方案中，所述甲羟戊酸的所述产生速率为至少1.25g/L/小时。在一些实施方案中，所述细胞在培养物中生长，并且所述培养物产生至少50g/L的所述甲羟戊酸。在一些实施方案中，所述培养物产生至少70g/L的所述甲羟戊酸。在一些实施方案中，所述培养物产生至少90g/L的所述甲羟戊酸。在一些实施方案中，所述培养物产生至少95g/L的所述甲羟戊酸。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸选自下组：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述酶的基因的转录；和降解多核苷酸，用于介导所述酶的细胞降解。
在某些方面，所述异源多核苷酸包含沉默多核苷酸，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述酶的基因的启动子的gRNA序列。在某些方面，所述异源多核苷酸编码CRISPR酶，其中当与所述gRNA结合时，所述CRISPR酶特异性结合所述启动子序列。在某些方面，所述CRISPR酶是催化失活的。在某些方面，所述异源多核苷酸包含降解多核苷酸，其中所述降解多核苷酸包含编码降解标签的序列，其中所述降解标签介导所述酶的降解。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸的表达受所述细胞中的磷酸盐可用性的调节。在一些实施方案中，所述生产多核苷酸的表达受所述细胞中的磷酸盐可用性的调节。在一些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌细胞(E.coli)。
另一方面，本文公开了一种方法，包括：
独立培养多个细胞株，其中每个细胞株包含(i)异源多核苷酸，用于介导受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述受控降低所述酶的表达诱导所述细胞的稳定期；以及(ii)异源生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；其中所述多个细胞株中的每个细胞株均与另一个细胞株不同，不同之处在于所述异源多核苷酸或所述异源生产多核苷酸两者中至少一者的序列；
使所述多个细胞株生长到稳定期；以及
选择所述多个细胞株中的一个细胞株，基于在所述稳定期由所述选择的细胞株产生的所述产物的水平来选择。
在一些实施方案中，所述方法包括确定所述产物的所述水平。在一些实施方案中，所述方法包括培养所述选择的细胞株。在一些实施方案中，所述选择的细胞株在生物反应器中生长。在一些实施方案中，包含所述选择的细胞株的培养基的体积为至少500ml。在一些实施方案中，所述培养基的体积为至少1L。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸选自下组：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述酶的基因的转录；和降解多核苷酸，用于介导所述酶的细胞降解。在一些实施方案中，所述多个细胞株的第一细胞株和第二细胞株包含沉默多核苷酸。在一些实施方案中，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述酶的基因的启动子序列的gRNA序列。在一些实施方案中，所述第一细胞株和第二细胞株的所述gRNA序列不同。在一些实施方案中，所述多个细胞株的第一细胞株和第二细胞株包含降解多核苷酸。在一些实施方案中，所述第一细胞株和第二细胞株的所述降解多核苷酸的序列不同。在一些实施方案中，所述酶选自下组：烯酰-ACP/CoA还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶、柠檬酸合酶、可溶性转氢酶和NADH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述生产酶选自下组：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶、丙氨酸输出物和NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述产物选自下组：甲羟戊酸、3-羟基丙酸和氨基酸。
在一些实施方案中，所述产物是氨基酸，所述氨基酸是丙氨酸。在一些实施方案中，在所述选择的细胞株的细胞中，与缺乏所述异源多核苷酸的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期所述产物的产生速率被降低地更少。在一些实施方案中，所述环境条件的改变包括接触所述细胞的培养基的糖浓度的改变。在一些实施方案中，所述环境条件的改变包括接触所述细胞的培养基的氧合作用的改变。
在一些实施方案中，本文公开了一种产生细胞产物的方法，包括：
在培养基中培养异源细胞，其中所述异源细胞包含：(i)异源多核苷酸，用于介导受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述受控降低所述酶的表达诱导所述细胞的稳定期；以及(ii)异源生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；
其中，与缺乏所述酶的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期所述产物的产生速率被降低地更少。
在一些实施方案中，所述方法还包括改变所述环境条件。在一些实施方案中，所述环境条件包括所述培养基的糖浓度，改变所述环境条件包括增加或降低所述糖浓度。在一些实施方案中，所述糖是葡萄糖。在一些实施方案中，所述环境条件包括所述培养基的氧浓度，改变所述环境条件包括增加或降低所述氧浓度。在一些实施方案中，所述培养在生物反应器中进行。在一些实施方案中，所述培养基的体积为至少500ml。在一些实施方案中，所述培养基的体积为至少1L。在一些实施方案中，所述产物包含3-羟基丙酸。在一些实施方案中，所述产物包含氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸包含丙氨酸。在一些实施方案中，所述丙氨酸的所述产生速率为至少0.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.0g/L/小时。在一些实施方案中，所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述丙氨酸的所述产生速率为至少1.6g/L/小时。在一些实施方案中，所述生产多核苷酸编码丙氨酸输出物。在一些实施方案中，所述丙氨酸输出物是alaE。
在一些实施方案中，所述产物包含甲羟戊酸。在一些实施方案中，所述甲羟戊酸的产生速率为至少0.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述甲羟戊酸的产生速率为至少1.0g/L/小时。在一些实施方案中，所述甲羟戊酸的产生速率为至少1.2g/L/小时。在一些实施方案中，所述甲羟戊酸的产生速率为至少1.25g/L/小时。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸选自下组：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述酶的基因的转录；和降解多核苷酸，用于介导所述酶的细胞降解。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸包含沉默多核苷酸，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述酶的基因的启动子序列的gRNA序列。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸编码CRISPR酶，其中当与所述gRNA结合时，所述CRISPR酶特异性结合所述启动子序列。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是催化失活的。在一些实施方案中，所述降解多核苷酸包含编码降解标签的序列，其中所述降解标签介导所述酶的降解。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸的表达受所述细胞中磷酸盐可用性的调节。在一些实施方案中，所述生产多核苷酸的表达受所述细胞中的磷酸盐可用性的调节。在一些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌细胞。
另一方面，本文公开了用于产生丙氨酸的细胞，其中所述细胞包括：(i)异源多核苷酸，用于受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述酶选自下组：烯酰-ACP/CoA还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶(lpd)、柠檬酸合酶(gltA)、可溶性转氢酶和NADH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶；和(ii)丙氨酸输出物，其中与野生型细胞相比，丙氨酸输出物以更高水平表达。
在一些实施方案中，丙氨酸输出物由alaE基因编码。在一些实施方案中，受控降低酶的表达诱导细胞的稳定期。在一些实施方案中，所述细胞还包含异源生产多核苷酸，用于受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生丙氨酸。在一些实施方案中，所述生产酶选自下组：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶和NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸选自下组：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述酶的基因的转录；和降解多核苷酸，用于介导所述酶的细胞降解。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸包含沉默多核苷酸，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述酶的基因的启动子的gRNA序列。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸进一步编码CRISPR酶，其中当与所述gRNA结合时，所述CRISPR酶特异性结合所述启动子序列。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是催化失活的。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸包含降解多核苷酸，其中所述降解多核苷酸包含编码降解标签的序列，其中所述降解标签介导所述酶的降解。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸受所述细胞中的磷酸盐可用性调节。在一些实施方案中，所述生产多核苷酸受所述细胞中的磷酸盐可用性调节。在一些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌细胞。
在一些实施方案中，培养物包含所述细胞。在一些实施方案中，所述培养物的所述丙氨酸的产生速率为至少0.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述培养物的所述丙氨酸的产生速率为至少1.0g/L/小时。在一些实施方案中，所述培养物的所述丙氨酸的产生速率为至少1.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述培养物的所述丙氨酸的产生速率为至少1.6g/L/小时。在一些实施方案中，培养物产生至少100g/L的丙氨酸。在一些实施方案中，所述培养物产生至少120g/L的所述丙氨酸。在一些实施方案中，所述培养物产生至少140g/L的所述丙氨酸。
在某些方面，本文公开了一种产生丙氨酸的方法，包括使细胞在培养基中生长，所述细胞包含：(i)异源多核苷酸，用于受控降低代谢途径的酶的表达，其中所述酶选自下组：烯酰-ACP/CoA还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、硫辛酰胺脱氢酶、柠檬酸合酶、可溶性转氢酶和NADH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶；以及(ii)丙氨酸输出物，其中与野生型细胞相比，所述丙氨酸输出物以更高水平表达。
在一些实施方案中，所述受控降低所述酶的表达诱导所述细胞的稳定期。在一些实施方案中，该方法还包括在所述稳定期降低所述培养基的氧合水平或糖浓度，其中与缺乏异源多核苷酸的细胞相比，响应于上述降低，所述细胞产物的产生速率被降低地更少。在一些实施方案中，所述糖是葡萄糖。在一些实施方案中，所述丙氨酸输出物由alaE基因编码。在一些实施方案中，所述细胞还包含异源生产多核苷酸，用于受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生丙氨酸。在一些实施方案中，所述生产酶选自下组：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶和NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸选自下组：沉默多核苷酸，用于介导编码所述酶的基因的转录抑制；和降解多核苷酸，用于介导所述酶的细胞降解。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸包含沉默多核苷酸，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述酶的基因的启动子序列的gRNA序列。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸编码CRISPR酶，其中当与所述gRNA结合时，所述CRISPR酶特异性结合所述启动子序列。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是催化失活的。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸包含降解多核苷酸，其中所述降解多核苷酸包含编码降解标签的序列，其中所述降解标记介导所述酶的降解。
在一些实施方案中，所述异源多核苷酸的表达受细胞中磷酸盐可用性的调节。在一些实施方案中，生产多核苷酸受细胞中的磷酸盐可用性调节。在一些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述丙氨酸的产生速率为至少0.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述丙氨酸的产生速率为至少1.0g/L/小时。在一些实施方案中，所述丙氨酸的产生速率为至少1.5g/L/小时。在一些实施方案中，所述丙氨酸的产生速率为至少1.6g/L/小时。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入那样。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。将通过参考以下详细描述和附图获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施例，在附图中：
图1A描绘了2阶段发酵中的动态代谢控制的概述。
图1B描绘了菌株和生物过程优化。
图2A-D描绘了在大肠杆菌中实施2阶段合成代谢阀(Synthetic MetabolicValves，SMVs)的实例。
图3A-K描绘了利用2阶段动态控制在大肠杆菌中生产丙氨酸的实例。
图4A-F描绘了2阶段与生长相关方法之间的示例稳健性比较。
图5A-J描绘了微发酵和1L发酵中“阀”和生长相关的丙氨酸产生的示例比较。
图6A-H描绘了利用2阶段动态控制在大肠杆菌中生产甲羟戊酸的实例。
图7描绘了磷酸盐消耗启动子表征的实例。
图8描绘了绝缘的磷酸盐消耗启动子表征的实例。
图9描绘了绝缘的组成型启动子表征的实例。
图10描绘了两阶段发酵中的最佳3-HP通量的代谢建模结果的实例。
图11描绘了染色体修饰的实例。
图12描绘了1L FGM10基本培养基发酵中起始宿主菌株的平均最大生长速率的实例，n＝2。
图13A-E描绘了在1L标准基本培养基发酵中起始宿主菌株的生长阶段期间使用的葡萄糖分布的实例。
图14描绘了pCASCADE-对照质粒构建方案。
图15A-B描绘了pCASCADE构建方案。
图16A-C描绘了微发酵过程概述。
图17描绘了在DLF_0025菌株中使用不同的绝缘的磷酸盐启动子进行L-丙氨酸生产的微发酵。
图18描绘了gapN/gapA菌株的L-丙氨酸产生的热图。
图19A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图20A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图21A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图22A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图23A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图24A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图25A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图26A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图27A-D描绘了针对4种菌株的微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生，评估了稳健性。
图28A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图29A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图30A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图31A-D描绘了评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图32描绘了评估一种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图33A-B描绘了在本文中评估的1L规模的所有阀和生长相关菌株的生长曲线。
图34描绘了具有来自文献中的具有最高甲羟戊酸效价的菌株和在该工作中评估的甲羟戊酸菌株1的比生产率(SP)比较。
图35描绘了来自MS测量的丙氨酸标准曲线。绘制了来自三次标准测量的质谱响应的平均值和标准偏差。
图36A-B描绘了来自RI测量的葡萄糖和乙醇标准曲线。
图37描绘了来自TUV测量的3-羟基丙酸标准曲线。
图38A-D描绘了L-丙氨酸、D-丙氨酸、甲羟戊酸和甲羟戊酸内酯的TUV标准曲线。
具体实施方式
定义
除非上下文另有明确说明，否则如说明书和权利要求书中所使用的单数形式“一个/种(a/an)”，和“所述(the)”包括复数对象。因此，例如，提及的“表达载体”包括单个表达载体以及相同的(例如，相同的操纵子)或不同的多个表达载体；提及的“微生物”包括单个微生物以及多个微生物；等等。
如本文所用的“降低的酶活性”、“降低酶活性”等意指表示微生物细胞或分离的酶，表现的活性水平为比在相同物种的类似细胞中测量的或其天然酶的活性水平更低。也就是说，在已知标准条件下将指定的底物酶促转化为指定的产物，用于该转化的酶活性比对于在标准特定条件下由天然(未修饰的)酶的相同生物化学转化的酶活性低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。该术语还可包括消除该酶活性。可以使用本领域已知的任何方法鉴定具有降低酶活性的酶的细胞。例如，酶活性测定可用于鉴定具有降低的酶活性的细胞。参见，例如，酶命名法(EnzymeNomenclature)，美国学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)，美国(New York)2007。
如本文所用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等是指核酸序列中存在以下至少一个方面的事实：(a)对给定宿主微生物来说是外源(即，不是天然存在)的核酸序列；(b)该序列可天然存在于给定的宿主微生物中，但是以非天然(例如，大于预期)的量存在；或(c)核酸序列包含两个或多个本质上彼此不存在相同关系的子序列。例如，关于情形(c)，重组产生的异源核酸序列将具有来自无关基因的两个或更多个序列，所述无关基因被排列以产生新的功能性核酸，例如驱动基因表达的非天然启动子。
本文所用的术语“合成代谢阀”等是指采用受控蛋白水解、基因沉默或蛋白水解与基因沉默两者的组合来改变代谢通量。
术语“异源的”旨在包括术语“外源的”，因为后一术语是本领域常用的。根据在引入异源核酸序列之前的宿主微生物的基因组，编码酶的核酸序列是异源的(无论异源核酸序列是否被引入该基因组中)。
如本文所用的术语“基因破坏”或其语法等同物(包括“破坏酶功能”、“酶功能的破坏”等)旨在表示对微生物的遗传修饰，使得与在未经如此修饰的微生物细胞中或来自该细胞的多肽活性相比，编码的基因产物具有降低的多肽活性。基因修饰可以是，例如，全部基因的缺失、转录或翻译所需的调控序列的缺失或其他修饰、一部分基因的缺失，其产生截短的基因产物(例如酶)或通过任何一种降低编码基因产物活性(包括将活性降低到无可检测活性水平)的突变策略。破坏可以广泛地包括缺失编码酶的全部或部分核酸序列，并且还包括但不限于其他类型的遗传修饰，例如，引入终止密码子，移码突变，引入或去除基因的某部分，引入降解信号，影响mRNA转录水平和/或稳定性、以及改变编码酶的基因上游的启动子或抑制子的那些遗传修饰。
如本文所用的生物生产或发酵可以是需氧的、微需氧的或厌氧的。
当本文提及基因产物(例如酶)的遗传修饰(包括权利要求)时，应理解基因修饰是核酸序列的修饰，例如或包括通常编码规定的基因产物(例如酶)的基因。
如本文所用，术语“代谢通量”等是指代谢的变化，其导致产物和/或副产物形成的变化，包括来自给定底物的生产速率、生产效价和生产产率。
物种和其他系统发育鉴定是根据微生物学领域技术人员已知的分类进行的。
此处列出了酶，参考通用蛋白质资源(Uniprot)鉴定号，其为本领域技术人员所熟知(Uniprot 是由UniProt财团(Consortium)维护并提供)。
在本文描述的方法和步骤表明以特定顺序发生的某些事件的情况下，本领域普通技术人员将认识到可以修改某些步骤的顺序，并且这些修改符合本发明的变化。另外，某些步骤可以在可能的情况下以并行处理同时执行，以及顺序执行。
缩写的含义如下：“C”表示摄氏度；从其用法可以清楚地看出，DCW表示干细胞重量，“s”表示秒，“min”表示分钟，“h”、“hr”或“hrs”表示小时，“psi”表示磅/平方英寸，“nm”表示纳米，“d”表示天，“μL”或“uL”或“ul”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mm”表示毫米，“nm”表示纳米，“mM”表示毫摩尔，“μM”或“uM”表示微摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmol”或“uMol”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”或“ug”表示微克，“ng”表示纳克，“PCR”表示聚合酶链式反应，“OD”表示光密度，“OD600”表示在600nm的光子波长下测量的光密度，“kDa”表示千道尔顿，“g”表示引力常数，“bp”表示碱基对，“kbp”表示千碱基对，“％w/v”表示重量/体积百分比，“％v/v”表示体积/体积百分比，“IPTG”表示异丙基-μ-D-硫代半乳糖苷，“aTc”表示无水四环素，“RBS”表示核糖体结合位点，“rpm”表示每分钟转数，“HPLC”表示高效液相色谱，“GC”表示气相色谱。
概述
本文提供了高通量代谢工程平台，其能够快速优化微生物生产菌株。该平台弥合了目前体内与体外生物生产方法之间的差距，依赖于活性代谢网络的动态最小化。动态代谢网络最小化可以使用CRISPR干扰和受控蛋白水解的组合来实现，以降低基本中枢代谢中多种酶的活性。最小化可以在标准化的2阶段生物过程的背景下实施。这种方法不仅可以使设计空间的复杂性大大降低，而且还可以增加代谢通量和产生速率，以及应变对环境条件的稳健性。稳健性可以实现从高通量小规模筛选或“微发酵”到完全仪器化生物反应器的可预测的可扩展性。预测性高通量方法对于代谢工程计划来说可能是至关重要的，以真正利用快速增加的通量和降低合成的生物学成本。本文提供的实施例不仅证明了这种方法在普通工业微生物(大肠杆菌)中的原理证据，并且已经通过快速优化以商业上有意义的速率、效价(分别为147g/L和97g/L)和产率产生两种重要工业化学品(丙氨酸和甲羟戊酸)的大肠杆菌菌株验证了这种方法。
本文还提供了以高通量方式快速优化用于化学产品的微生物的系统和方法。
本文还提供了可与所公开的平台一起使用的微生物和/或用于化学生产的方法。
合成代谢阀(SMV)
本公开内容描述了合成代谢阀(SMV)的构建，所述合成代谢阀(SMV)包含以下一种或多种或其组合：受控基因沉默和受控蛋白水解。应理解，本领域技术人员知道用于基因沉默和受控蛋白水解的几种方法。
利用SMV的平台微生物菌株的开发可以使产物形成与生长分离。这些菌株能够动态控制代谢途径，包括那些改变后对微生物生长产生负面影响的那些代谢途径。通过组合方法完成对代谢的动态控制，所述方法包括但不限于转录沉默和受控的酶蛋白水解。这些微生物菌株用于包括至少两个阶段的多阶段生物过程，在第一阶段中，微生物生长并且代谢可以针对微生物生长进行优化，在至少一个其他阶段中，生长可以减缓或停止，并且可以对代谢进行动态改变以改善所需产物，例如化学品或燃料的产生。可以通过人工化学诱导剂或优选通过控制关键限制营养物的水平来控制各阶段之间生长培养物的转变和代谢通量的操纵。此外，可以进行遗传修饰以提供用于一种或多种化学或燃料产物的生物合成的代谢途径。另外，可以进行遗传修饰以使得能够利用各种碳原料，包括但不限于糖例如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和乳糖，油，二氧化碳，一氧化碳，甲烷，甲醇和甲醛。
该方法允许在生产阶段期间的代谢通量和生理需求的更简单模型，将生长细胞转变为稳定期生物催化剂。这些合成代谢阀可用于关闭必需基因，并将碳、电子和能量通量重定向到多阶段发酵过程中的产物形成。以下中的一种或多种启动这些合成阀：1)转录基因沉默或抑制技术与2)诱导型酶降解和3)营养限制相结合以诱导静止或非分裂细胞状态。SMV可推广到任何途径和微生物宿主。这些合成代谢阀允许新的快速代谢工程策略，所述策略可用于生产可再生化学品和燃料以及可通过全细胞催化生产的任何产品。
在各种情况下，一种SMV可以指一种基因(或其蛋白质产物)的操纵。所述操纵可以控制基因的沉默和/或其蛋白产物的受控降解。在一些情况下，SMV的组合可以导致产率、速率和/或稳健性的改善，包括操纵两种基因(或其蛋白产物)。在一些情况下，工程微生物包含至少一种SMV。在一些情况下，工程微生物包含一种以上的SMV。在一些情况下，工程微生物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种SMV。
生物生产的方法和系统
本文提供了用于从生物制剂和小分子治疗剂到特种、大宗和商品化学品和生物燃料的稳健大规模生产分子的方法或系统。本文提供的方法或系统包括使用包含有限的一组代谢酶的工程微生物。在一些实施方案中，工程微生物包含至少一种具有降低的水平或活性的代谢酶。在一些实施方案中，工程微生物包含具有降低的水平或活性的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种代谢酶。本文提供的方法和系统可以减少对环境条件的代谢反应，并且可易于从小规模(例如mgs)生产转换到大规模(例如kgs)生产。本文提供的方法和系统可以减少与从小规模(例如mgs)转换到大规模(例如kgs)生产相关的时间和成本。
遗传修饰的微生物在本公开的范围内，其中所述微生物能够以特定速率产生衍生自任何关键代谢中间体的产物，所述关键代谢中间体包括但不限于丙二酰-CoA、丙酮酸、草酰乙酸、赤藓糖-4-磷酸、木酮糖-5-磷酸、α-酮戊二酸和柠檬酸盐，所述特定速率选自大于0.05g/gDCW-hr、0.08g/gDCW-hr、大于0.1g/gDCW-hr、大于0.13g/gDCW-hr、大于0.15g/gDCW-hr、大于0.175g/gDCW-hr、大于0.2g/gDCW-hr、大于0.25g/gDCW-hr、大于0.3g/gDCW-hr、大于0.35g/gDCW-hr、大于0.4g/gDCW-hr、大于0.45g/gDCW-hr、或大于0.5g/gDCW-hr。
在各种实施方案中，本发明包括培养系统，所述培养系统包含水性介质中的碳源和遗传修饰的微生物，其中所述基因修饰的生物体以选自大于0.05gDCW/L、0.1gDCW/L、大于1gDCW/L、大于5gDCW/L、大于10gDCW/L、大于15gDCW/L或大于20gDCW/L的量存在，例如当水性介质的体积选自大于5mL、大于100mL、大于0.5L、大于1L、大于2L、大于10L、大于250L、大于1000L、大于10,000L、大于50,000L、大于100,000L或者大于200,000L时，例如当水性介质的体积大于250L并且包含在钢容器内时。
碳源
生物生产培养基，在本发明中与重组微生物一起使用，必须含有适合生长和生产阶段的碳源或底物。合适的底物可包括但不限于葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、油、二氧化碳、一氧化碳、甲烷、甲醇、甲醛和甘油。预期所有上述碳底物及其混合物在本发明中适合作为碳源。
微生物
本文所描述和要求保护的特征可以提供在选自本文列表的微生物或其他合适的微生物中，所述微生物还包含一种或多种天然的、引进的或增强的产物生物生产途径。因此，在一些实施方案中，微生物包含内源产物生产途径(在一些这样的实施方案中，其可以被增强)，而在其他实施方案中，微生物不包含内源产物生产途径。
实施例描述了对某些细菌和真菌微生物的特定修饰和评价。本发明的范围不限于这些物种，而是通常适用于多种合适的微生物。
