KR20150051081A - 전사 인자 조작을 통하여 재프로그래밍된 유전자를 발현하는 내산성이 증가된 클루베로마이세스 마르시아누스 - Google Patents

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Abstract

클루베로마이세스 마르시아누스에서 산업적으로 유용한 형질을 유도하기 위해 전사인자변이를 이용한 시스템 및 이를 이용하여 제작한 변형된 클루베로마이세스 마르시아누스를 제공하기 위한 것이다. 이를 위해 유전자 발현을 조절하는 전사인자복합체의 조절 인자에 속하는 각각의 주요 인자를 이용하여 변이 라이브러리이를 구축하였다. 구축된 변이 벡터 라이브러리를 균주에 도입 및 발현하여 내산성이 향상된 변이주를 개발하였다. 또한, 이를 이용하여 3-HP를 효율적으로 생산할 수 있는 균주를 개발하였고, 이러한 균주는 산업적으로 매우 유용하다.

Description

전사 인자 조작을 통하여 재프로그래밍된 유전자를 발현하는 내산성이 증가된 클루베로마이세스 마르시아누스{Acid resistant increased Kluyveromyces marxianus expressing reprogrammed gene by engineering transcriptional factor}
일 구체예는 내산성이 증대된 클루베로마이세스 마르시아누스 및 이를 이용하여 제작된 3-하이드록시프로피온산을 고효율로 생산하는 생산 균주를 제공한다.
3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionate, 3-HP)은 유기산으로서, 3-HP의 칼슘염은 구연산이나 말산의 칼슘염 보다 물에 대한 용해도가 100배 정도 높아서, 보일러, 산업시설 등의 스케일 방지용으로 유용성이 있는 물질이다. 또한, 3-HP는 몇몇 화학공정에 있어서 중요한 합성 중간체이다. 특히, 산화 반응에 의한 말론산 생산, 알코올과 함께 에스테르화 반응에 의한 특이 목적의 폴리에스테르 생산, 환원반응에 의한 1,3-프로판디올 생산 등을 포함하여 몇몇 화학물질과 폴리머의 생산에 중요하다. 특히 아크릴산, 아크릴 폴리머, 1,3-프로판디올, 말론산, 아크릴아미드 등의 전구물질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 아크릴산는 코팅과 접착제, 세제 및 흡수제에 사용되는 중합체합성 원료로 사용되며 2008년 기준 세계시장규모는 8조원, 국내는 약 1,400억원의 시장을 형성하였다.
3-HP의 제조방법으로는 화학적 합성법과 생물학적인 방법으로 나눌 수 있다. 화학적 방법으로는 1,3-프로판디올을 출발물질로 하여 팔라듐 촉매를 이용하여 3-HP를 제조하는 방법, 3-히드록시프로피온 알데히드로부터 팔라듐, 백금 촉매존재하에서 3-HP를 제조하는 방법, 고체산 촉매로서 이온 교환수지(Amberlyst 15)를 이용하여 아크릴산을 출발물질로 고압반응기 내에서 40시간 반응하여 91% 선택성과 34% 수율로 3-HP를 얻는 방법 등이 보고되어 있다.
생물학적인 방법은 상온, 상압의 조건하에서 미생물에 의해 3-HP를 합성하는 방법인데, 캔디다루고사 변이주(Candidarugosa KT8201)를 이용하여 아크릴산, 프로피온산, 프로피온 알데히드로부터 3-HP를 합성하는 방법, 알칼리제네스 패칼리스 M3A(Alcaligenes faecalis M3A)를 이용하여 아크릴산으로부터 3-HP를 합성하는 방법, 대장균의 대사공학적인 기술을 이용하여 포도당으로부터 3-HP를 합성하는 방법이 보고되고 있다. 그러나, 미생물을 이용한 3-HP의 낮은 생산성은 바이오공정을 이용한 3-HP 생산에 장애가 되고 있다. 특히, 3-HP는 산이므로 미생물이 일정수준 3-HP를 생성시, pH의 변화로 미생물은 더 이상 3-HP를 생산할 수 없게 된다.
따라서, 이러한 문제점을 해소하기 위해 최적의 형질전환 미생물을 찾기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있는 실정이다. 일 구체예에서 상기 문제점을 해소하고 낮은 pH에서도 생존할 수 있는 미생물을 개발하여, 이를 이용한 3-HP를 효과적으로 생산할 수 있는 균주를 개발하였다.
일 측면은 내산성이 증대된 균주를 제공한다. 또 다른 측면은 상기 균주를 이용하여 유기산을 효율적으로 생산할 수 있는 균주를 제공한다. 또 다른 측면은 상기 균주를 이용하여 3-HP를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 측면은 유전자 조작을 통하여 내산성이 증대된 미생물을 제공하는 것이다. 일 구체예는 변이된 RNA 폴리머라제 II 복합체를 코딩하는 유전자를 발현하는 벡터를 이용하여 미생물내에서 발현시키거나, 변이된 RNA 폴리머라제 II 복합체를 코딩하는 유전자를 미생물의 유전체 내에 삽입시켜 발현시키는 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "RNA 폴리머라제 II 복합체"는 DNA를 RNA로 복사하는 기능을 갖는 단백질 복합체를 의미한다. 상기 복합체는 여러 서브유닛 단백질로 구성되어 있다. 구체적으로 RNA 폴리머라제 II 복합체는 RNAP II(RNA polymerase II), TFIID(Transcription factor II D), TFIIB(Transcription factor II B), TFIIF(Transcription factor II F), TFIIE(Transcription factor II E), TFIIH(Transcription factor II H), TBP(TATA-box binding protein) 및 TAF(TBP-associated factor) 을 포함한다.
용어, "변이된 RNA 폴리머라제 II 복합체"는 상기 RNA 폴리머라제 II 복합체를 구성하는 서브유닛 단백질 중 어느 하나가 변형된 것을 의미한다. 여기에서 사용된 “변형”은 서브유닛 단백질을 구성하는 적어도 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환되거나 신규 아미노산이 부가되는 것을 의미한다. 이러한 변형에 의해 폴리머라제 II 복합체의 3차원적 구조가 바뀌게 될 수 있으며, 활성이나 기능이 바뀌는 것을 의미한다. 상기 변형된 RNA 폴리머라제 II 복합체는 복합체를 구성하는 서브유닛을 코딩하는 유전자가 변형되고, 변형된 유전자에 의해 만들어진 서브유닛을 포함하는 복합체일 수 있다. 또한, 상기 변형된 유전자에 의해 세포내에서 서브유닛을 생산할 수 있다. 상기 변형된 유전자에 의해 전사를 조절하는 하위 유전자들 (약 3,000 여개 유전자)의 전사에 변형이 유도되고 이에 따라 단백질 발현에 변화가 유도되어 미생물이 일반적으로 갖지 않는 새로운 형질(Phenotype) 및 기능을 얻게 된다. 예를 들어, 내산성 증대가 포함될 수 있다.
또한, 상기 미생물은 클루베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 내산성이 증대된 클루베로마이세스 마르시아누스는 pH 5.0 이하에서도 생존 및 성장이 가능하며, pH 2.5 이하에서도 생존 및 성장을 할 수 있다.
상기 변이된 RNA 폴리머라제 II 복합체를 코딩하는 유전자는 클루베로마이세스 마르시아누스에서 유래한 유전자 일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 클루베로마이세스 마르시아누스 외에 사카로마이세스 세레비지애의 유전체에서 DNA 서열 및 아미노산 서열이 동일하거나 유사성이 높은 유전자 및 세포 내에서 기능이 동일하거나 유사한 유전자를 탐색, 선정하여 대체 이용할 수 있다.
