DE112006003884T5

DE112006003884T5 - Verfahren zur Verbesserung von Organismen unter Verwendung der Profilerstellung von Metaboliten-Gesamtflüssen

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Publication number: DE112006003884T5
Application number: DE112006003884T
Authority: DE
Inventors: Sang-Yup Lee; Tae Yong Yongin-si Kim; Dong-Yup Yongin-si Lee
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2006-05-04
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2009-04-09
Also published as: US20090305328A1; JP2009535055A; US8594945B2; KR100727053B1; WO2007129793A1; CN101460845A

Abstract

Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten, die bei der Erhöhung der Produktion nützlicher Substanzen involviert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Auswahl eines Zielorganismus zur Produktion einer nützlichen Zielsubstanz und Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Organismus;
(b) Bestimmen der Verwertung jedes Metaboliten als Gesamtfluss (Φ), ausgedrückt durch die folgende Gleichung 1, und Zeichnen eines Profils einer Einzelzielfunktion, die mit der Bildungsrate der nützlichen Substanz in Beziehung steht durch Störung einer oder mehrerer Funktionen, die in der Bildungsrate und Produktion der nützlichen Substanzen involviert ist bzw. sind, durch das Gesamtfluss-SCOF (Gesamtflussscanning mit kompromittierten Zielflüssen), um den Gesamtfluss des Stoffwechselwegs, konstruiert in Schritt (a), zu bestimmen;

worin Φ_i die Verwertung des i-ten Metaboliten bedeutet, f_in bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, in der ein relevanter Metabolit verbraucht wird, für den i-ten Metaboliten, f_out bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, wobei die nützliche Zielsubstanz produziert wird, für den...

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung bzw. Optimierung eines Organismus durch Profilerstellung des Gesamtflusses bzw. der Flusssumme von Metaboliten und insbesondere ein Verfahren zum Screening bzw. Screenen von Schlüsselmetaboliten, wobei das Verfahren umfasst: Plotten bzw. Zeichnen eines Profils zwischen Zielfunktionen, basierend auf der Bildungsrate einer nützlichen Substanz als Hauptfunktion durch einen Algorithmus und anderen Störfunktionen, die die Produktion der nützlichen Substanz beeinflussen; Bestimmen der Nutzbarmachung bzw. Verwertung (Gesamtfluss (Φ)) aller Metaboliten aus dem Profil; und Screening der Schlüsselmetabolite, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) unter Zunahme der Bildungsrate einer nützlichen Substanz bzw. nützlicher Substanzen zeigen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verbesserung eines Organismus, welcher eine nützliche Substanz produziert, welche das Einführen und/oder Amplifizieren von Genen, die mit den gescreenten Schlüsselmetaboliten assoziiert sind, oder das Einführen von Genen von der Außenseite in den Organismus umfasst.
STAND DER TECHNIK
Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um die Metabolismuscharakteristika von Zellen oder Stämmen durch Einführen neuer Stoffwechselwege, oder durch Auslöschen, Verstärken oder Modifizieren der vorhandenen Stoffwechselwege unter Verwendung von mit genetischer Rekombinationstechnologie verwandter molekularbiologischer Technologie in die gewünschte Richtung abzuändern. Mit Hilfe von Bioinformatik, die neu entwickelt wurde und zunehmend verwendet wird, war die Konstruktion eines jeden metabolischen Netzwerkmodells möglich geworden, und es wurde daher möglich, Organismen derart zu verbessern, dass sie verschiedene Charakteristika besitzen, einschließlich der Überproduktion vorhandener Metaboliten, der Produktion neuartiger Metaboliten, der Inhibierung der Produktion unvorteilhafter Metaboliten, der Ausnutzung bzw. Verwertung verschiedener Substrate und des Abbaus nicht biologisch abbaubarer Verbindungen.
Jedoch wird gegenwärtig die Verbesserung von Stämmen hauptsächlich durch Verfahren wie zum Beispiel der Überexpression von einem oder zwei Enzymen oder der Einführung oder Auslöschung einfacher Stoffwechselwege ausgeführt, jedoch entsprachen in vielen Fällen die Ergebnisse nicht den Erwartungen. Zusätzlich dazu können metabolisch verbesserte Stämme kaum bei der Produktion von Substanzen, die Veränderungen in komplexen metabolischen Flüssen erfordern, verwendet werden. Es ist bekannt, dass ein Grund darin liegt, dass die Stämme selbst dazu neigen, eher zu wachsen, als die gewünschten nützlichen Substanzen zu produzieren. Insbesondere konkurrieren Anstrengungen zur Produktion spezifischer nützlicher Substanzen unausweichlich mit der Tendenz dieser Stämme zu wachsen, da die Stämme sich so entwickelt haben, dass sie Substanzen, die für das Wachstum der Stämme selbst erforderlich sind, auf die am meisten optimierte Weise synthetisieren.
Ein anderer Grund für das Nichterreichen der theoretischen Ausbeute ist es, dass komplexe Stoffwechselwege nicht korrekt verstanden werden konnten. Insbesondere haben sich die Technologien zur genetischen Rekombination zur Manipulation von Stoffwechselwegen und zur Einführung von Stoffwechselwegen signifikant entwickelt, während Techniken für Analyse und Vorhersage der Stoffwechselwege erst seit kurzem diese Möglichkeit aufgrund schnell wachsender Genominformation eröffnet haben. Insbesondere wird das Modell des Stoffwechselwegs jedes Mikroorganismus mit mathematischen Modellen und Optimierungstechnologie kombiniert und es wird dadurch möglich, Stoffwechselwegsreaktionen, die nach der De letion und Addition von Genen auftreten, vorherzusagen (Lee et al., Trends Biotechnol., 23: 349, 2005).
