CN102317436B - 用于增加微生物对3-羟基丙酸(3-hp)的耐受性以及增加3-羟基丙酸产量的方法、系统和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及方法、系统和组合物,包括经遗传修饰的微生物,其经修改而显示出增加的3-羟基丙酸(3-HP)耐受性,尤其是通过改变在本文中鉴定为3-HP耐受形成性途径复合物(“3HPTGC”)的相关代谢途径。在多种实施方式中,这些生物是经遗传修饰的,从而获得增强的3-HP耐受性。另外,可以进行遗传修饰,以在包含3HPTGC的一个或多个遗传修饰的微生物中提供一个或多个3-HP生物合成途径的任意个的至少一个遗传修饰。
Description
相关申请
本申请要求以下美国临时专利申请的优先权:申请日为2008年7月23日的61/135,862;申请日为2008年8月12日的61/088,331;申请日为2008年9月15日的61/096,937;和申请日为2008年7月23日的61/135,861;上述各项全部通过引用的方式全文并入本文。
关于联邦政府支持开发的声明
本文公开的一些实施方式得到国家自然科学基金会的基金号BES0228584的部分支持。美国政府享有实施本发明的相应实施方式的一些权利。
关于序列表
本专利申请提供了纸质序列表,在后续申请中将以合适的格式以光盘提供。
通过引用并入
本文引用的所用参考文献都通过引用的方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及方法、系统和组合物,包括经遗传修饰的微生物,例如重组的微生物,其经修改而显示出对于化学品3-羟基丙酸(3-HP)的增强的耐受性。另外,例如在包含鉴定为3-HP耐受形成性途径复合物的复合物的一个或多个经遗传修饰的微生物中,可以进行遗传修饰以提供一种或多种3-HP生物合成途径。
背景技术
随着越来越多地接受石油烃的供给日益减少并且其成本在根本上日益升高,开发和改进工业微生物系统以生产化学品和燃料的兴趣已经增大。此类工业微生物系统能够完全或部分替代石油烃的使用,以生产某些化学品。
工业微生物系统中用于生物合成的一种候选化学品是3-羟基丙酸(“3-HP”,CAS No.503-66-2),如本文描述,其可被转化为聚合物的多种基础构建模块,所述聚合物用于多种工业和消费产品。不幸的是,之前的关于通过微生物合成3-HP以达到商业上可行的效价的尝试已揭示:所用的微生物被远低于确定的商业上可行效价的浓度的3-HP所抑制。
对所选微生物进行代谢工程化是产生经济上可行的工业微生物系统的一种方式,例如用于生产3-HP。此种定向代谢工程化的主要问题是确定在特定的靶微生物中引入何种遗传修饰、增加何种遗传修饰的拷贝数、和/或实现何种遗传修饰、和/或引入何种代谢途径(或其部分)、增加何种代谢途径的拷贝数、和/或修饰何种代谢途径。
代谢工程使用基因组学、蛋白质组学、生物信息学和代谢工程领域的知识和技术。此类知识和技术联同分子遗传学和重组技术中的一般能力,提供了关于多种目标物种的代谢生物化学和在其中进行遗传操作的高水平技能和知识。
虽然本领域有高水平的知识和技能,但是鉴别那些与特定目标表型相关的基因、酶、途径部分和/或完整代谢途径仍然是很麻烦的,有时是不准确的。在大肠杆菌细菌基因组中(见www.biocyc.org,12.0版,见菌株K-12),有至少4,580个基因(其中有4,389个被鉴定为蛋白基因、191个是RNA基因、116个是假基因),这个知识进一步加强了寻找特定基因或途径,其修饰可以提供更高的耐受性并产生目标产物的问题。关于具体代谢工程尝试的综述(也给出了现有的基因鉴别和修饰技术)见“Engineering primary metabolic pathways of industrial micro-organisms,”Alexander Kern 等人,Jl.of Biotechnology 129(2007)6-29,其关于此类技术的列举和描述通过引用并入本文。
但是,最近由一组共同发明人(包括一个或多个申请人)开发了实质上更强大和迅速的遗传研究技术。该研究工具提供了以比其它方法更快的速度和精确度鉴别与特定性质的表达相关的基因,由此推进了现有技术。该技术包括:产生多个广泛但完全确定的遗传文库、将此类文库的遗传元件导入微生物群体中、然后将该微生物群体培养的细胞暴露于应激物或其它选择压力、在捕获各个群体朝着更适应的克隆转变的指定时间段取样、并评估这些克隆中的遗传材料。该方法的描述见2004年9月20日提交的美国临时专利申请号60/611,377,以及2005年9月20日提交的美国专利申请号11/231,018,其于2006年4月20日以公开号US2006/0084098公布,标题为”Mixed-Library Parallel Gene Mapping,A Quantitative Microarray Technique for Genome Wide Identification of Trait Conferring Genes”(下文称为“SCALES技术”),以及SCALES:multiscale analysis of library enrichment,Lynch,M.,Warnecke,TE,Gill,RT,Nature Methods,2007.4(87-93),上述文献中关于该技术的教导通过引用方式全部并入本文。
虽然有了这些方法,包括SCALES技术,并且本领域有高水平的兴趣和技能,但是仍然需要更加清晰的理解在工业微生物的生物生产方法和系统中如何修饰和/或调节微生物以增加3-HP耐受性和生物生产。
发明内容
本发明的一个方面涉及经遗传修饰的微生物,其包含至少一个遗传修饰,以有效增加3-羟基丙酸(“3-HP”)的生产,其中3-HP生产的增加的水平高于野生型微生物中3-HP生产的水平;还包括在本文中鉴定为3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的代谢复合物的至少一个遗传修饰。在某些条件下,例如在最简培养基中培养时,3HPTGC遗传修饰允许经遗传修饰的微生物在特定的培养条件下产生3-HP,从 而3-HP可以积累至相对更高的浓度而没有那些在未经修饰的微生物中观察到的毒性效应。所述3-HP产生途径的至少一个遗传修饰可以是改善野生型微生物中存在的3-HP产生途径的3-HP积累和/或产生,或者可以是,在通常不合成3-HP的微生物中提供足够的酶促转化,从而生物生产3-HP。也描述了制备此类经遗传修饰的微生物的方法,其为本发明这个方面的一部分。
本发明的另一个方面涉及经遗传修饰的微生物,其包含来自3HPTGC的分支酸、苏氨酸/高半胱氨酸、聚胺合成、赖氨酸合成和核苷酸合成部分中的两项或更多项的至少一个遗传修饰。多个组合的非限制性实例例示了本发明这个方面的优点。另外的遗传修饰涉及3HPTGC的其它部分。可以通过合适的遗传修饰将生物生产3-HP的能力加入到一些经遗传修饰的微生物中。本发明的这个方面涉及,鉴定向微生物提供以便达到增强的3-HP耐受性的遗传修饰的方法,以及通过此类方法制备的微生物。
本发明的另一个方面涉及能够产生3-羟基丙酸(“3-HP”)的经遗传修饰的微生物,其包含对3HPTGC的至少一个遗传修饰,所述至少一个遗传修饰增加该微生物的3HPTGC的一个或多个酶促转化步骤中的酶促转化,并且其中所述至少一个遗传修饰将所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性增加至高于缺少所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性。还描述了制备此类经遗传修饰的微生物的方法,其为本发明这个方面的一部分。
本发明的另一个方面涉及经遗传修饰的微生物,其包含3HPTGC的特定遗传修饰的多个核心组。在多种实施方式中,该方面可以另外包含来自3HPTGC的分支酸、苏氨酸/高半胱氨酸、聚胺合成、赖氨酸合成和核苷酸合成部分中的一项或多项或两项或更多项的至少一个遗传修饰。还描述了制备此类经遗传修饰的微生物的方法,其为本发明这个方面的一部分。
另外,本发明包括使用上述任意内容改善微生物对3-HP的耐受性的方法,其可以在具有3-HP生产能力的微生物中(无论后者是天 然存在的还是通过遗传修饰增强的和/或导入的)。
另外,本发明的另一个方面旨在提供,用于微生物的培养物的一种或多种补充物,以有效增加该微生物对3-HP的耐受性,其中所述补充物是3HPTGC的底物(即反应物)和/或产物(在本文中共同称为“产物”,因为除了最初转化步骤之外的所有步骤的底物也是3HPTGC的产物)。该方面可以与上述其它方面组合。
本发明的另一个方面涉及遗传修饰,以导入编码在本文中鉴定为IroK的短肽的遗传元件。已经证明导入编码该短肽的遗传元件会改善大肠杆菌在微有氧条件下的3-HP耐受性。该遗传修饰可以与本发明的其它遗传修饰和/或补充物添加联合。
本发明的另一个方面涉及培养系统,其包含本发明的经遗传修饰的微生物,任选还包含3HPTGC相关的补充物。
本发明的其它方面涉及鉴定补充物的方法、鉴定遗传修饰修饰的方法、和鉴定补充物与遗传修饰的组合的方法,涉及引起微生物的增强的3-HP耐受性的3HPTGC。
可以以经遗传修饰的微生物实施上述任何方面,所述经遗传修饰的微生物除了对于3-HP产生途径和/或3HPTGC进行的遗传修饰之外,还可以包含遗传缺失和添加。
附图说明
在以下描述中结合附图描述了本发明,附图显示了:
图1A第1-7页是代谢途径的部分的多页展示,其显示了途径产物和酶,它们联合在一起包含大肠杆菌中的3-HP耐受形成性复合物(3HPTGC)。第1页提供了其余页的排列的一般性示意图。
图1B第1-7页提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的3HPTGC的多页展示。第1页提供了其余页的排列的一般性示意图。
图1C第1-7页提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3HPTGC的多页展示。第1页提供了其余页的排列的一般性示意图。
图1D第1-7页提供了钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(以前 称作真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha))的3HPTGC的多页展示。第1页提供了其余页的排列的一般性示意图。
图2提供了甘氨酸切割途径的示意图。
图3提供了来自现有技术文献的已知的3-HP产生途径的总结:从葡萄糖至丙酮酸至乙酰-CoA至丙二酰-CoA至3-HP。
图4A提供了来自现有技术文献的已知的3-HP产生途径的总结:从葡萄糖至磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)至草酰乙酸(直接或通过丙酮酸)至天冬氨酸至β-丙氨酸至丙二酸半醛至3-HP。
图4B提供了来自现有技术文献的已知的3-HP产生途径的总结,包括图2和3A中提及的那些。
图5A提供了大肠杆菌中的天然混合发酵途径的示意图。
图5B提供了从图4A修改的用于产生3-HP的提议的生物生产途径的示意图。
图6A-O提供了对照微生物对3-HP的响应的图形数据;图6P提供了与3HPTGC的一个遗传修饰的对比。
图7A描绘了由来自结核分枝杆菌的kgd基因编码的α酮戊二酸催化的已知化学反应。
图7B描绘了由kgd基因的修饰所实现的新的酶促功能:草酰乙酸脱羧形成丙二酸半醛。
图8显示了kgd突变体的提议的选择方法。
图9显示了基于图8的提议的选择方法预期的选择结果。
图10显示了与图9所示的提议的选择方法相关的筛选步骤。
图11提供了关于IroK肽序列的对比。
图12提供了以HPLC进行的3-HP的校正曲线。
图13提供了以GC/MS进行的3-HP的校正曲线。
如文中所示提供了表格,它们是本说明书的一部分并包括提及它们的各个实施例。
具体实施方式
本发明涉及方法、系统和组合物,其涉及通过对微生物进行代谢工程化而改善生物合成能力,以更好地耐受和/或产生化合物3-羟基丙酸(3-HP)。本发明的多个方面涉及3-HP耐受相关的改变,不被任何特定理论所限,相信其会通过多个相关联途径以及途径的部分中的一个或多个增加前向流动(forward flux)。
如本文所述,设想了这些途径和途径部分组合为复合物,该复合物在本文中鉴定为3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)。改变可以包括遗传修饰,其提供核酸序列,所述核酸序列编码多肽,所述多肽被认为会有效增加3HPTGC的酶促转化步骤中的酶促转化。培养系统(包括诸如工业生物生产系统的培养系统)中的改变也可以包含添加3HPTGC的代谢转化步骤的产物。在多个评估中确定此类改变与增加的3-HP耐受正相关。
本发明的其它方面涉及关于产生3-HP的方法。这些各自方面可以以多种组合方式实施,尤其是通过对目标微生物进行遗传修饰以增强对3-HP的耐受,任选也可以在重组微生物中产生3-HP。此类重组微生物可以用于生物合成3-HP的方法中,例如在工业生物生产系统中。
为了获得用于分析的遗传信息(其产生与本发明相关的数个发现),使用SCALES技术通过评估来自基因组文库群的克隆的拟合(fitness)获得了最初的3-HP相关的拟合数据。该技术在以上背景部分有所提及,在以下段落中更详细地描述。
因此,以下段落描述了用于获取进行分析的遗传数据的技术,所述分析导致本发明的概念和开发的发现的产生。以下讨论了实施方式的范围和本发明的其它方面和领域,后跟多个实施例,其支持本发明的权利要求的范围。
为了获取数据(其可以产生发现,所述发现引发本发明的方面的概念),使用SCALEs技术评估了来自基因组文库群的3-HP耐受性克隆。这些克隆生长在加入了升高的浓度的3-HP的选择性环境,所述选择性环境在之前被证明是3-HP耐受性的可靠测试。
更具体地,为了获得潜在可用于鉴定与升高的3-HP耐受性相关的遗传元件的数据,通过本领域技术人员已知的方法产生了5个代表性大肠杆菌K12基因组文库的最初群。所述5个文库分别包括大肠杆菌K12遗传材料的500、1000、2000、4000、8000个碱基对(bp)的插入。将这些文库的每一个(基本上包含完整的大肠杆菌K12基因组)分别转化进入 大肠杆菌细胞,并培养至对应于微有氧条件(OD600~0.2)的指数中期(mid-exponential phase)。批转移次数是可变的,根据需要进行调整,以避免营养物限制的选择环境(即,避免培养物进入稳定期)。尽管不是意在限制(关于替代性方法),在60小时的时间内以渐减的3-HP梯度,以8个连续转移批,在存在3-HP的情况下进行选择。更具体而言,对于连续批1和2,3-HP浓度是20g3-HP/L;对于连续批3和4,3-HP浓度是15g 3-HP/L;对于连续批5和6,3-HP浓度是10g 3-HP/L;对于连续批7和8,3-HP浓度是5g3-HP/L。对于连续批7和8,更换培养基以避免营养物限制,因为培养物到达了稳定期。
在选择过程中每一批的过程中和顶峰时取出样品,并进行微阵列分析以鉴定信号强度。在阵列和数据分析之前,制备文库、转化细胞培养物的各个标准实验室方法以及用于SCALES技术的其它标准实验室方法是本领域熟知的,例如由Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition 2001(卷1-3),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(下称,Sambrook和Russell,2001)中教导的方法所支持。在下文实施例1中以及在SCALES技术的专利申请(2004年9月20日提交的美国临时专利申请号60/611,377,以及2005年9月20日提交的美国专利申请号11/231,018(公布为US2006/0084098A1),二者标题为”Mixed-Library Parallel Gene Mapping,A Quantitative Microarray Technique for Genome Wide Identification of Trait Conferring Genes”(下文称作“SCALES技术”)中也更详细地讨论了各个方法的方面,这些文献通过引用并入本文以教导该技术的另外的细节。 微阵列技术也是本领域熟知的(参见,例如www.affymetrix.com)。为了获得关于“在暴露于3-HP的不同时间段,哪些克隆更普遍”的数据,根据来自Affymetrix producing affymetrix.cel files的大肠杆菌表达程序,操作并扫描Affymetrix大肠杆菌反义基因芯片阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)。在暴露于给定的3-HP之后,强烈的微阵列信号指示遗传序列(由包含该遗传序列的质粒导入)赋予3-HP耐受性。可以通过本领域已知的多种微阵列分析来鉴定这些克隆。
该方法提供了鉴定赋予3-HP耐受性的遗传元件的数据,该分析产生本发现和本发明的方面。
另外,为了如在美国适用的通过引用方式并入的目的,将“A genomics approach to improve the analysis and design of strain selections,”T.E.Warnecke 等人,Metabolic Engineering 10(2008)154-165通过引用并入本文,其给出了另外的具体教导,该教导证明:SCALEs拟合数据与3-HP的增强的耐受性相关,并且可以用作其替代物。该结论是基于受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)。ROC分析常规应用于医疗诊断领域以评估诊断测试与疾病的实际存在或不存在之间的关联。目前在世界上医疗应用中使用的在ROC分析中效果良好的诊断测试被常规地用于鉴别疾病的存在或不存在。该分析适应于评估不同的基于微生物生长的选择(所述选择产生拟合值,其作为3-HP耐受性的可靠测试)的灵敏性和特异性。特别地,基于生长的选择(其使用具有渐减水平的3-HP的连续批式培养物)被鉴定为3-HP耐受性的敏感且特异性的测试。因此,在该选择中,拟合度量大于截止值0的克隆被鉴定为赋予3-HP耐受性的克隆。
如实施例1所示,表1(其并入本部分)列举了显示出具有升高的拟合值的基因(通过文库的载体导入),根据上述显示为赋予3-HP耐受性。
A.3-HP耐受形成性复合物
3-HP耐受性SCALEs数据的分析产生了关于多个已鉴别的途径 及其部分之间的相互关系的更确切的理解。关于本申请,该分析产生了关于包含多个代谢途径的所有或一部分的复合物的发现。如上所述,该复合物被命名为“3-HP耐受形成性复合物”(3HPTGC)。注意到3HPTGC整体上是从具有升高的拟合值的基因之间的相互关系推导而来的。并不是说3HPTGC中的每种酶都在SCALES数据中显示为具有阳性的拟合值。这可能归因于:用于获得这些SCALES数据的商售阵列中的某些缺陷。因此,推断不是由此衍生自SCALES遗传元件数据的某些大肠杆菌3HPTGC成员添加到3HPTGC中。但是,注意到3HPTGC中的多数酶的确具有阳性拟合值,并且本文提供的总体拟合数据与补充物和遗传修饰数据的组合证明了该推导的合理性,并且3HPTGC的总体意义与3-HP耐受性相关。
3HPTGC被进一步分成(包括为了要求保护的目的)“上部分”和“下部分”,所述上部分包括糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛酸途径和戊糖磷酸途径的一部分;所述下部分包括下列的全部或部分(如下文具体指明):分支酸超途径、氨基甲酰磷酸至氨基甲酸的途径、苏氨酸/高半胱氨酸超途径、核苷酸合成途径和聚胺合成途径。
在多种实施方式中对微生物进行遗传修饰以影响3HPTGC的一种或多种酶活性,从而可以在例如工业系统中达到3-HP的增强的耐受性,所述活性包括微生物3-HP生物合成活性。另外,可以进行遗传修饰以提供和/或改善包含3-HP耐受形成性复合物的一个或多个遗传修饰的微生物中的一个或多个3-HP生物合成途径,从而提供增加的3-HP产生。后者所述这些重组微生物可以称作3-HP-syntha-耐受形成性重组微生物(“3HPSATG”重组微生物)。
大肠杆菌的3HPTGC公开于图1A,第1-7页(在图1A的第1页提供了这些页的放置以观看完整显示的3HPTGC的指南)。如图1中1-7中可见,3HPTGC包括所有或多个下列指明部分:分支酸超途径、氨基甲酰磷酸至氨基甲酸的途径、苏氨酸/高半胱氨酸超途径;戊糖磷酸途径的一部分;核苷酸合成途径;糖酵解/三羧酸循环/乙醛酸旁路超途径;和聚胺合成途径。注意到分支酸途径和苏氨酸途径被鉴 定为超途径,因为它们分别包括多个较小的已知途径。但是,完整的3HPTGC包括这些以及其它途径或其部分,它们通常不与分支酸超途径或苏氨酸/高半胱氨酸超途径相关。
更具体地,包含第1-7页的图1A被细分为下部分和上部分,所述下部分进一步细分为组A-E,所述上部分简称为组F。下部分的组鉴别如下:组A,或“分支酸”,其包含指明的分支酸超途径的主要部分(第3页);组B,或“苏氨酸/高半胱氨酸”,其包含苏氨酸/高半胱氨酸途径的指明部分(第7页);组C,或“聚胺合成”,其包含聚氨途径的指明部分,其中包括精氨酸合成步骤和氨基甲酰磷酸至氨基甲酸的途径(第5页);组D,或“赖氨酸合成”,其包含赖氨酸合成途径的指明部分(第6页);组E,或“核苷酸合成”,其包含核苷酸合成途径的指明部分(第4页)。组F(第2页)包含3HPTGC的上部分,并且包括糖酵解途径、三羧酸循环、和乙醛酸旁路途径,以及戊糖磷酸途径的指明部分。
注意,在图1A第1-7页中的3HPTGC的酶促转化步骤鉴别出特定基因。这些基因是针对大肠杆菌菌株K12,亚株MG1655;这些基因的核酸和对应的氨基酸序列可以从 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez或者www.ecocyc.org获得。本领域技术人员已知的是,一些基因可以存在于染色体上的操纵子内,处于单一启动子的控制下,或通过其它相互关系存在。当本文的核酸序列以组合方式被提及时,例如sucCD或cynTS,其意思分别是指,该核酸序列包含sucC和sucD二者,以及包含cynT和cynS二者。此类核酸序列中还可以存在另外的控制元件和其它遗传元件,当添加到遗传修饰中时,这些可以共同被称作“遗传元件”,其意在包括添加单一基因的遗传修饰。
但是,在不同物种和菌株中可以容易地发现功能相似的基因,其编码图1A第1-7页所示的具有功能相同的酶,此类基因以及此类其它物种和菌株的3HPTGC可用于实施本发明。这可通过以下方法实现,其不是意在限制。
对于大肠杆菌的3HPTGC内的基因群,从NCBI获得蛋白序列。为了鉴定酿酒酵母中的功能相似的基因,使用在大肠杆菌3HPTGC中鉴定的基因,使用www.biocyc.org的途径比较工具。对于枯草芽孢杆菌,部分使用上述指明工具,通过该方法未获得的酶或途径通过同源性比较方法获得。对于同源性方法,使用不同阈值(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi),使用大肠杆菌蛋白和芽孢杆菌蛋白序列(4096个序列)的所选组,进行局部blast比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tools/)(blastp)。使用同源性信息(具有E-10或更低的E-值的同源匹配),鉴别出枯草芽孢杆菌的3HPTGC的其余基因和酶。
同样,将后者所述同源性方法应用于钩虫贪铜菌,表2提供了钩虫贪铜菌的遗传元件的同源性关系的一些实例,所述钩虫贪铜菌与大肠杆菌的编码已知催化3HPTGC的酶促转化步骤的酶的基因具有被证明的同源性。这是基于具有低于E-10的E-值的同源性序列的标准。表2提供了通过比较获得的很多同源物(超过850)中的仅一小部分。不是所有的钩虫贪铜菌中的同源序列都预期为编码适合于钩虫贪铜菌的3HPTGC的酶促转化步骤的想要的酶。但是,通过已知编码想要的酶促反应的遗传元件的选择的一个或多个组合,选择了对于该物种的3HPTGC的最相关的遗传元件。
图1B第1-7页显示了枯草芽孢杆菌的3HPTGC;图1C第1-7页显示了酿酒酵母的3HPTGC;图1D第1-7页显示了钩虫贪铜菌的3HPTGC。显示了后者的酶名称,并指明了满足具有低于E-10的E-值的标准的同源序列的数量(当与已知催化想要的3HPTGC酶促转化步骤的大肠杆菌酶相比时)。
基于以上方法中的任一种,以及现有的给定微生物物种的基因组信息或获得所述信息的相对容易性和低成本,可以应用上述方法的一种或二者以鉴别所选微生物物种(其基因组序列是已知的或已经获得的)中的相关基因和酶,评估此类同源匹配和鉴定的基因的所选遗传修饰的3-HP耐受性的相对改善,从而产生包含改善的3-HP耐受性的 重组的所选的微生物。
另外认识到,多种微生物中的替代性途径可能产生3HPTGC的产物,其增加的产生或存在在本文中被证明会引起3-HP耐受性的增加。例如,在酵母物种中,具有赖氨酸(组D中的产物)的替代性途径。因此,此类替代性途径的改变包含在本发明的范围内,因为此类微生物物种也落在相关权利要求的范围内。因此,在各实施方式中,本发明不限于图1A-D所描述的具体途径。也就是说,产生如图1A-D所示产物的多种途径及其酶也被认为落在本发明的范围内。
注意到,当特定酶促转化步骤显示出两种或更多种基因时,这些可能是单一的多酶复合物的成分,或者可以表示替代性酶,所述替代性酶具有控制它们的不同控制因子,或者有差别地被诱导。另外,如本领域技术人员所明白,对于酶促转化步骤仅显示了主要的反应物(即底物)和产物。这是为了使原本已经拥挤不堪的图纸中的细节最简化。例如,没有显示电子载体和能量转移分子,例如NAD(P)(H)和ADP/ATP,这些(以及3HPTGC图中没有显示的其它小分子反应物)不被认为是3HPTGC的“产物”(如本文所用的术语)。另外,对于至少两个步骤(二氢新喋呤磷酸至7,8-二氢-D-新喋呤,和1,4-二羟基-2-萘甲酰-CoA至1,4-二羟基-2-萘甲酸)没有显示酶,因为在申请本专利时,对于该步骤尚未有已知鉴定的酶。因此,在一些实施方式中,对于这些步骤,3HPTGC应理解为和/或认为不包括酶、核酸序列等。另外,如下文所讨论,本发明范围内还包括核酸序列变体,其编码3HPTGC或本文所示的其相关复合物或其部分的任意酶的所鉴定的酶学功能变体,并包括其在本文要求保护的构建体、方法和系统中的用途。
表1中提供的一些拟合数据没有反映在3HPTGC的图中,但也认为支持改善3-HP的耐受性的遗传修饰和/或补充。例如,对于gcvH、gcvP和gcvT而言,相对升高的拟合值与甘氨酸切割系统相关。这些酶参与甘氨酸/5,10-亚甲基-四氢叶酸(“5,10mTHF”)转化途径,如图2所示。在图2所示的方向中,3个酶促催化的反应引起甘氨酸 (3HPTGC的产物,见图1A,第4页)的脱羧、从四氢叶酸(THF)产生5,10-亚甲基-THF、以及从NAD+产生NADH。该复合物的5,10-亚甲基-THF产物是酶促催化反应的反应物,所述酶促催化反应是下列的一部分:叶酸的聚谷氨酸化;泛酸的生物合成;甲酰基THF的生物合成;以及嘧啶脱氧核糖核苷酸的从新合成。总体而言,在表1中显示但在图1第1-7页中未显示的酶及其酶促催化步骤被认为是本发明的一部分(以及针对其它物种的它们的功能等同物)。
以下提供了涉及3HPTGC的改变的实际数据和/或预测性实施例。这些实施例旨在证明应用性的宽度(基于大量的与3HPTGC相关的遗传元件,其显示出增强的3-HP耐受性)以及实现增强的3-HP耐受性的一些具体方法。可以组合这些方法以达到关于3-HP耐受性的另外的或协同的改善,并且可以包括遗传上或非遗传上的改变(例如,涉及以特定化学品进行系统补充,或工业系统的一般改变)。另外,公开并例示了具体的生产策略。
如下文所描述和详述,本发明宽泛地涉及使用遗传修饰的改变和/或培养基修改(例如添加酶促转化产物或其它特定化学品),以在基于微生物的工业生物生产方法、系统和组合物中产生想要的结果。关于耐受性方面,本发明来源于关于3HPTGC的未预料的重要性的发现,所述3HPTGC包括一些代谢途径部分,所述代谢途径部分中包括酶,这些酶的增强的活性(基于编码它们的核酸序列的拷贝数的增加)与微生物对3-HP的增强的耐受性相关联。
B.3-HP的产生
本发明关于3-HP耐受性的方面可用于任何产生3-HP的微生物,无论该微生物天然产生3-HP或经过任何方法进行遗传修饰以产生3-HP。
关于本发明的3-HP产生的增加的方面(其可以在工业生物生产中得到3-HP升高的效价),遗传修饰包括向微生物中导入一个或多个核酸序列,其中所述一个或多个核酸序列编码并表达一种或多种产生途径的酶(或产生途径的酶的酶活性)。在多种实施方式中,由此 产生的这些改进组合起来以改善3-HP的工业生物生产的效率和功效,并因此降低其成本。
多种3-HP产生途径中的任一个或多个可用于微生物中,例如与旨在改善3-HP耐受性的遗传修饰联合。在多种实施方式中,进行遗传修饰以提供用于执行一个或多个此类3-HP产生途径的酶活性。数个3-HP产生途径是本领域已知的。例如,美国专利号6,852,517教导了以甘油作为碳源的3-HP产生途径,其关于该途径的教导通过引用并入本文。该文献教导了提供一种遗传构建体,其表达来自克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)的dhaB基因和醛脱氢酶的基因。据称其能够催化从甘油产生3-HP。
WO2002/042418(PCT/US01/43607)教导了数个3-HP产生途径。该PCT公开物中关于此类途径的教导通过引用并入本文。另外,该公开物的图44在本文中作为图3提供,该图总结了以下3-HP产生途径:从葡萄糖至丙酮酸至乙酰-CoA至丙二酰-CoA至3-HP。该公开物的图55在本文中作为图4A提供,该图总结了以下3-HP产生途径:从葡萄糖至磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)至草酰乙酸(直接或通过丙酮酸)至天冬氨酸至β-丙氨酸至丙二酸半醛至3-HP。在这些图中也显示了各个转化的代表性酶。
美国专利公开号US2008/0199926(公开于2008年8月21日,通过引用并入本文)的图4B总结了上述3-HP产生途径和其它已知的天然途径。Hatzimanikatis等人在“Exploring the diversity of complex metabolic networks,”Bioinformatics 21(8):1603-1609(2005)中更一般性地讨论了关于特定代谢途径(其中很多可能不存在于自然界中)的开发。该文章中关于代谢网络的复杂性的教导通过引用并入本文。
关于图3中总结的3-HP产生途径,Strauss和Fuchs(“Enzymes of a novel autotrophic CO2fixation pathway in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus,the 3-hydroxyproprionate cycle,”Eur.J.Bichem.215,633-643(1993))鉴定出产生3-HP的天然细菌途径。当时作者指出:丙二酰-CoA至丙二酸半醛的转化是由 NADP依赖性的酰化丙二酸半醛脱氢酶催化的;并且丙二酸半醛至3-HP的转化是由3-羟基丙酸脱氢酶催化的。但是,从那时起,人们认识到,至少对橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)而言,单一的酶可以催化这两个步骤(M.Hugler等人,“Malonyl-Coenzyme A Reductase from Chlorofiexus aurantiacus,a Key Enzyme of the 3-Hydroxypropionate Cycle for Autotrophic CO2Fixation,”J.Bacter,184(9):2404-2410(2002))。
因此,本发明的多种实施方式的一种产生途径包括丙二酰-CoA还原酶酶活性,其实现丙二酰-CoA至丙二酸半醛至3-HP的转化。如以下实施例中所提供,向微生物中导入编码提供该酶(或酶活性)的多肽的核酸序列可有效提供增加的3-HP生物合成。
图5B中提供了另一个3-HP产生途径(图5A显示了天然混合的发酵途径)并在本段和后续段落中有解释。这是可以与其它3-HP产生途径一起使用或不依赖其它3-HP产生途径的3-HP产生途径。作为在重组微生物中建立该生物合成途径的一种可能方式,将编码草酰乙酸α-脱羧酶(oad-2)酶(或具有此活性的各种酶或相关酶)的一个或多个核酸序列导入微生物中并进行表达。如实施例7所例示(其不是意在限制),将酶进化技术应用于对于结构相似的底物具有想要的催化作用的酶,从而获得进化的(例如突变的)酶(和相应的编码它的核酸序列),所述酶在微生物中显示出想要的速率和特异性的想要的催化反应。
注意,以上3-HP产生途径的实例不是意在限制,尤其是就本领域中用于实现想要的代谢转化的多种已知的方法和标准而言。
因此,对于本发明的多种实施方式,对任意的3HPTGC途径和任意的3-HP生物生产途径进行的遗传操作可以被描述为包括多种遗传操作,包括那些旨在改变在各途径中的任一个中鉴定的酶或酶酶活性的调节,并由此最终改变其活性的遗传操作。此类遗传修饰涉及转录、翻译和翻译后修饰,它们引起在选定的和/或鉴定的培养条件下的酶活性和/或选择性的改变。因此,在多种实施方式中,为了更有效地发挥 作用,微生物可以包含一个或多个基因缺失。例如,在大肠杆菌中,可以缺失编码下列酶的基因:丙酮酸激酶(pfkA和pfkB)、乳酸脱氢酶(ldhA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pflB)。此类基因缺失总结于图5B的底端,作为具体实施方式,其不是意在限制。可以通过突变的基因缺失方法实现基因缺失,和/或从具有减少的或没有一种或多种这些酶的表达的突变菌株出发,和/或通过其它本领域技术人员已知的方法进行。
更一般地,并取决于所选的进行遗传修饰的微生物的具体代谢途径,可以进行遗传修饰的任意亚组以减少选自下列的发酵产物的细胞产生:乙酸、乙酰甲基原醇、丙酮、丙烯酸、苹果酸、脂肪酸乙酯、异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、醋酸乙烯、其它醋酸酯、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸、异丁酸、2-OH-异丁酸、3-羟基丁酸、乙醇、异丙醇、D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、衣康酸、乙酰丙酸、葡萄糖二酸、戊二酸、己内酰胺、己二酸、丙醇、异丙醇、杂醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸、和马来酸。可以按照以上的一般性公开内容进行基因缺失,也可以使用其它方法以实现所选发酵产物的想要的减少的细胞产生。