상기 유전자 변형은 기존에 공지된 돌연변이 방법으로 야기할 수 있다. 이러한 방법에는 유전자의 결실, 삽입, 치환 등이 있다. 또한, 유전자 변형은 실수 유발 PCR(error-prone PCR 또는 ep-PCR 라고도 함)을 통해서 야기할 수 있다. 실수 유발 PCR은 통상의 방법으로 진행할 수 있다. 실수 유발 PCR시 표적 유전자를 둘 이상의 영역으로 나누어 수행할 수 있다. 하나의 영역은 500bp 이하일 수 있으며, 400bp 이하일 수 있다. 또한, 300bp 이하일 수 있으며, 200bp 이하일 수 있다. 또한, 100bp 이하일 수도 있다. 영역의 개수 및 영역의 크기는 유전자의 크기에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 변이된 RNA 폴리머라제 II 복합체는 변이된 TBP인 것일 수 있다. 또한, 변이된 TBP는 서열번호 2 내지 서열번호 4의 아미노산으로 구성된 하나 이상의 변이된 아미노산을 포함하는 TBP일 수 있다.
상기 변이된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 벡터에 삽입되어 균주 내로 도입될 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환된 균주는 상기 변이 단백질을 발현할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 균주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있다. 이러한 벡터를 이용해 상기 유전자는 플라스미드 상태로 상기 변형된 단백질을 생산하거나, 균주의 크로모좀상에 삽입되어 상기 변형된 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 작동가능한 프로모터와 연결될 수 있다.
발현용 벡터로서 작동을 하려면 복제원점, 프로모터, MCS, 선택 마커, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해 주고, 프로모터는 삽입되는 외래 유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 다중 클로닝 사이트로서 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 한다. 선택 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 들어갔는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선택 마커는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 비용의 측면을 고려하여 앰피실린 또는 겐타마이신 내성 유전자가 있다.
또한, 단백질을 발현시키기 위해 사용할 수 있는 프로모터는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터 또는 T7 프로모터 일 수 있다. 이와 같은 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 명세서 사용된 용어, "단백질 발현"은 단백질 또는 효소가 미생물내에 존재하고 활성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 상기 단백질 또는 효소는 미생물내에 존재하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되어 존재할 수 있다. 이때, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 미생물내의 크로모좀에 삽입되어 존재할 수 있으며, 플라스미드 벡터내에 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "형질전환"이란 유전자를 미생물 내에 도입하여 미생물 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주 세포에 도입되어, 미생물에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또 다른 측면은 내산성이 향상된 미생물에 유기산을 생산할 수 있는 유전자를 도입하여, 유기산 또는 그의 염을 효율적을 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.
이때 유기산은 미생물의 대사 과정에서 생산되는 물질일 수 있다. 또한, 미생물에 상기 변이된 RNA 폴리머라제 II 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 외에 유기산의 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 포함될 수 있다. 일 구체예로 락트산(lactic acid), 숙신산(succinic aicd), 말산(malic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP), 4-히드록시부티릭산(4-hydroxybutyric acid), 1,4-부탄디올(1,4-butandiol) 등일 수 있다.
상기 유기산 중 락테이트를 합성하기 위하여 미생물은 락테이트 데히드로게나제를 더 포함할 수 있다. 상기 효소는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 반응을 촉매하는 것이다. 상기 효소는 “lactate dehydrogenase” 또는 “Ldh”라고도 한다. 일 구체예로 상기 Ldh는 EC.1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다.
또한, 상기 유기산 중 3-HP를 생산하기 위하여 다양한 종류의 3-HP 생산 경로가 미생물내로 도입될 수 있다. 상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로는 말로닐-CoA 경로, β-알라닌 경로 및 글리세롤 경로로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 경로일 수 있다.
상기 말로닐-CoA 경로는 글루코오즈로부터 말로닐-CoA를 생산하는 단계를 의미하며, 글루코오즈로부터 말로닐-CoA 생산을 촉매하는 효소가 미생물 내에서 도입되어 발현될 수 있다. 이러한 반응을 촉매하는 효소로는 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드로라아제, 3-히드록시이소부틸레이트 데히드로게나제, 3-히드록시프로피오닐-CoA 히드로라아제, 3-히드록시프로피오닐-CoA 데히드라타아제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 아스파르테이트 데카르복실라제, CoA 트랜스퍼라아제, 말로닐-CoA 리덕타제, PEP 카르복실라제, 3-옥소프로파노에이트: NADP+ 옥시도리덕타아제, 말로네이트 세미알데히드 리덕타아제 및 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제 중 어느 하나 이상이 단독으로 또는 조합되어 이용될 수 있다. 특히, 3-옥소프로파노에이트: NADP+ 옥시도리덕타아제 및 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제를 도입하는 것일 수 있다.
상기 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드로라아제(3-hydroxyisobutryl-CoA hydrolase)는 3-히드록시-2-메틸프로파노일-CoA를 3-히드록시-2-메틸프로파노에이트로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 상기 효소는 EC 3.1.2.4로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 3-히드록시이소부틸레이트 데히드로게나제(3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase)는 3-히드록시-2-메틸프로파노에이트를 2-메틸-3-옥소프로파노에이트로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 상기 효소는 EC 1.1.1.31로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 3-히드록시프로피오닐-CoA 히드롤라아제(3-hydroxypropionyl-CoA hydrolase)은 3-히드록시프로피오닐-CoA를 3-히드록시프로피오네이트로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소로서, EC 3.1.2.로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 3-히드록시프로피오닐-CoA 데히드라타아제(3-hydroxypropionyl-CoA dehydratase)는 3-히드록시프로피오닐-CoA를 아크릴로일-CoA로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 상기 효소는 EC 4.2.1.116으로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 아세틸-CoA 카르복실라아제(acetyl-CoA carboxylase)는 아세틸-CoA를 말노닐-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 상기 효소는 EC 6.4.1.2로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 아스파르테이트 데카르복실라제(aspartate decarboxylase)는 L-아스파르테이트를 베타-알라닌으로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 또한, 상기 효소는 며, EC 4.1.1.11로 분류되는 효소일 수 있다.
CoA 트랜스퍼라아제(CoA transferase)는 아세틸-CoA에서 CoA를 다른 물질로 이동시키는 효소이다. 일 구체예로 상기 CoA 트랜스퍼라아제는 프로피오네이트 CoA 트랜스퍼라제일 수 있으며, 이는 아세틸-CoA를 프로파노에이트에 CoA를 이동시켜, 프로파노일-CoA를 생산하는 반응을 촉매하는 효소이다. 일 구체예로 상기 효소는 EC 2.8.3.1로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 말로닐-CoA 리덕타제(malonyl-CoA reductase)는 말로네이트 세미알데히드를 말로닐-CoA로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 상기 효소는 EC 1.2.1.75로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase) 또는 PEP 카르복실라제는 포스페이트와 옥살로아세테이트를 반응시켜 포스포에놀피루베이트로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 상기 효소는 EC 4.1.1.31로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 3-옥소프로파노에이트: NADP+ 옥시도리덕타아제(“3-oxopropanoate:NADP+ oxidoreductase)는 3-옥소프로파노에이트와 CoA를 반응시켜 아세틸-CoA로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 “말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제”, 또는 “malonate semialdehyde dehydrogenase”라고도 한다. 또한, 상기 효소는 EC 1.2.1.18로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 말로네이트 세미알데히드 리덕타아제(“malonate semialdehyde reductase)는 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제를 말로네이트 세미알데히드로 전환하는 반응을 촉매 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 1.14.1.298로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제(3-hydroxypropionate dehydrogenase)는 3-히드록시프로파노에이트를 3-옥소프로파노에이트로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 1.1.1.59로 분류되는 효소일 수 있다.