用于生物生产的合适宿主细胞或宿主微生物可以是原核的或真核的。合适的宿主细胞或宿主微生物可以是细菌，例如柠檬酸杆菌(Citrobacter)、肠杆菌(Enterobacter)、梭菌(Clostridium)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、气杆菌(Aerobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、曲霉菌(Aspergillus)、酵母菌(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、德巴利酵母(Debaryomyces)、毛霉菌(Mucor)、球拟酵母(Torulopsis)、甲基杆菌(Methylobacter)、埃希氏菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)和假单胞菌(Pseudomonas)。在一些实施方案中，宿主细胞或工程化细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，宿主细胞或工程化细胞是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
在某些方面，本文提供了经遗传修饰的微生物，其包含：包含至少一种用于产物生物合成的酶的生产途径，以及多种合成代谢阀的组合，以通过多种代谢途径可控制地减少或消除通量。在一些实施方案中，多种合成代谢阀中的每一种包含一个或多个基因，所述基因用于(i)至少一种基因的基因表达的受控沉默或(ii)至少一种蛋白质的受控蛋白水解失活。在一些实施方案中，在营养物耗尽时，在生产性稳定期中产物的生物合成速率增加，其中营养物的消耗诱导多种合成代谢阀。在一些情况下，基因表达的受控沉默通过RNA干扰、CRISPR干扰或转录抑制来实现。在一些情况下，受控的蛋白水解失活是通过特定蛋白酶进行的蛋白质切割或特定肽标签的靶向降解来实现的。在一些情况下，营养物是磷酸盐、氮、硫、镁或其组合。
在某些方面，本文提供了遗传修饰的微生物，其包含：至少一种用于产物生物合成的酶的生产途径，所述产物从以下代谢物之一生物合成：丙酮酸、乙酰乳酸、乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA或丙二酰-CoA；以及多种合成代谢阀的组合，其中所述多种合成代谢阀中的每一种包含fabI、gltA、lpd、zwf或udhA基因中的一种，所述基因用于(i)所述fabI、gltA、lpd、zwf或udhA基因中相应一种的基因表达的受控沉默，或(ii)由所述fabI、gltA、lpd、zwf或udhA基因中相应一种编码的蛋白质的受控蛋白水解失活。在一些实施方案中，在营养物耗尽时，在生产性稳定期中产物的生物合成速率增加，其中营养物的消耗诱导多种合成代谢阀。在一些实施方案中，产物是丙氨酸或其衍生物。在一些实施方案中，产物是甲羟戊酸或其衍生物。在一些实施方案中，产物是丙二酸或其衍生物。在一些实施方案中，营养物是磷酸盐、氮、硫、镁或其组合。
在某些方面，本文提供了遗传修饰的微生物，其包含：从丙酮酸产生丙氨酸的生产途径；以及多种合成代谢阀的组合，其中所述多种合成代谢阀中的每一种包含fabI、gltA、lpd、zwf或udhA基因中的一种，所述基因用于(i)所述fabI、gltA、lpd，zwf或udhA基因中相应一种的基因表达的受控沉默，或(ii)由所述fabI、gltA、lpd、zwf或udhA基因中的一种编码的蛋白质的受控蛋白水解失活。在一些实施方案中，在营养物耗尽时，在生产性稳定期中丙氨酸的生物合成速率增加，其中营养物的消耗诱导多种合成代谢阀。在一些实施方案中，营养物是磷酸盐、氮、硫、镁或其组合。
在一些情况下，遗传修饰的微生物是异源细胞。在一些情况下，本文提供了用于产生产物的异源细胞。在一些情况下，异源细胞包含工程化阀多核苷酸，用于介导受控降低在代谢途径中起作用的阀酶的表达。在一些情况下，受控降低阀酶表达减少了通过代谢途径的通量，其中受控降低阀酶表达诱导异源细胞的稳定期。在一些情况下，异源细胞还包含工程化生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生产物。在一些情况下，异源细胞包含工程化阀多核苷酸，用于介导受控降低在代谢途径中起作用的阀酶的表达，其中，与缺乏受控降低阀酶表达的细胞相比，响应于环境条件的改变，在稳定期的产物的产生速率被降低地更少。
在一些情况下，本文提供了用于产生产物的异源细胞，其中所述细胞包含：工程化阀多核苷酸，其用于介导受控降低在代谢途径中起作用的阀酶的表达，其中所述受控降低所述阀酶表达减少了通过所述代谢途径的通量，其中所述受控降低所述阀酶的表达诱导所述细胞的稳定期；和工程化生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；其中，与缺乏所述受控降低所述阀酶表达的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期的所述产物的产生速率被降低地更少。
在一些情况下，本文提供了包含降低的阀酶表达或活性的细胞，其中所述阀酶包含选自下组的酶：烯酰-ACP/CoA还原酶(fabI)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、硫辛酰胺脱氢酶(lpd)、柠檬酸合酶(gltA)、可溶性转氢酶(udhA)、NADH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)及其组合。
在一些情况下，本文提供了包含生产酶的细胞，其中生产酶包含选自下组的酶：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶(ald)、丙氨酸输出物(alaE)、NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapN)及其组合。
环境条件
环境条件可包括培养基和培养条件。可影响生产的环境因素可以是温度、pH值、酸度、乙醇、亚硫酸盐和营养物的可用性。
除了合适的碳源，例如选自本文公开的类型之一之外，生物生产培养基可含有合适的矿物质、盐、辅助因子、缓冲剂和本领域技术人员已知的适用于本公开内容的化学产品生物生产所需的培养物的生长和促进酶途径的其他组分。本发明的另一方面涉及包含本发明的遗传修饰的微生物和任选的补充物的培养基和培养条件。
通常，细胞在合适的培养基中在约25℃至约40℃的温度下生长，对于嗜热微生物，在高至70℃的温度下生长。合适的生长培养基已被充分表征并且是本领域已知的。
生物生产的合适pH范围为pH 2.0至pH 10.0，其中pH 6.0至pH 8.0是初始条件的典型pH范围。然而，特定实施方案的实际培养条件并不意味着受这些pH范围的限制。
生物生产可以在搅拌或不搅拌，在需氧、微需氧或厌氧条件下进行。
在一些情况下，环境条件的改变包括接触细胞的培养基的糖浓度的改变。在一些情况下，培养基的糖浓度的改变是糖浓度的增加。在一些其他情况下，糖浓度的改变是糖浓度的降低。在一些情况下，糖浓度增加是与培养基中的原始糖浓度相比增加1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％的糖。在一些情况下，糖浓度的降低是与培养基中的原始糖浓度相比降低1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％的糖。
在一些情况下，环境条件的改变包括接触细胞的培养基的氧合作用的改变。在一些情况下，培养基的氧合作用的改变是氧合作用的增加。在一些其他情况下，培养基的氧合作用的改变是氧合作用的降低。在一些情况下，氧合作用的增加是氧气的添加量比培养基中加入的氧的原始量多1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。在一些情况下，氧合作用的减少是氧气的添加量比培养基中加入的氧的原始量少1％至2％、2％至3％、3％至4％、4％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、或90％至100％。
生物生产反应器和系统
利用根据本发明的方法和/或组合物的发酵系统也在本发明的范围内。
可以将本文描述和/或提及的任何重组微生物引入工业生物生产系统，其中微生物以商业上可行的操作将碳源转化为产物。生物生产系统包括将这种重组微生物引入生物反应器容器中，生物反应器容器具有适合于生长重组微生物的碳源基质和生物生产培养基，并且将生物生产系统维持在合适的温度范围内(并且如果反应是需氧的或微需氧的，维持在合适的溶解的氧浓度范围内)一段合适的时间，以获得一部分底物分子按需转化成所选择的化学产物。生物生产可以在搅拌或不搅拌，在需氧、微需氧或厌氧条件下进行。工业生物生产系统及其操作是化学工程和生物工艺工程领域的技术人员所熟知的。在生物生产培养基中产生的产物的量通常可以使用本领域已知的许多方法测定，例如，高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)或GC/质谱(MS)。
遗传修饰、核苷酸序列和氨基酸序列
本公开内容的实施方案可以通过将表达载体引入宿主微生物中而产生，其中表达载体含有编码通常在宿主微生物中存在或不存在的酶的核酸序列。
遗传修饰宿主细胞的能力对于任何遗传修饰的(重组)微生物的产生都是必需的。转基因技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。可获得大范围的宿主接合质粒和抗药性标记。基于可在该宿主中起作用的抗生素抗性标记的性质，将克隆载体植入宿主生物。而且，如本文所公开的遗传修饰的(重组)微生物可以包含除通过质粒导入以外的修饰，包括对其基因组DNA的修饰。
更一般地，可以制备核酸构建体，其包含编码多肽的分离多核苷酸，所述多肽具有可操作地连接至一个或多个(几个)控制序列的酶活性，所述控制序列指导在与控制序列相容的条件下编码序列在微生物(例如大肠杆菌)中的表达。可以操纵分离多核苷酸以为多肽的表达做准备。在将多核苷酸序列插入载体之前对其进行操作可能是期望的还是必需的取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域中已经被很好地建立。
控制序列可以是合适的启动子序列，即宿主细胞识别的核苷酸序列，用于表达编码本公开多肽的多核苷酸。启动子序列可含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变体、截短的和杂合启动子，并且可获自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。用于修饰和利用重组DNA启动子序列的技术在本领域中已经被很好地建立。
对于本发明的各种实施方案，遗传操作可以被描述为包括各种遗传操作，包括旨在改变在任何相应途径中鉴定的酶的酶或酶活性的调节，并因此改变其最终活性的遗传操作。此类遗传修饰可以涉及转录、翻译和翻译后修饰，其导致在选定和/或鉴定的培养条件下酶活性和/或选择性的变化；和/或涉及提供额外的核酸序列，例如增加与产物生产相关的酶的拷贝数和/或突变体。实现此类遗传修饰的具体方法和方式是本领域技术人员公知的。
在各种实施方案中，为了更有效地起作用，微生物可包含一个或多个基因缺失。例如，在大肠杆菌中，编码乳酸脱氢酶(IdhA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)、丙酮酸甲酯裂解酶(pflB)、丙酮醛合酶(mgsA)、乙酸激酶(ackA)、乙醇脱氢酶(adhE)、clpXP蛋白酶特异性增强因子(sspB)、ATP依赖性Lon蛋白酶(Ion)、外膜蛋白酶(ompT)、arcA转录双重调节因子(arcA)和iclR转录调节因子(iclR)的基因可能被破坏，包括缺失。这种基因破坏(包括缺失)并不意味着限制，而是可以在各种实施方案中以各种组合实施。基因缺失可以通过本领域公知的许多方法完成，如将外源DNA引入宿主染色体的方法。
在各种实施方案中，为了更有效地起作用，微生物可包含一种或多种合成代谢阀，其由靶向用于受控蛋白水解、表达沉默或受控蛋白水解和表达沉默两者的组合的酶组成。在一些实施方案中，微生物可包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种合成代谢阀。例如，由一种基因编码的一种酶或由大肠杆菌中的许多基因编码的众多酶的组合可以被设计为合成代谢阀，以改变代谢并改善产物形成。大肠杆菌中的代表性基因可包括但不限于以下：fabl、zwf gltA、ppc、udhA、Ipd、sucD、aceA、pfkA、Ion、rpoS、tktA或tktB。应理解，本领域技术人员熟知如何鉴定这些基因和/或其他微生物物种中的其他基因的同源物。
对于本文提供的所有核酸和氨基酸序列，应理解包括这些序列的保守修饰变体，并且在其各种实施方案中，这些修饰变体还包括在本发明的范围内。功能等同的核酸和氨基酸序列(功能变体)可包括保守修饰的变体以及本领域普通技术人员公知的更广泛变化的序列，并且包含这些序列的微生物也是在本发明的各种实施方案的范围内，包含此类序列和/或微生物的方法和系统也是如此。
因此，如上文各部分所述，本公开的一些组合物、方法和系统包括提供遗传修饰的微生物，其包含主要中间体与合成代谢阀组合制备所需产物以重新分配通量的生产途径。
本发明的方面还涉及提供多种遗传修饰以改善微生物将选择的碳源转化为选定产物的总体性能。例如在实施例中显示了特定的组合，以基本上在更基本的遗传修饰组合上提高比生产率、体积生产率、效价和产率。除了上述遗传修饰之外，在各种实施方案中，还提供包括合成代谢阀的遗传修饰，以增加可在产物生产中消耗的辅助因子NADPH和/或NADH的库和可用性。
更普遍地，并且根据选择用于遗传修饰的微生物的特定代谢途径，可以制备任何遗传修饰子集以减少除了期望的发酵产物之外的发酵产物的细胞生产，所述发酵产物选自乙酸酯、乙偶姻、丙酮、丙烯酸、苹果酸酯、脂肪酸乙酯、类异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、其他乙酸酯、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸酯、异丁酸酯、2-OH-异丁酸酯、3-丁酸丁酯、乙醇、异丙醇、D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、衣康酸、乙酰丙酸、葡萄糖酸、戊二酸、己内酰胺、己二酸、丙醇、异丙醇、杂醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、甲酸、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸、马来酸和聚羟基丁酸酯。基因缺失可以如本文一般性公开的那样进行，并且也可以使用其他方法来实现除所需产物之外的所选发酵产物的所期望的降低的细胞产生。VI.A基因沉默
特别地，本发明描述了使用受控基因沉默，以帮助实现对受控的多阶段发酵过程中的代谢通量的控制。本领域已知有几种用于受控基因沉默的方法，包括但不限于mRNA沉默或RNA干扰、通过转录抑制子和CRISPR干扰的沉默。
在一些情况下，阀多核苷酸包含选自下组的多核苷酸：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述阀酶的基因的转录；降解多核苷酸，用于介导所述阀酶的细胞降解；及其组合。
在一些情况下，阀多核苷酸包含沉默多核苷酸，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述阀酶的基因的启动子的gRNA序列。
在一些情况下，阀多核苷酸进一步编码CRISPR酶，其中当与所述gRNA结合时，所述CRISPR酶特异性结合所述启动子序列。在一些情况下，CRISPR酶是催化失活的。
在一些情况下，阀多核苷酸包含降解多核苷酸，其中所述降解多核苷酸包含编码降解标签的序列，其中所述降解标记介导所述阀酶的降解。在一些情况下，阀多核苷酸的表达受细胞中磷酸盐可用性的调节。在一些情况下，生产多核苷酸的表达受细胞中磷酸盐可用性的调节。在一些情况下，细胞是大肠杆菌细胞。
受控蛋白水解
特别地，本公开内容描述了使用受控蛋白降解或蛋白水解以帮助实现对受控多阶段发酵过程中的代谢通量的控制。本领域已知有几种用于受控蛋白降解的方法，包括但不限于通过特定蛋白酶进行的靶向蛋白切割和通过特定肽标签受控靶向蛋白的降解。可以使用用于受控蛋白降解的大肠杆菌clpXP蛋白酶的系统。该方法依赖于添加特定的C-末端肽标签，例如DAS4(或DAS+4)标签。在表达特异性增强的伴侣蛋白sspB之前，具有该标签的蛋白不会被clpXP蛋白酶降解。sspB通过clpXP蛋白酶诱导DAS4标记蛋白的降解。另外，许多位点特异性蛋白酶系统是本领域熟知的。可以将蛋白改造成含有给定蛋白酶的特定靶位点，然后在蛋白酶的受控表达后切割该蛋白。在一些实施方案中，切割可预期导致蛋白失活或降解。例如，可以将N-末端序列添加至目标蛋白，以实现clpS依赖性clpAP降解。此外，该序列可进一步被另外的N-末端序列掩盖，所述N-末端序列可被控制例如通过ULP水解酶切割。这允许依赖于水解酶表达的受控的N-规则降解。因此，可以在N-末端或C-末端标记用于受控蛋白水解的蛋白质。
使用N-末端标签还是C-末端标签将在很大程度上取决于在受控的降解开始之前任一标签是否影响蛋白功能。本发明描述了使用受控蛋白降解或蛋白水解，以帮助实现对在大肠杆菌中受控多阶段发酵过程中的代谢通量的控制。本领域已知有几种用于在其他微生物宿主中受控蛋白降解的方法，所述微生物宿主包括广泛的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、酵母甚至古细菌。特别地，用于受控蛋白水解的系统可以从天然微生物宿主中转移并用于非天然宿主中。
合成代谢阀控制
特别地，本公开描述了使用合成代谢阀，以在多阶段发酵过程中控制代谢通量。本领域已知有许多方法可诱导可用于多阶段发酵的各阶段之间的转换的方法。这些诱导剂包括但不限于人造化学诱导剂，包括：四环素、无水四环素、乳糖、IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)、阿拉伯糖、棉子糖、色氨酸和许多其它诱导剂。将这些众所周知的诱导剂的使用与基因表达沉默和/或受控蛋白水解的控制联系起来的系统可以结合到遗传修饰的微生物系统中，以控制多阶段发酵过程中生长与生产阶段之间的转变。
此外，可能需要通过消耗一种或多种限制性营养物来控制多阶段发酵中生长与生产之间的转变，所述限制性营养物在生长期间消耗。限制营养物可包括但不限于：磷酸盐、氮、硫和镁。响应这些营养限制的天然基因表达系统可用于将基因表达沉默和/或受控蛋白水解的控制可操作地连接到多阶段发酵过程中生长与生产阶段之间的转换。
产物
在一些实施方案中，本文提供了用于产生产物的微生物或细胞。在一些情况下，该产物包含3-羟基丙酸。在一些情况下，该产物包含氨基酸。在一些情况下，氨基酸包含丙氨酸。在一些情况下，丙氨酸是L-丙氨酸。在一些情况下，丙氨酸是D-丙氨酸。在一些情况下，丙氨酸的产生速率为至少0.1g/L/hr、0.2g/L/hr、0.3g/L/hr、0.4g/L/hr、0.5g/L/hr、0.6g/L/hr、0.7g/L/hr、0.8g/L/hr、0.9g/L/hr、1.0g/L/hr、1.1g/L/hr、1.2g/L/hr、1.3g/L/hr、1.4g/L/hr、1.5g/L/hr、1.6g/L/hr、1.7g/L/hr、1.8g/L/hr、1.9g/L/hr、2.0g/L/hr、2.5g/L/hr、3.0g/L/hr、3.5g/L/hr、4.0g/L/hr、4.5g/L/hr、5.0g/L/hr、5.5g/L/hr、6.0g/L/hr、7.0g/L/hr、8.0g/L/hr、9.0g/L/hr、或至少10g/L/hr。
在一些情况下，24小时后的丙氨酸效价可以是0至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至1.5g/L、1.5g/L至2g/L、2g/L至2.5g/L、2.5g/L至3g/L、3g/L至3.5g/L、3.5g/L至4g/L、4g/L至4.5g/L、4.5g/L至5g/L、或5g/L至10g/L。与仅通过改变生产途径酶的表达水平(通过改变启动子)所提供的丙氨酸生产的动态范围相比，通过SMV提供的丙氨酸生产的动态范围可增加高达4倍。在一些情况下，与仅通过改变生产途径酶的表达水平所提供的丙氨酸生产的动态范围相比，通过SMV提供的丙氨酸生产的动态范围可增加高达2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一些情况下，微生物中的生产多核苷酸编码丙氨酸输出物。在一些情况下，丙氨酸输出物是alaE。
在一些情况下，产物包含甲羟戊酸。在一些情况下，甲羟戊酸的产生速率为至少0.1g/L/hr、0.2g/L/hr、0.3g/L/hr、0.4g/L/hr、0.5g/L/hr、0.6g/L/hr、0.7g/L/hr、0.8g/L/hr、0.9g/L/hr、1.0g/L/hr、1.1g/L/hr、1.2g/L/hr、1.3g/L/hr、1.4g/L/hr、1.5g/L/hr、1.6g/L/hr、1.7g/L/hr、1.8g/L/hr、1.9g/L/hr、2.0g/L/hr、2.5g/L/hr、3.0g/L/hr、3.5g/L/hr、4.0g/L/hr、4.5g/L/hr、5.0g/L/hr、5.5g/L/hr、6.0g/L/hr、7.0g/L/hr、8.0g/L/hr、9.0g/L/hr或至少10g/L/hr。
方法
本文提供了用于在工程微生物中大规模生产产物的方法。本文还提供了用于工程微生物以高通量方式大规模生产产物的方法。
在一些情况下，本文提供了一种方法，包括：培养多个细胞株，其中所述多个细胞株中的每个细胞株均包含(i)工程化阀多核苷酸，用于介导受控降低在代谢途径中起作用的阀酶的表达，其中所述阀酶的表达的受控降低减少了通过所述代谢途径的通量；(ii)工程化生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶产生所述产物；其中所述多个细胞株的每个细胞株与另一细胞株不同，不同之处在于所述工程化阀多核苷酸或所述工程化生产多核苷酸中的至少一个的序列；测量由所述多个细胞株中的每一个产生的所述产物的水平；并根据所述产物的所述水平选择细胞株。在一些实施方案中，该方法还包括所述选择的细胞株在生物反应器中生长。在一些实施方案中，包含所述选择的细胞株的培养基的体积为至少100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml或至少1000ml。在一些实施方案中，培养基的体积为至少1L。
在一些实施方案中，阀多核苷酸包含选自下组的多核苷酸：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述阀酶的基因的转录；和降解多核苷酸，用于介导所述阀酶的细胞降解；及其组合。在一些实施方案中，所述多个细胞株中的第一细胞株和第二细胞株包含沉默多核苷酸。在一些实施方案中，沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述阀酶的基因的启动子的gRNA序列。在一些实施方案中，所述第一细胞株和第二细胞株的gRNA序列不同。在一些实施方案中，所述第一细胞株和第二细胞株的由所述gRNA识别的启动子不同。在一些实施方案中，第一细胞株包含所述沉默多核苷酸和所述降解多核苷酸，并且第二细胞株包含所述沉默多核苷酸但不包含所述降解多核苷酸。在一些实施方案中，所述第二细胞株中的产物水平高于所述第一细胞株。在一些实施方案中，所述第一细胞株中的产物水平高于所述第二细胞株。在一些实施方案中，阀酶包含选自下组的酶：烯酰-ACP/CoA还原酶(fabI)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、硫辛酰胺脱氢酶(lpd)、柠檬酸合酶(gltA)、可溶性转氢酶(udhA)、NADH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)及其组合。在一些实施方案中，生产酶包含选自下组的酶：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶(ald)、丙氨酸输出物(alaE)、NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapN)及其组合。
在一些实施方案中，产物选自甲酰戊酸、3-羟基丙酸、氨基酸及其组合。在一些实施方案中，氨基酸是丙氨酸。在一些实施方案中，丙氨酸是L-丙氨酸。在一些实施方案中，丙氨酸是D-丙氨酸。
在一些实施方案中，与缺乏受控降低所述阀酶表达的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期产物的产生速率被降低更少。
在一些实施方案中，环境条件的改变包括接触所述细胞的培养基的糖浓度的改变。
在一些实施方案中，环境条件的改变包括接触所述细胞的培养基的氧合作用的改变。
在一些情况下，本文提供了产生细胞产物的方法，包括：在培养基中培养异源细胞，其中所述异源细胞包含：(i)工程化阀多核苷酸，用于介导受制降低在代谢途径中起作用的阀酶的表达，其中所述受控降低所述阀酶的表达减少了通过所述代谢途径的通量，其中所述受控降低所述阀酶的表达诱导所述细胞的稳定期；(ii)工程化生产多核苷酸，用于介导受控增加生产酶的表达，所述生产酶用于产生所述产物；其中，与缺乏所述受控降低所述阀酶的表达的细胞相比，响应于环境条件的改变，在所述稳定期所述产物的产生速率被降低更少。在一些实施方案中，该方法还包括改变所述环境条件。在一些实施方案中，环境条件包括所述培养基的糖浓度，改变所述环境条件包括增加或降低所述糖浓度。在一些情况下，所述糖是葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、木糖、甘露糖或其组合。在一些情况下，所述糖是葡萄糖。在一些情况下，环境条件包括所述培养基的氧浓度，改变所述环境条件包括增加或降低所述氧浓度。在一些情况下，所述培养在生物反应器中进行。
在一些情况下，所述培养基的体积为至少100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml或至少1000。例如，所述培养基的体积至少为1L。在一些情况下，所述产物包含3-羟基丙酸。在一些情况下，所述产物包含氨基酸。在一些情况下，所述氨基酸包含丙氨酸。
在一些情况下，所述丙氨酸的产生速率为至少0.1g/L/hr、0.2g/L/hr、0.3g/L/hr、0.4g/L/hr、0.5g/L/hr、0.6g/L/hr、0.7g/L/hr、0.8g/L/hr、0.9g/L/hr、1.0g/L/hr、1.1g/L/hr、1.2g/L/hr、1.3g/L/hr、1.4g/L/hr、1.5g/L/hr、1.6g/L/hr、1.7g/L/hr、1.8g/L/hr、1.9g/L/hr、2.0g/L/hr、2.5g/L/hr、3.0g/L/hr、3.5g/L/hr、4.0g/L/hr、4.5g/L/hr、5.0g/L/hr、5.5g/L/hr、6.0g/L/hr、7.0g/L/hr、8.0g/L/hr、9.0g/L/hr、或至少10g/L/hr。在一些情况下，所述生产多核苷酸编码丙氨酸输出物。在一些情况下，所述丙氨酸输出物是alaE。在一些情况下，所述培养发生少于20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时或小于100小时。在一些情况下，所述培养发生少于10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时或小于45小时。在一些情况下，所述培养发生少于30小时。
在一些情况下，所述产物包含甲羟戊酸。在一些情况下，所述甲基戊酸的产生速率为至少0.1g/L/hr、0.2g/L/hr、0.3g/L/hr、0.4g/L/hr、0.5g/L/hr、0.6g/L/hr、0.7g/L/hr、0.8g/L/hr、0.9g/L/hr、1.0g/L/hr、1.1g/L/hr、1.2g/L/hr、1.3g/L/hr、1.4g/L/hr、1.5g/L/hr、1.6g/L/hr、1.7g/L/hr、1.8g/L/hr、1.9g/L/hr、2.0g/L/hr、2.5g/L/hr、3.0g/L/hr、3.5g/L/hr、4.0g/L/hr、4.5g/L/hr、5.0g/L/hr、5.5g/L/hr、6.0g/L/hr、7.0g/L/hr、8.0g/L/hr、9.0g/L/hr、或至少10g/L/hr。在一些情况下，所述培养发生少于20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时或小于100小时。在一些情况下，所述培养发生少于80小时。
在一些实施方案中，阀多核苷酸包含选自下组的多核苷酸：沉默多核苷酸，用于抑制编码所述阀酶的基因的转录；降解多核苷酸，用于介导所述阀酶的细胞降解；及其组合。在一些情况下，阀多核苷酸包含沉默多核苷酸，所述沉默多核苷酸包含指导RNA(gRNA)，所述指导RNA包含识别编码所述阀酶的基因的启动子的gRNA序列。在一些情况下，阀多核苷酸进一步编码CRISPR酶，其中当与所述gRNA结合时，所述CRISPR酶特异性结合所述启动子序列。在一些情况下，CRISPR酶是催化失活的。在一些情况下，阀多核苷酸包含降解多核苷酸，其中所述降解多核苷酸包含编码降解标记的序列，其中所述降解标记介导所述阀酶的降解。在一些情况下，所述阀多核苷酸的表达受磷酸盐的调节。在一些情况下，所述生产多核苷酸的表达受磷酸盐的调节。在一些情况下，所述细胞是大肠杆菌细胞。
生物生产的优化
基于生物技术的发酵工艺已经被成功开发以生产各种物质，从生物制剂和小分子疗法到特种、大宗和商业化学品，甚至下一代生物燃料1-3。近年来，由于多种技术发展，这些工艺取得了快速进展4，5。使用合成生物学生产新分子从未如此简单。尽管取得了这些进展，但将分子从概念验证(POC)带到商业上有意义的水平仍然是一项重大挑战。菌株优化或克服“mg”至“kg”障碍仍然是生物过程成功商业化的关键障碍。在证实POC之后，成功的生物过程开发通常需要对微生物菌株和发酵优化进行冗长的迭代6-8(图1B)。这些优化努力通常是针对目的产物或宿主菌株。合成生物学的通量超过了代谢工程的通量，部分原因是缺乏广泛有用的工具来以高通量方式对工程微生物菌株进行有意义和标准化的优化9。
关于菌株优化和移动超过POC水平，存在许多挑战，其中最重要的是潜在设计空间的尺寸和复杂性。与更简单的基因电路相反，所述基因电路适用于电路模型10-12，代谢网络高度互联。每种代谢物和/或酶都可与其他代谢物相互作用。这种组合复杂性导致巨大的潜在设计空间，这对于开发标准化设计原则所需的各种系统实验是难以处理的(补充材料，表1)。尽管读取和编写DNA的显著进步和降低的成本导致新的高通量DNA装配和微生物菌株构建方法，但解决这样大的设计空间的挑战仍然存在13-16。并不意外的是，涉及菌株工程的新合成生物学技术经常被证明具有易于筛选或选择的表现13，17-19。其中大多数仅限于集中优化一组有限的途径特异性酶。
