CN114085783B - 马克斯克鲁维酵母及其在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单核苷酸中的应用 - Google Patents

马克斯克鲁维酵母及其在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单核苷酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了马克斯克鲁维酵母及其在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单核苷酸中的应用，所述马克斯克鲁维酵母保藏编号为CGMCC 23640。本发明以烟酰胺核糖为底物，使用马克斯克鲁维酵母的静息细胞及其无细胞提取液为催化剂，催化制备β‑烟酰胺单核苷酸，反应条件温和，底物浓度高，转化率高。磷酸化产物通过通用的树脂处理即可得到纯化，具有很好的工业应用前景。

Description

马克斯克鲁维酵母及其在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单 核苷酸中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体的涉及马克斯克鲁维酵母及其在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单核苷酸中的应用。
背景技术
β型烟酰胺单核苷酸在所有生物体内都存在，是重要辅酶NAD+ 的关键前体物质。研究表明，β型烟酰胺单核苷酸可以提高NAD+生物合成水平，改善各种疾病如糖尿病、血管功能障碍症状并有潜在延寿功能(Aging cell,2016,15(3):522-530；Cell metabolism,2011, 14(4):528-536)。因为这些预期效果，β型烟酰胺单核苷酸作为营养补充剂用于自我药疗。通常，使用纯化学法或者发酵法制备核苷化合物，比如烟酰胺单核苷酸，化学方法需要使用昂贵的底物和催化剂 (U.S.Patent 10,590)，而微生物发酵法产率较低，缺乏实际应用潜力(U.S.Patent Application 15/034,953[P])。因此，高昂的制备成本限制了烟酰胺单核苷酸的扩大应用。
近年来，基于整细胞或酶制剂的生物催化合成工艺在高附加值化合物合成领域取得了巨大成功。目前，生物催化合成β型烟酰胺单核苷酸仍属于一个较新的领域，许多研发工作尚处于起步阶段。烟酰胺核糖激酶更多应用于NAD+及其衍生物的合成，很少有用于制备β型烟酰胺单核苷酸的报道。如Madern等利用烟酰胺核糖激酶和腺苷转移酶组合催化合成NAD衍生物(ChemBioChem,2020,21(20):2903–2907)，中间产物β型烟酰胺单核苷酸浓度为10g/L，产物浓度较低，且需要使用纯化的烟酰胺核糖激酶，成本较高。Shoji等使用代谢工程方法改造了大肠杆菌代谢通路，提高了胞内5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成水平，导入烟酰胺单核苷酸合成关键酶烟酰胺磷酸核糖转移酶，并利用转移蛋白成功将烟酰胺单核苷酸分泌到胞外，发酵液中产物浓度达到 6.79g/L(Metabolic Engineering,2021,65:167-177.)。但此法菌株构建复杂，发酵时间较长，产物浓度低，并且菌体密度较高影响后续产物分离。因此，开发简单、高效、低成本用于烟酰胺单核苷酸制备的生物催化法，具有重要的工业应用价值。
发明内容
1、发明目的。
本发明提供了一种马克斯克鲁维酵母，并提供了采用该马克斯克鲁维酵母生物催化合成β型烟酰胺单核苷酸的方法。
2、本发明所采用的技术方案。
本发明的马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus保藏于保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 23640，保藏日期为2021年10月22日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明还公开了上述马克斯克鲁维酵母在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单核苷酸中的应用。
优选的，反应过程为：取马克斯克鲁维酵母湿细胞或马克斯克鲁维酵母无细胞提取液，加入缓冲液中，加入底物烟酰胺核糖、ATP、 MgCl2，搅拌反应，获得β型烟酰胺单核苷酸。
优选的，反应在pH为5～8的缓冲体系中，25～40℃条件下进行，烟酰胺核糖浓度为10～100g/L；反应体系中ATP的加入量为相对于底物烟酰胺核糖1.2倍摩尔当量，MgCl2浓度为2～15mM，反应时间为1～12h。
优选的，使用马克斯克鲁维酵母整细胞作为催化剂，每升反应液的催化剂用量为10～100g马克斯克鲁维酵母细胞。
优选的，使用含有烟酰胺核糖激酶的无细胞提取物作为催化剂，每升反应液的催化剂用量为4-40kU烟酰胺核糖激酶。
(1)静息细胞的制备
将马克斯克鲁维酵母在灭菌(121℃，20min)的丰富培养基(甘油1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.8％，琼脂1.5％)斜面上划线，于30℃静置培养1-2天。