또한, 일 구체예에서는 acetyl-coA가 malonyl-coA로 전환되고, malonyl-coA가 malonic semialdehyde로 전환되고, malonic semialdehyde가 3-HP로 전환되는 반응을 촉매하기 위한 경로가 도입될 수 있다. 이때, malonyl-coA를 malonic semialdehyde로 전환하는 반응을 촉매하는 말로닐 CoA 리덕타아제 및 malonic semialdehyde가 3-HP로 전환되는 반응을 촉매하는 말로네이트 세미알데히드 리덕타아제 가 도입될 수 있다.
상기 β-알라닌 경로의 도입은 글루코오즈로부터 β-알라닌을 경유하는 경로 (β-alanine pathway)를 도입하기 위한 것이다. β-알라닌 경로는 산화/환원 관계는 중립이나, ATP는 얻지 못한다는 점이 알려져 있었다. β-알라닌 경로를 도입하기 위하여, 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나아제, 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 데카르복실라제, 글루타메이트 데히드로게나제, OS17 효소, 피루베이트 카르복실라제, 베타-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 및 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제 중 어느 하나 이상을 도입하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제 를 도입하는 것일 수 있다.
상기 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나아제(3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase)는 3-히드록시-2-메틸프로파노에이트를 2-메틸-3-옥소프로파노에이트로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 1.1.1.31로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제(4-Aminobutyrate aminotransferase)는 4-아미노부타노에이트와 2-옥소글루타레이트를 반응시켜 숙시네이트 세미알데히드 및 L-글루타메이트로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 2.6.1.19로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 아세틸-CoA 카르복실라제(Acetyl-CoA carboxylase)는 아세틸-CoA와 HCO3을 반응시켜 포스페이트 및 말로닐-CoA로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 6.4.1.2로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(Aspartate aminotransferase)는 L-아스파르테이트와 2-옥소글루타레이트를 반응시켜 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트로 전환시키는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 2.6.1.1로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 아스파르테이트 데카르복실라제(Aspartate decarboxylase)는 L-아스파르테이트를 베타-알라닌으로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 4.1.1.11로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 글루타메이트 데히드로게나제(Glutamate dehydrogenase)는 L-글루타메이트와 NAD+를 반응시켜 옥소글루타레이트 및 NADH로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 1.4.1.2로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 OS17 효소(OS17 enzyme)는 프로파노에이트와 CoA를 반응시켜, 디포스페이트 및 프로파노일-CoA로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 “프로피오네이트-CoA 리가제” 또는 “propionate-CoA ligase”라고도 한다. 또한, 상기 효소는 EC 6.2.1.17로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 피루베이트 카르복실라제 (Pyruvate carboxylase)는 피루베이트와 HCO3를 반응시켜, 포스페이트와 옥살로아세테이로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 6.4.1.1로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 베타-알라닐-CoA 암모니아 리아제 (β-alanyl-CoA ammonia lyase)는 베타-알라닐-CoA를 아크릴로일-CoA로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 또한, 상기 효소는 EC 4.3.1.6로 분류되는 효소일 수 있다.
3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제 (3-hydroxypropionate dehydrogenase)는 3-히드록시프로파노에이트와 NAD+를 반응시켜, 3-옥소프로파노에이트 및 NADH를 생산하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 1.1.1.59로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 글리세롤 경로는 글루코오즈를 탄소원으로 활용하는 경우로서, 3-히드록시프로피온알데히드 (3-Hydroxypropionaldehyde) 경유하며, 기질로부터 산물까지의 직접적인 직선 경로임이 알려져 있다. 글리세롤 경로를 도입하기 위하여는 글리세롤 데히드라타아제 및 알데히드 데히드로게나아제 를 도입하는 것일 수 있다.
상기 글리세롤 데히드라타아제 (glycerol dehydratase)는 글리세롤을 3-히드록시프로파날로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 4.2.1.30로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 알데히드 데히드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase)는 알데히드와 NAD를 반응시켜, 카르복실레이트와 NADH로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 EC 1.2.1.3으로 분류되는 효소일 수 있다.
또 다른 측면은 유기산을 생산할 수 있는 내산성이 향상된 미생물을 이용하여 유기산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예는 상기 내산성이 향상되고, 유기산을 생산할 수 있도록 유전자가 도입된 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 특정 대사산물을 회수하는 단계를 포함하는 유기산을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 유기산은 구체예로 락트산(lactic acid), 숙신산(succinic aicd), 말산(malic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 4-히드록시부티릭산(4-hydroxybutyric acid), 1,4-부탄디올(1,4-butandiol) 등일 수 있다. 일 구체예에서는 상기 유기산은 3-HP 일 수 있다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 미생물은 클루베로마이세스 마르시아누스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어, "대사산물"은 미생물의 대사반응에 의해 생성되는 모든 물질들을 의미한다. 상기 대사산물은 미생물의 대사반응의 중간 생성물일 수도 있고, 미생물의 대사반응의 최종 생성물일 수도 있다. 이러한 대사 산물의 예로는 숙신산, 젖산, 3-HP 등이 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 또는 혐기 조건일 수 있다. 본 명세서 사용된 용어, "혐기 조건"은 정상 대기상태보다 산소의 함량이 적은 상태를 의미한다. 상기 혐기 조건은 배양하는 곳의 공기중의 산소가 21% 보다 적게 포함된 상태를 나타낼 수 있다. 또한, 혐기 조건하의 산소는 대기중에 비하여 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 일 수 있다. 또한, 혐기 조건의 배지내의 용존 산소량(dissolved oxygen)은 정상 대기중의 용존 산소량보다 낮다. 혐기 조건의 배지내 용존 산소량은 10 ppm 이하일 수 있으며, 8 ppm 이하, 5 ppm 이하, 3 ppm 이하 또는 2 ppm 이하일 수 있다. 또는 용존 산소량은 0.1 ppm 내지 1 ppm 일 수 있다. 일 구체예로 혐기성 조건은 이산화탄소 또는 질소를 약 0.1 내지 0.4 vvm (Volume per Volume per minute), 약 0.2 내지 0.3 vvm, 또는 약 0.25 vvm의 유속으로 공급하여 조성될 수 있다. 또한, 혐기성 조건은 통기 속도가 약 0 내지 0.4 vvm, 약 0.1 내지 0.3 vvm, 약 0.15 내지 0.25 vvm인 것일 수 있다.
일 구체예에서는 클루베로마이세스 마르시아누스를 다양한 산업적 목적을 위한 세포공장으로 활용하기 위해, 클루베로마이세스 마르시아누스내 유전자 발현을 총체적으로 재구성하여 세포 기능 향상 및 신기능을 부여한 형질전환 균주를 개발하였다. 특히, 이러한 균주를 통하여 내산성이 높은 클루베로마이세스 마르시아누스 균주를 개발하였다. 이는 산업용 플랫폼 케미컬인 3-HP 및 다양한 유용 유기산을　고농도로 생산하기 위한 최적화 균주로 산업적 활용이 가능하다.