Es ist bekannt, dass Techniken zur Analyse des metabolischen Flusses ideale metabolische Flüsse von Zellen zeigen und die exakte Simulation und Vorhersage des Verhaltens von Zellen erlauben, obwohl sie keine dynamische Information erfordern (Papin, J. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6: 99, 2005). Die Analyse des metabolischen Flusses zielt auf die Bestimmung eines idealen metabolischen Flussraums ab, den Zellen erreichen können, unter lediglicher Verwendung der Massenbilanz biochemischer Reaktionen und Informationen über die Zellzusammensetzung, und auf die Maximierung oder Minimierung spezifischer Zielfunktionen durch ein Optimierungsverfahren (zum Beispiel die Maximierung der Bildungsrate von Biomasse oder die Minimierung der metabolischen Regulierung durch spezifische Störung). Zusätzlich dazu kann die Analyse des metabolischen Flusses im Allgemeinen verwendet werden, um die maximale Produktionsausbeute des gewünschten Metaboliten durch Stammverbesserung bzw. -optimierung zu berechnen, und der bestimmte Wert kann verwendet werden, um die Charakteristika der Stoffwechselwege in Stämmen zu verstehen. Es wurde auch über verschiedene Studien berichtet, die die Technik der Analyse des metabolischen Flusses verwenden, um Änderungen im metabolischen Fluss, die nach der Deletion oder Addition von Genen auftreten, vorherzusagen.
Angesichts dessen besteht ein dringender Bedarf ein Verfahren zu entwickeln, das den komplexen Metabolismus bzw. Stoffwechsel von Mikroorganismen durch Verwendung der Technik der Analyse des metabolischen Flusses unter einem Gesamtgesichtspunkt – abgesehen von der Stammmanipulation – erläutern kann, welches teilweise metabolische Information bzw. Stoffwechselinformation verwendet, das ein Verständnis der Effekte der Manipulation eines spezifischen Gens auf den metabolischen Gesamtfluss liefern kann, und das die optimalen mikrobiellen meta bolischen Flüsse, die für die Massenproduktion nützlicher Zielsubstanzen erforderlich sind, wissenschaftlich prüfen und genau vorhersagen kann.
Demgemäß haben die Erfinder große Anstrengungen unternommen, um ein Verfahren zur effizienten Steigerung der Produktion nützlicher Zielsubstanzen aufzufinden, und es wurde im Ergebnis herausgefunden, dass spezifische Schlüsselmetabolite, die in die Produktion der nützlichen Substanzen involviert sind, durch Zeichnen bzw. Erstellen eines Profils einer Zielfunktion durch einen Algorithmus, wobei Funktionen gestört werden, die in der Bildungsgeschwindigkeit und Produktion der nützlichen Substanzen involviert sind, Bestimmen der Verwertung (definiert als Gesamtfluss (Φ)) jedes Metabolits aus dem Profil und Screenen auf Schlüsselmetabolite aus dem Profil, identifiziert werden können. Die Schlüsselmetabolite, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme in der Bildungsgeschwindigkeit der nützlichen Substanz zeigen, führen daher zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Screening spezifischer Schlüsselmetabolite, die die Produktionsausbeute nützlicher Substanzen erhöhen, bereitzustellen, wobei das Verfahren das Zeichnen eines Profils, das eine einzelne Zielfunktion betrifft, durch einen Algorithmus umfasst, wobei eine oder mehrere in die Bildungsgeschwindigkeit und Produktion der nützlichen Substanzen involvierte Funktionen gestört werden, und die Bestimmung der Metabolit-Verwertung (definiert als Flusssumme (Φ)) eines Organismus aus dem Profil.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verbesserung eines Organismus, der nützliche Substanzen produziert, bereitzustellen, wobei das Verfahren das Einführen und/oder Amplifizieren von Genen, die mit dem zuvor erwähnten gescreenten spezifischen Metaboliten assoziiert sind, umfasst.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz bereitzustellen, in welchem mit den gescreenten spezifischen Metaboliten assoziierte Gene während des Kultivierens eines Organismus, der die nützlichen Substanzen produziert, zugeführt werden.
Zur Lösung der obigen Aufgaben liefert die Erfindung unter einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten, die bei der Erhöhung der Produktion nützlicher Substanzen involviert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Auswahl eines Zielorganismus zur Produktion einer nützlichen Zielsubstanz und Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Organismus; (b) Definieren bzw. Bestimmen der Verwertung jedes Metaboliten als Gesamtfluss (Φ), ausgedrückt durch die folgende Gleichung 1 und Zeichnen eines Profils einer Einzelzielfunktion, die mit der Bildungsrate der nützlichen Substanz in Beziehung steht durch Störung einer oder mehrerer Funktionen, die in die Bildungsrate und Produktion der nützlichen Substanzen involviert ist bzw. sind, durch das Gesamtfluss-SCOF (Gesamtflussscanning mit kompromittierten Zielflüssen), um den Gesamtfluss des Stoffwechselwegs, konstruiert in Schritt (a), zu bestimmen; (c) Bestimmen des Gesamtflusses (Φ) jedes Metaboliten aus dem durch das Flusssummen-SCOF gezeichneten Profil und (d) Clustering und Screening eines spezifischen Metaboliten, der eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Zielsubstanz zeigt:
worin Φ_i die Verwertung des i-ten Metaboliten bedeutet, f_in bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, in der ein relevanter Metabolit verbraucht wird, für den i-ten Metaboliten, f_out bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, wobei die nützliche Zielsubstanz produziert wird, für den i-ten Metaboliten, S_ij bedeutet den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion und v_j bedeutet den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs.
