KR100727053B1 - 대사산물들의 플럭스 섬 프로파일링을 이용한 생물개량방법 - Google Patents

대사산물들의 플럭스 섬 프로파일링을 이용한 생물개량방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사산물들의 플럭스 섬 프로파일링을 이용한 생물 개량방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유용물질의 형성속도를 주요 함수로 놓고, 유용물질의 생산성에 영향을 미치는 다른 함수를 섭동시키는 알고리즘을 통해 목적함수간의 프로파일을 작성하고, 상기 프로파일로부터 모든 대사산물의 활용도인 플럭스 섬(Φ)을 구한 후, 유용물질의 형성속도 증가에 따라 플럭스 섬(Φ)이 증가하는 대사산물을 스크리닝하는 방법 및 상기 스크리닝된 핵심 대사산물과 관련된 유전자를 도입 및/또는 증폭시키거나 직접적으로 외부에서 도입시켜 유용물질을 생산하는 생물을 개량하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 유용물질의 형성속도의 증가에 따른 특정 대사산물의 대사활용도(플럭스 섬: Φ)를 예측할 수 있어, 유용물질의 생산성 향상에 핵심이 되는 대사산물을 스크리닝할 수 있고, 이러한 방법으로 스크리닝된 대사산물에 관련되는 유전자를 도입 및/또는 증폭하여 배양 대상 생물을 개량하는 방법 또는 그 대사산물을 배양 중에 공급하는 방법으로 유용물질의 생산성을 증대시키는 것이 가능하다.
대사흐름, 대사산물, 유용물질, 대사공학, 대사산물 활용도, 섭동

Description

대사산물들의 플럭스 섬 프로파일링을 이용한 생물 개량방법{Method of Improvement of Organisms Using Profiling the Flux Sum of Metabolites}
도 1은 본 발명에 따른 핵심 대사산물 분석을 통한 유용물질의 생산성 향상 방법의 개념도이다.
도 2는 ｉ번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 소비되는 반응식의 대사흐름의 일례를 도시한 것으로, fin이 세 개의 대사흐름으로 이루어져 있고, fout이 두 개의 대사흐름으로 이루어져 있다.
도 3a는 비증식속도와 유용물질의 형성속도를 목적함수로 했을 때 나타나는 프로파일을 도시한 것이고, 도 3b는 유용물질의 형성속도(x축)가 증가함에 따라 플럭스 섬(Φ) 값(y축)이 증가하는 대사산물을 프로파일 상에 도시하고 그 리스트를 나타낸 것이다.
도 4a는 대사산물을 외부로부터 추가하여 유용대사산물을 증가시키는 개략도이고, 도 4b는 대사산물이 외부로부터 추가되었을 때 유용물질의 형성속도 최대값이 증가하는 모습을 나타낸 개략도이다.
발명의 분야
본 발명은 대사산물들의 플럭스 섬 프로파일링을 이용한 생물 개량방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유용물질의 형성속도를 주요 함수로 놓고, 유용물질의 생산성에 영향을 미치는 다른 함수를 섭동시키는 알고리즘을 통해 목적함수의 프로파일을 작성하고, 상기 프로파일로부터 모든 대사산물의 활용도인 플럭스 섬(Φ)을 구한 후, 유용물질의 형성속도 증가에 따라 플럭스 섬(Φ)이 증가하는 대사산물을 스크리닝하는 방법 및 상기 스크리닝된 핵심 대사산물과 관련된 유전자를 도입 및/또는 증폭시키거나 직접적으로 외부에서 도입시켜 유용물질을 생산하는 생물을 개량하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
유전자 재조합기술과 관련 분자생물학 기술을 이용하여 새로운 대사회로를 도입하거나 기존의 대사회로를 제거·증폭 또는 변경시켜 세포나 균주의 대사특성을 우리가 원하는 방향으로 바꾸기 위한 많은 노력이 있어왔다. 이와 함께 새롭게 개발되어 증가하는 바이오 정보학의 도움으로 다양한 종의 게놈 정보로부터 각 대사 네트워크 모델의 구축이 가능하게 됨에 따라 기존 대사산물의 과량 생산, 신규 대사 산물의 생산, 불리한 대사 산물의 생성 저해, 다양한 기질의 이용, 난분해성 화합물의 분해 등의 특성을 갖도록 생물체를 개량하는 것이 가능하게 되었다.
그러나 현재의 균주 개량은 주로 한두 개 효소의 과다발현이나 간단한 대사회로의 도입·제거 등의 방법으로 이루어지고 있고, 원하는 만큼 좋은 결과를 얻지 못하는 경우가 많았다. 뿐만 아니라, 복잡한 대사흐름의 변화를 요하는 물질의 생산에는 대사공학적으로 개량된 균주가 거의 사용되지 못하고 있는 상황이다. 이러한 이유 중의 하나는 일반적으로 균주는 원하는 유용물질을 생산하려 하기 보다는 균주 자체의 성장을 최우선으로 하기 때문인 것으로 알려져 있다. 즉, 균주 자체의 성장에 필요한 물질을 가장 최적화된 방법으로 합성하게끔 자연적으로 진화하였기 때문에 특정 유용물질을 생산하기 위한 노력들은 이러한 성장을 우선으로 하는 균주와 항상 경쟁할 수밖에 없는 것이다.