도 1은 전사기구 유전자를 변형하여 균주의 표현형을 변형하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 전사인자를 코딩하는 유전자 중　TBP를 실수 유발 PCR로 변이 라이브러리 제작하는 방법을 나타낸 것이다. 702bp TBP 유전자를 175bp 또는 176bp 영역으로 나누어 실수 유발 PCR을 수행하는 것을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실시예 1. 전사기구( TBP ) 변이 라이브러리 제작
전사기구에서 돌연변이를 유발하기 위하여, 전사기구에 관련된 유전자를 선별하였다. 전사기구에 관련된 효소 중　RNAP II 복합체(RNA polymerase II complex)를 선정하였다. RNAP II 복합체에는 RNAP II, TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH, TBP, TAF 등이 포함되어 있다. 이 중 TATA box binding protein인 TBP 유전자를 선정하였다.
TBP 유전자 전체에 다양한 유전자 변이를 고르게 유도하기 위해 TBP 유전자(702 bp)를 약 175bp길이의 4개의 영역(domain)으로 나누어 각각의 영역을 실수 유발 PCR(error-prone PCR, ep-PCR)로 변이를 유도한 후, 이를 재차 실수 유발 PCR로 연결하여 최종 TBP 변이 라이브러리를 완성하였다(103　개 이상)(도 1). TBP 전체 유전자의 175 bp 길이로 구성된 각 4개의 영역(D1~D4)은 다음의 4쌍의 프라이머를 이용하여 클루베로마이세스 마르시아누스의 Genomic DNA를 template로 이용하여 GenemorphII Random Mutagenesis kit(Stratagene)을 이용하여 절편 돌연변이유발(Fragment mutagenesis)을 수행하였다.
TBP 유전자 돌연변이를 수행하기 위한 프라이머 세트
명칭 서열 서열번호
TBP D1 F XbaI 5'- GCTCTAGA ATGTCTGAAGATGATAGAAT-3' 서열번호 7
TBP D1 R 5'- TAGGTATGATTCCCGATGTA-3' 서열번호 8
TBP D2 F 5'- TACATCGGGAATCATACCTACTCTACAGAATATTGTTGCG -3' 서열번호 9
TBP D2 R 5'- GTAACAACCATCTTACCAGA-3' 서열번호 10
TBP D3 F 5'- TCTGGTAAGATGGTTGTTACGGGTGCTAAAAGTGAAGATG-3' 서열번호 11
TBP D3 R 5'- GAAAGTACCGTGACTAAATG-3' 서열번호 12
TBP D4 F 5'- CATTTAGTCACGGTACTTTCTCGTCATATGAACCAGAACT-3' 서열번호 13
TBP D4 R SmaI 5'- TCCCCCGGG TCATTATAATTTTCTGAATT -3' 서열번호 14
상기 키트의 프로토콜에 따라 낮은 빈도(0 ~ 4.5 mutations/kb), 중간 빈도(4.5 ~ 9 mutations/kb) 및 높은 빈도(9-16 mutations/kb)로 돌연변이된 절편을 수득하였다.
상기 절편 D1과 D2를 template으로 이용하고, 상기의 TBP D1 F XbaI과 TBP D2 R 프라이머를 이용하여 GenemorphII Random Mutagenesis kit(Stratagene)로 절편 돌연변이 유발(Fragment mutagenesis)을 수행하여 D1과 D2가 하나의 영역으로 연결된 2차 돌연변이 절편(D1/2)을 수득하였다. 또한, 상기 절편 D3와 D4를 template으로 이용하고, 상기의 TBP D3 F와 TBP D4 R SmaI 프라이머를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 절편 돌연변이 유발을 수행하여 D3와 D4가 하나의 영역으로 연결된 2차 돌연변이 절편(D3/4)을 수득하였다. 마지막으로 상기 절편 D1/2와 D3/4를 template으로 이용하고, 상기의 TBP D1 F XbaI과 TBP D4 R SmaI 프라이머를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 절편 돌연변이 유발을 수행하여 4가지 영역이 모두 연결된 3차 돌연변이 TBP 전체 유전자 단편을 수득하였다. 이와 같이 수득된 돌연변이 TBP 유전자 단편을 제한효소 XbaI과 SmaI으로 절단하고 이를 XbaI과 SmaI으로 절단한 pJSKM316-GPD 벡터에 (Appl Microbiol Biotechnol. 2013 Mar;97(5):2029-41. Characterization of Saccharomyces cerevisiae promoters for heterologous gene expression in Kluyveromyces marxianus) 도입하여 최종 TBP 변이 라이브러리를 완성하였다(103　개 이상).
상기 플라스미드 라이브러리를 E. coli DH5α에 도입하였다. 그 후 형질전환된 균주를 100 ug/ml 암피실린을 포함한 LB-아가 플레이트에서 도말하여 배양하였다. 전체 라이브러리 사이즈는 약 105 정도로 일 것으로 추정하였다. 배양한 E. coli 콜로니를 플레이트에서 피킹하고, plasmid MiniPrep Spin Kit으로 플라스미드를 수득하였다. 그 후 수득한 플라스미드를 효모(yeast)에 도입하였다.
또한 이와 같이 제작된 TBP 라이브러리의 유전자 변이수를 분석한 결과, 영역으로 나누지 않고 실수 유발 PCR로 변이를 유도하는 기공지된 일반적인 방법에 비해 약 2배 가량 변이가 많이 유도된 것을 확인하였다 (표 2).　
TBP 돌연변이 비율
TBP mutagenesis rate 기 공지 방법 영역별 mutagenesis(일 구체예)
High(16 bp/kb) 10~22 bp 11 bp
Low(9 bp/kb) 24 bp 4.2 bp
실시예 2. TBP 변이 라이브러리를 이용한 내산성 클루베로마이세스 마르시아누스 균주 개발
변이가 유도되지 않은 야생형 TBP 유전자의 도입에 의한 야생형 클루베로마이세스 마르시아누스 균주의 내산성 유도 여부를 확인하기 위하여 야생형 TBP 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하여 클루베로마이세스 마르시아누스 균주 내로 도입하였다. 야생형 TBP 유전자를 포함하는 플라스미드는 클루베로마이세스 마르시아누스의 Genomic DNA를 template로 이용하여 프라이머 TBP D1 F XbaI과 TBP D4 R SmaI으로 PCR하여 전체 유전자 단편을 수득하였다. 이와 같이 수득된 야생형 TBP 유전자 단편을 제한효소 XbaI과 SmaI으로 절단하고 이를 XbaI과 SmaI으로 절단한 상기 pJSKM316-GPD 벡터에 도입하여 제작하였다. 이와 같이 제작된 야생형 TBP 유전자를 포함하는 플라스미드를 클루베로마이세스 마르시아누스 균주 내로 도입하여 정상적인 성장 조건인 pH 7과 클루베로마이세스 마르시아누스 균주가 성장하지 못하는 pH 2.5의 조건에서 생존 및 성장 여부를 확인하였다.
변이를 유발하지 않은 야생형 TBP 유전자가 도입된 야생형 클루베로마이세스 마르시아누스 균주의 경우, pH 7에서는 상기의 클루베로마이세스 마르시아누스 균주가 정상적으로 생존 및 성장하지만, pH 2.5의 조건에서는 콜로니를 거의 형성하지 못하며 생존하지 못하는 것은 확인하였다 (표 3). 따라서 이후, TBP 변이 라이브러리를 이용하여 내산성 클루베로마이세스 마르시아누스 균주의 선별은 pH 2.5의 조건에서　수행하였다.
