KR20140015998A - 게놈 수준에서의 클루이베로마이세스 마르시아누스의 대사 네트워크 모델 및 이를 이용한 3ｈｐ 생산에 대한 대사특성분석 방법 - Google Patents

Abstract

일 구체예는 3HP 생성을 위한 Kluyveromyces marxianus 미생물의 대사 특성 분석용 대사 네트워크 모델 및 이를 이용한 Kluyveromyces marxianus 의 대사특성분석에 관한 것이다. 보다 상세하게는 유전자-단백질-생화학 반응관계를 이용한 Kluyveromyces marxianus 의 대사 네트워크 모델의 구축과 이 모델을 이용한 대사흐름 등의 대사특성의 분석, 그리고 대사흐름분석에 기반한 시뮬레이션을 이용하여 3HP 의 생산능을 향상시키는 신규 대사경로를 예측하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예의 방법은 기존의 방법과 달리, 효율적으로 미생물의 생산능 및 세포성장속도를 예측할 수 있게 하며, 신규 경로를 최적화하기 위한 시간 및 비용을 절약할 수 있게 하고, 특정 대사산물을 고효율로 생산할 수 있는 변이 미생물을 제공하는 효과가 있으므로 유용하다.

Description

게놈 수준에서의 클루이베로마이세스 마르시아누스의 대사 네트워크 모델 및 이를 이용한 3ＨＰ 생산에 대한 대사특성분석 방법{Genome-scale metabolic network model reconstruction of Kluyveromyces marxianus and strategies for engineering non-native pathways for 3-hydroxypropionate production in Kluyveromyces marxianus}

3-hydroxypropionate (3HP) 생산을 위한 Kluyveromyces marxianus 미생물의 대사 특성 분석용 대사 네트워크 모델 및 이에 기반한 시뮬레이션을 이용하여 3HP의 생산능을 향상시키는 신규 대사경로를 예측하는 방법에 관한 것이다.

일반 화학 반응식으로 여러 단계를 거쳐 얻을 수 있는 물질을 미생물을 이용하여 생산하는 경우 보다 효율적으로 원하는 물질을 생산할 수 있다. 이러한 경우 비용이나 시간면에서 일반 화학합성 공정보다 효율적일 수 있으므로 이에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다.

그러나, 미생물은 원하는 대사산물만을 생성하지 않으며, 특정 대사산물이 과량 생성될 경우 오히려 성장이 억제되거나 더 이상 원하는 대사산물을 생성하지 않거나, 원하지 않는 부산물을 생성할 수 있다.

최근에는 본래 미생물이 생산하지 않은 대사산물을 유전공학적 기술을 이용하여 미생물을 형질전환시키고, 그러한 형질전환된 미생물로부터 원하는 목적 대사산물을 얻으려는 시도가 있었다. 예를 들어, 숙신산을 과량 생산하기 위하여 대장균에 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase)를 암호화하는 핵산을 형질전환 시킨 예가 있다. 또한, 숙신산을 과량 생산하기 위하여 락테이트 탈수소화효소(lactate dehydrogenase) 및 PTA 효소(phosphotransacetylase enzyme)의 활성을 제거한 예가 있다. 그러나, 특정 유전자를 삽입하거나 제거할 경우 미생물내의 대사 경로가 어떻게 변형될 것인지를 예측하는 것은 용이하지 않을 뿐 아니라, 검증하기 위하여 많은 시간이 소요된다. 따라서, 원하는 특징을 갖는 미생물을 만드는데 많은 노력이 들게 된다.

한편, 생체내에서는 여러 유전자가 상호작용하여 기능을 발휘하는 경우가 많다. 이는 단백질(protein), 신호 전달(signaling pathway)이나 신진대사(metabolism)에도 동일하게 해당된다. 이렇게 생명체의 여러 요소가 상호 복합적으로 작동하여 만들어지는 것을 생물학적 네트워크라고 칭하며, 생물학적 네트워크는 크게 유전자 네트워크(gene network), 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction), 신호/물질대사 전달경로(signaling/metabolic pathway)로 구분할 수 있다.

단백질(protein)은 생명체내에서 유전자가 기능을 발휘하기 위하여 작동하는 분자로서 유전자와 마찬가지로 단백질이 단독으로 기능을 하는 경우보다, 두 개 이상의 폴리펩티드(polypeptide)가 아미노산(amino acid)간의 인력에 의해 결합하여 단백질 복합체(protein complex)를 이룬 형태처럼, 여러 단백질이 복합적으로 작용하여 기능을 발휘하는 경우가 더욱 많다. 이러한 단백질간의 연결성에 대한 정보를 단백질-단백질 상호작용이라고 하며,이 단백질-단백질 상호작용은 생명체가 생존하기 위한 여러 가지 기능을 발휘하는 단위로서 유전자의 기능을 파악하거나 해석하기 위한 필수적인 정보이다.

신호/물질대사 전달경로는 세포의 대사, 이동, 증식, 생존, 분화 또는 시신경의 움직임과 같이 특정 기능을 수행하는 유전자와 단백질의 집합체이며, 상기의 유전자 네트워크, 단백질-단백질 상호작용 또는 유전자-단백질상호작용을 포함하고 있다. 이러한 신호/물질대사 전달경로에서 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 인자(transcription factor) 단백질을 포함한 유전자와 단백질의 결합한 것이 대사 네트워크 모형이다.

따라서, 미생물을 이용하여 원하는 물질을 생산하기 위하여 대사 경로를 보다 효과적으로 예측하기 위하여 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 이용하는 방법을 개시하고자 한다.

일 구체예는 미생물내의 반응 네트워크를 변형하여 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 대사 경로를 예측하는 방법을 제공한다.

또 다른 구체예는 상기 대사 경로를 통해 예측된 대사 경로를 갖는 미생물을 제공한다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 양상은 미생물내의 반응 네트워크를 변형하여 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 대사 경로를 예측하고 획득하는 방법을 제공한다.

상기 대사 경로를 예측하는 방법은 구체적으로, 미생물내의 반응 네트워크에서 효소들이 관여하는 생화학적 반응에 관한 정보를 포함하는 데이터베이스에 기초하고, 미생물의 배양조건, 미생물이 생성하는 대사산물 및 미생물의 세포 조성정보 중 적어도 하나를 이용하여 미생물내의 대사 경로 및 생체량 합성 방정식을 획득하는 단계; 상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로를 도입하여, 1차 변형 대사 경로를 획득하는 단계; 1차 변형 대사경로에 관여하는 적어도 하나의 효소 반응을 변형하여, 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계; 2차 변형 대사 경로를 기반으로 하여 생성된 대사산물 및/또는 생체량 정보를 획득하는 단계; 획득된 대사산물 및 생체량 정보를 기반으로 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계; 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계 내지 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 반복하여 최적의 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계; 및 상기 최적의 대사산물-생체량 관련식의 기반이 되는 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함하는 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 대사 경로 예측 방법을 제공한다.

상기 대사 경로 예측 방법은 다음과 같다.

먼저, 미생물내의 대사 네트워크에서 효소들이 관여하는 생화학적 반응에 관한 정보를 포함하는 데이터베이스에 기초하고, 미생물의 배양조건, 미생물이 생성하는 대사산물 및 미생물의 세포 조성정보 중 적어도 하나를 이용하여 미생물내의 대사 경로 및 생체량 합성 방정식을 획득하는 단계를 제공한다.

용어, "대사 네트워크"는 세포내의 생리학적, 생화학적 특징을 결정하는 대사 과정 또는 물리학적 단계의 집합을 의미한다. 또한, 이러한 네트워크는 대사물의 화학적 반응 및 이러한 화학적 반응의 조절 관계 등을 포함한다. 예를 들면, 단백질-단백질 상호 작용, 효소의 작용 기작 등을 포함한다. 대사 네트워크는 화합물들의 네트워크인 동시에 효소의 네트워크 일 수 있다.

용어, "생화학적 반응에 관한 정보"는 특정 효소들이 촉매하는 반응 과정의 제반 정보를 의미한다. 이러한 정보는 효소 번호(enzyme commission numbers)로 부터 수득할 수 있으며, 새롭게 발견한 효소는 실험을 통하여 획득한 정보일 수 있다.

용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소조건일 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등이 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 등이 이용될 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 무기질소화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1 ~ 10 %의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 미생물이 실제로 이용가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

용어, "대사산물"은 미생물의 대사반응에 의해 생성되는 모든 물질들을 의미한다. 상기 대사산물은 미생물의 대사반응의 중간 생성물일 수도 있고, 미생물의 대사반응의 최종 생성물일 수도 있다. 이러한 대사산물의 예로는 숙신산, 젖산, 3HP(3-hydroxypropionate) 등이 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

미생물의 대사특성 분석용 대사 네트워크 모델은 다음과 같이 구축한다. 우선 게놈 정보 및 각 유전자 주석(annotation)에 대한 정보를 수집하고, 다음으로, 게놈 서열 정보를 바탕으로 하여 Kluyveromyces marxianus에 존재하는 효소 반응식들을 정리하고 이 효소 반응식을 촉매하는 효소 및 이를 코딩하는 유전자의 관계, 즉 GPR 관계를 정리한다.

용어, "GPR 관계"는 유전자-단백질-반응식 관계 (Gene-Protein-Reaction Relationship)이며, 유전자와 그 산물, 그리고 그 산물이 촉매하는 효소 반응식과의 관계를 말한다.

이때, 수집한 유전자 주석 정보를 직접 분석할 수 있다. 또한, 대사 경로 관련 정보를 분석 및 정리해 놓은 대사 관련 데이터베이스의 정보를 이용한 뒤, 수집된 정보는 보정 과정에서 사용되는 기준으로 삼을 수 있다.

상기에서 정리한 GPR 관계를 바탕으로 초벌 모델(draft model)을 구축한다. 일반적으로 대사 관련 데이터베이스에는 DNA 복제, 전사(transcription), 번역(translation) 및 세포를 구성하는 각종 요소(이를테면 세포막을 구성하는 인지질, 세포벽, 세포 내 모든 단백질의 아미노산 함량 및 세포 전체적인 고분자 조성)의 합성식, 그리고 세포 전체의 생체량 합성 방정식은 정리되어 있지 않다. 그러나 이 식들은 세포의 생장을 모사하기 위한 모델 구축에 필수적이라 할 수 있으며, 이러한 식들을 만들기 위해서는 세포를 구성하는 각 성분들의 조성 비율을 알아야 한다. 이는 참고 문헌을 통하여 얻거나 실제 발효를 통하여 얻은 시료를 분석함으로써 알아낼 수 있다.

이때, 발효 조건은 실제 보정 과정에서 사용되는 발효의 조건과 동일하게 하는 것이 바람직하다. 상기에서 구축한 초벌 모델을 검토하여 보정 작업을 수행한다. 대사 관련 데이터베이스는 생물정보학적 기법을 통하여 유전자 주석 정보를 컴퓨터 프로그램으로 분석하여 데이터베이스화한 것이다. 따라서, 이러한 데이터베이스는 불완전하거나 잘못된 대사 정보를 내포할 가능성이 매우 높은데, 이는 다음과 같은 원인에 기인한다.

첫째로, 유전자 주석 정보 자체가 불완전할 가능성이 있다. 이는 대부분의 유전자 주석 작업이 기존에 기능이 규명된 유전자 서열 및 효소의 아미노산 서열과 분석하고자 하는 서열을 통계적인 기법으로 비교함으로써 상동성을 바탕으로 수행되기 때문이다. 어떤 균주에 규명이 되지 않은 유전자가 존재한다면 이러한 유전자의 기능을 생물정보학 기법만을 이용하여서는 명확히 기능을 밝히기 어렵게 된다.

둘째로, 이러한 유전자 주석 정보를 자동으로 해석하여 대사 경로로 데이터베이스화하는 과정에서 오류가 일어날 가능성이 있다. 가령, 어떤 균주의 유전자 중 하나의 아미노산 서열을 BLAST 분석을 통하여 상동성을 분석하였을 때, 다른 균주의 단백질과 높은 상동성을 보이지만 실제로 그 데이터베이스에서는 이 유전자의 기능이 없는 것으로 지정되는 경우가 존재한다.

따라서 이 단계에서는 생물정보학적 기법을 통하여 얻어낸 정보보다는 실제로 발표된 균주 관련 논문, 생화학 관련 교재 및 문헌, 실제 발효를 통하여 파악된 형질을 바탕으로 보정 작업을 수행한다.

이 과정에서는 주로 다음과 같은 부분을 중점으로 보정한다.

1) 효소 반응식에서 대사산물 계수의 오류

2) 상기에서 분석한 세포의 구성 요소를 만드는 대사 경로가 끊어진 경우

3) 세포의 생명 유지 활동 및 생장에 사용되는 유지 에너지

4) 그 외의 각종 오타

여기서 3)의 유지 에너지는 연속 항성분 배양(continuous chemostat culture)을 통하여 얻게 된다. 연속 항성분 배양에서는 세포의 농도를 일정하게 유지할 수 있으며, 희석률(dilution rate)을 조절함으로써 세포의 생장도 인위적으로 통제할 수 있다는 것이 특징이다. 이 경우에 비(比)생장률(specific growth rate)은 희석률과 일치하게 되며, 희석률을 조절함으로써 희석률과 그 때의 세포의 건조 중량당 기질 흡수 속도를 구할 수 있다. 이를 바탕으로 세포가 생장에 사용하는 생장 관련 유지 에너지(growth-associated maintenance energy)와 생장에 관계 없는 생명 유지 현상에 사용되는 비생장-관련 유지 에너지(non-growth-associated maintenance energy)를 구할 수 있다.