Unter einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung eines Organismus, der eine nützliche Substanz produziert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Auswahl eines Zielorganismus zur Produktion einer nützlichen Zielsubstanz und Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Organismus; (b) Bestimmen der Verwertung jedes Metaboliten als Gesamtfluss (Φ), ausgedrückt durch die folgende Gleichung 1 und Zeichnen bzw. Erstellen eines Profils einer Einzelzielfunktion, die mit der Bildungsrate der nützlichen Substanz in Beziehung steht, durch Störung einer oder mehrer Funktionen, die in der Bildungsrate und Produktion der nützlichen Substanzen involviert sind, durch das Gesamtfluss-SCOF (Gesamtflussscanning mit kompromittierten Zielflüssen), um den Gesamtfluss des Stoffwechselwegs, konstruiert in Schritt (a), zu bestimmen; (c) Bestimmen des Gesamtflusses (Φ) jedes Metaboliten aus dem durch das Gesamtfluss-SCOF gezeichneten Profil; (d) Clustering und Screening eines spezifischen Metaboliten, der eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Zielsubstanzen zeigt; (e) Auswahl an zu amplifizierenden Genen aus einem mit den in Schritt (d) gescreenten spezifischen Metaboliten assoziierten Stoffwechselweg; und (f) Konstruktion einer Mutante des Zielorganismus durch Einführen und/oder Amplifizieren der in Schritt (e) ausgewählten Gene in den/dem Zielorganismus.
Das Verfahren zur Verbesserung des Organismus, der die nützliche Substanz produziert, kann zusätzlich den Schritt (g) experimentelle Bestätigung der Produktion der nützlichen Substanz durch Kultivieren der in Schritt (f) konstruierten Mutante umfassen.
Unter einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz, wobei das Verfahren das Kultivieren eines Organismus, welcher gemäß dem Verbesserungsverfahren verbessert ist, umfasst.
Unter einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz durch Kultivierung eines Organismus, wobei das Verfahren die Zufuhr der gescreenten Metabolite während der Kultivierung des Organismus umfasst, wobei die Metaboliten erhalten werden durch die folgenden Schritte: (a) Auswahl eines Zielorganismus zur Produktion einer nützlichen Zielsubstanz und Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Organismus; (b) Definieren bzw. Bestimmen der Verwertung jedes Metaboliten als Gesamtfluss (Φ), ausgedrückt durch die folgende Gleichung 1 und Zeichnen eines Profils einer Einzelzielfunktion, die mit der Bildungsrate der nützlichen Substanz in Beziehung steht, durch Störung einer oder mehrerer Funktionen, die in die Bildungsrate und Produktion der nützlichen Substanzen involviert ist bzw. sind, durch das Gesamtfluss-SCOF (Gesamtflussscanning mit kompromittierten Zielflüssen), um den Gesamtfluss des Stoffwechselwegs, konstruiert in Schritt (a), zu bestimmen; (c) Bestimmen des Gesamtflusses (Φ) jedes Metaboliten aus dem durch das Gesamtfluss-SCOF gezeichneten Profil und (d) Clustering und Screening spezifischer Metaboliten, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Zielsubstanz zeigen.
In der vorliegenden Erfindung ist bzw. sind die Funktion im Schritt (b) im Verfahren für das Screening des Metaboliten vorzugsweise eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus spezifischer Wachstumsrate, Nebenproduktbildungsrate, Substrataufnahmerate, ATP-Bildungsrate und Sauerstoffaufnahmerate. Ebenso umfasst das Gesamtfluss-SCOF im Schritt (b) die Bestimmung des Minimalwerts und Maximalwerts jeder der Zielfunktionen mit Ausnahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz, und das Ausführen der Optimierung unter Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz innerhalb eines Bereichs zwischen dem Minimalwert und dem Maximalwert.
In der vorliegenden Erfindung werden f_in und f_out vorzugsweise durch die folgenden Gleichungen 2 bzw. 3 verkörpert:
worin S_ij den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion bedeutet und v_j den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs bedeutet.
In der vorliegenden Erfindung ist der Zielorganismus vorzugsweise ein Mikroorganismus. Ebenso ist die nützliche Zielsubstanz ein Primärmetabolit, ein Sekundärmetabolit oder ein Fremdprotein, und der Zielorganismus ist ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, einen Primärmetaboliten, einen Sekundärmetaboliten oder ein fremdes Protein zu produzieren.
Andere Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden genauen Beschreibung und den Ansprüchen deutlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein schematisches Diagramm eines Verfahrens zur Erhöhung der Produktion einer nützlichen Substanz durch die Analyse von Schlüsselmetaboliten gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt ein Beispiel von metabolischen Flüssen einer Reaktionsgleichung, wobei ein relevanter Metabolit mit Bezug auf den i-ten Metaboliten verbraucht wird. In 2 besteht f_in aus drei metabolischen Flüssen, und f_out besteht aus zwei metabolischen Flüssen.
3 zeigt ein Profil, das erhalten wird, wenn die spezifische Wachstumsrate und die Bildungsrate einer nützlichen Substanz als eine Zielfunktion verwendet werden.
4 zeigt das Profil und die Liste von Metaboliten, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) (y-Achse) mit einer Zunahme der Bildungsrate einer nützlichen Substanz (x-Achse) zeigen.
5 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass nützliche Metabolite durch die Zugabe von Metaboliten von außen vermehrt werden.
6 ist ein schematisches Diagramm, welches zeigt, dass der Maximalwert der Bildungsrate einer nützlichen Substanz erhöht wird, wenn Metabolite von außen zugegeben werden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND IHRER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Der hierin verwendete Begriff „Störung" bezieht sich auf eine Manipulationsstörung einer Gruppe aller Metaboliten durch Anwendung eines spezifischen externen Faktors, um so den Metaboliten mit der gewünschten Eigenschaft aufzufinden.
Der hierin verwendete Begriff „Clustering" soll ein Verfahren und einen Prozess zur Gruppierung von Metaboliten umfassen, die ähnliche Muster bzw. Patterns in einer Gruppe von Metaboliten als Ergebnis aus Störung aller Metaboliten zeigen.
Der hierin verwendete Begriff „Amplifikation" von Genen umfasst alle Vorgänge der Erhöhung des Expressionsgrads der relevanten Gene durch Manipulation der gesamten oder eines Teils der Basensequenzen der zu replizierenden Gene in einem Organismus in großem Ausmaß.
Der hierin verwendete Begriff „Kultur" soll nicht nur die Kultur bzw. Kultivierung von Mikroorganismen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefen, Pilzen sowie Tier- und Pflanzenzellen, umfassen, sondern auch die Kultivierung von Pflanzen und Zucht von Tieren.