실제 이론 수율에 미치지 못하는 또 하나의 이유로는 복잡한 대사회로를 제대로 파악하지 못했기 때문인데, 이제까지 대사회로의 조작 및 대사회로 도입을 위한 재조합 유전자기술은 많은 발전이 이루어진 반면, 대사회로를 통한 분석 및 예측기술은 최근에야 급속하게 증가하는 게놈정보와 함께 그 가능성을 보이고 있다. 특히, 각 미생물의 대사회로 모델들이 수학적 모델 및 최적화 기술 등과 결합되어 유전자의 제거 또는 추가 후에 일어나는 대사회로의 반응을 예측하는 것이 가능해지고 있다 (Lee et al ., Trends Biotechnol ., 23:349, 2005).
대사흐름분석기법은 동적 정보를 필요로 하지 않음에도 세포의 이상적인 대사흐름을 보여주며 실제적으로 세포의 행동을 정확히 모사하고 예측할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Papin, J. et al ., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6:99, 2005). 대사흐름분석은 생화학 반응식의 질량수지와 세포조성 정보만을 이용 하여 세포가 도달 가능한 이상적인 대사 흐름 공간을 구하며 특정한 목적함수를 최적화 방법을 통하여 최대화하거나 최소화하는 것을 목적으로 한다(바이오매스 형성속도 최대화 또는 특정 섭동에 의한 대사 조절의 최소화 등). 그밖에 대사흐름분석은 일반적으로 균주개량을 통하여 원하는 대사산물의 최대 생산 수율의 계산 등을 위하여 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 균주내부의 대사회로 특성을 파악할 수 있다. 또한, 유전자의 제거 또는 추가에 의해 일어나는 대사회로의 흐름 변화 등을 예측하기 위해 대사흐름분석 방법을 응용한 다양한 연구가 보고되었다.
이에 비추어 볼 때, 대사흐름분석 기법을 이용하여 부분적인 대사정보를 이용한 균주조작이 아닌 전체적인 관점에서 복잡한 미생물의 대사를 살펴보고, 특정 유전자에 대한 조작이 전체 대사흐름에 미치는 영향들을 파악하며, 또한 목적하는 유용물질의 대량생산을 위해 요구되는 최적의 미생물대사흐름을 과학적으로 정확하게 예측할 수 있는 연구방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 효율적으로 목적 유용물질의 생산성을 향상시킬 수 있는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 유용물질의 형성속도 및 유용물질의 생산성에 관여하는 함수를 섭동시키는 알고리즘을 거쳐 목적함수의 프로파일을 작성하고, 그 프로파일 상에서 플럭스 섬(Φ)이라 정의한 각 대사산물의 활용도를 구한 다음, 상기 프로파일 상에서 유용물질의 형성속도 증가에 따라 플럭스 섬(Φ) 값이 증가하는 대사산물들을 스크리닝함으로써 유용물질의 생산성에 관여하는 핵심적인 특정 대사산물을 찾을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 유용물질의 형성속도와 유용물질의 생산성에 관련된 하나 이상의 함수로부터 이를 섭동시키는 알고리즘을 거쳐 단일목적함수에 관한 프로파일을 작성하고, 그 프로파일로부터 플럭스 섬(Φ)이라 정의한 생물의 대사산물 활용도를 구하여 유용물질의 생산 수율을 증가시키는 핵심적인 특정 대사산물을 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스크리닝된 특정 대사산물과 관련된 유전자를 도입 및/또는 증폭시켜 유용물질을 생산하는 생물을 개량하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스크리닝된 특정대사산물과 관련된 유전자를 유용물질을 생산하는 생물의 배양 중에 공급하는 유용물질의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적 유용물질을 생산하고자 하는 대상 생물을 선정하고, 선정된 생물의 대사회로 모델을 구축하는 단계; (b) 대사산물의 활용도를 다음의 수학식 1로 표현되는 플럭스 섬(flux sum: Φ)으로 정의하고, 상기 (a) 단계에서 구축된 대사회로 상에서 플럭스 섬을 구하기 위하여 플럭스 섬 SCOF(Flux sum scanning with compromised objective fluxes)를 이용하여, 상기 유용물질의 형성속도와 유용물질의 생산성에 관여하는 하나 이상의 함수를 섭 동(perturbation)시켜 유용물질의 형성속도에 관한 단일목적함수의 프로파일을 작성하는 단계:
[수학식 1]
Figure 112006031777319-pat00001
여기서, Φ i는 i번째 대사산물의 활용도이고, fin은 i번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 소비되는 반응식의 대사흐름이고, fout은 i번째 대사산물을 중심으로 목적 유용물질이 생성되는 반응식의 대사흐름이고, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이며, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임; (c) 상기 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF를 통해 작성된 프로파일 상에서 각 대사산물의 Φ를 구하는 단계; 및 (d) 목적 유용물질의 형성속도를 증가시키면 특정 대사산물의 Φ 값이 증가하는 경우, 상기 특정 대사산물을 클러스터링하여 스크리닝하는 단계를 포함하는 유용물질의 생산성 향상에 