위와 같은 연속 배양이 부득이한 경우에는 다른 균주의 정보를 사용할 수도 있다. 그러나 균주에 따라 유지 에너지의 크기가 차이를 보일 수 있으므로, 가급적이면 유연 관계가 가까운 균주의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 그렇지 않으면 실제 결과와 대사흐름분석 결과가 부정확하게 될 가능성이 높기 때문이다.

구축된 대사 네트워크를 수학적으로 표현하기 위하여, 구축된 대사 네트워크 모델을 구성하고 있는 모든 대사산물, 상기 대사산물의 대사경로 및 상기 대사경로에서의 화학양론 매트릭스 S (stoichiometric matrix)(Sij, j 번째 반응에서 i 번째 대사산물의 시간에 따른 화학양론 계수)를 이용하여, 대사흐름 벡터(νj, j 번째 대사반응의 대사흐름)를 계산할 수 있다.

여기서, 시간에 따른 대사산물 농도 X의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다. 시간에 따른 X의 농도 변화량이 없다고 가정하면, 즉 준정상 상태의 가정 하에서, 시간에 따른 대사산물 농도의 변화량은 아래의 수학식 1로 정의될 수 있다.

<수학식 1>

(여기서, Sν : 시간에 따른 X의 변화량, X: 대사산물의 농도, t: 시간, k: 상수)

상기 구성된 화학량론 행렬에서 최적화, 즉 최대화 또는 최소화하고자 하는 반응식을 목적함수로 설정하고 선형계획법(Linear programming)을 이용하여 세포 내의 대사흐름을 예측한다(Kim et al., Mol Biosyst. 4(2):113, 2008). 일 구체예에서는 행렬 S에서 세포의 구성성분을 나타내는 효소 반응식을 목적함수로서 설정함으로써, 세포 생장 속도를 최적화하였다.

그리고, 상기 대사흐름분석을 위한 선형계획법을 적용함에 있어서는, 실제 이 균주의 발효에서 사용된 영양분만이 공급된다는 가정 하에 실행해야 한다. 일반적으로 사용하는 복합 배지(complex medium)는 그 각각의 구성 성분을 정량적으로 파악하는 것이 매우 어려우므로, 기존에 최적화된 합성 배지(synthetic medium)를 이용하는 것이 바람직하다.

용어, "생체량 합성 방정식"은 미생물의 총괄적인 대사반응을 나타낸 것이다. 구체적으로 생체 조성물인 단백질, 핵산, 지질등의 관계와 생체량등의 관계를 나타낸 것이다. 생체량 합성 방정식은 적용되는 미생물에 따라 상이한 미생물 고유의 값이다. 미생물이 Kluyveromyces marxianus일 경우 상기 반응식은 하기의 반응식 I 일 수 있다.

[반응식 Ⅰ]

0.56 PROTEIN + 0.107 RNA + 0.007 DNA + 0.052 PHOSPHOLIPID + 0.03 COF + 0.110 CW + 0.265 CARBOHYDRATE + 70.37 ATP -> BIOMASS + 70.37 ADP + 70.37 Pi

대사물질과 생체량간의 관계를 나타내는 트레이드 오프 커브를 작성하기 위한 방법은 선행기술에 의해 제안되어 있는 알고리즘을 변형하였다(Burgard et al., Biotechnol Bioeng 84, 647-57, 2003). 우선적으로 유용산물 형성속도를 최대화 하였을 때의 값과 최소화하였을 때의 값을 구하여 허용하는 유용산물 형성속도의 범위를 구한다. 다음으로 허용 범위 내에서 비증식속도를 최대화하여 두 목적함수간의 트레이드 오프 커브를 작성하는 방식을 사용하였다. 위 참고문헌의 경우 트레이드 오프 커브를 통하여 후보 유전자를 찾는 방법이 정확히 서술되지 않은 반면 본 명세서에서는 해당 유전자가 도입된 미생물의 유용물질 생산속도와 세포성장속도간의 관계를 살펴보아 유용물질 생산 속도가 줄어듦에도 바이오매스가 감소가 크지 않는 곡선을 가지는 후보 외부 유전자들의 조합을 선택함으로써 해당하는 균주의 유용물질 생산능력을 비교하였다.

수율과 비증식속도를 고려하여 유용산물의 수율을 확인하기 위하여, 대사흐름 조절기술을 적용하는데 필요한 두 가지의 목적함수를 고려하여 생산물 형성 속도(product formation rate)와 비증식속도(specific growth rate)의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 구하고 그 결과를 도 1에 도시하였다.

또한, 상기 미생물은 자연계에 존재하는 모든 야생형 미생물, 형질전환된 미생물 등일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 Kluyveromyces marxianus일 수 있다.

또한, 상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로를 도입하여, 1차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

용어, "생화학 반응 경로"란 특정 효소에 의해 촉매되는 생화학 반응을 의미한다. 생화학 반응 경로는 하나 이상의 효소에 의해 촉매될 수 있으며, 전효소, 조효소, 보조인자 등이 함께 이용될 수 있다.

용어, "1차 변형 대사 경로"는 미생물 내의 대사 경로에 새로운 생화학 반응 경로가 도입되어 변형된 대사 경로를 의미한다. 구체적으로 미생물내에 존재하지 않는 효소를 하나 이상 도입한 것으로, 효소는 대사반응의 중간 생성물 또는 미생물의 대사반응의 최종 생성물을 이용할 수 있다.

상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로는 말로닐-CoA 경로, β-알라닌 경로 및 글리세롤 경로로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 경로일 수 있다.

상기 말로닐-CoA 경로의 도입은 글루코오즈로부터 말로닐-CoA를 경유하는 경로 (MalonylCoA pathway)를 도입하기 위한 것이다. 말로닐-CoA는 산화/환원 관계는 중립이나, ATP는 얻지 못하며, NADP는 활용하지 못한다는 점이 알려져 있었다(오직 NADPH만을 이용). 이러한 경로를 도입하기 위하여,

3-Hydroxyisobutryl-CoA hydrolase (EC 3.1.2.4),

3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31),

3-Hydroxypropionyl-CoA hydrolase (EC 3.1.2.-),

3-Hydroxypropionyl-CoA dehydratase (EC 4.2.1.-),

Acetyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2),

Aspartate decarboxylase (EC 4.1.1.11),

CoA transferase (EC 2.8.3.1),

Malonyl-CoA reductase (EC 1.1.1.-, 1.2.1.-),

PEP carboxylase (EC 4.1.1.31),

3-oxopropanoate:NADP+ oxidoreductase (EC 1.2.1.18) 및

3-hydroxypropionate dehydrogenase (EC 1.1.1.59) 중 어느 하나 이상을 도입할 수 있으며, 바람직하게는 3-oxopropanoate:NADP+ oxidoreductase (EC 1.2.1.18) 및

3-hydroxypropionate dehydrogenase (EC 1.1.1.59) 를 도입하는 것일 수 있다.

상기 β-알라닌 경로의 도입은 글루코오즈로부터 β-알라닌을 경유하는 경로 (β-alanine pathway)를 도입하기 위한 것이다. β-알라닌 경로는 산화/환원 관계는 중립이나, ATP는 얻지 못한다는 점이 알려져 있었다. β-알라닌 경로를 도입하기 위하여,

3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31),

4-Aminobutyrate aminotransferase (EC 2.6.1.19),

Acetyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2),

Aspartate aminotransferase (EC 2.6.1.1),

Aspartate decarboxylase (EC 4.1.1.11),

Glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2),

OS17 enzyme (EC 6.2.1.17),

Pyruvate carboxylase (EC 6.4.1.1),

β-Alanyl-CoA ammonia lyase (EC 4.3.1.6), 및

3-hydroxypropionate dehydrogenase (EC 1.1.1.59) 중 어느 하나 이상을 도입하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 3-hydroxypropionate dehydrogenase (EC 1.1.1.59) 를 도입하는 것일 수 있다.

상기 글리세롤 경로는 글루코오즈를 탄소원으로 활용하는 경우로서, 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde) 경유하며, 기질로부터 산물까지의 직접적인 직선 경로임이 알려져 있다. 글리세롤 경로를 도입하기 위하여는 glycerol dehydratase(EC 4.2.1.30) 및 aldehyde dehydrogenase(EC 1.2.1.3) 를 도입하는 것일 수 있다.

또한, 1차 변형 대사경로에 관여하는 적어도 하나의 효소 반응을 변형하여, 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

용어, "2차 변형 대사 경로"는 1차 변형 대사 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소 반응식을 변형한 것을 의미한다. 효소 반응식의 변형은 효소를 도입하여 효소의 반응을 강하게 하거나, 효소를 대사 경로에서 제거하는 것일 수 있다.

