KR20210107680A - 개선된 프럭토오스 이용을 위해 조작된 미생물 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 또는 그의 혼합물로부터 선택된 탄소원으로부터 락트산을 생산할 수 있는, 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.) 효모 균주로서, 상기 유전적으로 조작된 효모는 프럭토오스 임포터(fructose importer)로 기능하는 단백질의 생산능을 부여하는 하나 이상의 이종 DNA 카세트를 포함하는 것인 균주를 개시한다. 본 발명에 따른 유전적으로 조작된 효모 균주는 프럭토오스 이용의 개선을 갖고, 종래 균주보다 빠른 속도로 프럭토오스를 이용하여, 더 짧은 발효 시간 및 개선된 경제성을 제공할 수 있다.

Description

개선된 프럭토오스 이용을 위해 조작된 미생물 균주

본 발명은 화합물 생산을 위한 미생물의 유전 공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전적으로 변형된 미생물을 이용한 락트산의 생산을 위한 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 또는 그의 혼합물로부터 선택된 탄소원의 용도에 관한 것이다.

본 발명자들 및 다른 연구자들은 D-락트산 또는 L-락트산을 생산하는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 효모 균주를 개발하였다(2개의 대표적인 예를 위해, 미국 가출원 62/631,541 및 US 7,534,597 참조). 미국특허출원 62/631,541을 제외한 모든 선행기술의 예들에서, 덱스트로오스가 생물학적 발효에서 탄소원으로 사용된다. 그러나, 태국 및 동남아시아 및 기타 난대(warm) 또는 열대 지역, 예를 들면, 브라질, 중미, 인도, 미국 남부 등에서, 생물학적 발효를 위한 선호되는 탄소원은 사탕수수즙에서 유래된 이당류인 수크로오스이다. 유사하게, 사탕 무가 재배되는 온대 지역에서, 수크로오스가 생물학적 발효를 위한 선호되는 탄소원일 수 있다.

사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 다수의 다른 효모들 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus)는 발효 배지 또는 원형질막 주위 공간으로 전화 효소(invertase)를 분비하고, 이 효소는 수크로오스를 2개의 단당류, D-글루코오스(덱스트로오스로도 알려진, D-글루코오스는 이하에서 간결성을 위해 간단하게 글루코오스로 지칭될 것임) 및 D-프럭토오스(이하에서, 간결성을 위해 간단하게 프럭토오스로 지칭될 것임)로 분해한다. 그 후, 이 2개의 단당류는 효모 세포 내로 이입되어 대사된다.

전술된 2개의 효모 종을 포함한, 대부분의 미생물은 글루코오스와 다른 탄소원, 예를 들면, 프럭토오스의 혼합물이 제공되는 경우, 글루코오스를 대사하는 것에 대한 선호를 갖는다. 이러한 선호는 일반적으로, 다양한 명칭, 예를 들면, 글루코오스 저해(glucose inhibition), 글루코오스 억제(glucose repression), 분해대사산물 억제(catabolite repression), 탄소 분해대사산물 억제(carbon catabolite repression) 및 유도자 제거(inducer exclusion)로 불리는 여러 상이한 메카니즘 중 하나에 의해 비-글루코오스 탄소원의 이용을 억제하거나 저해하는 것에 의해 달성된다. 본 발명자들은 본 발명자들의 D-락트산 또는 L-락트산 생산 균주 및 탄소원으로서 수크로오스를 사용한 발효의 대부분에서, 발효의 종료 시, 통상적으로 약 48시간차에 일반적으로 발효액 중에 남아있는 일부 프럭토오스가 있다는 것을 주목했다(도 17 참조). 프럭토오스 농도는 통상적으로 약 1 g/L 내지 약 20 g/L로 다양했고, 글루코오스 농도는 통상적으로 검출 수준 미만이었다. 이 패턴은 수크로오스의 분해가 동일 몰량의 글루코오스와 프럭토오스를 생성하기 때문에, 평균적으로, 프럭토오스가 글루코오스보다 보다 느리게 사용된다는 것을 입증한다. 잔류 프럭토오스의 존재는 바람직하지 않고, 이는 프럭토오스는 환원당이고 따라서, 락트산의 하류 가공에서 제거하기에 어려운 원치않는 황색- 및 갈색 화합물을 초래하는 "메일라드(Maillard) 반응" 및/또는 카라멜화(caramelization)에서 아미노 화합물과 반응할 수 있기 때문이다. 또한, 잔류 프럭토오스는 폐류(waste stream)로부터 구제하는 것은 비현실적이므로, 폐기된 탄소의 형태이다. 프럭토오스가 보다 빠른 속도로 이용되는 경우, 수크로오스로부터의 산물의 보다 높은 수율이 수득될 수 있다. 따라서, 개선된 프럭토오스 이용은 2가지 합리적 이유, 1) 원치않는 부산물이 감소되고, 2) 원하는 산물의 보다 높은 수율이 수득될 것이라는 이유 때문에 유용할 것이다.

D-락트산 또는 L-락트산을 생산하는 클루이베로바이세스 마르시아누스 발효에서 일반적으로 잔류 프럭토오스를 관찰하고, 본 발명자들은 사카로마이세스 세레비시애 양조 균주(distillery strain)를 에탄올 생산을 위해 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물 상에서 배양하는 경우, 동일한 현상이 일어난다는 것을 보여주었다. 글루코오스가 완전히 소비되었을 때, 본 발명자들은 잔류 프럭토오스를 발견했다.

일부 상업적인 박테리아 발효의 경우, 수크로오스가 또한 선호되는 탄소원이고, 유사한 문제가 발생하며, 즉, 글루코오스가 소비된 후, 발효액 중에 잔류 프럭토오스가 남는다 (예를 들면, US 9,845,513의 도 1 참조).

본 발명자들은 미생물 균주가 증식 또는 발효 동안 일부 단계에서 글루코오스와 프럭토오스를 모두 포함하는 배지에서 증식 또는 발효 동안 평균적으로 또는 임의의 시점에 프럭토오스를 소비하는 것보다 더 빠른 속도로 글루코오스를 소비하는 현상을 의미하기 위해 구 "프럭토오스 문제(fructose problem or the fructose problem)"를 사용할 것이다. 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물은 증식 또는 발효의 개시 시에 배지에 존재할 수 있거나, 상기 혼합물은 증식 또는 발효 동안 수크로오스의 가수분해에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 전술된 프럭토오스 이용의 글루코오스 억제의 결과로, 다수의 미생물 종이 탄소원인 수크로오스에서 배양될 때, 결과적으로 수득되는 글루코오스가 결과적으로 수득되는 프럭토오스보다 더 빠르게 소비되어, 모든 당이 소비되고 원하는 산물, 예를 들면, 에탄올, 하나 이상의 부탄올 이성질체, D-락트산, L-락트산, 숙신산, 말산, 시트르산, 카로티노이드, 이소프렌, 지질, 또는 기타 상업적 목적의 화합물로 전환되도록 하기 위해, 수크로오스, 또는 글루코오스와 프럭토오스를 포함하는 혼합물을 이용한, 상업적인 발효는 글루코오스만을 이용하는 발효보다 더 긴 시간 동안 수행되어야 한다.

본 발명의 목적은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스 또는 그의 혼합물로부터 선택된 탄소원으로부터의 발효를 위해 적합하거나 바람직한 미생물 균주에 의한 프럭토오스 이용의 속도를 증가시키는 것이었다.

현재의 기술 (Current state of the art)

본 발명자들은 프럭토오스 이용을 개선할 목적을 위한 상업용 효모 균주의 공학(engineering)에 대해 들은 적이 없다. 당즙(sugar cane juice)과 당밀(molasses) 및 종래의 효모 균주를 이용하는 브라질의 에탄올 발효는 단순히 모든 당이 소비될 때까지 수행된다. 카길(Cargill) 및 바이오엠버(BioAmber)에서 상업적 L-락트산 및 숙신산 발효는, 부모 균주(parent strain)가 수크로오스를 사용하지 않기 때문에, 유일한 탄소원인 글루코오스에 기반하여 공학적으로 개발된(engineered) 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchekia orientalis) 효모를 사용하는 것으로 사료된다. 카길은 그들의 이사첸키아 오리엔탈리스 숙신산 생산 균주에 전화효소 유전자를 추가한 것을 기재하는 미국 특허 출원을 제출했으나, 결과적으로 수득된 균주는 분명히 앞서 정의된 "프럭토오스 문제"를 갖는다(WO 2017/091610 A1의 도 1 참조). WO 2017/091610 A1은 또한 전화 효소를 생성하는 효모에 의해 "락트산"을 생산하는 개념을 개시한다. 그러나, WO 2017/091610 A1은 D-락트산과 L-락트산을 구별하지 않고, 수크로오스, 또는 글루코오스와 프럭토오스를 포함하는 혼합물을 이용하여 어떻게 경제적으로 D-락트산 또는 L-락트산을 생산하는지, 또는 어떻게 그러한 효모에 의해 수크로오스, 또는 글루코오스와 프럭토오스를 포함하는 혼합물을 이용하여, 경제적으로 매력적인 방법으로 D-락트산 또는 L-락트산을 생산하는지를 기재하지 않는다. 또한, WO 2017/091610 A1은 피루베이트 데카르복실라아제를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 결실되고, 선천적으로 전화효소를 분비하는 공학적으로 개발된 사카로마이세스 세레비시애 또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 균주에 의한 L-락트산 생산을 개시하는 선행 기술(US 7,049,108 B2)을 무시한다. US 7,049,108 B2가 L-락트산 또는 D-락트산을 생산하는 개념을 개시하나, 개시된 균주 및 방법들은 이제 현재의 상업적 공정들, 예를 들면, 생산 개체로서 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans)와 같은 박테리아를 사용하는 공정과 경쟁할 수 있는 경제적으로 매력적인 공정을 고려하지 않는다(Poudel, 2016 #124); Michelson, 2006 #123). 락트산의 이성질체를 생산하는 "경제적으로 매력적인 (economically attractive)" 방법은 수크로오스 및/또는 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물로부터 적어도 110 g/L의 역가로 3.7 미만의 최종 pH에서, 48 시간 또는 그 미만 내에 0.75 g/g의 당에 대한 수율로 D-락트산 또는 L-락트산을 생산할 수 있는 효모 균주에 의해 수행되는 방법이다.

US 2011/0256598은 미생물에서 프럭토오스의 흡수(import)를 증가시키기 위해 사용되는 대장균 유래의 프럭토오스:H+ 심포터(symporter)를 제안하나, 그 발명자들은 효모에서 이 임포터의 사용을 입증하지 않았고, 따라서, 이 임포터가 효모에서 기능할 것인지는 명확하지 않다.

(Pina, 2004 #121)는 FFZ1 (fructose facilitator Zygosaccharomyces)로 명명된, 프럭토오스 트랜스포터를 코딩하는 지고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii) 유래의 유전자의 클로닝을 기재한다. 이 트랜스포터는 사카로마이세스 세레비시애에서 기능하는 것으로 확인되었다. 그러나, 저자들은 수크로오스 또는 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물에서의 증식, 또는 글루코오스의 존재 하에 개선된 프럭토오스 이용을 언급하지 않았다.

(Zhou, 2017 #1)는 또한 사카로마이세스 세레비시애에서 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae)로부터의 "ffziI" 또는 "fsy1"에 의해 코딩된 프럭토오스 임포터의 기능을 보여주고, 라피노오스로부터 멜리비오스를 생산하도록 설계된 균주에서 프럭토오스의 소비를 촉진하기 위한 그들의 이용을 제안하나, 저자들은 수크로오스 또는 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물에서의 증식, 또는 글루코오스의 존재 하에 개선된 프럭토오스 이용을 언급하지 않았다.

따라서, 수크로오스 또는 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물이 발효 배지 중에 중요한 탄소원으로 존재하는 경우 개선된 프럭토오스 이용을 갖는 미생물 균주에 대한 요구가 여전히 존재한다.

발명의 요약

본 발명의 목적, 즉, 글루코오스의 존재 하에 다양한 미생물 균주에 의한 프럭토오스의 이용을 개선하는 것은 천연적으로 글루코오스를 소비하는 것보다 더 빠른 속도로 프럭토오스를 소비하는 효모인, 소위 프럭토필릭 효모(fructorphilic yeast)로부터 클로닝된, 지고사카로마이세스 룩시(Zygosaccharomyces rouxii)로부터의 유전자 FFZ1(이하에서, ZrFFZ1로 지칭됨)을 발현하도록 설계된 유전자 카세트를 도입하는 것에 의해 달성되었다. 이전에 공개된 Z. bailii로부터의 FFZ1 유전자(ZbFFZ1로 지칭될 것임)가 ZrFFZ1 유전자를 포함하는 것과 유사한 구조체에서 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus)에서 측정가능할 정도로 기능하지 않았기 때문에, 글루코오스의 존재 하에 프럭토오스 이용의 증가된 속도에 의해 측정된, 원하는 이종 개체에서 FFZ1 유전자의 발현의 유용한 수준을 어떻게 달성할지는 자명하지 않았다.

본 명세서에 개시된 발명에서, 놀라운 발견이 이루어졌고, 즉, 부모 효모 균주가 이미 프럭토오스를 이용하는 내재된 능력을 가졌다는 사실에도 불구하고, 비-프럭토필릭 효모에 발현된 FFZ1 유전자의 첨가가 글루코오스 이용 대비 프럭토오스 이용의 속도를 증가시켰다. 이러한 개선은 보다 짧은 발효 시간 내에 프럭토오스의 보다 완전한 이용을 위해 유용하다.

본 발명은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 또는 그의 혼합물로로부터 선택된 탄소원으로부터 락트산을 생산할 수 있는, 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.) 효모 균주로서, 상기 유전적으로 조작된 효모는 프럭토오스 임포터로 기능하는 단백질의 생산능을 부여하는 하나 이상의 이종 DNA 카세트를 포함하는 것인 균주를 개시한다. 본 발명에 따른 유전적으로 조작된 효모 균주는 프럭토오스 이용의 개선을 갖고 종래 균주보다 더 빠른 속도로 프럭토오스를 이용하여, 더 짧은 발효 시간 및 개선된 경제성을 제공한다.

비교적 적은 수의 효모 종은 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물이 제공된 경우, 글루코오스보다 프럭토오스를 이용하는 것을 선호한다. 이러한 효모를 "프럭토파일(fructophile)"로 부르고, "프럭토필릭(fructophilic)"하다고 하거나, 또는 "프럭토오스 선호(fructophily)"를 보인다고 한다. 프럭토필릭 효모의 예는 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 속의 일원들, 예를 들면, 지고사카로마이세스 룩시(Z. rouxii) 및 지고사카로마이세스 바일리(Z. bailii)(Leandro, 2014 #6), 비케르하미엘라/스타르메렐라(Wickerhamiella/Starmerella) 또는 W/S 클레이드(clade)의 일원들(Goncalves, 2018 #4), 및 칸디다(Candida) 속의 일부 효모, 예를 들면, 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae)(Zhou, 2017 #1))이다.

모두는 아니나, 다수의 프럭토필릭 효모의 필수적 특징은 FFZ1 유전자, 또는 그의 동족체(homolog)이다. FFZ1 유전자 및 그들의 동족체의 세트는 프럭토오스에 특이적인 고 기능(high capacity)이나 저 친화도인 유니포터(uniporter)("촉진 확산자(facilitated diffuser)" 또는 단순히 "촉진자(facilitator)"로도 알려짐)를 코딩한다. 본 발명자들은 그러한 프럭토오스 임포터 단백질을 Ffz1로 지칭할 것이다. Ffz1 단백질은 프럭토오스가 대사될 수 있도록, 농도 구배를 따라 세포 내로의 프럭토오스 확산을 촉진하는 기능을 하는 막 단백질이다. 야생형 비-프럭토필릭 효모, 예를 들면, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 사카로마이세스 세레비시애, 이사첸키아 오리엔탈리스, 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 헥소오스 임포터 및 프럭토오스를 이용하는 대사 경로를 가지므로 프럭토오스를 대사하는 능력을 갖는다. 그러나, 명칭이 암시하는 바와 같이, 사카로마이세스 세레비시애로부터의 n은 1 내지 17의 정수인 것인 HXTn과 같은 유전자 및 그의 동족체 및 유사체에 의해 코딩되는, 전형적인 헥소오스 트랜스포터는 또한 글루코오스를 수송하고, 유전자 발현의 조절, 단백질 활성, 및 차등적 친화도를 포함한 다수의 인자들 때문에, HTXn에 의해 코딩된 헥소오스 트랜스포터의 대부분 또는 전부는 프럭토오스에 비해 글루코오스를 선호한다. Hxtn 임포터 단백질은 글루코오스와 프럭토오스가 세포 내로 확산되도록 촉진할 수 있으므로, 이 2개의 당은 에탄올 발효에서 프럭토오스 및 글루코오스가 존재하는 경우, 예를 들면, 자당(cane sugar)(및/또는 당밀(molasses))이 존재하는 경우 주로 사카로마이세스 세레비시애에 의하여 모두 궁극적으로 소비된다. K. marxianus 및 K. lactis 효모에 주로 기반한 발효의 경우에도 동일하게 적용되며, 이들도 HTXn 동족체를 헥소오스 임포터로 사용한다. 그러나, 그러한 발효에서, 글루코오스 소비의 속도는 프럭토오스 소비의 속도보다 통상적으로 더 높다. 어느 경우나, 일부 산업적 발효, 예를 들면, 연료용 에탄올, 하나 이상의 부탄올 이성질체, D-락트산, L-락트산, 숙신산, 말산, 시트르산, 카로티노이드, 이소프렌, 또는 상업적 목적의 지질과 같은 산물을 생성하는 발효의 경우, 특히 배지에 글루코오스도 존재하는 경우, 천연적으로 프럭토필릭이 아닌 효모 종 및 균주에 의해 프럭토오스가 소비되는 속도를 증가시키는 것에 발효 시간을 단축시켜야 하는 요구가 여전히 존재한다.

본 개시의 다양한 비-한정적 구체예가 이제 본 명세서에서 설명되고 첨부된 도면에서 예시될 것이다. 당해 기술 분야에서 통상의 기술자는 하나의 비-한정적 구체예와 연관하여 설명되거나 예시된 특성, 구조, 성분, 또는 특징이 하나 이상의 다른 비-한정적 구체예의 특성, 구조, 또는 특징과 함께 조합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러한 조합은 본 개시의 범위 내에 포함되도록 의도된다. 당해 기술 분야에서 통상의 기술자는 또한 하나 이상의 비-한정적 구체예와 연관하여 설명되거나 예시된 특성, 구조, 성분, 또는 특징이 본 발명의 범위 및 원리로부터 벗어나지 않으면서 수정되거나 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 명명법(nomenclature)의 설명이 하기에 제공된다.

명명법과 관련하여, 박테리아 유전자 또는 코딩 영역은 일반적으로 이탤릭체 소문자로 기재되고, 예를 들면, 대장균으로부터의 "ldhA"로 기재되고, 그 유전자에 의해 코딩된 효소, 또는 단백질은 동일한 문자로, 그러나, 이탤릭체 없이, 첫 문자는 대문자로, 예를 들면, "LdhA"로 기재된다. 효모 유전자 또는 코딩 영역은 이탤릭체 대문자로, 예를 들면, "PDC1"로 기재되고, 그 유전자에 의해 코딩되는 효소 또는 단백질은 동일한 문자로 기재되나, 첫 문자는 이탤릭체 없이 대문자로, 예를 들면, "Pdc1" 또는 "Pdc1p"로 기재되고, 후자는 효소 또는 단백질을 지정하기 위해 효모에서 이용되는 관습의 예이다. "p"는 지정된 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 약어이다. 효소 또는 단백질은 또한 보다 기술적인 명칭에 의해 지칭될 수 있고, 예를 들면, D-락테이트 데히드로게나아제 또는 피루베이트 데카르복실라아제이고, 이들은 각각 전술된 2개의 효소를 의미한다. 특정한 촉매 활성을 갖는 효소의 일 예를 코딩하는 유전자 또는 코딩 영역은 역사적으로 다른 기원, 기능적으로 중복된 유전자, 다르게 조절되는 유전자이기 때문에, 또는 유전자들이 다른 종으로부터 유래되기 때문에 수개의 다른 명칭을 가질 수 있다. 예를 들면, 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자는 다른 명칭들 외에 GPD1, GDP2, 또는 DAR1로 명명될 수 있다. 특정한 유전자가 유래된 개체를 명시하기 위해, 유전자 명칭이 속 및 종을 표시하는 2개의 문자에 의해 선행될 수 있다. 예를 들면, KmURA3 유전자는 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 유래되고, ScURA3 유전자는 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래되며, EcldhA 유전자는 대장균으로부터 유래되고, PaldhL 유전자는 페디오콕코스 액시딜락티(Pediococcus acidilacti)로부터 유래되며, BcldhL은 바실러스 코아귤란스로부터 유래된다. 특정한 유전자에 돌연변이를 포함하거나, 돌연변이 표현형을 갖는 효모 균주의 경우, 그 유전자 또는 균주는 소문자 이탤릭체 문자에 의해 표시되고, 예를 들면, 기능성 URA3 유전자가 결핍된 균주의 경우 ura3 또는 ura3-로 표시된다.

락트산 및 락트산 유사체의 모든 이성질체는 양성자화된(protonated) 산(유리 산으로도 알려짐) 또는 이온화된 염으로서 고체, 액체, 또는 용액 제형으로 존재할 수 있다. 수용액에서, 양성자화 형태 및 이온화 형태가 평형 상태로 공존한다. 모든 경우에 그러한 화합물의 모든 형태를 지칭하는 것은 복잡하기 때문에, 산 형태 또는 염 형태의 언급(예를 들면, D-락트산(D-LAC), D-락테이트, L-락트산(L-LAC), L-락테이트, 또는 D,L-베타-클로로락테이트)은 모든 형태 또는 그의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의되고, 다른 용어들은 본 명세서의 다른 곳들에서 발견된다.