관여하는 핵심 대사산물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 목적 유용물질을 생산하고자 하는 대상 생물을 선정하고, 선정된 생물의 대사회로 모델을 구축하는 단계; (b) 대사산물의 활용도를 수학식 1로 표현되는 플럭스 섬(flux sum: Φ)으로 정의하고, 상기 (a) 단계에서 구축된 대사회로 상에서 플럭스 섬을 구하기 위하여 플럭스 섬 SCOF(Flux sum scanning with compromised objective fluxes)를 이용하여, 상기 유용물질의 형성속도와 유용물질의 생산성에 관여하는 하나 이상의 함수를 섭동(perturbation)시켜 유용물질 의 형성속도에 관한 단일목적함수의 프로파일을 작성하는 단계; (c) 상기 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF를 통해 작성된 프로파일 상에서 각 대사산물의 Φ를 구하는 단계; (d) 목적 유용물질의 형성속도를 증가시키면 특정 대사산물의 Φ 값이 증가하는 경우, 상기 특정 대사산물을 클러스터링하여 스크리닝하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 스크리닝된 특정 대사산물과 관련된 대사회로로부터 증폭 대상 유전자를 선별하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계로부터 선별된 유전자를 상기 대상 생물에 도입 및/또는 대상생물에서 증폭시켜 상기 대상 생물의 변이체를 제작하는 단계를 포함하는 유용물질을 생산하는 생물의 개량방법을 제공한다.
상기 유용물질 생산하는 생물의 개량방법에 있어서, (g) 상기 (f) 단계에서 제작된 변이체를 배양하여 유용물질의 생산성을 실험적으로 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 개량방법에 의하여 개량된 생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또한, (a) 목적 유용물질을 생산하고자 하는 대상 생물을 선정하고, 선정된 생물의 대사회로 모델을 구축하는 단계; (b) 대사산물의 활용도를 수학식 1로 표현되는 플럭스 섬(flux sum: Φ)으로 정의하고, 상기 (a) 단계에서 구축된 대사회로 상에서 플럭스 섬을 구하기 위하여 플럭스 섬 SCOF(Flux sum scanning with compromised objective fluxes)를 이용하여, 상기 유용물질의 형성속도와 유용물질의 생산성에 관여하는 하나 이상의 함수를 섭동(perturbation)시켜 유용물질의 형성속도에 관한 단일목적함수의 프로파일을 작성하는 단계; (c) 상기 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF를 통해 작성된 프로파일 상에서 각 대사산물의 Φ를 구하는 단계; 및 (d) 목적 유용물질의 형성속도를 증가시키면 특정 대사산물의 Φ 값이 증가하는 경우, 상기 특정 대사산물을 클러스터링하여 스크리닝하는 단계를 거쳐 스크리닝된 대사산물을 배양과정에서 공급하는 것을 특징으로 하는 생물 배양에 의한 유용물질의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 대사산물을 스크리닝하는 과정 중 상기 (b) 단계의 함수는 비증식 속도, 부산물 형성속도, 기질 섭취 속도(substrate uptake rate), ATP 형성속도 및 산소 섭취 속도(oxygen uptake rate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (b) 단계의 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF는 유용물질의 형성속도를 제외한 다른 목적함수들의 최소값 및 최대값을 구하고, 그 최소값 및 최대값의 범위 내에서 유용물질의 형성속도를 증가시키면서 최적화를 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 fin 및 fout은 각각 다음의 수학식 2 및 수학식 3으로 표현되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[수학식 2]
Figure 112006031777319-pat00002
[수학식 3]
Figure 112006031777319-pat00003
(여기서, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이고, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임).
본 발명에 있어서, 상기 대상 생물은 미생물인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 유용물질은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질이고, 상기 대상 생물은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질 생성능을 가지는 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 섭동(perturbation)이란 모든 대사산물의 집단에 특정 외부요인을 가하여 교란시킴으로써 원하는 특성의 대사산물을 찾아내는 조치를 이른다.
본 발명에 있어서, 클러스터링(clustering)이라 함은 모든 대사산물의 섭동 후 형성된 집단으로부터 비슷한 양태를 보이는 대사산물들끼리 모으는 방법 및 과정을 포함한다.