대사특성 분석을 위하여 수 개 내지 수십 개의 효소 반응식이 가감될 수 있다. 변형될 수 있는 효소는,

polyphosphate polyphosphohydrolase, diphosphate phosphohydrolase, urea-1-carboxylate amidohydrolase, acetolactate synthase, Catalase, Trehalase, pyruvate dehydrogenase, cytochrome c peroxidase, cellobiose glucohydrolase, porphobilinogen synthase, riboflavin synthase, Ferrocytochrome-c:oxygen oxidoreductase, Ferrocytochrome c2:oxygen oxidoreductase, benzenediol:oxygen oxidoreductase (laccase), hydroxymethylbilane synthase, ATP diphosphohydrolase, ATP synthase, mitochondrial, ATP synthase, vacuole, adenylate cyclase, ferric-chelate reductase (NADH), glutamate synthase (NADH), glutathione:NAD+ oxidoreductase, cytochrome-b5 reductase, NAD+ phosphohydrolase, NAD kinase, NADPH:ferricytochrome oxidoreductase, glutathione:NADP+ oxidoreductase, ADP phosphohydrolase, adenosine tetraphosphate phosphodiesterase, ATP adenylyltransferase, adenylate kinase, dephospho-CoA kinase, carbonate dehydratase, ATP:nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase, UDP phosphohydrolase, UMP kinase, UTP phosphohydrolase, FAD nucleotidohydrolase, FAD synthetase, pyridoxal kinase, L-methionine S-adenosyltransferase, S-adenosylmethionine decarboxylase, AMP aminohydrolase, Adenosine 5'-monophosphate phosphohydrolase, adenosine kinase, P1,P3-bis(5'-adenosyl)-triphosphate adenylohydrolase, Adenosine 3',5'-bisphosphate 3'-phosphohydrolase, NAD synthetase, AMP:diphosphate phospho-D-ribosyltransferase, adenosine 3',5'-phosphate 5'-nucleotidohydrolase, S-Adenosyl-L-homocysteine hydrolase, S-lactate dehydrogenase (cytochrome), D-lactate dehydrogenase (cytochrome), pyruvate kinase, malic enzyme (NAD), malic enzyme (NADP), oxaloacetate carboxy-lyase, L-serine deaminase, pyruvate decarboxylase, S-acetolactate synthase, acetyl-CoA hydrolase, acetyl-CoA synthetase, acetyl-CoA acetyltransferase, glutamate 5-kinase, glutamate dehydrogenase (NAD+), L-Glutamate 5-semialdehyde:NAD+ oxidoreductase, glutamate dehydrogenase (NADP+), 5-oxoprolinase (ATP-hydrolysing), N-carbamyl-L-glutamate amidohydrolase, L-Glutamine amidohydrolase, NAD synthetase (glutamine-hydrolysing), alanine transaminase, N-acteylglutamate synthase, mitochondrial (predicted), L-glutamate 1-carboxy-lyase, 2,5-dioxopentanoate:NADP+ 5-oxidoreductase, Isocitrate:NADP+ oxidoreductase (decarboxylating), oxalosuccinate carboxy-lyase (2-oxoglutarate-forming), homocitrate synthase, glutathione:hydrogen-peroxide oxidoreductase, superoxide dismutase, Pyridoxamine-5'-phosphate:oxygen oxidoreductase (deaminating), Pyridoxine 5-phosphate:oxygen oxidoreductase, UDP-glucose glucophosphohydrolase, UDP glucose pyrophosphorylase, UDP-glucose 4-epimerase, protoheme ferro-lyase (protoporphyrin-forming), ATP:acetate adenylyltransferase, guanosine-diphosphatase, guanylate kinase, GTP phosphohydrolase, phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP), malate dehydrogenase, pyruvate carboxylase, citrate synthase, L-aspartate transaminase, glycine:oxygen oxidoreductase (deaminating), alanine-glyoxylate aminotransferase, Glycine:2-oxoglutarate aminotransferase, succinate dehydrogenase, methylisocitrate lyase, UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase, UDP-N-acetyl-D-glucosamine 4-epimerase, GTP 7,8-8,9-dihydrolase, GTP cyclohydrolase II, GTP 8,9-hydrolase, Succinate:CoA ligase (GDP-forming), GTP diphosphate-lyase, ureidoglycolate hydrolase, malate synthase, Isocitrate lyase, aspartate kinase (predicted), irreversible, L-aspartate:ammonia ligase, L-asparaginase, L-aspartate 1-carboxy-lyase (beta-alanine-forming), glutathione gamma-glutamylaminopeptidase, glutathione synthase, galactose 1-phosphate uridyltransferase, 3'-phosphoadenylyl-sulfate sulfohydrolase, 3'-Phospho-5'-adenylyl sulfate 3'-phosphohydrolase, adenylyl-sulfate kinase, Cytidine-5'-monophosphate phosphohydrolase, cytidine 5'-phosphotransferase:ATP, CDP phosphohydrolase, cytidine 5'-phosphotransferase:UTP, cytidine 5'-phosphotransferase:GTP, S-Formylglutathione hydrolase, sulfate adenylyltransferase, pantothenate 4'-phosphotransferase, riboflavin-5-phosphate phosphohydrolase (acid optimum), riboflavin kinase, arginase, CTP phosphohydrolase, CTP synthase, UTP:L-glutamine amido-ligase, carbamoyl-phosphate synthase (glutamine-hydrolysing), asparagine synthase (glutamine-hydrolysing), O-phospho-L-serine phosphohydrolase, serine-pyruvate transaminase, L-Serine hydro-lyase, S-Adenosyl-L-methionine:tRNA guanine N2-methyltransferase, methanol:hydrogen-peroxide oxidoreductase, ATP:thiamine-diphosphate phosphotransferase, ATP:thiamine diphosphotransferase, 2-oxoglutarate dehydrogenase, L-galactonolactone oxidase, homocysteine S-methyltransferase, enolase, UTP:pyruvate 2-O-phosphotransferase, Ornithine transaminase, Ornithine Decarboxylase, L-arogenate hydro-lyase, L-Phenylalanine:2-oxoglutarate aminotransferase, Farnesyl-diphosphate:farnesyl-diphosphate farnesyltransferase, 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase, 1-pyrroline-5-carboxylate:NADP+ oxidoreductase, isocitrate dehydrogenase (NAD+), Acetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, Acetaldehyde:NADP+ oxidoreductase, Succinate-semialdehyde:NAD+ oxidoreductase, Succinate-semialdehyde:NADP+ oxidoreductase, saccharopine dehydrogenase (NAD+, L-lysine-forming), saccharopine dehydrogenase (NAD+, L-lysine-forming), mitochondria, ITP phosphohydrolase, ITP:pyruvate 2-O-phosphotransferase, Succinate:CoA ligase (IDP-forming), L-tyrosine:2-oxoglutarate aminotransferase, Acetyl-CoA:carbon-dioxide ligase, threonine aldolase, ethanol:NAD+ oxidoreductase, D-fructose 6-phosphotransferase, D-fructose-6-phosphate amidotransferase, urea carboxylase, L-Cysteine hydrogen-sulfide-lyase, beta-fructofuranosidase-like protein, Succinyl-CoA:acetyl-CoA C-acyltransferase, 5-aminolevulinate synthase, D-glucose-6-phosphate:NADP+ 1-oxidoreductase, alpha,alpha-trehalose-phosphate synthase (UDP-forming), sn-glycerol-3-phosphate phosphohydrolase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol kinase, glycerol phosphate dehydrogenase (FAD), glycerol-3-phosphate O-acyltransferase, sulfite reductase (NADPH), Hydrogen-sulfide:ferredoxin oxidoreductase, GDP-mannose mannophosphohydrolase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, glutamate---cysteine ligase, L-Cysteine:2-oxoglutarate aminotransferase, cysteine synthase, L-cysteine,glutathione:NADP+ oxidoreductase (disulfide-forming), 3-aminopropanal:NAD+ oxidoreductase, beta-alanine-pyruvate aminotransferase, beta-alanine:2-oxoglutarate aminotransferase, Propanoate:CoA ligase (AMP-forming), Propionyladenylate:CoA propionyltransferase, acetyl-CoA:propanoyl-CoA 2-C-acetyltransferase, 2-methylcitrate synthase, 5,6,7,8-tetrahydrofolate:NAD+ oxidoreductase, 5,6,7,8-tetrahydrofolate:NADP+ oxidoreductase, Tetrahydrofolate:L-glutamate gamma-ligase, tetrahydrofolic formylase, 5,10-Methylenetetrahydrofolate:glycine hydroxymethyltransferase, ADP-glucose Glucose-1-phosphohydrolase, alpha-D-Glucose 1-phosphate 1,6-phosphomutase, IDP phosphohydrolase, cytidine 5'-phosphotransferase:ITP, Uridine 5'-monophosphate phosphohydrolase, uridine kinase (ATP:Uridine), orotidine-5'-phosphate carboxy-lyase (UMP-forming), uridine 5'-phosphotransferase:UTP, uridine 5'-phosphotransferase:GTP, uridine 5'-phosphotransferase:ITP, Cytosine deaminase, anthranilate synthase (chorismate pyruvate-lyase), (2R,3S)-3-methylmalate:NAD+ oxidoreductase, L-threonine ammonia-lyase, O-Succinyl-L-homoserine succinate-lyase (deaminating, L-cystathionine cysteine-lyase, dolichyldiphosphatase, dolichyl-phosphate beta-glucosyltransferase, UDP-N-acetyl-D-glucosamine:dolichyl-phosphate N-acetyl-D-glucosamine phosphotransferase, GDPMANNose:dolichyl-phosphate O-beta-D-mannosyltransferase, Dolichyl-phosphate-mannose--protein mannosyltransferase, endoplasmic reticular, Glycerone phosphate phosphohydrolase, glycerone kinase, glycerone-phosphate O-acyltransferase, triose-phosphate isomerase, dolichol kinase, choline kinase, sn-Glycero-3-phosphocholine glycerophosphohydrolase, Glycerol:NAD+ oxidoreductase, glycerol dehydrogenase (NADP+), ribose-phosphate diphosphokinase, ribokinase, ADP-ribose ribophosphohydrolase, pseudouridylate synthase, ribose-5-phosphate isomerase, D-Ribose 1,5-phosphomutase, D-glyceraldehyde-3-phosphate:NAD+ oxidoreductase (phosphorylating), beta-D-fructose-1,6-bisphosphate D-glyceraldehyde-3-phosphate-lyase (glycerone-phosphate-forming), ATP phosphoribosyltransferase, amidophosphoribosyltransferase, anthranilate phosphoribosyltransferase, biotin:CoA ligase, biotin synthase, fumarate hydratase, adenylosuccinate lyase, argininosuccinate lyase, L-Leucine:2-oxoglutarate aminotransferase, galactokinase, Galactan galactohydrolase, diphosphomevalonate decarboxylase, isopentenylpyrophosphate isomerase, Inosine 5'-monophosphate phosphohydrolase, IMP cyclohydrolase, IMP dehydrogenase, IMP:diphosphate phospho-D-ribosyltransferase, adenylosuccinate synthase, dATP:pyruvate 2-O-phosphotransferase, agmatinase, L-Histidinol:NAD+ oxidoreductase, Butanoyl-CoA:oxygen 2-oxidoreductase, butanoyl-CoA:acetyl-CoA C-butanoyltransferase, ferredoxin---NADP+ reductase, Chitinase, isopropylmalate synthase, L-Valine:2-oxoglutarate aminotransferase, 2-dehydropantoate formaldehyde-lyase (3-methyl-2-oxobutanoate-forming), methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NAD+), methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, glycine synthase, 5-methyltetrahydrofolate:NADP+ oxidoreductase, 5,10-Methylenetetrahydrofolate:3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase, Guanosine 5'-monophosphate phosphohydrolase, GMP:diphosphate 5-phospho-alpha-D-ribosyltransferase, Xanthosine-5'-phosphate:ammonia ligase, Xanthosine-5'-phosphate:L-glutamine amido-ligase, GDPglucose sugarphosphohydrolase, Guanosine 3',5'-cyclic phosphate 5'-nucleotidohydrolase, arylsulfatase, Adenosine ribohydrolase, pyrroline-5-carboxylate reductase, pyrroline-5-carboxylate reductase (NADPH), glutathione:L-amino-acid 5-glutamyltransferase, N-ribosylnicotinamide ribohydrolase, Palmitoyl-CoA hydrolase, Palmitoyl-CoA:oxygen 2-oxidoreductase, Palmitate:CoA ligase, serine palmitoyltransferase, Cystathionine L-homocysteine-lyase, L-cystathionine L-homocysteine-lyase, O-succinyl-L-homoserine succinate-lyase (adding hydrogen sulfide), chorismate pyruvate-lyase, phosphatidylcholine acylhydrolase, Phospholipase D, Phosphatidylcholine 2-acylhydrolase, S-Adenosyl-L-methionine:phosphatidyl-N-dimethylethanolamine N-methyltransferase, citrate hydroxymutase, ATP:D-mannose 6-phosphotransferase, phosphoglycolate phosphatase, L-Ornithine:2-oxo-acid aminotransferase, ATP:propanoate adenyltransferase, prephenate dehydratase, carbamoyl-phosphate:L-aspartate carbamoyltransferase, ornithine carbamoyltransferase, irreversible, 5'-methylthioadenosine nucleosidase, 5-Methylcytosine aminohydrolase, D-xylose reductase, cholesterol acyltransferase, O-phospho-L-homoserine phosphate-lyase, sn-Glycero-3-phosphoethanolamine glycerophosphohydrolase, sphingosine N-acyltransferase, UDP-glucose:N-acylsphingosine D-glucosyltransferase, phosphoglycerate kinase, 3-Phospho-D-glycerate:NAD+ 2-oxidoreductase, phosphoglycerate mutase, D-ribulokinase, phosphogluconate dehydrogenase, ribulose 5-phosphate 3-epimerase, arabinose-5-phosphate isomerase, ATP:dAMP phosphotransferase, cytidine 5'-phosphotransferase:dATP, uridine 5'-phosphotransferase:dATP, Adenosine aminohydrolase, Adenosine:phosphate alpha-D-ribosyltransferase, Thymidylate 5'-phosphohydrolase, D-arabinose 1-dehydrogenase [NAD(P)+], beta-D-glucose 6-phosphotransferase, aldose 1-epimeras, lysine N-acetyltransferase, acetyl-CoA:[acyl-carrier-protein] S-acetyltransferase, Malonyl-CoA:[acyl-carrier-protein] S-malonyltransferase, xylulokinase, Sedoheptulose-7-phosphate:D-glyceraldehyde-3-phosphate glycolaldehyde transferase, 4-aminobutanoate:2-oxoglutarate aminotransferase, Spontaneous, 10-Formyltetrahydrofolate:L-glutamate ligase, methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase, geranyl pyrophosphate synthase, 3-phospho-D-glycerate 1,2-phosphomutase, dCMP aminohydrolase, 2'-Deoxycytidine 5'-monophosphate phosphohydrolase, Guanine aminohydrolase, Guanosine ribohydrolase, Lactose galactohydrolase, 3-Sulfo-L-alanine carboxy-lyase (taurine-forming), Dihydrolipoamide:NAD+ oxidoreductase, pyridoxine 4-dehydrogenase, Pyridoxamine:oxygen oxidoreductase (deaminating), Pyridoxine:oxygen oxidoreductase (deaminating), chorismate synthase, chorismate mutase, chorismate:L-glutamine aminotransferase, Nicotinate D-ribonucleotide:diphosphate phosphoribosyltransferase, prephenate dehydrogenase, (R)-S-Lactoylglutathione hydrolase, gluconokinase, D-Glyceraldehyde:NAD+ oxidoreductase, Inosine ribohydrolase, homoserine kinase, L-Homoserine:NAD+ oxidoreductase, L-Homoserine:NADP+ oxidoreductase, homoserine acetyltransferase, Glucokinase, Dextrin 6-alpha-D-glucanohydrolase, 5,6,7,8-tetrahydrobiopterin:NAD+ oxidoreductase, 5,6,7,8-tetrahydrobiopterin:NADP+ oxidoreductase, CTP:phosphatidate cytidyltransferase, phosphatidylserine synthase, glycerophosphate phosphatidyltransferase, phosphatidylinositol synthase, D-mannose 1,6-phosphomutase, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthetase, sedoheptulose-7-phosphate:D-glyceraldehyde-3-phosphate glyceronetransferase, beta-D-Fructose 6-phosphate:D-glyceraldehyde-3-phosphate glycolaldehyde transferase transketolase, Sedoheptulose 7-phosphate 1-phosphotransferase:ATP, ATP:dGDP phosphotransferase, dGTP:pyruvate 2-O-phosphotransferase, purine-nucleoside phosphorylase, dihydroorotate dehydrogenase (Fumarate dependent), orotate phosphoribosyltransferase, Cytidine aminohydrolase, uridine 5'-phosphotransferase:dGTP, choline-phosphate cytidylyltransferase, D-xylulose reductase, Isocitrate:NADP+ oxidoreductase, pyridoxine 5'-phosphotransferase, spermidine synthase, sphingosine kinase, thiosulfate sulfurtransferase, 2-oxoadipate dehydrogenase complex, homoisocitrate dehydrogenase, (1R,2S)-1-hydroxybutane-1,2,4-tricarboxylate:NAD+ oxidoreductase (decarboxylating), L-2-aminoadipate:2-oxoglutarate aminotransferase, argininosuccinate synthase, L-Kynurenine:2-oxoglutarate aminotransferase, ATP:D-glucosamine 6-phosphotransferase, 