1 zeigt das Konzept eines Verfahrens zur Erhöhung der Produktion einer nützlichen Substanz durch die Analyse von Schlüsselmetaboliten unter Verwendung des Gesamtflusses gemäß der vorliegenden Erfindung. Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Erhöhung der Produktausbeute einer nützlichen Substanz durch Auswahl eines Zielorganismus, der die nützliche Substanz produziert, Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Mechanismus, Bestimmung der Werte des Gesamtflusses (Φ) der Metaboliten im konstruierten Netzwerk des Stoffwechselwegs, Störung des Gesamtflusses sowie Screening von Schlüsselmetaboliten, die in die Produktionsausbeute einer nützlichen Zielverbindung involviert sind durch Clustering, und Bereitstellen der Schlüsselmetaboliten. Die vorliegende Erfindung soll im Folgenden in. Einzelheiten beschrieben werden.
1. Konstruktion des metabolischen Netzwerks
In der vorliegenden Erfindung wurde ein neues System zur metabolischen Flussanalyse unter Verwendung einer E.-coli-Mutante als Zielstamm zur Produktion einer nützlichen Substanz konstruiert. Dieses System umfasst den Großteil des metabolischen Netzwerks von E. coli. Das neue metabolische Netzwerk besteht für E. coli aus 979 biochemischen Reaktionen und es werden 814 Metabolite im metabo lischen Netzwerk in Betracht gezogen. Die biologische Zusammensetzung von E. coli zur Verwendung in der Bildungsrate der Biomasse, die als Zielfunktion der metabolischen Flussanalyse verwendet werden soll, wurde wie in der früheren Literatur beschrieben, konstruiert (Neidhardt et al., E. coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 1996).
2. Definition und Störung des Gesamtflusses
(1) Gesamtfluss
Wenn alle Metaboliten, ihre Stoffwechselwege und eine entsprechende stöchiometrische Matrix (S^T _ij; der stöchiometrische Koeffizient des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion mit der Zeit) bekannt sind, so kann ein metabolischer Flussvektor (v_j, der metabolische Fluss des j-ten Wegs) berechnet werden, wobei eine Änderung der Metabolitkonzentration X mit der Zeit ausgedrückt werden kann als die Summe der Flüsse aller metabolischen Reaktionen bzw. Stoffwechselreaktionen. Eine Änderung von X mit der Zeit kann unter der Annahme eines quasi-stationären Zustands definiert werden über die folgende Gleichung: STv = dX/dt = 0worin S^Tv die Veränderung von X mit der Zeit ist, X die Metabolitkonzentration ist und t die Zeit ist.
Hierbei ist die Verwertung der Flüsse um die bzw. der Metabolite, um so den metabolischen Flüssen, die mit Bezug auf die Stoffwechselreaktionen definiert sind, zu entsprechen, wie folgt definiert.
Genauer, wird der metabolische Fluss einer Reaktion, wobei ein relevanter Metabolit verbraucht wird, für den i-ten Metaboliten als f_in definiert, und der metabolische Fluss einer Reaktion, wobei ein relevanter Metabolit produziert wird, für den i-ten Metaboliten als f_out definiert, so werden diese metabolischen Flüsse werden durch die folgenden Gleichungen 2 bzw. 3 verkörpert.
worin S_ij der stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion ist und v_j ist der metabolische Flussvektor des j-ten Wegs.
2 zeigt ein Beispiel des metabolischen Flusses einer Reaktion, wobei relevante Metabolite verbraucht werden, für den i-ten Metaboliten. Die metabolischen Flüsse der Reaktionen, die in 2 gezeigt sind, können wie folgt definiert werden:
Die oben definierten f_in und f_out können als die Verwertung der Flüsse um die bzw. der Metaboliten angesehen werden, da sie denselben Absolutwert unter der Annahme eines quasi-stationären Zustands haben. In der vorliegenden Erfindung wird die Verwertung der Flüsse der Metaboliten als „Gesamtfluss" (Φ) bezeichnet und gemäß Gleichung 1 definiert:
worin Φ_i die Verwertung des i-ten Metaboliten bedeutet, f_in bedeutet den metabolischen Gesamtfluss einer Reaktion, in der ein relevanter Metabolit verbraucht wird, für den i-ten Metaboliten, f_out bedeutet den metabolischen Gesamtfluss der Reaktionen, wobei ein nützliches Zielprodukt produziert wird, für den i-ten Metaboliten, S_ij bedeutet den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion und v_j bedeutet den metabolischen Fluss des j-ten Wegs.
Der Gesamtfluss (Φ) ist eine neu definierte Menge, um die Verwertung der Metabolite auszudrücken, die bisher nicht in dem existierenden Verfahren zur metabolischen Analyse verwendet worden sind. Je höher die Verwertung der relevanten Metabolite ist, desto höher wird der Wert Φ, und je niedriger die Verwertung der relevanten Metabolite ist, desto niedriger wird der Wert Φ.
Im Allgemeinen basiert die bekannte metabolische Flussanalyse auf der Annahme eines quasi-stationären Zustands, und eine Konzentrationsänderung der durch eine Änderung in der externen Umgebung verursachten internen Metabolite erfolgt unmittelbar („is very immediate"), und daher wird diese Änderung im Allgemeinen vernachlässigt und angenommen, dass die Konzentration von internen Metaboliten sich nicht ändert. Konkret besitzt das Verfahren zur metabolischen Flussanalyse einen Nachteil darin, dass nicht die Eigenschaft jedes Metaboliten untersucht werden kann, da eine Konzentrationsänderung interner Metabolite, verursacht durch eine Änderung in der externen Umgebung, unmittelbar erfolgt, und daher wird diese Änderung vernachlässigt, weshalb angenommen wird, dass die Konzentration interner Metabolite sich nicht ändert.
In der vorliegenden Erfindung ist der Gesamtfluss (Φ) definiert als Verwertung der Metabolite, um so eine quantitative Basis bereitzustellen, die geeignet ist, um Schlüsselmetabolite zur Steigerung der Produktion einer nützlichen Substanz aufzufinden.