"효모(yeast)"는 일정한 조건 하에서 단일 세포 상태로 증식할 수 있는 균류 개체를 의미한다. 일부 효모 균주는 또한 일부 조건, 예를 들면, 기아 하에 균사 상태 또는 유사 균사(pseudohyphal)(즉, 짧은 균사) 상태로 성장할 수 있다. 구체적으로, 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 이사첸키아(Issatchenkia), 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 야로위아(Yarrowia), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 및 란칸세아(Lachancea) 속 개체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"카세트(cassette)" 또는 "발현 카세트(expression cassette)"는 숙주 개체에 도입(intall)되는 경우, 하나 이상의 원하는 단백질 또는 효소를 코딩하거나, 생산하거나, 또는 과생산하거나, 또는 대안적으로 그의 활성을 제거하거나 또는 감소시킬 수 있는 데옥시리보핵산(DNA) 서열을 의미한다. 단백질 또는 효소를 생산하기 위한 카세트는 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 단백질 코딩 서열("개방 해독 프레임(open reading frame)" 또는 "ORF"로도 알려짐), 및 선택적으로 하나 이상의 전사 종결자(transcription terminator)를 포함한다. 발현될 유전자가 이종(heterologous) 또는 외래 유래(exogenous)인 경우, 프로모터 및 종결자는 프로모터 또는 종결자가 유래된 고유한 유전자(native gene)와의 이중 재조합(double recombination)을 방지하기 위해 통상적으로 2개의 상이한 유전자로부터 유래되거나 또는 이종 유전자로부터 유래된다. 카세트는 선택적으로 및 바람직하게 하나의 말단 또는 양 말단에 숙주 개체 중 DNA 서열("표적 서열(target sequence)")에 상동성인 하나 또는 2개의 플랭킹 서열(flanking sequence)을 포함할 수 있어서, 카세트가 표적 서열에서 염색체 또는 플라스미드로 숙주 개체와 상동성 재조합을 수행하여, 표적 서열에서 상기 염색체 또는 플라스미드로의 상기 카세트의 통합을 가져올 수 있다. 카세트의 단 하나의 말단만 플랭킹 상동성을 포함하는 경우, 원형 포맷의 카세트는 상기 플랭킹 서열에서 단일 재조합에 의해 통합될 수 있다. 카세트의 양 말단이 플랭킹 상동성을 포함하는 경우, 선형 또는 원형 포맷의 카세트는 주변 플랭킹 서열들과 이중 재조합에 의해 통합될 수 있다. 카세트는 유전 공학에 의해 작제될 수 있고, 예를 들면, 코딩 서열이 비-고유 프로모터(non-native promoter)로부터 발현되기ㅓ나 또는 천연적으로 연관된 프로모터를 이용할 수 있다. 카세트는 원형일 수 있는 플라스미드로 작제될 수 있거나, 중합효소 연쇄반응(PCR), 프라이머 연장 PCR, 또는 각각이 원하는 최종 카세트의 서브세트(subset)인 DNA 단편의 말단 사이의 인 비보 또는 인 비트로 상동성 재조합에 의해 생성된 선형 DNA일 수 있고, 상기 각 서브세트 단편은 인 비트로 또는 인 비보로 상동성 재조합에 의해 인접한 단편들의 연결을 가져오도록 설계된, 하나의 말단 또는 양 말단에서 중복 상동성(overlapping homology)을 갖는다. 카세트는 통합시, 약 30 bp 이상의 직접 반복 서열(통합된 선택(selectable) 유전자의 양 말단에 존재하는 동일한 배향의 동일한 서열)에 의해 둘러싸인 선택 마커 유전자 또는 DNA 서열을 포함하여, 선택 마커를 포함하는 최초 카세트가 염색체 또는 플라스미드 내로 통합된 후, 선택 마커가 상기 직접 반복 서열 간의 상동성 재조합("루핑 아웃(looping out)"으로도 알려짐)에 의해 결실될 수 있도록 설계될 수 있다. 유용한 선택 마커 유전자는 항생제 G418 내성 (kan 또는 kanR), 히그로마이신(hygromycin) 내성 (hyg 또는 hygR), 제오신(zeocin) 내성 (zeo 또는 zeoR), 나투리신(naturicin) 내성 (nat 또는 natR), 및 생합성 유전자, 예를 들면, URA3, TRP1, TRP5, LEU2, 및 HIS3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 선택 마커로 이용될 생합성 유전자의 경우, 숙주 균주는 물론, 상응하는 유전자에 돌연변이, 바람직하게는 비-복귀성 널 돌연변이(non-reverting null mutation)를 포함해야 한다. 예를 들면, URA3이 선택 마커 유전자로 이용되는 경우, 형질전환될 균주는 표현형이 ura3-이어야 한다. 항생제 내성 유전자의 경우, 내성 유전자는 통상적으로 선택을 가능하게 하기 위해 숙주 미생물 균주에서 충분히 잘 기능하는 프로모터를 요구한다. 발현되어야 하는 유전자가 카세트의 형태로 숙주 균주에 도입될 수 있어도, 유전자, 예를 들면, 개시 코돈부터 종결 코돈까지의 코딩 서열이 프로모터 또는 종결자 없이 숙주 염색체 또는 플라스미드 내로 통합될 수 있어서, 도입되는 코딩 서열이 정확하게 또는 거의 숙주 균주에 고유한 유전자의 코딩 서열을 대체하고, 통합 후에, 도입되는 코딩 영역은 상기 도입되는 코딩 서열에 의해 대체된 숙주 코딩 서열의 남은 프로모터로부터 발현될 수 있다.

본 명세서에 기재된 실시예들 중 일부에서, 카세트는 서브세트 단편의 각 말단에 있는 비교적 짧은 DNA 서열(약 20 내지 50 bp)이 최종 조립된 카세트의 인접한 서브세트 단편의 서열 또는 최종 조립된 카세트의 5' 및 3' 말단에 대한 염색체 표적 서열에 동일한 것인, "중복 상동성(overlapping homology)"을 이용한 상동성 재조합에 의해 세포 내에서 함께 연결되는 2개 이상의 선형 DNA 단편들의 거의 동일한 몰 농도의 혼합물로 효모 균주를 형질전환시키는 것에 의해 인 비보로 조립되었다. K. marxianus 및 S. cerevisiae 를 포함한 다수의 효모 균주는 복수 개의 서브세트 단편들을 최종 카세트로 조립하고 "중복 상동성 서열들"간에 상동성 재조합에 의해 조립된 카세트를 염색체 표적에 통합할 수 있는 능력을 갖는다.

"D-락테이트 데히드로게나아제(D-lactate dehydrogenase)"는 피루베이트로부터 D-락테이트의 형성을 촉매하는 효소를 의미한다. "L-락테이트 데히드로게나아제(L-lactate dehydrogenase)"는 피루베이트로부터 L-락테이트의 형성을 촉매하는 효소를 의미한다. 이러한 반응을 위한 필요한 환원 당량(reducing equivalent)은 NADH, NADPH, 또는 임의의 다른 환원 당량에 의해 공급될 수 있다.

"깁슨 방법(Gibson method)"은 그들의 말단에 짧은(약 15-40 bp) 중복 상동성을 갖는 2개 이상의 선형 DNA 단편을 인 비트로에서 함께 연결시키는 방법을 의미한다. 이 방법은 합성 선형 DNA 단편, PCR 단편, 또는 제한 효소에 의해 생성된 단편들로부터 플라스미드를 작제하기 위해 이용될 수 있다. 깁슨 방법을 수행하기 위해 키트, 예를 들면, NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England BioLabs, Ipswitch, Massachusetts, USA)를 구입하고, 제조자에 의해 설명된 바와 같이 사용할 수 있다.

"형질감염체(transformant)"는 선형이거나 원형이고, 자발적으로 복제하거나 또는 그렇지 않는 원하는 DNA 서열을 숙주 또는 부모 균주 내로 도입하는 것으로부터 수득된 세포 또는 균주를 의미한다.

"역가(titer)"는 통상적으로 리터당 그램(g/L) 또는 부피당 중량 %(%)로 표현되는, 발효액(fermentation broth) 중 화합물의 농도를 의미한다. 역가는 적합한 분석 방법, 예를 들면, 정량적 분석 크로마토그래피, 예를 들면, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 기체 크로마토그래피(GC)에 의해 결정되고, 표준 곡선은 외부 표준, 및 선택적으로 내부 표준으로부터 작성된다.

"수율(yield)"은 발효 동안 사용된 탄소원의 그램 당 산물의 그램을 의미한다. 이는 통상적으로 역가, 최종 액체 부피, 및 공급된 탄소원의 양에 근거하여 계산되고, 최종 부피는 샘플링되고, 공급되고, 및/또는 증발된 부피에 대해 보정된다. 통상적으로, 그램당 그램(g/g), 또는 중량 당 중량 % (%)로 표현된다.

"시간(time)"은 통상적으로 시(hour)로 측정된, 발효에서 접종(inoculation)부터 샘플링 또는 회수(harvesting)까지의 소요된 시간을 의미한다.

"비 생산성(specific productivity)"은 주어진 기간 동안 주어진 발효액의 부피에서 생산된 산물의 그램인 산물 형성의 속도를 의미하고, 통상적으로 그램 /리터-시간 (g/L-hr)으로 표현된다. "평균 비 생산성(average specific productivity)"은 기간이 접종부터 샘플링 또는 회수까지의 전체 발효인 비 생산성을 의미한다. 평균 비 생산성은 발효의 중간부터의 비 생산성보다 더 낮고, 이는 비 생산성이 초기 성장 기간 및 후기 단계동안 더 낮기 때문이다. 평균 비 생산성은 최종 역가를 회수 시의 시간 수로 나누는 것에 의해 계산될 수 있다. 측정 기간이 분명하게 주어지지 않더라도, 일부 공개된 비 생산성은 명확하게 평균 비 생산성이 아니라는 것에 유의한다(일부 실시예에 대한 표 1 참조).

"pKa"는 용액 중 산의 절반이 통상적으로 이온 또는 염 형태인 컨쥬게이트 염기 상태인 pH를 의미한다. 정확한 pKa는 온도, 농도, 및 다른 용질의 농도에 따라 약간 변할 수 있으나, L-LAC 및 D-LAC의 pKa는 3.78 내지 3.86으로 개시된다. 락트산의 경우, 컨쥬게이트 염기 상태는 락테이트 이온이고, 따라서, pKa는 락테이트 이온의 농도가 양성자화 상태 또는 "유리 산" 상태의 농도와 동일한 것인 pH이다. pKa는 산-염기 적정을 수행하고, 적정 곡선의 중점(midpoint)을 취하는 잘-알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 당업자는 수용액에서, D-락트산 및 L-락트산이 모두 어느 정도까지는 2가지 형태, 양성자화된 형태 및 이온화된 염(즉, 컨쥬게이트 염기) 형태로 존재한다는 것을 알 것이다. 따라서, 용어 "D-락테이트(D-lactate)", "D-락트산(D-lactic acid)", 및 "D-LAC"은 상황에 따라, 2가지 중 하나의 형태, 또는 두 형태의 혼합물을 의미할 수 있다. 구체적으로, 역가 및 수율을 논의할 때, 두 가지 형태의 합이 포함되도록 의도되나, 유리 산의 측면에서 표현되고, 환언하면, 역가와 수율은 존재하는 임의의 염 형태가 유리 산 형태로 전환되는 것처럼 표현된다.

"이종 (기원)(heterologous)"은 개체에서 자연적으로 또는 고유하게 발현되지 않으나, 유전 공학, 예를 들면, 형질전환, 접합(mating), 또는 형질도입(transduciton)에 의해 개체 내로 도입될 수 있는 유전자 또는 단백질을 의미한다. 이종 유전자는 염색체 내로 통합될(즉, 삽입되거나 또는 도입될) 수 있거나, 플라스미드 상에 포함될 수 있다. 용어 "외인성 (기원)(exogenous)"은 유전 공학, 예를 들면, 형질전환, 접합, 형질도입, 또는 돌연변이생성에 의해 활성을 증가, 감소, 또는 제거할 목적으로 개체에 도입되거나, 개체에서 변형된 유전자 또는 단백질을 의미한다. 외인성 유전자 또는 단백질은 이종 기원일 수 있거나, 또는 숙주 개체에 고유하나, 하나 이상의 방법, 예를 들면, 염색체 또는 플라스미드에서 돌연변이, 결실, 프로모터의 변경, 종결자의 변경, 하나 이상의 추가적인 카피의 중복(duplication), 또는 삽입에 의해 변형된 유전자 또는 단백질일 수 있다. 따라서, 예를 들면, DNA 서열의 제 2 카피가 고유한 부위와 다른 염색체 상의 부위에 삽입되는 경우, 상기 제 2 카피는 외인성일 것이다.

"플라스미드(plasmid)"는 염색체보다 훨씬 더 작고, 미생물의 염색체 또는 염색체들과 분리되고, 염색체 또는 염색체들과 별개로 복제하는 원형 또는 선형 DNA 분자를 의미한다. 플라스미드는 세포 당 약 1개의 카피, 또는 세포 당 2개 이상의 카피로 존재할 수 있다. 미생물 세포 중 플라스미드의 유지는 통상적으로 플라스미의 존재에 대해 선택하는 배지, 예를 들면, 항생제 내성 유전자, 또는 염색체 영양요구성(auxotrophy)의 보완성(complementation)을 이용하여 선택하는 배지에서의 배양을 요구한다. 그러나, 일부 플라스미드, 예를 들면, 다수의 사카로마이세스 균주 중 2 마이크론 원형 플라스미드는 안정한 유지를 위해 선택압을 요구하지 않는다.

"염색체(chromosome)" 또는 "염색체 DNA(chromosomal DNA)"는 플라스미드보다 실질적으로 더 크고 통상적으로 항생제 또는 영양적 선택을 요구하지 않는 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다. 본 발명에서, YAC(yeast artificial chromosome)가 이종 및/또는 외래 유전자의 도입을 위한 벡터로 이용될 수 있으나, 이는 유지를 위한 선택압을 요구할 것이다.

"과발현(overexpression)"은 유전자 또는 코딩 영역에 의해 코딩된 효소 또는 단백질이 숙주 미생물에서 동일하거나 유사한 성장 조건 하에서 숙주 미생물의 야생형 버전에서 발견되는 수준보다 높은 수준으로 생산되게 하는 것을 의미한다. 이는 예를 들면, 하기 방법 중 하나 이상에 의해 달성될 수 있다: 보다 강력한 프로모터의 도입, 보다 강력한 리보좀 결합 부위의 도입, 종결자 또는 보다 강력한 종결자의 도입, 코딩 영역의 하나 이상의 부위에서 코돈 선택의 개선, mRNA 안정성의 개선, 또는 염색체에 다중 카피의 도입, 다숭 카피의 플라스미드(multicopy plasmid) 상으로의 카세트의 배치에 의한 유전자의 카피 수 증가. 과발현된 유전자로부터 생산된 효소 또는 단백질은 "과생산된(overproduced)" 것으로 기술된다. 과발현되는 유전자 또는 과생산되는 단백질은 숙주 미생물에 고유한 것일 수 있거나, 또는 상이한 개체로부터 숙주 미생물로 유전 공학 방법에 의해 이식된 것일 수 있고, 이 경우 상기 효소 또는 단백질 및 상기 효소 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 코딩 영역은 "외인성" 또는 "이종성"으로 지칭된다. 외인성 또는 이종성 유전자 및 단백질은 정의상 과발현되고 과생산되며, 이들은 조작되지 않은(unengineered) 숙주 개체에 존재하지 않기 때문이다.

"동족체(homolog)"는 상이한 제1 유전자, DNA 서열, 또는 단백질에 서열 상동성에 의해 관계된 제2 유전자, DNA 서열, 또는 단백질 서열을 의미하고, 상기 제2 서열은, 서열 비교를 위한 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 컴퓨터 프로그램 (Altschul, 1990 #332; Altschul, 1997 #334)에 의해 결정된 바와 같이, 단백질 서열을 비교하거나 또는 유전자 서열로부터 도출된 단백질 서열을 비교할 때 25% 이상의 서열 동일성을 갖거나, 또는 DNA 서열을 상기 제1 유전자, DNA 서열, 또는 단백질 서열과 비교할때, 50% 이상의 동일성을 갖고, 결실 및 삽입을 허용한다. 클루이베로마이세스 마르시아누스 PDC1 유전자의 동족체의 예는 사카로마이세스 세레비시애로부터의 PDC1 유전자일 것이다. "기능성 동족체(functional homolog)"는 동족체이고, 상기 제1 DNA 또는 단백질 서열과 동일하거나 유사한 기능을 갖는 것으로 확인되거나 또는 확인될 수 있는 제2 DNA 또는 단백질 서열이다.

"유사체(analog)"는 또 다른 유전자, DNA 서열, 또는 단백질과 유사한 생물학적 기능을 수행하나, 서열 비교를 위한 BLAST 컴퓨터 프로그램 (Altschul, 1990 #26;Altschul, 1997 #17)에 의해 결정되는 경우, 상기 또 다른 유전자, DNA 서열, 또는 단백질과 (단백질 서열을 비교하거나 또는 유전자 서열로부터 도출된 단백질 서열을 비교하는 경우) 25% 미만의 서열 동일성을 갖고, 결실 및 삽입을 허용하는 유전자, DNA 서열, 또는 단백질을 의미한다. K. marxianus Gpd1 단백질의 유사체의 예는 K. marxianus Gut2 단백질이고, 이는 두 단백질이 모두 동일한 반응을 촉매하나, 두 효소 또는 그들의 개별적인 유전자 간에 유의성 있는 서열 상동성이 없기 때문이다. 당업자는 특정한 생물학적 기능(직전에 기술된 예에서, 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나아제)을 갖는 다수의 효소 및 단백질이 다수의 상이한 개체에서 동족체로서 또는 유사체로서 발견될 수 있고, 이는 그러한 효소 또는 단백질의 패밀리의 일원들은 구조가 약간 또는 상당히 다르더라도, 동일한 기능을 공유하기 때문이라는 것을 알 것이다. 동일한 패밀리의 상이한 일원들이 다수의 경우에 현재의 유전 공학의 방법들을 이용하여 동일한 생물학적 기능을 수행하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, D-락테이트 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자가 다수의 상이한 개체들로부터 수득될 수 있다.

"돌연변이(mutation)"는 고유한 또는 부모 DNA 서열로부터의 임의의 변화, 예를 들면, 하나 이상의 염기쌍의 역전, 중복, 삽입, 하나 이상의 염기쌍의 결실, 조기 종결 코돈을 생성하는 염기 변화를 초래하는 점 돌연변이, 또는 그 위치에 코딩된 아미노산을 변화시키는 미스센스 돌연변이를 의미한다. "널 돌연변이(null mutation)"는 실질적으로 유전자의 기능을 제거하는 돌연변이를 의미한다. 코딩 영역의 완전한 결실은 널 돌연변이일 것이나, 단일 염기 변경도 또한 널 돌연변이를 초래할 수 있다. "돌연변이체(mutant)", "돌연변이된 균주(mutated strain)", "돌연변이된 효모 균주(mutated yeast strain)", 또는 "돌연변이된" 균주는 고유의(native) 균주, 야생형 균주, 부모 균주, 또는 선도자(precursor) 균주와 비교하여, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 균주를 의미한다.

구 "기능을 제거하거나 감소시키는 돌연변이(a mutation that eliminates or reduces the function of)"는 분석가능한(assayable) 파라미터 또는 아웃풋을 측정하고 돌연변이되지 않은 부모 균주와 비교할 때, 균주의 유전자, 단백질, 또는 효소의 분석가능한 파라미터 또는 아웃풋, 예를 들면, mRNA 수준, 단백질 농도, 또는 비 효소 활성(specific enzymatic activity)을 낮추는 돌연변이를 의미한다. 그러한 돌연변이는 바람직하게는 결실 돌연변이이나, 기능의 원하는 제거 또는 감소를 달성하는 임의의 유형의 돌연변이일 수 있다.

"강력한 구성적 프로모터(strong constitutive promoter)"는 통상적으로 RNA 폴리머라아제에 의해 전사되는 DNA 서열 또는 유전자의 상류에 (관례적인 5'에서 3'으로의 배향으로 표시할 때, 유전자의 5'쪽에) 위치하고, 상기 DNA 서열 또는 유전자가 적절한 분석 절차에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 용이하게 검출되는 수준으로 RNA 폴리머나아제에 의한 전사에 의해 발현되게 하는 DNA 서열을 의미한다. 적절한 분석 절차의 예는 정량적 역 전사효소 플러스 PCR, 코딩된 효소의 효소 분석, 쿠마시 블루-염색 단백질 겔(Coomassie Blue-stained protein gel), 또는 상기 전사의 결과로 간접적으로 생성되는 대사산물의 측정가능한 생산을 포함하고, 그러한 측정가능한 전사는 전사, 대사산물, 또는 유도자 화합물의 수준을 특이적으로 조절하는 단백질의 존재 또는 부재와 무관하게 일어난다. 잘 알려진 방법을 이용하여, 강력한 구성적 프로모터가 고유한 프로모터(DNA 서열 또는 유전자로부터의 상류에 자연적으로 존재하는 프로모터)를 대체하여, 플라스미드 또는 염색체에 배치될 수 있고, 고유의 프로모터로부터의 수준보다 더 높은 수준에서 원하는 DNA 서열 또는 유전자의 발현 수준을 제공하는 발현 카세트를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 강력한 구성적 프로모터는 종 또는 속에 특이적일 수 있으나, 종종 효모로부터의 강력한 구성적 프로모터가 멀리 관련된 효모에서 잘 기능할 수 있다. 예를 들면, 아쉬비아 고십피(Ashbya gossypii)로부터의 TEF1 (translation elongation factor 1) 프로모터는 K. marxianus를 포함한 다수의 다른 효모 종에서 잘 기능한다.