야생형 TBP 유전자에 의한 클루베로마이세스 마르시아누스 균주의 내산성
pH 7 pH 2.5
콜로니 수 207 7
상기 실시예 1의 방법으로 제작된 TBP 변이 라이브러리를 클루베로마이세스 마르시아누스 균주 내로 도입하여 야생형 TBP 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 클루베로마이세스 마르시아누스 균주가 전혀 생존하지 못하는 pH 2.5의 조건에서 생존 및 성장하는 클루베로마이세스 마르시아누스 균주를 선별하였다(표 4).
TBP 변리 라이브러리에 의한 클루베로마이세스 마르시아누스 균주의 내산성 (콜로니 형성 수)
야생형 TBP TBP 변리 라이브러리
pH 5.4 201 365
pH 2.5 0 257
상기에서와 같이, TBP 변이 라이브러리를 이용하여 제조한 내산성 클루베로마이세스 마르시아누스 균주의 경우, pH 5.4에서는 변이된 TBP 유전자를 포함한 클루베로마이세스 마르시아누스 모두 잘 자람을 확인할 수 있었다. pH 2.5에서는 대조군인 야생형 클루베로마이세스 마르시아누스는 콜로니를 형성하지 않으나, 변이된 TBP 유전자를 갖는 균주는 pH 5.4에서와 동일하게 성장하여 많은 콜로니를 형성하는 것을 확인하였다.이때, 낮은 pH 조건하에도 잘 생존 및 성장하는 형질전환된 클루베로마이세스 마르시아누스 균주를 선별하여 TBP의 돌연변이 부위를 단백질 서열을 통해 확인하였다. (서열번호 2 내지 4).
TBP15 (wild-type amino acids sequence): 서열번호 1
MSEDDRMKQFQQENKIVFDPSTRSVWESQEKREHESLPGTDANGDEGEKGSATSGIIPTL
QNIVATVNLDCRLDLKTVALHARNAEYNPKRFAAVIMRIREPKTTALIFASGKMVVTGAK
SEDDSKLASRKYARIIQKIGFSAKFTDFKIQNIVGSCDVKFPIRLEGLAFSHGTFSSYEP
ELFPGLIYRMVKPKIVLLIFVSGKIVLTGAKQREEIYQAFEAIYPVLSEFRKL
TBP15-M1 (Mutated amini acids sequence): 서열번호 2
MSEDDRMKQF L QENKIVFDPSTRSVW G SQEKREHESL Q GTDAN A DEGEKGSATSGIIPTL
QNIVATVNLDCRLDLKTVALHARNAEYNP E RFAAVIMRIREPKTTALIFASGKMVVTGAK
SEDDSKLASRKYARIIQKIGFSAKFTDFKIQNIVGSCDVKFPIRLEGLAFSHGTFSSYEP
ELFPGLIYRMVKPKIVLLIFVSGK T VLTGAKQREEI H QAFEAIYPVLSEFRKL
TBP15-M2 (Mutated amini acids sequence): 서열번호 3:
MSEDDRMKQFQQENKIVFDPSTRSVWE G QE R REHESLPGTDAN A DEGEKGSATSGIIPTL
QNIVATVNLDCRLDLKTVALHARN S EYNPKRFAAVIMRI S EPKTTALIFASGKMVVTGAK
SEDDSKLA C RKYARIIQKIGFSAKFTDFKIQ D IVGSCDVKFPIRLEGLAFSHGTFSS C EP
ELFPGLIYRMVKPKIVLLIF D SGKIVLTGAKQREEIYQAFEAIYPVLSEFRKL
TBP15-M3 (Mutated amini acids sequence): 서열번호 4:
MSEDDRMKQFQQENKIVFDPSTRSVWESQEKREHESLPGTDAN A DEGEKGSATSGIIPTL
QNIVATVNLDCRLDLKTVALHARNAEYNPKRFAAV V MRIREPKTTALIFASGKMVVTGAK
SEDDS E LASRKYARIIQKIGFSAKFTDFKIQNIVGSCDVKFPIRLEGLAFSHGTFSSYEP
EL I PGLIYRMVKPKIVLLIFVSGKIVLT E AKQREEIYQAFEAIYPVL C EFRKL
실시예 3. 효소 도입을 통한 3- HP 생산 균주 제작 및 3- HP 생산량 확인
상기에서 서열번호 2 내지 4를 포함하는 클루베로마이세스 마르시아누스를 선별하였다. 선별된 균주를 이용하여 3-HP를 생산하는데 미치는 영향을 확인하기 위하여 3-HP 생산에 필요한 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 균주에 도입한다. 이때 3-HP 생산에 필요한 효소는 malonyl-coA를 malonic semialdehyde로 전환하는 반응을 촉매하는 malonyl coA reductase(EC 1.2.1.75) 및 malonic semialdehyde가 3-HP로 전환되는 반응을 촉매하는 malonate semialdehyde reductase (EC 1.14.1.298)이다. 이때, malonyl coA reductase는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 효소이고, malonate semialdehyde reductase는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 효소이다. 상기 단백질을 코딩하는 효소는 벡터를 통해 균주에 도입한다. 상기 단백질의 발현을 위하여 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 클루베로마이세스에서 발현을 위하여 pKDU7 벡터에 도입한다(Danguole Bartkeviciute et al., Enzyme and Microbial Technology 26, 2000, 653-656). 이렇게 생산된 균주는, 야생형 TBP가 도입된 균주에 malonyl coA reductase 및 malonate semialdehyde reductase를 도입한 균주에 비하여 pH 4.0 이하의 조건에서도 3-HP를 지속적으로 생산함을 확인한다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Acid resistant increased Kluyveromyces marxianus expressing reprogrammed gene by transcriptional engineering <130> PN097849 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP15 (wild-type amino acids sequence) <400> 1 Met Ser Glu Asp Asp Arg Met Lys Gln Phe Gln Gln Glu Asn Lys Ile 1 5 10 15 Val Phe Asp Pro Ser Thr Arg Ser Val Trp Glu Ser Gln Glu Lys Arg 20 25 30 Glu His Glu Ser Leu Pro Gly Thr Asp Ala Asn Gly Asp Glu Gly Glu 35 40 45 Lys Gly Ser Ala Thr Ser Gly Ile Ile Pro Thr Leu Gln Asn Ile Val 50 55 60 Ala Thr Val Asn Leu Asp Cys Arg Leu Asp Leu Lys Thr Val Ala Leu 65 70 75 80 His Ala Arg Asn Ala Glu Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile 85 90 95 Met Arg Ile Arg Glu Pro Lys Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ala Ser Gly 100 105 110 Lys Met Val Val Thr Gly Ala Lys Ser Glu Asp Asp Ser Lys Leu Ala 115 120 125 Ser Arg Lys Tyr Ala Arg Ile Ile Gln Lys Ile Gly Phe Ser Ala Lys 130 135 140 Phe Thr Asp Phe Lys Ile Gln Asn Ile Val Gly Ser Cys Asp Val Lys 145 150 155 160 Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly Leu Ala Phe Ser His Gly Thr Phe Ser 165 170 175 Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Val Lys 180 185 190 Pro Lys Ile Val Leu Leu Ile Phe Val Ser Gly Lys Ile Val Leu Thr 195 200 205 Gly Ala Lys Gln Arg Glu Glu Ile Tyr Gln Ala Phe Glu Ala Ile Tyr 210 215 220 Pro Val Leu Ser Glu Phe Arg Lys Leu 225 230 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP15-M1 (Mutated amini acids sequence) <400> 2 Met Ser Glu Asp Asp Arg Met Lys Gln Phe Leu Gln Glu Asn Lys Ile 1 5 10 15 Val Phe Asp Pro Ser Thr Arg Ser Val Trp Gly Ser Gln Glu Lys Arg 20 25 30 Glu His Glu Ser Leu Gln Gly Thr Asp Ala Asn Ala Asp Glu Gly Glu 35 40 45 Lys Gly Ser Ala Thr Ser Gly Ile Ile Pro Thr Leu Gln Asn Ile Val 50 55 60 Ala Thr Val Asn Leu Asp Cys Arg Leu Asp Leu Lys Thr Val Ala Leu 65 70 75 80 His Ala Arg Asn Ala Glu Tyr Asn Pro Glu Arg Phe Ala Ala Val Ile 85 90 95 Met Arg Ile Arg Glu Pro Lys Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ala Ser Gly 100 105 110 Lys Met Val Val Thr Gly Ala Lys Ser