2'-Deoxyguanosine 5'-monophosphate phosphohydrolase, Deoxyguanosine:orthophosphate ribosyltransferase, (S)-3-Hydroxybutanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, 4-Aminobutyraldehyde:NADP+ oxidoreductase, dihydroorotase, farnesyl pyrophosphate synthetase, NADPH:oxidized-thioredoxin oxidoreductase, 2'-Deoxyadenosine 5'-diphosphate:oxidized-thioredoxin 2'-oxidoreductase, 2'-Deoxyuridine 5'-diphosphate:oxidized-thioredoxin 2'-oxidoreductase, 2'-Deoxyguanosine 5'-diphosphate:oxidized-thioredoxin 2'-oxidoreductase, 2'-Deoxycytidine diphosphate:oxidized-thioredoxin 2'-oxidoreductase, phosphoadenylyl-sulfate reductase (thioredoxin, phosphogluconolactonase, CTP:ethanolamine-phosphate cytidylyltransferase, Phosphatidylethanolamine phosphatidohydrolase, Phosphatidylethanolamine 2-acylhydrolase, phosphatidylserine decarboxylase, phosphatidylethanolamine methyltransferase, glucosamine-phosphate N-acetyltransferase, geranylgeranyl pyrophosphate synthase, (R)-Mevalonate:NADP+ oxidoreductase (CoA acylating), 2'-Deoxyadenosine 5'-monophosphate phosphohydrolase, cytidine 5'-phosphotransferase:dGTP, dTDP phosphohydrolase, ATP:dTDP phosphotransferase, thymidylate kinase, dTTP nucleotidohydrolase, cytidine 5'-phosphotransferase:dTTP, uridine 5'-phosphotransferase:dTTP, uridylate kinase (dUMP), dUTP diphosphatase, thymidylate synthase, 2'-Deoxyuridine 5'-monophosphate phosphohydrolase, urate oxidase, UDP-glucose-sterol glucosyltransferase, retinol:NAD+ oxidoreductase, XMP:pyrophosphate phosphoribosyltransferase, guanosine:phosphate alpha-D-ribosyltransferase, cytochrome 2 reductase, NADH dehydrogenase, succinate dehydrogenase (ubiquinone), S-adenosyl-L-methionine:2-hexaprenyl-3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4-benzoquinone 3-O-methyltransferase, L-Isoleucine:2-oxoglutarate aminotransferase, stearoyl-CoA 9-desaturase, dihydrofolate:NAD+ oxidoreductase, dihydrofolate:NADP+ oxidoreductase, 7,8-dihydropteroate:L-glutamate ligase, 1,2-Diacyl-sn-glycerol 3-phosphate phosphohydrolase, acyl-CoA:1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate 2-O-acyltransferase, Mevalonate kinase, Triacylglycerol acylhydrolase, 1,2-diacylglycerol acyltransferase, 5,6-Dihydrouracil amidohydrolase, N2-Acetyl-L-ornithine:L-glutamate N-acetyltransferase, acteylornithine transaminase, irreversible, mitochondrial, aspartate-semialdehyde dehydrogenase, irreversible, N-Ribosylnicotinamide:orthophosphate ribosyltransferase, Nicotinate D-ribonucleoside:orthophosphate ribosyltransferase, Xanthosine:orthophosphate ribosyltransferase, S-Aminomethyldihydrolipoylprotein:(6S)-tetrahydrofolate aminomethyltransferase (ammonia-forming), formyltetrahydrofolic cyclodehydrase, saccharopine dehydrogenase (NADP+, L-glutamate-forming), ATP:dCDP phosphotransferase, uridine 5'-phosphotransferase:dCTP, uridine 5'-phosphotransferase:dUTP, Chitin amidohydrolase, chitin synthase, (1S,2R)-1-C-(indol-3-yl)glycerol 3-phosphate D-glyceraldehyde-3-phosphate-lyase, N-D-ribosylpurine ribohydrolase, Xanthosine ribohydrolase, NADPH:quinone reductase, cytidine 5'-phosphotransferase:dCTP, cytidine 5'-phosphotransferase:dUTP, Tyramine:o2 oxidoreductase(deaminating)(flavin-containing), carnitine O-acetyltransferase, butyrobetaine hydroxylase, Itaconate:CoA ligase (ADP-forming), Itaconate:CoA ligase (GDP-forming), Itaconate:CoA ligase (IDP-forming), L-Cystine L-Cysteine-lyase, Raffinose fructohydrolase, shikimate kinase, shikimate dehydrogenase, ubiquitin thiolesterase, Allantoate amidinohydrolase, Allantoin amidohydrolase, allantoinase, L-cysteate:2-oxoglutarate aminotransferase, L-ribulokinase, L-arabinitol 2-dehydrogenase, D-Ornithine:oxygen oxidoreductase (deaminating), Sphinganine-1-phosphate pamlmitaldehyde-lyase, 3-Sulfino-L-alanine carboxy-lyase, 2-dehydropantoate 2-reductase, pantothenate synthetase, holocytochrome-c synthase, deoxyuridine:orthophosphate 2-deoxy-D-ribosyltransferas, Deoxycytidine aminohydrolase, pyridoxal 5'-phosphotransferase, aminoacetone:oxygen oxidoreductase(deaminating), lactoylglutathione lyase, Phenylacetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, Phenylacetaldehyde:NADP+ oxidoreductase, 2-phenylacetamide amidohydrolase, Acyl-CoA:sphingosine N-acyltransferase, 4-aminobutyraldehyde:NAD+ oxidoreductase, Deoxyadenosine aminohydrolase, Deoxyadenosine:orthophosphate ribosyltransferase, D-Fructose 1-phosphate D-glyceraldehyde-3-phosphate-lyase, acetyl-CoA:dihydrolipoamide S-acetyltransferase, dihydrolipoamide succinyltransferase, Glutaryl-CoA:dihydrolipoamide S-succinyltransferase, 2-Deoxy-D-glucose 6-phosphate phosphohydrolase, Phenethylamine:oxygen oxidoreductase (deaminating), 2,3-Dehydroacyl-CoA:sn-glycerol-3-phosphate O-acyltransferase, 3-sulfino-L-alanine:2-oxoglutarate aminotransferase, acetylglutamate kinase, acetylglutamate kinase, mitochondrial, ADPmannose sugarphosphohydrolase, Indole-3-acetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, (3S)-3-Hydroxyacyl-CoA hydro-lyase, 1,2-diacyl-sn-glycerol acylhydrolase, 4-Hydroxyphenylacetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, 4-Hydroxyphenylacetaldehyde:NADP+ oxidoreductase, D-arabinono-1,4-lactone oxidase, Xanthosine 5'-phosphate phosphohydrolase, tryptophan synthase (indoleglycerol phosphate), fructose-2,6-bisphosphatase, phosphofructokinase 2, beta-D-Glucose-6-phosphate:NADP+ 1-oxoreductase, glucose-6-phosphate 1-epimerase, alpha-D-Glucose 6-phosphate ketol-isomerase, 1-Acyl-sn-glycero-3-phosphocholine acylhydrolase, 2-Acyl-sn-glycero-3-phosphocholine acylhydrolase, Deoxyinosine:orthophosphate ribosyltransferase, acylglycerone-phosphate reductase, trehalose-phosphatase, D-O-Phosphoserine phosphohydrolase, sirohydrochlorin ferrochelatase, D-hexose 6-phosphotransferase, S-adenosylmethioninamine:spermidine 3-aminopropyltransferase, Presqualene diphosphate:farnesyl-diphosphate farnesyltransferase, squalene monooxygenase, 1,4-beta-D-Glucan glucohydrolase, D-Proline:oxygen oxidoreductase, Creatinine iminohydrolase, D-Arginine:oxygen oxidoreductase (deaminating), 2-Propyn-1-al:NAD+ oxidoreductase, (R,R)-butanediol dehydrogenase, D-Glucuronolactone:NAD+ oxidoreductase, NAD(P)H dehydrogenase (quinone), ATP:sphinganine 1-phosphotransferase, 3-dehydrosphinganine reductase, dTDP glucose 4-epimerase, Deamino-NAD+ nucleotidohydrolase, histidinol-phosphatase, pantothenate kinase, 4-Nitrophenyl phosphate phosphohydrolase, (S)-3-Hydroxybutanoyl-CoA hydro-lyase, pantetheine-phosphate adenylyltransferas, Dephospho-CoA nucleotidohydrolase, 3-Hydroxypropionyl-CoA hydro-lyase, 2-Acetolactate pyruvate-lyase, acetohydroxy acid isomeroreductase, mitochondrial, 5,6-Dihydrothymine amidohydrolase, leukotriene-A4 hydrolase, 4-aminobenzoate synthase, 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine:4-aminobenzoate 2-amino-4-hydroxydihydropteridine-6-methenyltransferase, 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridine-diphosphate:4-aminobenzoate 2-amino-4-hydroxydihydropteridine-6-methenyltransferase, 3-dehydroquinate synthase, 3-dehydroquinate dehydratase, Indole-3-acetamide amidohydrolase, L-2-aminoadipate 6-O-adenylyltransferase, L-2-Aminoadipate-6-semialdehyde:NAD+ 6-oxidoreductase, L-2-Aminoadipate-6-semialdehyde:NADP+ 6-oxidoreductase, O3-Acetyl-L-serine acetate-lyase (adding hydrogen sulfide), primary-amine oxidase, 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase, uroporphyrinogen-III synthase, 4-Guanidinobutanamide amidohydrolase, Dethiobiotin synthetase, S-adenosyl-L-methionine:uroporphyrin-III C-methyltransferase, uroporphyrinogen decarboxylase, lanosterol synthase, O-Acetyl-L-homoserine succinate-lyase (adding cysteine), coproporphyrinogen III oxidase, protoporphyrinogen oxidase, thiamine-phosphate diphosphorylase, (3R)-3-Hydroxyacyl-CoA hydro-lyase, 7,8-diaminonanoate transaminase, D-tagatose-6-phosphate 1-phosphotransferase:ATP, 5-Amino-2-oxopentanoate:2-oxoglutarate aminotransferase, phosphomevalonate kinase, O-Succinyl-L-homoserine succinate-lyase (adding cysteine), phosphopantothenoylcysteine decarboxylase, 4-Trimethylammoniobutanal:NAD+ oxidoreductase, L-hydroxyproline reductase (NAD), L-hydroxyproline reductase (NADP), 3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, 3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde:NADP+ oxidoreductase, lathosterol oxidase, glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase, ATP:pseudouridine 5'-phosphotransferase, beta-D-Glucose 6-phosphate ketol-isomerase, Nicotinate D-ribonucleotide phosphohydrolase, 3-Hydroxy-2-methylpropanoyl-CoA hydrolase, beta-D-Galactosyl-1,4-beta-D-glucosylceramide galactohydrolase, 1-Palmitoylglycerol-3-phosphate:NADP+ oxidoreductase, 1-phosphatidylinositol 4-kinase, phosphatidylinositol 3-kinase, D-myo-Inositol-1,4,5-trisphosphate 5-phosphohydrolase, guanosine 3'-diphosphate 5'-triphosphate 5'-phosphohydrolase, S-Adenosyl-L-methionine:unsaturated-phospholipid methyltransferase (cyclizing), 1-Acyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine aldehydohydrolase, L-2-Lysophosphatidylethanolamine aldehydohydrolase, S-Adenosyl-L-methionine:phosphatidyl-N-methylethanolamine N-methyltransferase, glycine decarboxylase, D-myo-Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate 5-phosphohydrolase, phosphoinositide phospholipase C, N-acetyl-g-glutamyl-phosphate reductase, irreversible, mitochondrial, imidazoleglycerol-phosphate dehydratase, 5-amino-6-(5-phosphoribitylamino)uracil:NADP+ 1'-oxidoreductase, diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine deaminase, 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, irreversible, 1-phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase, 4-Carboxymuconolactone carboxy-lyase, hydroxymethylpyrimidine kinase, N-acetylglucosaminylphosphatidylinositol deacetylase, 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridine diphosphokinase, dihydroneopterin aldolase, indole-3-glycerol-phosphate synthase, phosphoribosylanthranilate isomerase (irreversible), RX:glutathione R-transferase, D-Glucoside glucohydrolase, Hydrogen selenide:NADP+ oxidoreductase, selenocysteine lyase, Stachyose fructohydrolase, alanine tRNA synthetase, arginine-tRNA synthetase, asparagine-tRNA synthetase, cysteine-tRNA synthetase, glutamine-tRNA synthetase, glycine-tRNA synthetase, histidine-tRNA synthetase, isoleucine-tRNA synthetase, leucine-tRNA synthetase, lysine-tRNA synthetase, methionine-tRNA synthetase, phenylalanine-tRNA synthetase, proline-tRNA synthetase, serine-tRNA synthetase, threonine-tRNA synthetase, tryptophan-tRNA synthetase, L-tyrosine:tRNATyr ligase, valine-tRNA synthetase, aspartate-tRNA synthetase, glutamate-tRNA synthetase, methionyl-tRNA synthetase, glycogenin glucosyltransferase, beta-Lactamhydrolase, Octanoyl-CoA:oxygen 2-oxidoreductase, Octanoyl-CoA:acetyl-CoA C-acyltransferase, dihydrolipoylprotein:NAD+ oxidoreductase, Lauroyl-CoA:(acceptor) 2,3-oxidoreductase, Lauroyl-CoA:acetyl-CoA C-acyltransferase, (S)-Methylmalonate semialdehyde:NAD+ oxidoreductase, [cytochrome c]-lysine N-methyltransferase, 4-Carboxymethylenebut-2-en-4-olide lactonohydrolase, (5-Glutamyl)-peptide:amino-acid 5-glutamyltransferase, Sucrose 6-phosphate fructohydrolase, methionyl-tRNA formyltransferase, precorrin-2 dehydrogenase, 2-Isopropylmalate hydro-lyase, gamma-Glutamyl-beta-aminopropiononitrile amidohydrolase, Estrone 3-sulfate sulfohydrolase, Tetradecanoyl-CoA:(acceptor) 2,3-oxidoreductase, myristoyl-CoA:acetylCoA C-myristoyltransferase, glycylpeptide N-tetradecanoyltransferase, 3-Isopropylmalate hydro-lyase, phosphoribosyl-ATP diphosphatase, 1-(5-phospho-D-ribosyl)-AMP 1,6-hydrolase, glutaminyl-peptide cyclotransferase, Imidazole acetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, S-(2-Hydroxyacyl)glutathione hydrolase, peptide-L-methionine:thioredoxin-disulfide S-oxidoreductase [L-methionine (S)-S-oxide-forming], 3-Hydroxyisopentyl-CoA hydro-lyase, phosphoribosylglycinamide synthetase, glutamyl transpeptidase, 1-Alkyl-2-acyl-sn-glycero-3-phosphate phosphohydrolase, (S)-3-Hydroxydodecanoyl-CoA hydro-lyase, 3-Hydroxy-L-kynurenine:2-oxoglutarate aminotransferase, phosphoserine transaminase, L-Alanine:3-oxopropanoate aminotransferase, (2S,3S)-3-hydroxy-2-methylbutanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, (2S,3S)-3-Hydroxy-2-methylbutanoyl-CoA hydro-liase, phosphoribosylformylglycinamidine cyclo-ligase, phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase 37 kDa, beta, gamma, alpha, and epsilon subunit, cis-4-Hydroxy-D-proline:oxygen oxidoreductase (deaminating), (S)-3-Hydroxyisobutyryl-CoA hydro-lyase, (R)-4'-Phosphopantothenate:L-cysteine ligase, Tetrahydrofolyl-[Glu](n):L-glutamate gamma-ligase, 4-(2-Aminoethyl)-1,2-benzenediol:o2 oxidoreductase(deaminating)(flavin-containing), 2,4-dienoyl-CoA reductase (NADPH), phosphoribosylglycinamide formyltransferase, homoaconitate hydratase, 1-(5'-Phosphoribosyl)-5-amino-4-imidazolecarboxamide:pyrophosphate phosphoribosyltransferase, L-2-Aminoadipate-6-semialdehyde:NAD(P)+ 6-oxidoreductase, 5-Methyltetrahydropteroyltri-L-glutamate:L-homocysteine S-methyltransferase, methionine synthase, methylthioribose 1-phosphate isomerase, 2-methylcitrate dehydratase, (2S,3R)-3-Hydroxybutane-1,2,3-tricarboxylate hydro-lyase, 3-Isopropylmalate:NAD+ oxidoreductase, S-Adenosyl-L-methionine:zymosterol C-methyltransferase, (R)-2,3-Dihydroxy-3-methylbutanoate:NADP+ oxidoreductase (isomerizing), (R)-2,3-Dihydroxy-3-methylbutanoate hydro-lyase, L-1-pyrroline-3-hydroxy-5-carboxylate dehydrogenase, L-1-pyrroline-3-hydroxy-5-carboxylate dehydrogenase (NADPH), hydroxyethylthiazole kinase, 1-Alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine acetohydrolase, phosphoribosylformylglycinamidine synthase, 4,4-dimethyl-5alpha-cholest-7-en-3beta-ol,NADH:oxygen oxidoreductase (hydroxylating), GDPMANNose:chitobiosyldiphosphodolichol beta-D-mannosyltransferase, 3alpha,7alpha-Dihydroxy-5beta-cholestan-26-al:NAD+ oxidoreductase, ATP:4-amino-2-methyl-5-phosphomethylpyrimidine phosphotransferase, Imidazole-glycerol-3-phosphate synthase, 1-(5'-Phosphoribosyl)-5-amino-4-(N-succinocarboxamide)-imidazole AMP-lyase, AICAR transformylase, biotin---[acetyl-CoA-carboxylase] ligase, biotin---[methylmalonyl-CoA-carboxytransferase] ligase, Biotin:apo-[propionyl-CoA:carbon-dioxide