또한 본 발명에서의 유전자 “증폭”이란 유전자의 염기서열 중 전체 혹은 일부가 생물 내에서 대량으로 복제되도록 조작하여 해당 유전자의 발현율을 높이는 것을 모두 포괄한다.
본 발명에서, “배양”이란 박테리아, 효모 곰팡이 동·식물 세포 등 미생물의 배양뿐만 아니라, 식물의 재배 및 동물의 사육도 포괄하는 것으로 정의한다.
이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.
도 1에는 본 발명에 따른 플럭스 섬을 이용한 핵심 대사산물 분석을 통해 유 용물질의 생산성을 향상시키는 방법의 개념을 도시하였다. 즉, 본 발명에서는 유용물질을 생산하고자 하는 대상 생물을 선정하고, 선정된 생물의 대사회로 모델을 구축한 후, 상기 구축된 대사회로 상의 대사산물들에 대한 활용도인 플럭스 섬(Flux sum: Φ) 값을 구하고, 이를 섭동(perturbation)시켜, 목적 유용물질 생산 수율을 증가시키는데 관여하는 핵심 대사산물을 클러스터링을 통해 스크리닝하고, 상기 핵심 대사산물을 공급함으로써 유용물질이 생산성을 향상시키는 방법을 제공한다. 이하에서는 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
1. 대사회로 구축( Metabolic network construction )
본 발명에서는 유용물질 생산을 위한 대상균주로서 대장균의 변이균주를 이용하여 새로운 대사흐름분석 시스템을 구축하였다. 이 시스템은 대장균의 대사회로를 대부분 포함하고 있다. 대장균의 경우 새로운 대사회로는 979개의 생화학 반응으로 구성되어 있으며, 814개의 대사산물이 대사회로에서 고려된다. 대사흐름 분석에서 목적함수로 사용할 균주의 바이오매스 형성속도(biomass formation)식에 사용하는 대장균의 생체 조성은 선행문헌에 게시된 바에 따라 구성하였다 (Neidhardt et al ., Escherichia coli and Salmonella : Cellular and Molecular Biology, 1996).
2. 플럭스 섬( Flux sum )의 정의와 섭동( perturbation )
1) 플럭스 섬
모든 대사산물, 그 대사경로, 및 경로에서의 화학양론 매트릭스(stoichiometric matrix) ( SijT , j 번째 반응에서 i 번째 대사산물의 시간에 따른 화학양론 계수)가 알려져 있다면, 대사흐름 벡터 (vj , j 경로의 대사흐름)를 계산할 수 있는데, 시간에 따른 대사산물 농도 X 의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다. 또한, 시간에 따른 X의 변화량이 일정하다고 가정하면, 즉 준정상상태 가정 하에서, 아래의 식으로 정의될 수 있다.
STv = dX / dt = 0
(여기서, STv 는 시간에 따른 X의 변화량이고, X 는 대사산물의 농도이며, t는 시간임)
이때, 대사반응의 관점에서 정의되는 대사흐름과 대응되도록 대사산물의 관점에서 대사산물 주변의 흐름 활용도를 다음과 같이 정의한다.
즉, i 번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 소비되는 반응식의 대사흐름을 fin 으로, 대사산물을 중심으로 생성되는 반응식의 대사흐름을 fout으로 정의하고, 이들 각각을 하기의 수학식 2 및 수학식 3으로 표현하였다:
[수학식 2]
Figure 112006031777319-pat00004
[수학식 3]
Figure 112006031777319-pat00005
(여기서, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이고, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임)
도 2는 i 번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 소비되는 반응식의 대사흐름의 예를 도시한 것으로,
Figure 112006031777319-pat00006
Figure 112006031777319-pat00007
임을 알 수 있다.
상기와 같이 정의하면, 준정상상태 가정에서 fin과 fout의 절대값이 같기 때문에 이를 대사산물 주변 흐름 활용도로 정의할 수 있다. 본 발명에서는 상기 대사산물 주변 흐름 활용도를 플럭스 섬(Flux sum: Φ)이라 명명하고 다음의 수학식 1과 같이 정의하였다.
[수학식 1]
Figure 112006031777319-pat00008
(여기서, Φ i 는 i번째 대사산물의 활용도이고, fin은 i번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 생성되는 반응식들의 전체 대사흐름, fout은 i번째 대사산 물을 중심으로 목적 유용물질이 소비되는 반응식들의 전체대사흐름이고, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이며, vj는 j 경로의 대사흐름임)
플럭스 섬(Φ)은 기존의 대사흐름 분석 방법에서는 나타낼 수 없었던 대사산물의 활용도를 나타내기 위해 새롭게 정의된 양이다. 즉, 해당 대사산물을 많이 이용할수록 Φ 값은 커지게 되고, 해당 대사산물을 적게 이용할수록 Φ의 값은 작아지게 된다.