克服该挑战的复杂性的一种方法是使用用于生物生产的体外系统，所述系统包含有限的一组代谢酶。然而，这些方法存在的挑战之处在于在复制体内系统的关键优势，包括辅助因子再循环和能量产生20，21。处理这种复杂性的另一种方法是开发更快的菌株评估的筛选方法22。然而，单独增加通量永远不会评估潜在设计空间的完整复杂性。此外，从高通量研究中获得的结果通常不会转化为不同的环境，即使在相同的微生物中也是如此20，23，24。小规模筛选不易转化为大规模的生产过程，这导致紧接着菌株优化的过程优化的迭代(图1B)。这是因为新陈代谢受到严格调节，并且有时可以对环境条件的变化做出剧烈反应25 20 ，26-23。缺乏环境稳健性传统上是使得基于发酵的过程的规模扩大变得困难的一个因素。这个问题导致了开发用于缩小规模的专用复杂微反应堆系统，所述系统仅在通量上提供了适度改进20，29-31。
仍然非常需要广泛适用的、快速且稳健的方法，以大大减少从“mgs”到“kgs”的转换时间和成本。理想情况下，方法应该适用于多种产物和生产宿主。本文提供了可通用的高通量菌株优化方法的开发，所述方法使得能够使用真正可扩展的标准化发酵方法。如图1B的版b所示，该方法涉及活性代谢网络的动态最小化32，其结合了体外方法常见的较小设计空间的益处，同时保持体内生物合成的益处20。我们可以分离并专注于生产所需的最小代谢网络。利用合成代谢阀(SMV)的组合32，33(图2A-D)，我们可以在标准化的2阶段发酵过程中动态最小化代谢网络并重新定向代谢通量20。
该方法可以降低问题的复杂性和相关设计空间的大小，极大地加速了优化。在各种实施方案中，本文证明了动态代谢网络最小化可改善途径通量，超过仅通过生产途径修饰可实现的途径通量(图3A-K和图6A-H)。同时，我们证明动态网络最小化减少了对环境条件的代谢响应，这增加了工程菌株的稳健性和可扩展性(图3A-K和图5A-J)。
实施例
在大肠杆菌中的2阶段合成代谢阀
我们首先研发了在大肠杆菌中的改进的合成代谢阀(SMV)，其能够在2阶段过程中动态降低蛋白水平。这些SMV可用于降低关键代谢酶的水平(或降低关键代谢酶的酶活性)，并依赖于受控蛋白水解或基于CRISPR的基因沉默或蛋白水解和沉默的组合(图2A-D)32-35。可以使用磷酸盐消耗作为环境触发物来实施细胞生长和动态代谢控制。磷酸盐可作为触发物的理想候选者，作为基本培养基中最重要的成分之一。此外，通过磷酸盐消耗在大肠杆菌中诱导的稳定期保留了糖酵解摄取以及增加的蛋白表达31，36。对磷酸盐有反应的许多启动子系统在大肠杆菌以及包括酿酒酵母在内的其他微生物中得到充分表征37。评估磷酸盐响应启动子变体(补充材料，第1节)，随后将其用于2阶段控制。
使用天然类型I-E级联CRISPR系统在大肠杆菌中实施SMV，用于诱导基因沉默34，38，而受控蛋白水解通过在靶蛋白上引入C末端degron标签来诱导，两者均如先前所示63，33(图2A)。将这些系统引入最初设计的最小的副产物形成和高生物量产率和生长速率的宿主菌株(大肠杆菌菌株DLF_0025，补充材料，第3节)24，27，28 39。使用该方法，如图2A-D证明，可在两阶段过程中控制蛋白水平，例如通过在基本培养基中用磷酸盐消耗来转化“开启”GFPuv和“关闭”mCherry荧光蛋白。基因沉默与蛋白水解的组合导致最大的蛋白降解速率(图2C-D)。基因沉默和蛋白水解对衰变率的具体影响可能取决于宿主、靶基因/酶及其特定的天然更新率和表达水平40，41。
代谢网络最小化导致通量的改善
成功证明了在2阶段过程中蛋白水平的动态控制，我们转向研究通过受控降低单独和组合的关键核心代谢酶来动态控制大肠杆菌中的代谢通量。通过网络中热力学上有利的“定型”反应减少通量预计会导致网络代谢物库的增加(补充材料，第5节)，并因此导致通路通量的变化。鉴定了核心代谢途径的关键步骤中的酶，并选择其作为初始SMV靶标，选择丙氨酸作为初始测试产物(图3A-K)。构建一组用于丙氨酸生产的菌株(图3A)，其包含NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶(ald*)42。制备具有在核心代谢酶中的SMV多种组合的变体，具有用于诱导蛋白水解的修饰或基因沉默或两者皆有。(补充材料，第3节)。将在2阶段过程中评估的具有SMV的菌株组在一起被鉴定为“阀”菌株。在基于标准化的2阶段96孔板的微发酵剂中评价丙氨酸“阀”菌株板(总共～500株)的丙氨酸生产(补充材料，第7节)。生产24小时后的丙氨酸效价在图3B-C中给出。简而言之，24小时后丙氨酸效价范围为～0g/L至～4.7g/L，并且如所预期的，其相对于SMV的数量和组合而言显著不同；与没有SMV和单独的丙氨酸途径的对照相比，多种SMV组合导致改善的性能。在一些情况下，24小时后的丙氨酸效价可以是0至0.5g/L、0.5g/L至1g/L、1g/L至1.5g/L、1.5g/L至2g/L、2g/L至2.5g/L、2.5g/L至3g/L、3g/L至3.5g/L、3.5g/L至4g/L、4g/L至4.5g/L、4.5g/L至5g/L、或5g/L至10g/L。与仅通过改变生产途径酶的表达水平(通过改变启动子)所提供的丙氨酸生产的动态范围相比，SMV提供的丙氨酸生产的动态范围可增加高达4倍(补充材料，第7节)。在一些情况下，与仅通过改变生产途径酶的表达水平所提供的丙氨酸生产的动态范围相比，通过SMV提供的丙氨酸生产的动态范围可增加高达2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。重要的是，单独和/或组合使用蛋白水解或沉默对生产具有显著影响，这表明对于每种酶，使用SMV微调活性是至关重要的。然后，在基本培养基中评估微发酵菌中表现最佳的菌株之一，2阶段，1L发酵，具有10gdcw/L生物质(图3F)，结果是，在生产48小时后产生80g/L 100％L-丙氨酸，产率为0.8g/g。通过过表达丙氨酸输出物(由大肠杆菌alaE基因编码43)进一步改造该菌株，在生产27小时后产生147g/L 100％L-丙氨酸，产率在理论产率误差范围内，～1g/g(图3G)。
微发酵的稳健性
一个核心假设是，通过在生产阶段限制新陈代谢，菌株性能不仅可以被改善，而且可以对环境(过程)条件更加稳健。简而言之，碳流量通过最小化的代谢网络受到限制，这种网络不再能够通过对环境的细胞反应来适应。为了测试该假设，在不同的“微发酵”工艺条件下评估菌株。葡萄糖浓度和氧转移率(在传统发酵中影响菌株性能的关键过程变量26)是变化的(图3D，补充材料，第8节)，并测量丙氨酸产量。建立稳健性评分(RS)以量化环境稳健性。较大的RS评分表明更稳健的菌株。虽然相对标准偏差(RSD)是稳健性的一个度量，但我们希望结合更严格的稳健性度量，其还结合了菌株在所有工艺条件下具有的最大偏差(MaxDev)(RS，公式(1))。
图3E中给出了48个丙氨酸“阀”菌株子集的稳健性评分。这些实验研究的结果列于补充材料第8节中。使用对于稳健性RS＞0.6的截止值进行Chi2分析以确定在统计学上有助于过程稳健性的关键SMV。fabI的蛋白降解是稳健性的主要贡献因素(Chi2＝13.85，P值<0.001)，因此，具有fabI的蛋白降解的“阀”菌株用于进一步研究。此外，发现具有gltA的蛋白降解和/或fabI和gltA的蛋白降解的组合的“阀”菌株尽管具有较大P值，也是稳健性的重要贡献者。
与传统生长相关菌株相比的2阶段“阀”菌株
为了将由SMV实现的2阶段方法与更传统的生长相关过程进行比较，我们构建了5个菌株，具有组成型表达的丙氨酸脱氢酶(ald*)，能够生长相关产生丙氨酸。这些生长相关的菌株在用于驱动ald*表达的启动子的强度上有所不同44(补充材料，第2节)，但使用了相同的常见无阀对照宿主菌株。图5显示了2阶段过程中“阀”菌株与传统发酵中的“生长相关(GA)”菌株在微量滴定器(图5A-D)和1L(图5E-J)规模上的直接比较结果。在微发酵菌中，2阶段“阀”菌株在效价和过程稳健性方面优于GA菌株。将来自微发酵分析的最稳健的GA菌株(也具有最高生产水平)与在具有不同工艺条件的1L发酵中的稳健“阀”菌株进行比较。“阀”菌株在评估的所有工艺条件下均显示出一致的性能(图5E)，与微发酵菌的结果一致，其中GA菌株具有根据过程显著的性能变异性。我们假设在“阀”菌株的“微”规模和1L规模发酵中观察到的增加的环境稳健性将导致可预测的规模扩大，其中在高通量微发酵中具有改进性能的菌株将确实在受控生物反应器中具有改善的性能。为了评估系统的可扩展性，在标准化的2阶段1L发酵中评估微发酵中具有统计学差异性能(P值<0.001)的“阀”丙氨酸菌株，并与将其所有GA菌株进行比较。对于2阶段“阀”菌株，在“微发酵”中观察到的统计学上有差异的性能已经可预测地扩展到1L发酵。这与使用GA菌株获得的结果形成对比，在使用GA菌株获得的结果中未观察到微发酵与1L性能之间的相关性(图5G-H)。
产物的多样性
随着丙氨酸菌株成功且可预测地扩增到1L完全仪器化的发酵中，我们开始验证用于另外产物：甲羟戊酸的技术平台。为此，构建了额外的动态生产途径用于甲酰戊酸生物合成(图6A)。构建了一组编码三种酶功能的双基因生产途径质粒用于甲羟戊酸生产，所述质粒分别由编码两种不同功能的乙酰CoA乙酰转移酶、NADPH依赖性HMG-CoA还原酶和HMG-CoA合酶的粪肠球菌mvaE和mvaS基因组成。使用突变体mvaS基因，mvaS(A110G)具有更高活性45，46。最初评估生产质粒在对照菌株中的甲羟戊酸生产(图6B)。然后将生产最好的质粒导入各种工程“阀”菌株中并在微发酵中进行评估(图6C)。然后在1L发酵中评估统计学上有差异的菌株的子集以评估可扩展性(图6D)，其与丙氨酸的情况一样是可预测的。在一些情况下，表现菌株在78小时的生产中产生有意义的效价和产率，97g/L，产率为0.46g/g(理论产率的84％)(图6E)。该甲羟戊酸菌株的比生产率比先前报道的最佳结果高4倍以上47(补充材料，第9节)。
讨论
在过去，代谢工程化小分子生产的一些最成功的努力已经利用厌氧代谢的力量将产物形成与生长相结合。这允许传统设计和选择工业菌株以产生许多产物，包括乙醇、琥珀酸、乳酸和异丁醇，它们利用进化和选择的力量来达到工程网络中的最佳代谢通量48，49。虽然生长相关的生产与厌氧代谢没有严格的联系，但生长相关性极大地限制了可以使用合成生物学制备的不同分子的数量和种类。通用、强大且易于访问的非生长相关平台将极大地简化各种产物的优化和规模扩大。
与依赖于对环境触发的自然代谢响应以用于生产改进的大多数现有的2阶段过程相比，我们已经采取了下一步骤，主动最小化基本代谢网络并将代谢物重定向到目标产物。在这项工作中，许多目标必需的核心代谢途径传统上都不受工程策略的限制，因为删除必需的酶与传统发酵中的生长和生长相关的生产是矛盾的。动态最小化的代谢网络还导致对环境变量的增强的稳健性，使得能够将高通量小规模研究如实地转化为更大的仪器化发酵。该领域的当前范例是通过开发用于增强过程控制的小规模、定制设计的微反应器来提高相关菌株评估的通量。相比之下，我们的方法是朝着一个新方向迈进，这个方向涉及工程微生物代谢对过程变化不太敏感，简化了高通量实验。
除了稳健性之外，我们已经证明，在最小代谢网络中对必需酶的组合修饰可导致生产的显著改善，特别是与单独改变生产途径表达水平相比时。这些性能的巨大变化是由于关键核心代谢节点的有限子集的变化，这可能导致改变的代谢物水平。与先前动态控制酶水平的方法相比，我们通过基因沉默和蛋白水解的组合证明了蛋白水平微调的改进潜力50。由于稳定期细胞不能通过细胞分裂稀释现有蛋白质，因此这种双重方法是有意义的。任何给定酶水平的具体控制当然也取决于天然更新机制。起初看来，将基因沉默和蛋白水解两者结合在一起并不总能导致改善的性能，即“更多并不总是更好”，这仍然是令人惊讶的。可能需要未来的努力来解释这些结果，这可能是由于需要维持较大网络中的最小通量，或者是不属于最小网络的一部分但是影响网络活性的关键调控代谢物水平变化的结果。
虽然所展示的方法可以解决大多数生物生产过程常见的许多问题，但仍存在许多产物特异性的挑战。产物或途径代谢物的毒性可能会限制效价或产生速率。在低效价下可为最佳的最小网络在升高的效价下可能不是最佳的。此外，改进酶的工程化通常是许多“mg”至“kg”工程中的一项挑战。
预期使该方法适应其他微生物宿主的可行性。新宿主的关键要求包括快速和稳健的生长阶段、设计动态控制蛋白水平的能力、以及代谢活跃的稳定期。许多微生物已经很好地表征了生产性稳定期代谢的营养物质触发物36，例如罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)物种、耶氏酵母属(Yarrowia)物种和其他物种的氮限制51 52。即使这些要求不能自然地满足，它们也可以被设计到宿主例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或其他微生物中，每种潜在的宿主都呈现出独特的挑战和相应的解决方案。
未来的努力可以旨在将该平台应用于具有更复杂的生产途径的分子。这种方法可以为代谢工程师和合成生物学家提供快速优化的易处理途径，代谢工程师和合成生物学家希望超越POC水平并开始以更具工业相关性的速率、效价和产率来解决问题。
方法
试剂和培养基
除非另有说明，否则所有材料和试剂都是可能的最高等级并购自Sigma(密苏里州圣路易斯)。C13标记的丙氨酸(2，3-13C2，99％)(型号#CLM-2734-PK)购自剑桥同位素实验室公司(Cambridge Isotope Laboratories，Inc.)(马萨诸塞州图克斯伯里)。Luria肉汤用于常规菌株和质粒的繁殖与构建。工作抗生素浓度如下：氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(35μg/mL)、氯霉素(35μg/mL)、大观霉素(100μg/mL)、博来霉素(zeocin)(50μg/mL)、庆大霉素(10μg/mL)、杀稻瘟菌素(100μg/mL)、嘌呤霉素(150μg/mL)、四环素(5μg/mL)。使用具有低盐的Luria肉汤(Lennox制剂)来选择博来霉素、杀稻瘟菌素和嘌呤霉素抗性克隆。另外，为了嘌呤霉素的选择，将磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)加入LB Lennox培养基中至终浓度为50mM。包含原液的培养基配方在补充材料第7节中描述。
大肠杆菌菌株构建
用于菌株构建和确认的寡核苷酸和合成线性DNA(GblocksTM)均在补充材料，第3节中给出，它们获自集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies，IDT)(爱荷华城珊瑚村(Coralville，IA))。菌株BW25113获自耶鲁基因库中心(CGSC http：//cgsc.biology.yale.edu/)。菌株BWapldf是来自George Chen(清华大学)的赠品62。使用标准重组工程方法进行染色体修饰63，在携带C末端DAS+4标签的抗生素抗性盒的情况下使用直接抗生素盒整合，或严格遵循Li等人的方案通过无痕tet-sacB选择和反选择64。重组工程质粒pSIM5和tet-sacB选择/反选择标记盒是唐纳德法院(Donald Court)的赠品(NCI，https：//redrecombineering.ncifcrf.gov/court-lab.html)。简言之，根据制造商的说明，最初在94℃变性10分钟，然后进行94℃15秒、52℃15秒、72℃5分钟的35个循环，使用Econotaq(Lucigen Middleton，WI)提供～50bp侧翼同源序列的适当寡核苷酸扩增tet-sacB选择/反选择盒。从IDT获得用于“固化(curing)”tet-sacB盒或直接整合(当存在抗生素标记物时)的盒子作为gBlock。在sspB基因缺失的情况下，从Keio Collection菌株JW3197-165扩增用卡那霉素抗性替换的开放阅读框缺失，并使用标准方法将开放阅读框缺失移至合适的背景菌株。使用pCP20质粒固化卡那霉素抗性盒，留下frt痕63，65。通过PCR扩增和测序(Eton Biosciences)使用成对的寡核苷酸确认染色体修饰，所述寡核苷酸位于整个区的侧翼，或者在DAS+4标签插入插入的寡核苷酸5′和电阻盒内部的寡核苷酸的情况下。
大肠杆菌质粒构建
用于设计和构建CASCADE引导阵列的引物列于补充材料，第6节中。基因沉默引导阵列由一系列pCASCADE质粒表达。通过用绝缘的低磷酸盐诱导的ugpB启动子74交换在pcrRNA.Tet中pTet的启动子73来制备pCASCADE-对照质粒。所有基因的启动子序列均获自EcoCyc数据库(https：//ecocyc.org/)。为了设计CASCADE引导阵列，鉴定了目标启动子-35或-10盒附近的CASCADE PAM位点，选择PAM位点3′末端处的30bp作为指导序列，并按照制造商的方案使用Q5定点突变(NEB，MA将其克隆到pCASCADE质粒中，制造商的方案中的修改之处为在Q5PCR反应中加入5％v/v DMSO。PCR循环如下：扩增包括98℃30秒的初始变性步骤，接下来以98℃10秒、72℃30秒、72℃1.5分钟(延伸率为30秒/kb)进行25个循环，然后在72℃下最终延伸2分钟。将2μL PCR混合物用于10μL KLD反应，该反应在室温下进行1小时后，将1μL KLD混合物用于电穿孔。
通过PCR依次扩增每个较小的引导质粒的互补半部分，随后进行DNA组装，制备pCASCADE引导阵列质粒。pCASCADE-对照载体用作模板。使用Q5超保真2X Master Mix(NEB，MA)制备具有两个或更多个引导阵列的pCASCADE质粒。PCR循环如下：扩增包括98℃30秒的初始变性步骤，接下来以98℃10秒、66℃30秒、72℃45秒(延伸率为30秒/kb)进行35个循环，然后在72℃下最终延伸2分钟。通过凝胶提取纯化PCR产物，使用20μL超纯水洗脱50μL PCR反应纯化物。将1μL每种洗脱的PCR产物用于10μL Gibson组装(GibsonAssembly)(NEB，MA)，其通过在50℃下孵育15分钟完成。将1μL Gibson Assembly混合物用于电穿孔。
通过低磷酸盐诱导型启动子从高拷贝质粒表达生产途径酶。使用来自IDT网站的密码子优化工具对生产途径基因序列进行密码子优化，针对每种途径，设计并从IDT购买磷酸化的G-blocksTM。按照制造商的方案(NEB，MA)使用 HiFi DNA AssemblyMaster Mix来组装质粒。pSMART-HC-Kan(Lucigen，WI)用作所有途径质粒的骨架。通过DNA测序(Eton Bioscience，NC)确认所有质粒序列并将其在Addgene保存。
大肠杆菌微型生物反应器(BioLector)
将每个菌株的单菌落接种到含有适当抗生素的5mL LB中，并在37℃、220rpm下培养9小时或直至OD600达到＞2。将500μL培养物接种到含有适当抗生素的10mL SM10培养基中，在37℃、220rpm下、在方形摇瓶(CAT#：25-212，Genesee Scientific，Inc.，San Diego，CA)中培养16小时。通过离心沉淀细胞，并使用FGM3培养基将培养密度标准化至OD600＝5。使用高质量传递FlowerPlate(CAT#：MTP-48-B，m2p-labs，德国)在微型生物反应器(m2plabs，Baesweiler，Germany)中获得生长和荧光测量值。将40μL OD标准化培养物接种到760μL含有适当抗生素的FGM3培养基中。微型生物反应器设置如下：RFP增益＝100，GFP增益＝20，生物量增益＝20，振荡速度＝1300rpm，温度＝37℃，湿度＝85％。每种菌株重复三次进行分析。
大肠杆菌微发酵
按照制造商的方案使用ECM 630高通量电穿孔系统(哈佛仪器公司(HarvardApparatus，Inc.)麻塞诸塞州霍利斯顿)或使用单独的电穿孔比色皿通过电穿孔将质粒转化到宿主菌株中。通过添加等体积的无菌20％甘油为每个转化平板制备甘油原液，使用3μL在含有适当抗生素的150μLSM10++培养基中接种过夜培养物。用夹层盖(获自荷兰哈勒姆的EnzyScreen的型号#CR1596)盖住平板。这些盖确保了孵育期间最小的蒸发损失。除非另有说明，否则96孔板均在37℃、400rpm下培养16小时，振荡器轨道为25mm。需要这种轨道和最小振动速度的组合以获得所需的传质系数并实现充分的培养物氧合作用。
生长16小时后，通过离心沉淀细胞，除去过量培养基并将细胞重悬于150μL FGM3洗涤溶液中。随后再次沉淀细胞并再次除去过量培养基，将沉淀重悬于50μL含有适当抗生素的FGM3无磷酸盐培养基中。使用标准平底96孔板将5μL重悬的培养物加入到195μL水中用于OD600测量。使用标准96孔板，使用总量为150μL的含有适当抗生素的FGM3无磷酸盐培养基，将用于生产的OD600标准化至OD600＝1。将夹层盖(获自荷兰哈勒姆的EnzyScreen的型号#CR1596)盖住平板，并将96孔板培养物在37℃、400rpm孵育24小时。生产24小时后，通过离心沉淀来自每个孔的所有样品，收集上清液用于随后的分析测量。对每种菌株进行三次微发酵。
对于与生长相关的丙氨酸微发酵，甘油原液制剂和SM10++中的16小时过夜培养按如上所述进行。在SM10++培养基中生长16小时后，将5μL过夜培养物接种到150μL含有40mM含有适当抗生素的磷酸盐的FGM3中。用夹层盖(获自荷兰哈勒姆的EnzyScreen的型号#CR1596)盖住平板，并将96孔板培养物在37℃、400rpm孵育24小时。产生24小时后，记录OD600，然后通过离心沉淀来自每个孔的所有样品，收集上清液用于随后的分析测量。对每种菌株进行三次微发酵。
如补充材料，第8节中所述进行微发酵稳健性评估。
1L发酵种子
将来自转化平板的单菌落接种到5mL含有适当抗生素的LB中，并在37℃、220rpm下培养16小时。将500μL LB培养物接种到方形摇瓶(CAT#：25-214，杰纳西科技有限公司(Genesee Scientific，Inc.)利福尼亚州圣迭戈(SanDiego，CA))中的50mL含有适当抗生素的SM10培养基中，将培养物在37℃下以220rpm的振荡速度培养24小时，此时OD600通常在3-10之间，通过以4000rpm离心15分钟收获培养物，弃去上清液并使用SM10培养基将细胞培养物标准化至OD600＝10。对于1L发酵种子，将6mL标准化OD600＝10的培养物加入到冷冻瓶中的1.5mL 50％甘油中，并在-80℃下储存。
1L发酵
使用Infors-HT并联发酵罐(Multifors)(Laurel，MD，USA)平行生物反应器系统进行1L发酵，包括经配置用于空气、氧气和氮气的三个气体连接质量流量控制器。使用的容器总容积为1400mL，工作容积高达1L。使用Hamilton探针完成在线pH和pO2监测和控制。使用多重Blue-in-OneBlueSens气体分析仪(BlueSens.Northbrook，IL，USA)完成废气分析。使用Optek 225mm OD探针(Optek，Germantown，WI，USA)连续监测培养物密度。使用的系统运行IrisV6.0命令和控制软件，并与Seg-flow自动采样系统(Flownamics，Rodeo，CA，USA)集成，Seg-flow自动采样系统包括FISP无需细胞的采样探针、Segmod 4800和FlowFraction96孔板馏分收集器。
对于具有～10gcdw/L生物质的标准化2阶段过程，在罐中填充800mL的FGM10培养基，其具有足够的磷酸盐以达到最终的大肠杆菌生物质浓度～10gcdw/L。适当时加入抗生素。将冷冻的种子小瓶在冰上解冻，并用7.5mL种子培养物接种罐。接种后，使用5M氢氧化铵和1M盐酸作为滴定剂将罐控制在37℃和pH 6.8。将10M氢氧化铵用于图3G的发酵运行。以下氧控制方案用于维持所需的溶解氧设定点。第一气体流速从最小0.3L/min的空气增加到0.8L/min的空气，随后，如果需要更多的通气，则搅拌从最小300rpm增加到最大1000rpm值。最后，如果需要更多氧气来达到设定点，则使用集成质量流量控制器包括氧气补充。起始葡萄糖浓度为25g/L。一旦搅拌达到800rpm，就将恒定浓缩的无菌过滤葡萄糖进料(500g/L)以指定的速率即2g/h加入到罐中。在需要改变进料速率或溶解氧含量以进行稳健性研究的情况下，在细胞进入稳定期后进行改变。在进入稳定期后，发酵运行延长至约50小时，每3小时自动出样。保存样品用于随后的分析测量。
在生长相关的发酵过程的情况下，在罐中装入800mL含有40mM磷酸盐的FGM10培养基，磷酸盐大大过量并且确保对于生长相关的发酵过程不会发生磷酸盐消耗。适当时加入抗生素。将冷冻的种子小瓶在冰上解冻，并使用7.5mL种子培养物接种罐。接种后，使用5M氢氧化铵和1M盐酸作为滴定剂将罐控制在37℃和pH 6.8。以下氧控制方案用于维持所需的溶解氧设定点。第一气体流速从最小0.3L/min的空气增加到0.8L/min的空气，随后，如果需要更多的通气，则搅拌从最小300rpm增加到最大1000rpm。最后，如果需要更多氧气来达到设定点，则使用集成质量流量控制器包括氧气补充。起始葡萄糖浓度为25g/L。一旦搅拌达到800rpm，就将恒定浓缩的无菌过滤葡萄糖进料(500g/L)以指定的速率即2g/h加入到罐中。进料速率和溶解氧浓度在开始时被设定为期望值，并在整个发酵过程中保持。发酵运行持续长达约50小时，每3小时自动出样。保存样品用于随后的理论分析。
分析方法
所有定量化合物的样品标准曲线显示在补充材料，第10节中。
葡萄糖和乙醇定量：使用集成有Waters 2414折射率(RI)检测器的超高效液相色谱Acquity H-Class UPLC(Waters Corp.，Milford，MA.USA)，开发UPLC-RI方法，用于同时定量葡萄糖和乙醇浓度。使用伯乐色谱柱(Bio-Rad FastAcidAnalysis HPLC Column)(100×7.8mm，9μm粒径；CAT#：#1250100，Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)在65℃下进行色谱分离。5mM硫酸用作洗脱液。等度洗脱如下：0-0.1min，流速从0.4mL/min增加至0.42mL/min，0.1-12min，流速为0.48mL/min。样品注射体积为10μL。使用分析物的标准含水原液进行UPLC方法开发。使用MassLynxv4.1软件进行峰积分和进一步分析。对于葡萄糖的线性范围是1-10g/L，对于乙醇的线性范围是1-20g/L。根据需要将样品稀释至精确的线性范围内。使用超纯水进行稀释。
丙氨酸定量：针对丙氨酸开发了反相UPLC-MS/MS方法。使用液相色谱柱RestekUltra AQ C18(150mm×2.1i.d.，3μm；CAT#：9178362，美国宾夕法尼亚州贝尔丰特的瑞斯特公司(Restek Corporation，Bellefonte，PA))在70℃下进行色谱分离。使用以下洗脱液：溶剂A：H2O，0.2％甲酸和0.05％铵(v/v)；溶剂B：MeOH，0.2％甲酸和0.05％铵(v/v)。梯度洗脱如下：0-0.1min，等度5％B，流速从0.65mL/min增加至0.75mL/min；0.1-0.3min，线性从5％至95％B，0.75mL/min；0.3-0.9min，等度95％B，0.75mL/min；0.9-1.2min，线性从95％至5％B，0.75mL/min；1.2-1.3min，等度5％B，0.75mL/min。样品注射体积为5μL。使用分析物的标准含水原液进行UPLC方法开发。使用集成有XevoTM TQD质谱仪的Acquity H-Class UPLC(Waters Corp.，Milford，MA，USA)进行分离。对每种分析物调整包括MRM转换的MS/MS参数，并列于表22中。浓度为5mg/L的丙氨酸(2，3-13C2，99％)用作丙氨酸的内标。使用MassLynxv4.1软件进行峰积分和进一步分析。丙氨酸的线性范围为1-100m g/L。根据需要将样品稀释至精确的线性范围内。使用超纯水进行稀释，并使用溶剂A与5mg/L的C13丙氨酸(2，3-13C2,99％)进行最终的10倍稀释。
甲羟戊酸定量：开发反相UPLC-TUV方法，用于同时定量甲基戊酸和甲羟戊酸内酯。使用RestekUltraAQ C18柱(150mm×2.1i.d.，3μm；CAT#：9178362，美国宾夕法尼亚州贝尔丰特的瑞斯特公司)在30℃下进行色谱分离。使用20mM磷酸作为洗脱液。等度洗脱如下：0-3min，等度1mL/min。样品注射体积为10μL。在210nm处监测吸光度。使用分析物的标准含水原液进行UPLC方法开发。使用Acquity H-Class UPLC(Waters Corp.，Milford，MA，USA)进行分离。使用MassLynxv4.1软件进行峰积分和进一步分析。甲基戊酸和甲羟戊酸内酯的线性范围为0.01-0.1g/L。根据需要将样品稀释至精确的线性范围内。在20mM磷酸中稀释的甲羟戊酸会自发地转化为甲羟戊酸内酯80，因此，甲基戊酸和甲羟戊酸内酯的定量对于发酵样品是必需的。每次新制备甲羟戊酸和甲羟戊酸内酯标准品，并立即在UPLC上运行。使用超纯水进行稀释，并使用20mM磷酸进行最终的10倍稀释。
丙氨酸立体异构体定量：开发反相UPLC-TUV方法，用于同时定量和区分L-/D-丙氨酸。使用Chirex 3126(D)-青霉胺柱(150×4.6mm，5μm；Phenomenex Inc.，Torrance，CA)在50℃下进行色谱分离。使用2mM硫酸铜作为洗脱液。等度洗脱如下：0-10min，0.75mL/min。样品注射体积为10μL。在254nm处监测吸光度。使用分析物的标准含水原液进行UPLC方法开发。使用AcquityH-Class UPLC(Waters Corp.，Milford，MA，USA)进行分离。使用MassLynxv4.1软件进行峰积分和进一步分析。L-/D-丙氨酸的线性范围为0.1-1g/L。根据需要将样品稀释至精确的线性范围内。使用超纯水进行稀释。
补充材料
表1：代谢网络的组合复杂性。
第1节：磷酸盐启动子
从EcoCyc数据库81获得磷酸盐启动子序列(https：//ecocyc.org/，表2)，用于PhoB调节的启动子。我们试图不仅评估先前表征的启动子响应磷酸盐消耗的相对强度，而且还评估富含磷酸盐条件下的相对渗漏性。为此目的，我们构建了一组荧光报告质粒。我们在pSMART-HC-Kan(Lucigen，WI)骨架中克隆了一组12个磷酸盐依赖性启动子后的紫外可激发GFPuv基因。在m2p-labs BiolectorTM中以2阶段微发酵方案评估这些报告菌株。结果如图7所示。当表达盒被染色体整合或用于诱导型表达引导阵列时，通常选择ugpB基因启动子用于高水平严格控制的表达。
将绝缘子82添加到磷酸盐启动子子集(表3)的5′和3′末端，以促进在不同序列背景下的一致性能。为了减少通读转录，在每个绝缘启动子的5′末端添加了独特的终止子。终止子序列来自http：//parts.igem.org/Terminators/Catalog。使用m2p-labs BiolectorTM中的GFPuv表达类似地表征绝缘的磷酸化启动子(图8)。
表2：评估磷酸盐诱导型启动子序列，核糖体结合位点加下划线，并且基因的起始密码子(GFPuv)以绿色显示。