ligase, SAICAR synthetase, biotin---[methylcrotonoyl-CoA-carboxylase] ligase, 2-Amino-4-hydroxy-6-(erythro-1,2,3-trihydroxypropyl) dihydropteridine triphosphate phosphohydrolase (alkaline optimum), D-Galactosyl-N-acetyl-D-galactosaminyl-(N-acetylneuraminyl)-D- galactosyl-D-glucosylceramide galactohydrolase, 2-Amino-4-hydroxy-6-(erythro-1,2,3-trihydroxypropyl) dihydropteridine triphosphate hydrolase, phosphoribosylformiminoaminophosphoribosylimidazolecarboxamide isomerase, (S)-2-Acetolactate pyruvate-lyase, (S)-2-Aceto-2-hydroxybutanoate pyruvate-lyase, S-adenosyl-L-methionine:3-hexaprenyl-4,5-dihydroxylate O-methyltransferase, 4a-hydroxytetrahydrobiopterin hydro-lyase, (S)-3-Hydroxyhexadecanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, (S)-3-Hydroxyhexadecanoyl-CoA hydro-lyase, (S)-3-Hydroxytetradecanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, (S)-3-Hydroxytetradecanoyl-CoA hydro-lyase, (S)-3-hydroxydodecanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, (S)-hydroxydecanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, (S)-hydroxyoctanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, (S)-Hydroxyoctanoyl-CoA hydro-lyase, (S)-hydroxyhexanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, (S)-Hydroxyhexanoyl-CoA hydro-lyase, Hexanoyl-CoA:(acceptor) 2,3-oxidoreductase, Decanoyl-CoA:(acceptor) 2,3-oxidoreductase, Selenomethionine methanethiol-lyase (deaminating), L-selenomethione S-adenosyltransferase, phosphofructokinase, fructose-bisphosphatase, 3-Ketolactose galactohydrolase, Alcohol dehydrogenase, 3alpha,7alpha,24-trihydroxy-5beta-cholestanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, 3alpha,7alpha,12alpha,24-tetrahydroxy-5beta-cholestanoyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, Sulfatide sulfohydrolase, O3-acetyl-L-serine:thiosulfate 2-amino-2-carboxyethyltransferase (reducing, L-cysteine-forming), 3,4-dihydroxyphenylethyleneglycol:NAD+ oxidoreductase, 3,4-Dihydroxymandelaldehyde:NAD+ oxidoreductase, 3,4-Dihydroxymandelaldehyde:NADP+ oxidoreductase, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylacetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylacetaldehyde:NADP+ oxidoreductase, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycolaldehyde:NAD+ oxidoreductase, 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycolaldehyde:NADP+ oxidoreductase, 5-Hydroxyindoleacetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, ATP:adenylylsulfate 3'-phosphotransferase, selenate adenylyltransferase, Selenocystathionine Lysteine-lyase (deaminating), (5-L-glutamyl)-peptide:Se-Methylselenocysteine 5-glutamyltransferase, Se-Adenosylselenohomocysteine hydrolase, Selenocystathionine L-homocysteine-lyase, O-phosphorylhomoserine phosphate-lyase (adding selenocysteine), O-succinyl-L-homoserine succinate-lyase (adding selenocysteine), Cyanoglycoside glucohydrolase, Uroporphyrinogen I carboxy-lyase, 3-Methylimidazole acetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, beta-D-Glucosyl-2-coumarinate glucohydrolase, Polyisopentenylpyrolinate:4-hydroxybenzoate nonaprenyltransferase, GDPMANNose:glycolipid 1,3-alpha-D-mannosyltransferase, formamidopyrimidine nucleoside triphosphate amidohydrolase, 2,5-Diaminopyrimidine nucleoside triphosphate mutase, N4-Acetylaminobutanal:NAD+ oxidoreductase, L-erythro-4-Hydroxyglutamate:NAD+ oxidoreductase, L-erythro-4-Hydroxyglutamate:2-oxoglutarate aminotransferase (predicted), (S)-3-Hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase, 3-Hydroxy-2-methylpropanoate:NAD+ oxidoreductase, ketol-acid reductoisomerase (2-Aceto-2-hydroxybutanoate), mitochondrial, (S)-2-Aceto-2-hydroxybutanoate:NADP+ oxidoreductase (isomerizing), (R)-2,3-Dihydroxy-3-methylpentanoate hydro-lyase, (S)-2-Acetolactate methylmutase, O-Phospho-4-hydroxy-L-threonine:2-oxoglutarate aminotransferase, O-Phospho-4-hydroxy-L-threonine phospho-lyase, NADPH:cytochrome-P-450 oxidoreductase, Gal-beta1->3GalNAc-beta1->4Gal-beta1->4Glc-beta1->1'Cer galactohydrolase, Biotinyl-5'-AMP:apo-[carboxylase] ligase, trans-3-Chloro-2-propene-1-ol:NAD+ oxidoreductase, cis-3-chloro-2-propene-1-ol:NAD+ oxidoreductase, aldehyde dehydrogenase, Chloroacetaldehyde:NAD+ oxidoreductase, Spermidine:eIF5A-lysine 4-aminobutyltransferase (propane-1,3-diamine-forming), phospholipid:diacylglycerol acyltransferase, Protoanemonin lactonohydrolase, amidase, aminodeoxychorismate lyase, (3S)-3-Hydroxyacyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, Acylamide aminohydrolase, flavin-containing monooxygenase, 4,4-dimethyl-5a-cholesta-8,24-dien-3b-ol:NADP+ D14-oxidoreductase, ergosterol:NADP+ D24(241)-oxidoreductase, nitric oxide dioxygenase, 1-phosphatidylinositol-3-phosphate 5-kinase, Non-enzymatic, D-alanine:oxygen oxidoreductase (deaminating), GDP-Man:Man1GlcNAc2-PP-Dol α-1,3-mannosyltransferase, ALG2 (gene name, ambiguous), mannosyl-oligosaccharide glucosidase, mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase, methylamine:oxygen oxidoreductase (deaminating) (copper-containing), L-Allothreonine acetaldehyde-lyase, squalene synthase, Penicillin hydrolase, Aldehyde:NAD+ oxidoreductase, cis-2-Methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienoyl-CoA hydro-lyase, sphingosine-1-phosphate palmitaldehyde-lyase, 3-sn-phosphatidate phosphohydrolase, sedoheptulose-7-phosphate:D-glyceraldehyde-3-phosphate glycolaldehydetransferase, alpha 1,2-mannosyloligosaccharide alpha-D-mannohydrolase, D-xylulose-5-phosphate:thiamin diphosphate glycolaldehydetransferase, D-Sedoheptulose-7-phosphate:thiamin diphosphate glycolaldehydetransferase, 1-hydroxymethylnaphthalene:NAD+ oxidoreductase, (2-naphthyl)methanol:NAD+ oxidoreductase, (S)-3-hydroxyacyl-CoA:NAD+ oxidoreductase, S-(hydroxymethyl)glutathione dehydrogenase, (1R)-hydroxy-(2R)-glutathionyl-1,2-dihydronaphthalene glutathione-lyase (epoxide-forming), (1R)-glutathionyl-(2R)-hydroxy-1,2-dihydronaphthalene glutathione-lyase (epoxide-forming), (1S)-hydroxy-(2S)-glutathionyl-1,2-dihydronaphthalene glutathione-lyase (epoxide-forming), Spontaneous - 1-Naphthol, (1R,2S)-naphthalene 1,2-oxide hydrolase, (1S,2R)-naphthalene 1,2-oxide hydrolase, 1-nitro-7-hydroxy-8-glutathionyl-7,8-dihydronaphthalene glutathione-lyase (epoxide-forming), 1-nitro-7-glutathionyl-8-hydroxy-7,8-dihydronaphthalene glutathione-lyase (epoxide-forming), 1-nitro-5-hydroxy-6-glutathionyl-5,6-dihydronaphthalene glutathione-lyase (epoxide-forming), 1-nitro-5-glutathionyl-6-hydroxy-5,6-dihydronaphthalene glutathione-lyase (epoxide-forming), 1-nitronaphthalene-5,6-oxide hydrolase, Glutathione: 5-HPETE oxidoreductase, Glutathione: 15-HPETE oxidoreductase, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-S-glutathionyl bromobenzene glutathione-lyase (epoxide-forming), 2,3-dihydro-2-S-glutathionyl-3-hydroxy bromobenzene glutathione-lyase (epoxide-forming), bromobenzene-3,4-oxide hydrolase, bromobenzene-2,3-oxide hydrolase, benzo[a]pyrene-7,8-oxide hydrolase, 4,5-dihydro-4-hydroxy-5-S-glutathionyl-benzo[a]pyrene glutathione-lyase (epoxide-forming), 7,8-dihydro-7-hydroxy-8-S-glutathionyl-benzo[a]pyrene hydrolase, S-(2,2-dichloro-1-hydroxy)ethyl-glutathione 2,2-dichloroacetaldehyde-lyase (glutathione-forming), 1,1-dichloroethylene-epoxide:glutathione S-(chloroepoxyethyl)transferase [2-(S-glutathionyl)acetyl-chloride-forming], chloroacetyl-chloride:glutathione S-chloroacetyltransferase, 2-(S-glutathionyl)acetyl-chloride:glutathione 2-(S-glutathionyl)acetyltransferase, trichloroethene:glutathione S-(1,2-dichlorovinyl)transferase, Chloral:NAD(P)+ oxidoreductase, trichloroethanol:NAD+ oxidoreductase, 1,2-dibromoethane:glutathione ethylenetransferase (episulfonium-forming), 2-bromoacetaldehyde:glutathione S-(formylmethyl)transferase, D-arabinitol 2-dehydrogenase, methylglyoxal reductase (NADPH-dependent), S-(hydroxymethyl)glutathione:NADP+ oxidoreductase, 5-methyltetrahydrofolate:NAD+ oxidoreductase, thiol-containing-reductant:hydroperoxide oxidoreductase, S-adenosyl-L-methionine:uroporphyrinogen-III C-methyltransferase, S-adenosyl-L-methionine:precorrin-1 C-methyltransferase, solanesyl-diphosphate:4-hydroxybenzoate nonaprenyltransferase, 2-lysophosphatidylcholine acylhydrolase, sn-glycerol-1-phosphate phosphohydrolase, inositol-3-phosphate synthase, 5,6,7,8-tetrahydropteridine:NAD(P)H+ oxidoreductase, acireductone synthase, 2-hydroxy-5-(methylthio)-3-oxopent-1-enyl phosphate phosphohydrolase, 5-(methylthio)-2,3-dioxopentyl-phosphate phosphohydrolase (isomerizing), cephalosporin C:oxygen oxidoreductase (deaminating), cysteine desulfurase, spermidine:NAD+ oxidoreductase, [eIF5A-precursor]-deoxyhypusine:NAD+ oxidoreductase, dehydrospermidine:[enzyme]-lysine N-4-aminobutylidenetransferase, N-(4-aminobutylidene)-[enzyme]-lysine:[eIF5A-precursor]-lysine N-4-aminobutylidenetransferase, 4,4-dimethyl-9beta,19-cyclopropylsterol-4alpha-methyl oxidase, Delta14-sterol reductase, L-methionine:thioredoxin-disulfide S-oxidoreductase, cis-stilbene-oxide hydrolase, carbamoylphosphate synthetase II, lipoyl synthase protein N6-(octanoyl)lysine:sulfur sulfurtransferase, lipoyl synthase octanoyl-[acp]:sulfur sulfurtransferase, ATP:lipoate adenylyltransferase, lipoate protein ligase, 5-fluoromuconolactone lactonohydrolase, 4-fluoromuconolactone lactonohydrolase, phosphoacetylglucosamine mutase, phosphoglycerate dehydrogenase, 5'-deoxy-5-fluorocytidine aminohydrolase, 5,6-dihydro-5-fluorouracil amidohydrolase, 5-fluorouridine monophosphate:diphosphate phospho-alpha-D-ribosyl-transferase, ATP:5-fluorouridine 5'-phosphotransferase, 6-thioinosine 5'-monophosphate:NAD+ oxidoreductase, 6-thioxanthine 5'-monophosphate:L-glutamine amido-ligase, tamoxifen,NADPH:oxygen oxidoreductase (N-oxide-forming), 4-glutathionyl cyclophosphamide hydrolase, alcophosphamide:NAD+ oxidoreductase, carboxyphosphamide:NAD+ oxidoreductase, carboxyphosphamide:NADP+ oxidoreductase, 2-phenyl-1,3-propanediol monocarbamate:NAD+ oxidoreductase, 3-carbamoyl-2-phenylpropionaldehyde:NAD+ oxidoreductase, 4-hydroxy-5-phenyltetrahydro-1,3-oxazin-2-one:NAD+ oxidoreductase, S-adenosylmethioninamine:cadaverine 3-aminopropyltransferase, tryparedoxin:hydroperoxide oxidoreductase, trypanothione:hydroperoxide oxidoreductase, 2'-deoxyribonucleoside-diphosphate:tryparedoxin-disulfide 2'-oxidoreductase, 2'-deoxyribonucleoside-diphosphate:trypanothione-disulfide 2'-oxidoreductase, purine-nucleoside:phosphate ribosyltransferase, R-nitrile:glutathione R-transferase, R-sulfate-ester:glutathione R-transferase, NADPH:ferricytochrome-b5 oxidoreductase, 2-Oxoglutarate dehydrogenase complex, cytochrome P-450 reductase, choline dehydrogenase, 2-Aminobut-2-enoate aminohydrolase (spontaneous), 2-aceto-2-hydroxybutanoate synthase, sn-glycerol 3-phosphate:ubiquinone oxidoreductase, glycerol-1-phosphate phosphohydrolase, 2-Aminoacrylate aminohydrolase, S-adenosyl-L-methionine:3-Polyprenyl-4,5-dihydroxylate 5-O-methyltransferase, 5,10-methylenetetrahydromethanopterin:glycine hydroxymethyltransferase, 2,3,5-trichlorodienelactone lactonohydrolase, dienelactone hydrolase, (2E,6E)-farnesyl-diphosphate:isopentenyl-diphosphate farnesyltranstransferase, geranylgeranyl-diphosphate:isopentenyl-diphosphate transferase, 5-methyltetrahydropteroyltri-L-glutamate:L-selenohomocysteine Se-methyltransferase, 2,5-diamino-6-(5-phospho-D-ribitylamino)pyrimidin-4(3H)-one:NAD+ 1'-oxidoreductase, 2,5-diamino-6-(5-phospho-D-ribitylamino)pyrimidin-4(3H)-one:NADP+ 1'-oxidoreductase, epoxide hydrolase, microsomal epoxide hydrolase, xylitol:NAD+ oxidoreductase, hydantoin racemase, fatty-acid--CoA ligase (octanoate), fatty-acid--CoA ligase (decanoate), fatty-acid--CoA ligase (dodecanoate), fatty-acid--CoA ligase (tetradecanoate), fatty-acid--CoA ligase (tetradecenoate), fatty-acid--CoA ligase (hexadecanoate), fatty-acid--CoA ligase (hexadecenoate), fatty-acid--CoA ligase (octadecanoate), fatty-acid--CoA ligase (octadecenoate), fatty-acid--CoA ligase (octadecynoate), fatty-acid--CoA ligase (n-C24:0), fatty-acid--CoA ligase (n-C26:0), fatty-acyl-ACP hydrolase, 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone endoplasmic reticular transport via diffusion, ceramide-1 (C24) endoplasmic reticular transport, ceramide-1 (C26) endoplasmic reticular transport, ceramide-2 (C24) endoplasmic reticular transport, ceramide-2 (C26) endoplasmic reticular transport, dolichol phosphate endoplasmic reticular transport via proton symport, ergosterol endoplasmic reticular transport, Ergosta-5,6,22,24,(28)-tetraen-3beta-ol endoplamic reticular transport, glucose 6-phosphate endoplasmic reticular transport via diffusion, H2O endoplasmic reticulum transport, O2 transport, endoplasmic reticulum, sphinganine 1-phosphate endoplasmic reticular transport, Squalene-2,3-epoxide endoplamic reticular transport, squalene endoplamic reticular transport, Diphosphate endoplasmic reticulum transport, FAD endoplasmic reticulum transport, Proton endoplasmic reticulum transport, Formate endoplasmic reticulum transport, FADH2 endoplasmic reticulum transport, NADH endoplasmic reticulum transport, NAD endoplasmic reticulum transport, CO2 endoplasmic reticulum transport, SAH endoplasmic reticulum transport, 2-oxoglutarate reversible transport via symport, 3mop reversible trasport, acetaldehyde reversible transport, acetate reversible transport via proton symport, acetate transporter, adenine transport in via proton symport, adenosine transport in via proton symport, allantoate irreversible uniport, allantoin irreversible uniport, alpha-ketoglutarate/malate transporter, ammonia reversible transport, ATPase, cytosolic, Biotin uptake, C080decanoate (n-C18:0) transport in via uniport, C080decenoate (n-C18:1) transport in via uniport, C080decynoate (n-C18:2) transport in via uniport, choline transport via proton symport, citrate reversible transport via symport, CO2 transporter via diffusion, cytidine transport in via proton symport, cytosine transport in via proton symport, D-arabinose reversible transport, deoxyadenosine transport in via proton symport, deoxycytidine transport in via proton symport, deoxyguanosine transport in via proton symport, deoxyinosine transport in via proton symport, deoxyURIdine