取一环斜面菌种，接入种子培养基(甘油1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.8％，pH 7.0)中，25-37℃培养24-48小时。再以该培养液作为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1-10％(v/v)接种至发酵培养基中，在25-37℃下150-250rpm摇床上培养24-48小时，培养结束后离心得到静息湿细胞。所述的发酵培养基可采用常规的培养基，其中各组分的含量如下：甘油10-50g/L，牛肉膏1-20g/L，蛋白胨 1-20g/L，KH2PO4 1-10g/L，Na2HPO4 1-10g/L，NaCl0.1-2g/L， MgSO4 0.1-2g/L，pH 5-8。
(2)无细胞提取物的制备
称取收获的湿细胞，悬浮于5～20倍体积质量比(v/w)的缓冲液中 (50mM,pH7.0)，对细胞进行破碎处理。一般的，使用超声波处理的方法进行细胞破碎，将细胞悬浮液置于冰水浴中，超声波功率为 400W，超声4s，间歇6s，计为一个循环，共进行99个循环，将破碎液在4℃，10000rpm高速离心，获得的上清液即为无细胞提取液。
无细胞提取液中的烟酰胺核糖激酶活力测定：
将含5mM烟酰胺核糖、5mM ATP、2mM MgCl2、0.1mM NADH、 5mM磷酸烯醇式丙酮酸、5μL丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合液(分别为700/1000U/mL，Sigma)的1mL反应体系(50mMTris–HCl， pH 7.5，50mM NaCl，50mM KCl)预热至30℃，然后加入适量的无细胞提取液，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADH 的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。
按上述测定方法，用下式计算得到所述烟酰胺核糖激酶的活力：
酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×1)
式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为ml；6220为NADH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)； 1为光程距离，单位为cm。1个单位(U)烟酰胺核糖激酶对应于上述条件下每分钟氧化1μmol NADH所需的酶量。
(3)生物催化烟酰胺核糖磷酸化
取适量的湿细胞或无细胞提取液，加入到pH 5.0～8.0的缓冲液(100mM)中，使用湿细胞作为催化剂时，其浓度为10～100g/L；使用无细胞提取液作为催化剂，烟酰胺核糖激酶的用量为4～40kU/L。加入底物烟酰胺核糖，底物浓度为10～100g/L，加入磷酸基团供体ATP，浓度为底物的1.2倍摩尔当量，加入0.5～15mM的MgCl2作为酶激活剂。25～40℃下搅拌反应，反应1～12小时，间歇取样，进行液相色谱分析，直至产物浓度不再提高时结束反应。
(4)产物的精制纯化
反应结束后，加入酸液将反应液酸化，所述的酸液为常规的非氧化性酸，通常使用20％(w/v)的硫酸，酸化至pH 3～4，离心除去不溶物，上清经过阴/阳离子交换去除反应液中ATP，ADP和Mg2+，再使用甲醇/水溶液洗脱产物，洗脱液冷冻干燥得到烟酰胺单核苷酸纯品。
3、本发明所产生的技术效果。
与现有技术相比，本发明以烟酰胺核糖为底物，使用马克斯克鲁维酵母的静息细胞及其无细胞提取液为催化剂，催化制备β-烟酰胺单核苷酸，反应条件温和，底物浓度高，转化率高。磷酸化产物通过通用的树脂处理即可得到纯化，具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1马克斯克鲁维酵母的细胞培养
种子液培养基配方：甘油1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.8％，pH 7.0。 121℃高温灭菌20min。
发酵培养基配方：甘油15g/L，牛肉膏8g/L，蛋白胨5g/L， KH2PO4 2.0g/L，Na2HPO42.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L， pH 7.0。121℃高温灭菌20min。
取4℃保藏的保藏编号为CGMCC 23640的马克斯克鲁维酵母的斜面，挑取一环接种至装有50ml种子液培养基的250ml的摇瓶中。在30℃下，180rpm摇床培养24h，按5％(v/v)的接种量转接至装有100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，于30℃、180rpm继续培养36h，离心收获湿细胞。
实施例2马克斯克鲁维酵母无细胞提取液
称取5g如实施例1所述的马克斯克鲁维酵母湿细胞，悬浮于 50ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，将细胞悬浮液置于冰水浴中，超声波功率为400W，超声4s，间歇6s，计为一个循环，共进行99个循环，将破碎液在4℃，10,000rpm高速离心，获得澄清的上清液，其活力为40kU/L。
实施例3-10马克斯克鲁维酵母静息细胞催化烟酰胺核糖磷酸化
称取适量如实施例1所述的马克斯克鲁维酵母湿细胞，悬浮于 10ml磷酸钾缓冲液(100mM)中，加入不同浓度的烟酰胺核糖，1.2 倍摩尔当量的三磷酸腺苷，2mM MgCl2，磁力搅拌反应12h，间隔2 h取样检测反应转化率。
取样100μl，加入900μl水，混匀后0.22μm膜过滤，滤液使用高效液相色谱分析法检测，色谱柱为ChromCore C18(NanoChrom，5μm,4.6mm×250mm)，柱温30℃，流动相为甲醇：磷酸二氢钾溶液(50mM,pH 6.2)＝1:3，检测波长为254nm，流速为0.5mL/min，其中底物烟酰胺核糖NR出峰时间为5.44min，底物ATP出峰时间为16.7min，产物β型烟酰胺单核苷酸NMN出峰时间为6.63min。反应结果见表1。