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表3：绝缘启动子序列。绝缘子序列用斜体表示。-35和-10框以粗体和下划线突出显示。
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第2节：组成型启动子
一组强度不同的组成型绝缘启动子用于组成型表达，其直接获自Davis等人，包括proA、proB、proC、proD启动子82和HCEp启动子83。将绝缘子添加到HCEp启动子的5′和3′端。与绝缘磷酸盐启动子类似，在组成型启动子的5′端添加了独特的终止子。它们被用来驱动与生长相关的生产菌株中的组成型途径表达，以及在合适的组成型异源基因表达的情况下进行菌株修饰。这些启动子序列在下表4中给出，并且使用GFPuv表达表征启动子(图9)。
表4：组成型启动子序列
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第3节：染色体修饰的宿主菌株
图11描绘了每种染色体修饰。表5中列出了本研究所采用和/或构建的菌株。表6和表7列出了用于菌株构建和/或确认的寡核苷酸和合成DNA序列。图12和图13A-E示出了1L发酵中对照菌株生长过程中的生长速率和葡萄糖分布。
表5：染色体修饰菌株的列表
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表6：用于菌株构建的寡核苷酸
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表7：用于菌株构建的合成DNA
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第4节：蛋白水平的动态控制。
将表达荧光蛋白和沉默指导的质粒转化到表8中列出的相应宿主菌株中。在m2p-labsBiolectorTM中三次评估菌株，同时测量荧光性以及生物量水平，荧光性包括GFPuv和mCherry水平。
表8：用于动态控制蛋白水平的菌株
使用以下公式校正OD600读数，其中OD600表示离线测量，OD600*表示微型生物反应器Biolector的生物质读数，t0表示起点，tf表示终点。
第5节：代谢控制
近平衡反应
以G6P节点为例，说明了阀对近平衡反应的代谢物库的影响。缩写：Gluc，葡萄糖；G6P，6-磷酸葡萄糖；F6P，6-磷酸果糖；6PG1，6-磷酸-葡萄糖酸内酯。
没有阀的G6P节点
公式S2：稳态质量平衡J1＝J2+J3
公式S6：Keq1＝Keq2+Keq3-1
公式S7：Keq1+1＝Keq2+Keq3
有阀的G6P节点
当zwf阀有效时，J3≈0。
公式S12：稳态质量平衡J1＝J2
公式S15：Keq1＝Keq2
阀的影响
由于接近平衡[6PGl]＞[G6P]
[F6P]值＞＝[F6P]网络
从网络中除去接近平衡的热力学上有利的反应将导致代谢物库增加。
第6节：基因沉默阵列和途径表达构建体
在图14和图15A-B中如下说明了CASCADE指导和引导阵列的设计和构建。通过将pcrRNA.Tet中的pTet启动子88与绝缘的低磷酸盐诱导的ugpB启动子82交换来制备pCASCADE对照质粒。两个启动子负责调节gltA基因，并为两个启动子设计了sgRNA，从而产生了指导gltA1(G1)和gltA2(G2)89。四个启动子负责调节gapA基因，并为第一个启动子设计了sgRNA，因为在指数生长阶段，gapA mRNA主要在高效的gapA P1启动子上启动，在稳定期仍保持高水平90。lpd基因上游的多个启动子参与了lpd调控(https：//ecocyc.org/gene？orgid＝ ECOLI&id＝EG10543#tab＝2howAll)，因此不可能为lpd设计独特而有效的sgRNA。FabI、udhA和zwf的启动子序列可获自EcoCyc数据库(https：//ecocyc.org/)。为了设计CASCADE引导阵列，鉴定了目标启动子-35框或-10框附近的CASCADE PAM位点，选择了PAM位点3′末端的30bp作为引导序列，并遵循制造商的方案使用Q5定向诱变(NEB，MA)将其克隆到pCASCADE质粒中，对制造商的方案的修改在于将5％vNDMSO添加到Q5PCR反应中。将pCASCADE对照载体用作模板。如图15A-B所示，制备了具有两个或更多个引导阵列的pCASCADE质粒。通过用PCR依次扩增每个较小的引导质粒的互补半部分，然后进行后续的DNA组装来制备pCASCADE引导质粒。表9列出了sgRNA引导序列和用于构建它们的引物。所有pCASCADE沉默质粒都列在下表10中，可由Addgene获得。
表9：sgRNA引导序列和用于构建它们的引物的列表。间隔子以斜体表示。
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表10：本研究中使用的质粒列表
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第7节：2阶段微发酵
大肠杆菌培养基原液
·10X浓缩的柠檬酸铵30盐(1L)，在搅拌下将30g(NH4)2SO4和1.5g柠檬酸在水中混合，用10M NaOH将pH调节至7.5。高压灭菌并保存在室温(RT)下。
·10X浓缩的柠檬酸铵90盐(1L)，在搅拌下将90g(NH4)2SO4和2.5g柠檬酸在水中混合，用10M NaOH将pH调节至7.5。高压灭菌并保存在室温下。
·1M 3-(N-吗啉代)丙磺酸钾(MOPS)，用50％KOH调节至pH 7.4。过滤除菌(0.2μm)并保存在室温下。
·0.5M磷酸钾缓冲液，pH 6.8，混合248.5mL的1.0M K2HPO4和251.5mL的1.0MKH2PO4，并用超纯水调节至最终体积1000mL。过滤除菌(0.2μm)并保存在室温下。
·2M MgSO4和10mM CaSO4溶液。过滤除菌(0.2μm)并保存在室温下。
·50g/L硫胺素-HCl溶液。过滤除菌(0.2μm)并保存在4℃下。
·500g/L葡萄糖溶液，加热搅拌溶解。冷却，过滤除菌(0.2μm)，并保存在室温下。
·100g/L酵母提取物，高压灭菌，并保存在室温下。
·100g/L酪蛋白氨基酸，高压灭菌，并保存在室温下。
·500X微量金属原液：在1000mL水中制备微量营养物溶液，该溶液含有10mL浓H2SO4、0.6g g CoSO4·7H2O、5.0g CuSO4·5H2O、0.6g ZnSO4·7H2O、0.2g Na2MoO4·2H2O、0.1g H3BO3和0.3g MnSO4·H2O。过滤除菌(0.2μm)并在黑暗中室温保存。
·在每次准备培养基之前，准备新鲜的40mM七水合硫酸铁水溶液，过滤(0.2μm)消毒。
培养基组分
最终使用的培养基通过按照下表所述顺序无菌混合原液来制备，以尽量减少沉淀，然后过滤灭菌(使用0.2μm过滤器)。
表11：种子培养基，pH 6.8：
成分 单位 SM10 SM10++
(NH4)2SO4 g/L 9 9
柠檬酸 g/L 0.25 0.25
磷酸钾 mM 5 5
CoSO4·7H2O g/L 0.0048 0.0048
CuSO4·5H2O g/L 0.04 0.04
ZnSO4·7H2O g/L 0.0048 0.0048
Na2MoO4·2H2O g/L 0.0016 0.0016
H3BO3 g/L 0.0008 0.0008
MnSO4·H2O g/L 0.0024 0.0024
FeSO4·7H2O g/L 0.044 0.044
MgSO4 mM 2.5 2.5
CaSO4 mM 0.06 0.06
葡萄糖 g/L 45 45
MOPS mM 200 200
硫胺素-HCl g/L 0.01 0.01
酵母提取物 g/L 1 2.5
酪蛋白氨基酸 g/L 0 2.5
表12：生产/洗涤培养基，pH 6.8：
微发酵
图16A-C示出了微发酵方案的概述。评估菌株在96孔板微发酵中的生产，其中细胞最初生长至对数中期，其被收集，洗涤，重悬并在无磷酸盐的生产培养基中标准化为OD600＝1，持续24小时的生产阶段。微发酵的成功需要：(1)通过收集指数期的所有菌株来使菌株同步；(2)利用低生物量水平，以使批次糖可以保持较低水平，同时实现大量潜在产物积累；(3)提供足够的混合和通气同时使蒸发损失最小化的方法。为了满足最终要求，使用了可从EnzyScreenTM获得的微孔板夹层盖和夹钳，这大大减少了蒸发损失，同时能够在以400rpm运行的标准25mm轨道振动器中实现高水平的混合和通气92-93。用不同的绝缘磷酸盐启动子生产丙氨酸的微发酵结果如图17所示。用gapA和gapN基因改变评估的菌株的微发酵结果如图18所示。
第8节：微发酵的稳健性评估
在微发酵氧稳定性研究中，改变生产培养体积以达到所需氧转移率(OTR)值，其如先前报道(http：//www.enzyscreen.com/oxygen_transfer_rates.htm)92-93，并如表14所示列出。改变生产阶段的批次葡萄糖水平以评估对葡萄糖的稳健性。表15中列出了在微发酵规模的稳健性实验中使用的菌株。微发酵稳健性研究的结果示出于图19A-D、图20A-D、图21A-D、图22A-D、图23A-D、图24A-D、图25A-D、图26A-D、图27A-D、图28A-D、图29A-D、图30A-D、图31A-D和图32中。
表14：对于不同OTR值的培养条件。
表15：用于微发酵稳健性评估的菌株以及其RS评分的列表。
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第9节：标准化的2阶段发酵
使用标准化的磷酸盐限制的2阶段发酵方案来评估所有阀菌株。该方案产生了高度可重复的生长阶段结果，即使生产不同产物的菌株，菌株之间的差异也很小。由于不同菌株的不同进料速度和碱利用率，在生产阶段观察到了更明显的变异性。图33A给出了该研究中进行的1L发酵中所有生物量为10g·cdw/L的阀菌株的生长曲线。这种一致性与图33B中给出的与生长相关的生产菌株更可变的生长相反。
表16：用于甲羟戊酸可扩展性的菌株。
第10节：分析方法
表17：UPLC-MS/MS参数
附图的详细说明
图1A：2阶段发酵中的动态代谢控制的概述。代谢工程涉及将到所需产物的代谢途径优化到宿主的现有代谢网络，将原料转化为所需产物。实心圆表示代谢物，线表示酶促反应。代谢工程的传统优化通常涉及三个关键步骤(a)去除竞争性非必要代谢途径，其包括导致不良副产物的代谢途径，以及过表达将原料分子转化为产物的途径(用粗线表示)中的酶；以及可能地(b)衰减必要代谢(以橙色线条表示)中的酶，以进一步提高产量。重复此过程，以优化所需产物的产率(饼图)。相比之下，动态代谢网络最小化可用于完全释放常用的二阶段发酵过程(c-d)的潜力。在这些过程的第一阶段(c)中，对生物质的生长和产率进行了优化，而在第二阶段(d)中，对产物形成进行了优化，这非常适合二阶段过程(e)，在该过程中，生物质水平积累并且消耗有限的营养物(在这种情况下为无机磷酸盐)，当营养物耗尽时会触发进入生产稳定期。可以使用利用基于CRISPRi的基因沉默和/或受控蛋白水解的合成代谢阀(f和g)，以在过渡到生产阶段时大大减少相关的代谢网络，(f)可以诱导沉默引导的阵列，并通过CASCADE复合体将该阵列加工成单独的引导，使用该阵列沉默多个目标基因(GOI)。(g)如果通过染色体修饰将C-末端DAD+4标签添加到目标酶(EOI)，则在存在sspB分子伴侣和诱导型sspB分子伴侣的情况下，C-末端DAD+4滞后物可由clpXP蛋白酶可诱导降解。(h)使用诱导型蛋白水解和CRISPRi沉默的两阶段动态控制来对大肠杆菌中的蛋白水平进行动态控制。随着细胞生长磷酸盐被耗尽，细胞“关闭”mCherry并“打开”GFPuv。阴影区域代表相对于平均值的一个标准偏差，n＝3。(i)单独和组合使用蛋白水解和基因沉默对mCherry降解的相对影响，以及(j)衰减率。
图1B：菌株和生物过程优化。(a)在代谢工程中菌株和过程优化的常规方法通常涉及去除竞争性非必要代谢途径和过表达途径酶(实心圆：代谢物；线：酶促反应，绿色表示生产途径)。(a-i)以筛选规模(微量滴定板，摇瓶等)评估菌株变体，(a-ii)在大规模仪器化生物反应器中评估最佳菌株。大量的设计-构建-测试周期(a-vi-vii)用于迭代优化生产菌株和过程，包括对环境(过程)变量的关键优化(a-vii)。(a-iii)将性能最佳的菌株和相关的优化工艺条件扩展到工业相关水平。(b)使用两阶段动态代谢控制进行快速菌株和生物过程优化。使细胞中的代谢网络动态地最小化为仅用于产物形成所必需的步骤。这是在标准化的两阶段生物过程(c)中完成的，在该过程中，生物质积累的生长阶段之后是生产阶段，只有最小的代谢网络。限制大量营养物可用于将细胞的代谢从生长“转变”为生产。该方法产生用于筛选的潜在菌株变体的较小子集(b-i)。代谢网络的最小化有助于提高相关代谢物的水平(d)，从而提高生产水平，还可以增强过程的稳健性(e)，从而提高过程和菌株的可扩展性(f)。通过筛选确定的最佳生产者可预测且迅速地扩展到(b-ii)大型仪器化生物反应器，以及(b-iii)随后达到工业相关水平。如果需要，则可以结合有限的设计-构建-测试周期(b-iv)来指导改进。遵循与产物无关的标准化方案进行各种规模的菌株评估，无需进行密集的过程优化。
图2A-D：在大肠杆菌中实施2阶段合成代谢阀(SMV)。图2A描绘了利用基于CRISPRi的基因沉默和/或受控蛋白水解构建的SMV。(顶部)沉默：当表达天然大肠杆菌CRISPR/Cascade机制时，可以使用诱导型沉默指导RNA阵列(i)来沉默表达多个目的基因(GOI)，这可以将引导序列加工成单个引导(ii)。(底部)蛋白水解：当将C末端DAS+4标签添加到目标酶(EOI)(通过染色体修饰)后，在受控诱导sspB分子伴侣(iii)的作用下，C末端DAS+4标签可以被clpXP蛋白酶(iv)降解。图2B描绘了使用诱导型蛋白水解和CRISPRi沉默对大肠杆菌中蛋白水平进行动态控制。随着细胞生长磷酸盐被耗尽，细胞“关闭”mCherry并“打开”GFPuv。阴影区域表示相对于平均值(r.f.u，相对荧光单位)的一个标准偏差。图2C描绘了蛋白水解和基因沉默单独或组合对mCherry降解的相对影响，n.f.u.归一化荧光单位(最大荧光归一化)。图2D描绘了蛋白水解和基因沉默单独或组合对观察到的mCherry荧光衰减率(每小时)的相对影响。
图3A-K：利用2阶段动态控制在大肠杆菌中生产丙氨酸。图3A描绘了菌株变体设计。核心代谢中的主要途径包括：糖酵解、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环(TCA)、脂肪酸生物合成和可溶性转氢酶。被“关闭”以减少通过核心代谢的通量的关键阀候选酶/基因可包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf-“Z”)、硫辛酰胺脱氢酶(lpd-“L”)、柠檬酸合酶(gltA-“G”)、烯酰ACP还原酶(fabI-“F”)和可溶性转氢酶(udhA-“U”)。重要的是，先前已经证明动态消除fabI会增加细胞内的丙二酰CoA库以及丙二酰CoA通量55。动态“打开”的酶可包括产生目标产物的代谢途径，在这种情况下目标产物为丙氨酸。特定途径酶包括NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶(ald*)和丙氨酸输出物(alaE)。另外，由于丙氨酸生产途径利用NADPH作为辅助因子，所以由来自变形链球菌(S.mutans)的gapN基因56编码的NADPH依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶被单独打开并且与关闭天然gapA-“A”基因(NADH依赖性甘油醛脱氢酶)结合打开。缩写：PTS-葡萄糖磷酸转移酶转运系统，P-磷酸盐，BP-二磷酸，OAA-草酰乙酸，DHAP-磷酸二羟丙酮，GA3P-甘油醛-3-磷酸，1，3-BPG-1，3二磷酸甘油酸，3-PG-3-磷酸甘油酸酸，2-PG-2-磷酸甘油酸，PEP-磷酸烯醇丙酮酸，MSA-丙二酸半醛，ACP-酰基载体蛋白，Ru-核酮糖，Xu-木酮糖，E-赤藓糖，Ri-核糖，S-景天庚酮糖。用SMV对菌株进行工程化，以通过单独的基因沉默、单独蛋白水解或结合两者来动态控制阀基因/酶的所有组合。评估标准的微发酵中这些菌株的丙氨酸生产。图3B描绘了在2阶段微发酵中检查的所有阀菌株的平均丙氨酸效价(黑色)的等级顺序图，灰色区域代表标准偏差。对照菌株中丙氨酸生产为红色。图3C描绘了响应于不同的蛋白水解和沉默组合，2阶段生产中从0g/L(紫色)至5g/L(红色)的平均丙氨酸效价。图3D描绘了针对单个“阀”丙氨酸菌株(沉默gltA1(“G1”)，蛋白水解fabI和udhA(“FU”))评价的响应于不同氧气转移速率(OTR)和葡萄糖浓度的平均丙氨酸效价。该表面的结果用于计算菌株特异的稳健性评分(RS)(请参见文本)，该菌株具有最高的RS评分。图3E描绘了在多个工艺条件下评估的48个“阀”菌株的子集的稳健性评分的热图。图3F描绘了将微发酵产量最大的菌株之一(沉默fabI-gltA1-gltA2(“FG1G2”)，蛋白水解fabI、gltA和udhA(“FGU”))规模扩大到1L生物反应器导致在生产48小时后产生80g/L的效价，产率为0.8g/g。图3G描绘了该菌株中alaE丙氨酸输出物的过表达(版f)导致产量显著提高，在生产27小时内产量达到147g/L，产率为～1g/g。(更多详细信息请参阅补充材料第3节)。图3H描绘了选择用于在微发酵中稳健性评估的菌株。图3I描绘了最稳健的“阀”丙氨酸菌株(沉默_gltAl，蛋白水解_FU)的稳健性和效价。底面显示针对所评估的所有工艺条件的中值标准化的丙氨酸效价的热图，顶面显示在所有工艺条件下的丙氨酸效价，两个板使用相同的色标(丙氨酸效价，单位为g/L)。图3J描绘了所选菌株的RS3评分。图3K描绘了所评估的所有条件下的过程可再现性热图，图3J和图3K使用了相同的灰度。
图4A-F：2阶段与生长相关方法之间的稳健性比较。图4A描绘了所有评估的丙氨酸菌株的RS3评分的等级顺序，红色条形表示阀丙氨酸菌株，蓝色条形表示与生长相关的(GA)丙氨酸菌株。图4B描绘了具有蛋白水解“F”阀的“阀”丙氨酸菌株和与生长相关的丙氨酸菌株的平均RS3评分。图4C描绘了在所评估的所有条件的微发酵中，代表性的“阀”丙氨酸(蛋白水解_FGU，沉默_gltA1)和生长相关的丙氨酸菌株的最大效价图。图4D描绘了在所评估的所有条件下生长相关的丙氨酸菌株的过程可再现性。图4E描绘了代表性的稳健“阀”丙氨酸(蛋白水解_FGU，沉默_gltA1)的稳健性和效价。图4F描绘了GA2菌株的稳健性和效价。底面，被归一化到所评估的所有工艺条件的中值的丙氨酸效价的热图，顶面，在所有工艺条件下的丙氨酸效价，两个板使用相同的色标(丙氨酸效价，单位为g/L)。
图5A-J：在微发酵(图5A-D)和1L发酵(图5E-J)中“阀”和生长相关的丙氨酸产生的比较。用于稳健性分析的所有菌株的平均丙氨酸效价(图5A)和稳健性评分(图5B)。所选“阀”丙氨酸菌株(图5C)和生长相关的丙氨酸菌株(图5D)对不同OTR和葡萄糖浓度的平均丙氨酸效价。使用(图5B)中星号标记的菌株进行此分析。选择这两个菌株进行1L性能比较。图5E和图5F描绘了所评估的1L性能指标，包括平均比生产率(SP，g/gdcw-h)、平均葡萄糖摄取率(GUR，g/gcdw-h)、最大效价(g/L)和最大产率(g/g)。图5G和图5H描绘了μL至1L的可扩展性。将1L数据标准化至生产50小时内的最大效价。为生长相关菌株使用足够的原料以避免葡萄糖耗尽。图5I和图5J分别描绘了在可扩展性图5G和图5H中使用的所有菌株的1L生产概况，较暗的符号代表生长曲线，较亮的符号代表生产曲线，符号的形状代表图5G或图5H中的相同菌株。
图6A-E：利用2阶段动态控制在大肠杆菌中生产甲羟戊酸。图6A描绘了用于甲羟戊酸生产的代谢途径和SMV。图6B描绘了在对照菌株中使用具有不同启动子组合的几种生产途径质粒变体来生产甲羟戊酸。图6C描绘了使用图6B的最佳生产途径连同蛋白水解和沉默SMV的组合一起产生甲羟戊酸的“阀”菌株子集的微发酵结果。图6D描绘了以1L规模评估的甲羟戊酸菌株子集的μL至1L可扩展性。对于μL数据，n＝3，对于1L数据，n＝1。在50小时的生产时间内最大效价用于关联。图6E描绘了在1L生物反应器中由图6D的最佳甲羟戊酸菌株(沉默fabI-gltA1-gltA2(“FG1G2”)、蛋白水解fabI和udhA(“FU”))的生产。在78小时的生产中观察到效价为97g/L。生产阶段的产率达到0.46g/g(理论产率为的84％)。(更多详细信息请参阅补充材料第9节)。图6F描绘了产生3-HP的菌株的子集的微发酵结果。图6G描绘了以1L规模评估的3-HP菌株子集的μL至1L可扩展性(补充材料表S21和S22)。图6H描绘了在1L系统中最佳3-HP菌株的生产性能，方形：3-HP/甲羟戊酸效价；圆圈：OD600。在产量最高的生产者中，生产阶段甲羟戊酸的产率达到0.46g/g，3-HP的产率达到0.63g/g。
图7：磷酸盐消耗启动子表征。构建了一组GFP报告载体，以评估12种先前鉴定的磷酸调节启动子的表达水平。使用标准方案连续评估菌株在BiolectorTM中的GFP表达，其中在基本培养基中限制磷酸盐。在生物量水平达到峰值(为清楚起见未显示)后，GFP表达开始。重要的是，当前的启动子组能够实现大范围的表达水平。
图8：绝缘的磷酸盐消耗启动子表征。构建了一组GFP报告载体，以评估FGM3培养基中五种绝缘的磷酸调节启动子的表达水平。使用标准方案连续评估菌株在BiolectorTM中的GFP表达，其中在基本培养基中限制磷酸盐。在生物量水平达到峰值(为清楚起见未显示)后，GFP表达开始。重要的是，当前的启动子组能够实现大范围的表达水平。
图9：绝缘的组成型启动子表征。构建了一组GFP报告载体，以评估在具有40mM磷酸盐的FGM3培养基中五种绝缘的组成型启动子的表达水平。阴影区域表示标准偏差，n＝3。连续评估菌株在BiolectorTM中的GFP表达。仅对启动子proA、proB和proD观察到GFP表达。
图10：两阶段发酵中的最佳3-HP通量的代谢建模结果。左图：生长阶段的最佳通量，其中以生物质生产为目标函数。右图：在3-HP生产阶段的最佳通量，其中以3-HP生产为目标函数(生物质产量设为0)。通量列为通过利用每100摩尔葡萄糖的给定反应的通量的相对比率或摩尔数。
图11：染色体修饰。
图12：1L FGM10基本培养基发酵中起始宿主菌株的平均最大生长速率，n＝2。
图13A-E：在1L标准基本培养基发酵中起始宿主菌株的生长阶段期间使用的葡萄糖分布。当“生产”在中后期指数期开始时，将给出DLF_0025的指数中期和最终生长期的结果。该结果是重复发酵的平均值。图13A，BW25113；图13B，BWapldf；图13C，DLF_0001；图13D，DLF_0025在中间指数期；图13E，DLF_0025在生长阶段的末期。单位为克葡萄糖。
图14：pCASCADE-对照质粒构建方案。
图15A-B：pCASCADE构建方案。图15A，单sgRNA克隆；图15B，双sgRNA。
图16A-C：微发酵过程概述。(A)高通量微发酵方案的概述。将冷冻原液(也可以使用菌落)接种到96孔板中的SM10++中。将培养物过夜生长16小时，通过离心收集，用无磷酸盐培养基洗涤培养物，并将其以目标生物量水平重悬于无磷酸盐培养基中。(OD600nm＝1.0)。使用EnzyScreenTM盖和夹钳以便减少蒸发并实现高氧气传输速率。该方案由TecanEvo液体处理器实施。(B)在96孔板培养中代表性的过夜生长，绘制了过夜培养的OD600分布。(C)使用Tecan Evo液体处理器标准化后的代表性OD600分布。
图17：在DLF_0025菌株中使用不同的绝缘的磷酸盐启动子进行L-丙氨酸生产的微发酵。
图18：gapN/gapA菌株的L-丙氨酸产生的热图。
图19A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图20A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图21A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图22A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图23A-D：针对4种菌株的微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生，评估了稳健性。
图24A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图25A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图26A-D：针对4种菌株的微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生，评估了稳健性。
图27A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图28A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图29A-D：针对4种菌株的微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生，评估了稳健性。
图30A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图31A-D：评估4种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图32：评估一种菌株的稳健性，在微发酵中响应于不同OTR和葡萄糖浓度的丙氨酸产生。
图33A-B：在本文中评估的1L规模的所有(图33A)阀菌株和(图33B)生长相关菌株的生长曲线。生长曲线被同步以说明滞后时间的任何变化。阀菌株增长曲线被同步到相同的中指数点。生长相关菌株的生长曲线被同步到相同的起飞点。
图34：具有来自文献中的具有最高甲羟戊酸效价的菌株和在本工作中评估的甲羟戊酸菌株1的比生产率(SP)比较。
图35：来自MS测量的丙氨酸标准曲线。绘制来自三次标准测量的质谱响应的平均值和标准偏差。
图36A-B：来自RI测量的葡萄糖(图36A)和乙醇(图36B)标准曲线。绘制了来自三次标准测量的峰面积的平均值和标准偏差。
图37：来自TUV测量的3-羟基丙酸标准曲线。绘制了来自两次标准测量的峰面积的平均值和标准偏差。
图38A-D：(图38A)L-丙氨酸、(图38B)D-丙氨酸、(图38C)甲羟戊酸和(图38D)甲羟戊内酯的TUV标准曲线。绘制了来自三次标准测量的峰面积的平均值和标准偏差。
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尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在会想到许多变化，改变和替代。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。本发明的范围由所附权利要求限定，其涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
SEQUENCE LISTING
<110> 杜克大学(DUKE UNIVERSITY)
<120> 用于稳健动态代谢控制的组合物和方法
<130> 52240-702.601
<140>
<141>
<150> 62/461,436
<151> 2017-02-21
<160> 204
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
tctttctgac accttactat cttacaaatg taacaaaaaa gttatttttc tgtaattcga 60
gcatgtcatg ttaccccgcg agcataaaac gcgtgtgtag gaggataatc tatg 114
<210> 2
<211> 160
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
gtgcgtaatt gtgctgatct cttatatagc tgctctcatt atctctctac cctgaagtga 60
ctctctcacc tgtaaaaata atatctcaca ggcttaatag tttcttaata caaagcctgt 120
aaaacgtcag gataacttct gtgtaggagg ataatctatg 160
<210> 3
<211> 174
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
cgattacgta aagaagttat tgaagcatcc tcgtcagtaa aaagttaatc ttttcaacag 60
ctgtcataaa gttgtcacgg ccgagactta tagtcgcttt gtttttattt tttaatgtat 120
ttgtagtgta ggaggataat ctatggctag caaaggagaa gaacttttca catg 174
<210> 4
<211> 154
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
gccacggaaa tcaataacct gaagatatgt gcgacgagct tttcataaat ctgtcataaa 60
tctgacgcat aatgacgtcg cattaatgat cgcaacctat ttattgtgta ggaggataat 120
ctatggctag caaaggagaa gaacttttca catg 154
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
agacagtcaa cgcgcttgat agcctggcga agatcatccg atcttcgcct tacacttttg 60
tttcacattt ctgtgacata ctatcggatg tgcggtaatt gtataggagg ataatctatg 120
<210> 6
<211> 125
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
gctatgccgg actgaatgtc caccgtcagt aatttttata cccggcgtaa ctgccgggtt 60
attgcttgtc acaaaaaagt ggtagactca tgcagttaac tcactgtgta ggaggataat 120
ctatg 125
<210> 7
<211> 206
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 7
catccataaa ttttgcataa ttaatgtaaa gaccaggctc gccagtaacg ctaaattcat 60