transport in via proton symport, D-fructose transport in via proton symport, D-galactose transport in via proton symport, D-lactate transport via proton symport, D-mannose transport in via proton symport, D-sorbitol transport via passive diffusion, dTTP reversible uniport, D-xylose reversible transport, ethanol reversible transport, fatty acid transport, formate transport via diffusion, glucose transport (uniport), glutathione transport, glycerol transport via channel, glycerol transport via symport, glycine reversible transport via proton symport, Glycoaldehydye reversible transport, glyoxylate transport, guanine reversible transport via proton symport, guanosine transport in via proton symport, H2O transport via diffusion, Hexadecanoate (n-C16:0) transport in via uniport, hexadecenoate (n-C16:1) transport in via uniport, hypoxanthine reversible transport via proton symport, iron (II) transport, L-alanine reversible transport via proton symport, L-arabinoase extracellular transport, L-arganine reversible transport via proton symport, L-asparagine reversible transport via proton symport, L-aspartate reversible transport via proton symport, L-cysteine reversible transport via proton symport, L-glutamate transport via proton symport, reversible, L-glutamine reversible transport via proton symport, L-histidine reversible transport via proton symport, L-isoleucine reversible transport via proton symport, L-lactate reversible transport via proton symport, L-leucine reversible transport via proton symport, L-lysine reversible transport via proton symport, L-malate reversible transport via proton symport, L-methionine reversible transport via proton symport, L-phenylalanine reversible transport via proton symport, L-proline reversible transport via proton symport, L-serine reversible transport via proton symport, L-sorbitol transport via passive diffusion, L-sorbose reversible transport, L-threonine reversible transport via proton symport, L-tryptophan reversible transport via proton symport, L-tyrosine reversible transport via proton symport, L-valine reversible transport via proton symport, maltose transport in via proton symport, N,N-bisformyl-dityrosine transport (extracellular), NADP transporter, Nicotinic acid transport, nmntp, o2 transport (diffusion), orntithine reversible transport in via proton symport, Oxaloacetate transport, oxidized glutathione irreversible uniport, Pantothenate reversible transport via proton symport, PAP reversible uniport, peptide transport in via proton symport, Phenethyl acetate transport (extracellular), Phenylacetaldehyde transport (extracellular), phosphate reversible transport via symport, potassium reversible transport via proton symport, Pyruvate exchange, diffusion, pyruvate transport in via proton symport, riboflavin transport in via proton symport, ribose transport in via proton symporter, sodium proton antiporter (H:NA is 1:1), spermidine excretion (cytosol to extracellular), spermidine transport in via proton antiport, spermine transport via proton antiport irreversible, succinate transport via proton symport, sucrose transport in via proton symport, sulfate irreversible uniport, sulfite transport (efflux, cytosol to extracellular), taURIne transport, Thiamine transport in via proton symport, thymidine transport in via proton symport, thymine reversible transport via proton antiport, trehalose transport in via proton symporter, Tryptophol transport (extracellular, uracil transport in via proton symport, urea reversible transport via proton symport (2 H+), URIdine transport in via proton symport, xanthine reversible transport, xanthosine transport in via proton symport, Xylitol transport via passive diffusion, zymosterol reversible transport, 2-methylbutyl transport (extracellular), 2-Methylbutanal transport (extracellular), 2-methyl-1-butanol transport (extracellular), 2-methylpropanal transport (extracellular), 2-phenylethanol reversible transport, 2-Isopropylmalate transport, diffusion, 3-methylbutanal transport (extracellular), 4-Aminobenzoate mitochondrial transport via diffusion, 5-Aminolevulinate transport in via proton symport, 8-Amino-7-oxononanoate reversible transport via proton symport, L-arabinitol transport via passive diffusion, 4-aminobutyrate reversible transport in via proton symport, acetic ester transport (extracellular), S-adenosyl-L-methionine transport in via proton symport, (R,R)-butanediol transport, 7,8-Diaminononanoate reversible transport via proton symport, ePisterol reversible transport, ergosterol reversible transport, ethanolamine transport via diffusion (extracellular), fecosterol reversible transport, fumarate reversible transport via symport, glycero-3-phosphocholine transport (extracellular to cytosol), glycero-3-phospho-1-inositol transport (extracellular to cytosol), D-glucosamine 6-phosphate reversible uniport, Isoamyl acetate transport (extracellular), isoamyl alcohol transport (extracellular), Isobutyl acetate transport (extracellular), isobutyl alcohol transport (extracellular), Indoleacetaldehyde transport (extracellular), inosine transport in via proton symport, inositol transport in via proton symport, lanosterol reversible transport, melibiose transport in via symport, S-methylmethionine permease, ammonia transport (efflux, cytosol to extracellular), putrescine transport in via proton antiport, irreversible, putrescine excretion (cytosol to extracellular), CO2 Golgi transport, GDP-mannose antiport, GDP Golgi transport via proton anitport, phosphatidylethanolamine Golgi transport , phosphatidylserine Golgi transport , UDPgalactose transport (Golgi apparatus), Diphosphate Mitochondrial transport, 2-Dehydro-3-deoxy-D-arabino-heptonate7-phohsphate mitochondrial transport via diffusion, 2-Dehydropantoate mitochondrial transport, OBUT transporter (mitochondrial), 2-oxoadipate transport out of mitochondria via diffusion, Chorismate mitochondrial transport, 3-(4-hydroxyphenyl)pyruvate mitochondrial transport via proton symport, 2-Isopropylmalate transport, diffusion, mitochondrial, 3-Carboxy-4-methyl-2-oxopentanoate transport, diffusion, mitochondrial, 3-Hexaprenyl-4,5-dihydroxybenzoate transport, mitochondrial, 3-methyl-2-oxobutanoate transport, diffusion, mitochondrial, 3-Methyl-2-oxopentanoate transport, diffusion, mitochondrial, 3-C080prenyl-4-hydroxybenzoate mitochondrial transport, 4-aminobutanal mitochondrial transport via diffusion, 4-aminobutanoate mitochondrial transport via diffusion, 4-Hydroxybenzoate mitochondrial transport, trans-4-hydroxy-L-proline mitochondrial transport via diffusion, 5-Aminolevulinate mitochondrial transport, acetaldehyde mitochondrial diffusion, acetate transport, mitochondrial, adenine reversible transport, mitochondria, S-adenosyl-L-homocysteine reversible transport, mitochondrial, Alanine transport from mitochondia to cytoplasm, S-Adenosyl-L-methionine reversible transport, mitochondrial, arginine mitochondrial transport via proton symport, asparagine mitochondrial transport via proton transport, Aspartate-glutamate transporter, aspartate mitochondrial transport via proton symport, ADP/ATP transporter, mitochondrial, citrate transport, mitochondrial, CO2 transport (diffusion), mitochondrial, CoA transporter (mitochondrial), irreversible, CTP/CMP antiport, D-lactate/pyruvate antiport, mitochondrial, D-lactate transport, mitochondrial, dihydroxyacetone phosphate transport, mitochondrial, dihydrofolate reversible mitochondrial transport, dhnpt mitochondrial transport, Dihydropteroate mitochondrial transport via diffusion, L-erythro-4-hydroxyglutamate mitochondrial transport via diffusion, D-erythrose 4-phosphate mtiochondrial transport via diffusion, ethanol transport to mitochondria (diffusion), fatty-acyl-ACP mitochondrial transport, FAD/FMN antiport, iron (II) uptake (mitochondrial), formate mitochondrial transport, fumarate reductase, cytosolic/mitochondrial, farnesyl diphosphate transport (mitochondrial), glycoaldehyde mitochondrial transport, L-glutamate transport into mitochondria via hydroxide ion antiport, Glutamate transport (uniporter), mitochondrial, glycerol-3-phosphate shuttle, glycine mitochondrial transport via proton symport, guanosine mitochondrial transport via proton symport, GTP/GDP translocase, mitochondrial (electroneutral), guanine mitochondrial transport via diffusion, H2O transport, mitochondrial, all-trans-hexaprenyl diphosphate transport, mitochondrial, histidine mitochondrial transport via proton symport, Hydroxymethylglutaryl-CoA reversible mitochondrial transport, isoamyl alcohol transport (mitochondrial), isobutyl alcohol transport (mitochondrial), indole-3-acetaldehyde mitochondrial transport via diffusion, Isoleucine transport from mitochondria to cytosol, indole-3-acetate mitochondrial transport via diffusion, Tryptophol transport (mitochondrial), Isopentenyl diphosphate transport, mitochondrial, L-lactate transport, mitochondrial, Lysine mitochondrial transport via proton symport, malate transport, mitochondrial, methionine mitochondrial transport via proton symport, NH3 mitochondrial transport, NMN mitochondrial transport via proton symport, oxaloacetate transport, mitochondrial, ornithine mitochondrial transport via proton antiport, 2-oxodicarboylate transporter, mitochondrial, Phenylacetaldehyde transport (mitochondrial), panthetheine 4'-phosphate reversible mitochondrial transport, pantothenate mitochondrial transport, Adenosine 3',5'-bisphosphate mitochondrial transport, phosphatidate reversible transport, mitochondrial , all-trans-Pentaprenyl diphosphate transport, mitochondrial, phosphatidylethanolamine mitochondrial transport , Phenylalanine mitochondrial transport via proton symport, phosphate transporter, mitochondrial, phosphate transport via hydroxide ion symport, mitochondrial, protoporphyrinogen IX mitochondrial transport, L-proline transport, mitochondrial, PRPP reversible transport, mitochondrial, phosphatidylserine mitochondrial transport , pyruvate mitochondrial transport via proton symport, Quinolinate reversible mitochondrial transport, Riboflavin reversible mitochondrial transport, serine mitochondrial transport via proton symport, succinate transport, mitochondrial, succinate-fumarate transport, mitochondrial, Thiamine diphosphate transport, mitochondria, threonine mitochondrial transport via proton symport, tryptophan mitochondrial transport via proton symport, tyrosine mitochondrial transport via proton symport, UTP/UMP antiport, Valine reversible mitochondrial transport via proton symport, acetyl-CoA transport, nuclear, 2-oxoglutarate nuclear transport via proton symport, AMP transport via diffusion (cytosol to nucleus), aspartate nuclear transport via proton symport, L-aspartate nuclear transport via diffusion, N-carbomoyl-L-aspartate transport, diffusion, carbamoyl phosphate nuclear transport via diffusion, CDP nuclear transport, CO2 nuclear transport via diffusion, coenzyme A transport, nuclear, DADP nuclear transport, dCDP nuclear transport, dGDP nuclear transport, dUMP nuclear transport, GDP nuclear transport, glutamine nuclear transport via proton symport, glutamate nuclear transport via proton symport, hydrogen peroxide nuclear transport, H2O transport, nuclear, bicarbonate nuclear transport via diffusion, 1D-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate nuclear transport via diffusion, inositol hexakisphosphate nuclear transport (diffusion), NAD transport, nuclear through pores, ammonia nuclear transport, phosphate nuclear transport via proton symport, phosphatidyl-1D-myo-insoitol nuclear transport , phosphatidyl-1D-myo-4-inositol nuclear transport , UMP nuclear transport, 3-(4-hydroxyphenyl)pyruvate peroxisomal transport via proton symport, 4-hydroxy-2-oxoglutarate peroxisomal transport via diffusion, acetate transport, peroxisomal, AKG transporter, peroxisome, aspartate-glutamate peroxisomal shuttle, AMP/ATP transporter, peroxisomal, ADP/ATP transporter, peroxisomal, citrate/malate antiport into peroxisome, citrate/isocitrate antiport into peroxisome, CO2 peroxisomal transport, cystathione peroxisomal transport, L-erythro-4-hydroxyglutamate peroxisomal transport via diffusion, fatty acid peroxisomal transport, glyoxylate transport, peroxisomal, H2O transport, peroxisomal, Homocysteine peroxisomal transport via proton symport, malate/oxaloacetate shuttle, ammonia peroxisomal transport, NMN peroxisomal transport via proton symport, phosphate peroxisomal transport via proton symport, pyruvate peroxisomal transport via proton symport, oxidized thioredoxin peroxisomal transport via diffusion, reduced thioredoxin peroxisomal transport via diffusion, tyrosine peroxisomal transport via proton symport, L-arginine transport in via proton antiport (vacuolar), L-asparagine transport in via proton antiport (vacuolar), L-asparagine transport out via proton symport, vacuolar, L-aspartate transport out via proton symport, vacuolar, CO2 vacuolar transport, Glycogen vacuolar 'transport' via autophagy, glucose transport, vacuolar, L-glutamine transport in via proton antiport (vacuolar), L-glutamine transport out via proton symport, vacuolar, L-glutamate transport out via proton symport, vacuolar, Reduced glutathione via ABC system (vacuolar), H2O transport, vacuolar, L-histidine transport in via proton antiport (vacuolar), L-isoleucine transport in via proton antiport (vacuolar), L-isoleucine transport out via proton symport, vacuolar, L-cystine transport via proton symport (vacuolar), L-leucine transport in via proton antiport (vacuolar), L-leucine transport out via proton symport, vacuolar, L-lysine transport in via proton antiport (vacuolar), phosphatidylethanolamine vacuolar transport , phosphate vacuolar transport via proton symport, phosphatidylserine vacuolar transport , Taurcholate via ABC system (vacuolar), trehalose vacuolar transport via proton symport, L-tyrosine transport in via proton antiport (vacuolar), L-tyrosine transport out via proton symport 및 vacuolar로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 구축된 대사 네트워크 모델에서 효소 반응식 차단 시뮬레이션은 상기 대사흐름 벡터(ν)에서 차단시키고자 하는 효소 반응식의 해당 대사흐름을 0(= νj)으로 고정시킨 상태에서 세포 생장 속도를 목적함수로 설정하고 이를 최대화하도록 선형계획법을 실행한다.