C.遗传修饰和补充物,包括其组合
对于本发明的多种实施方式,对3HPTGC的任意途径和途径部分以及任意的3-HP生物生产途径所做的遗传修饰可以描述为包括多种遗传操作,包括那些旨在改变在各途径中的任一个中鉴定的酶或酶的酶活性的调节,并由此最终改变其活性的遗传操作。此类遗传修饰涉及转录、翻译和翻译后修饰,它们引起在选定的和/或鉴定的培养条件下的酶活性和/或总体酶促转化速率的改变,和/或旨在提供另外的核酸序列(如一些实施方式中所提供)以便增加3HPTGC的酶的拷贝数和/或突变体。实现此类遗传修饰的具体方法和方式是本领域技术人员熟知的,包括但不限于:增加内源性遗传元件的表达;降低阻抑基因的功能;导入异源遗传元件;增加编码催化3HPTGC的酶促转化步骤 的多肽的核酸序列的拷贝数;使遗传修饰元件突变以提供突变的蛋白,以增加特异性酶活性;过表达;使表达不足;使伴侣分子(chaperone)过表达;敲除蛋白酶;改变或修饰反馈抑制;提供包含阻抑物和/或竞争性抑制剂的一个或多个破坏的结合位点的酶变体;敲除阻抑基因;改善mRNA稳定性的进化、选择和/或其它方法。可以实施随机诱变以提供3HPTGC的遗传修饰,其可以包含在这些或其它指明的方法中。所述遗传修饰可进一步广泛地包括添加(包括插入)、缺失(例如通过突变)和替换目标核酸中的一个或多个核酸。在多种实施方式中,遗传修饰引起改善的酶促比活性和/或酶的周转数。不被限制地讲,可以通过KM、Kcat、Kavidity中的一项或多项来测定变化情况。
此类遗传修饰总体上旨在增加3HPTGC的至少一个酶促转化步骤中的酶促转化,以便增强经过所述修饰的微生物的3-HP耐受性。另外,图1A-D中显示的酶促转化步骤可以由本领域技术人员容易地鉴定的酶所催化,例如通过搜索对应于图1A-D中的特定酶促转化步骤的基因名称的酶名称,然后在例如其它物种中鉴定具有相同名称和功能的酶。后者将能够把该酶促转化步骤的各个反应物转化为各自的产物。公共数据库站点例如www.metacyc.org,www.ecocyc.org, www.biocyc.org和www.ncbi.gov具有鉴定此类类似酶的相关工具。
另外,虽然本文中经常使用MIC分析作为指示在不同的3-HP浓度中放置指定时间段的微生物生长中的差异的末端点,但是其绝不旨在被认为是测定基于本发明的方面的关于微生物耐受性差异(例如改善)的唯一合适度量。不被限制地讲,其它合适的测定方法可以包括生长速率测定、延迟时间测定、在指定的培养时间段的培养物的光密度的变化、在给定时间段内群体的加倍次数,对于具有3-HP产生能力的微生物而言:培养系统中的总体3-HP产生,在所述系统中,3-HP积累至对于对照微生物而言具有抑制性的水平,所述对照微生物不具有那些增加3HPTGC的一个或多个酶促转化步骤中的酶促转化的遗传修饰。这可能引起增加的生产力、产量或效价。
一般认识到,用于测定3-HP耐受性的增加的度量可以与微生物 或微生物培养物在暴露于3-HP中指定时间段的生长能力相关。这可以通过多种定量和/或定性分析和末端点来测定,尤其是通过与合适的对照(其不含如本文公开和讨论的与3-HP耐受性相关的遗传修饰和/或补充物)相比较。用于此类测定的时间段可以是但不限于:12小时;24小时;48小时;72小时;96小时;和超过96小时的时间段。可以测定3-HP的多种暴露浓度以更清晰地鉴定3-HP耐受性的改善。下面的段落提供了方法的非限制性实例,所述方法可用于测定微生物在其培养系统中存在3-HP时的生长和/或存活能力上的差异(当把本发明的教导应用于所述微生物和/或所述培养系统时)。
图6A-O提供了来自响应于不同的3-HP浓度的多个对照微生物的数据(关于用于获取该数据的方法,参见实施例10)。这些图中的数据分别显示为:最大生长速率(μmax)的改变、光密度(“OD”)的改变和在给定时间段(此处为24小时)内的相对加倍次数。
测定生长速率、延迟时间和最大生长速率是普遍使用的用于开发比较型度量的分析。图6A、6D、6G、6J和6M显示了在指明的有氧或无氧测试条件下,所示物种在24小时的测试时间段内的最大生长速率的变化。当在目标化学品(其被认为对于生长具有毒性和/或抑制性)的一个浓度范围内表示该数据时,这种表示在本文中被称作“耐受图”。在此,通过测定在包括可变数量的3-HP的生长条件下生长的微生物的比生长速率来产生生长耐受图。
此外,图6P比较了对照微生物培养物与其中进行了遗传修饰以增加cynTS(其在3HPTGC的组C中)的表达的微生物的生长耐受图。大肠杆菌中的cynTS遗传修饰的曲线(通过下文的实施例5产生)显示出,对于每个3-HP浓度,在24小时的测试期内,最大生中速率随着3-HP浓度的增加而增大。这提供了定性的视觉可见的差异。然而,cynTS遗传修饰的曲线下的较大面积也提供了定量的差异,其可用于以下比较目的:与其它旨在改善3-HP耐受性的遗传修饰进行比较。此类曲线的评估可以更有效地鉴定遗传修饰和/或补充物,及其组合。
图6B、6E、6H、6K和6N显示了对照微生物针对不同的3-HP浓度的响应,其中使用的度量是24小时的光密度(“OD”,在600nm测定)。OD600是微生物培养物中细胞密度的常规度量。对于在有氧条件下的大肠杆菌,图6B显示了,从30g/L的3-HP开始,在24小时内细胞密度的显著降低。图6D显示了在无氧条件下,大肠杆菌相对更剧烈和更早的下降。
图6C、6F、6I、6L和6O显示了对照微生物针对不同的3-HP浓度的响应,其中显示了在24小时的时间段内的细胞加倍次数。
以上旨在作为测定3-HP耐受性改善的多种方法的非限制性描述。一般地,生长和/或存活上的可显示的改善被认为是测定耐受性例如3-HP耐受性的增强的方法。
除非上下文另有明确指明,否则如说明书和随附的权利要求中所使用的单数形式″一个(a)″、″一种(an)″和″该(the)″包括复数指称。因此,例如提及“表达载体”包括单一的表达载体,也包括多个表达载体,无论它们相同(例如相同的操纵子)或不同;提及“微生物”包括单一的微生物,也包括多个微生物;等等。
本文使用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等是指这样的核酸序列,其满足以下至少一项:(a)核酸的序列对于给定宿主微生物而言是外来的(即不是天然存在于其中);(b)该序列可以天然存在于给定宿主微生物中,但是以非天然(例如大于预期)数量存在;或(c)核酸的序列包含两个或多个亚序列,所述亚序列彼此之间的关系不同于天然环境中的关系。例如,关于情况(c),重组产生的异源核酸序列将具有来自不相关基因的两个或更多个序列,其排列为产生新的功能性核酸。本发明的实施方式可以产生于:将表达载体导入宿主微生物,其中所述表达载体含有编码酶的核酸序列,所述酶是或者不是正常存在于宿主微生物中的酶。所以,就导入异源核酸序列之前的宿主微生物的基因组而言,编码所述酶的核酸序列是异源的(不论所述异源核酸序列是否被导入该基因组中)。
一般地,通过本文描述的一种或多种方法提供一种或多种遗传修 饰以增加重组微生物对3-HP的耐受性是在本发明范围内的。因此,各方法的组合结果也在任何上述替代物及其实施方式的范围内,即,这样的经遗传修饰的微生物,其包含一个或多个,两个或更多个,三个或更多个等提及的为了获得增强的3-HP耐受性的遗传修饰。
另外,在本发明的范围内还提供了在合适的培养容器(其含有所选的微生物)中的一种或多种补充物,所述补充物是3HPTGC的中间体或终产物(合称“产物”)。表3给出了可以添加到含有经遗传修饰的微生物(其包含对3HPTGC和/或3-HP产生途径所做的一个或多个遗传修饰)的培养容器中的补充物的非限制性列举。例如,但不是意在限制,可以提供赖氨酸、蛋氨酸和碳酸氢盐中的一项或多项。此类补充物的添加可以与所选微生物的遗传修饰(如本文所描述)联合。
以下实施例提供了一些遗传修饰与补充物添加之组合的实例,不是意在限制。
关于补充物,关于组C中涉及聚胺合成,下文实施例3的结果证明:通过向培养基中添加聚胺:腐胺、亚精胺、和尸胺,大肠杆菌的3-HP耐受性增加。对照和补充后的培养基中大肠杆菌K12的最小抑制浓度(MIC)如下:在补充了腐胺的M9最简培养基中是40g/L;在补充了亚精胺的M9最简培养基中是40g/L;在补充了尸胺的M9最简培养基中是30g/L。在添加了碳酸氢钠的M9最简培养基中,最小抑制浓度(MIC)是30g/L。在100g/L贮液3-HP中,大肠杆菌K12的最小抑制浓度(MIC)是20g/L。
另外,鉴于,随着碳酸氢钠的补充,相对于对照的MIC增加,其它改变,例如碳酸酐酶的调节和/或遗传修饰(例如向目标细胞中提供异源核酸序列,其中所述核酸序列编码具有碳酸酐酶活性的多肽)被认为对于增加3-HP耐受性具有作用(例如与3HPTGC的其它改变联合)。类似地,并且如本文提供的其它数据所支持,酶活性的改变(例如,通过对3HPTGC途径部分中的酶进行的遗传修饰,其产生精氨酸、腐胺、尸胺、和亚精胺)被认为对于增加3-HP耐受性具有作用(例如与3HPTGC的其它改变联合)。
鉴于以上所述,认识到补充物评价的结果提供了关于直接向培养基中添加补充物的应用,以及关于通过遗传修饰途径(例如本文一些实施例中提供的)改善3-HP耐受性的应用的证据。认识到,增加3HPTGC酶促转化步骤的产物的浓度(例如通过遗传修饰,无论是通过补充和/或遗传修饰),可以有效增加微生物中和/或培养此类微生物的培养基中的一种或多种3HPTGC产物的细胞内浓度。
综上,与有关3HPTGC的遗传修饰和/或补充物相关的拟合数据和随后从以下实施例中获得的数据支持关于“用于增加3HPTGC的途径中的酶促转化的此类改变”和“得到的微生物细胞或培养系统中3-HP耐受性的功能性增加”之间的功能关系的概念。这可以在作为整体的3HPTGC中以及在其定义的组内和组间看出来。
另外,并入本部分的表6-9、11和13-17,提供了非限制性的补充物添加、遗传修饰和补充物添加与遗传修饰组合的实例。根据这些实例和所描述的在目标微生物中鉴定实现升高的3-HP耐受性的遗传修饰的方法,可以获得另外的补充物、遗传修饰、及其组合。具体组合可以包括:仅3HPTGC的下部分,包括其中的5个组的两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个的组合(每个涉及补充物添加和/或遗传修饰),在多种实施方式中这些中的任意个还包括关于3HPTGC上部分的一个或多个遗传修饰或补充物添加。
基于这些结果,认识到在本发明的多种实施方式中,不管所用的方法或组合物为何,作为3HPTGC的遗传修饰和/或其反应物的补充的结果,相对于不含所述至少一个3HPTGC遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性,涉及3HPTGC的改变可有效增加3-HP耐受性至少5%,至少10%,至少20%,至少30%,或至少50%。
如实施例所示,可以在培养系统中提供并利用本发明的任何经遗传修饰的微生物,例如用于产生3-HP。在一些实施方式中,向培养系统中提供一种或多种添加物(其为3HPTGC酶促转化步骤的产物)以进一步增加此类培养系统中的总体3-HP耐受性。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法或方式(包括但不限于 本文描述的那些)来测定微生物或培养系统对3-HP的增加的耐受性。
3HPTGC上部分的遗传修饰可以包括任何酶促转化步骤。一个非限制性实例涉及三羧酸循环。已知柠檬酸合酶(E.C.2.3.3.1[以前是4.1.3.7])的存在和活性(其催化该循环中的第一个步骤)控制总体循环的速率(即是限速者)。因此,微生物的遗传修饰,例如增加拷贝数和/或比活性,和/或其它相关特性(例如降低反馈抑制剂或其它控制分子的效应)可以包括柠檬酸合酶的修饰。进行柠檬酸合酶的此类改变的方法可以利用任意数量的实验室技术,例如本领域已知的,包括本文描述的用于3HPTGC的其它酶促转化步骤的方法。另外,在美国专利号6,110,714和7,247,459中描述了数个普遍已知的技术,二者皆转让给Ajinomoto Co.,Inc.,这两篇专利中关于增大柠檬酸合酶活性的各个教导通过引用并入本文(具体而言,美国专利6,110,714的第3和4栏,实施例3和4;美国专利7,247,459的第11和12栏,具体是实施例(1)和(2))。
在多种实施方式中,提供了包含选定的基因缺失的大肠杆菌菌株,所述基因缺失旨在增加3HPTGC中的酶促转化并因此增加微生物对3-HP的耐受性。例如,可以缺失下列与指明的3HPTGC组中的途径阻抑相关的基因:组A-tyrR,trpR;组B-metJ;组C-purR;组D-lysR;组E-nrdR。这些是对大肠杆菌而言的,本领域技术人员已知并可以确定的是,在该物种和其它物种中鉴定并遗传修饰等同的阻抑基因。
也可以进行基因功能的破坏,其中,改变核酸序列对于功能性酶的正常编码,从而减少或消除微生物细胞中该功能性酶的产生。广泛而言,破坏可以包括基因缺失,也可以包括但不限于基因修饰(例如,导入终止密码子、移框突变、导入或除去基因的部分、导入降解信号)、影响mRNA转录水平和/或稳定性、和改变编码多肽的基因上游的启动子或阻抑子。在一些实施方式中,基因破坏是指DNA、从DNA编码的mRNA、和由其产生的氨基酸序列的任意遗传修饰,所述遗传修饰引起微生物细胞中编码基因的酶功能的至少50%的降低。
另外,就本发明的完整范围和对于各个实施方式而言,认识到上述讨论和下述实施例是示例性的,不是限制性的。可以进行遗传操作以实现在总体酶功能上的想要的改变,例如通过减少反馈抑制和其它控制因素,包括DNA转录和RNA翻译控制机制的改变、改善mRNA稳定性,以及使用具有有效的拷贝数和启动子以达到有效改善水平的质粒。可以筛选和/或选择此类遗传修饰以实现流经3HPTGC内的某些基本途径的较高流速,并可以影响基础的和/或主要的途径中的一般性细胞机制。因此,在一些替代性实施方式中,对3HPTGC的其它部分进行更有选择性的遗传修饰。
另外,基于定位和定向步骤的特性、反馈抑制和其它因素和局限性的分析,在多种实施方式中,至少进行一个遗传修饰以增加3HPTGC的下列酶中的一种的总体酶促转化:2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶(例如,aroF,aroG,aroH);氰酸酶(例如,cynS);碳酸酐酶(例如,cynT);半胱氨酸合酶B(例如,cysM);苏氨酸脱氨酶(例如,ilvA);鸟氨酸脱羧酶(例如,speC,speF);腺苷甲硫氨酸脱羧酶(例如,speD);和亚精胺合酶(例如,speE)。遗传修饰可以包括,增加编码这些酶的核酸序列的拷贝数,提供具有减少的或消除的反馈抑制的修饰的核酸序列,通过调节剂控制,增加对底物的亲和性和其它修饰。因此,本发明的一个方面是以增加一个或多个3HPTGC酶促转化步骤的酶促转化的方式对这些酶中的一种或多种进行遗传修饰,以便增加流动和/或修改流经3HPTGC的反应,从而增加3-HP耐受性。除了下文的实施例4和5以外,它们分别涉及aroH和氰酸酶(与碳酸酐酶)的遗传修饰,提供了以下实例。注意到,在大肠杆菌中,已知有第二种碳酸酐酶。其被分别鉴别为Can和yadf。
另外,本发明涉及遗传修饰以导入编码短肽(在本文中鉴定为IroK)的遗传元件。已经证明了编码该短肽的遗传元件的导入改善了微有氧条件下的大肠杆菌的3-HP耐受性(如本文所描述)。在多种实施方式中,该遗传元件的导入可以与3HPTGC相关的遗传修饰和/或补充物联合,以进一步改善3-HP耐受性。
基于以上所述、以下实例和其中的数据,本发明的其它方面是鉴定补充物的方法、鉴定遗传修饰的方法、鉴定补充物和遗传修饰之组合的方法,所述补充物和遗传修饰与3HPTGC相关,它们引起微生物中增强的3-HP耐受性。
另外,认识到,本发明的多种实施方式可以包括,排除掉任一个或多个指定的酶促转化步骤、产物添加和/或特定酶的3HPTGC的遗传修饰,和/或其补充物。例如,本发明的一个实施方式可以包括3HPTGC的这样的遗传修饰,其排除掉3HPTGC的组A、或组A和B,或其一个或多个确定成员(可以是3HPTGC成员的任意子集)的遗传修饰。
D.微生物物种的讨论
以下实例描述了对一些细菌和酵母微生物的具体修饰和评估。本发明的范围无意限于这些物种,而是一般性地适用于众多合适的微生物。随着多个物种的基因组变成已知的,本发明可以容易地适用于不断增加的种类的合适的微生物。另外,鉴于遗传测序的成本相对较低,可以容易地测定目标物种的遗传序列以使本发明的方面的应用更加容易获得(基于对具有已知基因组序列的生物进行遗传修饰的容易性)。
更具体地,基于本文描述的多个标准,用于生物生产3-HP的包含本文提供的耐受性方面的合适的微生物宿主可以包括但不限于,任意革兰氏阴性生物,例如大肠杆菌、食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)、或假单胞菌属物种(Pseudomononas sp.);任何革兰氏阳性微生物,例如枯草芽孢杆菌、乳杆菌属物种(Lactobaccilus sp.)或乳球菌属物种(Lactococcus sp.)、酵母,例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或树干毕赤酵母(Pichia stipitis);和其它组或微生物种。更具体地,用于生物生产3-HP的合适的微生物宿主一般包括但不限于以下属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、 肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和酵母属(Saccharomyces)。特别感兴趣的宿主包括:食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)(例如菌株OM5)、大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus(钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)))、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本申请中上文和其它部分中的物种和其它系统发生鉴定是根据微生物学领域技术人员已知的分类法。
本文描述的并要求保护的改善耐受性的特征可以在选自上述所列的微生物或其它合适的也包含一个或多个天然的、导入的或增强的3-HP生物生产途径的微生物中提供。因此,在一些实施方式中,微生物包含内源的3-HP产生途径(在一些此类实施方式中,其可以被增强),而在其它实施方式中,微生物不包含内源的3-HP产生途径。
经遗传修饰的微生物可以引入基于本申请教导的为了改善3-HP耐受性的遗传修饰,并与多个3-HP产生途径的任意项组合。众多的此类经遗传修饰的微生物可以包含其它专利申请(其为本发明人中的一位或多位的,和/或经过转让给本专利申请的拥有者)中描述的遗传修饰和/或其它系统改变。
更一般地,用于本发明的微生物可以选自细菌、蓝藻、丝状真菌和酵母。对于一些实施方式,最初选作用于3-HP耐受形成性生物生产的微生物宿主也应该以高比率利用糖,包括葡萄糖。多数微生物能 够利用碳水化合物。但是,某些环境微生物不能高效利用碳水化合物,因此,它们不是用于旨在以葡萄糖或其它碳水化合物作为主要添加的碳源的此类实施方式的合适宿主。
对宿主进行遗传修饰的能力对于产生任意重组微生物是必不可少的。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合转化、转导或天然转化。有多种宿主接合质粒和药物抗性标志物是可获得的。根据在该宿主中起作用的抗生素抗性标志物的性质修饰克隆载体以适应宿主生物。
E.本发明的范围的其它方面
生物生产培养基
在本发明中用于重组微生物(其具有3-HP的生物合成途径)的生物生产培养基必须含有针对想要的代谢途径的合适的碳底物。合适的底物可以包括但不限于,单糖例如葡萄糖和果糖,寡糖例如乳糖或蔗糖,多糖例如淀粉或纤维素或其混合物,以及来自可再生原料(例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜和大麦芽)的未经纯化的混合物。另外,碳底物还可以是一元碳底物,例如二氧化碳、一氧化碳或甲醇(已经证明了它们向主要生化中间体的代谢转化)。除了一元碳和二元碳底物之外,还已知甲基营养菌利用多种其它的含碳化合物例如甲胺、葡萄糖胺和多种氨基酸以进行代谢活性。例如,已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion等人,Microb.Growth C1Compd.,[Int.Symp.],7th(1993),415-32.编辑:Murrell,J.Collin;Kelly,Don P.出版者:Intercept,Andover,UK)。类似地,多种念珠菌代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人,Arch.Microbiol.153:485-489(1990))。因此考虑到,本发明中使用的碳源可以包括多种含碳底物,其仅由生物的选择所限定。
虽然考虑到所有上述碳底物及其混合物都适用于本发明作为碳源,但普遍使用的用作碳源的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖,以及任意这些糖的混合物。蔗糖可以从诸如甘蔗、甜菜、木薯和甜高粱的原料获得。葡萄糖和右旋糖可以通过基于淀粉的原料(包括谷物,例如玉米、小麦、黑麦、大麦和燕麦)的糖化获得。
此外,可以通过预处理和糖化过程从纤维素和木质纤维素生物质获得可发酵的糖,见例如美国专利申请公开号US20070031918A1的描述,其通过引用并入本文。生物质是指任意纤维素或木质纤维素物质,并包括含有纤维素,任选还含有半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的物质。生物质还可以包含另外的成分,例如蛋白质和/或脂类。生物质可以来源于单一来源,或者生物质可以包含源于一个以上来源的混合物;例如,生物质可以包含玉米穗轴和玉米秸秆的混合物,或草和叶的混合物。生物质包括但不限于,生物能量作物、农业残余物、城市固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸厂的淤泥、庭园垃圾、树木和林业废弃物。生物质的实例包括但不限于,玉米粒、玉米穗轴、玉米残余物例如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦麦秆、大麦、大麦麦秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物粉碎得到的成分、树木、树枝、树根、树叶、木屑、锯屑、灌木和矮树、蔬菜、水果、花和动物肥料。任何此类生物质可用于生物生产方法或系统以提供碳源。
除了合适的碳源(例如选自上述类型的一种)之外,生物生产培养基必须含有本领域技术人员已知的适合于培养物生长并促进3-HP生产所需的酶途径的合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂和其它成分。
最后,在多种实施方式中,选择碳源可以排除丙烯酸、1,4-丁二醇,以及其它下游产物。
培养条件
细胞通常在大约25℃至大约40℃的温度生长于合适的培养基中,对于嗜热微生物,可以高达70℃。本发明中的合适的培养基是常见的商业制备的培养基,例如Luria Bertani(LB)培养基、M9最简培养基、沙保氏葡萄糖(SD)培养基、酵母培养基(YM)培养基(Ymin)酵母合成最简培养基,和如本文描述的最简培养基,例如M9最简培养基。也可以使用其它定义的或合成的培养基,用于特定微生物生长的合适培养基是微生物领域或生物生产科学领域技术人员已知的。在多种实施方式中,可以开发并使用最简培养基,其不含有或添加低水平 的(例如低于0.2%,或低于1%,或低于0.05%)一种或多种酵母提取物和/或衍生自酵母提取物的复合物,例如蛋白胨、胰蛋白胨等。
用于生物生产的合适的pH范围是pH 0.3至pH 10.0,其中pH 6.0至pH 8.0是用于最初条件的典型pH范围。
但是,用于具体实施方式的实际培养条件不是意在被本部分给出的范围所限制。
可以在有氧、微有氧、或无氧条件下,搅拌或不搅拌地进行生物生产。
一般可以使用多种本领域已知的方法测定生物生产培养基中产生的3-HP的量,例如,高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)或GC/质谱(MS)。本文提供了用于具体实施方式的具体HPLC方法。
生物生产反应器和系统
可以将以上描述和/或提及的任何重组微生物导入工业生物生产系统中,其中所述微生物以商业上可行的操作将碳源转化为3-HP。生物生产系统包括将此类重组微生物导入生物反应器容器中,所述容器含有适合于该重组微生物生长的碳源底物和生物生产培养基;并将该生物生产系统保持在合适的温度范围(如果是有氧或微有氧反应,还有合适的溶氧浓度范围)持续合适的时间,以获得想要的从底物分子的一部分向3-HP的转化。工业生物生产系统及其操作是化工和生物加工加工领域技术人员熟知的。以下段落提供了可用于3-HP的生物生产的方法和工业系统的方面的纵览。
在多种实施方式中,将多种糖中的任意种,包括但不限于蔗糖、葡萄糖、木糖、纤维素或半纤维素,提供给微生物,例如工业系统中的微生物,所述工业系统包含反应器容器,其中可以混合确定的培养基(例如最简盐培养基,包括但不限于M9最简培养基、硫酸钾最简培养基、酵母合成最简培养基和很多其它的或这些的变体)、提供一个或多个3-HP生物合成途径替代物的微生物的接种物、和碳源。所述碳源进入细胞并被熟知的和常见的代谢途径催化以产生常见的代谢中间体,包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)(参见Molecular Biology of the Cell,3rd Ed.,B.Alberts等人Garland Publishing,New York,1994,pp.42-45,66-74,其中关于糖的基本代谢催化途径的教导通过引用并入;Principles of Biochemistry,3rd Ed.,D.L.Nelson&M.M.Cox,Worth Publishers,New York,2000,pp 527-658,其中关于主要代谢途径的教导通过引用并入;和Biochemistry,4th Ed.,L.Stryer,W.H.Freeman and Co.,New York,1995,pp.463-650,其中关于主要代谢途径的教导也通过引用并入)。然后,合适的中间体通过一个或多个上述生物合成途径被转化为3-HP。
关于工业生物生产的类型,本发明的多种实施方式可以应用工业生物反应器的批式类型。经典的批式生物反应器系统被认为是“封闭的”,意思是在各个生物生产事件开始时确定培养基的成分,并且基本上在生物生产事件的终点结束的时间过程中不经过人工改变和添加。因此,在生物生产事件开始时,将想要的一种或多种生物接种至培养基,使生物生产发生,不向系统中添加任何物质。但是通常而言,生物生产事件的“批式”类型是就添加碳源而言是批式,通常会尝试控制各种因素例如pH和氧浓度。在批式系统中,系统的代谢物和生物质成分一直在改变,直至生物生产事件停止。在批式培养中,细胞通过静止延迟期缓慢进入高速生长对数期,最后进入稳定期,在稳定期生长速率降低或停止。如果不进行处理,稳定期的细胞最终将死亡。对数期的细胞一般负责大量产生想要的终产物或中间体。
标准批式系统的变体是补料-分批系统。补料-分批生物生产方法也适合于本发明,其包括典型的批式系统,不同之处在于随着生物生产的进展,递增所添加的营养物(包括底物)。当分解代谢产物阻抑倾向于抑制细胞的代谢并且需要在培养基中具有有限量的底物时,补料-分批系统是有用的。补料-分批系统中的实际营养物浓度的测定可以直接进行,例如通过在不同时间进行样品分析,或者基于可测因素例如pH、溶氧和废气例如CO2的分压的变化进行评估。批式和补料-分批方法是常见的并且是本领域熟知的,其实例可以见Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,Mass.,Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992),and Biochemical Engineering Fundamentals,2nd Ed.J.E.Bailey和D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986,其中关于生物生产的一般说明通过引用并入本文;如本文使用的该生物生产可以是有氧、微有氧或无氧。
虽然本发明可以以批式模式进行,如实施例8中所提供;或者以补料-分批模式进行,但是考虑到本方法将适应于持续生物生产方法。持续生物生产方法被认为是“开放”系统,其中持续向生物反应器中添加确定的生物生产培养基,同时取出等量的条件培养基以进行处理。持续生物生产一般将培养物维持在控制的密度范围内,其中细胞主要处于对数生长期。有两种类型的持续生物反应器操作,包括:1)恒化器(Chemostat)——其中向容器中添加新鲜的培养基,同时取出等量的容器内容物。该方法的局限性在于会损失细胞,并且一般不能达到高细胞密度。事实上,通常人们可以通过补料-分配方法获得高得多的细胞密度。2)灌流式培养(perfusion culture),其类似于恒化器方法,不同之处在于从容器中取出的流经历分离技术,其将活细胞回收至容器中。已经表明这种类型的持续生物反应器操作产生显著高于补料-分批法的细胞密度,并且可以持续操作。持续生物生产对于工业操作是特别有利的,因为其减少了与为了下一次生物生产事件进行排干、清洁和准备设备相关的时间。此外,相对于批式模式中的操作而言,持续操作下游的单元操作(例如蒸馏)通常更经济。
持续生物生产允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任何数目的因素。例如,一种方法将有限的营养物例如碳源或氮水平维持在固定速率,并允许所有其它参数变稳定。在其它系统中,可以持续改变影响生长的多个因素,而细胞浓度(通过培养基浊度测定)保持恒定。调节持续生物生产过程中的营养物和生长因素的方法以及使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物领域熟知的,Brock(见上文)详述了多种方法。
考虑到可以通过批式、补料-分批或持续方法实施本发明的实施方式,任意已知的生物生产模式都是合适的。另外考虑到,可以将细胞固定在惰性支架上作为总的细胞催化剂,并经历合适的生物生产条件以产生3-HP。
以下发表的资源的各自的教导通过引用并入本文,以表明这些相关领域的技术水平,并视需要支持关于教导如何产生并使用从糖源出发以工业方式生物生产3-HP的方法,以及可用于以本发明的任意重组微生物实现此转化的工业系统的公开内容(Biochemical Engineering Fundamentals,2nd Ed.J.E.Bailey和D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986,为了指明的目的,整本书并入;尤其关于生物反应器的设计,第9章,第533-657页并入;Unit Operations of Chemical Engineering,5th Ed.,W.L.McCabe等人,McGraw Hill,New York 1993,为了指明的目的,尤其是方法和分离技术分析,整本书并入;Equilibrium Staged Separations,P.C.Wankat,Prentice Hall,Englewood Cliffs,NJ USA,1988,关于分离技术的教导,整本书并入)。
另外,本发明的范围无意限于本文提供的确切序列。认识到可以对核酸和氨基酸序列进行多种修饰并仍然提供想要的功能,例如想要的酶活性和特异性。提供了以下讨论以描述可以实施并仍保持在本发明范围内的多种改变。
长期以来在本领域认识到,氨基酸序列中的一些氨基酸可以被改变而不显著影响蛋白质的结构或功能。改变可以包括缺失、插入、倒位、重复和类型替换,只要指明的酶活性不受到显著的不利影响。关于哪些氨基酸改变可能是表型上沉默的指南可以特别参见Bowie,J.U.,等人,″Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions,″Science 247:1306-1310(1990)。该文献中的此类教导通过引用并入本文,但是其也是本领域技术人员一般知道的。
在多种实施方式中,通过表达本发明的多核苷酸分子获得的多肽可以与本文描述的3-HP耐受性相关和生物合成途径中的基因和/或核 酸序列所编码的一个或多个氨基酸序列具有至少大约50%、60%、70%、80%、90%、95%、95%、97%、98%、99%、或100%的同一性。截短的各多肽具有至少大约90%的由编码各天然酶的核酸序列编码的全长多肽,更优选至少95%的由编码各天然酶的核酸序列编码的全长多肽。具有与多肽的参考氨基酸序列至少例如95%“同一性”的氨基酸序列的多肽是指,该多肽的氨基酸序列与所述参考序列相同,只不过对于多肽的参考氨基酸的每100个氨基酸而言,该多肽序列可以包括至多5个氨基酸改变。换言之,为了获得具有与参考氨基酸序列至少95%同一性的氨基酸序列的多肽,可以缺失参考序列中至多5%的氨基酸残基或将其替换为其它氨基酸,或者,可以向参考序列中插入数目为参考序列中总氨基酸残基数的至多5%的氨基酸。参考序列的这些改变可以发生于参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置,或这些末端位置之间的任意位置,单个地散布于参考序列的残基中,或者以一个或多个连续组的形式存在于参考序列中。