"미호기(microaerobic)" 또는 "미호기 발효 조건(microarobic fermentation conditions)"은 발효기로의 공기의 공급이 분당 액체 발효액의 부피당 0.1 부피(vvm) 미만이라는 것을 의미한다.

"화학적 한정 배지(chemically defined medium)", "최소 배지(minimal medium)", 또는 "미네랄 배지(mineral medium)"는 정제된 화합물, 예를 들면, 질소, 황, 마그네슘, 인 (및 일부 경우에, 칼슘 및 염소)과 같은 필요한 성분을 제공하는 미네랄 염(예를 들면, 소디움, 포타슘, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 포스페이트, 술페이트, 클로라이드, 등), 비타민 (미생물의 증식을 위해 필요하거나 또는 촉진할 때), 하나 이상의 순수한 탄소원, 예를 들면, 순수한 당, 글리세롤, 에탄올 등, 미생물의 증식을 위해 필요하거나 촉진하는 미량 금속(예를 들면, 철, 망간, 구리, 아연, 몰리브덴, 니켈, 붕소 및 코발트), 및 선택적으로 삼투성 보호제(osmotic protectant), 예를 들면, 베타인으로도 알려진 글리신 베타인으로 이루어진 발효 배지를 의미한다. 선택적인 삼투성 보호제 및 비타민을 제외하고, 그러한 배지는 발효되는 미생물의 증식을 위해 필수적이지 않은 영양분 또는 2종 이상의 영양분의 혼합물의 유의성 있는 양을 포함하지 않는다. 그러한 배지는 풍부한 또는 복합 영양분 혼합물, 예를 들면, 효모 추출물, 펩톤, 단백질 가수분해물, 당밀, 육즙(broth), 식물 추출물, 동물 추출물, 미생물 추출물, 유청, 돼지감자 분말(Jerusalem artichoke powder), 등의 유의성 있는 양을 포함하지 않는다. 단순한 증류에 의한 원하는 화합물의 정제가 경제적으로 매력적인 옵션이 아닌 것인 발효에 의한 상품 화합물(commodity chemical)의 생산의 경우에, 최소 배지가 풍부한 배지에 비해 선호되고, 이는 최소 배지가 일반적으로 덜 비싸고, 발효의 종료시 발효액이 일반적으로 원하는 산물로부터 정제에 의해 제거되어야 하는 원치않는 오염성 화합물의 더 낮은 농도를 포함하기 때문이다.

"발효 생산 배지(fermentation production medium)"는 미생물이 원하는 산물(예를 들면, D-LAC 또는 L-LAC)을 생산하도록 증식되는 것인 프로세스에서, 하나 이상의 탱크, 용기, 또는 발효기(fermentor)를 포함하는 시리즈에서 마지막 탱크, 용기, 또는 발효기에서 사용되는 배지를 의미한다. 방대한(extensive) 정제가 필요하거나 또는 요구되는, D-LAC 또는 L-LAC과 같은 발효에 의한 상품 화합물(commodity chemical)의 생산을 위해, 최소 배지인 발효 생산 배지가 풍부 배지(rich medium)보다 선호되며, 이는 최소 배지가 종종 덜 비싸고, 발효의 종료시 발효액이 일반적으로 원하는 화합물로부터 정제에 의해 제거되거야 하는 원치않는 오염성 화합물의 더 낮은 농도를 포함하기 때문이다. 그러한 발효에서 풍부한 영양분의 농도를 최소화하는 것이 일반적으로 바람직하나, 일부 경우에, 전체 프로세스를 위해, 종 배양물(inoculum culture)을 발효 생산 배지와 다른 배지에서 증식시키는 것, 예를 들면, 하나 이상의 풍부한 성분들을 포함하는 배지에서 증식된 종 배양물의 비교적 작은 부피(통상적으로, 발효 생산 배지의 10% 이하)를 증식시키는 것이 유리하다. 종 배양물이 생산 배양물 대비 적기 때문에, 종 배양물의 풍부한 성분들은 그들이 실질적으로 원하는 산물의 정제를 방해하지 않는 수준까지 발효 생산 배지로 희석될 수 있다. 발효 생산 배지는 탄소원을 포함해야 하고, 탄소원은 일반적으로 당(sugar), 글리세롤, 지방, 지방산, 이산화탄소, 메탄, 알코올, 또는 유기산이다. 일부 지리적 위치, 예를 들면, 중서부 미국에서, D-글루코오스 (덱스트로오스)는 비교적 저렴해서, 탄소원으로 유용하다. 효모에 의한 락트산 생산에 대한 대부분의 선행 문헌은 덱스트로오스를 탄소원으로 사용한다. 그러나, 일부 지리적 위치, 예를 들면, 브라질 및 대부분의 동남 아시아에서, 수크로오스가 덱스트로오스보다 덜 비싸고, 따라서, 이러한 지역에서는 수크로오스가 바람직한 탄소원이다.

"최종 pH(final pH)"는 발효가 완료된 것으로 간주되고 발효가 중단되고, 발효액이 수집된 때 발효의 완료시 발효액의 pH를 의미한다. 락트산 발효의 최종 pH가 락트산의 pKa 미만인 것이 바람직하나, 발효 동안 pH가 너무 빨리 낮아지거나 또는 너무 낮아지는 것을 방지하기 위해, "염기(base)"(알칼리 물질)의 첨가에 의해 조절되는 것이 바람직하다. "염기"는 용액, 현탁액, 슬러리(slurry), 또는 고체 형태일 수 있다. "염기"는 소디움, 암모늄, 포타슘, 마그네슘, 또는 칼슘의 수산화물(hyroxide), 산화물(oxide), 탄산염(carbonate)", 또는 중탄산염(bicarbonate)일 수 있다. 락트산의 생산을 위해, 바람직한 염기는 수산화칼슘의 슬러리, 또는 분말화된 수산화칼슘이고, 이는 발효액 중 양성자화된 산 형태와 혼합된 일부 칼슘 락테이트의 형성을 초래한다. 발효의 종료 시 결과적으로 수득된 발효액을 황산으로 처리하여, 칼슘 술페이트(석고(gypsum))의 침전을 유발하고, 칼슘의 제거에 기여하여, 양성자화된 형태로 존재하는 락트산의 비율을 증가시킬 수 있다. pH를 조절하기 위한 염기의 공급은 pH 측정값에 의해 요구될 때 수동으로 이루어질 수 있거나 또는 자동 조절 펌프나 오거(auger)에 의해 이루어질 수 있고, pH 측정값은 수동으로 또는 발효 용기에 침지된 pH 프로브를 통한 연속적인 모니터링에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 다양한 유전자가 표 1에 열거된다.

일반적인 방법 및 재료. 달리 명시되지 않는 경우, 재조합 DNA 및 유전 공학은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법 및 재료로 수행하였다. 플라스미드 및 선형 DNA 카세트는 NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 "깁슨 방법"을 이용하거나 또는 전술된 바와 같은 인 비보 상동성 재조합에 의해 조립했다. 카세트의 인 비보 조립을 위해, 서브세트 DNA 단편들을, 이상적으로는 총 500 ng 이상의 DNA를 포함하는, 대략 동몰 농도의 혼합물(roughly equimolar mixture)로 공급한다. 따라서, 예를 들면, 길이가 1000 bp(base pairs) 및 2000 bp인 2개의 서브세트 조각들로부터 카세트의 인 비보 조립은 두 단편을 각각 적어도 166 ng 및 333 ng 사용해야 한다. 인 비보에서 조립될 단편의 개수가 클수록, 성공적인 조립을 수득할 확률을 높이기 위해 더 많은 DNA가 요구된다. 하나의 극단적인 경우(실시예 5 참조), 6개의 단편을 인 비보에서 조립하고 1회의 형질전환으로 통합시켰다. 6개의 단편에 대한 DNA의 총량은 약 5 ㎍이었고, 약 40개의 형질감염체를 수득하였고, 그 40개 중 약 10개가 원하는 통합된 구조를 가졌다. 적절한 경우, 플라스미드 백본을 포함한, 플라스미드 또는 선형 카세트를 조립하기 위해 사용된 성분들 또는 "서브세트(subset)" DNA 단편들 모두는 적절하게, 3가지 방법 중 하나에 의해 생성되었다: 1) 공급사의 설명서에 따른 전구체 DNA 서열로부터 제한 효소 절단, 2) 제조사의 프로토콜에 따라 Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)를 사용한 PCR (Polymerase Chain Reaction), 또는 3) Integrated DNA Technologies, Inc.에 의한 gBlock의 상업적 합성.

정확한 작제(construction)를 진단적 제한효소 처리 및 아가로오스 겔 전기 영동(예를 들면, Qiagen Miniprep Kits에 의해 생성된 플라스미드의 경우), 또는 공급자의 프로토콜에 따라, Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs), 또는 Phire Plant PCR Master Mix Kit (ThermoScientific)를 이용한 적합한 진단적 PCR, 예를 들면, 정확한 연결을 확인하기 위해 PCR 산물이 2개 이상의 인접한 전구체 단편들의 연결 지점(junction)을 가로지는 것인 PCR 및 아가로오스 겔 전기영동에 의해 식별하고 및/또는 확인하였다. 효모 염색체로 통합된 카세트의 정확한 구조를 적합한 진단적 PCR, 예를 들면, 제1 PCR 프라이머가 통합될 카세트로부터 외향적으로 판독하고, 제2 프라이머가 통합 연결 지점을 향해 판독하며, 상기 제1 PCR 프라이머는 표적화된 통합 부위를 플랭킹하나, 통합될 카세트에는 포함되지 않는 것인 PCR에 의해 확인하였다. 정확한 DNA 구조를 식별하기 위한 진단적 PCR은 전체 세포(whole cell)(예를 들면, 플라스미드 또는 통합된 선형 DNA 카세트를 포함하는 대장균 또는 효모 형질전환체)에 대해 수행될 수 있다. 약 1 내지 2 마이크로리터의 세포량을 페트리 플레이트 상의 콜로니로부터 이쑤시개나 마이크로피펫 팁으로 채취하고 세포를 20 마이크로리터의 멸균수 또는 Phire Plant PCR Master Mix Kit (ThermoScientific)로부터의 "희석 완충액(Dilution Buffer)"에 현탁시킨다. 그러한 세포 현탁액 1 마이크로리터를 25 내지 40회 사이클을 위한 20 또는 25 마이크로리터(총 부피) PCR 반응액에서 주형 DNA로 사용한다. 대안적으로, 마이크로 원심분리기(microgfuge)에서 약 100 마이크로리터의 포화된 액체 배양액을 펠렛팅시키고, 상층액을 제거하고, 수득된 세포 펠렛을 20 마이크로리터의 멸균수 또는 희석 완충액에 재현탁시키는 것에 의해 거의 동일한 개수의 세포를 주형 DNA로 사용하기 위해 수득할 수 있다.

일부 경우에, 예를 들면, 진단적 PCR이 정확한 구조를 나타내나, 다른 증거가 예상되는 기능의 부재를 나타내는 경우, 원하는 또는 예상되는 DNA 서열을 확인하거나 또는 반증하기 위해, 플라스미드-유지(plasmid-borne) 또는 염색체에 통합된 DNA 카세트로부터 증폭된 PCR 산물, 또는 카세트의 전부 또는 일부를 시퀀싱한다. 다수의 상업적 회사들, 예를 들면, 미국, 매사추세츠주, 캠브리지의 GeneWiz가 DNA 시퀀싱 서비스를 수행한다.

DNA 서열을 결실시키거나 발현 카세트를 통합시키기 위해, 본 발명자들이 일반적으로 사용한 방법은 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드 상에 카세트를 조립하거나 또는 2개 이상의 카세트의 서브섹션을 공동-형질전환시키는 것에 의해 표적 효모 균주에서 인 비보로 카세트를 조립하고, 인접한 서브섹션들은 연결될 말단에서 40 내지 60 bp에 의해 중복되고, 조립된 카세트의 말단에서 40 내지 60 bp는 염색체 표적 서열에 상동성을 갖도록 설계된다. K. marxianus 염색체에서 통합을 위해 본 명세서에 기재된 모든 카세트는 효모 URA3 유전자 (통상적으로 ScURA3 유전자 또는 고유한 KmURA3 유전자)를 발현하도록 설계되고, 수령 숙주 개체(recipient host organism)는 통상적으로 고유한 KmURA3 좌위에서의 결실에 의해, 비-복구형(non-reverting) ura3- 표현형을 가졌다. 후속 엔지니어링 단계들에서 URA3+ 선택을 재사용할 수 있도록 하기 위해, 각 카세트에서, URA3 유전자는, 통합된 후, 직접적인 반복 DNA 서열들 간의 상동성 재조합에 의해 URA3 유전자의 결실을 가능하게 하고, 제2 단계에서 5'-플루오로오로트산을 포함하는 최소 배지에서 URA3 유전자에 대해 선택하는 것에 의해 확인될 수 있도록 직접적인 반복 DNA 서열에 의해 둘러싸인다(상세한 사항은 미국 특허출원 62/631,541 참조). 따라서, 플라스미드로 또는 직접적으로 효모 염색체에 조립된 경우, 염색체 표적 부위에서 2개의 특정한 염기쌍 사이에 삽입되도록 설계된 통합 카세트는 순서대로, 하기 서브섹션 또는 전구체 DNA 단편을 갖는 일반적 구조를 갖는다: 1) 도면에서 "Up"으로 표시된, 원하는 통합 표적 부위로부터 바로 상류에 있는 표적 염색체 서열에 상동성인 40 bp 이상의 서열, 2) 통합되기를 원하는 DNA 서열, 예를 들면, 프로모터-ORF-종결자 조합, 3) 표적 염색체 서열 부근의 서열에 상동성이 아닌 40 bp 이상의 서열 "DR"(직접적인 반복 서열(Direct Repeat), 4) 선택 유전자(selectable gene), 예를 들면, URA3 유전자, 5) 단편 3의 DR 서열의 제2 카피, 및 6) 도면에서 "Down"으로 표시된, 원하는 통합 표적 부위로부터 바로 하류인 표적 염색체 서열에 상동성인 40 bp 이상의 서열. 이 경우, "Up"과 "Down" 간의 이중 상동성 재조합에 의해 카세트가 통합된다. 선택 유전자의 역선택(counter selection)시, "DR"의 2개의 카피 간의 상동성 재조합은 선택 유전자의 루핑 아웃을 초래하여, 원하는 서열이 정확하게 염색체 표적에서 2개의 특정한 염기쌍 사이에 삽입되게 한다.

염색체 표적 부위에서 DNA 서열을 결실시키는 것이 바람직한 대안적인 카세트 설계에서, 조립되면 카세트는 하기의 서브섹션 또는 전구체 DNA 단편들을 순서대로 갖는 일반적인 구조를 가질 것이다: 1) 도면에서 "Up"으로 표시된, 원하는 통합 표적 부위로부터 바로 상류에 있는 표적 염색체 서열에 상동성인 40 bp 이상의 서열, 2) 통합되어야 하는 DNA 서열, 예를 들면, 프로모터-ORF-종결자 조합, 3) 원하는 결실 종말점(desired deletion endpoint)의 바로 하류에 있는 표적 염색체 서열에 상동성인 40 bp 이상의 서열 "Down", 4) URA3 유전자와 같은 선택 유전자, 5) 결실되어야 하는 염색체 표적 서열의 적어도 일부에 상동성인 40 bp 이상의 DNA 서열 "Middle". 명확한 결실이 요구되고, DNA가 삽입되지 않아야 하는 경우에, 이 설계 중 제2 단편은 생략된다. 형질전환 및 선택 후, 조립된 카세트는 "Up" 서열과 "Middle" 서열 간의 상동성 이중 재조합에 의해 염색체 표적 부위 내로 삽입된다. 전체 조립된 카세트의 올바른 통합은 진단적 PCR에 의해 확인된다. 제2 단계에서, 선택성 유전자가 역선택 및 카세트에 내재된 "Down" 서열과 삽입된 카세트로부터 하류에 필연적으로 존재하는 염색체의 "Down"에 상동성인 서열 간의 상동성 재조합에 의해 "루핑 아웃(looped out)"된다.

하기 실시예는 본 발명을 더 설명하기 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

도 1. NEJ1의 결실을 위한 DNA 카세트의 구조.
도 2. 4번 염색체 상의 ADH2 좌위에서 FFZ1의 삽입 및 발현을 위한 DNA 카세트의 구조.
도 3a 및 3b. 각각 12% 수크로오스 배지 및 6% 글루코오스 및 6% 프럭토오스 배지에서 ZbFFZ1 또는 ZrFFZ1을 발현하도록 설계된 통합 카세트를 포함하는 MYR2785로부터 유래된 균주에 의한 BioLector 발효에서 사용된 글루코오스 대비 사용된 프럭토오스의 비율.
도 4. 본 발명의 D-락테이트 생산 균주를 L-락테이트 생산 균주로 전환시키기 위한, SD1774 중 3개의 EcldhA 발현 카세트를 PaldhL 발현 카세트로 교체하도록 설계된 카세트를 포함하는, pMS155의 구조.
도 5. KmADH6 ORF(Open Reading Frame)의 중간으로의 삽입에 의해 통합되는 ZrFFZ1의 발현을 위한 카세트 JSS89의 구조.
도 6. KmADH6 ORF의 동시 결실과 함께 KmADH6에 삽입되는 ZrFFZ1의 발현을 위해 설계된 카세트 JSS90의 구조.
도 7. 12% 수크로오스 배지에 의한 BioLector 발효의 75시간차 JSS89 또는 JSS90 카세트를 포함하는 균주에 의한 [사용된 프럭토오스]/[사용된 글루코오스].
도 8. 탄산칼슘에 의한 완충 하에 진탕 플라스크에서 96시간 동안 배양된, 통합된 ZrFFZ1 발현 카세트를 포함하는 L-락테이트 생산 균주에 의한 [사용된 프럭토오스]/[사용된 글루코오스]의 비율.
도 9. 12 % 수크로오스를 함유한 최소 배지에서 미호기성 조건 하에 배양된 Ethanol Red에 의한 당의 소비.
도 10. 6% 글루코오스 및 6% 프럭토오스를 함유한 최소 배지에서 미호기성 조건 하에 배양된 Ethanol Red에 의한 당의 소비.
도 11. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 HO 좌위에서 ZrFFZ1을 통합시키기 위한 카세트를 포함하는 플라스미드, pRY789의 구조.
도 12. 6% 프럭토오스 및 6% 글루코오스를 함유한 최소 배지에서 미호기성 조건 하에 배양된, 도입된(instaolled) pRY789로부터의 ZrFFZ1 발현 카세트를 갖지 않거나, 또는 갖는 Ethanol Red에 의한 프럭토오스 및 글루코오스 이용.
도 13. 7-리터 발효조에서 균주 JSS1397과 KMS1017의 L-락트산 역가의 비교.
도 14. 균주 JSS1397 및 KMS1017의 7-리터 발효 중 프럭토오스 농도의 비교.
도 15. 7-리터 발효조에서 균주 JSS1397과 KMS1017에 의한 프럭토오스 이용의 속도에 대한 글루코오스 이용의 속도의 비율.
도 16. 용해도 한계를 실선으로 표시한, 7-리터 발효조에서 L-락트산 역가 vs. pH.
도 17. 180 g/L 수크로오스의 초기 배치 공급(initial batch feed)에 의한, 1개의 ZrFFZ1 카세트를 포함하는 D-락트산 생산 효모 균주(균주 SD1755), 2개의 ZrFFZ1 카세트를 포함하는 D-락트산 생산 효모 균주 (MYR2879) 및 그러한 카세트를 포함하지 않는 D-락트산 생산 효모 균주(균주 MYR2785)의 pH-조절 7-리터 발효에서 잔류 프럭토오스 농도.
도 18. 본 발명의 D-락트산 생산 균주를 L-락트산 생산 균주로 전환시키기 위한, MYR2787 중 3개의 EcldhA 발현 카세트 중 하나를 BcldhL 발현 카세트로 교체하도록 설계된 카세트를 포함하는, pBc-ldhL-OP2-int의 구조.
도 19. 216.7 g/L 당즙(cane juice)의 초기 배치 공급에 의한, ZrFFZ1 카세트를 포함하는 L-락트산 생산 효모 균주(균주 JSS1397) 및 ZrFFZ1 카세트를 포함하지 않는 L-락트산 생산 효모 균주(균주 MYR2893)의 pH-조절 5-리터 발효에서 잔류 프럭토오스 농도.
도 20. 150 g/L 수크로오스의 초기 배치 공급에 의한, 2개의 ZrFFZ1 카세트를 포함하는 L-락트산 생산 효모 균주(균주 JSS1397) 및 2개의 ZrFFZ1 카세트 및 KmRAG5를 포함하는 L-락트산 생산 효모 균주 (MYR3059)의 pH-조절 5-리터 발효에서 잔류 프럭토오스 농도.
도 21. 150 g/L 수크로오스의 초기 배치 공급에 의한, 2개의 ZrFFZ1 카세트를 포함하는 L-락트산 생산 효모 균주(균주 JSS1397) 및 2개의 ZrFFZ1 카세트 및 KmRAG5를 포함하는 L-락트산 생산 효모 균주 (MYR3059)의 pH-조절 5-리터 발효에서 L-락트산 농도.

실시예 1. 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주 SD 98 및 그의 유도체의 DNA 형질전환 방법.