(2) Scannen des Gesamtflusses mit kompromitierten Zielflüssen (Gesamtfluss-SCOF)
Es ist möglich, aus der obigen Definition den Gesamtfluss (Φ) zu bestimmen und den Gesamtfluss (Φ) für alle Metaboliten auf der Basis des oben bestimmten Gesamtflusses zu bestimmen.
Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, eine Änderung des Gesamtflusses gemäß der Störung der mit der Produktion einer nützlichen Substanz assoziierten Funktionen zu untersuchen. Dabei wurde das Profil der Flusssumme interner Metabolite entsprechend der Änderung der Zielfunktionen untersucht.
Wird eine metabolische Flussanalyse auf Basis linearer Programmierung untersucht, so wird eine Mehrzahl von Zielfunktionen im Allgemeinen verwendet, um eine Änderung der Funktionen gemäß einer Störung zu untersuchen. Als Zielfunktionen werden hauptsächlich die Nebenproduktbildungsrate und die Bildungsrate von Biomasse verwendet (Pharkya, P. et al., Biotechnol Bioeng., 84: 887, 2003). Ein lineares Programmieren, welches die Verwendung von zwei oder mehreren Zielfunktionen, wie oben beschrieben, verwendet, wird als Mehrzieloptimierung bzw. lineare Mehrzielprogrammierung bezeichnet.
Zielfunktionen, die mit der Produktion einer nützlichen Substanz assoziiert sind, die in der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, umfassen Produktbildungsrate (nützliche Substanz), spezifische Wachstumsrate, Nebenproduktbildungsrate, Substrataufnahmerate, ATP-Bildungsrate, Sauerstoffaufnahmerate und dergleichen. Die hierin verwendete lineare Mehrzielprogrammierung bzw. -optimierung kann auf lineares Programmieren mit einer Zielfunktion durch den folgenden, als Gesamtfluss-SCOF definierten Algorithmus transformiert werden. Andere Funktionen werden transformiert, so dass sie den Einschränkungsbedingungen genügen.
Schritt 1:
Eine Mehrzahl von Zielfunktionen wird auf Basis der Bildungsrate der spezifischen nützlichen Substanz ausgewählt. Eine beliebige der mit der Produktion der nützlichen Substanz assoziierten Funktionen kann wie oben beschrieben ausgewählt werden.

v-Zellzielfunktion 1 = Produktbildungsrate,
v-Zellzielfunktion 2 = spezifische Wachstumsrate,
v-Zellzielfunktion 3 = Bildungsrate eines Nebenprodukts...

Dabei sind die mathematischen Bedeutungen durch lineare Mehrzielprogrammierung wie folgt:
Zielfunktionen:

maximiere v-Zellzielfunktion 3,
maximiere v-Zellzielfunktion 2,
maximiere v-Zellzielfunktion 1,

Einschränkungsbedingungen:
worin I ein Satz Metabolite ist, E ein Satz externer Metabolite ist, J ein Satz Reaktionen ist, S_ij der stöchiometrische Koeffizient des i-ten Metaboliten in der i-ten Reaktion ist, b, der Netto-Transportfluss (+: Produktabscheidung; –: Substratauf nahme; sowie 0: Intermediärwert) des i-ten Metaboliten ist, l_i und u_i die untere bzw. obere Grenze für den Nettotransportfluss des i-ten Metaboliten bezeichnen und α_j und β_j den unteren bzw. oberen Grenzwert für den Reaktionsfluss bezeichnen.
Schritt 2:
Jede der Zielfunktionen wird maximiert oder minimiert, um den Maximalwert und Minimalwert jeder Funktion zu bestimmen. vmin-Zellzielfunktion 1 < v-Zellzielfunktion 1 < vmax-Zellzielfunktion 1 vmin-Zellzielfunktion 2 < v-Zellzielfunktion 2 < vmax-Zellzielfunktion 2 vmin-Zellzielfunktion 3 < v-Zellzielfunktion 3 < vmax-Zellzielfunktion 3 ...
Schritt 3:
Die lineare Mehrzielprogrammierung kann auf eine lineare Programmierung bzw. eine lineare Optimierung mit einer Zielfunktion durch den folgenden Algorithmus transformiert werden. Die Bildungsrate der nützlichen Substanz wird als Einzelzielfunktion gesetzt und die Optimierung wird durchgeführt, während die Produktbildungsrate (nützliche Substanz) innerhalb eines Bereichs zwischen den Minimalwerten und Maximalwerten anderer Funktionen erhöht wird.
Der obige Algorithmus macht es möglich, einen metabolischen Flussbereich zu bestimmen, der den betrachteten Zielfunktionen genügt.
Anschließend wird der Gesamtfluss (Φ) aller Metabolite aus dem Profil jeder der Zielfunktionen bestimmt. Dabei ist die Bildungsrate der nützlichen Substanzen als Hauptfunktion des Screenings von Schlüsselmetaboliten gewählt, andere Funktionen, die die Produktion der nützlichen Substanz beeinflussen, werden wechselnd angewendet, um das Profil der Produktbildungsrate zu bestimmen und der Gesamtfluss (Φ) aller Metabolite wird aus dem Profil bestimmt, und es wird eine Zunahme oder Abnahme der Metaboliten untersucht.
3. Gesamtfluss-Clustering unter Verwendung der Bildungsrate der nützlichen Substanz und der spezifischen Wachstumsrate als Zielfunktionen
Aus der linearen Programmierung, die zwei Zielfunktionen verwendet, d. h. das Profil, bestehend aus der Bildungsrate der nützlichen Substanz und einer anderen Funktion (zum Beispiel der spezifischen Wachstumsrate), können Metabolite, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) bei einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz zeigen, geclustert und gescreent werden.
Zum Beispiel ist es möglich, die Flusssumme (Φ) aller internen Metaboliten unter Verwendung der spezifischen Wachstumsrate und der Bildungsrate der nützlichen Substanz als Funktionen aus jedem Punkt, ausgewählt aus einem Profil, das die spezifische Wachstumsrate und die Bildungsrate der nützlichen Substanz als Zielfunktionen umfasst, wie in 3 gezeigt, zu bestimmen.