在实际中,关于任意特定多肽是否与本文描述的任意多肽(其可以对应于本文描述的特定核酸序列)的任意参考氨基酸序列至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、或99%相同,可以使用已知的计算机程序常规地确定此类特定多肽序列,例如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参考序列例如95%相同时,将参数设定为,在参考氨基酸序列的全长上计算同一性百分率,并且允许参考序列中总氨基酸残基数目的至多5%的同源性中的缺口。
例如,在具体实施方式中,可以使用基于Brutlag等人的算法(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的FASTDB计算机程序来确定参考序列(查询序列,即本发明的序列)与对象序列之间的同一性(也称为全局序列比对)。在狭窄解释同一性的具体实施方式中,用于 FASTDB氨基酸比对的优选参数是:评分方案=PAM(Percent Accepted Mutations)0,k-tuple=2,错配罚分=1,连接罚分=20,随机化组长度=0,截止分=1,窗口大小=序列长度,缺口罚分=5,缺口大小罚分=0.05,窗口大小=500或对象氨基酸序列的长度,以较短者为准。根据该实施方式,如果由于N-或C-末端缺失而不是由于内部缺失导致对象序列短于查询序列,则对结果进行人工校正以将下列事实考虑进去:当计算全局同一性百分率时,FASTDB程序不解决对象序列的N-和C-末端截短的问题。对于相对于查询序列在N-和C-末端截短的对象序列,通过计算位于对象序列的N-和C-末端外侧的查询序列的残基数目(它们不与相应的对象残基匹配/比对)占查询序列的总碱基的百分率来校正同一性百分率。关于某残基是否匹配/比对的确定,是由FASTDB序列比对的结果确定的。然后从使用指定参数由上述FASTDB程序计算得出的同一性百分率中减掉该百分率,以获得最终的同一性百分率分数。该最终的同一性百分率分数用于该实施方式的目的。为了人工调整百分率同一性得分,只计算那些在对象序列的N-和C-末端之外的碱基(它们不与查询序列匹配/比对)。即,只考虑那些在目标序列的最末的N-和C-末端残基之外的查询残基位置以进行该人工校正。例如,90个氨基酸残基的对象序列与100个残基的查询序列进行比对以确定百分率同一性。缺失发生在对象序列的N-末端,因此,FASTDB比对不显示N-末端的前10个碱基的匹配/比对。10个未配对的残基代表10%的序列(不匹配的N-和C-末端的碱基数目/查询序列的残基总数目),所以,从FASTDB程序计算而来的百分率同一性分数中减掉10%。如果剩余的90个碱基完全匹配,则最终的百分率同一性将是90%。在另一个实例中,90个残基的对象序列与100个残基的查询序列进行比较。这次的缺失是内部缺失,所以没有不与查询序列匹配/比对的位于对象序列的N-和C-末端的残基。在这种情况下,FASTDB程序计算的百分率同一性不进行人工校正。再次说明:只有那些不与查询序列匹配/比对的位于对象序列的N-和C-末端之外的残基(如FASTDB比对中所显示)进行人工校正。
本文使用的术语“同源性”是指序列(核苷酸或氨基酸)的最佳比对,其可以通过算法的计算机化执行来进行。例如,关于多核苷酸的“同源性”,可以通过使用BLASTN 2.0版使用缺省参数分析来确定。关于多肽(即多个氨基酸)的“同源性”,可以使用诸如BLASTP2.2.2版的程序以缺省参数来确定,其比对被比较的多肽或片段并确定它们之间的氨基酸同一性或相似性程度。将认识到,氨基酸“同源性”包括保守性替换,即通过具有相似特性的其它氨基酸替换多肽中的给定氨基酸。通常被视为保守性替换的是以下替换:脂肪族氨基酸例如Ala、Val、Leu和Ile替换为另一个脂肪族氨基酸;Ser替换为Thr,反之亦可;酸性残基例如Asp或Glu替换为另一个酸性残基;携带酰胺基团的残基例如Asn或Gln替换为另一个携带酰胺基团的残基;碱性残基例如Lys或Arg替换为另一个碱性残基;以及芳香族残基例如Phe或Tyr替换为另一个芳香族残基。与另一个氨基酸序列或另一个核苷酸序列具有至少50%同源性的多肽序列(即氨基酸序列)或多核苷酸序列分别具有50%或更高的同源性,例如60%、70%、80%、90%或100%。
以上描述和用于序列同一性和同源性的方法意在示例性的,认识到这些概念是本领域熟知的。另外,认识到核酸序列可以发生变化但仍编码显示出想要的功能的酶或其它多肽,此类变化在本发明的范围内。编码提供指明的3-HP增强的耐受性或产量的功能的多肽的核酸序列被认为是在本发明的范围内。当所编码的多肽的功能与指明的3-HP耐受性相关的或生物合成途径中的酶活性匹配时,这些可以通过如下文描述的杂交的严格性进一步定义,但这不是意在限制。
另外,就核酸序列而言,“杂交”是指两个单链多核苷酸非共价地结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”还可以指三链杂交。得到(通常的)双链多核苷酸是“杂交体”或“双体”。“杂交条件”通常包括低于大约1M,更通常是低于大约500mM和低于大约200mM的盐浓度。杂交温度可以低至5℃,但通常高于22℃,更通常是高于大约30℃,通常超过大约37℃。杂交通常在严格条件 下进行,即这样的条件:在该条件下,探针将与其靶亚序列杂交。严格条件是序列依赖性的,在不同环境下是不同的。较长的片段可能需要较高的杂交温度来进行特异性杂交。其它因素可能影响杂交的严格性,包括碱基组成和互补链的长度,有机溶剂的存在和碱基错配的程度,参数的组合比单独任意一个的绝对值更加重要。一般而言,将严格条件选择为:温度比特定序列在确定的离子强度和pH时的Tm低大约5℃。示例性的严格条件包括:至少0.01M至不超过1M的Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度,pH为7.0至8.3,并且温度为至少25℃。例如,5X SSPE(750mM NaCl,50mM磷酸钠(NaPhosphate),5mMEDTA,pH 7.4)和25-30℃的温度的条件适合于等位基因特异性的探针杂交。对于严格条件,参见例如Sambrook和Russell和Anderson ″Nucleic Acid Hybridization″1st Ed.,BIOS Scientific Publishers Limited(1999),关于杂交程序的内容通过引用并入本文。“特异性地杂交”或“特异性地杂交至”或类似表达语句是指,在严格条件下,一个分子基本上或仅与特定核苷酸序列结合、形成双体或杂交(当该序列存在于复杂混合物(例如总的细胞的)DNA或RNA中时)。
基于以上内容,认识到本发明的多个非限制性方面可以包括但不限于:
经遗传修饰的(重组的)微生物,其包含编码多肽的核酸序列,所述多肽与任意3-HP耐受性相关的或生物合成途径中的任意酶具有至少85%的氨基酸序列同一性,其中所述多肽具有有效进行各个3-HP耐受性相关的或生物合成途径酶的酶反应的酶活性和特异性,并且相对于不含所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更高的3-HP耐受性和/或3-HP生物生产。
经遗传修饰的(重组的)微生物,其包含编码多肽的核酸序列,所述多肽与任意3-HP耐受性相关的或生物合成途径中的任意酶具有至少90%的氨基酸序列同一性,其中所述多肽具有有效进行各个3-HP耐受性相关的或生物合成途径酶的酶反应的酶活性和特异性,并且相对于不含所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更 高的3-HP耐受性和/或3-HP生物生产。
经遗传修饰的(重组的)微生物,其包含编码多肽的核酸序列,所述多肽与任意3-HP耐受性相关的或生物合成途径中的任意酶具有至少95%的氨基酸序列同一性,其中所述多肽具有有效进行各个3-HP耐受性相关的或生物合成途径酶的酶反应的酶活性和特异性,并且相对于不含所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更高的3-HP耐受性和/或3-HP生物生产。在一些实施方式中,至少一个多肽与3-HPTGC途径和/或3-HP生物合成途径中的至少一种酶具有至少99%或100%的序列同一性。
在本发明的一个方面,前述段落中的同一性值是通过使用如上所述的用于FASTDB软件程序的参数设定来确定的。认识到,可以使用其它认可的参数设定替代性地确定同一性,并且不同的软件程序(例如Bestfit vs.BLASTp)预期会提供不同的结果。因此,可以以多种方式确定同一性。另外,对于本文中所有具体提及的序列,应该理解,其保守性修饰的变体意在包括在本发明内。
在一些实施方式中,本发明涉及经遗传修饰的(例如重组的)微生物,其包含编码多肽的异源核酸序列,所述多肽是任意3-HP耐受性相关的途径或途径部分(即3HPTGC的)中的任意酶的鉴定的酶功能变体,其中所述多肽具有有效进行各个3-HP耐受性相关的酶的酶反应的酶活性和特异性,从而相对于不含所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更高的3-HP耐受性。本发明的相关方法还意在涉及鉴定的酶功能变体和编码它们的核酸序列。
术语“鉴定的酶功能变体”意思是确定为具有目标酶的酶活性和特异性但其氨基酸序列不同于所述目标酶的多肽。可以构建相应的“变体核酸序列”,其确定为编码此类鉴定的酶功能变体。对于特定目的,例如通过遗传修饰以增加微生物中3HPTGC的一个或多个酶促转化步骤中的酶促转化而增加3-HP的耐受性,可以进行一个或多个遗传修饰以提供一个或多个异源核酸序列,其编码一种或多种鉴定的3HPTGC酶功能变体。即,每个此类核酸序列编码多肽,所述多肽不 是3HPTGC的酶的已知多肽,但是其显示出此类酶的酶活性。此类核酸序列及其编码的多肽可能不落在指明的同源性或同一性限制之内,但是通过在细胞中提供它们,能提供想要的酶活性和特异性。获得此类变体核酸序列和鉴定的酶功能变体的能力得到生物信息学和蛋白质工程和设计领域的最近进展(包括计算机化、预测和高通量方法中的进展)的支持。
应该理解,本文描述并也在以下的非限制性实施例中例示的步骤包括进行遗传修饰的步骤,以及鉴定遗传修饰和/或补充物的步骤,及其组合,以改善微生物和/或微生物培养物中的3-HP耐受性。另外,由此获得和/或鉴定的遗传修饰包括制备显示出增强的3-HP耐受性的微生物的方式。
已经对本发明进行了这样的描述并提供了以下实施例,并且参阅上文的段落,认识到本发明的多个非限制性方面可以包括但不限于以下实施方式。
在一些实施方式中,本发明涉及重组微生物,其包含至少一个遗传修饰以有效增加3-羟基丙酸(“3-HP”)产生,其中3-HP产生的增加的水平高于野生型微生物中的3-HP产生水平;以及3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰。在一些实施方式中,所述野生型微生物产生3-HP。在一些实施方式中,所述野生型微生物不产生3-HP。在一些实施方式中,所述重组微生物包含至少一个载体,例如至少一个质粒,其中所述至少一个载体包含至少一个异源核酸分子。
在本发明的一些实施方式中,所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效地将重组微生物的3-HP耐受性增加至对照微生物的3-HP耐受性之上,其中所述对照微生物不含所述至少一个3HPTGC遗传修饰。在一些实施方式中,重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性增加大约5%、10%或20%。在一些实施方式中,重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性增加大约30%、40%、50%、60%、80%或100%。
另外,在多种实施方式中,所述3HPTGC的至少一个遗传修饰编 码至少一个多肽,其显示3HPTGC的至少一种酶的至少一个酶促转化,其中所述重组微生物显示出比不含所述3HPTGC的至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或100%或更高的增强的3-HP耐受性。此类耐受性改善的任何评估可以基于最简培养基中的最小抑制浓度评估。
在一些实施方式中,微生物还包含至少一个另外的遗传修饰,其编码至少一个多肽,所述多肽显示出不同于3HPTGC的第一组的遗传修饰的第二组的至少一种酶的至少一个酶促转化,其中所述重组微生物显示出比不含3HPTGC的所有的所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或100%或更高的增强的3-HP耐受性。在多种实施方式中,所述至少一个另外的遗传修饰还包括来自组A-F的两个或更多个、或三个或更多个中的每一个的遗传修饰。
例如,所述遗传修饰可以包含:组A的至少一个遗传修饰和组B的至少一个遗传修饰,组A的至少一个遗传修饰和组C的至少一个遗传修饰,组A的至少一个遗传修饰和组D的至少一个遗传修饰,组A的至少一个遗传修饰和组E的至少一个遗传修饰,组B的至少一个遗传修饰和组C的至少一个遗传修饰,组B的至少一个遗传修饰和组D的至少一个遗传修饰,组B的至少一个遗传修饰和组E的至少一个遗传修饰,组C的至少一个遗传修饰和组D的至少一个遗传修饰,组C的至少一个遗传修饰和组E的至少一个遗传修饰,或,组D的至少一个遗传修饰和组E的至少一个遗传修饰。任意此类组合可以进一步与组F的遗传修饰一起实施。
在一些实施方式中,重组微生物包含选自tyrR、trpR、metJ、argR、purR、lysR和nrdR的3HPTGC阻抑基因的一个或多个基因破坏。
在一些实施方式中,重组微生物是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中,重组微生物选自下列属:发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、和雷伯氏菌属(Klebsiella)。在一些实施方式中, 重组微生物选自下列种:大肠杆菌(Escherichia coli)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)、和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在一些实施方式中,重组微生物是大肠杆菌菌株。
在一些实施方式中,重组微生物是革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中,重组微生物选自下列属:梭菌属(Clostridium)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、和短杆菌属(Brevibacterium)。在一些实施方式中,重组微生物选自下列种:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一些实施方式中,重组微生物是枯草芽孢杆菌菌株。
在一些实施方式中,重组微生物是酵母。在一些实施方式中,重组微生物选自下列属:毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和酵母属(Saccharomyces)。在一些实施方式中,重组微生物是酿酒酵母。
在一些实施方式中,3HPTGC的至少一个遗传修饰包括增加SEQID NO:129(Irok肽)的表达的方式。在一些实施方式中,重组微生物是大肠杆菌菌株。在一些实施方式中,重组微生物是钩虫贪铜菌菌株。
在一些实施方式中,至少一个遗传修饰编码与3HPTGC途径、3-HP生物合成途径的至少一种酶和/或SEQ ID NO:129(Irok)具有至少85%氨基酸序列同一性的至少一种多肽。
本发明的一些实施方式涉及培养系统。在一些实施方式中,所述 培养系统包括本文描述的经遗传修饰的微生物和培养基。此类经遗传修饰的微生物可以包含3HPTGC的单一遗传修饰,或本文描述的任意组合,并可以另外包含3-HP产生途径的一个或多个遗传修饰。在一些实施方式中,所述培养基包含至少大约1g/L,至少大约5g/L,至少大约10g/L,至少大约15g/L,或至少大约20g/L的3-HP。在一些实施方式中,所述培养系统包含例如表3所示的各个浓度的3HPTGC补充物。
在一些实施方式中,本发明涉及制备经遗传修饰的微生物的方法,包括在3-羟基丙酸耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的酶促转化步骤提供至少一个遗传修饰以使所述经遗传修饰的微生物的酶促转化相对于对照微生物的酶促转化升高,其中所述对照微生物不含所述至少一个遗传修饰,其中所述经遗传修饰的微生物合成3-HP。在一些实施方式中,所述对照微生物合成3-HP。在一些实施方式中,所述至少一个遗传修饰使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性升高。在一些实施方式中,经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%,至少大约10%,至少大约20%,至少大约30%,至少大约40%,至少大约50%,或至少大约100%。在一些实施方式中,基于在最简培养基上进行的最小抑制浓度评估,经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高大约50%至大约300%。在一些实施方式中,经遗传修饰的微生物还包含选自tyrR、trpR、metJ、argR、purR、lysR和nrdR的3HPTGC阻抑基因的一个或多个基因破坏。在一些实施方式中,对照微生物不合成3-HP。在一些实施方式中,提供至少一个遗传修饰包括提供至少一种载体。在一些实施方式中,所述至少一种载体包括至少一个质粒。在一些实施方式中,提供至少一个遗传修饰包括提供至少一个核酸分子。在一些实施方式中,所述至少一个核酸分子是异源的。在一些实施方式中,所述至少一个核酸分子编码SEQ IDNO:129(Irok)。
在一些实施方式中,本发明提供了制备经遗传修饰的微生物的方法,其包括:
a.选择微生物,其包括下列步骤:
i.提供微生物物种或菌株,其中目标微生物物种或菌株具有基因组序列;
ii.鉴定所述微生物的基因组序列;
ii.鉴定所述微生物的基因组序列与图1A-D的3-羟基丙酸耐受形成性复合物(3HPTGC)之间的同源性,
b.通过向所述微生物中导入至少一个选择的遗传修饰,对步骤a中所选的微生物进行遗传修饰,其中所述至少一个选择的遗传修饰增加在功能上等同于图1A-D的一个或多个3HPTGC酶促转化步骤的一个或多个酶促转化步骤的转化;其中所述的增加一个或多个酶促转化步骤的转化使所述微生物的3-HP耐受性相对于不含所述至少一个选择的遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性升高;
c.评估步骤b中导入的至少一个选择的遗传修饰,以鉴定产物微生物,其中所述产物微生物的3-HP耐受性高于对照微生物的3-HP耐受性;
d.选择步骤c中评估的至少一个选择的遗传修饰;和
e.通过向一个或多个细胞中导入步骤c的产物微生物的至少一个遗传修饰而制备经遗传修饰的微生物,以产生经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%。
在一些实施方式中,本发明涉及改善3-羟基丙酸(3-HP)耐受性的方法,其包括:
a.将至少一个遗传修饰导入选择的合成3-HP的微生物中,其中所述至少一个遗传修饰增加3HPTGC的一部分的至少一个酶促转化步骤的酶促转化,其中所述3HPTGC的一部分是苏氨酸/高半胱氨酸,聚胺合成,赖氨酸合成,或核苷酸合成(或3HPTGC的任何其它选择的部分);和
b.将选择的微生物暴露于包含至少大约1、5、10、20、25、30、 40或50g/L 3-HP的培养基中,
其中所述选择的微生物显示出的3-HP耐受性比不含步骤a的至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或100%或更高。因此,在一些实施方式中,选择的微生物显示出的3-HP耐受性比不含步骤a的至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%,至少大约10%,至少大约20%,至少大约30%,至少大约40%,至少大约50%,或至少大约100%。
在一些实施方式中,进行遗传修饰以增加鉴定为具有表1中的升高的拟合分数和/或在以下实施例中评估的酶促转化步骤的酶促转化。催化此类反应的酶是众多的,并包括氰酸酶和碳酸酐酶。
在一些实施方式中,本发明涉及重组微生物,其包含:
a.至少一个遗传修饰,所述遗传修饰增加氰酸酶和碳酸酐酶之一或二者的酶促转化;和
b.3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的一部分的至少一个另外的遗传修饰,其中所述3HPTGC的一部分是3HPTGC的分支酸、苏氨酸/高半胱氨酸、赖氨酸合成,或核苷酸合成部分。在一些实施方式中,所述微生物还包含3HPTGC的聚胺部分的至少一个另外的遗传修饰。
另外,对于一些实施方式,3HPTGC的遗传修饰不是来自于组A,或者不是来自于组A和B。
另外,认识到,本发明的多种实施方式可以涉及催化任何物种的3HPTGC的酶促转化步骤的酶的氨基酸序列。更具体地,图1A-D的3HPTGC的氨基酸序列可以从一个或多个通常使用的生物信息学数据库(例如,www.ncbi.gov;www.metacyc.org),通过在其中输入酶促转化步骤的各个基因而容易地获得。
除非另有指明,否则本发明的实施将应用生物合成工业等领域的常规技术,其是本领域能力范围内。此类技术在文献中有完善的解释并在下文中提供了示例性方法。
另外,虽然实施例的步骤包括使用质粒,但是可以使用本领域已知的其它载体。这些包括粘粒、病毒(例如细菌噬菌体、动物病毒、植物病毒)和人工染色体(例如酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC))。
在详细描述本发明的具体实施方式之前,应该理解,除非另有指明,否则本发明不限于特定序列、表达载体、酶、宿主微生物、组合物、方法或系统,或这些的组合,因为它们可以变化。还应该理解,本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的,不是意在限制。
另外,更一般地,根据本文的公开内容、讨论、实施例和实施方式,可能应用本领域技能之内的常规分子生物学、细胞生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中有完善的解释(参见,例如,Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition 2001(卷1-3),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Animal Cell Culture,R.I.Freshney,编辑,1986)。这些公开资源中其中的标准实验室方法的各自教导,通过引用并入本文。另外,本文引用的所有专利、专利申请、专利公开和其它公开物(合称为“公开资源”)通过引用并入本申请。此种并入,在最小意义上来讲,是为了具体教导和/或在本文中引用参考文献时注明的其它目的。如果没有注明具体教导和/或其它目的,则公开资源的特别并入是为了一个或多个标题、摘要和/或参考文献总结所指明的教导。如果没有相关的此类具体指明的教导和/或其它目的,则公开资源的并入是为了更完善地描述本发明相关领域的技术水平,和/或提供此类教导,如本领域技术人员一般已知的内容(如适用)。但是,特别指明:在本文中引用公开资源不应解释为承认其是本发明的现有技术。另外,如果出现并入的一个或多个公开资源与本申请相左或矛盾的情况,包括但不限于定义的术语、术语的使用、描述的技术等,则以本申请为准。
虽然已经在本文中显示并描述了本发明的多种实施方式,但要强调的是,此类实施方式仅以举例方式提供。可以不脱离本发明对其多 种实施方式作出多种变体、改变和替换。具体而言,并且不论因为何种原因,对于指明的或在本文的列表、表格中显示的化合物、核酸序列、多肽(包括具体蛋白,包括功能性酶)、代谢途径的酶或中间体、元件、或其它成分,或浓度的任意组,或其它组(例如附图中显示的代谢途径的酶)而言,除非另有明确指明,否则意在表示每一个此类组提供了各个子实施方式的基础并用于鉴定各个子实施方式,在最宽的范围上,所述子实施方式通过排除各个指明的组中的一个或多个成员(或子集)而包含此类组的每个子集。例如,图1A第1-7页的酶或酶促转化步骤及其在其它物种中的等同物的可要求的子集可以排除三羧酸途径的酶或整个上部分。此外,当本文描述任何范围时,除非另有明确指明,否则该范围包括其中的所有数值和其中的所有亚范围。因此,意在表示本发明仅由随附的权利要求、和后续权利要求、以及可能在本申请或要求本申请优先权的后续申请的审查过程中修改的这些权利要求的精神和范围所限制。
实施例部分
多数以下实施例公开了用于提供具有编码赋予增强的3-HP耐受性的酶或其它多肽的异源核酸序列的细胞的具体方法。当在两个或更多个具体实施例中共同实施的一种方法要达到某结果时(或为了其它原因),该方法可以在实施例之后的单独的“共同的方法部分”中提供。每个此类共同的方法通过引用并入提及它的各个具体实施例。另外,当具体实施例中关于供应商的信息不完整时,可以在单独的“供应商总结”部分找到另外的生产商信息,其还可以包括产品代码、目录号或其它信息。该信息意在并入提及此供应商和/或产品的各个具体实施例中。
在以下实施例中,已经努力确保关于使用的数字(例如数量、温度等)的精确性,但要把一些实验误差和偏差考虑在内。除非另有指明,否则温度单位是摄氏度,并且压力是在或接近于海平面以上大约5340英尺(1628米)的大气压。注意到,在外面的分析和合成设施中进行的工作不是在或接近于海平面以上大约5340英尺(1628米)的大气压 进行的。除非另有指明,否则所有的试剂从商业渠道购买。实施例和“共同的方法部分”提供的物种和其它系统发生鉴定是根据微生物学领域技术人员已知的分类法。
缩写的含义如下:“C”表示摄氏或摄氏度,从其使用中可以清晰看出,“s”表示秒,“min”表示分钟,“h”、“hr”或“hrs”表示小时,“psi”表示镑每平方英寸,“nm”表示纳米,“d”表示天,“μL”或“uL”或“ul”表示微升,“mL”表示毫升,“L”表示升,“mm”表示毫米,“nm”表示纳米,“mM”表示毫摩,“μM”或“uM”表示微摩,“M”表示摩,“mmol”表示毫摩尔,“μmol”或“uMol”表示微摩尔,“g”表示克,“μg”或“ug”表示微克,”ng”表示纳克,“PCR”表示聚合酶链式反应,“OD”表示光密度,“OD600”表示在600nm的波长测定的光密度,“kDa”表示千道尔顿,“g”表示重力常数,“bp”表示碱基对,“kbp”表示千碱基对,“%w/v”表示重量/体积百分比,“%v/v”表示体积/体积百分比,“IPTG”表示异丙基-μ-D-硫代半乳糖吡喃糖苷,“RBS”表示核糖体结合位点,“rpm”表示转/分,“HPLC”表示高效液相色谱,“GC”表示气体色谱。如上所述,“3-HP”表示3-羟基丙酸,“3HPTGC”表示3-HP耐受形成性复合物。另外,10^5等表示105等。
实施例1:3HPTGC中遗传元件拷贝数的增加赋予3-HP耐受性
使用SCALEs技术,来自于与3-HP暴露相关的文库克隆拟合的SCALEs评估的数据提供了关于多个基因和酶的3-HP耐受性的清晰的证据。从该数据以及根据来自3HPTGC的其它部分的拟合数据,可以获得以下主要观点:3HPTGC的任意基因或酶的适当修饰和/或提供核酸序列(所述核酸序列提供此类酶的酶活性,但不一定编码整个酶)可以引起改变的酶活性,改变的酶活性引起增强的3-HP耐受性。
用于测定由3HPTGC中的基因赋予的3-HP耐受性的方法总结如下。紧接下来公开的方法描述了SCALES方法的方面,其在上文也进行了总体上的描述(虽然没那么详细)。
细菌、质粒和文库构建
野生型大肠杆菌K12(ATCC#29425)用于制备基因组DNA。在 37C以两种平末端切割酶AluI和RsaI(Invitrogen,Carlsbad,CA USA)将纯化的基因组DNA的6个样品消化不同的下列时间-10、20、30、40、50和60分钟,然后在70C热灭活15分钟。混合限制性消化物,使用琼脂糖凝胶电泳基于大小分离片段化的DNA。从胶上切下0.5、1、2、4和大于8kb大小的不同DNA片段,并根据生产商的说明书使用凝胶提取试剂盒(Quagen)进行纯化。根据生产商的说明书,通过将各个纯化的片段化DNA与pSMART-LCKAN载体(Lucigen,Middleton,WI USA)连接而构建基因组文库。然后将每个连接产物电穿孔导入大肠杆菌10G超电感受态细胞(Lucigen)并铺在LB+卡那霉素平板上。收集菌落,根据生产商的说明书,使用Quiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit提取质粒DNA。将每个文库的纯化的质粒DNA通过电穿孔导入大肠杆菌菌株 (Invitrogen,Carlsbad,CA USA)。将这些培养物(它们代表每个文库-0.5、1.0、2.0、4.0和>8.0kb的基因组DNA)组合并在37C温育至想要的密度,使OD600达到大约0.50。该组合文库培养物混合物用于以下的选择。(参见以下的部分,另参见Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analys of library enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93);Warnecke,T.E.,Lynch,M.D.,Karimpour-Fard,A.,Sandoval,N.,Gill,R.T.,Agenomics approach to improve the analysis and design of strain selections.Metabolic Engineering,200810(154-156))。含有pSMART-LCKAN空载体的Mach1-T1R用于所有的对照研究。在MOPS最简培养基(参见Neidhardt,F.,Culture medium for enterobacteria.J Bacteriol,1974.119:p.736-747.)上建立生长曲线。抗生素浓度是20ug卡那霉素/mL。
3-HP的制备
3-HP获自TCI America(Portland,OR)。通过HPLC分析观察到显著的丙烯酸和2-氧二丙酸污染物。然后通过二乙醚萃取处理样品,以除掉丙烯酸和部分2-氧二丙酸污染物。然后以10M NaOH将样品中和至最终pH为7.0。在中性pH观察到相当多的不溶性物质,浓度 超过大约35g/L。将中和的样品在4C在4000rpm离心30分钟。从该离心的不溶性物质中分离可溶性3-HP组分,并通过HPLC进一步分析,以最终定量工作贮液的浓度和纯度。工作贮液用于本实施例中的选择和MIC评估。
选择
如上所述,从大肠杆菌K12基因组DNA中产生了5个代表性基因组文库,其具有确定的插入子大小:0.5、1、2、4、和8kb,将每个文库转化进入 大肠杆菌中,培养,然后混合。将混合物等分在两个15mL带螺旋帽的管中,管中含有终浓度为20g/L的3-HP(TCI America),使用10M NaOH中和至pH 7。监视选择培养物的细胞密度,它们达到最终的OD600为0.3-0.4。然后最初的选择培养物用于接种另一轮的15mL MOPS最简培养基+卡那霉素+3-HP,作为重复的批式选择策略的一部分。总体上,在60小时的时间内,在8个具有渐减的3-HP梯度的连续转移批中进行选择。更具体而言,对于连续批1和2,3-HP浓度是20g 3-HP/L;对于连续批3和4,3-HP浓度是15g 3-HP/L;对于连续批5和6,3-HP浓度是10g 3-HP/L;对于连续批7和8,3-HP浓度是5g 3-HP/L。对于连续批7和8,更换培养基以避免营养物限制,因为培养物到达了稳定期(另外参见,Warnecke,T.E.,Lynch,M.D.,Karimpour-Fard,A.,Sandoval,N.,Gill,R.T.,A genomics approach to improve the analysis and design of strain selections.Metabolic Engineering,200810(154-156),通过引用并入本文)。按照需要调整批转移次数,以避免营养物限制的选择环境。在每个批的培养过程中取出样品。监视含有3-HP的重复的批培养物,并在60小时的时间内接种以增大那些在存在3-HP的情况下显示出增加的生长的克隆的浓度。对于每个批,通过将1mL的选择的群体涂板于选择性平板(LB+卡那霉素)上而取出样品。从每个样品中提取质粒DNA,并根据之前的工作(参见Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis of library enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93))和生产商的说明书杂交至Affymetrix大肠杆 菌反义 阵列(Affymetrix,S anta Clara,CA)。
数据分析
使用如本文以及Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis of library enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93)中描述的适合于SCALEs的软件完成数据分析。按照之前的描述(Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis of library enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93)),从作为选择的群体的组分的每个区域的富集来计算来自具体基因组元件的拟合贡献。简而言之,按照上文所述,将来自于从选择中的每个批的培养物中取出样品的质粒DNA杂交至Affymetrix大肠杆菌反义 阵列,进一步分析从这之中获得的数据。对于每个阵列,从Affymetrix数据文件中提取对应于单个探针集的信号值,并基于相似的亲和值划分进入探针集中(Naef,F.和Magnasco,M.O.,2003,Solving the riddle of the bright mismatches:labeling and effective binding in oligonucelotide arrays.Phys.Rev.E 68,011906)。对于每个探针,根据常规的Affymetriz算法(MAS 5.0)减掉背景信号。非特异性干扰计算为:完全匹配的信号与错配的信号的差异针对完全匹配信号的稳健回归的截距。然后,将探针信号绘制到基因组位置,作为最接近的25个探针信号的tukey bi-weight,通过应用具有1000bp窗口长度的中值滤波器去燥。通过线性内插填充探针之间的缺口。使用基于N-筛子的分析分解该持续信号,并在500bp的最小规模上重建,如Lynch等人(2007)所详述。进一步通过总的引物阻抑子(repressor of primer,ROP)信号对信号进行校正,ROP信号是基于文库载体骨架并代表对应于添加到芯片上的总质粒浓度的信号。