일반적으로 기존의 대사흐름분석에서는 준정상상태 가정을 기반으로 하고, 외부의 환경변화에 따른 내부의 대사산물농도 변화는 매우 즉각적이므로, 일반적으로 이의 변화를 무시하고 내부 대사산물의 농도가 변화하지 않는다고 가정한다. 즉, 기존의 대사흐름분석 방법에서는 대사산물의 외부 환경변화에 따른 내부의 대사산물 농도 변화는 매우 즉각적이고, 이의 변화를 무시하여 내부의 대사산물의 농도가 변화하지 않는다고 보기 때문에, 각 대사산물의 특성을 살펴 볼 수 없는 단점을 가지고 있다.
본 발명에서는 대사물질 활용도로서 플럭스 섬(Φ)을 정의함으로써, 유용물질의 생산성 향상을 위한 핵심 대사산물을 찾을 수 있는 정량적 근거를 제공한다.
2) Flux sum scanning with compromised objective fluxes ( Flux Sum SCOF )
상기 정의로부터 플럭스섬(Φ) 값을 구하고, 이를 기준으로 모든 대사산물에 대하여 플럭스섬(Φ) 값을 구하는 것이 가능하다.
이 때, 유용물질의 생산성과 관련되는 함수들을 섭동시킬 때에, 이에 따른 플럭스 섬의 변화를 살펴보는 것이 가능하다. 여기서는 목적함수의 변화에 따른 내부 대사산물의 플럭스 섬의 프로파일을 살펴보았다.
일반적으로 선형 계획법을 이용하여 대사흐름 분석을 할 때, 함수들의 섭동에 따른 변화를 살피기 위해서 복수의 목적함수를 사용한다. 유용물질의 형성속도(bioproduct formation rate)와 비증식속도(biomass formation rate)가 주로 이용되는 목적함수이다 (Pharkya P et al ., Biotechnol Bioeng., 84:887, 2003). 이와같이, 두 개 이상의 목적함수를 사용하는 선형 계획법을 다목적함수 선형 계획법(multiobjective linear programming)이라 한다.
본 발명에 적용될 수 있는 유용물질의 생산성에 관계되는 목적함수로는 유용물질의 형성속도, 비증식 속도, 부산물 형성속도, 기질 섭취 속도(substrate uptake rate), ATP 형성속도, 산소 섭취 속도(oxygen uptake rate) 등이 있을 수 있다. 여기서 사용할 다목적함수 선형계획법은 플럭스 섬 SCOF라고 정의한 다음과 같은 알고리즘을 통하여 하나의 목적함수를 가진 선형계획법으로 변환하는 것이 가능하다. 이 때 다른 함수들은 제한조건으로서 변환한다.
단계 1:
특정 유용물질의 형성속도를 기본으로 하여 복수의 목적함수를 선택한다. 상기와 같이 유용물질의 생산성과 관련된 어떤 형태의 함수도 선택이 가능하다.
v셀 목적함수 1=유용물질의 형성속도,
v셀 목적함수 2 = 비증식 속도,
v셀 목적함수 3 =부산물 형성속도...
이때의 다목적함수 선형 계획법을 통한 수학적 표현은 다음과 같다.
목적함수:
v셀 목적함수 3을 최대화,
v셀 목적함수 2를 최대화,
v셀 목적함수 1을 최대화,
제한 조건 :
Figure 112006031777319-pat00009
,
Figure 112006031777319-pat00010
Figure 112006031777319-pat00011
,
Figure 112006031777319-pat00012
Figure 112006031777319-pat00013
,
Figure 112006031777319-pat00014
여기서, I는 대사산물의 세트, E는 외부 대사산물의 세트, J는 반응의 세트이고, Sij= j번째 반응에서 i번째 대사산물의 화학양론 계수이고, bi는 i번째 대사산물의 넷 트랜스포트 플럭스(+: 생산물 분비; -: 기질 섭취; 0: 중간값)이고, li,ui= i번째 대사산물의 넷 트랜스포트 대사흐름에 대해 각각 하위 및 상위 한계치이며, αj,βj는 반응의 플럭스에 대해 각각 하위 및 상위 한계치이다.
단계 2:
각 목적함수를 각각 최대화 또는 최소화하여 각 함수의 최대값과 최소값을 구한다.
vmin 셀 목적함수 1<v셀 목적함수 1< vmax 셀 목적함수 1
vmin 셀 목적함수 2<v셀 목적함수 2< vmax 셀 목적함수 2
vmin 셀 목적함수 3<v셀 목적함수3< vmax 셀 목적함수 3
......