Glu Asp Asp Ser Lys Leu Ala 115 120 125 Ser Arg Lys Tyr Ala Arg Ile Ile Gln Lys Ile Gly Phe Ser Ala Lys 130 135 140 Phe Thr Asp Phe Lys Ile Gln Asn Ile Val Gly Ser Cys Asp Val Lys 145 150 155 160 Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly Leu Ala Phe Ser His Gly Thr Phe Ser 165 170 175 Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Val Lys 180 185 190 Pro Lys Ile Val Leu Leu Ile Phe Val Ser Gly Lys Thr Val Leu Thr 195 200 205 Gly Ala Lys Gln Arg Glu Glu Ile His Gln Ala Phe Glu Ala Ile Tyr 210 215 220 Pro Val Leu Ser Glu Phe Arg Lys Leu 225 230 <210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP15-M2 (Mutated amini acids sequence) <400> 3 Met Ser Glu Asp Asp Arg Met Lys Gln Phe Gln Gln Glu Asn Lys Ile 1 5 10 15 Val Phe Asp Pro Ser Thr Arg Ser Val Trp Glu Gly Gln Glu Arg Arg 20 25 30 Glu His Glu Ser Leu Pro Gly Thr Asp Ala Asn Ala Asp Glu Gly Glu 35 40 45 Lys Gly Ser Ala Thr Ser Gly Ile Ile Pro Thr Leu Gln Asn Ile Val 50 55 60 Ala Thr Val Asn Leu Asp Cys Arg Leu Asp Leu Lys Thr Val Ala Leu 65 70 75 80 His Ala Arg Asn Ser Glu Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile 85 90 95 Met Arg Ile Ser Glu Pro Lys Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ala Ser Gly 100 105 110 Lys Met Val Val Thr Gly Ala Lys Ser Glu Asp Asp Ser Lys Leu Ala 115 120 125 Cys Arg Lys Tyr Ala Arg Ile Ile Gln Lys Ile Gly Phe Ser Ala Lys 130 135 140 Phe Thr Asp Phe Lys Ile Gln Asp Ile Val Gly Ser Cys Asp Val Lys 145 150 155 160 Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly Leu Ala Phe Ser His Gly Thr Phe Ser 165 170 175 Ser Cys Glu Pro Glu Leu Phe Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Val Lys 180 185 190 Pro Lys Ile Val Leu Leu Ile Phe Asp Ser Gly Lys Ile Val Leu Thr 195 200 205 Gly Ala Lys Gln Arg Glu Glu Ile Tyr Gln Ala Phe Glu Ala Ile Tyr 210 215 220 Pro Val Leu Ser Glu Phe Arg Lys Leu 225 230 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP15-M3 (Mutated amini acids sequence) <400> 4 Met Ser Glu Asp Asp Arg Met Lys Gln Phe Gln Gln Glu Asn Lys Ile 1 5 10 15 Val Phe Asp Pro Ser Thr Arg Ser Val Trp Glu Ser Gln Glu Lys Arg 20 25 30 Glu His Glu Ser Leu Pro Gly Thr Asp Ala Asn Ala Asp Glu Gly Glu 35 40 45 Lys Gly Ser Ala Thr Ser Gly Ile Ile Pro Thr Leu Gln Asn Ile Val 50 55 60 Ala Thr Val Asn Leu Asp Cys Arg Leu Asp Leu Lys Thr Val Ala Leu 65 70 75 80 His Ala Arg Asn Ala Glu Tyr Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Val 85 90 95 Met Arg Ile Arg Glu Pro Lys Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ala Ser Gly 100 105 110 Lys Met Val Val Thr Gly Ala Lys Ser Glu Asp Asp Ser Glu Leu Ala 115 120 125 Ser Arg Lys Tyr Ala Arg Ile Ile Gln Lys Ile Gly Phe Ser Ala Lys 130 135 140 Phe Thr Asp Phe Lys Ile Gln Asn Ile Val Gly Ser Cys Asp Val Lys 145 150 155 160 Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly Leu Ala Phe Ser His Gly Thr Phe Ser 165 170 175 Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Ile Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Val Lys 180 185 190 Pro Lys Ile Val Leu Leu Ile Phe Val Ser Gly Lys Ile Val Leu Thr 195 200 205 Glu Ala Lys Gln Arg Glu Glu Ile Tyr Gln Ala Phe Glu Ala Ile Tyr 210 215 220 Pro Val Leu Cys Glu Phe Arg Lys Leu 225 230 <210> 5 <211> 1220 <212> PRT <213> Chloroflexus aurantiacus <400> 5 Met Ser Gly Thr Gly Arg Leu Ala Gly Lys Ile Ala Leu Ile Thr Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Asn Ile Gly Ser Glu Leu Thr Arg Arg Phe Leu Ala Glu 20 25 30 Gly Ala Thr Val Ile Ile Ser Gly Arg Asn Arg Ala Lys Leu Thr Ala 35 40 45 Leu Ala Glu Arg Met Gln Ala Glu Ala Gly Val Pro Ala Lys Arg Ile 50 55 60 Asp Leu Glu Val Met Asp Gly Ser Asp Pro Val Ala Val Arg Ala Gly 65 70 75 80 Ile Glu Ala Ile Val Ala Arg His Gly Gln Ile Asp Ile Leu Val Asn 85 90 95 Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ala Gln Arg Arg Leu Ala Glu Ile Pro Leu 100 105 110 Thr Glu Ala Glu Leu Gly Pro Gly Ala Glu Glu Thr Leu His Ala Ser 115 120 125 Ile Ala Asn Leu Leu Gly Met Gly Trp His Leu Met Arg Ile Ala Ala 130 135 140 Pro His Met Pro Val Gly Ser Ala Val Ile Asn Val Ser Thr Ile Phe 145 150 155 160 Ser Arg Ala Glu Tyr Tyr Gly Arg Ile Pro Tyr Val Thr Pro Lys Ala 165 170 175 Ala Leu Asn Ala Leu Ser Gln Leu Ala Ala Arg Glu Leu Gly Ala Arg 180 185 190 Gly Ile Arg Val Asn Thr Ile Phe Pro Gly Pro Ile Glu Ser Asp Arg 195 200 205 Ile Arg Thr Val Phe Gln Arg Met Asp Gln Leu Lys Gly Arg Pro Glu 210 215 220 Gly Asp Thr Ala His His Phe Leu Asn Thr Met Arg Leu Cys Arg Ala 225 230 235 240 Asn Asp Gln Gly Ala Leu Glu Arg Arg Phe Pro Ser Val Gly Asp Val 245 250 255 Ala Asp Ala Ala Val Phe Leu Ala Ser Ala Glu Ser Ala Ala Leu Ser 260 265 270 Gly Glu Thr Ile Glu Val Thr His Gly Met Glu Leu Pro Ala Cys Ser 275 280 285 Glu Thr Ser Leu Leu Ala Arg Thr Asp Leu Arg Thr Ile Asp Ala Ser 290 295 300 Gly Arg Thr Thr Leu Ile Cys Ala Gly Asp Gln Ile Glu Glu Val Met 305 310 315 320 Ala Leu Thr Gly Met Leu Arg Thr Cys Gly Ser Glu Val Ile Ile Gly 325 330 335 Phe Arg Ser Ala Ala Ala Leu Ala Gln Phe Glu Gln Ala Val Asn Glu 340 