ttggctgtaa gcgcggtgtc atccgcgtca ggaaaattaa acagttactt taaaaaatga 120
aaacgtaaaa aggttgggtt tcgatgtatt gacgggtaaa ctttgtcgcc cgctaaacat 180
ttgtttgtgt aggaggataa tctatg 206
<210> 8
<211> 184
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 8
aatcctgctg aaagcacaca gcttttttca tcactgtcat cactctgtca tctttccagt 60
agaaactaat gtcactgaaa tggtgtttta tagttaaata taagtaaata tattgttgca 120
ataaatgcga gatctgttgt acttattaag tagcagcgga agttcgtgta ggaggataat 180
ctat 184
<210> 9
<211> 359
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 9
ctacagagat gacgtgtaga aaatagttac cgatataaat agttacagct aaacgcctga 60
aattacatgt cgagggcact atttaaaaca attttgagga tttccttata ttggtggtta 120
gtacgcatgc aattaaaaat gaaattccgc gaccacaagc caaaataaca aacggcaagg 180
agacaaaaat aagcacaaat agccaacacg tcctctgttc actttaaagg gaatcgctga 240
aaaatacgct ctgtttaagg ggattcacct ttctcagaaa gctattccgc ccttttcctg 300
ctgagaaatc gccacattcg gcatgacaac attgtgaaag tgtaggagga taatctatg 359
<210> 10
<211> 156
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 10
accgaactga agcaggatta caccgtggtg atcgtcaccc acaacatgca gcaggctgcg 60
cgttgttccg accacacggc gtttatgtac ctgggcgaat tgattgagtt cagcaacacg 120
gacgatctgt tcaccagtgt aggaggataa tctatg 156
<210> 11
<211> 151
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 11
aagactttat ctctctgtca taaaactgtc atattcctta catataactg tcacctgttt 60
gtcctatttt gcttctcgta gccaacaaac aatgctttat gagtgtagga ggataatcta 120
tggctagcaa aggagaagaa cttttcacat g 151
<210> 12
<211> 186
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 12
agcatggcgt tttgttgcgc gggatcagca agcctagcgg cagttgttta cgcttttatt 60
acagatttaa taaattacca cattttaaga atattattaa tctgtaatat atctttaaca 120
atctcaggtt aaaaactttc ctgttttcaa cgggactctc ccgctggtgt aggaggataa 180
tctatg 186
<210> 13
<211> 384
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 13
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120
gcgtttatac acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 180
tgctggataa cgtgcgtaat tgtgctgatc tcttatatag ctgctctcat tatctctcta 240
ccctgaagtg actctctcac ctgtaaaaat aatatctcac aggcttaata gtttcttaat 300
acaaagcctg taaaacgtca ggataacttc tatattcagg gagaccacaa cggtttccct 360
ctacaaataa ttttgtttaa cttt 384
<210> 14
<211> 284
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 14
cgcaaaaaac cccgcttcgg cggggttttt tcgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60
gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120
gataacgcca cggaaatcaa taacctgaag atatgtgcga cgagcttttc ataaatctgt 180
cataaatctg acgcataatg acgtcgcatt aatgatcgca acctatttat tatattcagg 240
gagaccacaa cggtttccct ctacaaataa ttttgtttaa cttt 284
<210> 15
<211> 365
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 15
cgccgaaaac cccgcttcgg cggggttttg ccgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60
gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120
gataaccatc cataaatttt gcataattaa tgtaaagacc aggctcgcca gtaacgctaa 180
attcatttgg ctgtaagcgc ggtgtcatcc gcgtcaggaa aattaaacag ttactttaaa 240
aaatgaaaac gtaaaaaggt tgggtttcga tgtattgacg ggtaaacttt gtcgcccgct 300
aaacatttgt ttatattcag ggagaccaca acggtttccc tctacaaata attttgttta 360
acttt 365
<210> 16
<211> 320
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 16
aaaaaaaaac cccgcccctg acagggcggg gtttttttta cgtctccatc gcttgcccaa 60
gttgtgaagc acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 120
tgctggataa caccgaactg aagcaggatt acaccgtggt gatcgtcacc cacaacatgc 180
agcaggctgc gcgttgttcc gaccacacgg cgtttatgta cctgggcgaa ttgattgagt 240
tcagcaacac ggacgatctg ttcaccaata ttcagggaga ccacaacggt ttccctctac 300
aaataatttt gtttaacttt 320
<210> 17
<211> 350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 17
cgccgcaaac cccgcccctg acagggcggg gtttcgccgc acgtctccat cgcttgccca 60
agttgtgaag cacagctaac accacgtcgt ccctatctgc tgccctaggt ctatgagtgg 120
ttgctggata acaatcctgc tgaaagcaca cagctttttt catcactgtc atcactctgt 180
catctttcca gtagaaacta atgtcactga aatggtgttt tatagttaaa tataagtaaa 240
tatattgttg caataaatgc gagatctgtt gtacttatta agtagcagcg gaagttcata 300
ttcagggaga ccacaacggt ttccctctac aaataatttt gtttaacttt 350
<210> 18
<211> 208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 18
cgccgaaaac cccgcttcgg cggggttttg ccgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60
gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120
gataacttta cgggcatgca taaggctcgt aggctatatt cagggagacc acaacggttt 180
ccctctacaa ataattttgt ttaacttt 208
<210> 19
<211> 213
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 19
aaaaaaaaac cccgcccctg acagggcggg gtttttttta cgtctccatc gcttgcccaa 60
gttgtgaagc acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 120
tgctggataa ctttacgggc atgcataagg ctcgtaatat atattcaggg agaccacaac 180
ggtttccctc tacaaataat tttgtttaac ttt 213
<210> 20
<211> 214
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 20
cgccgcaaac cccgcccctg acagggcggg gtttcgccgc acgtctccat cgcttgccca 60
agttgtgaag cacagctaac accacgtcgt ccctatctgc tgccctaggt ctatgagtgg 120
ttgctggata actttacggg catgcataag gctcgtatga tatattcagg gagaccacaa 180
cggtttccct ctacaaataa ttttgtttaa cttt 214
<210> 21
<211> 208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 21
cgcaaaaaac cccgcttcgg cggggttttt tcgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60
gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120
gataacttta cgggcatgca taaggctcgt ataatatatt cagggagacc acaacggttt 180
ccctctacaa ataattttgt ttaacttt 208
<210> 22
<211> 429
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 22
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120
gcgtttatac acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 180
tgctggataa cctccttcac agattcccaa tctcttgtta aataacgaaa aagcatcaat 240
taaaacccat gtctttctat attccagcaa tgttttatag gggacatatt gatgaagatg 300
ggtatcacct tagtgaattg ctataagctg ctcttttttg ttcgtgatat actgataaat 360
tgaattttca cacttcatat tcagggagac cacaacggtt tccctctaca aataattttg 420
tttaacttt 429
<210> 23
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 23
taacaataaa aatgaaaatg atttccacga tacagaaaaa agagactgtc atcctaattt 60
ttgttgacac tctatc 76
<210> 24
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 24
tgccactcag gtatgatggg cagaatattg cctctgcccg ccagaaaaag atcaaaggga 60
aaactgtcca tatgc 75
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 25
ccgacaggga ttccatctg 19
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 26
tatgacgacc attttgtcta cagttc 26
<210> 27
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
ggacttttgt acttcctgtt tcgatttagt tggcaattta ggtagcaaac tcctaatttt 60
tgttgacact ctatc 75
<210> 28
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 28
ataaaaacgg cgctaaaaag cgccgttttt tttgacggtg gtaaagccga atcaaaggga 60
aaactgtcca tatgc 75
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 29
cctgactgta ctaacggttg ag 22
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 30
tgacttttat ggcgttcttt gtttttg 27
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 31
ctggtacacg ctgatgaaca cc 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 32
ctggtcattg ccatttgtgc c 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 33
gaatcagagc gttccgaccc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 34
gtacgcagtt tgccaacgtg 20
<210> 35
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 35
aatagcccgc tgatatcatc gataatacta aaaaaacagg gaggctatta tcctaatttt 60
tgttgacact ctatc 75
<210> 36
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 36
tacagggatc cagttatcaa taagcaaatt catttgttct ccttcatatg atcaaaggga 60
aaactgtcca tatgc 75
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 37
caagacatgt gtatatcact gtaattc 27
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 38
gcgattgcag atttatgatt tgg 23
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 39
gcaaaatgct ggctcattg 19
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 40
gaactgaatg gcaaactgac tg 22
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 41
tggggatgat cgaccaca 18
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 42
tatcatcctg aaagcgatgg 20
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 43
atctcaccgt gtgatcgg 18
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 44
caaaagagat tctgggtatt cact 24
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 45
ctgctggaaa ccatgcg 17
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 46
agagcatgtc gttataggag gtgat 25
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 47
agtactcaac caagtcattc tg 22
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 48
gagcatggtg atcttctcag t 21
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 49
gcgatgaatg tcttactacg ga 22
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 50
gtcgctgggt aatctgcaa 19
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 51
atcaacgcat atagcgctag cag 23
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 52
actgaagccc agacgatc 18
<210> 53
<211> 3527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 53
tcctaatttt tgttgacact ctatcattga tagagttatt ttaccactcc ctatcagtga 60
tagagaaaag tgaaatgaat agttcgacaa agatcgcatt ggtaattacg ttactcgatg 120
ccatggggat tggccttatc atgccagtct tgccaacgtt attacgtgaa tttattgctt 180
cggaagatat cgctaaccac tttggcgtat tgcttgcact ttatgcgtta atgcaggtta 240
tctttgctcc ttggcttgga aaaatgtctg accgatttgg tcggcgccca gtgctgttgt 300
tgtcattaat aggcgcatcg ctggattact tattgctggc tttttcaagt gcgctttgga 360
tgctgtattt aggccgtttg ctttcaggga tcacaggagc tactggggct gtcgcggcat 420
cggtcattgc cgataccacc tcagcttctc aacgcgtgaa gtggttcggt tggttagggg 480
caagttttgg gcttggttta atagcggggc ctattattgg tggttttgca ggagagattt 540
caccgcatag tccctttttt atcgctgcgt tgctaaatat tgtcactttc cttgtggtta 600
tgttttggtt ccgtgaaacc aaaaatacac gtgataatac agataccgaa gtaggggttg 660
agacgcaatc gaattcggta tacatcactt tatttaaaac gatgcccatt ttgttgatta 720
tttatttttc agcgcaattg ataggccaaa ttcccgcaac ggtgtgggtg ctatttaccg 780
aaaatcgttt tggatggaat agcatgatgg ttggcttttc attagcgggt cttggtcttt 840
tacactcagt attccaagcc tttgtggcag gaagaatagc cactaaatgg ggcgaaaaaa 900
cggcagtact gctcggattt attgcagata gtagtgcatt tgccttttta gcgtttatat 960
ctgaaggttg gttagttttc cctgttttaa ttttattggc tggtggtggg atcgctttac 1020
ctgcattaca gggagtgatg tctatccaaa caaagagtca tcagcaaggt gctttacagg 1080
gattattggt gagccttacc aatgcaaccg gtgttattgg cccattactg tttgctgtta 1140
tttataatca ttcactacca atttgggatg gctggatttg gattattggt ttagcgtttt 1200
actgtattat tatcctgcta tcgatgacct tcatgttaac ccctcaagct caggggagta 1260
aacaggagac aagtgcttag ttatttcgtc accaaatgat gttattccgc gaaatataat 1320
gaccctcttg ataacccaag agcatcacat atacctgccg ttcactatta tttagtgaaa 1380
tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc aactttatgc ccatgcaaca 1440
gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag attttttagt tctttaggcc 1500
cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa agaggaaaat agaccagttg 1560
caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta aatcgcgcgg gtttgttact 1620
gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt gtatactttg gcgtcacccc 1680
ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact tgccatcttc aaacaggagg 1740
gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg agacatgaac gatgaacatc 1800
aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta ccgcactgct ggcaggaggc 1860
gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat ataaggaaac atacggcatt 1920
tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac agcaaaaaaa tgaaaaatat 1980
caagttcctg agttcgattc gtccacaatt aaaaatatct cttctgcaaa aggcctggac 2040
gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg tcgcaaacta tcacggctac 2100
cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg atgacacatc gatttacatg 2160
ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga aaaacgctgg ccgcgtcttt 2220
aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa aagaccaaac acaagaatgg 2280
tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt tattctacac tgatttctcc 2340
ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag ttaacgtatc agcatcagac 2400
agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa tctttgacgg tgacggaaaa 2460
acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact acagctcagg cgacaaccat 2520
acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca aatacttagt atttgaagca 2580
aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt tatttaacaa agcatactat 2640
ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac ttctgcaaag cgataaaaaa 2700
cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg agctaaacga tgattacaca 2760
ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag taacagatga aattgaacgc 2820
gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca ctgactcccg cggatcaaaa 2880
atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc ttggttatgt ttctaattct 2940
ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg tgttaaaaat ggatcttgat 3000
cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac ctcaagcgaa aggaaacaat 3060
gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg cagacaaaca atcaacgttt 3120
gcgccaagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat ctgttgtcaa agacagcatc 3180
cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca aaagaaaatg ccgatattga 3240
ctaccggaag cagtgtgacc gtgtgcttct caaatgcctg attcaggctg tctatgtgtg 3300
actgttgagc tgtaacaagt tgtctcaggt gttcaatttc atgttctagt tgctttgttt 3360
tactggtttc acctgttcta ttaggtgtta catgctgttc atctgttaca ttgtcgatct 3420
gttcatggtg aacagcttta aatgcaccaa aaactcgtaa aagctctgat gtatctatct 3480
tttttacacc gttttcatct gtgcatatgg acagttttcc ctttgat 3527
<210> 54
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 54