상기 Kluyveromyces marxianus 대사 네트워크를 구성하고 있는 효소 반응식들에 대하여 세포 성장 반응식의 대사속도 또는 대사흐름값을 0으로 고정하고 상기 효소 반응식들을 한 개씩 또는 여러 개의 조합을 구성하여 차단시키면서 용매 생성식의 흐름값을 최대화하는 선형계획법을 적용하였을 때, 차단하지 않았을 때에 비해 젖산 생산능을 증가시키는 경우의 차단된 효소 반응식들을 2차 결실 표적효소 후보(II)로 선정한다. 이는 용매 생성이 안정기에서 활발히 일어난다는 기존의 실험 결과들을 모델에 반영하기 위함이다.

상기 단계에서 얻은 결과들인 결실 표적 후보(I) 및 2차 결실 표적효소(II)를 비교하여 중복되는 결실 표적 효소 후보들을 최종 결실 표적 효소군으로 선정하거나, 이를 코딩하는 유전자를 결실 표적유전자로 선정한다. 이 단계는 대사흐름분석을 통하여 전체적인 산 생성기와 용매 생성기의 대사 흐름을 살펴봄으로써 젖산 생산에 가장 적합한 결실 표적 후보군을 통합하는 단계이다. 다만, 상기에서 (1) 단계만을 수행하여 결실 표적을 수득하는 것도 가능하다.

또한, 2차 변형 대사 경로를 기반으로 하여 생성된 대사산물 및/또는 세포 조성 정보를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

이때 대사산물은 대사 중간물 또는 대사 최종물일 수 있다. 구체적으로는 숙신산, 젖산, 3HP 일 수 있으며, 특히 3HP 일 수 있다.

또한, 획득된 대사산물 및 세포 조성 정보를 기반으로 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

용어, "대사산물-생체량 관련식"은 미생물이 생산하는 대사산물과 생체량의 관계를 나타내는 식이다. 또한, 이를 그래프로 표시한 것을 트레이드-오프 커브 그래프라고 한다.

상기 대사산물-생체량 관련식 및 트레이드-오프 커브 그래프를 통하여 생체량의 증감과 대사산물의 생산량의 관계를 알 수 있다.

또한, 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계 내지 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 반복하여 최적의 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

미생물내의 대사 경로에 관여하는 다양한 효소의 활성을 변형하여 2차 변형 대사 경로를 획득하고, 그에 따른 최적의 대사산물-생체량 관련식을 획득하고 이를 이용하여 대사산물-생체량 관련식을 얻을 수 있다. 이때 "최적"이란 생체량이 일정량 유지 또는 증가하는 동시에 가장 많은 대사산물을 생성할 때를 의미한다.

또한, 상기 최적의 대사산물-생체량 관련식의 기반이 되는 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 최적의 대사산물-생체량 관련식을 얻을 수 있는 2차 변형 대사 경로를 획득하여, 대사산물을 가장 효율적으로 얻기 위한 반응식을 얻을 수 있다.

이와 같이 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 대사 경로를 예측하여, 이를 이용하여 미생물의 형질전환을 구상할 수 있다.

또 다른 양상은 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 2차 변형 대사 경로를 포함하는 형질전환 미생물을 제공한다.

이때, 상기 미생물은 E.coli, 효모 등일 수 있으며, 바람직하게는 Kluyveromyces marxianus 일 수 있다.

상기 미생물은 목적하는 대사산물을 생성할 수 있다. 예를 들면, 숙신산, 젖산, 3HP 등을 생산할 수 있으며, 특히 3HP 일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 변이 미생물을 이용한 특정 대사산물의 제조방법에 관한 것이다. 이는 상기 변이 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 특정 대사산물을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 특정 대사산물은 3HP일 수 있다.

상기 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등에서 배양될 수 있다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 등이 이용될 수 있다. 또한, 미생물이 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 무기질소화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1 ~ 10 %의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건일 수 있다.

일 구체예에 따른 대사 네트워크 모델은 3HP 생성 미생물의 대사 흐름 및 대사특성을 분석하여, 특정 대사산물의 생산을 증가시키기 위한 최적 대사경로를 설계하는데 유용하다. 또한, 일 구체에에 따른 3HP 생성 미생물의 대사 네트워크 모델에 기반한 최적 대사경로 설계 방법은 인간의 직관과 추론에 의한 생산능 향상 경로 탐색과는 달리, 빠른 시간 내에 시스템 수준에서 예측할 수 있게 한다. 또한, 상기 방법에 따라 선정된 외부 효소 반응을 3HP 생성 균주에서 도입함으로써 시간 및 비용을 절약하고 3HP 등 특정 대사산물을 고효율로 생산할 수 있는 변이 미생물을 용이하게 얻을 수 있는 장점이 있다.

도 1은 Kluyveromyces marxianus에 3가지의 외부 효소 반응들이 각각 하나씩만 도입되었을 때의 트레이드-오프 커브 그래프로서, Kluyveromyces marxianus에서의 각 외부 효소 반응의 3HP 생산능을 나타낸 것이다.
도 2는 Saccharomyces cerevisiae에 Kluyveromyces marxianus에 도입한 것과 동일한 3가지 외부 효소 반응을 하나씩 도입하였을 때의 트레이드-오프 커브 그래프로서, Saccharomyces cerevisiae에서의 각 외부 효소 반응의 3HP 생산능을 나타낸 것이다.
도 3은 Kluyveromyces marxianus와 Saccharomyces cerevisiae에서 MalCoA와 글리세롤 효소 반응식을 각각 도입하였을 때의 3HP 생산능 비교한 것이다.
도 4는 다양한 3-HP 생산 경로를 나타낸 것이다.
도 5는 효소와 반응식을 나타낸 것이다.
도 6은 효소 반응식에 이용된 약어에 대한 설명을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 하기 실시예에서는 Kluyveromyces marxianus를 모델 시스템으로 이용한 방법에 대하여만 예시되어 있으나, Kluyveromyces marxianus 이외의 다른 3HP 생성 미생물의 경우에도 적용된다는 것은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업자에게 자명하다.

<실시예 1> Kluyveromyces marxianus 의 세포 조성 분석

각종 문헌의 정보와, 문헌 정보가 없는 부분들은 실제 발효로 얻은 시료를 직접 분석하거나 유연 관계가 가까운 균주로부터 참조하여 얻은 정보를 이용하여 대사 네트워크에 필수적인 세포의 생체량 합성 방정식을 구성하였다.

첫째로, 세포를 구성하는 거대 분자의 조성(macromolecular composition)은 각각 다음과 같은 방법을 통해 얻어서 이용하였다. 단, 여기에서 세포는 단백질, RNA, DNA, 인지질(phospholipids), 세포벽(다당류), 기타 미량 성분으로 나뉜다고 가정하였다.