345 350 Ser Arg Arg Leu Ala Gly Ala Asp Phe Thr Pro Pro Ile Ala Leu Pro 355 360 365 Leu Asp Pro Arg Asp Pro Ala Thr Ile Asp Ala Val Phe Asp Trp Gly 370 375 380 Ala Gly Glu Asn Thr Gly Gly Ile His Ala Ala Val Ile Leu Pro Ala 385 390 395 400 Thr Ser His Glu Pro Ala Pro Cys Val Ile Glu Val Asp Asp Glu Arg 405 410 415 Val Leu Asn Phe Leu Ala Asp Glu Ile Thr Gly Thr Ile Val Ile Ala 420 425 430 Ser Arg Leu Ala Arg Tyr Trp Gln Ser Gln Arg Leu Thr Pro Gly Ala 435 440 445 Arg Ala Arg Gly Pro Arg Val Ile Phe Leu Ser Asn Gly Ala Asp Gln 450 455 460 Asn Gly Asn Val Tyr Gly Arg Ile Gln Ser Ala Ala Ile Gly Gln Leu 465 470 475 480 Ile Arg Val Trp Arg His Glu Ala Glu Leu Asp Tyr Gln Arg Ala Ser 485 490 495 Ala Ala Gly Asp His Val Leu Pro Pro Val Trp Ala Asn Gln Ile Val 500 505 510 Arg Phe Ala Asn Arg Ser Leu Glu Gly Leu Glu Phe Ala Cys Ala Trp 515 520 525 Thr Ala Gln Leu Leu His Ser Gln Arg His Ile Asn Glu Ile Thr Leu 530 535 540 Asn Ile Pro Ala Asn Ile Ser Ala Thr Thr Gly Ala Arg Ser Ala Ser 545 550 555 560 Val Gly Trp Ala Glu Ser Leu Ile Gly Leu His Leu Gly Lys Val Ala 565 570 575 Leu Ile Thr Gly Gly Ser Ala Gly Ile Gly Gly Gln Ile Gly Arg Leu 580 585 590 Leu Ala Leu Ser Gly Ala Arg Val Met Leu Ala Ala Arg Asp Arg His 595 600 605 Lys Leu Glu Gln Met Gln Ala Met Ile Gln Ser Glu Leu Ala Glu Val 610 615 620 Gly Tyr Thr Asp Val Glu Asp Arg Val His Ile Ala Pro Gly Cys Asp 625 630 635 640 Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Ala Asp Leu Val Glu Arg Thr Leu Ser 645 650 655 Ala Phe Gly Thr Val Asp Tyr Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Ala Gly 660 665 670 Val Glu Glu Met Val Ile Asp Met Pro Val Glu Gly Trp Arg His Thr 675 680 685 Leu Phe Ala Asn Leu Ile Ser Asn Tyr Ser Leu Met Arg Lys Leu Ala 690 695 700 Pro Leu Met Lys Lys Gln Gly Ser Gly Tyr Ile Leu Asn Val Ser Ser 705 710 715 720 Tyr Phe Gly Gly Glu Lys Asp Ala Ala Ile Pro Tyr Pro Asn Arg Ala 725 730 735 Asp Tyr Ala Val Ser Lys Ala Gly Gln Arg Ala Met Ala Glu Val Phe 740 745 750 Ala Arg Phe Leu Gly Pro Glu Ile Gln Ile Asn Ala Ile Ala Pro Gly 755 760 765 Pro Val Glu Gly Asp Arg Leu Arg Gly Thr Gly Glu Arg Pro Gly Leu 770 775 780 Phe Ala Arg Arg Ala Arg Leu Ile Leu Glu Asn Lys Arg Leu Asn Glu 785 790 795 800 Leu His Ala Ala Leu Ile Ala Ala Ala Arg Thr Asp Glu Arg Ser Met 805 810 815 His Glu Leu Val Glu Leu Leu Leu Pro Asn Asp Val Ala Ala Leu Glu 820 825 830 Gln Asn Pro Ala Ala Pro Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Phe 835 840 845 Arg Ser Glu Gly Asp Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Leu Leu Asn 850 855 860 Arg Ser Ile Ala Ala Lys Leu Leu Ala Arg Leu His Asn Gly Gly Tyr 865 870 875 880 Val Leu Pro Ala Asp Ile Phe Ala Asn Leu Pro Asn Pro Pro Asp Pro 885 890 895 Phe Phe Thr Arg Ala Gln Ile Asp Arg Glu Ala Arg Lys Val Arg Asp 900 905 910 Gly Ile Met Gly Met Leu Tyr Leu Gln Arg Met Pro Thr Glu Phe Asp 915 920 925 Val Ala Met Ala Thr Val Tyr Tyr Leu Ala Asp Arg Asn Val Ser Gly 930 935 940 Glu Thr Phe His Pro Ser Gly Gly Leu Arg Tyr Glu Arg Thr Pro Thr 945 950 955 960 Gly Gly Glu Leu Phe Gly Leu Pro Ser Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu 965 970 975 Val Gly Ser Thr Val Tyr Leu Ile Gly Glu His Leu Thr Glu His Leu 980 985 990 Asn Leu Leu Ala Arg Ala Tyr Leu Glu Arg Tyr Gly Ala Arg Gln Val 995 1000 1005 Val Met Ile Val Glu Thr Glu Thr Gly Ala Glu Thr Met Arg Arg Leu 1010 1015 1020 Leu His Asp His Val Glu Ala Gly Arg Leu Met Thr Ile Val Ala Gly 1025 1030 1035 1040 Asp Gln Ile Glu Ala Ala Ile Asp Gln Ala Ile Thr Arg Tyr Gly Arg 1045 1050 1055 Pro Gly Pro Val Val Cys Thr Pro Phe Arg Pro Leu Pro Thr Val Pro 1060 1065 1070 Leu Val Gly Arg Lys Asp Ser Asp Trp Ser Thr Val Leu Ser Glu Ala 1075 1080 1085 Glu Phe Ala Glu Leu Cys Glu His Gln Leu Thr His His Phe Arg Val 1090 1095 1100 Ala Arg Lys Ile Ala Leu Ser Asp Gly Ala Ser Leu Ala Leu Val Thr 1105 1110 1115 1120 Pro Glu Thr Thr Ala Thr Ser Thr Thr Glu Gln Phe Ala Leu Ala Asn 1125 1130 1135 Phe Ile Lys Thr Thr Leu His Ala Phe Thr Ala Thr Ile Gly Val Glu 1140 1145 1150 Ser Glu Arg Thr Ala Gln Arg Ile Leu Ile Asn Gln Val Asp Leu Thr 1155 1160 1165 Arg Arg Ala Arg Ala Glu Glu Pro Arg Asp Pro His Glu Arg Gln Gln 1170 1175 1180 Glu Leu Glu Arg Phe Ile Glu Ala Val Leu Leu Val Thr Ala Pro Leu 1185 1190 1195 1200 Pro Pro Glu Ala Asp Thr Arg Tyr Ala Gly Arg Ile His Arg Gly Arg 1205 1210 1215 Ala Ile Thr Val 1220 <210> 6 <211> 263 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Arg Asn Ser Glu Met Ile Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Ala Gly 1 5 10 15 Phe Gly Glu Ser Ile Thr Arg Arg Phe Ile Gln Gln Gly Asn Lys Val 20 25 30 Ile Ala Thr Gly Arg Arg Gln Glu Arg Gly Gly Gly Trp Lys Lys Lys 35 40 45 Lys Glu Arg Leu Gln Glu Leu Lys Asp Glu Leu Gly Asp Asn Leu Tyr 50 55 60 Ile Ala Gln Leu Asp Val Arg Asn Arg Ala Ala Ile Glu Glu Met Leu 65 70 75 80 Ala Ser Leu Pro Ala Glu Trp Ser Asn Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn 85 90 95 Ala Gly Leu Ala Leu Gly Met Glu Pro Ala His Lys Ala Ser Val Glu 100 105 110 Asp Trp