分析将微阵列信号分解为相应的文库克隆,并计算具体区域随着时间的相对富集。按照这种方式,基于在存在3-HP的情况下进行的选择中的区域特异性富集模式测定出全基因组的拟合(ln(Xi/Xi0))。然后,通过基于它们的EcoCyc分类的代谢途径(ecocyc.org)将遗传元件及其相应的拟合分离开。该拟合矩阵用于计算在选择的群体中发现 的途径拟合(W)和富集频率。
通过以下步骤鉴定途径丰度:对途径拟合进行初步等级排序、然后将与多个途径相关的遗传元件与第一等级中鉴定的主要途径进行特异性比对,然后从次级途径中除掉基因特异性拟合值。
按照如下所述,将不依赖于遗传元件中的邻近基因的拟合分配至给定遗传元件中的相似基因:任意基因的拟合计算为包含该基因的所有克隆的拟合之和。然后将基因拟合进行初步等级排序,然后将与多个基因相关的遗传元件与遗传元件中鉴定的具有最高等级的显性基因进行特异性比对,然后从遗传元件中的非显性基因中除掉拟合值。
根据传统的信号检测理论(T.Fawcett,“An introduction to ROC analysis,”Pattern Recog.Let.(2006)27:861-874),通过构建受试者工作特性(“ROC”)进一步分析数据。使用如上所述的各个遗传元件的拟合值以及在存在20g/L 3-HP的情况下所测的比生长速率,使用标准分析方法,根据4个标准类别-真阳性、假阳性、真阴性、假阴性来归类数据,选择0.1、1.0、10和20的拟合的截止值以使真阳性和假阳性率的范围最优化。如果报告的拟合大于截止值,并且单独测定的生长速率显著高于阴性对照,则将代表克隆的遗传元件的数据点标记为真阳性。假阳性具有高于截止值的报告的拟合,但是生长速率不显著高于阴性对照的生长速率。只有当相应的拟合小于截止值并且产生显著降低的生长速率(即不显著高于阴性对照的生长速率)时,将克隆指定为真阴性;假阴性是指,克隆具有降低的拟合得分但是显示出增加的生长速率,即显著高于阴性对照的生长速率。
通过将真阳性率(灵敏性)相对于假阳性率(1-特异性)作图来构建ROC曲线(参见T.E.Warnecke等人Met.Engineering 10(2008):154-165)。因此,可以有信心地说:鉴定为具有增加的拟合的 克隆(及其各自的遗传元件)赋予相对于对照的3-HP耐受性。
结果
图1A第1-7页以图形的形式显示了对于大肠杆菌在3HPTGC中鉴定的基因。此外,表1给出了如上所述计算的3HPTGC中的基因的累积拟合值。
如上文所讨论,还针对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌、针对酿酒酵母、针对细菌钩虫贪铜菌研究了3-HP耐受形成性复合物。这些复合物分别显示于图1B-D第1-7页。
实施例2:添加3HPTGC产物,第一部分
基于以上实施例以及3HPTGC的概念化,可能通过添加3HPTGC的限制性酶促转化产物(即酶促转化步骤的产物)来增加微生物的3-HP耐受性。该实施例证明了添加一些此类产物以增加大肠杆菌的3-HP耐受性。
细菌、质粒和培养基
野生型大肠杆菌K12(ATCC#29425)用于制备基因组DNA。Mach1-T1R获自Invitrogen(Carlsbad,CA USA)。
3-HP的制备
3-HP获自TCI America(Portland,OR)。通过HPLC分析观察到显著的丙烯酸和2-氧二丙酸污染物。然后通过二乙醚萃取处理样品,以除掉丙烯酸和部分2-氧二丙酸污染物。然后以10M NaOH将样品中和至最终pH为7.0。在中性pH观察到相当多的3-HP聚合,浓度超过大约35g/L。将中和的样品在4℃在4000rpm离心30分钟。从固体聚合物产物中分离可溶性3-HP组分,并通过HPLC进一步分析,以最终定量工作贮液的浓度和纯度。工作贮液用于本实施例中的选择、生长速率和MIC评估。
最小抑制浓度
使用商售的3-HP(TCI America,Portland,OR USA,参见上文关于3-HP的制备),以96孔板的形式中在微有氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。使菌株的过夜培养物在5ml LB(视需要添加抗生素)中 生长。按照1v/v%接种15ml锥形管,管中装满MOPS最简培养基并盖帽。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶20稀释细胞,将10ul的等分试样用于接种每个孔(~104个细胞/孔)。在渐增的3-HP浓度(0-70g/L,递增5g/L)以及补充了最佳补充物浓度的培养基中,测定平板中的不同菌株的生长或生长状况,所述最佳补充物浓度经测定为:2.4mM酪氨酸(Sigma),3.3mM苯丙氨酸(Sigma),1mM色氨酸(Sigma),0.2mM对羟基苯甲酰肼(MPBiomedicals),0.2mM对氨基苯甲酸(MP Biomedicals),0.2mM 2,3-二羟基苯甲酸(MP Biomedicals),0.4mM莽草酸(Sigma),2mM维生素B6(Sigma),35uM高丝氨酸(Acros),45uM高半胱氨酸硫内酯盐酸盐(MP Biomedicals),0.5mM氧代丁酸(Fluka),5mM苏氨酸(Sigma)。在24小时后(24至25小时之间,虽然数据(未显示)表明:当时间段延长时,结果没有实质性变化)记录最小抑制性3-HP浓度(即,没有可见生长时的最低浓度)和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。
结果
通过向培养基中添加补充物,增强了大肠杆菌Mach1-T1R的3-HP耐受性。以上描述的补充引起下列MIC增加:40%(酪氨酸),33%(苯丙氨酸),33%(色氨酸),33%(对羟基苯甲酰肼),7%(对氨基苯甲酸),33%(2,3-二羟基苯甲酸),0%(维生素B6),33%(高丝氨酸),60%(高半胱氨酸硫内酯盐酸盐),7%(氧代丁酸),和3%(苏氨酸)。
实施例3:添加3HPTGC产物,第二部分(使用新的3-HP来源)
基于以上实施例以及3HPTGC的概念化,可能通过添加3HPTGC的限制性酶促转化产物(其中至少一些可以替代性地称作“中间体”)来增加微生物的3-HP耐受性。该实施例证明了添加腐胺、亚精胺、尸胺和碳酸氢钠增加了大肠杆菌的3-HP耐受性。本上下文中使用的“限制性”的概念是指假设的限制,即,如果克服的话,可以证明目标微生物或系统的增强的3-HP耐受性。作为非唯一的方法,可以通过实验方式确认此类假设性限制,如通过添加特定的酶促转化产物或 其它化合物后证明3-HP耐受性的增加。
细菌、质粒和培养基
野生型大肠杆菌K12(ATCC#29425)用于制备基因组DNA。M9最简培养基和EZ富集培养基见“共同的方法部分”中第II小部分之描述。
3-HP的制备
3-HP获自β丙内酯,见“共同的方法部分”中第III小部分之描述。
最小抑制浓度
以96孔板的形式中在有氧条件下测定大肠杆菌的3-HP(参见上文关于3-HP的制备)最小抑制浓度(MIC)。使菌株的过夜培养物在5mlLB(视需要添加抗生素)中在37℃摇动温育箱中生长。按照1v/v%接种10ml M9最简培养基。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶20稀释细胞,将10ul的等分试样用于接种每个孔(~104个细胞/孔)。在渐增的3-HP浓度(0-100g/L,递增10g/L),在补充了以下物质的M9最简培养基中,测定平板中的不同菌株的生长或生长状况:腐胺(0.1g/L,MP Biomedicals,Santa Ana,CA USA),尸胺(0.1g/L,MP Biomedicals)或亚精胺(0.1g/L,Sigma -Aldrich,St.Louis,MO,USA)或碳酸氢钠(20mM,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA USA)(括号中的数值表示其在培养基中的终浓度)。在24小时后(24至25小时之间,虽然数据(未显示)表明:当时间段延长时,结果没有实质性变化)记录最小抑制性3-HP浓度(即,没有可见生长时的最低浓度)和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。MIC的末端点是没有可见生长时的化合物的最低浓度。
结果
通过向培养基中添加聚胺:腐胺、亚精胺和尸胺,增强了大肠杆菌的3-HP耐受性。对于对照和补充后的培养基中的大肠杆菌K12的最小抑制浓度(MIC)如下:在补充了腐胺的M9最简培养基中是40g/L,在补充了亚精胺的M9最简培养基中是40g/L,在补充了尸胺 的M9最简培养基中是30g/L。对于添加了碳酸氢钠的M9最简培养基,最小抑制浓度(MIC)是30g/L。对于100g/L贮液3-HP中的大肠杆菌K12,最小抑制浓度(MIC)是20g/L。
鉴于使用碳酸氢钠补充物获得了相对于对照的MIC的增加,认为其它改变(例如调节和/或遗传修饰碳酸酐酶(未在图1A 1-7中显示,但是与HCO3 -直接相关),例如向目标细胞提供异源核酸序列,其中所述核酸序列编码具有碳酸酐酶活性的多肽)对于增加3-HP耐受性是有价值的(例如与3HPTGC的其它改变联合)。类似地,并如本文提供的其它数据所支持,认为酶活性的改变(例如3HPTGC途径部分中的酶的遗传修饰,其导致产生精氨酸、腐胺、尸胺和亚精胺)对于增加3-HP耐受性是有价值的(例如与3HPTGC的其它改变联合)。
实施例4:对aroH进行遗传修饰以增加3-HP耐受性
基于增加的拷贝数的tyrA-aroF操纵子被鉴定为赋予3-HP耐受性的遗传元件,进一步检测了该酶的活性。通过增加末产物酪氨酸和苯丙氨酸的浓度抑制野生型aroF基因。但是,为了绕过这个内在反馈抑制控制,获得了aroH基因的反馈抗性突变体,并按照下文所述将其导入细胞。
克隆构建
使用设计为包括上游aroFp启动子和rho非依赖性转录终止子的引物,使用PCR扩增大肠杆菌K12基因组DNA的对应于aroF-tyrA的区域。使用CloneSMART试剂盒(Lucigen,Middleton,WI USA),根据生产商的说明书,将纯化的、片段化的DNA连接至pSMART-卡那霉素载体。然后将连接产物转化进入化学上的感受态的Mach1-T1R大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA USA),涂板于LB+卡那霉素,并在37℃温育24小时。为了确认阳性转化子的插入,使用来自Qiagen(Valencia,CA)的Qiaprep Spin MiniPrep Kit从克隆中分离质粒,并测序(Macrogen,South Korea)。
从Ray等人(Ray,J.M.,C.Yanofsky,和R.Baurele,Mutational analysis of the catalytic and feedback sites of the tryptophan-sensitive 3-deoxy-D-arabino-heptulosante-7-phosphate synthase of Escherichia coli.J Bacteriol,1988.170(12):p.5500-6.)获得含有野生型aroH基因的质粒(CB202)和显示出对于色氨酸反馈抑制的抗性的突变形式(CB447)(通过单一的氨基酸改变(G149D))。将这些质粒与含有ptac启动子和rrNBT1转录终止子的pKK223-3骨架质粒构建在一起。使用设计为包括启动子和终止子的引物,根据传统PCR方法扩增aroH插入DNA。将纯化的PCR产物连接至pBT-1质粒并转化进入电感受态的 (Lynch,M.D.和R.T.Gill,A series of broad host range vectors for stable genomic library construction.Biotechnology and Bioengineering,2006.94(1):p.151-158)。得到的质粒序列显示于SEQID NO:001。通过最小抑制浓度测定法测定的最佳诱导水平是0.001mM IPTG。
MIC的比较
按照如实施例1的描述进行MIC评估。将包含aroH突变体的 细胞培养物与对照细胞培养物进行比较,二者均是在MOPS最简培养基中。
结果
如MIC倍数增加所测,包含aroH突变体的细胞的MIC比对照MIC高1.4倍。这代表40%的改善。
因此,该实施例证明了,基于关于3HPTGC在3-HP耐受性中的重要意义的知识,在选择的细胞中增加3-HP耐受性的很多可能的遗传修饰中的一种。
实施例5:通过导入氰酸酶的遗传修饰增加3-HP耐受性
从实施例1中描述的选择中获得包含来自大肠杆菌K12的cynTS基因的质粒克隆。根据标准方法分离并纯化这种被称作pSMART-LC-Kan-cynTS的质粒。(质粒的测序显示为最终序列(SEQID NO:002))。通过标准技术将纯化的质粒重转化进入大肠杆菌K12,并按照以上实施例3的描述测定MIC。
通过含有cynTS基因的质粒改善3-HP耐受性。
在M9最简培养基中,对于大肠杆菌K12和大肠杆菌K12+pSMART-LC-Kan-cynTS的3-HP最小抑制浓度(MIC)分别是30g/L和50g/L。因此,在该实施例中(在大肠杆菌宿主细胞中仅含有3HPTGC的一个遗传修饰)观察到MIC的超过60%的改善,代表3-HP耐受性的增加。
因此,本实施例再次证明了基于关于3HPTGC在3-HP耐受性中的重要意义的知识并合理使用该知识,在选择的细胞中增加3-HP耐受性的很多可能的遗传修饰方式中的一种。
实施例6:遗传修饰/导入丙二酰-CoA还原酶以在大肠杆菌DF40中产生3-HP
根据商业的DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的服务,将来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰-CoA还原酶基因的核苷酸序列针对大肠杆菌进行密码子优化。该基因序列在起始密码子之前引入EcoRI限制性位点,其后是HindIII限制性位点。此外,将Shine Delgarno序列(即核糖体结合位点)置于起始密码子之前、EcoRI限制性位点之后。由DNA 2.0合成该基因构建体,并提供于pJ206载体骨架中。根据生产商的说明书,使用来自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的酶EcoRI和HindIII,将含有合成的mcr基因的质粒DNA pJ206进行限制性酶消化。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的成分,从凝胶上切下包含对应于mcr基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。含有pKK223-aroH的大肠杆菌克隆菌株由Boulder的University of Colorado的Ryan T.Gill教授的实验室惠赠。根据标准方法使含有该质粒的该菌株的培养物生长,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的商售微量制备柱制备质粒DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒DNA。该消化是为了从 pKK223骨架中分离aroH阅读框。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen的成分,从凝胶上切下包含对应于pKK223骨架的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。
将对应于mcr基因的纯化的DNA片段与pK223载体骨架连接在一起,根据生产商的说明书转化并电穿孔连接产物。得到的载体命名为pKK223-mcr,通过Macrogen(USA)提供的商业服务通过常规测序确认其序列(SEQ ID NO:003)。pKK223-mcr赋予对β-内酰胺酶的抗性,并包含结核分枝杆菌(m.tuberculosis)的mcr基因,该基因在ptac启动子的控制之下,可以通过IPTG在大肠杆菌宿主中诱导该启动子。
通过标准方法(Sambrook和Russell,2001),将表达克隆pKK223-mcr和pKK223对照转化进入大肠杆菌K12和大肠杆菌DF40中。
在M9最简培养基中以10mL的规模证明了大肠杆菌DF40+pKK223-MCR的3-HP的产生。通过标准方法(Sambrook和Russell,2001),将来自冰冻贮液的大肠杆菌DF40、大肠杆菌DF40+pKK223和大肠杆菌DF40+pKK223-MCR的培养物接种至10mL的LB培养基+100ug/mL氨比西林(如标示),并在37度在225rpm摇动的条件下过夜生长至稳定期。次晨,通过离心使来自这些培养物的这些细胞沉淀,并重悬于10mL的M9最简培养基+5%(w/v)葡萄糖。使用该悬浮液接种处于M9最简培养基+5%(w/v)葡萄糖+100ug/mL氨比西林(如标示)中的5%(v/v)的新鲜10ml培养物[5%(v/v)]。这些培养物以至少一式三份生长,并添加1mM IPTG。为了监视这些培养物的生长,在时间=0和接种后每2个小时(总共12个小时)测定光密度值(在600nm的吸收,1cm光径),该光密度对应于细胞数目。12小时后,通过离心使细胞沉淀,并收集上清液,以分析3-HP的产生,如“共同的方法部分”中“分析培养物的3-HP产生”中所描述。
结果
HPLC分析之后,计算这些10mL培养物中的初步的3-HP最终效价为3.19+/-1.041mM 3-HP。公认的是,可能同时产生丙二酸半醛或可能产生另一种不能通过我们目前的HPLC分析与3-HP区分开的醛。
实施例7:开发编码具有草酰乙酸α-脱羧酶活性的蛋白序列的核酸序列(部分预测性的)
以前已经表征了数个具有广谱底物范围的2-酮酸脱羧酶(Pohl,M.,Sprenger,G.A.,Muller,M.,A new perspective on thiamine catalysis.Current Opinion in Biotechnology,15(4),335-342(2004))。其中很感兴趣的是来自结核分枝杆菌的酶,α-酮戊二酸脱羧酶,该酶已被纯化并表征(Tian,J.,Bryk,R.Itoh,M.,Suematsu,M.,和Carl Nathan,C.Variant tricarboxylic acid cycle in Mycobacterium tuberculosis:Identification of alpha-ketoglutarate decarboxylase.PNAS.July 26,2005vol.102(30):10670-10677;;Stephanopoulos,G.,Challenges in engineering microbes for biofuels production.Science,2007.315(5813):801-804)。该酶所进行的反应图示于图7B中(图7A显示了天然kgd基因编码的酶所催化的主要的已知化学反应)。以前已经从大肠杆菌克隆、表达、并纯化了天然kgd基因,无技术难度,对宿主菌株也没有毒性效应(Tian,J.,Bryk,R.Itoh,M.,Suematsu,M.,和Carl Nathan,C.Variant tricarboxylic acid cycle in Mycobacterium tuberculosis:Identification of alpha-ketoglutarate decarboxylase.PNAS.July 26,2005vol.102(30):10670-10677;Stephanopoulos,G.,Challenges in engineering microbes for biofuels production.Science,2007.315(5813):801-804)。该酶之选择也是因为它不可能与α-酮戊二酸脱氢酶相关。另外感兴趣的是已经开发了方便的比色方法来测定该酶的活性。在本文中,kgd酶进化为具有可测的酶功能,如图7B所示:将草酰乙酸脱羧为丙二酸半醛。达到这一点的技术工作在很大程度上依赖于传统选择和筛选具有想要的草酰乙酸α-脱羧酶活性的α-酮戊 二酸脱羧酶的突变体。
第一步:构建用于选择和筛选的kgd基因的突变体文库。根据商业的DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的服务,将来自结核分枝杆菌的α-酮戊二酸脱羧酶的蛋白序列针对大肠杆菌进行密码子优化。合成具有8个氨基酸的N-末端标签的核酸序列,以能够基于亲和性进行蛋白纯化。在该基因序列中引入NcoI限制性位点,其与基因的起始密码子重叠,其后是HindIII限制性位点。此外,将Shine Delgarno序列(即核糖体结合位点)置于起始密码子之前、EcoRI限制性位点之后。由DNA 2.0合成该基因构建体,并提供于pJ206载体骨架中。
按照下文所述,构建基于环状质粒的克隆载体,其被称为pKK223-kgd,用于在大肠杆菌中表达α-酮戊二酸脱羧酶。根据生产商的说明书,使用来自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的酶EcoRI和HindIII,将含有基因合成的kgd基因的质粒DNA pJ206进行限制性酶消化。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen的成分,从凝胶上切下包含对应于kgd基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。含有pKK223-aroH的大肠杆菌克隆菌株由Boulder的University of Colorado的Ryan T.Gill教授的实验室惠赠。根据标准方法使含有该质粒的该菌株的培养物生长,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的商售微量制备柱制备质粒DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒DNA。该消化是为了从pKK223骨架中分离aroH阅读框。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的成分,从凝胶上切下包含对应于pKK223骨架的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。
将对应于kgd基因的纯化的DNA片段与pKK223骨架连接在一起,根据生产商的说明书通过电穿孔转化连接产物。得到的载体命名为pKK223-kgd,通过Macrogen(Rockville,MD USA)提供的商业服务通过常规测序确认其序列(SEQ ID NO:004)。pKK223-kgd赋予对β-内酰胺酶的抗性,并包含结核分枝杆菌的kgd基因,该基因在ptac启动子的控制之下,可以通过IPTG在大肠杆菌宿主中诱导该启动子。
通过标准方法繁殖质粒pKK223-kgd并制备纯化的DNA。根据生产商的说明书,将质粒导入XL1-Red化学感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA),涂板至LB+100μg/mL氨比西林,并在37℃温育24小时以上。以1/1000的原始转化体积稀释的培养物涂板于LB+100μg/mL氨比西林,一式三份。获得了超过1000个菌落,其对应于大约107个突变细胞/转化。通过将板轻轻地刮入TB培养基中收集菌落。立即通过旋涡将培养物重悬,并等分进入1mL的含有终浓度为15%(v/v)的甘油的冷冻贮液培养物中(Sambrook和Russell,2001)。通过在3000rpm离心15分钟使剩余的培养物沉淀。根据生产商的说明书,使用HiSpeed Plasmid Midi Kit(Qiagen,Valencia,CA)提取质粒DNA。将来自每个突变体文库的纯化的质粒DNA通过电穿孔导入大肠杆菌10GF’(Lucigen,Middleton,WI USA)。将该转化的1/1000体积涂板于LB+卡那霉素,一式三份,以确定转化效率和足够的转化子数目(>10^6)。
本文描述的基于选择的方法允许迅速鉴定具有草酰乙酸α-脱羧酶活性的kgd突变体。可用的大肠杆菌菌株AB354作为用于选择的宿主(Bunch,P.K.,F.Mat-Jan,N.Lee,和D.P.Clark.1997.The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli.Microbiology 143:187-195)。该营养缺陷型的大肠杆菌菌株具有编码天冬氨酸脱羧酶的panD中的突变。该反应的产物β-丙氨酸是合成泛酸的必不可少的中间体,泛酸是辅酶A的前体。辅酶A合成的阻断使得该大肠杆菌菌株不能在不含添加物的最简培养基上生长(Cronoan,J.E。Little,K.J。Jackowski,S.;Genetic and Biochemical Analyses of Pantothenate Biosynthesis in Escherichia coli and Salmonella typhimurium.J.of Bacteriology,149(3),916-922(1982);Cronan,J.E.,Beta-Alanine Synthesis in Escherichia coli J.ofBacteriology,141(3),1291-1297(1980))(见图8)。来自褐家鼠(R.norvegicus)的gabT的表达赋予大肠杆菌β-丙氨酸氨基转移酶活性(Tunnicliff,G.;Ngo,T.T.;Rojo-Ortega,J.M.;Barbeau,A.;The inhibition by substrate analogues of gamma-aminobutyrate aminotransferase from mitochondria of different subcellular fractions of rat brain Can.J.Biochem.55,479-484(1977))。该酶可以利用丙二酸半醛作为底物以产生β-丙氨酸。表达gabT的大肠杆菌AB354菌株(大肠杆菌AB354+gabT)(此外还表达具有草酰乙酸α-脱羧酶活性的突变kgd基因)能够产生代谢物β-丙氨酸,并恢复了在最简培养基上生长的能力。该选择的预期结果显示于图9。
与kgd基因类似,通过商业的提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的基因合成,获得了密码子和表达优化的褐家鼠gabT基因。然后将其克隆进入表达质粒。
将kgd基因的突变体文库导入表达gabT基因的大肠杆菌菌株AB354。然后使该群体在最简培养基平板上生长。预期表达想要的草酰乙酸α-脱羧酶活性的单个突变体会显示出在这些条件下形成菌落的恢复的能力。分离这些克隆,然后就草酰乙酸α-脱羧酶活性选择它们所表达的突变体蛋白。
要想成功建立就草酰乙酸α-脱羧酶活性选择突变体kgd文库,需要确认这些突变体具有想要的酶活性。因此,确认了对于草酰乙酸α-脱羧酶活性呈阳性的突变体的α-脱羧酶活性。为此,从目前的标准方法中选取比色筛选法。该方法诠释于图10。该方法需要表达并纯化突变体酶,并与纯化的酶、其辅因子(焦磷酸硫胺)和合适的底物反应。根据标准方法进行蛋白表达和纯化。
实施例8:使用大肠杆菌DF40+pKK223+MCR在1升的规模上生物生产3-HP
使用以上实施例6中产生的大肠杆菌菌株DF40+pKK223+MCR,进行大约1升的工作体积的批式培养,以测定3-HP的微生物生物生产。
通过标准步骤(Sambrook和Russell,2001)将大肠杆菌DF40+pKK223+MCR从冷冻贮液接种至50mL的挡板瓶中的LB培养基+200μg/mL氨比西林(如标示),并在37℃在225rpm摇动过夜生长至稳定期。次晨,将该培养物用于接种(5%v/v)1升的生物反应器容器中的M9最简培养基+5%(w/v)葡萄糖+200μg/mL氨比西林+1mM IPTG(如标示)。通过加入10M NaOH或1M HCl(视需要)将该生物反应器容器保持在pH 6.75。通过持续通入速率为5L/分钟的空气并通过持续地将生物反应器容器的搅拌速率调整在100至1000rpm之间,将生物反应器容器的溶解氧含量维持在80%饱和度。这些生物生产评估至少以一式三份进行。为了监视这些培养物的生长,在接种时和接种后每2个小时(前12个小时)测定光密度值(在600nm的吸收,1cm光径),该光密度对应于细胞数目。在生物生产事件的第2天,每3个小时收集样品以测定光密度和其它度量值。对于收集的每个样品,通过离心使细胞沉淀,并收集上清液,以分析3-HP的产生,如下文“共同的方法部分”中“分析培养物的3-HP产生”中所描述。基于HPLC分析计算的该1升的生物生产体积中的初步的3-HP最终效价为0.7g/L 3-HP。公认的是,可能同时产生丙二酸半醛或可能产生另一种醛,或可能产生丙二酸半醛或其它醛的降解产物,它们不能通过这种HPLC分析与3-HP区分开。
实施例9:耐受性加上生物生产途径
使用本领域技术人员已知的方法,包括下文“共同的方法部分”提供的那些方法,以及使用来自本文的其它实施例的关于制备和引入核酸序列以提供增强的3-HP耐受性并提供3-HP生物生产的特定方法,对选择的微生物进行遗传修饰以提供异源核酸序列,其使3-HP耐受性和3-HP产量增加高于非修饰的微生物中的水平。构建质粒或其它载体或DNA序列(用于直接引入),它们包含一个或多个编码 酶或其它多肽的核酸序列,当将所述核酸序列组合进入所选的微生物并在其中表达时,通过修饰3HPTGC的一个或多个方面而增强3-HP耐受性。构建上述或不同的质粒或其它载体或DNA序列(用于直接引入),它们包含一个或多个编码酶或其它多肽的核酸序列,当将所述核酸序列在所选的微生物中表达时,提供(或增加)3-HP的生物生产。
在质粒的情况下,使质粒与所选的微生物在适合于促进转化的条件下接触,选择并鉴别转化的微生物。在其它载体或DNA序列的情况下,通过本领域技术人员熟知的方法将这些导入所选的微生物。可以根据本领域技术人员熟知的方法选择转化的重组微生物。
第一种特定的得到的重组微生物包含相对于对照非耐受性修饰的微生物而言增强的3-HP耐受性和生物生产能力,其中3-HP耐受性比所述非耐受性修饰的对照的耐受性高至少20%,3-HP生物生产比所述非耐受性修饰的对照的3-HP生物生产高至少20%。通过基于“共同的方法部分”提供的MIC程序的24-小时最小抑制浓度(MIC)评估法测定3-HP耐受性。3-HP生物生产是基于对数期之后持续至少24小时的批式培养物比较,使用“共同的方法部分”提供的HPLC方法测定最终的3-HP效价。
认识到使用本文提供的策略和方法以及基于关于3HPTGC途径和途径部分的相互关系的发现而获得的反复改进,可能引起在完成3-HP生物生产事件时甚至更大的3-HP耐受性和更加提高的3-HP效价。
因此,下列内容落在本发明的范围内:生产并利用生物生产方法和系统,包括用于生产3-HP的工业生物生产系统,经过遗传工程化改造以修改3HPTGC的一个或多个方面以有效地将3-HP耐受性(并且,在一些实施方式中,也增加3-HP生物生产)增加至少20%(相对于不含一个或多个改变耐受性的修饰的对照微生物)的重组微生物。
实施例10:用于比较耐受性改善的合适度量的证明
在指定的条件(有氧和无氧)下,在细胞培养物中的宽范围3-HP 浓度下,测定了以下物种的生长速率数据。这显示了可用于评估对照和处理微生物之间的差异的方法。这些或其它方法可用于证明本发明的多种实施方式的耐受性差异。
如附图6A-O所示,可以按照多种方式评估和显示数据:“耐受性图”(显示在不同3-HP浓度时的生长速率);在评估期内的光密度改变;和评估期内的细胞加倍次数。
除了使用MIC评估法之外,提供了这些方式作为非限制性方法和方式,以测定耐受性的变化,包括微生物和培养系统的耐受性。
以下方法用于产生指明的附图中的数据。实施例17提供了使用基于24小时的时间内的生长速率的耐受性图所进行的3HPTC的一个遗传修饰与对照的直接比较。
大肠杆菌有氧
使野生型大肠杆菌BW25113的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准LB培养基中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的M9最简培养基+3HP的样品,其中含有47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,和0.4%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.02-0.08范围内。将培养物在37C温育大约24小时,每1-2小时记录OD600(前8个小时),在大约24小时记录最终的OD600。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过将N代入等式2N=(ODt=24)/(ODt=0)来计算加倍的具体次数(Nd)。
大肠杆菌无氧
使野生型大肠杆菌BW25113的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准LB培养基中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的M9最简培养基+3-HP的样品,其中含有47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,和0.4%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.02-0.08范围内。将培养物中通入CO2,持续10秒,密封并在37C温育大约24小时。每1-2小时记录OD600(前8个小时),在大约24小时记录最终的OD600。对于每个数据点,开启样品、取样、重新通入CO2,然后再次封闭。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过将N代入等式2N=(ODt=24)/(ODt=0)来计算加倍的具体次数(Nd)。