단백질의 아미노산 조성 분석은 실제로 Kluyveromyces marxianus를 발효하여 얻은 시료를 기초과학지원연구원 프로테오믹스팀에 분석을 의뢰하여 얻었다. 그리고 DNA를 구성하는 뉴클레오티드(nucleotide)의 조성 분석은 이미 염기 서열이 완료되었기 때문에 이 염기서열의 조성을 분석하여 얻었다. RNA 또한 mRNA, tRNA, rRNA의 비율을 알고 있는 염기서열의 조성을 분석하여 얻었다. 다음으로 인지질의 지방산 조성 및 극성기의 조성은 실제 GC를 통하여 측정하였다. 마지막으로 기타 성분들은 문헌(Composition of the cell walls of several yeast species ,Nguyen TH et al., Appl Microbiol Biotechnol (1998); Appropriate sampling for intracellular amino acid analysis in 5 phylogenitically different yeast, Bolten CJ and Wittmann C, Biotechnol Lett (2008); Ethanol tolerance and membrane fatty acid adaptation in adh multiple and null mutants of Kluyveromyces lactis ,Heipieper HJ et al., Res. Microbiol. (2000); Simple control of specific growth rate in biotechnological fed-batch processes based on enhanced online measurements of biomass ,Dabros M et al., Can. J. Microbiol. (2010); The heterogeneity of Glucan Preparations from the Wall of Various Yeasts, Manners DJ, Masson AJ and Patterson JC, Journal of General Microbiology (1974); The structure of a beta-1-3-D-Glucan from Yeast Cell Walls, Manners DJ, Masson AJ and Patterson JC, Biochem. J. (1973); A systematic study of the cell wall composition of K lactis, Backhaus K et al., Yeast (2010))에 나와 있는 자료를 토대로 이용하였다.

상기의 방법을 통하여 얻은 정보로부터 표2 내지 표9의 세포 조성을 구하였다. 얻어진 세포 조성을 바탕으로 다음과 같은 생장 관련식을 만들었다.

구축된 대사 네트워크에 사용된 GPR 관계

단백질 반응 네트워크	도 5 참조
약어	도 6 참조

Kluyveromyces marxianus 의 고분자화합물 조성

Component	g·g -1 DW
Protoplast
Protein	0.546
DNA	0.007
RNA	0.107
Lipids	0.052
Cell wall
Carbohydrates	0.265
SUM	1.000

아미노산 조성

Amino acid	% protein (w/w)	MW, g/mol	mmol/g protein
Alanine Arginine Asparagine Aspartate Cysteine Glutamate Glutamine Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine	0.068 0.046 0.033 0.033 0.004 0.047 0.047 0.068 0.034 0.067 0.086 0.028 0.019 0.070 0.116 0.056 0.078 0.001 0.018 0.079	71.09 156.20 114.12 115.10 103.16 128.15 129.15 57.07 137.16 113.18 113.18 128.19 131.21 147.19 97.13 87.09 101.12 186.23 163.19 99.15	0.959 0.296 0.286 0.286 0.034 0.366 0.366 1.189 0.251 0.593 0.760 0.220 0.148 0.477 1.198 0.648 0.768 0.004 0.113 0.801
Energy requirement for polymerisation(ATP): 41.5

DNA 조성

Nucleotide	mol/mol DNA	MW g/mol	mmol/g DNA
dAMP dCMP dTMP dGMP	0.299 0.201 0.299 0.201	313.2 289.2 304.2 329.2	0.963 0.647 0.963 0.647
Energy requirement for polymerisation(ATP): 4.40

RNA 조성

Nucleotide	mRNA 5%	mol/mol RNA rRNA 75%	tRNA 20%	MW g/mol	mol/mol RNA	mmol/g RNA
AMP GMP CMP UMP	0.299 0.201 0.201 0.299	0.267 0.258 0.194 0.281		329.2 345.2 305.2 306.2	0.215 0.204 0.156 0.226	0.835 0.790 0.604 0.876
Energy requirement for polymerisation(ATP): 1.25

인지질 성분의 분자량

Constituent	backbone	MW, g/mol # of fatty acids residues	total
Fecosterol Phosphatidylinositol Phosphatidylcholine Phosphatidylserine Phosphatidylethanolamine Phosphatidylglycerol Phosphatidic acid Cardiolipin	398.664 300.200 223.207 223.121 181.128 212.139 228.094 332.183	0 2 2 2 2 2 2 4	398.66 762.74 685.75 685.66 643.67 674.68 690.63 1257.26

인지질에서 지방산의 조성

Fatty acid	g/g total fatty acids	MW, g/mol	mmol/g total fatty acids	mol/mol total fatty acids
C08 C10 C12 C14 C16 C16:1 C18 C18:1	0.1136484 0.047444 0.0432309 0.073 0.435 0.288	144 172 200 228 255 253 283 281	0.79 0.28 0.22 0.32 1.71 0.00 1.02 0.00	0.183 0.064 0.050 0.074 0.394 0.000 0.235 0.000
Average molecular weigh 231			SUM: 0.70

저분자 조성

Molecular	MW, g/mol	g/g pool of small molecules	mmol/g pool of small molecules
NAD NADP COA Q THF hemeA FMN FAD	664.438 744.418 767.534 853.365 445.434 852.837 456.348 785.557	0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125	0.188 0.168 0.163 0.146 0.281 0.147 0.274 0.159

탄수화물 조성

Component	Molar ratio	MW, g/mol	mmol/g carbohydrate
Chitin a-Glucan b-Glucan	0.0 0.3 0.3	185 162 162	0.101 3.026 3.026

1. 단백질 생합성 방정식( 1g 단백질의 합성을 위한 mmol):

0.959 ala_c + 0.266 arg_c + 0.286 asn_c + 0.286 asp_c + 0.034 cys_c + 0.366 gln_c + 0.366 glu_c + 1.189 gly_c + 0.251 his_c + 0.593 ile_c + 0.760 leu_c+ 0.220 lys_c + 0.148 met_c + 0.477 phe_c + 1.198 pro_c + 0.648 ser_c + 0.768 thr_c + 0.004 trp_c + 0.113 tyr_c + 0.801 val_c + 41.5 atp_c -> 41.5 adp_c + 41.5 pi_c + PROTEIN

2. DNA 생합성 방정식 (DNA 1g의 합성을 위한 mmol):

0.963 datp_n + 0.647 dctp_n + 0.963 dttp_n + 0.647 dgtp_n + 26.0 atp_n -> DNA + 26.0 adp_n + 26.0 pi_n + 3.223 ppi_n

3. RNA 생합성 방정식 (RNA 1g의 합성을 위한 mmol):

0.835 atp_n + 0.790 gtp_n + 0.604 ctp_n + 0.8876 utp_n + 1.25 atp_n -> RNA + 1.25 adp_n + 1.25 pi_n + 3.119 ppi_n

4. 인지질 생합성을 방정식(인지질 1g의 합성을 위한 mmol):

0.229 ptd1ino_c + 0.1 pc_c + 0.038 ps_c + 0.1 pe_c + 0.324 pa_c + 0.026 cl_m + 0.012 fecost_r -> PHOSPHOLIPID

5. 저분자 물질 합성 방정식 (소분자 1g의 합성을 위한 mmol):

0.188 NAD_c + 0.168 NADP_c + 0.163 CoA_c + 0.146 Q_m + 0.281 THF_c + 0.274 FMN_c + 0.159 FAD_c + 0.1 P5P_c -> COF

6. 탄수화물 생합성 방정식 (탄수화물 1g의 합성을 위한 mmol):

3.026 Adglcn_c + 3.026 13BDglcn_c + 0.101 C00461 + 12.8 atp_c -> CARBOHYDRATE + 12.8 adp_c + 12.8 pi_c

또한, 상기 조성으로부터 얻은 세포 성장 반응식은 다음과 같으며, 이를 본 발명에 따른 최적 대사경로 선정 방법에 적용하였다.

7. 생체량 합성 방정식(생체량 1g의 합성을 위한 g)

0.56 PROTEIN + 0.107 RNA + 0.007 DNA + 0.052 PHOSPHOLIPID + 0.03 COF + 0.110 CW + 0.265 CARBOHYDRATE + 70.37 ATP

-> BIOMASS + 70.37 ADP + 70.37 Pi

<실시예 2> Kluyveromyces marxianus 의 대사 네트워크 구축 및 대사흐름분석을 통한 3HP 생산능 최적 경로 예측과 3HP 생산균주로써의 Kluyveromyces marxianus 의 우수성 확인

이미 서열이 알려져 있는 Kluyveromyces marxianus의 게놈 정보 및 각 유전자 주석(annotation)에 대한 정보를 토대로 얻은 이 균주에 존재하는 효소 반응식들에 대한 GPR 관계와 위에서 얻은 균주의 세포 조성 정보를 이용해서 Kluyveromyces marxianus의 초벌 대사 네트워크를 구축하고, 여기에 대사산물(이 경우 3HP)의 생산을 위해 외부로부터 Kluyveromyces marxianus에 도입할 수 있는 3가지 효소반응들을 추가하여 3HP 생성 Kluyveromyces marxianus의 대사 네트워크를 구축하였다.

이렇게 구축된 대사 네트워크를 이용해서 가장 적합한 대사경로를 제공하는 외부효소반응을 선정하기 위해 효소반응식들을 선형계획법에 적용하였다. 이때, 목적함수로 3HP생산속도와 세포성장속도를 지정하여 이 둘 간의 트레이드-오프 관계를 확인함으로써 가장 적합한 최적 대사경로를 제공하는지 확인할 수 있었고 이 트레이드-오프 그래프는 도 1 에 도시하였다.

그리고 가장 흔한 yeast 균주인 Saccharomyces cerevisiae의 3HP 생산 트레이드-오프 커브를 구하여 도 2 에 도시하고 이를 비교한 그래프를 도 3 에 보였다. 그 결과, 우선, 도 1을 통해 Kluyveromyces marxianus에 도입된 3종류의 외부효소반응의 3HP 생산능을 비교해 볼 수 있었다.

그리고 다음으로 도 3을 통해서 Glucose MalCoA를 3HP 생산경로로 사용했을 때의 Kluyveromyces marxianus와 Saccharomyces cerevisiae 의 3HP 최대 생산량이 Kluyveromyces marxianus가 높음을 확인할 수 있었는데, 이는 새로이 개발한 3HP 생산 Kluyveromyces marxianus 균주가 기존의 yeast 균주보다 3HP이 생산능이 높다는 사실을 보여준다.

이로써, 외부 효소반응 도입을 통해 개발된 Kluyveromyces marxianus 균주의 효과적 3HP 생산 균주로써의 적합성을 증명하였다.

한편, 본 발명의 대사 네트워크에서 사용된 대사산물의 약어 및 이의 정식명칭은 <표 1>에 정리되어 있다.

Claims (18)

1. 미생물내의 대사 네트워크에서 효소들이 관여하는 생화학적 반응에 관한 정보를 포함하는 데이터베이스에 기초하고, 미생물의 배양조건, 미생물이 생성하는 대사산물 및 미생물의 세포 조성정보 중 적어도 하나를 이용하여 미생물내의 대사 경로 및 생체량 합성 방정식을 획득하는 단계;
   상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로를 도입하여, 1차 변형 대사 경로를 획득하는 단계;
   1차 변형 대사경로에 관여하는 적어도 하나의 효소 반응을 변형하여, 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계;
   2차 변형 대사 경로를 기반으로 하여 생성된 대사산물 및/또는 생체량 정보를 획득하는 단계;
   획득된 대사산물 및 생체량 정보를 기반으로 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계;
   2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계 내지 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계를 반복하여 최적의 대사산물-생체량 관련식을 획득하는 단계; 및
   상기 최적의 대사산물-생체량 관련식의 기반이 되는 2차 변형 대사 경로를 획득하는 단계를 포함하는 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 대사 경로 예측 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물내에는 존재하지 않는 생화학 반응 경로는 말로닐-CoA 경로, β-알라닌 경로 및 글리세롤 경로로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 경로인 것인 예측 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 말로닐-CoA 경로의 도입은 3-oxopropanoate:NADP+ oxidoreductase (EC 1.2.1.18) 및
   3-hydroxypropionate dehydrogenase (EC 1.1.1.59) 를 도입하는 것인 예측 방법.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 β-알라닌 경로의 도입은 3-hydroxypropionate dehydrogenase (EC 1.1.1.59) 를 도입하는 것인 예측 방법.
5. 청구항 2에 있어서, 상기 글리세롤 경로의 도입은 glycerol dehydratase(EC 4.2.1.30)를 암호화하는 및 aldehyde dehydrogenase(EC 1.2.1.3) 를 도입하는 것인 예측 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 2차 변형 대사 경로 단계에서 효소 반응을 변형하는 것은 효소를 대사 경로에서 제거하는 것인 예측 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 Kluyveromyces marxianus 인 것인 예측 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물의 배양조건은 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 및 산소조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 예측 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈 및 갈락토오즈 에서 선택되는 어느 하나인 것이 예측 방법.
10. 청구항 8에 있어서, 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염 및 암모늄염에서 선택되는 어느 하나인 것인 예측 방법.
11. 청구항 8에 있어서, 상기 산소 조건은 호기성 조건, 저산소 조건 또는 혐기성 조건인 것인 예측 방법.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 대사산물은 3HP(3-hydroxypropionate)인 것인 예측 방법.
13. 청구항 7항에 있어서, 상기 생체량 합성 방정식은 반응식 Ⅰ인 것을 특징으로 하는 예측 방법:
    [반응식 Ⅰ]
    0.56 PROTEIN + 0.107 RNA + 0.007 DNA + 0.052 PHOSPHOLIPID + 0.03 COF + 0.110 CW + 0.265 CARBOHYDRATE + 70.37 ATP -> BIOMASS + 70.37 ADP + 70.37 Pi
14. 청구항 1 내지 청구항 13에서 예측된 최적의 대사산물을 산출할 수 있는 2차 변형 대사 경로를 포함하는 것인 형질전환된 미생물.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 미생물은 Kluyveromyces marxianus 인 것인 형질전환된 미생물.
16. 청구항 14에 있어서, 상기 미생물은 3HP(3-hydroxypropionate)를 과량으로 생산할 수 있는 것인 형질전환된 미생물.
17. 청구항 14의 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 및
    배양액으로부터 특정 대사산물을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 특정 대사산물 제조 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 특정 대사산물은 3HP인 것인 제조 방법.

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