aaatgatttc cacgatacag aaaaaagaga ctgtcatggg cagaatattg cctctgcccg 60
ccagaaaaag 70
<210> 55
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 55
ctgtttcgat ttagttggca atttaggtag caaactcggc tttaccaccg tcaaaaaaaa 60
cggcgctttt 70
<210> 56
<211> 476
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 56
caagacatgt gtatatcact gtaattcgat atttatgagc agcatcgaaa aatagcccgc 60
tgatatcatc gataatacta aaaaaacagg gaggctatta ccaggcatca aataaaacga 120
aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 180
tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttatat ctttctgaca 240
ccttactatc ttacaaatgt aacaaaaaag ttatttttct gtaattcgag catgtcatgt 300
taccccgcga gcataaaacg cgtgtgtagg aggataatct ttgacggcta gctcagtcct 360
aggtacagtg ctagccatat gaaggagaac aaatgaattt gcttattgat aactggatcc 420
ctgtacgccc gcgaaacggg gggaaagtcc aaatcataaa tctgcaatcg ctatac 476
<210> 57
<211> 974
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 57
caagacatgt gtatatcact gtaattcgat atttatgagc agcatcgaaa aatagcccgc 60
tgatatcatc gataatacta aaaaaacagg gaggctatta ccaggcatca aataaaacga 120
aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 180
tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttatat ctttctgaca 240
ccttactatc ttacaaatgt aacaaaaaag ttatttttct gtaattcgag catgtcatgt 300
taccccgcga gcataaaacg cgtgtgtagg aggataatct atggatttgt cacagctaac 360
accacgtcgt ccctatctgc tgcgtgcatt ctatgagtgg ttgctggata accagctcac 420
gccgcacctg gtggtggatg tgacgctccc tggcgtgcag gttcctatgg aatatgcgcg 480
tgacgggcaa atcgtactca acattgcgcc gcgtgctgtc ggcaatctgg aactggcgaa 540
tgatgaggtg cgctttaacg cgcgctttgg tggcattccg cgtcaggttt ctgtgccgct 600
ggctgccgtg ctggctatct acgcccgtga aaatggcgca ggcacgatgt ttgagcctga 660
agctgcctac gatgaagata ccagcatcat gaatgatgaa gaggcatcgg cagacaacga 720
aaccgttatg tcggttattg atggcgacaa gccagatcac gatgatgaca ctcatcctga 780
cgatgaacct ccgcagccac cacgcggtgg tcgaccggca ttacgcgttg tgaagtaatt 840
gacggctagc tcagtcctag gtacagtgct agccatatga aggagaacaa atgaatttgc 900
ttattgataa ctggatccct gtacgcccgc gaaacggggg gaaagtccaa atcataaatc 960
tgcaatcgct atac 974
<210> 58
<211> 970
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 58
ctattgaaga tgtgggtaac tctgcggcat tcctgtgctc cgatctctct gccggtatct 60
ccggtgaagt ggtccacgtt gacggcggtt tcagcattgc tgcaatgaac gaactcgaac 120
tgaaagcggc caacgatgaa aactattctg aaaactatgc ggatgcgtct taataggaag 180
ttcctattct ctagaaagta taggaacttc cgaatccatg tgggagttta ttcttgacac 240
agatatttat gatataataa ctgagtaagc ttaacataag gaggaaaaac atatgttacg 300
cagcagcaac gatgttacgc agcagggcag tcgccctaaa acaaagttag gtggctcaag 360
tatgggcatc attcgcacat gtaggctcgg ccctgaccaa gtcaaatcca tgcgggctgc 420
tcttgatctt ttcggtcgtg agttcggaga cgtagccacc tactcccaac atcagccgga 480
ctccgattac ctcgggaact tgctccgtag taagacattc atcgcgcttg ctgccttcga 540
ccaagaagcg gttgttggcg ctctcgcggc ttacgttctg cccaagtttg agcagccgcg 600
tagtgagatc tatatctatg atctcgcagt ctccggcgag caccggaggc agggcattgc 660
caccgcgctc atcaatctcc tcaagcatga ggccaacgcg cttggtgctt atgtgatcta 720
cgtgcaagca gattacggtg acgatcccgc agtggctctc tatacaaagt tgggcatacg 780
ggaagaagtg atgcactttg atatcgaccc aagtaccgcc acctaagaag ttcctattct 840
ctagaaagta taggaacttc cgttctgttg gtaaagatgg gcggcgttct gccgcccgtt 900
atctctgtta tacctttctg atatttgtta tcgccgatcc gtctttctcc ccttcccgcc 960
ttgcgtcagg 970
<210> 59
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 59
tctccaaagc ggccaacgat gaaaactatt ctgaaaacta tgcggatgcg tcttgattga 60
cagctagctc agtcctaggt ataatgctag caactttaaa attaaagagg tatatattaa 120
tgactaagca atataagaat tacgtaaatg gggagtggaa gctttcggag aatgaaatta 180
agatctatga accagccagt ggggcggaat tggggtcagt cccggcaatg tccactgaag 240
aagttgacta tgtctacgcc tcggccaaaa aagcgcagcc agcatggcgc tcgctttcct 300
atattgagcg tgcggcttat ttgcacaaag tcgcagacat cctgatgcgt gacaaggaga 360
aaattggagc ggtattgtcc aaggaagtag cgaaaggcta caaatccgca gtatcggagg 420
tcgtccgcac cgccgagatt attaattatg cggccgaaga agggcttcgc atggagggtg 480
aggtcttgga gggcggcagt tttgaggcgg catccaagaa aaaaatcgct gtcgtccgtc 540
gcgagccggt gggacttgtg cttgctatta gtccgttcaa ttaccccgtg aatctggccg 600
gctccaagat tgcccctgca ctgatcgcgg gcaatgtaat cgcttttaaa ccaccgaccc 660
aaggatcgat tagtggactt cttttagcgg aggcgtttgc ggaggcaggt cttccagccg 720
gcgtattcaa taccatcacg gggcgtggaa gtgaaatcgg ggattacatc gtggagcacc 780
aggcagtaaa tttcatcaac ttcacgggtt ccacggggat cggggagcgt atcggtaaga 840
tggctgggat gcgtccgatc atgttggaac ttggcggcaa ggatagtgcg attgtgctgg 900
aagacgcaga cttggaattg acagctaaaa acattatcgc tggagccttc gggtatagtg 960
gtcaacgttg cacggcagtt aagcgcgttc ttgttatgga aagtgtcgcg gatgaattgg 1020
tcgagaagat tcgcgagaaa gtgttagctc ttacgattgg aaatccagag gacgatgctg 1080
acatcactcc attgatcgac acgaaatccg cggattacgt cgaggggctg atcaacgacg 1140
cgaacgataa gggagcagcg gctttgaccg agatcaaacg cgaggggaac ctgatctgcc 1200
cgattctttt tgacaaagtc acaactgaca tgcgcttggc atgggaagaa cccttcggcc 1260
cagtcttgcc tattatccgc gttactagcg tagaggaagc aattgaaatt tccaataaat 1320
ccgaatatgg gttgcaagcg agtatcttta ctaacgattt tccacgtgcc tttggtattg 1380
cggaacagtt agaagtcggg acagttcaca tcaacaacaa gacgcagcgc gggacagata 1440
acttcccctt tttgggagca aagaagtctg gggctggaat ccaaggggtg aaatactcca 1500
tcgaagccat gacgacggtg aagagcgttg tttttgacat caagtaaaac ataaggagga 1560
aaaacagatg gcgaaactga cctcggcggt tccggttctg acggcacgtg atgtggcggg 1620
cgcggttgaa ttttggacgg atcgtctggg cttcagtcgt gattttgtgg aagatgactt 1680
cgcaggcgtg gttcgcgatg acgtcaccct gtttatttcc gcagttcagg atcaagtcgt 1740
gccggacaac acgctggctt gggtgtgggt tcgtggcctg gatgaactgt atgcggaatg 1800
gagcgaagtt gtctctacca atttccgtga cgcgagcggt ccggccatga cggaaatcgg 1860
cgaacagccg tggggtcgcg aatttgctct gcgtgacccg gctggcaact gtgtccattt 1920
cgtggctgaa gaacaagatt gagttgagat gacactgtga tctaaaaaga gcgacttcgg 1980
tcgctctttt ttttacctga 2000
<210> 60
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 60
acgaaaccgg ttactccaac aaagttctgg acctgatcgc tcacatctcc aaatgattga 60
cagctagctc agtcctaggt ataatgctag caactttaaa attaaagagg tatatattaa 120
tgactaagca atataagaat tacgtaaatg gggagtggaa gctttcggag aatgaaatta 180
agatctatga accagccagt ggggcggaat tggggtcagt cccggcaatg tccactgaag 240
aagttgacta tgtctacgcc tcggccaaaa aagcgcagcc agcatggcgc tcgctttcct 300
atattgagcg tgcggcttat ttgcacaaag tcgcagacat cctgatgcgt gacaaggaga 360
aaattggagc ggtattgtcc aaggaagtag cgaaaggcta caaatccgca gtatcggagg 420
tcgtccgcac cgccgagatt attaattatg cggccgaaga agggcttcgc atggagggtg 480
aggtcttgga gggcggcagt tttgaggcgg catccaagaa aaaaatcgct gtcgtccgtc 540
gcgagccggt gggacttgtg cttgctatta gtccgttcaa ttaccccgtg aatctggccg 600
gctccaagat tgcccctgca ctgatcgcgg gcaatgtaat cgcttttaaa ccaccgaccc 660
aaggatcgat tagtggactt cttttagcgg aggcgtttgc ggaggcaggt cttccagccg 720
gcgtattcaa taccatcacg gggcgtggaa gtgaaatcgg ggattacatc gtggagcacc 780
aggcagtaaa tttcatcaac ttcacgggtt ccacggggat cggggagcgt atcggtaaga 840
tggctgggat gcgtccgatc atgttggaac ttggcggcaa ggatagtgcg attgtgctgg 900
aagacgcaga cttggaattg acagctaaaa acattatcgc tggagccttc gggtatagtg 960
gtcaacgttg cacggcagtt aagcgcgttc ttgttatgga aagtgtcgcg gatgaattgg 1020
tcgagaagat tcgcgagaaa gtgttagctc ttacgattgg aaatccagag gacgatgctg 1080
acatcactcc attgatcgac acgaaatccg cggattacgt cgaggggctg atcaacgacg 1140
cgaacgataa gggagcagcg gctttgaccg agatcaaacg cgaggggaac ctgatctgcc 1200
cgattctttt tgacaaagtc acaactgaca tgcgcttggc atgggaagaa cccttcggcc 1260
cagtcttgcc tattatccgc gttactagcg tagaggaagc aattgaaatt tccaataaat 1320
ccgaatatgg gttgcaagcg agtatcttta ctaacgattt tccacgtgcc tttggtattg 1380
cggaacagtt agaagtcggg acagttcaca tcaacaacaa gacgcagcgc gggacagata 1440
acttcccctt tttgggagca aagaagtctg gggctggaat ccaaggggtg aaatactcca 1500
tcgaagccat gacgacggtg aagagcgttg tttttgacat caagtaaaac ataaggagga 1560
aaaacagatg gcgaaactga cctcggcggt tccggttctg acggcacgtg atgtggcggg 1620
cgcggttgaa ttttggacgg atcgtctggg cttcagtcgt gattttgtgg aagatgactt 1680
cgcaggcgtg gttcgcgatg acgtcaccct gtttatttcc gcagttcagg atcaagtcgt 1740
gccggacaac acgctggctt gggtgtgggt tcgtggcctg gatgaactgt atgcggaatg 1800
gagcgaagtt gtctctacca atttccgtga cgcgagcggt ccggccatga cggaaatcgg 1860
cgaacagccg tggggtcgcg aatttgctct gcgtgacccg gctggcaact gtgtccattt 1920
cgtggctgaa gaacaagatt gagttgagat gacactgtga tctaaaaaga gcgacttcgg 1980
tcgctctttt ttttacctga 2000
<210> 61
<211> 907
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 61
tctaccgatt tcaacggcga agtttgcact tccgtgttcg atgctaaagc tggtatcgct 60
ctgaacgaca acttcgtgaa actggtatcc tggtacgaca acgaaaccgg ttactccaac 120
aaagttctgg acctgatcgc tcacatctcc aaagcggcca acgatgaaaa ctattctgaa 180
aactatgcgg atgcgtcttg atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta caaactcttt 240
ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 300
aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag taatggcgaa actgacctcg gcggttccgg 360
ttctgacggc acgtgatgtg gcgggcgcgg ttgaattttg gacggatcgt ctgggcttca 420
gtcgtgattt tgtggaagat gacttcgcag gcgtggttcg cgatgacgtc accctgttta 480
tttccgcagt tcaggatcaa gtcgtgccgg acaacacgct ggcttgggtg tgggttcgtg 540
gcctggatga actgtatgcg gaatggagcg aagttgtctc taccaatttc cgtgacgcga 600
gcggtccggc catgacggaa atcggcgaac agccgtgggg tcgcgaattt gctctgcgtg 660
acccggctgg caactgtgtc catttcgtgg ctgaagaaca agattgagtt gagatgacac 720
tgtgatctaa aaagagcgac ttcggtcgct ctttttttta cctgataaaa tgaagttaaa 780
ggactgcgtc atgattaaga aaatttttgc ccttccggtc atcgaacaaa tctcccctgt 840
cctctcccgt cgtaaactgg atgaactgga cctcattgtg gtcgatcatc cccaggtaaa 900
agcctct 907
<210> 62
<211> 1421
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 62
gtattccgtc ttccatgttc accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg 60
cccactggag cgaaatgcac agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata 120
caggatatga aaaacgcgac tttaaaagcg atatcaagcg tgcggccaac gatgaaaact 180
attctgaaaa ctatgcggat gcgtcttaat agtcctgacg gatggccttt ttgcgtttct 240
acaaactctt tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 300
taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 360
cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 420
acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 480
ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 540
atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa 600
gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc 660
acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc 720
atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 780
accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag 840
ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctacagc aatggcaaca 900
acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 960
gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 1020
tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 1080
ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca 1140
actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 1200
taactgtcag actaatggtt gattgctaag ttgtaaatat tttaacccgc cgttcatatg 1260
gcgggttgat ttttatatgc ctaaacacaa aaaattgtaa aaataaaatc cattaacaga 1320
cctatataga tatttaaaaa gaatagaaca gctcaaatta tcagcaaccc aatactttca 1380
attaaaaact tcatggtagt cgcatttata accctatgaa a 1421
<210> 63
<211> 1078
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 63
accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 60
agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 120
tttaaaagcg atatcaagcg tgcggccaac gatgaaaact attctgaaaa ctatgcggat 180
gcgtcttaat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactcttttt gtttattttt 240
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 300
atattgaaaa aggaagagta tgactgaata caagcccacg gtacgcttgg cgacgcgcga 360
cgatgttccc cgcgctgttc gtacattagc tgcggccttt gcagattacc cagcgacgcg 420
ccatacggtc gatccggacc gccatatcga gcgtgtcaca gaattgcagg aacttttctt 480
aactcgcgtg ggccttgaca tcggaaaggt ctgggtggct gacgatggcg ctgcagtggc 540
tgtttggacc actccggaga gtgtagaggc tggtgcagtg ttcgccgaaa ttggtcctcg 600
tatggccgaa ttaagtggaa gtcgtctggc agcccaacaa caaatggaag ggttgcttgc 660
gccccaccgt ccgaaagaac ccgcgtggtt ccttgccacc gttggagtaa gcccagatca 720
ccaggggaag ggtttaggat ctgccgtagt tttaccaggt gtggaggcag cagaacgtgc 780
gggagttccg gccttccttg agacgtcggc gccgcgcaat ttaccgtttt acgaacgtct 840
tggattcacc gttacggcgg acgtggaggt gccggaggga ccccgtactt ggtgtatgac 900
tcgtaaaccg ggagcctgat aatggttgat tgctaagttg taaatatttt aacccgccgt 960
tcatatggcg ggttgatttt tatatgccta aacacaaaaa attgtaaaaa taaaatccat 1020
taacagacct atatagatat ttaaaaagaa tagaacagct caaattatca gcaaccca 1078
<210> 64
<211> 869
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 64
gtattccgtc ttccatgttc accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg 60
cccactggag cgaaatgcac agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata 120
caggatatga aaaacgcgac tttaaaagcg atatcaagcg tgcggccaac gatgaaaact 180
attctgaaaa ctatgcggat gcgtcttaat agttgacaat taatcatcgg catagtatat 240
cggcatagta taatacgact cactatagga gggccatcat ggccaagttg accagtgccg 300
ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg 360
ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc 420
tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg 480
tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg 540
acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc 600
tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact ttgtggcaga ggagcaggac tgaggataag 660
taatggttga ttgctaagtt gtaaatattt taacccgccg ttcatatggc gggttgattt 720
ttatatgcct aaacacaaaa aattgtaaaa ataaaatcca ttaacagacc tatatagata 780
tttaaaaaga atagaacagc tcaaattatc agcaacccaa tactttcaat taaaaacttc 840
atggtagtcg catttataac cctatgaaa 869
<210> 65
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 65
gcggcgagct gctgggtgaa atcggcctgg caatcgaaat gggttgtgat gctgaagaca 60
tcgcactgac catccacgcg cacccgactc tgcacgagtc tgtgggcctg gcggcagaag 120