枯草芽孢杆菌有氧
使野生型枯草芽孢杆菌的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准LB培养基中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的M9最简培养基+3HP+谷氨酸补充物的样品,其中含有47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,0.4%葡萄糖和10mM谷氨酸,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.02-0.08范围内。将培养物在37C温育大约24小时,每1-2小时记录OD600(前8个小时),在大约24小时记录最终的OD600。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过将N代入等式2N=(ODt=24)/(ODt=0)来计算加倍的具体次数(Nd)。
酿酒酵母有氧
使酿酒酵母的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准YPD培养基(含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和2%葡萄糖)中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的SD最简培养基(不含维生素)+3-HP的样品,其中含有37.8mM(NH4)2SO4,8.1uM H3BO3,0.25uM CuSO4,0.6uM KI,1.25uM FeCl3,2.65uM MnSO4,1uM Na2MoO4,2.5uM ZnSO4,6.25mM KH2PO4,0.86mM K2HPO4,4.15 mM MgSO4,1.71mM NaCl,0.90mM CaCl2和2%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.03-0.08范围内。将培养物通入CO2,持续10秒,密封并在30C温育大约24小时。每1-2小时记录OD600(前8-12个小时),在大约24小时记录最终的OD600。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过将N代入等式2N=(ODt=24)/(ODt=0)来计算加倍的具体次数(Nd)。
酿酒酵母无氧
使酿酒酵母的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准YPD培养基(含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和2%葡萄糖)中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的SD最简培养基(不含维生素)+3HP的样品,其中含有37.8mM(NH4)2SO4,8.1uM H3BO3,0.25uM CuSO4,0.6uM KI,1.25uM FeCl3,2.65uM MnSO4,1uM Na2MoO4,2.5uM ZnSO4,6.25mM KH2PO4,0.86mM K2HPO4,4.15mM MgSO4,1.71mM NaCl,0.90mM CaCl2和2%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.03-0.08范围内。将培养物通入CO2,持续10秒,密封并在30C温育大约24小时。每1-2小时记录OD600(前8-12个小时),在大约24小时记录最终的OD600。对于每个数据点,开启样品、取样、重新通入CO2,然后再次封闭。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过将N代入等式2N=(ODt=24)/(ODt=0)来计算加倍的具体次数(Nd)。
实施例11:通过导入鉴别为能够增强微生物的3-HP耐受性的基因进行遗传修饰
背景
已经通过SCALES 3-HP耐受性数据鉴定出含有一个至数个基因的遗传元件对于3-HP耐受性具有重要意义。为了开发适合于在生物中提供更强的耐受性的这些元件的最佳组合,将多个这些遗传元件克隆进入一系列相容性质粒中,这些质粒含有不同的复制起始点和选择标志物。因此,可以将这些相容性质粒的组合转化进入细胞系中以便测定对于3-HP耐受性的组合影响。含有不同复制起始点和选择标志物的亲代质粒载体显示于表4A,其提供了每个此类亲代质粒载体的SEQ ID号(SEQ ID NO:005-012和183-186)。这些质粒用于构建以下描述的质粒,不含插入子的这些质粒也用于构建用于耐受性MIC测试的对照细胞系。
方法A:质粒设计和通过基因合成构建耐受形成性遗传元件
将含有多个鉴定的遗传元件的单一质粒的构建方式为:可以容易地构建多个其它质粒(其中一些按照以下描述来构建)。这些操纵子(包括组成型大肠杆菌启动子、核糖体结合位点、和这些遗传元件的开放区框)组合在单一质粒中,其根据商业的DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的基因合成服务来产生。根据DNA2.0的服务,将用于产生蛋白的每个开放阅读框进行密码子优化。另外,在每个操纵子和基因之间引入限制性位点,以产生能够通过一系列限制性消化和自我连接而表达这些蛋白的所有组合的质粒。该构建体的其它特征包括,在最后的操纵子之后有rrnB终止序列,在编码区的每个末端的两侧具有含有AfeI限制性位点的mosaic末端,以使用获自EPICENTRE(Madison,Wisconsin)的EZ::TNTM转位子系统,将来将这些遗传元件引入菌株中。在pJ61载体骨架中提供该构建的质粒。得到的载体命名为pJ61:25135,其序列提供为SEQ ID NO:012(见表4A)。
通过本文描述的方法,将多个编码催化3HPTGC的酶促转化步骤的酶的核酸序列导入pJ61:25135质粒。如表4B所示,对pJ61:25135质粒(表4A中的)进行不同的修饰以包含在修饰的Ptrc启动子(位于PmII和SfoI限制性位点之间)控制下表达的CynS和CynT的基 因优化的序列,在PtpiA启动子(位于SfoI和SmaI限制性位点之间)(SEQ ID NO:013)控制下表达的AroG,在修饰的Ptrc启动子(位于SmaI和ZraI限制性位点之间)(SEQ ID NO:014)控制下表达的SpeD、SpeE和SpeF,在PtalA启动子(位于ZraI和HpaI限制性位点之间)(SEQ ID NO:015)控制下表达的ThrA,在PrpiA启动子(位于HpaI和PmeI限制性位点之间)(SEQ ID NO:016)控制下表达的Asd,在Ppgk启动子(位于PmeI和ScaI限制性位点之间)(SEQ ID NO:017)控制下表达的CysM,在PtpiA启动子(位于ScaI和NaeI限制性位点之间)控制下表达的IroK,和在PtalA启动子(位于NaeI和EcoICRI限制性位点之间)(SEQ ID NO:018)控制下表达的IlvA。在pJ61:25135质粒中,这些限制性位点中每一个都是唯一的。
为了产生一组含有这些单一操纵子中的每一个的质粒,进行一系列限制性消化和自我连接。因此,可以通过除去任意操纵子两侧的限制性位点之间的DNA序列以及质粒的整个蛋白编码区两侧的EcoICRI和PmII位点而分离任意操纵子。例如,根据生产商的说明书,通过使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的PmII和SfoI首先消化pJ61:25135质粒,产生包含含有AroG多肽的操纵子的质粒,所述AroG多肽在PtpiA启动子的控制下表达,位于SfoI和SmaI限制性位点之间。然后,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的T4DNA连接酶,使得到的DNA自连并转化进入大肠杆菌K12。使来自该大肠杆菌K12转化的单个菌落生长于液体培养基,根据生产商的说明书,使用Qiagen微量制备试剂盒(Valencia,CA USA)从单个菌落分离质粒。通过使用AfeI限制性消化来筛选分离的质粒,将正确的质粒进行下一轮限制性消化和自我连接。在第二轮,根据生产商的说明书,使用分别获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)和Promega Corporation (Madison,Wisconsin)的SmaI和EcoICRI将这些质粒进行限制性消化。然后,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs (Ipswich,MA USA)的T4DNA连接酶,使得到的DNA自连并转化进入大肠杆菌K12。使来自该大肠杆菌K12转化的的单个菌落生长于液体培养基,根据生产商的说明书,使用Qiagen微量制备试剂盒(Valencia,CA USA)从单个菌落分离质粒。通过使用AfeI限制性消化来筛选分离的质粒,并通过测序验证。
按照类似的方式,使用相应的上述列出的限制性位点产生以下质粒:在PtalA启动子(位于NaeI和EcoICRI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-IlvA;在Ppgk启动子(位于PmeI和ScaI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-CysM;在PrpiA启动子(位于HpaI和PmeI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-Asd;在PtalA启动子(位于ZraI和HpaI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-ThrA;在Ptrc启动子(位于SmaI和ZraI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-SpeDEF;在PtpiA启动子(位于SfoI和SmaI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-AroG;和在Ptrc启动子(位于PmlI和SfoI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-CynTS。同样的,可以通过类似的限制性消化和自我连接方案获得这些操纵子的任意组合。
将这些序列验证的质粒转化进入BW25113大肠杆菌细胞,并测定3-HP耐受性。此外,可以使用AfeI消化这些质粒,并可以使用生产商的说明书使用获自EPICENTRE(Madison,Wisconsin)的EZ::TNTM转位子系统将含有具有mosaic末端的单个操纵子的纯化片段引入细胞系的基因组中。同样,可以将这些操纵子移至任意多种质粒以提供表达的另外控制或用于在多种菌株或生物中繁殖。
方法B:从其它实验室获得的含有鉴定的元件的质粒
开发出3HPTGC的图之后,文献综述鉴定出关于数个鉴定的基因的前人工作。向作出这些报告的实验室发出关于含有在3HPTGC中鉴定的元件的野生型或突变基因的质粒的请求。由此获得的基因及其编码的蛋白通过序列编号提供于表4B中,在其中的方法B部分中。
含有野生型aroH基因和aroH突变体的质粒由University of Virginia的Bauerle实验室惠赠。这些突变的描述见Ray JM,Yanofsky C,BauerleR.,J Bacteriol.1988Dec;170(12):5500-6.Mutational analysis of the catalytic and feedback sites of the tryptophan-sensitive 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli。与含有野生型基因的pKK223质粒一起,提供了另外3个pKK223质粒,它们包含编码位置149处的甘氨酸至半胱氨酸突变、位置149处的甘氨酸至天冬氨酸突变、和位置18处的脯氨酸至亮氨酸突变的突变基因。
含有突变的metE基因的质粒由University of Michigan的Matthews实验室惠赠。该突变体的描述见Hondorp ER,Matthews RG.J Bacteriol.2009May;191(10):3407-10.Epub 2009Mar 13.Oxidation of cysteine 645of cobalamin-independent methionine synthase causes a methionine limitation in Escherichia coli。该pKK233质粒携带编码位置645处的半胱氨酸至丙氨酸突变的metE基因。
这些基因编码的蛋白的序列提供为SEQ ID NO:022至026。
方法C:在pSMART-LC-Kan载体中构建耐受性质粒
在获自Lucigen Corporation (Middleton WI,USA)的pSMART-LC-kan载体(SEQ ID NO:027)中构建数个遗传元件(测定了它们对3-HP耐受性影响)。该载体提供低拷贝的复制起始点和卡那霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,导入的遗传元件及其编码的蛋白以序列编号显示于表4B中,见其中的方法C的部分。在表4B中每一行,在“方法C”下面,含有克隆的质粒中包含的蛋白的各自的序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物,和用于产生新质粒的聚合酶链式反应的产物的序列。
在每种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明书,使用来自Invitrogen Corporation(Carlsbad,CA USA)的pfxDNA聚合酶和作为模板的大肠杆菌K12基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入子。使用生产商的说明书,使用获自New England Biolabs(Ipswich,MA USA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的 5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒,从凝胶上分离具有预期大小的带,并从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明书,将提取的磷酸化的DNA平末端地连接进入pSMART-LC-Kan载体并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在富集培养基中恢复,然后涂板至LB琼脂平板,其中含有卡那霉素以正确地选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法D:在pSMART-HC-Amp载体中构建耐受性质粒
在获自Lucigen Corporation (Middleton WI,USA)的pSMART-HC-AMP载体中构建数个遗传元件(测定了它们对3-HP耐受性影响)。该载体提供高拷贝的复制起始点和氨比西林选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表4B中的方法D进行鉴定。在表4B中每一行含有克隆的质粒中包含的蛋白的序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物,和用于产生新质粒的聚合酶链式反应的产物的序列。
在每种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明书,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的针对每个相应的基因或遗传元件的pKK223质粒(通过表4B的方法B产生),使用所列的引物扩增正确的插入子。使用生产商的说明书,使用获自New England Biolabs (Ipswich,MA USA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒,从凝胶上分离具有预期大小的带,并从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明书,将提取的磷酸化的DNA平末端地连接进入pSMART-HC-AMP载体并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在富集培养基中恢 复,然后涂板至LB琼脂平板,其中含有氨比西林以正确地选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法E.:在pSMART-HC-Amp载体中构建另外的耐受性质粒
在获自Lucigen Corporation (Middleton WI,USA)的pSMART-HC-AMP载体中构建数个遗传元件(测定了它们对3-HP耐受性影响)。该载体提供高拷贝的复制起始点和氨比西林选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表4B中的方法E进行鉴定。在表4B中每一行含有克隆的质粒中包含的蛋白的序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物,和用于产生新质粒的聚合酶链式反应的产物的序列。
在每种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明书,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的大肠杆菌K12基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入子。由于引物的5’末端已经是磷酸化的,所以无需对扩增产物进行其它处理。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒,从凝胶上分离具有预期大小的带,并从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明书,将提取的磷酸化的DNA平末端地连接进入pSMART-HC-Amp载体并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在富集培养基中恢复,然后涂板至LB琼脂平板,其中含有氨比西林以正确地选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法F:在pACYC177(仅Kan)载体中构建耐受性质粒
在pACYC177(仅Kan)载体中构建数个遗传元件(测定了它们对 3-HP 耐受性影响)。通过使用引物CPM0075(5’-CGCGGTATCATTGCAGCAC-3’)(SEQ ID NO:123)和引物CPM0018(5’-GCATCGGCTCTTCCGCGTCAAGTCAGCGTAA-3’)(SEQ ID NO:124),使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD聚合酶,扩增pACYC177质粒的一部分,从而产生该骨架。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒,从凝胶上分离具有预期大小的带,并从凝胶中提取DNA。该DNA命名为pACYC177(仅Kan),并用于连接至下文产生的产物。该pACYC177(仅Kan)骨架DNA提供低拷贝的复制起始点和卡那霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表4B中的方法F进行鉴定。在表4B中每一行含有克隆的质粒中包含的蛋白的序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物,和用于产生新质粒的聚合酶链式反应的产物的序列。
在每种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明书,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的针对每个相应的基因(或遗传元件)的pKK223质粒(通过表4B的方法B产生)或大肠杆菌基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入子。使用生产商的说明书,使用获自England Biolabs(Ipswich,MA USA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒,从凝胶上分离具有预期大小的带,并从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明书,将提取的磷酸化的DNA平末端地连接进入上文描述的pACYC177(仅Kan)骨架DNA并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在富集培养基中恢复,然后涂板至LB琼脂平板,其中含有卡那霉素以正确地选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法G:在pBT-3载体中构建耐受性质粒
在pBT-3载体中构建数个遗传元件(测定了它们对3-HP耐受性影响)。通过使用引物PBT-FOR (5’-AACGAATTCAAGCTTGATATC-3’)(SEQ ID NO:125)和引物PBT-REV(5’-GAATTCGTTGACGAATTCTCTAG-3’)(SEQ IDNO:126),使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD聚合酶,扩增pBT-3质粒的一部分,从而产生该骨架。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒,从凝胶上分离具有预期大小的带,并从凝胶中提取DNA。该DNA命名为pBT-3骨架,并用于连接至下文产生的产物。该pBT-3骨架DNA提供低拷贝的复制起始点和氯霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表4B中的方法G进行鉴定。在表4B中每一行含有克隆的质粒中包含的蛋白的序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物,和用于产生新质粒的聚合酶链式反应的产物的序列。
在每种情况下,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明书,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的针对每个相应的基因(或遗传元件)的pKK223质粒(通过表4B的方法B产生)或大肠杆菌基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入子。使用生产商的说明书,使用获自New England Biolabs(Ipswich,MA USA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒,从凝胶上分离具有预期大小的带,并从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明书,将提取的磷酸化的DNA平末端地连接进入上文描述的pBT-3骨架DNA并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在富集培养基中恢复,然后涂板至LB琼脂平板,其中含有氯霉素以正确地选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制 备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,在用于其它实验之前通过测序进行验证。
实施例12:与3-HP耐受性相关的新的肽的评估
发现一种新的21个氨基酸的肽(称为IroK),其增强3-HP耐受性。
方法
IroK表达研究
获得用于表达研究的引物,包括整个IroK多肽区域和两侧为EcorI和HindIII限制性位点的核糖体结合位点(Operon,Huntsville,AL):
(5′-AATTCGTGGAAGAAAGGGGAGATGAAGCCGGCATTACGCGATTTCATCGCCATTGTGCAGGAACGTTTGGCAAGCGTAACGGCATAA-3′(SEQ I D NO:127),5′-AGCTTTATGCCGTTACGCTTGCCAAACGTTCCTGCACAATGGCGATGAAATCGCGTAATGCCGGCTTCATCTCCCCTTTCTTCCACG-3’)(SEQ ID NO:128)
包括IroK肽区域和具有突变的起始位点(ATG至TTG)的核糖体结合位点的引物用于翻译分析:
(5′-AATTCGTGGAAGAAAGGGGAGTTGAAGCCGGCATTACGCGATTTCATCGCCATTGTGCAGGAACGTTTGGCAAGCGTAACGGCATAA-3’(SEQ ID NO:187),5′-AGCTTTATGCCGTTACGCTTGCCAAACGTTCCTGCACAATGGCGATGAAATCGCGTAATGCCGGCTTCAACTCCCCTTTCTTCCACG-3’)(SEQ I D NO:188)
将两个寡核苷酸按1∶1的比例添加,并根据标准方法在热循环仪中退火。使用T4连接酶(Invitrogen,Carlsbad,CA.)将退火的引物产物与pKK223-3表达载体(SEQ ID NO:008,Pharmacia,Piscataway,NJ.)连接在一起,并在25℃温育过夜。然后将连接产物电穿孔进入感受态MACH1TM-T1R中,并涂板于LB+氨比西林,并在37℃温育24小时。分离质粒并通过纯化和随后的限制性消化和测序(Macrogen,Rockville,MD)进行验证。然后测定对应于1mM IPTG诱导的MIC。
最小、抑制浓度(MIC)
在微有氧条件下以96孔板的形式测定最小抑制浓度(MIC)。使菌株的过夜培养物在5ml LB(视需要添加抗生素)中生长。将1%(v/v) 接种物引入15ml的MOPS最简培养基。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶20稀释细胞,将10μl的等分试样用于接种96孔板的每个孔(~104个细胞/孔)。在渐增的3-HP浓度(0-70g/L,递增5g/L),测定平板中的不同菌株的生长或生长状况。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。
结果
为了研究IroK,含有21个氨基的肽(MKPALRDFIAIVQERLASVTA,SEQ ID NO:129)的效应,将编码它以及天然预测的核糖体结合位点的序列引入可诱导型表达载体(pKK223-3)中。图11显示了短的87bp的序列的增加的表达,其足以增强3-HP耐受性(>2倍的MIC增加)。另外,耐受性机制似乎对于3-HP生长抑制是特异性的,因为对于数个其它的具有类似分子组成的有机酸(包括乳酸、丙烯酸和乙酸)而言,MIC保持不变(数据未显示)。在试图分解赋予的耐受性的模式的尝试中,将几乎一样的序列引入相同的载体,只不过在翻译起始位点具有单一突变(ATG至TTG),得到等同于野生型大肠杆菌的降低的MIC(图11)。这个结果暗示了耐受性机制对于翻译的多肽的表达是特异性的,而不是在DNA或RNA水平上。
可以向微生物提供编码IroK肽的核酸序列,或其合适的变体,所述微生物可以包含3HPTGC的一个或多个遗传修饰以进一步增强3-HP耐受性,所述微生物还可以具有3-HP生产能力。
实施例13:遗传修饰/导入丙二酰-CoA还原酶以在大肠杆菌DF40中产生3-HP
根据商业的DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的服务,将来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰-CoA还原酶的核苷酸序列针对大肠杆菌进行密码子优化。该基因序列在起始密码子之前引入EcoRI限制性位点,其后是HindIII限制性位点。此外,将Shine Delgarno序列(即核糖体结合位点)置于起始密 码子之前、EcoRI限制性位点之后。由DNA 2.0合成该基因构建体,并提供于pJ206载体骨架中。根据生产商的说明书,使用获自NewEngland BioLabs(Ipswich,MA USA)的酶EcoRI和HindIII,将含有合成的mcr基因的质粒DNA pJ206进行限制性酶消化。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的成分,从凝胶上切下包含对应于mcr基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。含有pKK223-aroH的大肠杆菌克隆菌株由Boulder的University of Colorado的Ryan T.Gill教授的实验室惠赠。根据标准方法使含有该质粒的该菌株的培养物生长,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的商售微量制备柱制备质粒DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒DNA。该消化是为了从pKK223骨架中分离aroH阅读框。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen的成分,从凝胶上切下包含对应于pKK223质粒骨架的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。
将对应于mcr基因的纯化的DNA片段和pKK223载体骨架连接在一起,根据生产商的说明书转化并电穿孔连接产物。得到的载体命名为pKK223-mcr,通过Macrogen(USA)提供的商业服务通过常规测序确认其序列(SEQ ID NO:189)。pKK223-mcr赋予对β-内酰胺酶的抗性,并包含mcr基因,该基因在Ptac启动子的控制之下,可以通过IPTG在大肠杆菌宿主中诱导该启动子。
通过标准方法(Sambrook和Russell,2001),将表达克隆pKK223-mcr和pKK223对照转化进入大肠杆菌K12和大肠杆菌DF40中。
实施例14:大肠杆菌基因缺失菌株的构建
以下菌株获自Keio收藏:JW1650(ΔpurR)、JW2807(ΔlysR)、JW1316(ΔtyrR)、JW4356(ΔtrpR)、JW3909(ΔmetJ)、JW0403(ΔnrdR)。Keio收藏获自Open Biosystems(Huntsville,AL USA 35806)。单个克隆可以从Yale Genetic Stock Center(New Haven,CT USA 06520)购买。这些菌株每个在缺失基因的位置包含卡那霉素标志物。关于Keio收藏和卡那霉素盒的消除的更多信息,请参见:Baba,T等人(2006).Construction of Escherichia coli K12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology doi:10.1038/msb4100050和Datsenko KA和BL Wanner(2000).One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.PNAS97,6640-6645。通过标准方法使这些菌株成为电-感受态的。然后通过标准电穿孔方法以质粒pCP20转化每个菌株,该质粒由Ryan Gill博士(University of Colorado,Boulder,CO USA)惠赠。将转化子涂于含有20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨比西林的LB琼脂平板,并在30摄氏度温育36小时。从这些转化中分离克隆,并在10mL不含任何抗生素的M9培养基中过夜生长。通过在不含任何抗生素的LB琼脂平板上划线,从这些培养物中分离菌落。通过在含有抗生素卡那霉素(20μg/mL)、氯霉素(20μg/mL)和氨比西林(100μg/mL)的LB琼脂平板上确认不生长,而确认菌落丧失卡那霉素标志物和质粒pCP20。通过菌落PCR确认分离的克隆丧失卡那霉素盒。使用获自Lucigen,(Catalog#30033)(Middleton,WI USA)的EconoTaq PLUS GREEN 2X master PCR mix进行PCR。使用96孔梯度ROBOcycler(Stratagene,La Jolla,CA USA 92037)进行PCR,其具有以下循环:1)95摄氏度,10分钟;2)30个下列循环:a)95摄氏度,1分钟,b)52摄氏度,1分钟,c)72摄氏度,2分钟;然后是3)一个循环:72摄氏度,10分钟。在表5中提供了用于确认除掉了每个克隆的卡那霉素盒的PCR的引物。引物购自Integrated DNA Technologies(Coralville,IA USA)。得到的消除后的菌株,称作BX 00341.0、BX 00342.0、BX 00345.0、BX 00346.0、BX 00348.0 和BX_00349.0,分别对应于JW1316(ΔtyrR)、JW4356(ΔtrpR)、JW3909(ΔmetJ)、JW1650(ΔpurR)、JW2807(ΔlysR)和JW0403(ΔnrdR)。