단계 3:
다음의 알고리즘을 통하여 하나의 목적함수를 가진 선형계획법으로 변환하는 것이 가능하다. 유용물질의 형성속도를 유일한 목적함수로 두고, 다른 함수들의 최소값과 최대값 범위 내에서 상기 유용물질의 형성속도를 증가시키며 최적화를 수행한다.
t1= vmin 셀 목적함수 2 ~ vmax 셀 목적함수 2
시작
t2=vmin 셀 목적함수 3 ~ vmax 셀 목적함수 3
시작
vmin 셀 목적함수 1 최대화
Figure 112006031777319-pat00015
,
Figure 112006031777319-pat00016
Figure 112006031777319-pat00017
,
Figure 112006031777319-pat00018
Figure 112006031777319-pat00019
,
Figure 112006031777319-pat00020
v셀 목적함수 2 = t1
v셀 목적함수 3 = t2
종료
종료
상기와 같은 알고리즘을 통해 고려되는 목적함수들을 만족하는 대사흐름공간을 구하는 것이 가능하다.
다음으로 각 목적함수들의 프로파일로부터 모든 대사산물들의 플럭스 섬(Φ) 값을 구한다. 이 때, 유용물질의 형성속도를 핵심대사산물을 스크리닝하는 주요 함수로 놓고 유용물질의 생산성에 영향을 미치는 다른 함수들을 다양하게 적용하여 프로파일을 구하고, 이로부터 모든 대사산물의 플럭스 섬(Φ)을 구하여 그 증가 또는 감소 경향을 확인한다.
3. 유용물질의 형성속도 및 비증식속도를 목적함수로 한 플럭스 섬 클러스터 링
상기의 알고리즘 중 목적함수를 두 가지 사용하는 방법, 즉 유용물질의 형성속도와 다른 함수(예. 비증식 속도)로 이루어지는 프로파일에서 유용물질의 형성속도가 증가하는 방향으로 갈수록 플럭스 섬(Φ)이 증가하는 대사산물을 클러스터링하여 스크리닝할 수 있다.
예를 들어, 도 3a와 같은 비증식속도와 유용물질의 형성속도를 목적함수로 하는 프로파일로부터 선택되는 각 점의 비증식속도와 유용물질의 형성속도를 함수로 하여 모든 내부대사산물의 플럭스 섬(Φ)을 구하는 것이 가능하다.
다음으로, 상기 도 3a의 비증식 속도에 따른 유용물질의 형성속도 프로파일에서 유용물질의 형성속도가 증가할수록(A→B 방향) 플럭스 섬(Φ)이 증가하는 대사산물을 스크리닝하는 방법으로 핵심대사산물을 찾아낸다.
상기와 같은 방법으로 유용물질의 형성속도가 증가할수록 플럭스 섬(Φ)이 증가하는 대사산물을 스크리닝하여 도 3b에 도시하였다. 도 3b는 유용물질의 형성속도(x축)에 대한 각 대사산물의 플럭스 섬 값(y축)의 프로파일 및 도시된 각 대사산물의 리스트를 나타낸 것이다. 유용물질의 형성속도가 증가할수록 플럭스 섬(Φ)이 증가한다는 것은 유용물질이 형성됨에 따라 해당 대사산물의 활용도가 증가한다는 것을 뜻한다.
또한, 상기 함수로서 하나를 더 추가하여 불필요한 부산물을 또 하나의 목적함수로 하여 비증식속도, 유용물질의 형성속도 및 불필요한 부산물 형성속도와 같이 세 개 이상의 목적함수를 이용한 다목적 함수 선형계획법이 가능하다. 상기 세 가지의 다목적 함수 선형 계획법을 통해 나타나는 프로파일로부터 모든 내부대사산물의 플럭스 섬(Φ)을 구하여 유용물질이 형성됨에 따라 해당 대사산물의 활용도가 증가하면서 불필요한 부산물이 적은 대사산물 그룹을 스크리닝할 수 있다.
4. 생산성 향상을 위한 실험적 분석 - 외부로부터의 대사산물의 공급
유용물질의 형성속도를 주요 함수로 놓고, 유용물질의 생산성에 영향을 미치는 다른 함수들을 다양하게 적용한 후 이를 섭동시키는 알고리즘인 플럭스 섬 SCOF를 거친 목적함수의 프로파일 상에서 모든 대사산물의 플럭스 섬(Φ)을 구하고, 유용물질의 형성속도 증가에 따라 플럭스 섬(Φ)이 증가하는 대사산물 그룹을 스크리닝한다. 유용물질의 형성속도 증가에 따라 대사산물의 플럭스 섬(Φ)이 증가한다는 것은 유용물질이 형성됨에 따라 해당 대사산물의 활용도가 증가함을 뜻하는 것이므로, 대사산물과 관련된 유전자를 도입 및/또는 증폭 및 세포 외부로부터 해당 대사산물을 추가함으로써 플럭스 섬 값을 증가시킬 수 있다(도 4a 참조).
스크리닝 된 핵심 대사산물을 생산 또는 소비하는 유전자를 도입 및/또는 증폭하는 경우 해당 대사산물의 활용도를 증가시키는 것이 가능하다.