tgttcgaagg tagcattacc gacctgccga acccgaaagc gaagaagaag gcggccaacg 180
atgaaaacta ttctgaaaac tatgcggatg cgtcttaata gcgaatccat gtgggagttt 240
attcttgaca cagatattta tgatataata actgagtaag cttaacataa ggaggaaaaa 300
catatgttac gcagcagcaa cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta 360
ggtggctcaa gtatgggcat cattcgcaca tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc 420
atgcgggctg ctcttgatct tttcggtcgt gagttcggag acgtagccac ctactcccaa 480
catcagccgg actccgatta cctcgggaac ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt 540
gctgccttcg accaagaagc ggttgttggc gctctcgcgg cttacgttct gcccaagttt 600
gagcagccgc gtagtgagat ctatatctat gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg 660
cagggcattg ccaccgcgct catcaatctc ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct 720
tatgtgatct acgtgcaagc agattacggt gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag 780
ttgggcatac gggaagaagt gatgcacttt gatatcgacc caagtaccgc cacctaattt 840
ttcgtttgcc ggaacatccg gcaattaaaa aagcggctaa ccacgccgct ttttttacgt 900
ctgcaattta cctttccagt cttcttgctc cacgttcaga gagacgttcg catactgctg 960
accgttgctc gttattcagc ctgacagtat ggttactgtc 1000
<210> 66
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 66
tctgggtatt cactgctttg gcgagcgcgc tgccgaaatt attcatatcg gtcaggcgat 60
tatggaacag aaaggtggcg gcaacactat tgagtacttc gtcaacacca cctttaacta 120
cccgacgatg gcggaagcct atcgggtagc tgcgttaaac ggtttaaacc gcctgtttgc 180
ggccaacgat gaaaactatt ctgaaaacta tgcggatgcg tcttaatagt tgacaattaa 240
tcatcggcat agtatatcgg catagtataa tacgactcac tataggaggg ccatcatgaa 300
gaccttcaac atctctcagc aggatctgga gctggtggag gtcgccactg agaagatcac 360
catgctctat gaggacaaca agcaccatgt cggggcggcc atcaggacca agactgggga 420
gatcatctct gctgtccaca ttgaggccta cattggcagg gtcactgtct gtgctgaagc 480
cattgccatt gggtctgctg tgagcaacgg gcagaaggac tttgacacca ttgtggctgt 540
caggcacccc tactctgatg aggtggacag atccatcagg gtggtcagcc cctgtggcat 600
gtgcagagag ctcatctctg actatgctcc tgactgcttt gtgctcattg agatgaatgg 660
caagctggtc aaaaccacca ttgaggaact catccccctc aagtacacca ggaactaaag 720
taaaacttta tcgaaatggc catccattct tgcgcggatg gcctctgcca gctgctcata 780
gcggctgcgc agcggtgagc caggacgata aaccaggcca atagtgcggc gtggttccgg 840
cttaatgcac gg 852
<210> 67
<211> 898
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 67
gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 60
gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 120
acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gaggcggcca acgatgaaaa ctattctgaa 180
aactatgcgg atgcgtctta atagttgaca attaatcatc ggcatagtat atcggcatag 240
tataatacga ctcactatag gagggccatc atgaagacct tcaacatctc tcagcaggat 300
ctggagctgg tggaggtcgc cactgagaag atcaccatgc tctatgagga caacaagcac 360
catgtcgggg cggccatcag gaccaagact ggggagatca tctctgctgt ccacattgag 420
gcctacattg gcagggtcac tgtctgtgct gaagccattg ccattgggtc tgctgtgagc 480
aacgggcaga aggactttga caccattgtg gctgtcaggc acccctactc tgatgaggtg 540
gacagatcca tcagggtggt cagcccctgt ggcatgtgca gagagctcat ctctgactat 600
gctcctgact gctttgtgct cattgagatg aatggcaagc tggtcaaaac caccattgag 660
gaactcatcc ccctcaagta caccaggaac taaagtaata tctgcgctta tcctttatgg 720
ttattttacc ggtaacatga tcttgcgcag attgtagaac aatttttaca ctttcaggcc 780
tcgtgcggat tcacccacga ggcttttttt attacactga ctgaaacgtt tttgccctat 840
gagctccggt tacaggcgtt tcagtcataa atcctctgaa tgaaacgcgt tgtgaatc 898
<210> 68
<211> 1181
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 68
gcgtgcgcac catgacggtg gggaccgtct cgatggatat gctagcggtc gatttaacgc 60
cttgcccgca ggcgggtatt ggtacgccgg ttgagctgtg gggcaaggag atcaaaattg 120
atgatgtcgc cgccgctgcc ggaacggtgg gctatgagtt gatgtgcgcg ctggcgctac 180
gcgtcccggt tgtgacggtg gcggccaacg atgaaaacta ttctgaaaac tatgcggatg 240
cgtcttaatc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actctttttg tttatttttc 300
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 360
tattgaaaaa ggaagagtat gactgaatac aagcccacgg tacgcttggc gacgcgcgac 420
gatgttcccc gcgctgttcg tacattagct gcggcctttg cagattaccc agcgacgcgc 480
catacggtcg atccggaccg ccatatcgag cgtgtcacag aattgcagga acttttctta 540
actcgcgtgg gccttgacat cggaaaggtc tgggtggctg acgatggcgc tgcagtggct 600
gtttggacca ctccggagag tgtagaggct ggtgcagtgt tcgccgaaat tggtcctcgt 660
atggccgaat taagtggaag tcgtctggca gcccaacaac aaatggaagg gttgcttgcg 720
ccccaccgtc cgaaagaacc cgcgtggttc cttgccaccg ttggagtaag cccagatcac 780
caggggaagg gtttaggatc tgccgtagtt ttaccaggtg tggaggcagc agaacgtgcg 840
ggagttccgg ccttccttga gacgtcggcg ccgcgcaatt taccgtttta cgaacgtctt 900
ggattcaccg ttacggcgga cgtggaggtg ccggagggac cccgtacttg gtgtatgact 960
cgtaaaccgg gagcctgata acttgttgta agccggatcg gaggcaacgt cttctgggtg 1020
caaaaaaatc atccatccgg ctggtcagca actgtagttg ttaatgtgac agagccattg 1080
cccatgatag tgtccattaa aaggatggac actatttccc cggaacctga actcaccgca 1140
caggcgttct acataaaacg cttacgcttc attgttgact c 1181
<210> 69
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 69
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cg 92
<210> 70
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 70
gtttatctgt tcgtatcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59
<210> 71
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 71
ggttattata atcaacggtt tatccccgct ggcgcgggga actcgaggtg gtaccagatc 60
<210> 72
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 72
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc ggtttttgta attttacagg caacctttta 60
ttcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cg 92
<210> 73
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 73
caggcaacct tttattcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59
<210> 74
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 74
taaaattaca aaaaccggtt tatccccgct ggcgcgggga actcgaggtg gtaccagatc 60
<210> 75
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 75
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 93
<210> 76
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 76
gcgtaaaagt tatgaagttc gagttccccg cgccagcggg gataaaccga aaaaaaaacc 60
cc 62
<210> 77
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 77
attatatgct tttcggttta tccccgctgg cgcggggaac tcgaggtggt accagatct 59
<210> 78
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 78
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gtattgacca attcattcgg gacagttatt 60
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accg 94
<210> 79
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 79
gggacagtta ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59
<210> 80
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 80
gaatgaattg gtcaatacgg tttatccccg ctggcgcggg gaactcgagg tggtaccaga 60
tct 63
<210> 81
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 81
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gagtggttgc tggataactt tacgggcatg 60
ctcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cg 92
<210> 82
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 82
aactttacgg gcatgctcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgaaa aaaaaacccc 60
<210> 83
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 83
atccagcaac cactcggttt atccccgctg gcgcggggaa ctcgaggtgg taccagatct 60
<210> 84
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 84
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttaccattc tgttgctttt atgtataaga 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cg 92
<210> 85
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 85
ttttatgtat aagaatcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59
<210> 86
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 86
gcaacagaat ggtaacggtt tatccccgct ggcgcgggga actcgaggtg gtaccagatc 60
<210> 87
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 87
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gctcgtaaaa gcagtacagt gcaccgtaag 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cg 92
<210> 88
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 88
cagtgcaccg taagatcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59
<210> 89
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 89
tactgctttt acgagcggtt tatccccgct ggcgcgggga actcgaggtg gtaccagatc 60
<210> 90
<211> 154
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 90
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accg 154
<210> 91
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 91
gcgccagcgg ggataaaccg aaaagcatat aatgcg 36
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 92
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 93
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 94
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 94
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59
<210> 95
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 95
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgtattgacc aattcattcg ggacagttat 120
tagttcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccg 155
<210> 96
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 96
gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37
<210> 97
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 97
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 98
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 99
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 99
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59
<210> 100
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 100
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgttaccatt ctgttgcttt tatgtataag 120
aatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153
<210> 101
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 101
gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34
<210> 102
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 102
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 103
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 103
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 104
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 104
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59
<210> 105
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 105
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgctcgtaaa agcagtacag tgcaccgtaa 120
gatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 106
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 107
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 107
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 108
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 108
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 109
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 109
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59
<210> 110
<211> 156
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 110
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120
ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccg 156
<210> 111
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 111
gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37
<210> 112
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 112
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 113
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 113
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 114
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 114
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47
<210> 115
<211> 154
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 115
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgttaccat tctgttgctt ttatgtataa 120
gaatcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accg 154
<210> 116
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 116
gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34
<210> 117
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 117
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 118
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 118
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 119
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 119
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47
<210> 120
<211> 154
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 120
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgctcgtaa aagcagtaca gtgcaccgta 120
agatcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accg 154
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 121
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 122
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 122
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 123
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 123
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 124
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 124
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47
<210> 125
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 125
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gtattgacca attcattcgg gacagttatt 60
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgttacca ttctgttgct tttatgtata 120
agaatcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccg 155
<210> 126
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 126
gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34
<210> 127
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 127
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 128
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 128
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 129
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 129
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44
<210> 130
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 130