하기의 화합물-기반 DNA 형질전환 방법은 균주 SD98 (US 특허 출원 62/631,541) 및 그의 유도체를 위해 개선되도록, Abdel-Banat et al. (Abdel-Banat, 2010 #56)에 의해 공개된 프로토콜로부터 개조되었고, 유도체들 중 다수는 본 명세서에 기재된 실시예에서 명명되고 사용된다.

형질전환될 균주의 신선한 단일 콜로니를 리터당 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 3 g 글루코오스, 200 mg 암피실린(소디움 염)으로 구성되고, 농축 NH₄OH로 pH 6.2로 조정된 200 mM MES(Sigma-Aldrich)의 최종 농도로 완충된 5 ml TG (transformation growth medium)에 접종한다. 이 "출발 배양물(starting culture)"을 30℃, 250 rpm으로 진탕 인큐베이터에서 50 mL 엘렐마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 밤새(16 내지 24 시간) 포화까지 배양시켰다. 중요하게, 이러한 조건은 배양액의 pH가 4.5 미만으로 떨어지는 것을 방지한다.

균주들은 통상적으로 16 내지 24 시간 동안, 약 10의 OD₆₀₀까지 증식했다. 포화된 출발 배양물을 1.0의 OD₆₀₀ 까지(통상적으로 약 1:10) 500 mL 엘렌마이어 플라스크 중 동일한 TG 배지 50 ml로 희석시킨다. 이 배양물을 다시 250 rpm 및 30℃에서 진탕하면서 후기 지수 성장, 약 6.0 내지 6.5의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 증식시켰다. 이는 통상적으로 약 5 내지 6시간 소요되었으나, 이 시간은 균주마다 변했다. 보다 광범위하게 조작된 균주 중 일부는 그들의 선조보다 더 느리게 증식한다. 일부 광범위하게 조작된 균주는 단지 5 내지 6의 OD₆₀₀에서 포화에 도달했고, 이 경우 세포를 3.0 내지 3.5의 OD₆₀₀ 에서 회수하여, 후기-지수 성장기에 있는 세포를 회수하고자 하였다.

배양물의 증식 동안, 회수 후 형질전환이 신속하게 진행되도록 시약들(preparations)을 제조하였다. 써모사이클러에서 100℃까지 5분 동안 가열하고, 얼음-수조에서 튜브를 신속하게 냉각시키는 것에 의해 10 mg/mL 단일-가닥 연어 정자 DNA (ssDNA)의 용액을 준비하였다. 각각의 개별적인 형질전환에 대해 1.5 mL Eppendorf 튜브를 준비하고 얼음 상에서 냉각시켰다. 각 튜브에 10㎕의 ssDNA 용액을 첨가하고, 뒤이어 이상적으로 균주로의 형질전환을 위한 실험 DNA (선형 또는 원형) 5㎕를 첨가했다. 종종, 특히, 복수의 단편들이 함께 도입되는 경우, 모든 DNA를 5㎕에 맞추는 것은 어렵고, 이 경우, 실험 DNA를 최대 10㎕까지 사용할 수 있다. 이상적으로, 총 형질전환용 DNA의 1 ㎍ 이상이 형질전환 튜브당 첨가되도록, 실험 DNA의 농도는 적어도 200 ng/㎕이어야 한다.

40% 폴리에틸렌 글리콜 (약 3,000-3350의 분자량, Sigma-Aldrich로부터의 PEG 3350으로도 알려짐), 0.2 M 리튬 아세테이트, 0.1 M 디티오트레이톨, 0.2 X YPD 배지 (1 X YPD 배지는 리터당, 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 및 20 g 글루코오스이다)의 최종 농도를 포함하는 형질전환을 위해 화학적으로 세포를 준비하기 위해 멸균 형질전환 혼합물(Transformation Mixture, TM)을 준비한다. 실제로, 이 TM은 형질전환 일에 3개의 스톡 용액을 조합하는 것에 의해 준비한다. 2 M 리튬 아세테이트는 증류수보다 1 X YPD 배지 중에 제조한다. 멸균 여과시키고, 사용 전에 -20℃에서 1 mL 분량으로 보관한다. 1 M 디티오트레이톨을 마찬가지로 물이 아닌 1 X YPD 배지 중에 준비하고, 멸균 여과시키고, 사용 전에 -20℃에서 1 mL 분량으로 보관한다. 최종적으로, 50% PEG 3350의 용액을 증류수 중에 제조하고, 멸균 여과시키고, 실온에서 밀봉 용기에 보관한다. PEG 3350은 분명히 공기 중에서 서서히 산화되고, 그 시간 동안 용액의 pH가 저하된다. 일반적으로, 형질감염을 위해 사용된 PEG 3350의 모든 스톡은 2개월 이하였고, 5.0 이상의 pH를 가졌다. 10 mL "TM"의 제조는 YPD 중 멸균 리튬 아세테이트 1 mL, YPD 중 멸균 디티오트레이톨 1 mL, 및 멸균 PEG 3350 용액 8 mL를 혼합하는 것에 의해 형질전환 일에 신선하게 이루어졌다. 점착성 TM을 완전히 볼텍싱하여 적절한 혼합이 이루어지게 했다. 그 후, 형질전환에서 사용하기 전까지 얼음에서 보관했다.

형질전환될 배양물이 후기 지수 성장기(late logarithmic growth)에 도달하면, 세포를 온건한 냉장의 조건 (12℃) 하에 5분 동안 6500 rpm에서 원심분리했다. 이 시점부터 이후로, 배양물을 가능한 한 신속하게 다루어서, 균주가 열 충격(heat shock) 단계에 도달하기까지의 시간을 최소화했다. 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 1 mL의 TM에 재현탁시키고, 동일한 조건 하에 다시 원심분리시켰다. 상층액을 마이크로피펫으로 제거한다. 최종적으로, 세정된 세포 펠렛을 700 ㎕의 TM에 재현탁시켜, 약 900 ㎕ 내지 1 mL 총 부피의 점착성 세포 현탁액을 생성한다. 이 현탁액은 약 10회의 개별적인 형질전환을 위해 충분하다. 모든 후속 단계에서, 튜브는 얼음 상에 유지한다. 가능한 한 신속하고 조심스럽게, 현탁액을 85 ㎕ 분량으로 각각의 냉각된 형질전환 튜브에 분주하고 완전하게 혼합한다. 각 튜브에 이미 존재하는 15 ㎕의 혼합된 DNA와 함께, 이는 형질전환당 100 ㎕의 총 혼합물을 생성한다. 튜브를 42℃ 수조 또는 가열 블럭(heatin block)에 45분 동안 배치하여, 각 형질전환물에 열 충격을 수행한다.

45분의 열 충격 후에, 튜브를 즉시 얼음으로 복귀시키고, 선택 배지가 결핍 배지(drop out medium)(우라실과 같은 특성 성분이 결핍된 배지)인 경우, 선택을 위해 사용된 아가-기반 배지의 액체 배지 버전 1 mL와 함께 마이크로 원심분리기에서 완전한 스피드(full speed)로 세포를 펠렛팅하고 세정한다. 본 발명자들의 형질전환의 대부분은 선택 마커로 URA3 또는 TRP5를 이용했고, 따라서, 각각 우라실 또는 트립토판이 결핍된("제외(drop out)") 완전한 배지(2% 글루코오스 포함)를 이용하여 세포를 재현탁시키고 세정하였다. 각 형질전환의 세포들을 스핀 다운시키고, 상층액을 피펫으로 제거했다. 각 펠렛을 300 ㎕의 신선한 선택 배지에 재현탁시키고, 각 현탁액을 2% 아가를 포함한 선택 배지를 담은 플레이트 상에 도말시킨다. 현탁액의 1/10을 하나의 페트리 디쉬에 도말하고, 현탁액의 9/10을 제 2 플레이트에 도말하는 것이 정상 관행이다. 건조 후에, 플레이트를 콜로니가 나타날때까지, 통상적으로 2 내지 4일 동안 30℃에서 인큐베이션한다. G418과 같은 항생제가 선택을 위해 이용되는 경우, 세포를 액체 1X YPD 배지 1 ml에 재현탁시키고, 4 ml의 액체 1 X YPD를 담은 15 ml 튜브에 첨가하고, 30℃에서 3시간 동안 굴리거나 진탕시킨다. 3시간 후에, 세포들을 5,000 rpm에서 펠렛화하고, 0.5 ml의 1 X YPD에 재현탁시키고, 1 X YPD 및 항생제를 포함하는 선택용 플레이트에 플레이팅한다. 부모 균주의 배경 증식(background growth)을 제거하기 위해 필요한 최소 농도인, 적절한 항생제 농도를 각 균주에 대한 파일럿 실험으로 결정해야 한다. 통상적인 적절한 농도는 200 mg/L G418, 300 mg/L 히그로마이신, 또는 200 mg/L 제오신이다.

중복 말단의 상동성 재조합에 의해 인 비보에서 조립될 선형 DNA 또는 선형 DNA 단편들의 혼합물을 이용할 때, 수령체 균주가 Δnej1이고 선택 유전자가 URA3인 경우, 전술된 방법을 이용하여, 약 10 내지 200개의 형질전환체 콜로니를 수득하는 것이 일반적이다. 특정한 염색체 표적 내로 통합되어야 하는 선형 DNA에 의한 형질전환의 경우, 개별적인 콜로니를 공급자에 의해 지시된 바와 같이 Phire Plant PCR Kit (Thermo Fisher)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 정확한 원하는 통합 구조에 대해 테스트한다. 형질전환 혼합물로부터의 나머지 또는 비-상동성 말단 접합(NHEJ)에 의해 무작위 염색체 위치에 통합된 것으로 존재할 수 있는, 카세트 자체의 내부 부위들에 의한 PCR 프라이밍을 피하기 위해, 프라이머 쌍은 통합된 DNA와 인접한 염색체 DNA 사이의 연결 지점(junction) 중 하나를 포함해야 한다. 본 발명자들이 카세트의 일 말단에 있는 하나의 연결 지점은 올바른 것으로 보이나, 나머지 말단은 그렇지 않은 경우들을 봤기 때문에, 통합된 카세트와 주변 염색체 DNA 간의 2개의 접합 지점 각각에 대한 프라이머 쌍인 2종의 상이한 세트의 PCR 프라이머 쌍을 이용하는 것이 가장 바람직하다.

실시예 2. 형질전환 가능한 저 피루베이트 D-락테이트 생산 효모의 작제

SD1566은 E. coli ldhA (EcldhA) 유전자를 발현하도록 설계된 카세트의 3개의 통합된 카피를 포함하는 클루이베로마이세스 마르시아누스의 크랩트리(Crabtree) 양성 균주의 조작된 유도체이다. SD1566의 작제 및 생성은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허출원 62/631,541에 기재되었다. SD1566에서, 3개의 EcldhA 카세트가 KmPDC1, KmGPP1, 및 KmNDE1 좌위에서 삽입된다.　 3개의 경우 모두에서, EcldhA 유전자는 KmPDC1 프로모터에 의해 구동되나, 염색체 서열은 결실되지 않았다. SD1566의 전구체인 SD1555는 KmPCK1 좌위에 삽입된 4번째 카피의 EcldhA를 포함하나, SD1566을 가져온, 베타-클로로락테이트에 대한 내성에 대한 선택 동안, 전체 KmPCK1 좌위 및 주변 DNA의 자발적인 결실이 일어나서, 글루코오스생성을 수행하는 능력의 결핍인 pck1- 표현형을 갖는 SD1566을 남긴다.　SD1566에서 자발적으로 발생한 또 다른 표현형은 DNA 형질전환 능력의 소실이다. 그럼에도 불구하고, SD1566의 높은 D-락테이트 생산성 및 낮은 피루베이트 생산성은 본 발명자들이 SD1566의 바람직한 특성을 포함하는 균주를 더 개발할 수 있는 방법을 발견하게 하였다.

SD1566에 대한 전구체 균주는 SD1524이었고, 이는 SD1566과 동일한 3개의 카피의 EcLdhA를 포함했으나, SD1524는 온전하고 기능성인 PCK1 유전자를 포함했고, 따라서, 유일한 탄소원으로서 비-발효성(non-fermentable) 탄소원, 예를 들면, 글리세롤, D-락테이트, L-락테이트, 또는 숙시네이트를 포함하는 최소 배지 상에서 성장할 수 있었다. SD1524는 KmURA3 유전자가 결실되었고, 따라서, ura3- 표현형을 가졌다. 따라서, SD1566은 URA3+, pck1-이고, 반면에, SD1524는 ura3-, PCK1+이다.

본 발명자들의 K. marxianus 균주 모두는 두 접합 타입의 반수체의 혼합물을 포함하는 것으로 추측되므로, 본 발명자들은 SD1566 (URA3+, pck1-)이 SD1524 (ura3- PCK1+)과 접합할 수 있고, 이배체가 유일한 탄소원으로서 2% 포타슘 L-락테이트, pH 5.0을 포함하는 우라실 제외 최소 배지(Sigma Aldrich)(CM, -ura, + L-Lac)에서의 증식에 의에 선택될 수 있다는 것을 알아냈다.　SD1566과 SD1524는 2% 아가 및 2% 덱스트로오스로 구성된 "접합 배지(mating medium)"에서 패치로 함께 균주들을 혼합하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하는 것에 의해 접합되었다. 그 후, 접합된 패치를 CM, -ura, + L-Lac 플레이트에 복사 평판(replica plating)하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 2일 후에, 짐작건대 이배체 균주가 나타났고, 이를 단일 콜로니를 생성하기 위해 선조접종(streaking)하고, 2% 아가, 1% 포타슘 아세테이트, 0.1% 효모 추출물, 및 0.05% 덱스트로오스로 구성된 "포자형성 배지(sporulation medium)"에 패칭하였다. 포자형성 배지 플레이트를 30℃에서 4-7일 동안 인큐베이션시켰다. 현미경 검사에 의해 포자 형성을 확인하고, ~70% 이상의 발아형성 효율이 관찰될 때, 무작위 포자 분석을 수행했다. 무작위 포자 분석(random spore analysis)을 위해, 약 20 마이크로리터의 세포 매스를 이쑤시개로 긁어내고 200 units/ml 자이몰리아제(Zymolyase) (Zymo Research)를 포함하는 0.25 ml 완충액(10 mM TrisHCl, pH 6, 1 mM Na₂EDTA)에 재현탁시키고, 영양 세포(vegetative cell)를 사멸시키고 포자를 농축하기 위해 37℃에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 영양 세포를 사멸시키는 것에 의해 포자에 대해 더 농축하기 위해 현탁액을 57℃에서 15-25분 동안 열 처리하였다. 그 후, 포자를 연속적으로 희석하고 YPD 아가 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코오스, 2% 아가) 상에 플레이팅하고, 결과적으로 수득된 단일 콜로니들을 2% 글루코오스를 탄소원으로 갖는, 우라실을 함유한 완전한 최소 배지(Sigma-Aldrich), 2% 글루코오스를 탄소원으로 갖는, 우라실 제외 완전한 최소 배지(Sigma-Aldrich), 또는 2% 포타슘 L-락테이트를 유일한 탄소원으로 갖는, 우라실을 함유한 완전한 최소 배지(Sigma-Aldrich)에 플레이팅하여, URA3 및 PCK1 표현형에 대해 확인했다.

결과적으로 수득된 반수체-유래 균주들을 실시예 2에 기재된 바와 같이, 고 역가의 D-락테이트(100 g/L 초과), 저 역가의 피루베이트(1 g/L 미만)를 생산하는 능력, ura3+, 및 PCK1+을 보유하는지 여부에 대해 스크리닝했다. DNA에 의해 형질전환될 수 있는 능력을 재획득했기 때문에, 본 발명자들은 MYR2755로 명명된 하나의 그러한 균주를 추가적인 개발을 위해 선택했다. MYR2755의 추가적인 조작을 촉진하기 위해, 그의 NEJ1 유전자를 도 1에 도시되고, 그의 DNA 서열이 서열번호 1로 기재된 카세트를 이용하여 결실시켰다. URA3+인 MYR2755의 최초 형질전환체를 우라실 제외 배지에서 선택하고, MYR2785로 명명했다. MYR2785는 우라실 없이 최소 배지에서 증식할 수 있기 때문에, 하기에 주어진 여러 실시예에서 대조군 부모 균주(control parent strain)로 이용했다. 5-FOA에서의 선택에 의해 URA3 유전자를 루핑 아웃시킨 후에, ura3-인 △nej1 유도체, MYR2787이 하기 실시예에 기재된 바와 같은 FFZ1 발현 카세트의 제1 및 후속 도입을 위한 부모 균주가 되었다.

실시예 3. D-락테이트 생산 효모 중 1세대 FFZ1 발현 카세트의 작제.

지고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii) 또는 지고사카로마이세스 룩시(Zygosaccharomyces rouxii)로부터의 FFZ1 유전자를 4번 염색체 상의 게놈 좌위에 상동성 통합(homologous integration)에 의해 발현시켜, 그 좌위에 있는 고유한 KmADH2 유전자를 파괴시켰다. 통합 카세트는 1) "ADH2 up", 고유한 ADH2 ORF의 1 내지 501번의 코딩 서열에 해당하는 501 bp DNA, 2) 부분적 ADH2 ORF의 번역을 종료시키는 번역 종결 코돈으로 작용해야 하는 TAA 종결 코돈, 3) KmPDC1 프로모터를 포함하는 1000 bp 서열, 4) 각각 Zygosaccharomyces bailii 또는 Zygosaccharomyces rouxii로부터의 ZbFFZ1 ORF (open reading frame) 또는 ZrFFZ1 ORF, 5) Saccharomyces cerevisiae URA3 프로모터의 상류 및 하류에 배치된 변형된 Saccharomyces cerevisiae URA3 유전자 종결자 서열 및 ORF로 구성된 ScURA3 카세트, 6) "D+", 22 bp (aacttagactaaggaggtttgg)의 합성 DNA 서열, 및 7) "ADH2 down", 고유한 ADH2 유전자의 502번 내지 1001번 코딩 서열에 해당하는 500 bp 서열로 이루어졌다. ZbFFZ1 및 ZrFFZ1 통합 카세트의 구조를 보여주는 도표가 도 2에 도시되고, ZrFFZ1 버전의 DNA 서열은 서열번호 2로 기재된다.

카세트의 상동성 통합은 PCR에 의해 생성되고, 모두 수령하는 균주인 D-락테이트 생산 균주 MY2787로 거의 동일한 몰 농도로 함께 형질전환된, 그들의 말단에 중복 상동성을 갖는 DNA 단편들의 인 비보 조립을 이용하여 수행되었다 (실시예 2 참조). 통합체(integrant)를 우라실을 포함하지 않는 최소 2% 글루코오스 플레이트(우라실 불포함 CM, Sigma-Aldrich)에서 선택하고, 정제를 위해 동일한 배지 상에 선조접종(streaking)하고, 원하는 통합 사건에 대하여 콜로니 PCR에 의해 테스트하였다. 그 후, ScURA3 유전자 종결자 반복서열이 5'-FOA를 포함하는 배지 상에서 ScURA3 카세트의 상동성 "루프-아웃(loop-out)"을 가능하게 하여(미국 가출원 62/631,541 참조) FFZ1 발현 카세트는 통합된 상태로 유지되고, 균주는 표현형적으로 ura3-이 되어, 추가적인 조작을 위한 URA3 마커의 반복적 사용을 촉진한다.

수득된 그러한 URA3+ 형질전환체 (ZbFFZ1 카세트에 대한 SD1748 및 ZrFFZ1 카세트에 대한 SD1751 및 SD1755)를 서열로 확인하고, 수크로오스, 글루코오스 및 프럭토오스의 이용에 대해 BioLector 발효에서 테스트하였다.

ZbFFZ1은 유의성 있는 효과가 없었고, ZrFFZ1은 측정가능한 효과를 가졌다는 것을 보여주는 BioLector 실험으로부터의 결과가 도 3a 및 3b에 제시된다.

BioLector 실험은 ZrFFZ1 카세트의 도입시, 프럭토오스의 이용이 글루코오스의 이용 대비 개선되었다는 것을 보여주었다. 예를 들면, 이용된 프럭토오스 대 이용된 글루코오스의 비를 2개의 상이한 시점에서 계산하고 FFZ1이 결핍된 부모 균주(MYR2785)와 비교하면, 이 비는 약 0.32로부터 약 0.44까지 증가되었다 (12 % 수크로오스 배지, 48시간 데이터). 이러한 개선은 실험을 출발 배지에서 12% 수크로오스를 사용하지 않고, 출발 배지에서 6% 글루코오스와 6% 프럭토오스의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, 더 크다(약 0.3부터 약 1.3 (16시간 데이터)). 종합하면, 이러한 결과는 균주 SD1755 (ZrFFZ1 포함)가 프럭토오스 이용에 대해 가장 우수한 균주여서, 추가적인 조작을 위해 사용했다는 것을 나타낸다. SD1755를 pH-조절 7-리터 발효기에서 MYR2785과 비교했고, 프럭토오스는 역시 SD1755에 의해 더 빨리 소비되었다 (실시예 6 참조).

ScURA3 유전자를 5-FOA에서의 선택에 의해 SD1755로부터 결실시키고, 결과적으로 수득된 ura3- 유도체를 SD1774로 명명하였고, 이 균주는 추가적인 조작이 가능했다. 이 균주는 실시예 4에서 D-락테이트 생산자로부터 L-락테이트 생산자로 전환되었다.