또한, 도 4b와 같이 외부에서 특정 대사산물을 공급하는 것은 대사흐름공간에 있어서 유용물질 쪽으로의 공간을 크게 하는 역할을 한다. 즉, 외부에서 해당 대사산물이 공급되는 것은 원래의 대사흐름공간이 커지는 것을 뜻하고, 특히 유용물질 쪽으로의 대사흐름공간이 더 커지는 것을 뜻한다. 따라서, 유용물질 생산에 있어서 중요한 대사산물을 파악하고 해당 대사산물을 외부로부터 공급하여 생산성 을 향상시키는 것이 가능하다.
이 때 해당 균주가 해당 대사산물을 섭취(uptake)할 수 있는지를 확인해야 하는데 이는 현재 이미 구축되어 있는 다양한 데이터베이스와 문헌조사를 통해 가능하다. 특히, 해당 대사산물을 섭취할 수 있는 트랜스포터(transporter)가 있을 경우, 실제 배양실험에서 배지에 해당 대사산물을 추가하여 생산성을 최종 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 유용물질의 형성속도의 증가에 따른 특정 대사산물의 대사활용도(플럭스 섬: Φ)를 예측할 수 있어, 유용물질의 생산성 향상에 핵심이 되는 대사산물을 스크리닝할 수 있고, 이러한 방법으로 스크리닝된 대사산물에 관련되는 유전자를 도입 및/또는 증폭하여 배양 대상 생물을 개량하는 방법 또는 그 대사산물을 배양 중에 공급하는 방법으로 유용물질의 생산성을 증대시키는 것이 가능하다.

Claims (21)

  1. 다음의 단계를 포함하는 유용물질의 생산성 향상에 관여하는 핵심 대사산물을 스크리닝하는 방법:
    (a) 목적 유용물질을 생산하고자 하는 대상 생물을 선정하고, 선정된 생물의 대사회로 모델을 구축하는 단계;
    (b) 대사산물의 활용도를 다음의 수학식 1로 표현되는 플럭스 섬(flux sum: Φ)으로 정의하고, 상기 (a) 단계에서 구축된 대사회로 상에서 플럭스 섬을 구하기 위하여 플럭스 섬 SCOF(Flux sum scanning with compromised objective fluxes)를 이용하여, 상기 유용물질의 형성속도와 유용물질의 생산성에 관여하는 하나 이상의 함수를 섭동(perturbation)시켜 유용물질의 형성속도에 관한 단일목적함수의 프로파일을 작성하는 단계;
    [수학식 1]
    Figure 112006031777319-pat00021
    여기서, Φ i는 i번째 대사산물의 활용도이고, fin은 i번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 소비되는 반응식의 대사흐름이고, fout은 i번째 대사산물을 중심으로 목적 유용물질이 생성되는 반응식의 대사흐름이고, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이며, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임;
    (c) 상기 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF를 통해 작성된 프로파일 상에서 각 대사 산물의 Φ를 구하는 단계; 및
    (d) 목적 유용물질의 형성속도를 증가시키면 특정 대사산물의 Φ 값이 증가하는 경우, 상기 특정 대사산물을 클러스터링하여 스크리닝하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 함수는 비증식 속도, 부산물 형성속도, 기질 섭취 속도(substrate uptake rate), ATP 형성속도 및 산소 섭취 속도(oxygen uptake rate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF는 유용물질의 형성속도를 제외한 다른 목적함수들의 최소값 및 최대값을 구하고, 그 최소값 및 최대값의 범위 내에서 유용물질의 형성속도를 증가시키면서 최적화를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 fin 및 fout은 각각 다음의 수학식 2 및 수학식 3으로 표현되는 것을 특징으로 하는 방법:
    [수학식 2]
    Figure 112006031777319-pat00022
    [수학식 3]
    Figure 112006031777319-pat00023
    (여기서, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이고, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임).