实施例15:大肠杆菌菌株的构建
根据表6和7中指明的各个组合,将表4B的质粒导入各个基本菌株中。使用标准方法通过电穿孔方式同时将所有质粒导入。转化的细胞生长于合适的具有抗生素补充的培养基中,基于它们在选择性培养基上的恰当的生长选择菌落。
实施例16:野生型大肠杆菌中3HPTGC相关的补充物的评价
使用“共同的方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定补充物对3-HP耐受性的影响。测定的补充物列举于表3。表8提供了有氧条件下的MIC评估的结果,表9提供了无氧条件下的MIC评估的结果。该数据包括单一的和多个补充物添加,其证明了基于24-小时的MIC评估,这些培养系统中的3-HP耐受性的改善。
实施例17:大肠杆菌中3HPTGC相关的遗传修饰的评价
使用“共同的方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定遗传修饰对3-HP耐受性的影响。在大肠杆菌中测定的遗传修饰及其MIC结果列举于表6(有氧条件)和表7(无氧条件)。该数据包括单一的和多个遗传修饰,其证明了基于24-小时的MIC评估,这些培养系统中的3-HP耐受性的改善。
实施例18:具有CynTS遗传修饰的耐受性图比较
进行24小时内的耐受性图评估,以比较对照(野生型)大肠杆菌(菌株BW25113)和含有遗传修饰以导入cynTS的经遗传修饰的大肠杆菌(菌株BW25113)。通过实施例5的方法进行所述导入。
结果显示于图12,其显示了也在指明的另外的条件下测定的对照菌株。
基于曲线下的面积,证明相对于对照而言,cynTS处理在多个升高的3-HP浓度显示出更高的3-HP耐受性。
实施例19:遗传修饰/将耐受性片段导入枯草芽孢杆菌
为了在枯草芽孢杆菌中产生3-HP生产耐受性片段,将来自大肠杆菌耐受形成性复合物的数个基因克隆进入获自Boca Scientific(Boca Raton,FL USA)的芽孢杆菌穿梭质粒pWH1520(SEQ ID NO:010)。该穿梭质粒携带可诱导型Pxyl木糖-可诱导启动子,以及用于在大肠杆菌中繁殖的氨比西林抗性盒,和用于在枯草芽孢杆菌中繁殖的四环素抗性盒。这些基因的克隆策略显示于表10。
方法A
按照相似的方式产生用于在枯草芽孢杆菌中测试的克隆的耐受性基因(称作克隆方法A,见表10)。这里描述的克隆方法将基因置于木糖-可诱导启动子控制之下。使用它们相应的引物A和引物B(列举于表的每一行中),通过聚合酶链式反应扩增每个基因。每个组的引物A具有与基因的起始处的同源性和SpeI限制性位点。引物B具有与基因的终止密码子的下游区域的同源性和BamHI限制性位点。根据生产商的说明书,使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的PCR纯化试剂盒纯化聚合酶链式反应的产物。接下来,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的SpeI和BamHI消化纯化的产物。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的成分,从凝胶上切下含有对应于消化的和纯化的耐受性基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。
根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准微量制备DNA纯化试剂盒分离该pWH1520穿梭载体的DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的SpeI和SphI,限制性消化得到的DNA。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的成分,从凝胶上切下包含对应于消化的pWH1520骨架产物的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。
根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的T4连接酶将消化的和纯化的耐受性基因与pWH1520DNA产物连接在一起。然后,根据生产商的说明书,将连接混合物转化进入获自Lucigen Corporation(Middleton WI,USA)的化学上的感受态10G大肠杆菌细胞,并涂板至补充了氨比西林的LB平板以进行选择。将得到的数个菌落培养,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准的微量制备DNA纯化试剂盒分离菌落的DNA。通过限制性消化、然后通过琼脂糖凝胶电泳检查回收的DNA。进一步通过DNA测序验证显示出正确的条带样式的DNA样品。
实施例20:遗传修饰/导入丙二酰-CoA还原酶以在枯草芽孢杆菌中生产3-HP
为了在枯草芽孢杆菌中产生3-HP产生途径,将来自橙色绿屈挠菌的丙二酰-CoA还原酶的密码子优化的核苷酸序列(由商业DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的基因合成服务构建)加入到枯草芽孢杆菌穿梭载体中。该穿梭载体pHT08(SEQ ID NO:011)获自Boca Scientific(Boca Raton,FL USA)并携带可诱导型Pgrac IPTG-可诱导启动子。
使用引物1(5’GGAAGGATCCATGTCCGGTACGGGTCG-3’)(SEQ ID NO:148)(其含有与mcr基因的起始处的同源性以及BamHI限制性位点)和引物2(5’-Phos-GGGATTAGACGGTAATCGCACGACCG-3’)(SEQ ID NO:149)(其含有mcr基因的终止密码子以及磷酸化的5’末端以进行平末端连接克隆),通过聚合酶链式反应制备该mcr基因序列,以插入pHT08穿梭载体中。根据生产商的说明书,使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的PCR纯化试剂盒纯化聚合酶链式反应的产物。接下来,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的BamHI消化纯化的产物。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提 取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的成分,从凝胶上切下含有对应于mcr基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。
根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准微量制备DNA纯化试剂盒分离该pHT08穿梭载体的DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的BamHI和SmaI,限制性消化得到的DNA。按照“共同的方法部分”中第II小部分的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透视下显示。根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的成分,从凝胶上切下包含对应于消化的pHT08骨架产物的DNA片段的琼脂糖凝胶条并回收DNA。
根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的T4连接酶将消化的和纯化的mcr与pHT08产物连接在一起。然后,根据生产商的说明书,将连接混合物转化进入获自Lucigen Corporation(Middleton WI,USA)的化学上的感受态10G大肠杆菌细胞,并涂板至补充了氨比西林的LB平板以进行选择。将得到的数个菌落培养,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准的微量制备DNA纯化试剂盒分离菌落的DNA。通过限制性消化、然后通过琼脂糖凝胶电泳检查回收的DNA。进一步通过DNA测序验证显示出正确的条带样式的DNA样品。经过序列验证的DNA被命名为pHT08-mcr,然后通过获自Boca Scientific(Boca Raton,FL USA)的指引,将其转化进入化学上感受态的枯草芽孢杆菌细胞。在增加了氯霉素的LB平板上选择携带pHT08-mcr质粒的枯草芽孢杆菌细胞。
使携带pHT08-mcr的枯草芽孢杆菌细胞在补充了20ug/mL氯霉素的5mL的LB培养基上过夜生长,以225rpm摇动并在37摄氏度温育。这些培养物用于接种1%v/v,75mL M9最简培养基,其中补充了1.47g/L谷氨酸,0.021g/L色氨酸,20ug/mL氯霉素和1mM IPTG。然后使这些培养物在250mL的挡板erylenmeyer瓶中以25rpm生长18小时,在37摄氏度温育。18小时后,使细胞沉淀,通过GC_MS 检测上清液中的3-HP(如“共同的方法”IIIb部分所描述)。使用合格的离子检测痕量的3-HP。
实施例21:枯草芽孢杆菌菌株的构建
将具有耐受性遗传元件的pWH1520质粒和生产质粒pHT08-mcr转化进入两个枯草芽孢杆菌菌株。枯草芽孢杆菌枯草亚种168菌株由Boulder的University of Colorado的Ryan T.Gill教授惠赠。使用修改自Anagnostopoulos和Spizizen(Requirements for transformation in Bacillus subtilis.J.Bacteriol.81:741-746(1961))开发的的方案进行转化,如Boca Scientific(Boca Raton,FL USA)为pHT08穿梭载体所提供的指引。
实施例22:野生型枯草芽孢杆菌中3HPTGC相关的补充物的评价
使用“共同的方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定补充物对3-HP耐受性的影响。测定的补充物列举于表3。表11提供了无氧条件下的MIC评估的结果。
实施例23:不添加以及添加3HPTGC相关的补充物时,3HPTGC相关的遗传修饰的枯草芽孢杆菌的评价
使用“共同的方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定补充物和/或遗传修饰对枯草芽孢杆菌中3-HP耐受性的影响。测定的补充物列举于表3。在有氧条件下,枯草芽孢杆菌的所测的遗传修饰和MIC结果显示于表11。该数据包括单一的遗传修饰和单一的及多个补充物添加,其证明了基于OD值的变化,该培养系统中的3-HP耐受性的改善。
实施例24:用于3-HP生产的酵母有氧途径(预测性的)
使用基因合成(DNA 2.0)构建以下构建体(SEQ ID NO:150),含有:与ACC1具有200bp的5’同源性、用于选择的His3基因、Adh1酵母启动子、用于MCR克隆的BamHI和SpeI位点、cyc1终止子、来自酵母的Tef1启动子和与酵母ACC1开放阅读框具有前200bp的同源性。MCR开放阅读框(SEQ ID NO:151)将被克隆进入BamHI和 SpeI位点,这将允许adh1启动子指导的组成型转录。将MCR克隆进入该构建体之后,通过限制性消化从质粒中分离遗传元件(SEQ ID NO:152),并转化转化进入相关的酵母菌株。该遗传元件将敲除酵母ACC1的天然启动子,并将其替换为表达自adh1启动子的MCR,此后Tef1启动子将驱动ACC1的表达。通过在不含组氨酸的条件下生长来选择整合。通过PCR确认阳性菌落。通过RT-PCR确认MCR的表达和ACC1的增加的表达。
可用于在酵母中表达MCR的替代性方法是从质粒表达MCR。可以使用标准分子生物学技术,将含有ADH1启动子(SEQ ID NO:4)控制下的MCR的遗传元件克隆进入酵母载体,例如pRS421(SEQ ID NO:153),从而产生含有MCR的质粒(SEQ ID NO:154)。然后可以将基于MCR的质粒转化进入不同的酵母菌株。
实施例25:酿酒酵母中用于增加3-HP耐受性的遗传元件的克隆
通过使用biocyc.org的同源性和途径比较鉴定酵母基因,如图1D第1-7页所示。使用表12中的引物通过PCR扩增遗传元件。将酵母遗传元件扩增为含有天然启动子和3’非翻译区,PCR产物序列见表12。根据生产商的说明书,使用Qiagen gel extraction(Valencia,CA USA,Cat.No.28706)通过凝胶电泳和凝胶纯化分离PCR产物。然后,根据生产商的说明书,将凝胶纯化的酵母遗传元件克隆进入pYes2.1-topo载体(SEQ ID NO:183,Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)。通过PCR筛选菌落,然后由Genewiz测序。
实施例26:将酵母遗传元件亚克隆进入大肠杆菌/酵母穿梭载体pRS423和pRS425
通过使用限制性酶PvuII和XbaI进行的限制性消化从pYes2.1切除遗传元件。根据生产商的说明书,使用Qiagen gel extraction (Valencia,CA USA,Cat.No.28706)通过凝胶电泳和凝胶纯化分离包含酵母遗传元件的限制性片段。使用限制性酶SmaI和SpeI消化骨架载体pRS423和pRS425,并进行凝胶纯化。将酵母遗传元件连接进入pRS423和pRS425(SEQ ID NO:184和185)。通过PCR分析和测序检查所有的质粒。
实施例27:酵母菌株的构建
使用标准的酵母转化构建酵母菌株,并通过补充营养缺陷型标志物进行选择。所有的菌株均为S288C背景的。关于一般的酵母转化方法,参见Gietz,R.D.和R.A.Woods.(2002)TRANSFORMATION OF YEAST BY THE Liac/SS CARRIER DNA/PEG METHOD.Methods in Enzymology 350:87-96。
实施例28:补充物和/或遗传修饰对于酵母中3HP耐受性的影响的评估
使用本实施例中描述的方法通过MIC评估测定补充物和/或遗传修饰对于3-HP耐受性的影响。对于有氧和无氧条件下所测的补充物分别列举于表13和表14。对于有氧和无氧条件下在酵母中所测的遗传修饰分别列举于表15和表16。MIC评估的结果显示于表13-16。该数据包括单一的和多个补充物添加和遗传修饰,证明了基于如下所述的MIC评估,在这些培养系统中的3-HP耐受性改善。
酵母有氧条件下最小抑制浓度评估方法
以96孔板的形式在有氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各个单独的孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列水平的成分(对应于合成的最简葡萄糖培养基(SD)标准培养基,不含维生素):20g/L右旋糖、5g/L硫酸铵、850mg/L磷酸二氢钾、150mg/L磷酸氢二钾、500mg/L硫酸镁、100mg/L氯化钠、100mg/L氯化钙、500μg/L硼酸、40μg/L硫酸铜、100μg/L碘化钾、200μg/L氯化铁、400μg/L硫酸锰、200μg/L钼酸钠、和400μg/L硫酸锌。根据表3报告的水平(如果指明)添加培养基补充物。使菌株的过夜培养物在5ml含有维生素的SD培养基(Methods in Enzymology vol.350,page 17(2002))中生长,一式三份。将1%(v/v)接种物导入5ml不含维生素的SD最简培养基的培养物。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶5稀释细胞,将10μl的等分试样用于接种96孔板的每个孔(~104个细胞/孔)至总体积为100uL。在渐增的3-HP 浓度(0至60g/L,递增5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。在30C温育平板72小时。在72小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,递增5g/L)的平板中进行测定。
酵母无氧条件下最小抑制浓度评估方法
以96孔板的形式在无氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各个单独的孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列水平的成分(对应于合成的最简葡萄糖培养基(SD)标准培养基,不含维生素):20g/L右旋糖、5g/L硫酸铵、850mg/L磷酸二氢钾、150mg/L磷酸氢二钾、500mg/L硫酸镁、100mg/L氯化钠、100mg/L氯化钙、500g/L硼酸、40g/L硫酸铜、100g/L碘化钾、200g/L氯化铁、400g/L硫酸锰、200g/L钼酸钠、和400g/L硫酸锌。根据表X报告的水平(如果指明)添加培养基补充物。使菌株的过夜培养物在5ml含有维生素的SD培养基(Methods in Enzymology vol.350,page 17(2002))中生长,一式三份。将1%(v/v)接种物导入5ml不含维生素的SD最简培养基的培养物。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶5稀释细胞,将10μl的等分试样用于接种96孔板的每个孔(~104个细胞/孔)至总体积为100uL。在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,递增5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。在30C温育平板72小时。在72小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,递增5g/L)的平板中进行测定。将平板密封在含有用于无氧条件的气体发生器的生物袋无氧室中,并在30C温育72小时。在72小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,递增5g/L)的平板中进行测定。
实施例29:钩虫贪铜菌中3HPTGC相关的补充物的评估
使用“共同的方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定补充物对钩虫贪铜菌中3HP耐受性的影响。测定的补充物列举于表3。
在有氧条件下,钩虫贪铜菌的MIC结果显示于表17。该数据包括单一和多个补充物添加,其证明了基于MIC评估,这些培养系统中的3-HP耐受性的改善。
实施例30:3HPTGC耐受性指导的遗传修饰与3-HP生产遗传修饰的组合的另外的实例
除了实施例9(其提供了组合耐受性和3-HP生产遗传修饰以获得想要的适合用于生产3-HP的经遗传修饰的微生物的一般性实例)之外,并根据实施例9之后的实施例并考虑到本文的另外的公开内容,以及本领域技术人员已知的方法(例如,Sambrook和Russell,2001,其关于遗传修饰的方法通过引用并入本实施例),本实施例30提供了经遗传修饰的微生物物种,其包含3HPTGC的一个或多个遗传修饰以提供增强的3-HP耐受性(其可通过任何度量来测定,如本文讨论的那些)和一个或多个遗传修饰以增加3-HP的产量(例如3-HP生产途径的遗传修饰,如本文公开的那些)。
可以在不同的条件(包括培养系统的氧含量和培养基的营养物组成),就3-HP耐受性以及3-HP的生产来评估经此遗传修饰的微生物。
在本实施例的不同方面,进行遗传修饰的多个组合,并进行比较,以鉴定包含想要的特性和/或增强的3-HP耐受性和产量的度量的一种或多种经遗传修饰的微生物。
实施例31:导入编码Irok序列的遗传修饰结合3HPTGC遗传修饰
实施例12描述了Irok肽(包含21个氨基酸的肽)以及当把编码该肽的质粒导入大肠杆菌菌株并在微有氧条件下评估时,该肽的改善3-HP耐受性的效应。
考虑到本文中关于3HPTGC的公开内容,以及本领域技术人员已知的方法(例如,Sambrook和Russell,2001,其关于遗传修饰的方法通过引用并入本实施例),对微生物物种进行了遗传修饰,以包含编码IroK肽序列的核酸序列和3HPTGC的一个或多个遗传修饰,联合起来提供增强的3-HP耐受性。可以通过任何度量测定此3-HP耐受性的增强,如本文讨论的那些。
因此,基于以上结果,可以评估包括来自组A-E的两个或更多个代表的多个遗传修饰组合,并应用于微生物中以达到想要的增强的3-HP耐受性。表6、7、11、15和16显示了包括来自这些组的组合的特定遗传修饰组合的结果。另外,可以从组F提供另外的遗传修饰。如本文其它地方所描述,可以将任意此类组合与其它的遗传修饰联合,所述其它的遗传修饰可以包括下列一个或多个:3-HP生物生产途径以提供和/或增加重组微生物的3-HP合成和积累,缺失或其它修饰以指导更多的代谢资源(例如碳和能量)进入3-HP的生物生产。
根据以上公开内容,以下涉及修饰宿主生物(跨越众多具有商业价值的微生物)的具体物种的示例性方法。这些实施例进一步支持:虽然由于多种原因使大肠杆菌使用方便,但大肠杆菌的使用不是意在限制。以下是关于在其它微生物物种中实施本发明的非限制性的一般性预测性实施例。
一般性预测性实施例32:红平红球菌中3-HP耐受性的改善
可以获得一系列大肠杆菌-红球菌穿梭质粒以在红平红球菌中表达,所述质粒包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.62:61-68(2003))。另外,可以获得用于在红平红球菌中异源表达基因的一系列启动子(参见,例如,Nakashima等人,Appl.Environ.Microbiol.70:5557-5568(2004),和Tao等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.2005,DOI 10.1007/s00253-005-0064)。可以使用Tao等人,见上文,和Brans等人(Appl.Environ.Microbiol.66:2029-2036(2000))描述的方法产生红平红球菌染色体基因的靶向基因破坏。这些公开的资源中各自的指明的教导和组合物通过引用并入。
最初将提供增强的3-HP耐受性所需的核酸序列(如上所述)以及任选的提供和/或改善3-HP生物合成途径的核酸序列最初被克隆进入pDA71或pRhBR71,并转化进入大肠杆菌。然后将载体通过电穿 孔转化进入红平红球菌,如Kostichka等人(见上文)所述。使重组子在含有葡萄糖的合成培养基中生长,使用本领域已知的或本文描述的方法监视3-HP耐受性和/或3-HP的生物生产。
一般性预测性实施例33:地衣芽孢杆菌中3-HP耐受性的改善
多数在枯草芽孢杆菌中复制的质粒和穿梭载体都可用于通过原生质转化或电穿孔法转化地衣芽孢杆菌。改善3-HP耐受性所需的核酸序列,和/或用于3-HP生物合成的核酸序列分离自多种来源,视需要进行密码子优化,并克隆进入质粒pBE20或pBE60衍生物(Nagarajan等人,Gene 114:121-126(1992))。转化地衣芽孢杆菌的方法是本领域已知的(例如,参见,Fleming等人Appl.Environ.Microbiol.,61(11):3775-3780(1995))。这些公开的资源中各自的指明的教导和组合物通过引用并入。
将构建为用于在枯草芽孢杆菌中表达的质粒转化进入地衣芽孢杆菌以产生重组微生物,然后其显示出增强的3-HP耐受性和任选的3-HP生物生产。
一般性预测性实施例34:浸麻芽孢杆菌中3-HP耐受性的改善
构建如上所述的用于在枯草芽孢杆菌中表达的质粒并用于通过原生质体转化法转化浸麻芽孢杆菌,以产生重组微生物,其显示出增强的3-HP耐受性和任选的3-HP生物生产。
一般性预测性实施例35:真养产碱杆菌(现在称作钩虫贪铜菌)中的3-HP耐受性的表达
真养产碱杆菌中的基因表达和产生突变的方法是本领域已知的(参见,例如Taghavi等人,Appl.Environ.Microbiol.,60(10):3585-3591(1994))。该公开资源中的指明的教导和组合物通过引用并入。从多个来源分离任意的鉴定为改善3-HP耐受性的核酸序列,和/或用于3-HP生物合成的核酸序列,视需要进行密码子优化,并克隆进入任意的多种如上所述的宿主载体中,电穿孔以产生重组微生物,其显示出改善的3-HP耐受性和任选的3-HP生物生产。产碱菌中的聚(羟基丁酸)途径已进行了详细描述,多种修饰真养产碱杆菌基因组的遗传技术是已 知的,这些工具可应用于工程化改造3-HP耐受形成性或任选的3-HP-gena-耐受形成性重组微生物。
一般性预测性实施例36:恶臭假单胞菌中3-HP耐受性的改善
恶臭假单胞菌中的基因表达方法是本领域已知的(参见,例如Ben-Bassat等人,U.S.Pat.No.6,586,229,关于这些教导通过引用并入本文)。从多个来源分离任意的鉴定为改善3-HP耐受性的核酸序列,和/或用于3-HP生物合成的核酸序列,视需要进行密码子优化,并克隆进入任意的多种如上所述的宿主载体中,电穿孔以产生重组微生物,其显示出改善的3-HP耐受性和任选的3-HP生物生产。例如,将这些核酸序列插入pUCP18,并将该连接的DNA电冲孔进入电感受态的恶臭假单胞菌KT2440细胞,以产生重组的恶臭假单胞菌微生物,其显示出增强的3-HP耐受性,并任选也包含至少包含在部分导入的核酸序列中的3-HP生物生产途径。
一般性预测性实施例37:植物乳杆菌中3-HP耐受性的改善
植物乳杆菌属于乳杆菌科,用于转化枯草芽孢杆菌和链球菌的很多质粒和载体都用于乳杆菌。合适的载体的非限制性实例包括pAM.beta.1及其衍生物(Renault等人,Gene 183:175-182(1996);和O′Sullivan等人,Gene 137:227-231(1993));pMBB1及其衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol 62:1481-1486(1996));接合质粒pMG1(Tanimoto等人,J.Bacteriol.184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等人,Appl.Environ.Microbiol.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等人,Appl.Environ.Microbiol.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等人,Antimicrob.Agents Chemother.38:1899-1903(1994))。还报道了数个来自植物乳杆菌的质粒(例如van Kranenburg R,Golic N,Bongers R,Leer R J,de Vos W M,Siezen R J,Kleerebezem M.Appl.Environ.Microbiol.2005March;71(3):1223-1230)。
一般性预测性实施例38:屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、和粪肠球菌中3-HP耐受性的改善
肠球菌属归属于乳杆菌科,很多用于转化乳杆菌、枯草芽孢杆菌和链球菌的质粒和载体都用于肠球菌。合适的载体的非限制性实例包括pAM.beta.1及其衍生物(Renault等人,Gene 183:175-182(1996);和O′Sullivan等人,Gene 137:227-231(1993));pMBB1及其衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62:1481-1486(1996));结合质粒pMG1(Tanimoto等人,J.Bacteriol.184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等人,Appl.Environ.Microbiol.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等人,Appl.Environ.Microbiol.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等人,Antimicrob.Agents Chemother.38:1899-1903(1994))。还可以使用,用于粪肠球菌的表达载体(使用来自乳球菌的nisA基因)(Eichenbaum等人,Appl.Environ.Microbiol.64:2763-2769(1998)。另外使用,用于在屎肠球菌染色体中进行基因置换的载体(Nallaapareddy等人,Appl.Environ.Microbiol.72:334-345(2006))。
对于一般性预测性实施例32-38中的每一个,可以向其中引入下列3-HP生物生产的比较:使用3-HP的分析方法,例如以下“共同的方法部分”中第III小部分描述的方法,在以各重组微生物进行的各生物生产事件结束后,获得可测定数量的3-HP(参见以下的生物生产事件类型,通过引用并入各个一般性预测性实施例)。该可测定数量基本上大于使用适当的不含功能性3-HP途径(如各一般性预测性实施例中所提供)的各自的对照微生物的对照生物生产事件中产生的3-HP的量。还可以通过任何已有的比较测定技术来测定耐受性的改善,例如使用“共同的方法部分”提供的MIC程序。
共同的方法部分
本部分中的所有方法的提供是为了并入其中和/或下文提及它们的以上方法中。
第I小部分.细菌生长方法:公开了用于各物种的细菌生长培养方法和相关的物质和条件,可以视需要应用,如下所述:
醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(DSMZ#1139)获自 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。将重悬的醋酸钙不动杆菌培养物的系列稀释物置于BHI,并允许其在有氧条件下在37℃在250rpm生长48小时直至饱和。
枯草芽孢杆菌由Gill实验室(University of Colorado at Boulder)惠赠,以活性生长的培养物的形式获得。将活性生长的枯草芽孢杆菌培养物的系列稀释物置于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),并允许其在有氧条件下在37℃在250rpm生长24小时直至饱和。
泥生绿菌(Chlorobium limicola)(DSMZ#245)获自GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后按照DSMZ说明书的描述,将培养物重悬于Pfennig’s Medium I和II(#28和29)。泥生绿菌在25℃在恒定漩涡中生长。
布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)(DSMZ#30040)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。将重悬的布氏柠檬酸杆菌培养物的系列稀释物置于BHI,并允许其在有氧条件下在30℃在250rpm生长48小时直至饱和。
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(DSMZ#792)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后按照DSMZ说明书的描述,将培养物重悬于丙酮丁醇梭菌培养基(#411)。丙酮丁醇梭菌在无氧条件下在37℃在250rpm生长直至饱和。
氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)(DSMZ#2634)获自 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后按照DSMZ说明书的描述,将培养物重悬于氨基丁酸梭菌培养基(#286)。氨基丁酸梭菌在无氧条件下在37℃在250rpm生长直至饱和。
克氏梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)(DSMZ#555)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以活性生长的培养物的形式提供。按照DSMZ说明书的描述,将克氏梭状芽孢杆菌培养物的系列稀释物置于克氏梭状芽孢杆菌培养基(#286)。克氏梭状芽孢杆菌在无氧条件下在37℃在250rpm生长直至饱和。
耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)(DMSZ#2839)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)。将重悬的耐金属贪铜菌培养物的系列稀释物置于BHI,并允许其在有氧条件下在30℃在250rpm生长48小时直至饱和。
钩虫贪铜菌(DSMZ#428)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion (BHI)Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)。将钩虫贪铜菌培养物的系列稀释物置于BHI,并允许其在有氧条件下在30℃在250rpm生长48小时直至饱和。如其它地方所指出,该物种之前的名字是真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus和Ralstonia eutrophus)。
食果糖脱硫弧菌(Desulfovibrio fructosovorans)(DSMZ#3604)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后按照DSMZ说明书的描述,将培养物重悬于Desulfovibrio fructosovorans 培养基(#63)。食果糖脱硫弧菌在无氧条件下在37℃在250rpm生长 直至饱和。