실시예 4. L-락테이트 생산 균주, KMS1017, 및 추가적인 공학적 조작에 적합한 그의 ura3 - 유도체, KMS1019의 작제

D-락테이트 생산 균주 중 통합된 카세트에서 PaldhL ORF를 EcldhA ORF로 교환하기 위한 카세트를 포함하도록 설계된, 플라스미드 pMS155를 NEBuilder HiFi Assembler Cloning Kit를 이용하여 작제했다 (도 4 및 서열번호 5 참조). PaldhL 스왑 카세트를 pMS155로부터 PCR에 의해 증폭시키고 SD1774에 형질전환시키고, URA3+ 형질전환체에 대해 선택했다. 그 후, EcldhA 유전자의 3개의 카피 중 어느 것이 교체되었는지를 결정하기 위해 URA3+ 콜로니를 콜로니 PCR에 의해 테스트하였다. 균주 KMS977은 GPP1 좌위에 있는 카피가 교체되었다는 것을 보여주었다. 그 후, KMS977 중 URA3 유전자를 상동성 재조합에 의해 결실시키고, 5'-FOA를 함유한 배지에서 선택하여, KMS984를 생성했다. KMS984를 후속적으로 동일한 스왑 카세트로 형질전환시키고, 이 때, NDE1 좌위의 EcldhA를 교체시켜 KMS1001를 생성했다. KMS1001 중 URA3 유전자를 5'-FOA를 함유한 배지에서의 선택에 의해 결실시켜, 균주 KMS1004를 생성했다. KMS1004를 스왑 카세트로 형질전환시켜, PDC1 좌위에 있는 마지막으로 남은 EcldhA 유전자를 교환하여, KMS1017을 생성했고, 이 균주는 L-락테이트만을 생산했다. 전술된 바와 같이, KMS1017로부터 URA3 카세트를 결실시켜, KMS1019를 생성했다. KMS1017은 PaldhL 카세트만을 포함하여, L-락테이트만을 생산한다. KMS1019는 ura3-이고, 따라서, 실시예 5에서와 같이, 추가적인 유전적 조작을 위해 사용된다.

실시예 5. 지고사카로마이세스 룩시 FFZ1 유전자의 재설계된 통합 및 개선된 기능.

4번 염색체의 KmADH2의 중간으로 ZrFFZ1 발현 카세트 1 카피를 삽입하는 것에 의해 초래된 글루코오스 이용 대비 프럭토오스 이용의 적당하나, 측정가능한 증가를 고려할때, 본 발명자들의 기존의 D-락테이트 생산 균주 SD1755 및 MYR2785에 추가적인 카피의 ZrFFZ1 발현 카세트를 첨가하는 것에 의해 프럭토오스 이용을 더 개선하고자 했다. ZrFFZ1이 이종 숙주에서 발현될 때, 프럭토오스 투과성의 정상적인 강력한 기능을 재현할 수 없을 가능성이 존재했다. 이 이론을 테스트하기 위해, 클루이베로마이세스 마르시아누스에서 그의 효과를 증가시킬 통합 방법을 찾기 위해, ZrFFZ1 발현 카세트를 새로운 2가지 방식으로 재설계했다.

K. marxianus에서 ZrFFZ1을 발현시키기 위해 2종의 새로운 통합 카세트를 설계했다. JSS89로 명명된 하나는 KmADH6의 전체 ORF를 결실시키고 대체하도록 설계되었다. JSS90으로 명명된 나머지는 KmADH6 ORF의 중간에 삽입되도록 설계되었다. 두 개의 카세트, JSS89 및 JSS90의 구조가 각각 도 5 및 6에 도시된다. 이 2개의 카세트의 DNA 서열은 각각 서열번호 3 및 4로 주어진다. 실시예 2에서 카세트 설계에서 사용되었던, TAA 종결 코돈에 이어진, 동일한 1,000 bp KmPDC1 프로모터 (P_{PDC1-1,000 bp})를 다시 이 새로운 카세트 모두로부터 ZrFFZ1 발현을 구동하기 위해 이용했다. 그러나, 새로운 카세트들은, JSS89 및 JSS90이 모두 Zygosaccharomyces rouxii로부터의 ZrFFZ1 유전자의 고유한 종결자 서열을 이용한다는 점에서 실시예 2에서 SD1755를 생성하기 위해 이용된 이전 설계와 상이했다. 두 경우 모두에서, 사카로마이세스 세레비시애 URA3을 선택 마커로 이용했으나, 락테이트 생산 균주들로의 통합을 촉진하기 위해 2개의 카세트들에서 상이하게 도입되었다. pJSS89 카세트는 FFZ1 유전자의 반대 방향으로 ScURA3을 발현하여, 이 카세트는 본 발명자들의 균주 계통에서 보다 빠른 통합 사건들에서 남겨진 DNA "자국(scar)" 내에 통합될 수 없을 것이다. pJSS90 카세트는 1 카피의 ZrFFZ1 ORF 및 고유한 ZrFFZ1 종결자의 207 bp 바로 다음에 그의 고유한 종결자가 결핍된, 약간 짧아진 ScURA3 유전자를 발현시키는 것에 의해 동일한 문제를 회피했다. ScURA3 프로모터 및 ORF는 전체 900 bp Zr FFZ1 종결자로 이어졌고, 이는 ScURA3 전사체를 종료시키고, 5-FOA 선택에 의한 마커 유전자의 제거를 가능하게 하는 207 bp의 직접 반복 서열을 제공하기 위해 이용되었다.

카세트 JSS89에서, 전체 ZrFFZ1- 900 bp 종결자는 KmADH6에 대한 고유한 종결자에 해당하는 220 bp 서열로 이어진다. 이는 완전한, 전도된(inverted) ScURA3 마커로 이어지고, 뒤이어, KmADH6 서열의 중앙에 해당하는 DNA의 500 bp 단편으로 이어진다. 고유하게 KmADH6의 ATG로부터 270 bp 하류에 나타나는 이 단편은 카세트를 위한 "하류(downstream)" 통합 플랭크(flank)로 작용한다. 이 카세트의 전단에 있는 TAA- P_{PDC1-1,000 bp} 프로모터 구조체에 선행하는 것은 KmADH6의 상류 조절 영역(ATG의 5'에 -510 bp 내지 -10 bp)에 해당하는 DNA의 500 bp 단편이었다. 이는 전체 카세트에 대해 "상류" 통합 플랭크로 작용했다.

JSS89 및 JDSS90 통합 카세트를 작제하기 위해 필요한 DNA 단편들(각각 인접한 단편과 중복되는 DNA 상동성의 60 bp 영역을 가짐)을 PCR에 의해 생산하고 동일 몰량으로 혼합했다. 그 후, 이 혼합물을 전술된 방법에 의해 SD1755의 △ura3 유도체 (SD 1774로 지칭됨) 및 MYR 2785의 △ura3 유도체 (MYR 2787로 지칭됨)에 형질전환시키고, 중복되는 단편들을 함께 연결시키고 상동성 재조합에 의해 통합시켰다. 도 5 및 6으로부터의 카세트의 각 균주로의 올바른 통합을 확인하기 위해 URA3 ⁺ 형질전환체 클론들을 콜로니 PCR에 의해 스크리닝했다. 복수 개의 단리물로, 각 클론의 발효를 BioLector Basic (m2p Labs에서 판매함)에서 12% 수크로오스 및 150 mM 암모늄 포스페이트 완충액, pH 6.3을 포함하는 SDM2 최소 배지를 이용하여 수행했다. 낮은 pH 때문에, 증식이 중단될 때까지, 75시간 동안 균주들을 배양했다. 시료를 D-락테이트에 대해 HPLC에 의해 분석했다 (도 7).

이전의 결과들로부터 예상된 바와 같이, 추가적인 카피의 ZrFFZ1을 첨가하는 것은 모든 균주에서 프럭토오스 이용의 속도를 더 증가시켰다. pJSS90 카세트는 SD1755에서 KmADH2에 통합되었던, 이전 삽입 카세트와 거의 동일한 방식으로 거동했다. 각각은 부모 균주에 비해, 사용된 프럭토오스 대 사용된 글루코오스의 비를 약 0.1 내지 0.2 증가시켰다 (도 7). 2개의 통합된 카세트로부터의 기여는 거의 부가적이었고, pJSS90 카세트의 SD1774로의 통합체는 MYR2787로의 유사한 통합체보다, 사용된 프럭토오스 대 사용된 글루코오스의 비 측면에서, 훨씬 더 높았다.

그러나, 예상치않게, ZrFFZ1 유전자를 ADH6에 도입하도록 설계된 2개의 카세트 간에 성능에 있어서 큰 차이가 있었다. JSS90을 MYR2787에 통합시키는 것은 사용된 프럭토오스 대 사용된 글루코오스의 비를 0.35로부터 0.55로 증가시켰고, 1 카피의 JSS89 카세트를 첨가하는 것은 그 비를 1.65까지 증가시켰고, 이는 이전의 삽입 카세트들과 비교하여, 효과에 있어서 거의 6배 증가에 해당한다(도 7). 이러한 단일의 급격한 증가는 그 자체로 균주의 대사를 글루코오스 선호형(glucophilic)에서 프럭토오스 선호형(fructophilic)으로 완전히 변화시키기에 충분한 것 이상이었다. 흥미롭게, 이 효과는 또한 ADH2에서 최초의 ZrFFZ1 카세트의 효과에 부가적이었고, 다만, 존재하는 2개의 카세트가 [사용된 프럭토오스]/[사용된 글루코오스]를 1.65로부터 단지 1.85까지 증가시켰기 때문에, 최초 카세트의 효과는 훨씬 더 미미하게 유지된 것으로 보였다.

각 경우에, Kluyveromyces marxianus의 이러한 조작된 균주에 추가적인 카피의 ZrFFZ1을 첨가하는 것은 원래 글루코필릭인 균주가 증식 동안 프럭토오스를 흡수하고 대사하는 능력을 증가시켰다. 이 효과는 그러나, Km에서 이 특정한 이종 대립인자에 따라 및 그의 발현 상황 때문에 현저하다. KmADH6 대신에 ZrFFZ1을 통합하고 그 유전자 다음에 고유한 Zr DNA의 연장된 종결자 서열(900 bp)을 사용하는 것은 프럭토오스 이용의 크고 예상치 못한 증가를 가능하게 했다. 이 증가는 신규한 Km D-락테이트 생산 균주(표 2에 열거됨)가 완료까지 수행된 염기-조절 7L 발효에서조차 들의 프럭토필릭 특성을 유지하기 때문에 상이한 규모 및 기간의 발효에서 일관되게 관찰되었다 (실시예 6 참조).

ZrFFZ1 발현을 위한 JSS89-기반 "교체(replacement)" 카세트의 특성-변경 능력은 L-락테이트 생산 균주 KMS1017의 유도체 KMS1019에 도입된 경우 유사하게 기능했다(실시예 4 참조). KMS1017의 △ura3 유도체, KMS1019에 첨가되는 경우, 프럭토오스 이용에 있어서 유사한 개선이 수득되었다. JSS89 카세트를 KMS1019에 형질전환시키는 것에 의해 수득된 5개의 단리물의 요약이 표 3에 제시된다. 신규한 균주들은 모두 발효의 초기 동안 pH를 지속적으로 6 부근에서 유지하기 위해 탄산칼슘을 포함하는 진탕 플라스크 발효에서 증가된 프럭토필릭 특성을 보였다 (도 8). 개선된 프럭토오스 이용의 관찰된 정도는 전술된 BioLector 발효에서보다 진탕 플라스크에서 더 낮다는 것에 주목한다. JSS89 카세트를 포함하는 KMS1019의 가장 우수한 유도체는 pH가 수산화칼슘을 공급하는 것에 의해 조절된 7-리터 발효에서 평가하였다. 7-리터 발효에서, 가장 우수한 성능의 단리물은 JSS1397이었다 (실시예 6 참조).

실시예 6. pH-조절 7-리터 발효기에서 ZrFFZ1 카세트를 포함하는 균주에 의한 D-락테이트 또는 L-락테이트의 생산.

균주 JSS1397의 접종물(inoculum)을 500 ml 배플 장착 진탕 플라스크(baffled shake flask) 중 150 ml YPS-MES 배지(표 4 참조)에서 37℃에서 3.0 내지 4.0의 OD 600 nm까지 배양했다. 150 ml를 4 리터의 AM1S 배지(표 4 참조)에 접종했다. 임펠러 속도는 750 rpm이었고, 통기(aeration)는 출발 부피의 0.075 vvm과 동일한 300 ml/분이었다. 출발 pH는 약 6.8이었다. pH는 교반되는 저장소(stirred reservoir)에 현탁된, 3몰 농도(molar) 수산화칼슘의 슬러리의 자동화된 연동 펌프(peristaltic pumping)에 의해 조절했다. 0 시간차(접종 시간)부터 25시간까지 선형적(linear) 방식으로 pH 설정점(set point)은 pH 4.25까지 자동적으로 내려갔다(즉, 낮아졌다). 25시간차에, 설정점이 pH 3.5로 변했다. 이는 더 많은 L-락트산이 생산되면서 pH가 자연적으로 떨어질 수 있게 했다. 45시간 발효의 종료 시, 최종 pH는 3.5이었다. pH 램프(ramp)는 칼슘 락테이트의 침전을 방지했다. 도 16에서, 칼슘 락테이트의 용해도가 pH의 함수로 표시된다.

45 시간 차에, L-LAC 역가는 126 g/L이고, 계산된 수율은 0.85 g/g 수크로오스였다(도 12 내지 16에서 YL487 및 YL488로 명명된, 2회 발효(duplicate fermentations)의 평균). L-LAC의 최대 비 생산성은 3.75 g/L-hr였고, 누적 생산성은 3.4 g/L-hr였다. JSS1397의 최종 L-락테이트 역가는 대조군 균주 KMS1017 (도 13 내지 16에서 발효 YL492로 명명됨)의 역가와 비슷했으나, JSS1397에 의한 생산 속도가 훨씬 더 빨랐다(도 13). 프럭토오스 이용의 증가된 속도는 수크로오스 가수분해 후 유리 프럭토오스를 측정하는 것에 의해 알 수 있다 (도 14). 훨씬 더 인상적인 것은 도 15에 도시된 글루코오스 대 프럭토오스 이용의 비율이다. JSS1397에 대한 글루코오스 이용 속도 대 프럭토오스 이용 속도의 비는 발효의 대부분에 대해 거의 동일했으나, 대조군 균주 KMS1017은 발효의 초기에 글루코오스를 프럭토오스 이용 속도의 2배로 이용했고, 잔여 프럭토오스 대 글루코오스의 비가 4:1인 27시간 EFT(elaspsed fermentation time)에 짧게 글루코오스와 프럭토오스를 동일한 속도로 이용했다.

유사한 7-리터 발효에서, D-락테이트 생산 균주 SD1755 (ZrFFZ1의 카세트 1개를 포함함), MYR2879 (ZrFFZ1의 카세트 2개를 포함함) 또는 MYR2785 (ZrFFZ1 카세트 불포함)를 비교했다. 이 경우, 출발 수크로오스 농도는 180 g/L보다 약간 더 낮았다. 도 17에 도시된 바와 같이, MYR2879 및 SD1755에 의한 프럭토오스 소비의 속도는 MYR2785보다 증가되었다. 또한, MYR2879는 SD1755보다 더 빠른 프럭토오스 소비를 보였다. 이 비교를 위해 수득된 최종 발효 파라미터가 표 5에 제시된다.

실시예 7. L-락테이트를 위한 당즙 발효에서 프럭토오스 문제의 해결

기후가 열대 또는 난대인 다수의 지역에서, 사탕수수가 발효당의 바람직한 공급원이다. 수확 후에, 사탕수수를 기계적으로 파쇄하고 제분하여 당즙(juice)을 추출하고, 그 후, 당즙을 여러 단계에서 정제하여 당을 제조한다. 당즙 중 주요한 당은 수크로오스이다. 상업적 생산에서, 당즙은 여러 바이오-기반 화합물을 생산하기 위한 저비용 공급 원료(feedstock)로서 사용하기 위해 선호된다. K. Marxianus는 세포 막의 외부에서 수크로오스를 글루코오스와 프럭토오스로 가수분해하는 효소를 분비하고, 그 후, 글루코오스와 프럭토오스를 세포 내로 유입시키고, 세포 내에서 그들은 해당 경로(glycolytic pathway)로 들어간다. 효모 K. marxianus가 고농도의 수크로오스를 함유한 당즙에서 배양되는 경우, 전화효소에 의한 세포외 글루코오스와 프럭토오스의 생산은 세포가 글루코오스와 프럭토오스를 유입하는 능력을 초과하여, 글루코오스와 프럭토오스가 세포의 외부에 축적된다. 발효가 진행되면서, 글루코오스가 프럭토오스보다 더 빨리 이용되어, 모든 프럭토오스가 소비되도록 하기 위해, 발효 시간이 연장되어야 한다. 이 현상을 "프럭토오스 문제(fructose problem)"이라 부르고, 이는 하기 실험에서 L-락테이트 생산의 경우에서 실증된다.

이 현상을 실증하기 위해, ZrFFZ1 카세트를 갖지 않는 새로운 L-락테이트 생산 균주를 작제했다. Bacillus coagulans BC060로부터의 락테이트 데히드로게나아제 유전자를 K. marxianus 효모에서 발현시키기 위해 선택했다. D-락테이트 생산 균주 중 통합된 카세트에서 BcldhL ORF를 EcldhA ORF로 교환하기 위한 카세트를 포함하도록 설계된, 플라스미드 pBc-ldhL-OP2-int를 NEBuilder HiFi Assembler Cloning Kit를 이용하여 작제하였다 (도 18 및 서열번호 7 참조). BcldhL 스왑 카세트(swap cassette)를 pL-BCldh로부터 PCR에 의해 증폭시키고 MYR2787에 형질전환시키고, URA3+ 형질전환체를 선택했다. 그 후, EcldhA 유전자의 3개의 카피 중 어느 것이 교체되었는지를 결정하기 위해 URA3+ 콜로니를 콜로니 PCR에 의해 테스트하였다. 균주 MYR2891은 GPP1 좌위에 있는 카피가 교체되었다는 것을 보여주었다. 그 후, MYR2891 중 URA3 유전자를 상동성 재조합에 의해 결실시키고, 5'-FOA를 함유한 배지에서 선택하여, MYR2891-ura^-를 생성했다. MYR2891-ura^-를 후속적으로 동일한 스왑 카세트로 형질전환시키고, 이 때, NDE1 좌위의 EcldhA를 교체시켜 MYR2892를 생성했다. MYR2892 중 URA3 유전자를 5'-FOA를 함유한 배지에서의 선택에 의해 결실시켜, 균주 MYR2892-ura^-를 생성했다. MYR2892-ura^-를 스왑 카세트로 형질전환시켜, PDC1 좌위에 있는 마지막으로 남은 EcldhA 유전자를 교환하여, MYR2893을 생성했고, 이 균주는 L-락테이트만을 생산했다. MYR2893은 BcldhL 카세트만을 포함하여, ZrFFZ1의 카세트 없이, L-락테이트만을 생산한다.

JSS1397 (ZrFFZ1 카세트 포함) 및 MYR2893 (ZrFFZ1 불포함)의 L-락테이트 발효를 pH 조절된 5-리터 발효기에서 수행했다. 효모 균주 JSS1397 및 MYR2893의 접종물(inoculum)을 500 ml 배플 장착 진탕 플라스크 중 150 ml YPS-MES 배지(표 4 참조)에서 37℃에서 3.0 내지 4.0의 OD 600 nm까지 배양했다. 150 ml를 3 리터의 AM1CJ 배지(표 4 참조)에 접종했다. 임펠러 속도는 750 rpm이었고, 통기는 출발 부피의 0.065 vvm과 동일한 195 ml/분이었다. 출발 pH는 약 6.8이었다. pH는 교반되는 저장소에 현탁된, 3몰 농도 수산화칼슘의 슬러리의 자동화된 연동 펌프에 의해 조절했다. 0 시간차(접종 시간)부터 25시간까지 선형적 방식으로 pH 설정점은 pH 4.1까지 자동적으로 내려갔다(즉, 낮아졌다). 25시간차에, 설정점이 pH 3.5로 변했다. 이는 더 많은 L-락트산이 생산되면서 pH가 자연적으로 떨어질 수 있게 했다. 각 균주의 발효 실험은 2회(duplicate) 발효였고, 평균 결과가 표 6에 요약된다.

도 19에 도시된 바와 같이, 발효 동안 JSS1397 배양물 중 유리 프럭토오스는 MYR2893보다 훨씬 더 낮았다. 또한, JSS1397 배양물 중 프럭토오스는 27시간 내에 완전히 소비되었고, 프럭토오스 소비 속도는 3.66 g L^-1 hr^-1이었다. 이는 프럭토오스가 3.28 g L^-1 hr^-1.의 프럭토오스 소비 속도로, 30시간차에 완전히 소비되었던 MYR2893의 것보다 더 빨랐다. 이 실험은 명확하게 ZrFFZ1 카세트를 갖는 세포가 L-락테이트 생산을 위한 당즙 발효에서 "프럭토오스 문제"를 해결할 수 있다는 것을 보여주었다.

실시예 8. 사카로마이세스 세레비시애 에탄올 발효에서 프럭토오스 문제의 해결.

사카로마이세스 세레비시애 효모 균주에 의해 당즙으로부터 유래된 당의 연료 및 음료용 에탄올로의 발효는 대규모로 수행된다. K. marxianus처럼, S. cerevisiae는 세포막의 외부로 수크로오스를 글루코오스 및 프럭토오스로 가수분해시키는 효소를 분비하고, 글루코오스 및 프럭토오스는 세포 내로 유입되고, 세포 내에서 해당 경로로 들어간다. S. cerevisiae의 경우, 분비된 효소는 특히 전화효소(invertase), 수크라아제(sucrase), 또는 수크로오스 가수분해효소(sucrose hydrolase)로 명명된다. S. cerevisiae가 고농도의 수크로오스를 함유한 배지에서 배양되면, 전화효소에 의한 세포외 글루코오스와 프럭토오스의 생산이 세포가 글루코오스 및 프럭토오스를 세포 내로 유입시키는 능력을 초과하여, 글루코오스 및 프럭토오스가 세포 외부에 축적된다. 발효가 진행되면서, 글루코오스가 프럭토오스보다 더 빨리 소비되고, 따라서, 모든 프럭토오스가 소비되도록 하기 위해 발효 시간이 연장되어야 한다. 이러한 현상은 하기 실험에서 실증된다.