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gtattgacca attcattcgg gacagttatt 60
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgctcgta aaagcagtac agtgcaccgt 120
aagatcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccg 155
<210> 131
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 131
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 132
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 132
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 133
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 134
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 134
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44
<210> 135
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 135
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttaccattc tgttgctttt atgtataaga 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgctcgtaaa agcagtacag tgcaccgtaa 120
gatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153
<210> 136
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 136
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 137
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 137
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 138
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 138
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 139
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 139
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48
<210> 140
<211> 217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 140
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180
attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217
<210> 141
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 141
gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37
<210> 142
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 142
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 143
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 143
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 144
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 144
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47
<210> 145
<211> 217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 145
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120
ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccggttt ttgtaatttt acaggcaacc 180
ttttattcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217
<210> 146
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 146
gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40
<210> 147
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 147
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 148
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 148
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 149
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 149
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44
<210> 150
<211> 217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 150
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120
ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgttac cattctgttg cttttatgta 180
taagaatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217
<210> 151
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 151
gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34
<210> 152
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 152
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 153
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 153
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 154
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 154
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44
<210> 155
<211> 217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 155
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120
ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgctcg taaaagcagt acagtgcacc 180
gtaagatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 156
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 157
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 157
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 158
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 158
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 159
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 159
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44
<210> 160
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 160
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180
attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccggtt tttgtaattt tacaggcaac 240
cttttattcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278
<210> 161
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 161
gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40
<210> 162
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 162
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 163
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 163
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 164
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 164
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44
<210> 165
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 165
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180
attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240
ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278
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<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 166
gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37
<210> 167
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 167
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 168
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 168
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 169
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 169
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47
<210> 170
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 170
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180
attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgctc gtaaaagcag tacagtgcac 240
cgtaagatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278
<210> 171
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 171
gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37
<210> 172
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
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cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 173
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 174
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 174
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47
<210> 175
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 175
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120
ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgttac cattctgttg cttttatgta 180
taagaatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccggtt tttgtaattt tacaggcaac 240
cttttattcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278
<210> 176
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 176
gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40
<210> 177
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 177
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 178
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 178
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 179
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 179
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48
<210> 180
<211> 278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 180
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60
gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120
ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgttac cattctgttg cttttatgta 180
taagaatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgctc gtaaaagcag tacagtgcac 240
cgtaagatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278
<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 181
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 182
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 182
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 183
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 183
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 184
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 184
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48
<210> 185
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 185
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180
attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240
ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccggt ttttgtaatt ttacaggcaa 300
ccttttattc gagttccccg cgccagcggg gataaaccg 339
<210> 186
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 186
gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40
<210> 187
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 187
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 188
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 188
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 189
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 189
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48
<210> 190
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 190
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180
attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240
ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccgct cgtaaaagca gtacagtgca 300
ccgtaagatc gagttccccg cgccagcggg gataaaccg 339
<210> 191
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 191
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 192
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 192
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 193
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 193
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 194
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 194
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48
<210> 195
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 195
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120
agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180
attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240
ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccgct cgtaaaagca gtacagtgca 300
ccgtaagatc gagttccccg cgccagcggg gataaaccgg tttttgtaat tttacaggca 360
accttttatt cgagttcccc gcgccagcgg ggataaaccg 400
<210> 196
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 196
gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40
<210> 197
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 197
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 198
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 198
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 199
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 199
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atcttacggt gcactgtac 49
<210> 200
<211> 153
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 200
tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttaccattc tgttgctttt atgtataaga 60
atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgctcgtaaa agcagtacag tgcaccgtaa 120
gatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153
<210> 201
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 201
gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30
<210> 202
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 202
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28
<210> 203
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 203
ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28
<210> 204
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 204
cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48

Claims (5)

1.一种从遗传修饰的微生物(GMO)中生产产物的多阶段发酵生物工艺，包括：
鉴定用于产生产物的GMO；
在生长阶段，使所鉴定的GMO在培养基中生长，所述GMO包括：
i.生产途径，其包含至少一种用于产物生物合成的酶；以及
ii.合成代谢阀(SMV)组合，用于在诱导所述合成代谢阀时减少或消除所述GMO中通过多个代谢途径的通量，所述SMV包括：
a)沉默SMV，其使编码酶的基因的基因表达沉默，或
b)蛋白水解SMV，其控制酶的蛋白水解；
过渡到生产性稳定阶段，与缺乏所述生产途径或所述SMV的微生物相比，在该阶段所述GMO的生长被减慢或停止，产物生产被提高，通过至少诱导所述SMV进入所述生产性稳定阶段；以及
生产产物，
其中所述合成代谢阀组合产生遗传修饰的微生物，所述遗传修饰的微生物具有应对环境条件变化的稳健性，稳健性评分大于0.6，
其中所述稳健性评分通过以下方法计算：在多种不同的葡萄糖浓度和氧转移率条件下生产所述产物，确定所得产物的浓度的相对标准偏差(RSD)和最大偏差[(maxDev]，通过公式(1)计算所述稳健性评分，
公式(1)：
所述产物选自氨基酸、乙酸酯、乙偶姻、丙酮、丙烯酸、苹果酸酯、脂肪酸乙酯、类异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸酯、异丁酸酯、2-OH-异丁酸酯、3-OH丁酸酯、乙醇、异丙醇、D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、衣康酸、乙酰丙酸、葡萄糖酸、戊二酸、己内酰胺、己二酸、丙醇、杂醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸、马来酸和聚羟基丁酸酯，
通过所述沉默代谢阀进行沉默的酶和通过所述蛋白水解合成代谢阀进行蛋白水解的酶均由选自以下的基因进行编码：fabI、gltA、ldp、zwf和udhA。
2.根据权利要求1所述的多阶段发酵生物工艺，其中：
所述沉默SMV的特征在于：CRISPR干扰基因表达，以及表达包括指导RNA基因阵列的CASCADE质粒；或者
所述蛋白水解SMV的特征在于：表达可操作地连接至N末端或C末端标签的酶，以及在诱导所述合成代谢阀时，受控的蛋白水解对所述N末端或C末端标签具有选择性。
3.根据权利要求1所述的多阶段发酵生物工艺，其中所述鉴定用于产生产物的GMO的步骤包括：
获得多个微生物菌株，每个微生物菌株包括：
i.生产途径，其包含至少一种用于产物生物合成的酶；以及
ii.SMV组合，其用于在诱导所述SMV时减少或消除所述GMO中通过多个代谢途径的通量，所述SMV包括：
a)沉默的SMV，其使编码酶的基因的基因表达沉默，或
b)蛋白水解的SMV，其控制酶的蛋白水解；
其中，所述多个菌株中的每个菌株均与另一菌株不同，不同之处在于所表达的产物途径的酶或由合成代谢阀控制的至少一种酶；
在生长阶段，使所述多个微生物菌株中的每一个在培养基中独立生长；
过渡到生产性稳定阶段，与缺乏所述生产途径或SMV的微生物相比，在该阶段中所述GMO的生长被减慢或停止，产物生产被提高，通过至少诱导所述SMV进入所述生产稳定阶段；
生产产物；
在一段时间后，针对每个所述微生物菌株，测量在所述生产阶段生产的产物水平，以及
基于所述生产的产物的水平，从多个所述GMO中选择用于产物生产的遗传修饰的微生物。
4.根据权利要求1所述的多阶段发酵生物工艺，其中：
所述产物为丙氨酸；
用于产物生物合成的酶与GMO是异源的，以及
用于丙氨酸生产的异源的酶是以下之一：NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶(ald)、丙氨酸输出物(alaE)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapN)，或其组合。
5.根据权利要求1所述的多阶段发酵生物工艺，其中：
所述产物为甲羟戊酸或3-HP；
用于产物生物合成的酶与GMO是异源的，以及
用于甲羟戊酸或3-HP生产的异源酶是以下之一：乙酰基-CoA乙酰转移酶、NADPH依赖性HMG-CoA还原酶、HMG-CoA合酶，或其组合。
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