Anschließend werden aus dem Profil der Bildungsrate der nützlichen Substanz gemäß der Funktion der spezifischen Wachstumsrate, wie in 3 gezeigt, Metabolite gescreent, welche eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz (Richtung A → B) zeigen, um Schlüsselmetabolite aufzufinden.
Diejenigen Metabolite, welche eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) bei einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz zeigen, werden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren gescreent, wie in 4 gezeigt. 4 zeigt das Profil des Gesamtflusses (y-Achse) jedes Metaboliten für die Bildungsrate der nützlichen Substanz (x-Achse) sowie eine Liste der Metaboliten. Die Zunahme (Φ) im Gesamtfluss mit der Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz zeigt an, dass die Verwertung relevanter Metabolite mit der Bildung der nützlichen Substanz zunimmt.
Es ist ebenso möglich, eine lineare Mehrzielprogrammierung durchzuführen, die drei oder mehr Zielfunktionen verwendet, einschließlich spezifischer Wachstumsrate, der Bildungsrate der nützlichen Substanz und der Bildungsrate der unnötigen Nebenprodukte der nützlichen Substanz. Der Gesamtfluss (Φ) aller internen Metaboliten kann bestimmt werden aus einem Profil, welches sich aus der vorstehend erwähnten linearen Mehrzielprogrammierung bzw. -optimierung unter Verwendung der drei Zielfunktionen ergibt, und eine Metabolitengruppe, welche eine Zunahme in der Verwertung relevanter Metabolite gemäß der Bildung der nützlichen Substanz zeigt sowie eine geringe Anzahl unnötiger Nebenprodukte aufweist, kann aus dem Profil gescreent werden.
4. Experimentelle Analyse zur Verbesserung der Produktivität: Metabolitenzufuhr von außen
Die Bildungsrate der nützlichen Substanz wird als Hauptfunktion gewählt, und andere Funktionen, die die Produktion der nützlichen Substanzen beeinflussen, werden abwechselnd angewendet, und das Gesamtfluss-SCOF, ein Algorithmus, der die Funktionen stört, wird ausgeführt, um das Profil der Zielfunktion zu bestimmen. Aus dem Profil wird der Gesamtfluss (Φ) aller Metaboliten bestimmt, und eine Gruppe von Metaboliten, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) mit einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz zeigen, wird gescreent. Die Zunahme (Φ) des Gesamtflusses mit der Zunahme der Produktbildungsrate zeigt, dass die Verwertung der relevanten Metaboliten mit Bildung der nützlichen Substanzen zunimmt. Demnach ist es möglich, den Gesamtfluss durch Einführen und/oder Amplifizieren von mit Metaboliten assoziierten Genen und Zugabe fehlender Metabolite von außerhalb der Zellen zu erhöhen (vgl. 5).
Werden Gene, die die gescreenten Schlüsselmetabolite produzieren oder verbrauchen, eingeführt und/oder amplifiziert, so ist es möglich, die Verwertung der relevanten Metaboliten zu erhöhen.
Die Zufuhr spezifischer Metabolite von außen, wie in 6 gezeigt, dient dazu, einen Bereich in Richtung der nützlichen Substanzen im metabolischen Flussbereich zu vergrößern. Insbesondere vergrößert die externe Zufuhr relevanter Metabolite den ursprünglichen metabolischen Flussbereich, und vergrößert insbesondere den metabolischen Flussbereich in Richtung nützlicher Substanzen. Es ist daher möglich, die Produktion nützlicher Substanzen durch Identifizierung von Metaboliten, die bei der Produktion an nützlichen Substanzen wichtig sind, und Zufuhr der relevanten Metaboliten von außen, zu steigern.
Es sollte untersucht werden, ob der relevante Stamm relevante Metaboliten aufnehmen kann, was durch eine Vielzahl an Datenbanken und Literatur realisiert werden kann. Insbesondere können, wenn ein Transporter existiert, der relevante Metabolite aufnehmen kann, relevante Metabolite zu einem Medium im betreffenden Kultivierungsexperiment zugegeben werden, und die Produktion nützlicher Substanzen kann letztendlich analysiert werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung in Einzelheiten mit Bezug auf die spezifischen Merkmale beschrieben worden ist, ist es dem Fachmann klar, dass diese Beschreibung lediglich eine bevorzugte Ausführungsform beschreibt, und nicht den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung einschränkt. Der wesentliche Bereich der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche und deren Äquivalente bestimmt. Der Fachmann wird erkennen, dass einfache Modifikationen, Variationen und Hinzufügungen zur gegenwärtigen Erfindung möglich sind, ohne jedoch den Sinn und Gültigkeitsbereich der Erfindung, wie in den beigelegten Ansprüchen offenbart, zu verlassen.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Wie oben in Einzelheiten beschrieben, kann gemäß der vorliegenden. Erfindung die metabolische Verwertung (Gesamtfluss, Φ) spezifischer Metabolite entsprechend der Zunahme der Bildungsrate nützlicher Substanzen vorhergesagt werden, so dass Schlüsselmetabolite zur Zunahme der Produktion einer nützlichen Substanz gescreent werden können. Es ist ebenso möglich, die Produktion einer nützlichen Substanz durch das Verfahren zur Verbesserung eines Zielorganismus durch Einführen und/oder Amplifizieren von mit den gescreenten Metaboliten assoziierten Genen zu verbessern oder durch das Verfahren der Zugabe der Metabolite bei der Kultivierung des Organismus zu steigern.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung eines Organismus durch Profilerstellung des Gesamtflusses bzw. der Flusssumme von Metaboliten und insbesondere ein Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten, wobei das Verfahren umfasst: Zeichnen bzw. Erstellen eines Profils von Zielfunktionen, basierend auf der Bildungsrate mit einer nützlichen Substanz als Hauptfunktion durch einen Algorithmus unter Störung anderer Funktionen, die die Produktion der nützlichen Substanz beeinflussen; Bestimmen der Verwertung (Gesamtfluss (Φ)) aller Metaboliten aus dem Profil; und Screening der Schlüsselmetabolite, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) unter Zunahme der Bildungsrate einer nützlichen Substanz bzw. nützlicher Substanzen zeigen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verbesserung eines Organismus, welcher eine nützliche Substanz produziert, welche das Einführen und/oder Amplifizieren von Genen, die mit den gescreenten Schlüsselmetaboliten assoziiert sind, oder das Einführen von Genen von der Außenseite in den Organismus umfasst. Gemäß der Erfindung kann die metabolische Verwertung (Gesamtfluss; Φ) spezifischer Metabolite gemäß der Zunahme der Bildungsrate einer nützlichen Substanz vorhergesagt werden, so dass Schlüsselmetabolite zur Steigerung der Produktion einer nützlichen Substanz gescreent werden können. Es ist ebenso möglich, die Produktion einer nützlichen Substanz durch das Verfahren der Verbesserung eines Zielorganismus durch Einführen und/oder Amplifizieren von mit den gescreenten Metaboliten assoziierten Genen, oder durch das Verfahren der Zufuhr von Metaboliten während der Kultivierung des Organismus zu steigern.