상업적으로 입수가능한 양조용(distillery) 균주 Ethanol Red (LaSaffre Advanced Fermentations)를 미호기 진탕 플라스크(250 ml 엘렌마이어 중 100 ml, 80 rpm, 무 슬로싱(no sloshing))에서 34℃에서 2 X Yeast Nitrogen Base (Sigma-Aldrich) 및 12% w/v 수크로오스로 이루어진 배지로 배양했다. 수크로오스, 글루코오스, 및 프럭토오스 농도를 시간의 함수로 HPLC에 의해 측정했다 (도 9). 발효의 종료 시에, 글루코오스보다 훨씬 더 많은 프럭토오스가 남아 있어서, Ethanol Red가 "프럭토오스 문제"를 갖는다는 것이 명확했다.

종종 당즙 중 수크로오스는 처리 및/또는 보관 동안 가수분해된다. 예를 들면, 전화 당밀(high test molasses)의 생산에서, 당즙을 가열하고, 물을 증발시켜 농축된 믹스를 형성시킨다. 열로의 노출, 약한 산성 pH, 및 가능하게는 효소 때문에, 수크로오스의 상당한 양(large portion)이 글루코오스 및 프럭토오스로 가수분해된다. 그러한 믹스로부터 제조된 배지를 모사하기(simulate) 위해, 배지가 2 X Yeast Nitrogen Base + 6% w/v 글루코오스 및 6% w/v 프럭토오스였다는 것을 제외하고, 동일하게 전술된 실험을 반복했다. 결과가 도 10에 도시된다. 다시, 발효의 종료 시에, 글루코오스보다 많은 양의 프럭토오스가 남았고, 따라서, 출발 배지가 수크로오스를 포함할 때 뿐 아니라, 출발 배지가 글루코오스와 프럭토오스의 혼합물을 포함하는 경우에도 "프럭토오스 문제"가 존재한다.

그 후, S. cerevisiae의 프럭토오스 문제가 발현 카세트에 ZrFFZ1 유전자를 도입하는 것에 의해 해결된다는 것을 확인했다. S. cerevisiae에서 ZrFFZ1의 발현을 위해, S. cerevisiae MEL5 유전자로부터의 전사 종결자와 함께 강력한 구성적 ScADH1 프로모터로부터 ZrFFZ1 개방 해독 프레임을 발현하는 카세트를 작제하였다. 상기 카세트는 HO 좌위에 상동성인 약 1 kb의 플랭킹 DNA 서열을 도입하는 것에 의해 HO 좌위에서 통합되도록 설계되었다. 전술된 성분 DNA 서열 모두는 제조사의 프로토콜에 따라 Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)를 이용한 PCR에 의해 생성했다. 성분 DNA 서열들을 제조사의 프로토콜에 따라, NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs)를 이용하여 pRY789로 명명된, 대장균에서 복제하는 플라스미드로 조립했다. pRY789의 구조가 도 11에 도시되고, 전체 pRY789의 DNA 서열은 서열번호 6으로 표시된다. S. cerevisiae에 대해 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법, 형질전환 적격(competent) 세포의 제조 및 항생제 G418 내성을 제공하는 복제 플라스미드와 함께 선형 카세트 DNA의 공-형질전환의 조합에 의해 Ethanol Red의 HO 좌위에서 발현 카세트가 통합되었다(Gietz, 2014 #63); Rudolph, 1985 #80; US 6,214,577). 공급자의 프로토콜에 따라 Phire Plant PCR Master Mix (ThermoScientific)를 이용하여 개별적인 콜로니에 대한 진단적 PCR에 의해 올바른 통합체(integrant)를 확인했다.

ER+ZrFFZ1로 명명된, 결과적으로 수득된 균주를 이 실험에서 당이 완전히 소비되기 전에 중간 시간대에 더 많은 데이터를 편리하게 수집할 수 있도록, 온도를 26℃까지 낮추는 것을 제외하고, 전술된 바와 같이, 6% 글루코오스 및 6% 프럭토오스를 포함하는 2 X Yeast Nitrogen Base로 이루어진 배지로, 전술된 바와 같이 미호기 진탕 플라스크에서 부모 균주 Ethanol Red(ER)와 비교했다. 도 12에 도시된 바와 같이, 조작된 균주 ER+ZrFFZ1은 부모 균주보다 프럭토오스를 더 빨리 소비하고, 글루코오스를 더 느리게 소비했다. ER + ZrFFZ1에 의한 프럭토오스 이용의 개선은 보통이나(modest) 유의했다. 표시된 데이터는 Ethanol Red에 대한 2개의 플라스크의 평균 및 ER+ZrFFZ1에 대한 3개의(triplicate) 플라스크의 평균이다. 순 결과는 프럭토오스와 글루코오스가 조작된 균주에 의해 유사한 속도로 사용되어, 두 당이 거의 동시에 완전히 소비되었다는 것이다. 여기에서 확인된 패턴은 전술된 D-락테이트 또는 L-락테이트 생산을 위해 조작된 본 발명자들의 K. marxianus 균주의 것과 유사하다.

실시예 9. 프럭토오스의 인산화 속도의 증가

프럭토오스를 세포 내로 유입시키는 것의 병목을 해결하였으므로, 그 다음의 잠재적인 속도 결정 단계는 프럭토키나아제(EC 2.7.1.4) 또는 헥소키나아제(EC 2.7.1.1)와 같은 효소에 의한 프럭토오스-6-포스페이트를 생성하기 위한 프럭토오스의 인산화이다. K. marxianus는 2개의 고유한 헥소키나아제 유전자, GLK1 및 RAG5를 갖는다. 코딩된 효소는 글루코오스 및 프럭토오스를 인산화시킨다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(애기장대) 및 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)(토마토)과 같은 식물체는 잘 규명된 유전자, 예를 들면, 전용(dedicated) 프럭토키나아제를 코딩하는 AtFRK1-7 및 SlFRK1-4를 갖는다 (Stein, 2018 #88). 이러한 유전자들 중 하나로부터의 인트론-불포함 개방 해독 프레임을 (KmGLK1 및 KmRAG5의 경우 K. marxianus 게놈으로부터 또는 식물체 유전자의 경우 cDNA 클론으로부터) PCR에 의해 수득할 수 있거나, 또는 개방 해독 프레임(세포소기관 표적 서열 제외)을 gBlock(Integrated DNA Technologies)으로부터 합성하고 효모에서 강력한 구성적 프로모터로부터, 예를 들면, 해당 경로로의 프럭토오스의 유량(flux)을 증가시키기 위해, K. marxianus에서 KmPDC1 프로모터로부터 발현시킬 수 있다. 표적화된 염색체 통합 부위에서 유전자의 비-필수적 개방 해독 프레임이 정확하게 결실된 것인 L-락테이트 생산 효모로 발현 카세트를 통합시켰다. L-락테이트 생산 효모, KMS1019 (KMS1017 ura ^- ), JSS1398 (JSS1397 ura ^- ), 및 JSS1408 (JSS1407 ura ^- )을 부모 균주로 이용했다. 결과적으로, 표 7에 열거된 바와 같은 35종의 재조합 효모를 작제하였다. 각각의 재조합체에 대해, 2가지 변형을 포함하나, 실시예 7에 기재된 것과 동일한 실험 방법으로 pH-조절 5-리터 발효기에서 L-LAC 발효 및 당 소비의 성능을 결정했다. 첫째로, 이 실험에서 150 g/L 수크로오스를 포함하는 AM1S 배지를 사용했다. 둘째로, 발효의 개시 시에 pH를 3.5로 설정했다. 이는 보다 많은 L-락트산이 생산되면서 pH가 자연적으로 떨어질 수 있게 했다.

실험 동안, 본 발명자들은 JSS1408로부터 유래된 KmRAG5를 포함하는 세포, 소위 MYR3058 및 MYR3059의 예상치 못한 거동을 발견했다. 두 재조합 효모의 배양에서 유리 프럭토오스가 부모 균주의 배양과 비교하여 급격하게 감소했다. 이러한 거동을 확인하기 위해, JSS1407(JSS1408 URA⁺)과 유사한 유전적 배경을 갖는 JSS1397과 비교하여 발효 성능을 결정하기 위해 MYR3059를 선택하고 본 발명에서 성능을 입증하기 위해 사용했다. 본 실시예에서 전술된 동일한 실험 방법으로 pH 조절된 5-리터 발효기에서 발효를 수행하였다. 결과는 프럭토키나아제 유전자 (RAG5)를 갖는 효모 세포가 도 20에 도시된 바와 같이 프럭토오스 소비의 개선를 가졌고 및 도 21에 도시된 바와 같이 이 세포들의 L-LAC 생산 성능도 개선되었다는 것을 보여준다.

실시예 10. 프럭토오스-6-포스페이트의 인산화에 의해 프럭토오스-1, 6-비스포스페이트를 생성하는 속도의 증가

프럭토오스 대사에서 프럭토키나아제 다음의 단계는 프럭토오스-1,6-비포스페이트를 생성하는, 포스포프럭토키나아제 1(EC 2.7.1.11)에 의한 제2 인산화이다. K. marxianus에서, 야생형 포스포프럭토키나아제 1은 8량체이고, KmPFK1 및 KmPFK2 유전자에 의해 코딩된 2개의 동일하지 않은 서브유닛 각각의 4개의 카피로 이루어진다. 이 효소는 ATP에 의해 알로스테릭(allosterically)하게 억제된다. 유사한 효소를 갖는 S. cerevisiae에서, 과잉활성이고 ATP에 의한 억제에 저항성을 갖는 돌연변이 버전을 생성하는 방법이 알려져 있다(Lobo, 1982 #98; (odicio, 2000 #113). 이 돌연변이 버전은 L-락테이트 또는 D-락테이트와 같은 원하는 화합물의 생산을 증가시키기 위한 목적으로 해당(glycolysis)을 통한 유량을 증가시키 위해 간단한 유전 공학에 의해 K. marxianus 균주에 이식될 수 있다. 또한, 유사한 돌연변이가 K. marxianus PFK 유전자 또는 그의 동족체에 도입될 수 있다. 그러한 돌연변이, 특히, 프럭토오스 임포트 및/또는 프럭토키나아제 활성에 대한 증가된 능력을 갖는 균주에서의 돌연변이가 TCA(tricarboxylic acid cycle)로부터의 산물을 포함한, 해당 경로로부터 유래된 원하는 산물로의 유량을 증가시키는데 유용하다.

전술된 모든 실시예의 결과는 유전적으로 조작된 효모 세포가 본 발명의 요약에 기재된 바와 같이 프럭토오스 이용의 개선을 갖는 본 발명에서 발견된 프럭토오스 임포터로서 기능하는 하나 이상의 이종 DNA 카세트를 포함한다는 것을 반영한다.