Glu Thr Met Ile Asp Thr Asn Asn Lys Gly Leu Val Tyr Met 115 120 125 Thr Arg Ala Val Leu Pro Gly Met Val Glu Arg Asn His Gly His Ile 130 135 140 Ile Asn Ile Gly Ser Thr Ala Gly Ser Trp Pro Tyr Ala Gly Gly Asn 145 150 155 160 Val Tyr Gly Ala Thr Lys Ala Phe Val Arg Gln Phe Ser Leu Asn Leu 165 170 175 Arg Thr Asp Leu His Gly Thr Ala Val Arg Val Thr Asp Ile Glu Pro 180 185 190 Gly Leu Val Gly Gly Thr Glu Phe Ser Asn Val Arg Phe Lys Gly Asp 195 200 205 Asp Gly Lys Ala Glu Lys Thr Tyr Gln Asn Thr Val Ala Leu Thr Pro 210 215 220 Glu Asp Val Ser Glu Ala Val Trp Trp Val Ser Thr Leu Pro Ala His 225 230 235 240 Val Asn Ile Asn Thr Leu Glu Met Met Pro Val Thr Gln Ser Tyr Ala 245 250 255 Gly Leu Asn Val His Arg Gln 260 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D1 F <400> 7 gctctagaat gtctgaagat gatagaat 28 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D1 R <400> 8 taggtatgat tcccgatgta 20 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D2 F <400> 9 tacatcggga atcataccta ctctacagaa tattgttgcg 40 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D2 R <400> 10 gtaacaacca tcttaccaga 20 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D3 F <400> 11 tctggtaaga tggttgttac gggtgctaaa agtgaagatg 40 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D3 R <400> 12 gaaagtaccg tgactaaatg 20 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D4 F <400> 13 catttagtca cggtactttc tcgtcatatg aaccagaact 40 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP D4 R <400> 14 tcccccgggt cattataatt ttctgaatt 29

Claims (17)

  1. 변이된 RNA 폴리머라제 II 복합체(RNAP II)를 코딩하는 유전자를 포함하는 내산성이 증대된 클루베로마이세스 마르시아누스.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 RNAP II 복합체를 코딩하는 유전자는 RNAP II(RNA polymerase II), TFIID(Transcription factor II D), TFIIB(Transcription factor II B), TFIIF(Transcription factor II F), TFIIE(Transcription factor II E), TFIIH(Transcription factor II H), TBP(TATA-box binding protein) 및 TAF(TBP-associated factor)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 유전자인 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 변이된 RNAP II 복합체를 변이된 TBP인 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 변이된 TBP는 서열번호 2 내지 서열번호 4의 아미노산으로 구성된 군에서 선택되는 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 클루베로마이세스 마르시아누스는 pH 2.5 이하의 산도에서 생존 또는 성장이 가능한 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  6. 청구항 1항의 클루베로마이세스 마르시아누스에 유기산을 합성하는데 필요한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 도입된 클루베로마이세스 마르시아누스.
  7. 청구항 1이 있어서, 상기 유기산을 합성하는데 필요한 단백질은 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드로라아제, 3-히드록시이소부틸레이트 데히드로게나제, 3-히드록시프로피오닐-CoA 히드로라아제, 3-히드록시프로피오닐-CoA 데히드라타아제3-, 아세틸-CoA 카르보시라아제, 아스파르테이트 데카르복실라제, CoA 트랜스퍼라아제, 말로닐-CoA 리덕타제, PEP 카르복실라제, 3-옥소프로파노에이트: NADP+ 옥시도리덕타아제, 말로네이트 세미알데히드 리덕타아제, 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제, 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 데카르복실라제, 글루타메이트 데히드로게나제, OS17 효소, 피루베이트 카르복실라제, 베타-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 글리세롤 데히드라타아제 및 알데히드 데히드로게나아제로 구성된 군에서 선택되는 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 도입된 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 클루베로마이세스 마르시아누스는 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드로라아제, 3-히드록시이소부틸레이트 데히드로게나제, 3-히드록시프로피오닐-CoA 히드로라아제, 3-히드록시프로피오닐-CoA 데히드라타아제3-, 아세틸-CoA 카르보시라아제, 아스파르테이트 데카르복실라제, CoA 트랜스퍼라아제, 말로닐-CoA 리덕타제, PEP 카르복실라제, 3-옥소프로파노에이트: NADP+ 옥시도리덕타아제, 말로네이트 세미알데히드 리덕타아제 및 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제로 구성된 군에서 선택되는 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 도입된 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 클루베로마이세스 마르시아누스는 3-옥소프로파노에이트: NADP+ 옥시도리덕타아제 및 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 도입된 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 클루베로마이세스 마르시아누스는 말로닐 CoA 리덕타제 및 말로닉 세미알데히드 리덕타제를 더 되입된 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 클루베로마이세스 마르시아누스는 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나아제, 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 데카르복실라제, 글루타메이트 데히드로게나제, OS17 효소, 피루베이트 카르복실라제, 베타-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 및 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 도입된 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 클루베로마이세스 마르시아누스는 3-히드록시프로피오네이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 도입된 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 클루베로마이세스 마르시아누스는 글리세롤 데히드라타아제 및 알데히드 데히드로게나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 도입된 것인 클루베로마이세스 마르시아누스.
  14. 청구항 7의 클루베로마이세스 마르시아누스를 배양하는 단계; 및
    상기 배양액으로부터 유기산을 회수하는 단계를 포함하는 유기산을 생산하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 유기산은 3-하이드록시프로피온산, 1,4-부탄디올, 젖산 및 숙신산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 방법.
  16. 청구항 8 내지 13의 어느 한 항의 클루베로마이세스 마르시아누스를 배양하는 단계; 및
    상기 배양액으로부터 3-HP를 회수하는 단계를 포함하는 3-HP를 생산하는 방법.
  17. 청구항 14 내지 16의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물을 호기성 조건 또는 혐기성 조건 산소 조건에서 배양하는 것인 방법.
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