  5. 제1항에 있어서, 상기 대상 생물은 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유용물질은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질이고, 상기 대상 생물은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질 생성능을 가지는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 다음의 단계를 포함하는 유용물질을 생산하는 생물의 개량방법:
    (a) 목적 유용물질을 생산하고자 하는 대상 생물을 선정하고, 선정된 생물의 대사회로 모델을 구축하는 단계;
    (b) 대사산물의 활용도를 다음의 수학식 1로 표현되는 플럭스 섬(flux sum: Φ)으로 정의하고, 상기 (a) 단계에서 구축된 대사회로 상에서 플럭스 섬을 구하기 위하여 플럭스 섬 SCOF(Flux sum scanning with compromised objective fluxes)를 이용하여, 상기 유용물질의 형성속도와 유용물질의 생산성에 관여하는 하나 이상의 함수를 섭동(perturbation)시켜 유용물질의 형성속도에 관한 단일목적함수의 프로파일을 작성하는 단계;
    [수학식 1]
    Figure 112006031777319-pat00024
    여기서, Φ i는 i번째 대사산물의 활용도이고, fin은 i번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 소비되는 반응식의 대사흐름이고, fout은 i번째 대사산물을 중심으로 목적 유용물질이 생성되는 반응식의 대사흐름이고, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이며, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임;
    (c) 상기 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF를 통해 작성된 프로파일 상에서 각 대사산물의 Φ를 구하는 단계;
    (d) 목적 유용물질의 형성속도를 증가시키면 특정 대사산물의 Φ 값이 증가하는 경우, 상기 특정 대사산물을 클러스터링하여 스크리닝하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 스크리닝된 특정 대사산물과 관련된 대사회로로부터 증폭 대상 유전자를 선별하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계로부터 선별된 유전자를 상기 대상 생물에 도입 및/또는 대상생물에서 증폭시켜 상기 대상 생물의 변이체를 제작하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, (g) 상기 (f) 단계에서 제작된 변이체를 배양하여 유용물질의 생산성을 실험적으로 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 (b) 단계의 변수는 비증식 속도, 부산물 형성속도, 기질 섭취 속도(substrate uptake rate), ATP 형성속도 및 산소 섭취 속도(oxygen uptake rate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 변수는 비증식속도인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 (b) 단계의 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF는 유용물질의 형성속도를 제외한 다른 목적함수들의 최소값 및 최대값을 구하고, 그 최소값 및 최대값의 범위 내에서 유용물질의 형성속도를 증가시키면서 최적화를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 fin 및 fout은 각각 다음의 수학식 2 및 수학식 3으로 표현되는 것을 특징으로 하는 방법:
    [수학식 2]
    Figure 112006031777319-pat00025
    [수학식 3]
    Figure 112006031777319-pat00026
    (여기서, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이고, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임).
  13. 제7항에 있어서, 상기 대상 생물은 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 유용물질은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질이고, 상기 대상 생물은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질 생성능을 가지는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 개량된 생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법.
  16. 생물 배양에 의한 유용물질의 제조방법에 있어서, 다음의 단계를 거쳐 스크리닝된 대사산물을 배양과정에서 공급하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 목적 유용물질을 생산하고자 하는 대상 생물을 선정하고, 선정된 생물의 대사회로 모델을 구축하는 단계;
    (b) 대사산물의 활용도를 다음의 수학식 1로 표현되는 플럭스 섬(flux sum: Φ)으로 정의하고, 상기 (a) 단계에서 구축된 대사회로 상에서 플럭스 섬을 구하기 위하여 플럭스 섬 SCOF(Flux sum scanning with compromised objective fluxes)를 이용하여, 상기 유용물질의 형성속도와 유용물질의 생산성에 관여하는 하나 이상의 함수를 섭동(perturbation)시켜 유용물질의 형성속도에 관한 단일목적함수의 프로파일을 작성하는 단계;
    [수학식 1]
    Figure 112006031777319-pat00027
    여기서, Φ i는 i번째 대사산물의 활용도이고, fin은 i번째 대사산물을 중심으로 해당 대사산물이 소비되는 반응식의 대사흐름이고, fout은 i번째 대사산물을 중심으로 목적 유용물질이 생성되는 반응식의 대사흐름이고, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이며, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임;
    (c) 상기 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF를 통해 작성된 프로파일 상에서 각 대사산물의 Φ를 구하는 단계; 및
    (d) 목적 유용물질의 형성속도를 증가시키면 특정 대사산물의 Φ 값이 증가하는 경우, 상기 특정 대사산물을 클러스터링하여 스크리닝하는 단계.
  17. 제16항에 있어서, 상기 (b) 단계의 함수는 비증식 속도, 부산물 형성속도, 기질 섭취 속도(substrate uptake rate), ATP 형성속도 및 산소 섭취 속도(oxygen uptake rate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, (b) 단계의 플럭스 섬(Flux Sum) SCOF는 유용물질의 형성 속도를 제외한 다른 목적함수들의 최소값 및 최대값을 구하고, 그 최소값 및 최대값의 범위 내에서 유용물질의 형성속도를 증가시키면서 최적화를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 fin 및 fout은 각각 다음의 수학식 2 및 수학식 3으로 표현되는 것을 특징으로 하는 방법:
    [수학식 2]
    Figure 112006031777319-pat00028
    [수학식 3]
    Figure 112006031777319-pat00029
    (여기서, Sij는 j 번째 반응에서의 i번째 대사산물의 화학양론 계수이고, vj는 j 경로의 대사흐름 벡터임).
  20. 제16항에 있어서, 상기 대상 생물은 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 유용물질은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질이고, 상기 대상 생물은 1차 대사산물, 2차 대사산물 및 외래 단백질 생성능을 가지는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
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