참고문헌

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SEQUENCE LISTING <110> PTT Global Chemical Public Company Limited <120> MICROBIAL STRAINS ENGINEERED FOR IMPROVED FRUCTOSE UTILIZATION <130> 524821WO <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cassette for deleting the NEJ1 gene from Kluyveromyces marxianus. <400> 1 gtacttgctg gcgtatatgt gatacacaaa ctaaacctat ggggtccttt ataccaattc 60 gctaatcaag caacgggaca agcaactatg actttgaaac agactgtccg taatttggtg 120 cttgatgaag accctaagcc tgtatccaca gagaaatact ctggagattt gaaggccagg 180 aaagaagatc cttctaaaga gagtacccat ttataaggag caaatataaa acaacaaaat 240 agcaatcgca accacatatt agataggtct gtagactata tccaatgcac caaaatatgg 300 catcctattt cctgtgcctt atcactacat gatcattcgt ttagatcttt taactaatat 360 tgtatataac cattttttaa ggctgtagtt cttacaaact taaccttaaa aaacttagca 420 tgggaacctt acaaagacta ctacgctgaa agaaatagta acctaagcgc tagattcgga 480 tttccttgca aaaaggatat gtatttctaa ccttttcttc tagctctccg atcaagctgg 540 acctaattca gagcaccttt gtagccaagt gtgaaagaac 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cacagttaag 1440 ccgctaaagg cattatccgc caagtacaat tttttactct tcgaagacag aaaatttgct 1500 gacattggta atacagtcaa attgcagtac tctgcgggtg tatacagaat agcagaatgg 1560 gcagacatta cgaatgcaca cggtgtggtg ggcccaggta ttgttagcgg tttgaagcag 1620 gcggcagaag aagtaacaaa ggaacctaga ggccttttga tgttagcaga attgtcatgc 1680 aagggctccc tatctactgg agaatatact aagggtactg ttgacattgc gaagagcgac 1740 aaagattttg ttatcggctt tattgctcaa agagacatgg gtggaagaga tgaaggttac 1800 gattggttga ttatgacacc cggtgtgggt ttagatgaca agggagacgc attgggtcaa 1860 cagtatagaa ccgtggatga tgtggtctct acaggatctg acattattat tgttggaaga 1920 ggactatttg caaagggaag ggatgctaag gtagagggtg aacgttacag aaaagcaggc 1980 tgggaagcat atttgagaag atgcggccag caaaactaaa aaactgtatt ataagtaaat 2040 gcatgtatac taaactcaca aattagagct tcaatttaat tatatcagtt attacccggg 2100 aatctcggtc gtaatgattt ttataatgac gaaaaaaaaa aaattggaaa gaaaaagctt 2160 tctaaagagc ttctgaaagc ctcaacgaaa gaagaaggac taatagatac actgcaggac 2220 atatacacaa tattatcaga agaatccaat tctaagtttg agtcattggg 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aactgtccag acgctgactt gtccggttac 360 acccacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgtccaagc cgctcacatc 420 ccagctggta ccgacttggc tcaagtcgcc ccaatcttgt gtgccggtgt taccgtctac 480 aaggctttga agaccgctga ataaagcgtg aataatgaat ggccttgtat tcgttttttt 540 ccgagagaaa attaacaaga gcgaaaaaaa aaacgggctt cggtgaaaat cgggtgaata 600 tgcaactagc gggacgaatg ctctggaaat gcatatccta tgcaactagc gggatgaaca 660 aatctcaccc cagaattcgc aggaaaaaac aggaaaaaaa aaaagaaggc caccacggcc 720 acaaagacca caaagaccac aaaaaaaaac aaaaaacaac cgtcccagct tccagtgttt 780 ggaatactgg aacacaggaa gccgcataag agtgggcgtt gcacaggaag ccaggcccag 840 aagccccaga gttacttttt tttttttgtt ttttccttct gttcgctgtg cccgcatcag 900 atgatgcgcc tttatttacg atgccaatgc gaatagcacc agtgagagca ccagtaaaag 960 catacgcata cacatacaca catagagcaa gcaagcaggc tagcaaccag gaaaggctgc 1020 cagtgactgc tactgggtgt ctaagaaccg tagggcggat tattgttgcg gtggttggtt 1080 gcgggtggtt atgcgatggt acggtgcaga atcgtacggt gttgggttat ggaattagta 1140 tgggtatgtg atatgtggta atatgtgata ttgggttatt 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cassette from pJSS89 for integrating and expressing ZrFFZ1 by insertion in the middle of the KmADH6 ORF. <400> 3 cccggggatc ctctagagtc gagcggccgc cgaaagcatt gcgcttgtac ggtacactac 60 tgcatattcg gacgtggaaa cggcaagaaa aaaaagccag gaatgcaagt gcgggaataa 120 gctacgtacc gcacgctgta tacttgtgca ctagatgttt cttgtgcgct tcctatttgt 180 gcgtgaagac gtagagaaga ttatacaata caggtctcga gcgtgcgccg cgaatccagt 240 agattatgtc agaagagcaa atgggaagaa gcaaaagttg gtagggtaga gattatagat 300 gaggacgggt tttgatatga gagattagta attagtaatc acagagagag agagatggaa 360 tagaatgtct tagagacaca catgcacgtt tcacaatgtg taaaagtata aaaagaaggg 420 agcattgaat cttttcttgt caattgttta agctaatgta gttagtatga atttaaagag 480 cgtactacag taagctgata gatagaaggt atatccatac tttagccaaa taaagcgtga 540 ataatgaatg gccttgtatt cgtttttttc cgagagaaaa ttaacaagag cgaaaaaaaa 600 aacgggcttc ggtgaaaatc gggtgaatat gcaactagcg ggacgaatgc tctggaaatg 660 catatcctat gcaactagcg ggatgaacaa atctcacccc agaattcgca ggaaaaaaca 720 ggaaaaaaaa aaagaaggcc accacggcca caaagaccac aaagaccaca aaaaaaaaca 780 aaaaacaacc gtcccagctt ccagtgtttg gaatactgga acacaggaag ccgcataaga 840 gtgggcgttg cacaggaagc caggcccaga agccccagag ttactttttt ttttttgttt 900 tttccttctg ttcgctgtgc ccgcatcaga tgatgcgcct ttatttacga tgccaatgcg 960 aatagcacca gtgagagcac cagtaaaagc atacgcatac acatacacac atagagcaag 1020 caagcaggct agcaaccagg aaaggctgcc agtgactgct actgggtgtc taagaaccgt 1080 agggcggatt attgttgcgg tggttggttg cgggtggtta tgcgatggta cggtgcagaa 1140 tcgtacggtg ttgggttatg gaattagtat gggtatgtga tatgtggtaa tatgtgatat 1200 tgggttattg tgatttggaa tactgaatat cgaatatgga tatggaatat ggctatggca 1260 tggtatggta tgggatggga gtattctatt ttattttatt ctggttcctg cgtttagggt 1320 agggtaggaa gaaggtgagt gcttttgtat ataagtggag tgtctggatc agttttgtgg 1380 attgtgaatg ttagtttccc ctttaatgta tatttgtatt atttgctttt gagtactcaa 1440 taaccaagca caactactag ttttaaagga tccatcctct taaacagtac aaatcgcaaa 1500 gaaaagctcc acacccaaac caaataattg caatggtcaa aatagacgcc agtgcagatt 1560 tggactggaa taatttgcct ccccaacaga ggttgggtag aatcgttggt ggaaaatata 1620 ttgaaaccgt gcacatggat gagtcatcac cagaagccat ggagcgtcca atgacaaaag 1680 tcgagtgtga tatcccatta acttatactg aatctgtgga aaaggacggc aaagaatggg 1740 taatgttaac ttttgcacca ggtgatccag aaaacccatt taattggagt cttagattga 1800 aatggtttct aacgacttta ctgtgcctaa tgacactttt catcggtcta gccaccacgg 1860 cttatattct ggtatagaca gaatggcaaa acactttaac agttcttcgg aagttggtca 1920 gttgggtctt ttcaccttca atgaaacatg ttccattgca cctttgtttc tagcgccatt 1980 ctgtgaattg gttggtagaa aggtgattta caccggtggt tatctttgct tctgtctttg 2040 tttcatcggt cttgcattag gtaaaaatat ggccactatc atttgtttgc gtgcttgttt 2100 aggtttgttt ggttgcattg gtaccattct tgttggtggt actttcgacg atatgtttgt 2160 tgcagatgaa agagctattc ctatggctct gtttgcatat gttgctatcc tgggtaccgt 2220 gggtgctcca atctatgcag gttttattga tcaagccatt ggctggcgtt ggattgaagg 2280 tatccaaggg ttatctaatg ttccattgtt gattatcatc tttttatttt tcaaagaaac 2340 tcgtggtggt gtcaccttgc aaaagagggc caagtctcta cgtaaagata ccggtgatga 2400 gagatgggtg 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acgagctgta cttcccgagc tggtttctcc aaacagccaa tgatcatacc 4140 aagatctgat gtatggcaac gttgttcacg tttgacatac gcagtatggt tgacaagaat 4200 cagggctctc aagctcagtt gagcggtttc cgggtcaaat tgctatgaat tcagtgatga 4260 gaattaatgc aactcccttc tttgtgacta gttcctacac tcaattgaaa cacggcatga 4320 gaattataaa actctaaagc aggtctaaac ttatactttg catgtcgttg catttccccc 4380 gtcttctaaa aaacataacc ctttcaatta tacttatata taatataata tgaattcgtc 4440 attctatgca gcattattat acagatccag atacaaatac gaagccattt tacaaaaaaa 4500 aaaaagatta tactacaaaa gttttgaagt agaatcgtaa gctttttctt tccaattttt 4560 tttttttcgt cattataaaa atcattacga ccgagattcc cgggtaataa ctgatataat 4620 taaattgaag ctctaatttg tgagtttagt atacatgcat ttacttataa tacagttttt 4680 tagttttgct ggccgcatct tctcaaatat gcttcccagc ctgcttttct gtaacgttca 4740 ccctctacct tagcatccct tccctttgca aatagtcctc ttccaacaat aataatgtca 4800 gatcctgtag agaccacatc atccacggtt ctatactgtt gacccaatgc gtctcccttg 4860 tcatctaaac ccacaccggg tgtcataatc aaccaatcgt aaccttcatc tcttccaccc 4920 atgtctcttt gagcaataaa gccgataaca aaatctttgt cgctcttcgc aatgtcaaca 4980 gtacccttag tatattctcc agtagatagg gagcccttgc atgacaattc tgctaacatc 5040 aaaaggcctc taggttcctt tgttacttct tctgccgcct gcttcaaacc gctaacaata 5100 cctgggccca ccacaccgtg tgcattcgta atgtctgccc attctgctat tctgtataca 5160 cccgcagagt actgcaattt gactgtatta ccaatgtcag caaattttct gtcttcgaag 5220 agtaaaaaat tgtacttggc ggataatgcc tttagcggct taactgtgcc ctccatggaa 5280 aaatcagtca agatatccac atgtgttttt agtaaacaaa ttttgggacc taatgcttca 5340 actaactcca gtaattcctt ggtggtacga acatccaatg aagcacacaa gtttgtttgc 5400 ttttcgtgca tgatattaaa tagcttggca gcaacaggac taggatgagt agcagcacgt 5460 tccttatatg tagctttcga catgatttat cttcgtttcc tgcaggtttt tgttctgtgc 5520 agttgggtta agaatactgg gcaatttcat gtttcttcaa cactacatat gcgtatatat 5580 accaatctaa gtctgtgctc cttccttcgt tcttccttct gttcggagat taccgaatca 5640 aaaaaatttc aaagaaaccg aaatcaaaaa aaagaataaa aaaaaaatga tgaattgacg 5700 tgttggtgtt ggtgcgcaag tcagatcctg tttggaatgt agacgttgta aggaggacaa 5760 cgaaccatac tgtccaaagt tcgtcactac ttactcgcaa ccatacccag aagatggtta 5820 cgtttcccaa ggtggttacg cctctcatat cagattgcat gagcactttg ccattccaat 5880 cccagaatct ctagaagccg cttacactgc tcctctactt tgcggtggtg gtactgtcta 5940 ctctccattg aagagatacg gctgtggtcc aggtaagaag gttggtatcg tcggtatcgg 6000 tggtattggt cacatgggta tccttttggc caaggctatg ggtgctgaag tttacgccat 6060 ctccagatct cacgctaaag aagaagctgc caagaaattg ggtgctgacc actacattgc 6120 taccaaggat gaaggctggg aattggaaaa ctttgacaaa ttggacttga tcgttctatg 6180 tgccagctcc ttgaccgagc ggccgcgccg ggtcacccgg ccagcgac 6228 <210> 4 <211> 6094 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cassette from pJSS90 for integrating and expressing ZrFFZ1 with simultaneous deletion of the KmADH6 ORF. <400> 4 cccggggatc ctctagagtc gagcggccgc tttgatatga gagattagta attagtaatc 60 acagagagag agagatggaa tagaatgtct tagagacaca catgcacgtt tcacaatgtg 120 taaaagtata aaaagaaggg agcattgaat cttttcttgt caattgttta agctaatgta 180 gttagtatga atttaaagag cgtactacag taagctgata gatagaaggt atatccatac 240 tttagccaaa tagtcaaata atgtcctacc cagatagttt ccaaggtttc gctgtcgtta 300 atgaccacaa gaactggttg aacccagaaa agatcgttta cccagccaag aagttcggtc 360 ctcaagacgt tgatgtcgag atcgaagctt gcggtgtttg tggtagtgat gtccattgtg 420 ccaacggtaa ctggggtaat caaaagttgc cattagttgt tggtcacgaa gtcatcggta 480 aggttatcag agttggtgaa gaatgtacca ctggtatcaa ggttggtgac taaagcgtga 540 ataatgaatg gccttgtatt cgtttttttc cgagagaaaa ttaacaagag cgaaaaaaaa 600 aacgggcttc ggtgaaaatc gggtgaatat gcaactagcg ggacgaatgc tctggaaatg 660 catatcctat gcaactagcg ggatgaacaa atctcacccc agaattcgca ggaaaaaaca 720 ggaaaaaaaa aaagaaggcc accacggcca caaagaccac aaagaccaca aaaaaaaaca 780 aaaaacaacc gtcccagctt ccagtgtttg gaatactgga acacaggaag ccgcataaga 840 gtgggcgttg cacaggaagc caggcccaga agccccagag ttactttttt ttttttgttt 900 tttccttctg ttcgctgtgc ccgcatcaga tgatgcgcct ttatttacga tgccaatgcg 960 aatagcacca gtgagagcac cagtaaaagc atacgcatac acatacacac atagagcaag 1020 caagcaggct agcaaccagg aaaggctgcc agtgactgct actgggtgtc taagaaccgt 1080 agggcggatt attgttgcgg tggttggttg cgggtggtta tgcgatggta cggtgcagaa 1140 tcgtacggtg ttgggttatg gaattagtat gggtatgtga tatgtggtaa tatgtgatat 1200 tgggttattg tgatttggaa tactgaatat cgaatatggg atatggaata tggctatggc 1260 atggtatggt atgggatggg agtattctat tttattttat tcggttcctg cgtttagggt 1320 agggtaggaa gaaggtgagt gcttttgtat ataagtggag tgtctggatc agttttgtgg 1380 attgtgaatg ttagtttccc ctttaatgta tatttgtatt atttgctttt gagtactcaa 1440 taaccaagca caactactag ttttaaagga tccatcctct taaacagtac aaatcgcaaa 1500 gaaaagctcc acacccaaac caaataattg caatggtcaa aatagacgcc agtgcagatt 1560 tggactggaa taatttgcct ccccaacaga ggttgggtag aatcgttggt ggaaaatata 1620 ttgaaaccgt gcacatggat gagtcatcac cagaagccat ggagcgtcca atgacaaaag 1680 tcgagtgtga tatcccatta acttatactg aatctgtgga aaaggacggc aaagaatggg 1740 taatgttaac ttttgcacca ggtgatccag aaaacccatt taattggagt cttagattga 1800 aatggtttct aacgacttta ctgtgcctaa tgacactttt catcggtcta gccaccacgg 1860 cttatagttc tggtatagac agaatggcaa aacactttaa cagttcttcg gaagttggtc 1920 agttgggtct tttcaccttc aatgaaacat gttccattgc acctttgttt ctagcgccat 1980 tctgtgaatt ggttggtaga aaggtgattt acaccggtgg ttatctttgc ttctgtcttt 2040 gtttcatcgg tcttgcatta ggtaaaaata tggccactat catttgtttg cgtgcttgtt 2100 taggtttgtt tggttgcatt ggtaccattc ttgttggtgg tactttcgac gatatgtttg 2160 ttgcagatga aagagctatt cctatggctc tgtttgcata tgttgctatc ctgggtaccg 2220 tgggtgctcc aatctatgca ggttttattg atcaagccat tggctggcgt tggattgaag 2280 gtatccaagg gttatctaat gttccattgt tgattatcat ctttttattt ttcaaagaaa 2340 ctcgtggtgg tgtcaccttg caaaagaggg ccaagtctct acgtaaagat accggtgatg 2400 agagatgggt gtccaaggaa gaattggagg ctcctggtct taaggatgct ctttacaact 2460 cctctgttaa ggctattaag atgttaatct ccgagcccgt ggtgtttttc tttggtcttt 2520 ggatcagttt cgcatggttc ctaacctttt tgtttttgtc tgttatcggt attactttct 2580 cacactttaa gcactggagt gaaggtgttg caggtttacc ttatatctcc cttgttattg 2640 gtgttaccat tggattctta accaactttt tgcaaattcg caaatacgaa aatatgagaa 2700 agaagtcaaa gtatccttta ccacctgaaa accgtttata tggtgctatg actggtgccg 2760 tgtttttacc tattggtctt atgatctact ctttcactca ataccactgg ttgcactgga 2820 tcggtcctaa catcggtttg gcatgcatct ctctcggtat cttcttcatc ttcgaatcct 2880 gttattccta cacttcggat tgttatggtc ctgatgcttc ttccgccatt gcaggtcaag 2940 gtttcatgcg taatacttta ggtgccgttt caccattgtt tggtaagtac atgttcttaa 3000 acatgcacag tcaatgggcc ggcctgttgt gtagtctcgt ggctttcggt ttgacattgt 3060 tgcccttcgt cctttacaaa tttggtcctg caatccgtgc cagatctaag cgtgctattg 3120 tgtaccatgg tgaagaagac gatgaagatg acgaaattgc tgaacagcaa agtagctcaa 3180 gtactggagg aggcagatct ttgcaagatg atgctcacgt tgaaaatgct aacaacaacc 3240 agttattcga aaagaacgaa ggttctcgtg aatctgattc tccagagact gctagagaga 3300 ctgattccct atcaccttcc gaaaaggtag ataaccatgc tggagtatct cgtagcgtgg 3360 aagaacactc agataccgtt tctgaaagtg aattacatgg ccatactggt cgtgcatgaa 3420 cgttgtcatt ttcatttcat ttcatttcat aacatttctg ttttcatttg tctttttttc 3480 tgttattata attaacaaac gagaatggat cttataaatt cgtaacgatg gccttcatac 3540 cacaattcca tctgaattac taacactatt aactttatat ttttctttct gtctaacgaa 3600 cggtgtaaag catatgataa taaattcgtc cggcgtagag gatcctcaat tcatcatttt 3660 ttttttattc ttttttttga tttcggtttc tttgaaattt ttttgattcg gtaatctccg 3720 aacagaagga agaacgaagg aaggagcaca gacttagatt ggtatatata cgcatatgta 3780 gtgttgaaga aacatgaaat tgcccagtat tcttaaccca actgcacaga acaaaaacct 3840 gcaggaaacg aagataaatc atgtcgaaag ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc 3900 ctagtcctgt tgctgccaag ctatttaata tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg 3960 cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat tactggagtt agttgaagca ttaggtccca 4020 aaatttgttt actaaaaaca catgtggata tcttgactga tttttccatg gagggcacag 4080 ttaagccgct aaaggcatta tccgccaagt acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat 4140 ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc agtactctgc gggtgtatac agaatagcag 4200 aatgggcaga cattacgaat gcacacggtg tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga 4260 agcaggcggc agaagaagta acaaaggaac ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt 4320 catgcaaggg ctccctatct actggagaat atactaaggg tactgttgac attgcgaaga 4380 gcgacaaaga ttttgttatc ggctttattg ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag 4440 gttacgattg gttgattatg acacccggtg tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg 4500 gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg tctctacagg atctgacatt attattgttg 4560 gaagaggact atttgcaaag ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag 4620 caggctggga agcatatttg agaagatgcg gccagcaaaa ctaaacgttg tcattttcat 4680 ttcatttcat ttcataacat ttctgttttc atttgtcttt ttttctgtta ttataattaa 4740 caaacgagaa tggatcttat aaattcgtaa cgatggcctt cataccacaa ttccatctga 4800 attactaaca ctattaactt tatatttttc tttctgtcta acgaacggtg taaagcatat 4860 gataataaat taactatata ggttttaaaa aaagtataga acgaacttaa atgatatcag 4920 gataattgaa gatgtttttt tttacttttt gtttgcttat atattacaaa tataatggga 4980 ggggtacgga gataaaactg taagcgggaa caatggttgt aaacgtcaaa cttcatgact 5040 ccaacaagtt agacttttgc gtagcgtctg cacctgaaaa tccggggccg ataccaacaa 5100 gctaacacta acaaatactg tagagacacg gtacctagca agttcctaga cacataaaca 5160 gacaatctag tacacacgga agccagacaa ccgctacagg cactacttac gttatctgca 5220 tttatcctaa tgaggcaaaa atctagaaac catggagact accccgcgat taaaggcgat 5280 taaaagaaag taccacaacg tagaacagag ccgaacttaa agtggaacag gtgtctacga 5340 gctgtacttc ccgagctggt ttctccaaac agccaatgat cataccaaga tctgatgtat 5400 ggcaacgttg ttcacgtttg acatacgcag tatggttgac aagaatcagg gctctcaagc 5460 tcagttgagc ggtttccggg tcaaattgct atgaattcag tgatgagaat taatgcaact 5520 cccttctttg tgactagttc ctacactcaa ttgaaacacg gcatcgtgtt ggtgttggtg 5580 cgcaagtcag atcctgtttg gaatgtagac gttgtaagga ggacaacgaa ccatactgtc 5640 caaagttcgt cactacttac tcgcaaccat acccagaaga tggttacgtt tcccaaggtg 5700 gttacgcctc tcatatcaga ttgcatgagc actttgccat tccaatccca gaatctctag 5760 aagccgctta cactgctcct ctactttgcg gtggtggtac tgtctactct ccattgaaga 5820 gatacggctg tggtccaggt aagaaggttg gtatcgtcgg tatcggtggt attggtcaca 5880 tgggtatcct tttggccaag gctatgggtg ctgaagttta cgccatctcc agatctcacg 5940 ctaaagaaga agctgccaag aaattgggtg ctgaccacta cattgctacc aaggatgaag 6000 gctgggaatt ggaaaacttt gacaaattgg acttgatcgt tctatgtgcc agctccttga 6060 ccgagcggcc gcgccgggtc acccggccag cgac 6094 <210> 5 <211> 6398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pMS155 containing the integration cassette for swapping in the PaldhL expression cassette to replace the EcldhA expression cassette at any of the three loci. <400> 5 agcatacgca tacacataca cacatagagc aagcaagcag gctagcaacc aggaaaggct 60 gccagtgact gctactgggt gtctaagaac cgtagggcgg attattgttg cggtggttgg 120 ttgcgggtgg ttatgcgatg gtacggtgca gaatcgtacg gtgttgggtt atggaattag 180 tatgggtatg tgatatgtgg taatatgtga tattgggtta ttgtgatttg gaatactgaa 240 tatcgaatat gggatatgga atatggctat ggcatggtat ggtatgggat gggagtattc 300 tattttattt tattctggtt cctgcgttta gggtagggta ggaagaaggt gagtgctttt 360 gtatataagt ggagtgtctg gatcagtttt gtggattgtg aatgttagtt tcccctttaa 420 tgtatatttg tattatttgc ttttgagtac tcaataccaa gcacaactac tagttttaaa 480 ggatccatcc tcttaaacag tacaaatcgc aaagaaaagc tccacaccca aaccaaataa 540 ttgcaatgtc taatattcaa aatcatcaaa aagttgtcct cgtcggtgac ggtgccgtag 600 gttctagtta cgcattcgcg atggcactac aaggaatcgc tgaagaattc gtcattgtcg 660 acgttgttaa ggatcgtaca gttggggacg cattggacct tgaagatgct actccattca 720 cagctccaaa gaacatctac tctggtgaat actcagactg caaggatgct gacttagttg 780 ttatcacagc tggcgcacca caaaagccag gtgaaacacg tcttgacctt gttaacaaga 840 acttaaacat cctttcaacg attgttaaac cagttgttga ttctggtttt gatggtatct 900 tccttgttgc tgctaaccca gttgatatcc ttacttacgc aacatggaaa ttctctggct 960 tccctaagga aaaagttatc ggttcaggta tctcacttga cacagctcgt ttgcgcgtag 1020 ctcttggtaa gaaattcaac gttagcccag aatctgtaga tgcttacatc ttaggtgaac 1080 atggtgacag tgaatttgct gcttactcat cagctacaat cggtacaaag ccattgcttg 1140 aaatcgctaa agaagaaggc gtttcaactg acgaattggc tgaaatcgaa gacagcgtac 1200 gtaacgcagc ttacgaaatc atcaacaaga agggtgctac attctacggt gttggtactg 1260 cattgatgcg catttctaaa gcaattcttc gcgacgaaaa cgccgtattg cctgttggtg 1320 catacatgga tggcgaatat ggtttgaacg acatttacat tggtactcct gcagttatca 1380 atggtcaagg tctaaaccgc gttatcgaag caccacttag cgatgacgaa aagaagaaga 1440 tgactgactc agcaactact ttgaagaagg ttcttactga cggtctaaac gctcttgctg 1500 aaaaacaaga caaataaggc gcgggagatt gataagactt ttctagttgc atatctttta 1560 tatttaaatc ttatctatta gttaattttt tgtaatttat ccttatatat agtctggtta 1620 ttctaaaata tcatttcagt atctaaaaat tcccctcttt tttcagttat atcttaacag 1680 gcgacagtcc aaatgttgat ttatcccagt ccgattcatc agggttgtga agccaatact 1740 gccatttcaa agaatacgta aataattaat agtagtgatt ttcctaactt tatttagtca 1800 aaaaattagc cttttaattc tgctgtaacc cgtacatgcc caaaataggg ggcgggttac 1860 acagaatata taacatcgta ggtgtctggg tgaacagttt attcctggca tccactaaat 1920 ataatggagc ccgcttttta agctggcatc cagaaaaaaa aagaatccca gcaccaaaat 1980 attgttttct tcaccaacca tcagttcata ggtccattct cttagcgcaa ctacagagaa 2040 caggggcaca aacaggcaaa aaacgggcac aacctcaatg gagtgatgca acctgcctgg 2100 agtaaatgat gacacaaggc aattgaccca cgcatgtatc tatctcattt tcttacacct 2160 tctattacct tctgctctct ctgatttgga aaaagctgaa aaaaaaggtt gaaaccagtt 2220 ccctgaaatt attcccctac ttgactaata agtatataaa gacggtaggt attgattgta 2280 attctgtaaa tctatttctt aaacttctta aattctactt ttatagttag tctttttttt 2340 agttttaaaa caccaagaac ttagtttcga ataaacacac ataaacaaac aaaatgtcga 2400 ctaagagtta ctcggaaaga gcagctgctc atagaagtcc agttgctgcc aagcttttaa 2460 acttgatgga agagaagaag tcaaacttat gtgcttctct tgatgttcgt aaaacagcag 2520 agttgttaaa attagtcgag gttttgggtc catatatctg tctattgaag acacatgtag 2580 atatcttgga ggatttcagc tttgagaata ccattgtgcc gttgaagcaa ttagcagaga 2640 aacacaagtt tttgatattt gaagacagga agtttgccga cattgggaac actgttaaat 2700 tacaatacac gtctggtgta taccgtatcg ccgaatggtc tgatatcacc aatgcacacg 2760 gtgtgactgg tgcgggcatt gttgctggtt tgaagcaagg tgccgaggaa gttacgaaag 2820 aacctagagg gttgttaatg cttgccgagt tatcgtccaa ggggtctcta gcgcacggtg 2880 aatacactcg tgggaccgtg gaaattgcta agagtgataa ggactttgtt attggattta 2940 ttgctcaaaa cgatatgggt ggaagagaag agggctacga ttggttgatc atgacgccag 3000 gtgttggtct tgatgacaaa ggtgatgctt tgggacaaca atacagaact gtggatgaag 3060 ttgttgccgg tggatcagac atcattattg ttggtagagg tcttttcgca aagggaagag 3120 atcctgtagt ggaaggtgag agatacagaa aggcgggatg ggacgcttac ttgaagagag 3180 taggcagatc cgcttaatca tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctccccc 3240 cacatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta 3300 tttttttata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt ttcttttttt 3360 tctgtacaga cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt 3420 gggacgctcg aaggctttaa tttgcgtgat gctaacttct ctctggaagg tctgaccggc 3480 tttactatgt atggcaaaac ggcaggcgtt atcggtaccg gtaaaatcgg tgtggcgatg 3540 ctgcgcattc tgaaaggttt tggtatgcgt ctgctggcgt tcgatccgta tccaagtgca 3600 gcggcgctgg aactcggtgt ggagtatgtc gatctgccaa ccctgttctc tgaatcagac 3660 gttatctctc tgcactgccc gctgacaccg gaaaactatc atctgttgaa cgaagccgcc 3720 ttcgaacaga tgaaaaatgg cgtgatgatc gtcaatacca gtcgcggtgc attgattgat 3780 tctcaggcag caattgaagc gctgaaaaat cagaaaattg gttcgttggg tatggacgtg 3840 tatgagaacg aacgcgatct attctttgaa gataaatcca acgacgtgat ccaggatgac 3900 gtattccgtc gcctgtctgc ctgccacaac gtgctgttta ccgggcacca ggcattcctg 3960 acagcagaag ctctgaccag tatttctcag actacgctgc aaaacttaag caatctggaa 4020 aaaggcgaaa cctgcccgaa gaactggtct accctgtgga acacctacat ctgtattaac 4080 gaagcgctaa ccgtttttat caggctctgg gaggcagaat aaatgatcat atcgtcaatt 4140 attacctcca cggggagagc ctgagcaaac tggcctcagg catttgagaa gcacacggtc 4200 acactgcttc cggtagtcaa taaaccggta aaccagcaat agacataagc ggctatttaa 4260 cgaccctgcc ctgaaccgac gaccgggtcg aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc 4320 gcttattatc acttattcag gcgtagcacc aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta 4380 aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 4440 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 4500 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 4560 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 4620 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 4680 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 4740 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 4800 cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag 4860 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 4920 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 4980 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 5040 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 5100 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 5160 tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc 5220 tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc 5280 caacttactg atttagtgta tgatggtgtt tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta 5340 tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg 5400 gacatcagcg ctagcggagt gtatactggc ttactatgtt ggcactgatg agggtgtcag 5460 tgaagtgctt catgtggcag gagaaaaaag gctgcaccgg tgcgtcagca gaatatgtga 5520 tacaggatat attccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg 5580 cgagcggaaa tggcttacga acggggcgga gatttcctgg aagatgccag gaagatactt 5640 aacagggaag tgagagggcc gcggcaaagc cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca 5700 agcatcacga aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 5760 accaggcgtt tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta 5820 ccggtgtcat tccgctgtta tggccgcgtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc 5880 gggtaggcag ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc 5940 tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccacccgga aagacatgca aaagcaccac 6000 tggcagcagc cactggtaat tgatttagag gagttagtct tgaagtcatg cgccggttaa 6060 ggctaaactg aaaggacaag ttttggtgac tgcgctcctc caagccagtt acctcggttc 6120 aaagagttgg tagctcagag aaccttcgaa aaaccgccct gcaaggcggt tttttcgttt 6180 tcagagcaag agattacgcg cagaccaaaa cgatctcaag aagatcatct tattaatcag 6240 ataaaatatt tctagatttc agtgcaattt atctcttcaa atgtagcacc tgaagtcagc 6300 cccatacgat ataagttgta attctcatgt ttgacagctt atcatcgata agctttaatg 6360 cggtagttta tcacagttaa attgctaacg cagtcagg 6398 <210> 6 <211> 8515 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pRY789 containing a ZrFFZ1 expression cassette for integration at the HO locus of Saccharomyces cerevisiae. <400> 6 tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 60 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 120 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 180 ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat 240 ggccgcggac agcatcaaac tgtaagattc cgccacattt tatacactct ggtcctttaa 300 ctggcaaacc ttcgggcgta atgcccaatt tttcgccttt gtcttttgcc tttttcactt 360 cacgtgcttc tggtacatac ttgcaattta tacagtgatg accgctgaat ttgtatcttc 420 catagcatct agcacatact cgatttttac cactccaatc tttataaaaa tacttgattc 480 cctttctggg acaagcaaca cagtgtttta gattcttttt ttgtgatatt ttaagctgtt 540 ctcccacaca gcagcctcga catgatttca cttctatttt gttgccaagc aagaaatttt 600 tatggccttc tatcgtaagc ccatatacag tactctcacc ctggaaatca tccgtgaagc 660 tgaaatatac gggttccctt tttataattg gcggaacttc tcttgttttg tgaccacttc 720 gacaatatga caaaacattc tgtgaagttg ttcccccagc aacattacag tcgtatgtaa 780 attgacattg gacttttctt ccttcaatga tttcctccct agctgacctg gtcgtcacag 840 tagctgacat accaagagat cttgaaatat ggacaattcc gtccataatg gatgaataaa 900 cagtttgaat tgctatttta taagattcag ggccttcgcc ctttttcaca acgtacccat 960 ctgagtcgat caagccggct aagaatgctt cacgaacttc tatatgctcg ccgtacataa 1020 attcagggat ttgcttctct ccatcaagat cccttttaaa ctttaaaatt gtgacagctt 1080 tccagaatgg attatttttc ctcaaattcc ttgtcttcct gttttcatct ggaccatctc 1140 cataatgaag ccttacatgt ttggcacgta gcggaacgtg atcgtcacaa accgtaaggt 1200 agagacccca gattttcgca ttttctctta aactctccat tagcttagga tccaagctat 1260 ctactgagat ttctggctct tttgttgtac tgtcacctaa ccacagaccc agcgtgaata 1320 atgaatggcc ttgtattcgt ttttttccga gagaaaatta acaagagcga aaaaaaaaac 1380 gggcttcggt gaaaatcggg tgaatatgca actagcggga cgaatgctct ggaaatgcat 1440 atcctatgca actagcggga tgaacaaatc tcaccccaga attcgcagga aaaaacagga 1500 aaaaaaaaaa gaaggccacc acggccacaa agaccacaaa gaccacaaaa aaaaacaaaa 1560 aacaaccgtc ccagcttcca gtgtttggaa tactggaaca caggaagccg cataagagtg 1620 ggcgttgcac aggaagccag gcccagaagc cccagagtta cttttttttt tttgtttttt 1680 ccttctgttc gctgtgcccg catcagatga tgcgccttta tttacgatgc caatgcgaat 1740 agcaccagtg agagcaccag taaaagcata cgcatacaca tacacacata gagcaagcaa 1800 gcaggctagc aaccaggaaa ggctgccagt gactgctact gggtgtctaa gaaccgtagg 1860 gcggattatt gttgcggtgg ttggttgcgg gtggttatgc gatggtacgg tgcagaatcg 1920 tacggtgttg ggttatggaa ttagtatggg tatgtgatat gtggtaatat gtgatattgg 1980 gttattgtga tttggaatac tgaatatcga atatgggata tggaatatgg ctatggcatg 2040 gtatggtatg ggatgggagt attctatttt attttattct ggttcctgcg tttagggtag 2100 ggtaggaaga aggtgagtgc ttttgtatat aagtggagtg tctggatcag ttttgtggat 2160 tgtgaatgtt agtttcccct ttaatgtata tttgtattat ttgcttttga gtactcaata 2220 accaagcaca actactagtt ttaaaggatc catcctctta aacagtacaa atcgcaaaga 2280 aaagctccac acccaaacca aataattgca atggtcaaaa tagacgccag tgcagatttg 2340 gactggaata atttgcctcc ccaacagagg ttgggtagaa tcgttggtgg aaaatatatt 2400 gaaaccgtgc acatggatga gtcatcacca gaagccatgg agcgtccaat gacaaaagtc 2460 gagtgtgata tcccattaac ttatactgaa tctgtggaaa aggacggcaa agaatgggta 2520 atgttaactt ttgcaccagg tgatccagaa aacccattta attggagtct tagattgaaa 2580 tggtttctaa cgactttact gtgcctaatg acacttttca tcggtctagc caccacggct 2640 tatagttctg gtatagacag aatggcaaaa cactttaaca gttcttcgga agttggtcag 2700 ttgggtcttt tcaccttcaa tgaaacatgt tccattgcac ctttgtttct agcgccattc 2760 tgtgaattgg ttggtagaaa ggtgatttac accggtggtt atctttgctt ctgtctttgt 2820 ttcatcggtc ttgcattagg taaaaatatg gccactatca tttgtttgcg tgcttgttta 2880 ggtttgtttg gttgcattgg taccattctt gttggtggta ctttcgacga tatgtttgtt 2940 gcagatgaaa gagctattcc tatggctctg tttgcatatg ttgctatcct gggtaccgtg 3000 ggtgctccaa tctatgcagg ttttattgat caagccattg gctggcgttg gattgaaggt 3060 atccaagggt tatctaatgt tccattgttg attatcatct ttttattttt caaagaaact 3120 cgtggtggtg tcaccttgca aaagagggcc aagtctctac gtaaagatac cggtgatgag 3180 agatgggtgt ccaaggaaga attggaggct cctggtctta aggatgctct ttacaactcc 3240 tctgttaagg ctattaagat gttaatctcc gagcccgtgg tgtttttctt tggtctttgg 3300 atcagtttcg catggttcct aacctttttg tttttgtctg ttatcggtat tactttctca 3360 cactttaagc actggagtga aggtgttgca ggtttacctt atatctccct tgttattggt 3420 gttaccattg gattcttaac caactttttg caaattcgca aatacgaaaa tatgagaaag 3480 aagtcaaagt atcctttacc acctgaaaac cgtttatatg gtgctatgac tggtgccgtg 3540 tttttaccta ttggtcttat gatctactct ttcactcaat accactggtt gcactggatc 3600 ggtcctaaca tcggtttggc atgcatctct ctcggtatct tcttcatctt cgaatcctgt 3660 tattcctaca cttcggattg ttatggtcct gatgcttctt ccgccattgc aggtcaaggt 3720 ttcatgcgta atactttagg tgccgtttca ccattgtttg gtaagtacat gttcttaaac 3780 atgcacagtc aatgggccgg cctgttgtgt agtctcgtgg ctttcggttt gacattgttg 3840 cccttcgtcc tttacaaatt tggtcctgca atccgtgcca gatctaagcg tgctattgtg 3900 taccatggtg aagaagacga tgaagatgac gaaattgctg aacagcaaag tagctcaagt 3960 actggaggag gcagatcttt gcaagatgat gctcacgttg aaaatgctaa caacaaccag 4020 ttattcgaaa agaacgaagg ttctcgtgaa tctgattctc cagagactgc tagagagact 4080 gattccctat caccttccga aaaggtagat aaccatgctg gagtatctcg tagcgtggaa 4140 gaacactcag ataccgtttc tgaaagtgaa ttacatggcc atactggtcg tgcatgaaat 4200 atctatatca caagatggac tcaatgttga gcaaagcagg acgagaaaaa aaaaaataat 4260 gattgttaag aagttcatga aaaaaaaaag aaaaaatact caaatactta taacagagtg 4320 attaaataat aaacgacagt ataccctatc aggtattcag atagttttat ttttgtaggt 4380 atataatctg aagcctttga actattttct cgtatatatc atggagtata cattgcatta 4440 gcaacattac atactagtga cttttgagaa gtggcttttg gtttctcaat tttttgaagg 4500 aaacatcctt ggacctgtgg caactcctcc aataattctt cgaagttatg ttgaactttt 4560 cgtggtttca cacctaataa cgcccagcgg tagtacaatt caaagtagta ggtaccaatg 4620 gtagtactag tgggtgatag tagcaaattt ctctatgaaa atgaattgtt gctctgcaat 4680 gatgttaatg tggacatgac atgaattttc gcgatatgtt gatgtaaata ataacatgat 4740 tttcgtggat catttcgtaa accataggtt tatttcgtga attactaaga gaaaggcata 4800 gaaacaggac ttgcgaaccc tttctgtaat atgtcataat atttcaatac acgcacaaaa 4860 aaggtacgtt aatttccatg gtaatcgtgt atttagttac atcacttttc gtgacacaca 4920 tgaatacatt tgcccttaag ccctgtgtag gattgatttc ttttttcgtg acgcacatgt 4980 cttcaactgc atcaatttcc atgagacaca cacgtctacc atgttgtcag atctcatgaa 5040 tctttcatgt attcattcac atcattttcg tggatcctct aattgtatcg agatcacttt 5100 tcgtgatccg ctaatcagcg acggtcacat taggtttgcc aagtcagggt atgaaccata 5160 cgatcagttt tcgtgaacct ggtacgtata ttgtggcgtt tgtgtatatt ttcattcttt 5220 gacaacaatc aataccaacc tcaaatagga aaagtaataa gtttggcgtt acaccccaaa 5280 agacgccaaa cggatcgaac ttactcaata gcaattagcg agacaaaacc tacgttaaga 5340 cctgtaaccg atttatcaaa gcactctgcg gttctttctt gggaatatta cctggacatt 5400 ttgtgccctc aagaaacgag gctctacgag cctgttggag cccctcagac attagccgcc 5460 acgaatcaaa ctttttacgc gattcggccc aaatcagttt ctcacagatc attcgtagag 5520 tgaaaaagca catcgattat ttgatacccc tttgggttaa ttactgttga ggtcttttct 5580 atttctgatt gaaatttttg ctccagcatt atagcatgct ggtttttttt ttaaattgat 5640 gtatctcatc gcaggcacgg gcagtacagt gccctgagcg tagggaaaaa tgaaaaaaag 5700 gatgtaactt ttaacataat tccagcacgc agcgattggg tataatgaag attgttaagt 5760 tcaacaacat gtgaaattct tagctccgca acttgcttga attatgagct cccaacgcgt 5820 tggatgcata gcttgagtat tctatagtgt cacctaaata gcttggcgta atcatggtca 5880 tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 5940 agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 6000 cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 6060 caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 6120 tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 6180 cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 6240 aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 6300 gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 6360 agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 6420 cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 6480 cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 6540 ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 6600 gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 6660 tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 6720 acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 6780 tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 6840 attacgcgca gaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 6900 ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 6960 tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 7020 aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 7080 tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 7140 gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 7200 atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 7260 tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 7320 ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 7380 ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 7440 tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 7500 ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 7560 ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 7620 tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 7680 gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 7740 taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 7800 cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 7860 agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 7920 gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 7980 ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgat gcggtgtgaa 8040 ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcagga aattgtaagc gttaatattt 8100 tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa 8160 tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag 8220 tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg 8280 tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga 8340 ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg 8400 gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg 8460 cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaa 8515 <210> 7 <211> 8458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pBc-ldhL-int containing the integration cassette for swapping in the BcldhL expression cassette to replace the EcldhA expression cassette at any of the three loci. <400> 7 atgtctgaat tagttgtttt caaagcaaat gaactagcga ttagtcgcta tgacttaacg 60 gagcatgaaa ccaagctaat tttatgctgt gtggcactac tcaaccccac gattgaaaac 120 cctacaagga aagaacggac ggtatcgttc acttataacc aatacgctca gatgatgaac 180 atcagtaggg aaaatgctta tggtgtatta gctaaagcaa ccagagagct gatgacgaga 240 actgtggaaa tcaggaatcc tttggttaaa ggctttgaga ttttccagtg gacaaactat 300 gccaagttct caagcgaaaa attagaatta gtttttagtg aagagatatt gccttatctt 360 ttccagttaa aaaaattcat aaaatataat ctggaacatg ttaagtcttt tgaaaacaaa 420 tactctatga ggatttatga gtggttatta aaagaactaa cacaaaagaa aactcacaag 480 gcaaatatag agattagcct tgatgaattt aagttcatgt taatgcttga aaataactac 540 catgagttta aaaggcttaa ccaatgggtt ttgaaaccaa taagtaaaga tttaaacact 600 tacagcaata tgaaattggt ggttgataag cgaggccgcc cgactgatac gttgattttc 660 caagttgaac tagatagaca aatggatctc gtaaccgaac ttgagaacaa ccagataaaa 720 atgaatggtg acaaaatacc aacaaccatt acatcagatt cctacctacg taacggacta 780 agaaaaacac tacacgatgc tttaactgca aaaattcagc tcaccagttt tgaggcaaaa 840 tttttgagtg acatgcaaag taagcatgat ctcaatggtt cgttctcatg gctcacgcaa 900 aaacaacgaa ccacactaga gaacatactg gctaaatacg gaaggatctg aggttcttat 960 ggcagcgtga ataatgaatg gccttgtatt cgtttttttc cgagagaaaa ttaacaagag 1020 cgaaaaaaaa aacgggcttc ggtgaaaatc gggtgaatat gcaactagcg ggacgaatgc 1080 tctggaaatg catatcctat gcaactagcg ggatgaacaa atctcacccc agaattcgca 1140 ggaaaaaaca ggaaaaaaaa aaagaaggcc accacggcca caaagaccac aaagaccaca 1200 aaaaaaaaca aaaaacaacc gtcccagctt ccagtgtttg gaatactgga acacaggaag 1260 ccgcataaga gtgggcgttg cacaggaagc caggcccaga agccccagag ttactttttt 1320 ttttttgttt tttccttctg ttcgctgtgc ccgcatcaga tgatgcgcct ttatttacga 1380 tgccaatgcg aatagcacca gtgagagcac cagtaaaagc atacgcatac acatacacac 1440 atagagcaag caagcaggct agcaaccagg aaaggctgcc agtgactgct actgggtgtc 1500 taagaaccgt agggcggatt attgttgcgg tggttggttg cgggtggtta tgcgatggta 1560 cggtgcagaa tcgtacggtg ttgggttatg gaattagtat gggtatgtga tatgtggtaa 1620 tatgtgatat tgggttattg tgatttggaa tactgaatat cgaatatggg atatggaata 1680 tggctatggc atggtatggt atgggatggg agtattctat tttattttat tctggttcct 1740 gcgtttaggg tagggtagga agaaggtgag tgcttttgta tataagtgga gtgtctggat 1800 cagttttgtg gattgtgaat gttagtttcc cctttaatgt atatttgtat tatttgcttt 1860 tgagtactca ataaccaagc acaactacta gttttaaagg atccatcctc ttaaacagta 1920 caaatcgcaa agaaaagctc cacacccaaa ccaaataatt gcaatgaaga aggtgaatcg 1980 tattgccgtg gtcggcactg gcgcagttgg tacgagttac tgctacgcta tgataaatca 2040 gggggttgcc gaggagttgg tgttgataga tattaatgag gctaaggccg aaggggaagc 2100 aatggatttg aatcacggtc ttccatttgc tccgactccc accagagttt ggaagggcga 2160 ctacagtgac tgtggtaccg cagacctagt agtaatcacc gccgggtccc cccagaagcc 2220 cggagaaacc cgtcttgact tggtttctaa gaacgcaaaa atctttaaag gcatgattaa 2280 atcaataatg gacagtggtt tcaacggcat tttcttggta gcatcaaacc ccgttgatat 2340 tcttacatac gttacgtgga aagaatcagg gttgccgaag gagcacgtga taggttcagg 2400 aacagttctt gactcagccc gtctaagaaa ctcactttcc gcccagtttg gaattgaccc 2460 aagaaatgtc cacgctgcca ttataggtga acacggggac acggagttac ccgtctggtc 2520 tcatactaac attggctacg acacgattga gtcgtactta caaaaaggta tcatagacga 2580 aaagacgctt gatgatatct ttgtcaatac tagagacgct gcataccaca tcatcgaaag 2640 gaagggagcc acattctatg gaataggcat gtcgttgact aggatcacca gggccatttt 2700 gaacaatgag aatagtgttt taacggttag tgccttctta gagggacaat atggtaattc 2760 cgacgtatat gtcggagtac cggcaattat taataggcaa ggtatacgtg aagtcgtaga 2820 gataaaactt aatgagaagg agcaagaaca gtttaatcac agtgttaagg ttttaaagga 2880 gaccatggcc cccattttgt aagagattga taagactttt ctagttgcat atcttttata 2940 tttaaatctt atctattagt taattttttg taatttatcc ttatatatag tctggttatt 3000 ctaaaatatc atttcagtat ctaaaaattc ccctcttttt tcagttatat cttaacaggc 3060 gacagtccaa atgttgattt atcccagtcc gattcatcag ggttgtgaag cattttgtca 3120 atggtcgaaa tcacatcagt aatagtgcct cttacttgcc tcatagaatt tctttctctt 3180 aacgtcaccg tttggtcttt tatagtttcg aaatctatgg tgataccaaa tggtgttccc 3240 aattcatcgt tacgggcgta ttttttacca attgaagtat tggaatcgtc aattttaaag 3300 tatatctctc ttttacgtaa agcctgcgag atcctcttaa gtatagcggg gaagccatcg 3360 ttattcgata ttgtcgtaac aaatactttg atcggcgcta tctgtaatgg aaaccaatac 3420 tgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat tttcctaact ttatttagtc 3480 aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta 3540 cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa 3600 tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa 3660 tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc tcttagcgca actacagaga 3720 acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg 3780 gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt ttcttacacc 3840 ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt tgaaaccagt 3900 tccctgaaat tattccccta cttgactaat 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gttggtagag gtcttttcgc aaagggaaga 4800 gatcctgtag tggaaggtga gagatacaga aaggcgggat gggacgctta cttgaagaga 4860 gtaggcagat ccgcttaatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc 4920 ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt 4980 atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt 5040 ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt 5100 tgggacgctc gaaggcttta atttgcgtga tgctaacttc tctctggaag gtctgaccgg 5160 ctttactatg tatggcaaaa cggcaggcgt tatcggtacc ggtaaaatcg gtgtggcgat 5220 gctgcgcatt ctgaaaggtt ttggtatgcg tctgctggcg ttcgatccgt atccaagtgc 5280 agcggcgctg gaactcggtg tggagtatgt cgatctgcca accctgttct ctgaatcaga 5340 cgttatctct ctgcactgcc cgctgacacc ggaaaactat catctgttga acgaagccgc 5400 cttcgaacag atgaaaaatg gcgtgatgat cgtcaatacc agtcgcggtg cattgattga 5460 ttctcaggca gcaattgaag cgctgaaaaa tcagaaaatt ggttcgttgg gtatggacgt 5520 gtatgagaac gaacgcgatc tattctttga agataaatcc aacgacgtga tccaggatga 5580 cgtattccgt cgcctgtctg cctgccacaa 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Claims (9)