大肠杆菌Crooks(DSMZ#1576)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion (BHI)Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)。将重悬的大肠杆菌Crooks培养物的系列稀释物置于BHI,并允许其在有氧条件下在37℃在250rpm生长48小时直至饱和。
大肠杆菌K12由Gill实验室(University of Colorado at Boulder)惠赠,以活性生长培养物的形式获得。将活性生长的大肠杆菌K12培养物的系列稀释物置于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),并允许其在有氧条件下在37℃在250rpm生长24小时直至饱和。
盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum)(DSMZ#1576)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后按照DSMZ说明书的描述,将培养物重悬于盐杆菌培养基(#97)。盐沼盐杆菌在有氧条件下在37℃在250rpm生长直至饱和。
德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(#4335)is obtained from WYEAST USA(Odell,OR,USA),以活性生长培养物的形式提供。将活性生长的德氏乳杆菌培养物的系列稀释物置于Brain Heart Infusion(BHI)broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),并允许其在有氧条件下在30℃在250rpm生长24小时直至饱和。
勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)(DSMZ#5348)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig,Germany),以活性生长的培养物形式提供。按照DSMZ说明书的描述,将勤奋金属球菌培养物的系列稀释物置于金属球菌培养基(#485)。勤奋金属球菌在有氧条件下在65℃在250rpm生长直至饱和。
费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii)(DSMZ#4902)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后按照DSMZ说明书的描述,将培养物重悬于PYG-培养基(#104)。费氏丙酸杆菌谢氏亚种在无氧条件下在30℃在250rpm生长直至饱和。
恶臭假单胞菌由Gill实验室(University of Colorado at Boulder)惠赠,以活性生长的培养物形式提供。将活性生长的恶臭假单胞菌培养物的系列稀释物置于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),并允许其在有氧条件下在37℃在250rpm生长24小时直至饱和。
链球菌突变体(DSMZ#6178)获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany),以真空干燥培养物的形式提供。然后将培养物重悬于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)。链球菌突变体在有氧条件下在37℃在250rpm生长直至饱和。
第II小部分:凝胶制备、DNA分离、提取、连接和转化方法:
将分子生物学级别的琼脂糖(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)加入到1x TAE中以制备1%的琼脂糖:TAE溶液。为了获得50x TAE,将下列物质加入到900mL蒸馏水中:将下列物质加入到900ml蒸馏的H2O中:242g Tris碱(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),57.1ml冰醋酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和18.6g EDTA(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA USA),并使用另外的蒸馏水调整体积至1L。为了获得1x TAE,将20mL 50x TAE加至980mL蒸馏水中。然后将琼脂糖-TAE溶液加热至发生沸腾并且琼脂糖完全溶解。使溶液冷却至50℃,然后加入10mg/mL溴化乙啶(Acros Organics,Morris Plains,NJ,USA),浓度是5ul/100mL 1%琼脂糖溶液。加入溴化乙啶之后,轻微混合溶液并倒入按照样品数具有合适数目的梳子(Idea Scientific Co.,Minneapolis,MN,USA)的制胶托盘中。然后将DNA样品与5XTAE上样缓冲液混合。5X TAE上样缓冲液由下列组成:5XTAE(从 上述的50X TAE稀释而来),20%甘油(Acros Organics,Morris Plains,NJ,USA),0.125%溴酚蓝(Alfa Aesar,Ward Hill,MA,USA),并使用蒸馏水调整体积至50mL。然后在装满了1X TAE的凝胶装备(Idea Scientific Co.,Minneapolis,MN,USA)中,在125伏的恒定电压,跑胶25-30分钟。此时,将凝胶从有电压的胶盒中取出,并在UV透射仪(FOTODYNE Inc.,Hartland,WI,USA)下显示。
然后根据生产商(Qiagen(Valencia CA USA))的说明书,使用QIAquick Gel Extraction Kit提取从凝胶提取物中分离的DNA。类似的方法是本领域技术人员已知的。
然后可以根据生产商的说明书,将由此提取的DNA连接进入pSMART(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA),StrataClone (Stratagene,La Jolla,CA,USA)或pCR2.1-TOPO TA(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)。这些方法在下面的“共同的方法”的下一个小部分中描述。
连接方法:
连接进入pSMART载体:
根据生产商的说明书,使用PCRTerminator(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)将凝胶提取的DNA平末端化。然后,将500ng的DNA加入至2.5uL 4x CloneSmart vector premix,加入1ul CloneSmart DNA连接酶(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)和蒸馏水,使总体积为10ul。然后使反应物在室温静置30分钟,然后在70℃加热灭活15分钟,然后置于冰上。将大肠杆菌10G化学感受态细胞(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)在冰上解冻20分钟。将40ul化学感受态细胞置于微量离心管中,向管中加入1ul热灭活的CloneSmart Ligation。使用移液枪枪头轻微搅拌整个反应物。将连接物和细胞在冰上温育30分钟,然后将细胞在42℃热击45秒,然后放回至冰上,放置2分钟。向离心管中加入960ul室温回收培养基(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)。在37℃在250rpm摇动该管1个小时。将100ul转化的细胞涂于LB平板(RPI Corp,Mt.Prospect, IL,USA),其中含有取决于所用的pSMART载体的合适的抗生素。在37℃过夜温育平板。
连接进入StrataClone:
根据生产商的说明书,使用PCRTerminator(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)将凝胶提取的DNA平末端化。然后,将2ul的DNA加入至3ul StrataClone Blunt Cloning buffer和1ul StrataClone Blunt vector mix amp/kan(Stratagene,La Jolla,CA,USA),总体积为6ul。通过轻轻地上下吸液来混合反应物,在室温温育反应物30分钟,然后置于冰上。将一管StrataClone化学感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)在冰上解冻20分钟。将1ul克隆反应物加入至含有化学感受态细胞的管中,然后使用移液枪枪头轻轻混合,并在冰上温育20分钟。将转化物在42℃热击45秒,然后置于冰上,放置2分钟。加入250ul预热的Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),并在250rpm在37℃摇动2小时。将100ul转化混合物涂于LB平板(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),其中含有合适的抗生素。在37℃过夜温育平板。
连接进入pCR2.1-TOPO TA:
将1ul TOPO载体、1ul盐溶液(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)和3ul凝胶提取的DNA加入至微量离心管中。将管在室温温育30分钟,然后将反应物置于冰上。每个反应物解冻1管TOP10F’化学感受态细胞(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)。将1ul反应混合物加至解冻的TOP10F’细胞,并通过使用移液枪枪头打旋细胞轻轻混合,在冰上温育20分钟。将转化物在42℃热击45秒,然后置于冰上,放置2分钟。加入250ul预热的SOC培养基(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA),并在250rpm在37℃摇动1小时。将100ul转化混合物涂于LB平板(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),其中含有合适的抗生素。在37℃过夜温育平板。
一般性转化和相关的培养方法:
根据生产商的说明书或根据Molecular Cloning(Sambrook和 Russell,2001)中包含的文献进行化学上的感受态转化程序。一般地,将质粒DNA或连接产物在含有化学感受态细胞的溶液中在冰上致冷5至30分钟。化学感受态细胞是生物化学领域中广泛使用的产品,可以从多个供应商获得,例如本小部分中上文指明的那些。致冷期后,一般将细胞在42℃热击30秒,不摇动,重新致冷,并与250ul的富集培养基例如S.O.C中混合。然后将细胞在37℃温育,同时在250rpm摇动1小时。最后,通过涂于含有合适的抗生素的培养基中筛选成功转化的细胞。
或者,可以通过电穿孔方法例如本领域技术人员已知的那些来转化选择的细胞。
用于质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的选择是通过考虑因素例如质粒稳定性、质粒相容性、质粒筛选方法和蛋白表达确定的。可以通过简单地纯化质粒DNA(如上文所述)并将质粒转化进入想要的或其它情况下合适的大肠杆菌宿主菌株(如通过实验需要确定的那些,例如任意的通常使用的克隆菌株,(例如DH5α,Top10F’,大肠杆菌10G等))来改变菌株背景。
制备1升的M9最简培养基:
通过将5X M9盐、1M MgSO4、20%葡萄糖、1M CaCl2和无菌去离子水混合来制备M9最简培养基。通过将以下的盐溶解于去离子水中至1升的终体积来制备5X M9盐:64g Na2HPO4·7H2O、15gKH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl。将盐溶液分成200mL的等份,并通过在15psi在液体循环下通过高压蒸汽灭菌15分钟来灭菌。1M的MgSO4溶液和1M的CaCl2分别制备,然后通过高压蒸汽灭菌法灭菌。将葡萄糖通过0.22μm的滤纸,从而将其过滤灭菌。将所有成分按照下述混合以制备1升的M9:750mL无菌水、200mL 5X M9盐、2mL的1M MgSO4、20mL 20%葡萄糖、0.1mL CaCl2,定容至1L的终体积。
制备EZ富集培养基:
所有的培养基成分获自TEKnova(Hollister CA USA),并按照以 下体积混合:100mL 10X MOPS混合物、10mL 0.132M K2HPO4、100mL 10X ACGU、200mL 5X Supplement EZ、10mL 20%葡萄糖、580mL无菌水。
第IIIa小部分.3-HP的制备
按照如下所述制备3-HP贮液,并用于除实施例1外的实施例。在通风橱中打开1瓶β-丙内酯(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA),使用25-mL的玻璃移液管,将瓶中全部内容物转移至新的容器。使用50mL HPLC级别的水润洗该瓶,将该润洗液倒入所述的新的容器。再进行两次润洗并加入所述新的溶液。向所述的新的容器中加入另外的HPLC级别的水,达到50mL水/5mLβ-丙内酯的比例。将该新的容器紧密地加盖,并在室温在通风橱中放置72小时。72小时后,将内容物转移至离心管,在4,000rpm离心10分钟。然后将溶液过滤以除去颗粒,如果需要,在室温使用旋转蒸发器进行浓缩。按照下文叙述进行浓度测定,如果需要,进行稀释以制备标准浓度的贮液。
注意到,在3-HP溶液的毒性中似乎有小的批间差异。不被特定理论所限,相信该差异可能与低水平的丙烯酸污染物相关,丙烯酸比3-HP毒性更强,另外,在较低的程度上,与β-丙内酯聚合物的存在相关。HPLC结果显示丙烯酸峰的存在,如所注意到的,其是浓度在各批次之间各异的微量污染物。
第IIIb小部分.用于检测3-HP的HPLC和GC/MS分析方法
对于3-HP的HPLC分析,Waters色谱系统(Milford,MA)由下列组成:600S控制器、616泵、717Plus自动取样器、486可调UV检测器、和内嵌的移动相脱气装置。此外,使用Eppendorf外部柱子加热器,使用连接至标准台式机的SRI(Torrance,CA)模/数转换器来收集数据。使用SRI Peak Simple软件分析数据。使用Coregel 64H离子排除柱(Transgenomic,Inc.,San Jose,CA)。柱树脂是磺化的聚苯乙烯二乙烯苯,颗粒尺寸为10μm,柱尺寸为300x 7.8mm。移动相由硫酸(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA USA)组成,以去离子(18MΩcm)水稀释至0.02N的浓度,并通过0.2μm的尼龙滤纸真空过滤。流动相的流速是0.6mL/分钟。UV检测器在210nm的波长运行,将柱加热至60℃。本文描述的相同设备和方法用于相关的预测性实施例中的3-HP分析。使用HPLC方法和3-HP标准物(TCI America,Portland,OR)建立的校正曲线显示于图13。
以下方法用于3-HP的GC-MS分析。以乙酸乙酯萃取一次发酵培养基之后,使用GC-MS定量测定可溶性单体3-HP。GC-MS系统由下列组成:Hewlett Packard model 5890GC和Hewlett Packard model 5972MS。柱是Supelco SPB-1(60m X 0.32mm X 0.25μm膜厚度)。毛细包被物是非极性的甲基硅酮。载气是氦,流速是1mL/分钟。使用以下温度梯度方案,将3-HP与乙酸乙酯萃取物中的其它成分分离:开始是40℃,1分钟;然后是10℃/分钟至235℃;然后50℃/分钟至300℃。使用托品酸(1mg/mL)作为内部对照。在运行开始时使用3-HP标准曲线定量3-HP,使用HP Chemstation分析数据。使用标准物自动生成的校正曲线显示于图13。
第IVa小部分.最小抑制浓度评估(MIC)的一般步骤(用于除了实施例1-4之外的评估)
大肠杆菌有氧
以96孔板的形式在有氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各个单独的孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列水平的成分(对应于标准的M9培养基):47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,和0.4%葡萄糖。根据表3报告的水平添加培养基补充物(如指明)。使菌株的过夜培养物一式三份在5mL LB(视需要添加抗生素)生长。将1%(v/v)接种物导入5ml M9最简培养基的培养物。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞,将10μL的等分试样用于接种96孔板的每个孔(~104个细胞/孔),至100uL的总体积。在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,递增5g/L)测定平板中的不同菌株的生长或生长状况。将平板在37C温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对 应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,递增5g/L)的平板中进行测定。
大肠杆菌无氧
以96孔板的形式在无氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各个单独的孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列水平的成分(对应于标准的M9培养基):47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,和0.4%葡萄糖。根据表3报告的水平添加培养基补充物(如指明)。使菌株的过夜培养物一式三份在5mL LB(视需要添加抗生素)生长。将1%(v/v)接种物导入5ml M9最简培养基的培养物。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞,将10μL的等分试样用于接种96孔板的每个孔(~104个细胞/孔),至100uL的总体积。在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,递增5g/L)测定平板中的不同菌株的生长或生长状况。将平板密封在含有用于无氧条件的气体发生器的生物袋无氧室中,并在37C温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,递增5g/L)的平板中进行测定。
枯草芽孢杆菌有氧
以96孔板的形式在有氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各个单独的孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列水平的成分(对应于标准的M9培养基+补充性谷氨酸):47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,10mM谷氨酸和0.4%葡萄糖。根据表3报告的水平添加培养基补充物(如指明)。使菌株的过夜培养物一式三份在5mL LB(视需要添加抗生素)生长。将1%(v/v)接种物导入5mlM9最简培养基+谷氨酸的培养物。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞, 将10μL的等分试样用于接种96孔板的每个孔(~104个细胞/孔),至100uL的总体积。在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,递增5g/L)测定平板中的不同菌株的生长或生长状况。将平板在37C温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,递增5g/L)的平板中进行测定。
钩虫贪铜菌(真养产碱杆菌)有氧
以96孔板的形式中在有氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各个单独的孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列水平的成分(对应于标准的FGN培养基):21.5mM K2HPO4,8.5mM KH2PO4,18mM NH4Cl,12mM NaCl,7.3uM ZnCl,0.15uM MnCl2,4.85uM H3BO3,0.21uM CoCl2,0.41uM CuCl2,0.50uM NiCl2,0.12uM Na2MoO4,0.19uM CrCl3,0.06mM CaCl2,0.5mM MgSO4,0.06mM FeSO4,0.2%甘油,0.2%果糖。根据表3报告的水平添加培养基补充物(如指明)。使菌株的过夜培养物一式三份在5mL LB(视需要添加抗生素)生长。将1%(v/v)接种物导入5ml FGN培养基的培养物。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞,将10μL的等分试样用于接种96孔板的每个孔(~104个细胞/孔),至100uL的总体积。在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,递增5g/L)测定平板中的不同菌株的生长或生长状况。将平板在30C温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,递增5g/L)的平板中进行测定。
对于上述的MIC评估,最终的结果表示为根据HPLC分析贮液所测的化学试剂的浓度(即,参见第IIIb小部分)。
供应商的总结部分
本部分提供了供应商的总结,可以修改以加入后续申请中的另外的供应商信息。主要供应商的名字和城市地址提供于以上的方法中。
此外,关于Qiagen产品, 血液和组织试剂盒,Cat.No.69506,用于制备基因组DNA的方法中; Spin(“mini prep”),Cat.No.27106用于质粒DNA的纯化, Gel Extraction Kit,Cat.No.28706用于如上所述的凝胶提取。
表1:SCALES拟合数据
基因 | 累积拟合 | 基因 | 累积拟合 | 基因 | 累积拟合 | ||
aceE | 11.2 | cysM | 26.63 | ilvC | 2.61 | ||
aceF | 8.39 | eno | 6.98 | ilvD | 1.6 | ||
ackA | 2.36 | entA | 1.58 | ilvE | 0.94 | ||
acnA | 3.58 | entB | 0.93 | ilvH | 1.18 | ||
acnB | 3.18 | entC | 1.26 | ilvI | 1.77 | ||
adhE | 3.68 | entD | 1 | ilvM | 1.02 | ||
adiA | 1.95 | entE | 1.03 | ilvN | 1.53 | ||
adk | 2.18 | entF | 1.03 | kbl | 3.11 | ||
aldA | 1.83 | fbaA | 2.87 | itaE | 1.14 | ||
argA | 3.94 | fbaB | 2.28 | lysC | 1.97 | ||
argB | 8.94 | folA | 15.07 | malY | 2.58 | ||
argC | 4.02 | folB | 0.57 | menA | 3.2 | ||
argD | 2.87 | folC | 1.72 | menB | 0.86 | ||
argE | 2.15 | folD | 8.54 | menC | 0.92 | ||
argF | 2.04 | folE | 1.08 | menD | 2.33 | ||
argG | 2.62 | folK | 1.73 | menE | 3.06 | ||
argH | 8.06 | folP | 2.45 | menF | 3.09 | ||
argI | 4.06 | fumA | 3.84 | metA | 1.56 | ||
aroA | 2.31 | fumB | 2.51 | metB | 1.83 | ||
aroB | 8.68 | fumC | 1.86 | metC | 6.08 | ||
aroC | 1.95 | gabD | 1.83 | metE | 2.46 | ||
aroD | 1.93 | gabT | 1.41 | metH | 2.44 | ||
aroE | 8.44 | gapA | 3.03 | metK | 3.35 | ||
aroF | 6.24 | gcvH | 5.9 | metL | 2.97 | ||
aroG | 2.26 | gcvP | 7.91 | mhpF | 1.44 | ||
aroH | 1.61 | gcvT | 1.78 | ndk | 1.66 | ||
aroK | 4 | gdhA | 2.84 | nrdA | 2.01 | ||
aroL | 1.63 | gldA | 2.08 | nrdB | 1.81 | ||
asd | 2.96 | glk | 1.17 | nrdD | 2.79 | ||
aspC | 2.82 | glnA | 1.34 | nrdE | 1.91 | ||
astC | 2.29 | gltA | 6.37 | nrdF | 1.25 | ||
carA | 0.89 | glyA | 5.06 | pabA | 2.33 | ||
carB | 1.17 | gmk | 1.86 | pabB | 1.92 | ||
cynS | 4.83 | gnd | 1.69 | thrA | 2.79 | ||
cysE | 1.19 | gpmA | 2.01 | thrB | 0.96 | ||
cysK | 2.41 | guaA | 3.65 | thrC | 1.51 | ||
pabC | 1.75 | guaB | 2.63 | pheA | 6.7 | ||
pfkA | 1.78 | ilvA | 12.21 | pta | 2.7 | ||
pfiB | 2.83 | ilvB | 2.7 | purA | 5.1 |
基因 | 累积拟合 | 基因 | 累积拟合 | 基因 | 累积拟合 | ||
purB | 3.65 | rpiA | 1.85 | trpC | 1.56 | ||
purC | 1.78 | sdaA | 1.62 | trpD | 2.48 | ||
purD | 1.32 | sdaB | 1.22 | trpE | 2.85 | ||
purE | 1.82 | serA | 3.11 | tynA | 2.36 | ||
purF | 2.04 | serB | 2.46 | tyrA | 9.1 | ||
purH | 1.66 | serC | 2.15 | tyrB | 1.49 | ||
purK | 2.65 | speA | 2.09 | ubiA | 1.51 | ||
purL | 4.83 | speB | 1.66 | ubiB | 2.09 | ||
purM | 3.13 | speC | 1.52 | ubiC | 2.4 | ||
purN | 2.94 | speD | 3.43 | ubiD | 0.91 | ||
purT | 3.73 | talA | 1.24 | ubiE | 1.02 | ||
puuE | 1.53 | talB | 4.78 | ubiF | 1.78 | ||
pyrB | 6.36 | tdcB | 1.87 | ubiG | 3.17 | ||
pyrC | 14.48 | tdcD | 1.64 | ubiH | 5.35 | ||
pyrD | 2.26 | tdcE | 1.16 | ubiX | 1.72 | ||
pyrE | 1.03 | tdh | 1.38 | ydcW | 0.89 | ||
pyrF | 1.38 | tktA | 1.89 | ydiB | 0.87 | ||
pyrG | 2.23 | tktB | 1.21 | ygjG | 2.51 | ||
pyrH | 1.78 | trpA | 2.45 | yneI/sad | 4.18 | ||
pyrI | 0.83 | trpB | 1.93 | ||||
rpe | 2.06 |
表3:补充物
表3:补充物(续)
表4A:载体
载体 | 序列编号 |
pSMART-HC-Amp | SEQ ID NO:005 |
pSMART-LC-Kan | SEQ ID NO:006 |
pBT-3 | SEQ ID NO:007 |
pKK223-3 | SEQ ID NO:008 |
pACYC 177(kan only) | SEQ ID NO:009 |
pWH1520 | SEQ ID NO:010 |
pHT08 | SEQ ID NO:011 |
pJ61:25125 | SEQ ID NO:012 |
pYes2.1-topo | SEQ ID NO:183 |
pRS423 | SEQ ID NO:184 |
pRS425 | SEQ ID NO:185 |
pJ251 | SEQ ID NO:186 |
表5:缺失构建体
Keio克隆编号 | 基因删除 | 正向引物 | 反向引物 |
JW1650 | purR | SEQ ID:130 | SEQ ID:131 |
JW2807 | lysR | SEQ ID:132 | SEQ ID:133 |
JW1316 | tyrR | SEQ ID:134 | SEQ ID:135 |
JW4356 | trpR | SEQ ID:136 | SEQ ID:137 |
JW3909 | metJ | SEQ ID:138 | SEQ ID:139 |
JW0403 | nrdR | SEQ ID:140 | SEQ ID:141 |
表12:酵母耐受性引物
基因 | 引物A | 引物B |
spe3 | SEQID 0155 | SEQID 0156 |
hom2 | SEQID 0157 | SEQID 0158 |
MET6 | SEQID 0159 | SEQID 0160 |
ILV2 | SEQID 0161 | SEQID 0162 |
ILV6 | SEQID 0163 | SEQID 0164 |
THR1 | SEQID 0165 | SEQID 0166 |
SER2 | SEQID 0167 | SEQID 0168 |
SER3 | SEQID 0169 | SEQID 0170 |
ARG2 | SEQID 0171 | SEQID 0172 |
RNR1 | SEQID 0173 | SEQID 0174 |
aro3 | SEQID 0175 | SEQID 0176 |
ARO7 | SEQID 0177 | SEQID 0178 |
TYR1 | SEQID 0179 | SEQID 0180 |
TRP1 | SEQID 0181 | SEQID 0182 |
Claims (131)
1.一种经遗传修饰的微生物,其包含:
a.至少一个遗传修饰以产生3-羟基丙酸(“3-HP”);和
b.3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰,以有效地使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性增加至超过不含所述3HPTGC的至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合。
2.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中所述产生3-HP的至少一个遗传修饰使微生物的3-HP合成增加至超过不含所述的产生3-HP的至少一个遗传修饰的对照微生物的速率或效价。
3.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少5%。
4.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少10%。
5.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少20%。
6.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少30%。
7.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少50%。
8.一种经遗传修饰的微生物,其包含3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合。
9.权利要求8的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少5%。
10.权利要求8的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少10%。
11.权利要求8的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少20%。
12.权利要求8的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少30%。
13.权利要求8的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰有效使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少50%。
14.权利要求8的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物产生3-HP。