表1马克斯克鲁维酵母湿细胞催化烟酰胺核糖磷酸化
实施例11-13马克斯克鲁维酵母整细胞催化烟酰胺核糖磷酸化
称取适量如实施例1所述的马克斯克鲁维酵母湿细胞，悬浮于 10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，加入100g/L的烟酰胺核糖，1.2倍摩尔当量的三磷酸腺苷，不同浓度MgCl2，磁力搅拌反应 12h，取样检测反应转化率。
取样100μl，加入900μl水，混匀后0.22μm膜过滤，滤液使用高效液相色谱分析法检测，色谱柱为ChromCore C18 (NanoChrom，5μm,4.6mm×250mm)，柱温30℃，流动相为甲醇：磷酸二氢钾溶液(50mM,pH 6.2)＝1:3，检测波长为254nm，流速为0.5mL/min。结果见表2。
表2马克斯克鲁维酵母整细胞催化烟酰胺核糖磷酸化
实施例14-18无细胞提取液催化烟酰胺核糖磷酸化
取适量如实施例2所述的无细胞提取液，加入磷酸钾缓冲液(100 mM，pH 7.0)至总体积为10ml，使烟酰胺核糖激酶终浓度4-40kU/L，加入终浓度为10g/L的烟酰胺核糖，1.2当量的三磷酸腺苷，不同浓度MgCl2，反应温度维持在30℃，磁力搅拌反应12h，取样检测反应转化率。
取样100μl，加入900μl水，混匀后0.22μm膜过滤，滤液使用高效液相色谱分析法检测，色谱柱为ChromCore C18 (NanoChrom，5μm,4.6mm×250mm)，柱温30℃，流动相为甲醇：磷酸二氢钾溶液(50mM,pH 6.2)＝1:3，检测波长为254nm，流速为0.5mL/min。结果见表3。
表3马克斯克鲁维酵母无细胞提取液催化烟酰胺核糖磷酸化
实施例19采用不同的马克斯克鲁维酵母静息细胞催化合成烟酰胺单核苷酸
取5g如实施例1所述湿细胞以及ATCC(美国典型菌种保藏中心)748、ATCC 4135、DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)7239三种马克斯克鲁维酵母湿细胞，超声破碎检测酶活，结果如表4所示。
催化反应在带有水浴循环的玻璃夹套反应器内进行，再称取5g 如实施例1所述湿细胞以及ATCC 748、ATCC 4135、DSM 7239三种马克斯克鲁维酵母湿细胞，悬浮于50ml KPB缓冲液(100mM,pH 7.0)，加入烟酰胺核糖5g，15mM MgCl2，1.2倍摩尔当量的三磷酸腺苷，调节pH至7.0，磁力搅拌反应。反应过程中间歇取样，液相分析检测转化率。转化8h，结束反应，计算转化率，结果如表4所示。
表4不同的马克斯克鲁维酵母静息细胞催化合成烟酰胺单核苷酸
实施例20无细胞提取液催化合成烟酰胺单核苷酸
取50ml如实施例2所述的无细胞提取液，加入烟酰胺核糖5g， 15mM MgCl2，1.2倍摩尔当量的三磷酸腺苷，调节pH至7.0，磁力搅拌反应，反应温度维持在30℃。反应过程中取样检测反应进程，反应10h，转化率为99.7％。
反应结束后，使用20％(w/v)的硫酸将反应液酸化，酸化至pH 3～4，离心除去不溶物，上清经过HZ293/HZ301离子交换去除反应液中ATP， ADP和Mg2+，再使用甲醇/水溶液(50：50，V/V)洗脱产物，收集含产物成分洗脱液旋蒸后冻干得到烟酰胺单核苷酸纯品4.8g，纯度97.2％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之上或之下可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征之上、上方和上面包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征之下、下方和下面包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

Claims (6)

1.一种马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母保藏编号为CGMCC NO.23640。
2.权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces
marxianus)在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单核苷酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于反应过程为：取马克斯克鲁维酵母湿细胞或马克斯克鲁维酵母无细胞提取液，加入缓冲液中，加入底物烟酰胺核糖、ATP、MgCl2，搅拌反应，获得β型烟酰胺单核苷酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：反应在pH为5～8的缓冲体系中，25～40℃条件下进行，烟酰胺核糖浓度为10～100g/L；反应体系中ATP的加入量为相对于底物烟酰胺核糖1.2倍摩尔当量，MgCl2浓度为2～15mM，反应时间为1～12h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：使用马克斯克鲁维酵母湿细胞作为催化剂，每升反应液的催化剂用量为10～100g马克斯克鲁维酵母湿细胞。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：使用含有烟酰胺核糖激酶的无细胞提取液作为催化剂，每升反应液的催化剂用量为4-40kU烟酰胺核糖激酶。
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