1. 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 또는 그의 혼합물로로부터 선택된 탄소원으로부터 락트산을 생산할 수 있는, 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.) 효모 균주로서, 상기 유전적으로 조작된 효모는 프럭토오스 임포터(fructose importer)로 기능하는 단백질의 생산능을 부여하는 하나 이상의 이종 DNA 카세트를 포함하는 것인 균주.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 프럭토오스 임포터는 촉진 확산에 의해 기능하는 것인 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 프럭토오스 임포터는 외래 FFZ1 유전자, 또는 그의 기능적 동족체에 의해 코딩되는 것인 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주.
4. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 효모 균주는 모 균주에 비해 프럭토오스 이용의 개선을 갖는 것인 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주.
5. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 효모 균주는 1.25 g L^-1 hr^-1 이상의 프럭토오스 소비 속도로 모든 측정가능한 글루코오스 및 프럭토오스를 소비할 수 있는 것인 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주.
6. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 효모 균주는 프럭토키나아제(fructokinase) 또는 헥소키나아제(hexokinase)를 코딩하는 유전자의 발현을 부여하는 카세트를 더 포함하는 것인 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주.
7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 클루이베로마이세스 종 효모 균주는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 클루이베로마이세스 애스투아리(Kluyveromyces aestuarii), 클루이베로마이세스 아프리카누스(Kluyveromyces africanus), 클루이베로마이세스 바실리스포루스(Kluyveromyces bacillisporus), 클루이베로마이세스 블라타에( Kluyveromyces blattae), 클루이베로마이세스 도브잔스키(Kluyveromyces dobzhanskii), 클루이베로마이세스 휴베이엔시스(Kluyveromyces hubeiensis), 클루이베로마이세스 로더라에(Kluyveromyces lodderae), 클루이베로마이세스 논퍼멘탄스(Kluyveromyces nonfermentans), 클루이베로마이세스 피세아에(Kluyveromyces piceae), 클루이베로마이세스 시넨시스(Kluyveromyces sinensis), 클루이베로마이세스 월티(Kluyveromyces waltii), 클루이베로마이세스 비케라미(Kluyveromyces wickerhamii), 또는 클루이베로마이세스 야로위(Kluyveromyces yarrowii)로부터 선택되는 것인 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주.
8. 액체 배지에서 선행하는 항 중 어느 한 항에 따른 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 락트산을 제조하는 방법.
9. 선행하는 항 중 어느 한 항에 따른 유전적으로 조작된 클루이베로마이세스 종 효모 균주를 이용한 락트산 생산을 위한 발효 방법.

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