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Lee et al., Trends Biotechnol., 23: 349, 2005 [0004]
- Papin, J. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6: 99, 2005 [0005]
- Neidhardt et al., E. coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 1996 [0031]
- Pharkya, P. et al., Biotechnol Bioeng., 84: 887, 2003 [0042]

Claims

Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten, die bei der Erhöhung der Produktion nützlicher Substanzen involviert sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Auswahl eines Zielorganismus zur Produktion einer nützlichen Zielsubstanz und Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Organismus; (b) Bestimmen der Verwertung jedes Metaboliten als Gesamtfluss (Φ), ausgedrückt durch die folgende Gleichung 1, und Zeichnen eines Profils einer Einzelzielfunktion, die mit der Bildungsrate der nützlichen Substanz in Beziehung steht durch Störung einer oder mehrerer Funktionen, die in der Bildungsrate und Produktion der nützlichen Substanzen involviert ist bzw. sind, durch das Gesamtfluss-SCOF (Gesamtflussscanning mit kompromittierten Zielflüssen), um den Gesamtfluss des Stoffwechselwegs, konstruiert in Schritt (a), zu bestimmen;
worin Φ_i die Verwertung des i-ten Metaboliten bedeutet, f_in bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, in der ein relevanter Metabolit verbraucht wird, für den i-ten Metaboliten, f_out bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, wobei die nützliche Zielsubstanz produziert wird, für den i-ten Metaboliten, S_ij bedeutet den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion und v_j bedeutet den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs; (c) Bestimmen des Gesamtflusses (Φ) jedes Metaboliten aus dem durch das Gesamtfluss-SCOF gezeichneten Profil und (d) Clustering und Screening eines spezifischen Metaboliten, der eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Zielsubstanz zeigt.
Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten gemäß Anspruch 1, wobei die Funktion im Schritt (b) eine oder mehrere ist bzw. sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der spezifischen Wachstumsrate, der Bildungsrate des Nebenprodukts, der Substrataufnahmerate, der ATP-Bildungsrate und der Sauerstoff-Aufnahmerate.
Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten gemäß Anspruch 1, wobei das Gesamtfluss-SCOF in Schritt (b) die Bestimmung des Minimalwerts und Maximalwerts jeder der Zielfunktionen mit Ausnahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz, sowie das Durchführen der Optimierung während der Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz innerhalb eines Bereichs zwischen dem Minimalwert und dem Maximalwert umfasst.
Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten gemäß Anspruch 1, wobei f_in und f_out durch die folgenden Gleichungen 2 bzw. 3 verkörpert werden:
worin S_ij den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion bedeutet und v_j den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs bedeutet.
Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten gemäß Anspruch 1, wobei der Zielorganismus ein Mikroorganismus ist.
Verfahren zum Screening von Schlüsselmetaboliten gemäß Anspruch 1, wobei die nützliche Zielsubstanz ein Primärmetabolit, ein Sekundärmetabolit oder ein Fremdprotein ist, und der Zielorganismus ein Mikroorganismus ist, der in der Lage ist, einen Primärmetaboliten, einen Sekundärmetaboliten oder ein Fremdprotein zu produzieren.
Verfahren zur Verbesserung eines Organismus, der eine nützliche Substanz produziert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Auswahl eines Zielorganismus zur Produktion einer nützlichen Zielsubstanz und Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Organismus; (b) Bestimmen der Verwertung jedes Metaboliten als Gesamtfluss (Φ), ausgedrückt durch die folgende Gleichung 1, und Zeichnen eines Profils einer Einzelzielfunktion, die mit der Bildungsrate der nützlichen Substanz in Beziehung steht durch Störung einer oder mehrerer Funktionen, die in der Bildungsrate und Produktion der nützlichen Substanzen involviert ist bzw. sind, durch den Gesamtfluss-SCOF (Gesamtflussscanning mit kompromittierten Zielflüssen), um den Gesamtfluss des Stoffwechselwegs, konstruiert in Schritt (a), zu bestimmen:
worin Φ_i die Verwertung des i-ten Metaboliten bedeutet, f_in bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, in der ein relevanter Metabolit verbraucht wird, für den i-ten Metaboliten, f_out bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, wobei die nützliche Zielsubstanz produziert wird, für den i-ten Metaboliten, S_ij bedeutet den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion und v_j bedeutet den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs; (c) Bestimmen des Gesamtflusses (Φ) jedes Metaboliten aus dem durch das Gesamtfluss-SCOF gezeichneten Profil und (d) Clustering und Screening spezifischer Metabolite, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Zielsubstanzen zeigen; (e) Auswahl an zu amplifizierenden Genen aus einem mit den in Schritt (d) gescreenten spezifischen Metaboliten assoziierten Stoffwechselweg; und (f) Konstruktion einer Mutante des Zielorganismus durch Einführen und/oder Amplifizieren der in Schritt (e) ausgewählten Gene in den/dem Zielorganismus.