15.权利要求9-13任一项的经遗传修饰的微生物,其中所述对照微生物产生3-HP。
16.权利要求9-13任一项的经遗传修饰的微生物,其中所述对照微生物不产生3-HP。
17.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中所述至少一个3HPTGC遗传修饰包括苏氨酸/高半胱氨酸途径的基因的至少一个遗传修饰。
18.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括聚胺途径的基因的至少一个遗传修饰。
19.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括赖氨酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰。
20.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括核苷酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰。
21.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括苏氨酸/高半胱氨酸途径的基因的至少一个遗传修饰和聚胺途径的基因的至少一个遗传修饰。
22.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括苏氨酸/高半胱氨酸途径的基因的至少一个遗传修饰和赖氨酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰。
23.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括苏氨酸/高半胱氨酸途径的基因的至少一个遗传修饰和核苷酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰。
24.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括聚胺途径的基因的至少一个遗传修饰和赖氨酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰。
25.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括聚胺途径的基因的至少一个遗传修饰和核苷酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰。
26.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括赖氨酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰和核苷酸合成途径的基因的至少一个遗传修饰。
27.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR、和等同的阻抑基因的一个或多个3HPTGC阻抑基因的至少一个遗传修饰。
28.权利要求27的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括破坏。
29.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中至少一个3HPTGC遗传修饰包括:增加内源性遗传元件的表达;降低阻抑基因的功能;改变或修饰反馈抑制;导入异源遗传元件;或增加编码催化3HPTGC的酶促转化的多肽的核酸序列的拷贝数。
30.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其中3HPTGC的至少一个遗传修饰中的至少一个编码催化3HPTGC的至少一个酶促转化的至少一种多肽。
31.权利要求1-9任一项的经遗传修饰的微生物,其中3-HP耐受形成性复合物的至少一个遗传修饰不包括苏氨酸/高半胱氨酸途径的基因的遗传修饰。
32.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其进一步包括增加SEQID NO:129的表达的遗传修饰。
33.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中相对于不含至少一个3HPTGC遗传修饰的对照微生物的酶促转化,所述经遗传修饰的微生物在3HPTGC的一个或多个酶促转化具有酶促转化的增加。
34.权利要求1的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物不含糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛酸旁路途径、戊糖磷酸途径或其任意组合的基因的遗传修饰。
35.权利要求1-14任一项的经遗传修饰的微生物,其包含增加的碳酸酐酶活性。
36.权利要求32的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是大肠杆菌菌株或钩虫贪铜菌菌株。
37.权利要求1-14或32-34任一项的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是革兰氏阴性细菌。
38.权利要求37的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物选自以下属:发酵单胞菌属、埃希菌属、假单胞菌属、产碱菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、伯克氏菌属、寡养菌属和雷伯氏菌属。
39.权利要求37的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物选自下列种:大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食羧寡养菌和恶臭假单胞菌。
40.权利要求37的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是大肠杆菌菌株。
41.权利要求1-14或32-34任一项的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是革兰氏阳性细菌。
42.权利要求41的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物选自以下属:梭菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌属、肠球菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属和短杆菌属。
43.权利要求41的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物选自下列种:地衣芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌、红平红球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌和枯草芽孢杆菌。
44.权利要求41的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是枯草芽孢杆菌菌株。
45.权利要求1-14或32-34任一项的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是真菌。
46.权利要求45的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是酵母。
47.权利要求46的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物选自下列属:毕赤酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属和酵母属。
48.权利要求46的经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是酿酒酵母。
49.一种微生物培养系统,其包括:
a.权利要求1-48任一项的经遗传修饰的微生物;和
b.包含至少1g/L的3-HP的培养基。
50.权利要求49的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少5g/L的3-HP。
51.权利要求49的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少10g/L的3-HP。
52.权利要求49的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少20g/L的3-HP。
53.权利要求49的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少50g/L的3-HP。
54.权利要求49的微生物培养系统,其进一步包括至少一种补充物,其中所述至少一种补充物包括3HPTGC的酶促转化步骤的至少一种反应物。
55.权利要求54的微生物培养系统,其中所述补充物选自表3。
56.权利要求49的微生物培养系统,其中微生物培养系统的经遗传修饰的微生物显示出高于不含至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性的增强的3-HP耐受性。
57.权利要求49的微生物培养系统,其中微生物培养系统的经遗传修饰的微生物显示出相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少5%的增强的3-HP耐受性。
58.权利要求49的微生物培养系统,其中微生物培养系统的经遗传修饰的微生物显示出相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少10%的增强的3-HP耐受性。
59.权利要求49的微生物培养系统,其中微生物培养系统的经遗传修饰的微生物显示出相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少20%的增强的3-HP耐受性。
60.权利要求49的微生物培养系统,其中微生物培养系统的经遗传修饰的微生物显示出相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少30%的增强的3-HP耐受性。
61.权利要求49的微生物培养系统,其中微生物培养系统的经遗传修饰的微生物显示出相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少50%的增强的3-HP耐受性。
62.权利要求49的微生物培养系统,其中所述培养基是最简培养基。
63.制备经遗传修饰的微生物的方法,包括将至少一个遗传修饰导入微生物中以增加3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的一个或多个酶促转化的酶促转化,其中增加3HPTGC的一个或多个酶促转化的酶促转化的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合,且其中所述经遗传修饰的微生物合成3-HP。
64.权利要求63的方法,其中所述至少一个遗传修饰使经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性增加至超过不含遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性。
65.权利要求64的方法,其中所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少5%。
66.权利要求64的方法,其中所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少10%。
67.权利要求64的方法,其中所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少20%。
68.权利要求64的方法,其中所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少30%。
69.权利要求64的方法,其中所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性增加至少50%。
70.权利要求64-69任一项的方法,其中所述对照微生物合成3-HP。
71.权利要求64-69任一项的方法,其中所述对照微生物不合成3-HP。
72.权利要求64的方法,还包括导入选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR和arg的一个或多个3HPTGC阻抑基因的一个或多个基因破坏。
73.制备经遗传修饰的微生物的方法,包括:
a.向所选微生物中导入3-羟基丙酸(“3-HP”)产生途径的至少一个遗传修饰,以使微生物的3-HP合成增加至超过不含所述至少一个遗传修饰的对照微生物的速率;和
b.向所选微生物中导入3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合。
74.权利要求73的方法,其中将3-HP产生途径导入所选微生物中。
75.权利要求73的方法,其中对照微生物不产生3-HP。
76.一种经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物是通过权利要求73、74或75的方法制备的。
77.一种微生物培养系统,其包括:
a.包含3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰的经遗传修饰的微生物,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合;和
b.包含至少1g/L的3-HP的培养基。
78.权利要求77的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少5g/L的3-HP。
79.权利要求77的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少10g/L的3-HP。
80.权利要求77的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少20g/L的3-HP。
81.权利要求77的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少50g/L的3-HP。
82.权利要求77的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少60g/L的3-HP。
83.权利要求77的微生物培养系统,其中所述培养基包含至少100g/L的3-HP。
84.权利要求77的微生物培养系统,其进一步包含至少一种补充物,其中所述至少一种补充物包括3HPTGC的酶促转化的至少一种产物。
85.权利要求84的微生物培养系统,其中所述补充物选自表3。
86.权利要求77的微生物培养系统,其中所述经遗传修饰的微生物缺少苏氨酸/高半胱氨酸途径的基因的遗传修饰。
87.权利要求77的微生物培养系统,其中在所述微生物培养系统中,经遗传修饰的微生物显示出高于不含3HPTGC遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性的增强的3-HP耐受性。
88.权利要求87的微生物培养系统,其中在所述微生物培养系统中,经遗传修饰的微生物显示出的增强的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性高至少5%。
89.权利要求87的微生物培养系统,其中在所述微生物培养系统中,经遗传修饰的微生物显示出的增强的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性高至少10%。
90.权利要求87的微生物培养系统,其中在所述微生物培养系统中,经遗传修饰的微生物显示出的增强的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性高至少20%。
91.权利要求87的微生物培养系统,其中在所述微生物培养系统中,经遗传修饰的微生物显示出的增强的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性高至少30%。
92.权利要求87的微生物培养系统,其中在所述微生物培养系统中,经遗传修饰的微生物显示出的增强的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性高至少50%。
93.权利要求77的微生物培养系统,其中所述培养基是最简培养基。
94.权利要求77的微生物培养系统,其中经遗传修饰的微生物还包含至少一个对aldA的遗传修饰。
95.权利要求77的微生物培养系统,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:pheA、folA、aroB、folD、trpA、aroF、tyrA、menA、aspC、aroG、aroE、ubiB、ubiC、aroA、entA、menF、aroD、menD、ubiX、ubiG、ydiB、purN、ubiH、tyrB、trpB、aroH、trpE、folC、ubiA、ubiD、pabB、ubiF、trpD、entB、trpC、ubiE、pabA、aroL、menE、entC、pabC、aroK、entD、entE、folP、aroC、entF、和menC。
96.权利要求77的微生物培养系统,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:aceE、aceF、adhE、adiA、gabD、gabT、gdhA、tyrA-aroF、和ydcW。
97.改善选择的微生物中的3-羟基丙酸(3-HP)耐受性的方法,包括:
a.将至少一个遗传修饰导入选择的合成3-HP的微生物中,以增加选自下组的途径的基因的酶促转化的酶促转化:苏氨酸/高半胱氨酸途径、聚胺途径、赖氨酸合成途径、核苷酸合成途径、糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛酸旁路途径、戊糖磷酸途径、及其组合;和
b.将所述选择的微生物暴露于包含至少1g/L的3-HP的培养基中,其中所述选择的微生物显示出的3-HP耐受性比不含a的至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少5%。
98.权利要求97的方法,其中所述选择的微生物显示出的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少10%。
99.权利要求97的方法,其中所述选择的微生物显示出的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少30%。
100.权利要求97的方法,其中所述选择的微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少50%。
101.权利要求97的方法,进一步包括导入至少一个遗传修饰以增加分支酸超途径的基因的酶促转化的酶促转化。
102.制备经遗传修饰的微生物的方法,包括:
a.选择微生物,其包括:
i.提供微生物物种或菌株,其中目标微生物物种或菌株具有基因组序列;
ii.鉴定所述微生物的基因组序列;
ii.鉴定所述微生物的基因组序列与图1A-D的3-羟基丙酸耐受形成性复合物(3HPTGC)之间的同源性,
b.通过向所述微生物中导入至少一个选择的遗传修饰,对步骤a中所选的微生物进行遗传修饰,其中所述至少一个选择的遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合,且所述至少一个选择的遗传修饰增加为图1A-D的一个或多个酶促转化的一个或多个酶促转化的转化;其中所述的增加一个或多个酶促转化的转化使所述微生物的3-HP耐受性相对于不含所述至少一个选择的遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性升高;
c.评估b中导入的至少一个选择的遗传修饰,以鉴定产物微生物,其中所述产物微生物的3-HP耐受性高于对照微生物的3-HP耐受性;
d.选择c中评估的至少一个选择的遗传修饰;和
e.通过向一个或多个细胞中导入c的产物微生物的至少一个遗传修饰而制备经遗传修饰的微生物,以产生经遗传修饰的微生物,其中所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少5%。
103.权利要求102的方法,其中重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少10%。
104.权利要求102的方法,其中重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少20%。
105.权利要求102的方法,其中重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少30%。
106.权利要求102的方法,其中重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少50%。
107.权利要求102的方法,其中在选自下组的途径的两个或更多个中的每一个中进行至少一个选择的遗传修饰:苏氨酸/高半胱氨酸途径、聚胺途径、赖氨酸合成途径、核苷酸合成途径、糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛酸旁路途径、戊糖磷酸途径、及其组合。
108.鉴定微生物中的增加3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受性的遗传修饰的方法,包括:
a.向选择的微生物中导入编码多肽的异源核酸序列,所述多肽是为了修饰选自3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的酶促转化步骤的活性,其中所述异源核酸序列是选自下组的基因的异源核酸序列:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合;和
b.评估遗传修饰的微生物的增强的3-HP耐受性。
109.权利要求108的方法,还包括将所述异源核酸序列导入选择的3-HP生产菌株微生物中。
110.权利要求109的方法,还包括导入并评价至少一个另外的与3HPTGC相关的异源核酸序列,对于任意此类提供想要的3-HP耐受性增加的异源核酸序列,将所述异源核酸序列导入权利要求88的选择的3-HP生产菌株微生物中。
111.鉴定微生物中的增加3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受性的遗传修饰的方法,包括:
a.向选择的微生物中导入遗传修饰以修饰选自3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的酶促转化的活性,其中所述遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合;和
b.评估遗传修饰的微生物的增强的3-HP耐受性。
112.产生3-羟基丙酸(“3-HP”)的微生物中的遗传修饰,其中所述遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、folP、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合,且所述遗传修饰有效增加微生物中3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的产物的浓度,其中由此造成微生物的3-HP耐受性比不含所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少5%。
113.权利要求112的遗传修饰,其中所述遗传修饰有效增加微生物中3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的产物的浓度,其中由此造成微生物的3-HP耐受性比不含所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少10。
114.权利要求112的遗传修饰,其中所述遗传修饰有效增加微生物中3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的产物的浓度,其中由此造成微生物的3-HP耐受性比不含所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少20。
115.权利要求112的遗传修饰,其中所述遗传修饰有效增加微生物中3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的产物的浓度,其中由此造成微生物的3-HP耐受性比不含所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少30。
116.权利要求112的遗传修饰,其中所述遗传修饰有效增加微生物中3-HP耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的产物的浓度,其中由此造成微生物的3-HP耐受性比不含所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少50。
117.权利要求112的遗传修饰,其中经遗传修饰的微生物还包含至少一个对aldA的遗传修饰。
118.权利要求112的遗传修饰,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:pheA、folA、aroB、folD、trpA、aroF、tyrA、menA、aspC、aroG、aroE、ubiB、ubiC、aroA、entA、menF、aroD、menD、ubiX、ubiG、ydiB、purN、ubiH、tyrB、trpB、aroH、trpE、folC、ubiA、ubiD、pabB、ubiF、trpD、entB、trpC、ubiE、pabA、aroL、menE、entC、pabC、aroK、entD、entE、folP、aroC、entF、和menC。
119.权利要求112的遗传修饰,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:aceE、aceF、adhE、adiA、gabD、gabT、gdhA、tyrA-aroF、和ydcW。
120.一种经遗传修饰的微生物,其包含3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰,所述遗传修饰增加图1A第2至7页的酶促转化的至少一种产物的产量,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合,且其中所述经遗传修饰的微生物显示出的3-HP耐受性比不含所述至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高。
121.权利要求120的经遗传修饰的微生物,其中所述图1A第2至7页的酶促转化的至少一种产物是图1A第3至7页的酶促转化的至少一种产物。
122.权利要求121的经遗传修饰的微生物,其中所述图1A第2至7页的酶促转化的至少一种产物是图1A第4至7页的酶促转化的至少一种产物。
123.一种经遗传修饰的微生物,其包含3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰,所述遗传修饰增加图1B第2至7页的酶促转化的至少一种产物的产量,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合,且其中所述经遗传修饰的微生物显示出的3-HP耐受性比不含所述至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高。
124.一种经遗传修饰的微生物,其包含3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰,所述遗传修饰增加图1C第2至7页的酶促转化的至少一种产物的产量,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合,且其中所述经遗传修饰的微生物显示出的3-HP耐受性比不含所述至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高。
125.一种经遗传修饰的微生物,其包含3-羟基丙酸(“3-HP”)耐受形成性复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰,所述遗传修饰增加图1D第2至7页的酶促转化的至少一种产物的产量,其中所述3HPTGC的至少一个遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:ackA、acnA、acnB、adk、argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、aroH-G149C、aroH-G149D、aroH-P18L、aroKB-C1、asd、astC、cadA、carA、carB、cynS、cynTS、cysE、cysK、cysM、dapA、eno、fbaA、fbaB、folA-C1、folA-ORF、folB、folE、folK、fumA、fumB、fumC、gapA、gcvH、gcvP、gcvT、gldA、glk、glnA、gltA、glyA、glyA-C1、glyA-ORF、gmk、gnd、gpmA、guaA、guaB、ilvA、ilvA-C1、ilvA-operon、ilvB、ilvC、ilvD、ilvE、ilvH、ilvl、ilvM、ilvN、itaE、kbl、lysA、lysC、lysR、malY、mcsl、menA C1、menA-ORF、menB、metA、metB、metC、metC C1、metE、metE-C645A、metH、metJ、metK、metL、mhpF、ndk、nrdA、nrdAB、nrdB、nrdD、nrdE、nrdEF、nrdF、nrdLEF、nrdR、pfkA、pflB、pheA-C1、pheA-C2、prs、pta、purA、purB、purC、purD、purE、purF、purH、purK、purL、purM、purR、purT、puuE、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、pyrF、pyrG、pyrH、pyrl、rpe、rpiA、sdaA、sdaB、serA、serB、serC、speA、speB、speC、speD、speFED、talA、talB、tdcB、tdcD、tdcE、tdh、thrA、thrB、thrC、tktA、tktB、trpR、tynA、tyrA-C1、tyrR、ygjG、ynel/sad、及其组合,且其中所述经遗传修饰的微生物显示出的3-HP耐受性比不含所述至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高。
126.权利要求1、8、120、123-125任一项的经遗传修饰的微生物,还包含至少一个对aldA的遗传修饰。
127.权利要求1、8、120、123-125任一项的经遗传修饰的微生物,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:pheA、folA、aroB、folD、trpA、aroF、tyrA、menA、aspC、aroG、aroE、ubiB、ubiC、aroA、entA、menF、aroD、menD、ubiX、ubiG、ydiB、purN、ubiH、tyrB、trpB、aroH、trpE、folC、ubiA、ubiD、pabB、ubiF、trpD、entB、trpC、ubiE、pabA、aroL、menE、entC、pabC、aroK、entD、entE、folP、aroC、entF、和menC。
128.权利要求1、8、120、123-125任一项的经遗传修饰的微生物,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:aceE、aceF、adhE、adiA、gabD、gabT、gdhA、tyrA-aroF、和ydcW。
129.权利要求63、73、102、108和111的任一项的方法,还包含产生至少一个对aldA的遗传修饰。
130.权利要求63、73、102、108和111的任一项的方法,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:pheA、folA、aroB、folD、trpA、aroF、tyrA、menA、aspC、aroG、aroE、ubiB、ubiC、aroA、entA、menF、aroD、menD、ubiX、ubiG、ydiB、purN、ubiH、tyrB、trpB、aroH、trpE、folC、ubiA、ubiD、pabB、ubiF、trpD、entB、trpC、ubiE、pabA、aroL、menE、entC、pabC、aroK、entD、entE、folP、aroC、entF、和menC。
131.权利要求63、73、102、108和111的任一项的方法,还包含至少一个3HPTGC的额外遗传修饰,其中所述至少一个额外遗传修饰是对选自下组的基因的修饰:aceE、aceF、adhE、adiA、gabD、gabT、gdhA、tyrA-aroF、和ydcW。
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