Verfahren zur Verbesserung des die nützliche Substanz produzierenden Organismus gemäß Anspruch 7, welches zusätzlich den Schritt von (g) experimenteller Bestätigung der Produktion der nützlichen Substanz durch Kultivieren der in Schritt (f) konstruierten Mutante umfasst.
Verfahren zur Verbesserung des die nützliche Substanz produzierenden Organismus gemäß Anspruch 7, wobei die Funktion in Schritt (b) eine oder mehrere ist bzw. sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus spezifischer Wachstumsrate, Nebenproduktbildungsrate, Substrataufnahmerate, ATP-Bildungsrate und Sauerstoffaufnahmerate.
Verfahren zur Verbesserung des die nützliche Substanz produzierenden Organismus gemäß Anspruch 7, wobei die Funktion im Schritt (b) die spezifische Wachstumsrate ist.
Verfahren zur Verbesserung des die nützliche Substanz produzierenden Organismus gemäß Anspruch 7, wobei das Gesamtfluss-SCOF im Schritt (b) Folgendes umfasst: Bestimmen des Minimalwerts und Maximalwerts jeder Zielfunktion außer der Bildungsrate der nützlichen Substanz, sowie Durchführen von Optimie rung bei Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz innerhalb eines Bereichs zwischen dem Minimalwert und dem Maximalwert.
Verfahren zur Verbesserung des die nützliche Substanz produzierenden Organismus gemäß Anspruch 7, wobei f_in und f_out durch die folgenden Gleichungen 2 bzw. 3 verkörpert werden:
worin S_ij den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion bedeutet und v_j den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs bedeutet.
Verfahren zur Verbesserung des die nützliche Substanz produzierenden Organismus gemäß Anspruch 7, wobei der Zielorganismus ein Mikroorganismus ist.
Verfahren zur Verbesserung des die nützliche Substanz produzierenden Organismus gemäß Anspruch 7, wobei die nützliche Zielsubstanz ein Primärmetabolit, ein Sekundärmetabolit oder ein Fremdprotein ist, und der Zielorganismus ist ein Mikroorganismus ist, der in der Lage ist, einen Primärmetaboliten, einen Sekundärmetaboliten oder ein Fremdprotein zu produzieren.
Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz, wobei das Verfahren das Kultivieren des Organismus, verbessert durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz durch Kultivierung eines Organismus, wobei das Verfahren die Zufuhr der gescreenten Metabolite während des Kultivierens des Organismus umfasst, wobei die Metaboliten erhalten werden durch die folgenden Schritte: (a) Auswahl eines Zielorganismus zur Produktion einer nützlichen Zielsubstanz und Konstruktion des metabolischen Netzwerkmodells des ausgewählten Organismus; (b) Bestimmen der Verwertung jedes Metaboliten als Gesamtfluss (Φ), ausgedrückt durch die folgende Gleichung 1, und Zeichnen eines Profils einer Einzelzielfunktion, die mit der Bildungsrate der nützlichen Substanz in Beziehung steht durch Störung einer oder mehrer Funktionen, die in der Bildungsrate und Produktion der nützlichen Substanzen involviert ist bzw. sind, durch das Gesamtfluss-SCOF (Gesamtflussscanning mit kompromittierten Zielflüssen), um den Gesamtfluss des Stoffwechselwegs, konstruiert in Schritt (a), zu bestimmen;
worin Φ_i die Verwertung des i-ten Metaboliten bedeutet, f_in bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, in der ein relevanter Metabolit verbraucht wird, für den i-ten Metaboliten f_out bedeutet den metabolischen Fluss einer Reaktion, wobei die nützliche Zielsubstanz produziert wird, für den i-ten Metaboliten, S_ij bedeutet den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion und v_j bedeutet den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs; (c) Bestimmen des Gesamtflusses (Φ) jedes Metaboliten aus dem durch das Gesamtfluss-SCOF gezeichneten Profil und (d) Clustering und Screening spezifischer Metabolite, die eine Zunahme im Gesamtfluss (Φ) gemäß einer Zunahme der Bildungsgeschwindigkeit der nützlichen Zielsubstanz zeigen.
Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen durch Kultivierung eines Organismus gemäß Anspruch 16, wobei die Funktion in Schritt (b) eine oder mehrere ist bzw. sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus spezifischer Wachstumsrate, Bildungsrate eines Nebenprodukts, Substrataufnahmerate, ATP-Bildungsrate und Sauerstoffaufnahmerate.
Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen durch Kultivierung eines Organismus gemäß Anspruch 16, wobei das Gesamtfluss-SCOF im Schritt (b) Folgendes umfasst: Bestimmen des Minimalwerts und Maximalwerts jeder Zielfunktion außer der Bildungsrate der nützlichen Substanz, sowie Durchführen von Optimierung bei Zunahme der Bildungsrate der nützlichen Substanz innerhalb eines Bereichs zwischen dem Minimalwert und dem Maximalwert.
Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen durch Kultivierung eines Organismus gemäß Anspruch 16, wobei f_in und f_out durch die folgenden Gleichungen 2 bzw. 3 verkörpert werden:
worin S_ij den stöchiometrischen Koeffizienten des i-ten Metaboliten in der j-ten Reaktion bedeutet und v_j den metabolischen Flussvektor des j-ten Wegs bedeutet.
Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen durch Kultivierung eines Organismus gemäß Anspruch 16, wobei der Zielorganismus ein Mikroorganismus ist.
Verfahren zur Herstellung nützlicher Substanzen durch Kultivierung eines Organismus gemäß Anspruch 16, wobei die nützliche Zielsubstanz ein Primärmetabolit, ein Sekundärmetabolit oder ein Fremdprotein ist, und der Zielorganismus ein Mikroorganismus ist, der in der Lage ist, einen Primärmetaboliten, einen Sekundärmetaboliten oder ein Fremdprotein zu produzieren.